特表 2024-534047 膵臓ベータ細胞の特定のバイオマーカーに対する細胞表面抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-18

(54)【発明の名称】膵臓ベータ細胞の特定のバイオマーカーに対する細胞表面抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240910BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240910BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240910BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240910BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240910BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240910BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240910BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240910BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 51/10 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240910BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240910BHJP

   G01T 1/161 20060101ALI20240910BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240910BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C12N15/13

A61K51/10 200

A61K39/395 D

A61K39/395 C

A61K39/395 L

A61K39/395 R

A61P3/10

A61K39/395 N

A61K48/00

G01T1/161 D

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024509132

(86)(22)【出願日】2022-08-18

(85)【翻訳文提出日】2024-04-01

(86)【国際出願番号】 US2022075156

(87)【国際公開番号】W WO2023023607

(87)【国際公開日】2023-02-23

(31)【優先権主張番号】63/235,237

(32)【優先日】2021-08-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/388,005

(32)【優先日】2022-07-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＷＩＮＤＯＷＳ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】501335771

【氏名又は名称】ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ

(71)【出願人】

【識別番号】308032460

【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ コロラド，ア ボディー コーポレイト

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＯＬＯＲＡＤＯ，ａ ｂｏｄｙ ｃｏｒｐｏｒａｔｅ

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(74)【代理人】

【識別番号】230118913

【弁護士】

【氏名又は名称】杉村 光嗣

(74)【代理人】

【識別番号】100230891

【弁理士】

【氏名又は名称】里見 紗弥子

(72)【発明者】

【氏名】ダー フー

(72)【発明者】

【氏名】リーピン ユー

(72)【発明者】

【氏名】チェン グオ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4C188

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA92Y

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA13

4C084MA66

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZC351

4C084ZC352

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085BB31

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB43

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE03

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG06

4C085HH03

4C085KA03

4C085KA04

4C085KA26

4C085KA28

4C085KA29

4C085KB02

4C085KB07

4C085KB11

4C085KB82

4C085LL05

4C188EE02

4C188FF04

4C188FF07

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA71

4H045BA72

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA54

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明は、膵臓亜鉛輸送体であるＺｎＴ８に対する抗体の使用を対象とした方法および組成物を提供する。特定の実施形態では、抗ＺｎＴ８抗体は、ＺｎＴ８の膜貫通型ドメインに特異的に結合する。より具体的な実施形態では、抗ＺｎＴ８抗体は、膜貫通型ドメインの細胞外表面に特異的である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

亜鉛トランスポーター－８（ＺｎＴ８）の膜貫通型ドメインの３つの細胞外ループに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

前記ＺｎＴ８の３つの細胞外ループは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のアミノ酸９５～９９、１６９～１７５、および２４２～２４５を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（ａ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～５を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３と、
（ｂ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１０を含む軽鎖ＣＤＲ１、２および３と、
を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（ａ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～５を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３と、
（ｂ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１０を含む軽鎖ＣＤＲ１、２および３、と、
を含み、
前記重鎖ＣＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～５の１つ以上の内に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含み、および／または軽鎖ＣＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１０の１つ以上の内に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む、
請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列と、
を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

前記重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、前記軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項7】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域配列と、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を含む軽鎖可変領域配列と、
を含む、請求項５に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項8】

前記フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ^１－ＳＨ、Ｆｖ、ダイアボディ、直鎖抗体、または単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項9】

前記重鎖定常領域は、免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）アイソタイプである、請求項１から８のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項10】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１から９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項11】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、治療剤に接合されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項12】

前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、造影剤に接合されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項13】

治療有効量の請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。

【請求項14】

請求項１から１０のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸分子。

【請求項15】

請求項１４に記載の核酸を含むベクター。

【請求項16】

請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項17】

ＺｎＴ８の膜貫通型ドメインの３つの細胞外ループに特異的に接合する抗体薬物複合体を作製する方法であって、
（ａ）抗体の産生に適した条件下で請求項１６に記載の宿主細胞を培養するステップと、
（ｂ）抗体を治療剤に結合させるステップと、
を含む、ＺｎＴ８の膜貫通型ドメインの３つの細胞外ループに特異的に接合する抗体薬物複合体を作製する方法。

【請求項18】

ＺｎＴ８の膜貫通型ドメインの３つの細胞外ループに特異的に接合する抗体造影剤複合体を生成する方法であって、
（ａ）抗体の産生に適した条件下で請求項１６に記載の宿主細胞を培養するステップと、
（ｂ）抗体を造影剤に接合させるステップと、
を含む、ＺｎＴ８の膜貫通型ドメインの３つの細胞外ループに特異的に結合する抗体造影剤複合体を生成する方法。

【請求項19】

請求項１から１１に記載の抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項１３に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象におけるＺｎＴ８に関連する疾患または症状を治療するための方法。

【請求項20】

前記疾患または症状は、１型または２型糖尿病を含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

請求項１２に記載の抗体またはその抗原接合フラグメントを対象に投与すること、および抗体またはその抗原結合フラグメントに結合した造影剤を検出することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏで膵臓ベータ細胞を検出する方法。

【請求項22】

検出ステップは、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）／ＣＴイメージング、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、または近赤外（ＮＩＲ）光学イメージングを含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記抗体または抗原結合フラグメントは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を含む軽鎖可変領域配列と、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９内に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含み、および（ｂ）軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７内に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記造影剤は、放射性金属である、請求項２１に記載の方法。

【請求項26】

前記造影剤は、放射性金属であり、検出ステップは、ＰＥＴを含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項27】

前記放射性金属は、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６８Ｇａ、^６０Ｇａ、^８９Ｚｒ、^８６Ｙ、および^９４ｍＴｃからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記造影剤は、放射性金属であり、検出ステップは、ＳＰＥＣＴを含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項29】

前記放射性金属は、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、^９９ｍＴｃ、および^１７７Ｌｕからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の重鎖可変領域配列、および（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の軽鎖可変領域配列を含む、ＺｎＴ８の膜貫通型ドメインの３つの細胞外ループに結合する（ｓｃＦｖ）またはその抗原結合フラグメントを含む単鎖可変フラグメント。

【請求項31】

前記重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９内に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含み、（ｂ）軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７内に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む、請求項３０に記載のｓｃＦｖ。

【請求項32】

前記ｓｃＦｖは、造影剤に接合している、請求項３０に記載のｓｃＦｖ。

【請求項33】

造影剤は、放射性金属である、請求項３１に記載のｓｃＦｖ。

【請求項34】

放射性金属は、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６８Ｇａ、^６０Ｇａ、^８９Ｚｒ、^８６Ｙ、^９４ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、^９９ｍＴｃ、および^１７７Ｌｕからなる群から選択される、請求項３２に記載のｓｃＦｖ。

【請求項35】

（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖および（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１～２４の１つを含む重鎖を含む抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項36】

（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖および（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７～３０の１つを含む重鎖を含む抗体またはその抗原結合フラグメント。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年８月２０日に出願された米国仮特許出願第６３／２３５，２３７号、および２０２２年７月１１日に出願された米国仮特許出願第６３／３８８，００５号に対する優先権を主張し、それらの全体を参照によって本明細書に援用する。

【0002】

（配列表）
本出願には、４４８０７０４４０ＷＯ１．ｘｍｌという名前のＸＭＬファイルとして電子的に提出された配列表が含まれる。２０２２年８月１７日に作成されたＸＭＬファイルのサイズは５４，４７２バイトである。ＸＭＬファイル内の内容を、参照によってその全体を本明細書に援用する。

【0003】

（技術分野）
本明細書では、免疫学および糖尿病の分野に関連する材料および方法を提供する。より具体的には、本明細書では膵臓亜鉛輸送体、ＺｎＴ８に対する抗体の使用を対象とした方法および組成物を提供する。

【0004】

（連邦政府の援助を受けた研究または開発）
本発明は、米国立衛生研究所によって授与された助成金ＤＫ１２５７４６およびＤＫ１２３４３５に基づく政府支援により行われた。政府は発明に関して一定の権利を有する。

【背景技術】

【0005】

（背景技術）
膵臓β細胞は専門的な分泌細胞として、人体内で血糖値を制御するためのインスリンの唯一の供給源となる。β細胞はグルコース変動に応答してインスリン産生の大きな動的能力を進化させてきたが、１型糖尿病におけるβ細胞自己免疫脆弱性の根底にある膵島炎症や代謝ストレス［１］、および２型糖尿病におけるβ細胞不全および消失に対処する能力［２］が不十分である。したがって、原発性β細胞欠陥は、両方の形態の糖尿病に対する感受性の中心にある。糖尿病の病因をより深く理解し、治療介入を評価するには、疾患および治療条件下でのβ細胞の運命を正確にモニタリングする必要がある。しかし、インスリン／Ｃ－ペプチドレベル、空腹時血糖値、経口耐糖能の測定などの日常的な検査では、糖尿病の前臨床段階および介入療法を受けた後におけるインスリン産生β細胞の量と機能に関する適切な情報が得られない。高い細胞表面密度でインスリン分泌生物学に直接関連する細胞表面バイオマーカーは、β細胞機能および薬物送達の非侵襲的モニタリングに適用可能である細胞表面モノクローナル抗体（ｍＡｂ）開発の貴重な標的である。

【発明の概要】

【0006】

膵島におけるインスリン産生β細胞の機能不全と消失とは糖尿病の主な原因であるが、β細胞の量と機能のｉｎ ｖｉｖｏモニタリングや標的薬物送達の方法はまだ開発されていない。β細胞におけるインスリンの産生と貯蔵とは、細胞の亜鉛濃縮と機能的に結びついており、これは膵島特異的亜鉛トランスポーター－８（ＺｎＴ８）の過剰発現によって制御されている。本明細書では、ＺｎＴ８の細胞外エピトープに対してナノモル以下の結合親和性および立体構造特異性を有する自己反応性抗体（ｍＡｂ４３）について説明する。グルコース刺激によって細胞外細胞表面上のＺｎＴ８－ｍＡｂ４３の結合が増加し、ｍＡｂ４３を使用して膵臓全体の単細胞懸濁液からβ細胞を単離し、全身投与後のマウスにおける蛍光タグの膵島ホーミングを誘導することが可能になった。いくつかの実施形態では、自己反応性抗体は、イメージングペイロードおよび抗体薬物接合体のｉｎ ｖｉｖｏ送達のためにβ細胞表面ＺｎＴ８を標的とし得る。

【0007】

本明細書では、亜鉛トランスポーター－８（ＺｎＴ８）の膜貫通型ドメインの３つの細胞外ループに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、ＺｎＴ８の３つの細胞外ループは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のアミノ酸９５～９９、１６９～１７５、および２４２～２４５を含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、（ａ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～５を含む重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３と、（ｂ）それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１０を含む軽鎖ＣＤＲ１、２および３以下と、を含む。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３～５の１つ以上の内の少なくとも１つの保存的アミノ酸置換、および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８～１０の１つ以上の内の少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列と、を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し、軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を含む軽鎖可変領域配列と、を含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ^１－ＳＨ、Ｆｖ、ダイアボディ、直鎖抗体、または単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）アイソタイプのものである。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、治療剤に接合される。いくつかの実施形態では、抗体またはその抗原結合フラグメントは、造影剤に接合される。

【0010】

また、本明細書では、治療有効量の本明細書に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントのいずれかを含む医薬組成物をも提供する。

【0011】

また、本明細書では、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントのいずれかをコードする核酸分子をも提供する。本明細書では、本明細書に記載の核酸のいずれかを含むベクターをも提供する。また、本明細書に記載されるベクターのいずれかを含む宿主細胞をも提供する。

【0012】

また、本明細書では、ＺｎＴ８の膜貫通型ドメインの３つの細胞外ループに特異的に結合する抗体薬物接合体を作製するための方法を提供し、本方法は、（ａ）本明細書に記載の宿主細胞のいずれかを抗体の産生に適した条件下で培養することと、（ｂ）抗体を治療剤に接合させることと、を含む。

【0013】

また、本明細書では、ＺｎＴ８の膜貫通型ドメインの３つの細胞外ループに特異的に結合する抗体造影剤複合体を産生する方法をも提供し、この方法は、（ａ）抗体の産生に適した条件下で本明細書に記載の宿主細胞のいずれかを培養することと、（ｂ）抗体を造影剤に接合させることと、を含む。

【0014】

また、本明細書では、対象におけるＺｎＴ８に関連する疾患または状態を治療するための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントのいずれかを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、疾患または状態は、１型または２型糖尿病を含む。

【0015】

また、本明細書では、ｉｎ ｖｉｖｏで膵臓ベータ細胞を検出するための方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の抗体または抗原結合フラグメントのいずれかを対象に投与すること、および抗体またはその抗原結合フラグメントに接合した造影剤を検出することを含む。いくつかの実施形態では、検出ステップは、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）／ＣＴイメージング、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、または近赤外（ＮＩＲ）光学イメージングを含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合フラグメントは、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９を含む重鎖可変領域配列と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７を含む軽鎖可変領域配列と、を含む、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９内に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含み、（ｂ）軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７内に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、造影剤は放射性金属である。いくつかの実施形態では、造影剤は放射性金属であり、検出ステップはＰＥＴを含む。いくつかの実施形態では、放射性金属は、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６８Ｇａ、^６０Ｇａ、^８９Ｚｒ、^８６Ｙ、および^９４ｍＴｃからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、造影剤は放射性金属であり、検出ステップはＳＰＥＣＴを含む。いくつかの実施形態では、放射性金属は、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、^９９ｍＴｃ、および^１７７Ｌｕからなる群から選択される。

【0018】

また、本明細書では、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の重鎖可変領域配列を含み、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の軽鎖可変領域配列を含む、ＺｎＴ８の膜貫通型ドメインの３つの細胞外ループに結合する（ｓｃＦｖ）またはその抗原結合フラグメントを含む単鎖可変フラグメントをも提供する。いくつかの実施形態では、重鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９内に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含み、（ｂ）軽鎖可変領域配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７内に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む。

【0019】

いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは造影剤に接合される。いくつかの実施形態では、造影剤は放射性金属である。いくつかの実施形態では、放射性金属は、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^６８Ｇａ、^６０Ｇａ、^８９Ｚｒ、^８６Ｙ、^９４ｍＴｃ、^１１１Ｉｎ、^６７Ｇａ、^９９ｍＴｃ、および^１７７Ｌｕからなる群から選択される。

【0020】

また、本明細書では、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１～２４の１つを含む重鎖と、を含む抗体またはその抗原結合フラグメントをも提供する。また、本明細書では、（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０を含む軽鎖と、（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７～３０の１つを含む重鎖と、を含む抗体またはその抗原結合フラグメントをも提供する。

【0021】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施に使用することができるが、適切な方法および材料を下記に記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、およびその他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾が生じた場合には、定義を含む本仕様が優先される。さらに、材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定することを意図したものではない。

【0022】

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および下記の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１Ａは、抗ＴＭＤ抗体の誘導および生化学的特徴を示す。亜鉛イオンが結合したＺｎＴ８ホモ二量体上の３つの短いループ（ボールアンドスティック、右）によって形成されるＺｎＴ８の膜と同一面の細胞外表面（空間充填表示、左）を示す。ＴＭＤは脂質二重層に埋め込まれているが、ＣＴＤは細胞質内に拡張されている。図１Ｂは、抗ＴＭＤ抗体の誘導および生化学的特徴を示す。３つの細胞外ループ（ＥＣＬ）の配列アラインメントを示す。図１Ｃは、抗ＴＭＤ抗体の誘導および生化学的特徴を示す。示されるように、プロテオリポソームまたはリポソームを注射されたＺｎＴ８－ＫＯマウスからのマウス血清の、ｆｌＺｎＴ８またはＣＴＤのいずれかに対するＥＬＩＳＡ滴定を示す。図１Ｄは、抗ＴＭＤ抗体の誘導および生化学的特徴を示す。ＮＯＤ雌マウスの使用を想定したことを除き、図１Ｃ中と同じものを示す。エラーバーは、４匹のＺｎＴ８－ＫＯまたは４匹のＮＯＤマウスからの標準誤差、＊ｐ＜０．０１（ｎ＝４）である。図１Ｅは、抗ＴＭＤ抗体の誘導および生化学的特徴を示す。示されるように、界面活性剤で可溶化されたｆｌＺｎＴ８に対するｍＡｂ４３およびｍＡｂ２０の滴定を示す。図１Ｆは、抗ＴＭＤ抗体の誘導および生化学的特徴を示す。ＣＴＤに対するｍＡｂ４３およびｍＡｂ２０の力価を示す。図１Ｇは、抗ＴＭＤ抗体の誘導および生化学的特徴を示す。ＺｎＴ８プロテオリポソームに対するｍＡｂ４３およびｍＡｂ２０の滴定を示す。プロテオリポソーム内のＺｎＴ８は、示されているようにＴＭＤまたはＣＴＤのいずれかを抗体結合にさらす混合膜貫通配向を採用していることに留意されたい。実線は、ｒ２＞０．９８の双曲線関数への結合曲線の最小二乗当てはめである。

【図2】図２Ａは、ＺｎＴ８および細胞表面マーカーへの抗体結合を示す。示されるように、ｍＡｂ４３またはｍＡｂ２０を用いた生Ｅｎｄｏｃ－βＨ１細胞のＩＦ標識を示す。細胞をＣＤ７１抗体およびＤＡＰＩで対比染色した。図２Ｂは、ＺｎＴ８および細胞表面マーカーへの抗体結合を示す。ＰＦＡ固定および界面活性剤透過処理後のＥｎｄｏｃ－βＨ１細胞の平行したＩＦ標識を示す。図２Ｃは、ＺｎＴ８および細胞表面マーカーへの抗体結合を示す。示したように、ｍＡｂ４３、Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ抗体およびＤＡＰＩを用いた野生型またはＺｎＴ８－ＫＯ ＩＮＳ－１Ｅ生細胞のＩＦ染色を示す。図２Ｄは、ＺｎＴ８および細胞表面マーカーへの抗体結合を示す。ＰＦＡ固定および界面活性剤透過後の野生型細胞またはＺｎＴ８－ＫＯ ＩＮＳ－１Ｅ細胞の平行したＩＦ標識を示す。図２Ｅは、ＺｎＴ８および細胞表面マーカーへの抗体結合を示す。示されるように、ＺｎＴ８ｅｃＡ陽性ヒト血清、マウスｍＡｂ４３、または血清－ｍＡｂ４３の組み合わせを用いた生Ｅｎｄｏｃ－ｂＨ１細胞のＩＦ標識を示す。図２Ｆは、ＺｎＴ８および細胞表面マーカーへの抗体結合を示す。図２Ａ～図２Ｂにおける生Ｅｎｄｏｃ－ｂＨ１細胞のｍＡｂ４３またはｍＡｂ２０免疫標識による細胞表面（Ｓ）および細胞内（Ｉ）の蛍光強度の定量化、または図２Ｃ～２ＤにおけるＷＴ細胞またはＺｎＴ８－ＫＯ ＩＮＳ－１Ｅ細胞のいずれかのｍＡｂ４３免疫標識による細胞表面（Ｓ）および細胞内（Ｉ）の蛍光強度の定量化を示す。蛍光強度は、示されているように、対照群の各ペアにおけるｍＡｂ４３の強度に対して正規化された。白丸は個々のセルのデータポイントである。エラーバーは標準誤差である。図２Ｇは、ＺｎＴ８および細胞表面マーカーへの抗体結合を示す。図２Ｅに記載のＺｎＴ８ｅｃＡ陽性ヒト血清、マウスｍＡｂ４３、または血清／ｍＡｂ４３の組み合わせによる生Ｅｎｄｏｃ－βＨ１細胞の細胞表面ＩＦ標識の定量を示す。分数強度は、示されているように、対照群の各ペアの血清強度とｍＡｂ４３強度の合計に対して正規化された血清またはｍＡｂ４３シグナルである。

【図3】図３Ａは、ＥＣＬへのｍＡｂ４３エピトープのマッピングを示す。示されるように、ＺｎＴ８－ＧＦＰとｍＡｂ４３、ｍＡｂ２０、またはＦＬＡＧ抗体との安定なタンパク質結合複合体のサイジング－ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。破線は、示されているように、遊離または結合したＺｎＴ８－ＧＦＰのピーク位置のアラインメントを示す。図３Ｂは、ＥＣＬへのｍＡｂ４３エピトープのマッピングを示す。示されるように、ＺｎＴ８ＦＬＡＧ－ＧＦＰとｍＡｂ４３、ｍＡｂ２０、またはＦＬＡＧ抗体との安定なタンパク質結合複合体のクロマトグラムを示す。図３Ｃは、ＥＣＬへのｍＡｂ４３エピトープのマッピングを示す。ヒトＥｎｄｏｃ－βＨ１細胞のＳＤＳ変性全溶解物を用いた、ｍＡｂ４３、ｍＡｂ２０および抗ペプチドＺｎＴ８抗体の免疫ブロット分析を示す。矢印は、内因性ＺｎＴ８の２つのスプライス変異体を示す。図３Ｄは、ＥＣＬへのｍＡｂ４３エピトープのマッピングを示す。２つのＺｎＴ８プロトマーのうちの１つに結合したＦａｂ４３分子を示す、ネガティブ染色されたＺｎＴ８－Ｆａｂ４３複合体の電子密度マップの側面図を示す。楕円形の密度は、ＺｎＴ８ホモ二量体と関連する界面活性剤／脂質分子からなる。絵図はそれぞれヒトＺｎＴ８とＦａｂ分子をドッキングさせたものである。破線の矢印は、楕円形の短軸と一致するＺｎＴ８ホモ二量体の二重軸を示す。

【図4】図４Ａは、マウスβ細胞に対するｍＡｂ４３の特異性を示す。陰性対照としてｍＡｂ２０およびＰＢＳを用いた、パラフィン包埋マウス膵臓切片における内在性ＺｎＴ８のｍＡｂ４３免疫標識およびジアミノベンジジン検出を示す。図４Ｂは、マウスβ細胞に対するｍＡｂ４３の特異性を示す。マウスｍＡｂ４３またはマウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照、その後の抗マウスＩｇＧ－ＰＥ、抗インスリン－ＡＰＣ、抗グルカゴン－４８８およびＤＣＶを使用した、単離されたマウス膵島からの酵素的に分散された膵島細胞のＩＦ標識を示す。すべての膵島細胞は、免疫標識前にＰＦＡ固定され、界面活性剤透過処理された。図４Ｃは、マウスβ細胞に対するｍＡｂ４３の特異性を示す。ＤＡＰＩ対比染色を用いた、剖検ヒト膵臓の凍結切片のｍＡｂ４３および抗インスリン共免疫標識を示す。図４Ｄは、マウスβ細胞に対するｍＡｂ４３の特異性を示す。酵素的に分散させた膵臓全体に由来する単一細胞懸濁液の免疫標識および蛍光活性化細胞選別を示す。分散した全膵臓細胞をＤＣＶ、キメラｍＡｂ４３またはｍＡｂ２０で標識し、示されているようにＰＥ接合抗ヒトＩｇＧで検出した。インタクトな細胞（ＤＣＶ陽性）をゲートし、ｍＡｂ４３－ＰＥ陽性（Ｒ１）集団と陰性（Ｒ０）集団とに分類した。破線は、ＤＣＶおよびｍＡｂ４３－ＰＥゲートの閾値を示す。Ｒ１およびＲ０ゲート内の無傷の細胞の合計の割合が示される。データは４つの独立した実験の代表である。図４Ｅは、マウスβ細胞に対するｍＡｂ４３の特異性を示す。示されたｍＡｂ４３標識細胞の異なる集団におけるインスリンおよびグルカゴン発現の共焦点顕微鏡分析を示す。選別された膵臓細胞をマトリゲルでコーティングしたガラス表面上で増殖させ、ＰＦＡで固定し、透過処理した後、ｍＡｂ４３で免疫標識し、続いて示されているように抗インスリンＡＰＣ、抗グルカゴン４８８、および抗ヒトＩｇＧ－ＰＥで免疫標識した。挿入図は、細胞質におけるインスリンとＺｎＴ８のとの共局在を示す、Ｒ１ゲート内の通常のβ細胞の拡大図である。図４Ｆは、マウスβ細胞に対するｍＡｂ４３の特異性を示す。図４Ｅの濃縮膵臓細胞のｍＡｂ４３および抗インスリンＩＦ強度の定量化を示す。ｍＡｂ４３または抗インスリンＩＦ強度は、Ｒ１細胞集団の強度に対して正規化されている。白丸は個々のセルのデータポイントである。エラーバーは標準誤差である。

【図5】図５Ａは、グルコース刺激によるＺｎＴ８－ｍＡｂ４３の取り込みを示す。３７℃でのＥｎｄｏｃ－βＨ１細胞におけるｍＡｂ４３－Ａ６４７の取り込みを示す。生細胞を、示されているように、高グルコース（２０ｍＭ）または基礎グルコース（２ｍＭ）のいずれかの存在下で、ｍＡｂ２０－Ａ６４７またはｍＡｂ４３－Ａ６４７に曝露した。各画像について、左側のパネルはＡ６４７－ＩＦを示し、右側のパネルはＡ６４７、ＣｅｌｌＭａｓｋグリーン、およびＤＡＰＩ信号を統合したものである。すべてのスケールバーは１０μｍである。図５Ｂは、グルコース刺激によるＺｎＴ８－ｍＡｂ４３の取り込みを示す。８℃での細胞表面ｍＡｂ－Ａ６４７結合を示す。図５Ｃは、グルコース刺激によるＺｎＴ８－ｍＡｂ４３の取り込みを示す。示されるように８℃または３７℃で、グルコース刺激（２０／２ｍＭ）の有無にかかわらず、任意の単位（ａ．ｕ．）での総Ａ６４７－ＩＦ強度の画像定量化を示す。白丸は個々のセルのデータポイントである。エラーバーは標準誤差である。

【図6】図６Ａは、マウスにおいて全身投与された抗体の生体内分布を示す。示されるキメラｍＡｂ４３またはｍＡｂ２０の注射後１日目にＣ５７ＢＬ／６マウスから切除された異なる器官のＳＤＳ可溶化組織のウエスタンブロット分析を示す。組織タンパク質を０．５ｍｇ／レーンで搭載し、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）化学発光によって検出した。図６Ｂは、マウスにおいて全身投与された抗体の生体内分布を示す。異なる器官におけるｍＡｂ４３（黒色のバー）またはｍＡｂ２０（灰色のバー）の相対的な組織存在量を示す。ウエスタンブロット強度を、注射後の同じ時点での膵臓ｍＡｂ４３シグナルに対して正規化し、注射後１、３、５、６日目に採取した組織からの４つの独立した測定値の平均をとった。白丸は個々のデータポイントである。エラーバーは標準誤差である。図６Ｃは、マウスにおいて全身投与された抗体の生体内分布を示す。示されるように、膵臓ｍＡｂ４３または腎臓ｍＡｂ２０の時間依存性の減少を示す。ヒトＩｇＧ標準の段階希釈物を同じゲルに搭載して、ｍＡｂ４３およびｍＡｂ２０の強度を校正した。図６Ｄは、マウスにおいて全身投与された抗体の生体内分布を示す。示されるように、注射後の様々な時点での膵臓ｍＡｂ４３および腎臓ｍＡｂ２０の定量を示す。エラーバーは、４つの独立したウエスタンブロット測定からの標準誤差である。図６Ｅは、マウスにおいて全身投与された抗体の生体内分布を示す。示されるように、ＮＯＤ（黒色のバー）またはｄｂ／ｄｂマウス（白色のバー）におけるｍＡｂ４３の相対的な組織取り込みを示す。ウエスタンブロット強度を膵臓ｍＡｂ４３シグナルに対して正規化し、注射の２日後に採取した組織からの４匹のＮＯＤまたは４匹のｄｂ／ｄｂマウスの平均を求めた。白丸は個々のデータポイントである。エラーバーは標準誤差である。図６Ｆは、マウスにおいて全身投与された抗体の生体内分布を示す。示されるように、３つの異なるマウス系統における膵臓ｍＡｂ４３取り込みの比較を示す。膵臓のｍＡｂ４３取り込みレベルは、さまざまな系統の個々のマウスのＦＢＧレベルと相関している。図６Ｇは、マウスにおいて全身投与された抗体の生体内分布を示す。示されるように、異なるマウス染色における平均膵臓ｍＡｂ４３取り込みの定量化を示す。白丸は個々のマウスのウェスタンブロットデータポイントであり、対応するＦＢＧレベルが右パネルに示されている。エラーバーは、示されているように、各マウス群の４匹のマウスからの標準誤差である。

【図7】図７Ａは、平らな膵臓におけるｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔの分布を示し、ｍＳｃａｒｌｅｔのｉｎ ｖｉｖｏ膵島ホーミングを実証している。１５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔ注射を受けたＭＩＰ－ＧＰＦマウスから切除された膵臓のホールマウント画像を示す。ＧＦＰ、ｍＳｃａｒｌｅｔ、および明視野画像が統合され、クローズアップ表示に使用される対象領域（ＲＯＩ）に番号が付けられる。図７Ｂは、平らな膵臓におけるｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔの分布を示し、ｍＳｃａｒｌｅｔのｉｎ ｖｉｖｏ膵島ホーミングを実証している。膵島クラスターにおける分枝細動脈およびＧＦＰおよびｍＳｃａｒｌｅｔの共局在を示す、異なるＲＯＩ（１、２、３）の拡大図を示す。図７Ｃは、平らな膵臓におけるｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔの分布を示し、ｍＳｃａｒｌｅｔのｉｎ ｖｉｖｏ膵島ホーミングを実証している。異なるＲＯＩにおける重複するＧＦＰおよびｍＳｃａｒｌｅｔ蛍光を有する個々の島の拡大図（４、５、６）を示す。図７Ｄは、平らな膵臓におけるｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔの分布を示し、ｍＳｃａｒｌｅｔのｉｎ ｖｉｖｏ膵島ホーミングを実証している。異なるＲＯＩにおける追加の散乱ｍＳｃａｒｌｅｔ蛍光を有する個々の島の拡大図（７、８、９）を示す。図７Ｅは、平らな膵臓におけるｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔの分布を示し、ｍＳｃａｒｌｅｔのｉｎ ｖｉｖｏ膵島ホーミングを実証している。ｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔに曝露された単離されたマウス膵島におけるｍＳｃａｒｌｅｔの取り込みを示す。図７Ｆは、平らな膵臓におけるｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔの分布を示し、ｍＳｃａｒｌｅｔのｉｎ ｖｉｖｏ膵島ホーミングを実証している。ｍＡｂ２０－ｍＳｃａｒｌｅｔに曝露された単離されたマウス膵島におけるｍＳｃａｒｌｅｔの取り込みが存在しないことを示す。代表的な膵島画像は２つの独立した実験から得られた。

【発明を実施するための形態】

【0024】

本発明は、本明細書に記載される特定の方法および構成要素などに限定されず、これらは変更される可能性があることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を単に説明する目的に使用されており、本発明の範囲を限定するものではないことも理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈上明らかに別段の指示がない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数形を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は、１つ以上のタンパク質への言及であり、当業者に既知であるその等価物などを含む。

【0025】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。特定の方法、装置、および材料を記載しているが、本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用し得る。

【0026】

すべての雑誌記事、書籍、マニュアル、公開された特許出願、および発行された特許を含む、本明細書で引用されるすべての刊行物は、参照により本明細書に援用される。さらに、明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語および語句の意味を提供する。これらの定義は実質的に限定することを意図したものではなく、本発明の特定の態様をより明確に理解するために役立つものである。

【0027】

ＺｎＴ８は、ハウスキーピングαチューブリンのタンパク質発現レベルに匹敵するタンパク質発現レベルを有する、β細胞における主要な亜鉛トランスポーターである［３］。活性亜鉛輸送体を生成するこの驚異的な細胞能力は、人体のβ細胞の細胞内亜鉛含有量の中で最も高いものの一つをもたらす。ＺｎＴ８の組織分布は、ほぼ独占的に膵島に限定されている［４，５］。膵島内のＺｎＴ８ｍＲＮＡは、α、β、γ、δ、ε細胞を含むすべての内分泌細胞タイプで検出されたが、ｍＲＮＡレベルは、異なる細胞タイプにおけるＺｎＴ８の対応するタンパク質レベルと大まかに関連しているだけである可能性がある［６，７］。細胞の亜鉛含有量に基づく細胞選別によって、他の島細胞からβ細胞が明確に分離される結果となり［８］、細胞の亜鉛含有量とそれに関連するＺｎＴ８タンパク質レベルがβ細胞に特有のバイオマーカーであることが示唆された。ＺｎＴ８の細胞内分布は、細胞表面膜、インスリン分泌顆粒および小胞体の間で動的平衡状態にあり、ＺｎＴ８は亜鉛隔離トランスポーターとして機能する［３、９、１０］。濃縮された亜鉛イオンは、プロインスリンのプロセシングと亜鉛－インスリン六量体の結晶パッケージングに必要である［９～１３］。結果として、ＺｎＴ８の細胞内分布は、インスリンの処理、貯蔵、分泌と密接に結びついている［１４］。グルコース刺激によるインスリン分泌は、ＺｎＴ８の細胞表面への輸送を促進し［１５］、ＺｎＴ８を１型糖尿病患者における自己抗体の主要な細胞表面抗原標的としている［１６］。同様に、表面化されたＺｎＴ８は、ｍＡｂベースの免疫検出の機能的バイオマーカーとして機能する可能性があり得る。

【0028】

ＺｎＴ８の細胞外ループに由来する直鎖ペプチドに対する初期のＺｎＴ８ ｍＡｂは、中程度の結合親和性（１０８ｎＭ）と低い特異性［１７］をもたらした。ｉｎ ｖｉｖｏβ細胞のイメージングおよびターゲティングには、空間配置に配置された複数の細胞外ループに対する絶妙な構造特異性を備えた高親和性 ｍＡｂｓの開発が必要である。ＺｎＴ８は、コンパクト膜貫通型ドメイン（ＴＭＤ）とサイトゾルＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）からなる２モジュール式タンパク質である。ＴＭＤは細胞外ドメインを欠いているが、その細胞外表面は膜と同一面であり、３つの短い細胞外ループ（ＥＣＬ１～３）によって形成されている（図１Ａ）。エピトープの利用可能性が限られていることに加えて、これらのループは、ＥＣＬ３における高度に保存されたＥからＤへの置換を除いて、マウスとヒトのＺｎＴ８の間で準不変であるため、抗原性が低い（図１Ｂ）。本明細書に記載されるように、マウス免疫化戦略は、天然にフォールディングされたＺｎＴ８の細胞外エピトープの免疫原性を増強するために確立され、立体構造特異性を有する細胞外ループに対するｍＡｂ４３を同定し、β細胞精製およびイメージングプローブの標的送達におけるｍＡｂ４３の有用性を実証した。

【0029】

（Ｉ．定義）
「抗体」という用語は、タンパク質（例えば、ＺＮＴ８、そのサブユニット、または受容体複合体）、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはそれらの組み合わせなどの標的を認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して、上記の反応が行われる。通常の抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２本の重（ＨＣ）鎖と２本の軽（ＬＣ）鎖を含む。各重鎖は、「重鎖可変領域」または「重鎖可変ドメイン」（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、ＣＨＩ、ＣＨ２、ＣＨ３の３つのドメインで構成される。各軽鎖は、「軽鎖可変領域」または「軽鎖可変ドメイン」（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＩで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨ領域とＶＬ領域は３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、ＦＲＩ、ＣＤＲＩ、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で配置されている。重鎖および軽鎖の可変領域には、抗原と相互作用する結合ドメインが含まれている。本明細書で使用される「抗体」という用語は、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆａｃｂ、およびＦｖフラグメントなど）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ミニボディ（例えば、ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディ）、少なくとも２つの完全な抗体から生成される二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などの多重特異性抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗体が所望の生物学的活性を示す限り、抗原認識部位を含む他の任意の修飾免疫グロブリン分子を包含する。したがって、「抗体」という用語には、抗体全体およびその任意の抗原結合フラグメントまたは一本鎖が含まれる。抗体は、素のままの場合もあれば、毒素、放射性同位元素、小分子薬物、ポリペプチドなどの他の分子と接合している場合もある。

【0030】

「単離された抗体」という用語は、自然環境の成分から同定され、分離および／または回収された抗体を指す。自然環境の汚染成分は、抗体の診断または治療用途を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、その他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。いくつかの実施形態では、抗体は、（１）例えばＬｏｗｒｙ法によって決定される抗体の９５重量％を超えるまで精製され（９９重量％を含む）、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によって、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を取得するのに十分な程度まで精製され、または（３）クーマシーブルーまたは銀染色を使用した還元または非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均質に精製される。抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のｉｎ ｓｉｔｕ抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離された抗体は少なくとも１つの精製ステップによって調製される。

【0031】

「ヒト化」免疫グロブリンという用語は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（通常はマウスまたはラット）免疫グロブリン由来の１つ以上のＣＤＲを含む免疫グロブリンを指す。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合、それらはヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち少なくとも約８５～９０％、好ましくは約９５％以上同一でなければならない。したがって、おそらくＣＤＲを除いて、ヒト化免疫グロブリンのすべての部分は、天然ヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。例えば、ヒト化抗体は、例えば、キメラ抗体の可変領域全体が非ヒトであるため、上記で定義した通常のキメラ抗体を包含しないであろう。

【0032】

「抗原結合フラグメント」という用語は、無傷の抗体の一部を指し、無傷の抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントによって実行され得ることが当技術分野で知られている。抗原結合抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｃｂ、Ｆｄ、およびＦｖフラグメント、直鎖抗体、一本鎖抗体、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、抗体フラグメントは、無傷の抗体または完全な抗体のタンパク質分解消化によって調製され得る。例えば、抗体フラグメントは、抗体全体をパパイン、ペプシン、プラスミンなどの酵素で処理することにより得られ得る。抗体全体をパパイン消化すると、Ｆ（ａｂ）２またはＦａｂフラグメントが生成される。抗体全体をペプシン消化すると、Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂ’が生成される。抗体全体のプラスミン消化によって、Ｆａｃｂフラグメントが得られる。

【0033】

「Ｆａｂ」という用語は、酵素パパインによる免疫グロブリン（通常、ＩｇＧ）の消化によって得られるものと実質的に等価な抗体フラグメントを指す。Ｆａｂフラグメントの重鎖セグメントはＦｄ部分である。このようなフラグメントは、完全な抗体のフラグメント化によって酵素的または化学的に生成することも、部分抗体配列をコードする遺伝子から組換え生成することもでき、あるいは全体的または部分的に合成的に生成することもできる。「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、ｐＨ４．０～４．５で酵素ペプシンを用いた免疫グロブリン（通常、ＩｇＧ）の消化によって得られるフラグメントと実質的に等価である抗体フラグメントを指す。このようなフラグメントは、完全な抗体のフラグメント化によって酵素的または化学的に生成することも、部分抗体配列をコードする遺伝子から組換え生成することもでき、あるいは全体的または部分的に合成的に生成することもできる。「Ｆｖ」という用語は、非共有結合的相互作用によって結合された１つのＮＨドメインおよび１つのＮドメインからなる抗体フラグメントを指す。

【0034】

「ＺＮＴ８抗体」、「抗ＺＮＴ８抗体」、「抗ＺＮＴ８」、「ＺＮＴ８に結合する抗体」という用語およびその文法的変形は、十分な親和性でＺＮＴ８に特異的に結合することができる抗体を指す。抗体は、ＺＮＴ８を標的とする治療剤または診断試薬として有用である。本明細書に開示される抗ＺＮＴ８抗体の無関係な非ＺＮＴ８タンパク質への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）（分析物としての組換えＺＮＴ８およびリガンドとしての抗体の使用、またはその逆）、または当技術分野で知られている他の結合アッセイなどの、測定された抗ＺＮＴ８抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、ＺＮＴ８に結合する抗体は、１μＭ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、または１ｎＭ未満の解離定数（ＫＤ）を有する。

【0035】

２つのポリペプチド（またはポリヌクレオチド）配列間の「同一性％」という用語は、２つの配列を最適なアラインメントを整列させるために導入しなければならない付加または欠失（すなわち、ギャップ）を考慮した、比較ウィンドウにわたって配列によって共有される同一の一致位置の数を指す。一致する位置とは、標的配列と参照配列の両方に同一のヌクレオチドまたはアミノ酸が存在する任意の位置である。ギャップはヌクレオチドまたはアミノ酸ではないため、ターゲット配列に存在するギャップはカウントされない。同様に、参照配列からのヌクレオチドまたはアミノ酸ではなく、標的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸がカウントされるため、参照配列に存在するギャップはカウントされない。配列同一性のパーセンテージは、両方の配列で同一のアミノ酸残基または核酸塩基が存在する位置の数を決定し、一致する位置の数を求め、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを算出することによって計算される。配列の比較と２つの配列間の配列同一性パーセントの決定は、オンライン使用とダウンロードとの両方で容易に入手可能なソフトウェアを使用して行われ得る。タンパク質配列とヌクレオチド配列の両方のアラインメントに適したソフトウェアプログラムがさまざまなソースから入手可能である。配列同一性パーセントを決定するのに適したプログラムの１つはｂｌ２ｓｅｑであり、これは、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センターＢＬＡＳＴ Ｗｅｂサイトから入手できるＢＬＡＳＴスイートプログラムの一部である。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して２つのシーケンス間の比較を実行する。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列の比較に使用され、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列の比較に使用される。他の適切なプログラムは、例えば、バイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳスイートの一部であるＮｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、またはＭａｔｃｈｅｒであり、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ）から入手可能である。特定の実施形態では、第１のアミノ酸配列の第２の配列のアミノ酸に対する同一性パーセンテージ「Ｘ」は、１００×（Ｙ／Ｚ）として計算され、Ｙは、（目視検査または特定の配列アラインメントプログラムによってアラインメントされた）第１および第２の配列のアラインメントにおいて同一の一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、Ｚは第２の配列内の残基の総数である。第１の配列の長さが第２の配列よりも長い場合、第２の配列に対する第１の配列の同一性パーセントは、第１の配列に対する第２の配列の同一性パーセントよりも高くなる。当業者は、配列同一性パーセントを計算するための配列アラインメントの生成が、もっぱら一次配列データによって駆動されるバイナリ配列－配列比較に限定されないことを理解するであろう。配列アラインメントは、複数の配列アラインメントから派生され得る。複数の配列アラインメントを生成するのに適したプログラムの１つは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２である（ＣｌｕｓｔａｌＸは、Ｗｉｎｄｏｗｓ環境に移植されたＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムのバージョンである）。別の適切なプログラムはＭＵＳＣＬＥである。ＣｌｕｓｔａｌＷ２およびＭＵＳＣＬＥは、例えば欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）から入手可能である。

【0036】

「治療剤」という用語は、疾患または障害の治療に使用される任意の生物学的薬剤または化学薬剤を指す。治療薬には、任意の適切な生物学的に活性な化合物、細胞、ペプチド、抗体、およびポリヌクレオチドなどの生物学的に由来する成分、および放射性同位体などの放射化学治療剤が含まれる。いくつかの実施形態では、治療剤は化学療法剤または鎮痛剤を含む。

【0037】

本明細書で使用される場合、用語「治療」、「治療すること」、「治療する」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。この用語は、「治療有効量」の薬剤、例えば抗ＺｎＴ８抗体の投与の文脈でも使用される。この効果は、特定の転帰、疾患またはその症状を完全または部分的に予防するという点で予防的であり得、および／または疾患および／または疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という点で治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、対象、特にヒトにおける疾患のあらゆる治療を包含し、（ａ）病気の素因があるかもしれないが、まだ病気であると診断されていない対象における病気の発生を予防すること、（ｂ）病気を阻害する、すなわち、その発症を阻止すること、および（ｃ）疾患を軽減すること、例えば疾患の退行を引き起こすこと、例えば疾患の症状を完全にまたは部分的に除去することを含む。特定の実施形態では、この用語は、糖尿病を含む任意のＺｎＴ８媒介疾患の予防または治療の文脈で使用される。

【0038】

（ＩＩ．抗ＺｎＴ８抗体）
本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＺＮＴ８に特異的に結合する。特定の実施形態では、これらの抗体または抗原結合フラグメントはヒトＺＮＴ８に特異的に結合する。特定の実施形態では、これらの抗体または抗原結合フラグメントは、ＺＮＴ８の膜貫通型ドメインに特異的に結合する。本明細書で使用される「特異的に結合する」とは、抗体または抗原結合フラグメントが他のタンパク質よりもＺＮＴ８（例えば、ヒトＺＮＴ８、マウスＺＮＴ８）に優先的に結合することを意味する。特定の例において、本開示の抗ＺＮＴ８抗体は、他のタンパク質よりもＺＮＴ８に対して高い親和性を有する。ＺＮＴ８に特異的に結合する抗ＺＮＴ８抗体は、ヒトＺＮＴ８に対して１×１０^－７Ｍ以下、２×１０^－７Ｍ以下、３×１０^－７Ｍ以下、４×１０^－７Ｍ以下、５×１０^－７Ｍ以下、６×１０^－７Ｍ以下、７×１０^－７Ｍ以下、８×１０^－７Ｍ以下、９×１０^－７Ｍ以下、１ｘ１０^－８Ｍ以下、２ｘ１０^－８Ｍ以下、３×１０^－８Ｍ以下、４×１０^－８Ｍ以下、５×１０^－８Ｍ以下、６×１０^－８Ｍ以下、７×１０^－８Ｍ以下、８×１０^－８Ｍ以下、９×１０^－８Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、２×１０^－９Ｍ、３×１０^－９Ｍ以下、４×１０^－９Ｍ以下、５×１０^－９Ｍ以下、６×１０^－９Ｍ以下、７ｘ１０^－９Ｍ以下、８ｘ１０^－９Ｍ以下、９ｘ１０^－９Ｍ以下、１ｘ１０^－１０Ｍ以下、２×１０^－１０Ｍ以下、３×１０^－１０Ｍ以下、４×１０^－１０Ｍ以下、５×１０^－１０Ｍ以下、６×１０^－１０Ｍ以下、７×１０^－１０Ｍ以下、８×１０^－１０Ｍ以下、９×１０^－１０Ｍ以下、１×１０^－１１Ｍ以下、２×１０^－１１Ｍ以下、３×１０^－１１Ｍ以下、４×１０^－１１Ｍ以下、または５×１０^－１１Ｍ以下、６×１０^－１１Ｍ以下、７×１０^－１１Ｍ以下、８×１０^－１１Ｍ以下、９×１０^－１１Ｍ以下、１×１０^－１２Ｍ以下、２×１０^－１２Ｍ以下、３×１０^－１２Ｍ以下、４×１０^－１２Ｍ以下、５×１０^－１２Ｍ以下、６×１０^－１２Ｍ以下、７×１０^－１２Ｍ以下、８×１０^－１２Ｍ以下、または９ｘ１０^－１２Ｍ以下の結合親和性を有し得る。抗体の結合親和性を測定する方法は当技術分野で周知であり、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＭｏｒｔｏｎおよびＭｙｓｚｋａ’’Ｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ’’Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９８）２９５、２６８－２９４）、生物層干渉法、（Ａｂｄｉｃｈｅ、’’Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ Ｐａｒａｌｌｅｌ Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ Ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，ｔｈｅ ＯＣＴＥＴ’’ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００８）３７７，２０９－２１７）、速度論的排除アッセイ（ＫｉｎＥｘＡ））（ＤａｒｌｉｎｇおよびＢｒａａｕｌｔ’’Ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｎｇｕｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ’’ＡｓｓａｙおよびＤｒｕｇ Ｄｅｖ Ｔｅｃｈ（２００４）２，６４７－６５７）、等温熱量測定（Ｐｉｅｒｃｅら’’Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ’’Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９９））１９、２１３～２２１）および分析用超遠心分離（Ｌｅｂｏｗｉｔｚら’’Ｍｏｄｅｍ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅ：Ａ ｔｕｔｏｒｉａｌ ｒｅｖｉｅｗ’’Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）、１１：２０６７～２０７９）が含まれる。

【0039】

一態様では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗ＺｎＴ８抗体またはその抗原結合フラグメントを本明細書において提供し、重鎖可変領域は、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ１、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ２、および（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｈ３、を含み、および／または軽鎖可変領域は、（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ１、（ｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ２、および（ｉｉｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ－Ｌ３を含み、抗ＺｎＴ８抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ番号付けスキームによって定義される。

【0040】

一態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗ＺｎＴ８抗体またはその抗原結合フラグメントが本明細書において提供する。

【0041】

いくつかの実施形態では、本明細書では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む抗ＺｎＴ８抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインは、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または参照配列と比べた欠失を含有し、ＺｎＴ８（例えば、ヒトＺｎＴ８）に結合する能力を保持する。特定の実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸）は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で起こる。いくつかの実施形態では、抗ＺｎＴ８抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９の重鎖可変ドメイン配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。特定の実施形態では、重鎖可変ドメイン配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に対して１つの点変異を含む。さらなる実施形態では、１つの点変異はＣＤＲ領域に位置する。

【0042】

いくつかの実施形態では、本明細書では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む抗ＺｎＴ８抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインは、置換（例えば、保存的置換）、挿入、または参照配列と比べた欠失を含有し、ＺｎＴ８（例えば、ヒトＺｎＴ８）に結合する能力を保持する。特定の実施形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７において、合計１～１０個のアミノ酸が置換、挿入および／または欠失されている。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失（例えば、１、２、３、４、または５個のアミノ酸）は、ＣＤＲの外側の領域（すなわち、ＦＲ内）で起こる。いくつかの実施形態では、抗ＺｎＴ８抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の軽鎖可変ドメイン配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。特定の実施形態では、軽鎖可変ドメイン配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に対して少なくとも１つの点変異を含む。さらなる実施形態では、１つの点変異はＣＤＲ領域に位置する。

【0043】

したがって、特定の実施形態では、配列は少なくとも１つの保存的置換を含み得る。「少なくとも１つ」という語句は「１つ以上」と同義であり、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５・・・少なくとも「Ｎ」、「Ｎ」は特定の順序でアミノ酸の総数に等しい（つまり、１つ以上、２つ以上、３つ以上など）、などの値を含むことを理解されたい。

【0044】

シーケンスは、最大１、最大２、最大３、最大４、最大５、最大６、最大７、最大８、最大９、最大１０、最大１１、最大１２、最大１３、最大１４、最大１５・・・最大「Ｎ」、「Ｎ」は特定の配列におけるアミノ酸の総数に等しい、でも構成され得る。あるいは、特定の配列は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下などのアミノ酸位置での置換を含み得る。

【0045】

特定の実施形態において、本発明は、ＺｎＴ８に特異的に結合する単離された抗体またはその抗体結合フラグメントを提供し、抗体または抗体結合フラグメントは、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２および３を含み、重鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のアミノ酸配列、または３つ以下のアミノ酸位置が置換されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載のアミノ酸配列を含み、重鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載のアミノ酸、または７つ以下のアミノ酸位置が置換されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載のアミノ酸を含み、重鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列、または４つ以下のアミノ酸位置が置換されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列を含む。

【0046】

さらなる実施形態では、単離された抗体または抗原結合フラグメントは、軽鎖ＣＤＲ１、２および３をさらに含み、軽鎖ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列、または６つ以下のアミノ酸位置が置換されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列を含み、軽鎖ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載のアミノ酸、または４つ以下のアミノ酸位置が置換されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載のアミノ酸を含み、軽鎖ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載のアミノ酸配列、または５つ以下のアミノ酸位置が置換されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に記載のアミノ酸配列を含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、抗ＺｎＴ８抗体、または抗ＺｎＴ８抗体－薬物接合体の抗ＺｎＴ８抗体はモノクローナル抗体である。

【0048】

免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つのクラスがあり、それぞれα、δ、ε、γ、μと呼ばれる重鎖を有する。γおよびμクラスはさらにサブクラスに分類される。例えば、ヒトはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２次のサブクラスを発現する。ＩｇＧ１抗体は、アロタイプと呼ばれる複数の多型変異体で存在し得（Ｊｅｆｅｒｉｓ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ ２００９．ｍＡｂｓ Ｖｏｌ １ Ｉｓｓｕｅ４１－７で概説）、そのいずれも本明細書のいくつかの実施形態での使用に適している。ヒト集団における一般的なアロタイプ変異体は、文字ａ、ｆ、ｎ、ｚ、またはそれらの組み合わせで指定されるものである。本明細書の実施形態のいずれかにおいて、抗体は、ヒトＩｇＧＦｃ領域を含む重鎖Ｆｃ領域を含み得る。さらなる実施形態では、ヒトＩｇＧＦｃ領域はヒトＩｇＧ４を含む。

【0049】

抗体はまた、共有結合が抗体のＺｎＴ８への結合、または細胞に対する細胞増殖抑制効果または細胞毒性効果の発揮を妨げないように、修飾された、すなわち、抗体への任意のタイプの分子の共有結合によって修飾された誘導体を含み得る。例えば、限定するものではないが、抗体誘導体には、例えば、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞リガンドへの結合、または他のタンパク質などが含まれる。多数の化学修飾のいずれも、特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがこれらに限定されない既知の技術によって実行され得る。さらに、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。

【0050】

（抗体フラグメント）
本開示は、ＺＮＴ８（例えば、ヒトＺＮＴ８（ＺＮＴ８の膜貫通型ドメインを含むがこれに限定されない））に特異的に結合する能力を保持する、本明細書に記載の抗体フラグメントまたはドメインを包含する。抗体フラグメントには、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、およびＦｖが含まれる。これらのフラグメントは、ヒト化されている場合もあり得、完全にヒト型であり得る。抗体フラグメントは、無傷の抗体のタンパク質分解消化によって調製され得る。例えば、抗体フラグメントは、抗体全体をパパイン、ペプシン、プラスミンなどの酵素で処理することにより得られ得る。抗体全体をパパイン消化すると、Ｆ（ａｂ）２またはＦａｂフラグメントが生成され、抗体全体をペプシン消化すると、Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂ’が得られ、抗体全体をプラスミン消化すると、Ｆａｃｂフラグメントが得られる。

【0051】

あるいは、抗体フラグメントは組換えによって生成され得る。例えば、対象の抗体フラグメントをコードする核酸を構築し、発現ベクターに導入し、適切な宿主細胞で発現させ得る。例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：２９６８－２９７６（１９９４）；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．およびＨｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１７８：４７６－４９６（１９８９）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ＡおよびＳｋｅｒｒａ，Ａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１７８：４７６－４９６（１９８９）；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：６５２－６６３（１９８９）；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，（１９８９）１２１：６６３－６６９（１９８９）；およびＢｉｒｄ，ＲＥ．ら、ＴＩＢＴＥＣＨ，９：１３２－１３７（１９９１））を参照されたい。抗体フラグメントは大腸菌内で発現し、大腸菌から分泌されるため、これらのフラグメントを大量に容易に生産し得る。抗体フラグメントは抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメントを大腸菌から直接回収し、化学的に結合させてＦ（ａｂ）２フラグメントを形成することもでき得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６３－１６７（１９９２））。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、ｉｎ ｖｉｖｏ半減期が増加したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、米国特許第５，８６９，０４６号明細書に記載されている。

【0052】

（ミニボディ）
また、本明細書に記載の抗体のミニボディも包含される。抗ＺＮＴ８抗体の低分子化抗体には、ダイアボディ、一本鎖（ｓｃＦｖ）、一本鎖（Ｆｖ）２（ｓｃ（Ｆｖ）２）が含まれる。

【0053】

「ダイアボディ」は、遺伝子融合によって構築された二価ミニボディである（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ．Ａ．，９０：６４４４－６４４８（１９９３）；欧州特許出願公開第４０４，０９７号明細書；国際公開第９３／１１１６１号を参照のこと）。ダイアボディは、２つのポリペプチド鎖で構成される二量体である。ダイアボディの各ポリペプチド鎖のＶＬドメインとＶＨドメインはリンカーによって結合されている。リンカーを構成するアミノ酸残基の数は、２～１２残基（例えば、３～１０残基、または５または約５残基）であり得る。ダイアボディ内のポリペプチドのリンカーは、通常、ＶＬとＶＨが互いに結合するには短すぎる。したがって、同じポリペプチド鎖にコードされるＶＬとＶＨは単鎖可変領域フラグメントを形成できず、異なる単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディには２つの抗原結合部位が存在する。

【0054】

ｓｃＦｖは、ＶＨとＶＬをリンカーで連結することによって得られる単鎖ポリペプチド抗体である（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：５８７９－５８８３（１９８８）；およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、’’モノクローナル抗体の薬理学’’第１１３巻、エド・リセンバーグおよびムーア、シュプリンガー・フェアラグ、ニューヨーク、２６９～３１５頁、（１９９４）を参照））。各可変ドメイン（またはその一部）は、同じまたは異なる抗体に由来する。単鎖Ｆｖ分子は、好ましくは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に介在するｓｃＦｖリンカーを含む。例示的なｓｃＦｖ分子は当技術分野で知られており、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号明細書；米国特許第５，８９２，０１９号明細書；および米国特許第５，８９２，０１９号明細書、Ｈｏら、Ｇｅｎｅ、７７：５１（１９８９）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３（１９８８）；Ｐａｎｔｏｌｉａｎｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１０１ １７（１９９１）；Ｍｉｌｅｎｉｃら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５１：６３６３（１９９１）、Ｔａｋｋｉｎｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、４：８３７（１９９１）に記載されている。

【0055】

本明細書で使用される「ｓｃＦｖリンカー」という用語は、ｓｃＦｖのＶＬドメインとＶＨドメインとの間に介在する部分を指す。ｓｃＦｖリンカーは、好ましくは、ｓｃＦｖ分子を抗原結合立体構造に維持する。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖリンカーペプチドを含むか、またはｓｃＦｖリンカーペプチドからなる。特定の実施形態では、ｓｃＦｖリンカーペプチドは、Ｇｌｙ－Ｓｅｒペプチドリンカーを含むか、またはＧｌｙ－Ｓｅｒペプチドリンカーからなる。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖリンカーはジスルフィド結合を含む。

【0056】

ＶＨとＶＬとの接続順序は特に限定されず、どのような順序で配置されてもよい。配置の例には［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］；または［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］が含まれる。ｓｃＦｖにおけるＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域は、本明細書に記載される任意の抗ＺＮＴ８抗体またはその抗原結合フラグメントに由来し得る。

【0057】

ｓｃ（Ｆｖ）２は、２つのＶＨと２つのＶＬとがリンカーで連結されて一本鎖となったミニボディである（Ｈｕｄｓｏｎら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，（１９９９）２３１：１７７－１８９（１９９９））。ｓｃ（Ｆｖ）２は、例えばｓｃＦｖをリンカーで連結することにより作製され得る。本発明のｓｃ（Ｆｖ）２には、好ましくは２つのＶＨと２つのＶＬとがＶＨ、ＶＬ、ＶＨ、ＶＬ（［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］）の順に配置され、単鎖ポリペプチドのＮ末端から始まる、抗体が含まれる。しかしながら、２つのＶＨと２つのＶＬの順序は、上記の配置に限定されるものではなく、任意の順序で配置され得る。配置の例を、下記に示す。
［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］
［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＨ］
［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］リンカー［ＶＬ］リンカー［ＶＨ］

【0058】

通常、４つの抗体可変領域をリンクする場合は３つのリンカーが必要である。使用されるリンカーは同一であっても異なっていてもよい。ミニボディのＶＨ領域とＶＬ領域とを連結するリンカーは特に限定されない。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。リンカーとしては、３～２５残基程度（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８）の任意の単鎖ペプチドを使用し得る。

【0059】

いくつかの実施形態では、リンカーは、合成化合物リンカー（化学架橋剤）である。市販されている架橋剤の例には、Ｎヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）、ジチオビス（スクシンイミジルイプロピオネート）（ＤＳＰ）、ジチオビス（スルホスクシンイミジルイプロピオネート）（ＤＴＳＳＰ）、エチレングリコールビス（スクシンイミジルコハク酸塩）（ＥＧＳ）、エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルコハク酸塩）（スルホ－ＥＧＳ）、酒石酸ジスクシンイミジル（ＤＳＴ）、酒石酸ジスルホスクシンイミジル（スルホ－ＤＳＴ）、ビス［２－（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（ＢＳｏｃＯＥＳ）、およびビス［２－（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ－ＢＳｏｃＯＥＳ）が含まれる。

【0060】

抗体フラグメントまたはミニボディにおけるＶＨまたはＶＬのアミノ酸配列には、置換、欠失、付加および／または挿入などの修飾が含まれ得る。例えば、修飾は、本明細書に記載の抗ＺＮＴ８抗体のＣＤＲの１つ以上の中にあり得る。特定の実施形態では、修飾は、抗ＺＮＴ８ミニボディのＶＨの１つ、２つもしくは３つのＣＤＲおよび／またはＶＬドメインの１つ、２つもしくは３つのＣＤＲにおける１つ、２つもしくは３つのアミノ酸置換を含む。このような置換は、抗ＺＮＴ８ミニボディの結合および／または機能活性を改善するために行われる。いくつかの実施形態では、抗ＺＮＴ８抗体またはその抗原結合フラグメントの６つのＣＤＲのうちの１つ以上の１つ、２つ、または３つのアミノ酸は、ＶＨとＶＬとが関連付けられるときＺＮＴ８結合および／または機能的活性が存在する限り、欠失または付加され得る。

【0061】

（ＶＨＨ）
ナノボディとしても知られるＶＨＨは、軽鎖を持たないラクダやラマに見られる重鎖抗体の抗原結合可変重鎖領域（ＶＨＨ）に由来する。本開示は、ＺＮＴ８に特異的に結合するＶＨＨを包含する。

【0062】

（新しい抗原受容体（ＶＮＡＲ）の可変ドメイン）
ＶＮＡＲは、新しい抗原受容体（ＩｇＮＡＲ）の可変ドメインである。ＩｇＮＡＲはサメの血清中に共有結合した重鎖ホモ二量体として存在する。それは、異なる数の定常ドメインを持つ可変ドメイン（ＶＮＡＲ）からなる可溶性および受容体結合型として存在する。ＶＮＡＲは、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３で構成され、ＣＤＲ２の代わりにＨＶ２およびＨＶ４ドメインを有する（例えば、Ｂａｒｅｌｌｅ ａｎｄ Ｐｏｒｔｅｒ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，４：２４０－２５８（２０１５）を参照）。本開示は、ＺＮＴ８に特異的に結合するＶＮＡＲを包含する。

【0063】

（定常領域）
本開示の抗体は、抗体全体または単鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）であり得、当技術分野で知られている任意の定常領域を含み得る。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型またはラムダ型の軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパまたはヒトラムダ軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、またはミュー型重鎖定常領域、例えば、ヒトアルファ型、ヒトデルタ型、ヒトイプシロン型、ヒトガンマ型、またはヒトミュー型重鎖定常領域であり得る。特定の例において、抗ＺＮＴ８抗体は、ＩｇＡ抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＥ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、ＩｇＧ４抗体、またはＩｇＭ抗体である。

【0064】

いくつかの実施形態では、軽鎖または重鎖定常領域は、天然に存在する定常領域のフラグメント、誘導体、変異体、またはムテインである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＺＮＴ８抗体の可変重鎖は、ＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域を含む重鎖定常領域に連結される。いくつかの実施形態では、可変重鎖は、ＣＨ２ドメインを含む重鎖定常領域に連結される。いくつかの実施形態では、可変重鎖は、ＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域に連結される。いくつかの実施形態では、可変重鎖は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域に連結される。いくつかの実施形態では、可変重鎖は、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域に連結される。ＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２、および／またはＣＨ３は、ＩｇＧ抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４）に由来し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＺＮＴ８抗体の可変重鎖は、ＩｇＧ４からのＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、およびＣＨ２ドメイン、ならびにＩｇＧ１からのＣＨ３ドメインを含む重鎖定常領域に連結される。特定の実施形態では、このようなキメラ抗体は、キメラ抗体の安定性を高める重鎖定常領域に１つ以上の追加の変異を含み得る。特定の実施形態では、重鎖定常領域は、抗体の特性を改変する置換を含む。

【0065】

特定の実施形態では、本開示の抗ＺＮＴ８抗体は、ＩｇＧアイソタイプ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧ１である。別の実施形態では、抗体はＩｇＧ２である。さらに別の実施形態では、抗体はＩｇＧ４である。場合によっては、ＩｇＧ４抗体は、機能的に一価の形式を採用することを低減または妨げる１つ以上の変異を有する。例えば、ＩｇＧ４のヒンジ領域を変異させて、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域とアミノ酸配列とを同一にし得る（ヒトＩｇＧ４ヒンジのセリンからプロリンへの変異）。いくつかの実施形態では、抗体はキメラ重鎖定常領域を有する（例えば、ＩｇＧ４のＣＨ１、ヒンジ、およびＣＨ２領域、ならびにＩｇＧ１のＣＨ３領域を有する）。

【0066】

（二重特異性抗体）
特定の実施形態では、本開示の抗ＺＮＴ８抗体は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、ＺＮＴ８タンパク質の２つの異なるエピトープに結合し得る。
他のそのような抗体は、ＺＮＴ８結合部位を別のタンパク質の結合部位と組み合わせ得る。二重特異性抗体は、完全長抗体またはその低分子量形態として調製され得る（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体、ｓｃ（Ｆｖ）２二重特異性抗体、ダイアボディ二重特異性抗体）。

【0067】

全長二重特異性抗体の従来の産生は、２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の共発現に基づいており、２つの鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７－５３９（１９８３））。別のアプローチでは、望ましい結合特異性を持つ抗体可変ドメインが免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。免疫グロブリン重鎖融合体、および必要に応じて免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞に同時トランスフェクトされる。これによって、３つのポリペプチドフラグメントの比率を調整する際の柔軟性が高まる。しかしながら、少なくとも２つのポリペプチド鎖を等しい比率で発現させて高収率が得られる場合には、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を単一の発現ベクターに挿入することが可能である。

【0068】

米国特許第５，７３１，１６８号明細書に記載されている別のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大化し得る。好ましい界面は、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、最初の抗体分子の界面にある１つ以上の小さなアミノ酸側鎖は、より大きな側鎖（チロシンまたはトリプトファンなど）に置き換えられる。大きな側鎖および同一または同様のサイズの代償的な「キャビティ」は、大きなアミノ酸側鎖を小さなもの（アラニンまたはトレオニンなど）に置き換えることによって、二次抗体分子の界面に作成される。これは、ホモ二量体などの他の望ましくない最終生成物よりもヘテロ二量体の収量を増加させるメカニズムを提供する。

【0069】

二重特異性抗体には、架橋抗体または「ヘテロ接合体」抗体が含まれる。例えば、ヘテロ接合体の抗体の１つはアビジンに結合し、もう１つはビオチンに結合され得る。ヘテロ接合体抗体は、任意の便利な架橋方法を使用して作成され得る。

【0070】

「ダイアボディ」技術は、二重特異性抗体フラグメントを作成するための代替メカニズムを提供する。このフラグメントは、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによってＶＬに接続されたＶＨを含む。したがって、１つのフラグメントのＶＨおよびＶＬドメインは、別のフラグメントの相補的なＶＬおよびＶＨドメインと強制的に対形成され、それによって２つの抗原結合部位が形成される。

【0071】

（接合抗体）
本明細書に開示される抗体または抗原接合フラグメントは、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＥＧで修飾されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ＰＥＩ－ＰＥＧ）、ポリグルタミン酸（ＰＧＡ）（Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）コポリマー）などの高分子物質、ヒト血清アルブミンまたはそのフラグメント、放射性物質（^９０Ｙ、^１３１Ｉなど）、蛍光物質、発光物質、ハプテン、酵素、金属キレート、および薬物を含む様々な分子と結合され得る。

【0072】

特定の実施形態では、抗ＺＮＴ８抗体またはその抗原結合フラグメントは、循環中、例えば血液、血清、または他の組織中でのその安定化および／または保持を、例えば少なくとも１．５、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、または５０倍、改善する部分で修飾される。例えば、抗ＺＮＴ８抗体またはその抗原結合フラグメントは、ポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドなどの実質的に非抗原性ポリマーと結合（例えば、接合）され得る。適切なポリマーは、重量によって実質的に異なる。約２００～約３５，０００ダルトン（または約１，０００～約１５，０００、および２，０００～約１２，５００）の範囲の数平均分子量を有するポリマーを使用し得る。例えば、抗ＺＮＴ８抗体またはその抗原結合フラグメントは、水溶性ポリマー、例えば、親水性ポリビニルポリマー、例えば、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンに接合され得る。このようなポリマーの例には、ブロックコポリマーの水溶性が維持される限り、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、それらのコポリマー、およびそれらのブロックコポリマーが含まれる。追加の有用なポリマーには、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマーなどのポリオキシアルキレン、ポリメタクリレート、カルボマー、および分岐または非分岐の多糖類が含まれる。

【0073】

上記の接合抗体またはフラグメントは、本明細書に記載の抗体またはその低分子量形態に化学修飾を施すことによって調製され得る。抗体を修飾する方法は当技術分野でよく知られている。

【0074】

（ＩＩＩ．抗体の特性評価）
本明細書に記載される抗体のＺＮＴ８結合特性は、任意の標準的な方法、例えば、ＯＣＴＥＴ（登録商標）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射性免疫測定法）、および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の方法のうちの１つ以上によって測定され得る。

【0075】

対象のタンパク質（抗ＺＮＴ８抗体またはその機能的フラグメント）と標的（ＺＮＴ８など）の結合相互作用は、ＯＣＴＥＴ（登録商標）システムを使用して分析され得る。この方法では、ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製のさまざまな機器（ＯＣＴＥＴ（登録商標）ＱＫｅおよびＱＫなど）の１つを使用して、タンパク質の相互作用、結合特異性、およびエピトープマッピングを決定する。ＯＣＴＥＴ（登録商標）システムは、カスタムチップを通過してセンサーに戻る偏光の変化を測定することによって、リアルタイムの結合を監視する簡単な方法を提供する。

【0076】

対象のタンパク質（抗ＺＮＴ８抗体またはその機能的フラグメント）と標的（ＺＮＴ８など）の結合相互作用は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して分析され得る。ＳＰＲまたは生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）は、相互作用物質を標識せずに、生体特異的相互作用をリアルタイムで検出する。

【0077】

ＢＩＡチップの結合表面の質量変化（結合イベントを示す）によって、表面付近の光の屈折率（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）が変化する。屈折率の変化によって検出可能なシグナルが生成され、生体分子間のリアルタイム反応の指標として測定される。ＳＰＲを使用する方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号明細書、Ｒａｅｔｈｅｒ（１９８８）Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ；ＳｊｏｌａｎｄｅｒおよびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ ６３：２３３８－２３４５、Ｓｚａｂｏら、（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９－７０５およびＢＩＡｃｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＡＢ（スウェーデン、ウプサラ）によって提供されるオンラインリソースに記載されている。ＳＰＲからの情報を使用して、平衡解離定数（Ｋｄ）、および生体分子の標的への結合に関する速度論パラメーター（ＫｏｎおよびＫｏｆｆを含む）の正確かつ定量的な測定を提供し得る。

【0078】

エピトープはまた、ＢＩＡＣＯＲＥクロマトグラフィー技術を使用して、ヒトＺＮＴ８への結合に関して互いに競合する異なる抗ＺＮＴ８抗体またはその機能的フラグメントの能力を評価することによって直接マッピングもされ得るる（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢＩＡｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ、’’ｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ’’、セクション６．３．２、（１９９４年５月））；Ｊｏｈｎｅら、（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６０：１９１－１９８も参照されたい）。

【0079】

酵素免疫測定法を用いるとき、抗体を含む試料、例えば抗体産生細胞の培養上清または精製抗体を抗原コートプレートに添加する。アルカリホスファターゼなどの酵素で標識した二次抗体を加えてインキュベートし、洗浄後、ｐ－ニトロフェニルリン酸などの酵素基質を加え、吸光度を測定することで抗原結合活性を評価する。

【0080】

例えばウエスタンブロットおよび免疫沈降アッセイなど、抗体を評価するための追加の一般的なガイダンスは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ（１９８８）、中に見られ得る。

【0081】

（ＩＶ．親和性の成熟）
いくつかの実施形態では、抗ＺＮＴ８抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば突然変異誘発によって修飾されて、修飾された抗体のプールを提供する。次いで、修飾された抗体を評価して、変化した機能特性（例えば、結合の改善、安定性の改善、抗原性の低下、またはｉｎ ｖｉｖｏでの安定性の増加）を有する１つ以上の抗体を同定する。一実施形態では、ディスプレイライブラリ技術を使用して、修飾抗体のプールを選択またはスクリーニングする。次いで、より高い親和性の抗体が、例えばより高いストリンジェンシーまたはより競合的な結合および洗浄条件を使用することによって、第２のライブラリーから同定される。他のスクリーニング技術も使用され得る。親和性成熟をもたらす方法には、ランダム突然変異誘発（例えば、Ｆｕｋｕｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３４：ｅｌ２７（２００６））；標的突然変異誘発（例えば、Ｒａｊｐａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０２：８４６６－７１（２００５）；シャッフリングアプローチ（例えば、Ｊｅｒｍｕｔｕｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９８：７５－８０（２００１））；およびシリカアプローチ（例えば、Ｌｉｐｐｏｗら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２５：１１７１－６（２００５）が含まれる。

【0082】

いくつかの実施形態では、突然変異誘発は、結合界面にあることが知られている領域、または結合界面にある可能性が高い領域を標的とする。例えば、同定された結合タンパク質が抗体である場合、本明細書に記載されるように、突然変異誘発は重鎖または軽鎖のＣＤＲ領域に向けられ得る。さらに、突然変異誘発は、ＣＤＲの近くまたは隣接するフレームワーク領域、例えば、特にＣＤＲ接合部の１０、５、または３アミノ酸以内のフレームワーク領域に向けられ得る。抗体の場合、例えば段階的に改善するために、突然変異誘発を１つまたはいくつかのＣＤＲに限定し得る。

【0083】

いくつかの実施形態では、突然変異誘発を使用して、抗体を１つ以上の生殖系列配列により類似させる。１つの例示的な生殖系列化方法は、単離された抗体の配列に類似する（例えば、特定のデータベースにおいて最も類似する）１つ以上の生殖系列配列を同定することを含み得る。次に、単離された抗体に、段階的に、組み合わせて、またはその両方で変異（アミノ酸レベルで）を加え得る。例えば、考えられる生殖系列変異の一部またはすべてをコードする配列を含む核酸ライブラリーが作成される。次いで、変異抗体を評価して、例えば、単離された抗体と比較して１つ以上の追加の生殖系列残基を有し、なお有用である（例えば、機能的活性を有する）抗体を同定する。いくつかの実施形態では、できるだけ多くの生殖系列残基が単離された抗体に導入される。

【0084】

いくつかの実施形態では、突然変異誘発を使用して、１つ以上の生殖系列残基をＣＤＲ領域に置換または挿入する。例えば、生殖系列ＣＤＲ残基は、修飾される可変領域に類似した（例えば、最も類似した）生殖系列配列に由来し得る。突然変異誘発後、抗体の活性（例えば、結合または他の機能活性）を評価して、生殖系列残基が許容されるかどうかを決定し得る。同様の突然変異誘発をフレームワーク領域でも実行され得る。

【0085】

生殖系列配列の選択は、さまざまな方法で実行され得る。例えば、生殖系列配列は、選択性または類似性についての所定の基準、例えば少なくとも一定の同一性パーセント、例えばドナー非ヒト抗体と比較して少なくとも７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％の同一性を満たす場合に選択され得る。選択は、少なくとも２、３、５、または１０個の生殖系列配列を使用して実行され得る。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の場合、類似の生殖系列配列を同定することは、そのような配列の１つを選択することを含み得る。ＣＤＲ３の場合、類似の生殖系列配列の同定には、そのような配列を１つ選択することが含まれるが、アミノ末端部分とカルボキシ末端部分に別々に寄与する２つの生殖系列配列を使用することが含まれ得る。他の実施形態では、例えば、コンセンサス配列を形成するために、１つまたは２つを超える生殖系列配列が使用される。

【0086】

２つの配列間の「配列同一性」の計算は次のように実行される。配列は、最適な比較目的のためにアラインメントされる（例えば、最適なアラインメントのために第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較目的のために非相同配列を無視することができる）。最適なアラインメントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用し、ギャップペナルティ１２、ギャップ拡張ペナルティ４、およびフレームシフトギャップペナルティ５のＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスを使用して、最良のスコアとして決定される。アミノ酸残基または、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のヌクレオチドが比較される。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められているとき、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。

【0087】

いくつかの実施形態では、抗体は、変化したグリコシル化パターン（すなわち、元のまたは天然のグリコシル化パターンから変化）を有するように修飾され得る。この文脈で使用される場合、「改変された」とは、１つ以上の炭水化物部分が欠失していること、および／または元の抗体に１つ以上のグリコシル化部位が付加されていることを意味する。ここで開示される抗体へのグリコシル化部位の付加は、グリコシル化部位コンセンサス配列を含むようにアミノ酸配列を改変することによって達成され得る。このような技術は当技術分野でよく知られている。抗体上の炭水化物部分の数を増やす別の手段は、抗体のアミノ酸残基へのグリコシドの化学的または酵素的結合によるものである。これらの方法は、例えば、国際公開第８７／０５３３０号、およびＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ（１９８１）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２２：２５９－３０６。抗体上に存在する炭水化物部分の除去は、当該技術分野で記載されているように化学的または酵素的に達成され得る（Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２；Ｅｄｇｅら、（１９８１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１１８：１３１；およびＴｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１３８：３５０）。例えば、サルベージ受容体結合エピトープを提供することによってｉｎ ｖｉｖｏ半減期を増加させる修飾については、米国特許第５，８６９，０４６号明細書を参照されたい。

【0088】

いくつかの実施形態では、抗ＺＮＴ８抗体は、本明細書に記載のものとは異なる１つ以上のＣＤＲ配列（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、増強されたＣｈｏｔｈｉａ、またはＫａｂａｔ ＣＤＲ）を有する。いくつかの実施形態では、抗ＺＮＴ８抗体は、ＣＤＲが５～７アミノ酸の長さである場合には１、２、３、または４個のアミノ酸の置換、またはＣＤＲの長さが８アミノ酸以上である場合にはＣＤＲの配列内のアミノ酸の１、２、３、４、または５個アミノ酸の置換などのアミノ酸変化を含む１つ以上のＣＤＲ配列を有する。置換されるアミノ酸は、同様の電荷、疎水性、または立体化学的特徴を有し得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は保存的置換である。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。同様の電荷を有する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例：リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例：アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例：グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例、チロシン）、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は非保存的置換である。置換されたＣＤＲを含む抗体またはその抗体フラグメントをスクリーニングして、対象の抗体を同定し得る。

【0089】

ＣＤＲとは異なり、抗体の結合特性に悪影響を与えることなく、構造フレームワーク領域（ＦＲ）にさらに実質的な変更を加え得る。ＦＲへの変更には、非ヒト由来フレームワークのヒト化、または抗原接触または結合部位の安定化に重要な特定のフレームワーク残基の操作、例えば定常領域のクラスまたはサブクラスの変更、Ｆｃ受容体結合などのエフェクター機能を変化させる可能性のある特定のアミノ基の変更（Ｌｕｎｄら、Ｊ Ｉｍｍｕｎ．、１４７：２６Ｓ７－６２（１９９１）；Ｍｏｒｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８６：３１９－２４（１９９Ｓ））、または定常領域の由来となる種の変更が含まれるが、これらに限定されない。

【0090】

（Ｖ．ヒト化抗体）
ヒト化抗体は、非ヒト「ドナー」抗体のＣＤＲがヒト「アクセプター」抗体配列に移植された、遺伝子操作された抗体である。例えば、Ｑｕｅｅｎ、米国特許第５，５３０，１０１号明細書および第５，５８５，０８９号明細書、Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号明細書、Ｃａｒｔｅｒ、米国特許第６，４０７，２１３号明細書、Ａｄａｉｒ、米国特許第５，８５９，２０５号明細書、およびＦｏｏｔｅ、米国特許第６，８８１，５５７号明細書を参照されたい。アクセプター抗体配列は、例えば、成熟ヒト抗体配列、そのような配列の複合体、ヒト抗体配列のコンセンサス配列、または生殖系列領域配列であり得る。いくつかの実施形態では、重鎖の場合、アクセプター配列は、生殖系列Ｖ_ＨエクソンＶ_Ｈ１－２（文献ではＨＶ１－２とも呼ばれる）（Ｓｈｉｎら、１９９１、ＥＭＢＯ Ｊ．１０：３６４１－３６４５）であり、ヒンジ領域（ＪＨ）の場合、エクソンＪＨ－６（Ｍａｔｔｉｌａら、１９９５、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２５７８－２５８２）である。軽鎖の場合、アクセプター配列はエクソンＶＫ２－３０（文献ではＫＶ２－３０とも呼ばれる）を含み得、ヒンジ領域の場合、エクソンＪＫ－４を含み得る（Ｈｉｅｔｅｒら、１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１５１６－１５２２）。したがって、ヒト化抗体は、完全にまたは実質的にドナー抗体に由来するいくつかまたはすべてのＣＤＲ、ならびに可変領域フレームワーク配列および存在する場合には完全にまたは実質的にヒト抗体配列に由来する定常領域を有する抗体である。同様に、ヒト化重鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体重鎖に由来する少なくとも１つ、２つ、通常は３つすべてのＣＤＲ、ならびに存在する場合には実質的にヒト重鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に由来する重鎖可変領域フレームワーク配列および重鎖定常領域を有する。同様に、ヒト化軽鎖は、完全にまたは実質的にドナー抗体軽鎖に由来する少なくとも１つ、２つ、通常は３つすべてのＣＤＲ、ならびに存在する場合には実質的にヒト軽鎖可変領域フレームワークおよび定常領域配列に由来する軽鎖可変領域フレームワーク配列および軽鎖定常領域を有する。ナノボディおよびｄＡｂ以外に、ヒト化抗体はヒト化重鎖およびヒト化軽鎖を含む。ヒト化抗体のＣＤＲは、対応する残基（Ｋａｂａｔによって定義される）の少なくとも６０％、８５％、９０％、９５％または１００％がそれぞれのＣＤＲ間で同一であるとき、非ヒト抗体中の対応するＣＤＲに実質的に由来する。抗体鎖の可変領域フレームワーク配列または抗体鎖の定常領域は、Ｋａｂａｔによって定義される対応する残基の少なくとも８５％、９０％、９５％または１００％が同一であるとき、それぞれ実質的にヒト可変領域フレームワーク配列またはヒト定常領域に由来する。いくつかの実施形態では、本発明のＺｎＴ８抗体はヒト化抗体である。

【0091】

ヒト化抗体はマウス抗体の６つすべてのＣＤＲ（好ましくはＫａｂａｔによって定義されたとおり）をしばしば組み込むが、マウス抗体のすべてのＣＤＲよりも少ないＣＤＲ（例えば、少なくとも３、４、または５つ）のＣＤＲを使用して作成され得る。例えば、Ｐａｓｃａｌｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６、２００２、Ｖａｊｄｏｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３２０：４１５－４２８、２００２；Ｉｗａｈａｓｈｉら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１０７９－１０９１、１９９９；およびＴａｍｕｒａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６４：１４３２－１４４１、２０００を参照されたい。

【0092】

ヒト化抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、ヒト定常領域の少なくとも一部に連結され得る。定常領域の選択は、部分的には、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性、抗体依存性細胞食作用、および／または補体依存性細胞傷害性が望ましいかどうかに依存する。例えば、ヒトアイソトープＩｇＧ１およびＩｇＧ３は強い補体依存性細胞傷害性を有し、ヒトアイソタイプＩｇＧ２は弱い補体依存性細胞傷害性を有する。ＩｇＧ４には補体依存性の細胞毒性がない。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３はまた、ヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも強力な細胞媒介エフェクター機能を誘導する。軽鎖定常領域はラムダまたはカッパであり得る。抗体は、２つの軽鎖と２つの重鎖を含む四量体として、別個の重鎖、軽鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖとして、または重鎖と軽鎖が可変である単鎖抗体として発現され得る。ドメインはスペーサーを介して連結され得る。

【0093】

ヒト定常領域は、異なる個体間でアロタイプ変動およびアイソアロタイプ変動を示す。つまり、定常領域は、１つ以上の多型位置で異なる個体間で異なり得る。アイソアロタイプは、アイソアロタイプを認識する血清が１つ以上の他のアイソタイプの非多型領域に結合するという点でアロタイプとは異なる。

【0094】

重鎖のＣ末端リジンなど、軽鎖および／または重鎖のアミノ末端またはカルボキシ末端の１つまたはいくつかのアミノ酸は、分子の一部またはすべてで欠落しているか誘導体化されている場合があり得る。定常領域に置換を行って、補体媒介性細胞毒性もしくはＡＤＣＣなどのエフェクター機能を減少もしくは増加させ得る（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、米国特許第５，６２４，８２１号明細書；Ｔｓｏら、米国特許第５，８３４，５９７号明細書；Ｔｓｏら、米国特許第５，８３４，５９７号明細書、およびＬａｚａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０３：４００５，２００６を参照）、またはヒトにおける半減期を延長させ得る（例えば、Ｈｉｎｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：６２１３，２００４を参照）。

【0095】

例示的な置換には、アミノ酸位置２３４、２３５、２３７、２３９、２６７、２９８、２９９、３２６、３３０、または３３２に導入される天然アミノ酸のシステイン残基へのアミノ酸置換が含まれ、好ましくはヒトＩｇＧ１アイソタイプ（米国特許出願公開第２０１００１５８９０９号明細書）におけるＳ２３９Ｃ変異である。追加のシステイン残基の存在によって、鎖間ジスルフィド結合の形成が可能になる。このような鎖間ジスルフィド結合の形成は立体障害を引き起こし得、それによってＦｃ領域－ＦｃγＲの結合相互作用の親和性が低下する。ＩｇＧ定常領域のＦｃ領域内またはその近傍に導入されたシステイン残基は、治療薬剤への接合（つまり、薬物のマレイミド誘導体などのチオール特異的試薬を使用した細胞傷害性薬物の結合）のための部位としても機能する。治療剤は立体障害を引き起こすため、Ｆｃ領域－ＦｃγＲ結合相互作用の親和性がさらに低下する。

【0096】

抗体のｉｎ ｖｉｖｏ半減期もそのエフェクター機能に影響を与え得る。抗体の半減期を延長または短縮して、その治療活性を変更し得る。ＦｃＲｎは、β２ミクログロブリンと非共有結合するＭＨＣクラスＩ抗原と構造的に類似した受容体である。ＦｃＲｎは、ＩｇＧの異化作用および組織を越えるそれらのトランスサイトーシスを調節する（ＧｈｅｔｉｅおよびＷａｒｄ、２０００、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７３９～７６６；ＧｈｅｔｉｅおよびＷａｒｄ、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２５：９７～１１３）。ＩｇＧ－ＦｃＲｎ相互作用はｐＨ６．０（細胞内小胞のｐＨ）で起こるが、ｐＨ７．４（血液のｐＨ）では起こらない。この相互作用によって、ＩｇＧは循環にリサイクルされて戻されることが可能になる（ＧｈｅｔｉｅおよびＷａｒｄ，２０００，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：７３９－７６６；ＧｈｅｔｉｅおよびＷａｒｄ，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２５：９７－１１３）。ＦｃＲｎ結合に関与するヒトＩｇＧ１上の領域はマッピングされている（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１－６０４）。ヒトＩｇＧ１の位置Ｐｒｏ２３８、Ｔｈｒ２５６、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｐ３１２、Ｇｌｕ３８０、Ｇｌｕ３８２、またはＡｓｎ４３４におけるアラニン置換は、ＦｃＲｎ結合を増強する（Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：６５９１－６０４）。これらの置換を有するＩｇＧ１分子は、より長い血清半減期を有する。結果として、これらの修飾されたＩｇＧ１分子は、未修飾のＩｇＧ１と比較して、より長期間にわたってエフェクター機能を実行することができ、したがってその治療効果を発揮することができ得る。ＦｃＲｎへの結合を増加させるための他の例示的な置換には、２５０位のＧｉｎおよび／または４２８位のＬｅｕが含まれる。ＥＵ番号付けは、定常領域内のすべての位置に使用される。

【0097】

ヒト定常領域への言及には、任意の天然アロタイプ、または天然アロタイプの多型位置を占める残基の任意の順列を有する定常領域が含まれる。また、Ｆｃガンマ受容体結合を減少させるか、またはＦｃＲＮへの結合を増加させるために上記で示したような、天然のヒト定常領域と比較して、最大１、２、５、または１０個の変異が存在し得る。

【0098】

（ＶＩ．抗体薬物接合体）
抗ＺｎＴ８抗体を治療剤に接合させて、抗体薬物結接合体（ＡＤＣ）を形成し得る。特定の実施形態では、治療剤は、細胞傷害性剤、プロドラッグ変換酵素、放射性同位体もしくは化合物、または毒素を含み得る。例えば、抗ＺｎＴ８抗体は、毒素（例えば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、またはジフテリア毒素などの細胞増殖抑制剤または細胞破壊剤）などの細胞傷害剤に接合され得る。

【0099】

抗ＺｎＴ８抗体は、プロドラッグ変換酵素に接合され得る。プロドラッグ変換酵素は、既知の方法を使用して抗体に組換え的に融合させるか、または抗体に化学的に接合され得る。例示的なプロドラッグ変換酵素は、カルボキシペプチダーゼＧ２、ベータ－グルクロニダーゼ、ペニシリン－Ｖ－アミダーゼ、ペニシリン－Ｇ－アミダーゼ、β－ラクタマーゼ、β－グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼおよびカルボキシペプチダーゼＡである。

【0100】

治療剤をタンパク質、特に抗体に接合させる技術はよく知られている。例えば、ＭｏｎｏＣｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｒｅｉｓｆｅｌｄら編、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５）におけるＡｒｎｏｎら、’’Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ’’、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、第２版、１９８７）におけるＨｅｌｌｓｔｒｏｍら、’’Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ’’、ＭｏｎｏＣｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｐｉｎｃｈｅｒａら編、１９８５）におけるＴｈｏｒｐｅ、’’Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ’’、ＭｏｎｏＣｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｂａｌｄｗｉｎら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８５）における’’Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ’’、Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９－５８を参照されたい。例えば特許国際公開第８９／１２６２４号をも参照されたい。

【0101】

治療剤は、抗体から切断されない限り（例えば、加水分解、抗体分解、または切断剤によって）その活性を低下させる方法で接合され得る。このような治療剤は、ＺｎＴ８発現癌細胞の細胞内環境での切断には感受性があるが、細胞外環境では実質的に感受性がない切断可能なリンカーを用いて抗体に結合されており、これがＺｎＴ８発現細胞によって取り込まれるとき、（例えば、エンドソーム内で、または例えばｐＨ感受性またはプロテアーゼ感受性により、リソソーム環境またはカベオレ環境内で）その結果、接合体は抗体から切断される。

【0102】

通常、ＡＤＣは、治療剤と抗ＺｎＴ８抗体との間にリンカー領域を含む。上記のように、通常、リンカーは細胞内条件下で切断可能であり、リンカーの切断によって細胞内環境（例えば、リソソーム、エンドソーム、またはカベオレア内）で抗体から治療剤が放出される。リンカーは、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼを含む細胞内ペプチダーゼまたはプロテアーゼ酵素によって切断されるペプチジルリンカーであり得る。通常、ペプチジルリンカーは少なくとも２アミノ酸長、または少なくとも３アミノ酸長である。最も典型的には、ＺｎＴ８発現細胞に存在する酵素によって切断可能なペプチジルリンカーである。他のそのようなリンカーは、例えば米国特許第６，２１４，３４５号明細書に記載されている。特定の実施形態では、細胞内プロテアーゼによって切断可能なペプチジルリンカーは、Ｖａｌ－ＣｉｔリンカーまたはＰｈｅ－Ｌｙｓジペプチドを含む（例えば、Ｖａｌ－Ｃｉｔリンカーを用いたドキソルビシンの合成を記載している米国特許第６，２１４，３４５号明細書を参照されたい）。治療剤の細胞内タンパク質分解放出を使用する利点の１つは、治療剤が接合すると通常減弱化され、接合体の血清安定性が通常高いことである。

【0103】

切断可能なリンカーは、ｐＨ感受性、すなわち、特定のｐＨ値での加水分解に対して感受性があり得る。通常、ｐＨ感受性リンカーは酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソーム中で加水分解可能な酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス－アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用し得る。例えば、米国特許第５，１２２，３６８号明細書；第５，８２４，８０５明細書号；および第５，６２２，９２９号、ＤｕｂｏｗｃｈｉｋおよびＷａｌｋｅｒ、１９９９、Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ８３：６７－１２３；Ｎｅｖｉｌｌｅら、１９８９、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４６５３－１４６６１を参照されたい。このようなリンカーは、血液中などの中性ｐＨ条件下では比較的安定であるが、リソソームのおおよそのｐＨであるｐＨ５．５または５．０未満では不安定になる。特定の実施形態では、加水分解性リンカーは、チオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療剤に結合したチオエーテル（例えば、米国特許第５，６２２，９２９号を参照）など）である。

【0104】

他のリンカーは還元条件下で切断可能である（例：ジスルフィドリンカー）。ジスルフィドリンカーには、ＳＡＴＡ（Ｎ－スクシンイミジル－Ｓ－アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）ブチレート）およびＳＭＰＴ（Ｎ－スクシンイミジル－オキシカルボニル－アルファ－メチル－アルファ－（２－ピリジル－ジチオ）トルエン）、ＳＰＤＢおよびＳＭＰＴを使用して形成できるものが含まれる。例えば、Ｔｈｏｒｐｅら、１９８７，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：５９２４－５９３１；Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋら、’’ｍｍｕｎｏＣｏｎｊｕｇａｔｅｓ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ Ｒａｄｉｏｉｍａｇｅｒｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ’’（Ｃ．Ｗ．Ｖｏｇｅｌ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕ．Ｐｒｅｓｓ、１９８７）を参照されたい。米国特許第４，８８０，９３５号明細書をも参照されたい。

【0105】

リンカーは、マロン酸リンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：１３８７－９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ－Ｍｅｄ－Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９－１３０４）、または３’－Ｎ－アミド類似体（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ－Ｍｅｄ－Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５－１２）でもあり得る。リンカーは、マロン酸リンカー（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９５、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：１３８７－９３）、マレイミドベンゾイルリンカー（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ－Ｍｅｄ－Ｃｈｅｍ．３（１０）：１２９９－１３０４）、または３’－Ｎ－アミド類似体（Ｌａｕら、１９９５、Ｂｉｏｏｒｇ－Ｍｅｄ－Ｃｈｅｍ．３（１０）：１３０５－１２）でもあり得る。

【0106】

リンカーはまた、治療剤（例えば、薬物）に直接結合するマレイミド－アルキレン－リンカーまたはマレイミド－アリールリンカーなどの非切断性リンカーであり得る。活性薬物リンカーは、抗体の分解によって放出される。

【0107】

通常、リンカーは細胞外環境に対して実質的に感受性がなく、これは、ＡＤＣのサンプル中のリンカーの約２０％以下、典型的には約１５％以下、より典型的には約１０％以下、さらにより典型的には約５％以下、約３％以下、約１％以下が、ＡＤＣが細胞外環境（例えば、血漿中）に存在する場合、切断されることを意味する。

【0108】

リンカーが細胞外環境に対して実質的に感受性がないかどうかは、例えば、（ａ）ＡＤＣ（「ＡＤＣサンプル」）および（ｂ）等モル量の非接合抗体または治療剤（「対照サンプル」）の両方を血漿とともに所定の期間（例えば、２、４、８、１６、または２４時間）独立してインキュベートすることによって、および次いで、例えば高速液体クロマトグラフィーによって測定された、ＡＤＣサンプル中に存在する非接合抗体または治療薬の量を対照サンプル中に存在する量と比較することによって、決定され得る。

【0109】

リンカーは細胞内在化をも促進し得る。リンカーは、治療剤に接合した場合（すなわち、本明細書に記載のＡＤＣまたはＡＤＣ誘導体のリンカー－治療剤部分の環境で）細胞内在化を促進し得る。あるいは、リンカーは、治療剤と抗ＺｎＴ８抗体との両方に接合した場合（すなわち、本明細書に記載のＡＤＣの環境下で）、細胞内在化を促進し得る。

【0110】

抗ＺｎＴ８抗体は、抗体のヘテロ原子を介してリンカーに接合させ得る。これらのヘテロ原子は、自然な状態で抗体上に存在し得、または抗体に導入され得る。いくつかの態様では、抗ＺｎＴ８抗体は、リジン残基の窒素原子を介してリンカーに接合される。他の態様では、抗ＺｎＴ８抗体は、システイン残基の硫黄原子を介してリンカーに接合される。システイン残基は天然に存在し得、または抗体に組み込まれたものでもあり得る。リジンおよびシステイン残基を介してリンカーおよび薬物リンカーを抗体に接合させる方法は、当技術分野で知られている。

【0111】

（ＶＩＩ．イメージング）
別の態様では、抗体は標識剤に接合される。「標識剤」（または「検出可能な標識」）とは、対象の用途（例えば、インビトロおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ研究および／または臨床用途）において抗体が検出され得るように、その薬剤が抗体を検出可能に標識することを意味する。対象の検出可能な標識には、放射性同位体、検出可能な生成物を生成する酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光タンパク質、常磁性原子などが含まれる。特定の態様では、抗体は、検出可能な標識の特異的結合パートナーに接合される（例えば、アビジン／ストレプトアビジンを含む検出可能な標識を介して検出が起こり得るようにビオチンに接合される）。

【0112】

特定の実施形態において、薬剤は、限定されないが、近赤外（ＮＩＲ）光学イメージング、単光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）／ＣＴイメージング、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法などのｉｎ ｖｉｖｏイメージングに使用される標識剤である。このような用途に使用される標識剤としては、蛍光標識、放射性同位体などが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、標識剤は、２つ以上のイメージングアプローチを使用してｉｎ ｖｉｖｏイメージングを可能にするマルチモーダルｉｎ ｖｉｖｏ造影剤である。Ｔｈｏｒｐ－ＧｒｅｅｎｗｏｏｄおよびＣｏｏｇａｎ（２０１１）Ｄａｌｔｏｎ Ｔｒａｎｓ．４０：６１２９－６１４３を参照されたい。他の実施形態において、標識剤は、近赤外（ＮＩＲ）イメージング用途に使用されるｉｎ ｖｉｖｏ造影剤であり、この薬剤は、Ｋｏｄａｋ Ｘ－ＳＩＧＨＴ色素、Ｐｚ ２４７、ＤｙＬｉｇｈｔ ７５０および８００ Ｆｌｕｏｒｓ、Ｃｙ ５．５および７つの蛍光体、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０および７５０色素、ＩＲＤｙｅ ６８０および８００ＣＷ蛍光体から選択される。いくつかの実施形態では、標識剤は、ＳＰＥＣＴイメージング用途に使用されるｉｎ ｖｉｖｏ造影剤であり、この剤には、^９９ｍＴｃ、Ｉｎ－１１１、１２３－Ｉｎ、^２０１Ｔ１、および^１３３Ｘｅが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、標識剤は、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）イメージング用途に使用されるｉｎ ｖｉｖｏイメージング剤であり、その剤としては、^ＵＣ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^６４Ｃｕ、^６２Ｃｕ、^１２４Ｉ、^７６Ｂｒ、^８２Ｒｂ、^６８Ｇａが挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0113】

（ＶＩＩＩ．抗ＺＮＴ８抗体の作製方法）
本開示の抗ＺＮＴ８抗体（または抗体の抗原結合ドメインもしくはその機能的フラグメント）は、細菌細胞または真核細胞において産生され得る。対象のポリペプチドを産生するには、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構築し、発現ベクターに導入し、その後、適切な宿主細胞で発現させる。標準的な分子生物学技術を使用して、組換え発現ベクターの調製、宿主細胞のトランスフェクト、形質転換体の選択、宿主細胞の培養、および抗体の回収が行われる。

【0114】

抗体が細菌細胞（例えば、大腸菌）内で発現される場合、発現ベクターは細菌細胞内でのベクターの増幅を可能にする特性を有するべきである。加えて、ＪＭ１０９、ＤＨ５ａ、ＨＢ１０１、またはＸＬ Ｉ－Ｂｌｕｅなどの大腸菌を宿主として使用するとき、ベクターは、プロモーター、例えばｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら、３４１：５４４－５４６（１９８９）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１０４１－１０４３（１９８８））、または大腸菌における効率的な発現を可能にするＴ７プロモーターを有さなければならない。このようなベクターとしては、例えば、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ－Ｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ」（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＥＧＦＰ、およびｐＥＴ（この発現ベクターが使用されるとき、宿主は、好ましくはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現するＢＬ２１である）を含む。発現ベクターには、抗体分泌のためのシグナル配列が含まれ得る。大腸菌のペリプラズム内への産生のために、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６９：４３７９（１９８７））を抗体分泌のためのシグナル配列として使用され得る。細菌発現の場合、塩化カルシウム法またはエレクトロポレーション法を使用して発現ベクターを細菌細胞に導入し得る。

【0115】

抗体がＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、２９３Ｔ、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞などの動物細胞で発現される場合、発現ベクターには、これらの細胞での発現に必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２７７：１０８（１９７９））、ＭＭＬＶ－ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８：５３２２（１９９０））、またはＣＭＶプロモーターが含まれる。免疫グロブリンまたはそのドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能なマーカー遺伝子などの追加の配列を担持し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号明細書、第４，６３４，６６５号明細書および第５，１７９，０１７号明細書を参照）。例えば、通常、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を与える。選択マーカーを有するベクターの例には、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ－ＲＳＶ、ｐＢＫ－ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、およびｐＯＰ１３が含まれる。

【0116】

いくつかの実施形態では、抗体は哺乳類細胞内で産生される。ポリペプチドを発現するための例示的な哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７７：４２１６－４２２０に記載されている、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞、ＤＨＦＲ選択マーカー、例えば、Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１－６２１とともに使用される、を含む）、ヒト胎児腎臓２９３細胞（例えば、２９３、２９３Ｅ、２９３Ｔ）、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、リンパ球細胞株、例えば、ＮＳＯ骨髄腫細胞およびＳＰ２細胞、ならびにトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック哺乳動物、からの細胞が挙げられる。例えば、細胞は乳房上皮細胞である。

【0117】

本開示の抗体は、宿主細胞の内部または外部（培地など）から単離され得、実質的に純粋で均質な抗体として精製され得る。ポリペプチドに一般的に使用される単離および精製のための方法は、本明細書に記載される抗体の単離および精製のために使用され得、いかなる特定の方法にも限定されない。抗体は、例えば、カラムクロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、透析、再結晶等を適宜選択および組み合わせることによって単離および精製され得る。クロマトグラフィーには、例えば、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーが含まれる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９９６）。クロマトグラフィーは、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィーを用いて行われ得る。親和性クロマトグラフィーに使用されるカラムには、タンパク質Ａカラムおよびタンパク質Ｇカラムが含まれる。タンパク質Ａカラムを用いたカラムとしては、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）等が挙げられる。本開示には、これらの精製方法を使用して高度に精製された抗体も含まれる。

【0118】

本開示はまた、本明細書に開示される抗ＺＮＴ８抗体またはその抗原結合分子をコードする核酸分子または核酸分子のセットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗ＺＮＴ８抗体またはその抗原結合分子の軽鎖を含むポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗ＺＮＴ８抗体またはその抗原結合分子の重鎖を含むポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含む。

【0119】

また、そのような核酸分子または核酸分子のセットもしくはその相補体を含むベクターまたはベクターのセット、ならびにベクターを含む宿主細胞をも提供する。

【0120】

本開示はまた、本明細書に開示されるＺＮＴ８もしくはその抗原結合分子、またはキメラ分子を産生するための方法を提供し、そのような方法は、本明細書に開示される宿主細胞を培養し、培地から抗体、その抗原結合分子、またはキメラ分子を回収することを含む。

【0121】

本明細書に開示されるＺＮＴ８抗体もしくはその抗原結合分子、または本明細書に開示されるキメラ分子を組換え的に産生するために、様々な方法が利用可能である。コードの縮重のため、さまざまな核酸配列がポリペプチドのアミノ酸配列をコードすることが理解されるであろう。所望のポリヌクレオチドは、デノボ固相ＤＮＡ合成によって、または事前に調製されたポリヌクレオチドのＰＣＲ突然変異誘発によって生成され得る。

【0122】

組換え産生の場合、ポリペプチド（例えば、本明細書に開示されるＺＮＴ８抗体もしくはその抗原結合分子、または本明細書に開示されるキメラ分子のいずれか）をコードするポリヌクレオチド配列が、適切な発現媒体、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクター、またはＲＮＡウイルスベクターの場合、複製および翻訳に必要な要素を含むベクター、に挿入される。

【0123】

ポリペプチドをコードする核酸（例えば、本明細書に開示されるＺＮＴ８抗体もしくはその抗原結合分子、または本明細書に開示されるキメラ分子のいずれか）は、適切なリーディングフレームでベクターに挿入される。次いで、発現ベクターは、ポリペプチドを発現する適切な標的細胞にトランスフェクトされる。当技術分野で公知のトランスフェクション技術には、リン酸カルシウム沈殿（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７８，Ｃｅｌｌ １４：７２５）およびエレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎら、１９８２，ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１）が含まれるが、これらに限定されない。様々な宿主発現ベクター系を利用して、本明細書に記載のポリペプチド（例えば、本明細書に開示のＺＮＴ８抗体もしくはその抗原結合分子、または本明細書に開示のキメラ分子のいずれか）を真核細胞内で発現され得る。いくつかの実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞（例えば、２９３細胞、ＰｅｒＣ６、ＣＨＯ、ＢＨＫ、Ｃｏｓ、ＨｅＬａ細胞）を含む動物細胞である。ポリペプチドが真核細胞内で発現されるとき、ポリペプチドをコードするＤＮＡ（例えば、本明細書に開示されるＺＮＴ８抗体もしくはその抗原結合分子、または本明細書に開示されるキメラ分子のいずれか）はまた、ポリペプチドの分泌を可能にするシグナル配列をコードすることもできる。当業者は、ポリペプチドが翻訳される間にシグナル配列が細胞によって切断されて成熟キメラ分子を形成することを理解するであろう。様々なシグナル配列が当技術分野で知られており、当業者にはよく知られている。あるいは、シグナル配列が含まれないとき、ポリペプチド（例えば、本明細書に開示されるＺＮＴ８抗体もしくはその抗原結合分子、または本明細書に開示されるキメラ分子のいずれか）は、細胞を溶解することによって回収され得る。

【0124】

（ＩＸ．医薬組成物）
本開示はまた、（ｉ）本明細書に開示されるＺＮＴ８抗体またはその抗原結合分子、（ｉｉ）本明細書に開示されるＺＮＴ８抗体または抗原結合分子をコードする核酸分子または核酸分子のセット、または、（ｉｉｉ）本明細書に開示されるベクターまたはベクターのセット、および薬学的に許容される担体の１つ以上を含む医薬組成物を提供する。

【0125】

本明細書に記載の抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントは、例えば本明細書に記載の障害を治療するために対象に投与するための医薬組成物として製剤化され得る。通常、医薬組成物には、薬学的に許容される担体が含まれ得る。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合するあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。組成物は、薬学的に許容される塩、例えば、酸付加塩または塩基付加塩を含み得る（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら、（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１－１９を参照）。

【0126】

医薬製剤は十分に確立された技術であり、例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ（編），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）、Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）、およびＫｉｂｂｅ（編）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，第３版（２０００）（ＩＳＢＮ：０９１７３３０９６Ｘ）にさらに記載されている。

【0127】

医薬組成物は様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体、半固体、および固体の剤形、例えば、溶液（例えば、注射用および注入用溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸薬、粉末、リポソームおよび座薬が含まれる。好ましい形態は、意図される投与様式および治療用途に依存し得る。通常、本明細書に記載の薬剤の組成物は、注射可能または注入可能な溶液の形態である。

【0128】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体は、クエン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム七水和物、一塩基性リン酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、および安定剤などの賦形剤材料を用いて製剤化される。例えば、適切な濃度の緩衝溶液中で提供され得、２～８℃で保存され得る。いくつかの実施形態では、組成物のｐＨは、約５．５～７．５（例えば、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、および７．５）であり得る。

【0129】

医薬組成物はまた、製剤化された場合に抗体の凝集を減少させる薬剤を含み得る。凝集低減剤の例としては、メチオニン、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グリシン、およびグルタミン酸からなる群から選択される１つ以上のアミノ酸が挙げられる。これらのアミノ酸は、約０．５ｍＭ～約１４５ｍＭ（例えば、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２５ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ）の濃度で製剤に添加され得る。医薬組成物はまた、糖（例えば、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトール、またはキシリトール）および／または等張性調整剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、またはソルビトール）および／または界面活性剤（例えば、ポリソルベート－２０またはポリソルベート－８０）を含み得る。

【0130】

組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高濃度での安定した保存に適した他の規則構造として製剤化され得る。無菌の注射用溶液は、必要に応じて、上に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに、適切な溶媒中に必要な量の本明細書に記載の薬剤を組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。

【0131】

概して、分散液は、塩基性分散媒および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌媒体に本明細書に記載の薬剤を組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、本明細書に記載の薬剤の粉末および、事前に滅菌濾過したその溶液から任意の追加の所望の成分を加えた真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散の場合には必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持され得る。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。

【0132】

特定の実施形態では、抗体は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤などの急速な放出から化合物を保護する担体を用いて調製され得る。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用し得る。このような製剤を調製するための多くの方法は特許公開されているか、一般的に知られている。例えば、持続放出および制御放出薬物送達システム、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク（１９７８）を参照されたい。

【0133】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、約０．００５ｍｇ／ｍＬ～５００ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．００５ｍｇ／ｍＬ、０．０１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、８５ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、９５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１７５ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、３５０ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、４５０ｍｇ／ｍＬ、５００ｍｇ／ｍＬ）の濃度で、薬学的に許容される担体とともに配合された、抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は滅菌蒸留水またはリン酸緩衝生理食塩水中で製剤化される。医薬製剤のｐＨは、５．５～７．５（例えば、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．３、７．４、７．５）であり得る）。

【0134】

医薬組成物は、本明細書に記載の薬剤の「治療有効量」を含み得る。このような有効量は、投与される薬剤の効果、または複数の薬剤が使用される場合には薬剤の組み合わせ効果に基づいて決定され得る。薬剤の治療有効量はまた、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重などの要因、ならびに個体において所望の反応、例えば少なくとも１つの障害パラメーターの改善、または障害の少なくとも１つの症状の改善を誘発する化合物の能力によっても変化し得る。治療有効量はまた、組成物のあらゆる毒性または有害な効果を治療上有益な効果が上回る量である。

【0135】

本開示の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはそれをコードする核酸は、様々な方法によって対象、例えばそれを必要とする対象、例えばヒトまたは動物対象に投与することができる。多くの用途では、投与経路は静脈内注射または非経口、点滴（ＩＶ）、皮下注射（ＳＣ）、腹腔内（ＩＰ）、または筋肉内注射、腫瘍内（ＩＴ）のいずれかである。他の非経口投与方法も使用され得る。このようなモードの例には、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、および硬膜外および胸骨内注射が含まれる。

【0136】

いくつかの実施形態では、本発明の抗体の投与経路は非経口である。本明細書で使用される非経口という用語には、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸または膣内投与が含まれる。非経口投与の静脈内投与形態が好ましい。これらすべての投与形態は明らかに本発明の範囲内であると考えられるが、投与形態は注射用溶液、特に静脈内または動脈内注射または点滴用の溶液であろう。通常、注射に適した医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、必要に応じて安定化剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。本明細書の教示によれば、ポリペプチドを有害な細胞集団の部位に直接送達することができ、それにより、治療薬に対する罹患組織の曝露が増加する。

【0137】

非経口投与用の製剤には、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれる。非水溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、オレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。水性担体には、水、アルコール／水溶液、乳濁液または懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）が含まれる。

【0138】

薬学的に許容される担体には、０．０１～０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または０．８％の生理食塩水が含まれるが、これらに限定されない。他の一般的な非経口媒体には、リン酸ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖と塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内媒体には、液体および栄養補給剤、リンガーブドウ糖をベースにしたものなどの電解質補給剤などが含まれる。防腐剤および他の添加剤、例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、および不活性ガスなども存在し得る。

【0139】

より具体的には、注射用に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射液または分散液を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。このような場合、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に液体である必要がある。それは、製造および保管の条件下で安定であるべきであり、細菌や真菌などの微生物の汚染作用に対して保存されることが好ましい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散の場合には必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用によって維持され得る。

【0140】

微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらされ得る。

【0141】

いずれの場合でも、滅菌注射用溶液は、本明細書に列挙される成分の１つまたは組み合わせを有する適切な溶媒中に必要な量の活性化合物（例えば、ポリペプチド単独で、または他の活性剤と組み合わせて）を組み込み、必要に応じて、続いて濾過滅菌することによって調製され得る。

【0142】

概して、分散液は、基本的な分散媒および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌媒体に活性化合物を組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これによって、有効成分と事前に無菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分との粉末が得られる。注射用製剤は、当技術分野で知られている方法に従って処理され、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジまたはバイアルなどの容器に充填され、無菌条件下で密封される。さらに、製剤を包装し、キットの形態で販売することもできる。このような製品は、関連する組成物が凝固障害に罹患している、または凝固障害になりやすい対象の治療に有用であることを示すラベルまたは添付文書を有することが好ましい。

【0143】

状態の治療のための本開示の組成物の有効投与量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者が人間であるか動物であるか、投与される他の薬剤、および投与される薬剤を含む多くの異なる因子、および治療が予防的であるか治療的であるかにに応じて、変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物も治療することができる。治療投与量は、安全性および有効性を最適化するために、当業者に知られている日常的な方法を使用して滴定することができる。

【0144】

抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントの投与経路および／または投与様式は、例えば対象をモニタリングすることによって、個々の症例に合わせて調整することもできる。

【0145】

抗体またはそのフラグメントは、固定投与量として、またはｍｇ／ｋｇ用量で投与され得る。投与量はまた、抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントに対する抗体の産生を低減または回避するように選択することもできる。投与計画は、所望の反応、例えば、治療反応または併用療法効果を提供するように調整される。概して、対象に生体利用可能な量の薬剤を提供するために、抗体またはそのフラグメント（および場合により第二の薬剤）の投与量を使用し得る。例えば、０．１～１００ｍｇ／ｋｇ、０．５～１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、０．５～２０ｍｇ／ｋｇ、０．１～１０ｍｇ／ｋｇ、または１～１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量を投与し得る。他の投与量も使用され得る。特定の実施形態では、抗体またはそのフラグメントによる治療を必要とする対象に、抗体またはそのフラグメントを約１ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。いくつかの実施形態では、抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントによる治療を必要とする対象に、抗体またはそのフラグメントを１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、２８ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、３５ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇの投与量で投与する。特定の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、１ｍｇ／ｋｇ～３ｍｇ／ｋｇの投与量で皮下投与される。別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、４ｍｇ／ｋｇ～３０ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与される。

【0146】

組成物は、約１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、または約１０ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ、または約５０～２５０ｍｇ／ｍＬ、または約１００～１５０ｍｇ／ｍＬ、または約１００～２５０ｍｇ／ｍＬの、抗体またはそのフラグメントを含み得る。

【0147】

本明細書で使用される投与単位形態または「固定投与量」とは、治療される対象に対する単位投与量として適した物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要な医薬担体と関連して、および場合により他の薬剤と関連して、所望の治療効果を生み出すように計算された所定量の抗体またはそのフラグメントを含む。単回または複数回の投与量を与えてもよい。あるいは、またはそれに加えて、抗体またはそのフラグメントは、持続注入によって投与されてもよい。

【0148】

抗体またはそのフラグメントの用量は、十分な期間（治療コース）にわたって、例えば少なくとも２回、３回、５回、１０回以上、例えば１日１回または２回、または１週間に約１～４回、または好ましくは週単位で、隔週（２週間ごと）、３週間ごと、月単位で、例えば約１～１２週間、好ましくは２～８週間、より好ましくは約３～７週間、さらにより好ましくは約４、５、または６週間を包含する、定期的な間隔で、投与され得る。対象を効果的に治療するために必要な投与量およびタイミングに影響を与え得る要因としては、例えば、疾患または障害の段階または重症度、製剤、送達経路、以前の治療、対象の一般的な健康状態および／または年齢、および他の病気が存在する。さらに、治療有効量の化合物による対象の治療は、単一の治療を含み得、または好ましくは一連の治療を含み得る。

【0149】

対象が本明細書に記載の障害を発症するリスクがある場合、抗体またはそのフラグメントは、例えば予防措置として、障害が完全に発症する前に投与することができる。このような予防的治療の期間は、抗体またはそのフラグメントの単回投与であってもよく、または治療は継続してもよい（例えば、複数回の投与）。例えば、障害のリスクがある対象、または障害の素因を有する対象を、障害の発生または劇症化を防ぐために、抗体またはそのフラグメントで数日、数週間、数ヶ月、さらには数年間治療することができる。

【0150】

特定の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、約１ｍｇ／ｍＬ～約５００ｍｇ／ｍＬ（例：１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、４５ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、５５ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、６５ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、８５ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、９５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１７５ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２２５ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬ、２７５ｍｇ／ｍＬ、３００ｍｇ／ｍＬ、３２５ｍｇ／ｍＬ、３５０ｍｇ／ｍＬ、４００ｍｇ／ｍＬ、４５０ｍｇ／ｍＬ）の濃度で皮下投与される。いくつかの実施形態では、抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントは、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で皮下投与される。別の実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、約１ｍｇ／ｍＬ～約５００ｍｇ／ｍＬの濃度で静脈内投与される。いくつかの実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、５０ｍｇ／ｍＬの濃度で静脈内投与される。

【0151】

上記範囲の中間の投与量も本発明の範囲内であることが意図される。対象には、そのような用量を毎日、隔日、毎週、または経験的分析によって決定された任意の他のスケジュールに従って投与することができる。例示的な治療は、長期間、例えば少なくとも６ヶ月にわたる複数回投与を必要とする。いくつかの方法では、２つ以上のポリペプチドを同時に投与することができ、その場合、各ポリペプチドの投与量は、示された範囲内に入る。

【0152】

本発明のポリペプチドは複数回投与することができる。単回投与の間隔は、毎日、毎週、毎月、または毎年であり得る。患者の修飾ポリペプチドまたは抗原の血中濃度を測定することによって示されるように、間隔は不規則であり得る。あるいは、ポリペプチドを徐放性製剤として投与することもでき、この場合、必要な投与量および頻度は少なくて済む。投与量と頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期に応じて異なる。

【0153】

投与量および頻度は、治療が予防的であるか治療的であるかによって異なる。予防的用途では、本発明のポリペプチドまたはそのカクテルを含む組成物を、まだ疾患状態にない患者に投与して、患者の抵抗力を強化するか疾患の影響を最小限に抑える。このような量は「予防的有効投与量」として定義される。比較的低投与量を、長期間にわたって比較的低頻度の間隔で投与する。患者の中には生涯治療を受け続ける人もいる。

【0154】

（Ｘ．治療用の機器およびキット）
抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントは、キットとして提供され得る。いくつかの実施形態では、キットは、（ａ）本明細書に記載の抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントを含む組成物を含む容器、および必要に応じて（ｂ）情報資料を含む。情報資料は、本明細書に記載される方法および／または治療効果のための薬剤の使用に関連する、説明、指導、マーケティング、または他の資料であり得る。

【0155】

特定の実施形態では、キットは、本明細書に記載の障害、すなわち、ＺｎＴ８によって媒介されるか、またはＺｎＴ８に関連する疾患または状態（例えば、１型または２型糖尿病）を治療するための第２の薬剤も含む。例えば、キットは、抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントを含む組成物を含有する第１の容器と第２の薬剤を含有する第２の容器とを含む。

【0156】

いくつかの実施形態では、キットはまた、造影剤などの第２の薬剤も含む。例えば、キットは、抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントを含む組成物を含有する第１の容器と第２の薬剤を含む第２の容器とを含有する。

【0157】

キットの情報資料の形式は限定されない。いくつかの実施形態では、情報資料には、化合物の製造、化合物の分子量、濃度、有効期限、バッチまたは製造場所の情報などに関する情報が含まれ得る。いくつかの実施形態では、情報資料は、本明細書に記載の疾患に罹患したことのある対象、または疾患のリスクがある対象を治療するために、抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントを、例えば、適切な投与量、剤形、または投与様式（例えば、本明細書に記載される投与量、剤形、または投与様式）で投与する方法に関する）、投与方法に関する。情報は、印刷されたテキスト、コンピュータ可読資料、ビデオ録画、音声録画、またはインターネットなどの実体資料へのリンクやアドレスを提供する情報など、さまざまな形式で提供され得る。

【0158】

抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントに加えて、キット内の組成物には、溶媒または緩衝剤、安定剤、または保存剤などの他の成分が含まれ得る。抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントは、任意の形態、例えば、液体、乾燥形態または凍結乾燥形態で提供され得、好ましくは実質的に純粋および／または無菌である。薬剤が溶液中で提供される場合、溶液は好ましくは水溶液である。特定の実施形態では、溶液中の抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントは、約２５ｍｇ／ｍＬ～約２５０ｍｇ／ｍＬ（例えば、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７５ｍｇ／ｍＬ、８５ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２５ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、および２００ｍｇ／ｍＬ）の濃度であり得る。抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントが凍結乾燥製品として提供される場合、抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントは、約７５ｍｇ／ｖｉａｌ～約２００ｍｇ／ｖｉａｌ（例えば、１００ｍｇ／ｖｉａｌ、１０８．５ｍｇ／ｖｉａｌ、１２５ｍｇ／ｖｉａｌ、１５０ｍｇ／ｖｉａｌ）である。凍結乾燥粉末は概して、適切な溶媒を添加することによって復元される。溶媒（例えば、滅菌水または緩衝液（例えば、ＰＢＳ））は、必要に応じてキットに含まれ得る。

【0159】

キットは、薬剤を含む組成物または複数の組成物のための１つ以上の容器を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、組成物および情報資料用の別個の容器、仕切りまたは区画を含有する。例えば、組成物はボトル、バイアル、または注射器に入れられ得、情報資料はプラスチックのスリーブまたはパケットに入れ得る。いくつかの実施形態では、キットの別個の要素は、単一の分割されていない容器内に含まれる。例えば、組成物は、ラベルの形態の情報資料が取り付けられたボトル、バイアル、または注射器に収容される。いくつかの実施形態では、キットは、複数（例えば、パック）の個別の容器を含み、各々の容器は、薬剤の１つ以上の単位剤形（例えば、本明細書に記載される剤形）を含む。容器は、組み合わせ単位投与量、例えば、抗ＺＮＴ８抗体またはそのフラグメントと第２の薬剤の両方を、例えば所望の比率で含む単位を含み得る。例えば、キットは、複数の注射器、アンプル、ホイルパケット、ブリスターパック、または医療器具を含み、例えば、各々が単一の組み合わせ単位投与量を含む。キットの容器は、気密性、防水性（例えば、湿気の変化または蒸発に対して不透過性）、および／または遮光性であり得る。

【0160】

キットは必要に応じて、組成物の投与に適した装置、例えば注射器または他の適切な送達装置を含む。デバイスには、エージェントの一方または両方を事前にロードした状態で提供することも、空の状態でも搭載に適した状態で提供することもできる。

【0161】

さらに詳しく説明することなく、当業者であれば、上記の説明を用いて、本発明を最大限に利用できると考えられる。実施例は単なる例示であり、いかなる形であっても本開示の残りの部分を限定するものではない。

【実施例】

【0162】

下記の実施例は、本明細書に記載され特許請求されている化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法がどのように作製および評価されているかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、これらは単に例示的なものであることを意図し、発明者らが発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。数値（例えば、量、温度など）の正確性を確保するために努力が払われているが、ここでは多少の誤差や偏差を考慮する必要がある。別段の指示がない限り、部は重量部であり、温度は摂氏度または周囲温度であり、圧力は大気圧または大気圧に近いものである。記載されたプロセスから得られる生成物の純度および収率を最適化するために使用され得る、反応条件、例えば、成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、および他の反応範囲および条件には、多数のバリエーションおよび組み合わせが存在する。このようなプロセス条件を最適化するには、合理的かつ日常的な実験のみが必要である。

【0163】

（実施例１：ｍＡｂ４３の生成および特性評価）
（材料および方法）
（動物）ＮＯＤ、Ｃ５７ＢＬ／６、およびＭＩＰ－ＧＦＰマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入し、ＺｎＴ８－ＫＯマウスをＴａｃｏｎｉｃから購入した。マウスを１２時間の明／１２時間の暗サイクルで飼育し、水および標準的なげっ歯類の餌を自由に摂取できる病原体のないバリア施設内の滅菌容器内の集団飼育で維持した。すべての動物手順は、ジョンズ・ホプキンス大学医学部の施設内動物管理使用委員会およびコロラド大学バーバラ・デイビス糖尿病センターによって承認された。

【0164】

（ヒトＺｎＴ８抗原の生成とプロテオリポソームの再構成）ヒトＺｎＴ８アイソフォーム－２ｃＤＮＡ（ＮＭ＿００１１７２８１４．１）を、Ｃ末端Ｈｉｓタグを有する哺乳類ｐＣＭＶ６ベースの発現ベクターにサブクローニングした［１６］。発現プラスミドをＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３－Ｆ細胞に導入し、メーカーの指示に従って無血清培地の懸濁培養で一過的に発現させた。ヒトＣＴＤ－Ｈｉｓは、ＺｎＴ８－Ｈｉｓ構築物からＴＭＤ配列全体を除去するためにＮ末端欠失によって構築され、上記のように２９３－Ｆ細胞で一時的に発現した。ＺｎＴ８－ＨｉｓまたはＣＴＤ－Ｈｉｓを発現する細胞をトランスフェクションの１８時間後に採取し、マイクロフルイダイザーを使用してホモジナイズした。細胞膜を超遠心分離によってサイトゾル画分から分離した。膜結合ＺｎＴ８－Ｈｉｓは、以前に記載されているように界面活性剤抽出および精製された［１６］。精製されたＺｎＴ８－Ｈｉｓを、１／２０（ｗｔ／ｗｔ）のＺｎＴ８／脂質の比で、２：１：１の比のＤＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＤＯＰＧで構成されるプロテオリポソームに再構成した。リピドＡ助剤を、総脂質含量の１０％の濃度まで再構成脂質混合物に添加した。プロテオリポソーム内で再構成されたＺｎＴ８－Ｈｉｓは機能的に活性なままであり、洗剤によって再可溶化されてサイジングＨＰＬＣで単分散種を形成し得る［２６］。リポソームを、脂質再構成混合物にＺｎＴ８－Ｈｉｓを添加することなく、プロテオリポソームと並行して調製した。

【0165】

（マウスの免疫化およびｍＡｂ４３の生成）４対の７週齢雄／雌ホモ接合性ＺｎＴ８－ＫＯマウスをプロテオリポソーム免疫化に使用し、１対の雄／雌同腹子をリポソーム免疫化に使用した。１０週齢の５匹のＮＯＤ雌をプロテオリポソーム免疫に使用し、３匹のＮＯＤ雌同腹子をリポソーム免疫に使用した。各マウスに、プロテオリポソームエマルジョン中の５０～６０μｇの精製ＺｎＴ８、または等量のリポソームエマルジョン（１００μｌ）を毎週腹腔内注射した。注射の３週間後に頤下出血を採取し、比較ＺｎＴ８およびＣＴＤ ＥＬＩＳＡによる血清抗体力価測定に使用した。すべてのマウスを注射後５週間で安楽死させた。流入リンパ節および脾臓を収集し、電気融合によってハイブリドーマ融合体を生成した。融合細胞をＨＡＴで選択し、半固体ＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）－ＨＹ培地Ｄでクローン化し、比較ＥＬＩＳＡによるｍＡｂスクリーニングのために９６ウェルプレートの培地Ｅで増殖させた（下記を参照）。大規模なｍＡｂ生産のために、１２個の陽性クローンをＡＯＦ培地で増殖させた。細胞培養グレードのｍＡｂは、ＰＢＳ中でのサイズ排除ＨＰＬＣ精製によって生成され、ヒトＺｎＴ８－ＧＦＰを安定的に発現するＩＮＳ－１Ｅ細胞の表面上のＺｎＴ８結合に基づく生細胞スクリーニングに使用された［１１］。ハイブリドーマ細胞内のｍＡｂ４３転写産物の可変領域の配列を決定し、ヒトシグナルペプチド、カッパおよびガンマ定常領域を保持する哺乳動物のバイシストロニックＩＲＥＳ発現ベクター（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ、ｐＩＲＥＳ Ｖｅｃｔｏｒ、Ａｄｄｇｅｎｅ、ｐＶＩＴＲＯ１－ｄＶ－ＩｇＧ１／κ；ｐＶＩＴＲＯ１－トラスツズマブ－ＩｇＧ２／κ、ｐＶＩＴＲＯ１－トラスツズマブ－ＩｇＧ３／κ、ｐＶＩＴＲＯ１－トラスツズマブ－ＩｇＧ４／κ）にサブクローニングした。さまざまなＩｇＧアイソタイプの組換えｍＡｂ４３コンストラクトを２９３－Ｆ細胞で一時的に発現させた後、精製し、蛍光サイズ排除ＨＰＬＣでの安定なｍＡｂ４３－ＺｎＴ８－ＧＦＰ複合体の形成に基づいてＺｎＴ８結合について検証した。

【0166】

（ＥＬＩＳＡの比較）プロテオリポソームベースのＥＬＩＳＡの場合、１００μｌのＰＢＳで希釈した４μｇのプロテオリポソーム（重量で５％のヒトＺｎＴ８－Ｈｉｓを含む）を高結合９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、４℃で一晩インキュベートした。受動的に固定化されたプロテオリポソームを５％ＢＳＡでブロックし、ハイブリドーマ培養上清でテストした。溶液ベースのＥＬＩＳＡでは、ヒトＺｎＴ８－ＨｉｓまたはＣＴＤ－Ｈｉｓを発現する２９３－Ｆ細胞をマイクロフルイダイザーを使用して機械的に溶解し、超遠心分離によって細胞残骸を除去した。次いで、界面活性剤で可溶化した細胞膜からの０．２μｇのヒトＺｎＴ８－Ｈｉｓ、または１００μｌのＰＢＳ中の細胞溶解物からの０．１μｇのＣＴＤ－Ｈｉｓを、Ｃ末端Ｈｉｓタグを介してニッケルコート９６ウェルプレートの各ウェルに固定化した。固定化されたタンパク質を５％のＢＳＡでブロックし、その後３倍連続希釈のマウス血清またはハイブリドーマ培養上清でテストした。結合した血清抗体は、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ－３マイクロプレートリーダー上のＨＲＰ接合ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（１：３０００）によって検出した。

【0167】

（免疫蛍光標識および画像分析）Ｅｎｄｏｃ－βＨ１細胞を、βコートで予めコーティングされたガラス底マイクロウェルディッシュに播種し、ＯＰＴＩ細胞培養培地中、３７℃、５％の、ＣＯ２加湿雰囲気下で２日間増殖させた。細胞表面のＩＦ標識では、生細胞を高グルコース（２０ｍＭ）Ｋｒｅｂｓ緩衝液で洗浄し、８℃で３０分間冷却した後、ｍＡｂ４３（１：１００）、ｍＡｂ２０（１：１００）、抗ＣＤ７１（１：５０）または抗Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ（１：５０）抗体に曝露した。８℃で１時間インキュベートした後、高グルコースＫｒｅｂｓ緩衝液を使用して２回洗浄することによって、未結合の抗体を除去した。次に、細胞を蛍光抗ＩｇＧ二次抗体（１：４００）に０．５時間曝露し、未結合の二次抗体を洗浄して除去した後、６３倍の油対物レンズを有する、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００倒立共焦点顕微鏡での蛍光イメージングのためにＤＡＰＩ／ＤＣＶを培地に添加した。細胞内ＩＦ標識の場合、生細胞を高グルコース（２０ｍＭ）Ｋｒｅｂｓ緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリー固定緩衝液を使用してＲＴで２０分間固定し、ＰＢＳを使用して再度洗浄し、フローサイトメトリー透過化緩衝液でＲＴで２０分間透過処理し、ＰＢＳ＋５％ＢＳＡに３０分間曝露した後、ｍＡｂ４３（１：１０００）、ｍＡｂ２０（１：１０００）、抗ＣＤ７１（１：２００）または抗Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ（１：２００）抗体に室温で２時間暴露した。二次抗体免疫標識、ＤＡＰＩ対比染色および免疫蛍光イメージングを、上記と同じ手順を使用して実行した。野生型ＩＮＳ－１Ｅ細胞またはＺｎＴ８－ＫＯ ＩＮＳ－１Ｅ細胞［１３］を用いた実験では、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウムおよび５０μＭのβ－ＭＥを供給したＲＭＰＩ １６４０培地で細胞を増殖させた。免疫蛍光標識およびイメージングは上記と同じ手順に従った。Ｅｎｄｏｃ－βＨ１細胞における抗体内部移行のために、最初にｍＡｂ４３（１：１００）およびＮＴＰＤａｓｅ３（１：１００）をそれぞれＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ－６４７（１：２００）およびＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ－４８８二次抗体（１：２００）と共インキュベートした。蛍光抗体複合体を形成するために、ＩＦイメージングの前に、Ｅｎｄｏｃ－βＨ１生細胞に３７℃で１時間添加した。

【0168】

（免疫組織化学）切除したマウス膵臓を４％のＰＦＡ中に４℃で４時間固定し、処理してからパラフィンに包埋した。組織切片（４μｍ）を脱脂および再水和し、１時間ブロックした後、ユニバーサル抗体希釈緩衝液中で１：５０のキメラｍＡｂ４３またはキメラｍＡｂ２０と４℃で１６時間インキュベートし、その後３７℃で３０分間、二次ビオチン化抗ヒトＩｇＧ抗体（１：４００）で、その後アビジンビオチン化ペルオキシダーゼ複合体で３７℃で３０分間処理した。次に、ジアミノベンジジン基質を適用して、最適な染色強度を開発した。比色反応は、ｄＨ２Ｏで洗浄することによって停止させた。次に、膵臓切片をエオシンで対比染色し、脱水し、イメージング用にキシレン互換封入剤で封入した。

【0169】

（蛍光サイズ排除ＨＰＬＣ分析）ＺｎＴ８－ＧＦＰまたはＺｎＴ８ＦＬＡＧ－ＧＦＰを発現する約３×１０６個の安定にトランスフェクトされたＩＮＳ－１Ｅ細胞を、２００μｌのアッセイ緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）＋０．５％ＤＤＭを使用して可溶化した。ＺｎＴ８－ＧＦＰまたはＺｎＴ８ＦＬＡＧ－ＧＦＰを含む界面活性剤粗抽出物をサイズ排除ＴＳＫ ＨＰＬＣカラムに注射し、蛍光検出器（４８８／５１０ｎｍ）を使用してＧＦＰ蛍光をモニタリングした。ＺｎＴ８－ＧＦＰを単分散ピーク画分として収集した。次に、ＨＰＬＣで単離したＺｎＴ８－ＧＦＰまたはＺｎＴ８ＦＬＡＧ－ＧＦＰをｍＡｂ４３、ｍＡｂ２０、または抗ＦＬＡＧ抗体とともに氷上で１時間インキュベートし、その後ＨＰＬＣカラムに再注射した。ＺｎＴ８抗体複合体をイムノブロッティング分析用に収集し、結合複合体中のＺｎＴ８および抗体の両方の存在を検証した。

【0170】

（ＺｎＴ８－Ｆａｂ４３の精製およびＥＭ単一部分分析）ｍＡｂ４３を、無血清ＡＯＦ培地で３週間増殖させたハイブリドーマ細胞によって生成し、タンパク質Ａ／Ｇビーズによって捕捉し、ＩｇＧ溶出緩衝液によって溶出し、メーカーのプロトコルに従ってＰｉｅｒｃｅｒｓ Ｆａｂ調製キットを使用してＦａｂ生成のために約２０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。精製したＦａｂ４３を、再構成プロテオリポソーム中の精製ＺｎＴ８と５：１のモル比および１％ＤＤＭで混合し、脂質に富んだ界面活性剤溶液中にＦａｂ４３－ＺｎＴ８を可溶化した。Ｆａｂ４３－ＺｎＴ８複合体を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１００ｍＭ ＮａＣｌ中０．０５％ＤＤＭ、ｐＨ＝７．０で平衡化したＴＳＫサイズ排除ＨＰＬＣカラムを通して精製した。ＨＰＬＣ脱脂を３回実行した後、ＺｎＴ８－Ｆａｂ複合体が単分散溶出ピークとして収集された。精製タンパク質サンプルを２０μｇ／ｍｌに希釈し、３μｌの希釈サンプルのアリコートを、連続的な薄い炭素膜で覆われたグロー放電ＥＭグリッド上に適用し、２％ギ酸ウラニル水溶液で０．５分間染色した。１２０ｋＶの高圧で動作するＴｅｃｎａｉ Ｓｐｉｒｉｔ電子顕微鏡にグリッドを装着した。電子顕微鏡写真は、Ｇａｔａｎ Ｏｒｉｕｓ ＣＣＤカメラを使用し、アンダーフォーカス値が１～２．５μｍの範囲で、標本レベル２．３オングストローム／ピクセルに相当する、倍率３０，０００倍の低線量モード（１０ｅ－／オングストローム）で記録された。合計９２枚の顕微鏡写真を収集し、各画像のコントラスト伝達関数パラメーターをＣＴＦＦＩＮＤ４．１．１０によって決定した。顕微鏡写真から１２，７７８個の粒子を抽出した。ＲＥＬＩＯＮ３．０で２Ｄ分類し、ｃｒｙｏＳＰＡＲＣ３．１で３Ｄ分類した後、９，２１６個の粒子画像を３Ｄ再構成のために保存した。ｃｒｙｏＳＰＡＲＣ３．１を使用して３Ｄリファインメントを実行し、推定解像度１．５ｎｍの３Ｄ ＥＭマップを得た。本発明者らは、Ｆａｂ構造（ＰＤＢ １Ｍ７１）、ヒトＺｎＴ８の低温ＥＭ構造（ＰＤＢ ６ＸＰＤ）、および剛体ドッキングを使用して、成分構造をＺｎＴ８－Ｆａｂ４３複合体のＥＭマップに適合させた。

【0171】

（組織の分散と膵臓細胞の標識）Ｃ５７ＢＬ／６マウスから切除した膵臓を小片に切断し、細かく刻み、７０μｍストレーナー上でＨＢＳＳで洗浄して造血細胞を除去した。洗浄した組織ペレットをアキュターゼに再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＣＶを添加して生細胞のＤＮＡを染色した。分散した細胞を、１２００ｒｐｍで２分間穏やかに回転させることによって、ストレーナーを通して濾過した。残りの組織ペレットは、完全な細胞分散を達成するために、アキュターゼ消化と細胞濾過の追加サイクルを受けた。分散した細胞をプールし、ＤＮａｓｅおよびトリプシン／キモトリプシン阻害剤を含む冷細胞培養培地で洗浄した。この時点で、トリパンブルー排除法で測定した細胞生存率は通常８０％以上であった。分散した細胞をフローサイトメトリーチューブ内で細胞密度１０６／１００μｌに調整し、キメラｍＡｂ４３（１ｍｇ／ｍｌの１０６細胞／１μＬのｍＡｂ４３ストック）とともに氷上で１時間インキュベートし、その後、次いで、氷上で１時間、抗ヒトＩｇＧ二次抗体（１ｍｇ／ｍｌの１０６細胞／１μＬの抗体ストック）とＰＥ接合させた。キメラｍＡｂ２０をアイソタイプ対照として使用した。

【0172】

（蛍光活性化細胞選別および共焦点顕微鏡分析）標識した膵臓細胞を、４０５および５６１ｎｍレーザーを備えたＭｏＦｌｏ ＸＤＰセルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）ですぐに分析および分類した。データを、前方散乱光、側方散乱光、および４４０ｎｍおよび５７８ｎｍの蛍光チャネルで収集した。前方散乱と側方散乱でゲートした細胞によって、１００万を超える単一細胞計数イベントが得られた。Ｒ０またはＲ１ゲートで選別した細胞を、穏やかな遠心分離（１２００ｒｐｍ、１分）によってマイクロウェルディッシュのガラス底に堆積させた。マトリゲル（１：１００）でコーティングした表面に細胞を付着させた後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで２０分間固定し、その後透過処理した。細胞内標識は、キメラｍＡｂ４３を含む２％ＢＳＡを含む透過化緩衝液中で実行され、続いて抗ヒトＩｇＧ－ＰＥ、抗インスリンＡＰＣ、および抗グルカゴンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８で標識した。洗浄および核ＤＡＰＩ対比染色後、免疫蛍光画像は、上記のようにＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７００を使用して取得した。

【0173】

（マウスにおけるｍＡｂ生体内分布のウエスタンブロット分析）。１０～１１週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、キメラｍＡｂ４３またはキメラｍＡｂ２０を５ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内または腹腔内投与した。注射から１～６日後、マウスを安楽死させ、さまざまな臓器から組織を切除し、ストレーナー上で簡易に回転させて乾燥させ、重量を量り、ＤＮａｓｅおよびプロテアーゼ阻害剤を含むＰＢＳ中でホモジナイズした。組織懸濁液を４Ｘ ＳＤＳ－ＰＡＧＥサンプリング緩衝液に５０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。各組織内のキメラｍＡｂ４３またはキメラｍＡｂ２０を、抗ヒトＩｇＧイムノブロッティングによって検出し、同じブロット上でヒトＩｇＧ標準の段階希釈を使用して定量した。組織取り込みを、組織重量と総投与量で補正した。保持された抗体の量は、収集した各組織のグラム当たりの注射されたｍＡｂのパーセンテージとして計算された（％ｍＡｂ注射／ｇ）。

【0174】

（平らなホールマウント膵臓の準備）１０～１１週齢の雄／雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔ、ｍＡｂ２０－ｍＳｃａｒｌｅｔ、またはＰＢＳを５ｍｇ／ｋｇの投与量で静脈内投与した。注射の１日後、マウスを安楽死させ、膵臓全体を切除し、一対の顕微鏡スライドの間に置き、ガラスサンドイッチの上に重りを置いて平らにし、４％ＰＦＡで２時間固定した。次に、部分的に固定した膵臓をガラスサンドイッチから取り出し、さらに４時間固定した。次に、固定した膵臓を飽和スクロースに約４８時間移し、次に１００％グリセロールに一晩移した。組織の平坦化から光学的透明化までの全手順を、組織の劣化を最小限に抑えるためにコールドルーム（８℃）で実行した。β細胞免疫標識のために、平らにしてＰＦＡで固定した膵臓を、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ ＰＢＳ＋２％ＢＳＡに一晩移した。次に、膵臓を、０．２％ＢＳＡを含む０．１％トリトンＸ－１００中の抗インスリン－ＡＰＣ（１：５０）とともに１２時間インキュベートし、洗浄し、上記のように光学的透明化に供した。透明なホールマウント膵臓を顕微鏡スライドとカバースリップの間に置き、次にカバースリップをフルオロゲルで密封しながら、重いおもりを使用して再び平らにした。１０週齢の雄／雌ＭＩＰ－ＧＦＰマウスのペアに、ｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔを３倍量（１５ｍｇ／ｋｇ）で腹腔内投与した。注射の３日後、膵臓を切除し、上記のようにＰＦＡ固定および光学的透明化を行った。

【0175】

（ホールマウント膵臓のイメージングおよびデータ分析）ホールマウント膵臓の画像を、４ｘ／０．２ ＰｌａｎＡｐｏ対物レンズを備えたＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏハイコンテンツ分析システムで取得した。ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓソフトウェアによって制御されるレーザーオートフォーカスはガラス表面（２０ｍｍＷ．Ｄ．）に固定され、１７ｘ１０μｍのＺスタック（組織厚さ約０．２ｍｍ）の３Ｄ再構成からの最大投影によって、それぞれＧＦＰ、ｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔおよびインスリンＡＰＣの蛍光用のＧＦＰ（４８８ｎｍ）、ローダミン（５８５ｎｍ）、およびＣｙ５（６９２ｎｍ）フィルターセットを使用した１６ビット平面解像度、３ログ強度範囲、Ｌｕｍｅｎｃｏｒ ＳＯＬＡ固体蛍光光源からの３色の各位置の２Ｄ投影画像が得られた。透過光走査を同時に記録して、明視野画像を生成した。各蛍光チャネルの露光時間（１００～２００ｍｓ）を、ＰＢＳまたはｍＡｂ２０－ｍＳｃａｒｌｅｔ注射を与えたマウスからの膵臓の自己蛍光を示すのにちょうど十分な露光となるように選択した。電動ステージ上でホールマウント膵臓をタイル状にスキャンすると、画像のグリッドが生成され、Ｆｉｊｉステッチングプラグインを使用してこれらの画像が結合され、統合画像が生成された。平らにした膵臓の標本と光学的透明化によって、均一な自己蛍光バックグラウンドが得られた。単一のバックグラウンド蛍光レベルが各蛍光チャネルについて測定され、画像全体にわたって数値的に減算され、さらに変更を加えずにＩｍａｇｅＪによって表示された。マンダーのオーバーラップ係数は、バックグラウンド補正なしでＧＦＰおよびｍＳｃａｒｌｅｔ蛍光の自動閾値を超えるすべてのピクセルを使用して、膵臓全体にわたって計算された。

【0176】

（マウス膵島の調製とイメージング）マウスの膵臓は、肝臓近くの胆管束を縫合して閉じながら、乳頭で十二指腸に付着した胆管にカニューレを挿入することによって、５ｍｌの事前に冷却したコラゲナーゼＰ（１ｍｇ／ｍｌ）で灌流した［４４］。完全に膨張した膵臓を切除し、３７℃で７分間消化し、Ｇ溶液（ＨＢＳＳプラス０．３５ｇ／ＬのＮａＨＣＯ３および１％ＢＳＡ）で洗浄し、メッシュで濾過し、１２００ｒｐｍで２分間ペレット化した。ペレットを１５ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １１００［４５］に再懸濁し、１２００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって膵島を組織破片から分離した。上層を収集し、２５ｍｌのＧ溶液で希釈し、その後、膵島を１５００ｒｐｍで４分間、２回洗浄しながらペレット化した。ペレットを膵島培養培地（ＲＰＭＩ １６４０プラス２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン）に再懸濁した。健康な膵島を、ガラス底マイクロウェルディッシュ内の２０ｍＭグルコースを補充した新鮮な培地に採取した。ｍＡｂ４３－ｍＳｃａｌｅｔまたはｍＡｂ２０－ｍＳｃａｌｅｔを膵島培養培地に最終濃度０．０１ｍｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃のＣＯ２インキュベーターで２時間インキュベートし、ＨＢＳＳ緩衝液で１回洗浄し、膵臓のホールマウントイメージングに使用されるガラスサンドイッチ（約０．４ｍｍ間隔）に搭載した。膵島イメージャーを、上記のように、膵臓ホールマウントイメージングと同じ設定を使用して、ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏハイコンテンツ分析システムにおいて室温で取得した。

【0177】

（統計分析）すべての値は、平均値±平均値の標準誤差として表される。両側スチューデントのｔ検定は、グループを比較するために使用される。図中に示される重要性は＊で示され、Ｐ＜０．０１である。

【0178】

（実施例２：抗ＴＭＤ抗体の誘導および生化学的特性評価）
ＺｎＴ８の高度に保存したエピトープに対する抗体の産生の原因となるリンパ球は、リンパ球が自己抗原を攻撃するのを防ぐ自己寛容の発達中に排除され得る。この支障を克服するために、ヒトＺｎＴ８に対する抗体応答を誘発するために、（１）免疫学的に無傷なマウスにおけるネガティブ選択を回避するためにＺｎＴ８遺伝子を欠失すること、および（２）免疫寛容に欠陥のある免疫学的に構成したマウスにおけるＺｎＴ８に対する自己反応性を刺激することの、２つの異なる免疫化戦略を使用した。したがって、本発明者らは、自然発生的な自己免疫性糖尿病を発症しやすいＺｎＴ８－ＫＯマウスおよび非肥満糖尿病（ＮＯＤ）雌マウスを免疫した。血液循環に注射した後のＺｎＴ８抗原の本来のフォールディングを保存するために、本発明者らは、リポソーム再構成ＺｎＴ８製剤を開発した［１４、１６］。ＺｎＴ８は、膜貫通型ドメイン（ＴＭＤ）およびサイトゾルＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）からなる２モジュール式タンパク質である（図１Ａ）。ＴＭＤの天然のフォールディングにはＣＴＤの存在が必要であるため、ＴＭＤに対するマウス抗体応答を、全長ＺｎＴ８（ｆｌＺｎＴ８）およびそのＣＴＤに対する比較ＥＬＩＳＡによって調べた。両方のマウス系統は、対照として空のリポソーム注射を受けたマウスのバックグラウンドレベルを上回る強力な抗ｆｌＺｎＴ８（ＴＭＤ＋ＣＴＤ）および抗ＣＴＤ応答を示した。ＺｎＴ８－ＫＯマウスは、ｆｌＺｎＴ８およびＣＴＤに対する血清滴定に差を示さず、これはすべての血清抗体がＣＴＤに向けられたことを示唆している（図１Ｃ）。比較すると、ＮＯＤマウスは、より低い血清希釈でｆｌＺｎＴ８に対する有意に高い血清反応性を示し（図１Ｄ）、プロテオリポソームを注射したＮＯＤマウスにはＣＴＤ反応性に加えて抗ＴＭＤ反応性が存在することが示唆された。次に、本発明者らは、免疫化したＺｎＴ８－ＫＯおよびＮＯＤマウスからハイブリドーマ細胞を生成した。ＺｎＴ８－ＫＯマウスに由来するすべてのｍＡｂは、ＺｎＴ８の細胞内ＣＴＤ部分を標的とした。同様に、ＮＯＤマウス由来のｍＡｂは主にＣＴＤを認識した。それにもかかわらず、本発明者らは、ＣＴＤに対する反応性が検出できないが、ｆｌＺｎＴ８（ＴＭＤ＋ＣＴＤ）に対してのみ反応性である抗ＴＭＤ ｍＡｂ（ｍＡｂ４３）を同定した（図１Ｅ～１Ｆ）。界面活性剤で可溶化したヒトＺｎＴ８をプロテオリポソームに再構成すると、ｍＡｂ４３の反応性が６．２９倍増加し、膜内で天然フォールディングされたＴＭＤ立体構造が優先的に認識されることが実証された（図１Ｇ）。検証済みの抗ＣＴＤ ｍＡｂ２０を結合コントロールとして使用した（１７）。３つの異なる抗原形式：界面活性剤可溶化ＺｎＴ８、ＣＴＤ、およびリポソーム再構成ＺｎＴ８に対するｍＡｂ２０の反応性において差は観察されなかった（図１Ｅ～１Ｇ）。このｍＡｂ２０結合プロファイルは、独立して天然フォールディングされた可溶性ドメインとしてのＣＴＤと一致している（１８）。ＺｎＴ８プロテオリポソームに対するｍＡｂ４３およびｍＡｂ２０の滴定では、それぞれ０．４２±０．０５および０．５７±０．０７ ｎＭの結合親和性が得られた。

【0179】

（実施例３：細胞表面の結合および特異性）
観察されたｍＡｂ４３の抗ＴＭＤ反応性がＴＭＤの細胞外表面に向けられたものであるかどうかを確認するために、ｍＡｂ４３、ｍＡｂ２０、および豊富な細胞表面マーカーＣＤ７１に対する抗体による生ヒトβ細胞（Ｅｎｄｏｃ－βＨ１）の免疫蛍光（ＩＦ）標識と比較した。すべての実験は、抗体のエンドサイトーシスを阻止するために８℃で、ＺｎＴ８表面化を刺激するために２０ｍＭグルコースの存在下で行われた（１１）。ｍＡｂ４３および抗ＣＤ７１は細胞表面に強いＩＦパンクテーションを生じたが、ｍＡｂ２０は検出可能なシグナルを生成しなかった（図２Ａ）。一方、ｍＡｂ２０およびｍＡｂ４３は両方とも、それぞれサイトゾルＣＴＤおよび管腔ＴＭＤエピトープを認識するため、透過処理されたＥｎｄｏｃ－βＨ１細胞を強く標識した（図２Ｂ）。本発明者らはさらに、豊富な細胞表面マーカーＮａ＋／Ｋ＋ ＡＴＰａｓｅに対するげっ歯類反応性抗体と比較して、ラットβ細胞株（ＩＮＳ－１Ｅ）に対するｍＡｂ４３の交差反応性を調査した。ｍＡｂ４３および抗Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅは、生ＩＮＳ－１Ｅ細胞の細胞表面上に強いＩＦパンクテーションを生じた（図２Ｃ）。比較すると、透過処理されたＩＮＳ－１Ｅ細胞の免疫標識によって、それぞれｍＡｂ４３およびＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅ抗体による小胞および核の標識が明らかになった（図２Ｄ）。Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰａｓｅは、細胞表面に加えて核膜にも局在していることが以前に報告されている［１９］。最後に、ＩＮＳ－１Ｅ細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ＺｎＴ８ノックアウトは、細胞表面および細胞内小胞におけるｍＡｂ４３のＩＦ標識を廃止し、げっ歯類β細胞におけるＺｎＴ８特異性を検証した（図２Ｃ～２Ｄ）。Ｅｎｄｏｃ－ｂＨ１細胞のｍＡｂ４３またはｍＡｂ２０ ＩＦ標識、および野生型またはＺｎＴ８－ＫＯ ＩＮＳ－１Ｅ細胞のｍＡｂ４３ ＩＦ標識における差異を定量することによって、細胞表面ＺｎＴ８の特異的ｍＡｂ４３免疫標識をさらに検証した（図２Ｆ）。最後に、マウスｍＡｂ４３と、以前にＺｎＴ８ｅｃＡ陽性と判定されたヒト血清によるＺｎＴ８の競合結合を調査した。生Ｅｎｄｏｃ－ｂＨ１細胞をマウスｍＡｂ４３またはヒト血清のいずれかに曝露すると、細胞表面に強いマウスまたはヒトＩｇＧのパンクテーションが生じた。比較すると、生Ｅｎｄｏｃ－βＨ１細胞をマウスｍＡｂ４３およびヒト血清の両方に曝露すると、血清またはｍＡｂ４３のプレブロッキングに関係なく、主にマウスＩｇＧのパンクテーションが生じた（図２Ｅ）。画像定量化によって、ｍＡｂ４３が細胞表面上の血清ＩｇＧの点状の８０％を超えて置換されたことが示された（図２Ｇ）。この発見は、糖尿病患者由来のポリクローナル血清ＺｎＴ８ｅｃＡが、名目上、ｍＡｂ４３が共有する細胞表面ＺｎＴ８エピトープに向けられていることを示す。

【0180】

（実施例４：エピトープマッピングおよび立体構造特異性）
ｍＡｂ４３エピトープをＺｎＴ８細胞外ループ（ＥＣＬ）にマッピングするために、本発明者らは、個々のＥＣＬにＦＬＡＧ－オクタペプチドを挿入してその局所構造を乱し、次いで、天然ＺｎＴ８およびＺｎＴ８ＦＬＡＧに対するｍＡｂ４３の結合を比較した。９つの挿入コンストラクトのうち、ＥＣＬ－２挿入のみがＩＮＳ－１Ｅ細胞でＺｎＴ８ＦＬＡＧ発現を引き起こした［１１］。蛍光サイズ排除ＨＰＬＣによってバイナリｍＡｂ－ＺｎＴ８複合体の形成をモニタリングするために、強化された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をＺｎＴ８ Ｃ末端に付加した。ｍＡｂ４３結合は、ＺｎＴ８－ＧＦＰピークを左にシフトさせ、安定なｍＡｂ４３－ＺｎＴ８－ＧＦＰ複合体の形成を示した（図３Ａ）。ＦＬＡＧタグは、ＺｎＴ８ＦＬＡＧ－ＧＦＰへのｍＡｂ４３の結合を消滅させたが、安定な抗ＦＬＡＧ－ＺｎＴ８ＦＬＡＧ－ＧＦＰ複合体を形成する抗ＦＬＡＧ結合を追加した（図３Ｂ）。ＦＬＡＧタグは、ＺｎＴ８ＦＬＡＧ－ＧＦＰの単分散プロファイルを変化させず、ｍＡｂ２０－ＣＴＤ複合体の形成にも影響を与えなかった（図３Ｂ）。したがって、ｍＡｂ４３およびＦＬＡＧ抗体は、天然フォールディングされたＺｎＴ８のＴＭＤ表面上のＥＣＬ－２をめぐって直接競合した。さらに、ｍＡｂ４３は、未変化のＥＣＬ－２ループの存在にもかかわらず、免疫ブロット上でＳＤＳ変性ＺｎＴ８に対して反応性を示さなかった（図３Ｃ）。この発見は、ｍＡｂ４３の立体構造特異性をさらに実証した。比較すると、ｍＡｂ２０はＥｎｄｏｃ－βＨ１細胞の溶解物中に２つのＳＤＳ変性ＺｎＴ８スプライス変異体を検出したが［４、１７］、抗ペプチドＺｎＴ８抗体は高い非特異的反応性を有する変性ＺｎＴ８を検出した（図３Ｃ）。最後に、ネガティブ染色電子顕微鏡（ＥＭ）単粒子分析を使用して、ｍＡｂ４３の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ４３）と界面活性剤で可溶化したＺｎＴ８との結合複合体を視覚化した。脱脂したＺｎＴ８は、ＥＭグリッドの調製に耐えるのに安定したＦａｂ４３－ＺｎＴ８複合体を形成可能ではなかった。それにもかかわらず、Ｆａｂ４３－ＺｎＴ８複合体は、最小限に脱脂したＺｎＴ８を用いて捕捉され、ＺｎＴ８ホモ二量体と複合体を形成するＦａｂ４３分子は１つだけ見出された（図３Ｄ）。ＺｎＴ８ホモ二量体密度へのＦａｂ４３の結合点は、２重ホモ二量体軸から約１８°離れており、広がったＴＭＤと一致していた。このＦａｂ４３結合様式は、以前に報告されたＦａｂ２０－ＺｎＴ８複合体における２重軸でのＣＴＤへのＦａｂ２０のドッキングとは明らかに異なる［１２、１７］。ＺｎＴ８ホモ二量体中の２つのＺｎＴ８プロトマーは異なる立体構造をとるため［２０］、Ｆａｂ４３は外側または内側を向いた立体構造を認識すると考えられる。総合すると、生化学データは、ｍＡｂ４３がＥＣＬ－２ループへの立体構造特異的結合を通じてＺｎＴ８と安定な複合体を形成することを示している。

【0181】

（実施例５：マウス膵島およびβ細胞に対する特異性）
ｍＡｂ４３の特異性を、パラフィン包埋マウス膵臓切片においてｅｘ ｖｉｖｏで調査した。ｍＡｂ４３標識およびジアミノベンジジン免疫組織化学によって、ランゲルハンス島へのｍＡｂ４３結合の特異的局在化が明らかになった。比較すると、ｍＡｂ２０は、マウスＺｎＴ８に対する交差反応性が欠如しているため、膵島を免疫標識しなかった（図４Ａ）。酵素的に分散され界面活性剤透過処理されたマウス膵島細胞を抗インスリン、抗グルカゴンおよびｍＡｂ４３で共免疫標識したところ、ｍＡｂ４３はａ細胞とｂ細胞の両方を認識したが、アイソタイプ（ＩｇＧ２ｂ）対照は検出可能なＩＦシグナルを生成しなかったことが示された（図４Ｂ）。２人の異なるＴ２Ｄ患者からのヒト膵臓凍結切片の同時免疫標識によって、抗インスリンシグナルおよびｍＡｂ４３のＩＦシグナルの共局在化が明らかになり、ヒト膵島に対するｍＡｂ４３の特異性が実証された（図４Ｃ）。いくつかの島では、茶色の染色のない細胞の輪が明らかであった。これらの細胞は、通常、正常なマウス島の周囲に局在するα細胞およびδ細胞であると考えられる。次に、蛍光活性化セルソーティングを使用して、酵素的に分散されたマウス膵臓の混合細胞集団におけるβ細胞のｍＡｂ４３標識を調査した。ｍＡｂ４３標識細胞はフィコエリトリン（ＰＥ）接合二次抗体を使用して検出され、無傷の島細胞は細胞透過性ＤＮＡ色素ＤｙｅＣｙｃｌｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＤＣＶ）による陽性染色に基づいて大きな細胞破片および顆粒小胞に対してゲートされた。単一細胞イベントのゲートには、前方散乱制限と側方散乱制限が適用された。膵臓分散液のごく一部（１．７％）のみがＤＣＶ（＋）／ｍＡｂ４３－ＰＥ（＋）象限に該当した（図４Ｄ）。この低いパーセンテージは、膵臓塊全体の２％未満を構成する膵臓β細胞集団と一致している。選別した細胞を、マトリゲルコーティングされたガラス表面上で増殖させ、その後固定し、透過処理し、ＺｎＴ８、インスリン、およびグルカゴンの三重ＩＦ染色に供した。選別されたすべてのＤＣＶ（＋）／ｍＡｂ４３－ＰＥ（＋）細胞は、ＺｎＴ８およびインスリンの両方について陽性であったが、グルカゴンについては陰性であった（図４Ｅ）。比較すると、ほとんどの選別されたＤＣＶ（＋）／ｍＡｂ４３－ＰＥ（－）細胞は、ＺｎＴ８、インスリン、およびグルカゴンに対して陰性であった。インスリンおよびＺｎＴ８免疫標識の定量化によって、ｍＡｂ４３ ＩＦ強度の上昇と相関するｂ細胞の明らかな濃縮が明らかになった（図４Ｆ）。したがって、ｍＡｂ４３標識細胞のフローソーティングによって、膵臓塊の大部分（９８．３％）を構成する腺房および管組織からβ細胞を分離することが可能であった。ｍＡｂ４３のマウス反応性は、ｍＡｂ４３がＺｎＴ８ 自己エピトープに対するＮＯＤ自己免疫から生じたことを示す。初代マウスβ細胞に対するｍＡｂ４３の特異性は、β細胞に対するＮＯＤ 自己免疫の高度に選択的な性質と一致しているが、島細胞の残りの部分は自己免疫寛容である。

【0182】

（実施例６：グルコース刺激によるＺｎＴ８－ｍＡｂ４３の取り込み）
ｍＡｂ４３の細胞表面捕捉とその後のＺｎＴ８媒介ｍＡｂ４３エンドサイトーシスを追跡するために、ｍＡｂ２０およびｍＡｂ４３を標識する蛍光Ａ６４７二次抗体、およびＣｅｌｌＭａｓｋ緑色染色を使用して細胞境界を画定した。生ＥｎｄｏＣ－βＨ１細胞の抗体表面結合と内部移行をモニタリングした。ｍＡｂ４３－Ａ６４７は３７℃で急速に内部移行したが、ｍＡｂ２０－Ａ６４７の曝露では検出可能なシグナルが得られなかった（図５Ａ）。ＥｎｄｏＣ－βＨ１細胞を８℃で冷却すると、ｍＡｂ４３－Ａ６４７のエンドサイトーシスは停止したが、ｍａｂ４３－Ａ６４７の細胞表面結合は持続した（図５Ｂ）。重要なことに、グルコース濃度を２０ｍＭから２ｍＭに下げると、８℃でのｍＡｂ４３細胞表面結合と３７℃でのｍＡｂ４３－Ａ６４７の取り込みとの両方が著しく減少した（図５Ａ～５Ｂ）。画像定量化は、グルコース刺激（２０ｍＭ）が総ｍＡｂ４３－Ａ６４７ ＩＦ標識を３７℃および８℃でそれぞれ２２．１倍および１５．０倍増加させることを示唆した（図５Ｃ）。３７℃と８℃との間のｍＡｂ４３－Ａ６４７ ＩＦシグナルの差は、正味のｍＡｂ４３－Ａ６４７取り込みに近似した。グルコース刺激によって、ＺｎＴ８媒介ｍＡｂ４３の取り込みが３０．９倍増加した（図５Ｃ）。グルコース依存性のｍＡｂ４３の捕捉および内部移行を、ｍＡｂ４３と単量体赤色蛍光タンパク質ｍＳｃａｒｌｅｔの融合を使用して観察した。

【0183】

（実施例７：マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ ｍＡｂ４３生体内分布）
マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ ｍＡｂ４３取り込みを特徴付けるために、マウスＦａｂ／ヒトＦｃキメラｍＡｂ４３を生成し、４匹の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｃ１－４）に５ｍｇ／ｋｇの低投与量で注射し、次に、抗ヒトＩｇＧイムノブロッティングを使用して、切除された臓器パネル内のキメラｍＡｂ４３を検出した。Ｃ１～Ｃ３はｍＡｂ４３を静脈内に、Ｃ４は腹腔内に投与した。血漿中の循環ｍＡｂ４３は、低用量投与における標的媒介抗体クリアランスのマウス薬物動態モデルと一致して、１日以内に急速に除去された（図６Ａ）。注射後１日から６日まで、ｍＡｂ４３は主に膵臓で検出され、その生体内分布プロフィールは投与経路に関係なく変化しなかった（図６Ｂ）。ｍＡｂ４３の膵臓対血清の比は２４．６～６６．２の範囲であった。マウス／ヒトキメラｍＡｂ２０を用いた対照実験では、注射後３日までに膵臓において検出可能なシグナルが得られなかった（図６Ａ～６Ｃ）。比較すると、膵臓におけるｍＡｂ４３の半減期は約１週間で、注射後１日目の初期膵臓濃度は２１．１±０．９％ｍＡｂ_{ｉｎｊｅｃｔｅｄ}／ｇであり、徐々に減少してそれぞれ注射後５日目および６日目に、１４．３±１．５％および１１．１±１．０％ｍＡｂ_{ｉｎｊｅｃｔｅｄ}／ｇとなった（図６Ｄ）。膵臓特異的ｍＡｂ４３生体内分布は、全身投与を通じてｍＡｂ４３を膵臓に標的化することが可能であることを示している。この発見は、膵島に対するｅｘ ｖｉｖｏｍＡｂ４３の特異性（図４Ａ～４Ｆ）と併せて、ｍＡｂ４３が膵島に特異的に向けられていることをさらに示唆する。次に、Ｔ１ＤおよびＴ２Ｄ のマウスモデルでｍＡｂ４３の生体内分布を調査した。生後１８週のＮＯＤ雌４匹（Ｎ１～Ｎ４）とｄｂ／ｄｂ雄４匹（Ｄ１～Ｄ４）に、ｍＡｂ４３を５ｍｇ／ｋｇ単回腹腔内注射し、組織へのｍＡｂ４３の取り込みを注射から４８時間後に測定した。１８週齢では、ＮＯＤ雌の膵島におけるリンパ球浸潤は十分に確立されているが、ｄｂ／ｄｂ雄では明らかな肥満が発症する。両方のマウス系統は、Ｃ５７ＢＬ／６と同様の生体内分布プロファイルを示し、ｍＡｂ４３が主に膵臓に蓄積した（図６Ｅ）。膵臓のｍＡｂ４３取り込みレベルを、正常血糖から高血糖までの範囲の異なる空腹時血糖（ＦＢＧ）レベルを有する異なる染色の個々のマウス間で比較した（図６Ｆ）。平均して、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、それぞれＮＯＤマウスおよびｄｂ／ｄｂマウスよりも若干高いｍＡｂ４３取り込みを有していた（図６Ｇ）。１匹のＮＯＤマウスおよび２匹のｄｂ／ｄｂマウスが糖尿病になり（ＦＢＧ＞２５０ｍｇ／ｄＬ）、これらのマウスは膵臓ｍＡｂ４３取り込みの大幅な減少を示した。

【0184】

（実施例８：膵島へのｍＳｃａｒｌｅｔの標的送達）
イメージングペイロードのｉｎ ｖｉｖｏ送達のためのｍＡｂ４３の実現可能性を評価するために、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔ、ｍＡｂ２０－ｍＳｃａｒｌｅｔ、またはＰＢＳ対照を注射し、次いでホールマウント膵臓イメージングを実施して切除膵臓におけるｍＳｃａｒｌｅｔの取り込みを検出した。ｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔ注射のみが膵臓全体に特徴的なｍＳｃａｒｌｅｔ点をもたらした。界面活性剤で透過処理した膵臓のβ細胞を抗インスリンＡＰＣ免疫標識すると、同様のＡＰＣ涙点分布が得られたが、界面活性剤処理によって細胞内に捕捉されたｍＳｃａｒｌｅｔが消失したため、ｍＳｃａｒｌｅｔ点が消失した。ｍＳｃａｒｌｅｔの膵島ホーミングを直接評価するために、本発明者らは、ｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔ注射を受けたトランスジェニックＭＩＰ－ＧＦＰマウスにおいてＧＦＰタグ付きβ細胞を使用した（２５）。ホールマウント膵臓イメージングによって、ＧＦＰとｍＳｃａｒｌｅｔとの間の高度な全体的共局在が明らかになり、ＧＦＰと重複するｍＳｃａｒｌｅｔの画分、およびｍＳｃａｒｌｅｔと重複するＧＦＰの割合について、マンダーの重複係数がそれぞれ０．９３および０．７９であった（図７Ａ）。２１％の不一致ＧＦＰシグナルは、膵臓動脈およびその分枝における赤血球ＧＦＰ自己蛍光に主に起因しており、ｍＳｃａｒｌｅｔシグナルは完全に存在しなかった（図７Ｂ）。対照的に、ＧＦＰ－ｍＳｃａｒｌｅｔの共起は、大きな血管を取り囲む膵島クラスターではほぼ絶対的であった（図７Ｂ）。同様の血管系関連膵島クラスターがヒトの膵臓でも報告されている［２６］。高倍率倍率によって、個々のＧＦＰおよびｍＳｃａｒｌｅｔ涙点が共局在することが確認された（図７Ｃ）。一部の領域では、マイナーなｍＳｃａｒｌｅｔシグナルがＧＦＰシグナルと重なり合うことなく散乱した（図７Ｄ）。それらはおそらく小さなβ細胞クラスターであり、組織の除去中に界面活性剤が使用されなかった場合、そのＧＦＰシグナルは目に見えなかった［２７］。最後に、単離したマウス島のｅｘ ｖｉｖｏでのｍＳｃａｒｌｅｔの取り込みについて調査した。個々の島のサイズは、ホールマウント膵臓イメージングによって明らかになったｍＳｃａｒｌｅｔクラスターのサイズと一致した。単離したマウス島のｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔ曝露は、強いｍＳｃａｒｌｅｔ蛍光を生じたが、ｍＡｂ２０－ｍＳｃａｒｌｅｔでの曝露は検出可能な取り込みを示さなかった（図７Ｅ～７Ｆ）。これらの発見は、β細胞表面上のＺｎＴ８結合を介したｍＡｂ４３媒介ｍＳｃａｒｌｅｔ取り込みの特異性をさらに実証した。

【0185】

データは、ｍＡｂ４３の生成が、ＺｎＴ８に対するＣＤ４＋自己反応性Ｔ細胞が自発的に発生するＮＯＤマウスにおける自己寛容の崩壊に依存しているが、それらは弱い病原性を有することを示している。したがって、ＥＣＬに対する自己反応性を高めるには、ＺｎＴ８プロテオリポソーム免疫化が必要である。ＺｎＴ８－ＫＯマウスでＺｎＴ８遺伝子を欠失しても、ヒトＺｎＴ８のＥＣＬに対する抗体を誘導するには不十分であり、これはおそらく、細胞外ＺｎＴ８エピトープがＺｎＴタンパク質ファミリーの他のホモログ（ＺｎＴ１－１０）で種を超えて保存されているためと考えられる。特に、ＺｎＴシグネチャシーケンスの一部はＥＣＬ１に位置する。得られたｍＡｂ４３は、Ｔ１Ｄの顕著なｉｎ ｖｉｖｏ膵島特異性を備えた細胞表面ＺｎＴ８エピトープを認識する自己抗体である。ｍＡｂ４３のサブナノモル結合親和性は、ＮＯＤマウスの自発的自己抗体レパートリーではまれに発生する。ｍＡｂ４３－ＺｎＴ８の結合は、明らかに構造特異的である。個々のＥＣＬは独立してフォールディングには短すぎるため、ｍＡｂ４３の認識可能な立体構造を形成するには複数のＥＣＬとその相互作用が必要である。ＺｎＴ８の限られた細胞外表面積上にマルチループｍＡｂ４３エピトープがあるとすると、ｍＡｂ４３エピトープはその全体または少なくとも一部がポリクローナル血清ＺｎＴ８ｅｃＡによって共有されるべきである。したがって、ｍＡｂ４３結合は、Ｔ１Ｄ患者の血清ＺｎＴ８ｅｃＡに対してＺｎＴ８細胞外エピトープを効果的に保護し得る。ｍＡｂ４３のＩｇＤおよびＩｇＭ形態は、ＺｎＴ８特異的自己反応性Ｂ細胞のＢＣＲである。ＢＣＲとしてのｍＡｂ４３を使用すると、ＺｎＴ８－ＢＣＲ（ｍＡｂ４３）中心の免疫学的シナプスの形成を介して、自己反応性Ｂ細胞によるβ細胞の分子認識および関与を調べることができる。

【0186】

膵臓切片の膵島特異的免疫標識と組み合わせたｍＡｂ４３の膵臓特異的体内分布は、全身投与されたｍＡｂ４３がｉｎ ｖｉｖｏで膵島に特異的に送達される可能性があることを示唆している。ｍＳｃａｒｌｅｔをプローブとして使用したホールマウント膵臓イメージングによって、膵臓周縁部の膵島クラスターにおける局所的なｍＡｂ４３－ｍＳｃａｒｌｅｔの濃縮が明らかになった。これらの高度に血管新生した島は、循環中へのインスリンの迅速な放出を可能にし、一方、局所的なＧＳＩＳ活性は、ＺｎＴ８表面化とその後の循環ｍＡｂ４３の捕捉と機能的に結合している。膵臓のｍＡｂ４３取り込みは、Ｔ１ＤモデルとＴ２Ｄモデルの両方の糖尿病マウスで維持されるが、疾患マウスにおけるβ細胞の質量および／または機能の消失を反映して、ｍＡｂ４３取り込みレベルは減少する。

【0187】

ｍＡｂ４３のｉｎ ｖｉｖｏ膵島特異性は、ＺｎＴ８の膵島特異的発現と一致している。膵島内では、ＺｎＴ８は概して、すべての種類の終末細胞で発現される細胞内タンパク質であると考えられる。β－セルは、β－セルの次に多いセルタイプである。界面活性剤透過処理されたα－およびβ細胞はｍＡｂ４３よって免疫標識されたが、膵臓細胞集団全体からＦＡＣＳ濃縮されたのは無傷のβ細胞のみであり、ＺｎＴ８表面化はＧＳＩＳによって駆動されるβ細胞に特異的な機能であり得ることが示唆されている。細胞表面上の特定のマーカーを認識する抗体は、非膵島組織に有毒な造影剤または薬物を送達するためにβ細胞を標的とするために使用され得る。ｍＡｂ４３およびＥＣＬ２のペプチド配列を対象とする別のＺｎＴ８抗体（Ａｂ３１）によって標的とされるＺｎＴ８に加えて、スフィンゴミエリンパッチおよびＮＴＰＤａｓｅ３もβ細胞表面マーカーとして標的とされている。これまでのところ、ｍＡｂ４３だけが、イメージングペイロードおよび抗糖尿病誘発薬物の膵島ホーミングへの有用性を裏付ける膵臓特異的な生体内分布プロファイルを実証している。

【0188】

（実施例９：Ｉｎ Ｖｉｖｏイメージングおよび抗体薬物複合体の標的送達のためのｍＡｂ４３の使用）
ｉｎ ｖｉｖｏイメージングおよび抗体薬物接合体の標的送達に対するｍＡｂ４３の実現可能性を評価するために、ｍＡｂ４３重鎖のＣ末端に部位特異的ビオチン化を有する組換えｍＡｂ４３を生成する。ビオチン標識は、蛍光ストレプトアビジンをイメージングプローブとして接合するために使用される。マウス膵島細胞はｍＡｂ４３－ストレプトアビジンで標識され、細胞表面のＩＦ強度と細胞の亜鉛感受性蛍光に基づいて分類される。ＦＡＣＳからのポジティブまたはネガティブにゲートされた細胞は継代培養され、ＰＦＡ固定され、その後インスリンおよびグリコーゲン抗体でＩＦ標識される。二次フローサイトメトリー分析では、すべてのｍＡｂ４３陽性細胞がインスリンまたはグルカゴン陽性であるのに対し、ｍＡｂ４３陰性細胞はインスリンまたはグルカゴン陰性であることが示されることが期待される。さらなる分析によって、ｍＡｂ４３とインスリン陽性の正の相関関係が明らかになり得、表面化ＺｎＴ８が島細胞の混合集団からインスリン産生ｂ細胞を精製するためのバイオマーカーとして使用され得ることが示される。一部のグルカゴン産生ａ細胞もまたｍＡｂ４３陽性であり得るが、ｍＡｂ４３のＩＦ強度はｂ細胞の強度よりも大幅に低いと予想され、細胞の亜鉛含有量との相関は示されない。最後に、ビオチン化ｍＡｂ４３をマウスに注射し、ストレプトアビジン－ＨＰＲによるｍＡｂ４３の組織分布を調査する。組織組織学によって、膵島におけるｍＡｂ４３の蓄積が明らかになり、膵島へのｍＡｂ４３のｉｎ ｖｉｖｏ標的送達が実証されることが期待される。

【0189】

（実施例１０：生成熟幹細胞由来ベータ細胞（ｓＢＣ）の精製）
ｍＡｂ４３は、不均一な細胞混合物から生成熟ｓＢＣを精製するために使用される。以前の実験では、ＰＦＡ固定および透過処理後にＣペプチド陽性ｓＢＣを選別するためにｍＡｂ２０が使用された。ｍＡｂ２０と比較すると、ｍＡｂ４３は同様のＺｎＴ８親和性と特異性を有するが、細胞表面上のＺｎＴ８密度はおそらく細胞内密度の５％未満である。したがって、ＰＥまたはＡＰＣなどの明るい色素はシグナル増幅に使用され得る。部位特異的蛍光標識を備えた組換えｍＡｂ２０／４３が生成される。

【0190】

ｍＡｂ４３をＥＮＴＰＤ３（ＮＴＰＤａｓｅ３）およびＩＮＳ／Ｃｐｅｐと比較して、成熟幹細胞由来ベータ細胞（ｓＢＣ）を同定する研究が行われる。未成熟および成熟ｓＢＣを含むｈＥＳ、ｉＰＳＣ、およびＴ１Ｄ－ｉＰＳＣ ｓＢＣクラスターが使用される。

【0191】

生ｓＢＣクラスターの単一細胞懸濁液を調製し、ｍＡｂを使用した標識効率を定量する。ｍＡｂ陽性／陰性集団を分類し、インスリン／Ｃペプチド発現との相関を調査る。これらのクラスター／細胞にはｐＩｎｓｕｌｉｎ－ＧＦＰレポーターも含まれているため、ｍＡｂ４３－ＧＦＰ相関を直接調べ得る。

【0192】

ｍＡｂ４３はマウスＩｇＧ２ｂであり、対照ｍＡｂ２０はマウスＩｇＧ２ａである。組換え抗体はヒトＩｇＧ－４に切り替えられる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０～３０を参照されたい。

【0193】

【表1】

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0194】

【非特許文献1】Ｒｏｅｐ，Ｂ．Ｏ．，Ｔｈｏｍａｉｄｏｕ，Ｓ．，ｖａｎ Ｔｉｅｎｈｏｖｅｎ，Ｒ．，およびＺａｌｄｕｍｂｉｄｅ，Ａ．（２０２１）Ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ ａｓ ａ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｅｔａ－ｃｅｌｌ（ｄｏ ｎｏｔ ｂｌａｍｅ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ？）．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １７，１５０－１６１．

【非特許文献2】Ｌｉｓｔｏｎ，Ａ．，Ｔｏｄｄ，Ｊ．Ａ．，およびＬａｇｏｕ，Ｖ．（２０１７）Ｂｅｔａ－Ｃｅｌｌ Ｆｒａｇｉｌｉｔｙ Ａｓ ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ Ｒｉｓｋ Ｆａｃｔｏｒ ｉｎ Ｔｙｐｅ １ ａｎｄ Ｔｙｐｅ ２ Ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２３，１８１－１９４．

【非特許文献3】Ｃｈｉｍｉｅｎｔｉ，Ｆ．（２０１３）Ｚｉｎｃ，ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉａｂｅｔｅｓ：ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ａｎ ｏｌｄ ｓｔｏｒｙ．Ｎｕｔｒ Ｒｅｓ Ｒｅｖ ２６，１－１１．

【非特許文献4】Ｍｅｒｒｉｍａｎ，Ｃ．，およびＦｕ，Ｄ．（２０１９）Ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｌｅｔ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｚｉｎｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ－８（ＺｎＴ８）ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎｏｍａ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｔｒｅｓｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９４，１６９９２－１７００６．

【非特許文献5】Ｄｏｄｓｏｎ，Ｇ．，およびＳｔｅｉｎｅｒ，Ｄ．（１９９８）Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎ ｉｎｓｕｌｉｎ’ｓ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．８，１８９－１９４．．

【非特許文献6】Ｌｅｍａｉｒｅ，Ｋ．，Ｃｈｉｍｉｅｎｔｉ，Ｆ．，および Ｓｃｈｕｉｔ，Ｆ．（２０１２）Ｚｉｎｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ－ｃｅｌｌ．Ｊ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ ３，２０２－２１１．

【非特許文献7】Ｓｅｇｅｒｓｔｏｌｐｅ，Ａ．，Ｐａｌａｓａｎｔｚａ，Ａ．，Ｅｌｉａｓｓｏｎ，Ｐ．，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｅ．Ｍ．，Ａｎｄｒｅａｓｓｏｎ，Ａ．Ｃ．，Ｓｕｎ，Ｘ．，Ｐｉｃｅｌｌｉ，Ｓ．，Ｓａｂｉｒｓｈ，Ａ．，Ｃｌａｕｓｅｎ，Ｍ．，Ｂｊｕｒｓｅｌｌ，Ｍ．Ｋ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｍ．，Ｋａｓｐｅｒ，Ｍ．，Ａｍｍａｌａ，Ｃ．，およびＳａｎｄｂｅｒｇ，Ｒ．（２０１６）Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｉｓｌｅｔｓ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｔｙｐｅ ２ Ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ ２４，５９３－６０７．

【非特許文献8】Ｌｕｋｏｗｉａｋ，Ｂ．，Ｖａｎｄｅｗａｌｌｅ，Ｂ．，Ｒｉａｃｈｙ，Ｒ．，Ｋｅｒｒ－Ｃｏｎｔｅ，Ｊ．，Ｇｍｙｒ，Ｖ．，Ｂｅｌａｉｃｈ，Ｓ．，Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ｊ．，およびＰａｔｔｏｕ，Ｆ．（２００１）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ－ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｎｅｗ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｚｉｎｃ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ．Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ ４９，５１９－５２８．

【非特許文献9】Ｌｅｍａｉｒｅ，Ｋ．，Ｒａｖｉｅｒ，Ｍ．Ａ．，Ｓｃｈｒａｅｎｅｎ，Ａ．，Ｃｒｅｅｍｅｒｓ，Ｊ．Ｗ．，Ｖａｎ ｄｅ Ｐｌａｓ，Ｒ．，Ｇｒａｎｖｉｋ，Ｍ．，Ｖａｎ Ｌｏｍｍｅｌ，Ｌ．，Ｗａｅｌｋｅｎｓ，Ｅ．，Ｃｈｉｍｉｅｎｔｉ，Ｆ．，Ｒｕｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．，Ｇｉｌｏｎ，Ｐ．，ｉｎ’ｔ Ｖｅｌｄ，Ｐ．Ａ．，およびＳｃｈｕｉｔ，Ｆ．Ｃ．（２００９）Ｉｎｓｕｌｉｎ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ｚｉｎｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＺｎＴ８ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｂｕｔ ｉｓ ｎｏｔ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｎｏｒｍａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０６，１４８７２－１４８７７．

【非特許文献10】Ｎｉｃｏｌｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｂｅｌｌｏｍｏ，Ｅ．Ａ．，Ｗｉｊｅｓｅｋａｒａ，Ｎ．，Ｌｏｄｅｒ，Ｍ．Ｋ．，Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｇｙｕｌｋｈａｎｄａｎｙａｎ，Ａ．Ｖ．，Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ｖ．，Ｔａｒａｓｏｖ，Ａ．Ｉ．，Ｃａｒｚａｎｉｇａ，Ｒ．，Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｋ．，Ｔａｎｅｊａ，Ｔ．Ｋ．，ｄａ Ｓｉｌｖａ Ｘａｖｉｅｒ，Ｇ．，Ｌｉｂｅｒｔ，Ｓ．，Ｆｒｏｇｕｅｌ，Ｐ．，Ｓｃｈａｒｆｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｔｅｔｓｙｕｋ，Ｖ．，Ｒａｖａｓｓａｒｄ，Ｐ．，Ｐａｒｋｅｒ，Ｈ．，Ｇｒｉｂｂｌｅ，Ｆ．Ｍ．，Ｒｅｉｍａｎｎ，Ｆ．，Ｓｌａｄｅｋ，Ｒ．，Ｈｕｇｈｅｓ，Ｓ．Ｊ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｒ．，Ｍａｓｓｅｂｏｅｕｆ，Ｍ．，Ｂｕｒｃｅｌｉｎ，Ｒ．，Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｓ．Ａ．，Ｌｉｕ，Ｍ．，Ｌａｒａ－Ｌｅｍｕｓ，Ｒ．，Ａｒｖａｎ，Ｐ．，Ｓｃｈｕｉｔ，Ｆ．Ｃ．，Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｍ．Ｂ．，Ｃｈｉｍｉｅｎｔｉ，Ｆ．，およびＲｕｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．（２００９）Ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｓｅ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｎｕｌｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｒａｎｕｌｅ ｚｉｎｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＺｎＴ８ ａｎｄ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖａｒｉａｎｔｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５８，２０７０－２０８３．

【非特許文献11】Ｈｕａｎｇ，Ｑ．，Ｍｅｒｒｉｍａｎ，Ｃ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．，およびＦｕ，Ｄ．（２０１７）Ｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ Ｉｎｓｕｌｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ａ Ｇｒａｎｕｌｅ－ｒｅｓｉｄｅｎｔ Ｚｉｎｃ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＺｎＴ８ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｂｅｔａ Ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９２，４０３４－４０４３．

【非特許文献12】Ｇｕ，Ｙ．，Ｍｅｒｒｉｍａｎ，Ｃ．，Ｇｕｏ，Ｚ．，Ｊｉａ，Ｘ．，Ｗｅｎｚｌａｕ，Ｊ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｒｅｗｅｒｓ，Ｍ．，Ｙｕ，Ｌ．，およびＦｕ，Ｄ．（２０２１）Ｎｏｖｅｌ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｂｅｔａ－ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｏｆ ＺｎＴ８ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇ ｔｏ ｔｙｐｅ－１ ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ １２２，１０２６７７

【非特許文献13】Ｍｅｒｒｉｍａｎ，Ｃ．，Ｈｕａｎｇ，Ｑ．，Ｇｕ，Ｗ．，Ｙｕ，Ｌ．，およびＦｕ，Ｄ．（２０１８）Ａ ｓｕｂｃｌａｓｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｎｔｉ－ＺｎＴ８ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ｌｉｖｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ－ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９３，５７９－５８７．

【非特許文献14】Ｗａｎ，Ｈ．，Ｍｅｒｒｉｍａｎ，Ｃ．，Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｗａｓｓｅｒｆａｌｌ，Ｃ．Ｈ．，ＭｃＧｒａｉｌ，Ｋ．Ｍ．，Ｌｉａｎｇ，Ｙ．，Ｆｕ，Ｄ．，およびＤａｉ，Ｈ．（２０１７）Ｐｒｏｔｅｏｌｉｐｏｓｏｍｅ－ｂａｓｅｄ ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈ ＺｎＴ８ ｓｅｌｆ－ａｎｔｉｇｅｎ ｆｏｒ ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｎ ａ ｐｌａｓｍｏｎｉｃ ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１４，１０１９６－１０２０１．

【非特許文献15】Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｏ．，Ｋｏｒｓｇｒｅｎ，Ｏ．，Ｓｅｌｖａｒａｊｕ，Ｒ．Ｋ．，Ｍｏｌｌａｒｅｔ，Ｍ．，ｄｅ Ｂｏｙｓｓｏｎ，Ｙ．，Ｃｈｉｍｉｅｎｔｉ，Ｆ．，およびＡｌｔａｉ，Ｍ．（２０１８）Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｚｉｎｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｔｙｐｅ ８：ａ ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｒａｄｉｏ－ｉｏｄｉｎａｔｅｄ Ｅｘｅｎｄｉｎ－４．Ａｃｔａ Ｄｉａｂｅｔｏｌ ５５，４９－５７．

【非特許文献16】Ｍｅｒｒｉｍａｎ，Ｃ．，Ｈｕａｎｇ，Ｑ．，Ｒｕｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．，およびＦｕ，Ｄ．（２０１６）Ｌｉｐｉｄ－ｔｕｎｅｄ Ｚｉｎｃ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＺｎＴ８ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｒｉｓｋ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ－２ Ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９１，２６９５０－２６９５７．

【非特許文献17】Ｍｅｒｒｉｍａｎ，Ｃ．，Ｌｉ，Ｈ．，Ｌｉ，Ｈ．，およびＦｕ，Ｄ．（２０１８）Ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｚｉｎｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＺｎＴ８．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９３，１６２０６－１６２１６．

【非特許文献18】Ｌｕ，Ｍ．，ａｎｄ Ｆｕ，Ｄ．（２００７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｚｉｎｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ＹｉｉＰ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３１７，１７４６－１７４８．．

【非特許文献19】Ｇａｒｎｅｒ，Ｍ．Ｈ．（２００２）Ｎａ，Ｋ－ＡＴＰａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｎａ＋：Ｋ＋ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅｉ．Ｊ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ １８７，９７－１１５．

【非特許文献20】Ｘｕｅ，Ｊ．，Ｘｉｅ，Ｔ．，Ｚｅｎｇ，Ｗ．，Ｊｉａｎｇ，Ｙ．，およびＢａｉ，Ｘ．Ｃ．（２０２０）Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＺｎＴ８ ｉｎ ｂｏｔｈ ｏｕｔｗａｒｄ－ ａｎｄ ｉｎｗａｒｄ－ｆａｃｉｎｇ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ．Ｅｌｉｆｅ ９．

【非特許文献21】Ｂｉｎｄｅｌｓ，Ｄ．Ｓ．，Ｈａａｒｂｏｓｃｈ，Ｌ．，ｖａｎ Ｗｅｅｒｅｎ，Ｌ．，Ｐｏｓｔｍａ，Ｍ．，Ｗｉｅｓｅ，Ｋ．Ｅ．，Ｍａｓｔｏｐ，Ｍ．，Ａｕｍｏｎｉｅｒ，Ｓ．，Ｇｏｔｔｈａｒｄ，Ｇ．，Ｒｏｙａｎｔ，Ａ．，Ｈｉｎｋ，Ｍ．Ａ．，および Ｇａｄｅｌｌａ，Ｔ．Ｗ．，Ｊｒ．（２０１７）ｍＳｃａｒｌｅｔ：ａ ｂｒｉｇｈｔ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍａｇｉｎｇ．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４，５３－５６．

【非特許文献22】Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｄ．Ｃ．，Ｂｒｉｓｓｏｖａ，Ｍ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｎ．，Ｓｈｒｅｓｔｈａ，Ｓ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｔ．，Ａｒａｍａｎｄｌａ，Ｒ．，Ｐｏｆｆｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｇ．，Ｆｌａｈｅｒｔｙ，Ｄ．Ｋ．，Ｗｅｌｌｅｒ，Ｋ．Ｐ．，Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．，Ｃｏｏｐｅｒ，Ｔ．，Ｇｏｆｆ，Ｍ．Ｔ．，Ｖｉｒｏｓｔｋｏ，Ｊ．，Ｓｈｏｓｔａｋ，Ａ．，Ｄｅａｎ，Ｅ．Ｄ．，Ｇｒｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｌ．，Ｓｈｕｌｔｚ，Ｌ．Ｄ．，Ｐｒａｓａｄ，Ｎ．，Ｌｅｖｙ，Ｓ．Ｅ．，Ｃａｒｎａｈａｎ，Ｒ．Ｈ．，Ｄａｉ，Ｃ．，Ｓｅｖｉｇｎｙ，Ｊ．，およびＰｏｗｅｒｓ，Ａ．Ｃ．（２０１８）Ｅｃｔｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｄｉｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ－３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔａｒｇｅｔｓ Ａｄｕｌｔ Ｈｕｍａｎ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ ａｎｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂ．

【非特許文献23】Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｏｚｅｋｉ，Ｋ．，ａｎｄ Ａｋｉｔａ，Ｈ．（２０２０）Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ａｐｐｒｏａｃｈ ｕｓｉｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ １０，１６２６８．

【非特許文献24】Ｏｖａｃｉｋ，Ｍ．，およびＬｉｎ，Ｋ．（２０１８）Ｔｕｔｏｒｉａｌ ｏｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｅａｒｌｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｌｉｎ Ｔｒａｎｓｌ Ｓｃｉ １１，５４０－５５２．

【非特許文献25】Ｈａｒａ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｘ．，Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｂｉｎｄｏｋａｓ，Ｖ．Ｐ．，Ｄｉｚｏｎ，Ｒ．Ｆ．，Ａｌｃｏｓｅｒ，Ｓ．Ｙ．，Ｍａｇｎｕｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，およびＢｅｌｌ，Ｇ．Ｉ．（２００３）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｌａｂｅｌｅｄ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ －ｃｅｌｌｓ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２８４，Ｅ１７７－１８３．

【非特許文献26】Ｉｏｎｅｓｃｕ－Ｔｉｒｇｏｖｉｓｔｅ，Ｃ．，Ｇａｇｎｉｕｃ，Ｐ．Ａ．，Ｇｕｂｃｅａｃ，Ｅ．，Ｍａｒｄａｒｅ，Ｌ．，Ｐｏｐｅｓｃｕ，Ｉ．，Ｄｉｍａ，Ｓ．，およびＭｉｌｉｔａｒｕ，Ｍ．（２０１５）Ａ ３Ｄ ｍａｐ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｌｅｔ ｒｏｕｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｔｈｅ ｈｅａｌｔｈｙ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５，１４６３４

【非特許文献27】Ｋｉｍ，Ａ．，Ｋｉｌｉｍｎｉｋ，Ｇ．，およびＨａｒａ，Ｍ．（２０１０）Ｉｎ ｓｉｔｕ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｂｅｔａ－ｃｅｌｌ ｍａｓｓ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．

【非特許文献28】Ｍｕｒａｔｏｒｅ，Ｍ．，Ｓａｎｔｏｓ，Ｃ．，およびＲｏｒｓｍａｎ，Ｐ．（２０２１）Ｔｈｅ ｖａｓｃｕｌａｒ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔｓ：Ａ ｈｏｍａｇｅ ｔｏ Ａｕｇｕｓｔ Ｋｒｏｇｈ．Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ａ Ｍｏｌ Ｉｎｔｅｇｒ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２５２，１１０８４６．

【非特許文献29】Ｈａｈｎ，Ｍ．，Ｎｏｒｄ，Ｃ．，Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，Ｍ．，Ｍｏｒｉｎｉ，Ｆ．，Ａｌａｎｅｎｔａｌｏ，Ｔ．，Ｋｏｒｓｇｒｅｎ，Ｏ．，およびＡｈｌｇｒｅｎ，Ｕ．（２０２１）３Ｄ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｏｒｇａｎｓ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ － ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｃｏｍｍｕｎ Ｂｉｏｌ ４，１０６３．

【非特許文献30】Ｅｌ－Ｇｏｈａｒｙ，Ｙ．，Ｓｉｍｓ－Ｌｕｃａｓ，Ｓ．，Ｌａｔｈ，Ｎ．，Ｔｕｌａｃｈａｎ，Ｓ．，Ｇｕｏ，Ｐ．，Ｘｉａｏ，Ｘ．，Ｗｅｌｓｈ，Ｃ．，Ｐａｒｅｄｅｓ，Ｊ．，Ｗｉｅｒｓｃｈ，Ｊ．，Ｐｒａｓａｄａｎ，Ｋ．，Ｓｈｉｏｔａ，Ｃ．，およびＧｉｔｔｅｓ，Ｇ．Ｋ．（２０１２）Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｌｅｔ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ．Ａｎａｔ Ｒｅｃ （Ｈｏｂｏｋｅｎ）２９５，１４７３－１４８１．

【非特許文献31】Ｂｏｎｎｅｒ－Ｗｅｉｒ，Ｓ．およびＯｒｃｉ，Ｌ．（１９８２）Ｎｅｗ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｌｅｔｓ ｏｆ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１，８８３－８８９．

【非特許文献32】Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ．Ｗ．，Ｋｅｎｄａｌｌ，Ｐ．ＬおよびＭｉｔｃｈｅｌｌ，Ｈ．Ｇ．（２００２）Ｔｈｅ ｎａｔｕｒａｌ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｎｏｎｏｂｅｓｅ ｄｉａｂｅｔｉｃ ｍｉｃｅ ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９，６６１７－６６２４．

【非特許文献33】Ａｒｖａｎ，Ｐ．，Ｐｉｅｔｒｏｐａｏｌｏ，Ｍ．，Ｏｓｔｒｏｖ，Ｄ．，およびＲｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ｊ．（２０１２）Ｉｓｌｅｔ ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ ２．

【非特許文献34】Ｌｅｒｎｍａｒｋ，Ａ．，Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ｚ．Ｒ．，Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｃ．，Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｈ．，Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｄ．Ｆ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｌ．，Ｗｉｎｔｅｒ，Ｒ．Ｊ．，およびＴｒａｉｓｍａｎ，Ｈ．Ｓ．（１９７８）Ｉｓｌｅｔ－ｃｅｌｌ－ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２９９，３７５－３８０．

【非特許文献35】Ｖａｎ Ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｍ．，Ｓｍｅｔｓ，Ｇ．，Ｇｅｐｔｓ，Ｗ．，およびＰｉｐｅｌｅｅｒｓ，Ｄ．（１９８２）Ｉｓｌｅｔ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｉｎｓｕｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｉｃｓ ｂｉｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｔｏ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｂ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ７０，４１－４９．

【非特許文献36】Ｔｏｚｚｏｌｉ，Ｒ．（２０２０）Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ：ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｕｔｏ Ｉｍｍｕｎ Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ １１，１．

【非特許文献37】Ｂｌｏｅｍ，Ｓ．Ｊ．，およびＲｏｅｐ，Ｂ．Ｏ．（２０１７）Ｔｈｅ ｅｌｕｓｉｖｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｉｓｌｅｔ ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ （ｈｕｍａｎ）ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ６０，１１８５－１１８９．

【非特許文献38】Ｆｌａｎｎｉｃｋ，Ｊ．，Ｔｈｏｒｌｅｉｆｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｂｅｅｒ，Ｎ．Ｌ．，Ｊａｃｏｂｓ，Ｓ．Ｂ．，Ｇｒａｒｕｐ，Ｎ．，Ｂｕｒｔｔ，Ｎ．Ｐ．，Ｍａｈａｊａｎ，Ａ．，Ｆｕｃｈｓｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．，Ａｔｚｍｏｎ，Ｇ．，Ｂｅｎｅｄｉｋｔｓｓｏｎ，Ｒ．，Ｂｌａｎｇｅｒｏ，Ｊ．，Ｂｏｗｄｅｎ，Ｄ．Ｗ．，Ｂｒａｎｄｓｌｕｎｄ，Ｉ．，Ｂｒｏｓｎａｎ，Ｊ．，Ｂｕｒｓｌｅｍ，Ｆ．，Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｊ．，Ｃｈｏ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｃ．，Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｄ．Ａ．，Ｄｕｇｇｉｒａｌａ，Ｒ．，Ｄｙｍｅｋ，Ｚ．，Ｆａｒｊｏｕｎ，Ｙ．，Ｆｅｎｎｅｌｌ，Ｔ．，Ｆｏｎｔａｎｉｌｌａｓ，Ｐ．，Ｆｏｒｓｅｎ，Ｔ．，Ｇａｂｒｉｅｌ，Ｓ．，Ｇｌａｓｅｒ，Ｂ．，Ｇｕｄｂｊａｒｔｓｓｏｎ，Ｄ．Ｆ．，Ｈａｎｉｓ，Ｃ．，Ｈａｎｓｅｎ，Ｔ．，Ｈｒｅｉｄａｒｓｓｏｎ，Ａ．Ｂ．，Ｈｖｅｅｍ，Ｋ．，Ｉｎｇｅｌｓｓｏｎ，Ｅ．，Ｉｓｏｍａａ，Ｂ．，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，Ｓ．，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｔ．，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｋａｔｈｉｒｅｓａｎ，Ｓ．，Ｋｏｎｇ，Ａ．，Ｋｏｏｎｅｒ，Ｊ．，Ｋｒａｖｉｃ，Ｊ．，Ｌａａｋｓｏ，Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｊ．Ｙ．，Ｌｉｎｄ，Ｌ．，Ｌｉｎｄｇｒｅｎ，Ｃ．Ｍ．，Ｌｉｎｎｅｂｅｒｇ，Ａ．，Ｍａｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｍｅｉｔｉｎｇｅｒ，Ｔ．，Ｍｏｈｌｋｅ，Ｋ．Ｌ．，Ｍｏｌｖｅｎ，Ａ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ａ．Ｐ．，Ｐｏｔｌｕｒｉ，Ｓ．，Ｒａｕｒａｍａａ，Ｒ．，Ｒｉｂｅｌ－Ｍａｄｓｅｎ，Ｒ．，Ｒｉｃｈａｒｄ，Ａ．Ｍ．，Ｒｏｌｐｈ，Ｔ．，Ｓａｌｏｍａａ，Ｖ．，Ｓｅｇｒｅ，Ａ．Ｖ．，Ｓｋａｒｓｔｒａｎｄ，Ｈ．，Ｓｔｅｉｎｔｈｏｒｓｄｏｔｔｉｒ，Ｖ．，Ｓｔｒｉｎｇｈａｍ，Ｈ．Ｍ．，Ｓｕｌｅｍ，Ｐ．，Ｔａｉ，Ｅ．Ｓ．，Ｔｅｏ，Ｙ．Ｙ．，Ｔｅｓｌｏｖｉｃｈ，Ｔ．，Ｔｈｏｒｓｔｅｉｎｓｄｏｔｔｉｒ，Ｕ．，Ｔｒｉｍｍｅｒ，Ｊ．Ｋ．，Ｔｕｏｍｉ，Ｔ．，Ｔｕｏｍｉｌｅｈｔｏ，Ｊ．，Ｖａｚｉｒｉ－Ｓａｎｉ，Ｆ．，Ｖｏｉｇｈｔ，Ｂ．Ｆ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｏｅｈｎｋｅ，Ｍ．，ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｍ．Ｉ．，Ｎｊｏｌｓｔａｄ，Ｐ．Ｒ．，Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｏ．，Ｇｒｏｏｐ，Ｌ．，Ｃｏｘ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ，Ｋ．，およびＡｌｔｓｈｕｌｅｒ，Ｄ．（２０１４）Ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＳＬＣ３０Ａ８ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｇａｉｎｓｔ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４６，３５７－３６３

【非特許文献39】Ｄｗｉｖｅｄｉ，Ｏ．Ｐ．，Ｌｅｈｔｏｖｉｒｔａ，Ｍ．，Ｈａｓｔｏｙ，Ｂ．，Ｃｈａｎｄｒａ，Ｖ．，Ｋｒｅｎｔｚ，Ｎ．Ａ．Ｊ．，Ｋｌｅｉｎｅｒ，Ｓ．，Ｊａｉｎ，Ｄ．，Ｒｉｃｈａｒｄ，Ａ．Ｍ．，Ａｂａｉｔｕａ，Ｆ．，Ｂｅｅｒ，Ｎ．Ｌ．，Ｇｒｏｔｚ，Ａ．，Ｐｒａｓａｄ，Ｒ．Ｂ．，Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｏ．，Ａｈｌｑｖｉｓｔ，Ｅ．，Ｋｒｕｓ，Ｕ．，Ａｒｔｎｅｒ，Ｉ．，Ｓｕｏｒａｎｔａ，Ａ．，Ｇｏｍｅｚ，Ｄ．，Ｂａｒａｓ，Ａ．，Ｃｈａｍｐｏｎ，Ｂ．，Ｐａｙｎｅ，Ａ．Ｊ．，Ｍｏｒａｌｌｉ，Ｄ．，Ｔｈｏｍｓｅｎ，Ｓ．Ｋ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｐ．，Ｓｐｉｌｉｏｔｉｓ，Ｉ．，Ｒａｍｒａｃｈｅｙａ，Ｒ．，Ｃｈａｂｏｓｓｅａｕ，Ｐ．，Ｔｈｅｏｄｏｕｌｏｕ，Ａ．，Ｃｈｅｕｎｇ，Ｒ．，ｖａｎ ｄｅ Ｂｕｎｔ，Ｍ．，Ｆｌａｎｎｉｃｋ，Ｊ．，Ｔｒｏｍｂｅｔｔａ，Ｍ．，Ｂｏｎｏｒａ，Ｅ．，Ｗｏｌｈｅｉｍ，Ｃ．Ｂ．，Ｓａｒｅｌｉｎ，Ｌ．，Ｂｏｎａｄｏｎｎａ，Ｒ．Ｃ．，Ｒｏｒｓｍａｎ，Ｐ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ｂ．，Ｂｒｏｓｎａｎ，Ｊ．，ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｍ．Ｉ．，Ｏｔｏｎｋｏｓｋｉ，Ｔ．，Ｌａｇｅｒｓｔｅｄｔ，Ｊ．Ｏ．，Ｒｕｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．，Ｇｒｏｍａｄａ，Ｊ．，Ｇｌｏｙｎ，Ａ．Ｌ．，Ｔｕｏｍｉ，Ｔ．，およびＧｒｏｏｐ，Ｌ．（２０１９）Ｌｏｓｓ ｏｆ ＺｎＴ８ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｂｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ５１，１５９６－１６０６．

【非特許文献40】Ｋａｍｂｅ，Ｔ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｍ．，およびＦｕ，Ｄ．（２０２１）Ｚｉｎｃ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１００３２０．

【非特許文献41】Ｄｏｎａｔｈ，Ｍ．Ｙ．，およびＳｈｏｅｌｓｏｎ，Ｓ．Ｅ．（２０１１）Ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ ａｓ ａｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１，９８－１０７．

【非特許文献42】Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｂ．，Ｂｅｌｌ，Ｃ．Ｊ．Ｍ．，Ｈｏｗｌｅｔｔ，Ｓ．Ｋ．，Ｐｅｋａｌｓｋｉ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｒａｄｙ，Ｋ．，Ｈｉｎｔｏｎ，Ｈ．，Ｓａｕｔｅｒ，Ｄ．，Ｔｏｄｄ，Ｊ．Ａ．，Ｕｍａｎａ，Ｐ．，Ａｓｔ，Ｏ．，Ｗａｌｄｈａｕｅｒ，Ｉ．，Ｆｒｅｉｍｏｓｅｒ－Ｇｒｕｎｄｓｃｈｏｂｅｒ，Ａ．，Ｍｏｅｓｓｎｅｒ，Ｅ．，Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．，Ｈｏｓｓｅ，Ｒ．Ｊ．，およびＷｉｃｋｅｒ，Ｌ．Ｓ．（２０１８）Ａ ｌｏｎｇ－ｌｉｖｅｄ ＩＬ－２ ｍｕｔｅｉｎ ｔｈａｔ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ａｎｄ ｅｘｐａｎｄｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ ９５，１－１４．

【非特許文献43】Ｃｉｅｓｌａｋ，Ｍ．，Ｗｏｊｔｃｚａｋ，Ａ．，およびＣｉｅｓｌａｋ，Ｍ．（２０１５）Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｉｓｌｅｔｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｅｌａｂｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｐｏｌ ６２，１５－２１．

【非特許文献44】Ｓｔｕｌｌ，Ｎ．Ｄ．，Ｂｒｅｉｔｅ，Ａ．，ＭｃＣａｒｔｈｙ，Ｒ．，Ｔｅｒｓｅｙ，Ｓ．Ａ．，およびＭｉｒｍｉｒａ，Ｒ．Ｇ．（２０１２）Ｍｏｕｓｅ ｉｓｌｅｔ ｏｆ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌ ｐｒｏｔｅａｓｅ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．

【非特許文献45】Ｃｏｒｂｉｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｗｅｓｔ，Ｈ．Ｌ．，Ｂｒｏｄｓｋｙ，Ｓ．，Ｗｈｉｔｔｉｃａｒ，Ｎ．Ｂ．，Ｋｏｃｈ，Ｗ．Ｊ．，およびＮｕｎｅｍａｋｅｒ，Ｃ．Ｓ．（２０２１）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｒｏｄｅｎｔ Ｉｓｌｅｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ．Ｂｉｏｌ Ｐｒｏｃｅｄ Ｏｎｌｉｎｅ ２３，７．

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【配列表】

2024534047000001.xml

【国際調査報告】