特表 2024-534066 脂質ナノ粒子製剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-18

(54)【発明の名称】脂質ナノ粒子製剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/44 20170101AFI20240910BHJP

   A61K 9/16 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 9/51 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20240910BHJP

   A61K 47/24 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 47/28 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 38/22 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 31/713 20060101ALI20240910BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240910BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240910BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240910BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240910BHJP

   C08G 65/324 20060101ALI20240910BHJP

   C07K 14/47 20060101ALN20240910BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20240910BHJP

【ＦＩ】

A61K47/44

A61K9/16

A61K9/51

A61K47/34

A61K47/24

A61K47/28

A61K45/00

A61K38/02

A61K38/19

A61K38/22

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K31/7088

A61K31/7105

A61K31/713

A61P43/00 105

A61P43/00 111

C12N15/11 Z

C12N5/10

C12P21/02 C

C08G65/324

C07K14/47

C07K16/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024509404

(86)(22)【出願日】2022-08-17

(85)【翻訳文提出日】2024-04-16

(86)【国際出願番号】 AU2022050913

(87)【国際公開番号】W WO2023019310

(87)【国際公開日】2023-02-23

(31)【優先権主張番号】2021902567

(32)【優先日】2021-08-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】304044531

【氏名又は名称】モナシュ ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】ヘアス ベイシム アリ オル－ワシティ

(72)【発明者】

【氏名】コリン ウィリアム ポートン

(72)【発明者】

【氏名】カ トゥ ジョーン ホ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4H045

4J005

【Ｆターム（参考）】

4B064AG32

4B064CA19

4B064CC24

4B065AA91X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA05

4B065CA24

4B065CA44

4B065CA45

4B065CA46

4C076AA31

4C076AA65

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB21

4C076BB31

4C076CC26

4C076CC29

4C076DD15

4C076DD63

4C076DD70

4C076EE23

4C076EE52

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA17

4C084AA27

4C084BA03

4C084DA01

4C084DB01

4C084MA05

4C084MA13

4C084MA16

4C084MA17

4C084MA22

4C084MA23

4C084MA28

4C084MA35

4C084MA37

4C084MA38

4C084MA41

4C084MA43

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA60

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA10

4C084ZB211

4C084ZB212

4C084ZC021

4C084ZC022

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085EE01

4C085GG01

4C085GG08

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA03

4C086MA05

4C086MA13

4C086MA16

4C086MA17

4C086MA22

4C086MA23

4C086MA28

4C086MA32

4C086MA35

4C086MA37

4C086MA38

4C086MA41

4C086MA43

4C086MA52

4C086MA55

4C086MA56

4C086MA60

4C086MA63

4C086MA66

4C086NA05

4C086NA10

4C086ZB21

4C086ZC02

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA31

4H045FA74

4J005BD00

4J005BD05

4J005BD07

(57)【要約】

本発明は、脂質ナノ粒子、脂質ナノ粒子を含む製剤及び前記脂質ナノ粒子及びその製剤を用いて疾患又は状態を治療する方法に関する。脂質ナノ粒子は、ａ）活性剤；（ｂ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を含む、カチオン性脂質及び／又はイオン化脂質；（ｃ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を含むリン脂質；（ｄ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を含む構造脂質；（ｅ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約０．０５ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％未満を含むＰＥＧ化脂質、を含む。
【選択図】 なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

脂質ナノ粒子であって、：
（ａ）活性剤
（ｂ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を含む、カチオン性脂質及び／又はイオン化脂質
（ｃ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を含むリン脂質；
（ｄ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を含む構造脂質；
（ｅ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約０．０５ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％未満を含むＰＥＧ化脂質、
を含む、脂質ナノ粒子。

【請求項2】

前記ＰＥＧ化脂質は、粒子中に存在する全脂質の約０．０６ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．０７ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．０８ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．０９ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．１５ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．２ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．２５ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．３ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．３ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．３５ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．４ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．４５ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．４５ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．４ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．３５ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．３ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．２５ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．２ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．１５ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．１ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．０９ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．０８ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．０７ｍｏｌ％、又は約０．０５ｍｏｌ％～約０．０６ｍｏｌ％を含む、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項3】

前記ＰＥＧ化脂質は、粒子中に存在する全脂質の０．０６ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．０７ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．０８ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．０９ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．１ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．１５ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．２ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．２５ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．３ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．３ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．３５ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．４ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．４５ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．４５ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．４ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．３５ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．３ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．２５ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．２ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．１５ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．１ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．０９ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．０８ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．０７ｍｏｌ％、又は０．０５ｍｏｌ％～０．０６ｍｏｌ％を含む、請求項１又は２に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項4】

前記ＰＥＧ化脂質は、粒子中に存在する全脂質の０．０５ｍｏｌ％、０．０６ｍｏｌ％、０．０７ｍｏｌ％、０．０８ｍｏｌ％、０．０９ｍｏｌ％、０．１ｍｏｌ％、０．１５ｍｏｌ％、０．２ｍｏｌ％、０．２５ｍｏｌ％、０．３ｍｏｌ％、０．３５ｍｏｌ％、０．４ｍｏｌ％、又は０．４５ｍｏｌ％を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項5】

前記ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧで修飾されたホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧで修飾されたホスファチジン酸、ＰＥＧで修飾されたセラミド、ＰＥＧで修飾されたジアルキルアミン、ＰＥＧで修飾されたジアシルグリセロール、ＰＥＧで修飾されたジアルキルグリセロール、及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項6】

前記ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、又はＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質からなる群より選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項7】

前記ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ－ＤＳＰＥである、請求項６に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項8】

前記ＰＥＧ化脂質は、約１００Ｄａ～約１００，０００Ｄａ、約１００Ｄａ～約１００，０００Ｄａ、約１０００Ｄａ～約９０００Ｄａ、約１０００Ｄａ～約８０００Ｄａ、約１０００Ｄａ～約７０００Ｄａ、約１０００Ｄａ～約６０００Ｄａ、約１０００Ｄａ～約５０００Ｄａ、約１０００Ｄａ～約４０００Ｄａ、約１０００Ｄａ～約３０００Ｄａ、又は約１０００Ｄａ～約２０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧ成分を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項9】

前記ＰＥＧ化脂質は、約１，０００Ｄａ～５，０００Ｄａ、好ましくは約２，０００Ｄａ～５，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧ成分を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項10】

前記ＰＥＧ化脂質は、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、及び１００Ｄａの分子量を有するＰＥＧ成分を有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項11】

前記ＰＥＧ化脂質は、ＤＳＰＥ－ＰＥＧであって、前記ＰＥＧは、２０００Ｄａの分子量を有する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項12】

前記カチオン性脂質は、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジオエイルオキシ－３－（ジメチルアミノ）プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－β－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスト－５－エン－３．β．オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス，シス－９’，１－２’－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＣＤＡＰ）、４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－３０１５）、８－［（２－ヒドロキシエチル）［６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル］アミノ］－オクタン酸，１－オクチルノニルエステル（ＳＭ－１０２）及びこれらの混合物のいずれか１つである、請求項１～１１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項13】

前記カチオン性脂質は、式Ｉであって、

【化1】

Ｒ^１及びＲ^２は、独立して選択され、Ｈ又はＣ_１－Ｃ_３アルキルであって、Ｒ^３及びＲ^４は、独立して選択され、約１０～約２０個の炭素原子を有するアルキル基であって、Ｒ^３及びＲ^４の少なくとも１つは、少なくとも２つの不飽和部位を含み、好ましくは、式Ｉのカチオン性脂質は、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）又は１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項14】

前記カチオン性脂質は、式ＩＩであって、

【化2】

Ｒ^１及びＲ^２は、独立して選択され、Ｈ又はＣ_１－Ｃ_３アルキルであって、Ｒ^３及びＲ^４は、独立して選択され、約１０～約２０個の炭素原子を有するアルキル基であって、Ｒ^３及びＲ^４の少なくとも１つは、少なくとも２つの不飽和部位を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項15】

前記カチオン性脂質は、式ＩＩＩであって、

【化3】

Ｒ^１及びＲ^２は、同一であるか、それとも相違しており、独立して、任意に置換されたＣ_１２－Ｃ_２４アルキル、任意に置換されたＣ_１２－Ｃ_２４アルケニル、任意に置換されたＣ_１２－Ｃ_２４アルキニル、又は任意に置換されたＣ_１２－Ｃ_２４アシルであって；Ｒ^３及びＲ^４は、同一であるか、それとも相違しており、独立して、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルケニル、又は任意に置換されたＣ_１－Ｃ_５アルキニルであるか、あるいはＲ^３及びＲ^４は、結合して、４～６個の炭素原子並びに窒素及び酸素から選択される１又は２個のヘテロ原子の任意に置換された複素環を形成してもよく；Ｒ^５は、存在しないか、あるいは水素又はＣ１－Ｃ６アルキルのいずれかであり、第４級アミンを提供し；ｍ、ｎ及びｐは、同一であるか、それとも相違しており、ｍ、ｎ及びｐが同時に０ではないという条件で、独立して０又は１のいずれかであり；ｑは、０、１、２、３又は４であり；かつＹ及びＺは、同一であるか、それとも相違しており、独立してＯ、Ｓ又はＮＨである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項16】

前記式ＩＩＩのカチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ；「ＸＴＣ２」）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプロピル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（４－ジメチルアミノブチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－５－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－Ｎ－メチルペピアジノ－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＭＰＺ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレイルオキシ－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃ１）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃ１）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、又はそれらの混合物である、請求項１５に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項17】

前記カチオン性脂質は、ＤＯＤＡＰ、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ２－ＤＭＡ ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項18】

前記カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約４５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、又は約５５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項19】

前記カチオン性脂質は、粒子中に存在する全脂質の約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０ｍｏｌ％を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項20】

前記リン脂質は、カチオン性リン脂質である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項21】

前記リン脂質は、不飽和脂質である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項22】

前記リン脂質は、多価不飽和脂質である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項23】

前記リン脂質は、式（ＩＶ）に記載のものであって：

【化4】

式中、脂質部分を表して、Ｒ及びＲ’は、同一又は相違していてもよい、不飽和を有するか、あるいは有さない脂肪酸部分を表す、請求項１～２２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項24】

前記リン脂質部分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２－リゾホスファチジルコリン、及びスフィンゴミエリンからなる群より選択される、請求項１～２３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項25】

前記リン脂は、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α－リノレン酸、エルカ酸、フィタン酸、アラキジン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる非限定的な群より選択される脂肪酸部分を有する、請求項１～２４のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項26】

前記リン脂質は、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、ケファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、及びそれらの混合物である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項27】

前記リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項28】

前記リン脂質は、粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、又は約１５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項29】

前記リン脂質は、典型的には、粒子中に存在する全脂質の５ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％～１５ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％、又は１５ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％を含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項30】

前記構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、α－トコフェロール、及びそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１～２９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項31】

前記構造脂質は、コレステロールである、請求項１～３０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項32】

前記構造脂質は、粒子中に存在する全脂質の約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、又は約４５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項33】

前記構造脂質は、典型的には、粒子中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～３５ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％又は４５ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項34】

前記活性剤は、ペプチド又はポリペプチドを含むか、あるいは、からなる、請求項１～３３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項35】

前記ポリペプチドは、抗体、好ましくは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント；ヒト化抗体、組換え抗体、組換えヒト抗体、Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（商標）抗体、又はそれらの混合物を含む、請求項３４に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項36】

前記ペプチド又はポリペプチドは、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘導因子、細胞表面受容体、リガンド、ホルモン、小分子（例えば、有機小分子又は化合物）、又はそれらの混合物を含む、請求項３４に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項37】

前記活性剤は、核酸を含むか、あるいは、からなる、請求項１～３３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項38】

前記核酸は、干渉ＲＮＡ分子、好ましくは、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はそれらの混合物を含む、請求項３７に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項39】

前記核酸は、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、免疫刺激オリゴヌクレオチド、又はそれらの混合物を含む、請求項３７に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項40】

前記活性剤は、ｍＲＮＡである、請求項１～３９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項41】

前記活性剤は、脂質粒子の脂質部分内に完全にカプセル化されており、脂質粒子内の活性剤又は治療薬は、水溶液中で、例えば、ヌクレアーゼ又はプロテアーゼによる酵素分解に対して耐性を示す、請求項１～４０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項42】

前記脂質ナノ粒子は、標的細胞の表面上の分子に特異的に結合するターゲティングリガンドを含まない、請求項１～４１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項43】

前記脂質ナノ粒子の平均サイズは、例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定される、約１００ｎｍより大きい、請求項１～３４２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項44】

前記平均サイズは、約７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、１５０ｎｍ、１５５ｎｍ、１６５ｎｍ、１７０ｎｍ、１７５ｎｍ、１８０ｎｍ、１８５ｎｍ、１９０ｎｍ、１９５ｎｍ、２００ｎｍ、２０５ｎｍ、２１０ｎｍ、２１５ｎｍ、２２０ｎｍ、２２５ｎｍ、２３０ｎｍ、２３５ｎｍ、２４０ｎｍ、２４５ｎｍ、２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、２６０ｎｍ、２６５ｎｍ、２７０ｎｍ、２７５ｎｍ、２８０ｎｍ、２８５ｎｍ、２９０ｎｍ、２９５ｎｍ、３００ｎｍ、３０５ｎｍ、３１０ｎｍ、３１５ｎｍ、３２０ｎｍ、３２５ｎｍ、３３０ｎｍ、３３５ｎｍ、３４０ｎｍ、３４５ｎｍ、３５０ｎｍ、３５５ｎｍ、３６０ｎｍ、３６５ｎｍ、３７０ｎｍ、３７５ｎｍ、３８０ｎｍ、３８５ｎｍ、３９０ｎｍ、３９５ｎｍ、４００ｎｍ、４０５ｎｍ、４１０ｎｍ、４１５ｎｍ、４２０ｎｍ、４２５ｎｍ、４３０ｎｍ、４３５ｎｍ、４４０ｎｍ、４４５ｎｍ、４５０ｎｍ、４５５ｎｍ、４６０ｎｍ、４６５ｎｍ、４７０ｎｍ、４７５ｎｍ、４８０ｎｍ、４８５ｎｍ、４９０ｎｍ、又は５００ｎｍより大きく（ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ，ｏｒ ｇｒｅａｔ ｔｈａｎ）てもよい、請求項１～４３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項45】

本発明のナノ粒子の前記平均サイズは、約７５ｎｍ～約５００ｎｍ、約８０ｎｍ～約５００ｎｍ、約９０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５００ｎｍ、約１１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１２０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１３０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１４０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１６０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１７０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１８０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１９０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約２１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２２０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２３０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２４０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２６０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２７０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２８０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３２０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３３０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３４０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３６０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３７０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３８０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３９０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍ、約４１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４２０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４３０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４４０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４６０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４７０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４８０ｎｍ～約５００ｎｍ、又は約４９０ｎｍ～約５００ｎｍであってもよい、請求項１～４３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項46】

本発明のナノ粒子の前記平均サイズは、約１００ｎｍ～約４９０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４８０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４７０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４６０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４４０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４３０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４２０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４３０ｎｍまで、約１００ｎｍ～約４２０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４１０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４００ｎｍ、約１００ｎｍ～約３９０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３８０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３７０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３６０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３５０ｎｍ、約１０００ｎｍ～約３４０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３３０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３２０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３１０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２９０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２８０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２７０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２６０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２４０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２３０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２２０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２１０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１９０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１８０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１７０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１６０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１４０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１３０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１２０ｎｍ、又は約１００ｎｍ～約１１０ｎｍであってもよい、請求項１～４５のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項47】

前記脂質ナノ粒子は、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、又は０．２５などの多分散指数を有する、求項１～４６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項48】

前記脂質ナノ粒子は、約０．１０～約０．２０の多分散指数を有する、請求項１～４６のいずれか１項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項49】

前記ナノ粒子組成物のゼータ電位は、約－５０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、好ましくは、約－２０ｍＶ～約＋５ｍＶである、請求項１～４８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。

【請求項50】

請求項１～４９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項51】

細胞に活性剤を導入する方法であって、好ましくは、細胞がインビボで存在して、請求項１～４９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子と細胞を接触させ、それによって活性剤（例えば、核酸）を細胞に導入することを含む、方法。

【請求項52】

活性剤のインビボ送達のための方法であって、請求項１～４９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、又は請求項５０に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与して、それによって活性剤をインビボで送達することを含む、方法。

【請求項53】

それを必要とする対象において疾患又は状態を治療又は予防するための方法であって、請求項１～４９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子又は請求項５０に記載の医薬組成物を対象に投与して、それによって、それを必要とする対象において疾患又は状態を治療又は予防することを含む、方法。

【請求項54】

細胞、好ましくは哺乳動物細胞において目的のポリペプチドを産生する方法であって、前記方法は、請求項１～４７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、又は請求項５０に記載の医薬組成物と細胞を接触させることを含み、前記活性剤が目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡであって、前記ｍＲＮＡは、細胞内で翻訳されて目的のポリペプチドを産生することが可能である、方法。

【請求項55】

ｍＲＮＡを細胞、好ましくは哺乳動物細胞に送達する方法であって、前記方法は、請求項１～４９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、又は請求項５０に記載の医薬組成物を対象に投与し、ここで前記活性剤はｍＲＮＡであり、それによってｍＲＮＡを細胞に送達することを含む、方法。

【請求項56】

前記細胞は、脾臓に存在する細胞である、請求項５１、５４又は５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項57】

前記脾臓に存在する細胞は、脾臓の細胞又は脾臓に輸送される対象の別の部分に由来する細胞である、請求項５６に記載の方法。

【請求項58】

ｍＲＮＡを標的組織に送達するための方法であって、請求項１～４９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、又は請求項５０に記載の医薬組成物を対象に投与し、ここで前記活性剤はｍＲＮＡであり、それによってｍＲＮＡを標的組織に送達することを含む、方法。

【請求項59】

前記標的組織は、哺乳動物の脾臓である、請求項５５に記載の方法。

【請求項60】

それを必要とする対象において疾患又は状態を治療又は予防するための医薬の製造において、請求項１～４９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、又は請求項５０に記載の医薬組成物。

【請求項61】

それを必要とする対象において疾患又は状態の治療又は予防で用いる、請求項１～４９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子、又は請求項５０に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の技術分野
本発明は、脂質ナノ粒子、脂質ナノ粒子を含む製剤及び前記脂質ナノ粒子及びその製剤を用いて疾患（ｄｉｓｅａｓｅｓ）又は状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）を治療する方法に関する。

【0002】

関連出願
本出願は、オーストラリア仮出願 ＡＵ ２０２１９０２５６７の優先権を主張するものであり、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
小分子薬物、タンパク質、及び核酸などの生物学的に活性な物質の効果的な標的送達は、継続的な医学的課題の典型となる。特に、核酸の細胞への送達は、そのような種の相対的不安定性及び低い細胞透過性により困難である。したがって、核酸のような治療薬及び／又は予防薬の細胞への送達を容易にする方法及び組成物を開発する必要性が存在する。

【0004】

脂質含有ナノ粒子組成物、リポソーム、及びリポプレックスは、小分子薬物、タンパク質、及び核酸などの生物学的に活性な物質の細胞及び／又は細胞内区画への輸送体として有効であることが証明されている。そのような組成物には、一般に、「カチオン性」及び／又はアミノ（イオン化）脂質、多価不飽和脂質を含むリン脂質、構造脂質（例えば、ステロール）、及び／又はポリエチレングリコールを含む脂質（ＰＥＧ脂質）の１つ以上が含まれる。カチオン性及び／又はイオン化脂質（Ｃａｔｉｏｎｉｃ ａｎｄ／ｏｒ ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄｓ）としては、例えば、容易にプロトン化され得るアミン含有脂質が挙げられる。

【0005】

脂質ナノ粒子製剤の送達有効性を改善することを目指して努力なされてきた。かかる努力の多くは、より適切なカチオン性脂質を開発することに向けられてきた。これらの努力にもかかわらず、特に治療上の使用を対象とする脂質ナノ粒子ベースの薬物送達システムに関して、有効性の向上という観点での改善が依然として必要とされている。

【0006】

その結果、有効性を向上する、特に、臓器分布を変化するための新規及び／又は改良された脂質ナノ粒子に対する必要性が存在する。

【0007】

本明細書における任意の先行技術への言及は、この先行技術がいかなる法域においても周知の一般知識の一部を形成していること、又はこの先行技術が当業者によって理解され、関連性があるとみなされ、及び／又は他の先行技術と組み合わされることが合理的に期待され得ることを承認又は示唆するものではない。

【発明の概要】

【0008】

一態様において、本発明は、以下を含む脂質ナノ粒子を提供する：
（ａ）活性剤；
（ｂ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を含むカチオン性及び／又はイオン化脂質；
（ｃ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を含むリン脂質；
（ｄ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を含む構造脂質；
（ｅ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約０．０５ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％未満を含むＰＥＧ化脂質。

【0009】

好ましい実施形態において、脂質粒子中の活性剤又は治療剤が、水溶液中で酵素分解、例えば、ヌクレアーゼ又はプロテアーゼによる分解に対して耐性であるように、活性剤又は治療剤は、脂質粒子の脂質部分内に完全にカプセル化される。他の好ましい実施形態において、脂質粒子は、ヒトのような哺乳動物に対して実質的に非毒性である。

【0010】

一実施形態において、脂質ナノ粒子は、標的細胞の表面上の分子に特異的に結合する標的リガンドを含まない。別法として、脂質ナノ粒子は、標的リガンドを含まない。

【0011】

別の態様において、本発明は、本発明の脂質ナノ粒子及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

【0012】

別の態様において、本発明は、活性剤（例えば、核酸）を細胞に導入する方法を提供しており、好ましくは、細胞は、インビボで存在し、前記方法は、細胞を本発明の脂質ナノ粒子と接触させ、それによって活性剤（例えば、核酸）を細胞に導入することを含む。

【0013】

別の態様において、本発明は、活性剤のインビボ送達のための方法を提供しており、前記方法は、本発明の脂質ナノ粒子を、それを必要とする対象に投与し、それによって対象に活性剤を送達することを含む。

【0014】

別の態様において、本発明は、それを必要とする対象の疾患又は状態を治療又は予防するための方法を提供しており、前記方法は、本発明の脂質ナノ粒子又は医薬組成物を対象に投与し、それによって、それを必要とする対象の疾患又は状態を治療又は予防することを含む。

【0015】

別の態様において、本発明は、それを必要とする対象における疾患又は状態を治療又は予防するための医薬の製造における本発明の脂質ナノ粒子又は医薬組成物を提供する。

【0016】

別の態様において、本発明は、それを必要とする対象における疾患又は状態の治療又は予防で用いるための本発明の脂質ナノ粒子又は医薬組成物を提供する。

【0017】

別の態様において、本発明は、細胞、好ましくは哺乳動物細胞において、目的のポリペプチドを産生する方法を提供しており、前記方法は、細胞を本発明の脂質ナノ粒子と接触させることを含み、前記活性剤は、目的のポリペプチドをコードするｍＲＮＡであり、前記ｍＲＮＡは、細胞内で翻訳されて目的のポリペプチドを産生することができる。

【0018】

別の態様において、本発明は、ｍＲＮＡを細胞、好ましくは哺乳動物細胞に送達する方法を提供しており、前記方法は、前記活性剤がｍＲＮＡである、本発明の脂質ナノ粒子を対象に投与し、それによってｍＲＮＡを細胞に送達することを含む。

【0019】

任意の態様又は実施形態において、細胞は、哺乳動物細胞である。

【0020】

任意の態様又は実施形態において、細胞は。脾臓に位置する細胞である。脾臓に位置する細胞は、脾臓の細胞又は脾臓に輸送される対象の別の部分に由来する細胞であってもよい。

【0021】

任意の実施形態において、脂質ナノ粒子は、肝臓と比較すると、脾臓を優先的に標的とする。一実施形態において、脂質ナノ粒子は、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、又は１４．５を超える脾臓／肝臓の標的比を有する。一実施形態において、脂質ナノ粒子は、約８以上、約１４以上、又は実施例及び図を含む本明細書中に記述されている任意の他の値の脾臓／肝臓の標的比を有する。典型的には、脾臓／肝臓の標的比は、ナノルシフェラーゼアッセイなど、実施例を含む本明細書において記述されているアッセイを用いて決定される。

【0022】

別の態様において、本発明は、標的組織へのｍＲＮＡデリバリーのための方法を提供しており、前記方法は、前記活性剤がｍＲＮＡである、本発明の脂質ナノ粒子を対象に投与し、それによって標的組織にｍＲＮＡを送達することを含む。

【0023】

好ましくは、標的組織は、哺乳動物の脾臓である。

【0024】

別の態様において、本発明は、本発明の脂質ナノ粒子を産生するためのプロセスを提供しており、前記プロセスは、以下を含む；
・カチオン性及び／又はイオン化脂質、リン脂質、構造脂質及びＰＥＧ化脂質の溶液を混合して所望のモル比をもたらすこと、
それによって脂質ナノ粒子を産生すること。

【0025】

好ましくは、プロセスは、脂質を混合する工程に活性剤を添加することをさらに含む。一実施形態において、脂質ナノ粒子は、脂質成分対活性剤が、ｗｔ：ｗｔ比で約５：１～約５０：１の間であるように形成される。一実施形態において、溶液中の最終脂質濃度は、約５．５ｍＭ～約５０ｍＭの間であり、好ましくは、エタノールで希釈される。

【0026】

カチオン性及び／又はイオン化脂質、リン脂質、構造脂質及びＰＥＧ化脂質の溶液を混合して所望のモル比をもたらすことにより、脂質溶液が形成されることができる。一実施形態において、脂質溶液は、Ｎａｎｏ－Ａｓｓｅｍｂｌｅｒマイクロ流体ベースのシステムなどのマイクロ流体システムを用いて、約０．５ｍｌ／分～約８ｍｌ／分の間の流量で、活性剤を含む溶液中に迅速に注入され、それによって、約１：１～約４：１の間、好ましくは３：１の水対エタノール比を有する懸濁液を生成する。

【0027】

典型的には、ＮＰ比（窒素対ホスフェート）は、４～７の間に維持される。

【0028】

一実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子を産生するプロセスは、本明細書中の実施例、例えば、実施例１に記述されている工程の１つ以上、又は全てを含む。

【0029】

本明細書で使用される場合、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ」などの用語の変形は、さらなる添加剤、成分、整数値（ｉｎｔｅｇｅｒｓ）又は工程を除外することを意図するものではない。

【0030】

本発明のさらなる態様及び先の段落に記述されている態様のさらなる実施形態は、例として、かつ添付の図面を参照して与えられる下記の説明から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】図１．ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒを使用する脂質ナノ粒子生成の図解。

【0032】

【図2】図２．ＭＩＰＳ－ＬＮＰの粒径及び多分散性指数。（Ａ）典型的なＭＩＰＳ－ＬＮＰ（ｎ＝３）の初期粒径及び多分散性指数（ＰＤＩ）、これは粒子が、薬学的に許容されるサイズ及び分散性の両方の範囲内に含まれるということを示している。（Ｂ）ＭＩＰＳ－ＬＮＰ対従来のＬＮＰの粒径分布。（Ｃ）０日目、７日目及び６ヵ月目でのＤＭＧ－ＰＥＧを用いて産生された粒子の安定性。

【0033】

【図3】図３．ＤＯＤＡＰ脂質を使用するＭＩＰＳ－ＬＮＰの脾臓送達嗜好性。円グラフは、ＩＭ注射後の筋肉を除いた組織における比例した遺伝子発現を示す。筋肉以外では、ＭＩＰＳ－ＬＮＰ（Ａ）は、用量の＞７５％を脾臓（ピンク色）に送達し、両方のリンパ節（ＤＬＮ及び非ＤＬＮ）にも積極的に送達するが、筋肉組織外では、従来のＬＮＰ（Ｂ）の用量のほとんどが、ＩＭ注射後に肝臓に入り、これはＩＶ注射後の粒子の分布とある程度酷似している。組織のキー（Ｋｅｙ ｔｏ ｔｉｓｓｕｅ）：非ＤＬＮ－非流入領域リンパ節（ｎｏｎ－ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）、ＤＬＮ－流入領域リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ）、ＳＰ－脾臓、ＫＤ－腎臓、ＬＧ－肺、ＬＶ－肝臓。

【0034】

【図4】図４．ＭＩＰＳ－ＬＮＰは、従来のＬＮＰと比較して、脾臓内での遺伝子導入及び発現を増進する。（Ａ）マウスにＭＩＰＳ－ＬＮＰ製剤を筋肉内注射した結果として、従来のＬＮＰと比較して、脾臓での遺伝子発現レベルが～１００倍高くなる（強調表示されたボックス（ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｅｄ ｂｏｘ））。（ｎ＝３又は４）。組織のキー：非ＤＬＮ－非流入領域リンパ節、ＤＬＮ－流入領域リンパ節、ＳＰ－脾臓、ＫＤ－腎臓、ＬＧ－肺、ＬＶ－肝臓、ＱＭ－大腿四頭筋。（Ｂ）マウスにＭＩＰＳ－ＬＮＰ製剤（ＤＯＤＡＰを使用）を静脈注射した結果として、脾臓における遺伝子発現レベルが従来のＬＮＰよりも約５００倍高くなる（強調表示されたボックス）。（ｎ＝２又は３）。ＬＮ１及びＬＮ２－サンプルリンパ節。（Ｃ）ＭＩＰＳ－ＬＮＰの静脈内注射後に選別された脾細胞の分析では、従来のＬＮＰと比較した、遺伝子発現レベルの増強が表示される。１０μｇのＤＯＤＡＰ製剤化ナノルシフェラーゼｍＲＮＡをすべての実験で注射した。

【0035】

【図5】図５．オボアルブミン標的ワクチンのマウスモデルプロトコルの図解。フローサイトメーター及びＦｌｏＪｏソフトウェアを用いて分析を実施した。

【0036】

【図6】図６．ＭＩＰＳ－ＬＮＰは、オボアルブミンのエピトープに対する標的特異的細胞傷害性Ｔ細胞の死滅（ｋｉｌｌｉｎｇ）の増強（ＣＤ８＋細胞応答）を誘導する。オボアルブミンをコードするｍＲＮＡを用いるワクチン接種後の細胞傷害性Ｔ細胞によるオボアルブミンパルス標的細胞のインビボ死滅。データは、非パルス状の細胞と比較した、致死の割合として提示した。各処置につき最低ｎ＝３を使用。データは、１０μｇの投与で、ＭＩＰＳ製剤が完全な殺細胞活性を誘導するのに対し、標準（従来型）ＬＮＰは誘導しないということを示している。

【0037】

【図7】図７．スクロース（Ｓｕｃ）の有無にかかわらず、様々な緩衝液中での凍結融解サイクル前後のＬＮＰの粒径。異なるトリス緩衝液組成を使用した。スクロースもまた、保護剤として使用した。緩衝液間に大きな相違はなかったが、スクロースは、ＭＩＰＳ製剤の凍結融解安定性にとって重要であった。

【0038】

【図8】図８．ナノルシフェラーゼレベルは、０．１５モル％又は１．５モル％のいずれかでＤＳＰＥ－ＰＥＧ又はＤＭＧ－ＰＥＧのいずれかを含むＬＮＰ製剤に、ナノルシフェラーゼｍＲＮＡを静脈内（Ａ）又は筋肉内（大腿四頭筋）（Ｂ）送達した後の、組織の単位質量あたりの相対光単位として表された。ＬＮＰ製剤は、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（５０モル％）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）（１０モル％）、ＰＥＧ化脂質（０．１５モル％又は１．５モル％）、コレステロール（脂質含量の残り、すなわち、それぞれ３９．８５モル％又は３８．５モル％）を含んでいた。（Ａ）ポストホック（ｐｏｓｔ ｈｏｃ）一対比較（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｃｏｍｐａｓｓｉｏｎ）を用いるＡＮＯＶＡ。^＊ｐ＜０．０５，^＊＊ｐ＜０．０１；（Ｂ）ポストホック一対比較（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｃｏｍｐａｓｓｉｏｎ）を用いるＡＮＯＶＡ。^＊ｐ＜０．０５，^＊＊ｐ＜０．０１、点線は、ｔ検定 ^＊ｐ＜０．０５により分析されたデータを示す。組織のキー：ＬＮ１及びＬＮ２－サンプルリンパ節、ＤＬＮ－ＩＭ注射後の流入領域リンパ節、ｎＤＬＡ－非流入領域リンパ節（代替肢）、ＱＭ－大腿四頭筋。

【0039】

【図9】図９．ＤＭＧ－ＰＥＧを含むＬＮＰ製剤の筋肉内データ（図８にも示す）の統計比較。この実験では、ＤＬｉｎＭＣ３ ＤＭＡをＭＩＰＳ製剤に使用した。

【0040】

【図10】図１０．筋肉内注射後の脾臓への組織ターゲティングは、脾臓及び肝臓におけるナノルシフェラーゼ活性を比として比較することにより示される。（Ａ）０．１５モル％のＰＥＧ化脂質を含むＤＭＧ－ＰＥＧ及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ製剤は両方とも、ＩＭ注射後に脾臓を標的とした。（Ｂ）肝臓に対する脾臓へのターゲティングは、低濃度のＤＭＧ－ＰＥＧでより顕著である。

【発明を実施するための形態】

【0041】

実施形態の詳細な説明
次に、本発明の特定の実施形態について詳細に説明する。本発明を実施形態と併せて説明するが、本発明をこれらの実施形態に限定する意図はないことが理解されるであろう。それどころか、本発明は、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれることができる、全ての代替物（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ）、修正物（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）、及び均等物（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ）をカバーすることを意図している。

【0042】

当業者は、本発明の実施において使用され得る、本明細書中に記述されているものと類似又は同等の多くの方法及び材料を認識するであろう。本発明は、記述された方法及び材料に決して限定されない。本明細書において開示及び規定される本発明は、本文又は図面から言及されるか、あるいは明らかな２つ以上の個々の特徴の全ての代替的な組み合わせにまで及ぶことが理解されるであろう。これらの異なる組み合わせは全て、本発明の様々な代替的態様を構成する。

【0043】

本明細書において言及される特許及び刊行物は全て、参照によりその全体が組み込まれる。

【0044】

本明細書の解釈上、単数形で使用される用語は、複数形も含み、逆の場合も同じである。

【0045】

別段の指示がない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。さらに、本明細書において記述されている方法又は材料と類似又は同等の、任意の方法又は材料を本発明の実施に使用することができる。本発明の目的のために、下記の用語を定義する。

【0046】

本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」、又は「ｔｈｅ」という用語は、１つの部材（ｏｎｅ ｍｅｍｂｅｒ）を有する態様を含むだけでなく、２つ以上の部材を有する態様も含む。例えば、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明白に別段の指示をしている場合を除いて複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数のかかる細胞を含み、「薬剤（ｔｈｅ ａｇｅｎｔ）」への言及は、当業者などに既知の一又は複数の薬剤への言及を含む。本明細書の解釈上、単数形で使用される用語は、複数形も含み、逆の場合も同じである。

【0047】

本発明は、脾臓における細胞のトランスフェクションの増加をもたらす脂質ナノ粒子の驚くべき開発に基づいている。これは、脂質ナノ粒子が脾臓の細胞（例えば、脾細胞）の表面上の分子に特異的に結合する標的リガンドを含まないので、驚くべきことである。さらに、従来の脂質ナノ粒子と比較して、本発明の脂質ナノ粒子は、体内の一又は複数の他の部位（例えば、心臓、肝臓、腎臓、肺、血液、及び／又はリンパ節）におけるトランスフェクションを有意に増加させないので、細胞の感染の増加は、脾臓に特異的である。脾臓のこのトランスフェクションの増強は、本発明の脂質ナノ粒子を静脈内に、あるいは筋肉内に投与した場合に観察されるように、投与経路に依存しない。その上、本発明の脂質ナノ粒子によっても提供される利点は、脂質ナノ粒子のＰＥＧ－脂質含量が、ナノ粒子の全脂質の狭いｍｏｌ％範囲内にある場合にのみ生じる。

【0048】

ＰＥＧ－脂質のこの低く狭いｍｏｌ％範囲は、直径が１００ｎｍに等しいか、あるいはより大きいナノ粒子をもたらすが、これは現在の脂質ナノ粒子の直径７０～１００ｎｍのサイズ範囲より大きい。典型的には、本発明の脂質ナノ粒子は、直径が１２５ｎｍより大きく、例えば、１４０～１６０ｎｍなどである。

【0049】

本発明の脂質ナノ粒子のもう一つの特性は、異常に高い負のゼータ電位である。より高電荷の種は、細胞、組織、及び体内の他の要素と不必要に相互作用をする可能性があるため、正又は負の比較的低い電荷を有するナノ粒子が一般的に望ましい。しかしながら、本発明の脂質ナノ粒子は、高い負のゼータ電位を有し、驚くべきことに、脾臓における受動的ターゲティングの増加を示す。

【0050】

最後に、本発明の脂質ナノ粒子は、長期間、例えば、４℃で少なくとも５ヶ月間安定である。

【0051】

いかなる理論又は作用機序にもとらわれず、粒径の増大が、食細胞による相互作用及び更新を増強し、高度に負のゼータ電位と併せて、脾臓送達及び抗原提示細胞のトランスフェクションを促進すると考えられている。

【0052】

脂質ナノ粒子は、本明細書において記述されているような、多くの用途を有するが、脾臓の細胞のトランスフェクションの増強は、ワクチンに見出されるような抗原性分子又は免疫原性分子（又は抗原性分子若しくは免疫原性分子を産生するように細胞を誘導する分子）のための特に有益な送達ビヒクル（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅ）を提供する。脾細胞ターゲティングは、免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）阻害のためのタンパク質の発現などの多くの応用、並びにＭＩＰＳ製剤による標的ｍＲＮＡデリバリーを介した、抗原特異的耐性、一般的な耐性の誘導を誘導する、他の応用、並びにｍＲＮＡデリバリー、ｓｉＲＮＡデリバリー、他の分子（例えば、ＭＩＰＳ ＬＮＰに組み込まれた小薬物など）を用いる、ＤＮＡ又は他の任意の核酸又はｍＲＮＡデリバリーの手段を介した、自己免疫疾患に対抗すること、脾細胞によって引き起こされる炎症を軽減すること又はアレルギー反応及びアナフィラキシー反応を軽減することにおける応用にとって魅力的である。

【0053】

定義
本明細書で使用する場合、一又は複数の目的の値に適用される「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」及び「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、記載された基準値に類似する値を指す。特定の実施形態において、「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」又は「約（ａｂｏｕｔ）」という用語は、別段の記載がない限り、あるいは文脈上明白な場合を除き（そのような数値が可能値の１００％を超える場合を除く）、いずれの方向（より大きいか、あるいはより小さい）にしても、記載された基準値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ以下に収まる値の範囲を指す。例えば、ナノ粒子組成物の脂質成分中の所与の化合物の量の文脈で使用される場合、「約」は、言及された値の±１０％を意味することができる。例えば、約４０％の所与の化合物を有する脂質成分を含むナノ粒子組成物は、３０～５０％の化合物を含む可能性がある。

【0054】

ナノ粒子
本発明のナノ粒子の平均サイズは、例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって測定される約１００ｎｍより大きくてもよい。例えば、平均粒径は、約７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、１５０ｎｍ、１５５ｎｍ、１６５ｎｍ、１７０ｎｍ、１７５ｎｍ、１８０ｎｍ、１８５ｎｍ、１９０ｎｍ、１９５ｎｍ、２００ｎｍ、２０５ｎｍ、２１０ｎｍ、２１５ｎｍ、２２０ｎｍ、２２５ｎｍ、２３０ｎｍ、２３５ｎｍ、２４０ｎｍ、２４５ｎｍ、２５０ｎｍ、２５５ｎｍ、２６０ｎｍ、２６５ｎｍ、２７０ｎｍ、２７５ｎｍ、２８０ｎｍ、２８５ｎｍ、２９０ｎｍ、２９５ｎｍ、３００ｎｍ、３０５ｎｍ、３１０ｎｍ、３１５ｎｍ、３２０ｎｍ、３２５ｎｍ、３３０ｎｍ、３３５ｎｍ、３４０ｎｍ、３４５ｎｍ、３５０ｎｍ、３５５ｎｍ、３６０ｎｍ、３６５ｎｍ、３７０ｎｍ、３７５ｎｍ、３８０ｎｍ、３８５ｎｍ、３９０ｎｍ、３９５ｎｍ、４００ｎｍ、４０５ｎｍ、４１０ｎｍ、４１５ｎｍ、４２０ｎｍ、４２５ｎｍ、４３０ｎｍ、４３５ｎｍ、４４０ｎｍ、４４５ｎｍ、４５０ｎｍ、４５５ｎｍ、４６０ｎｍ、４６５ｎｍ、４７０ｎｍ、４７５ｎｍ、４８０ｎｍ、４８５ｎｍ、４９０ｎｍ、又は５００ｎｍより大きいか、あるいはより大きく（ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ， ｏｒ ｇｒｅａｔ ｔｈａｎ）てもよい。

【0055】

いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子の平均粒径は、約７５ｎｍ～約５００ｎｍ、約８０ｎｍ～約５００ｎｍ、約９０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１００ｎｍ～約５００ｎｍ、約１１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１２０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１３０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１４０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１６０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１７０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１８０ｎｍ～約５００ｎｍ、約１９０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２００ｎｍ～約５００ｎｍ、約２１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２２０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２３０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２４０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２６０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２７０ｎｍ～約５００ｎｍ、約２８０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３００ｎｍ～約５００ｎｍ、約３１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３２０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３３０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３４０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３６０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３７０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３８０ｎｍ～約５００ｎｍ、約３９０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４００ｎｍ～約５００ｎｍ、約４１０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４２０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４３０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４４０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４５０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４６０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４７０ｎｍ～約５００ｎｍ、約４８０ｎｍ～約５００ｎｍ、又は約４９０ｎｍ～約５００ｎｍであってもよい。

【0056】

いくつかの実施形態において、本発明のナノ粒子の平均粒径は、約１００ｎｍ～約４９０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４８０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４７０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４６０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４４０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４３０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４２０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４３０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４２０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４１０ｎｍ、約１００ｎｍ～約４００ｎｍ、約１００ｎｍ～約３９０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３８０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３７０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３６０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３５０ｎｍ、約１０００ｎｍ～約３４０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３３０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３２０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３１０ｎｍ、約１００ｎｍ～約３００ｎｍ、約１００ｎｍ～約２９０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２８０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２７０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２６０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２４０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２３０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２２０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２１０ｎｍ、約１００ｎｍ～約２００ｎｍ、約１００ｎｍ～約１９０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１８０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１７０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１６０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１４０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１３０ｎｍ、約１００ｎｍ～約１２０ｎｍ、又は約１００ｎｍ～約１１０ｎｍであってもよい。

【0057】

ナノ粒子は比較的均質であってもよい。多分散性指数は、ナノ粒子組成物の均質性、例えば、ナノ粒子組成物の粒度分布を示すために使用されてもよい。小さい（例えば、０．３未満）多分散性指数は、一般に、狭い粒度分布を示す。ナノ粒子組成物は、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、又は０．２５などの多分散性指数を有することができる。いくつかの実施形態において、ナノ粒子組成物の多分散性指数は、約０．１０～約０．２０であってもよい。

【0058】

本明細書で使用する場合、「ゼータ電位」とは、例えば、ナノ粒子中の脂質の界面動電位である。

【0059】

ナノ粒子のゼータ電位は、粒子の界面動電位を示すために使用されることができる。例えば、ゼータ電位は、ナノ粒子の表面電荷を表すことができる。より高電荷の種は、細胞、組織、及び体内の他の要素と望ましくない相互作用をする可能性があるため、正又は負の比較的低い電荷を有するナノ粒子が一般的に望ましい。しかしながら、現在の脂質ナノ粒子は、異常に高い負のゼータ電位を有する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子のゼータ電位は、約－５０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、好ましくは約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶであることができる。いくつかの実施形態において、ナノ粒子のゼータ電位は、－５０ｍＶ～＋１０ｍＶ、好ましくは－１０ｍＶ～＋５ｍＶであることができる。さらに、いくつかの実施形態において、ナノ粒子のゼータ電位は、約－２０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－１５ｍＶ～約－５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－２０ｍＶ～約－１０ｍＶであってもよい。さらに、いくつかの実施形態において、ナノ粒子のゼータ電位は、－２０ｍＶ～－５ｍＶ、－１５ｍＶ～－５ｍＶ、－１０ｍＶ～－５ｍＶ、－２０ｍＶ～－１０ｍＶであってもよい。さらに、いくつかの実施形態において、ナノ粒子のゼータ電位は、約－５ｍＶ、約－１０ＭＶ、約－１５ｍＶ又は約－２０ｍＶであってもよい。その上、いくつかの実施形態において、ナノ粒子のゼータ電位は、－５ｍＶ、－１０ｍＶ、－１５ｍＶ又は－２０ｍＶであってもよい。

【0060】

脂質ナノ粒子は、実施例１などの実施例に列挙されたものを含む、本明細書において記述されているいずれか１つであってもよい。

【0061】

カチオン性及び／又はイオン化脂質
様々なカチオン性脂質のいずれかが、本発明の脂質ナノ粒子に使用されることができる。

【0062】

本発明で有用であるカチオン性脂質は、生理的ｐＨで正味の正電荷を有する多数の脂質種のいずれかであり得る。かかる脂質には、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２－ジオエイルオキシ－３－（ジメチルアミノ）プロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、３－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－Ｃｈｏｌ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロップ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパナミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、３－ジメチルアミノ－２－（コレスト－５－エン－３－β－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣＬｉｎＤＭＡ）、２－［５’－（コレスト－５－エン－３．β．－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス，シス－９’，１－２’－オクタデカジエノキシ）プロパン（ＣｐＬｉｎＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（ＤＭＯＢＡ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＣＤＡＰ）、４－ヒドロキシブチル）アザンジイル）ビス（ヘキサン－６，１－ジイル）ビス（２－ヘキシルデカノエート）（ＡＬＣ－０３１５）、８－［（２－ヒドロキシエチル）［６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル］アミノ］－オクタン酸，１－オクチルノニルエステル（ＳＭ－１０２）及びこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。これらの脂質及び関連類似体の多くは、米国特許公開第２００６００８３７８０号及び第２００６０２４０５５４号；米国特許第５，２０８，０３６号；同第５，２６４，６１８号；同第５，２７９，８３３号；同第５，２８３，１８５号；同第５，７５３，６１３号；及び同第５，７８５，９９２号；並びにＰＣＴ公開第ＷＯ ９６／１０３９０号に記述されており、これらの開示はそれぞれ、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、カチオン性脂質の多数の市販製剤が入手可能であり、本発明で使用され得る。これらには、例えば、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡ及びＤＯＰＥを含む市販のカチオン性リポソーム、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎ．Ｙ．、ＵＳＡ製）；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＤＯＳＰＡ及びＤＯＰＥを含む市販のカチオン性リポソーム、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ製）；及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（ＤＯＧＳを含む市販のカチオン性リポソーム、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ、ＵＳＡ製）が含まれる。

【0063】

さらに、下記の構造を有する式Ｉのカチオン性脂質は、本発明において有用である。

【化1】

ここで、Ｒ^１及びＲ^２は、独立して選択され、Ｈ又はＣ_１－Ｃ_３アルキルであり、Ｒ^３及びＲ^４は、独立して選択され、約１０～約２０の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ^３及びＲ^４の少なくとも１つは、少なくとも２つの不飽和部位を含む。特定の例において、Ｒ^３及びＲ^４は両方とも同じであり、すなわち、Ｒ^３及びＲ^４は両方ともリノレイル（Ｃ_１８）などである。特定の他の例において、Ｒ^３及びＲ^４は相違しており、すなわち、Ｒ^３はテトラデクトリエニル（Ｃ_１４）であり、Ｒ^４はリノレイル（Ｃ_１８）である。好ましい実施態様において、式Ｉのカチオン性脂質は対称であり、すなわち、Ｒ^３及びＲ^４は両方とも同じである。別の好ましい実施形態において、Ｒ^３及びＲ^４は、両方とも少なくとも２つの不飽和部位を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ^３及びＲ^４は、ドデカジエニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、リノレイル、及びイコサジエニルからなる群より独立して選択される。好ましい実施形態において、Ｒ３及びＲ４は両方ともリノレイルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^３及びＲ^４は、少なくとも３つの不飽和部位を含み、例えば、ドデカトリエニル、テトラデカトリエニル、ヘキサデカトリエニル、リノレニル、及びイコサトリエニルから独立して選択される。特に好ましい実施形態において、式Ｉのカチオン性脂質は、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）又は１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）である。

【0064】

さらに、下記の構造を有する式ＩＩのカチオン性脂質は、本発明において有用である。

【化2】

ここで、Ｒ^１及びＲ^２は、独立して選択され、Ｈ又はＣ_１－Ｃ_３アルキルであり、Ｒ^３及びＲ^４は、独立して選択され、約１０～約２０の炭素原子を有するアルキル基であり、Ｒ^３及びＲ^４の少なくとも１つは、少なくとも２つの不飽和部位を含む。特定の例において、Ｒ^３及びＲ^４は両方とも同じであり、すなわち、Ｒ^３及びＲ^４は両方ともリノレイル（Ｃ_１８）などである。特定の他の例において、Ｒ^３及びＲ^４は相違しており、すなわち、Ｒ^３はテトラデクトリエニル（Ｃ_１４）であり、Ｒ^４はリノレイル（Ｃ_１８）である。好ましい実施態様において、本発明のカチオン性脂質は対称であり、すなわち、Ｒ^３及びＲ^４は両方とも同じである。別の好ましい実施形態において、Ｒ^３及びＲ^４は、両方とも少なくとも２つの不飽和部位を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ^３及びＲ^４は、ドデカジエニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、リノレイル、及びイコサジエニルからなる群より独立して選択される。好ましい実施形態において、Ｒ^３及びＲ^４は両方ともリノレイルである。いくつかの実施形態において、Ｒ^３及びＲ^４は、少なくとも３つの不飽和部位を含み、例えば、ドデカトリエニル、テトラデカトリエニル、ヘキサデカトリエニル、リノレニル、及びイコサトリエニルから独立して選択される。

【0065】

その上、下記の構造（又はその塩）を有する式ＩＩＩのカチオン性脂質は、本発明において有用である。

【化3】

ここで、Ｒ^１及びＲ^２は、同じか、あるいは相違しており、独立して、任意に置換されたＣ_１２－Ｃ_２４アルキル、任意に置換されたＣ_１２－Ｃ_２４アルケニル、任意に置換されたＣ_１２－Ｃ_２４アルキニル、又は任意に置換されたＣ_１２－Ｃ_２４アシルであり；Ｒ^３及びＲ^４は、同じか、あるいは相違しており、独立して、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキル、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルケニル、又は任意に置換されたＣ_１－Ｃ_５アルキニルであるか、あるいはＲ^３及びＲ^４は、結合して、４～６個の炭素原子及び窒素及び酸素から選択される１又は２個のヘテロ原子の任意に置換された複素環を形成してもよい；Ｒ５は、存在しないか、あるいは水素又は第４級アミンを提供するためのＣ_１－Ｃ_６アルキルのいずれかであり、；ｍ、ｎ及びｐは、同じか、あるいは相違しており、独立して０又は１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎ及びｐは、同時に０ではない；ｑは、０、１、２、３又は４であり；そしてＹ及びＺは、同じか、あるいは相違しており、独立してＯ、Ｓ又はＮＨである。

【0066】

いくつかの実施形態において、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、２，２－ジリノレイル－４－（２－ジメチルアミノエチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ；「ＸＴＣ２」）、２，２－ジリノレイル－４－（３－ジメチルアミノプロピル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ３－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－（４－ジメチルアミノブチル）－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ４－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－５－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ６－ＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－Ｎ－メチルペピアジノ－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＭＰＺ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレオイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレオイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレオイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃ１）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃ１）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、又はそれらの混合物である。好ましい実施形態において、式ＩＩＩのカチオン性脂質は、ＤＬｉｎ－Ｋ－Ｃ２－ＤＭＡ（ＸＴＣ２）である。

【0067】

好ましくは、カチオン性脂質は、ＤＯＤＡＰ、ＤＬｉｎ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ、ＤＬｉｎ－Ｋ２－ＤＭＡ ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡである。

【0068】

カチオン性脂質は、典型的には、粒子中に存在する全脂質の約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約５５ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約４５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、約５０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％、又は約５５ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を含む。

【0069】

カチオン性脂質は、典型的には、粒子中に存在する全脂質の約４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９又は６０ｍｏｌ％を含む。

【0070】

リン脂質
本明細書で使用する場合、「リン脂質」とは、リン酸部分及び不飽和脂肪酸鎖などの、一又は複数の炭素鎖を含む脂質である。リン脂質は、一又は複数の多重（例えば、二重又は三重）結合（例えば、一又は複数の不飽和）を含むことができる。特定のリン脂質は、膜への融合を促進することができる。例えば、カチオン性リン脂質は、膜（例えば、細胞膜又は細胞内膜）の一又は複数の負に帯電したリン脂質と相互作用することができる。リン脂質の膜への融合は、一又は複数の脂質含有組成物の要素が膜を通過することを可能にし、例えば、一又は複数の要素を細胞に送達することを可能にする。

【0071】

脂質ナノ粒子又は組成物の脂質成分は、一又は複数のリン脂質、例えば、一又は複数の（ポリ）不飽和脂質を含むことができる。リン脂質は、一又は複数の脂質二重層に集合することができる。一般に、リン脂質は、リン脂質部分及び一又は複数の脂肪酸部分を含むことができる。例えば、リン脂質は、式（ＩＶ）による脂質であってもよい：

【化4】

これはリン脂質部分を表しており、Ｒ及びＲ’は、同じであっても異なっていてもよい、不飽和を有するか、あるいは有さない脂肪酸部分を表す。リン脂質部分は、以下からなる非限定的な群より選択されることができる：
・ホスファチジルコリン、
・ホスファチジルエタノールアミン、
・ホスファチジルグリセロール、
・ホスファチジルセリン、
・ホスファチジン酸、
・２－リゾホスファチジルコリン、及び
・スフィンゴミエリン。

【0072】

脂肪酸部分は、以下からなる非限定的な群より選択されることができる：
・ラウリン酸、
・ミリスチン酸、
・ミリストレイン酸、
・パルミチン酸、
・パルミトレイン酸、
・ステアリン酸、
・オレイン酸、
・リノール酸、
・α－リノレン酸、
・エルカ酸、
・フィタン酸、
・アラキジン酸、
・アラキドン酸、
・エイコサペンタエン酸、
・ベヘン酸、
・ドコサペンタエン酸、
・ドコサヘキサエン酸。

【0073】

分岐、酸化、環化及びアルキンを含む修飾及び置換を有する天然種を含む、非天然種もまた、意図される。例えば、リン脂質は、一又は複数のアルキン（例えば、一又は複数の二重結合が三重結合で置換されたアルケニル基）で官能基化されるか、あるいは架橋されてもよい。適切な反応条件下では、アルキン基は、アジドに曝露されると、銅触媒環状付加反応を受ける。かかる反応は、ナノ粒子組成物の脂質二重層を官能化して膜透過又は細胞認識を促進するか、あるいは、ナノ粒子組成物をターゲティング又はイメージング部分（例えば、色素）のような有用成分と結合させるのに有用である。

【0074】

意図されるのは、例えば、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、ケファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、ステアロイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、及びこれらの混合物などのリン脂質である。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質もまた、使用され得る。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ_１０－Ｃ_２４炭素鎖を有する脂肪酸由来のアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。

【0075】

いくつかの実施形態において、ナノ粒子組成物はＤＳＰＣを含む。特定の実施形態において、ナノ粒子組成物はＤＯＰＥを含む。いくつかの実施形態において、ナノ粒子組成物は、ＤＳＰＣ及びＤＯＰＥの両方を含む。

【0076】

リン脂質は、典型的には、粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約１５ｍｏｌ％、約５ｍｏｌ％～約１０ｍｏｌ％、約１０ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％、又は約１５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を含む。

【0077】

リン脂質は、典型的には、粒子中に存在する全脂質の５ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％～１５ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％～１０ｍｏｌ％、１０ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％、又は１５ｍｏｌ％～２０ｍｏｌ％を含む。

【0078】

構造脂質
ナノ粒子組成物の脂質成分は、一又は複数の構造脂質を含むことができる。構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、トマチジン、トマチン、ウルソール酸、α－トコフェロール、及びこれらの混合物からなる群より選択され得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、構造脂質はコレステロールである。いくつかの実施形態において、構造脂質は、コレステロール及びコルチコステロイド（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、及びヒドロコルチゾンなど）、又はその組み合わせを含む。さらに、構造脂質は、スクアレン、スクアレン又はその組み合わせであってもよい。

【0079】

構造脂質は、ゲラニルアセテート、ファルネシルアセテート又はゲラニル－ゲラニル、又はエーテル、エステル、又は他の誘導体を含む脂質を含んでもよい。

【0080】

構造脂質は、典型的には、粒子中に存在する全脂質の約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４５ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約４０ｍｏｌ％、約３０ｍｏｌ％～約３５ｍｏｌ％、約３５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、約４０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％、又は約４５ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を含む。

【0081】

構造脂質は、典型的には、粒子中に存在する全脂質の３０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～４５ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～４０ｍｏｌ％、３０ｍｏｌ％～３５ｍｏｌ％、３５ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、４０ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％、又は４５ｍｏｌ％～５０ｍｏｌ％を含む。

【0082】

ＰＥＧ化脂質
脂質ナノ粒子又は組成物の脂質成分は、一又は複数のＰＥＧ又はＰＥＧ修飾脂質を含むことができる。そのような種は、その代わりにＰＥＧ化脂質と呼ばれる可能性がある。本明細書で使用する場合、「ＰＥＧ脂質」又は「ＰＥＧ化脂質」は、ポリエチレングリコール成分を含む脂質を指す。ＰＥＧ脂質は、以下からなる非限定的な群より選択されることができる：
・ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、
・ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、
・ＰＥＧ修飾セラミド、
・ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、
・ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、
・ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロール、及び
・それらの混合物。

【0083】

例えば、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ＤＬＰＥ、ＰＥＧ－ＤＭＰＥ、ＰＥＧ－ＤＰＰＣ、又はＰＥＧ－ＤＳＰＥ脂質であることができる。

【0084】

別の実施形態において、ＰＥＧ化脂質は、ＤＭＧ－ＰＥＧとしても知られている、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００であってもよい。

【0085】

別の実施形態において、ＰＥＧ化脂質は、２－［（ポリエチレングリコール）－２０００］－Ｎ，Ｎ－ジテトラデシルアセトアミド（ＡＬＣ－０１５９）であってもよい。

【0086】

ＰＥＧ化脂質は、約１００ダルトン（Ｄａ）～１０，０００Ｄａ又は望ましいそれ以上（場合により０．１～１０ｋＤａを含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない、実際的に望ましい任意の分子量（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ）の分子量（ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）を有するＰＥＧ成分を有してもよい。ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａ～約１０，０００Ｄａ以上を含むがこれらに限定されない広い範囲のものであってもよい。ＰＥＧは、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、及び１００Ｄａを含むが、これらに限定されない、約１００Ｄａ～約１００，０００Ｄａであってもよい。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１００Ｄａ～１０，０００Ｄａ、約１０００Ｄａ～９，０００Ｄａ、約１０００Ｄａ～８，０００Ｄａ、約１０００Ｄａ～７，０００Ｄａ、約１０００Ｄａ～６，０００Ｄａ、約１０００Ｄａ～５，０００Ｄａ、約１０００Ｄａ～４，０００Ｄａ、約１０００Ｄａ～３，０００Ｄａ、又は約１０００Ｄａ～２，０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１０００Ｄａ～５０００Ｄａである。いくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約２，０００Ｄａ～５，０００Ｄａである。

【0087】

ＰＥＧ化脂質は、典型的には、粒子中に存在する全脂質の約０．０５ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．０６ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．０７ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．０８ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．０９ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．１ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．１５ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．２ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．２５ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．３ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．３ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．３５ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．４ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．４５ｍｏｌ％～約０．５ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．４５ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．４ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．３５ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．３ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．２５ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．２ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．１５ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．１ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．０９ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．０８ｍｏｌ％、約０．０５ｍｏｌ％～約０．０７ｍｏｌ％、又は約０．０５ｍｏｌ％～約０．０６ｍｏｌ％を含む。

【0088】

ＰＥＧ化脂質は、典型的には、粒子中に存在する全脂質の０．０５ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．０６ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．０７ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．０８ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．０９ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．１ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．１５ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．２ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．２５ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．３ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．３ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．３５ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．４ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．４５ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．４５ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．４ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．３５ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．３ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．２５ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．２ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．１５ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．１ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．０９ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．０８ｍｏｌ％、０．０５ｍｏｌ％～０．０７ｍｏｌ％、又は０．０５ｍｏｌ％～０．０６ｍｏｌ％を含む。

【0089】

ＰＥＧ化脂質は、典型的には、粒子中に存在する全脂質の０．０５ｍｏｌ％、０．０６ｍｏｌ％、０．０７ｍｏｌ％、０．０８ｍｏｌ％、０．０９ｍｏｌ％、０．１ｍｏｌ％、０．１５ｍｏｌ％、０．２ｍｏｌ％、０．２５ｍｏｌ％、０．３ｍｏｌ％、０．３５ｍｏｌ％、０．４ｍｏｌ％、又は０．４５ｍｏｌ％を含む。

【0090】

本明細書で使用する場合、モル％及びｍｏｌ％は同義で使用される。

【0091】

活性剤
脂質ナノ粒子は、一又は複数の治療薬及び／又は予防薬を含むことができる。本開示は、治療薬及び／又は予防薬を哺乳動物細胞又は器官に送達する方法、任意に哺乳動物細胞において目的のポリペプチドを産生する方法、及び治療薬及び／又は予防薬を含む脂質ナノ粒子を哺乳動物に投与すること及び／又は哺乳動物細胞と接触させることを含む、それを必要とする哺乳動物の疾患又は障害を治療する方法を特徴とする。

【0092】

治療薬及び／又は予防薬は、生物学的に活性な物質を含み、その代わりに「活性剤」と呼ばれる。治療薬及び／又は予防薬は、一旦細胞又は器官に送達されると、細胞、器官、又は他の身体組織又は体系に望ましい変化をもたらす物質であることができる。そのような薬剤は、一又は複数の疾患、障害、又は状態の治療に有用であることができる。いくつかの実施形態において、治療薬及び／又は予防薬は、特定の疾患、障害、又は状態の治療に有用な小分子薬物である。ナノ粒子組成物において有用な薬剤の例には、抗腫瘍薬（ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）（例えば、ビンクリスチン、ドキソルビシン、ミトキサントロン、カンプトテシン、シスプラチン、ブレオマイシン、シクロホスファミド、メトトレキセート、及びストレプトゾトシン）、抗がん剤（ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｇｅｎｔｓ）（例えば、アクチノマイシンＤ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シスチンアラビノシド、アントラサイクリン、アルキル化剤、白金化合物、代謝拮抗剤、及びメトトレキサート及びプリン及びピリミジンアナログなどのヌクレオシドアナログ）、抗感染剤、局所麻酔薬（例えば、ジブカイン及びクロルプロマジン）、βアドレナリン遮断薬（例えば、プロプラノロール、チモロール、及びラベトロール（ｌａｂｅｔｏｌｏｌ））、抗高血圧薬（例えば、クロニジン及びヒドララジン）、抗うつ薬（例えば、イミプラミン、アミトリプチリン、及びドキセピム（ｄｏｘｅｐｉｍ））、抗けいれん薬（ａｎｔｉ－ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔｓ）（例えば、フェニトイン）、抗ヒスタミン薬（例えば、ジフェンヒドラミン、クロルフェニリミン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｉｒｉｍｉｎｅ）、及びプロメタジン）、抗生物質製剤／抗菌剤（例えば、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、及びセフォキシチン）、抗真菌薬（例えば、ミコナゾール、テルコナゾール、エコナゾール、イソコナゾール、ブタコナゾール（ｂｕｔａｃｏｎａｚｏｌｅ）、クロトリマゾール、イトラコナゾール、ナイスタチン、ナフチフィン、及びアムホテリシンＢ）、抗寄生虫剤、ホルモン、ホルモン拮抗薬、免疫調節剤、神経伝達物質拮抗薬、抗緑内障薬、ビタミン、麻酔薬、及び造影剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0093】

本発明は、一又は複数の活性剤を含む新規な脂質ナノ粒子、脂質粒子を製造する方法、及び脂質ナノ粒子を送達及び／又は投与する方法（例えば、疾患又は障害の治療のため）を提供する。

【0094】

一態様において、本発明は以下を含む脂質ナノ粒子を提供する：
（ａ）活性剤
（ｂ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約４０ｍｏｌ％～約６０ｍｏｌ％を含むカチオン性及び／又はイオン化脂質
（ｃ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％を含むリン脂質；
（ｄ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約３０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％を含む構造脂質；
（ｅ）ナノ粒子中に存在する全脂質の約０．０５ｍｏｌ％～０．５ｍｏｌ％未満を含むＰＥＧ化脂質。

【0095】

本明細書で使用する場合、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）は「脂質成分」と呼ばれる可能性がある。

【0096】

特定の実施形態において、活性剤又は治療薬は、脂質ナノ粒子中の活性剤が、例えば、ヌクレアーゼ又はプロテアーゼによる酵素分解に対して水溶液中で耐性を有示すように、脂質粒子の脂質部分内に完全に封入される。特定の他の実施形態において、脂質ナノ粒子は、ヒトなどの哺乳動物に対して実質的に無毒性である。

【0097】

いくつかの実施形態において、活性剤又は治療薬は、核酸を含む。特定の実施態様において、核酸は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ａｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はそれらの混合物などの干渉ＲＮＡ分子を含む。特定の他の実施態様において、核酸は、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、免疫刺激性オリゴヌクレオチド、若しくはそれらの混合物のようなＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを含む。

【0098】

脂質ナノ粒子中のｍＲＮＡの量は、ｍＲＮＡのサイズ、配列、及び他の特性に依存する可能性がある。脂質ナノ粒子中のｍＲＮＡの量はまた、脂質ナノ粒子のサイズ、組成、所望の標的、及び他の特性にも依存する可能性がある。ｍＲＮＡ及び他の要素（例えば、脂質）の相対量もまた、変化する可能性がある。いくつかの実施形態において、ナノ粒子組成物中のｍＲＮＡに対する脂質成分のｗｔ／ｗｔ比は、約５：１～約５０：１、例えば、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１、１２：１、１３：１、１４：１、１５：１、１６：１、１７：１、１８：１、１９：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、及び５０：１などであることができる。例えば、ｍＲＮＡに対する脂質成分のｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１～約４０：１であってもよい。ナノ粒子組成物中のｍＲＮＡの量は、例えば、吸光分光法（例えば、紫外可視分光法）を用いて測定されることができる。

【0099】

いくつかの実施形態において、ナノ粒子組成物中のｍＲＮＡに対する脂質成分のｗｔ／ｗｔ比は、約５：１～約５０：１である。特定の実施形態において、ｗｔ／ｗｔ比は、約１０：１～約４０：１である。

【0100】

いくつかの実施形態において、一又は複数のｍＲＮＡ、脂質、及びそれらの量は、特定のＮ：Ｐ比を提供するように選択されることができる。組成物のＮ：Ｐ比は、ｍＲＮＡ中のリン酸基の数に対する、一又は複数の脂質中の窒素原子のモル比を指す。一般に、Ｎ：Ｐ比は低い方が好ましい。一又は複数のｍＲＮＡ、脂質、及びそれらの量は、約２：１～約８：１、例えば、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、及び８：１などのＮ：Ｐ比を提供するように選択されることができる。特定の実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約２：１～約５：１であってもよい。好ましい実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約４：１であってもよい。他の実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約５：１～約８：１である。例えば、Ｎ：Ｐ比は、約５．０：１、約５．５：１、約５．６７：１、約６．０：１、約６．５：１、又は約７．０：１であってもよい。

【0101】

いくつかの実施形態において、ナノ粒子組成物のＮ：Ｐ比は、約２：１～約８：１である。特定の実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約２：１～約５：１である。好ましい実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約４：１である。特定の実施形態において、Ｎ：Ｐ比は、約５：１～約８：１である。例えば、Ｎ：Ｐ比は、約５．０：１、約５．５：１、約５．６７：１、約６．０：１、約６．５：１、又は約７．０：１であってもよい。

【0102】

他の実施形態において、活性剤又は治療薬は、ペプチド又はポリペプチドを含む。特定の例において、ペプチド又はポリペプチドは、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント；ヒト化抗体、組換え抗体、組換えヒト抗体、Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ（商標）抗体、又はそれらの混合物などの抗体を含む。特定の他の実施態様において、ペプチド又はポリペプチドは、サイトカイン、成長因子、アポトーシス因子、分化誘導因子、細胞表面レセプター、リガンド、ホルモン、小分子（例えば、有機小分子（ｓｍａｌｌ ｏｒｇａｎｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）又は化合物）、又はそれらの混合物を含む。

【0103】

いくつかの実施形態において、活性剤は、治療剤、又はその塩若しくは誘導体である。治療薬誘導体は、それら自体に治療効果があるか、あるいはさらなる修飾により活性となる、プロドラッグであってもよい。したがって、一実施形態において、治療薬誘導体は、未修飾の薬剤と比較して、一部又は全ての治療活性を保持するが、別の実施形態において、治療薬誘導体は、治療活性を欠くが、さらなる修飾により活性となるプロドラッグである。

【0104】

Ａ．核酸
特定の実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、核酸と結合し（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）、核酸－脂質ナノ粒子（例えば、ＮＡＬＰ）をもたらす。いくつかの実施形態において、核酸は、脂質粒子中に完全に封入される。本明細書で使用する場合、「核酸」という用語は、任意のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含み、最大で６０までのヌクレオチドを含む断片は一般にオリゴヌクレオチドと称され、より長い断片はポリヌクレオチドと称される。

【0105】

特定の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、約１５～約６０ヌクレオチド長である。核酸は、本発明の脂質粒子中に単独で、あるいはペプチド、ポリペプチド、又は従来の薬物のような小分子を含む本発明の脂質ナノ粒子と組み合わせて（例えば、共投与）投与されることができる。

【0106】

本発明の文脈において、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然に存在する塩基、糖及びインターシュガー（ｉｎｔｅｒｓｕｇａｒ）（バックボーン）リンケージからなるヌクレオチド又はヌクレオシドモノマーのポリマー又はオリゴマーを指す。「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、天然に存在しないモノマー、又はその一部を含むポリマー又はオリゴマーも含み、これらは同様に機能する。そのような修飾オリゴヌクレオチド又は置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込みの促進、免疫原性の低下、ヌクレアーゼの存在下での安定性の向上などの特性のために、しばしば天然型よりも好まれる。

【0107】

オリゴヌクレオチドは、一般に、デオキシリボオリゴヌクレオチド又はリボオリゴヌクレオチドに分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、デオキシリボースと呼ばれる五炭糖からなり、この糖の５’及び３’の炭素でホスフェートに共有結合して、交互の、非分岐ポリマー（ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｎｇ，ｕｎｂｒａｎｃｈｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ）を形成する。リボオリゴヌクレオチドは、五炭糖がリボースである同様の反復構造からなる。

【0108】

本発明による核酸－脂質ナノ粒子中に存在する核酸は、既知である任意の形態の核酸を含む。本明細書において使用される核酸は、一本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ前駆体、成熟ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、又は二本鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドであり得る。二本鎖ＤＮＡの例は、本明細書において記述されており、例えば、構造遺伝子、制御領域及び終端領域を含む遺伝子、並びにウイルスＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡのような自己複製系を含む。二本鎖ＲＮＡの例は、本明細書において記述されており、例えば、ｓｉＲＮＡ、並びにａｉＲＮＡ及びｐｒｅ－ｍｉＲＮＡなどの他のＲＮＡｉ剤を含む。一本鎖核酸には、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、成熟ｍｉＲＮＡ、及び三重鎖形成オリゴヌクレオチドが含まれる。

【0109】

本発明の脂質ナノ粒子に含まれるか、あるいはそれによってカプセル化されるｍＲＮＡは、目的のポリペプチドをコードすることができる。好ましくは、ｍＲＮＡは、細胞内で翻訳されて目的のポリペプチドを産生することができる。目的のポリペプチドは、体液性（例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞）免疫系を刺激するために使用されるような、抗原性又は免疫原性ポリペプチドであってもよい。目的のポリペプチドは、哺乳動物、好ましくはヒトの治療又は予防免疫に有用である。目的のポリペプチドは、疾患又は状態、好ましくは、状態は感染症であるが、に対する治療又は予防効果を提供するために有用であることができる。感染症は、任意の微生物、例えば、細菌、ウイルス、真菌又は原虫などによるものであってもよい。ウイルスは、コロナウイルス、好ましくは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含むが、これらに限定されない任意のウイルスであってもよい。

【0110】

本発明の核酸は、一般に核酸の特定の形態に依存して、様々な長さのものであってもよい。例えば、特定の実施形態において、プラスミド又は遺伝子は、長さが約１００～約１００，０００ヌクレオチド残基の範囲であることができる。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、約１０～約１００ヌクレオチド長であり得る。様々な関連する実施形態において、一本鎖、二本鎖、及び三本鎖のオリゴヌクレオチドは、長さが約１０～約６０ヌクレオチド、約１５～約６０ヌクレオチド、約２０～約５０ヌクレオチド、約１５～約３０ヌクレオチド、又は約２０～約３０ヌクレオチドの範囲であることができる。

【0111】

特定の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチド（又はその鎖）は、標的ポリヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするか、あるいは相補的である。本明細書で使用する場合、「特異的にハイブリダイズ可能」及び「相補的」という用語は、ＤＮＡ又はＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドの間に安定で特異的な結合が生じるような、十分な程度の相補性を示す。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸配列と１００％相補的である必要はないことが理解される。好ましい実施態様において、標的配列へのオリゴヌクレオチドの結合が、標的配列の正常な機能を妨害し、それによる有用性又は発現の欠失を引き起こす場合、オリゴヌクレオチドは特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が望まれる条件下、すなわち、インビボアッセイ若しくは治療的処置、又はインビトロアッセイについては生理学的条件下で、アッセイが実施される条件下で、非標的配列へのオリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在するしたがって、オリゴヌクレオチドは、それが標的としているか、あるいはそれが特異的にハイブリダイズする遺伝子又はｍＲＮＡ配列の領域と比較して、１、２、３、又はそれ以上の塩基置換を含むことができる。

【0112】

１．ｓｉＲＮＡ
本発明の核酸－脂質粒子のｓｉＲＮＡ成分は、目的の標的遺伝子の発現をサイレンシングすることができる。ｓｉＲＮＡ二重鎖の各鎖は、典型的には約１５～約６０ヌクレオチド長、好ましくは約１５～約３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。修飾ｓｉＲＮＡは、一般に、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列よりも免疫刺激性（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）が低く、目的の標的遺伝子に対するＲＮＡｉ活性を保持する。いくつかの実施形態において、修飾ｓｉＲＮＡは、２’ＯＭｅ－グアノシン、２’ＯＭｅ－ウリジン、２’ＯＭｅ－アデノシン、及び／又は２’ＯＭｅ－シトシンヌクレオチドなどの少なくとも１つの２’ＯＭｅプリン又はピリミジンヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、一又は複数のウリジン及び／又はグアノシンヌクレオチドが修飾される。修飾ヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡの一方の鎖（すなわち、センス又はアンチセンス）又は両方の鎖に存在し得る。ｓｉＲＮＡ配列は、オーバーハング（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１５：１８８（２００１）又はＮｙｉｌｎｅｎら、Ｃｅｌｌ、１０７：３０９（２００１）に記述されているような３’又は５’オーバーハング）を有していてもよく、あるいはオーバーハングを欠いていてもよい（すなわち、平滑末端を有する）。

【0113】

修飾ｓｉＲＮＡは、一般に、ｓｉＲＮＡ二本鎖の二本鎖領域中の約１％～約１００％（例えば、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％）の修飾ヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上のヌクレオチドは修飾ヌクレオチドを含む。

【0114】

いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中のヌクレオチドの約２５％未満（例えば、約２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満）が修飾ヌクレオチドを含む。

【0115】

他の実施形態において、ｓｉＲＮＡの二本鎖領域中の約１％～約２５％（例えば、約１％～２５％、２％～２５％、３％～２５％、４％～２５％、５％～２５％、６％～２５％、７％～２５％、８％～２５％、９％～２５％、１０％～２５％、１１％～２５％、１２％～２５％、１３％～２５％、１４％～２５％、１５％～２５％、１６％～２５％、１７％～２５％、１８％～２５％、１９％～２５％、２０％～２５％、２１％～２５％、２２％～２５％、２３％～２５％、２４％～２５％など）、又は約１％～約２０％（例えば、約１％～２０％、２％～２０％、３％～２０％、４％～２０％、５％～２０％、６％～２０％、７％～２０％、８％～２０％、９％～２０％、１０％～２０％、１１％～２０％、１２％～２０％、１３％～２０％、１４％～２０％、１５％～２０％、１６％～２０％、１７％～２０％、１８％～２０％、１９％～２０％、１％～１９％、２％～１９％、３％～１９％、４％～１９％、５％～１９％、６％～１９％、７％～１９％、８％～１９％、９％～１９％、１０％～１９％、１１％～１９％、１２％～１９％、１３％～１９％、１４％～１９％、１５％～１９％、１６％～１９％、１７％～１９％、１８％～１９％、１％～１８％、２％～１８％、３％～１８％、４％～１８％、５％～１８％、６％～１８％、７％～１８％、８％～１８％、９％～１８％、１０％～１８％、１１％～１８％、１２％～１８％、１３％～１８％、１４％～１８％、１５％～１８％、１６％～１８％、１７％～１８％、１％～１７％、２％～１７％、３％～１７％、４％～１７％、５％～１７％、６％～１７％、７％～１７％、８％～１７％、９％～１７％、１０％～１７％、１１％～１７％、１２％～１７％、１３％～１７％、１４％～１７％、１５％～１７％、１６％～１７％、１％～１６％、２％～１６％、３％～１６％、４％～１６％、５％～１６％、６％～１６％、７％～１６％、８％～１６％、９％～１６％、１０％～１６％、１１％～１６％、１２％～１６％、１３％～１６％、１４％～１６％、１５％～１６％、１％～１５％、２％～１５％、３％～１５％、４％～１５％、５％～１５％、６％～１５％、７％～１５％、８％～１５％、９％～１５％、１０％～１５％、１１％～１５％、１２％～１５％、１３％～１５％、１４％～１５％など）のヌクレオチドは修飾ヌクレオチドを含む。

【0116】

さらなる実施形態において、例えば、ｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖がウリジン及び／又はグアノシンヌクレオチドで選択的に修飾される場合、結果として生じる修飾ｓｉＲＮＡは、約３０％未満の修飾ヌクレオチド（例えば、約３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の修飾ヌクレオチド）、又は約１％～約３０％の修飾ヌクレオチド（例えば、約１％～３０％、２％～３０％、３％～３０％、４％～３０％、５％～３０％、６％～３０％、７％～３０％、８％～３０％、９％～３０％、１０％～３０％、１１％～３０％、１２％～３０％、１３％～３０％、１４％～３０％、１５％～３０％、１６％～３０％、１７％～３０％、１８％～３０％、１９％～３０％、２０％～３０％、２１％～３０％、２２％～３０％、２３％～３０％、２４％～３０％、２５％～３０％、２６％～３０％、２７％～３０％、２８％～３０％、又は２９％～３０％の修飾ヌクレオチド）を含み得る。

【0117】

ａ．ｓｉＲＮＡ配列の選択
適切なｓｉＲＮＡ配列は、当技術分野において知られている任意の手段を用いて同定され得る。典型的には、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ、４１１：４９４－４９８（２００１）及びＥｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、２０：６８７７－６８８８（２００１）に記述されている方法は、Ｒｅｙｎｏｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２２（３）：３２６－３３０（２００４）に記載されている合理的設計規則と併用される。

【0118】

一般に、目的の標的遺伝子からの転写産物の３’のＡＵＧ開始コドンのヌクレオチド配列は、ジヌクレオチド配列（例えば、ＡＡ、ＮＡ、ＣＣ、ＧＧ、又はＵＵ、ここでＮ＝Ｃ、Ｇ、又はＵ）に関してスキャンされる（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．、２０：６８７７－６８８８（２００１）を参照されたい）。ジヌクレオチド配列の直近の３’のヌクレオチド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ３’）は、潜在的なｓｉＲＮＡ配列（すなわち、標的配列又はセンス鎖配列）として同定される。典型的には、ジヌクレオチド配列の直近の３’の１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、又はそれ以上のヌクレオチドは、潜在的なｓｉＲＮＡ配列として同定される。いくつかの実施形態では、ジヌクレオチド配列は、ＡＡ又はＮＡ配列であり、ＡＡ又はＮＡジヌクレオチドの直近の３’の１９個のヌクレオチドは、潜在的なｓｉＲＮＡ配列として同定される。ｓｉＲＮＡ配列は、通常、標的遺伝子の長さに沿って異なる位置に間隔を置いて配置される。ｓｉＲＮＡ配列のサイレンシング効率をさらに高めるために、潜在的なｓｉＲＮＡ配列は、例えば、標的細胞又は生物において、他のコード配列と相同性の領域を含まない部位を同定するために分析されることができる。例えば、約２１塩基対の適切なｓｉＲＮＡ配列は、典型的には、標的細胞又は生物におけるコード配列と１６～１７より多い連続した塩基対の相同性（ｍｏｒｅ ｔｈａｎ １６－１７ ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ ｂａｓｅ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有さない。ｓｉＲＮＡ配列がＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターから発現する場合、４つより多い連続したＡ又はＴ（ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ４ ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ Ａ’ｓ ｏｒ Ｔ’ｓ）を欠くｓｉＲＮＡ配列が選択される。

【0119】

一旦潜在的なｓｉＲＮＡ配列が同定されると、相補的な配列（すなわち、アンチセンス鎖配列）を設計することができる。潜在的なｓｉＲＮＡ配列はまた、当技術分野において知られている様々な基準を用いて分析されることもできる。例えば、ｓｉＲＮＡ配列は、それらのサイレンシング効率を高めるために合理的設計アルゴリズムによって分析されて、一又は複数の下記の特徴を有する配列を同定することができる：（１）約２５％～約６０％のＧ／Ｃ含量、（２）センス鎖の１５～１９位に少なくとも３つのＡ／Ｕ、（３）内部反復なし、（４）センス鎖の１９位にＡ、（５）センス鎖の３位にＡ、（６）センス鎖の１０位にＵ、（７）センス鎖の１９位にＧ／Ｃなし、（８）センス鎖の１３位にＧなし。これらの各特徴の適切な値を割り当て、ｓｉＲＮＡの選択に有用であるアルゴリズムを組み込むｓｉＲＮＡ設計ツールは、例えば、http://boz094.ust.hk/RNAi/siRNAで見出される。当業者であれば、一又は複数の前述の特性を有する配列が、潜在的なｓｉＲＮＡ配列としてさらなる分析及び試験のために選択される可能性があることを十分理解するであろう。

【0120】

さらに、一又は複数の下記の基準を有する潜在的なｓｉＲＮＡ配列は、しばしばｓｉＲＮＡとして除外され得る：（１）一列に（ｉｎ ａ ｒｏｗ）４つ以上の同じ塩基のストレッチ（ａ ｓｔｒｅｔｃｈ）を含む配列；（２）Ｇのホモポリマーを含む配列（すなわち、これらのポリマーの構造上の特徴に起因する可能性のある非特異的効果を低減するため）；（３）三重塩基モチーフ（ｔｒｉｐｌｅ ｂａｓｅ ｍｏｔｉｆｓ）（例えば、ＧＧＧ、ＣＣＣ、ＡＡＡ、又はＩＴＴ）を含む配列；（４）一列に７個以上のＧ／Ｃのストレッチを含む配列；及び（５）内部折り返し構造（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｆｏｌｄ－ｂａｃｋ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）をもたらす候補内の４個以上の塩基の直接反復（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔｓ）を含む配列。しかしながら、当業者であれば、一又は複数の前述の特徴を有する配列が、潜在的なｓｉＲＮＡ配列としてさらなる分析及び試験のために依然として選択される可能性があることを十分理解するであろう。

【0121】

いくつかの実施形態において、潜在的なｓｉＲＮＡ配列は、例えば、Ｋｈｖｏｒｏｖａら、Ｃｅｌｌ、１１５：２０９－２１６（２００３）；及びＳｃｈｗａｒｚら、Ｃｅｌｌ、１１５：１９９－２０８（２００３）に記述されているように、ｓｉＲＮＡ二重鎖非対称性に基づいて、さらに分析されることができる。他の実施形態において、潜在的なｓｉＲＮＡ配列は、例えば、Ｌｕｏら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３１８：３０３－３１０（２００４）に記述されているように、標的部位での二次構造に基づいて、さらに分析されることができる。例えば、標的部位での二次構造は、Ｍｆｏｌｄアルゴリズム（http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/rna/forml.cgiで入手可能）を用いてモデル化されて、塩基対合又はステムループの形状の二次構造が少ない標的部位でのアクセシビリティに有利に働くｓｉＲＮＡ配列を選択することができる。

【0122】

一旦潜在的なｓｉＲＮＡ配列が同定されると、その配列は、例えば、インビトロサイトカインアッセイ又はインビボ動物モデルを用いて、任意の免疫刺激特性（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）に関して分析され得る。ＧＵリッチモチーフ（例えば、５’－ＧＵ－３’，５’－ＵＧＵ－３’，５’－ＧＵＧＵ－３’，５’－ＵＧＵＧＵ－３’など）のようなｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖中のモチーフはまた、配列が免疫刺激性であるかどうかの指標も提供し得る。一旦ｓｉＲＮＡ分子が免疫刺激性であることが見出されると、本明細書において記述されているようなその免疫刺激特性を低下させるように改良することができる。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡ配列は、細胞が検出可能な免疫応答を生じさせるような条件下で哺乳動物レスポンダー細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ ｃｅｌｌ）と接触して、ｓｉＲＮＡが免疫刺激性ｓｉＲＮＡであるか、あるいは非免疫刺激性ｓｉＲＮＡであるかを決定することができる。哺乳動物レスポンダー細胞は、ナイーブ哺乳動物（ａ ｎａｉｖｅ ｍａｍｍａｌ）（すなわち、以前にｓｉＲＮＡ配列の遺伝子産物と接触したことのない哺乳動物）由来であってもよい。哺乳動物レスポンダー細胞は、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、マクロファージなどであってもよい。検出可能な免疫応答は、例えば、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、又はそれらの組み合わせなどのサイトカイン又は成長因子の産生を含んでいてもよい。免疫刺激性であると同定されたｓｉＲＮＡ分子は、その後、少なくとも１つのセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖上のヌクレオチドを修飾ヌクレオチドで置換することによって、その免疫刺激特性を低下させるように修飾され得る。例えば、ｓｉＲＮＡ二本鎖の二本鎖領域の約３０％未満（例えば、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％未満）のヌクレオチドは、２’ＯＭｅヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドで置換され得る。次に、修飾ｓｉＲＮＡは、上述のような哺乳動物レスポンダー細胞と接触して、その免疫刺激特性が減少又は消失し（ａｂｒｏｇａｔｅｄ）たということを確認することができる。

【0123】

免疫応答を検出するのに適切なインビトロアッセイには、Ｄａｖｉｄらの二重モノクローナル抗体サンドイッチ免疫測定法（米国特許第４，３７６，１１０号）；モノクローナル－ポリクローナル抗体サンドイッチアッセイ（Ｗｉｄｅら、ｉｎ Ｋｉｒｋｈａｍ ａｎｄ Ｈｕｎｔｅｒ，ｅｄｓ．，Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｅ．ａｎｄＳ． Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ（１９７０））；Ｇｏｒｄｏｎらの「ウェスタンブロット」法（米国特許第４，４５２，９０１号）；標識リガンドの免疫沈降（Ｂｒｏｗｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５５：４９８０－４９８３（１９８０））；例えば、Ｒａｉｎｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５７：５１５４－５１６０（１９８２）によって記述されているような酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）；蛍光色素の使用を含む免疫細胞化学的手法（Ｂｒｏｏｋｓら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３９：４７７（１９８０））；及び活性の中和（Ｂｏｗｅｎ－Ｐｏｐｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：２３９６－２４００（１９８４））が含まれるが、これらに限定されない。上述の免疫学的検定に加えて、多数の他の免疫学的検定が利用可能であり、米国特許第３，８１７，８２７号；第３，８５０，７５２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；及び第４，０９８，８７６号に記述されているものを含む。これらの参考文献の開示は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0124】

免疫応答を検出するためのインビボモデルの非限定的な例としては、例えば、Ｊｕｄｇｅら、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１３：４９４－５０５（２００６）に記述されているようなアッセイが挙げられる。特定の実施形態において、アッセイは、次のとおりに実施され得る：（１）ｓｉＲＮＡは、外側尾静脈への標準的な静脈内注射によって投与され得る；（２）血液は、投与の約６時間後に心臓穿刺によって収集され、サイトカイン分析のために血漿として処理され得る；そして（３）サイトカインは、製造者の指示に従ってサンドイッチＥＬＩＳＡキットを使用して定量され得る（例えば、マウス及びヒトＩＦＮ－α（ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ；ピスカタウェイ、Ｎ．Ｊ．）；ヒトＩＬ－６及びＴＮＦ－α（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；サンディエゴ、Ｃａｌｉｆ．）；並びにマウスＩＬ－６、ＴＮＦ－α及びＩＦＮ－γ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；サンディエゴ、Ｃａｌｉｆ．）。

【0125】

サイトカイン及び成長因子に特異的に結合するモノクローナル抗体は、複数の供給源から市販されており、当技術分野において既知の方法を用いて作成され得る（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５－４９７（１９７５）及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照されたい）。モノクローナル抗体の作成は、以前に記述されており、当技術分野において既知の、任意の手段によって達成され得る（Ｂｕｈｒｉｎｇら、ｉｎ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、第１０巻、第１号、７７－７８頁（１９９１））。いくつかの方法において、モノクローナル抗体は、検出を容易にするために（例えば、分光学的、光化学的、生化学的、電気的、光学的、又は化学的手段によって検出可能な任意の組成物で）標識される。

【0126】

ｂ．ｓｉＲＮＡ分子の作成
ｓｉＲＮＡは、例えば、一又は複数の単離された低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）二重鎖として、より長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）として、あるいはＤＮＡプラスミド中の転写カセットから転写されたｓｉＲＮＡ又はｄｓＲＮＡとしてなどを含む、いくつかの形態で提供され得る。ｓｉＲＮＡ配列は、オーバーハング（例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１５：１８８（２００１）又はＮｙｋａｎｅｎら、Ｃｅｌｌ、１０７：３０９（２００１）に記述されているような３’又は５’オーバーハング）を有するか、あるいはオーバーハングを欠いていてもよい（すなわち、平滑末端を有するように）。

【0127】

ＲＮＡ集団は、長いＲＮＡ前駆体（ｌｏｎｇ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ＲＮＡｓ）を提供するために使用され得るか、あるいは選択された標的配列と実質的又は完全な同一性を有する長いＲＮＡ前駆体は、ｓｉＲＮＡを作るために使用され得る。ＲＮＡｓは、当業者に周知の方法に従って、細胞又は組織から単離、合成、及び／又はクローニングされ（ｃｌｏｎｅｄ）得る。ＲＮＡは、混合群（細胞又は組織から得られたもの、ｃＤＮＡから転写されたもの、減算されたもの（ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ）、選択されたものなど）であり得るか、あるいは単一の標的配列を表し得る。ＲＮＡは、天然に存在するもの（例えば、組織又は細胞サンプルから単離されたもの）、インビトロで合成されたもの（例えば、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼ及びＰＣＲ産物又はクローニングされたｃＤＮＡを用いたもの）、又は化学的に合成されたものであり得る。

【0128】

長いｄｓＲＮＡを形成するために、合成ＲＮＡに関して、相補体もまた、インビトロで転写され、ハイブリダイズされてｄｓＲＮＡを形成する。天然に存在するＲＮＡ集団が使用される場合、ＲＮＡ集団に対応するｃＤＮＡを転写するか、あるいはＲＮＡポリメラーゼを使用することによって、ＲＮＡの相補体もまた、提供される（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡｓｅ ＩＩＩ又はＤｉｃｅｒによる消化のためにｄｓＲＮＡを形成する）。その後、ＲＮＡ前駆体は、消化のためにハイブリダイズされて二本鎖ＲＮＡを形成する。ｄｓＲＮＡｓは、対象に直接投与され得るか、あるいは投与前にインビトロで消化され得る。

【0129】

ＲＮＡを単離する方法、ＲＮＡを合成する方法、核酸をハイブリダイズする方法、ｃＤＮＡライブラリーを作成及びスクリーニングする方法、並びにＰＣＲを実施する方法は、当技術分野において周知である（米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、１９９０）を参照されたい）。発現ライブラリーもまた、当業者に周知である。本発明で使用する一般的な方法を開示している追加の基本的なテキストとしては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及びＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）が挙げられる。これらの参考文献の開示は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0130】

好ましくは、ｓｉＲＮＡは、化学的に合成される。本発明のｓｉＲＮＡ分子を含むオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｕｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０９：７８４５（１９８７）；Ｓｃａｒｉｎｇｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８：５４３３（１９９０）；Ｗｉｎｃｏｔｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２３：２６７７－２６８４（１９９５）；及びＷｉｎｃｏｔｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．、７４：５９（１９９７）などの当技術分野において既知の様々な技術のいずれかを用いて合成され得る。オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、５’末端のジメトキシトリチル及び３’末端のホスホロアミダイトなどの一般的な核酸保護基及びカップリング基を利用する。非限定的な例として、小規模合成は、０．２μｍｏｌスケールのプロトコルを用いてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのシンセサイザーで実施され得る。その代わりに、０．２μｍｏｌスケールでの合成は、Ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ（パロアルト、カリフォルニア州）の９６ウェルプレートのシンセサイザーで実施され得る。しかしながら、より大きいか、あるいは小さいスケールの合成もまた、本発明の範囲内である。オリゴヌクレオチドの合成に適した試薬、ＲＮＡ脱保護の方法、及びＲＮＡ精製の方法もまた、当業者に知られている。

【0131】

ｓｉＲＮＡ分子はまた、タンデム合成技術（ａ ｔａｎｄｅｍ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）によって合成されることもでき、両鎖は、切断可能なリンカー（ａ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒ）により分離された単一の連続したオリゴヌクレオチドフラグメント又は鎖として合成され、その後切断されて、ｓｉＲＮＡ二重鎖を形成するためにハイブリダイズする別々の断片又は鎖を提供する。リンカーは、ポリヌクレオチドリンカー又は非ヌクレオチドリンカーであり得る。ｓｉＲＮＡのタンデム合成（ｔａｎｄｅｍ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）は、マルチウェル／マルチプレート合成プラットフォーム及びバッチリアクター、合成カラムなどを使用する大規模合成プラットフォームの両方に容易に適応し得る。その代わりに、ｓｉＲＮＡ分子は２つの、異なるオリゴヌクレオチドから組み立てられることができ、一方のオリゴヌクレオチドはｓｉＲＮＡのセンス鎖を含み、他方はアンチセンス鎖を含む。例えば、各鎖は、別々に合成され、合成及び／又は脱保護後にハイブリダイゼーション又はライゲーションにより結合され得る。特定の他の例において、ｓｉＲＮＡ分子は、単一の連続したオリゴヌクレオチドフラグメントとして合成され、そこで自己相補的なセンス領域及びアンチセンス領域がハイブリダイズしてヘアピン二次構造を有するｓｉＲＮＡ二重鎖を形成し得る。

【0132】

ｃ．ｓｉＲＮＡ配列の修飾
特定の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、２本の鎖及び２本鎖領域中の少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを有する２重鎖を含み、各鎖は約１５～約６０ヌクレオチド長である。有利なことには、修飾ｓｉＲＮＡは、対応する非修飾ｓｉＲＮＡ配列よりも免疫刺激性が低いが、標的配列の発現をサイレンシングする能力を保持する。好ましい実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子に導入される化学修飾の程度は、ｓｉＲＮＡの免疫刺激特性の減少又は消失とＲＮＡｉ活性の保持の間のバランスを取る。非限定的な例として、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子は、その標的遺伝子の発現をサイレンシングする（ｓｉｌｅｎｃｅ）能力を保持しながら、ｓｉＲＮＡによって生成される免疫応答を排除するために、ｓｉＲＮＡ二重鎖内の選択的なウリジン及び／又はグアノシンヌクレオチドで最小限の修飾（例えば、約３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％未満の修飾）を受けることができる。

【0133】

本発明での使用に適した修飾ヌクレオチドの例には、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’Ｆ）、２’－デオキシ、５－Ｃ－メチル、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）、４’－チオ、２’－アミノ、又は２’－Ｃ－アリル基を有するリボヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ編、（１９８４）に記述されているようなノーザンコンフォメーションを有する修飾ヌクレオチドもまた、ｓｉＲＮＡ分子での使用に適している。かかる修飾ヌクレオチドには、限定されないが、ロック核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）（ＬＮＡ）ヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ、４’－Ｃ－メチレン－（Ｄ－リボフラノシル）ヌクレオチド）、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（ＭＯＥ）ヌクレオチド、２’－メチル－チオエチルヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’Ｆ）ヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－クロロ（２’Ｃｌ）ヌクレオチド、及び２’－アジドヌクレオチドが含まれる。特定の実施態様において、本明細書中に記述されているｓｉＲＮＡ分子は、一又は複数のＧ－クランプヌクレオチドを含む。Ｇ－クランプヌクレオチドとは、修飾シトシンアナログを指し、修飾が、二重鎖内の相補的グアニンヌクレオチドのワトソン・クリック及びフーグスティーン面の両方を水素結合する能力を与える（例えば、Ｌｉｎら、Ｊ Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０：８５３１－８５３２（１９９８）を参照されたい）。さらに、例えば、Ｃ－フェニル、Ｃ－ナフチル、他の芳香族誘導体、イノシン、アゾールカルボキサミド、並びにニトロアゾール誘導体、例えば、３－ニトロピロール、４－ニトロインドール、５－ニトロインドール、及び６－ニトロインドールなどのようなヌクレオチド塩基アナログを有するヌクレオチド（例えば、Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９：２４３７－２４４７（２００１）を参照されたい）は、ｓｉＲＮＡ分子に組み込まれることができる。

【0134】

特定の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、一又は複数の化学修飾、例えば、末端キャップ部分（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃａｐ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）、リン酸骨格（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ）修飾などをさらに含むことができる。末端キャップ部分の例には、限定されないが、反転デオキシ脱塩基残基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙ ａｂａｓｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅｓ）、グリセリル修飾、４’，５’－メチレンヌクレオチド、１－（β－Ｄ－エリスロフラノシル（ｅｒｙｔｈｒｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ））ヌクレオチド、４’－チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ－ヌクレオチド、α－ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ－ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’－セコヌクレオチド、非環式３，４－ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５－ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’－３’－反転ヌクレオチド部分（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）、３’－３’－反転脱塩基部分（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ａｂａｓｉｃ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）、３’－２’－反転ヌクレオチド部分、３’－２’－反転脱塩基部分、５’－５’－反転ヌクレオチド部分、５’－５’－反転脱塩基部分、３’－５’－反転デオキシ脱塩基部分（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｄｅｏｘｙ ａｂａｓｉｃ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）、５’－アミノアルキルホスフェート、１，３－ジアミノ－２－プロピルホスフェート、３－アミノプロピルホスフェート、６－アミノヘキシルホスフェート、１，２－アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、１，４－ブタンジオールホスフェート、３’－ホスホロアミダート、５’－ホスホロアミダート、ヘキシルホスフェート（ｈｅｘｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、アミノヘキシルホスフェート、３’－ホスフェート、５’－アミノ、３’－ホスホロチオエート、５’－ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉｔｈｉｏａｔｅ）、及び架橋又は非架橋メチルホスホネート又は５’－メルカプト部分が含まれる（例えば、米国特許第５，９９８，２０３号；Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９：１９２５（１９９３）を参照されたい）。リン酸骨格修飾の非限定的な例（すなわち、修飾されたヌクレオチド間の結合（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｎｋａｇｅｓ）をもたらす）としては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、モルホリノ、アミデート、カルバメート、カルボキシメチル、アセトアミデート、ポリアミド、スルホネート、スルホンアミド、スルファメート、ホルムアセタール（ｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、チオホルムアセタール（ｔｈｉｏｆｏｒｍａｃｅｔａｌ）、及びアルキルシリル置換が挙げられる（例えば、Ｈｕｎｚｉｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＶＣＨ，３３１－４１７（１９９５）；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら，Ｎｏｖｅｌ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＡＣＳ，２４－３９（１９９４）を参照されたい）。そのような化学修飾は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖、アンチセンス鎖、又は両鎖の５’末端及び／又は３’末端で起こり得る。これらの参考文献の開示は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0135】

いくつかの実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖は、約１～約４つ（例えば、１、２、３、又は４つ）の２’－デオキシリボヌクレオチド及び／又は修飾ヌクレオチド及び非修飾ヌクレオチドの任意の組み合わせを有する３’末端オーバーハング（ａ ３’－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｏｖｅｒｈａｎｇ）をさらに含み得る。ｓｉＲＮＡ分子に導入され得る修飾ヌクレオチド及び化学修飾のタイプの追加の例は、例えば、英国特許第ＧＢ ２，３９７，８１８ Ｂ号並びに米国特許公開第２００４０１９２６２６号、同第２００５０２８２１８８号、及び同第２００７０１３５３７２号に記述されており、これらの開示は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0136】

本明細書において記述されているｓｉＲＮＡ分子は、任意に、ｓｉＲＮＡの一方又は両方の鎖に一又は複数の非ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用する場合、「非ヌクレオチド」という用語は、糖及び／又はリン酸置換を含む、一又は複数のヌクレオチド単位の代わりに、核酸鎖に組み込まれることができ、残りの塩基がそれらの活性を示すことを可能にする任意の基又は化合物を指す。その基又は化合物は、一般に認識されるヌクレオチド塩基、例えば、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシル、又はチミンなどを含まず、それ故に１’位に塩基を欠くという点で非塩基性である。

【0137】

他の実施形態において、ｓｉＲＮＡの化学修飾は、ｓｉＲＮＡ分子に複合体（ａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を付着させることを含む。複合体は、例えば生分解性リンカーのような共有結合を介して、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の５’及び／又は３’末端に付着し得る。複合体はまた、例えば、カルバメート基又は他の連結基を介してｓｉＲＮＡにも結合し得る（例えば、米国特許公開第２５００００７４７７１号、同第２００５００４３２１９号、及び同第２００５０１５８７２７号を参照されたい）。特定の実施態様において、複合体は、細胞内へのｓｉＲＮＡの送達を促進する分子である。ｓｉＲＮＡへの付着に適した共役分子（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）の例には、限定されないが、コレステロールなどのステロイド、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのグリコール、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、脂肪酸、カロテノイド、テルペン、胆汁酸、フォレート（ｆｏｌａｔｅｓ）（例えば、葉酸、フォレートアナログ及びその誘導体）、糖（例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、グルコース、マンノース、フルクトース、フコースなど）、リン脂質、ペプチド、細胞取り込みを媒介することができる細胞レセプターのためのリガンド、及びそれらの組み合わせが含まれる（例えば、米国特許公開第２００３０１３０１８６号、同第２００４０１１０２９６号、及び同第２００４０２４９１７８号；米国特許第６，７５３，４２９号を参照のされたい）。他の例としては、米国特許公開第２００５０１１９４７０号及び同第２００５０１０７３２５号に記述されている親油性部分、ビタミン、ポリマー、ペプチド、タンパク質、核酸、小分子、オリゴ糖、炭水化物クラスター、インターカレーター、マイナーグルーブバインダー、切断剤（ｃｌｅａｖｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、及び架橋剤共役分子が挙げられる。さらに他の例としては、米国特許公開第２００５０１５３３３７号に記述されている２’－Ｏ－アルキルアミン、２’－Ｏ－アルコキシアルキルアミン、ポリアミン、Ｃ５－カチオン性修飾ピリミジン、カチオン性ペプチド、グアニジニウム基、アミジニウム（ａｍｉｄｉｎｉｎｉｕｍ）基、カチオン性アミノ酸共役分子が挙げられる。追加の例としては、米国特許公開第２００４０１６７０９０号に記述されている疎水基、膜活性化合物、細胞透過性化合物、細胞標的シグナル、相互作用修飾因子（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）、及び立体安定剤共役分子が挙げられる。さらなる例としては、米国特許公開第２００５０２３９７３９号に記述されている共役分子が挙げられる。使用される複合体のタイプ及びｓｉＲＮＡ分子への接合の程度は、ＲＮＡｉ活性を保持しながら、ｓｉＲＮＡの薬物動態プロファイル、生物学的利用能、及び／又は安定性の改善について評価され得る。したがって、当業者は、様々な複合体を付着させたｓｉＲＮＡ分子をスクリーニングして（ｓｃｒｅｅｎ）、様々な周知のインビトロ細胞培養又はインビボ動物モデルのいずれかを用いて、改善された特性及び完全なＲＮＡｉ活性を有するものを同定することができる。上述の特許文献の開示は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0138】

ｄ．標的遺伝子
本明細書において記述されている核酸－脂質粒子のｓｉＲＮＡ成分は、目的の遺伝子の翻訳（すなわち、発現）を下方制御又はサイレンシングするために使用され得る。目的の遺伝子には、ウイルス感染及び生存に関連する遺伝子、代謝性疾患及び障害（例えば、肝臓疾患及び障害）に関連する遺伝子、腫瘍形成及び細胞形質転換（例えば、がん）に関連する遺伝子、血管新生遺伝子（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｇｅｎｅｓ）、免疫調節遺伝子、例えば、炎症及び自己免疫反応に関連するものなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0139】

代謝性疾患及び障害（例えば、肝臓が標的である障害並びに肝臓疾患及び障害）に関連する遺伝子としては、例えば、
脂質異常症で発現する遺伝子（例えば、ＬＸＲα及びＬＸＲβなどの肝臓Ｘ受容体（Ｇｅｎｂａｃｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００７１２１）、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００５１２３）、ステロール調節エレメント結合タンパク質（ＳＲＥＢＰ）、サイト１プロテアーゼ（ＳＩＰ）、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル補酵素－Ａ還元酵素（ＨＭＧ補酵素－Ａ還元酵素）、アポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０００３８４）、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡｐｏＣ３）（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ＿００００４０及びＮＧ＿００８９４９ ＲＥＧＩＯＮ：５００１．８１６４）、及びアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ＿００００４１及びＮＧ＿００７０８４ ＲＥＧＩＯＮ：５００１．８６１２））；並びに糖尿病で発現する遺伝子（例えば、グルコース６－ホスファターゼ）が挙げられる（例えば、Ｆｏｒｍａｎら、Ｃｅｌｌ，８１：６８７（１９９５）；Ｓｅｏｌら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、９：７２（１９９５）、Ｚａｖａｃｋｉら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：７９０９（１９９７）；Ｓａｋａｉら、Ｃｅｌｌ，８５：１０３７－１０４６（１９９６）；Ｄｕｎｃａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１２７７８－１２７８５（１９９７）；Ｗｉｌｌｙら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，９：１０３３－１０４５（１９９５）；Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：３１３７－３１４０（１９９７）；Ｊａｎｏｗｓｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３８３：７２８－７３１（１９９６）；及びＰｅｅｔら、Ｃｅｌｌ、９３：６９３－７０４（１９９８）を参照されたい）。当業者は、代謝性疾患及び障害（例えば、肝臓が標的である疾患及び障害、並びに肝臓疾患及び障害）に関連する遺伝子には、肝臓自体で発現する遺伝子及び他の器官及び組織で発現する遺伝子が含まれるということを十分理解するであろう。代謝性疾患及び障害に関連する遺伝子をコードする配列のサイレンシングは、疾患又は障害を治療するために用いられる従来の薬剤の投与と組み合わせて都合よく使用され得る。ＡｐｏＢ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例としては、米国特許公開第２００６０１３４１８９号に記述されているものが挙げられ、その開示は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＡｐｏＣ３遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例としては、２００９年１月２６日に出願された米国仮出願第６１／１４７，２３５号に記述されたものが挙げられ、その開示は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0140】

腫瘍形成及び細胞形質転換（例えば、がん（ｃａｎｃｅｒ）又は他の腫瘍（ｎｅｏｐｌａｓｉａ））に関連する遺伝子配列の例としては、Ｅｇ５（ＫＳＰ、ＫＩＦ１１；Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００４５２３）などの有糸分裂キネシン；ポロ様キナーゼ１（ＰＬＫ－１）（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００５０３０；Ｂａｒｒら、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：４２９－４４０（２００４））などのセリン／スレオニンキナーゼ；ＷＥＥ１（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００３３９０及びＮＭ＿００１１４３９７６）などのチロシンキナーゼ；ＸＩＡＰ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００１１６７）などのアポトーシス阻害剤；ＣＳＮ１、ＣＳＮ２、ＣＳＮ３、ＣＳＮ４、ＣＳＮ５（ＪＡＢ１；Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿００６８３７）、ＣＳＮ６、ＣＳＮ７Ａ、ＣＳＮ７Ｂ、及びＣＳＮ８などのＣＯＰ９シグナルソームサブユニット；ＣＯＰ１（ＲＦＷＤ２；Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ＿０２２４５７及びＮＭ＿００１００１７４０）などのユビキチンリガーゼ；並びにＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ ００１５２７）、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ６、ＨＤＡＣ７、ＦＩＤＡＣ８、ＨＤＡＣ９などのヒストン脱アセチル化酵素などが挙げられる。Ｅｇ５及びＸＩＡＰ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例としては、２００７年５月２９日に出願された米国特許出願シリアル番号第１１／８０７，８７２号に記述されているものが挙げられ、その開示は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＰＬＫ－１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例としては、米国特許公開第２００５０１０７３１６号及び同第２００７０２６５４３８号；並びに２００８年１２月２３日に出願された米国特許出願シリアル番号第１２／３４３，３４２号に記述されているものが挙げられ、これらの開示は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＣＳＮ５遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例としては、２００８年４月１５日に出願された米国仮出願第６１／０４５，２５１号に記述されたものが挙げられ、その開示は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0141】

腫瘍形成及び細胞形質転換に関連する遺伝子配列のさらなる例としては、ＭＬＬ融合遺伝子、ＢＣＲ－ＡＢＬ（Ｗｉｌｄａら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２１：５７１６（２００２）；Ｓｃｈｅｒｒら、Ｂｌｏｏｄ、１０１：１５６６（２００３））、ＴＥＬ－ＡＭＬ１、ＥＷＳ－ＦＬＩ１、ＴＬＳ－ＦＵＳ、ＰＡＸ３－ＦＫＨＲ、ＢＣＬ－２、ＡＭＬ１－ＥＴＯ、及びＡＭＬ１－ＭＴＧ８（Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈら、Ｂｌｏｏｄ、１０１：３１５７（２００３））などの転座配列；多剤耐性遺伝子（Ｎｉｅｔｈら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ、５４５：１４４（２００３）；Ｗｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６３：１５１５（２００３））、サイクリン（Ｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６３：３５９３（２００３）；Ｚｏｕら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１６：２９２３（２００２））、β－カテニン（Ｖｅｒｍａら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、９：１２９１（２００３））、テロメラーゼ遺伝子（Ｋｏｓｃｉｏｌｅｋら、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ、Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．、２：２０９（２００３））、ｃ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、ＢＣＬ－２、成長因子受容体（例えば、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ１（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ＿００５２２８、ＮＭ＿２０１２８２、ＮＭ＿２０１２８３、及びＮＭ＿２０１２８４；また、Ｎａｇｙら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．，２８５：３９－４９（２００３）も参照されたい）、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ－２（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ＿００４４４８及びＮＭ＿００１００５８６２）、ＥｒｂＢ３（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ００１９８２及びＮＭ＿００１００５９１５）、及びＥｒｂＢ４（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏｓ．ＮＭ＿００５２３５及びＮＭ＿００１０４２５９９））などの過剰発現配列；並びにＲＡＳ（総説：Ｔｕｓｃｈｌ及びＢｏｒｋｈａｒｄｔ、Ｍｏｌ．Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ，２：１５８（２００２）に概説されている）のような変異配列が挙げられる。ＥＧＦＲ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子の非限定的な例としては、２００７年５月２９日に出願された米国特許出願シリアル番号第１１／８０７，８７２号に記述されたものが挙げられ、その開示は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0142】

ＤＮＡ修復酵素をコードする配列のサイレンシングは、化学療法剤の投与と組み合わせて使用される（Ｃｏｌｌｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６３：１５５０（２００３））。腫瘍の移動に関連するタンパク質をコードする遺伝子もまた、目的の標的配列であり、例えば、インテグリン、セレクチン、及びメタロプロテアーゼである。前述の例は排他的なものではない。当業者は、腫瘍形成又は細胞形質転換、腫瘍増殖、又は腫瘍の移動を容易にするか、あるいは促進する任意の遺伝子配列の全体又は一部が鋳型配列として含まれ得るということを十分理解するであろう。

【0143】

血管新生遺伝子は、新しい血管の形成を促進することができる。特に興味深いのは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（Ｒｅｉｃｈら、Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．，９：２１０（２００３））又はＶＥＧＦＲである。ＶＥＧＦＲを標的とするｓｉＲＮＡ配列は、例えば、ＧＢ ２３９６８６４；米国特許公開第２００４０１４２８９５号；及びＣＡ ２４５６４４４に記載されており、これらの開示は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0144】

抗血管新生遺伝子は、新生血管形成を阻害することができる。これらの遺伝子は、血管新生が疾患の病理学的進行で役割を果たすがんの治療に特に有用である。抗血管新生遺伝子の例には、エンドスタチン（例えば、米国特許第６，１７４，８６１号を参照されたい）、アンギオスタチン（例えば、米国特許第５，６３９，７２５号を参照されたい）、及びＶＥＧＦＲ２（例えば、Ｄｅｃａｕｓｓｉｎら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１８８：３６９－３７７（１９９９）を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されず、これらの開示は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0145】

免疫調節遺伝子は、一又は複数の免疫応答を調節する遺伝子である。免疫調節遺伝子の例には、限定されないが、成長因子（例えば、ＴＧＦ－α、ＴＧＦ－ β、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＧＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＳＣＦなど）、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１２（Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７１：６９１（２００３））、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２０など）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γなど）及びＴＮＦが含まれる。Ｆａｓ及びＦａｓリガンド遺伝子もまた、目的の免疫調節標的配列である（Ｓｏｎｇら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，９：３４７（２００３））。造血細胞及びリンパ細胞における二次シグナル伝達分子をコードする遺伝子もまた、本発明に含まれ、例えば、ブルトン型チロシンキナーゼ（Ｂｔｋ）（Ｈｅｉｎｏｎｅｎら、ＦＥＳＳ Ｌｅｔｔ．、５２７：２７４（２００２））のようなＴｅｃファミリーキナーゼである。

【0146】

細胞レセプターリガンドには、細胞表面レセプター（例えば、インスリンレセプター、ＥＰＯレセプター、Ｇタンパク質共役型受容体、チロシンキナーゼ活性を有するレセプター、サイトカインレセプター、成長因子受容体など）に結合して、レセプターが関与する生理学的経路（例えば、グルコースレベルの調節、血球発生、有糸分裂など）を調節（例えば、阻害、活性化など）することができるリガンドが含まれる。細胞レセプターリガンドの例には、サイトカイン、成長因子、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、グルカゴン、Ｇタンパク質共役型受容体リガンドなどが含まれるが、これらに限定されない。トリヌクレオチド反復（例えば、ＣＡＧ反復）の拡大をコードするテンプレートは、球脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎｏｂｕｌｂｕｌａｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ａｔｒｏｐｈｙ）又はハンチントン病などのトリヌクレオチド反復の拡大によって引き起こされる神経変性障害における病原性配列をサイレンシングするのに利用される（Ｃａｐｌｅｎら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１１：１７５（２００２））。

【0147】

治療目的のために上述の遺伝子のいずれかの発現をサイレンシングするときの有用性に加えて、本明細書において記述されているｓｉＲＮＡはまた、診断、予防、予後、臨床、及び他のヘルスケア用途と同様に、研究及び開発用途にも有用である。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡは、目的の遺伝子が治療標的となる可能性を有するかどうかを試験することを対象とする標的バリデーション研究において使用され得る。ｓｉＲＮＡはまた、潜在的な治療標的としての遺伝子を発見することを目的とする標的同定研究においても使用され得る。

【0148】

２．ａｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡと同様に、非対称干渉ＲＮＡ（ａｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を採用し、アンチセンス鎖の５’末端に対してヌクレオチド１０と１１の間の標的配列の配列特異的切断を媒介することによって、哺乳類細胞における様々な遺伝子の効果的なサイレンシングをもたらすことができる（Ｓｕｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、２６：１３７９－１３８２（２００８））。典型的には、ａｉＲＮＡ分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を有する短いＲＮＡ二重鎖を含み、前記二重鎖がアンチセンス鎖の３’末端及び５’末端にオーバーハングを含む。センス鎖は相補的なアンチセンス鎖と比べて両端が短いため、ａｉＲＮＡは、一般に非対称である。いくつかの態様において、ａｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子に使用されるものと似ている条件下で設計、合成、及びアニーリングされることができる。非限定的な例として、ａｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列を選択するために、上述の方法を用いて選択及び生成されてもよい。

【0149】

別の実施形態において、様々な長さ（例えば、約１０～２５、１２～２０、１２～１９、１２～１８、１３～１７、又は１４～１７塩基対、より典型的には１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０塩基対）のａｉＲＮＡ二重鎖は、目的のｍＲＮＡを標的とするためにアンチセンス鎖の３’及び５’末端でのオーバーハングを考慮して設計されることができる。特定の例において、ａｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、約１０～２５、１２～２０、１２～１９、１２～１８、１３～１７、又は１４～１７ヌクレオチド長、より典型的には１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド長である。特定の他の例において、ａｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、約１５～６０、１５～５０、又は１５～４０ヌクレオチド長であり、より典型的には、約１５～３０、１５～２５、又は１９～２５ヌクレオチド長であり、好ましくは、約２０～２４、２１～２２、又は２１～２３ヌクレオチド長である。

【0150】

いくつかの実施形態において、５’アンチセンスオーバーハングは、１、２、３、４、又はそれ以上の非標的ヌクレオチド（例えば、「ＡＡ」、「ＵＵ」、「ｄＴｄＴ」など）を含む。他の実施形態において、３’アンチセンスオーバーハングは、１、２、３、４、又はそれ以上の非標的ヌクレオチド（例えば、「ＡＡ」、「ＵＵ」、「ｄＴｄＴ」など）を含む。特定の態様において、本明細書中に記述されているａｉＲＮＡ分子は、例えば、二本鎖（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）（ｄｕｐｌｅｘ）領域及び／又はアンチセンスオーバーハングにおいて、一又は複数の修飾ヌクレオチドを含むことができる。非限定的な例として、ａｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列に関して、上述した一又は複数の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。好ましい実施形態において、ａｉＲＮＡ分子は、例えば、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド、又はそれらの混合物などの２’ＯＭｅヌクレオチドを含む。

【0151】

特定の実施形態において、ａｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖、例えば、本明細書中で記述されているｓｉＲＮＡ分子の１つのアンチセンス鎖に対応するアンチセンス鎖を含むことができる。他の実施形態において、ａｉＲＮＡ分子は、例えば、ウイルス感染及び生存に関連する遺伝子、代謝性疾患及び障害に関連する遺伝子、腫瘍形成及び細胞形質転換に関連する遺伝子、血管新生遺伝子、炎症及び自己免疫反応に関連する遺伝子などの免疫調節遺伝子、リガンドレセプター遺伝子、及び神経変性障害に関連する遺伝子など、上記で規定された標的遺伝子のいずれかの発現をサイレンシングするために使用されることができる。

【0152】

３．ｍｉＲＮＡ
一般に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現を制御する約２１－２３ヌクレオチド長の一本鎖ＲＮＡ分子である。ｍｉＲＮＡは、ＤＮＡから転写される遺伝子によってコードされるが、ｍｉＲＮＡｓはタンパク質には翻訳されない（非コードＲＮＡ）；その代わりに、それぞれの一次転写産物（ａ ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステムループ構造、かつ最終的には機能的な成熟ｍｉＲＮＡに加工される。成熟ｍｉＲＮＡ分子は、一又は複数のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子と部分的に、あるいは完全に相補的であり、それらの主な機能は、遺伝子発現を下方制御することである。ｍｉＲＮＡ分子の同定については、例えば、Ｌａｇｏｓ－Ｑｕｉｎｔａｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８５３－８５８；Ｌａｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８５８－８６２；及びＬｅｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４：８６２－８６４に記述されている。

【0153】

ｍｉＲＮＡをコードする遺伝子は、加工された成熟ｍｉＲＮＡ分子よりもはるかに長い。ｍｉＲＮＡは、最初にキャップ及びポリＡテールを有する一次転写産物又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡとして転写され、細胞核内でｐｒｅ－ｍｉＲＮＡとして知られる、短い、～７０ヌクレオチド（^～７０－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）のステムループ構造に加工される。このプロセシングは、動物ではヌクレアーゼＤｒｏｓｈａ及び二本鎖ＲＮＡ結合タンパク質Ｐａｓｈａからなるマイクロプロセッサ複合体として知られるタンパク質複合体によって実施される（Ｄｅｎｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ、４３２：２３１－２３５（２００４））。これらのｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、次に、エンドヌクレアーゼＤｉｃｅｒとの相互作用によって細胞質で成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされ（ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）、それはまた、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の形成も開始する（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，４０９：３６３－３６６（２００１））。ＤＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかは、ｍｉＲＮＡを生じさせる鋳型として機能し得る。

【0154】

Ｄｉｃｅｒがｐｒｅ－ｍｉＲＮＡのステムループを切断する場合、２つの相補的な短いＲＮＡ分子が形成されるが、ＲＩＳＣ複合体に組み込まれるのは１つだけである。この鎖は、ガイド鎖として知られ、ＲＩＳＣ複合体の触媒活性ＲＮａｓｅであるアルゴノートタンパク質によって、５’末端の安定性に基づいて選択される（Ｐｒｅａｌｌら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１６：５３０－５３５（２００６））。アンチガイド鎖又はパッセンジャー鎖として知られる残りの鎖は、ＲＩＳＣ複合体の基質として分解される（Ｇｒｅｇｏｒｙら、Ｃｅｌｌ，１２３：６３１－６４０（２００５））。活性ＲＩＳＣ複合体に組み込まれた後、ｍｉＲＮＡｓは、それらの相補的なｍＲＮＡ分子と塩基対を形成し、標的ｍＲＮＡの分解及び／又は翻訳抑制を誘導する。

【0155】

哺乳類のｍｉＲＮＡ分子は、通常、標的ｍＲＮＡ配列の３’ＵＴＲの部位と相補的である。特定の例において、標的ｍＲＮＡへのｍｉＲＮＡのアニーリングは、タンパク質翻訳機構を妨げることによってタンパク質の翻訳を阻害する。特定の他の例において、標的ｍＲＮＡへのｍｉＲＮＡのアニーリングは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と似ている過程を介して標的ｍＲＮＡの切断及び分解を促進する。ｍｉＲＮＡはまた、標的ｍＲＮＡに対応するゲノム部位のメチル化を標的としてもよい。一般に、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＰと総称されるタンパク質の相補体と関連して機能する。

【0156】

特定の態様において、本明細書中に記述されているｍｉＲＮＡ分子は、約１５～１００、１５～９０、１５～８０、１５～７５、１５～７０、１５～６０、１５～５０、又は１５～４０ヌクレオチド長、より典型的には、約１５～３０、１５～２５、又は１９～２５ヌクレオチド長、好ましくは、約２０～２４、２１～２２、又は２１～２３ヌクレオチド長である。特定の他の態様において、ｍｉＲＮＡ分子は、一又は複数の修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。非限定的な例として、ｍｉＲＮＡ配列は、ｓｉＲＮＡ配列に関して、一又は複数の上述の修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。好ましい実施形態において、ｍｉＲＮＡ分子は、例えば、２’ＯＭｅ－グアノシンヌクレオチド、２’ＯＭｅ－ウリジンヌクレオチド、又はそれらの混合物などの２’ＯＭｅヌクレオチドを含む。

【0157】

いくつかの実施形態において、ｍｉＲＮＡ分子は、例えば、ウイルス感染及び生存に関連する遺伝子、代謝性疾患及び障害に関連する遺伝子、腫瘍形成及び細胞形質転換に関連する遺伝子、血管新生遺伝子、炎症及び自己免疫反応に関連する遺伝子などの免疫調節遺伝子、リガンドレセプター遺伝子、及び神経変性障害に関連する遺伝子などの、上記で規定された標的遺伝子のいずれかの発現をサイレンシングするために使用されることができる。

【0158】

他の実施形態において、目的のｍＲＮＡを標的とするｍｉＲＮＡの活性を妨げる一又は複数の薬剤は、本発明の脂質粒子（例えば、核酸－脂質粒子）を用いて投与される。遮断薬の例には、立体ブロックオリゴヌクレオチド（ｓｔｅｒｉｃ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、ロック核酸オリゴヌクレオチド、及びモルフォリノオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。かかる遮断薬は、ｍｉＲＮＡに直接結合するか、あるいは標的ｍＲＮＡ上のｍｉＲＮＡ結合部位に結合してもよい。

【0159】

４．アンチセンスオリゴヌクレオチド
一実施形態において、核酸は、目的の標的遺伝子又は配列を対象にするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は「アンチセンス」という用語は、標的ポリヌクレオチド配列に相補的であるオリゴヌクレオチドを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列に相補的であるＤＮＡ又はＲＮＡの一本鎖である。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡに結合することによって、相補的なＲＮＡ鎖の翻訳を阻害する。アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドは、特定の相補的な（コード又は非コード）ＲＮＡを標的とするために使用され得る。結合が起こる場合、このＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは、酵素ＲＮａｓｅＨによって分解され得る。特定の実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは，約１０～約６０ヌクレオチド、より好ましくは約１５～約３０ヌクレオチドを含む。この用語はまた、所望の標的遺伝子に正確に相補的でない可能性があるアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する（ｅｎｃｏｍｐａｓｓｅｓ）。したがって、本発明は、アンチセンスに非標的特異的活性が見いだされる場合、又は標的配列との一又は複数のミスマッチを含むアンチセンス配列が特定の用途に最も好ましい場合に利用され得る。

【0160】

アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の効果的で標的化された阻害剤であることが証明されており、その結果、標的遺伝子によるタンパク質の合成を特異的に阻害するために使用され得る。タンパク質合成を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性は十分に確立されている。例えば、ポリガラクツロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔａｕｒｏｎａｓｅ）及びムスカリン２型アセチルコリン受容体の合成は、それぞれのｍＲＮＡ配列を対象にするアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号及び第５，７５９，８２９号参照）。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ１）、ＩＣＡＭ－１、Ｅ－セレクチン、ＳＴＫ－１、線条体ＧＡＢＡＡ受容体、及びヒトＥＧＦで実証されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１５４４－６（１９８８）；Ｖａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｍｍｕｎ．、１：２２５－３２（１９８９）；Ｐｅｎｉｓら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｍａｌ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．、１５；５７：３１０－２０（１９９８）；並びに米国特許第５，８０１，１５４号；第５，７８９，５７３号；第５，７１８，７０９号及び第５，６１０，２８８号参照）。その上、様々な異常細胞増殖、例えば、がんを阻害し、治療するために使用され得るアンチセンス構築物もまた、記述されている（米国特許第５，７４７，４７０号；同第５，５９１，３１７号；及び同第５，７８３，６８３号参照）。これらの参考文献の開示は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0161】

アンチセンスオリゴヌクレオチドを産生する方法は、当技術分野で公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを産生するために容易に適合し得る。与えられた標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列の選択は、選択された標的配列の分析、並びに二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、及び相対的安定性の決定に基づいている。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主細胞内で標的ｍＲＮＡへの特異的結合を減少させるか、あるいは妨げる二量体、ヘアピン、又は他の二次構造を形成するそれらの相対的不能に基づいて選択されることができる。ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域には、ＡＵＧ翻訳開始コドン又はその近くの領域、及びｍＲＮＡの５’領域と実質的に相補的な配列が含まれる。これらの二次構造の解析及び標的部位選択の考慮は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー解析ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ）のｖ．４及び／又はＢＬＡＳＴＮ ２．０．５アルゴリズムソフトウェアを用いて実施され得る（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５：３３８９－４０２（１９９７））。

【0162】

５．リボザイム
本発明の別の実施態様によれば、核酸－脂質粒子は、リボザイムと関連している。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するＲＮＡ－タンパク質複合体である（Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８４：８７８８－９２（１９８７）；及びＦｏｒｓｔｅｒら、Ｃｅｌｌ，４９：２１１－２０（１９８７）参照）。例えば、多くのリボザイムは、高度な特異性でリン酸エステル転移反応を促進し、しばしばオリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルの１つだけを切断する（Ｃｅｃｈら、Ｃｅｌｌ，２７：４８７－９６（１９８１）；Ｍｉｃｈｅｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１６：５８５－６１０（１９９０）；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ－Ｈｕｒｅｋら、Ｎａｔｕｒｅ，３５７：１７３－６（１９９２）参照）。この特異性は、化学反応に先立って、基質がリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に特異的な塩基対合相互作用を介して結合するという要件に起因している。

【0163】

現在、少なくとも６つの基本的な種類の天然に存在する酵素ＲＮＡ分子が知られている。それぞれが生理学的条件下で、トランスのＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解に触媒作用を及ぼし得る（ひいては、他のＲＮＡ分子を切断し得る）。一般に、酵素核酸は、最初に標的ＲＮＡに結合することによって作用する。そのような結合は、標的ＲＮＡを切断するために作用する分子の酵素部分にごく近接して保持されている酵素核酸の標的結合部分を通じて起こる。したがって、酵素核酸は、最初に標的ＲＮＡを認識し、次に相補的塩基対合を介して結合させ、一旦正しい部位に結合すると、標的ＲＮＡを切断するために酵素的に作用する。そのような標的ＲＮＡの戦略的な切断は、コードされたタンパク質の合成を指示するその能力を損なうであろう。酵素核酸がそのＲＮＡ標的を結合させ、切断した後、それは、別の標的を探すためにそのＲＮＡから遊離し、そして、繰り返し新しい標的を結合させ、切断し得る。

【0164】

酵素核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、δ型肝炎ウイルス、グループＩイントロン又はＲＮａｓｅＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と関連して）、又はＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡモチーフで形成される。ハンマーヘッドモチーフの具体例は、例えば、Ｒｏｓｓｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０：４５５９－６５（１９９２）に記述されている。ヘアピンモチーフの例は、例えば、ＥＰ ０３６０２５７、Ｈａｍｐｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８：４９２９－３３（１９８９）；Ｈａｍｐｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８：２９９－３０４（１９９０）；及び米国特許第５，６３１，３５９号に記述されている。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、例えば、Ｐｅｒｒｏｔｔａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１：１１８４３－５２（１９９２）に記述されている。ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、例えば、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ－Ｔａｋａｄａら、Ｃｅｌｌ、３５：８４９－５７（１９８３）に記述されている。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ＶＳ ＲＮＡリボザイムモチーフの例は、例えば、Ｓａｖｉｌｌｅら、Ｃｅｌｌ，６１：６８５－９６（１９９０）；Ｓａｖｉｌｌｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８８２６－３０（１９９１）；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：２７９５－９（１９９３）に記述されている。グループＩイントロンの例は、例えば、米国特許第４，９８７，０７１号に記述されている。本発明に従って使用される酵素核酸分子の重要な特徴は、一又は複数の標的遺伝子ＤＮＡ又はＲＮＡ領域に相補的である特異的基質結合部位を有するということ、及び分子にＲＮＡ切断活性を与えるその基質結合部位の内部又は周囲にヌクレオチド配列を有するということである。したがって、リボザイム構築物は、本明細書において言及された特定のモチーフに限定される必要はない。これらの参考文献の開示は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0165】

任意のポリヌクレオチド配列を標的とするリボザイムを産生する方法は、当技術分野で知られている。リボザイムは、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ ９３／２３５６９号及び第ＷＯ ９４／０２５９５号に記述されたとおりに設計され、当該明細書において記述されたとおりにインビトロ及び／又はインビボで試験されるように合成されることができる。これらのＰＣＴ公報の開示は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0166】

リボザイム活性は、リボザイム結合アームの長さを変えるか、あるいは血清リボヌクレアーゼによる分解を防止する修飾（例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ ９２／０７０６５号、第ＷＯ ９３／１５１８７号、第ＷＯ ９１／０３１６２号、及び第ＷＯ ９４／１３６８８号；ＥＰ ９２１１０２９８．４；並びに米国特許第５，３３４，７１１号を参照されたい、これらは酵素ＲＮＡ分子の糖部分に加えることができる様々な化学修飾について記述しており、これらの開示はそれぞれ、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、細胞内での効力を増強する修飾、及びＲＮＡ合成時間を短縮し、化学的必要条件を低減するための幹ＩＩ塩基（ｓｔｅｍ ＩＩ ｂａｓｅｓ）の除去を有するリボザイムを化学的に合成することによって最適化され得る。

【0167】

６．免疫刺激性オリゴヌクレオチド
本発明の脂質粒子に関連する核酸は、ヒトなどの哺乳動物である、対象に投与された場合、免疫応答を誘導することができる免疫刺激性オリゴヌクレオチド（ＩＳＳ；一本鎖又は二本鎖）を含む免疫刺激性（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）であってもよい。ＩＳＳには、例えば、ヘアピン二次構造につながる特定のパリンドローム（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：４０７２－６（１９９２）参照）、又はＣｐＧモチーフ、及び他の既知のＩＳＳの特徴（マルチＧドメインなど；ＰＣＴ公報第ＷＯ ９６／１１２６６号参照；その開示は、あらゆる目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）が含まれる。

【0168】

免疫刺激性核酸は、免疫応答を引き起こすために標的配列に特異的に結合し、その発現を低下させることが要求されない場合、非配列特異的であると見なされる。したがって、特定の免疫刺激性核酸は、天然に存在する遺伝子又はｍＲＮＡの領域に対応する配列を含むことができるが、それにしても非配列特異的免疫刺激性核酸と見なされる可能性がある。

【0169】

一実施形態において、免疫刺激性核酸又はオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチド又はＣｐＧジヌクレオチドは、非メチル化又はメチル化されていてもよい。別の実施形態において、免疫刺激性核酸は、メチル化シトシンを有する少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。一実施形態において、核酸は、単一のＣｐＧジヌクレオチドを含み、前記ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンはメチル化されている。代替の実施形態において、核酸は、少なくとも２つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、前記ＣｐＧジヌクレオチド中の少なくとも１つのシトシンはメチル化されている。さらなる実施形態において、配列中に存在するＣｐＧジヌクレオチド中の各シトシンは、メチル化されている。別の実施形態において、核酸は、複数のＣｐＧジヌクレオチドを含み、前記ＣｐＧジヌクレオチドの少なくとも１つはメチル化シトシンを含む。本発明の組成物及び方法での使用に適した免疫刺激性オリゴヌクレオチドの例は、２００８年１２月３１日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０８／８８６７６号、ＰＣＴ公報第ＷＯ ０２／０６９３６９号及び第ＷＯ ０１／１５７２６号、米国特許第６，４０６，７０５号、及びＲａｎｅｙら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．、２９８：１１８５－９２（２００１）に記述されており、これらの開示は、あらゆる目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、本発明の組成物及び方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル（「ＰＯ」）主鎖又はホスホロチオエート（「ＰＳ」）主鎖、及び／又はＣｐＧモチーフ中の少なくとも１つのメチル化シトシン残基を有する。

【0170】

Ｂ．他の活性剤
特定の実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子に関連する活性剤は、一又は複数の治療用タンパク質、ポリペプチド、又は有機小分子又は化合物を含むことができる。そのような治療上有効な薬剤（ａｇｅｎｔｓ）又は薬物（ｄｒｕｇｓ）の非限定的な例としては、抗がん剤（ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｄｒｕｇｓ）（例えば、化学療法薬、ホルモン療法薬、免疫療法薬、放射線治療薬など）、脂質低下薬、抗ウイルス薬、抗炎症化合物、抗うつ薬、興奮剤、鎮痛剤、抗生物質、避妊薬、解熱剤、血管拡張剤、抗血管形成剤（ａｎｔｉ－ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃｓ）、細胞血管剤（ｃｙｔｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｇｅｎｔｓ）、シグナル伝達阻害剤、抗不整脈薬などの心臓脈管薬、ホルモン、血管収縮剤、及びステロイドが挙げられる。これらの活性剤は、本発明の脂質粒子中に単独で、あるいは干渉ＲＮＡなどの核酸を含む本発明の脂質粒子と組み合わせて（例えば、共投与）投与されることができる。

【0171】

化学療法薬の非限定的な例としては、白金ベースの薬剤（例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、スピロプラチン、イプロプラチン、サトラプラチンなど）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロレタミン、ウラムスチン、チオテパ、ニトロソウレアなど）、代謝拮抗剤（例えば、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、アザチオプリン、メトトレキサート、ロイコボリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ペメトレキセド、ラルチトレキセドなど）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセルなど）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン（ＣＰＴ－１１；Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、トポテカン、アムサクリン、エトポシド（ＶＰ１６）、リン酸エトポシド、テニポシドなど）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシンなど）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、ゲフィチニブ（イレッサ（登録商標））、スニチニブ（スーテント（登録商標）；ＳＵ１１２４８）、エルロチニブ（タルセバ（登録商標）；ＯＳＩ－１７７４）、ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６；ＧＷ２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ １０３３）、セマキシニブ（ｓｅｍａｘｉｎｉｂ）（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３－９００６）、イマチニブ（グリベック（登録商標）；ＳＴＩ５７１）、ダサチニブ（ＢＭＳ－３５４８２５）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクティマ（商標）；ＺＤ６４７４）など）、薬学的に許容されるそれらの塩、それらの立体異性体、それらの誘導体、それらのアナログ、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

【0172】

従来のホルモン療法薬の例としては、限定されないが、ステロイド（例えば、デキサメタゾン）、フィナステリド、アロマターゼ阻害剤、タモキシフェン、及びゴセレリン及び他のゴナドトロピン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨ）が挙げられる。

【0173】

従来の免疫療法薬の例には、免疫刺激剤（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）、レバミソール、インターロイキン－２、α－インターフェロンなど）、モノクローナル抗体（例えば、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＨＬＡ－ＤＲ、及び抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体）、免疫毒素（例えば、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体－カリキアミシン複合体、抗ＣＤ２２モノクローナル抗体－緑膿菌外毒素複合体など）、放射免疫治療（例えば、^１１１Ｉｎ、^９０Ｙ、^１３１Ｉと結合した抗ＣＤ２０モノクローナル抗体など）が含まれるが、これらに限定されない。

【0174】

従来の放射線治療薬の例には、^４７Ｓｃ、^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ、^３７Ｓｒ、^８６Ｙ、^３７Ｙ、^９０Ｙ、^１０５Ｒｈ、^１１１Ａｇ、^１１１Ｉｎ、^１１７ｍＳｎ、^１４９Ｐｍ、^１５３Ｓｍ、^１６６Ｈｏ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^２１１Ａｔ、及び^２１２Ｂｉなどの放射性核種が含まれるが、これらに限定されるものではなく、任意に腫瘍抗原に対する抗体と結合する。

【0175】

本発明に従って使用されることができる追加の抗がん剤には、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、ａｒａＣ、三酸化ヒ素、ベキサロテン、ｂｉＣＮＵ、カルムスチン、ＣＣＮＵ、セレコキシブ、クラドリビン、シクロスポリンＡ、シトシンアラビノシド、シトキサン、デクスラゾキサン、ＤＴＩＣ、エストラムスチン、エキセメスタン、ＦＫ５０６、ゲムツズマブ－オゾガマイシン、ハイドレア、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、インターフェロン、レトロゾール、ロイスタチン、リュープロリド、リトレチノイン（ｌｉｔｅｒｔｉｎｏｉｎ）、メガストロール、Ｌ－ＰＡＭ、メスナ、メトキサレン、ミトラマイシン、ナイトロジェンマスタード、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニゾン、リツキサン、ストレプトゾシン、ＳＴＩ－５７１、タキソテール、テモゾラミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、ＶＭ－２６、トレミフェン、トレチノイン、ＡＴＲＡ、バルルビシン、及びベルバン（ｖｅｌｂａｎ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明に従って使用されることができる抗がん剤の他の例は、エリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎ）及びエリプチシンアナログ又は誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害剤、並びにカンプトテシンである。

【0176】

トリグリセリド、コレステロール、及び／又はグルコースの上昇に関連する脂質疾患又は障害を治療するための脂質低下剤の非限定的な例としては、スタチン、フィブラート、エゼチミブ、チアゾリジンジオン、ナイアシン、β遮断薬、ニトログリセリン、カルシウム拮抗薬、魚油、及びそれらの混合物が挙げられる。

【0177】

抗ウイルス薬の例には、アバカビル、アシクロビル（ａｃｉｃｌｏｖｉｒ）、アシクロビル（ａｃｙｃｌｏｖｉｒ）、アデホビル、アマンタジン、アンプレナビル、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、シドホビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、エントリー阻害剤、ファムシクロビル、多剤混合薬、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネート（ｆｏｓｆｏｎｅｔ）、融合阻害剤、ガンシクロビル、イバチタビン、イムノビル（ｉｍｕｎｏｖｉｒ）、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、インターフェロンＩＩＩ型（例えば、ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２、ＩＦＮ－λ３などのＩＦＮ－λ分子）、インターフェロンＩＩ型（例えば、ＩＦＮ－γ）、インターフェロンＩ型（例えば、ＰＥＧ化ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－κ、ＩＦＮ－δ、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－τ、ＩＦＮ－ω、及びＩＦＮ－ξなどのＩＦＮ－α）、インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、ＭＫ－０５１８、マラビロク、モロキシジン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネキサビル、ヌクレオシド類似体、オセルタミビル、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、プロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、サキナビル、スタブジン、相乗的エンハンサー、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、ティプラナビル、トリフルリジン、トリジビル（ｔｒｉｚｉｖｉｒ）、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロク、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、ジドブジン、薬学的に許容されるそれらの塩、それらの立体異性体、それらの誘導体、それらのアナログ、及びそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。

【0178】

追加の薬剤としては、ゾタロリムス、シロリムス、ラパマイシン、エベロリムス、バイオリムス、ミオリムス、ノボリムス、テムシロリムス、デフォロリムス、メリリムス、タクロリムス、ピメクロリムス、リダフォロリムス（ｒｉｄａｆｏｒｏｌｉｍｕｓ）、薬学的に許容されるそれらの塩、それらの立体異性体、それらの誘導体、それらのアナログ、及びそれらの混合物が挙げられる。

【0179】

医薬組成物
脂質ナノ粒子は、医薬組成物として全部又は一部において製剤化される（ｂｅ ｆｏｒｍｕｌａｔｅｄ）ことができる。医薬組成物は、一又は複数のナノ粒子を含むことができる。例えば、医薬組成物は、一又は複数の異なる治療薬及び／又は予防薬を含む一又は複数のナノ粒子を含むことができる。医薬組成物は、本明細書において記述されているような一又は複数の薬学的に許容される賦形剤又は副成分をさらに含むことができる。医薬組成物及び医薬品の処方及び製造のための一般的なガイドラインは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１^ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ．，２００６で入手可能である。従来の賦形剤及び副成分は、任意の従来の賦形剤又は副成分が脂質ナノ粒子の一又は複数の成分と不適合である可能性がある場合を除き、任意の医薬組成物に使用されることができる。賦形剤又は副成分は、脂質ナノ粒子の成分との組み合わせが望ましくない生物学的効果又はその他の有害な効果をもたらす可能性がある場合、脂質ナノ粒子の成分と不適合である可能性がある。

【0180】

いくつかの実施形態において、一又は複数の賦形剤又は副成分は、脂質ナノ粒子を含む医薬組成物の全質量又は体積の５０％超を構成することができる。例えば、一又は複数の賦形剤又は副成分は、医薬品協定（ａ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ）の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれ以上を構成してもよい。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％純粋である。いくつかの実施形態において、賦形剤は、ヒトでの使用及び動物用として承認されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されている。いくつかの実施形態において、賦形剤は医薬品グレードである。いくつかの実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、及び／又は国際薬局方の基準を満たす。

【0181】

本開示に従った医薬組成物中の一又は複数の脂質ナノ粒子、一又は複数の薬学的に許容される賦形剤、及び／又は任意の付加成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズ、及び／又は状態に応じて、さらに組成物が投与される経路に応じて変化するであろう。一例として、医薬組成物は、０．１％～１００％（ｗｔ／ｗｔ）の一又は複数の脂質ナノ粒子を含むことができる。

【0182】

特定の実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子及び／又は医薬組成物は、保管及び／又は出荷のために冷蔵又は冷凍される（例えば、約－１５０℃～約０℃、又は約－８０℃～約－２０℃（例えば、約－５℃、－１０℃、－１５℃、－２０℃、－２５℃、－３０℃、－４０℃、－５０℃、－６０℃、－７０℃、－８０℃、－９０℃、－１３０℃又は－１５０℃）の温度などの約４℃以下の温度で保管される）。

【0183】

特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物は、本明細書中に開示される脂質ナノ粒子、並びにトリス、アセテート（例えば、酢酸ナトリウム）、シトレート（例えば、クエン酸ナトリウム）、生理食塩水、ＰＢＳ、及びスクロースの１つ以上から選択される薬学的に許容される担体を含む。特定の実施形態において、本開示の医薬組成物は、約７～８（例えば、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９若しくは８．０、又は７．５～８又は７～７．８）のｐＨ値を有する。例えば、本開示の医薬組成物は、本明細書中に開示されるナノ粒子組成物、トリス、生理食塩水及びスクロースを含み、例えば、約－２０℃での保管及び／又は出荷に適している、約７．５～８のｐＨを有する。例えば、本開示の医薬組成物は、本明細書において開示される脂質ナノ粒子及びＰＢＳを含み、例えば、約４℃以下での保管及び／又は出荷に適した、約７～７．８のｐＨを有する。本開示の文脈における「安定性」、「安定化」及び「安定」とは、所与の製造、調製、輸送、保管及び／又は使用中の条件下、例えば、せん断力、凍結／融解ストレスなどのストレスが加えられた場合の、化学的又は物理的変化（例えば、分解、粒径の変化、凝集、カプセル化の変化など）に対する、本明細書中に開示されるナノ粒子組成物及び／又は医薬組成物の耐性を指す。

【0184】

好ましい実施形態において、本発明の脂質ナノ粒子は、トリスＨＣｌ、トリスアセテート、ＴＴ／ＡＡを含む、本明細書中に記述されている任意の一又は複数の緩衝液中で、一又は複数の二糖類、又は例えば、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、マルチトール、若しくはラクチトールなどの分子を含む二糖を用いて処方される。以下の実施例において示されるように、スクロースを用いて製剤化された脂質ナノ粒子は、凝集することなく解凍後に再構成され得る。

【0185】

脂質ナノ粒子及び／又は一又は複数の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、一又は複数の特定の細胞、組織、器官、又は腎系などの、それらの系若しくは群への治療薬及び／又は予防薬の送達によって提供される治療効果から利益を得る可能性のある患者又は対象を含む、任意の患者又は対象に投与されることができる。脂質ナノ粒子及び脂質ナノ粒子を含む医薬組成物の本明細書において提供される説明は、主にヒトへの投与に適している組成物を対象にするが、そのような組成物は、一般に任意の他の哺乳動物への投与に適していることが当業者に理解されるであろう。組成物を様々な動物への投与に適する状態にするために、ヒトへの投与に適する組成物の改良はよく理解されており、人並みに熟練した獣医薬学者は、もしあれば、単なる普通の実験を用いて、そのような改良を設計及び／又は実施することができる。組成物の投与が考えられる対象には、ヒト、他の霊長類、及び例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／又はラットなどの商業的に関連のある哺乳動物を含む他の哺乳動物が含まれるが、これらに限定されない。

【0186】

一又は複数の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、薬理学の技術分野において既知の、あるいは今後開発される任意の方法によって調製されることができる。一般に、そのような調製方法には、賦形剤及び／又は１つ以上の他の副成分に関連する有効成分をもたらすこと、及び次に、望ましい場合か、あるいは必要ならば、製品を所望の単回又は複数回投与単位に分割、成形、及び／又は包装することが含まれる。

【0187】

本開示に従った医薬組成物は、単回単位用量として、及び／又は複数の単回単位用量として、バルクで調製、包装、及び／又は販売されることができる。本明細書で使用する場合、「単位用量」とは、所定量の有効成分（例えば、脂質ナノ粒子）を含む医薬組成物の離散量である。有効成分の量は、一般に、対象に投与されることになる有効成分の投与量に等しい、及び／又はかかる投与量の都合の良い分数（ｆｒａｃｔｉｏｎ）、例えば、かかる投与量の２分の１若しくは３分の１などである。

【0188】

医薬組成物は、様々な投与経路及び投与方法に適した様々な形態で調製されることができる。例えば、医薬組成物は、液体剤形（例えば、エマルション、マイクロエマルション、ナノエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、及びエリキシル）、注射剤型、固体剤形（例えば、カプセル、錠剤（ｔａｂｌｅｔｓ）、丸薬（ｐｉｌｌｓ）、粉末、及び顆粒）、局所及び／又は経皮投与のための剤形（例えば、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、及びパッチ）、懸濁液、粉末、及び他の形態で調製されてもよい。

【0189】

経口及び非経口投与のための液体剤形には、薬学的に許容されるエマルション、マイクロエマルション、ナノエマルション、溶液、懸濁液、シロップ、及び／又はエリキシルが含まれるが、これらに限定されない。有効成分に加えて、液体剤形は、例えば、水又は他の溶媒、可溶化剤及びエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１．３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステルなどのエマルション、並びにそれらの混合物などの当該技術分野で一般に使用される不活性希釈剤を含むことができる。不活性希釈剤の他に、経口組成物は、追加の治療薬及び／又は予防薬、追加の薬剤、例えば、湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味剤、香味剤、及び／又は芳香剤などを含むことができる。非経口投与のための特定の実施形態において、組成物は、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、及び／又はそれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合される。

【0190】

注射用製剤、例えば、滅菌注射用水性又は油性懸濁液は、適切な分散剤、湿潤剤、及び／又は懸濁化剤を用いて、既知の技術に従って製剤化するされるができる。滅菌注射製剤は、非毒性の、非経口的に許容される希釈剤及び／又は溶媒中の、例えば、１，３－ブタンジオール中の溶液として、滅菌注射溶液、懸濁液、及び／又は乳剤であることができる。水、リンゲル液、Ｕ．Ｓ．Ｐ．、及び等張塩化ナトリウム溶液は、使用されることができる容認可能なビヒクル及び溶媒である。滅菌固定油は、溶媒又は懸濁媒体として従来の方法で使用されている。この目的のために、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む、任意の無菌性の固定油が使用され得る。オレイン酸のような脂肪酸は、注射物質の調製に使用され得る。

【0191】

注射製剤は、例えば、細菌保持フィルターを介したろ過によって、及び／又は使用前に滅菌水又は他の滅菌注射媒体に溶解又は分散し得る滅菌固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって滅菌され得る。

【0192】

直腸又は膣投与のための組成物は、典型的には座薬であり、組成物を適切な非刺激性賦形剤、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール又は座薬ワックスなどと混合することによって調製されることができ、これらの組成物は、周囲温度では固体であるが体温では液体であり、それ故に直腸又は膣腔内で融解して有効成分を放出する。

【0193】

経口投与のための固形剤形には、カプセル、錠剤、丸薬、フィルム、粉末、及び顆粒が含まれる。そのような固形剤形において、有効成分は、クエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウムなどの少なくとも１つの不活性で薬学的に許容される賦形剤及び／又は充填剤又は増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、及びケイ酸）、結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏｎｅ）、スクロース、及びアカシア）、保湿剤（例えば、グリセロール）、崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケート、及び炭酸ナトリウム）、溶解遅延剤（例えば、パラフィン）、吸収促進剤（例えば、第４級アンモニウム化合物）、湿潤剤（例えば、セチルアルコール及びグリセロールモノステアレート）、吸収剤（例えば、カオリン及びベントナイトクレー、シリケート）、及び潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、並びにそれらの混合物である。カプセル、錠剤及び丸薬の場合、剤形は、緩衝剤を含んでもよい。

【0194】

同様のタイプの固体組成物は、ラクトース又は乳糖などの賦形剤及び高分子量ポリエチレングリコールなどを用いて、ソフト及びハード充填ゼラチンカプセルの充填剤として使用されることができる。錠剤、糖衣錠、カプセル、丸薬及び顆粒の固形剤形は、腸溶コーティング及び医薬製剤技術分野で周知の他のコーティングなどのコーティング及び殻を用いて調製され得る。これらは、任意に乳白剤を含むことができ、腸管の特定の部分においてのみ、あるいは優先的に、任意に、遅延して有効成分を放出する組成のものであり得る。使用され得る包理組成物の例としては、重合物質及びワックスが挙げられる。同様のタイプの固体組成物は、ラクトース又は乳糖などの賦形剤及び高分子量ポリエチレングリコールなどを用いて、ソフト及びハード充填ゼラチンカプセルの充填剤として使用されることができる。

【0195】

組成物の局所及び／又は経皮投与のための剤形としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉末、溶液、スプレー、吸入剤、及び／又はパッチが挙げられる。一般に、有効成分は、滅菌条件下で、薬学的に許容される賦形剤及び／又は任意の必要とされる防腐剤及び／又は必要である可能性がある緩衝液と混和される。さらに、本開示は、経皮パッチの使用を検討しており、このパッチは、しばしば、身体への化合物の制御された送達を提供するという付加的な利点を有する。そのような剤形は、例えば、化合物を適切な媒体に溶解及び／又は分散することによって調製されることができる。代替的又は付加的に、速度制御膜を提供すること及び／又はポリマーマトリクス及び／又はゲル中に化合物を分散させることのいずれかによって、速度を制御することができる。

【0196】

本明細書において記述されている皮内医薬組成物の送達に使用するための適切な装置としては、米国特許第４，８８６，４９９号；第５，１９０，５２１号；第５，３２８，４８３号；第５，５２７，２８８号；第４，２７０，５３７号；第５，０１５，２３５号；第５，１４１，４９６号；及び第５，４１７，６６２号に記述されているもののような短針装置が挙げられる。皮内組成物は、ＰＣＴ公報ＷＯ ９９／３４８５０に記述されているもの及びその機能的等価物などの皮膚への針の有効侵入長を制限する装置によって投与されることができる。液体ジェット式注射器を介して、及び／又は角質層を貫通し、真皮に到達するジェットを生成する針を介して、液体組成物を真皮に送達するジェット注射装置が適している。ジェット注射装置は、例えば、米国特許第５，４８０，３８１号；第５，５９９，３０２号；第５，３３４，１４４号；５，９９３，４１２号；第５，６４９，９１２号；第５，５６９，１８９号；第５，７０４，９１１号；第５，３８３，８５１号；第５，８９３，３９７号；第５，４６６，２２０号；第５，３３９，１６３号；第５，３１２，３３５号；第５，５０３，６２７号；第５，０６４，４１３号；第５，５２０，６３９号；第４，５９６，５５６号；第４，７９０，８２４号；第４，９４１，８８０号；第４，９４０，４６０号；及びＰＣＴ公報ＷＯ ９７／３７７０５及びＷＯ ９７／１３５３７に記述されている。圧縮ガスを使用して粉末状のワクチンを皮膚の外層から真皮まで加速させる弾道粉末／粒子送達装置（Ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｐｏｗｄｅｒ／ｐａｒｔｉｃｌｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｄｅｖｉｃｅｓ）が適している。代替的又は追加的に、従来の注射器は、皮内投与のための古典的なマントゥー法に使用されることができる。

【0197】

局所投与に適した製剤には、液体及び／又は半液体製剤、例えば、塗布薬、ローション、クリーム、軟膏及び／又はペーストなどの水中油型及び／又は油中水型エマルション、及び／又は溶液及び／又は懸濁液などが含まれるが、これらに限定されない。有効成分の濃度は、溶媒中の有効成分の溶解限界と同じくらい高くてもよいが、局所投与可能な製剤は、例えば、約１％～約１０％（ｗｔ／ｗｔ）の有効成分を含んでもよい。局所投与のための製剤は、本明細書において記述されている一又は複数の付加成分をさらに含んでもよい。

【0198】

医薬組成物は、口腔を介した肺投与に適した製剤で調製、包装、及び／又は販売されることができる。そのような製剤は、有効成分を含む乾燥粒子を含んでもよい。そのような組成物は、都合が良いことには、粉末を分散させるために推進剤の流れを向けることができる乾燥粉末リザーバを含む装置を用いて、及び／又は密閉容器内の低沸点推進剤に溶解及び／又は懸濁した有効成分を含む装置などの自己推進溶媒／粉末分注容器（ａ ｓｅｌｆ－ｐｒｏｐｅｌｌｉｎｇ ｓｏｌｖｅｎｔ／ｐｏｗｄｅｒ ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）を用いて投与するための乾燥粉末の形態である。乾燥粉末組成物は、砂糖のような固体微粉末希釈剤を含んでもよく、単位用量形態で都合よく提供される。

【0199】

低沸点推進剤は、一般に、大気圧で６５°Ｆ未満の沸点を有する液体推進剤を含む。一般に、推進剤は、組成物の５０％～９９．９％（ｗｔ／ｗｔ）を構成することができ、有効成分は、組成物の０．１％～２０％（ｗｔ／ｗｔ）を構成することができる。推進剤は、液体の非イオン性界面活性剤及び／又は固体のアニオン性界面活性剤及び／又は固体の希釈剤（有効成分を含む粒子と同じオーダーの粒径を有してもよい）などの付加成分をさらに含んでよい。

【0200】

肺送達のために製剤化された医薬組成物は、溶液及び／又は懸濁液の液滴の形態で有効成分を提供することができる。そのような製剤は、任意に無菌の、有効成分を含む、水性及び／又は希アルコール溶液及び／又は懸濁液として調製、包装、及び／又は販売されることができ、任意の噴霧及び／又は霧化装置（ｎｅｂｕｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ／ｏｒ ａｔｏｍｉｚａｔｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ）を用いて都合よく投与されることができる。そのような製剤は、サッカリンナトリウムのような香味剤、揮発性油、緩衝剤、表面活性剤、及び／又はメチルヒドロキシベンゾエートのような防腐剤を含むが、これらに限定されない一又は複数の付加成分をさらに含んでもよい。この投与経路によって提供される液滴は、約１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均直径を有することができる。

【0201】

肺送達に有用であるような本明細書おいて記述されている製剤は、医薬組成物の経鼻送達に有用である。鼻腔内投与に適した別の製剤は、有効成分を含み、約０．２μｍ～約５００μｍの平均粒子を有する粗粉末である。そのような製剤は、嗅ぎたばこを吸う方法で、すなわち、鼻の近くに保持された粉末の容器から鼻腔を通過して急速に吸入することによって投与される。

【0202】

鼻腔投与に適した製剤は、例えば、約０．１％（ａｓ ｌｉｔｔｌｅ ａｓ ０．１％）（ｗｔ／ｗｔ）～約１００％（ａｓ ｍｕｃｈ ａｓ １００％）（ｗｔ／ｗｔ）の有効成分を含み、本明細書において記述されている一又は複数の付加成分を含むことができる。医薬組成物は、口腔投与に適した製剤で調製、包装、及び／又は販売されることができる。そのような製剤は、例えば、従来の方法を用いて製造される錠剤及び／又はトローチ剤の形態であってもよく、例えば、０．１％～２０％（ｗｔ／ｗｔ）の有効成分、経口溶解性及び／又は分解性組成物を含む残り（ｂａｌａｎｃｅ）、及び任意に、本明細書において記述されている一又は複数の付加成分であってもよい。別法として、口腔投与に適した製剤は、有効成分を含む粉末及び／又はエアロゾル化及び／又は霧化溶液（ａｎ ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ ａｎｄ／ｏｒ ａｔｏｍｉｚｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）及び／又は懸濁液を含むことができる。そのような粉末化、エアロゾル化、及び／又はエアロゾル化（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ， ａｎｄ／ｏｒ ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ）製剤は、分散した場合、約０．１ｎｍ～約２００ｎｍの範囲の平均粒子及び／又は液滴サイズを有し、本明細書において記述されている一又は複数の任意の付加成分をさらに含むことができる。

【0203】

医薬組成物は、眼投与に適した製剤で調製、包装、及び／又は販売されることができる。そのような製剤は、例えば、水性又は油性液体賦形剤中の有効成分の、例えば、０．１／１．０％（ｗｔ／ｗｔ）溶液及び／又は懸濁液を含む点眼薬の形態であってもよい。かかる点眼薬は、緩衝剤、塩、及び／又は本明細書において記述されている、一又は複数のその他の任意の付加成分をさらに含んでもよい。有用である他の眼投与可能な製剤には、有効成分を微結晶形態及び／又はリポソーム製剤中に含むものが含まれる。点耳薬及び／又は点眼薬は、本開示の範囲内であると考えられる。

【0204】

疾患及び障害の治療方法
脂質ナノ粒子は、疾患、障害、又は状態の治療に有用であることができる。特に、そのような組成物は、タンパク質又はポリペプチド活性の欠損又は異常を特徴とする疾患、障害、又は状態の治療に有用であることができる。例えば、欠損又は異常ポリペプチドをコードするｍＲＮＡなどの活性（ａｎ ａｃｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｅ）を含むナノ粒子組成物を細胞に投与又は送達することができる。ｍＲＮＡのその後の翻訳は、ポリペプチドを産生し、それによってポリペプチドの欠失又はポリペプチドに起因する異常な活性によって引き起こされる問題を低減又は除去することができる。翻訳が迅速に起こる可能性があるので、本方法及び組成物は、急性疾患、障害、又は状態、例えば、敗血症、脳卒中、心筋梗塞などの治療に有用であることができる。ナノ粒子組成物に含まれる治療薬及び／又は予防薬はまた、所与の種の転写速度を変化させることができ、それによって遺伝子発現に影響を及ぼすことができる。

【0205】

組成物が投与される可能性があるタンパク質又はポリペプチド活性の機能不全又は異常を特徴とする疾患、障害、及び／又は状態には、希少疾患、感染性疾患（ワクチン及び治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の両方として）、がん及び増殖性疾患、遺伝的疾患（例えば、嚢胞性線維症）、自己免疫疾患、糖尿病、神経変性疾患、心臓血管疾患及び腎血管疾患、並びに代謝性疾患が含まれるが、これらに限定されない。複数の疾患、障害、及び／又は状態は、タンパク質活性の欠損（又は適切なタンパク質機能が生じないように実質的に低下した）によって特徴付けられることができる。そのようなタンパク質は、存在しないか、あるいは本質的に機能しない可能性がある。機能不全タンパク質の具体例は、嚢胞性線維症を引き起こす、ＣＦＴＲタンパク質の機能不全タンパク質変異体を産生する、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子のミスセンス突然変異体である。

【0206】

本開示は、ＲＮＡを含む本発明の脂質ナノ粒子を投与することによって、対象におけるそのような疾患、障害、及び／又は状態を治療する方法を提供し、前記ＲＮＡは、対象の細胞内に存在する異常なタンパク質活性に拮抗するか、あるいは他の方法で克服するポリペプチドをコードするｍＲＮＡであることができる。

【0207】

本開示は、一又は複数の治療薬及び／又は予防薬を含む脂質ナノ粒子を投与することを含む方法、及びそれを含む医薬組成物を提供する。治療の及び予防のという用語は、本開示の特徴及び実施形態に関して本明細書において互換的に使用され得る。治療組成物、又はその画像化、診断、若しくは予防組成物は、疾患、障害、及び／又は状態、及び／又は任意の他の目的の予防、治療、診断、又は画像化に有効な任意の適正な量及び任意の投与経路を用いて対象に投与され得る。所与の対象に投与される具体的な量は、対象の種、年齢、及び一般的な状態；投与の目的；特定の組成物；投与の様式；などに依存して変化することができる。本開示に従った組成物は、投与の容易さ及び投与量の均一性のために、投与単位形態で製剤化されることができる。しかしながら、本開示の脂質ナノ粒子又は医薬組成物の１日当たりの総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されるということが理解されるであろう。特定の患者に対する特定の治療上有効な、予防上有効な、あるいはその他の方法で適切な用量レベル（例えば、画像化のための）は、もしあれば、治療される障害の重症度及び同定；採用される一又は複数の治療薬及び／又は予防薬；採用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事；採用される特定の医薬組成物の投与時間、投与経路、及び排泄速度；治療の期間；採用される特定の医薬組成物と併用又は同時に使用される薬物；並びに医療技術分野において周知の同様の要因を含む、様々な要因に依存する。

【0208】

一又は複数の治療薬及び／又は予防薬を含む脂質ナノ粒子は、任意の経路で投与されることができる。いくつかの実施形態において、本明細書中に記述されている一又は複数の脂質ナノ粒子を含む予防、診断、又は画像化組成物を含む組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、心室内、経皮又は皮内、皮膚間、直腸、膣内、腹腔内、眼内、網膜下、硝子体内、局所（例えば、粉末、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、及び／又は液滴による）、粘膜、経鼻、口腔、経腸、硝子体、腫瘍内、舌下、鼻腔内を含む一又は複数の様々な経路によって；気管内注入、気管支注入、及び／又は吸入によって；経口スプレー及び／又は粉末、鼻腔用スプレー、及び／又はエアロゾルとして、及び／又は門脈カテーテルを介して投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、静脈内、筋肉内、皮内、動脈内、腫瘍内、皮下、眼内、網膜下、硝子体内、又は吸入によって投与されることができる。一般に、最も適切な投与経路は、一又は複数の治療薬及び／又は予防薬を含むナノ粒子組成物の性質（例えば、血流及び胃腸管のような種々の身体環境におけるその安定性）、患者の状態（例えば、患者が特定の投与経路に耐えられるかどうか）などを含む様々な要因に依存する。

【0209】

特定の実施形態において、本開示に従った組成物は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇの治療薬及び／又は予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）を所与の用量で送達するのに十分な投与量レベルで投与されることができ、ここで、１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の用量は、対象の体重１ｋｇあたり１ｍｇの治療薬及び／又は予防薬を提供する。いくつかの実施形態において、ナノ粒子組成物の治療薬及び／又は予防薬（例えば、ｍＲＮＡ）の約０．００１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量を投与することができる。他の実施形態において、治療薬及び／又は予防薬の約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約２．５ｍｇ／ｋｇの用量を投与することができる。特定の実施形態において、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇの用量を投与することができる。他の実施形態において、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約０．２５ｍｇ／ｋｇの用量を投与することができる。所望のレベルのｍＲＮＡの発現及び／又は治療、診断、予防、又は画像化効果を得るために、同一又は異なる量で、１日に一又は複数回、用量を投与することができる。所望の投与量は、例えば、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、３日おき、１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、又は４週間ごとに送達されることができる。特定の実施形態において、所望の投与量は、複数回投与（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、又はそれ以上の投与）を用いて送達されることができる。いくつかの実施形態において、単回投与は、例えば、外科的処置の前又は後に、あるいは急性疾患、障害、又は状態の場合に投与されることができる。

【0210】

一又は複数の治療薬及び／又は予防薬を含む本発明の脂質ナノ粒子は、一又は複数の他の治療薬、予防薬、診断用薬、又は造影剤剤と組み合わせて使用されることができる。「と組み合わせて」とは、これらの送達方法が本開示の範囲内であるが、薬剤が同時に投与されなければならない、及び／又は一緒に送達するために製剤化されなければならない
という意味を含むことを意図するものではない。例えば、一又は複数の異なる治療薬及び／又は予防薬を含む一又は複数の脂質ナノ粒子を組み合わせて投与することができる。脂質ナノ粒子は、一又は複数の他の所望の治療薬又は医療処置と同時に、その前に、あるいはその後に投与され得る。一般に、各薬剤は、その薬剤に関して決定された用量で、及び／又はタイムスケジュールで投与される。いくつかの実施形態において、本開示は、生物学的利用能を改善し、代謝を低減及び／又は改変し、排泄を阻害し、及び／又は体内分布を改変する薬剤と組み合わせた、脂質ナノ粒子、組成物、又はその画像化、診断、若しくは予防組成物の送達を包含する。

【0211】

さらに、組み合わせて利用される治療的、予防的、診断的、又は画像化活性剤は、単一の組成物中で一緒に投与されるか、あるいは異なる組成物中で別々に投与されてもよいことが理解されるであろう。一般に、組み合わせて利用される薬剤は、それらが個々に利用されるレベルを超えないレベルで利用されることが期待される。いくつかの実施形態において、組み合わせて利用されるレベルは、個別に利用されるレベルよりも低くてもよい。

【0212】

併用レジメンに採用する治療（治療薬又は処置）の特定の組み合わせは、所望の治療薬及び／又は処置の適合性及び達成されるべき所望の治療効果を考慮に入れるであろう。また、採用される治療は、同じ障害（例えば、がんの治療に有用な組成物が化学療法剤と同時に投与される）に対して所望の効果を達成することができるか、あるいは異なる効果（例えば、インフュージョンリアクション（ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）などの任意の副作用の制御）を達成することができることが理解されるであろう。

【実施例】

【0213】

実施例１－脂質ナノ粒子の生成
ナノ粒子は、マイクロフルイディクス及び２つの流体流のＴ字路の混合（－ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｍｉｘｉｎｇ ｏｆ ｔｗｏ ｆｌｕｉｄ ｓｔｒｅａｍｓ）などの混合過程で作成されることができ、一方の流体流が治療薬及び／又は予防薬を含み、他方が脂質成分を有する。脂質組成物は、カチオン性脂質（ＤＯＤＡＣ、ＤＯＤＡＰ又はＤｌｉｍ－ＭＣ３－ＤＭＡなど）、リン脂質（ＤＯＰＥ又はＤＳＰＣなど）、ＰＥＧ脂質（１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００など、ＤＭＧ－ＰＥＧとしても知られる）及び構造脂質（コレステロール又はコルチコステロイド（プレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾン、及びヒドロコルチゾンなど）、又はその組み合わせなど）をエタノール中で、約５０ｍＭの濃度で組み合わせることによって調製される。別段の定めがない限り、本明細書において「ＭＩＰＳ－ＬＮＰ」と呼ばれるナノ粒子には、以下で言及される脂質ナノ粒子１～４のいずれか１つが含まれる。溶液は、例えば、４℃で保管する場合には冷蔵され、例えば、－２０℃で保管する場合には凍結される必要がある。脂質を所望のモル比をもたらすように組み合わせ、エタノールで約５．５ｍＭ～約５０ｍＭの最終脂質濃度に希釈する。治療薬及び／又は予防薬及び脂質成分を含むナノ粒子組成物は、約５：１～約５０：１の脂質成分対治療薬及び／又は予防薬のｗｔ：ｗｔ比で、治療薬及び／又は予防薬を含む溶液を有する脂質溶液を組み合わせることによって調製される。脂質溶液は、例えば、マイクロ流体又はＴ字接合ベースのシステムを用いて、約０．５ｍｌ／ｍｉｎ～約８ｍｌ／ｍｉｎの流速で核酸溶液と混合され、約１：１～約４：１、好ましくは３：１の水対エタノール比を有する脂質ナノ粒子懸濁液を産生する。ここで、ＮＰ比（窒素体ホスフェート）は４～７の間で維持される。溶液は、後述のように、最適な緩衝液で直ちに希釈又は緩衝液交換されることができる。

【0214】

生成された脂質ナノ粒子の例としては、以下が挙げられる：

【表1】

【表2】

【表3】

【表4】

【0215】

ＲＮＡを含むナノ粒子組成物に関して、脱イオン水中で０．１３３～０．６ｍｇ／ｍｌ濃度のＲＮＡ溶液をｐＨ３～４．５の２５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液で希釈し、貯蔵液を形成する（図１）。ナノ粒子の製剤化後、ナノ粒子組成物は、透析又はタンジェンシャルフローろ過によって処理され、エタノールを除去し、緩衝液交換を達成し得る。例えば、製剤は、分子量カットオフが１０ｋＤであるＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒカセット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩＩ．）を用いて、一次製品の２００倍の体積で、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して２回透析される。最初の透析は、室温で３時間実行される。結果として生じるナノ粒子懸濁液は、ガラスバイアル中で０．４又は０．２２μｍの滅菌フィルターを通ってろ過され、密封される。０．０１ｍｇ／ｍｌ～０．５０ｍｇ／ｍｌのナノ粒子組成物溶液が一般に得られる。いくつかの実施形態において、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ製のタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を透析カセットの代わりに使用した。さらに、ｐＨ７．４のトリススクロース溶液は、製剤の一部が－１０～－８０℃で凍結されるのを可能にするために使用された。

【0216】

上述の方法は、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒマイクロフルイディクスを用いてナノ沈殿及び粒子形成を誘導する。Ｔ字接合及び直接注射を含むが、これらに限定されない別のプロセスは、同様のナノ沈殿を達成するために使用されることができる。ｍＲＮＡストック、及びカプセル化脂質の濃度を高くしたり低くしたりして、ナノ沈殿の際に使用することもできる。

【0217】

ＬＮＰは、一般に、静脈注射後、肝臓に受動的に送達されるように製剤化される。肝臓へのｓｉＲＮＡを標的とするＬＮＰ（ＯｎＰａｔｔｒｏ、Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）は、２０１８年にＦＤＡによってヒトへの使用が承認された。本発明者らは、このタイプの製品を従来のＬＮＰと呼んでいる。

【0218】

実施例２－脂質ナノ粒子の構造特性評価
脂質ナノ粒子サイズ、多分散性指数（ＰＤＩ）、及びナノ粒子組成物のゼータ電位は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて測定された。つまり、透析された粒子を使い捨てキュベット（例えば、ゼータセル（Ｍａｌｖｅｒｎ）又はＵＶキュベット）に入れた。キュベットをゼータサイザー内に置き、測定を記録した。ゼータサイザーのソフトウェア１２．０を用いてサイズの計算を再コード化した。

【0219】

ＭＩＰＳ－ＬＮＰは、ＰＥＧ化脂質含量のモル比を、従来のＬＮＰ組成物で使用されている０．５モル％濃度未満に低下させることによって製造され得る。一般に、従来のＬＮＰは、１．５モル％のＰＥＧ化脂質で形成される。本発明者らは、ＬＮＰのＰＥＧ化脂質含量濃度を低下させると、粒径が１００ｎｍより大きくなるということを観察した（図２Ａ）。対照的に、従来のＬＮＰ製剤は、サイズが１００ｎｍ未満の粒子を生成するが、ＭＩＰｓ－ＬＮＰ及び従来のＬＮＰは、両方とも同様の粒度分布プロファイルを維持する（図２Ｂ）。さらに、本発明者らは、ＰＥＧ化脂質０．１５モル％のＭＩＰＳ－ＬＮＰが、ＰＥＧ化モル％濃度の低下した状態で、４℃で少なくとも６ヶ月間安定であるということを示した（図２Ｃ）。ＭＩＰＳ－ＬＮＰの全体的な製剤は、脾臓のような免疫器官へのアクセスを高めるのに有益である、非常に強い負のゼータ電位を提供する（データは示さず）。

【0220】

本明細書において記述されている生物物理学的特性評価は、上記で言及された脂質ナノ粒子３又は４で実施された。

【0221】

実施例３－脂質ナノ粒子の機能的特性評価
筋肉内注射（ＩＭ）は、特にウイルス性疾患及び細菌性疾患のワクチン接種に用いられる一般的な投与方法である。ＤＯＤＡＰをイオン化脂質（例えば、上記で言及された脂質ナノ粒子３又は４）として用いて、本発明者らは、ＩＭ注射後、ＭＩＰＳ－ＬＮＰによって誘導された筋肉組織以外の遺伝子発現の＞７５％が、従来のＬＮＰによって誘導された～１０％と比較して、脾臓にあるということを実証した（図３）。ＭＩＰＳ－ＬＮＰによるｍＲＮＡの送達はまた、驚くべきことに、従来の小型ＬＮＰと比べて、脾臓におけるレポーター遺伝子であるナノルシフェラーゼの～１００倍高い濃度をもたらす（図４Ａ）。この研究では、１０μｇのナノルシフェラーゼｍＲＮＡの用量が使用された。さらに、ＭＩＰＳ－ＬＮＰは、注射部位からのリンパ流のすぐ下流ではないリンパ節（非流入領域リンパ節として知られている）へのアクセスを獲得することが示されている。

【0222】

本発明者らは、ＬＮＰの平均サイズが大きいほど、抗原提示細胞、すなわち、ワクチン応答を指揮する免疫細胞によるより優れた取り込みにつながるということを示した。現在のＬＮＰの一般的なサイズは、７０－１００ｎｍの範囲である。ＭＩＰＳ－ＬＮＰは、１００ｎｍより大きく設計されている。特に直径１２５ｎｍより大きい（典型的には１４０－１６０ｎｍ）。しかし、より大きな粒子は脾臓への選択的受動的送達をさらに加えることができる（データは示さず）。

【0223】

静脈内（ＩＶ）注射は、入院患者の治療－例えば、がんワクチン接種に使用され得る別の投与方法である。本発明者らは、ＭＩＰＳ－ＬＮＰ（超大型ＬＮＰ）による、ＩＶ注射を介した、１０μｇのナノルシフェラーゼｍＲＮＡの用量を用いるｍＲＮＡの送達が、従来の小型ＬＮＰと比べて、脾臓におけるレポーター遺伝子であるナノルシフェラーゼの～５００倍高い濃度をもたらす（ボックスによるハイライト）ということを実証した（図４Ｂ）。さらに、ＭＩＰＳ－ＬＮＰは、従来のＬＮＰと比較して、様々な選別された脾臓細胞におけるレポーター遺伝子の発現を介した遺伝子導入の実質的な増加を明示した（図４Ｃ）。ＭＩＰＳ－ＬＮＰはまた、製剤を肝臓（肝臓へのｓｉＲＮＡの送達のために設計された従来のＬＮＰ製剤の主な使用対象）から迂回させるという利点も有する。ワクチンにとって、肝臓での遺伝子発現を低下させることは、有益と見なされる。－すなわち、「オフターゲット」領域を減少させることによって副作用を減少させること。これらの研究で遺伝子発現を分析するために、注射から１６－２４時間後に組織を採取し、組織を量り、１ｍｌのＧｌｏＬｙｓｉｓ緩衝液を加え、Ｍ－ｔｕｂｅｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ）を用いて均質化した。チューブを遠心分離機にかけ（１００００ｇ×１ｍｉｎ）、上清を収集した。ナノルシフェラーゼ遺伝子発現の分析は、ＮａｎｏＧｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって提案されたとおり実施された。遺伝子発現レベルは、ルシフェラーゼの設定を用いてプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ ｅｌｍｅｒ）で定量化された。組織１ｇあたりの遺伝子発現を計算及びプロットした。

【0224】

脾臓細胞における遺伝子発現は、ナノルシフェラーゼ（１０ｕｇ）を注射して約１６時間後に測定された。脾細胞は、コラゲナーゼ消化（２ｍｇ／ｍｌ）によって単離され、最初にＣＤ８、ＣＤ１１Ｃ、Ｆ４／８０、ｍＰＤＣＡ－１で標識され、ＦＡＣＳを用いて分離された。次に、分離された集団は、ルシフェラーゼ発現（すなわち、細胞集団あたりの特異的取り込み及び発現）に関して、上述のようにＮａｎｏＧｌｏアッセイを用いて分析された。

【0225】

この例では、ＭＩＰＳ－ＬＮＰは、従来のＬＮＰと比較して、肝臓への送達が２．３倍低い（表１）。

【表5】

【0226】

実施例４－抗原分子の脂質ナノ粒子送達に対する細胞免疫応答
免疫応答のレベルを決定するために、オボアルブミン抗原を用いた抗原特異的死滅アッセイを使用した。Ｃ５７ＢＬマウス（８～２４週齢）に静脈内ワクチン接種した。

【0227】

ＭＩＰＳ－ＬＮＰによる抗原分子送達に対する細胞性免疫応答に関して、本発明者らは、インビボでｍＲＮＡワクチンモデルを使用した。マウスは、０日目に抗原性オボアルブミンｍＲＮＡ構築物を含むＭＩＰＳ－ＬＮＰで免疫を与えられた。細胞追跡標識ＳＩＩＮＦＥＫＬ脾細胞を５日目にドナーマウスから免疫化マウスに移植し、ワクチン接種を受けたマウスの脾細胞を単離し、２４時間後に分析した（図５）。ＳＩＩＮＦＥＫＬパルス細胞（抗原保有細胞）の死滅のレベルを細胞コントロール（ＳＩＩＮＦＥＫＬなし）と比較した。ＭＩＰＳ－ＬＮＰは、オボアルブミンエピトープに対する標的特異的細胞傷害性Ｔ細胞の死滅の増強を誘導した（図６）。ＭＩＰＳ－ＬＮＰは、少量のｍＲＮＡをマウスに投与した（１０ｕｇ）場合、ほぼ完全な死滅を誘導した。比較して、従来のＬＮＰは、同じｍＲＮＡの用量で有効なワクチン接種を生じさせなかった。注射前と比較した抗原欠失率と抗原含有率（死滅）の差は、フローサイトメーターを用いて測定され、百分率としてプロットされた。

【0228】

実施例５－ＭＩＰＳ－ＬＮＰの物理的安定性
ＭＩＰＳ製剤を用いて医薬品の製造が可能であることを証明するため、本発明者らは、製剤を「凍結融解」できるかどうかを試験し、使用前の輸送のために冷凍庫での保管を可能にした。製品（上記の脂質ナノ粒子１）を上述のように様々な緩衝液中で製剤化及び透析し、複数回凍結した（図７）。凍結保護剤（ａ ｃｒｙｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）としてスクロースを添加した全ての製剤は、著しい凝集を起こすことなく、解凍後に粒子の再構成を明示した。したがって、ＭＩＰＳ－ＬＮＰ製剤は、輸送に対して安定であることが示され、医薬品として使用可能であることを実証する。

【0229】

実施例６－ＬＮＰ送達におけるＰＥＧ化脂質含量の効果
ＬＮＰ送達に対するＰＥＧ化脂質濃度の効果を証明するために、本発明者らは、ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（５０モル％）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）（１０モル％）、ＰＥＧ化脂質（０．１５モル％又は１．５モル％）、コレステロール（脂質含量の残り－すなわち、それぞれ３９．８５モル％又は３８．５モル％）を含む２つの製剤を調製した。ＤＳＰＥ－ＰＥＧ又はＤＭＧ－ＰＥＧをＰＥＧ化脂質として使用した。ナノルシフェラーゼｍＲＮＡをＬＮＰ製剤（「０．１５モル％」又は「１．５モル％」）にパッケージングし、ＢａｌｂＣマウス（８～２４週齢）に筋肉内注射（ＩＭ）又は静脈内注射（ＩＶ）した。１４～１８時間後、器官を単離し、重量を量った。器官をＭ－ｔｕｂｅｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びＧｌｏ－ｌｙｓｉｓ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて均質化した。（ＲＬＵ）としてのナノルシフェラーゼ活性は、ナノルシフェラーゼ溶解キット（Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、製造者の指示に従って測定された。

【0230】

ＩＶ注射後、脾臓及びリンパ節のナノルシフェラーゼ濃度は、０．１５モル％製剤の方が１．５モル％製剤よりも一貫して５０～１００倍高かった。ＩＭ注射後のリンパ組織に対する傾向もまた、一貫していたが、その差は５～１０倍であった（図８）。特に、ＩＭ注射した０．１５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ製剤は、１．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ製剤と比較して、脾臓では有意に高濃度、肝臓では濃度のナノルシフェラーゼを産生した（図９）。０．１５モル％のＰＥＧ化脂質を含むＤＭＧ－ＰＥＧ及びＤＳＰＥ－ＰＥＧ製剤は、両方ともナノルシフェラーゼｍＲＮＡを肝臓から脾臓へのルートに切り替えた（図１０Ａ）。

【0231】

実施例７－脂質ナノ粒子中のＰＥＧ化脂質含量
１．５モル％より低いＰＥＧ化脂質含量がＬＮＰ ｍＲＮＡ送達に有益な効果をもたらすことを確立したので、本発明者らは、ＬＮＰ製剤に最適なＰＥＧ化脂質の範囲を決定しようとした。

【0232】

様々なＤＭＧ－ＰＥＧ脂質組成物を０．１モル％～１．５モル％の範囲で試験し、コレステロール組成物を適切に調整した。ナノルシフェラーゼｍＲＮＡをＬＮＰ製剤中にパッケージングし、組成物をＢａｌｂＣマウス（８～２４週）にＩＭ注射した。

【表6】

【0233】

０．２モル％～０．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧは、標準的な１．５モル％のＰＥＧ化脂質製剤と比較して、脾臓におけるナノルシフェラーゼの高い発現をもたらし、この特定の範囲で脾臓の送達が促進されることを示唆している（表２）。しかしながら、０．１モル％～０．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ ＬＮＰ製剤は、全て１．５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧ ＬＮＰ製剤よりも脾臓／肝臓の発現比が有意に高かった。同様の効果はまた、非流入領域リンパにも見られ、ナノルシフェラーゼの発現は０．２モル％のＤＭＧ－ＰＥＧで最も高かった（データは示さず）。流入領域リンパ節、注射を受けた大腿四頭筋及び肝臓でのナノルシフェラーゼ発現に有意差はなかったが、０．１～０．２モル％の平均発現レベルは高い範囲より低かった（データは示さず）。

【0234】

ＰＥＧ化脂質の範囲をさらに解明するために、本発明者らは、ＬＮＰ製剤中の０．１５モル％、０．２モル％、０．２５モル％、０．３モル％及び０．３５モル％のＤＭＧ－ＰＥＧを試験した。上記のように、ナノルシフェラーゼｍＲＮＡをＬＮＰ製剤中にパッケージングし、組成物をＩＭ注射した。前回の結果と同様に、脾臓、非流入領域リンパ節及びリンパ節におけるナノルシフェラーゼの最も高い発現レベルは、０．１５モル％で見られ、ＤＭＧ－ＰＥＧ含量が増加するにつれて発現が減少する傾向が見られた（データは示さず）。

【0235】

ＤＭＧ－ＰＥＧ含量の減少は、脾臓のナノルシフェラーゼ発現の増加及び肝臓のナノルシフェラーゼ発現の減少と関連していた（データは示さず）。同様に、ＤＭＧ－ＰＥＧの減少と非流入領域リンパ球の送達及び発現の増加の間にも関係がある。さらに、低濃度のＤＭＧ－ＰＥＧは、ナノルシフェラーゼ発現を肝臓から脾臓へのルートに切り替えた（表３）。

【表7】

【0236】

総合して、これらの結果は、ＭＩＰＳ－ＬＮＰで処方されているように、ＬＮＰのＰＥＧ化の減少が脾臓内での粒子の取り込み及び遺伝子発現を促進するということを明示している。ＭＩＰＳ－ＬＮＰ製剤（例としてＤＯＤＡＰを使用）は、免疫応答を増強し、恐らくがん用予防ワクチン及び治療ワクチンの両方の効率を向上させる。脾臓細胞ターゲティングは、免疫チェックポイント阻害のためのタンパク質の発現などの多くの応用、並びにＭＩＰＳ製剤による標的ｍＲＮＡデリバリーを介した、抗原特異的耐性、一般的な耐性の誘導を誘導する、他の応用、並びにｍＲＮＡデリバリー、ｓｉＲＮＡデリバリー、他の分子（例えば、ＭＩＰＳ ＬＮＰに組み込まれた小薬物など）を用いる、ＤＮＡ又は他の任意の核酸又はｍＲＮＡデリバリーの手段を介した、自己免疫疾患に対抗すること、脾細胞によって引き起こされる炎症を軽減すること又はアレルギー反応及びアナフィラキシー反応を軽減することにおける応用に魅力的である。従来のＬＮＰは、脾細胞に送達せず、それ故に上記の概略の応用に使用する場合には劣る。

【0237】

本明細書で開示及び規定された本発明は、本文又は図面で言及されるか、あるいは、から明らかな２つ以上の個々の特徴の全ての代替的な組み合わせにまで及ぶことが理解されるであろう。これらの異なる組み合わせは全て、本発明の様々な代替的態様を構成する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【国際調査報告】