特表 2024-533839 軟骨前駆細胞凝集体形成装置及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-12

(54)【発明の名称】軟骨前駆細胞凝集体形成装置及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20240905BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20240905BHJP

   C12M 1/42 20060101ALI20240905BHJP

   C12N 5/077 20100101ALI20240905BHJP

【ＦＩ】

C12M3/00 A

C12M1/34 A

C12M1/42

C12N5/077

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024520530

(86)(22)【出願日】2022-09-28

(85)【翻訳文提出日】2024-05-09

(86)【国際出願番号】 KR2022014557

(87)【国際公開番号】W WO2023055072

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】10-2021-0130406

(32)【優先日】2021-09-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524122897

【氏名又は名称】ユース バイオ グローバル カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＹＯＵＴＨ ＢＩＯ ＧＬＯＢＡＬ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．

【住所又は居所原語表記】Ａ－０６， １９６－２５ Ｏｓｏｎｇｓａｅｎｇｍｙｅｏｎｇ １－ｒｏ， Ｈｅｕｎｇｄｅｏｋ－ｇｕ， Ｃｈｅｏｎｇｊｕ－ｓｉ， Ｃｈｕｎｇｃｈｅｏｎｇｂｕｋ－ｄｏ， ２８１６０ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ

(74)【代理人】

【識別番号】100121382

【弁理士】

【氏名又は名称】山下 託嗣

(72)【発明者】

【氏名】ユ，スン ホ

(72)【発明者】

【氏名】チャン，チ ヨン

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029AA07

4B029BB11

4B029CC02

4B029DG10

4B029FA15

4B029GA03

4B065AA90X

4B065AC20

4B065BC50

4B065CA44

4B065CA46

(57)【要約】

本実施例に係る軟骨前駆細胞凝集体を形成する装置は、それぞれマイクロマス（ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）が配置された複数のウェル（ｗｅｌｌ）と、前記マイクロマスに電気刺激を提供する電気刺激部と、前記複数のウェルに配置されたマイクロマスを予め定められた時間毎に撮影してイメージを取得するイメージ取得部と、前記イメージから前記電気刺激の提供を決定する刺激提供決定部とを含み、前記刺激提供決定部は、前記電気刺激が提供された前記マイクロマスの凝集程度から前記電気刺激の提供を決定する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

軟骨前駆細胞凝集体を形成する装置であって、
前記装置は、
それぞれマイクロマス（ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）が配置された複数のウェル（ｗｅｌｌ）と、
前記マイクロマスに電気刺激を提供する電気刺激部と、
前記複数のウェルに配置されたマイクロマスを予め定められた時間毎に撮影してイメージを取得するイメージ取得部と、
前記イメージから前記電気刺激の提供を決定する刺激提供決定部と、
を含み、
前記刺激提供決定部は、前記電気刺激が提供された前記マイクロマスの凝集程度から前記電気刺激の提供を決定する装置。

【請求項2】

前記マイクロマスは、間葉系幹細胞及び線維芽細胞の何れか１つであることを特徴とする請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記間葉系幹細胞は、脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項２に記載の装置。

【請求項4】

前記電気刺激は、
０より大きく２０Ｈｚ以下の周波数と、
－２０Ｖ以上、２０Ｖ以下の振幅と、
０より大きく８０％以下のデューティ比と、を有することを特徴とする請求項１に記載の装置。

【請求項5】

前記電気刺激は、電圧信号及び電流信号の何れか１つ以上であることを特徴とする請求項４に記載の装置。

【請求項6】

前記装置は、
前記電気刺激を６日以内に持続的又は断続的に前記マイクロマスに提供することを特徴とする請求項１に記載の装置。

【請求項7】

前記刺激提供決定部は、
学習された人工ニューラルネットワーク回路（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）を含み、
前記刺激提供決定部は、
前記イメージの提供を受け、前記マイクロマスが最大に凝集した時を推定して前記電気刺激を遮断することを特徴とする請求項１に記載の装置。

【請求項8】

前記マイクロマスが最大に凝集した際に、
前記軟骨前駆細胞は、スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状に凝集することを特徴とする請求項７に記載の装置。

【請求項9】

前記装置は、
蛍光物質で染色された前記マイクロマスが位置するウェルと、
染色された前記マイクロマスが蛍光を発生するように光を提供する光源と、
前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスを撮影してイメージを取得する蛍光イメージ取得部と、
を更に含み、
前記電気刺激部は、前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスに電気刺激を更に提供することを特徴とする請求項１に記載の装置。

【請求項10】

前記蛍光イメージ取得部は、
前記電気刺激が提供された後、
６時間以後４０時間以内に前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスで発生するカルシウムオシレーション（ｃａｌｃｉｕｍ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）イメージを取得することを特徴とする請求項９に記載の装置。

【請求項11】

軟骨前駆細胞凝集体を形成する方法であって、
前記方法は、
複数のウェル（ｗｅｌｌ）に配置されたマイクロマス（ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）に電気刺激を提供する電気刺激提供段階と、
前記マイクロマスを予め定められた時間毎に撮影してイメージを取得するイメージ取得段階と、
前記イメージから前記電気刺激の提供を決定する刺激提供決定段階と、
を含み、
前記刺激提供決定段階では、前記電気刺激が提供された前記マイクロマスの凝集程度から前記電気刺激の提供を決定する方法。

【請求項12】

前記マイクロマスは、間葉系幹細胞及び線維芽細胞の何れか１つであることを特徴とする請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記間葉系幹細胞は、脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記電気刺激提供段階は、
０より大きく２０Ｈｚ以下の周波数と、
－２０Ｖ以上、２０Ｖ以下の振幅と、
０より大きく８０％以下のデューティ比と、を有することを特徴とする請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

前記電気刺激は、電圧信号及び電流信号の何れか１つ以上であることを特徴とする請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記電気刺激提供段階では、
前記電気刺激を６日以内に持続的又は断続的に前記マイクロマスに提供することを特徴とする請求項１１に記載の方法。

【請求項17】

前記刺激提供決定段階は、
学習された人工ニューラルネットワーク回路（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）を用いて行い、
前記刺激提供決定段階では、
前記イメージの提供を受け、前記マイクロマスが最大に凝集した時を推定して前記電気刺激を遮断して行うことを特徴とする請求項１１に記載の方法。

【請求項18】

前記マイクロマスが最大に凝集した際に、
前記軟骨前駆細胞は、スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状に凝集することを特徴とする請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記方法は、
蛍光物質で染色された前記マイクロマスが位置するウェルに染色された前記マイクロマスが蛍光を発生するように光を提供する段階と、
前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスを撮影して蛍光イメージを取得する段階と、
を更に含み、
前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスには、電気刺激が提供されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。

【請求項20】

前記蛍光イメージ取得段階では、
前記電気刺激が提供された後、
６時間以後４０時間以内に前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスで発生するカルシウムオシレーション（ｃａｌｃｉｕｍ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）イメージを取得することを特徴とする請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記イメージ取得段階は、前記電気刺激提供段階と並列的に行われることを特徴とする請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、軟骨前駆細胞凝集体形成装置及び方法に関するものである。

【背景技術】

【0002】

膝を多く使用して軟骨がすり減ると同時に、膝関節と靭帯に炎症が生じて退行性関節炎が発生し、韓国の６５歳以上の高齢者１０人に８人が患っている。老人性疾患として知られていた退行性関節炎が、近年は誤った生活習慣、運動ブームによる外傷性関節炎の増加などにより、若年層の関節炎を加速させる要因になっている。軟骨関連疾患を治療するために、肋骨軟骨から分離された軟骨細胞を含む人工軟骨を使用する方法が研究されている。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

膝の軟骨は、大体２～３ｍｍの厚さで薄いが、周囲の組織に衝撃を分散して関節の円滑な運動と関節の損傷を防ぐ役割を果たす。膝の軟骨は、再生不可能な代表的な組織であって、過度な使用及び外部からの衝撃による損傷などによる外部的な要因によっても年齢に関係なく減少する可能性があり、関節リウマチのような病理的な要因によっても軟骨組織の損傷が誘発される恐れがある。

【0004】

年を取るにつれて軟骨組織が減少して発病する退行性関節炎は、損傷した軟骨が正常に作動できず、下部の骨が露出し、これによる炎症と痛みにより動きが制限され、軟骨組織の減少が加速化する結果を生む。

【0005】

このような関節関連障害を解消するための従来の技術は、幹細胞を活用する方法があり、主に高価な成長因子の添加を通じて軟骨細胞に分化させる方法を用いているので、臨床に活用されるためには、コスト問題を解決する必要がある。これらのコストや免疫などのような問題はまだ解決されていない。

【0006】

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであって、その目的は、前述した従来技術の難点を解消することにある。即ち、間葉系幹細胞、線維芽細胞を用いて軟骨細胞及び／又は軟骨全能性細胞凝集体を形成して退行性関節炎だけでなく、関節リウマチなどの関節関連疾患の治療剤を製造できる装置及び方法を提供することが本発明で解決しようとする課題の１つである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本実施例に係る軟骨前駆細胞凝集体を形成する装置は、それぞれマイクロマス（ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）が配置された複数のウェル（ｗｅｌｌ）と、前記マイクロマスに電気刺激を提供する電気刺激部と、前記複数のウェルに配置されたマイクロマスを予め定められた時間毎に撮影してイメージを取得するイメージ取得部と、前記イメージから前記電気刺激の提供を決定する刺激提供決定部とを含み、前記刺激提供決定部は、前記電気刺激が提供された前記マイクロマスの凝集程度から前記電気刺激の提供を決定する。

【0008】

本実施例に係る装置のある一側面によれば、前記マイクロマスは、間葉系幹細胞及び線維芽細胞の何れか１つである。

【0009】

本実施例に係る装置のある一側面によれば、前記間葉系幹細胞は、脂肪由来間葉系幹細胞である。

【0010】

本実施例に係る装置のある一側面によれば、前記電気刺激は、０より大きく２０Ｈｚ以下の周波数と、－２０Ｖ以上、２０Ｖ以下の振幅と、０より大きく８０％以下のデューティ比とを有するパルス状電気刺激である。

【0011】

本実施例に係る装置のある一側面によれば、前記電気刺激は、電圧信号及び電流信号の何れか１つ以上である。

【0012】

本実施例に係る装置のある一側面によれば、前記電気刺激を６日以内に持続的又は間欠的に前記マイクロマスに提供する。

【0013】

本実施例に係る装置のある一側面によれば、前記刺激提供決定部は、学習された人工ニューラルネットワーク回路（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）を含み、前記刺激提供決定部は、前記イメージの提供を受け、前記マイクロマスが最大に凝集した時を推定して前記電気刺激を遮断する。

【0014】

本実施例に係る装置のある一側面によれば、前記マイクロマスが最大に凝集した際に、前記軟骨前駆細胞は、スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状に凝集する。

【0015】

本実施例に係る装置のある一側面によれば、前記装置は、蛍光物質で染色された前記マイクロマスが位置するウェルと、染色された前記マイクロマスが蛍光を発生するように光を提供する光源と、前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスを撮影してイメージを取得する蛍光イメージ取得部とを更に含み、前記電気刺激部は、前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスに電気刺激を更に提供する。

【0016】

本実施例に係る装置のある一側面によれば、前記蛍光イメージ取得部は、前記電気刺激が提供された後、６時間以後４０時間以内に前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスで発生するカルシウムオシレーション（ｃａｌｃｉｕｍ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）イメージを取得する。

【0017】

本実施例に係る軟骨前駆細胞凝集体を形成する方法は、複数のウェル（ｗｅｌｌ）に配置されたマイクロマス（ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）に電気刺激を提供する電気刺激提供段階と、前記マイクロマスを予め定められた時間毎に撮影してイメージを取得するイメージ取得段階と、前記イメージから前記電気刺激の提供を決定する刺激提供決定段階とを含み、前記刺激提供決定段階では、前記電気刺激が提供された前記マイクロマスの凝集程度から前記電気刺激の提供を決定する。

【0018】

本実施例に係る方法のある一側面によれば、前記マイクロマスは、間葉系幹細胞及び線維芽細胞の何れか１つである。

【0019】

本実施例に係る方法のある一側面によれば、前記間葉系幹細胞は、脂肪由来間葉系幹細胞である。

【0020】

本実施例に係る方法のある一側面によれば、前記電気刺激提供段階は、０より大きく２０Ｈｚ以下の周波数と、－２０Ｖ以上、２０Ｖ以下の振幅と、０より大きく８０％以下のデューティ比とを有するパルス状電気刺激を提供して行う。

【0021】

本実施例に係る方法のある一側面によれば、前記電気刺激は、電圧信号及び電流信号の何れか１つ以上である。

【0022】

本実施例に係る方法のある一側面によれば、前記電気刺激提供段階では、前記電気刺激を６日以内に持続的又は間欠的に前記マイクロマスに提供する。

【0023】

本実施例に係る方法のある一側面によれば、前記刺激提供決定段階は、学習された人工ニューラルネットワーク回路（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）を用いて行い、前記刺激提供決定段階では、前記イメージの提供を受け、前記マイクロマスが最大に凝集した時を推定して前記電気刺激を遮断して行う。

【0024】

本実施例に係る方法のある一側面によれば、前記マイクロマスが最大に凝集した際に、前記軟骨前駆細胞は、スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状に凝集する。

【0025】

本実施例に係る方法のある一側面によれば、前記方法は、蛍光物質で染色された前記マイクロマスが位置するウェルに染色された前記マイクロマスが蛍光を発生するように光を提供する段階と、前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスを撮影して蛍光イメージを取得する段階とを更に含み、前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスには、電気刺激が提供される。

【0026】

本実施例に係る方法のある一側面によれば、前記蛍光イメージ取得段階では、前記電気刺激が提供された後、６時間以後４０時間以内に前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスで発生するカルシウムオシレーション（ｃａｌｃｉｕｍ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）イメージを取得する。

【0027】

本実施例に係る方法のある一側面によれば、前記イメージ取得段階は、前記電気刺激提供段階と並列的に行われる。

【発明の効果】

【0028】

本実施例によれば、マイクロマスに電気刺激を提供して、軟骨前駆細胞を形成できる装置と方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】本実施例に係る軟骨全能性細胞凝集体形成装置の概要を示す概要図である。

【図2】本実施例に係る軟骨全能性細胞凝集体形成方法の概要を示す手順図である。

【図3】電気刺激部が電極を通じて提供する電気刺激の実施例を概要的に示す図である。

【図4】ウェル内に含まれている培養液内のマイクロマスに電気刺激を加えた際に時間に応じて観察されるイメージの例をモデリングして示す図である。

【図5】任意のイメージで内側閉曲線を決定する方法を説明する図である。

【図6】時間に応じて本発明の一実施例に係る電気刺激システムの推定部が出力する値を示すグラフの例である。

【発明を実施するための形態】

【0030】

以下では、添付の図面を参照して、本実施例を説明する。

【0031】

図１は、本実施例に係る軟骨前駆細胞凝集体形成装置１０の概要を示す概要図であり、図２は、本実施例に係る軟骨全能性細胞凝集体形成方法の概要を示す手順図である。図１及び図２を参照すると、軟骨前駆細胞凝集体形成装置１０は、それぞれマイクロマス（ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、Ｍ）が配置された複数のウェル（ｗｅｌｌ、Ｗ）と、マイクロマスＭに電気刺激を提供する電気刺激部１００と、複数のウェルＷに配置されたマイクロマスＭを予め定められた時間毎に撮影してイメージを取得するイメージ取得部２００と、イメージから電気刺激の提供を決定する刺激提供決定部３００とを含み、刺激提供決定部３００は、電極刺激が提供されたマイクロマスＭの凝集程度から電気刺激提供を決定する。

【0032】

本実施例に係る軟骨前駆細胞凝集体形成方法は、複数のウェル（ｗｅｌｌ）に配置されたマイクロマス（ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）に電気刺激を提供する電気刺激提供段階（Ｓ１００）と、マイクロマスを予め定められた時間毎に撮影してイメージを取得するイメージ取得段階（Ｓ２００）と、イメージから電気刺激の提供を決定する刺激提供決定段階（Ｓ３００）とを含み、刺激提供決定段階（Ｓ３００）は、電気刺激が提供されたマイクロマスの凝集程度から決定する。

【0033】

複数のウェル（ｗｅｌｌ、Ｗ）には、マイクロマス（ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、Ｍ）が配置される。マイクロマスには、後続する過程で電気刺激が提供されて凝集し、軟骨前駆細胞に凝集する。一実施例として、マイクロマスＭは、間葉系幹細胞及び線維芽細胞の何れか１つであって、間葉系幹細胞は、脂肪由来間葉系幹細胞であり得る。

【0034】

何れか１つ以上のウェルＷｆには、蛍光物質で染色されたマイクロマスＭｆを配置できる。蛍光物質で染色されたマイクロマスＭｆは、光源（図示せず）が提供した特定波長の光の提供を受けて蛍光を発生する。蛍光イメージ取得部（図示せず）は、蛍光物質で染色されたマイクロマスＭｆから発生するカルシウムオシレーション（ｃａｌｃｉｕｍ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）を検出でき、これからマイクロマスＭｆが損傷せずに機能することを把握し、残りのマイクロマスＭの状態を類推できる。蛍光イメージ取得部は、イメージ取得部２００が検出する光の波長と異なる帯域の光に対するイメージを取得してカルシウムオシレーションを検出する。

【0035】

一実施例として、カルシウムオシレーションの検出は、電気刺激の提供後６時間以後４０時間以内に１回以上行うことができ、好ましくは電気刺激の提供後６時間以後４０時間以内に周期的に行うことができる。

【0036】

一実施例として、マイクロマスＭｆは、染色剤で染色されることができ、光源は、染色剤で染色されたマイクロマスＭｆが吸収して蛍光を発生させることができる波長の光を提供する光源であり得る。

【0037】

ウェルＷには、電極（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ、Ｅ）が配置され、電極Ｅは、電気刺激部１００が提供する電気刺激をウェルＷ内に位置するマイクロマスＭに印加する。また、染色剤で染色されたマイクロマスＭｆが位置するウェルＷｆにも電極Ｅを配置することができ、染色剤で染色されたマイクロマスＭｆに電気刺激を印加できる。

【0038】

電気刺激部１００は、電極Ｅを通じてマイクロマスＭに電気刺激を印加する。電気刺激が印加されたマイクロマスＭは、球形に隣接するスフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状に凝集する。

【0039】

図３は、電気刺激部１００が電極Ｅを通じて提供する電気刺激の実施例を概要的に示す図である。図３で例示された実施例において、パルス状の電流信号及び／又は電圧信号であり得る。例示された実施例において、電気刺激は互いに異なる極性で振動するパルス状であり得るが、これは実施例に過ぎず、正の極性或いは負の極性のうち単一の方向に振動するパルスであり得る。

【0040】

一実施例として、電気刺激は、０より大きく２０Ｈｚの周波数を有することができ、－２０Ｖと２０Ｖとの間で振動でき、０より大きく８０％以下のデューティ比を有することができる。電気刺激は、６日以内に持続的又は断続的に提供できる。但し、これらは全て実施例であり、本発明の範囲は、これに限定されないのは当然である。

【0041】

更に図１及び図２を参照すると、電気刺激部１００が電気刺激を提供することによって、マイクロマスＭは、スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状に凝集する。機能が損傷していないマイクロマスは、カルシウムイオンが細胞膜の内部と外部に流入及び流出するカルシウムオシレーション現象が発生する。従って、カルシウムオシレーション現象を観察できると、マイクロマスの機能に損傷なく軟骨前駆細胞に凝集していることが分かる。

【0042】

イメージ取得部２００は、ウェルＷに配置されたマイクロマスＭを撮影してイメージを取得する。イメージ取得部２００は、一実施例として、光学系（図示せず）と、光学系で形成されたイメージを電気的信号に変換する撮像素子（図示せず）を含むことができ、ウェルＷの内部に位置するマイクロマスＭを撮影する。一例として、光学系は、凸レンズ、凹レンズなどのレンズを含むことができ、撮像素子は、ＣＣＤ（ｃｈａｒｇｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）及びＣＩＳ（ＣＭＯＳ ｉｍａｇｅ ｓｅｎｓｏｒ）センサのうちの何れか１つ以上を含むことができる。イメージ取得部２００で撮影されて形成されたイメージは、刺激提供決定部３００に提供される。

【0043】

イメージ取得部２００は、予め定められた時間毎にウェルＷに配置されたマイクロマスＭを撮影してイメージを形成し、形成されたイメージを刺激提供決定部３００に提供する。イメージ取得部２００が取得したイメージは、時間の経過に伴ってウェルＷに配置されたマイクロマスＭが凝集した程度を示すイメージであり得る。

【0044】

刺激提供決定部３００は、学習可能であり、学習の結果によって推論を行うニューラルネットワーク回路を含む。学習されたニューラルネットワーク回路を含む刺激提供決定部３００は、イメージ取得部２００が提供したイメージから電気刺激部１００が電気刺激を提供するかを決定する。

【0045】

以下、学習に利用されるラベルを決定する方法を含むニューラルネットワーク回路の学習方法を説明する。

【0046】

刺激提供決定部３００に含まれているニューラルネットワーク回路の学習のために、専門家（人）は、イメージ取得部２００が出力した複数のイメージを時間順に観察し、複数のイメージのうち軟骨前駆細胞の生成量が最大値に達したと判断された最初のイメージである第１イメージ（＝基準イメージ）に特定値を有する基準ラベルを付与できる。一例として、基準ラベルの特定の値は１ であり得る。即ち、電気刺激によって生成された軟骨前駆細胞の量が最大になった時にイメージ取得部２００によって取得されるイメージに基準ラベルを関連付けることができる。

【0047】

撮影された複数のイメージは、以下で説明する現象による特徴を有することができる。即ち、電気刺激を加える以前にウェル内に含まれていたマイクロマスＭは、ウェルに含まれている培養液内に均一に分布できる。電気刺激が提供されることによって、マイクロマスＭが凝集して軟骨前駆細胞に変化し、このように生成された軟骨前駆細胞は凝集体をなす。

【0048】

しかし、軟骨前駆細胞の生成量が増加し、電気刺激が継続して印加されると、凝集した軟骨前駆細胞は再び散乱し、結局のところ、軟骨前駆細胞の量が減少する。このような現象は、図４を参照して更に詳しく説明する。

【0049】

図４は、ウェルＷ内に含まれている培養液内のマイクロマスＭに電気刺激を加えた際に時間に応じて観察されるイメージの例をモデリングして示すものである。図４（ａ）乃至図４（ｈ）に示した大きな円は、ウェルＷの枠が円形の場合において、上から下に見下ろした際にウェルＷの外郭縁の形状を示す。図４（ａ）から図４（ｈ）に行くほど時間に応じて電気刺激が更に提供された結果を示す。図４（ａ）は、電気刺激を開始した時点を示すものである。図４（ｂ）乃至図４（ｈ）に示した小さな円は、電気刺激によって生成される軟骨前駆細胞凝集体の外郭縁の形状を示すものである。実際に軟骨前駆細胞凝集体の形状は、正確な円形ではないこともできるが、略円形にモデリングできる。図４の（ｂ）乃至（ｈ）に示した小さな円の中には、生成された軟骨前駆細胞だけでなく、マイクロマスＭが共に混合されて含まれていることができるが、軟骨前駆細胞が密集しているので、軟骨前駆細胞の凝集領域と見なすことができる。

【0050】

図４を参照すると、図４（ａ）では電気刺激が提供される時点であるので、別途の軟骨前駆細胞の凝集体が観察されない。図４（ａ）から図４（ｅ）に行くほど電気刺激によって軟骨前駆細胞の群集の面積が次第に減少することが観察できる。軟骨前駆細胞の凝集体の面積が減少しても、実際にこの凝集体内に存在する軟骨前駆細胞の量は、時間に応じて次第に増加する。図４（ｅ）のように、軟骨前駆細胞の量が最大値に達すると、電気刺激を加えても図４（ｆ）のように、軟骨前駆細胞が更に生成されず、最大値の状態を維持できる。

【0051】

しかし、その後、電気刺激を中断せずに提供し続けると、図４（ｇ）及び図４（ｈ）で示すように、軟骨前駆細胞の凝集体の面積が再び増加し始め、実際には生成された軟骨前駆細胞の量が減少する。従って、マイクロマスＭから軟骨前駆細胞を最大限に多く生成するためには、マイクロマスＭに提供される電気刺激を適切な時点で遮断する必要がある。図４で例示された実施例において、図４（ｅ）と図４（ｆ） の状態で電流を遮断することが好ましい。一例として、図４（ｅ）の段階で電流を遮断すると、軟骨前駆細胞を最大限に得ることができ、マイクロマスＭから軟骨前駆細胞を得るための時間を最小化し、消耗電流を減少させることができるという長所がある。

【0052】

更に図１及び図２を参照して、上述した基準ラベルの値を設定する方法を説明する。軟骨前駆細胞の凝集体に含まれる軟骨前駆細胞の量（個数）が実質的に最大値になった際に撮影された基準イメージに付与された基準ラベルの値は特定値、例えば１に設定できる。

【0053】

ここで、軟骨前駆細胞の生成量が最大値に達したと判断する主体は、専門家（人）である。最大値に対応する軟骨前駆細胞の生成量を第１生成量又は基準生成量又は最大生成量と称することができ、基準生成量は、上述したように、特定の値に正規化できる。例えば、基準生成量は１であると提示することもできる。

【0054】

本発明の一実施例によって提供される刺激提供決定部３００は、イメージ取得部２００が提供した複数のイメージのうち、基準イメージを除いた残りのイメージのそれぞれにアルゴリズムによって固有のラベル値を付与できる。残りのイメージのそれぞれに付与されるラベル値は、基準ラベルが有する特定値以下であり得る。例えば、残りのイメージのうち任意の第２イメージに付与されるラベル値は、１以下の値であり得る。

【0055】

刺激提供決定部３００は、残りのイメージのそれぞれに付与するラベル値を、基準ラベルの値、基準撮影イメージ、及びそれぞれの撮影イメージに基づいて決定できる。例えば、基準撮影イメージから推定される軟骨前駆細胞の生成量を基準生成量とし、第２イメージから推定される軟骨前駆細胞の生成量を第２生成量とし、そして第２イメージに付与されるべきラベルを第２ラベルとすれば、数１の関係が成立する。

【0056】

【数1】

【0057】

前記数１において、基準ラベル値は、専門家によって既に付与された値である。例えば、基準ラベルの値は１であり得る。そして、基準生成量は予め設定された値を基準に正規化された値であり得る。一実施例において、生成された軟骨前駆細胞の総数の具体的な値に関係なく専門家が判断した軟骨前駆細胞の最大生成時点での軟骨前駆細胞の生成量を１と定義することもできる。また、第２生成量は、後述する方法によって決定できる値である。従って、第２イメージに対して付与されるべき第２ラベルの値は、以下の数２のように決定できる。

【0058】

【数2】

【0059】

数２を一般化すると、第ｋイメージに対する第ｋラベルの値は、以下の式３のように決定できる。

【0060】

【数3】

【0061】

それぞれのイメージから軟骨前駆細胞の生成量を推定する方法は、次のように提示されることができる。まず、刺激提供決定部３００は、イメージからウェルＷの縁を識別できる。ウェルＷは、円形又は四角形の皿であり得る。このとき、培養器ウェルＷの縁は一例として、図４に示すように円形の閉曲線であり得る。

【0062】

続いて、刺激提供決定部３００は、ウェルＷ内に存在するマイクロマスＭに対する撮影イメージを所定の基準に従って２つの領域に分類できる。２つの領域は、図４に示されている。２つの領域のうち、第１領域（外側領域、１１０）は、外側閉曲線１１１と内側閉曲線１１２を有するドーナツ状の領域であり得る。外側閉曲線１１１は、ウェルＷの外側縁であり得る。そして、２つの領域のうち第２領域（内側領域、１２０）は、内側閉曲線１１２内部の領域であり得る。一実施例において、内側閉曲線１１２は、円形又は楕円形にモデリングして定義することもできる。

【0063】

以下、図５を参照して、本発明の一実施例によって任意のイメージで内側閉曲線を決定する方法を説明する。任意のイメージで内側閉曲線１１２を決定する方法は、次の段階を含むことができる。まず、刺激提供決定部３００は、任意の撮影イメージにおいて、ウェルＷの縁の地点である第１外郭地点１１１０からウェルＷの中心点１１２０を繋ぐ経路Ｐ１を決定できる。経路Ｐ１は、直線又は曲線であり得る。経路Ｐ１の長さをＬ１としたとき、第１外郭地点からｄＬだけ中心点に移動した第２地点を定義できる。

【0064】

このように第ｋ地点からｄＬだけ中心点に移動した第ｋ＋１地点を連続して定義できる（ｋは１以上の自然数、ｄＬ＜Ｌ１）。第ｋ地点でのイメージ属性値と第ｋ＋１地点でのイメージ属性値との差値をＤｋと定義できる。イメージ属性値は、例えば、任意のイメージの各地点での明度又は彩度などの属性値であり得る。イメージ属性値は、イメージプロセッシング分野においてイメージの属性を区分する基準に従えば十分であり、その具体的な属性の選択によって本発明が制限されるものではない。

【0065】

このように定義されたイメージ属性値間の差値Ｄｋ（ｋ=１、２、３、...）のうち最も大きな値を選択できる。例えば、もし差異値Ｄ３が最も大きい値であれば、経路Ｐ１上で第３地点１１３１と第４地点１１４１との間で前記イメージ属性値が最も大きく変化したものと見られる。これから、内側閉曲線１１２を構成する第１内側地点１１２１は、第３地点１１３１と第４地点１１４１との間に存在するものと決定できる。

【0066】

第１内側地点１１２１を決定する過程は、ウェルＷの縁の第１外郭地点を選択する段階から始まったものである。第１内側地点を決定する過程をウェルＷの縁の多様な他の外郭地点から始めて行うと、内側閉曲線１１２を構成する複数の他の内側地点を決定できる。このように決定された複数の内側地点を互いに補間（ｉｎｔｅｒｐｏｌａｔｉｏｎ）して繋ぐと、内側閉曲線１１２を完成できる。その結果、第１領域（外側領域、１１０）と第２領域（内側領域、１２０）を定義できる。

【0067】

もし、差値Ｄｋ（ｋ=１、２、３、...）のうち最も大きい値が予め決定された値よりも小さければ、第１内側地点１１２１は、第１外郭地点１１１０であると決定できる。場合によって、第２領域（内側領域、１２０）と第１領域（外側領域、１１０）が存在しない場合もあり得る。このような状況は、例えばマイクロマスＭに電気刺激を全く加えていない状態で発生することもできる。例えば、図４（ａ）では、内側領域１２０と外側領域１１０を定義できない。

【0068】

上述した第１内側地点を決定する方法は、円形又は楕円形に近似する第２領域（内側領域、１２０）と第２領域（内側領域、１２０）の外側に存在する第１領域（外側領域、１１０）とを区分するための多様なアルゴリズムの１つとして提示されたものである。即ち、上述した内容は、ウェルＷ内に存在するマイクロマスＭ培養液のイメージを上述した２つの領域に分けられるという実施可能性を説明するものであり、本発明がこのような実施例に限定されるものではない。

【0069】

撮影イメージを２つの領域に分ける過程は、電気刺激が加えられる時間の流れによって撮影された複数のイメージそれぞれ及び複数のウェルＷに含まれているマイクロマスＭそれぞれに対して行われるものである。このように、第２領域（内側領域、１２０）が定義されると、第２領域（内側領域、１２０）の面積ＳＢを算出できる。

【0070】

第ｋイメージから推定される軟骨前駆細胞の生成量を第ｋ生成量とし、第ｋイメージから算出された第２領域（内側領域、１２０）の面積を第ｋ面積とするとき、第ｋイメージから推定される軟骨前駆細胞の第ｋ生成量は第ｋ面積に反比例するものと定義することもできる。しかし、実施例によっては、第ｋ生成量が第ｋ面積に基づいて推定されるものとし、第ｋ生成量と第ｋ面積との関係に非線形関数が介入するものとして規則を定めることもできる。本発明の一態様によれば、第ｋ生成量が第ｋ面積に基づいて推定されるが、その具体的な関数関係によって本発明が制限されるものではない。このように、第ｋイメージから第ｋ生成量が推定されると、数３を用いて第ｋラベルの値を決定できる。

【0071】

上述した過程を通じて電気刺激が印加されてその状態が変化するウェル内のマイクロマスＭを撮影した一連のイメージに対して割り当てられたラベルを定義するか、又は算出して取得できる。

【0072】

刺激提供決定部３００は、ニューラルネットワーク回路の入力層に前記第ｋイメージを入力して、ニューラルネットワーク回路が出力した値が第ｋイメージに対応する第ｋラベルとの誤差が減少するようにニューラルネットワーク回路を更新できる。

【0073】

一実施例において、ニューラルネットワーク回路は、例えばＣＮＮ（Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ）であり得る。複数枚のイメージ及びこれらに対して生成したラベルを用いてニューラルネットワーク回路の学習を繰り返すことができる。また、複数のウェルＷに配置されたマイクロマスＭにそれぞれ電気刺激を加えながら撮影した複数のイメージ及びこれに対応するラベルを用いてニューラルネットワークの学習を繰り返すことができる。

【0074】

上述したニューラルネットワーク学習方法において、ニューラルネットワークの学習用入力データは、前記撮影データであり、それぞれの学習用入力データに対応する正解枝に該当するラベルを作る方法に本発明の１つの特徴が存在すると見られる。

【0075】

ウェルＷに入ったマイクロマスＭ培養液に提供する電流を遮断する時点を決定できる。まず、電気刺激部１００は、マイクロマスＭ培養液が入ったウェルＷに一対の電極Ｅを用いて電流を印加する（Ｓ１００）。続いて、イメージ取得部２００は、所定の時間間隔でマイクロマスＭ培養液を撮影してイメージを取得（Ｓ２００）し、刺激提供決定部３００に伝達する。刺激提供決定部３００は、伝達されたそれぞれの撮影イメージを刺激提供決定部３００のニューラルネットワーク回路の入力レイヤに入力する。

【0076】

刺激提供決定部３００は、電気刺激部１００が電気刺激を提供するかを判断し（Ｓ３００）、電気刺激部１００を制御する制御信号を出力する。電気刺激部１００は、刺激提供決定部３００が出力した制御信号に応じて電気刺激を提供するか、電気刺激の提供を終了する。一例として、刺激提供決定部３００は、提供されたイメージから決定されたラベル値がこれ以上増加しないと判断されるとき、電流の印加を終了することで、制御信号を提供できる。このために、例えば、刺激提供決定部３００は、ニューラルネットワーク回路が出力したラベル値の移動平均値を観察し、移動平均値が減少し始める時点、又は一定期間飽和してこれ以上増加しない時点に電気刺激の提供を終了する信号を提供できる。

【0077】

他の実施例として、刺激提供決定部３００は、スカラー値であるラベル値を出力できる。電気刺激部１００は、刺激提供決定部３００が出力した一連の出力値の時間に応じたヒストリに基づいて電気刺激の提供を終了するか否かを決定できる。

【0078】

一例として、電気刺激部１００は、刺激提供決定部３００が出力した出力値がこれ以上増加しないと判断される瞬間、電流の印加を終了することによって決定できる。このために、例えば、駆動電流制御部３０は、推定部５０が出力した出力値の移動平均値を観察し、移動平均値が減少し始める時点、又は一定期間飽和してこれ以上増加しない時点に電流の印加を終了することを決定できる。

【0079】

上述したように、駆動電流制御部３０がマイクロマスＭ培養液に提供する電気刺激を遮断する方法を、図６を参照して説明する。

【0080】

図６は、時間に応じて本発明の一実施例に係る電気刺激システムの推定部が出力する値を示すグラフの例である。図６のグラフは、推定部５０が出力する原形値をそのまま示すものであることもでき、又は原形値を時間に応じた区間平均を出して示すものであることもできる。

【0081】

図６において、ｔ０～ｔ１区間ではニューラルネットワーク回路が演算したラベル値が単純増加し、ｔ１～ｔ２区間ではニューラルネットワーク回路が演算したラベル値が維持され、ｔ２～区間では値が減少する。場合によっては、ｔ１～ｔ２の時区間が実質的に存在せず、ｔ１以降に直ぐにラベル値が減少し始める可能性もある。

【0082】

図６に示す曲線を時間に応じてリアルタイムで観測する場合、理想的にはｔ１時点で電気刺激の終了を命じなければならないが、軟骨前駆細胞の生成量が最大値に達したか否かをニューラルネットワーク回路が演算したラベル値を観察して決定するためには、ある程度の時間遅延が必要であるため、実質的には、ｔ１時点以降に電気刺激の終了が命じられる可能性がある。

【0083】

本発明に対する理解を助けるために図面に示された実施例を参照して説明されたが、これは実施のための実施例であり、例示的なものに過ぎず、当該分野における通常の知識を有する者であれば、これから多様な変形及び均等な他の実施例が可能であるという点が理解できる。従って、本発明の真の技術的保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって定められるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【手続補正書】

【提出日】2024-05-09

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

軟骨前駆細胞凝集体を形成する装置であって、
前記装置は、
それぞれマイクロマス（ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）が配置された複数のウェル（ｗｅｌｌ）と、
前記マイクロマスに電気刺激を提供する電気刺激部と、
前記複数のウェルに配置されたマイクロマスを予め定められた時間毎に撮影してイメージを取得するイメージ取得部と、
前記イメージから前記電気刺激の提供を決定する刺激提供決定部と、
を含み、
前記刺激提供決定部は、前記電気刺激が提供された前記マイクロマスの凝集程度から前記電気刺激の提供を決定する装置。

【請求項2】

前記マイクロマスは、間葉系幹細胞及び線維芽細胞の何れか１つであり、
前記間葉系幹細胞は、脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記電気刺激は、
０より大きく２０Ｈｚ以下の周波数と、
－２０Ｖ以上、２０Ｖ以下の振幅と、
０より大きく８０％以下のデューティ比と、を有することを特徴とする請求項１に記載の装置。

【請求項4】

前記装置は、
前記電気刺激を６日以内に持続的又は断続的に前記マイクロマスに提供することを特徴とする請求項１に記載の装置。

【請求項5】

前記刺激提供決定部は、
学習された人工ニューラルネットワーク回路（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）を含み、
前記刺激提供決定部は、
前記イメージの提供を受け、前記マイクロマスが最大に凝集した時を推定して前記電気刺激を遮断し、
前記軟骨前駆細胞は、前記マイクロマスが最大に凝集した際に、スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状に凝集することを特徴とする請求項１に記載の装置。

【請求項6】

前記装置は、
蛍光物質で染色された前記マイクロマスが位置するウェルと、
染色された前記マイクロマスが蛍光を発生するように光を提供する光源と、
前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスを撮影してイメージを取得する蛍光イメージ取得部と、
を更に含み、
前記電気刺激部は、前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスに電気刺激を更に提供することを特徴とする請求項１に記載の装置。

【請求項7】

前記蛍光イメージ取得部は、
前記電気刺激が提供された後、
６時間以後４０時間以内に前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスで発生するカルシウムオシレーション（ｃａｌｃｉｕｍ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）イメージを取得することを特徴とする請求項６に記載の装置。

【請求項8】

装置によって実行される、軟骨前駆細胞凝集体を形成する方法であって、
前記方法は、
複数のウェル（ｗｅｌｌ）に配置されたマイクロマス（ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）に電気刺激を提供する段階と、
前記マイクロマスを予め定められた時間毎に撮影してイメージを取得する段階と、
前記イメージから前記電気刺激の提供を決定する段階と、
を含み、
前記電気刺激の提供を決定する段階では、前記電気刺激が提供された前記マイクロマスの凝集程度から前記電気刺激の提供を決定する方法。

【請求項9】

前記マイクロマスは、間葉系幹細胞及び線維芽細胞の何れか１つであり、
前記間葉系幹細胞は、脂肪由来間葉系幹細胞であることを特徴とする請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記電気刺激は、
０より大きく２０Ｈｚ以下の周波数と、
－２０Ｖ以上、２０Ｖ以下の振幅と、
０より大きく８０％以下のデューティ比と、を有することを特徴とする請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記電気刺激を提供する段階では、
前記電気刺激を６日以内に持続的又は断続的に前記マイクロマスに提供することを特徴とする請求項８に記載の方法。

【請求項12】

前記電気刺激の提供を決定する段階は、
学習された人工ニューラルネットワーク回路（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｎｅｕｒａｌ ｎｅｔｗｏｒｋ）を用いて行い、
前記電気刺激の提供を決定する段階では、
前記イメージの提供を受け、前記マイクロマスが最大に凝集した時を推定して前記電気刺激を遮断することを決定し、
前記軟骨前駆細胞は、前記マイクロマスが最大に凝集した際に、スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄ）状に凝集することを特徴とする請求項８に記載の方法。

【請求項13】

前記方法は、
蛍光物質で染色された前記マイクロマスが位置するウェルに染色された前記マイクロマスが蛍光を発生するように光を提供する段階と、
前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスを撮影して蛍光イメージを取得する段階と、
を更に含み、
前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスには、電気刺激が提供されることを特徴とする請求項８に記載の方法。

【請求項14】

前記蛍光イメージを取得する段階では、
前記電気刺激が提供された後、
６時間以後４０時間以内に前記蛍光物質で染色された前記マイクロマスで発生するカルシウムオシレーション（ｃａｌｃｉｕｍ ｏｓｃｉｌｌａｔｉｏｎ）イメージを取得することを特徴とする請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記イメージを取得する段階は、前記電気刺激を提供する段階と並列的に行われることを特徴とする請求項８に記載の方法。

【国際調査報告】