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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-18
(54)【発明の名称】パーキンソン病の治療方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/275 20060101AFI20240910BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240910BHJP
【ＦＩ】
A61K31/275 ZNA
A61P25/16
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024509029
(86)(22)【出願日】2022-08-19
(85)【翻訳文提出日】2024-04-11
(86)【国際出願番号】 US2022075219
(87)【国際公開番号】W WO2023023649
(87)【国際公開日】2023-02-23
(31)【優先権主張番号】63/235,064
(32)【優先日】2021-08-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508285271
【氏名又は名称】オラテック セラピューティクス， インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100225598
【弁理士】
【氏名又は名称】桐島 拓也
(72)【発明者】
【氏名】チャールズ エー．ディナレロ
(72)【発明者】
【氏名】ジーザス アモ アパリシオ
【テーマコード（参考）】
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C206AA01
4C206AA02
4C206JA19
4C206MA01
4C206MA04
4C206MA72
4C206MA75
4C206NA14
4C206ZA02
(57)【要約】
本発明は、パーキンソン病を治療する方法に関する。この方法は、ダパンストリルを必要とする対象に有効量で投与することを含む。ダパンストリルは、炎症反応の調節、α－シヌクレインレベルの低下、ドーパミン作動性ニューロンの保護を通じて、運動機能障害などのＰＤの臨床的特徴を最小限に抑える。好ましい投与経路は経口投与である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
パーキンソン病を治療する方法であって、以下の工程：パーキンソン病に罹患している対象に有効量のダパンストリル（dapansutrile）、又は医薬的に許容されるその溶媒和物を投与する工程、
を含む方法。
【請求項2】
前記化合物が全身投与により投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記化合物が経口投与により投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
1つ又は複数の運動関連の症状を改善する、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項5】
前記運動関連の症状が、震え、固縮、動きの遅さ、細かい運動能力の困難、歩行、及び歩き方からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、有効量のダパンストリル（dapansutrile）を投与することによるパーキンソン病の治療方法に関する。
【背景技術】
【0002】
パーキンソン病(ＰＤ)は、特発性又は原発性パーキンソニズムとしても知られ、中枢神経系の変性神経障害である。ＰＤは、アルツハイマー病に次いで２番目に頻度の高い変性疾患である。ＰＤの運動症状は、中脳の領域である黒質のドーパミン生成細胞の死によって引き起こされ；この細胞死の原因は不明である。病気の初期段階では、最も明らかな症状は運動に関連したものであり；これらには、震え、固縮、動きの遅さ、及び細かい運動能力、歩行、及び歩き方の困難が含まれる。その後、思考や行動に問題が生じる可能性があり、病気の進行段階では認知症が一般的に発生するが、鬱病が最も一般的な精神症状である。その他の症状には、感覚、睡眠、及び感情の問題がある。
【0003】
臨床的には、その主な特徴には、振戦、筋肉の固縮、随意運動の遅さ、及び姿勢の不安定性が含まれる。ＰＤ神経病理には多数の異なる神経伝達物質経路が含まれるが、上記で引用した生活に支障をきたす症状は、主にドーパミン作動性ニューロンの死による脳内のドーパミン欠乏に起因すると考えられている。
【0004】
ＰＤの病理学的特徴は、黒質緻密部におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失であり、その結果、線条体における神経伝達物質ドーパミン(ＤＡ)のレベルが低下する。ＤＡは運動に関連する一部の脳回路の調節に役割を果たしているため、その減少は運動障害につながる。ＰＤに対して承認された治療法は利用可能だが、そのほとんどはＤＡレベルの回復に重点を置いている。それにもかかわらず、脳内のＤＡレベルを増加させる現在の治療法では、欠損が持続し、治療法は病気の進行を効果的に遅らせたり止めたりすることができない。
【0005】
この疾患の進行を防ぐためにＰＤを治療する方法が必要である。この方法は効果的であり、そして重大な副作用がないことが必要である。
【発明の概要】
【0006】
本発明は、ダパンストリルを使用してＰＤを治療する方法を提供する。
【0007】
本発明者らは、ダパンストリルが血液脳関門を通過して脳に侵入することを発見した。次に、ダパンストリルは、脳内の炎症細胞によるＩＬ－１βのプロセシングを阻害し、脳内の炎症誘発性サイトカインＩＬ－１β、ＩＬ－１８、ＩＬ－６、ＩＬ－１７Ａの発現を減少させる。
【0008】
ダパンストリルは、炎症反応の調節、α－シヌクレインレベルの低下、及びドーパミン作動性ニューロンの保護を通じて、ＰＤの臨床的特徴を最小限に抑える。
【0009】
図１は、ＰＤを治療するためにダパンストリル（ＯＬＴ１１７７（登録商標））を使用する治療アプローチを示す。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図3】図３は、ＭＰＴＰ注射後３日目のロータロッドの性能に対するダパンストリルの効果を示す。ＭＰＴＰ注射の３０分前に、マウスをダパンストリルで強制経口投与して処置した。次に、各動物の全体的なロッド性能(ＯＲＰ)を、回転速度に対するロッド上の時間のプロットにおける曲線の下の面積として計算した。生理食塩水の場合はＮ＝４。ＭＰＴＰ＋生理食塩水の場合はＮ＝９。ＭＰＴＰ＋ダパンストリルの場合はＮ＝７。ダネットの事後補正を使用した一元配置分散分析。＊＊ｐ＜０．００１。
【図4】図４は、ＭＰＴＰ注射１日後の脳におけるＴＮＦＲＮＡ倍率変化を示す。ＭＰＴＰ注射の３０分前に、マウスをダパンストリルで強制経口投与して処置した。ＭＰＴＰ＋生理食塩水の場合はＮ＝５。ＭＰＴＰ＋ダパンストリルの場合はＮ＝５。＊＊ｐ＜０．０１。Ｔ検定とＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの事後補正との比較。
【図5】図５は、ＭＰＴＰ注射後３日目の脳内のＩＬ－１８のタンパク質レベルを示す。ＭＰＴＰ注射の３０分前に、マウスをダパンストリルで強制経口投与して処置した。ＭＰＴＰ＋生理食塩水の場合はＮ＝４。ＭＰＴＰ＋ダパンストリルの場合はＮ＝３。＊ｐ＜０．０５。Ｔ検定とＨｏｌｍ－Ｓｉｄａｋの事後補正との比較。
【図6】図６は、注射後３日目のロータロッド性能に対するアナキンラの効果を示す。ＭＰＴＰの３０分前に、マウスを腹腔内注射によりアナキンラで治療した。生理食塩水の場合はＮ＝４。ＭＰＴＰ＋生理食塩水の場合はＮ＝５。ＭＰＴＰ＋アナキンラの場合はＮ＝５。ダネットの事後補正を使用した一元配置分散分析。＊ｐ＜０．０５。
【図7】図７は、外因性刺激がない場合のダパンストリルの脳レベルを示す。マウスにダパンストリル強化ペレット（ＯＬＴ、ペレット１ｋｇ当たり７．５ｇ）を３週間与えた。ダパンストリルを除いて同じ組成のペレットを標準飼料として使用した。データは平均±ＳＥＭとして表される。Ｎ＝１グループ当たり５人。Ｔ検定比較を使用して、グループ間の差異を分析した。＊＊＊p＜０．００１。
【図8】図８Ａ－８Ｂは、ダパンストリルがＭＰＴＰ急性投与の３日後にマウスの運動能力を改善することを示す。図８Ａは、加速ロータロッド装置にかかる時間を示す。マウスには、ＭＰＴＰ投与の１時間前から開始して、１日１回、６０ｍｇ/ｋｇ(ＯＬＴ６０)又は２００ｍｇ/kg(ＯＬＴ２００)のダパンストリルを投与した。生理食塩水を媒体として使用した。ＭＰＴＰを受けなかった偽マウスを対照として使用した。図８Ｂは、加速ロータロッド装置上での異なる速度でのマウスの走行パターンを示す。データは３つの別々の実験からプールされ、図８Ａについては平均値±ＳＥＭ、図８Ｂについては平均値として表される。偽物＋生理食塩水の場合はＮ＝９、ＭＰＴＰ＋生理食塩水の場合はＮ＝１２、ＭＰＴＰ＋ＯＬＴ６０の場合はＮ＝９、ＭＰＴＰ＋ＯＬＴ２００の場合はＮ＝１４。Ｔｕｋｅｙの事後補正を伴う一元配置分散分析を使用して、図８Ａのグループ間の差異を分析した(＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１)。カプラン・マイヤー検定を使用して、ＭＰＴＰ＋生理食塩水に対するＭＰＴＰ＋ＯＬＴ２００について、図８Ｂのグループ間の差異を分析した（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図9】図９は、ＭＰＴＰ注射マウスにおける２００ｍｇ／ｋｇのダパンストリル（ＯＬＴ）での処置後の血液中の異なる細胞型の数を示す。ＭＰＴＰ投与後７日目に末梢血から白血球(ＷＢＣ)、リンパ球(ＬＹＭ)、単球(ＭＯＮＯ)、及び顆粒球(ＧＲＡＮ)を測定した。データは平均±ＳＥＭとして表される。偽物＋生理食塩水の場合はＮ＝５、ＭＰＴＰ＋生理食塩水の場合はＮ＝６、ＭＰＴＰ＋ＯＬＴの場合はＮ＝６。Ｔｕｋｅｙの事後補正を伴う二元配置分散分析を使用して、グループ間の差異を分析した。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１。
【図10】図１０Ａ－１０Ｂは、ＭＰＴＰを注射したマウスからの脾細胞におけるサイトカインレベルを示す。刺激剤としてＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌ）を用いて２日間培養した後のＩＬ－１＋（図１０Ａ）及びＩＬ－６（図１０Ｂ）の産生。ＬＰＳを含まない培地を対照として使用した。ＩＬ－１αのレベルは溶解物細胞で測定され、ＩＬ－６は上清で測定された。ＭＰＴＰ投与後７時間で脾臓を摘出し、培養した。マウスを２００ｍｇ/ｋｇのダパンストリル(ＯＬＴ)で７日間治療した。生理食塩水を媒体として使用した。データは平均±ＳＥＭとして表される。偽物＋生理食塩水の場合はＮ＝５、ＭＰＴＰ＋生理食塩水及びＭＰＴＰ＋ＯＬＴの場合はＮ＝６。Ｔｕｋｅｙの事後補正を伴う一元配置分散分析を使用して、グループ間の差異を分析した。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１。
【図11-1】図１１Ａ－１１Ｈは、ダパンストリルがＭＰＴＰ急性投与後の様々な時点で脳内の炎症促進性サイトカインの動態を調節することを示す。図１１Ａ－１１Ｄは、ＭＰＴＰ投与４日後の線条体（Ｓｔ）及び腹側中脳（ＶＭ）におけるＩＬ－１β（図１１Ａ－１１Ｂ）及びＩＬ－１８（図１１Ｃ－１１Ｄ）の脳レベルを示す。図１１Ｅ－１１Ｈは、ＭＰＴＰ投与の７日後のＩＬ－６（図１１Ｅ－１１Ｆ）及びＩＬ－１７Ａ（図１１Ｇ－１１Ｈ）の脳レベルを示す。マウスは、ＭＰＴＰ投与の１時間前に開始して、１日１回、２００ｍｇ／ｋｇのダパンストリル（ＯＬＴ）で治療された。生理食塩水を媒体として使用した。データは平均±ＳＥＭとして表される。図１１Ａ－１１Ｄについてはグループ当たりＮ＝４、図１１Ｅ－１１Ｈについてはグループ当たりＮ＝５である。Ｔｕｋｅｙの事後補正を伴う一元配置分散分析を使用して、グループ間の差異を分析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図11-2】図１１Ａ－１１Ｈは、ダパンストリルがＭＰＴＰ急性投与後の様々な時点で脳内の炎症促進性サイトカインの動態を調節することを示す。図１１Ａ－１１Ｄは、ＭＰＴＰ投与４日後の線条体（Ｓｔ）及び腹側中脳（ＶＭ）におけるＩＬ－１β（図１１Ａ－１１Ｂ）及びＩＬ－１８（図１１Ｃ－１１Ｄ）の脳レベルを示す。図１１Ｅ－１１Ｈは、ＭＰＴＰ投与の７日後のＩＬ－６（図１１Ｅ－１１Ｆ）及びＩＬ－１７Ａ（図１１Ｇ－１１Ｈ）の脳レベルを示す。マウスは、ＭＰＴＰ投与の１時間前に開始して、１日１回、２００ｍｇ／ｋｇのダパンストリル（ＯＬＴ）で治療された。生理食塩水を媒体として使用した。データは平均±ＳＥＭとして表される。図１１Ａ－１１Ｄについてはグループ当たりＮ＝４、図１１Ｅ－１１Ｈについてはグループ当たりＮ＝５である。Ｔｕｋｅｙの事後補正を伴う一元配置分散分析を使用して、グループ間の差異を分析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図12】図１２Ａ－１２Ｃは、ダパンストリルがＭＰＴＰの急性投与後にＴＲＥＭ２のレベルを増加させることを示す。図１２Ａは、ＭＰＴＰ投与４日後の線条体におけるグリコシル化型（３５ｋＤａ）及び非グリコシル化型（２８ｋＤａ）のＴＲＥＭ２のレベルを示す代表的な免疫ブロットである。マウスは、ＭＰＴＰ投与の１時間前に開始して、１日１回、２００ｍｇ／ｋｇのダパンストリル（ＯＬＴ）で治療された。Β－アクチンをローディングコントロールとして使用した。分子量(ｋＤａ)は右側にマークされている。図１２Ｂ－１２Ｃは、ＴＲＥＭ２の２８ｋＤａ（図１２Ｂ）及び３５ｋＤａ（図１２Ｃ）形態の定量化である。グループ当たりＮ＝４。Ｔｕｋｅｙの事後補正を伴う一元配置分散分析を使用して、グループ間の差異を分析した。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１。
【図13】図１３Ａ－１３Ｃは、ダパンストリルが、ＭＰＴＰ－亜急性投与後の腹側中脳におけるα－シヌクレインのレベルを低下させることを示す。図１３Ａは、異なるグループにおけるα－シヌクレインの単量体及びオリゴマー形態のレベルを示す代表的なイムノブロッティングである。マウスを２００ｍｇ/ｋｇのダパンストリル(ＯＬＴ)で６日間治療した。生理食塩水を媒体として使用した。Β－アクチンをローディングコントロールとして使用した。分子量(ｋＤａ)は右側にマークされている。図１３Ｂ－１３Ｃは、α－シヌクレインの単量体（図１３Ｂ）及びオリゴマー（図１３Ｃ）形態の定量化である。偽物＋生理食塩水の場合はＮ＝４、ＭＰＴＰ＋生理食塩水及びＭＰＴＰ＋ＯＬＴの場合はＮ＝５。Ｔｕｋｅｙの事後補正を伴う一元配置分散分析を使用して、グループ間の差異を分ました。＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１。
【図14-1】図１４Ａ－１４Ｄは、ダパンストリルがＭＰＴＰ媒介細胞死からドーパミン作動性ニューロンを保護することを示す。図１４Ａ－１４Ｂは、線条体（Ｓｔ、図１４Ａ）及び黒質緻密部（ＳＮｐｃ、図１４Ｂ）における代表的なチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫染色である。マウスを２００ｍｇ/ｋｇのダパンストリル(ＯＬＴ)で7日間治療した。生理食塩水を媒体として使用した。陽性シグナルは茶色で表示されている。ボックス内で囲まれた領域は、挿入図の高倍率で示されている。図１４Ｃ－１４Ｄは、ＳｔにおけるＴＨ免疫反応性（図１４Ｃ）及びＳＮｐｃにおけるＴＨ立体学的計数（図１４Ｄ）を示す。データは平均±ＳＥＭとして表される。偽物＋生理食塩水の場合はＮ＝５、ＭＰＴＰグループの場合はＮ＝７。Ｔｕｋｅｙの事後補正を伴う一元配置分散分析を使用して、グループ間の差異を分析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図14-2】図１４Ａ－１４Ｄは、ダパンストリルがＭＰＴＰ媒介細胞死からドーパミン作動性ニューロンを保護することを示す。図１４Ａ－１４Ｂは、線条体（Ｓｔ、図１４Ａ）及び黒質緻密部（ＳＮｐｃ、図１４Ｂ）における代表的なチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫染色である。マウスを２００ｍｇ/ｋｇのダパンストリル(ＯＬＴ)で7日間治療した。生理食塩水を媒体として使用した。陽性シグナルは茶色で表示されている。ボックス内で囲まれた領域は、挿入図の高倍率で示されている。図１４Ｃ－１４Ｄは、ＳｔにおけるＴＨ免疫反応性（図１４Ｃ）及びＳＮｐｃにおけるＴＨ立体学的計数（図１４Ｄ）を示す。データは平均±ＳＥＭとして表される。偽物＋生理食塩水の場合はＮ＝５、ＭＰＴＰグループの場合はＮ＝７。Ｔｕｋｅｙの事後補正を伴う一元配置分散分析を使用して、グループ間の差異を分析した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、及び＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【0011】
化合物
本発明は、以下のダパンストリル（３－メタンスルホニルプロピオニトリル）の精製化合物、又はその医薬的に許容される溶媒和物を使用する：
本発明は、以下のダパンストリル（３－メタンスルホニルプロピオニトリル）の精製化合物、又はその医薬的に許容される溶媒和物を使用する：
【化1】
【0012】
本明細書で使用される「溶媒和物」とは、化合物が許容される溶媒と一定の割合で組み合わされた付加錯体である。許容される溶媒としては、水、酢酸、エタノール、及びダパンストリルに適した他の有機溶媒が挙げられるが、これらに限定されない。
【0013】
本明細書で使用される「医薬的に許容される溶媒和物」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒性効果を与えない溶媒和物である。
【0014】
医薬組成物
医薬組成物中の活性化合物ダパンストリル、又はその医薬的に許容される溶媒和物は、一般的に、注射用製剤の場合は約０．１～５％、パッチ製剤の場合は０．１～５％、錠剤製剤の場合は約１～９０％の量であり、カプセル製剤の場合は１～１００％、局所製剤の場合、約０．０１～２０％、又は０．０５～２０％、又は０．１～２０％、又は０．２～１５％、又は０．５～１０％、又は１～５％（ｗ／ｗ）の量である。
医薬組成物中の活性化合物ダパンストリル、又はその医薬的に許容される溶媒和物は、一般的に、注射用製剤の場合は約０．１～５％、パッチ製剤の場合は０．１～５％、錠剤製剤の場合は約１～９０％の量であり、カプセル製剤の場合は１～１００％、局所製剤の場合、約０．０１～２０％、又は０．０５～２０％、又は０．１～２０％、又は０．２～１５％、又は０．５～１０％、又は１～５％（ｗ／ｗ）の量である。
【0015】
１つの実施形態によれば、医薬組成物は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、シロップ剤、坐剤、注射液、貼付剤などの剤形である。
【0016】
不活性成分である医薬的に許容される担体は、従来の基準を使用して当業者によって選択され得る。医薬的に許容される担体には、非水性ベースの溶液、懸濁液、乳濁液、マイクロエマルション、ミセル溶液、ゲル、及び軟膏が含まれるが、これらに限定されない。医薬的に許容される担体には、以下に限定されないが、生理食塩水及び電解質水溶液；塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセロール、及びデキストリンなどのイオン性及び非イオン性浸透圧剤；水酸化物、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩などのｐＨ調整剤及び緩衝剤；及びトロラミン;抗酸化剤、バイサルファイト、サルファイト、メタビサルファイト、チオサルファイト、アスコルビン酸、アセチルシステイン、システイン、グルタチオン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、トコフェロール、及びパルミチン酸アスコルビルの塩、酸及び／又は塩基；レシチン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルイノシオールを含むがこれらに限定されないリン脂質のような界面活性剤；ポロキサマー及びプロキサミン（ploxamine）、ポリソルベート８０、ポリソルベート６０、及びポリソルベート２０などのポリソルベート、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールなどのポリエーテル；ポリビニルアルコール、ポビドンなどのポリビニル；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等のセルロース誘導体及びその塩；鉱物油、白色ワセリンなどの石油誘導体；ラノリン、ピーナッツ油、パーム油、大豆油などの脂肪；モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド；カルボキシポリメチレンゲル、疎水変性架橋アクリル酸共重合体などのアクリル酸のポリマー；デキストランなどの多糖類及びヒアルロン酸ナトリウムなどのグリコサミノグリカンを含む成分も含まれてよい。このような医薬的に許容される担体は、周知の防腐剤を使用して細菌汚染から保存することができ、これらには、塩化ベンザルコニウム、エチレンジアミン四酢酸及びその塩、塩化ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、メチルパラベン、チメロサール、及びフェニルエチルアルコールが含まれるが、これらに限定されず、又は、単回又は複数回の使用のために非保存製剤として製剤化することもできる。
【0017】
例えば、ダパンストリルの錠剤製剤又はカプセル製剤は、生物活性を有さず、活性化合物と反応しない他の賦形剤を含有する場合がある。錠剤の賦形剤には、充填剤、結合剤、滑沢剤及び流動促進剤、崩壊剤、湿潤剤、及び放出速度調節剤が含まれ得る。結合剤は製剤の粒子の接着を促進し、錠剤製剤にとって重要である。結合剤の例には、カルボキシメチルセルロース、セルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カラヤガム、デンプン、デンプン、及びトラガカントガム、ポリ（アクリル酸）、及びポリビニルピロリドンが含まれるが、これらに限定されない。
【0018】
例えば、ダパンストリルのパッチ製剤には、いくつかの不活性成分、例えば、３－ブチレングリコール、ジヒドロキシアルミニウムアミノアセテート、エデト酸二ナトリウム、Ｄ－ソルビトール、ゼラチン、カオリン、メチルパラベン、ポリソルベート８０、ポビドン、プロピレングリコール、プロピルパラベン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、酒石酸、二酸化チタン、及び精製水を含むことができる。パッチ製剤はまた、乳酸エステル（例えば、乳酸ラウリル）又はジエチレングリコールモノエチルエーテルなどの皮膚透過性増強剤を含んでもよい。
【0019】
ダパンシトリルを含む局所製剤は、ゲル、クリーム、ローション、液体、乳濁液、軟膏、スプレー、溶液、及び懸濁液の形態であり得る。局所製剤中の不活性成分としては、例えば、乳酸ラウリル(皮膚軟化剤/浸透促進剤)、ジエチレングリコールモノエチルエーテル(皮膚軟化剤/浸透促進剤)、ＤＭＳＯ(溶解促進剤)、シリコーンエラストマー(レオロジー/質感調整剤)、カプリル酸/カプリン酸トリグリセリド、(エモリエント)、オクチサレート、(エモリエント/ＵＶフィルター)、シリコーン液(エモリエント/希釈剤)、スクアレン(エモリエント)、ヒマワリ油(エモリエント)、及び二酸化ケイ素(増粘剤)を含むが、これらに限定されない。１つの実施形態によれば、ジエチレングリコールモノエチルエーテルが局所用ゲル製剤に含まれる。
【0020】
使用方法
Liuら(MolNeurobiol54,7762-7776,2017)は、Ｔｈ１７細胞由来のＩＬ－１７Ａが、これらの細胞の膜上に発現する２つの接着分子ＬＦＡ－１/ＩＣＡＭ－１間の相互作用によってドーパミン作動性ニューロンを殺すことを報告している。Liuら（BrainBehavImmun81,630-645,2019）は、ＭＰＴＰモデルにおいてＩＬ－１７Ａ欠損又は遮断によりドーパミン作動性神経変性及び運動障害が回避され、ＰＤマウスモデルにおいてＩＬ－１７Ａが有害な影響と関連していることを報告している。
Liuら(MolNeurobiol54,7762-7776,2017)は、Ｔｈ１７細胞由来のＩＬ－１７Ａが、これらの細胞の膜上に発現する２つの接着分子ＬＦＡ－１/ＩＣＡＭ－１間の相互作用によってドーパミン作動性ニューロンを殺すことを報告している。Liuら（BrainBehavImmun81,630-645,2019）は、ＭＰＴＰモデルにおいてＩＬ－１７Ａ欠損又は遮断によりドーパミン作動性神経変性及び運動障害が回避され、ＰＤマウスモデルにおいてＩＬ－１７Ａが有害な影響と関連していることを報告している。
【0021】
ダパンストリルの投与は、脳内の炎症誘発性サイトカインのレベルを低下させる。ＮＬＲＰ３直接サイトカインとしてのＩＬ－１β及びIL－１８だけでなく、下流サイトカインとしてのＩＬ－６及びＩＬ－１７Ａにも変化が観察されており、ダパンストリルがＰＤにおける適応免疫応答の調節に有効であることが示されている。ダパンスルトリルは、情報伝達促進性サイトカインを減少させ、細胞死から保護することにより、体の免疫監視を維持する。
【0022】
細胞内α－シヌクレインの凝集は、ドーパミン作動性ニューロン死の主な病原性原因と考えられている。Wangら(Proc.Natl.Acad.Sci.113:9587-9592,2016)及びBassilら(Proc.Natl.Acad.Sci.113:9593-9598,2016)による報告は、カスパーゼ－１を介したα－シヌクレインの切断が、シヌクレイノパシーにおけるこの分子の凝集と毒性を引き起こす上流の出来事であることを示している。α－シヌクレインの蓄積により、脳内のドーパミン作動性ニューロンが死滅し、二次的な損傷につながる慢性炎症反応が開始される。
【0023】
ダパンストリルは、炎症反応を調節し、脳内のα－シヌクレインの凝集を減少させるのに効果的であり、その結果、ドーパミン作動性ニューロンが保護され、運動能力が向上する。
【0024】
本発明は、ＰＤ及び関連するイヌクレイン症、例えばレビー小体型認知症（ＤＬＢ）、レビー小体病（ＬＢＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）を治療する方法に関する。この方法は、それを必要とする対象に有効量のダパンストリルを投与する工程を含む。本明細書で使用される「有効量」とは、病理学的状態を改善するか、又は疾患の症状を軽減することによって疾患を治療するのに有効な量である。ダパンストリルは、単独療法として、又は他の薬物治療との併用療法として使用できる。
【0025】
本発明は、カスパーゼ－１媒介α－シヌクレイン切断に起因するα－シヌクレイン凝集を標的とすることによる、シヌクレイン症、例えばＰＤに関連する神経炎症に対する治療的介入を提供する。ダパンストリル治療はまた、ニューロンから放出されたα－シヌクレインの下流の活性化ミクログリアによる、プロ－ＩＬ－１β及びプロ－ＩＬ－１８の成熟と炎症性サイトカインへの放出を標的とする。ダパンストリルによる炎症反応の遮断により、脳上の免疫細胞サブセット（ミクログリア、マクロファージ、好中球）の活性化/浸潤が減少する可能性がある。ダパンストリルはドーパミン作動性ニューロンの死滅を減少させる。
【0026】
本方法は、ＰＤ患者の運動機能障害又は行動機能障害を低減又は軽減する。例えば、この方法は、震え、固縮、動きの遅さ、細かい運動能力の困難、歩行、歩行などの運動関連の症状を改善する。
【0027】
本発明者らは、ダパンストリルがＰＤの動物モデルに対して有益な効果を有することを実証した。本発明者らは、ダパンストリルがＭＰＴＰ注射に関連する機能障害を回復させることを示した。
【0028】
本発明の医薬組成物は、全身投与又は局所投与により適用することができる。全身投与には、経口、非経口（静脈内、筋肉内、皮下又は直腸など）、及び吸入投与が含まれるが、これらに限定されない。全身投与では、活性化合物は最初に血漿に到達し、次に標的組織に分布する。経口投与は、本発明の好ましい投与経路である。局部投与には局所投与が含まれる。
【0029】
組成物の投与量は、損傷の程度及び各患者の個々の反応に基づいて変化し得る。全身投与の場合、送達される活性化合物の血漿濃度は変動する可能性があるがしかし、一般的には１×１０－１０～１×１０－４モル／リットル、好ましくは１×１０－８～１×１０－５モル／リットルである。
【0030】
全身投与には、経口、非経口（静脈内、筋肉内、皮下又は直腸など）、及び他の全身投与経路が含まれる。全身投与では、活性化合物は最初に血漿に到達し、次に標的組織に分布する。
【0031】
１つの実施形態によれば、医薬組成物は対象に経口投与される。経口投与の用量は、一般に少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ／日、１００ｍｇ／ｋｇ／日未満又は２００ｍｇ／ｋｇ／日未満である。例えば、経口投与の用量は、ヒト対象に対して１～１００、又は５～５０、又は１０～５０ｍｇ/ｋｇ/日である。例えば、経口投与の場合の投与量は、ヒト対象に対して１００～１０，０００ｍｇ／日であり、好ましくは５００～２０００、５００～４０００、５００～４０００、１０００～５０００、２０００～５０００、２０００～６０００、又は２０００～８０００ｍｇ／日である。この薬は、１日１回、２回、３回、又は４回経口摂取できる。
【0032】
１つの実施形態によれば、医薬組成物は対象に静脈内投与される。静脈内ボーラス注射又は静脈内注入の場合の投与量は、通常０．０３～２０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．０３～１０ｍｇ／ｋｇ／日である。
【0033】
１つの実施形態によれば、医薬組成物は対象に皮下投与される。皮下投与の場合の投与量は、通常０．３～２０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．３～３ｍｇ／ｋｇ／日である。
【0034】
１つの実施形態によれば、組成物は局所的に適用される。組成物は、医学的問題及び疾患の病状に応じて、少なくとも１日に１～２回、又は１日に３～４回、局所的に適用される。一般的に、局所用組成物は、約０．０１～２０％、又は０．０５～２０％、又は０．１～２０％、又は０．２～１５％、０．５～１０、又は１～５％（ｗ／ｗ）の活性化合物を含む。典型的には、１回の用量当たり０．２～１０ｍＬの局所組成物が個体に適用される。
【0035】
当業者は、多種多様な送達機構も本発明に適していることを認識するであろう。
【0036】
本発明は、ヒト、ウマ、イヌ及びネコなどの哺乳動物対象を治療するのに有用である。本発明は、ヒトの治療に特に有用である。
【0037】
以下の実施例は本発明をさらに説明するものである。これらの実施例は、単に本発明を説明することを意図しており、限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例1】
【0038】
実施例１．ＭＰＴＰモデル
ＰＤのさまざまなモデルの中で、ＭＰＴＰ(１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン)モデルが最も一般的に使用されている。この毒素をマウスの腹腔内に注射すると、黒質線条体ドーパミン作動性経路の信頼性と再現性のある損傷が生じる。
ＰＤのさまざまなモデルの中で、ＭＰＴＰ(１－メチル－４－フェニル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン)モデルが最も一般的に使用されている。この毒素をマウスの腹腔内に注射すると、黒質線条体ドーパミン作動性経路の信頼性と再現性のある損傷が生じる。
【0039】
ＭＰＴＰ(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)は、急性及び亜急性の２つの用量レジメンで投与できる。急性レジメンでは、ＭＰＴＰを１日に４回腹腔内(i.p.)投与した。投与は、８時間にわたって２時間ごとに実施された。亜急性レジメンでは、1日当たり1回のＭＰＴＰ腹腔内注射を、５日間連続でマウスに投与した。両方のモデルのすべての用量に２０ｍｇ/ｋｇの遊離塩基ＭＰＴＰ用量を使用した。滅菌生理食塩水をビヒクルとして使用した。対照マウスには、同じ投与プロトコルを使用して生理食塩水を注射し、偽マウスと定義した。ＭＰＴＰの最初の注射後、異なる日にマウスを屠殺した。Ｃ５６ＢＬ/Ｊマウスでは急性プロトコルを使用してドーパミン神経変性、炎症、及び運動障害を研究し、次の実施例では亜急性モデルを使用してα－シヌクレイン凝集を評価した。
【0040】
実施例２.ダパンストリルは運動機能障害を改善する
図２は、ダパンストリル（ＯＬＴ１１７７（登録商標））が実験的ＰＤモデル（ＭＰＴＰモデル）を治療するためにどのように作用するかを示す。
図２は、ダパンストリル（ＯＬＴ１１７７（登録商標））が実験的ＰＤモデル（ＭＰＴＰモデル）を治療するためにどのように作用するかを示す。
【0041】
本発明者らは、ＰＤのＭＰＴＰ注射マウスモデルにおける全体的な運動能力を評価するための全体的なロータロッド性能(ＯＲＰ)試験を調査した。この手順では、マウスをロータロッド上で事前に訓練し、その後一連の速度を上げて試験し、動物が各速度でロッド上に留まっている時間を記録し；次に、各動物の全体的なロッド性能(ＯＲＰ)を、回転速度に対するロッドオン時間のプロットにおける曲線の下の面積として計算した。
【0042】
加速ロータロッド(UgoBasile、イタリア、ジェモニオ)を使用して、ＭＰＴＰを急性投与したマウスの運動機能を評価した。ＭＰＴＰに関連する運動障害を検出するために加速プログラムが選択された(Keshetetal.,JCompNeurol504:690-701,2007;Ruietal.,IntJNeuropsychopharmacol.,2020)。直径３センチメートルのシリンダーロッドを備えたロータロッド装置を使用した。マウスは、ＭＰＴＰ投与前に連続３日間の訓練期間を受けた。各トレーニングセッションでは、マウスを４つの一定速度(１０ｒｐｍ、２０ｒｐｍ、３０ｒｐｍ、及び４０ｒｐｍ)で各速度で１５０秒間走行させた。その間マウスが落ちた場合は、すぐにロータロッドに戻された。試験当日は高速化プログラムを使用した。ウォームアップとして、マウスをロータロッド装置上に３０ｒｐｍで１５０秒間置いた。１５０秒後すぐに加速セッションが開始され、５００秒間で速度が３０rpmから７０rpmに増加した。落下までの時間を記録した。セッション間に５分間の休憩を挟んで、加速セッションを３回繰り返した。マウス当たりの落下までの平均時間を計算し、最終測定値として使用した。
【0043】
次に、ダパンストリルの効果を評価した。動物に水分を過剰に与えること（致命的な心不全を引き起こす可能性がある）を避けるために、ダパンストリルを水中溶解２００ｍｇ/ｋｇで強制経口投与した。ダパンストリルは、ＭＰＴＰの最初の注射の３０分前に投与された。生理食塩水で処理したマウスを対照として使用した。ＭＰＴＰの代わりに腹腔内注射により生理食塩水を投与した偽グループも含めた。
【0044】
ＭＰＴＰ注射後３日目に、ダパンストリルで治療したマウスが転倒するまでの時間が増加したことを観察した。ダパンストリルで治療したマウスは、水で治療したマウスよりも約９０秒長くロータロッドに留待った。さらに、ダパンストリル治療グループと偽グループの間に有意差はなかった。各動物の全体的なロッド性能(ＯＲＰ)は、回転速度に対するロッド上の時間のプロットにおける曲線の下の面積として計算された（図３）。
【0045】
実施例３.ダパンストリルは脳内のＴＮＦαＲＮＡレベルを低下させる
実施例２に記載したように、マウスをダパンストリル又は生理食塩水で処理し、ＭＰＴＰを注射した。
実施例２に記載したように、マウスをダパンストリル又は生理食塩水で処理し、ＭＰＴＰを注射した。
【0046】
ＭＰＴＰの最初の注射から２４時間後、マウスを屠殺した。線条体を中心とした脳の一部を各マウスから採取し、液体窒素中で凍結させた。製造業者のプロトコールに従って、サンプルをＴｒｉｚｏｌ溶解試薬(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ)を用いて均質化した。各サンプルからのＲＮＡ１μｇを、Ｈｉｇｈ－ＣａｐａｃｉｔｙＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット(ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ)を使用して逆転写した。
【0047】
遺伝子発現測定は、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎマスターミックス(AｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ)と推奨される熱サイクルパラメーターを使用したｑＰＣＲによって実行された:９５℃で１０分間のポリメラーゼ活性化を１サイクル、及び９５℃で１５秒間の変性を４０サイクル＋６０℃で１分間のアニーリング/伸長（捕獲）。ＴＮＦα(炎症誘発性サイトカイン)の遺伝子レベルは、ΔΔＣＴ法に従ってＧＡＤＰＨ遺伝子の発現の関係比に対して正規化された。プライマー配列については以下で詳しく説明する。最終的な倍率変化値は、ナイーブ条件で正規化することによって得られた。
ＴＮＦ－Ｆ：ＣＡＧＧＣＧＧＴＧＣＣＴＡＴＧＴＣＴＣ(配列番号１)
ＴＮＦ－Ｒ：ＣＧＡＴＣＡＣＣＣＣＧＡＡＧＴＴＣＡＧＴＡＧ(配列番号２)
ＧＡＰＤＨ－Ｆ：ＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡ(配列番号３)
ＧＡＰＤＨ－Ｒ：ＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＧＴＡＴＴＣＡ(配列番号４)
ＴＮＦ－Ｆ：ＣＡＧＧＣＧＧＴＧＣＣＴＡＴＧＴＣＴＣ(配列番号１)
ＴＮＦ－Ｒ：ＣＧＡＴＣＡＣＣＣＣＧＡＡＧＴＴＣＡＧＴＡＧ(配列番号２)
ＧＡＰＤＨ－Ｆ：ＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＴＣＣＣＡＣＴＣＴＴＣＣＡ(配列番号３)
ＧＡＰＤＨ－Ｒ：ＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＧＴＡＴＴＣＡ(配列番号４)
【0048】
ＴＮＦαＲＮＡの倍率変化を図４に示す。結果は、ダパンストリルが脳内のＴＮＦαＲＮＡの発現を低下させることを示している。
【0049】
実施例４.ダパンストリルは脳内のＩＬ－１８レベルを低下させる
実施例２に記載のように、マウスをダパンストリル又は生理食塩水で処理し、ＭＰＴＰを注射した。
実施例２に記載のように、マウスをダパンストリル又は生理食塩水で処理し、ＭＰＴＰを注射した。
【0050】
ＭＰＴＰの３日後にマウスを屠殺し、脳内のＩＬ－１８レベルを測定した。簡単に言うと、マウスから脳を取り出し、線条体の一部を均質化した。タンパク質のレベルは２ｍｇ/ｍｌに正規化し、ＲａｎｄＤＳｙｓｔｅｍｓのマウスＩＬ－１８ＥＬＩＳＡを使用してＩＬ－１８を測定した。本発明者らは、ダパンストリルでの処置により、水で処置されたマウスと比較して脳内のIL－１８レベルが低下することを発見した(図５)。
【0051】
実施例５.アナキンラは機能の改善をもたらさない
アナキンラは、インターロイキン1受容体アンタゴニスト(ＩＬ－１Ｒａ)である。アナキンラ(１７．３ｋＤａ)は、アミノ末端にメチオニンが付加されていることと、グリコシル化が存在しないことにより、天然のヒトＩＬ－１Ｒａ(２３～２５ｋＤａ)とは異なる。
アナキンラは、インターロイキン1受容体アンタゴニスト(ＩＬ－１Ｒａ)である。アナキンラ(１７．３ｋＤａ)は、アミノ末端にメチオニンが付加されていることと、グリコシル化が存在しないことにより、天然のヒトＩＬ－１Ｒａ(２３～２５ｋＤａ)とは異なる。
【0052】
ダパンストリルが機能レベルで有益な効果を持っていることを実証した後、ロータロッドの性能に対するアナキンラの効果を研究した。ＭＰＴＰの３０分前に、マウスを２０ｍｇ/ｋｇの用量でアナキンラで治療した。アナキンラの投与がＭＰＴＰの機能的影響から脳を保護しないことを観察した。アナキンラで処置したマウスは、生理食塩水で処置した対照マウスと同じ転倒潜時を示した(図６)。これらの結果は、アナキンラの脳への浸透度が低いためであると考えられる。ヒト以外の霊長類におけるアナキンラのＣＳＦ浸透はわずか０．２～０．３％であるため、アナキンラの用量を増やす価値はないと考えられる(Foxetal,J.Neuroimmunol.223:138-140,2010)。
【0053】
実施例６.ダパンストリルは血液脳関門を容易に通過する
本発明者らは、ダパンストリルが血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、脳区画で治療レベルに達することを初めて実証した。ダパンストリル強化飼料ペレット（７．５ｇ/ｋｇ）を自由に摂取することにより、マウスをダパンストリルで２１日間治療した。対照マウスには、ダパンストリルを含まない対応する非強化食餌を与えた。研究中、マウスは、不規則な体重の増減や体温の変化など、生理学的パラメーターの変化がないか監視された。２１日目にマウスを屠殺し、脳を単離した。
本発明者らは、ダパンストリルが血液脳関門（ＢＢＢ）を通過し、脳区画で治療レベルに達することを初めて実証した。ダパンストリル強化飼料ペレット（７．５ｇ/ｋｇ）を自由に摂取することにより、マウスをダパンストリルで２１日間治療した。対照マウスには、ダパンストリルを含まない対応する非強化食餌を与えた。研究中、マウスは、不規則な体重の増減や体温の変化など、生理学的パラメーターの変化がないか監視された。２１日目にマウスを屠殺し、脳を単離した。
【0054】
全脳均質物におけるダパンストリルの測定は、ＳｙｎｅｏｓＨｅａｌｔｈ(ニュージャージー州プリンストン)で実施された。１グループあたり５匹のマウスを評価した。図７に示すように、ダパンストリルは、２１日間の経口投与後に脳内で４７μｇ／ｇのレベルに達した。経口ダパンストリルはＢＢＢを容易に通過し、ＮＬＲＰ３集合を阻害するのに必要な濃度よりも少なくとも３０倍高い脳内レベルを維持する。ダパンストリルが経口投与された場合でもＢＢＢを通過する能力は、ＰＤのような慢性患者の治療に潜在的な進歩をもたらす。
【0055】
実施例７.ダパンストリルはＭＰＴＰに関連する運動機能障害を救済する
次に、ＭＰＴＰの急性投与後のマウスの運動能力にその投与が影響するかどうかを試験した。この目的のために、マウスの運動能力を、実施例２に記載した加速ロータロッド試験を使用して評価した。９匹のマウスを偽物＋生理食塩水グループに使用した。ＭＰＴＰ＋生理食塩水グループには１２匹のマウスを使用した。ＭＰＴＰ＋ダパンストリルグループでは、６０ｍｇ/ｋｇ及び２００ｍｇ/ｋｇの用量でそれぞれ９匹及び１４匹のマウスを使用した。
次に、ＭＰＴＰの急性投与後のマウスの運動能力にその投与が影響するかどうかを試験した。この目的のために、マウスの運動能力を、実施例２に記載した加速ロータロッド試験を使用して評価した。９匹のマウスを偽物＋生理食塩水グループに使用した。ＭＰＴＰ＋生理食塩水グループには１２匹のマウスを使用した。ＭＰＴＰ＋ダパンストリルグループでは、６０ｍｇ/ｋｇ及び２００ｍｇ/ｋｇの用量でそれぞれ９匹及び１４匹のマウスを使用した。
【0056】
ダパンストリルは、最初のＭＰＴＰ注射の１時間前に腹腔内投与された。ダパンストリルの２つの異なる用量、６０ｍｇ/ｋｇと２００ｍｇ/ｋｇを使用した。溶液は毎日新たに調製した。ダパンストリルの投与は、実験が終了するまで１日１回繰り返した。腹腔内注射の媒体として生理食塩水を使用した。急性ＭＰＴＰレジメンは腹腔内注射の繰り返しにより体液過負荷を引き起こす可能性があるため、最初のダパンストリル投与は同じ濃度で強制経口投与によって行われた。経口強制経口投与の媒体として水を使用した。
【0057】
図８Ｂに示すように、ＭＰＴＰ＋生理食塩水群のマウスの約５０％は、速度が６ｃｍ／秒に増加する前であっても、回転円筒上で失敗し；７ｍ/ｓに達したものはなかった。より低用量のダパンストリル(６０ｍｇ/ｋｇ)で処置したマウスは、ＭＰＴＰ＋生理食塩水グループと比較して有意な改善を示さなかったが、増加傾向が観察された(図８Ａ－８Ｂ)。しかし、より高用量のダパンストリル（２００ｍｇ/ｋｇ）での治療は、転倒までの時間を２倍（ｐ＜０．００１）にすることにより、ＭＰＴＰに関連する運動能力を回復した（図８Ａ）。さらに、ロータロッド装置上に落ちるまでの時間は、偽マウスとほぼ同じであった（図８Ａ）。偽＋生理食塩水群と同様に、２００ｍｇ／ｋｇの用量で処置したマウスの約５０％が７ｃｍ／秒の速度に達し、そのうちの７％は８ｃｍ／秒にさえ達した（図８Ｂ）。従って、行動レベルでは、ダパンストリルがＭＰＴＰ神経毒性に関連する機能障害を防止することを、ロータロッド装置での運動パフォーマンスを通じて実証する。
【0058】
実施例８.ダパンストリルはＭＰＴＰの全身性炎症を調節する
運動活動に対するダパンストリルの保護効果を実証した後、全身性炎症に対するＭＰＴＰの効果を調べた。ＭＰＴＰの急性投与の７日後、各マウスから末梢血と脾臓を分離し、末梢血の血液学的変化と脾臓でのサイトカイン産生を評価した。運動機能により、２００ｍｇ/ｋｇのダパンストリルの用量がＭＰＴＰの効果を回復することが実証されたため、残りの実験ではこの用量を投与した。ＨｅｍａＴｒｕｅセルカウンター(Ｈｅｓｋａ、コロラド州ラブランド)を使用して、末梢血から白血球、リンパ球、単球、及び顆粒球を測定した。脾臓を単離し、ＰＢＳ中で７０μｍのセルストレーナー(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ)に機械的に通した。細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地（Ｃｏｒｉｎｇ、ニューヨーク州ニューヨーク州）中で２００，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種した。その後、細胞を１μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。ＲＰＭＩ培地を対照として使用した。７２時間後、上清を単離してＩＬ－６のレベルを測定した。プロテアーゼ阻害剤(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ)を添加したＲＩＰＡ緩衝液(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ)で細胞を溶解し、ＩＬ－１αレベルを測定した。どちらの場合も、１グループあたり５～６匹のマウスを使用した。
運動活動に対するダパンストリルの保護効果を実証した後、全身性炎症に対するＭＰＴＰの効果を調べた。ＭＰＴＰの急性投与の７日後、各マウスから末梢血と脾臓を分離し、末梢血の血液学的変化と脾臓でのサイトカイン産生を評価した。運動機能により、２００ｍｇ/ｋｇのダパンストリルの用量がＭＰＴＰの効果を回復することが実証されたため、残りの実験ではこの用量を投与した。ＨｅｍａＴｒｕｅセルカウンター(Ｈｅｓｋａ、コロラド州ラブランド)を使用して、末梢血から白血球、リンパ球、単球、及び顆粒球を測定した。脾臓を単離し、ＰＢＳ中で７０μｍのセルストレーナー(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ)に機械的に通した。細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地（Ｃｏｒｉｎｇ、ニューヨーク州ニューヨーク州）中で２００，０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレートに播種した。その後、細胞を１μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌのＬＰＳで刺激した。ＲＰＭＩ培地を対照として使用した。７２時間後、上清を単離してＩＬ－６のレベルを測定した。プロテアーゼ阻害剤(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ)を添加したＲＩＰＡ緩衝液(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ)で細胞を溶解し、ＩＬ－１αレベルを測定した。どちらの場合も、１グループあたり５～６匹のマウスを使用した。
【0059】
図９に示すように、ＭＰＴＰは、末梢の循環白血球、特にリンパ球及び顆粒球の数を減少させた。しかし、ダパンストリルの投与後、これらの細胞の数はそれぞれ２４％及び３３％と有意に増加した(図９)。ＭＰＴＰに供したマウスの培養脾臓細胞において、細胞内ＩＬ－１αの発現増加が観察された（図１０Ａ）。ダパンストリルで治療したマウスの脾細胞は、ＩＬ－１αレベルの４０％の大幅な減少を示した。ＩＬ－６については、ＭＰＴＰの効果を回復するダパンストリルで非常に類似した結果が得られた(図１０B)。
【0060】
実施例９.ダパンストリルの投与は脳内の炎症誘発性サイトカインのレベルを低下させる
ＭＰＴＰの投与により、脳内でＮＬＰＲ３インフラマソームの集合が誘導されることが報告されている。ＭＰＴＰ投与の４日後及び７日後に、マウスを頸椎脱臼により麻酔後に屠殺した。脳を収集し、両半球の線条体(Ｓｔ)及び腹側中脳(ＶＭ)領域を切除し、液体窒素で凍結した。サンプルを、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒ(Ｑｉａｇｅｎ、メリーランド州ジャーマンタウン)を使用して、プロテアーゼ阻害剤(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ)を補充したＲＩＰＡ緩衝液(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム)中で均質化した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ)を製造元の指示に従って使用して測定した。サンプルを同じ抽出緩衝液で２ｍｇ/ｍｌに希釈した。
ＭＰＴＰの投与により、脳内でＮＬＰＲ３インフラマソームの集合が誘導されることが報告されている。ＭＰＴＰ投与の４日後及び７日後に、マウスを頸椎脱臼により麻酔後に屠殺した。脳を収集し、両半球の線条体(Ｓｔ)及び腹側中脳(ＶＭ)領域を切除し、液体窒素で凍結した。サンプルを、ＴｉｓｓｕｅＲｕｐｔｏｒ(Ｑｉａｇｅｎ、メリーランド州ジャーマンタウン)を使用して、プロテアーゼ阻害剤(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ)を補充したＲＩＰＡ緩衝液(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム)中で均質化した。タンパク質濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ)を製造元の指示に従って使用して測定した。サンプルを同じ抽出緩衝液で２ｍｇ/ｍｌに希釈した。
【0061】
脳均質物からのＩＬ－１β、ＩＬ－１８、ＩＬ－６、及びＩＬ－１７ＡのレベルをＥＬＩＳＡＤｕｏＳｅｔキット(Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州)によって測定した。ＩＬ－１β用ＥＬＩＳＡキットは、このサイトカインの１７ｋＤａ型の９２～９５％を検出するが、前駆体型の８～５％のみを検出する。９６ウェルプレート(ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)を捕捉抗体でコーティングした。サンプルを室温で２時間インキュベートした。検出抗体とストレプトアビジン－ＨＲＰを追加した。ＴＭＢＥＬＩＳＡ(ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ,カリフォルニア州サンディエゴ)を基質溶液として使用した。結果はマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｔｅｋ、カリフォルニア州サンタクララ）で測定された。最終値は、各サンプルのタンパク質濃度によって正規化された。各サイトカインに対して、１グループ当たり４～５匹のマウスを使用した。
【0062】
ＮＬＲＰ３阻害に対するダパンストリルの効果を評価するために、まずＮＬＲＰ３インフラマソームの下流サイトカインであるＩＬ－１β及びＩＬ－１８のレベルを測定した。ＩＬ－１β及びＩＬ－１８を、ＭＰＴＰの急性投与の４日後にＳｔ及びＶＭで測定した。ＩＬ－１βのレベルは、４日目にＳｔ及びＶＭにおいて有意に増加し、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化を確認した（図１１Ａ～１１Ｂ）。Ｓｔでは、ダパンストリルでの処置により、ＩＬ－１βのレベルが４日目で２４％有意に減少し(図１１Ａ)、基礎状態に達した。ＶＭでは、ダパンストリルに関連する変化は検出されなかった(図１１Ｂ)。ＩＬ－１８のレベルは、脳の両方の領域で有意に上昇した(図１１Ｃ～１１Ｄ)。Ｓｔにおいて、ダパンストリルで処置したマウスは、生理食塩水で処置したＭＰＴＰマウスと比較して、ＩＬ－１８レベルの１５％の減少を示した（図１１Ｃ）。ＳｔにおけるＩＬ－１８レベルのダパンストリル依存性低下は、実施例４で以前に得られた結果と一致する。ＩＬ－１βで起こったように、ＶＭではダパンストリルに関連する変化は観察されなかった(図１１Ｄ)。
【0063】
ダパンストリルがＩＬ－１βとＩＬ－１８を減少させることを確認した後、ＩＬ－１βの影響を受ける他の炎症誘発性サイトカインを測定した。ＩＬ－１βの下流サイトカインとしてＩＬ－６とＩＬ－１７Ａに注目し、ＭＰＴＰの急性投与から７日後にそれらのレベルを測定した。ＩＬ－６については、ＭＰＴＰが脳の両方の領域のレベルを増加させることが観察された(図１１Ｅ～１１Ｆ)。ダパンストリルはレベルを２６％有意に低下させ、Ｓｔの基礎状態に達した（図１１Ｅ）。ＶＭでは影響は検出されなかった(図１１Ｆ)。ＩＬ－１７Ａについては、ＳｔではＭＰＴＰによる変化は観察されなかったが(図１１Ｇ)、ＶＭではレベルが３０％有意に増加した(ｐ＜０．０１)(図１１Ｈ)。これは、脳のこの領域におけるＩＬ－１７Ａの同様の動態を示す以前の報告を裏付けるものである。処置後、ダパンストリルは、ＩＬ－１７Ａレベルを５８ｐｇ／μｇから４６ｐｇ／μｇに有意に（ｐ＜０．０５）減少させ、これはシャムマウスとほぼ同じであった（図１１Ｈ）。まとめると、サイトカイン動態に関するデータは、ＭＰＴＰが活性化ＮＬＲＰ３に特徴的な炎症反応を誘導し、ダパンストリルがこれらのサイトカインのレベルを効果的に低下させ、炎症反応を調節することを示している。ＮＬＲＰ３直接サイトカインであるＩＬ－１β及びＩＬ－１８だけでなく、下流サイトカインであるＩＬ－６及びＩＬ－１７にも変化が観察された。従って、ダパンストリルは、脳内のＩＬ－１β及びＩＬ－１８のレベルを低下させることに加えて、ＩＬ－６及びＩＬ－１７Ａのレベルも低下させた。これらのデータは、ダパンストリルがＰＤにおける適応免疫応答の調節に有効であることを示唆している。
【0064】
実施例１０.ダパンストリルは線条体のＴＲＥＭ２レベルを維持する
この実施例では、ダパンストリル治療後の骨髄細胞誘発受容体ＩＩ(ＴＲＥＭ２)のレベルを測定した。ＴＲＥＭ２はＰＤ治療の潜在的な標的となる可能性がある。ＴＲＥＭ２の場合、ＭＰＴＰの急性投与後４日目にマウスを屠殺した。Ｓｔを切除し、実施例９に記載したようにタンパク質を抽出し、定量した。サンプル当たり３０μｇのタンパク質を、０．１％ＳＤＳランニング緩衝液（Bio-Rad）中のＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮＴＧＸ４－２０％勾配ゲル（Bio-Rad、Hercules、CA）で分離した。ゲルを０．１μＭのニトロセルロース膜（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、イリノイ州シカゴ）に移した。膜を、ＴＢＳ０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）溶液中の５％ブロッキング緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて室温で１時間ブロックした。サンプルをマウスＴＲＥＭ２に対する一次抗体(１：１０００、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ、マサチューセッツ州ダンバーズ)と共に一晩インキュベートした。ペルオキシダーゼ結合二次抗体(ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルベニア州フィラデルフィア)及び化学発光を使用して、タンパク質濃度を検出した。β－アクチンに対する結合抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、テキサス州ダラス）を使用してタンパク質濃度を正規化した。ＮＩＨＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、個々のマウスのモノマー及びオリゴマーのタンパク質バンドを定量化した。１グループ当たり４匹のマウスを使用した。
この実施例では、ダパンストリル治療後の骨髄細胞誘発受容体ＩＩ(ＴＲＥＭ２)のレベルを測定した。ＴＲＥＭ２はＰＤ治療の潜在的な標的となる可能性がある。ＴＲＥＭ２の場合、ＭＰＴＰの急性投与後４日目にマウスを屠殺した。Ｓｔを切除し、実施例９に記載したようにタンパク質を抽出し、定量した。サンプル当たり３０μｇのタンパク質を、０．１％ＳＤＳランニング緩衝液（Bio-Rad）中のＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮＴＧＸ４－２０％勾配ゲル（Bio-Rad、Hercules、CA）で分離した。ゲルを０．１μＭのニトロセルロース膜（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、イリノイ州シカゴ）に移した。膜を、ＴＢＳ０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ（登録商標）溶液中の５％ブロッキング緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて室温で１時間ブロックした。サンプルをマウスＴＲＥＭ２に対する一次抗体(１：１０００、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ、マサチューセッツ州ダンバーズ)と共に一晩インキュベートした。ペルオキシダーゼ結合二次抗体(ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルベニア州フィラデルフィア)及び化学発光を使用して、タンパク質濃度を検出した。β－アクチンに対する結合抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、テキサス州ダラス）を使用してタンパク質濃度を正規化した。ＮＩＨＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、個々のマウスのモノマー及びオリゴマーのタンパク質バンドを定量化した。１グループ当たり４匹のマウスを使用した。
【0065】
ＴＲＥＭ２のタンパク質レベルは、ＭＰＴＰの急性投与後４日目に脳のＳｔ領域で測定された。ＭＰＴＰは、非グリコシル化形態のＴＲＥＭ２（２８ｋＤａ）のレベルを２５％減少させた（図１２Ａ～１２Ｂ）。ダパンストリルでの治療後、ＴＲＥＭ２のレベルは有意に増加し、基礎状態に達した(図１２Ａ～１２Ｂ)。３５ｋＤａグリコシル化型のＴＲＥＭ２の場合、ＭＰＴＰに関連する変化はなく、ダパンストリルも検出されなかった（図１２Ａ、１２Ｃ）。ＭＰＴＰ後に増加傾向が観察されるが、差は有意ではなかった。これらの結果は、ダパンストリルによるＮＬＲＰ３阻害がＭＰＴＰマウスのＳｔにおけるＴＲＥＭ２レベルを増加させ、ドーパミン作動性ニューロンの保存と相関することを示した。ＴＲＥＭ２発現におけるこの変化は、そのグリコシル化パターンに影響を与えなかった。これらの発見は、ＮＬＲＰ３を標的とすることによってＴＲＥＭ２レベルを調節する新しいシステムを推測している。
【0066】
実施例１１.ダパンストリルは腹側中脳におけるα－シヌクレインの凝集を防止する
ＭＰＴＰは亜急性レジメン後のα－シヌクレイン凝集を促進するため、このタンパク質のレベルに対するダパンストリルの効果を評価した。ＭＰＴＰの最後の注射から２４時間後に、マウスを屠殺した。ＶＭを切除し、実施例９に記載したようにタンパク質を分離した。以前の出版物に従って、α－シヌクレイン蓄積を評価するための領域としてＶＭを選択した。マウスα－シヌクレイン(１：１０００、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ)及びペルオキシダーゼ結合二次抗体(ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ)を使用した。１グループ当たり４～５匹のマウスを使用した。α－シヌクレインのレベルをウェスタンブロットによって測定した。図１３Ａ～１３Ｂに示すように、２．５倍上昇したＭＰＴＰは、α－シヌクレインの単量体形態（１７ｋＤａ）のレベルを変化させる。これは、異なるオリゴマー形態（１５０～３０ｋＤａ）の増加（１．５倍の変化）によって反映されるα－シヌクレインのより高い凝集と相関する（図１３Ｃ）。ダパンストリルは、α－シヌクレインのモノマー及びオリゴマーの両方のレベルを有意に減少させた(図１３Ｂ～１３Ｃ)。
ＭＰＴＰは亜急性レジメン後のα－シヌクレイン凝集を促進するため、このタンパク質のレベルに対するダパンストリルの効果を評価した。ＭＰＴＰの最後の注射から２４時間後に、マウスを屠殺した。ＶＭを切除し、実施例９に記載したようにタンパク質を分離した。以前の出版物に従って、α－シヌクレイン蓄積を評価するための領域としてＶＭを選択した。マウスα－シヌクレイン(１：１０００、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ)及びペルオキシダーゼ結合二次抗体(ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ)を使用した。１グループ当たり４～５匹のマウスを使用した。α－シヌクレインのレベルをウェスタンブロットによって測定した。図１３Ａ～１３Ｂに示すように、２．５倍上昇したＭＰＴＰは、α－シヌクレインの単量体形態（１７ｋＤａ）のレベルを変化させる。これは、異なるオリゴマー形態（１５０～３０ｋＤａ）の増加（１．５倍の変化）によって反映されるα－シヌクレインのより高い凝集と相関する（図１３Ｃ）。ダパンストリルは、α－シヌクレインのモノマー及びオリゴマーの両方のレベルを有意に減少させた(図１３Ｂ～１３Ｃ)。
【0067】
実施例１２.ダパンストリルはドーパミン作動性ニューロンをＭＰＴＰ誘発細胞死から保護する
ドーパミン作動性ニューロンに対するダパンストリルの効果を評価するために、マウスにＭＰＴＰ急性投与を行った。ドーパミン作動性ニューロンのレベルが低下した７日後、チロシンヒドロキシラーゼ(ＴＨ)免疫染色によって黒質線条体経路を評価し、ドーパミン作動性ニューロンの生存率を評価した。マウスをＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で灌流した。脳を取り出し、同じ灌流緩衝液に一晩浸漬し、その後、０．１ＭＰＢＳ中の３０％スクロースで４℃で凍結保護した。脱水後、サンプルを切片作成のためにパラフィン型に埋め込んだ。Ｓｔ及びＳＮｐｃを含む冠状脳切片(厚さ４μｍ)を取得し、顕微鏡スライドガラスに移した。抗原回復後、スライドを一次抗ＴＨ抗体(１：２０００、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、英国)と共に室温で３０分間インキュベートした。ＴＨ抗体の結合は、抗ウサギＨＲＰ結合二次ポリマーを使用して検出され、続いてジアミノベンジジン(ＤＡＢ、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ)を使用して発色視覚化された。ヘマトキシリン対比染色を使用して核を視覚化した。サンプルの処理は、ＩｎｏｔｉｖＢｏｕｌｄｅｒ(コロラド州ボルダー)によって実行された。Ｓｔにおけるドーパミン作動性免疫反応性は、ＮＩＨＩｍａｇｅＪソフトウェアで積分密度を測定することによって計算された。ＳＮｐｃにおける立体的な計数は、ＴＨ陽性ニューロンの手動定量化によって実行された。マウス当たり３つの切片を使用した。５匹のマウスを偽＋生理食塩水グループに使用し、７匹のマウスをＭＰＴＰグループに使用した。
ドーパミン作動性ニューロンに対するダパンストリルの効果を評価するために、マウスにＭＰＴＰ急性投与を行った。ドーパミン作動性ニューロンのレベルが低下した７日後、チロシンヒドロキシラーゼ(ＴＨ)免疫染色によって黒質線条体経路を評価し、ドーパミン作動性ニューロンの生存率を評価した。マウスをＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で灌流した。脳を取り出し、同じ灌流緩衝液に一晩浸漬し、その後、０．１ＭＰＢＳ中の３０％スクロースで４℃で凍結保護した。脱水後、サンプルを切片作成のためにパラフィン型に埋め込んだ。Ｓｔ及びＳＮｐｃを含む冠状脳切片(厚さ４μｍ)を取得し、顕微鏡スライドガラスに移した。抗原回復後、スライドを一次抗ＴＨ抗体(１：２０００、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、英国)と共に室温で３０分間インキュベートした。ＴＨ抗体の結合は、抗ウサギＨＲＰ結合二次ポリマーを使用して検出され、続いてジアミノベンジジン(ＤＡＢ、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ)を使用して発色視覚化された。ヘマトキシリン対比染色を使用して核を視覚化した。サンプルの処理は、ＩｎｏｔｉｖＢｏｕｌｄｅｒ(コロラド州ボルダー)によって実行された。Ｓｔにおけるドーパミン作動性免疫反応性は、ＮＩＨＩｍａｇｅＪソフトウェアで積分密度を測定することによって計算された。ＳＮｐｃにおける立体的な計数は、ＴＨ陽性ニューロンの手動定量化によって実行された。マウス当たり３つの切片を使用した。５匹のマウスを偽＋生理食塩水グループに使用し、７匹のマウスをＭＰＴＰグループに使用した。
【0068】
予想通り、ＭＰＴＰの投与は、偽マウスと比較してＳｔ線維のレベルを４５％減少させた（図１４Ａ、１４Ｃ）。ＳＮｐｃでは、ＭＰＴＰにより陽性ニューロンの数が４０００から１０００に減少した(図１４Ｂ、１４Ｄ)。ダパンストリルによる治療は、ＭＰＴＰの有害な影響からドーパミン作動性ニューロンを保護した。Ｓｔの場合、ダパンストリルで処置したマウスは、生理食塩水で処置したＭＰＴＰマウスと比較して、ＴＨ陽性線維密度の増加（ｐ＜０．０５）を示した（図１４Ａ、１４Ｃ）。ＳＮｐｃにおけるＴＨ陽性ニューロンも、ダパンストリル処理後に３倍増加した(図１４Ｂ、１４Ｄ)。さらに、ダパンスリルで処置したマウスでは、対照マウスに対して有意な変化は観察されなかった。ダパンストリルがＭＰＴＰによって引き起こされる毒性によってドーパミン作動性ニューロンを保護すると結論付けた。これらの所見は、実施例１１に示されるα－シヌクレインレベルの減少と相関する。
【0069】
総合すると、これらのデータは、ダパンストリルが炎症反応の調節、α－シヌクレインレベルの低下、ドーパミン作動性ニューロンの保護を通じてＰＤの臨床的特徴を最小限に抑える治療として機能することを示している。
【0070】
本発明、及びその製造及び使用の方法及びプロセスを、本発明に関連する当業者が製造及び使用できるように完全、明確、簡潔かつ正確な用語で説明する。以上は本発明の好ましい実施形態について説明しており、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲から逸脱することなく変更を加えることができることを理解されたい。発明とみなされる主題を特に指摘し、明確に請求するために、以下の特許請求の範囲によって明細書が締めくくられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【配列表】
【国際調査報告】