▶ モジア バイオテック ピーティーイー．リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-18
(54)【発明の名称】一炭素利用のための直交性代謝フレームワーク
(51)【国際特許分類】
C12N 9/10 20060101AFI20240910BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240910BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240910BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240910BHJP
【ＦＩ】
C12N9/10
C12N1/21 ZNA
C12N15/31
C12N15/54
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024509068
(86)(22)【出願日】2022-08-16
(85)【翻訳文提出日】2024-03-29
(86)【国際出願番号】 US2022040516
(87)【国際公開番号】W WO2023023097
(87)【国際公開日】2023-02-23
(31)【優先権主張番号】63/233,589
(32)【優先日】2021-08-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524014802
【氏名又は名称】モジア バイオテック ピーティーイー．リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100095832
【弁理士】
【氏名又は名称】細田 芳徳
(74)【代理人】
【識別番号】100187850
【弁理士】
【氏名又は名称】細田 芳弘
(72)【発明者】
【氏名】ゴンザレス，ラモン
(72)【発明者】
【氏名】チョウ，アレキサンダー
(72)【発明者】
【氏名】コロンバーグ，ジェームズ
(72)【発明者】
【氏名】ジュー，ファーイン
(72)【発明者】
【氏名】リー，スン ウォン
(72)【発明者】
【氏名】ネザミラド，モハマドレザ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01Y
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BB02
4B065BB04
4B065BB06
4B065BB07
4B065BB09
4B065CA05
4B065CA08
4B065CA10
4B065CA29
(57)【要約】
中間生成物として中心代謝構築ブロックを生じることなく、C1基質を、1つより多くの炭素を含む生成物に変換するための系および方法が提供される。一態様において、該系/方法は、ホルミル-CoA伸長(FORCE)反応に基づいたC1利用のための直交性のプラットフォームを可能にする生化学的経路を含み得る。一態様において、該系/方法は、ホルミル-CoAとカルボニル含有分子の間のアシロイン縮合を含み得る。一態様において、該系/方法は、酵素2-ヒドロキシアシル-CoAリアーゼ(HACL)により触媒される反応を含み得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ロドスピリルム目細菌URHD0017 2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼと比較して、酵素的に、少なくとも2倍、代替的に3倍速い速度でのカルボニル含有化合物およびホルミル-CoAからの2-ヒドロキシアシル-CoAの形成が可能である組換え2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼ。
【請求項2】
カルボニル含有化合物が、アルデヒドおよびケトンからなる群より選択される、請求項１記載の酵素。
【請求項3】
2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼが表1または表2から選択される、請求項１記載の酵素。
【請求項4】
2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼが、表1または表2における酵素に対して90%以上の同一性を有する、請求項３記載の酵素。
【請求項5】
一炭素基質と酵素触媒を接触させることによりホルミル-CoAを作製することをさらに含む、請求項１～４いずれか記載の酵素。
【請求項6】
基質と酵素触媒を接触させることにより基質をカルボニル含有化合物に変換することをさらに含む、請求項１～４いずれか記載の酵素。
【請求項7】
2-ヒドロキシアシル-CoAを有機化学生成物に変換することをさらに含む、請求項１～４いずれか記載の酵素。
【請求項8】
カルボニル含有化合物が少なくとも1つの置換基を有するアルデヒドである、請求項１～４いずれか記載の酵素。
【請求項9】
アルデヒド置換基がヒドロキシルである、請求項８記載の酵素。
【請求項10】
アルデヒド置換基がカルボニルである、請求項８記載の酵素。
【請求項11】
アルデヒド置換基がカルボキシルである、請求項８記載の酵素。
【請求項12】
アルデヒド置換基がアルキルである、請求項８記載の酵素。
【請求項13】
アルデヒド置換基がアルケニルである、請求項８記載の酵素。
【請求項14】
アルデヒド置換基がアルキニルである、請求項８記載の酵素。
【請求項15】
アルデヒド置換基がアミンである、請求項８記載の酵素。
【請求項16】
カルボニル含有化合物がケトンである、請求項１～４いずれか記載の酵素。
【請求項17】
ケトンがメチルケトンである、請求項１６記載の酵素。
【請求項18】
一炭素基質がホルムアルデヒドであり、ホルミル-CoAを生じる酵素触媒が：a. ホルムアルデヒドのホルミル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAレダクターゼ(アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ)
である、請求項５記載の酵素。
【請求項19】
一炭素基質がメタノールであり、ホルミル-CoAを生じる酵素触媒が：a. メタノールのホルムアルデヒドへの変換を触媒するメタノールデヒドロゲナーゼ；および
b. ホルムアルデヒドのホルミル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAレダクターゼ(アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ)
である、請求項５記載の酵素。
【請求項20】
一炭素基質がメタンであり、ホルミル-CoAを生じる酵素触媒が：a. メタンのメタノールへの変換を触媒するメタンモノオキシゲナーゼ；
b. メタノールのホルムアルデヒドへの変換を触媒するメタノールデヒドロゲナーゼ；および
c. ホルムアルデヒドのホルミル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAレダクターゼ(アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ)
である、請求項５記載の酵素。
【請求項21】
一炭素基質が蟻酸塩であり、ホルミル-CoAを生じる酵素触媒が：a. 蟻酸塩のホルミル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンターゼ；または
b. 蟻酸塩のホルミル-リン酸塩への変換を触媒する蟻酸塩キナーゼおよびホルミル-リン酸塩のホルミル-CoAへの変換を触媒するリン酸ホルミル-トランスフェラーゼ
である、請求項５記載の酵素。
【請求項22】
一炭素基質が二酸化炭素であり、ホルミル-CoAを生じる酵素触媒が：a. 二酸化炭素の蟻酸塩への変換を触媒する二酸化炭素レダクターゼ；および
b. 蟻酸塩のホルミル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンターゼ；または
c. 蟻酸塩のホルミル-リン酸塩への変換を触媒する蟻酸塩キナーゼおよびホルミル-リン酸塩のホルミル-CoAへの変換を触媒するリン酸ホルミル-トランスフェラーゼ
である、請求項５記載の酵素。
【請求項23】
2-ヒドロキシアシル-CoA由来の生成物がアルデヒドであり、2-ヒドロキシアシル-CoAを該生成物に変換する酵素触媒が：a. 2-ヒドロキシアシル-CoAのアルデヒドへの変換を触媒するアシル-CoAレダクターゼ
である、請求項７または８記載の酵素。
【請求項24】
2-ヒドロキシアシル-CoA由来の生成物がアルコールであり、2-ヒドロキシアシル-CoAを該生成物に変換する酵素触媒が：a. 2-ヒドロキシアシル-CoAのアルデヒドへの変換を触媒するアシル-CoAレダクターゼ；および
b. アルデヒドのアルコールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼ(アルデヒドレダクターゼ)
である、請求項７または８記載の酵素。
【請求項25】
2-ヒドロキシアシル-CoA由来の生成物がカルボン酸であり、2-ヒドロキシアシル-CoAを該生成物に変換する酵素触媒が：a. 2-ヒドロキシアシル-CoAのカルボン酸への変換を触媒するチオエステラーゼ
である、
請求項７または８記載の酵素。
【請求項26】
酵素触媒が、それぞれの酵素を発現するための遺伝子を有する組換え微生物に含まれる、請求項１～７いずれか記載の酵素。
【請求項27】
基質が、任意にバッファ、塩、ビタミン、無機物を含む水性媒体中に酵素触媒を含む組換え微生物と接触される、請求項２６記載の酵素。
【請求項28】
基質が、任意にバッファ、塩、ビタミン、無機物および補因子を含む水性反応混合物へのそれぞれの添加により、酵素触媒と接触される、請求項１～７いずれか記載の酵素。
【請求項29】
酵素触媒が粗製細胞抽出物として提供される、請求項２８記載の酵素。
【請求項30】
酵素触媒が精製されたタンパク質として提供される、請求項２８記載の酵素。
【請求項31】
請求項１～３０いずれか記載の少なくとも1つの異種酵素を含む改変された生物であって、一炭素基質上で増殖でき、異種酵素なしでは一炭素基質上で増殖できない、改変された生物。
【請求項32】
細菌である、請求項３１記載の改変された生物。
【請求項33】
細菌が大腸菌である、請求項３１または３２記載の改変された生物。
【請求項34】
2つ以上の改変された酵素を含む、請求項３１～３３いずれか記載の改変された生物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願についての他所参照
本願は、2021年8月16日に出願された米国仮特許出願63/233,589に対する優先権を主張し、その内容は、その全体において参照により本明細書に援用される。
本願は、2021年8月16日に出願された米国仮特許出願63/233,589に対する優先権を主張し、その内容は、その全体において参照により本明細書に援用される。
【0002】
連邦政府に支援された研究または開発に関する陳述
本発明は、米国エネルギー省およびJoint Genome Instituteにより与えられた授与番号DE-AR0001508およびDE-EE0008499の下、政府支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
本発明は、米国エネルギー省およびJoint Genome Instituteにより与えられた授与番号DE-AR0001508およびDE-EE0008499の下、政府支援によりなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【0003】
背景
1. 開示の分野
本開示は、炭素含有基質の生成物への生物変換の分野に関する。
1. 開示の分野
本開示は、炭素含有基質の生成物への生物変換の分野に関する。
【0004】
2. 背景の記載
代謝は、生物の生存および生殖能力を最適化するために進化した、全ての生体細胞の保存された特徴の1つである。単細胞細菌からヒトほどに複雑な生物までの全ての生物は、細胞性構成要素および代謝生成物の生合成のために炭素およびエネルギー源が利用される異化(分解)および同化(合成)経路の間の連結として働く中心代謝に伴って進化したカノニカルな代謝の体系を示す。しばしば「ボウタイ(bow-tie)」または「砂時計」体系と称されるこの構造は、一炭素(「C1」)基質の代謝により例示され得る。
代謝は、生物の生存および生殖能力を最適化するために進化した、全ての生体細胞の保存された特徴の1つである。単細胞細菌からヒトほどに複雑な生物までの全ての生物は、細胞性構成要素および代謝生成物の生合成のために炭素およびエネルギー源が利用される異化(分解)および同化(合成)経路の間の連結として働く中心代謝に伴って進化したカノニカルな代謝の体系を示す。しばしば「ボウタイ(bow-tie)」または「砂時計」体系と称されるこの構造は、一炭素(「C1」)基質の代謝により例示され得る。
【0005】
しかしながら、ほとんどが有する頑強さおよび可塑性は、実質的な遺伝子工学で作り変える困難さを提示する。例えば、前駆体代謝産物を生じそのの使用のバランスを取る必要性のうち、多くの細胞は、経路のフラックスを制御するための複雑で規則的な機構を進化させた。さらに、所望の化合物の利用または合成を最大化することとは反対に、代謝経路は進化および所定の適合性利点により形作られたので、天然の経路はしばしば、固有の代謝的非効率および生成物形成と成長維持反応の間の負のクロストークのために、達成可能な生成物の力価、速度および収率を制限する。天然および合成の経路の両方を含むこれらの分子からの生物学的生成物合成に向かう現在のアプローチは、C1同化、中心代謝および標的化学物質の有効な産生のための生成物合成経路を同時に遺伝子工学的に作り変えなければならないので、これは再度、C1基質により要約される。そのため、C1分子は成長のために微生物により利用され得るが、C1供給原料からの工業的化学物質の生物学的産生およびC1基質上の工業的有機体の効率的な成長は、かかるプロセスの誘因および機会に関わらず、開かれた困難さを残す。今日まで、合成経路または新規の酵素設計を開発するものであっても、C1生物変換を遺伝子工学的に作り変える試みは、炭素源としておよび/または生成物合成のために種々のC1基質を利用するための中心的な炭素代謝に頼ってきた。これらの設計は、C1生物変換を収容するための宿主の代謝ネットワークを配線しなおすことを必要としており、これは難題であることが明らかにされた。
【発明の概要】
【0006】
概要
C1基質からの工業的化学物質などの生成物の作製は、直交性(orthogonal)の生物系の使用により容易にされ得る。直交性の系は、それらの生物学的状況に影響を与えるかまたはそれにより影響を受ける可能性が低く、天然の部分を改変するかまたは別の目的で使用する(repurposing)ことと比較して、より予測可能で一貫した挙動を可能にする。中心の代謝を迂回する標的生成物への経路は、より直接的であり(すなわちより少ない工程)、多くの固有の規則的な機構ならびに炭素およびエネルギーの非効率を回避し得るので、直交性の代謝規範は、ボウタイ体系内での遺伝子工学的作り変えの強力な代替物であり得る。
C1基質からの工業的化学物質などの生成物の作製は、直交性(orthogonal)の生物系の使用により容易にされ得る。直交性の系は、それらの生物学的状況に影響を与えるかまたはそれにより影響を受ける可能性が低く、天然の部分を改変するかまたは別の目的で使用する(repurposing)ことと比較して、より予測可能で一貫した挙動を可能にする。中心の代謝を迂回する標的生成物への経路は、より直接的であり(すなわちより少ない工程)、多くの固有の規則的な機構ならびに炭素およびエネルギーの非効率を回避し得るので、直交性の代謝規範は、ボウタイ体系内での遺伝子工学的作り変えの強力な代替物であり得る。
【0007】
C1基質について特異的に、それらは、予め存在する炭素-炭素結合を何ら有さないので、原則的に、所望の生成物に向かう途中で中心的な代謝構築ブロックを最初に作製する理由はない。そのため、適切な生化学を仮定すると、C1分子からの生成物の直接の合成に基づく直交性の代謝フレームワークを確立するための機会が存在する。
【0008】
本開示は、ホルミル-CoA伸長(FORCE)反応に基づくC1利用のための直交性プラットフォームを可能にする生化学経路の概念化および設計に関する。このアプローチは、ホルミル-CoAとカルボニル含有分子の間のアシロイン縮合に頼る。これらの反応は、酵素2-ヒドロキシアシル-CoAリアーゼ(HACL)により触媒され得る。HACL(および関連のある酵素オキサリル-CoAデカルボキシラーゼ、OXC17)は、C1化合物ホルムアルデヒドなどの広い鎖の長さおよび官能基化のカルボニル含有アクセプターを使用して、広範囲の生化学変換に従順なアシル-CoAを作製し得る。生成物合成に加えて、FORCE経路は、宿主微生物に対する天然の基質である多炭素化合物の作製を介する非天然C1基質上での成長を可能にするための基準として働き得る。
【0009】
本開示の一局面において、組換え2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼは、ロドスピリルム(Rhodospiralle)目細菌性URHD0017 2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼと比較して、少なくとも2倍、代替的には3倍高い速度でのカルボニル含有化合物およびホルミル-CoAからの2-ヒドロキシアシル-CoAの酵素的な形成が可能である。
【0010】
いくつかの態様において、カルボニル含有化合物は、アルデヒドおよびケトンからなる群より選択される。いくつかの態様において、2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼは、表1または表2から選択される。いくつかの態様において、2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼは、表1または表2の酵素に対して90%以上の同一性を有する。
【0011】
本開示の別の局面は、一炭素基質と酵素触媒を接触させることによりホルミル-CoAを産生することをさらに含む酵素である。別の局面において、該酵素はさらに、基質と酵素触媒を接触させることにより基質をカルボニル含有化合物に変換することを含む。別の局面において、該酵素はさらに、2-ヒドロキシアシル-CoAを有機化学生成物に変換することを含む。さらに別の局面において、カルボニル含有化合物は、少なくとも1つの置換基を有するアルデヒドである。
【0012】
いくつかの態様において、アルデヒド置換基は、ヒドロキシル、カルボニル、アルキルまたはアミンであり得る。いくつかの態様において、カルボニル含有化合物はケトンであり、ケトンはメチルケトンである。
【0013】
いくつかの態様において、一炭素基質はホルムアルデヒドであり、ホルミル-CoAを生じる酵素触媒は、ホルムアルデヒドのホルミル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAレダクターゼ(アシル化(acylating)アルデヒドデヒドロゲナーゼ)である。
【0014】
いくつかの態様において、一炭素基質はメタノールであり、ホルミル-CoAを生じる酵素触媒は、メタノールのホルムアルデヒドへの変換を触媒するメタノールデヒドロゲナーゼ；およびホルムアルデヒドのホルミル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAレダクターゼ(アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ)である。
【0015】
いくつかの態様において、一炭素基質はメタンであり、ホルミル-CoAを生じる酵素触媒は、メタンのメタノールへの変換を触媒するメタンモノオキシゲナーゼ；メタノールのホルムアルデヒドへの変換を触媒するメタノールデヒドロゲナーゼ；およびホルムアルデヒドのホルミル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAレダクターゼ(アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ)である。
【0016】
いくつかの態様において、一炭素基質は蟻酸塩であり、ホルミル-CoAを生じる酵素触媒は、蟻酸塩のホルミル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンターゼまたは蟻酸塩のホルミル-リン酸塩への変換を触媒する蟻酸塩キナーゼおよびホルミル-リン酸塩のホルミル-CoAへの変換を触媒するリン酸ホルミル-トランスフェラーゼである。
【0017】
いくつかの態様において、一炭素基質は二酸化炭素であり、ホルミル-CoAを生じる酵素触媒は、二酸化炭素の蟻酸塩への変換を触媒する二酸化炭素レダクターゼ；および蟻酸塩のホルミル-CoAへの変換を触媒するアシル-CoAシンターゼ；または蟻酸塩のホルミル-リン酸塩への変換を触媒する蟻酸塩キナーゼおよびホルミル-リン酸塩のホルミル-CoAへの変換を触媒するリン酸ホルミル-トランスフェラーゼである。
【0018】
いくつかの態様において、2-ヒドロキシアシル-CoA由来の生成物はアルデヒドであり、2-ヒドロキシアシル-CoAを該生成物に変換する酵素触媒は、2-ヒドロキシアシル-CoAのアルデヒドへの変換を触媒するアシル-CoAレダクターゼである。
【0019】
いくつかの態様において、2-ヒドロキシアシル-CoA由来の生成物はアルコールであり、2-ヒドロキシアシル-CoAを該生成物に変換する酵素触媒は、2-ヒドロキシアシル-CoAのアルデヒドへの変換を触媒するアシル-CoAレダクターゼ；およびアルデヒドのアルコールへの変換を触媒するアルコールデヒドロゲナーゼ(アルデヒドレダクターゼ)である。
【0020】
いくつかの態様において、2-ヒドロキシアシル-CoA由来の生成物はカルボン酸であり、2-ヒドロキシアシル-CoAを該生成物に変換する酵素触媒は2-ヒドロキシアシル-CoAのカルボン酸への変換を触媒するチオエステラーゼである。
【0021】
いくつかの態様において、酵素触媒は、それぞれの酵素を発現するための遺伝子を有する組換え微生物に含まれる。
【0022】
いくつかの態様において、基質は、バッファ、塩、ビタミン、無機物を任意に含む水性培地中に酵素触媒を含む組換え微生物と接触される。
【0023】
いくつかの態様において、基質は、バッファ、塩、ビタミン、無機物および補因子を任意に含む水性反応混合物へのそれぞれへの添加により酵素触媒と接触される。
【0024】
いくつかの態様において、酵素触媒は粗製細胞抽出物として提供される。いくつかの態様において、酵素触媒は精製されたタンパク質として提供される。
【0025】
本開示の一局面は、本明細書に記載される少なくとも1つの異種酵素を含む改変された生物であり、該生物は、一炭素基質上で増殖し得、該生物は、異種酵素なしで、一炭素基質上で増殖し得ない。
【0026】
いくつかの態様において、改変された生物は細菌である。いくつかの態様において、該生物は2つ以上の改変された酵素を含む。
【図面の簡単な説明】
【0027】
図面の簡単な説明
【図8】図8は、FORCE経路バリアント：a)(ホルム)アルデヒド伸長、b)α還元、c)アルドース伸長を使用する増殖のためのゲノムスケール大腸菌モデル由来のシミュレーションされたフラックスマップの図を示す。
【図19】図19は、開始参照遺伝子としてロドスピリルム目細菌URHD0017 (RuHACL)を用いた34の2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼ(HACS)バリアントの同定のために使用されるバイオプロスペクティング(bioprospecting)戦略を示す。
【図20】図20は、(a)2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼ(HACS)およびアシル-CoAレダクターゼ(LmACR)活性を介したホルムアルデヒドからのグリコール酸塩産生、(b)HACSバリアントをスクリーニングするためのハイスループット静止細胞生物変換プラットフォーム、(c)細胞密度当たりのグリコール酸塩生産性(uM/OD)に対する初期の29のHACSバリアントおよびRuHACLのスクリーニング結果ならびに発現のレベルを示す。
【図21】図21は、(a)2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼ(HACS)およびアシル-CoAレダクターゼ(LmACR)活性を介したホルムアルデヒドからのグリコール酸塩産生を示す。5mMホルムアルデヒドを唯一の炭素源として使用する。(b)2つの誘導性プロモーター、IPTG誘導性T7プロモーターの制御下のHACSならびにキュメート(cumate)誘導性T5プロモーターの制御下のLmACRおよびEcAldAは、分析のために使用される。(c)IPTGおよびキュメート濃度の変化に伴うHACSとしてRuHACLG390Nを使用するグリコール酸塩生産性(μM/OD)、(d)IPTGおよびキュメート濃度の変化に伴うHACSとしてJGI15を使用するグリコール酸塩生産性(μM/OD)。
【図22】図22は、(a)ホルムアルデヒド(0.5mMまたは5mM)および蟻酸塩(20mM)の共供給からのグリコール酸塩産生を示す。HACSおよびFAE (AbfT)の発現は、誘導性プロモーター(IPTGおよびキュメート)により独立して制御される。(b)開始参照、RuHACLおよび初期ラウンドからの2つの最良のバリアントについてのHACSスクリーニング結果。C1-C1縮合反応活性は、0.5mMまたは5mMホルムアルデヒド(FALD)下でグリコール酸塩生産性により表される。
【図23】図23は、(a)AlphaFold2を使用したJGI15モデル化のタンパク質構造、(b)AlphaFold2を使用したJGI20モデル化のタンパク質構造、(c)OfOXCの結晶構造(PDBコード：2JI8)との整列により活性部位に結合した2つのリガンド(チアミン二リン酸およびホルミル-CoA)を示す。
【図24】図24は、(a)チアミン二リン酸(TPP)から3.5Å内のアミノ酸残基を選択することによる活性部位残基の同定、(b)ホルミル-CoA(CoA)から3.5Å内のアミノ酸残基を選択することによる活性部位残基の同定、(c)AbfT共発現を有するホルムアルデヒド(0.5または5mM)および蟻酸塩(20mM)系を使用した野生型JGI20に関するグリコール酸塩生産性(μM/OD/h)により表される活性部位残基をスキャンする、アラニンのスクリーニング結果を示す。
【図25】図25は、(a)c末端での第1ラウンドJGIバリアントの配列解析を示す。活性なバリアント(アスタリスク有り)は、かなり保存されたRKPQQF-W残基を示す。(b)AbfT共発現を有するホルムアルデヒド(0.5または5mM)および蟻酸塩(20mM)系を使用する野生型JGI20に関するグリコール酸塩生産性(μM/OD/h)により表される保存されたc末端残基をスキャンするアラニンのスクリーニング結果。
【図26】図26は、(a)整列されたアミノ酸残基により表されるJGI15のアライメントおよびJGI20 AlphaFold構造アライメントを示す。JGI20のN461およびJGI15のR493は、2つのバリアント間で整列されない2残基である。(b)AbfT共発現を有するホルムアルデヒド(0.5または5mM)および蟻酸塩(20mM)系を使用する野生型JGI20に関するグリコール酸塩生産性(μM/OD/h)により表される単一残基挿入/欠失による2つのタンパク質の構造ハイブリッドのスクリーニング結果。
【図27】図27は、(a) JGI15とJGI20の間のc末端尾部「カバーループ(covering loop)」の配列および構造、(b)AbfT共発現を有するホルムアルデヒド(0.5または5mM)および蟻酸塩(20mM)系を使用する野生型JGI20に関するグリコール酸塩生産性(μM/OD/h)により表される、JGI20 c末端をJGI15で置き換えることによる構造ハイブリッドのスクリーニング結果を示す。
【図28】図28は、(a)2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼ(HACS)およびアシル-CoAレダクターゼ(LmACR)活性を介するホルムアルデヒドからのグリコール酸塩産生を示す。5mMホルムアルデヒドは、唯一の炭素源として使用される。(b)2つの誘導性プロモーター、IPTG誘導性T7プロモーターの制御下のHACSならびにキュメート誘導性T5プロモーターの制御下のLmACRおよびEcAldAを分析のために使用する。(c)5mMホルムアルデヒド下のRuHACL、3つの最良の第1ラウンド変異体およびAcHACLのグリコール酸塩生産性。
【図29】図29、開始参照としてのAcHACL、JGI19、JGI15およびJGI20に基づく第2ラウンドJGI HACSホモログの同定。系統発生樹は、全ての第1ラウンドおよび第2ラウンドHACSバリアントならびに文献において利用可能なHACLおよびOXCを含む。
【図30】図30は、(a)ホルムアルデヒド(0.5mM)および蟻酸塩(20mM)の共供給からのグリコール酸塩産生を示す。HACSおよびFAE (AbfT)の発現は、誘導性プロモーター(IPTGおよびキュメート)により独立して制御される。(b)参照としてJGI15に関するグリコール酸塩生産性の%変化により表される有望な第2ラウンドバリアントのHACSスクリーニング結果。
【図31】図31は、(a)アルデヒドおよび蟻酸塩の共供給からの2-ヒドロキシ酸産生を示す。(b)HACSおよびFAE (CaAbfT)の発現は、誘導性プロモーター(IPTGおよびキュメート)により独立して制御される。
【図32】図32は、(a)アセトアルデヒド(5mM)および蟻酸塩(20mM)の共供給からの乳酸(乳酸塩)産生、(b)乳酸塩生産性(μM/OD)により表される有望な第1ラウンドバリアントのHACSスクリーニング結果、(c)参照としてのJGI15に関する乳酸塩生産性の%変化により表される有望な第2ラウンドバリアントのHACSスクリーニング結果を示す。
【図33】図33は、(a)プロピオンアルデヒド(5mM)および蟻酸塩(20mM)の共供給からの2-ヒドロキシ酪酸(2HB)産生、(b)2HB生産性(μM/OD)により表される有望な第1ラウンドバリアントのHACSスクリーニング結果、(c)参照としてのJGI15に関する2HB生産性の%変化により表される有望な第2ラウンドバリアントのHACSスクリーニング結果を示す。
【図34】図34は、(a)グリコールアルデヒド(5mM)および蟻酸塩(20mM)の共供給からのグリセリン酸(グリセリン酸塩)産生、(b)グリセリン酸塩生産性(μM/OD)により表される有望な第1ラウンドバリアントのHACSスクリーニング結果を示す。
【図35】図35は、(a)グリオキシル酸塩(5mM)および蟻酸塩(20mM)の共供給からのタルトロン酸(タルトロン酸塩)産生、(b)タルトロン酸塩生産性(μM/OD)により表される有望な第1ラウンドバリアントのHACSスクリーニング結果を示す。
【図36】図36は、(a)3-ヒドロキシプロピオンアルデヒド(5mM)および蟻酸塩(20mM)の共供給からの2,4-ジヒドロキシ酪酸(DHB)産生、(b)DHB生産性(μM/OD)により表される有望な第1ラウンドバリアントのHACSスクリーニング結果を示す。
【図37】図37は、アセトンおよび蟻酸塩を用いた第1ラウンドHACSのスクリーニングを示す。(a)100mMアセトンおよび20mM蟻酸塩の共供給からの2HIB産生。HACSおよびFAE (CaAbfT)の発現は、誘導性プロモーター(IPTGおよびキュメート)により独立して制御される。(b)有望なHACSバリアントのHACSスクリーニング結果。
【図38】図38は、精製された酵素を使用したホルミル-CoAとの縮合のための基質としてのメチルケトンを示す。(a)蟻酸塩から2-ヒドロキシ-2-メチル酸へのメチルケトンおよびホルミル-CoAの縮合のための経路；(b)異なるメチルケトンおよび蟻酸塩を用いたインビトロアッセイのGC-MS結果。所望の生成物を青色の矢印で指示した。
【図41】図41は、2-ヒドロキシブタン酸由来ブタノンおよびホルミル-CoAの縮合からの2-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸、3-ヒドロキシ-2-メチルブタン酸、2-メチルブタン-1-オール、2-メチルブタン-1,2-ジオールおよび2-メチルブタ-2-エン酸の作製を示す。
【図42】図42は、2-ヒドロキシペンタン酸由来ペンタノンおよびホルミル-CoAの縮合からの2-ヒドロキシ-2-メチルペンタン酸、3-ヒドロキシ-2-メチルペンタン酸、2-メチルペンタン-1-オール、2-メチルペンタン-1,2-ジオールおよび2-メチルペンタ(methylpen)-2-エン酸の作製を示す。
【図43】図43は、2-ヒドロキシヘプタン酸由来ヘプタノンおよびホルミル-CoAの縮合からの2-ヒドロキシ-2-メチルヘプタン酸、3-ヒドロキシ-2-メチルヘプタン酸、2-メチルヘプタン-1-オール、2-メチルヘプタン-1,2-ジオールおよび2-メチルヘプタ-2-エン酸の作製を示す。
【図44】図44は、2,3-ヒドロキシプロパン酸由来ヒドロキシアセトンおよびホルミル-CoAの縮合からの2,3-ヒドロキシ-2-メチルプロパン酸(metylproptanoic acid)、2-メチルプロパン-1,3-ジオール、2-メチルプロパン-1,2,3-トリオールおよび3-ヒドロキシ-2-メチルアクリル酸の作製を示す。
【図45】図45は、2-ヒドロキシ-3メチルブタン酸由来3-メチル-2-ブタノンおよびホルミル-CoAの縮合からの2-ヒドロキシ-2,3-ジメチルブタン酸、3-ヒドロキシ-2,3-ジメチルブタン酸、2,3-ジメチルブタン-1-オール、2,3-ジメチルブタン-1,2-ジオールおよび2,3-ジメチルブタ-2-エン酸の作製を示す。
【図46】図46は、2-ヒドロキシ-3-オキソプロパン酸由来メチルグリオキサールおよびホルミル-CoAの縮合からの2-ヒドロキシ-2-メチル-3-オキソプロパン酸、2-メチルプロパン-1,3-ジオールおよび2-メチルヘプタン-1,2,3-トリオールの作製を示す。
【図47】図47は、2-ヒドロキシ-4-オキソペンタン酸由来ペンタン-2,4-ジオンおよびホルミル-CoAの縮合からの2-ヒドロキシ-2-メチル-4-オキソペンタン酸、3-ヒドロキシ-2-メチル-4-オキソペンタン酸、5-ヒドロキシ-4-メチルペンタン-2-オン、4,5-ジヒドロキシ-4-メチルペンタン-2-オンおよび2-メチル-4-オキソペンタ-2-エン酸の作製を示す。
【図48】図48は、(a)2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼ(RuHACL)およびアシル-CoAレダクターゼ(ACR)バリアントを介したホルムアルデヒドからのグリコール酸塩産生、(b)文献から同定される初期ACRバリアントのスクリーニング結果を示す。
【図49】図49は、(a)開始参照としてLmACRを使用して同定されたACRバリアントの系統発生樹の図を示す。(b)ACRバリアントのスクリーニングは、ACRバリアント過剰発現下のホルムアルデヒド消費を測定することにより行った。(c)参照としてのLmACRに関するホルムアルデヒド消費活性の%変化により表される0.5mMおよび3mMホルムアルデヒド濃度下のACRバリアントのスクリーニング結果。
【図50】図50は、(a)2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼ(JGI15)および蟻酸塩活性化酵素バリアントを介したホルムアルデヒドおよび蟻酸塩からのグリコール酸塩産生を示す。PTA-ACKは、ホルミル-リン酸塩中間体を介してホルミル-CoAを作製し、ACTは、CoA供与体分子からCoAを蟻酸塩に直接変換する。(b)文献から同定される初期のACT & PTA-ACKバリアントのスクリーニング結果。
【図51】図51は、(a)開始参照としてAbfTを使用して同定されたACTバリアントの系統発生樹の図、(b)開始参照としてCcAck-Ptaを使用して同定されたACTバリアントの系統発生樹の図を示す。
【発明を実施するための形態】
【0028】
詳細な説明
用語「約」は、本明細書で使用する場合、例えば本明細書における開示の態様を含み得る、履物の製品または他の製造物品に使用される典型的な測定および製造手順；これらの手順における不注意による誤り；組成物もしくは混合物を作製するためまたは該方法を実行するために使用される成分の製造、源または純度における違い等を通じて生じ得る、数的な量の変動をいう。本開示を通じて、用語「約(about)」および「約(approximately)」は、該用語が先行する数値の値±5%の範囲をいう。
用語「約」は、本明細書で使用する場合、例えば本明細書における開示の態様を含み得る、履物の製品または他の製造物品に使用される典型的な測定および製造手順；これらの手順における不注意による誤り；組成物もしくは混合物を作製するためまたは該方法を実行するために使用される成分の製造、源または純度における違い等を通じて生じ得る、数的な量の変動をいう。本開示を通じて、用語「約(about)」および「約(approximately)」は、該用語が先行する数値の値±5%の範囲をいう。
【0029】
代謝の規範的な「ボウタイ(bow-tie)」体系において、基質は、生じる中心の代謝産物由来の生合成構造ブロックおよび目的の生成物と共に中心代謝に集中される。今日まで、C1生物変換を遺伝子工学で作り変える試みは、C1基質の利用および目的の生成物へのそれらの変換のための中心の炭素代謝を必要としている。最小の直交性を示すこれらの設計は、宿主の代謝ネットワークを最適化して、C1生物変換を適応させることを必要とし、これは難題であると明らかにされた。
【0030】
しかしながら、宿主代謝に直交する様式のC1利用および生物変換を可能にするホルミル-CoA伸長(FORCE)経路の実行は、これらの難題を解決し得る。FORCE経路は、同化代謝産物としてのホルミル-CoAの使用に基づき、これは2-ヒドロキシアシル-CoAリアーゼ(HACL)により触媒されるホルミル-CoAとカルボニル含有基質の間のアシロイン縮合反応により可能にされる。生成物合成は、他のアプローチと比較して、中心代謝に対する比較的高い直交性により達成される。経路熱力学の本発明者らの分析は、蟻酸塩、ホルムアルデヒドおよびメタノールの、例示的な生成物としてのグリコール酸塩または酢酸塩へのFORCE経路変換のための好ましい駆動力を示唆した。自己が含有される直交性の経路は、インビトロ(精製された酵素および細胞抽出物)およびインビボ(静止および増殖細胞)での実行の両方で潜在的に実現可能であることが示され、ここで多様な機能性の生成物(例えばグリコール酸塩、グリコールアルデヒド、エチレングリコール、エタノール、グリセリン酸塩)は、唯一のC1基質としてホルムアルデヒド、蟻酸塩またはメタノールを使用して、増殖および宿主代謝依存的な様式で作製され得る。ここで示される生成物合成は、中心代謝を完全に迂回し、これは今日までに報告された全ての他のアプローチとは異なる。増殖および生体触媒の維持が多炭素基質を用いて実行され、生体触媒がC1生物変換に使用される潜在的なバイオプロセスが構想され得る。多酵素カスケードおよび2段階発酵に基づくこの性質のバイオプロセスは、最近の概論の主題であった。
【0031】
C1利用および生成物合成のための直交性代謝体系の設計
いくつかの態様のC1基質の所望の生成物への生物変換を提供し得るFORCE経路は、以下で議論され、図面に示される。図1aおよび1bに示される例を具体的に参照すると、いくつかの態様の系は、直交性代謝体系の3つの主要な特徴：1) C1基質の炭素鎖伸長に適切な構築ブロックへの活性化；2)1サイクル当たり1炭素による炭素鎖の反復伸長；および3)目的の生成物の蓄積を生じる経路の終結を有し得る。例えば、態様において、これらの特徴を有する直交性の代謝体系は、反復炭素鎖伸長のための活性化されたC1単位としてホルミル-CoAを使用して実行され得た。
いくつかの態様のC1基質の所望の生成物への生物変換を提供し得るFORCE経路は、以下で議論され、図面に示される。図1aおよび1bに示される例を具体的に参照すると、いくつかの態様の系は、直交性代謝体系の3つの主要な特徴：1) C1基質の炭素鎖伸長に適切な構築ブロックへの活性化；2)1サイクル当たり1炭素による炭素鎖の反復伸長；および3)目的の生成物の蓄積を生じる経路の終結を有し得る。例えば、態様において、これらの特徴を有する直交性の代謝体系は、反復炭素鎖伸長のための活性化されたC1単位としてホルミル-CoAを使用して実行され得た。
【0032】
既存の文献において、C1分子からのホルミル-CoAの作製の報告が散在する。しかしながらアシル-CoAは、カルボン酸塩とアルデヒドの形態の間の都合の良い中間体である。結果的に、図2の一炭素活性化パネルに示されるように、酸化および還元されたC1基質の両方からホルミル-CoAを作製することが可能である。ホルムアルデヒドから、アシル-CoAレダクターゼ(ACR)の活性によりホルミル-CoAが作製され得、メタノールデヒドロゲナーゼ(MDH)によりメタノールはホルムアルデヒドに変換され得る。
【0033】
ホルミル-CoAは、CoAトランスフェラーゼを使用して、蟻酸塩から作製され得る。ホルミル-CoAトランスフェラーゼは、CoAチオエーテル転移において蟻酸塩およびホルミル-CoAを含むことが知られる1つのかかる酵素である。大腸菌由来のアセチル-CoAシンテターゼ(ACS)(EcACS)の無差別の活性による蟻酸塩のホルミル-CoAへの活性化は全て可能である。EcACSにより触媒される反応はAMP形成(2ATP同等物を消費する)であるが、ADP形成経路の証拠は、中間体ホルミル-リン酸塩を介して存在する。この経路において、蟻酸塩は、蟻酸塩キナーゼ(FOK)によりホルミル-リン酸塩に変換され、ホスホトランスアシラーゼ(PTA)は、ホルミル-リン酸塩をホルミル-CoAに変換する。ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ(FaldDH)による蟻酸塩のホルムアルデヒドへの直接の還元を介するATP依存的様式で、蟻酸塩をホルミル-CoAに変換することも可能であり得る。図2に示されるように、かかる変換は熱力学的に困難であるが、この反応は、細胞非含有系において示され、インビトロおよびインビボでの実行の両方に潜在的に有用であり得た。また、CO2は、蟻酸塩デヒドロゲナーゼ(または二酸化炭素レダクターゼ)の逆活性により蟻酸塩に変換され得、メタンは、メタンモノオキシゲナーゼによりメタノールに変換され、上述の反応に連結される場合に、これはホルミル-CoAの形成をもたらし得る。
【0034】
C1単位を使用する伸長による多様な炭素骨格の直交性のデノボの構築は、C2-C5代謝産物から炭素骨格を構築する天然に見られるものと同様の反復経路を必要とするが、中心の代謝の外側に存在する。2-ヒドロキシアシル-CoAリアーゼ(HACL)は広範囲の炭素鎖長さ特異性を有するので、これは反復経路を確立するための良好な候補である。HACL触媒反応の生成物、2-ヒドロキシアシル-CoAを、ホルミル-CoAによりさらに伸長され得るアルデヒドに変換することにより反復を可能にし得る多くの潜在的な反応経路が存在する。図11に示されるように、十分に確立されたアクリル酸塩経路の機構と同様の、2-ヒドロキシアシル-CoAを2-エノイル-CoAに変換する図11、α炭素での脱水が可能である。2-エノイル-CoAはβ酸化に含まれるので、2-エノイル-CoAの産生も都合がよく、酵素ツールキットおよびプラットフォーム経路β酸化反転について確立された知識を使用することを潜在的に可能にする。しかしながら、2-ヒドロキシアシル-CoAの脱水は、β酸化反転における3-ヒドロキシアシル-CoAの脱水よりもかなり困難であるので、酸素感受性ラジカルの機構を必要とする。2-ヒドロキシアシル-CoAの脱水もβ炭素の存在を必要とするので、経路の実行を、3炭素またはそれより大きな中間体に制限する。
【0035】
これらの問題は、チオエステルの変換をより有望な経路にする。図2およびホルミル-CoA伸長パネルに示されるように、CoA-チオエステルの還元は、2-ヒドロキシアルデヒドを生じ、これは特定のアシル-CoAレダクターゼ(ACR)の非特異的な活性のために可能である。さらに、HACLによる2-ヒドロキシアルデヒドとホルミル-CoAの連結は、ポリヒドロキシアシル-CoAおよびさらにアルドースとして一般的に公知であるポリヒドロキシアルデヒドを生じる。ポリヒドロキシアルデヒドは原則的に、アルドース伸長と称され得るHACL触媒反応の基質として働き得、この例はホルミル-CoA伸長パネルで図2に示される)。
【0036】
1,2-ジオールを生じる2-ヒドロキシアルデヒドのさらなる還元は、ジオールオキシドレダクターゼ(DOR)の活性により可能である。大腸菌FucOは、1,2-ジオールと2-ヒドロキシアルデヒドの相互変換を触媒するDORの例である34。しかしながら、大腸菌は、DORのほんの一例であり、いくつかの例において他の適切なDORが代わりに使用され得る。例えば、いくつかの態様において、DORは、別の原核生物細菌であり得る。代替的に、いくつかの態様において、DORは、真核生物細菌または真菌であり得る。1,2-ジオールの脱水は、ジオールデヒドラターゼ(DDR)の活性により触媒されてアルデヒドを生じ得、α還元を有効に達成する。ジオール脱水もラジカル機構を必要とするが、B12依存的ジオールデヒドラターゼは酸素耐性である。アルデヒド伸長と称され得るホルミル-CoAによるアルデヒドのさらなる伸長は、脂肪酸生合成または逆β酸化経路における2炭素伸長と類似のアルキル鎖の伸長を生じる。アルドース伸長を含むこれらの経路は、まとめてα還元、およびアルデヒド伸長、ホルミル-CoA伸長(FORCE)経路と称され得、それらはホルミル(hteformyl)-CoA伸長パネルで図2に示されるように、炭素鎖伸長単位としてホルミル-CoAの使用を容易にする。
【0037】
図2に示されるように、中間体としてまたはFORCE経路の中間体の誘導体から種々の生成物クラスが作製され得、そのいくつかも、微生物増殖を支持し得る(図1cに示される)。例えばアルドース糖は、2-ヒドロキシアルデヒドノード(node)の直接的な結果である。エチレングリコールなどの主要な工業的化学物質を含むジオールは、1,2-ジオールノードの結果である。2-ヒドロキシアシル-CoAノードの誘導体としては、チオエステラーゼにより触媒される反応により作製される工業的生成物グリコール酸および乳酸などの2-ヒドロキシ酸が挙げられる。他の生成物の前駆体として働き得るカルボン酸、アルコールおよびアシル-CoAなどの多くの化学クラスがアルデヒドノードに由来し得る。
【0038】
C1利用のためのFORCE経路の熱力学的分析
図2に示される経路反応の標準的なギブス自由エネルギーは、潜在的な反応を容易に明らかにするが、ギブスエネルギーは、経路が全体として実行可能であるかおよび意図される方向で作動するかを予測するには不十分である。このために、経路反応が互いに影響する能力を考慮する経路熱力学への全体論的なアプローチが必要である。これを達成するために、「最大-最小駆動力(Max-min Driving Force)(MDF)」アプローチがこれらの反応に適用された。
図2に示される経路反応の標準的なギブス自由エネルギーは、潜在的な反応を容易に明らかにするが、ギブスエネルギーは、経路が全体として実行可能であるかおよび意図される方向で作動するかを予測するには不十分である。このために、経路反応が互いに影響する能力を考慮する経路熱力学への全体論的なアプローチが必要である。これを達成するために、「最大-最小駆動力(Max-min Driving Force)(MDF)」アプローチがこれらの反応に適用された。
【0039】
唯一のC1基質からのC2代謝産物グリコール酸塩および酢酸塩の作製のためのFORCE経路のMDFを評価したが、質量移動制限がCO2およびメタン利用を有意に制限する可能性が高いので、可溶性C1基質のMDFのみを評価した。グリコール酸塩および酢酸塩が、経路生成物および増殖基質の両方である代表的なC2生成物として選択され、グリコール酸塩は最も短い経路を必要とし、酢酸塩はアルデヒド伸長反応の全体的な流れ(sequence)を必要とした。図3aに示されるように、それぞれの基質について、酢酸塩よりも大きいグリコール酸塩の作製に向かう駆動力がある。これは、チオエステラーゼによるグリコリル-CoAの熱力学的に好ましい加水分解のためであるが、酢酸塩の作製は、熱力学的に困難なグリコリル-CoAの還元を必要とする。代謝産物濃度の標準的な制限を使用して、ホルムアルデヒドは、困難なNAD+依存的メタノールデヒドロゲナーゼ反応またはホルムアルデヒドへのホルミル-CoA還元反応を必要としないので、最大のMDFを可能にする。メタノールデヒドロゲナーゼ反応の熱力学的な困難さに関わらず、グリコール酸塩および酢酸塩の正味の作製について、好ましい方向での十分な駆動力があることも明らかである。
【0040】
蟻酸塩利用のための駆動力は最低である。ここで、ATP加水分解は、蟻酸塩の活性化を補助する。ACSによる2ATP同等物の加水分解は、酢酸塩の正味の作製についてちょうど十分な駆動力を提供し、1ATP同等物の利用は、グリコール酸塩の作製に十分な駆動力のみを提供する。ATP依存的経路は、これらの条件下では実行可能ではない。
【0041】
上述の分析は、1μM～10mMの代謝産物濃度に対する標準的な拘束を推定するが、実際にはC1基質濃度は、それを外的に供給する能力に基づいてこの上限よりも高くあり得るかまたは低くあり得る。次に、図3に示されるように、C1基質の毒性などの物理的制限に基づいて、基質濃度についてより厳密/現実的な値が使用された。いくつかの生物は、生存して、約10mMのホルムアルデヒド濃度を消費し得るが42、ほとんどの生物、例えば細菌大腸菌はそれができない。ホルムアルデヒドの上限がより妥当な0.1mMに調整された場合、経路のMDFは予想されるように低下した。一方でメタノールは、ホルムアルデヒドよりもかなり毒性が低く、約100mMの濃度で大腸菌増殖培地に供給された43。メタノール濃度の上限を増加することにより、メタノール変換のMDFが増加された。興味深いことに、これらの濃度では、メタノール利用についての駆動力は、ホルムアルデヒドについてのものよりもわずかに大きくなる。
【0042】
同様に、大腸菌は、約100mMの蟻酸塩濃度の存在下で増殖する能力を有する9。他の態様において、蟻酸塩濃度の存在下で増殖する他のDORも使用され得た。蟻酸塩濃度の限度を増加することは、1または2ATP消費シナリオにおけるMDFに影響を有さなかったが、0ATP経路のMDFに対して大きな影響を有した。100mM蟻酸塩を用いて、酢酸塩ではなくグリコール酸塩の正味の作製は、ATP加水分解の必要なく可能である。この分析は、細胞非含有生物変換系に情報を与えて、インビボ実行についての基質取込みに関して価値のある洞察を提供し得る。
【0043】
基質濃度に加えて、NADH/NAD+比は経路熱力学についての他の主要な拘束である。以前に使用されたNADH/NAD+に対する拘束は、好気性条件下での大腸菌の増殖を反映する0.141であったが、生理学的NADH/NAD+は変動し得、嫌気性条件下で1に近いかまたはそれより高い値に達する。インビトロ実行においてはさらに高い比が達成され得る。経路駆動力に対するNADH/NAD+比の影響を評価するために、NADH/NAD+比を変化させた。図12に示されるように、生理学的範囲(ここでは0.1～1が採られる)において、経路駆動力は、基質としてホルムアルデヒドおよびメタノールについて正のままであった図12。予想されるように、経路がレドックス生成であった場合(メタノール対酢酸塩/グリコール酸塩およびホルムアルデヒド対グリコール酸塩)低い比が好ましかったが、経路がレドックス消費であった(蟻酸塩対酢酸塩/グリコール酸塩)またはレッドクスのバランスがとられた場合(ホルムアルデヒド対酢酸塩-おそらくは還元反応が熱力学的により困難であるため)高い比が好ましかった。図3bに示されるように、NADH/NAD+比は、蟻酸塩利用経路の駆動力に決定的であり得る。
【0044】
蟻酸塩のグリコール酸塩への変換について、1～2ATP同等物を必要とする経路は、生理学的範囲のほぼ全体を通して正の駆動力を保持する。しかしながら蟻酸塩の酢酸塩への変換について、NADH/NAD+比は、1ATP同等物の消費により正の駆動力を有するために生理学的範囲の上限でなければならない。10mM蟻酸塩で、グリコール酸塩または酢酸塩の作製についてのいずれの駆動力も生理学的範囲で正でない。蟻酸塩の濃度が100mMに増加される場合、グリコール酸塩または酢酸塩作製のための駆動力は、ATP加水分解なしであってもNADH/NAD+比の生理学的範囲内で正であり得る。全体的に、蟻酸塩の、酢酸塩などのより還元された生成物への変換は、熱力学的におよび正味のレドックスバランスに基づいての両方で困難である。
【0045】
C1基質を生成物に変換する態様方法の一例として、FORCE経路が例示的な基質としてホルムアルデヒドを使用してその中間体レドックス状態のために反復を支持する能力を、さらに評価した。図3cに示されるように、アルドースおよびアルデヒド伸長経路の両方の熱力学は、4炭素までの反復を支持する。また、経路の駆動力は、反復の回数に伴って減少する。4炭素の後、アルドース伸長様式は、おそらくは連続アシル-CoA還元反応の累積効果のために、好ましくないものになる。一方で、アルデヒド伸長様式は、おそらくはDORおよびDDRにより触媒される熱力学的に好ましい反応のために、同じアシル-CoA還元を必要するにもかかわらず、好ましいままである。異なるC1活性化および終結経路は、反復の回数が低い場合、全体的な伸長サイクルのMDFに対する影響を有する。図13に示されるように、反復の回数が増加するにつれて、伸長サイクル反応の熱力学は支配的になる図13。先の分析に基づいて、基質の利用が熱力学的により拘束されるために、アルドースおよびアルデヒド伸長経路のMDFは、メタノールまたは蟻酸塩がC1基質である場合、同様またはより低くなることが予想され得る。
【0046】
インビトロ経路検証
FORCE経路の必要条件は、ホルミル-CoAおよびホルムアルデヒドの作製である。これらの反応の機能を検証するために、図4に示されるように、精製された酵素系を開発して、異なるC1基質からのホルミル-CoAおよびHACL縮合生成物グリコリル-CoAの両方の形成を追跡した。図2に示されるように、ホルミル-CoAは、アシル-CoAレダクターゼ(ACR)によりホルムアルデヒドから作製され得る。リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes) ACR (LmACR)およびロドスピリルム目細菌URHD0017由来のHACL (RuHACL)の両方を含む反応において、ホルミル-CoAおよびグリコリル-CoAの両方の形成を観察した。ホルミル-CoAも、蟻酸塩の活性化による酸化C1基質由来であり得る。オキサロバクター・ホルミゲネス(Oxalobacter formigenes)由来のホルミル-CoAトランスフェラーゼ(OfFrc)およびCoA供与体としてのスクシニル-CoAを使用して、蟻酸塩のホルミル-CoAへの活性化を観察し、ホルムアルデヒドの添加により、グリコリル-CoAの形成が生じた。LmACRを使用したホルミル-CoAの還元によりホルムアルデヒドがインサイチュで作製され得たかどうかをさらに試験した。実際に、グリコリル-CoAが観察されたが、その存在度は、ホルムアルデヒドを直接添加した場合よりも低かった。一緒にして、これらの結果は、この酵素系において、酵素の活性のためにACR反応または適切な形態のNAD(H)の必要性のために配置される拘束のいずれかにより、制限が課されることを示唆する。後者を支持して、酸化方向(すなわちホルムアルデヒドからホルミル-CoA)で、CoAチオエステルの加水分解後に観察されるグリコール酸塩の量は、反応に添加されるNADHの量とほぼ同等であった(1mM)。図2および3bに示されるように、反対の方向で、同等よりも低い量のグリコール酸塩が観察され、これはNADH/NAD+の比が減少するにつれて好ましくないものになる反応の熱力学と一致する。
FORCE経路の必要条件は、ホルミル-CoAおよびホルムアルデヒドの作製である。これらの反応の機能を検証するために、図4に示されるように、精製された酵素系を開発して、異なるC1基質からのホルミル-CoAおよびHACL縮合生成物グリコリル-CoAの両方の形成を追跡した。図2に示されるように、ホルミル-CoAは、アシル-CoAレダクターゼ(ACR)によりホルムアルデヒドから作製され得る。リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes) ACR (LmACR)およびロドスピリルム目細菌URHD0017由来のHACL (RuHACL)の両方を含む反応において、ホルミル-CoAおよびグリコリル-CoAの両方の形成を観察した。ホルミル-CoAも、蟻酸塩の活性化による酸化C1基質由来であり得る。オキサロバクター・ホルミゲネス(Oxalobacter formigenes)由来のホルミル-CoAトランスフェラーゼ(OfFrc)およびCoA供与体としてのスクシニル-CoAを使用して、蟻酸塩のホルミル-CoAへの活性化を観察し、ホルムアルデヒドの添加により、グリコリル-CoAの形成が生じた。LmACRを使用したホルミル-CoAの還元によりホルムアルデヒドがインサイチュで作製され得たかどうかをさらに試験した。実際に、グリコリル-CoAが観察されたが、その存在度は、ホルムアルデヒドを直接添加した場合よりも低かった。一緒にして、これらの結果は、この酵素系において、酵素の活性のためにACR反応または適切な形態のNAD(H)の必要性のために配置される拘束のいずれかにより、制限が課されることを示唆する。後者を支持して、酸化方向(すなわちホルムアルデヒドからホルミル-CoA)で、CoAチオエステルの加水分解後に観察されるグリコール酸塩の量は、反応に添加されるNADHの量とほぼ同等であった(1mM)。図2および3bに示されるように、反対の方向で、同等よりも低い量のグリコール酸塩が観察され、これはNADH/NAD+の比が減少するにつれて好ましくないものになる反応の熱力学と一致する。
【0047】
細胞非含有代謝的遺伝子工学作り変えアプローチを使用して、生成物合成のためのFORCE経路をさらにプロトタイピングした。α還元FORCE経路を含むそれぞれの経路酵素を発現する大腸菌の抽出物は、連続して合わされ、段階的な様式で経路機能を示した。図2(ホルミル-CoA伸長パネルにおいて)に示されるように、HACLにより作製される2-ヒドロキシアシル-CoAのチオエステル切断を介する2-ヒドロキシカルボキシル酸塩(例えばグリコール酸塩)の直接の作製の外側で、他のC2生成物(例えばアルドースまたはアルデヒド伸長経路)は、この2-ヒドロキシアシル-CoA(ホルムアルデヒドおよびホルミル-CoA連結の場合にグリコリル-CoA)の還元を必要とする。図5aに示されるように、リステリア・モノサイトゲネスACR (LmACR)もグリコールアルデヒドに対して働いて、遺伝子工学で作り変えられた系の複雑さを最小化し得、LmACRは、ホルムアルデヒドのホルミル-CoAへの酸化およびグリコリル-CoAのグリコールアルデヒドへの還元の両方を触媒する二機能性の役割において使用された。図5bに示されるように、LmACR単独は、ホルムアルデヒドの蟻酸塩への変換のみを生じた。ロドスピリルム目細菌URHD0017由来の以前に同定されたHACL (RuHACL)を含んで、グリコール酸塩が観察された。しかしながら、グリコールアルデヒドは、おそらくは細胞抽出物系における内因性オキシドレダクターゼの存在のために生成物としては有意に検出されず、これは、グリコールアルデヒドのグリコール酸塩(例えばAldA、AldB、PuuC、PatD)への酸化またはより低い程度でエチレングリコール(例えばFucO、YqhD、AdhP、EutGおよび他のもの)への還元を触媒した。
【0048】
図5aおよび5bに示されるように、次の還元生成物、エチレングリコールの合成は、大腸菌FucO、1,2-ジオールオキシドレダクターゼを過剰発現する大腸菌の細胞抽出物の添加により有意に増加した(2倍増加、1.37±0.1mMから2.73±0.03mM)。エチレングリコールは、ジオールデヒドラターゼによりアセトアルデヒドにさらに脱水され得る(図5aに示される)。補酵素B12と共にクレブシエラ・オキシトカ(Klebsiella oxytoca)由来のジオールデヒドラターゼ(DDR)を発現する大腸菌細胞抽出物のさらなる添加の際に、おそらくはエチレングリコールの対応する減少と共に、内因性オキシドレダクターゼによるアセトアルデヒドの還元のために、エタノールが検出された(1時間で1.90±0.03mM：図5b)。より遅い時点(2時間)で、おそらくは再度の内因性オキシドレダクターゼ活性の存在のためのエタノールおよびアセトアルデヒドの酸化のために、酢酸塩の増加が観察された。変化した生成物(すなわちグリコール酸塩、エチレングリコール、エタノール、グリセリン酸塩、酢酸塩)の合成は、経路酵素の賢明な選択が、全て中心の代謝に独立して、アシル-CoAノードから変化するレベルの還元、鎖長さおよび機能性を有する生成物の合成を制御するために使用され得ることを示す。
【0049】
FORCE経路のインビボ実行
FORCE経路の直交する性質は、細胞非含有系における迅速なプロトタイピングだけでなく、容易なインビボ実行も可能にする。図6および7は、設計されるプラットフォームならびに大腸菌の静止および増殖培養物を使用したさらなる生成物の合成および種々のC1基質の利用の重要な特徴を示す。FORCE経路設計の重要な特徴は、反復であり、これは、(図2のホルミル-CoA伸長パネルおよび図3cに示されるように)アルドースまたはアルデヒド伸長を介して達成され得る。インビボでの反復性アルドース伸長の実行可能性を示すために、図6aに示されるように、ホルムアルデヒドからの三炭素生成物グリセリン酸塩の合成を標的化した。C1異化およびグリコール酸塩消費ノックアウトを有し、RuHACLG390N、LmACRおよびEcAldA16を(過剰)発現する株(AC440：MG1655(DE3) ΔfrmA ΔfdhF ΔfdnG ΔfdoG ΔglcD)を使用した。グリコールアルデヒドの蓄積およびホルミル-CoAとのその縮合を促進するために、発現ベクターからEcAldAを除去した。ホルムアルデヒドの消費は有意に低減されたが、図6bは、グリコールアルデヒドおよびグリセリン酸塩の蓄積が観察されたことを示し、反復性アルドース伸長経路を示した。これらの化合物の作製を増加する試みにおいて、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(ΔaldA ΔaldB ΔpatD ΔpuuC、まとめてΔaldhと称する)をさらにノックアウトした。この宿主を使用して、酸化生成物、グリコール酸塩の濃度は減少したが、EcAldAが過剰発現されなかった場合、グリコールアルデヒド濃度は増加した。これに関わらず、ノックアウトは、グリセリン酸塩の蓄積に影響するようには見えず、おそらくはRuHACLにより触媒されるグリコールアルデヒドとホルミル-CoAの間の縮合反応に対する制限を示した。ノックアウトはまた、副生成物蟻酸塩の蓄積に影響を有さず、副生成物形成の可能性のある経路は、ホルミル-CoAのチオエステル加水分解を介することを示した。
FORCE経路の直交する性質は、細胞非含有系における迅速なプロトタイピングだけでなく、容易なインビボ実行も可能にする。図6および7は、設計されるプラットフォームならびに大腸菌の静止および増殖培養物を使用したさらなる生成物の合成および種々のC1基質の利用の重要な特徴を示す。FORCE経路設計の重要な特徴は、反復であり、これは、(図2のホルミル-CoA伸長パネルおよび図3cに示されるように)アルドースまたはアルデヒド伸長を介して達成され得る。インビボでの反復性アルドース伸長の実行可能性を示すために、図6aに示されるように、ホルムアルデヒドからの三炭素生成物グリセリン酸塩の合成を標的化した。C1異化およびグリコール酸塩消費ノックアウトを有し、RuHACLG390N、LmACRおよびEcAldA16を(過剰)発現する株(AC440：MG1655(DE3) ΔfrmA ΔfdhF ΔfdnG ΔfdoG ΔglcD)を使用した。グリコールアルデヒドの蓄積およびホルミル-CoAとのその縮合を促進するために、発現ベクターからEcAldAを除去した。ホルムアルデヒドの消費は有意に低減されたが、図6bは、グリコールアルデヒドおよびグリセリン酸塩の蓄積が観察されたことを示し、反復性アルドース伸長経路を示した。これらの化合物の作製を増加する試みにおいて、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子(ΔaldA ΔaldB ΔpatD ΔpuuC、まとめてΔaldhと称する)をさらにノックアウトした。この宿主を使用して、酸化生成物、グリコール酸塩の濃度は減少したが、EcAldAが過剰発現されなかった場合、グリコールアルデヒド濃度は増加した。これに関わらず、ノックアウトは、グリセリン酸塩の蓄積に影響するようには見えず、おそらくはRuHACLにより触媒されるグリコールアルデヒドとホルミル-CoAの間の縮合反応に対する制限を示した。ノックアウトはまた、副生成物蟻酸塩の蓄積に影響を有さず、副生成物形成の可能性のある経路は、ホルミル-CoAのチオエステル加水分解を介することを示した。
【0050】
該経路はまた、発現ベクターに、グリコールアルデヒドおよびエチレングリコールの相互変換を触媒することが知られる大腸菌fucOを含むことにより、グリコールアルデヒドの作製を超えて、次の還元生成物、エチレングリコールまで伸長された。図6bに示されるように、これは、細胞外培地中のエチレングリコールの蓄積をもたらした。アルデヒドデヒドロゲナーゼのさらなるノックアウトは、エチレングリコール産生の約68%の増加を生じた。興味深いことに、EcFucOを含むことは、ホルムアルデヒドの消費を劇的に増加し、その多くは蟻酸塩に変換された。これは、NADHの形態のさらなる還元同等物を必要とする、ホルムアルデヒドからのエチレングリコール産生についての正味のレドックスバランスにより説明され得た。これは、NADH/NAD+比を低下させ、ホルムアルデヒド酸化のためのさらなる電子アクセプターを提供する。
【0051】
観察された生成物がホルムアルデヒド由来であり、残存の多炭素基質またはバイオマス構成成分由来でないことを検証するために、13C標識ホルムアルデヒドを、遺伝子工学で作り変えられた株についての基質として使用した。図6cに示されるように、生成物グリコール酸、エチレングリコールおよびグリセリン酸は、生成物のTMS誘導体の特徴的な[M-15]+イオンに基づいて、十分に13C標識されることが見出された。そのため、2および3炭素生成物の両方は、FORCE経路を使用して、ホルムアルデヒドから作製され得た。
【0052】
変化した生成物に加えて、異なる基質が利用され得るかどうかも評価した。図2、7aに示されるように、メタノールをホルムアルデヒドに変換するために、メタノールデヒドロゲナーゼ(MDH)のさらなる発現のみが必要であり、これは、以前に確立されたホルムアルデヒド利用経路の都合の良い伸長である。バチルス・メタノリクス(Bacillus methanolicus) MGA3由来の十分に試験されたMDHバリアント(BmMDH2MGA3)は、株AC440において、RuHACLG390N、LmACRおよびEcAldAと組み合わせて発現された。毒性が静止細胞の使用を必要とするホルムアルデヒドとは異なり、メタノールも、増殖大腸菌培養物に直接添加され得る。図7bに示されるように、遺伝子工学で作り変えられたメタノール利用株を複雑な栄養素および500mMメタノールの存在下で増殖した場合、グリコール酸塩の形成が観察され、これはRuHACLを発現しない株における場合ではなかった。
【0053】
この系の性能を向上するように努めて、RuHACLG390Nを、本明細書においてBsmHACLと称されるビーチサンドメタゲノム(beach sand metagenome) (UniProtアクセッション：A0A3C0TX30)から得られた新しく同定されたHACLと置き換えた。図7cに示されるように、BsmHACLの使用は、グリコール酸塩蓄積を約3倍、実質的に増加させ、経路における主要なボトルネックを反映した。向上されたグリコール酸塩産生に関わらず、蟻酸塩蓄積は高いままであった。この問題に対処する努力において、終結酵素EcAldAを、OfFrc51よりも良好な特性を有することが見出されたクロストリジウム・アミノブチリクム由来の以前に同定されたCoA-トランスフェラーゼ(CaAbfT)と置き換えた。CaAbfTは、グリコリル-CoAからグリコール酸塩を放出することおよびさらなる縮合のために観察された副生成物蟻酸塩をホルミル-CoAに再活性化することの両方のために働く。CaAbfTが発現された場合、グリコール酸塩蓄積は、約33%だけさらに増加され、蟻酸塩蓄積は、約36%だけ低減された。最終的に、グリコール酸塩の放出を介して経路を終結する方法として働くCaAbfTを用いて、内因性チオエステラーゼは、必要であるとは予測されず、少なくとも部分的に観察される蟻酸塩の原因であると推定された。そのため、チオエステラーゼを欠損する株(ΔyciA ΔtesA ΔtesB ΔybgC ΔydiI ΔfadM)を構築し、経路を用いて試験した。チオエステラーゼ欠損バックグラウンドを使用することは、観察される蟻酸塩をさらに低減したが、それを排除はしなかった。ホルムアルデヒドの直接酸化またはまだ同定されていないチオエステラーゼなどの蟻酸塩作製の他の経路がある可能性がある。観察されたグリコール酸塩がメタノール由来であることを検証するために、13C標識メタノールをさらに使用した。図7dに示されるように、グリコール酸のTMS誘導体の[M-15]+イオンから観察される場合、これらの培養中で作製されたグリコール酸塩は十分に13Cメタノールに由来した。
【0054】
蟻酸塩活性化のための有望な経路としてCaAbfTを確立して、外的に供給される蟻酸塩の組み込みを可能にするためにCaAbfTが使用され得るかどうかをさらに評価した。大腸菌の遺伝子工学で作り変えられた株において、CaAbfTは蟻酸塩を活性化するように発現され、LmACRは、ホルムアルデヒドおよびホルミル-CoAの相互変換がないように発現されなかった。そのため、観察されたグリコール酸塩は、ホルミル-CoAへの蟻酸塩活性化および得られたホルミル-CoAとホルムアルデヒドのさらなる縮合から生じるはずである。図14に示されるように、BsmHACLを発現する遺伝子工学で作り変えられた株において、ホルムアルデヒドを単独で補充図14した場合と比較して、ホルムアルデヒドに加えて蟻酸塩を培地に含ませた場合、グリコール酸塩の12倍の増加が観察され、グリコール酸塩としての蓄積した総炭素は、ホルムアルデヒドとして最初に添加した量よりも大きかった。したがって、この株によるグリコール酸塩の作製は、蟻酸塩依存的であり、これは外的に供給された蟻酸塩がC1基質としてFORCE経路により使用され得ることの証明として働く。
【0055】
合成メチロトロフィー(methylotrophy)のためのFORCE経路のフラックスバランス分析
FORCE経路が生成物合成を支持する能力を示して、生成物のいくつか(例えばグリコール酸塩、グリセリン酸塩、酢酸塩)が増殖基質として働き得るために、大腸菌において合成メチロトロフィーを可能にするそれらの能力をインシリコで評価した。ゲノムスケールモデルの大腸菌、iML151552を使用して、メチロトロフィーを可能にすると報告または提唱された選択経路を含むモデルへの反応の追加により、有機C1基質上での大腸菌の増殖を評価した。全ての経路は、存在する異なる還元レベルでのC1分子の相互変換を可能にする反応を用いて評価した。それぞれの経路を実行する十分な反応を表3に与える。
FORCE経路が生成物合成を支持する能力を示して、生成物のいくつか(例えばグリコール酸塩、グリセリン酸塩、酢酸塩)が増殖基質として働き得るために、大腸菌において合成メチロトロフィーを可能にするそれらの能力をインシリコで評価した。ゲノムスケールモデルの大腸菌、iML151552を使用して、メチロトロフィーを可能にすると報告または提唱された選択経路を含むモデルへの反応の追加により、有機C1基質上での大腸菌の増殖を評価した。全ての経路は、存在する異なる還元レベルでのC1分子の相互変換を可能にする反応を用いて評価した。それぞれの経路を実行する十分な反応を表3に与える。
【表1-1】
【表1-2】
【0056】
以下の表1に示されるように、シミュレーション結果は、天然(リブロース一リン酸またはRuMP、セリン)および合成(ホルモラーゼ(formolase)、合成アセチル-CoAまたはSACA、還元性グリシン)の両方の大腸菌においてメチロトロフィーのいくつかの形態を可能にすると以前に提唱された全ての経路がそのように実行し得ることを示唆する。
【表2】
【0057】
非天然C1基質の天然増殖基質グリコール酸塩、酢酸塩およびグリセルアルデヒドへの変換について評価されたFORCE経路は例外がなく、プラットフォームの直交性の性質の別の利点を示す。大腸菌または任意の他の生物について生理学的な基質を示す化合物(1つまたは複数)への直接の経路(1つまたは複数)を開発することにより、FORCE経路は、変動するまたは複数の代謝ノードで統合されて、それらを遺伝子工学で作り変えることの必要性とは反対に、天然の代謝および基質(1つまたは複数)利用の制御を利用し得る。興味深いことに、このインシリコ分析により、3炭素代謝産物(FORCE-グリセルアルデヒド、ホルモラーゼ、RuMP)の作製を生じる経路が、上の表1に示されるように、炭素および電子基準で最も高いバイオマス収率を生じると予想されることが明らかになった。
【0058】
3つのモデル化されたFORCE経路のフラックス分布の分析は、図8に示され、3炭素代謝産物の作製がなぜ有利であり得るかについてのいくつかの洞察を提供する。図8に示されるように、グリコール酸塩の形成をもたらすFORCE経路は、2分子のグリオキシル酸塩の脱炭素化縮合を必要とする大腸菌に存在する炭素非効率グリコール酸塩利用経路を利用する。より還元されたC2代謝産物、例えばグリコールアルデヒドまたは酢酸塩の作製は、グリコール酸塩の形態の酸化C2に好ましい。グリコールアルデヒドの予想される代謝は特に興味深く、該モデルは、グリコールアルデヒド同化のための経路がグリシンとの縮合および逆ピリドキサール-5-リン酸生合成経路を含み、最終的にペントースリン酸塩再配置を生じて、グリセルアルデヒド-3-リン酸を生じることを示唆する(図8bに示される)。この経路は、予想されるフラックス分布に基づいて、グリオキシル酸塩バイパスを介するアセチル-CoAの同化に好ましいと思われる。図8cに示されるように、HACL系経路からのグリセルアルデヒドの直接の作製は、グリセルアルデヒドのグリセロールへの変換、その後天然のグリセロール代謝を生じる。結果的に、グリセルアルデヒドまたはジヒドロキシアセトンなどのC3分子を生じる経路は、ATPの正味の産生を生じる糖分解反応を利用し得、最終的に、より大きなバイオマス収率を可能にする。全体的に、上で議論される(および図8および表1に示される)3つのシナリオにおいて、FORCE経路は、図1cに図示されるように、非天然C1基質の天然の多炭素基質への変換を可能にする。表4は、FORCE経路が、レドックスバランス、ATP要求および必要とされる反応の数などの他の測定基準に基づく有望な特徴も有することを示す。
【表3】
【0059】
合成メチロトロフィーを評価するための2系統共培養系
FORCE経路の大腸菌代謝に対する直交性は、C1変換経路の、増殖からの十分な分離、およびそのために経路のメチロトロフィー能力を評価するための特有の設計も可能にする。1つの潜在的に有利な実行は、多炭素化合物作製および細胞増殖を2つの宿主に分離することにより労力の分割を使用し得、これは、例えばC1同化経路の2つの共通の生成物であるアルドースリン酸塩またはアセチル-CoAを介して、経路が中心代謝と直接交流される場合には可能でない。この方法で系をモジュール化することは、潜在的な制限のより簡単な分析を可能にする。この考えを使用して、FORCE経路がC1基質(例えばホルムアルデヒド、蟻酸塩およびメタノール)上での大腸菌増殖を支持する能力を評価した。
FORCE経路の大腸菌代謝に対する直交性は、C1変換経路の、増殖からの十分な分離、およびそのために経路のメチロトロフィー能力を評価するための特有の設計も可能にする。1つの潜在的に有利な実行は、多炭素化合物作製および細胞増殖を2つの宿主に分離することにより労力の分割を使用し得、これは、例えばC1同化経路の2つの共通の生成物であるアルドースリン酸塩またはアセチル-CoAを介して、経路が中心代謝と直接交流される場合には可能でない。この方法で系をモジュール化することは、潜在的な制限のより簡単な分析を可能にする。この考えを使用して、FORCE経路がC1基質(例えばホルムアルデヒド、蟻酸塩およびメタノール)上での大腸菌増殖を支持する能力を評価した。
【0060】
図9aに示されるように、2つの遺伝子工学で作製された大腸菌の株で構成される2系統系を、共培養中で働くように設計、構築および構想した。プロデューサー株と称される第1の株は、非天然のC1基質の天然のC2増殖基質グリコール酸塩への変換のためのFORCE経路の発現のための構築物を含んだが、グリコール酸塩を消費し、その上で増殖する能力を欠損した。センサー株と称される第2の株は、グリコール酸塩上で増殖する能力を保持し、さらにシグナルとしてeGFPを構成的に発現したが、グリコール酸塩産生のためのFORCE経路は発現しなかった。したがって、プロデューサーおよびセンサー株は、グリコール酸塩最小培地プレート上の選択および蛍光コロニーの検出の両方により区別され得た。異なる基質の実行可能性を評価するために、3つの異なるプロデューサー株を考案した。ホルムアルデヒド利用のためのプロデューサー株は、LmACR、BsmHACLおよびEcAldAを発現した。ホルムアルデヒドを用いた蟻酸塩利用を評価するためのプロデューサー株は、CaAbfTと共にBsmHACLを発現した。最終的に、メタノール利用についてのプロデューサー株は、BmMdhMGA3、LmACR、BsmHACLおよびCaAbfTを発現するチオエステラーゼ欠損バックグラウンドであった(図9aに示す)。
【0061】
図15aに示されるように、ホルムアルデヒドは最初に試験した基質であったが、増殖条件を可能にするために、パラホルムアルデヒドを使用した。パラホルムアルデヒドは徐々に脱重合して、水性培地中に、粒子サイズおよび濃度の選択により可溶化速度を制御する能力を有するホルムアルデヒドを生じる(図15)。ここで図15bを参照すると、これは順に、ホルムアルデヒドがミリモーラー以下の濃度を維持し得る系が、毒性レベルまでの蓄積を回避することを可能にし、有意なグリコール酸塩産生が依然として図15において観察された。唯一の炭素基質として(パラ)ホルムアルデヒド(5mMの当量)を有する最小培地において、センサー株の増殖は、図9bおよび図16に示されるプロデューサー株がHACLを発現しなかった対照系と比較して、コロニー形成単位(CFU)の増加により示されるように観察された。グリコール酸塩は、最初の8時間で迅速に蓄積し、最初のラグ(lag)段階の後にセンサー株の持続的な指数関数的増殖が生じた。センサー株は、30時間で約6.6の倍化を経験したことが見出された。
【0062】
2系統系のための基質としてメタノールも評価した。図9cおよび図17は、プロデューサー株がBsmHACLを発現した場合にのみセンサー株の増殖が観察されたことを示す。しかしながら図17において、パラホルムアルデヒド利用の場合と比較して、センサー株の増殖速度は異なり、経時的にCFUのほぼ線形の増加を反映した。観察された動力学の差は、一定の供給速度供給バッチ(feed-rate fed-batch)培養において観察される現象と類似する、プロデューサー株によるメタノールからのグリコール酸塩産生の速度により課された制限を反映し得た56。メタノールの利用は、(パラ)ホルムアルデヒドの利用よりも実質的に遅く、72時間で約4.6の倍化を生じた。
【0063】
静止細胞を使用して試験した1mMホルムアルデヒドおよび10mM蟻酸塩共基質系を使用して、同様の実験を行った。図18に示され、上で観察されたように、ホルムアルデヒドとして添加されるよりも多くの炭素がグリコール酸塩において観察され、蟻酸塩の組み込みが示された、図18。図9cは、センサー株の増殖が、メタノール上での増殖よりも速かったが、5mM(パラ)ホルムアルデヒドと同様の多くの倍化を生じなかったことを示す。27時間に、約4.9の倍化が観察された。
【0064】
考察
C1基質からの生成物合成はFORCE経路の限定特徴であるが、該経路は、従属栄養生物により天然に消費される多炭素化合物、例えばグリコール酸塩、酢酸塩またはグリセルアルデヒドの産生を介して、非天然C1基質(例えば合成メチロトロフィー)上での増殖を可能にする能力も有する。このために、合成メチロトロフィーを達成するFORCE経路の効率を、ゲノムスケールモデリングおよびフラックスバランス分析により評価した。この分析により、FORCE経路は、代替的なアプローチと同等またはそれより良いことが明らかにされた。現在の経路性能は、C1基質上での単一株の大腸菌の増殖を支持し得なかったが、該経路の直交性の性質は、増殖、分離、ならびに別の株の大腸菌における蟻酸塩、ホルムアルデヒドおよびメタノール上での増殖に対する経路制限の評価を可能にした。プロデューサー株は、過剰に添加される必要があり、経路効率における細胞特異的な向上は、単一のシャシー(chassis)への増殖によりFORCE経路の強化を可能にするはずであることが示された。FORCE経路がメチロトロフィーを可能にする能力は、唯一の炭素源としてのC1に基づく従来の発酵とより類似したバイオプロセスの実行を可能にする。これらのアプローチにおいて、基質は、生成物合成のためならびに生体触媒作製および維持のための両方に使用される。
C1基質からの生成物合成はFORCE経路の限定特徴であるが、該経路は、従属栄養生物により天然に消費される多炭素化合物、例えばグリコール酸塩、酢酸塩またはグリセルアルデヒドの産生を介して、非天然C1基質(例えば合成メチロトロフィー)上での増殖を可能にする能力も有する。このために、合成メチロトロフィーを達成するFORCE経路の効率を、ゲノムスケールモデリングおよびフラックスバランス分析により評価した。この分析により、FORCE経路は、代替的なアプローチと同等またはそれより良いことが明らかにされた。現在の経路性能は、C1基質上での単一株の大腸菌の増殖を支持し得なかったが、該経路の直交性の性質は、増殖、分離、ならびに別の株の大腸菌における蟻酸塩、ホルムアルデヒドおよびメタノール上での増殖に対する経路制限の評価を可能にした。プロデューサー株は、過剰に添加される必要があり、経路効率における細胞特異的な向上は、単一のシャシー(chassis)への増殖によりFORCE経路の強化を可能にするはずであることが示された。FORCE経路がメチロトロフィーを可能にする能力は、唯一の炭素源としてのC1に基づく従来の発酵とより類似したバイオプロセスの実行を可能にする。これらのアプローチにおいて、基質は、生成物合成のためならびに生体触媒作製および維持のための両方に使用される。
【0065】
FORCE経路は、生成物合成および増殖に向かう流れの分岐点であるので、図10に示されるフラックスの仕切り(flux partitioning)に対して容易な制御のための有意な可能性がある。これらのフラックスに対する優れた制御は、特に炭素およびエネルギーが制限される場合、例えば唯一の基質としての蟻酸塩の場合にC1からの高収率生物変換を達成するために決定的であり得る。
【0066】
FORCE経路のさらなる開発は、特に経路反復を介する合成メチロトロフィーおよびより多様な生成物合成のためのより効率的な設計を可能にするはずである。例として、ホルミル-CoAのアシロイン縮合反応である主要なボトルネックは、HACLにより触媒されるアルデヒドにより評価された。還元された基質ホルムアルデヒドおよびメタノールを使用する種々の実行を通じた副生成物としての蟻酸塩の観察は、おそらくはホルミル-CoAの作製の速度とHACLによるその利用の速度の間の不均衡のためである。内因性チオエステラーゼの存在によりインビボで悪化される可能性のあるホルミル-CoA加水分解も観察された。この制限に対処するための1つの例示的なアプローチは、本発明者らがCoA-トランスフェラーゼCaAbfTを使用して行ったように、CoA-トランスフェラーゼを使用して蟻酸塩をホルミル-CoAに再活性化することである。より良い特徴を有するHACL酵素の同定または遺伝子工学的な作り変えは、この制限の対処を補助するはずである。このアプローチの1つの具体例は、本明細書に記載されるBsmHACLの同定である。他の例としては、内因性アルデヒドデヒドロゲナーゼの欠失などの宿主株改変が挙げられ、チオエステラーゼが調べられた。
【0067】
HACL触媒縮合反応および酵素活性は最近記載されただけであるので、さらなるゲノムマイニング(genome mining)、バイオプロスペクティング、酵素遺伝子工学的作り変えおよび生化学的特徴付けは、より良く機能するバリアントの発見を生じ、最終的に経路ボトルネックを克服することが予想される。十分に画定された鎖の長さおよび官能基特異性を有するHACLバリアントは、適合性で特異的な終結酵素と組み合わせて、他のプラットフォーム経路により説明されたものと類似する特異的な生成物の作製も可能にするはずである。
【0068】
方法：
以下に概略を述べられる方法には、本明細書に開示される特定の試験例を作製するために使用される手順および材料が記載される。
以下に概略を述べられる方法には、本明細書に開示される特定の試験例を作製するために使用される手順および材料が記載される。
【0069】
熱力学的計算
反応の標準ギブス自由エネルギーは、データベースソース(MetaCyc)からまたはeQuilibrator生化学熱力学計算機を使用してのいずれかで見出された。経路の最小-最大駆動力は、MATLAB (Mathworks)を使用して実行された以前に報告された方法を使用して計算された。該分析を実行するために使用されるスクリプトは、補助ファイルに提供される。
反応の標準ギブス自由エネルギーは、データベースソース(MetaCyc)からまたはeQuilibrator生化学熱力学計算機を使用してのいずれかで見出された。経路の最小-最大駆動力は、MATLAB (Mathworks)を使用して実行された以前に報告された方法を使用して計算された。該分析を実行するために使用されるスクリプトは、補助ファイルに提供される。
【0070】
フラックスバランス分析
フラックスバランス分析は、Gurobi solver (Gurobi Optimization, LLC)を備えるCOBRA Toolbox66 for MATLAB (Mathworks)を使用して実行された。種々のメチロトロフィー経路(表3に概略を述べられる)を可能にする反応を、大腸菌ゲノムスケールモデルiML151552に追加するかまたはそれに対して改変した。基質交換反応に対する制限は、全てのC1基質について10mmol C/g DCW/hrに設定された。該分析を実行するために使用されたスクリプトは、補助ファイルに提供される。
フラックスバランス分析は、Gurobi solver (Gurobi Optimization, LLC)を備えるCOBRA Toolbox66 for MATLAB (Mathworks)を使用して実行された。種々のメチロトロフィー経路(表3に概略を述べられる)を可能にする反応を、大腸菌ゲノムスケールモデルiML151552に追加するかまたはそれに対して改変した。基質交換反応に対する制限は、全てのC1基質について10mmol C/g DCW/hrに設定された。該分析を実行するために使用されたスクリプトは、補助ファイルに提供される。
【0071】
試薬
全ての化学物質は、そうではないと特定されない限り、Fisher Scientific Co.およびSigma-Aldrich Co.から入手した。プライマーは、Integrated DNA TechnologiesによりまたはEurofins Genomicsにより合成した。制限酵素は、そうではないと特定されない限り、New England Biolabsから入手した。
全ての化学物質は、そうではないと特定されない限り、Fisher Scientific Co.およびSigma-Aldrich Co.から入手した。プライマーは、Integrated DNA TechnologiesによりまたはEurofins Genomicsにより合成した。制限酵素は、そうではないと特定されない限り、New England Biolabsから入手した。
【0072】
遺伝子的方法
プラスミドおよび株は、以前に記載される方法に従って構築した16。大腸菌に対して天然にはない遺伝子は、GeneArt (Thermo Fisher)によりコドン最適化および合成した。大腸菌遺伝子は、標準的な方法に従って染色体DNAから増幅した。この試験に使用したプラスミドおよび株を表2に列挙する。
プラスミドおよび株は、以前に記載される方法に従って構築した16。大腸菌に対して天然にはない遺伝子は、GeneArt (Thermo Fisher)によりコドン最適化および合成した。大腸菌遺伝子は、標準的な方法に従って染色体DNAから増幅した。この試験に使用したプラスミドおよび株を表2に列挙する。
【表4】
【0073】
精製された酵素を使用したコア経路モジュールの評価
RuHACLG390N、LmACRおよびOfFrcは、以前に記載されるように発現して精製した。唯一のC1基質としてのホルムアルデヒドの利用を試験するために、反応は、50mM KPi pH7.4、5mM MgCl2、0.1mM TPP、1mM NAD+、2mM CoASH、1μM RuHACLG390N、1μM LmACRおよび100mM FALDで構成された。共基質としての蟻酸塩およびホルムアルデヒドの利用を試験するために、反応は、50mM KPi pH7.4、5mM MgCl2、0.1mM TPP、1mMスクシニル-CoA、1μM RuHACLG390N、2μM OfFrc、100mM蟻酸ナトリウムおよび100mMホルムアルデヒドで構成された。唯一のC1基質としての蟻酸塩の利用を試験するために、反応は、50mM KPi pH7.4、5mM MgCl2、0.1mM TPP、1mM NADH、2mMスクシニル-CoA、1μM RuHACLG390N、2μM OfFrc、1μM LmACRおよび100mM蟻酸ナトリウムで構成された。対照として、反応は、50mM KPi pH7.4、5mM MgCl2、0.1mM TPP、1mM NADH、1mM NAD+、2mMスクシニル-CoA、2mM CoASH、2μM BSA、100mM蟻酸ナトリウムおよび100mMホルムアルデヒドで構成された。反応体積は200μLであり、反応は、ロティサリー振盪器上室温で30分間行った。遊離酸のGC-MS分析は、200μLの反応試料を5μL 10M NaOHで処理した後、以前に記載されるように行った。
RuHACLG390N、LmACRおよびOfFrcは、以前に記載されるように発現して精製した。唯一のC1基質としてのホルムアルデヒドの利用を試験するために、反応は、50mM KPi pH7.4、5mM MgCl2、0.1mM TPP、1mM NAD+、2mM CoASH、1μM RuHACLG390N、1μM LmACRおよび100mM FALDで構成された。共基質としての蟻酸塩およびホルムアルデヒドの利用を試験するために、反応は、50mM KPi pH7.4、5mM MgCl2、0.1mM TPP、1mMスクシニル-CoA、1μM RuHACLG390N、2μM OfFrc、100mM蟻酸ナトリウムおよび100mMホルムアルデヒドで構成された。唯一のC1基質としての蟻酸塩の利用を試験するために、反応は、50mM KPi pH7.4、5mM MgCl2、0.1mM TPP、1mM NADH、2mMスクシニル-CoA、1μM RuHACLG390N、2μM OfFrc、1μM LmACRおよび100mM蟻酸ナトリウムで構成された。対照として、反応は、50mM KPi pH7.4、5mM MgCl2、0.1mM TPP、1mM NADH、1mM NAD+、2mMスクシニル-CoA、2mM CoASH、2μM BSA、100mM蟻酸ナトリウムおよび100mMホルムアルデヒドで構成された。反応体積は200μLであり、反応は、ロティサリー振盪器上室温で30分間行った。遊離酸のGC-MS分析は、200μLの反応試料を5μL 10M NaOHで処理した後、以前に記載されるように行った。
【0074】
アシル-CoAsをLC-MSで分析するために、反応は、8μLの蟻酸を200μLの反応試料に添加して停止し、200μLメタノールで2回誘導(prime)し、100μLの1mM酢酸アンモニウムpH3.0で平衡化した1mL HyperSep C18 Cartridges (Thermo Scientific)で脱塩した。カラムを200μLの1mM酢酸アンモニウムpH3.0で1回洗浄し、アシル-CoAを200μLメタノールに溶出した。LC-MS分析は、以前に記載されたものに基づいて行った。Agilent 6540 Q-TOF LC-MSシステムは、正のイオン化モードに設定されたジェットストリームエレクトロスプレーイオン化源および100mm x 4.6mm Kinetex 2.6μm Polar C18 100Åカラム(Phenomenex)を備えた。LC条件は：40℃に設定したカラムオーブン、5μLの注射体積および移動相として50mM蟻酸アンモニウムおよびメタノールであった。化合物分離は、400μL/分の流速で、以下の勾配法：0分、0%メタノール；1分、0%メタノール；3分、2.5%メタノール；9分、23%メタノール；14分、80%メタノール；16分、80%メタノール；17分、0%メタノールを使用して達成した。MS条件は：キャピラリー電圧3.5kV、ノズル電圧500V、フラグメンター電圧150Vであり、噴霧(25psig)、乾燥(5L/分、225℃)およびシース気体(10L/分、400℃)のために窒素を使用した。100～1000m/zのスキャン範囲を使用した。データはMassHunter Qualitative Analysis B.05.00 (Agilent)を使用して分析した。
【0075】
経路検証のための細胞非含有代謝的遺伝子工学的作り変え
酵素発現および細胞抽出物調製は、以前に記載されるように行った。細胞非含有反応は、50mM KPi pH7.4、4mM MgCl2、0.1mM TPP、2.5mM CoASH、5mM NAD+、50mMホルムアルデヒドおよび0.1mM補酵素B12を含んだ。個々の細胞抽出物負荷は、約4.4g/Lタンパク質(反応体積の1/8)であり、それぞれの反応に添加したタンパク質の量は、BL21(DE3)抽出物で約26g/Lタンパク質(反応体積の3/4)まで標準化した。反応を、室温で示された時間インキュベートし、この時点で、1%硫酸で酸性化された飽和硫酸アンモニウム溶液の反応体積の1/4を添加して反応を停止した。試料を20817xgで15分間遠心分離して、上清を以前に記載されるようにHPLCで分析した。
酵素発現および細胞抽出物調製は、以前に記載されるように行った。細胞非含有反応は、50mM KPi pH7.4、4mM MgCl2、0.1mM TPP、2.5mM CoASH、5mM NAD+、50mMホルムアルデヒドおよび0.1mM補酵素B12を含んだ。個々の細胞抽出物負荷は、約4.4g/Lタンパク質(反応体積の1/8)であり、それぞれの反応に添加したタンパク質の量は、BL21(DE3)抽出物で約26g/Lタンパク質(反応体積の3/4)まで標準化した。反応を、室温で示された時間インキュベートし、この時点で、1%硫酸で酸性化された飽和硫酸アンモニウム溶液の反応体積の1/4を添加して反応を停止した。試料を20817xgで15分間遠心分離して、上清を以前に記載されるようにHPLCで分析した。
【0076】
静止細胞生物変換
静止細胞を使用した生物変換は、わずかに変更して以前に記載されるように行った。使用した基底塩培地は、Neidhardtの微量栄養素溶液をさらに補充したM9 (6.78g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、1g/L NH4Cl、0.5g/L NaCl、2mM MgSO4、100μM CaCl2および15μMチアミン-HCl)であった。それぞれの株の一晩のLB培養を使用して、20g/Lグリセロール、10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物および適切な抗生物質(50μg/mLカルベニシリン、50μg/mLスペクチノマイシン)をさらに補充した50mLの上述の培地を含む250mLフラスコに接種した(1%)。フラスコ培養物を、NBS I24ベンチトップインキュベーター振盪器(New Brunswick Scientific Co.)中、30℃、250rpmでインキュベートした。2.5時間後、0.1mMイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)および0.04mMキュメート(ホルムアルデヒドおよび蟻酸塩を用いた実験には0.2mM IPTGおよび0.1mMキュムレート(cumulate)を使用した)の添加により遺伝子発現を誘導した。
静止細胞を使用した生物変換は、わずかに変更して以前に記載されるように行った。使用した基底塩培地は、Neidhardtの微量栄養素溶液をさらに補充したM9 (6.78g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、1g/L NH4Cl、0.5g/L NaCl、2mM MgSO4、100μM CaCl2および15μMチアミン-HCl)であった。それぞれの株の一晩のLB培養を使用して、20g/Lグリセロール、10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物および適切な抗生物質(50μg/mLカルベニシリン、50μg/mLスペクチノマイシン)をさらに補充した50mLの上述の培地を含む250mLフラスコに接種した(1%)。フラスコ培養物を、NBS I24ベンチトップインキュベーター振盪器(New Brunswick Scientific Co.)中、30℃、250rpmでインキュベートした。2.5時間後、0.1mMイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)および0.04mMキュメート(ホルムアルデヒドおよび蟻酸塩を用いた実験には0.2mM IPTGおよび0.1mMキュムレート(cumulate)を使用した)の添加により遺伝子発現を誘導した。
【0077】
上述の培養からの細胞を遠心分離(5000xg、22℃、5分)で採取し、炭素源を有さない上述のM9培地で2回洗浄した。最終細胞ペレットを、適切な炭素源(10mMホルムアルデヒドで約10のOD600または1mMホルムアルデヒドおよび10mM蟻酸塩で約5のOD600)を有するM9に再懸濁した。5mLの細胞懸濁物を25mLエルレンマイヤーフラスコ(Corning Inc.)に添加して、フォームプラグで頂部を覆った。フラスコを、NBS I24ベンチトップインキュベーター振盪器(New Brunswick Scientific Co.)中30℃、200rpmでインキュベートした。ホルムアルデヒドが唯一の炭素源であった場合、1.5時間後にさらなる10mMホルムアルデヒドを添加した。24時間後に、HPLC分析のために試料を以前に記載されるように得た。13C標識ホルムアルデヒドを基質として使用した場合、試料は、抽出および誘導後に以前に記載されるようにGC-MSにより分析した。
【0078】
発酵実験
使用した増殖培地は、500mMメタノール、10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物およびNeidhardtの微量栄養素溶液をさらに補充したM9 (6.78g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、1g/L NH4Cl、0.5g/L NaCl、2mM MgSO4、100μM CaCl2および15μMチアミン-HCl)であった。それぞれの株の一晩のLB培養物を使用して、適切な抗生物質(50μg/mLカルベニシリン、50μg/mLスペクチノマイシン)をさらに補充した5mLの上述の培地を含む50mL閉鎖キャップ円錐チューブ(Genesee Scientific Co.)に接種した(1%)。約3時間後、0.04mMイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)および0.04mMキュメートの添加により遺伝子発現を誘導した。チューブを、NBS I24ベンチトップインキュベーター振盪器(New Brunswick Scientific Co.)中、30℃、200rpmでインキュベートした。試料(100μL)を、以前に記載されるようにOD600測定およびHPLC分析のために、接種後24、48、72および96時間毎に採取した。基質として13Cメタノールを使用した場合、以前に記載されるように、抽出および誘導後に試料をGC-MSにより分析した。
使用した増殖培地は、500mMメタノール、10g/Lトリプトン、5g/L酵母抽出物およびNeidhardtの微量栄養素溶液をさらに補充したM9 (6.78g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、1g/L NH4Cl、0.5g/L NaCl、2mM MgSO4、100μM CaCl2および15μMチアミン-HCl)であった。それぞれの株の一晩のLB培養物を使用して、適切な抗生物質(50μg/mLカルベニシリン、50μg/mLスペクチノマイシン)をさらに補充した5mLの上述の培地を含む50mL閉鎖キャップ円錐チューブ(Genesee Scientific Co.)に接種した(1%)。約3時間後、0.04mMイソプロピルβ-d-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)および0.04mMキュメートの添加により遺伝子発現を誘導した。チューブを、NBS I24ベンチトップインキュベーター振盪器(New Brunswick Scientific Co.)中、30℃、200rpmでインキュベートした。試料(100μL)を、以前に記載されるようにOD600測定およびHPLC分析のために、接種後24、48、72および96時間毎に採取した。基質として13Cメタノールを使用した場合、以前に記載されるように、抽出および誘導後に試料をGC-MSにより分析した。
【0079】
唯一の炭素源としてホルムアルデヒドを用いた増殖のための2系統大腸菌系
M9培地を使用して以前に記載されるように培養および誘導した株を使用して、2系統実験を行った。誘導された細胞を、M9培地中3*109 CFU(コロニー形成単位)/mL(約5のOD600に同等)の初期濃度まで再懸濁した。20mLの懸濁物を、3mgパラホルムアルデヒド(5mMと同等)を含む25mLフラスコに添加したか、または10mLの懸濁物を、500mMメタノールまたは1mMホルムアルデヒドおよび10mM蟻酸ナトリウムを添加した25mLフラスコに添加した。グリコール酸塩を消費し得る第2の大腸菌株、AC763を、5*106 CFU/mL(約0.005のOD600と同等)の初期濃度に添加した。AC763はさらに、2つの株の識別を補助するために構成的に発現されるeGFPの染色体コピーを有した。培養へのその添加の前に、AC763を、25mLエルレンマイヤーフラスコ中(単一コロニー接種由来)、200rpm、30℃で24時間、5g/Lグリコール酸塩および2g/Lトリプトンを補充した5mLの上述のM9最小培地中で前もって増殖した。次いで細胞を遠心分離し(5000xg、22℃、5分)、5g/Lグリコール酸塩を補充した培地で2回洗浄し、約0.05の光学密度まで再懸濁した。200rpm、30℃でのインキュベーション(25mLエルレンマイヤーフラスコ中5mL)の24時間後、細胞を遠心分離し(5000xg、22℃)、炭素源を有さない培地で2回洗浄し、適切な体積を2系統系に添加した。両方の株を含むフラスコを、200rpm、30℃でさらにインキュベートした。HPLCおよび細胞増殖分析のために試料を種々の時間で採取した。1mLの培養当たりのコロニー形成単位を、細胞増殖の基準として使用した。適切な体積の培養を、炭素源を有さない上述の最小培地に希釈して、50μLの種々の希釈物を、2.5g/Lグリコール酸塩を含む最小培地プレート上で平板培養した。37℃でのプレートインキュベーション後、eGFP発現株AC763を照射する青色光トランスイルミネーター(Vernier, Beaverton, OR)を使用する視覚化により補助して、コロニーを手動で計数した。
M9培地を使用して以前に記載されるように培養および誘導した株を使用して、2系統実験を行った。誘導された細胞を、M9培地中3*109 CFU(コロニー形成単位)/mL(約5のOD600に同等)の初期濃度まで再懸濁した。20mLの懸濁物を、3mgパラホルムアルデヒド(5mMと同等)を含む25mLフラスコに添加したか、または10mLの懸濁物を、500mMメタノールまたは1mMホルムアルデヒドおよび10mM蟻酸ナトリウムを添加した25mLフラスコに添加した。グリコール酸塩を消費し得る第2の大腸菌株、AC763を、5*106 CFU/mL(約0.005のOD600と同等)の初期濃度に添加した。AC763はさらに、2つの株の識別を補助するために構成的に発現されるeGFPの染色体コピーを有した。培養へのその添加の前に、AC763を、25mLエルレンマイヤーフラスコ中(単一コロニー接種由来)、200rpm、30℃で24時間、5g/Lグリコール酸塩および2g/Lトリプトンを補充した5mLの上述のM9最小培地中で前もって増殖した。次いで細胞を遠心分離し(5000xg、22℃、5分)、5g/Lグリコール酸塩を補充した培地で2回洗浄し、約0.05の光学密度まで再懸濁した。200rpm、30℃でのインキュベーション(25mLエルレンマイヤーフラスコ中5mL)の24時間後、細胞を遠心分離し(5000xg、22℃)、炭素源を有さない培地で2回洗浄し、適切な体積を2系統系に添加した。両方の株を含むフラスコを、200rpm、30℃でさらにインキュベートした。HPLCおよび細胞増殖分析のために試料を種々の時間で採取した。1mLの培養当たりのコロニー形成単位を、細胞増殖の基準として使用した。適切な体積の培養を、炭素源を有さない上述の最小培地に希釈して、50μLの種々の希釈物を、2.5g/Lグリコール酸塩を含む最小培地プレート上で平板培養した。37℃でのプレートインキュベーション後、eGFP発現株AC763を照射する青色光トランスイルミネーター(Vernier, Beaverton, OR)を使用する視覚化により補助して、コロニーを手動で計数した。
【0080】
以前に記されるように、本開示は特定の態様および例示に関して上述されているが、該開示は必ずしもそのように限定されないことと、多くの他の態様、例示、使用、改変ならびに態様、例示および使用からの逸脱は、本明細書に添付される特許請求の範囲に包含されるように意図されることが当業者に理解される。
【実施例】
【0081】
実施例
実施例1：配列類似性に基づく同様の構造および/または機能を有する酵素を同定するために使用される戦略
この実施例の目的は、クエリとして参照酵素から開始する、所望の活性を有する酵素バリアントを同定するために使用されるワークフローの概観を提供することである。この実施例において、2-ヒドロキシアシル-CoAリアーゼ、ロドスピリルム目細菌URHD0017由来のHACL (RuHACL)を、第1ラウンド2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼ(HACS)バリアントの同定のための開始クエリとして使用する。RuHACLと、オキサリル-CoAデカルボキシラーゼ、大腸菌(EcOXC)およびオキサロバクター・ホルミゲネス(OfOXC)由来のOXCの間のE値に基づくE値カットオフを用いて、プロテインBLAST (pBLAST)を使用する(図19)。クエリ結果を同様の配列を有するファミリーにクラスタリングすることにより代表的なバリアントを範囲を狭める(down select)ために、本発明者らはCD-HITウェブサーバー(Huang et al. Bioinformatics, (2010). 26:680)を使用した。70%同一性閾値のより寛大な制限を、原核生物起源由来の遺伝子に課したが、分類学的制限なしについては50%を使用した(図19)。CD-HITを使用して代表的な遺伝子をクラスタリングすることおよび選別することにより、RuHACLと同様の93のHACSバリアントを得た。リストからのさらなる管理(curation)は、大腸菌内で十分に発現される可能性が低い動物界由来の長すぎるまたは短すぎる配列およびバリアントの排除を含む。結果的に、本発明者らは、管理後に、34の残りのバリアントを、宿主としての大腸菌内での合成および試験のための第1ラウンドのHACSバリアントであると決定した(図19)。次いで、選択された遺伝子を、大腸菌における発現のためにコドン最適化し、Joint Genome Institute (JGI)と共同して合成した。5つのバリアントは合成の間に失敗し、29の第1ラウンドJGI HACSバリアント(JGI1～JGI29)を得た(表5)。
実施例1：配列類似性に基づく同様の構造および/または機能を有する酵素を同定するために使用される戦略
この実施例の目的は、クエリとして参照酵素から開始する、所望の活性を有する酵素バリアントを同定するために使用されるワークフローの概観を提供することである。この実施例において、2-ヒドロキシアシル-CoAリアーゼ、ロドスピリルム目細菌URHD0017由来のHACL (RuHACL)を、第1ラウンド2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼ(HACS)バリアントの同定のための開始クエリとして使用する。RuHACLと、オキサリル-CoAデカルボキシラーゼ、大腸菌(EcOXC)およびオキサロバクター・ホルミゲネス(OfOXC)由来のOXCの間のE値に基づくE値カットオフを用いて、プロテインBLAST (pBLAST)を使用する(図19)。クエリ結果を同様の配列を有するファミリーにクラスタリングすることにより代表的なバリアントを範囲を狭める(down select)ために、本発明者らはCD-HITウェブサーバー(Huang et al. Bioinformatics, (2010). 26:680)を使用した。70%同一性閾値のより寛大な制限を、原核生物起源由来の遺伝子に課したが、分類学的制限なしについては50%を使用した(図19)。CD-HITを使用して代表的な遺伝子をクラスタリングすることおよび選別することにより、RuHACLと同様の93のHACSバリアントを得た。リストからのさらなる管理(curation)は、大腸菌内で十分に発現される可能性が低い動物界由来の長すぎるまたは短すぎる配列およびバリアントの排除を含む。結果的に、本発明者らは、管理後に、34の残りのバリアントを、宿主としての大腸菌内での合成および試験のための第1ラウンドのHACSバリアントであると決定した(図19)。次いで、選択された遺伝子を、大腸菌における発現のためにコドン最適化し、Joint Genome Institute (JGI)と共同して合成した。5つのバリアントは合成の間に失敗し、29の第1ラウンドJGI HACSバリアント(JGI1～JGI29)を得た(表5)。
【0082】
表5. 参照酵素としてRuHACLを使用した配列類似性を有する遺伝子クラスターから代表的な遺伝子を選択することにより同定した2-ヒドロキシアシル-CoA (HACS)バリアント(JGI)のリスト
【表5】
【0083】
実施例2：C1-C1縮合のための第1ラウンドHACSバリアントをスクリーニングするためのハイスループットプラットフォームの確立
この実施例の目的は、インビボで2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼ(HACS)バリアントをスクリーニングするためのハイスループットプラットフォームを示すことである。本発明者らは、HACS活性の指標として細胞密度当たりのグリコール酸(グリコール酸塩)生産性(μMグリコール酸塩/OD600)を使用した。グリコール酸塩は、活性なHACSバリアントおよびリステリア・モノサイトゲネス由来のアシル-CoAレダクターゼ(LmACR)の存在下、唯一の炭素源としてのホルムアルデヒドから作製され得る(図20A)。LmACRは、ホルムアルデヒドからホルミル-CoAへの酸化反応を触媒し得ることが示される(Chou, A., et al. Nat. Chem. Biol. 15:900-906 (2019))。HACSは、ホルムアルデヒドおよびホルミル-CoAを縮合して、グリコリル-CoAを形成し、これは次いで天然のチオエステラーゼ活性によりグリコール酸塩に加水分解され得る(図20A)。
この実施例の目的は、インビボで2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼ(HACS)バリアントをスクリーニングするためのハイスループットプラットフォームを示すことである。本発明者らは、HACS活性の指標として細胞密度当たりのグリコール酸(グリコール酸塩)生産性(μMグリコール酸塩/OD600)を使用した。グリコール酸塩は、活性なHACSバリアントおよびリステリア・モノサイトゲネス由来のアシル-CoAレダクターゼ(LmACR)の存在下、唯一の炭素源としてのホルムアルデヒドから作製され得る(図20A)。LmACRは、ホルムアルデヒドからホルミル-CoAへの酸化反応を触媒し得ることが示される(Chou, A., et al. Nat. Chem. Biol. 15:900-906 (2019))。HACSは、ホルムアルデヒドおよびホルミル-CoAを縮合して、グリコリル-CoAを形成し、これは次いで天然のチオエステラーゼ活性によりグリコール酸塩に加水分解され得る(図20A)。
【0084】
インビボでのホルムアルデヒドからのグリコール酸塩産生経路をプロトタイプ化するために、本発明者らは、pCDFDuet-1およびpETDuet-1それぞれにおいて両方がIPTG誘導性T7プロモーターの制御下にある種々のHACS候補およびLmACRを過剰発現するベクターを構築した(図20C)。これらのベクターの宿主として、本発明者らは、本発明者らの経路の分析と競合または干渉し得ると予想したホルムアルデヒド(ΔfrmA)および蟻酸塩(ΔfdhF ΔfdnG ΔfdoG)酸化についてならびにグリコール酸塩利用について(ΔglcD)のノックアウトを有するMG1655(DE3)に基づいて大腸菌の遺伝子工学で作り変えられた株を使用した。
【0085】
インビボ生成物合成は、そうではないと特定されない限り、M9最小培地(6.78g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、1g/L NH4Cl、0.5g/L NaCl、2mM MgSO4、100μM CaCl2および15μMチアミン-HCl)を使用して行った。細胞は、20g/Lグリセロール、10g/Lトリプトンおよび5g/L酵母抽出物をさらに補充した0.2mLの上述の培地を含む96深ウェルプレート(USA Scientific, Ocala, FL)中で最初に増殖された。所望の株の単一コロニーを、適切な抗生物質を有するLB培地中で一晩(14～16時間)培養し、接種物(1%)として使用した。適切な場合に、抗生物質(100μg/mLカルベニシリン、100μg/mLスペクチノマイシン)を含めた。次いで、培養物を、30℃、1000rpmで、約0.4のOD600が達成されるまでDigital Microplate Shaker (Fisher Scientific)中でインキュベートし、この時点で適切な量の誘導物質(1つまたは複数)(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG))を添加した。プレートを接種後合計で24時間インキュベートした(図20B)。
【0086】
次いで、上述の前培養由来の細胞を遠心分離し(4000rpm、22℃)、炭素源を有さない上述の最小培地で洗浄し、示される量の炭素源を含む1mLの上述の最小培地で再懸濁した。5mMホルムアルデヒドを0時間に添加し、Digital Microplate Shaker (Fisher Scientific)中、30℃、1000rpmでインキュベートした。30℃で3時間のインキュベーション後、遠心分離により細胞をペレット化し、上清を、下記のようにHPLCまたはGC-MSにより分析した。生物変換後に採取した細胞ペレットを、細胞溶解のために0.1mg/mLニワトリ卵白リゾチーム(Fisher)および5U/mL Benzonase(登録商標)ヌクレアーゼ(Sigma)を補充したB-PER(登録商標) Bacterial Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher)中で20ODまで再懸濁した。室温で15分のインキュベーション後、100μLのそれぞれの細胞溶解物を、15,000xgで5分間の遠心分離のために1.5mLマイクロ遠心分離チューブに移した。上清から得られた可溶性細胞溶解物を、SDS-PAGEを使用して分析した。相対的HACS発現を、タンパク質ゲル画像中のバンド面積により推定した。
【0087】
生成物および基質濃度(蟻酸、ホルムアルデヒドおよびグリコール酸)の定量化は、屈折率検出器およびHPX-87H有機酸カラム(Bio-Rad, Hercules, CA)を備えたShimadzu Prominence SIL 20システム(Shimadzu Scientific Instruments, Inc., Columbia, MD)を使用して、ピーク分離を最適化する操作条件(0.3ml/分流速、30mM H2SO4移動相、カラム温度42℃)でHPLCにより決定した。化合物同定および分析は、5977B Inert Plus Mass Selective Detector Turbo EI Bundle (同定のため)およびAgilent HP-5-msキャピラリーカラム(0.25mm内径、0.25μmフィルム厚さ、30m長さ)を備えたAgilent 7890B Series Custom Gas Chromatographyシステムを使用して、GC-MSにより行った。
【0088】
第1ラウンドHACSバリアントのスクリーニングは、29のうち3つのバリアント(JGI15、19、20)が、開始参照RuHACLよりも良好なグリコール酸塩生産性および相対的なHACS発現を示すを示すことを示す(図20C)。JGI15およびJGI20は、グリコール酸塩生産性において3倍より高い向上を示す2つの最良の候補であり、さらなる分析について選択する。
【0089】
実施例3：種々のC1-C1縮合プラットフォーム下での高性能バリアントの試験
この実施例の目的は、参照酵素RuHACLとの比較における2つの高性能HACSバリアント(JGI15およびJGI20)に対する分析を示すことである。本発明者らは、HACS活性の指標として細胞密度当たりのグリコール酸(グリコール酸塩)生産性(μMグリコール酸塩/OD600)を使用した。グリコール酸塩合成についての2つの異なる酵素経路を調べた。第1の経路(経路1)は、グリコールアルデヒドからグリコール酸塩へのフラックスを駆動するために過剰発現される余分な遺伝子、大腸菌由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼaldA (EcAldA)の添加による実施例2における最初にスクリーニングに使用された経路と同様である(図21A)。また、HACSおよびLmACR-AldAは、相対的遺伝子発現を変動させる影響を調べるために、独立した誘導性プロモーター下で制御される(図21B)。第2の経路(経路2)は、一定のホルミル-CoAフラックスを保ちながら、ホルムアルデヒド濃度のみの変化に応答する酵素活性の評価を可能にする、ホルムアルデヒドおよびホルミル-CoAの独立したフラックスを含む。ホルミル-CoAは、クロストリジウム・アミノブチリクム(Clostridium aminobutyricum)由来のアシル-CoAトランスフェラーゼ(CaAbfT)により触媒される蟻酸(蟻酸塩)により作製される(図22A)。
この実施例の目的は、参照酵素RuHACLとの比較における2つの高性能HACSバリアント(JGI15およびJGI20)に対する分析を示すことである。本発明者らは、HACS活性の指標として細胞密度当たりのグリコール酸(グリコール酸塩)生産性(μMグリコール酸塩/OD600)を使用した。グリコール酸塩合成についての2つの異なる酵素経路を調べた。第1の経路(経路1)は、グリコールアルデヒドからグリコール酸塩へのフラックスを駆動するために過剰発現される余分な遺伝子、大腸菌由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼaldA (EcAldA)の添加による実施例2における最初にスクリーニングに使用された経路と同様である(図21A)。また、HACSおよびLmACR-AldAは、相対的遺伝子発現を変動させる影響を調べるために、独立した誘導性プロモーター下で制御される(図21B)。第2の経路(経路2)は、一定のホルミル-CoAフラックスを保ちながら、ホルムアルデヒド濃度のみの変化に応答する酵素活性の評価を可能にする、ホルムアルデヒドおよびホルミル-CoAの独立したフラックスを含む。ホルミル-CoAは、クロストリジウム・アミノブチリクム(Clostridium aminobutyricum)由来のアシル-CoAトランスフェラーゼ(CaAbfT)により触媒される蟻酸(蟻酸塩)により作製される(図22A)。
【0090】
インビボプロトタイピングのために、本発明者らは、HACSバリアントおよびLmACR-EcAldA(経路1、図21A)またはCaAbfT(経路2、図22A)の発現を独立して制御するベクターを遺伝子工学で作り変え、pCDFDuet-1においてHACSはIPTG誘導性T7プロモーターの制御下にあり、pETDuet-1においてLmACR-EcAldAまたはCaAbfTはキュメート誘導性T5プロモーターの制御下にある(図21B)。これらのベクターのための宿主として、本発明者らは、本発明者らの経路の分析と競合または干渉し得ると予想したホルムアルデヒド(ΔfrmA)および蟻酸塩(ΔfdhF ΔfdnG ΔfdoG)酸化についてならびにグリコール酸塩利用について(ΔglcD)のノックアウトを有するMG1655(DE3)に基づいて、大腸菌の遺伝子工学で作り変えられた株を使用した。
【0091】
インビボ生成物合成は、そうではないと特定されない限り、M9最小培地(6.78g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、1g/L NH4Cl、0.5g/L NaCl、2mM MgSO4、100μM CaCl2および15μMチアミン-HCl)を使用して行った。細胞を最初に、20g/Lグリセロール、10g/Lトリプトンおよび5g/L酵母抽出物をさらに補充した0.2mLの上述の培地を含む96深ウェルプレート(USA Scientific, Ocala, FL)中で増殖させた。所望の株の単一コロニーを、適切な抗生物質を有するLB培地中で一晩(14～16時間)培養し、接種物(1%)として使用した。適切な場合は、抗生物質(100μg/mLカルベニシリン、100μg/mLスペクチノマイシン)を含めた。次いで培養物を、約0.4のOD600が達成されるまでDigital Microplate Shaker (Fisher Scientific)中、30℃、1000rpmでインキュベートし、この時点で適切な量の誘導因子(1つまたは複数)(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)およびキュメート)を添加した。プレートは、接種後合計で24時間インキュベートした(図20B)。
【0092】
次いで上述の前培養由来の細胞を遠心分離し(4000rpm、22℃)、炭素源を有さない上述の最小培地で洗浄し、示される量の炭素源を含む1mLの上述の最小培地で再懸濁した。LmACR-EcAldA共発現について5mMホルムアルデヒドのみ(図21A)、CaAbfT共発現について0.5/5mMホルムアルデヒドおよび20mM蟻酸塩(図22A)を0時間に添加して、Digital Microplate Shaker (Fisher Scientific)中、30℃、1000rpmでインキュベートした。LmACR-EcAldA共発現について3時間後およびCaAbfT共発現について1時間後に遠心分離により細胞を採取し、上清を、実施例2に記載されるようにHPLCまたはGC-MSにより分析した。
【0093】
5mMホルムアルデヒドを唯一の炭素源として使用した場合、JGI15(図21C)は、最適な誘導物質濃度(相対的遺伝子発現)下、3時間のグリコール酸塩生産性(μM/OD600)に基づいて、RuHACL(図21D)よりも2.5倍良好に機能する。ホルムアルデヒドおよび蟻酸塩を共に供給する場合、JGI15は、低いホルムアルデヒド利用可能性(0.5mM)下で、実質的な限界(7倍および1.5倍のそれぞれ)においてRuHACLおよびJGI20よりも優れ、JGI15とホルムアルデヒドの良好な親和性(低Km)を示す(図4B)。一方で、JGI20は、高いホルムアルデヒド濃度(5mM)下で良好なグリコール酸塩生産性を示し、このバリアントの良好な代謝回転(高kcat)を示す。
【0094】
実施例4：高性能HACSバリアントの動力学的特徴付け
この実施例の目的は、精製された酵素を用いたインビトロ動力学的アッセイを使用した第1ラウンドのホモログ由来の高性能HACSバリアント(JGI15、JGI20、JGI23およびJGI24)の動力学的特徴付けを示すことである。動力学的アッセイは、CoA供与体としてアセチル-CoAを使用してCoAトランスフェラーゼCaAbfTにより触媒される蟻酸塩からホルミル-CoAを提供する連結された反応を用いて行った。
この実施例の目的は、精製された酵素を用いたインビトロ動力学的アッセイを使用した第1ラウンドのホモログ由来の高性能HACSバリアント(JGI15、JGI20、JGI23およびJGI24)の動力学的特徴付けを示すことである。動力学的アッセイは、CoA供与体としてアセチル-CoAを使用してCoAトランスフェラーゼCaAbfTにより触媒される蟻酸塩からホルミル-CoAを提供する連結された反応を用いて行った。
【0095】
選択される酵素バリアントの発現は、HACSバリアント(JGI15、20、23および24)についてのJoint Genome Institute (JGI)によってまたは所望の遺伝子(1つまたは複数)を、適切な制限酵素で消化されたpCDFDuet-1 (Novagen, Darmstadt, Germany)にクローニングすることによっておよびIn-Fusionクローニング技術(Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA)を利用することによってのいずれかで構築されたプラスミド系遺伝子発現を使用して達成された。挿入のための線形DNA断片は、コドン最適化遺伝子の遺伝子合成により作製された。遺伝子はGeneArt (Life Technologies, Carlsbad, CA)またはTwist (Twist Biosciences)により合成された。得られたIn-Fusion反応生成物を使用して、大腸菌Stellar細胞(Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA)を形質転換し、PCRスクリーニングにより同定されたクローンを、DNA配列決定によりさらに確認した。
【0096】
発現株の一晩の培養物は、LB中で増殖され、これを使用して、250mLバッフルフラスコ内の25mL TB培地に1v/v% (250μL)で接種した。OD550が0.4～0.6に達するまで、培養物を回転振盪器中30℃、250rpmで増殖させ、この時点で0.1mM IPTGにより発現を誘導した。接種の24時間後、遠心分離により細胞を回収した。細胞ペレットを冷9g/L NaCl溶液で1回洗浄し、必要になるまで-80℃で保存した。適切な場合は以下の濃度で抗生物質を含めた：カルベニシリン(50μg/mL)およびスペクチノマイシン(50μg/mL)。
【0097】
タンパク質精製について、所望のhis-タグ付加酵素を発現する大腸菌細胞ペレットを上述の通りに調製した。凍結した細胞ペレットを、冷溶解バッファ(50mM NaPi pH7.4、300mM NaCl、10mMイミダゾール、0.1% Triton-X 100)中、約40のOD550まで再懸濁し、これに1mg/mLのリゾチームおよび250UのBenzonaseヌクレアーゼを添加した。Branson Sonifier 250を使用して氷上の超音波処理(25%義務サイクルおよび出力制御を3に設定で5分)により混合物をさらに処理し、7500×g、15分間、4℃で遠心分離した。上清を、1mL TALON金属親和性樹脂(Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA)を含むクロマトグラフィーカラムに適用し、溶解バッファで前平衡化した。次いでカラムを最初に10mLの溶解バッファで、次いで20mLの洗浄バッファ(50mM NaPi pH7.4、300mM NaCl、20mMイミダゾール)で2回洗浄した。目的のhis-タグ付加タンパク質を、4mL溶出バッファ(50mM NaPi pH7.4、300mM NaCl、250mMイミダゾール)の1～2回の適用により溶出した。溶出物を回収して、10,000 MWCO Amicon限外濾過遠心分離デバイス(Millipore, Billerica, MA)に適用し、濃縮物(約100μL)を脱塩のために4mLの50mM KPi pH7.4で2回洗浄した。Bradford法によりタンパク質濃度を推定した。必要になるまで、精製したタンパク質を20μLアリコート中-80℃で保存した。
【0098】
SDSランニングバッファ用いてNuPAGE 12% Bis-Tris Protein Gelを使用してSDS-PAGEを実行し、製造業者のプロトコルに従ってSimplyBlue SafeStain(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)により染色した。
【0099】
インビトロ動力学的アッセイは、100mM KPi pH6.9、10mM MgCl2、0.15mM TPP、2mMアセチル-CoA、1μM CaAbfT、0.25μM HACSバリアントおよび20mM蟻酸ナトリウムで構成された。反応を室温で3分間インキュベートして、蟻酸塩をホルミル-CoAに変換し、次いで特定の濃度のアルデヒド(具体的に、ここではアセトアルデヒドまたはプロピオンアルデヒド)を反応に添加した。さらに3分のインキュベーション後、反応体積の1/20の10M NaOH溶液を添加して反応を終結させた。30分の加水分解後、反応体積の1/20の10N H2SO4を添加してpHを中性化した。試料を20817xgで15分間遠心分離し、上清を、下記のようにGC-MSにより分析した。
【0100】
この分析について、0.15の反応体積の内部標準コハク酸メチルを試料に添加した。20分間の激しいボルテックスにより、得られた試料を4mL酢酸エチルに抽出した。有機相を分離して、窒素流下で乾燥まで蒸発させた。残渣を30μLピリジンおよび30μL N,O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(BSTFA)に溶解して、60℃で15分間インキュベートした。5977B Inert Plus Mass Selective Detector Turbo EI Bundle (同定のため)およびAgilent HP-5-msキャピラリーカラム(0.25mm内径、0.25μmフィルム厚さ、30m長さ)を備えたAgilent 7890B Series Custom Gas Chromatographyシステムを使用して、GC-MSにより化合物の同定および分析を行った。試料は、担体気体として1.5mL/分の流速のヘリウムおよび以下の温度プロフィール：初期90℃、3分；15℃/分の傾斜で170℃まで；20℃/分の傾斜で300℃までおよび8分間保持を使用して、GC (1μL注射、20:1の分離比)により分析した。注入器および検出器温度はそれぞれ250℃および350℃であった。
【0101】
実施例3(図22B)から推測されるように、JGI15は、JGI20と比較して、ホルムアルデヒドに関して低いkcatを有する低いKmを有した(表8)。より長い鎖のアルデヒドを用いて、JGI15およびJGI20は、JGI23およびJGI24と比較してアセトアルデヒドおよびプロピオンアルデヒドに対してより低いKm(ミリモーラー以下)を有し、より低いKcatも有する。これは、それらがアルデヒドに対してより強い親和性およびより低い酵素活性を有することを示す。JGI23およびJGI24は、より良い活性(より高いKcat)を有するので有望であり、基質に対する親和性を向上することにより(より低いKm)、インビボでより良く働く良好な能力を有する。同様に、AcHACLは、アセトンとより低いKmであり、JGI15はより良いKcatである(表8)。
【0102】
表8. 基質として種々のアルデヒドおよびケトンを用いた2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼ(HACS)バリアントについての見かけの動力学的パラメーター。
【表6】
【0103】
実施例5：高性能HACSバリアントのタンパク質構造のモデル化および構造分析による重要な触媒残基の理解
この実施例には、タンパク質構造分析およびアラニンスキャニング法を使用した組換え高性能HACSバリアント(JGI15およびJGI20)の分析が示される。JGI15 (図23A)およびJGI20 (図23B)の完全二量体構造は、ColabFoldプラットフォーム(Mirdita et al. Nature Methods 19:679-682 (2022))においてAlphaFold (Jumper et al. Nature 596:583-589 (2021))を使用してモデル化される。該モデルを、ホルミル-CoAとの複合体におけるオキサロバクター・ホルミゲネス由来のオキサリル-CoAデカルボキシラーゼの結晶構造と整列し(PDBコード：2JI8) (Berthold et al. Structure 15: 853-861 (2007))、活性部位における2つの重要なリガンド、チアミン二リン酸(TPP)およびホルミル-CoAの方向を理解する。該構造は、JGI15およびJGI20のそれぞれについて1.185Åおよび0.981Åの二乗平均距離(RMSD)値を有して高度に類似する。(TPPおよびホルミル-CoAのホルミル残基が触媒について交流する)活性部位およびCoA結合部位は両方、溶媒に曝露され、JGI15およびJGI20構造にドッキングするリガンドの正確な方向を示す(図23C)。
この実施例には、タンパク質構造分析およびアラニンスキャニング法を使用した組換え高性能HACSバリアント(JGI15およびJGI20)の分析が示される。JGI15 (図23A)およびJGI20 (図23B)の完全二量体構造は、ColabFoldプラットフォーム(Mirdita et al. Nature Methods 19:679-682 (2022))においてAlphaFold (Jumper et al. Nature 596:583-589 (2021))を使用してモデル化される。該モデルを、ホルミル-CoAとの複合体におけるオキサロバクター・ホルミゲネス由来のオキサリル-CoAデカルボキシラーゼの結晶構造と整列し(PDBコード：2JI8) (Berthold et al. Structure 15: 853-861 (2007))、活性部位における2つの重要なリガンド、チアミン二リン酸(TPP)およびホルミル-CoAの方向を理解する。該構造は、JGI15およびJGI20のそれぞれについて1.185Åおよび0.981Åの二乗平均距離(RMSD)値を有して高度に類似する。(TPPおよびホルミル-CoAのホルミル残基が触媒について交流する)活性部位およびCoA結合部位は両方、溶媒に曝露され、JGI15およびJGI20構造にドッキングするリガンドの正確な方向を示す(図23C)。
【0104】
触媒活性および基質結合の原因となる特定のアミノ酸(AA)残基を理解するために、本発明者らは、参照タンパク質としてJGI20を使用して、TPP(図24A)またはホルミル-CoA(図24B)のいずれかから3.5Å以内にある全てのAA残基を選択した(表7)。次いで、本発明者らは、全ての第1ラウンドJGIバリアント(RuHACLを含んで30)間で保存されず、C1-C1縮合活性を有するバリアントに特有のAA残基を選択した。TPP結合部位由来の3つのAA残基(JGI20由来のH80、Q113およびY367)およびCoA結合部位由来の6個(F112、V354、M392、T397、Q544およびW548)が結果的に選択される(図24C)。Q544およびW548は、他の同様のタンパク質、例えばアクチノミセトスポラ・チアングマイエンシス(Actinomycetospora chiangmaiensis)由来の2-ヒドロキシアシル-CoAリアーゼ(AcHACL)における活性部位を覆う閉じたループを形成することが示されたJGI20のc末端に配置される(Zahn et al. J. Biol. Chem. 298(1) 101522 (2022))。活性なHACSバリアントは、この領域に「RKPQQF-W」の保存された残基を有するが、他のものは有さないことが見出された(図25A)。結果的に、本発明者らは、アラニンスキャニング方法(Morrison and Weiss, Curr Opin Chem Biol. 5 (3): 302-7 (2001))を使用して、活性部位およびc末端の閉じたループの近くで活性なバリアントのみの間で、保存された残基の重要性を調べ、それらの中の重要な触媒残基を同定することを決定した。
【0105】
表7. C1-C1縮合に対する高性能バリアントの活性部位残基(JGI20のAlphaFold構造に基づいてTPPおよびホルミル-CoAの3.5Å内)および対応する残基。太字の残基は活性バリアント間の保存されない残基を示す。アスタリスク(*)が付された残基は、HACSとOXCを区別すると推定される重要な触媒残基を示す。
【表7】
【0106】
JGI15およびJGI20変異体は、野生型JGI15およびJGI20をベクターpUC19にクローニングすることにより調製した(Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA)。突然変異誘発のための「インビボアセンブリ」(IVA)プロトコルに従って、所望の変異を含むプライマーを設計した(Garcia-Nafria et al., Sci. Rep. 6, 12. 2016)。変異を含むPCR産物は、IVAプロトコルに従って作製し、大腸菌Stellar細胞(Clontech Laboratories)を形質転換するために使用した。所望の突然変異配列は、DNA配列決定により確認した。次いで変異体遺伝子を、制限酵素消化およびライゲーションを使用して、最終の発現ベクター(pCDFDuet-1)にクローニングした。変異体のHACS活性は、炭素源として0.5mMホルムアルデヒドおよび20mM蟻酸塩を用いて、実施例3に記載される経路2(図22A)と同一の形式で試験する。
【0107】
活性部位残基に対するアラニンスキャニング結果は、TPP結合由来のグルタミン113(Q113)およびチロシン367(Y367)ならびにCoA結合由来のフェニルアラニン112 (F112)およびメチオニン392(M392)が、ホルムアルデヒド-ホルミル-CoA縮合に対するHACS活性に重要な残基であることを示す(図24C)。Q113は、他の2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼ、例えばAcHACLにおいて重要な触媒機能を有することが示された(Zahn et al. J. Biol. Chem. 298(1) 101522 (2022))。また、F112およびQ113の突然変異誘発は、RuHACLに対する以前の試験においてHACS活性の廃止を示した(Chou, A., et al. Nat. Chem. Biol. 15:900-906 (2019))。大腸菌、O.ホルミゲネスおよびメチロルブルム・エクストルクエンス(Methylorubrum extorquens)由来の遺伝子を含む公知のオキサリル-CoAデカルボキシラーゼ(OXC)バリアントは、F112 Q113の位置に保存されたチロシン-グルタミン酸(YE)残基を有することも見出された。OXC様「YE」残基を有する第1ラウンドHACSバリアントからの全てのバリアント(JGI4、6、7、9、10、11)は、ホルムアルデヒドからのグリコール酸塩産生を何ら有さず、系統発生分析においてOXCと一緒にクラスター化される(図29)。そのため、「FQ」および「YE」は、酵素のHACSおよびOXC型を区別する重要な触媒性残基であり得た。興味深いことに、触媒機能について重要であることが見出された2つのさらなる残基(Y367およびM392)(図24C)は、HACSの間のみでも保存されるが、OXCでは保存されない(表7)。OXC型酵素は、Y367に対応する位置に保存されない残基を有し、M392の位置に保存されたロイシン(L)残基を有する。そのため、該2つの残基は、HACSとOXCの活性を区別する触媒機能においても重要な役割を果たし得た。
【0108】
JGI20のQ545Aを除いて、JGI15およびJGI20中のc末端残基のいずれもアラニンへの点突然変異誘発から活性を廃止しなかった(図25B)。文献に従って、HACSのc末端が、触媒機能なしで基質結合を安定化する閉じたループとして働くことが予想される(Zahn et al. J. Biol. Chem. 298(1) 101522 (2022))。そのため、c末端は、結合ポケットの基質サイズの制限に重要な役割を果たすと推定された。JGI15およびJGI20の両方についてのこの領域に対するアラニンスキャニング結果に基づいて、おそらくは結合ポケットの安定性の低下のために、本発明者らは、特に高ホルムアルデヒド濃度(5mM)下で、全体的な活性の低下の傾向を見出し得る。しかしながら、興味深いことに、P547A (JGI15)、P543A (JGI20)、Q549A (JGI15)およびQ544A (JGI20)などのいくつかの突然変異は、低いホルムアルデヒド(0.5mM)で活性の顕著な向上を示す(図25B)。これは、最少のアルデヒド、ホルムアルデヒドとの基質結合親和性を変化することの結果であり得た。
【0109】
実施例6：2つの高性能バリアントのハイブリッドタンパク質を作製することによるHACS活性の向上
この実施例には、構造分析に基づいてハイブリッドタンパク質を作製することによる組換え高性能HACSバリアント(JGI15およびJGI20)の遺伝子工学的作り変えが示される。動力学的特徴付け(表8)に基づいて、JGI20は、JGI15よりも高いkcatを有するが、ホルムアルデヒドとの高いKmも有する。本発明者らは、2つの間でハイブリッドタンパク質を作製することにより、JGI20の親和性またはJGI15の代謝回転のいずれかを向上し得たことを推定した。2つのタンパク質の間の構造の差を同定するために、本発明者らは、タンパク質データバンク(PDB)ウェブサイト(www.rcsb.org)において、「ペアワイズ構造アライメント」機能を使用した。AlphaFoldによりモデル化されるJGI15およびJGI20構造は構造比較のために使用され、結果は、2つのタンパク質構造の間で整列されない2つの残基があることを示す(図26A)。JGI15-20ハイブリッドタンパク質は、AA残基を挿入または欠失して、2つの構造を完全に整列させることにより構築された。結果的に、JGI15 N465ins、R493delおよびN465 R493delを構築してJGI15を「JGI20様」にし、一方でJGI20 N461del、R480insおよびN461del R480insを構築してJGI20を「JGI15様」にする(図26B)。
この実施例には、構造分析に基づいてハイブリッドタンパク質を作製することによる組換え高性能HACSバリアント(JGI15およびJGI20)の遺伝子工学的作り変えが示される。動力学的特徴付け(表8)に基づいて、JGI20は、JGI15よりも高いkcatを有するが、ホルムアルデヒドとの高いKmも有する。本発明者らは、2つの間でハイブリッドタンパク質を作製することにより、JGI20の親和性またはJGI15の代謝回転のいずれかを向上し得たことを推定した。2つのタンパク質の間の構造の差を同定するために、本発明者らは、タンパク質データバンク(PDB)ウェブサイト(www.rcsb.org)において、「ペアワイズ構造アライメント」機能を使用した。AlphaFoldによりモデル化されるJGI15およびJGI20構造は構造比較のために使用され、結果は、2つのタンパク質構造の間で整列されない2つの残基があることを示す(図26A)。JGI15-20ハイブリッドタンパク質は、AA残基を挿入または欠失して、2つの構造を完全に整列させることにより構築された。結果的に、JGI15 N465ins、R493delおよびN465 R493delを構築してJGI15を「JGI20様」にし、一方でJGI20 N461del、R480insおよびN461del R480insを構築してJGI20を「JGI15様」にする(図26B)。
【0110】
代替的なアプローチは、JGI20の活性部位を遺伝子工学で作り変えてJGI15を模倣することにより、JGI20の基質結合親和性(Km)を向上することに基づいた。2つの酵素の活性部位残基を比較すると(表11)、保存されない残基は、JGI15が対応する位置において2つの連続するグリシン残基を有するA253およびP254のみである。結果的に、「JGI15様」のJGI20 A253G P254Gが構築された。別の標的領域は、アラニンスキャニング結果が活性の変化を示すc末端であった。JGI15および20は、最後の4～5残基を除き、c末端尾部で高度に保存された配列を有する(図27A)。AlphaFoldによりモデル化されたJGI15および20のタンパク質構造に基づいて、c末端の差は、閉じたループのわずかに異なる方向を示す(図27A)。本発明者らは、この違いが、JGI15とJGI20の間のKmの違いに寄与し得たと推定し、JGI20の「JGI15様」c末端：JGI20 L549H T550G R551delを構築した。
【0111】
表11. 参照酵素としてCcAckおよびCcPtaを使用して、配列類似性を有する遺伝子クラスターから代表的な遺伝子を選択することにより同定されたアシル-CoAキナーゼ(ACK)およびホスホアシルトランスフェラーゼ(PTA)バリアント(JGIK)のリスト。
【表8-1】
【表8-2】
【0112】
変異体の構築および試験は、実施例5に記載されるものと同一の形式で行う。
【0113】
構造整列に基づくJGI15-20ハイブリッドは、高いホルムアルデヒドでJGI15および低いホルムアルデヒドでJGI20の顕著な向上を示し、これは興味深いことに、両方のバリアントにおいて正の影響を示す(図26B)。2つのバリアントを整列することで、高いまたは低いホルムアルデヒド濃度下で活性を特異的に変化させる触媒残基の方向に影響を与える可能性がある。JGI15を模倣するためのJGI20活性部位およびc末端上の突然変異誘発は、低いホルムアルデヒド濃度下で、それぞれ39%および61%のグリコール酸塩生産性においてより有意な向上を示した(図27B)。本発明者らはまた、JGI15-20構造ハイブリッド由来の有益な突然変異および活性部位ハイブリッドを組み合わせようと試み、AlphaFold構造ハイブリッドおよびc末端ハイブリッドを組み合わせたJGI20 R480 L549H T550G R551delは、高いホルムアルデヒド濃度で活性の最小の低下のみを伴い、70%までの活性の最良の向上を示した(図27B)。これは、JGI20のKmにおける顕著な低減を示す0.5mM FALDでのJGI15からの50%向上に近く、これはハイブリッドアプローチから意図される。
【0114】
実施例7：ホルムアルデヒドを用いた活性についての第2ラウンドHACSバリアントの同定、合成およびスクリーニング
この実施例には、基質としてホルムアルデヒドを用いた第2ラウンドHACSバリアントの同定、合成およびスクリーニングが示される。第1ラウンドバリアントから、本発明者らは、開始参照酵素、RuHACLを超えてグリコリル-CoAシンターゼ活性について活性であるJGI15、JGI19およびJGI20を見出した(図28C)。また、アクチノミセトスポラ・チアングマイエンシス由来の2-ヒドロキシアシル-CoAリアーゼ(AcHACL)の潜在的なグリコリル-CoAシンターゼ(C1-C1縮合)活性は文献に示された(Rohwerder et al. Front. Microbiol. 11:691 (2020))。唯一の炭素源としてホルムアルデヒドを使用したインビボスクリーニングに基づいて(図28A)(実施例3、経路1)、AcHACLは、5mMホルムアルデヒド下でRuHACLよりも良好なグリコール酸塩生産性を示した。AcHACLは、系統発生樹から見られるように、RuHACLおよび他の第1ラウンドJGIバリアントに対して遠く関連する(図29)。そのため、本発明者らは、第1ラウンドバリアントからのJGI15、JGI19、JGI20およびAcHACLを参照酵素として使用して、第2ラウンドHACSバリアント(JGIH)を同定することを決定した。
この実施例には、基質としてホルムアルデヒドを用いた第2ラウンドHACSバリアントの同定、合成およびスクリーニングが示される。第1ラウンドバリアントから、本発明者らは、開始参照酵素、RuHACLを超えてグリコリル-CoAシンターゼ活性について活性であるJGI15、JGI19およびJGI20を見出した(図28C)。また、アクチノミセトスポラ・チアングマイエンシス由来の2-ヒドロキシアシル-CoAリアーゼ(AcHACL)の潜在的なグリコリル-CoAシンターゼ(C1-C1縮合)活性は文献に示された(Rohwerder et al. Front. Microbiol. 11:691 (2020))。唯一の炭素源としてホルムアルデヒドを使用したインビボスクリーニングに基づいて(図28A)(実施例3、経路1)、AcHACLは、5mMホルムアルデヒド下でRuHACLよりも良好なグリコール酸塩生産性を示した。AcHACLは、系統発生樹から見られるように、RuHACLおよび他の第1ラウンドJGIバリアントに対して遠く関連する(図29)。そのため、本発明者らは、第1ラウンドバリアントからのJGI15、JGI19、JGI20およびAcHACLを参照酵素として使用して、第2ラウンドHACSバリアント(JGIH)を同定することを決定した。
【0115】
表6. 参照酵素としてAcHACL、JGI15、JGI19およびJGI20を使用して、配列類似性を有する遺伝子クラスターから代表的な遺伝子を選択することにより同定された2-ヒドロキシアシル-CoA (HACS)バリアント(JGIH)のリスト
【表9-1】
【表9-2】
【表9-3】
【表9-4】
【0116】
開始参照酵素のそれぞれについて、実施例1に記載される方法(図19)を使用した。AcHACL (AcHACLクラスター)に近く関連し、AcHACL (AcHACLクラスターに遠く関連する)、JGI19クラスター、JGI15クラスターおよびJGI20クラスターに遠く関連する合計で99の酵素が同定される(図29)。本発明者らはまた、配列類似性を考慮することなく、I-TASSERから、AcHACL、JGI15、JGI19またはJGI20に構造的に類似する9個の余分な酵素を同定した(Yang et al. Nature Methods, 12: 7-8 (2015))。合計で108の遺伝子(JGIH1～JGIH108)を、Joint Genome Instituteと共同してコドン最適化して合成し、99のバリアントを、試験のためのpCDFDuet-1発現ベクターに成功裡に構築する。
【0117】
蟻酸塩活性化酵素と共にホルムアルデヒド(0.5mM)および蟻酸塩を共供給して、ハイスループットスクリーニングを使用して、グリコリル-CoAシンターゼ活性について第2ラウンドバリアントを試験する(図30A)。結果は、6個のバリアント(JGIH25、26、30、41、61および65)が、野生型JGI15よりも良好に機能し、JGIH25および65が、グリコール酸塩生産性において50%の増加を超えることを示す。JGI15と同様のレベルで機能する5個のさらなる候補がある(図30B)。
【0118】
系統発生樹分析に基づくと、JGIH25、26および30はJGI20クラスターに属し、41および61はJGI15クラスターに属し、JGI65はJGI19クラスターに属する。AcHACLクラスター(JGIH5および12)由来のカップルバリアントも、JGI15の約80%のかなりのグリコール酸塩生産性を示す。実施例5から同定されたJGI20の活性部位残基と整列される6個の最良のバリアントの残基を比較する場合、本発明者らは、JGI15とJGI20の間で保存されなかった2つの残基(JGI20のA253 P254)を除いて、それらのほとんどが高度に保存されることを見出し得る(表7)。JGIH61および65は、JGI15および20から系統発生的に最も離れるので、2つの以前に同定されたもの以外の活性部位に、複数の保存されない残基がある。それらのホルムアルデヒドおよびホルミル-CoAとの親和性および代謝回転速度などの2つのバリアントのさらなる特徴付けの後、以前のJGI15および20ハイブリッドアプローチからの学習に基づいて新規のハイブリッドタンパク質を構築することが考慮され得た。6個の最良のバリアントのc末端残基はまた、JGIH61および65がc末端で2および3個の余分なAA残基を有することを除いて、十分に保存される。6個のバリアントのいずれもJGI15と同じc末端残基を有さず、これは閉じたループについてのハイブリッドタンパク質アプローチについて別の標的であり得た。
【0119】
実施例8：アルデヒドを用いた活性についての第1および第2ラウンドバリアントのスクリーニング
この実施例の目的は、インビボにおいて基質として種々のアルデヒドを使用して、第1および第2ラウンドの2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼ(HACS)バリアントをスクリーニングするためのハイスループットプラットフォームを示すことである。本発明者らは、HACS活性の指標として、細胞密度当たりの2-ヒドロキシ酸生産性(μM/OD600)を使用した。2-ヒドロキシ酸は、活性なHACSバリアントおよびクロストリジウム・アミノブチリクム由来のアシル-CoAトランスフェラーゼ(CaAbfT)の存在下で、炭素源として種々のアルデヒドおよび蟻酸(蟻酸塩)を共供給して作製され得る。CaAbfTは、蟻酸塩からホルミル-CoAへの反応を触媒し得ることが示される(Nattermann, M., et al. ACS Catal 11(9):5396-5404 (2021))。HACSは、アルデヒドおよびホルミル-CoAを縮合し、2-ヒドロキシアシル-CoAを形成し、次いでこれは、天然のチオエステラーゼ活性により2-ヒドロキシ酸に加水分解され得る(図31A)。
この実施例の目的は、インビボにおいて基質として種々のアルデヒドを使用して、第1および第2ラウンドの2-ヒドロキシアシル-CoAシンターゼ(HACS)バリアントをスクリーニングするためのハイスループットプラットフォームを示すことである。本発明者らは、HACS活性の指標として、細胞密度当たりの2-ヒドロキシ酸生産性(μM/OD600)を使用した。2-ヒドロキシ酸は、活性なHACSバリアントおよびクロストリジウム・アミノブチリクム由来のアシル-CoAトランスフェラーゼ(CaAbfT)の存在下で、炭素源として種々のアルデヒドおよび蟻酸(蟻酸塩)を共供給して作製され得る。CaAbfTは、蟻酸塩からホルミル-CoAへの反応を触媒し得ることが示される(Nattermann, M., et al. ACS Catal 11(9):5396-5404 (2021))。HACSは、アルデヒドおよびホルミル-CoAを縮合し、2-ヒドロキシアシル-CoAを形成し、次いでこれは、天然のチオエステラーゼ活性により2-ヒドロキシ酸に加水分解され得る(図31A)。
【0120】
インビボプロトタイピングについて、本発明者らは、HACSバリアントおよびCaAbfTの発現を独立して制御するように、ベクターを遺伝子工学的に作り変え、ここでpCDFDuet-1においてHACSはIPTG誘導性T7プロモーターの制御下にあり、pETDuet-1においてCaAbfTはキュメート誘導性T5プロモーターの制御下にあり(図31B)、該ベクターは実施例3に記載される大腸菌の遺伝子工学で作り変えられた株に形質転換された。
【0121】
5mMアルデヒドおよび20mM蟻酸塩を共供給することにより、実施例3に記載されるようにハイスループットスクリーニングプラットフォームを使用して、HACSバリアントを2-ヒドロキシ酸産生についてスクリーニングした。遠心分離することにより1時間後に細胞を採取し、HPLC(実施例2に記載される)またはSoGO法により上清を分析した。
【0122】
SoGO法において、ホウレンソウ由来のグリコール酸塩オキシダーゼ(SoGO)を使用して、2-ヒドロキシ酸の酸化を触媒し、2-オキソ酸および過酸化水素(H2O2)を作製する。次いで、Amplex UltraRed (Invitrogen)試薬を、H2O2と1:1の化学量論比で反応して、明るい蛍光性で強く吸収される反応生成物Amplex UltroxRed (励起/放出最大値約568/581nm)を生じるホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP) (Sigma)についての蛍光基質として使用する。BioTek Synergy HTプレートリーダー(BioTek Instruments)を使用して、Amplex UltroxRedにより測定される蛍光読み取りの較正に基づいて、2-ヒドロキシ酸濃度を計算した。
【0123】
実施例9：アセトアルデヒドを用いた活性についての第1および第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニング
この実施例には、インビボにおいて基質としてアセトアルデヒドを用いた第1および第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニングが示される。本発明者らは、HACS活性の指標として細胞密度当たりの乳酸(乳酸塩)生産性(μM乳酸塩/OD600)を使用した。5mMアセトアルデヒドおよび20mM蟻酸塩を共供給することにより、実施例3に記載されるハイスループットスクリーニングプラットフォームを使用して、HACSバリアントを乳酸産生についてスクリーニングした。HACSは、アセトアルデヒドおよびホルミル-CoAを縮合してラクトイル-CoAを形成し、次いでこれは天然のチオエステラーゼ活性を介して乳酸塩に加水分解され得る(図32A)。
この実施例には、インビボにおいて基質としてアセトアルデヒドを用いた第1および第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニングが示される。本発明者らは、HACS活性の指標として細胞密度当たりの乳酸(乳酸塩)生産性(μM乳酸塩/OD600)を使用した。5mMアセトアルデヒドおよび20mM蟻酸塩を共供給することにより、実施例3に記載されるハイスループットスクリーニングプラットフォームを使用して、HACSバリアントを乳酸産生についてスクリーニングした。HACSは、アセトアルデヒドおよびホルミル-CoAを縮合してラクトイル-CoAを形成し、次いでこれは天然のチオエステラーゼ活性を介して乳酸塩に加水分解され得る(図32A)。
【0124】
第1ラウンドHACSバリアントのスクリーニングは、29のうち6個のバリアントがかなりの乳酸塩生産性を生じることを示す(図32B)。JGI15およびJGI20は、他のHACSバリアントと比較して、2倍より高い乳酸塩生産性を示す2つの最良の候補である。
【0125】
第2ラウンドHACSバリアントについての生成物濃度(乳酸塩)の定量化は、実施例8に記載されるSoGO法により決定された。結果は、1つのバリアントJGIH48が、乳酸塩生産性の20%の増加を超えて野生型JGI15よりも良好に機能することを示す(図32C)。さらに、JGIH28は、JGI15と同様のレベルで機能する。
【0126】
実施例10：プロピオンアルデヒドを用いた活性についての第1および第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニング
この実施例には、インビボでの基質としてプロピオンアルデヒドを用いた第1および第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニングが示される。本発明者らは、HACS活性の指標として細胞密度当たりの2-ヒドロキシ酪酸(2HB)生産性(μM 2HB/OD600)を使用した。HACSバリアントは、5mMプロピオンアルデヒドおよび20mM蟻酸塩を共供給することにより、実施例3に記載されるハイスループットスクリーニングプラットフォームを使用して、2HB産生についてスクリーニングされた。HACSは、プロピオンアルデヒドおよびホルミル-CoAを縮合して2-ヒドロキシブチリル-CoAを形成し、次いでこれは天然のチオエステラーゼ活性により2HBに加水分解され得る(図33A)。
この実施例には、インビボでの基質としてプロピオンアルデヒドを用いた第1および第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニングが示される。本発明者らは、HACS活性の指標として細胞密度当たりの2-ヒドロキシ酪酸(2HB)生産性(μM 2HB/OD600)を使用した。HACSバリアントは、5mMプロピオンアルデヒドおよび20mM蟻酸塩を共供給することにより、実施例3に記載されるハイスループットスクリーニングプラットフォームを使用して、2HB産生についてスクリーニングされた。HACSは、プロピオンアルデヒドおよびホルミル-CoAを縮合して2-ヒドロキシブチリル-CoAを形成し、次いでこれは天然のチオエステラーゼ活性により2HBに加水分解され得る(図33A)。
【0127】
第1ラウンドHACSバリアントのスクリーニングは、29のうち10個のバリアントがかなりの2HB生産性を生じることを示す(図33B)。JGI20、JGI23およびJGI24は、他のHACSバリアントと比較して、3倍より高い2HB生産性を示す3つの最良の候補である。
【0128】
第2ラウンドHACSバリアントについての生成物濃度(2HB)の定量化は、実施例8に記載されるSoGO法により決定された。結果は、JGIH28が40%を超える2HB生産性の増加を有して、3つのバリアント(JGIH25、JGIH28およびJGIH48)が、JGI23よりも良好に機能することを示す(図33C)。
【0129】
実施例11：グリコールアルデヒドを用いた活性についての第1および第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニング
この実施例には、インビボでの基質としてグリコールアルデヒドを用いた第1および第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニングが示される。本発明者らは、HACS活性の指標として細胞密度当たりのグリセリン酸(グリセリン酸塩)生産性(μMグリセリン酸塩/OD600)を使用した。HACSバリアントは、5mMグリコールアルデヒドおよび20mM蟻酸塩を共供給することにより、実施例3に記載されるハイスループットスクリーニングプラットフォームを使用して、2HB産生についてスクリーニングされた。HACSはグリコールアルデヒドおよびホルミル-CoAを縮合してグリセリル-CoAを形成し、次いでこれは天然のチオエステラーゼ活性によりグリセリン酸塩に加水分解され得る(図34A)。
この実施例には、インビボでの基質としてグリコールアルデヒドを用いた第1および第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニングが示される。本発明者らは、HACS活性の指標として細胞密度当たりのグリセリン酸(グリセリン酸塩)生産性(μMグリセリン酸塩/OD600)を使用した。HACSバリアントは、5mMグリコールアルデヒドおよび20mM蟻酸塩を共供給することにより、実施例3に記載されるハイスループットスクリーニングプラットフォームを使用して、2HB産生についてスクリーニングされた。HACSはグリコールアルデヒドおよびホルミル-CoAを縮合してグリセリル-CoAを形成し、次いでこれは天然のチオエステラーゼ活性によりグリセリン酸塩に加水分解され得る(図34A)。
【0130】
第1ラウンドHACSバリアントのスクリーニングは、29のうち9個のバリアントがかなりのグリセリン酸塩生産性を生じることを示す(図34B)。JGI15およびJGI20は、他のHACSバリアントと比較して2倍より高いグリセリン酸塩生産性を示す2つの最良の候補である。
【0131】
系統発生樹分析(図29)に基づいて、JGI15およびJGI20は、第1ラウンドHACSスクリーニングからの最良の性能の候補であるので、本発明者らは、JGI15および/またはJGI20クラスターに属するバリアントが第2ラウンドHACSバリアントスクリーニングについてかなりの性能(グリセリン酸塩生産性)を示すと予想する。
【0132】
実施例12：グリオキシル酸を用いた活性についての第1および第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニング
この実施例には、インビボでの基質としてグリオキシル酸(グリオキシル酸塩)を用いた第1および第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニングが示される。本発明者らは、HACS活性の指標として細胞密度当たりのタルトロン酸(タルトロン酸塩)生産性(μMタルトロン酸塩/OD600)を使用した。HACSバリアントは、5mMグリオキシル酸塩および20mM蟻酸塩を共供給することにより、実施例3に記載されるハイスループットスクリーニングプラットフォームを使用して、タルトロン酸塩産生についてスクリーニングされた。HACSはグリオキシル酸塩およびホルミル-CoAを縮合してタルトロニル-CoAを形成し、次いでこれは天然のチオエステラーゼ活性によりタルトロン酸塩に加水分解され得る(図35A)。
この実施例には、インビボでの基質としてグリオキシル酸(グリオキシル酸塩)を用いた第1および第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニングが示される。本発明者らは、HACS活性の指標として細胞密度当たりのタルトロン酸(タルトロン酸塩)生産性(μMタルトロン酸塩/OD600)を使用した。HACSバリアントは、5mMグリオキシル酸塩および20mM蟻酸塩を共供給することにより、実施例3に記載されるハイスループットスクリーニングプラットフォームを使用して、タルトロン酸塩産生についてスクリーニングされた。HACSはグリオキシル酸塩およびホルミル-CoAを縮合してタルトロニル-CoAを形成し、次いでこれは天然のチオエステラーゼ活性によりタルトロン酸塩に加水分解され得る(図35A)。
【0133】
第1ラウンドHACSバリアントのスクリーニングは、29のうち6個のバリアントがかなりのタルトロン酸塩生産性を生じることを示す(図35B)。JGI20は、他のHACSバリアントと比較して、30%良好なタルトロン酸塩生産性を示す最良の候補である。
【0134】
系統発生樹分析(図29)に基づいて、JGI20は第1ラウンドHACSスクリーニングからの最良の性能の候補であるので、本発明者らは、JGI20クラスターに属するバリアントが第2ラウンドHACSバリアントスクリーニングについてかなりの性能(タルトロン酸塩生産性)を示すことを予想する。
【0135】
実施例13：3-ヒドロキシプロピオンアルデヒドを用いた活性についての第1および第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニング
この実施例には、インビボでの基質として3-ヒドロキシプロピオンアルデヒド(3HP)を用いた第1および第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニングが示される。本発明者らは、HACS活性の指標として細胞密度当たりの2,4-ジヒドロキシ酪酸(DHB)生産性(μM DHB/OD600)を使用した。HACSバリアントは、5mM 3HPおよび20mM蟻酸塩を共供給することにより、実施例3に記載されるハイスループットスクリーニングプラットフォームを使用して、DHB産生についてスクリーニングされた。HACSは3HPおよびホルミル-CoAを縮合して2,4-ジヒドロキシブチリル-CoAを形成し、次いでこれは天然のチオエステラーゼ活性によりDHBに加水分解され得る(図36A)。
この実施例には、インビボでの基質として3-ヒドロキシプロピオンアルデヒド(3HP)を用いた第1および第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニングが示される。本発明者らは、HACS活性の指標として細胞密度当たりの2,4-ジヒドロキシ酪酸(DHB)生産性(μM DHB/OD600)を使用した。HACSバリアントは、5mM 3HPおよび20mM蟻酸塩を共供給することにより、実施例3に記載されるハイスループットスクリーニングプラットフォームを使用して、DHB産生についてスクリーニングされた。HACSは3HPおよびホルミル-CoAを縮合して2,4-ジヒドロキシブチリル-CoAを形成し、次いでこれは天然のチオエステラーゼ活性によりDHBに加水分解され得る(図36A)。
【0136】
第1ラウンドHACSバリアントのスクリーニングは、29のうち3個のバリアント(JGI15、JGI20およびRuHACL)がかなりのDHB生産性を生じることを示す(図36B)。
【0137】
系統発生樹分析(図29)に基づいて、JGI15、JGI20およびRuHACLは、第1ラウンドHACSスクリーニングからの最良の性能の候補であるので、本発明者らは、これらのクラスターに属するバリアントが第2ラウンドHACSバリアントスクリーニングについてかなりの性能(DHB生産性)を示すと予想する。
【0138】
実施例14：ケトンを用いた活性についての第1ラウンドバリアントのスクリーニング
この実施例には、分岐鎖化合物産生のための基質として種々のケトンを用いた第1第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニングが示される。HACSバリアントは、蟻酸塩活性化酵素CaAbfTと共に100mMアセトンおよび20mM蟻酸塩を共供給することにより、実施例3経路2に記載されるハイスループットスクリーニングプラットフォームを使用して試験される(図37A)。
この実施例には、分岐鎖化合物産生のための基質として種々のケトンを用いた第1第2ラウンドHACSバリアントのスクリーニングが示される。HACSバリアントは、蟻酸塩活性化酵素CaAbfTと共に100mMアセトンおよび20mM蟻酸塩を共供給することにより、実施例3経路2に記載されるハイスループットスクリーニングプラットフォームを使用して試験される(図37A)。
【0139】
結果は、JGI15、JGI19およびJGI20がAcHACLと一緒に、他のHACLよりも良好な性能を有し、JGI15が最良の性能を有することを示す。アセトンおよび蟻酸塩を用いたJGI15およびAcHACLの動力学的特徴付けは、実施例4に記載される方法を使用して行った。JGI15は、インビボでより良い性能を与えるかなり良好な活性(より高いKcat)を有するが、その性能を制限したかなり高いKmを有する(表8)。AcHACLはさらに悪い活性を有するが、かなり低いKmを有する(図37B)。アセトンおよびホルミル-CoAの縮合による2HIB産生についてのより良いHACLは、参照としてAcHACLまたはJGI15を使用した第2ラウンドHACSバリアントにおいて予想される。
【0140】
実施例15：インビトロアッセイによるホルミル-COAとの縮合についての基質としてのメチルケトン
この実施例には、精製された酵素を使用したメチルケトンとホルミル-CoAの縮合の実行が示される。CoAトランスフェラーゼCaAbfTにより触媒されるホルミル-CoA作製およびHACS JGI15により触媒される縮合は、上述の例と同一である(図38A)。メチルケトンは、文献に示される脂肪酸合成およびβ酸化経路により作製され得る(Goh E-B, et al., Appl Environ Microbiol 78:70-80(2012)；Nies SC, et al., Metab Eng 62:84-94(2020))。
この実施例には、精製された酵素を使用したメチルケトンとホルミル-CoAの縮合の実行が示される。CoAトランスフェラーゼCaAbfTにより触媒されるホルミル-CoA作製およびHACS JGI15により触媒される縮合は、上述の例と同一である(図38A)。メチルケトンは、文献に示される脂肪酸合成およびβ酸化経路により作製され得る(Goh E-B, et al., Appl Environ Microbiol 78:70-80(2012)；Nies SC, et al., Metab Eng 62:84-94(2020))。
【0141】
酵素CoAトランスフェラーゼCaAbfTおよびHACS JGI15を、上述のように過剰発現して精製した。メチルケトンおよびホルミル-CoAの縮合についてのインビトロの精製された酵素反応は、100mM KPi pH6.9、10mM MgCl2、0.15mM TPP、2mMアセチル-CoA、1μM JGI15、2μM CaAbfT、20mM蟻酸塩および100mMの試験されたメチルケトンで構成された。そうではないと特定されない限り、反応は30℃で24時間インキュベートした。
【0142】
この分析について、アシル-CoAを含む試料は最初に、反応体積の1/20の10M NaOH溶液で処理され、これは反応を終結するために添加された。加水分解の30分後、反応体積の1/20の10N H2SO4を添加して、酸抽出の効率を向上した。90秒間激しくボルテックスにかけることにより、得られた試料を4mL酢酸エチルに抽出した。有機相を分離して、窒素流下で乾燥まで蒸発させた。残渣を、50μLピリジンおよび50μL N,O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(BSTFA)に溶解して、60℃で15分間インキュベートした。化合物同定および分析は、5977B Inert Plus Mass Selective Detector Turbo EI Bundle (同定のため)およびAgilent HP-5-msキャピラリーカラム(0.25mm内径、0.25μmフィルム厚さ、30m長さ)を備えたAgilent 7890B Series Custom Gas Chromatographyシステムを使用して、GC-MSにより行った。試料は、1.5mL/分の流速で担体気体としてヘリウムおよび以下の温度プロフィール：開始90℃で3分；15℃/分の傾斜で170℃まで；20℃/分の傾斜で300℃までおよび8分間保持を使用して、GC (20:1の分離比を有する1μL注入)により分析した。注入器および検出器の温度はそれぞれ250℃および350℃であった。
【0143】
縮合について、限定されないが、アセトン、メチルエチルケトン(Cn-ケトン、n>3、例としてブタノン、ペンタノンおよびヘプタノン)、ヒドロキシル化ケトン(ヒドロキシアセトン)および他の官能基化ケトン(アセチルアセトン、分岐鎖ケトン、メチルグリオキサール)などのメチルケトンを使用し得る。JGI15は、図38Bに示されるように試験されるケトンの縮合を触媒し得、これは他の同定されたHACSが他のケトンとホルミル-CoAを縮合して、2-ヒドロキシ-2メチル酸および誘導体を作製し得ることを示す(図39)。縮合について、限定されないが、アセトン、メチルエチルケトン(Cn-ケトン、n>3、例としてブタノン、ペンタノンおよびヘプタノン)、ヒドロキシル化ケトン(ヒドロキシアセトン)および他の官能基化ケトン(アセチルアセトン、分岐鎖ケトン、メチルグリオキサール)などのメチルケトンが使用され得る(図40～47)。
【0144】
実施例16： ACRバリアントの同定、合成およびスクリーニング
この実施例には、ホルムアルデヒド酸化(ホルムアルデヒドからホルミル-CoA)反応を特異的にアシル化するためのアシル-CoAレダクターゼ(ACR)バリアントの同定、合成およびスクリーニングが示される。RuHACLと連結されたグリコール酸塩生産性により測定される公知のACRの最初のスクリーニングから(図48A)、本発明者らは、リステリア・モノサイトゲネス由来のアシル-CoAレダクターゼ(LmACR)を最も活性であると同定し(図48B)、配列類似性を有する新規の酵素を同定するための開始参照としてこれを選択した。
この実施例には、ホルムアルデヒド酸化(ホルムアルデヒドからホルミル-CoA)反応を特異的にアシル化するためのアシル-CoAレダクターゼ(ACR)バリアントの同定、合成およびスクリーニングが示される。RuHACLと連結されたグリコール酸塩生産性により測定される公知のACRの最初のスクリーニングから(図48A)、本発明者らは、リステリア・モノサイトゲネス由来のアシル-CoAレダクターゼ(LmACR)を最も活性であると同定し(図48B)、配列類似性を有する新規の酵素を同定するための開始参照としてこれを選択した。
【0145】
実施例1に記載される方法(図19)を使用して、44の新規のACRバリアント(JGIR1～44)を同定し、40の最終構築物をJoint Genome Instituteと共同して合成する(図49A、表9)。
【0146】
表9. 参照酵素としてLmACRを使用して、配列類似性を有する遺伝子クラスターからの代表的な遺伝子を選択することにより同定したアシル-CoAレダクターゼ(ACR)バリアント(JGIR)のリスト。
【表10-1】
【表10-2】
【0147】
全体的な反応スキームの複雑さを低減するために、HACSの存在なしで、実施例2に記載されるものと同一の静止細胞形式において、ACRバリアントを試験する(図49B)。結果的に、インビボでACRバリアントにより触媒されるホルミル-CoAへのホルムアルデヒド還元は、ハイスループットNASH比色定量アッセイ(Nash, Biochem J. 55(3):416-421 (1953))を使用して測定した。細胞密度当たりのホルムアルデヒド消費(OD600)を計算し、参照としてのLmACR活性と比較した(図49C)。低ホルムアルデヒド(0.5mM)および高ホルムアルデヒド(3mM)の両方下で10～20%向上したホルムアルデヒド消費活性を示す3つのバリアント(JGIR2、5および14)がある。JGIR10は、LmACRと比較して、高ホルムアルデヒド下で活性の有意な向上(40%)を示すが、低ホルムアルデヒドで低減した活性を示し、おそらくより高いkcatであるがより高いKmも示す。LmACRと同等の活性を有するいくつかの他のバリアントがあり、これは他の条件でさらに調べる価値がある。
【0148】
実施例17：蟻酸塩活性化酵素(ACTおよびACK-PTA)バリアントの同定、合成およびスクリーニング
この実施例には、具体的に蟻酸塩活性化(蟻酸塩からホルミル-CoA)反応のためのアシル-CoAトランスフェラーゼ(ACT)バリアントならびにアシル-CoAキナーゼ(ACK)およびホスホアシルトランスフェラーゼ(PTA)バリアントの同定、合成およびスクリーニングが示される(図50A)。JGI15と連結されるグリコール酸塩生産性により測定される公知のACTおよびACK-PTAの最初のスクリーニングから(図50B)、本発明者らは、ACTバリアントから最も活性であるクロストリジウム・アミノブチリクム由来のアシル-CoAトランスフェラーゼ(CaAbfT)ならびにACK-PTAバリアントから最も活性であるクロストリジウム・シリンドロスポラム(Clostridium cylindrosporum)由来のアシル-CoAキナーゼおよびホスホアシルトランスフェラーゼ組合せ(CcAck-Pta)を同定し(図50B)、配列類似性を有する新規の酵素を同定するための開始参照としてこれらを選択した。
この実施例には、具体的に蟻酸塩活性化(蟻酸塩からホルミル-CoA)反応のためのアシル-CoAトランスフェラーゼ(ACT)バリアントならびにアシル-CoAキナーゼ(ACK)およびホスホアシルトランスフェラーゼ(PTA)バリアントの同定、合成およびスクリーニングが示される(図50A)。JGI15と連結されるグリコール酸塩生産性により測定される公知のACTおよびACK-PTAの最初のスクリーニングから(図50B)、本発明者らは、ACTバリアントから最も活性であるクロストリジウム・アミノブチリクム由来のアシル-CoAトランスフェラーゼ(CaAbfT)ならびにACK-PTAバリアントから最も活性であるクロストリジウム・シリンドロスポラム(Clostridium cylindrosporum)由来のアシル-CoAキナーゼおよびホスホアシルトランスフェラーゼ組合せ(CcAck-Pta)を同定し(図50B)、配列類似性を有する新規の酵素を同定するための開始参照としてこれらを選択した。
【0149】
実施例1に記載される方法(図19)を使用して、62の新規のACTバリアント(JGIT1～62)および38の新規のACK-PTAバリアントを同定し、Joint Genome Instituteと共同して合成する(図51AB、表10)。
【0150】
表10. 参照酵素としてCaAbfTおよびOfFrcを使用して、配列類似性を有する遺伝子クラスターから代表的な遺伝子を選択することにより同定されたアシル-CoAトランスフェラーゼ(ACT)バリアント(JGIT)のリスト。
【表11-1】
【表11-2】
【表11-3】
【0151】
HACSとしてJGI20およびCaAbfTの代わりに異なる蟻酸塩活性化酵素バリアントを用いて、実施例3(経路2)に記載されるものと同一の静止細胞形式で、ACTおよびACK-PTAバリアントを試験する(図52A)。2.5mMホルムアルデヒドおよび20mM蟻酸塩を炭素源とし添加して、バリアントのグリコール酸塩活性を測定した。結果は、2つのACTバリアント(JGIRT45および51)が同等または向上したCoAトランスフェラーゼ活性を示し、複数のACK-PTAバリアントが、CcAck-Ptaから観察されなかった顕著なホルミル-CoA作製活性を示すことを示す(図52B)。これは、この酵素の高いKmを示す顕著なグリコール酸塩生産性を示すために、CcAck-Ptaが高い蟻酸塩濃度(50mM)を必要とするという、本発明者らの以前の観察と一致する(図52B)。いくつかのACK-PTAバリアント、例えばJGIK1、18および31は、高性能ACTバリアントと同等の活性を示し、これは比較的低い蟻酸塩濃度下でもホルミル-CoA作製のためのより多様な経路を提供し得た(図52B)。
【0152】
実施例18：向上した触媒効率を有する酵素を遺伝子工学で作り変えてスクリーニングするための戦略
この実施例には、所望の基質(1つまたは複数)に対する向上した活性および選択性のためにHACS、ACR、ACTおよびACK-PTA酵素をさらに遺伝子工学で作り変えるための有力な戦略が示される。実施例5および6に記載されるアプローチは、第2ラウンドHACSバリアントだけでなく、他のACR、ACTおよびACK-PTAバリアントについての他のバリアントにおいても適用され得る。相同性誘導アライメントに従うAlphaFoldによりモデル化される構造は、実施例5に示される活性部位残基の同定を可能にする。次いでこれらの重要な残基は、飽和突然変異誘発による方向づけられた進化のために標的化され得る。同時および反復突然変異誘発の両方は、方向づけられた進化のために考慮され得る。代替的に、高い発現、活性または基質特異性を有する複数のバリアントのDNAシャッフリングは、より高い触媒効率を有する候補を同定するためにシャッフルされ得る。エラーを起こしやすいPCRによる候補遺伝子のランダム突然変異誘発も選択肢である。
この実施例には、所望の基質(1つまたは複数)に対する向上した活性および選択性のためにHACS、ACR、ACTおよびACK-PTA酵素をさらに遺伝子工学で作り変えるための有力な戦略が示される。実施例5および6に記載されるアプローチは、第2ラウンドHACSバリアントだけでなく、他のACR、ACTおよびACK-PTAバリアントについての他のバリアントにおいても適用され得る。相同性誘導アライメントに従うAlphaFoldによりモデル化される構造は、実施例5に示される活性部位残基の同定を可能にする。次いでこれらの重要な残基は、飽和突然変異誘発による方向づけられた進化のために標的化され得る。同時および反復突然変異誘発の両方は、方向づけられた進化のために考慮され得る。代替的に、高い発現、活性または基質特異性を有する複数のバリアントのDNAシャッフリングは、より高い触媒効率を有する候補を同定するためにシャッフルされ得る。エラーを起こしやすいPCRによる候補遺伝子のランダム突然変異誘発も選択肢である。
【0153】
スクリーニング方法の処理量を増加するために、選択に基づくスクリーニング方が使用され得る。ホルムアルデヒド酸化活性に対するACRのスクリーニングのために、本発明者らは、ホルムアルデヒドの毒性を強化し得る。ホルムアルデヒド解毒経路(frmA)が欠失した大腸菌は、ミリモーラー以下の濃度のホルムアルデヒド下で生存できない。高い触媒効率(kcat/Km)を有するACRを有する細胞は、ホルムアルデヒドを、実質的に毒性の低いホルミル-CoAに迅速に変換し得、細胞維持および増殖のための他の栄養素の存在下での生存を可能にする。
【0154】
本発明者らは、グリシン独立栄養株を介した、グリコール酸塩産生のための選択に基づくスクリーニングプラットフォームも開発した。選択プラットフォームのための宿主として、本発明者らは、グリシン産生および利用についてのノックアウト(ΔaceA Δkbl ΔltaE ΔglyA)を有するMG1655(DE3)に基づいて、大腸菌のグリシン独立栄養株を遺伝子工学で作り変え、この株をグリシン補充のみで増殖させた(図53A)。グリコール酸塩は最初に、大腸菌glcD、次いでグリシンへのグリオキシル酸塩還元を触媒する異種アラニンデヒドロゲナーゼの無差別の活性により触媒されて、グリオキシル酸塩に酸化され得る(図53A)。マイコバクテリウム・ツベルクロス(Mycobacterium tuberculos)および枯草菌由来のアラニンデヒドロゲナーゼは、グリオキシル酸塩を用いてグリシンを生じる活性を有することが示される(J. Bacteriol. 194:1045-1054, 2012；Biochemistry 20:5650-5655, 1981)。
【0155】
遺伝子欠失について、Appl. Environ. Microbiol. 81:2506-2514, 2015)において開発された方法に基づいてCRISPRを使用する。第1に、宿主株を、プラスミドpCas、Cas9およびλ-redリコンビナーゼの発現のためのベクターで形質転換する。得られた株を、λ-redリコンビナーゼ発現の誘導のためにL-アラビノースと共に30℃下で増殖させ、ODが約0.6に達する場合に、コンピテント細胞を調製して、標的遺伝子の挿入の座および鋳型を標的化するsgRNAおよびN20スペーサーを発現するpTargetF (AddGene 62226)で形質転換する。鋳型は、Phusionポリメラーゼを用いたオーバーラップPCRにより構築されるかまたはGenScript (Piscataway, NJ)により合成される、挿入座の上流および下流と相同な約500bp配列を有する欠失した遺伝子である。pTargetFプラスミドのN20スペーサーを交換するための方法は、Phusionポリメラーゼを使用するプライマーの5'末端で吊り下がる改変されたN20スペーサーを用いた逆PCR、次いでT4 DNAリガーゼおよびT4ポリヌクレオチドキナーゼ(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)を使用する自己ライゲーションである。スペクチノマイシンおよびカナマイシン(または他の適切な抗生物質)を補充された固形培地(LB+寒天)上、30℃下で増殖する形質転換体を単離して、PCRにより染色体遺伝子挿入物についてスクリーニングする。Phusionポリメラーゼを使用するPCRによりゲノムDNAから増幅される遺伝子挿入物の配列を、DNA配列決定によりさらに確認する。次いで、pTargetFはIPTG誘導により回復され得、pCasは37～42℃などのより高温での増殖により回復され得る。
【0156】
得られたグリシン独立栄養株を、結核菌(MtAld)または枯草菌(BsAld)由来のアラニンデヒドロゲナーゼを構成的に発現するベクターで形質転換した。株を最小培地(M9)中、5g/Lグルコースと共にインキュベーションする場合、それらはグリシン補充なしでは増殖できず、グリシン独立栄養性を示した。2つの候補のうち、BsAldを有する株は、グリシン補充の代わりにグリコール酸塩により増殖を開始し(図28B)、グリコール酸塩が、天然のglcDおよび異種的に発現されたBsAld遺伝子により成功裡にグリシンに変換されることを示した。これは、50mg/Lグリコール酸塩の最小の補充のみで増殖が見られるのに十分であったことも示し、C1化合物からのグリコール酸塩産生のためのHACS、ACR、ACTおよびACK-PTAバリアントの選択に基づくスクリーニングのための適切なプラットフォームを示す。
【0157】
本明細書に記載される特定の実施例および態様についての配列情報は以下のとおりである：
【表12-1】
【表12-2】
【表12-3】
【表12-4】
【表12-5】
【表12-6】
【表12-7】
【表12-8】
【表12-9】
【表12-10】
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図8-1】
【図8-2】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20-1】
【図20-2】
【図21-1】
【図21-2】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25-1】
【図25-2】
【図26-1】
【図26-2】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【図46】
【図47】
【図48】
【図49-1】
【図49-2】
【図50】
【図51】
【図52】
【図53】
【配列表】
【国際調査報告】