特表 2024-533942 軽度認知障害を診断するための方法とキット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-18

(54)【発明の名称】軽度認知障害を診断するための方法とキット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20240910BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240910BHJP

   C12Q 1/00 20060101ALI20240910BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20240910BHJP

   C07K 14/46 20060101ALN20240910BHJP

   C07K 7/08 20060101ALN20240910BHJP

   C07K 16/24 20060101ALN20240910BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240910BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68 ZNA

G01N33/53 D

G01N33/53 Y

C12Q1/00 C

G01N33/50 K

C07K14/46

C07K7/08

C07K16/24

C07K16/28

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024502464

(86)(22)【出願日】2022-07-15

(85)【翻訳文提出日】2024-01-15

(86)【国際出願番号】 US2022073799

(87)【国際公開番号】W WO2023288318

(87)【国際公開日】2023-01-19

(31)【優先権主張番号】63/222,463

(32)【優先日】2021-07-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524019542

【氏名又は名称】亞東紀念醫院

【氏名又は名称原語表記】ＦＡＲ ＥＡＳＴＥＲＮ ＭＥＭＯＲＩＡＬ ＨＯＳＰＩＴＡＬ

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．２１，Ｓｅｃｔｉｏｎ ２，Ｎａｎｙａ Ｓ．Ｒｏａｄ，Ｂａｎｑｉａｏ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｎｅｗ Ｔａｉｐｅｉ Ｃｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎ

(74)【代理人】

【識別番号】110001508

【氏名又は名称】弁理士法人 津国

(72)【発明者】

【氏名】邱彦霖

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045CA18

2G045CA20

2G045CA25

2G045CA26

2G045CB01

2G045CB03

2G045CB04

2G045CB07

2G045CB08

2G045CB11

2G045CB12

2G045CB17

2G045CB30

4B063QA01

4B063QA07

4B063QQ02

4B063QQ79

4B063QR48

4B063QS33

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA17

4H045BA19

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA50

(57)【要約】

アミロイドβペプチドまたはその断片で対象から得られた生体サンプル中のＴ細胞を刺激すること、およびアミロイドβペプチドまたはその断片に対するＴ細胞応答の大きさを評価することを含む、軽度認知障害（ＭＣＩ）に罹患するかまたはそのリスクを有する対象を診断するための方法が提供される。また、この方法を利用してＭＣＩを診断するためのキットも提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

アミロイドβペプチドまたはその断片で、対象から得られた生体サンプル中のＴ細胞を刺激すること、および
アミロイドβペプチドまたはその断片に対するＴ細胞応答の大きさを評価すること
を含む、
軽度認知障害（ＭＣＩ）に罹患するかまたはそのリスクを有する対象を診断するための方法。

【請求項2】

前記評価は、刺激されたＴ細胞からのバイオマーカーのレベルを測定することを含み、前記バイオマーカーは、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＴＮＦαおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記評価は、刺激されたＴ細胞からのＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２およびＴＮＦαのうちの少なくとも２つのレベルを測定することを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記評価は、バイオマーカーの測定されたレベルを参照レベルと比較することをさらに含み、参照レベルと比較してバイオマーカーのレベルが高いことは、対象がＭＣＩに罹患しているかまたはそのリスクを有する可能性が高いことを示す、請求項２に記載の方法。

【請求項5】

前記バイオマーカーは、ＣＤ４＋Ｔ細胞から発現される、請求項２に記載の方法。

【請求項6】

前記生体サンプルは、組織サンプルまたは流体生体サンプルである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記生体サンプルは、前記対象の血液、血漿、血清、尿、喀痰、唾液、脳脊髄液、汗、便抽出物、涙、腹膜液または脳から得られる、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記Ｔ細胞は、生体サンプル由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に存在する、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記アミロイドβペプチドは、配列番号１または配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記アミロイドβペプチドの断片は、配列番号１または配列番号１２で表されるアミノ酸配列の少なくとも９個の連続するアミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記アミロイドβペプチドの断片は、配列番号２～１１のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記刺激は、Ｔ細胞をアミロイドβペプチドまたはその断片とともに少なくとも３時間インキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記対象は、哺乳動物である、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、サル、げっ歯動物、ネズミ、ウサギおよびモルモットからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

アミロイドβペプチド、その断片もしくは凝集体関連治療の応答、副作用またはそれらの組み合わせをモニタリングするために使用される、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

アミロイドβペプチド、その断片もしくは凝集体関連治療の有効性を予測するために使用される、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

アミロイドβペプチド、その断片もしくは凝集体関連治療の治療決定を導くために使用される、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記凝集体関連治療は、モノクローナル抗体療法である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記副作用は、脱力感、頭痛、発熱、悪寒、吐き気、嘔吐、下痢、発疹、低血圧およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。

【請求項20】

アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、脳アミロイド血管症、炎症性脳アミロイド血管症および脳アミロイドーマからなる群から選択される少なくとも１つのアミロイド関連疾患をモニタリングするために使用される、請求項１に記載の方法。

【請求項21】

アミロイドβペプチドまたはその断片によって誘導されるＴ細胞応答を評価するために使用される、請求項１に記載の方法。

【請求項22】

アミロイドβペプチドまたはその断片、および
ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２およびＴＮＦαからなる群から選択される少なくとも１つのバイオマーカーに特異的な少なくとも１つの試薬
を含む、
軽度認知障害（ＭＣＩ）に罹患するかまたはそのリスクを有する対象を診断するためのキット。

【請求項23】

前記少なくとも１つの試薬は、抗原抗体相互作用に基づいて、その対応するバイオマーカーに特異的に結合する抗体である、請求項２２に記載のキット。

【請求項24】

前記アミロイドβペプチドは、配列番号１または配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のキット。

【請求項25】

前記アミロイドβペプチドの断片は、配列番号１または配列番号１２で表されるアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む、請求項２２に記載のキット。

【請求項26】

前記アミロイドβペプチドの断片は、配列番号２～１１のいずれかで表されるアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のキット。

【請求項27】

請求項１に記載の方法に従って使用するための説明書をさらに含む、請求項２２に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、軽度認知障害（ＭＣＩ）に罹患する対象を同定するための診断アッセイに関し、特に、アミロイド特異的Ｔ細胞応答を評価することによって、ＭＣＩに罹患するかまたはそのリスクを有する対象を診断するための方法およびキットに関する。

【背景技術】

【0002】

神経変性疾患は、ニューロンの機能が徐々に低下するときに発生する。ニューロン機能が時間の経過とともに低下するため、会話、バランス、運動などに関連する活動などの調整機能に軽度の問題が発生し始めることがある。変性疾患は、神経細胞の一部が機能を失い、最終的に死滅するまでは明らかではない。神経変性疾患の状態と障害は多様であり、不均一である。神経変性疾患の種類に応じて、そのような状態や障害は生命の脅威となり、深刻な生活に影響を与える可能性がある。神経変性疾患の例には、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、フリードライヒ運動失調、ハンチントン病、レビー小体病、および脊髄性筋萎縮症が含まれる。

【0003】

アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および多発性硬化症（ＭＳ）を含むいくつかの神経変性疾患は、アミロイドファミリーに関連する。アルツハイマー病（ＡＤ）を例として挙げると、ＡＤは、脳内のβ－アミロイドタンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ β）の蓄積を特徴とする。認知症患者の数は、人口高齢化に伴い、２００５年の約２，６００万人から２０４０年の８，０００万人を超えるまでに世界的に急増しており、前例のない規模の公衆衛生上の課題を引き起こしている［１］。

【0004】

遺伝的リスクがあるコホートと臨床的に正常な高齢者の両方から得られた証拠は、認知症の最も一般的な形態であるアルツハイマー病（ＡＤ）の根底にある病理が、病気の発症の数年前に始まる可能性が高いことを示唆している［２］。軽度認知障害（ＭＣＩ）は、個体が軽度の認知症状を示す可能性があるものの、一般にコミュニティでは事実上正常に機能し続ける、亜臨床障害の中間状態として認識されるようになった［３～５］。現在のデータでは、ＭＣＩ患者は認知症に進行するリスクが高く、転換率は年間約１０％～１５％であることを示している［３、５］。したがって、認知機能の障害の存在をできるだけ早く認識することが重要な課題となっている。

【0005】

細胞外アミロイドβ（Ａβ）斑の蓄積に加えて、アルツハイマー病患者の死後の脳で見られる他の神経病理学的特徴としては、全身性皮質萎縮、神経細胞およびシナプスの喪失、過剰リン酸化タウからなる細胞内神経原線維変化（ＮＦＴ）などがある［６］。ニューロイメージングは、信頼できるアルツハイマー病バイオマーカーを開発する貴重な機会を提供し、生きた脳における神経病理学的特徴を直接的または間接的に視覚化できるようになる。これは、アミロイド斑をインビボで定量するためのアミロイド標識陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）トレーサーの使用において示されており、それは死後のＡＤ脳におけるアミロイド負荷のインビトロ測定と強い相関がある［７］。

【0006】

ＭＣＩ患者の約５０％～７０％は、ＡＤ患者や正常対照と比較して、中間レベルの有意な皮質アミロイドＰＥＴ貯留を示した［８、９］。ＭＣＩ患者におけるこの高いアミロイドβ負荷は、エピソード記憶能力の低下とより良い相関があることがわかる［１０，１１］。さらに、疾患進行に対するＡβ沈着の影響を評価する縦断的研究では、ベースラインでのアミロイドＰＥＴ滞留が高いＭＣＩ患者は、Ａβ負荷が低い患者よりもＡＤへの進行率が高く、感度は８３．３％～１００％の範囲であり、特異性は４１．１％～１００％であることが判明した［１２］。ＡＤの前症候期におけるＡβ病理の検出は、認知および／または神経変性に対するＡβ沈着の潜在的な影響を評価するのに役立つことができ、また、脳からのＡβの低減または除去を目的とする治療での利益を得る可能性が最も高い可能性がある個体を同定することができる。

【0007】

しかしながら、日常的な診断目的のための神経イメージングモダリティの実用性は、感度および特異性が不充分であり、また高価で労働集約的であるので、制限される。したがって、認知症が臨床的に発現されていない段階およびそのような臨床的発現の初期段階において、認知症を効率的に評価する追加試験および方法に対するニーズが満たされていないことは依然としてある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

上記を考慮して、本開示は、ＡＤのようなアミロイド関連神経変性疾患の前駆症状、すなわち、アミロイド関連神経変性疾患の開始を示す可能性のある初期症状を検出できるバイオマーカーを含む診断ツールを提供する。本開示の少なくとも１つの実施形態において、軽度認知障害（ＭＣＩ）に罹患するかまたはそのリスクを有する対象を診断するための方法が提供される。本開示の方法は、アミロイドβペプチドまたはその断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）で、対象から得られた生体サンプル（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）中のＴ細胞を刺激すること、およびアミロイドβペプチドまたはその断片に対するＴ細胞応答の大きさを評価することを含む。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、本明細書に記載の方法に使用されるためのアミロイドβペプチドまたはその断片は、完全長アミロイドタンパク質（Ａβ１－４２）に由来してもよく、前記の完全長アミロイドタンパク質（Ａβ１－４２）は、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号１２）の少なくとも一部を含むか、それらのみからなるか、または実質的にそれらからなる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法に使用されるためのアミロイドβペプチドは、アミロイドβタンパク質の完全長Ａ２１Ｇフランドル型変異体に由来してもよく、前記のアミロイドβタンパク質の完全長Ａ２１Ｇフランドル型変異体は、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＧＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号１）の少なくとも一部を含む、それらのみからなるか、または実質的にそれらからなる。それにもかかわらず、本明細書に記載の方法に使用されるためのアミロイドβペプチドまたはその断片は、当技術分野で知られている任意の完全長野生型アミロイドβタンパク質変異体に由来してもよいことに留意されたい。

【0010】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、本明細書に記載の方法に使用されるためのアミロイドβペプチドの断片は、配列番号１または配列番号１２で表される全長配列に由来してもよい。いくつかの実施形態において、アミロイドβペプチドの断片は、配列番号１または配列番号１２のアミノ酸配列の少なくとも１０個（例えば、１０～３０個、１２～２５個、および１５～２０個）の連続するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、アミロイドβペプチドの断片は、アミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱ（Ａβ１－１５、配列番号２）、ＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶ（Ａβ４－１８、配列番号３）、ＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＧ（Ａβ７－２１、配列番号４）、ＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＧＥＤＶ（Ａβ１０－２４、配列番号５）、ＨＨＱＫＬＶＦＦＧＥＤＶＧＳＮ（Ａβ１３－２７、配列番号６）、ＫＬＶＦＦＧＥＤＶＧＳＮＫＧＡ（Ａβ１６－３０、配列番号７）、ＦＦＧＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧ（Ａβ１９－３３、配列番号８）、ＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶ（Ａβ２２－３６、配列番号９）、ＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶ（Ａβ２５－３９、配列番号１０）、および／またはＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（Ａβ２８－４２、配列番号１１）を含むか、それらのみからなるか、または実質的にそれらからなる。

【0011】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、本明細書に記載の方法における刺激は、Ｔ細胞をアミロイドペプチドプールと一定期間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、アミロイドペプチドプールは、配列番号２～１１からなる群から選択される少なくとも２つ（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０個）の断片を含む。いくつかの実施形態において、この期間は、少なくとも３時間、例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１および１２時間であってもよい。

【0012】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、本明細書に記載の方法における評価は、刺激されたＴ細胞からのＴ細胞応答バイオマーカーのレベルを測定することを含み、ここで、バイオマーカーは、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＴＮＦαおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つである。いくつかの実施形態において、前記評価は、バイオマーカーの測定されたレベルを参照レベル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｌｅｖｅｌ）と比較することをさらに含み、参照レベルと比較してバイオマーカーのレベルが高いことは、対象がＭＣＩに罹患しているかまたはそのリスクを有する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、前記評価は、刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞からのＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、およびＴＮＦαのうちの少なくとも２つのレベルを測定することを含む。

【0013】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、ＭＣＩに罹患するかまたはそのリスクを有する対象を診断するためのキットも提供される。本開示のキットは、上記のアミロイドβペプチドまたはその断片、および少なくとも１つのＴ細胞応答バイオマーカーに特異的な少なくとも１つの試薬を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞応答バイオマーカーは、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２およびＴＮＦαからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記キットは、上記の方法に従って使用するための説明書をさらに含む。

【0014】

本開示では、アミロイド特異的Ｔ細胞応答の大きさを評価することにより、本明細書に記載の方法およびキットを使用して、ＭＣＩを発症するリスクを有する対象を効率的に同定することができる。本明細書で提供されるそのような同定方法は、アミロイド関連神経変性疾患が臨床的に発現していない段階またはそのような臨床発現の初期段階においての発症の予測に有用であり得る。このような疾患は、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、脳アミロイド血管症、炎症性脳アミロイド血管症、または脳アミロイドーマであり得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される同定は、アミロイドβペプチド、その断片もしくは凝集体関連治療の応答、副作用またはそれらの組み合わせをモニタリングすること、アミロイドβペプチド、その断片もしくは凝集体関連治療の有効性を予測すること、および／またはアミロイドβペプチド、その断片もしくは凝集体関連治療、例えば、モノクローナル抗体療法の治療上の決定を導くことに利用されてもよい。いくつかの実施形態において、前記副作用は、脱力感、頭痛、発熱、悪寒、吐き気、嘔吐、下痢、発疹、低血圧およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

【0015】

いくつかの実施形態において、本方法は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、脳アミロイド血管症、炎症性脳アミロイド血管症および脳アミロイドーマからなる群から選択される少なくとも１つのアミロイド関連疾患をモニタリングするために使用することができる。いくつかの実施形態において、この方法は、アミロイドβペプチドまたはその断片によって誘導されるＴ細胞応答を評価するために使用することができる。

【0016】

本発明は、添付図面を参照しながら以下の実施形態の説明を読むことにより、さらに完全に理解することができる。

【図面の簡単な説明】

【0017】

【図1】図１Ａおよび１Ｂは、アミロイドβペプチドプール特異的Ｔ細胞応答（図１Ａ）または全長アミロイドβ特異的Ｔ細胞応答（図１Ｂ）の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。ＳＳＣ－Ａ：側方散乱エリア。ＦＳＣ－Ａ：前方散乱エリア。Ｌ／Ｄ：生存／死亡。ＩＦＮｇ：インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）。ＴＮＦａ：腫瘍壊死因子α （ＴＮＦα）。

【図2】図２Ａ～２Ｆおよび図３Ａ～３Ｆは、アミロイドβペプチドプール応答（図２Ａ～２Ｆ）またはアミロイドβ全長ペプチド応答（図３Ａ～３Ｆ）についてのＴ細胞応答バイオマーカーの動作特性曲線（ＲＯＣ）分析の結果を示す。

【図3】図２Ａ～２Ｆおよび図３Ａ～３Ｆは、アミロイドβペプチドプール応答（図２Ａ～２Ｆ）またはアミロイドβ全長ペプチド応答（図３Ａ～３Ｆ）についてのＴ細胞応答バイオマーカーの動作特性曲線（ＲＯＣ）分析の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0018】

以下の実施例は、本開示を例示するために使用される。当業者であれば、本開示の明細書に基づいて、本開示の他の利点を理解することができる。本開示は、さまざまな例で説明したように実行または適用することもできる。本開示を実施するために、さまざまな態様および用途に対する本開示の範囲を逸脱することなく、以下の実施例を修正および／または変更することが可能である。

【0019】

本開示で使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「前記、上記（ｔｈｅ）」は、明示的かつ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。「または」という用語は、文脈で明確に別段の指示がない限り、「および／または」という用語と同じ意味で使用される。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」あるいは「および／または」は、包括的であると解釈され、すなわち、要素の数またはリストのうちの少なくとも１つを含むが、１つ以上のものを含むということを意味し、さらに、リストにない追加の項目も任意に含む。「…の１つのみ」や「正確に１つの…（ｅｘａｃｔｌｙ ｏｎｅ ｏｆ）」あるいは特許請求の範囲で使用される「…からなる」などの明確に反対の意味を示す用語のみが、要素の数またはリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。

【0020】

本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、前記特徴の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％以上を指す。例えば、本明細書で使用される「実質的に…からなる」という用語は、参照配列のアミノ酸の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％以上からなるペプチドを示すことがある。

【0021】

本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、組成物、方法、およびそのそれぞれの構成要素に関して使用され、これらは本開示に含まれるが、不特定の要素が含まれることも許容される。例えば、要素または作用のリストを含む組成物、混合物、プロセスまたは方法は、必ずしもそれらの要素または動作のみに限定されるわけではなく、明示的に列挙されていない、あるいはそのような組成物、混合物、プロセスまたは方法に固有の他の要素または動作を含む場合がある。

【0022】

本明細書で使用される場合、「少なくとも１つ」および「１つ以上」という語句は同じ意味を有し、１つ、２つ、３つまたはそれ以上を含んでもよい。例えば、１つ以上の要素のリストに関する「少なくとも１つ」という語句は、要素のリスト内の任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリスト内にリストされているすべての要素の少なくとも１つを必ず含む必要はなく、要素のリスト内の要素の組み合わせを除外する必要もない。この定義は、「少なくとも１つ」という語句が指す要素のリスト内で特定された要素以外の要素が、特定された要素に関連するか否かには関係なく、任意に存在することも許可する。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同等に『ＡまたはＢの少なくとも１つ』、あるいは同等に『Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ』）は、一つの実施形態においては、「少なくとも１つの（任意に複数の）Ａを含むが、Ｂは存在しない（および任意にＢ以外の要素を含む）」ということを示し；別の実施形態においては、「少なくとも１つの（任意に複数の）Ｂを含むが、Ａは存在しない（および任意にＡ以外の要素を含む）」ということを示し；さらに別の実施形態においては、「少なくとも１つの（任意に複数の）Ａと、少なくとも１つの（任意に複数の）Ｂとを含む（および任意に他の要素を含む）」ということを指すことができる。

【0023】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、一般に、所定の値または範囲の１０％、５％、１％、または０．５％以内を意味する。あるいは、「約」という用語は、当業者が考慮した場合に、平均値の許容可能な標準誤差内を意味する。他に明示的に指定しない限り、本明細書に開示される材料の量、期間の長さ、温度、動作条件、量の比などの数値範囲、量、数値およびパーセンテージはいずれも、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されるべきである。

【0024】

本明細書で使用される場合、「対象」、「個体」および「患者」という用語は交換可能であり、動物、例えば、哺乳動物を指す場合がある。例えば、「対象」という用語は、一方の性別が特に示されない限り、男性と女性の両方の性別を指す場合がある。さらに、「患者」という用語は、疾患または症状の疑いがあるかまたは罹患している「対象」を指してもよい。いくつかの実施形態において、本開示の方法で試験される対象は、ヒト、家庭動物（例えば、イヌ、ネコなど）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）または実験動物（例えば、サル、げっ歯動物（すなわち、齧歯動物、ｒｏｄｅｎｔ）、ネズミ、ウサギ、モルモットなど）であってもよい。

【0025】

本明細書で使用される場合、「生体サンプル」という用語は、以下のものを含む任意のサンプルを指す：組織サンプル（組織切片や組織の針生検など）；細胞サンプル（例えば、細胞学的塗抹標本（Ｐａｐ(パップ)や血液塗抹標本など）、または顕微解剖によって得られた細胞のサンプル）；あるいは細胞画分、断片または細胞小器官（細胞を溶解して遠心分離などによってその成分を分離することで得られるものなど）。生体サンプルの他の例としては、脳組織、全血、血清、血漿、尿、喀痰、唾液、脳脊髄液、汗、便抽出物、滑液、涙、腹膜液、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0026】

本明細書で使用される場合、「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」、「診断の（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）」および「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」という用語は、対象が所与の疾患または状態に罹患しているか否かについての確率（「尤度」）を当業者が推定および／または決定し得る方法を指す。このような診断が「確定している」ということは、診断が１００％正確であることを意味するものではない。多くのバイオマーカーは複数の状態を示す。熟練した臨床医は、情報が不足している状態でバイオマーカーの結果を使用するのではなく、診断に到達するために検査結果を他の臨床指標とともに使用する。したがって、所定の診断閾値の一方側で測定されたバイオマーカーレベルは、所定の診断閾値の他方側で測定されたレベルと比較して、対象における疾患の発生の可能性がより高いことを示し得る。

【0027】

本明細書で使用される場合、疾患の「進展（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）」または「進行（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）」という用語は、疾患の初期症状および／またはその後の進行を指す。疾患の進展は、当技術分野で周知の標準的な臨床技術を使用して検出可能であり、評価することができる。ただし、進展とは、検出できない可能性のある進行も指す。「進展」という用語には、疾患、状態、または障害の発生、再発、および発症が含まれる。本明細書で使用される場合、標的疾患、状態、または障害の「発症（ｏｎｓｅｔ）」または「発生（ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ）」という用語には、その最初の発症および／または再発が含まれる。

【0028】

少なくとも１つの実施形態において、本開示は、アミロイドβペプチドまたはその断片で、対象から得られた生体サンプル中のＴ細胞を刺激すること、およびアミロイドβペプチドまたはその断片に対するＴ細胞応答の大きさを評価することを含む、軽度認知障害（ＭＣＩ）に罹患するかまたはそのリスクを有する対象を診断するための方法に関する。

【0029】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、前記評価は、ＣＤ４＋Ｔ細胞などの刺激されたＴ細胞からのＴ細胞応答バイオマーカーのレベルを測定することを含む。いくつかの実施形態において、前記評価は、バイオマーカーの測定されたレベルを参照レベルと比較することをさらに含み、参照レベルと比較してバイオマーカーのレベルが高いことは、対象がＭＣＩに罹患しているかまたはそのリスクを有する可能性が高いことを示す。

【0030】

本明細書で使用される場合、「参照レベル」は、絶対値、相対値、値の範囲、代表的平均値（ａｖｅｒａｇｅ ｖａｌｕｅ）、中央値、平均値（ｍｅａｎ ｖａｌｕｅ）、統計値、カットオフ値または識別値、あるいは特定のコントロールもしくはベースライン値と比較した値であってもよい。参照レベルは、個体のサンプル値に基づいてもよく、前記個体のサンプル値は、例えば、試験される個体以外の対象、または健康な状態にあると同定された個体もしくはＭＣＩと診断されていない個体である「正常な」個体からのサンプルから得られる値である。

【0031】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、アミロイドβペプチドまたはその断片で刺激されるＴ細胞は、対象の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に存在してもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、対象の生体サンプル（流体生体サンプルまたは組織サンプルなど）を提供すること、および生体サンプルからＰＢＭＣを単離することをさらに含んでもよい。

【0032】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、本明細書に記載の方法は、ＭＣＩの診断のための追加アッセイを実施することをさらに含み、それによって診断精度を高めることができる。ＭＣＩを診断するための追加アッセイは、当技術分野において周知であり得る。例えば、ＭＣＩの診断に使用される臨床基準は、以下のものを含む：（１）情報提供者によって裏付けられた記憶の苦情、（２）年齢や教育から予想される以上の客観的な記憶障害、（３）正常な一般的な認知機能、（４）日常生活の無傷活動、および（５）対象が認知症の基準を満たしていないこと。

【0033】

また、少なくとも１つの実施形態において、本開示は、ＭＣＩに罹患するかまたはそのリスクを有する対象を診断するためのキットに関する。本明細書で使用される場合、「キット」という用語には、対象からの生体サンプルを検出、同定および／または分析するための少なくとも１つの試薬、およびキットの使用方法に関する使用者に説明を提供する凡例が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で提供されるキットは、バイアル、ボトル、ジャー、柔軟な包装などを含む適切な包装であってもよいが、これらに限定されない。また、この分野で制限なく適用可能であるとよく知られている医療機器と組み合わせて使用するためのパッケージも考慮されている。

【0034】

本開示の少なくとも１つの実施形態において、前記キットは、アミロイドβペプチドまたはその断片と、少なくとも１つのＴ細胞応答バイオマーカー（例えば、分化抗原群１０７ａ（Ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ １０７ａ、すなわち、ＣＤ１０７ａ）、インターフェロン－γ（ＩＦＮγ）、インターロイキン２（ＩＬ－２）および腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦα））に特異的な少なくとも１つの試薬とを含む。いくつかの実施形態において、前記試薬は、抗原抗体相互作用に基づいてその対応するバイオマーカーに特異的に結合する抗体、例えば、抗ＣＤ１０７ａ抗体、抗ＩＬ－２抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＦＮγ抗体であってもよい。

【0035】

少なくとも１つの実施形態において、本開示のキットは、本明細書に記載の方法のいずれかに従って使用するための説明書を含み得る。付属の説明書には、Ｔ細胞をアミロイドβペプチドまたはその断片とインキュベートする説明を含み得る。前記キットは、Ｔ細胞応答バイオマーカーのレベルを測定することによってアミロイド特異的Ｔ細胞応答の大きさを評価することについての説明をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、キットに含まれる試薬は、Ｔ細胞応答バイオマーカーのレベルを測定するために検出可能である。検出可能な試薬で標識されたバイオマーカーは、フローサイトメトリー、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）および酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを含むが、これらに限定されないアッセイを使用して定量することができる。

【0036】

本明細書で使用される場合、標的に「特異的に結合する」という語句は、他の生物製剤の異種集団の存在下での分子の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下では、特定の分子は特定の標的に優先的に結合し、サンプル中に存在する他の生物製剤には大量的に結合しない。

【0037】

本開示を説明するために多くの例が使用されてきた。以下の例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0038】

実施例１：サンプル処理とＰＢＭＣ分離

【0039】

この研究では、採血のために亞東記念病院（Ｆａｒ Ｅａｓｔｅｒｎ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、すなわち、ＦＥＭＨ）からヒト対象を募集した。この研究は、ＦＥＭＨの施設内倫理委員会（症例番号：ＦＥＭＨ １０５１４７－Ｆ）によって承認され、全ての参加者からインフォームドコンセントの書面が取得された。研究参加者に関する詳細情報を以下の表１に示す。

【0040】

【表1】

ＳＤ：標準偏差。ＢＭＩ：ボディマス指数。ＧＤＳ：高齢者うつ尺度。ＭＭＳＥ：ミニメンタルステート検査。ＡＰＯＥ４：アポリポタンパク質Ｅ４。

【0041】

採血当日、製造業者（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のプロトコールに従って、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ勾配遠心分離によって末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を分離し、その後の実験に使用した。

【0042】

実施例２：Ｔ細胞の刺激、およびアミロイドに対するＴ細胞応答の定量化

【0043】

重複ペプチドのタンパク質スパンニング混合物の使用は、Ｔリンパ球の免疫刺激および診断用途に効果的であった。この開示では、全長アミロイドβタンパク質（Ａβ１－４２）に由来する重複する１５量体ペプチドが作成され、Ｔ細胞刺激に使用された。ＰＢＭＣ刺激の陽性対照としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ｐｐ６５タンパク質ペプチドプール（ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ドイツ）および化学ホルボールミリスチン酸酢酸塩（ＰＭＡ）／イオノマイシンを使用した。

【0044】

ＪＰＴ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの全長アミロイドβタンパク質（Ａβ１－４２）のアミノ酸配列は、ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＧＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号１）であった。全長アミロイドβタンパク質（Ａβ１－４２）の連続する３アミノ酸シフトを持つ１５量体のアミノ酸長に基づいて作成された１０個の配列で構成されるペプチドプールには、ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱ（Ａβ１－１５、配列番号２）、ＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶ（Ａβ４－１８、配列番号３）、ＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＧ（Ａβ７－２１、配列番号４）、ＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＧＥＤＶ（Ａβ１０－２４、配列番号５）、ＨＨＱＫＬＶＦＦＧＥＤＶＧＳＮ（Ａβ１３－２７、配列番号６）、ＫＬＶＦＦＧＥＤＶＧＳＮＫＧＡ（Ａβ１６－３０、配列番号７）、ＦＦＧＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧ（Ａβ１９－３３、配列番号８）、ＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶ（Ａβ２２－３６、配列番号９）、ＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶ（Ａβ２５－３９、配列番号１０）およびＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（Ａβ２８－４２、配列番号１１）を含んだ。

【0045】

全長アミロイドβタンパク質、アミロイドペプチドプールおよび対照ＣＭＶペプチドプールを、抗ＣＤ２８／ＣＤ４９ｄ、抗ＣＤ１０７ａ、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（モネンシン含有、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（ブレフェルジンＡ含有、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の同時刺激とともにＰＢＭＣ細胞刺激（ペプチドあたり１ｍｇ／ｍＬ）に３７℃で６時間使用した。続いて、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で固定した前に、細胞を抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４および生存／死亡の細胞生存率アッセイキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２０分間染色した。細胞を固定し、洗浄し、抗ＣＤ４０Ｌ、抗ＩＬ－２、抗ＴＮＦαおよび抗ＩＦＮγで染色した。結果は、亞東記念病院コアラボのマルチカラーフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｙｔｏｆｌｅｘ）を使用して取得した。フローサイトメトリーの結果は、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して分析した。

【0046】

生存するＣＤ３＋細胞をゲーティングした後、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞を、各刺激に対する応答におけるサイトカイン発現について別々に分析した。各エフェクター関数のゲートに基づく組み合わせゲート戦略を、ＦｌｏｗＪｏ Ｂｏｏｌｅａｎゲートプラットフォームを使用して共発現パターンについてさらに分析することで、組み合わせ関数発現パターンの統計を導き出した。各刺激に対するＴ細胞のそれぞれの単一機能と全体的な機能応答が導出され、比較された。アミロイドタンパク質に応答したＴ細胞サイトカイン産生の代表的な画像を図１Ａおよび図１Ｂに示す。アミロイドペプチドプールに応答したＴ細胞サイトカイン産生の代表的な画像を図１Ａに示す。アミロイド全長ペプチドに応答したＴ細胞サイトカイン産生の代表的な画像を図１Ｂに示す。

【0047】

ＭＣＩと正常を区別するための感度と特異性について、アミロイドβペプチドプールおよびアミロイドβ全長ペプチドに対するＰＢＭＣ ＣＤ４＋Ｔ細胞反応の大きさをテストした。正しく分類された参加者、感度、特異度は、ＭＣＩと正常の場合のＬｉｕの方法から最も高い指数を生成するカットオフを使用して計算された。総応答は、少なくとも１つの測定されたバイオマーカー（すなわち、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、またはＴＮＦα）によるアミロイドβペプチドプールおよびアミロイドβ全長ペプチド刺激に対して応答した総ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちのＴ細胞の割合として列挙された。

【0048】

受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）を使用して、バイオマーカーの識別性能を調べた。曲線下面積（ＡＵＣ）のための信頼区間（ＣＩ）は、ノンパラメトリック法を使用して２，０００個のブートストラップサンプルに基づいて計算された。アミロイドプールおよびアミロイド全長ペプチド応答のカットオフは、各ＲＯＣ分析においてＭＣＩと年齢に一致する正常者を区別するために、感度と特異性の最高積で確立された（Ｌｉｕの方法）。ＲＯＣ分析の結果を以下の表２および表３、ならびに図２Ａ～図２Ｆ、図３Ａ～図３Ｆに示す。

【0049】

【表2】

【0050】

【表3】

【0051】

上記から、アミロイドβ全長ペプチドおよびアミロイドβペプチドプールに対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を、高齢者ＭＣＩと正常高齢者を区別するために使用できることがわかる。本明細書で提供される方法は、ＰＢＭＣの刺激および多色フローサイトメトリーによる刺激されたＴ細胞におけるサイトカインエフェクター応答の測定に基づくため、増殖アッセイと比較した場合に標準化がより容易である。アミロイドペプチドに対する血液Ｔ細胞の反応はまれな現象であるため（ＣＤ４＋細胞中のＴ細胞の割合は０．１％未満）、本明細書で提供されるマルチマーカー法は測定値の絶対値を０．１％以上に増加させ、ＭＣＩと正常を区別する持続的な能力を示す。したがって、本開示の方法は、ＭＣＩを進展するリスクのある高齢者を分類するために利用することができ、アミロイド関連神経変性疾患の発症の予測力を調査するために使用することができる。

【0052】

以上、本開示の実施形態のうちのいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば、本開示の教示および利点から実質的に逸脱することなく、示された実施形態に対して様々な修正および変更を行うことが可能である。そのような修正および変更は、添付の特許請求の範囲に記載される本開示の範囲内に包含される。

【0053】

本明細書で引用および議論するすべての参考文献および刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれ、各参考文献または刊行物が個別に参照により組み込まれるのと同じ程度に組み込まれる。

【0054】

参考文献：
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【図1A-1】

【図1A-2】

【図1B-1】

【図1B-2】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【配列表】

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【国際調査報告】