特表 2024-533901 保湿機能を持つセリシンペプチド及びその製造方法並びに使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-13

(54)【発明の名称】保湿機能を持つセリシンペプチド及びその製造方法並びに使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/435 20060101AFI20240906BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240906BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20240906BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20240906BHJP

   C12P 1/00 20060101ALN20240906BHJP

   C12P 1/02 20060101ALN20240906BHJP

   C12N 9/50 20060101ALN20240906BHJP

   C12N 1/16 20060101ALN20240906BHJP

【ＦＩ】

C07K14/435

C12P21/02 A

A61Q19/00

A61K8/64

C12P1/00 A

C12P1/02 Z

C12N9/50

C12N1/16 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023546292

(86)(22)【出願日】2022-11-22

(85)【翻訳文提出日】2023-07-31

(86)【国際出願番号】 CN2022133579

(87)【国際公開番号】W WO2024040769

(87)【国際公開日】2024-02-29

(31)【優先権主張番号】202211022217.3

(32)【優先日】2022-08-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521155645

【氏名又は名称】チャイナ ナショナル リサーチ インスティテュート オブ フード アンド ファーメンテーション インダストリーズ カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＣＨＩＮＡ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ ＦＯＯＤ ＆ ＦＥＲＭＥＮＴＡＴＩＯＮ ＩＮＤＵＳＴＲＩＥＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｂｌｄｇ． ６， Ｎｏ． ２４， Ｊｉｕｘｉａｎｑｉａｏ Ｍｉｄｄｌｅ Ｒｏａｄ， Ｃｈａｏｙａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００１５ Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100106297

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 克博

(72)【発明者】

【氏名】サイ、 ムイ

(72)【発明者】

【氏名】グ、 ルイゼン

(72)【発明者】

【氏名】キン、 シュウユアン

(72)【発明者】

【氏名】チェン、 リアン

(72)【発明者】

【氏名】ドン、 ツェ

(72)【発明者】

【氏名】チャン、 シンシュエ

(72)【発明者】

【氏名】ワン、 ジン

(72)【発明者】

【氏名】チャン、 ハイシン

(72)【発明者】

【氏名】ビ、 ユアン

(72)【発明者】

【氏名】マ、 ヨンキン

(72)【発明者】

【氏名】ファン、 レイ

(72)【発明者】

【氏名】リ、 グオミン

(72)【発明者】

【氏名】リウ、 ウェニン

(72)【発明者】

【氏名】ル、 ル

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C083

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA06

4B064CA21

4B064CB05

4B064CD20

4B064CE09

4B064CE16

4B064DA20

4B065AA72X

4B065BC03

4B065BD10

4B065BD39

4B065BD45

4B065CA24

4B065CA50

4C083AD411

4C083CC02

4C083CC19

4C083CC31

4C083EE16

4C083EE17

4C083FF01

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA11

4H045BA12

4H045CA51

4H045EA15

4H045FA70

4H045FA73

(57)【要約】

本願は、保湿機能を持つセリシンペプチド及びその製造方法並びに使用を提供する。本願の第１の態様は、保湿機能を持つセリシンペプチドを提供し、前記セリシンペプチドの組成には、少なくともペプチド断片ＧＧＳ、ＡＳ及びＧＳが含まれており、前記セリシンペプチドの質量を基準にすると、前記ペプチド断片ＧＧＳの含有量は０．８０％以上であり、前記ペプチド断片ＡＳの含有量は０．２０％以上であり、前記ペプチド断片ＧＳの含有量は０．５０％以上である。本願によって提供されるセリシンペプチドは、ＧＧＳ、ＡＳ及びＧＳの３種類の機能性ペプチド断片を含有しており、明らかな保湿効果を有する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

保湿機能を持つセリシンペプチドであって、前記セリシンペプチドの組成には、少なくともペプチド断片ＧＧＳ、ペプチド断片ＡＳ及びペプチド断片ＧＳが含まれており、
前記セリシンペプチドの質量を基準にすると、前記ペプチド断片ＧＧＳの含有量は０．８０％以上であり、前記ペプチド断片ＡＳの含有量は０．２０％以上であり、前記ペプチド断片ＧＳの含有量は０．５０％以上である、セリシンペプチド。

【請求項2】

前記セリシンペプチドのタンパク質の含有量は８５％以上であり、遊離アミノ酸の含有量は５％以下であり、酸可溶性タンパク質の含有量は８０％以上であり、相対分子量が１０００以下の成分の含有量は８５％以上である、請求項１に記載のセリシンペプチド。

【請求項3】

前記セリシンペプチドは、無蛹繭（蛹の入っていない繭、以下、無蛹繭という）を原料として、セリシン溶出、発酵、酵素加水分解、吸着脱色、乾燥処理をこの順に経て得られるものであり、
前記発酵では、トルラ酵母を使用し、
前記酵素加水分解は、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼを使用して酵素加水分解を行うことを含む、請求項１又は２に記載のセリシンペプチド。

【請求項4】

１）無蛹繭からセリシンを溶出して、セリシン溶液を得るステップと、
２）トルラ酵母を使用して前記セリシン溶液を発酵させ、発酵終了後、セリシン発酵液を得るステップと、
３）前記セリシン発酵液にアルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼを加えて酵素加水分解を行い、酵素加水分解終了後、セリシン酵素加水分解液を得るステップと、
４）前記セリシン酵素加水分解液に活性炭を加えて吸着脱色処理を行い、処理終了後に濾液を回収し、前記濾液を乾燥して前記セリシンペプチドを得るステップとを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のセリシンペプチドの製造方法。

【請求項5】

ステップ１）は、具体的には、質量比１：１０～３０で無蛹繭と純水を混合し、１１０～１２５℃で１０～９０分間処理することにより、前記無蛹繭からセリシンを溶出して、前記セリシン溶液を得ることを含む、請求項４に記載の製造方法。

【請求項6】

１グラムの前記無蛹繭あたり、前記トルラ酵母のコロニー数は、１０^５～１０^７個である、請求項４に記載の製造方法。

【請求項7】

前記発酵の温度は、２８～３２℃であり、時間は、３６～７２時間である、請求項４又は６に記載の製造方法。

【請求項8】

１グラムの前記無蛹繭あたり、前記アルカリプロテアーゼの酵素活性は、３０００～６０００Ｕであり、前記中性プロテアーゼの酵素活性は、５００～１５００Ｕである、請求項４に記載の製造方法。

【請求項9】

前記酵素加水分解の温度は、４５～５５℃であり、前記酵素加水分解の時間は、４～６時間である請求項４又は８に記載の製造方法。

【請求項10】

請求項１～３のいずれか１項に記載のセリシンペプチドの、保湿製品における使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本願は、保湿機能を持つセリシンペプチド及びその製造方法並びに使用に関し、シルクプロテイン加工の技術分野に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、シルクは主に紡績材料として使用されてきており、シルクのタンパク質含有量は９８％以上に達している。１９７０年代末から、研究者はシルクの新たな用途に目を向けるようになり、これまでに、シルクは日用化工品、医薬品及び生体材料、健康機能食品などの分野において様々な程度に利用されてきているため、シルクプロテインについての開発は近年、研究の焦点になっている。

【0003】

シルクプロテインは、主に、シルクフィブロイン及びセリシンを含み、そのうち、シルクフィブロインの質量はシルクプロテインの総質量の７０～８０％を占めており、それは水又はエタノールに溶けず、緻密で秩序のある凝集構造を有するため、溶解させるのに高極性溶媒で構造を破壊しなければならない。セリシンの質量はシルクプロテインの総質量の２０～３０％を占めており、セリシンは、球状タンパク質であり、相対分子量が１万４０００～３１万４０００で、１８種類のアミノ酸からなる。そのうち、セリンの含有量は約３０％と最も高く、水に溶けやすいだけでなく、良好な吸湿性を有する。セリシンについての研究が深まるにつれて、セリシンは良好な細胞親和性と生体適合性を有するとともに、チロシナーゼ阻害活性、抗紫外線活性、保湿・美容・ヘアケアなどの機能を有することが分かった。

【0004】

セリンは、人体の皮膚の中に天然に存在する保湿因子で、良好な水分子吸収機能を有するため、化粧品で基礎的な保湿剤として存在するのが一般的であり、セリンに富むセリシン又はシルクプロテインは、天然的な保湿性という構造上の優位性を有するとともに、天然的なタンパク質栄養及びスキンケアの機能特性を有するため、保湿機能性化粧品の原料の開発において可能性を秘めている。

【0005】

現在、シルクプロテインに対する高度加工の方法は、高温高圧でセリシンを除去し、酸又は塩基を用いる加水分解でシルクフィブロインペプチドを得ること、又は酸／塩基複合酵素加水分解を用いてシルクプロテインを処理することでシルクプロテインペプチドを製造することに集中しており、このような方法から得るシルクフィブロインペプチド又はシルクプロテインペプチドの遊離アミノ酸の含有量が高く、１３％以上に達しており、また、酸／塩基試薬で処理するプロセスでは、有害物質が生じ又は汚染を引き起こす可能性がある。

【発明の概要】

【0006】

本願は、保湿機能を持つセリシンペプチドを提供し、当該セリシンペプチドは、特定の質量含有量で含まれている機能性ペプチド断片としての、グリシン－グリシン－セリン（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、ＧＧＳ）、アラニン－セリン（Ａｌａ－Ｓｅｒ、ＡＳ）及びグリシン－セリン（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、ＧＳ）により、保湿に関して良好な効果を現している。

【0007】

本願は、さらに、保湿機能を持つセリシンペプチドの製造方法を提供し、当該製造方法によって製造されたセリシンペプチドに特定の質量含有量で含まれている機能性ペプチド断片としての、グリシン－グリシン－セリン（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、ＧＧＳ）、アラニン－セリン（Ａｌａ－Ｓｅｒ、ＡＳ）及びグリシン－セリン（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、ＧＳ）により、保湿に関して良好な効果を現している。

【0008】

本願は、さらに、前記セリシンペプチドの、保湿製品での使用を提供する。

【0009】

本願の第１の態様は、保湿機能を持つセリシンペプチドを提供し、前記セリシンペプチドの組成には、ペプチド断片としての、ＧＧＳ、ＡＳ及びＧＳが少なくとも含まれており、
前記セリシンペプチドの質量を基準にすると、前記ペプチド断片ＧＧＳの含有量は０．８０％以上であり、前記ペプチド断片ＡＳの含有量は０．２０％以上であり、前記ペプチド断片ＧＳの含有量は０．５０％以上である。

【0010】

また、本願によって提供されるセリシンペプチドは、前記特殊なペプチド断片を備えるとともに、前記セリシンペプチドのタンパク質の含有量は８５％以上であり、遊離アミノ酸の含有量は５％以下であり、酸可溶性タンパク質の含有量は８０％以上であり、分子量が１０００以下の成分の含有量は８５％以上である。

【0011】

１つの具体的な実施形態において、前記セリシンペプチドは、無蛹繭（蛹の入っていない繭、以下、無蛹繭という）を原料として、セリシン溶出、発酵、酵素加水分解、吸着脱色、乾燥処理をこの順に経て得られるものであり、
ただし、前記発酵ではトルラ酵母を使用し、
前記酵素加水分解は、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼを使用して酵素加水分解を行うことを含む。

【0012】

本願の第２の態様は、次のステップを含む上記いずれかに記載のセリシンペプチドの製造方法を提供し、
１）無蛹繭からセリシンを溶出して、セリシン溶液を得る。
２）トルラ酵母を使用して前記セリシン溶液を発酵させ、発酵終了後、セリシン発酵液を得る。
３）前記セリシン発酵液にアルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼを加えて酵素加水分解を行い、酵素加水分解終了後、セリシン酵素加水分解液を得る。
４）前記セリシン酵素加水分解液に活性炭を加えて吸着脱色処理を行い、処理終了後に濾液を回収し、前記濾液を乾燥して前記セリシンペプチドを得る。

【0013】

１つの具体的な実施形態において、図１は、本願の一実施例によって提供されるセリシンペプチドの製造方法のフローチャートであり、図１に示されるとおり、当該方法は、具体的には、次のステップを含む。
ステップ１）無蛹繭からセリシンを溶出して、セリシン溶液を得る。
無蛹繭の市販品を原料として、質量比１：１０～３０で無蛹繭と純水を混合し、１１０～１２５℃で１０～９０分間処理し、処理する過程で、繭からセリシンが純水に溶出されて、セリシン溶液を得る。

【0014】

ステップ２）トルラ酵母を使用して前記セリシン溶液を発酵させ、発酵終了後、セリシン発酵液を得る。
ステップ１）で得られたセリシン溶液を滅菌し、滅菌は、当分野の通常の技術的手段で行ってもよく、例えば、１１５～１２１℃で１５～３０分間滅菌し、滅菌の前に、セリシン溶液を濃縮してもよく、具体的には、ロータリーエバポレーターを用いて、一部の水分を除去してもよい。

【0015】

滅菌終了後、セリシン溶液にトルラ酵母を加えて発酵させ、トルラ酵母が成長・代謝するプロセスは豊な短鎖ペプチド及び酵素を生成することができるため、次のステップの酵素加水分解プロセスで酵素系を豊かにするのに役立つとともに、繭自身では生成できない外因性ペプチドを提供し、また、トルラ酵母は厳格な好気的条件下でエタノールを生成しないため、良好な安全性を有し、具体的には、トルラ酵母（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）は、中国産業微生物菌種寄託管理センター（ＣＩＣＣ）より購入することができ、菌株の寄託番号はＣＩＣＣ３１１７０であり、１グラムの前記無蛹繭あたり、前記トルラ酵母のコロニー数は、１０^５～１０^７個であり、発酵の温度を２８～３２℃に限定し、シェーカーにおいて培養し、３６～７２時間発酵させ、発酵終了後、菌体を濾過し、発酵液を回収してセリシン発酵液を得る。

【0016】

ステップ３）前記セリシン発酵液にアルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼを加えて酵素加水分解を行い、酵素加水分解終了後、セリシン酵素加水分解液を得る。
セリシン発酵液にアルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼを加えて酵素加水分解を行うことにより、セリシンの中のペプチド結合を切断させて、短鎖ペプチドを得て、酵素加水分解プロセスでは、１グラムの前記無蛹繭あたり、前記アルカリプロテアーゼの酵素活性は、３０００～６０００Ｕであり、前記中性プロテアーゼの酵素活性は、５００～１５００Ｕであり、酵素加水分解の温度を４５～５５℃に限定し、時間は、４～６時間であり、酵素加水分解終了後にセリシン酵素加水分解液を得る。

【0017】

ステップ４）前記セリシン酵素加水分解液に活性炭を加えて吸着脱色処理を行い、処理終了後に濾液を回収し、前記濾液を乾燥して前記セリシンペプチドを得る。
酵素加水分解終了後、セリシン酵素加水分解液の温度を８５～９５℃に上げ、１５～２５分間の保温処理で酵素を失活させ、酵素の失活終了後、濾過して高分子タンパク質などの不溶物を除去し、具体的には、孔径が１０ＫＤ～２０ＫＤのセラミック膜を使用してもよく、上澄みを回収し、上澄みに活性炭を加えて吸着脱色処理を行って、上澄みの中の色素を吸着し、吸着処理終了後、活性炭を除去し、濾液を回収し乾燥してセリシンペプチドを得て、乾燥はスプレードライヤにおいて行ってもよく、入口空気温度を１２０～１４０℃に、出口空気温度を８０～１００℃に限定する。

【0018】

本願の第３の態様は、上記のいずれかに記載のセリシンペプチドの、保湿製品における使用を提供する。

【0019】

本願によって提供されるセリシンペプチドは、機能性ペプチド断片としてのＧＧＳ、ＡＳ及びＧＳを明確に含有しており、且つペプチド断片ＧＧＳの含有量は０．８０％以上であり、ペプチド断片ＡＳの含有量は０．２０％以上であり、ペプチド断片ＧＳの含有量は０．５０％以上であり、明らかな保湿効果を有することが試験より証明されている。

【発明の効果】

【0020】

本願を実施すると、少なくとも以下の利点が得られる。
１．本願によって提供されるセリシンペプチドは、機能性ペプチド断片としてのＧＧＳ、ＡＳ及びＧＳを明確に含有しており、且つペプチド断片ＧＧＳの含有量は０．８０％以上であり、ペプチド断片ＡＳの含有量は０．２０％以上であり、ペプチド断片ＧＳの含有量は０．５０％以上であり、明らかな保湿効果を有する。

【0021】

２．本願によって提供されるセリシンペプチドの製造プロセスでは、酸、塩基を使用して処理する必要がなく、グリーンで環境面の配慮があるという特徴がある。

【図面の簡単な説明】

【0022】

本願の実施例又は従来技術における技術的解決手段を一層明瞭に説明するために、以下、実施例又は従来技術の説明で使用すべき図面を簡単に紹介する。以下に説明される図面は本願の一部の実施例であることは自明であり、当業者にとって、創造的な作業をすることなく、これらの図面から他の図面を得ることもできる。

【図1】本願の一実施例によって提供されるセリシンペプチドの製造方法のフローチャートである。

【図2】本願の実施例及び比較例１～４によって提供されるセリシンペプチドの保湿率の試験結果である。

【図3a】ＧＧＳ標準物質のクロマトグラフィー検出結果である。

【図3b】ＧＧＳの標準曲線である。

【図4a】ＡＳ標準物質のクロマトグラフィー検出結果である。

【図4b】ＡＳの標準曲線である。

【図5a】ＧＳ標準物質のクロマトグラフィー検出結果である。

【図5b】ＧＳの標準曲線である。

【図6a】本願の実施例によって提供されるセリシンペプチドの中のＧＧＳのクロマトグラフィー検出結果である。

【図6b】本願の実施例によって提供されるセリシンペプチドの中のＡＳのクロマトグラフィー検出結果である。

【図6c】本願の実施例によって提供されるセリシンペプチドの中のＧＳのクロマトグラフィー検出結果である。

【図7a】本願の比較例１によって提供されるセリシンペプチドの中のＧＧＳのクロマトグラフィー検出結果である。

【図7b】本願の比較例１によって提供されるセリシンペプチドの中のＡＳのクロマトグラフィー検出結果である。

【図7c】本願の比較例１によって提供されるセリシンペプチドの中のＧＳのクロマトグラフィー検出結果である。

【図8a】本願の比較例２によって提供されるセリシンペプチドの中のＧＧＳのクロマトグラフィー検出結果である。

【図8b】本願の比較例２によって提供されるセリシンペプチドの中のＡＳのクロマトグラフィー検出結果である。

【図8c】本願の比較例２によって提供されるセリシンペプチドの中のＧＳのクロマトグラフィー検出結果である。

【図9a】本願の比較例３によって提供されるセリシンペプチドの中のＧＧＳのクロマトグラフィー検出結果である。

【図9b】本願の比較例３によって提供されるセリシンペプチドの中のＡＳのクロマトグラフィー検出結果である。

【図9c】本願の比較例３によって提供されるセリシンペプチドの中のＧＳのクロマトグラフィー検出結果である。

【図10a】本願の比較例４によって提供されるセリシンペプチドの中のＧＧＳのクロマトグラフィー検出結果である。

【図10b】本願の比較例４によって提供されるセリシンペプチドの中のＡＳのクロマトグラフィー検出結果である。

【図10c】本願の比較例４によって提供されるセリシンペプチドの中のＧＳのクロマトグラフィー検出結果である。

【図11】本願の実施例によって提供されるセリシンペプチド及び特徴的なペプチド断片の保湿率の試験結果である。

【発明を実施するための形態】

【0023】

本願の目的、技術的解決手段及び利点を一層明瞭にするために、以下、本願の実施例を参照して、本願の実施例に係る技術的解決手段を明瞭、かつ完全に説明する。説明される実施例は全ての実施例ではなく、本願の実施例の一部であることは自明である。当業者は、本願の実施例に基づいて創造的な作業をせずに得る他の全ての実施例は、いずれも本願の請求範囲に属する。

【0024】

以下の実施例及び比較例で使用する無蛹繭は購入するものであり、トルラ酵母（Ｃａｎｄｉｄａｕｔｉｌｉｓ）は中国産業微生物菌種寄託管理センター（ＣＩＣＣ）より購入し、菌株の寄託番号はＣＩＣＣ３１１７０であり、アルカリプロテアーゼはｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入し、中性プロテアーゼは広西南寧▲ボウ▼博生物工程有限公司より購入し、活性炭は広東華一活性炭股▲フン▼有限公司より購入し、水酸化ナトリウムは西隴化工股▲フン▼有限公司より購入する。

【0025】

（実施例）
本実施例によって提供されるセリシンペプチドの製造方法は、ステップ１～ステップ４を含む。
ステップ１において、１００ｇの無蛹繭を秤量し、破砕機に入れて破砕し純水で洗浄して、表面のホコリ及び不純物を除去し、洗浄用水を除去した後、質量比１：２０で純水と混合し、１２１℃で３０分間保圧処理し、処理終了後、不溶物を除去して上澄みを回収する。
ロータリーエバポレーターを用いて上澄みを濃縮し、温度を８０℃に、真空度を－０．１ＭＰａに限定し、溶液中の水を半分蒸発した後、残りの溶液を取り出して、残りの溶液を１２１℃で１５分間滅菌して、セリシン溶液を得る。

【0026】

ステップ２において、セリシン溶液の温度を２８～３２℃に限定し、活性化後で菌数が１０^８であるトルラ酵母（１０^６／ｇ無蛹繭に相当する）を加え、シェーカーにおいて２００ｒｐｍで４８時間持続的に発酵させ、発酵終了後にセリシン発酵液を得る。

【0027】

ステップ３において、ＮａＯＨ溶液を使用してセリシン発酵液のｐＨを９．０に調整し、続いてまたアルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼを加え、且つ１グラムの無蛹繭あたり、加えたアルカリプロテアーゼの酵素活性は５０００Ｕであり、加えた中性プロテアーゼの酵素活性は１０００Ｕであり、５０℃で６時間酵素加水分解し、酵素加水分解終了後、セリシン酵素加水分解液を得る。

【0028】

ステップ４において、セリシン酵素加水分解液の温度を９５℃に上げ、１５分間の保温でプロテアーゼを失活させ、孔径が１０ＫＤのセラミック膜を用いてセリシン酵素加水分解液を濾過し、上澄みを回収して濃縮し、具体的には、ロータリーエバポレーターを用いてもよく、温度を８０℃に、真空度を－０．１ＭＰａに設定し、濾液中の水を９２０ｍＬ回転蒸発する。

【0029】

残りの原料液を取り出して７０℃に上げ、４ｇの活性炭を加えて、７０℃で１時間撹拌して、吸着脱色処理を行い、処理終了後、活性炭を除去し、上澄みを回収し、
上澄みをスプレードライヤ（ＢＨ－１００圧力スプレードライヤ、江蘇博鴻）に送って噴霧乾燥を行い、入口空気温度を１４０℃に、出口空気温度を９０℃に限定して、セリシンペプチドを得る。

【0030】

（比較例１）
本比較例によって提供される方法は実施例を参照することができ、相違点は、ステップ３で、酵素加水分解の時間は４時間であることであり、具体的には、ＮａＯＨ溶液を使用してセリシン発酵液のｐＨを９．０に調整すると同時に、アルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼを加えて、５０℃で４時間酵素加水分解し、酵素加水分解終了後にセリシン酵素加水分解液を得る。

【0031】

（比較例２）
本比較例によって提供される方法は実施例を参照することができ、相違点は、ステップ３で、アルカリプロテアーゼだけを使用して酵素加水分解を行うことであり、具体的には、ＮａＯＨ溶液を使用してセリシン発酵液のｐＨを９．０に調整し、アルカリプロテアーゼを加えて、５０℃で６時間酵素加水分解し、酵素加水分解終了後にセリシン酵素加水分解液を得る。

【0032】

（比較例３）
本比較例によって提供される方法は実施例を参照することができ、相違点は、ステップ３で、アルカリプロテアーゼだけを使用して酵素加水分解を行うことであり、具体的には、ＮａＯＨ溶液を使用してセリシン発酵液のｐＨを９．０に調整し、アルカリプロテアーゼを加えて、５０℃で４時間酵素加水分解し、酵素加水分解終了後にセリシン酵素加水分解液を得る。

【0033】

（比較例４）
本比較例によって提供される方法は実施例を参照することができ、相違点は、ステップ３で、中性プロテアーゼだけを使用して酵素加水分解を行うことであり、具体的には、ＮａＯＨ溶液を使用してセリシン発酵液のｐＨを９．０に調整し、中性プロテアーゼを加えて、５０℃で４時間酵素加水分解し、酵素加水分解終了後にセリシン酵素加水分解液を得る。

【0034】

（１）実施例及び比較例１～４によって提供されるセリシンペプチドに対し物理的及び化学的指標を検出し、検出方法は次のとおりである。検出結果は表１を参照する。
１．水分及び灰分の検出：国家標準法ＧＢ５００９．３－２０１０を採用して水分の含有量を測定し、国家標準法ＧＢ５００９．４－２０１６を採用して灰分の含有量を測定する。

【0035】

２．タンパク質、ペプチド含有量、遊離アミノ酸の検出：国家標準法ＧＢ５００９．５－２０１０を採用してタンパク質（乾燥基準）の含有量を測定し、国家標準法ＧＢ２２７２９－２００８を参照して酸可溶性タンパク質の含有量、遊離アミノ酸の含有量及びペプチドの含有量を測定する。

【0036】

３．分子量の異なる成分の分布検出：アミノ酢酸－アミノ酢酸－アミノ酢酸（分子量１８９）、アミノ酢酸－アミノ酢酸－チロシン－アルギニン（分子量４５１）、サブチラーゼ（分子量１４５０）、アプロチニン（分子量６５００）、シトクロムＣ（分子量１２５００）の５種類のペプチド標準物質をそれぞれ０．１％（Ｍ／Ｖ）の溶液として調製し、孔径０．２μｍのポリテトラフルオロエチレンフィルター膜で濾過した後、高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ－２０ＡＤ型高速液体クロマトグラフィー、日本島津会社）に注入して分析し、移動相は、Ｖ（アセトニトリル）：Ｖ（水）：Ｖ（トリフルオロ酢酸）＝４５：５５：０．１であり、注入量は、１０μＬであり、流速は、０．５ｍＬ／分であり、検出波長は、２２０ｎｍであり、カラム温度は、３０℃であり、紫外線検出器を用いて検出し、ＧＰＣソフトウェアを用いてデータを処理する。サンプルのクロマトグラフィーデータを検量線方程式に代入して計算し、サンプルのペプチド分子量及びその分布範囲を得ることができる。ピーク面積正規化法を用いて分子量範囲の異なる成分の相対パーセンテージを算出できる。

【0037】

【表1】

【0038】

表１から分かるように、実施例によって提供されるセリシンペプチドのペプチドの含有量は高く、相対分子量が１０００以下の成分の割合が低く、また、既存のシルクフィブロインペプチド又はシルクプロテインペプチド製品よりも遊離アミノ酸の含有量が低いため、人体で吸収しやすい。

【0039】

（２）実施例及び比較例１～４によって提供されるセリシンペプチドの保湿特性を検出し、検出方法は次のとおりである。
硫酸アンモニウム（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４（分析グレード、上海試薬一厂）を水に溶解して飽和硫酸アンモニウム（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４水溶液を調製し、空のデシケーターの中に置いて相対湿度（Ｒ．Ｈ．）８１％の環境をシミュレートする。被験サンプルを質量濃度２％の水溶液として調製し、純水、２％のセリン、２％のグリセリン、５％のグリセリン、０．５％のＨＡを対照群とし、それぞれ秤量してＷ_０と記し、２００μＬを吸い上げて３Ｍテープを貼付した時計皿に加え、それぞれ、４時間、８時間の後に質量を秤量して、Ｗ_ｎと記し、算式：保湿率（％）＝（Ｗ_ｎ－Ｗ_０）÷Ｗ_０×１００％より保湿率を算出し、試験結果は、平均値±標準偏差で表され、テューキー法（Ｔｕｋｅｙ’ｓ Ｍｅｔｈｏｄ）を採用してデータを分析し、ｐ＜０．０５は有意差があることを表す。多重比較のアルファベット付け法を採用し、同じアルファベットを付けるものは有意差がなく、異なるアルファベットを付けるものは有意差があり、試験結果について図２を参照する。

【0040】

図２に示されるとおり、相対湿度（Ｒ．Ｈ．）８１％の環境で、４時間と８時間静置し、純水を陰性対照とすると、実施例によって提供されるセリシンペプチドの保湿率は、純水、比較例１～４といずれも有意差があり、且つ実施例のセリシンペプチドの保湿率は同じ濃度のグリセリンよりも高いが、同等な濃度のセリン、２％及び５％のグリセリン、０．５％のＨＡと有意差がなく、このことは、実施例によって提供されるセリシンペプチドは２％のセリン溶液、２％のグリセリン、５％のグリセリン及び５％のＨＡと同等な保湿効果を有することを示している。

【0041】

（３）実施例及び比較例１～４によって提供されるセリシンペプチドの特徴的な構造を同定し、同定方法は次のとおりである。
ＧＧＳ、ＡＳ及びＧＳ標準物質の粉末をそれぞれ正確に２０．０ｍｇ秤量し（いずれも蘇州強耀生物科技有限公司より購入し、純度は全て９８％以上である）、水を加えて溶解し、ボルテックス混合して均一とし、１００ｍＬに定容して、２００μｇ／ｍＬの標準原液を得る。前記標準原液をそれぞれ５００μＬ取り出し、１０ｍＬに定容して、１０μｇ／ｍＬの混合標準中間作業溶液を得る。前記混合標準中間作業溶液を純水で段階的に希釈して１．９５、３．９１、７．８１、１５．６３、３１．２５、６２．５、１２５、２５０及び５００ｎｇ／ｍＬのシリーズ標準作業溶液を得る。

【0042】

純水を用いてペプチドサンプルを２０．０ｍｇ／ｍＬとして調製し、純水で１０^３倍希釈して、被験物を得る。

【0043】

超高速液体クロマトグラフィーＮｅｘｅｒａＸ２とトリプル四重極質量分析計を併用するシステム（島津、日本）を用いて試験し、当該システムは、具体的には、ＬＣ－３０ＡＤ×２輸液ポンプと、ＳＩＬ－３０ＡＣオートサンプラーと、ＣＴＯ－２０ＡＣカラムサーモスタットと、ＣＢＭ－２０Ａシステムコントローラと、ＬＣＭＳ－８０６０トリプル四重極質量分析計と、ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｖｅｒ．５．９１クロマトグラフィーワークステーションとを含む。ＸＳ２０５ＤＵ分析天びん（ＭｅｔｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏ、米国）、ＱＬ－９０１ボルテックスミキサー（其林貝爾儀器製造有限公司、中国）。

【0044】

液体クロマトグラフィーの条件：クロマトグラフィーカラム：ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ－３（５μｍ、２．１×２５０ｍｍ）、移動相：Ａ ０．１％ギ酸水溶液、Ｂ ０．１％ギ酸アセトニトリル溶液、勾配溶出プログラム：０～１５分 Ｂ０～５０％、１５～２０分 Ｂ５０～１００％、２０～２５分 Ｂ１００％、２５．１～３５分 Ｂ０％、流速：０．２ｍＬ／分、注入量：５μＬ、カラム温度：４０℃。

【0045】

質量分析の条件：イオン化モード：ＥＳＩ、陽イオンモード、イオン噴霧電圧：＋４．５ｋＶ、霧化ガス流速：窒素３．０Ｌ／分、加熱ガス流速：窒素１０Ｌ／分、乾燥ガス流速：窒素１０Ｌ／分、ＤＬ温度：２５０℃、加熱モジュール温度：４００℃、イオン源温度：３００℃、スキャンモード：多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、保持時間：１００ミリ秒、遅延時間：３ミリ秒。ＭＲＭパラメータは、表２を参照する。

【0046】

【表2】

【0047】

図３ａ～図５ｂは、それぞれ、ＧＧＳ、ＡＳ及びＧＳ標準物質のクロマトグラフィー検出結果及び標準曲線であり、図６ａ～図１０ｃは、それぞれ、実施例及び比較例１～４によって提供されるセリシンペプチドの中の各特徴的なペプチド断片のクロマトグラフィー検出結果であり、図３ａ～図１０ｃから分かるように、実施例及び比較例１～３はいずれも３種類の特徴的なペプチド断片を含有しているが、比較例４はわずかな特徴的なペプチド断片ＧＧＳ及びＧＳだけを含有しており、標準曲線から各群のセリシンペプチドの中の特徴的な構造の含有量を計算し、計算結果は、表３を参照する。

【0048】

【表3】

【0049】

表３から分かるように、比較例１～４と比べて、実施例によって提供されるセリシンペプチドは３種類の特徴的なペプチド断片ＧＧＳ、ＡＳ及びＧＳを同時に備え、且つ含有量は比較例１～４より明らかに優れることから、実施例によって提供される製造方法は、シルクプロテインを効果的に酵素加水分解することができ、３種類の特徴的なペプチド断片ＧＧＳ、ＡＳ及びＧＳを効果的に得ることができるということが示される。

【0050】

（４）実施例及び比較例１～４によって提供されるセリシンペプチドの特徴的な構造の機能を評価し、評価方法は次のとおりである。
ＧＧＳ、ＡＳ、ＧＳの３種類の特徴的なペプチド断片の標準物質及び実施例によって提供されるセリシンペプチドを０．４％の水溶液として調製し、（２）から提供される保湿機能の評価方法で保湿率試験を実施し、試験結果は、図１１に示すとおりである。

【0051】

図１１に示されるとおり、純水を陰性対照とすると、実施例によって提供されるセリシンペプチドは一定の保湿機能を有しており、且つ、セリシンペプチドとペプチド断片ＧＧＳ、ＡＳ、ＧＳは４時間と８時間の静置後の保湿率の変化傾向が一致することから、本実施例によって提供される製造方法は、シルクプロテインの中の３種類のペプチド断片ＧＧＳ、ＡＳ、ＧＳを良く保持しているため、相応の保湿機能を有することが示される。

【0052】

なお、上記の各実施例は本願の技術的解決手段を説明するものに過ぎず、限定するものではなく、前記各実施例を参照して本願を詳細に説明しているが、当業者に自明なように、依然として前記各実施例に記載されている技術的解決手段を補正し、又はその一部若しくは全ての技術的特徴について同等な置換を行うことができ、これらの補正又は置換により、その対象となる技術的解決手段の趣旨が本願の各実施例の技術的解決手段の範囲から逸脱することはない。

【0053】

本願は、２０２２年８月２５日に中国国家知識産権局に提出された、出願番号が２０２２１１０２２２１７．３で、出願の名称が「保湿機能を持つセリシンペプチド及びその製造方法並びに使用」である中国特許出願の優先権を主張し、それは全体として参照により本願に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3a】

【図3b】

【図4a】

【図4b】

【図5a】

【図5b】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図7a】

【図7b】

【図7c】

【図8a】

【図8b】

【図8c】

【図9a】

【図9b】

【図9c】

【図10a】

【図10b】

【図10c】

【図11】

【手続補正書】

【提出日】2023-07-31

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0043】

超高速液体クロマトグラフィーＮｅｘｅｒａＸ２とトリプル四重極質量分析計を併用するシステム（島津、日本）を用いて試験し、当該システムは、具体的には、ＬＣ－３０ＡＤ×２輸液ポンプと、ＳＩＬ－３０ＡＣオートサンプラーと、ＣＴＯ－２０ＡＣカラムサーモスタットと、ＣＢＭ－２０Ａシステムコントローラと、ＬＣＭＳ－８０６０トリプル四重極質量分析計と、ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｖｅｒ．５．９１クロマトグラフィーワークステーションとを含む。ＸＳ２０５ＤＵ分析天びん（ＭｅｔｔｌｅｒＴｏｌｅｄｏ、米国）、ＱＬ－９０１ボルテックスミキサー（其林貝爾儀器製造有限公司、中国）をさらに含む。

【手続補正2】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

保湿機能を持つセリシンペプチドであって、前記セリシンペプチドの組成には、少なくともペプチド断片ＧＧＳ、ペプチド断片ＡＳ及びペプチド断片ＧＳが含まれており、
前記セリシンペプチドの質量を基準にすると、前記ペプチド断片ＧＧＳの含有量は０．８０％以上であり、前記ペプチド断片ＡＳの含有量は０．２０％以上であり、前記ペプチド断片ＧＳの含有量は０．５０％以上である、セリシンペプチド。

【請求項2】

前記セリシンペプチドのタンパク質の含有量は８５％以上であり、遊離アミノ酸の含有量は５％以下であり、酸可溶性タンパク質の含有量は８０％以上であり、相対分子量が１０００以下の成分の含有量は８５％以上である、請求項１に記載のセリシンペプチド。

【請求項3】

前記セリシンペプチドは、無蛹繭（蛹の入っていない繭、以下、無蛹繭という）を原料として、セリシン溶出、発酵、酵素加水分解、吸着脱色、乾燥処理をこの順に経て得られるものであり、
前記発酵では、トルラ酵母を使用し、
前記酵素加水分解は、アルカリプロテアーゼ、中性プロテアーゼを使用して酵素加水分解を行うことを含む、請求項１に記載のセリシンペプチド。

【請求項4】

１）無蛹繭からセリシンを溶出して、セリシン溶液を得るステップと、
２）トルラ酵母を使用して前記セリシン溶液を発酵させ、発酵終了後、セリシン発酵液を得るステップと、
３）前記セリシン発酵液にアルカリプロテアーゼ及び中性プロテアーゼを加えて酵素加水分解を行い、酵素加水分解終了後、セリシン酵素加水分解液を得るステップと、
４）前記セリシン酵素加水分解液に活性炭を加えて吸着脱色処理を行い、処理終了後に濾液を回収し、前記濾液を乾燥して前記セリシンペプチドを得るステップとを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のセリシンペプチドの製造方法。

【請求項5】

ステップ１）は、具体的には、質量比１：１０～３０で無蛹繭と純水を混合し、１１０～１２５℃で１０～９０分間処理することにより、前記無蛹繭からセリシンを溶出して、前記セリシン溶液を得ることを含む、請求項４に記載の製造方法。

【請求項6】

１グラムの前記無蛹繭あたり、前記トルラ酵母のコロニー数は、１０^５～１０^７個である、請求項４に記載の製造方法。

【請求項7】

前記発酵の温度は、２８～３２℃であり、時間は、３６～７２時間である、請求項４に記載の製造方法。

【請求項8】

１グラムの前記無蛹繭あたり、前記アルカリプロテアーゼの酵素活性は、３０００～６０００Ｕであり、前記中性プロテアーゼの酵素活性は、５００～１５００Ｕである、請求項４に記載の製造方法。

【請求項9】

前記酵素加水分解の温度は、４５～５５℃であり、前記酵素加水分解の時間は、４～６時間である請求項４に記載の製造方法。

【請求項10】

請求項１～３のいずれか１項に記載のセリシンペプチドの、保湿製品における使用。

【国際調査報告】