特表 2024-534120 インビトロ転写技術

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-18

(54)【発明の名称】インビトロ転写技術

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20240910BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALN20240910BHJP

   C07H 21/02 20060101ALN20240910BHJP

   A61K 39/00 20060101ALN20240910BHJP

   A61K 48/00 20060101ALN20240910BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20240910BHJP

   A61P 31/00 20060101ALN20240910BHJP

   A61P 31/14 20060101ALN20240910BHJP

【ＦＩ】

C12N15/10 Z

A61K31/7105 ZNA

C07H21/02

A61K39/00 H

A61K48/00

A61P35/00

A61P31/00

A61P31/14

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024511980

(86)(22)【出願日】2021-09-01

(85)【翻訳文提出日】2024-04-19

(86)【国際出願番号】 EP2021074139

(87)【国際公開番号】W WO2023025404

(87)【国際公開日】2023-03-02

(31)【優先権主張番号】63/236,660

(32)【優先日】2021-08-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522021206

【氏名又は名称】ビオンテック・ソシエタス・エウロパエア

【氏名又は名称原語表記】ＢｉｏＮＴｅｃｈ ＳＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】ラーベ，イレーナ

(72)【発明者】

【氏名】ブッフ，マクシミリアン

(72)【発明者】

【氏名】ツィーゲンハルス，トーマス

(72)【発明者】

【氏名】ドレーゲミュラー，ヨハンナ

(72)【発明者】

【氏名】クーン，アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】フェッサー，シュテファニー

(72)【発明者】

【氏名】コームズ，ロドニー ジーン

(72)【発明者】

【氏名】エシュマン，ニコル

(72)【発明者】

【氏名】ロマイン，ジェニファー アン ショボーグ

(72)【発明者】

【氏名】ウィリアムソン，ジェナ キャスリン

【テーマコード（参考）】

4C057

4C084

4C085

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C057CC03

4C057DD03

4C057MM01

4C057MM02

4C057MM08

4C057MM09

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZB32

4C084ZB33

4C085AA03

4C085DD90

4C085EE01

4C086AA04

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZB32

4C086ZB33

(57)【要約】

本開示は、インビトロ転写反応のための技術、特に医薬品グレードＲＮＡの産生のための技術、及びいくつかの実施形態では、大規模産生のための技術を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

インビトロ転写を介してリボ核酸（ＲＮＡ）分子を産生する方法であって、反応混合物を反応条件下で作製して、前記ＲＮＡ分子を形成することを含み、前記反応混合物が、核酸ポリメラーゼ、核酸テンプレート、ならびに
総グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）に対するモル比ａの総シチジン三リン酸（ＣＴＰ）及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）及び／または
総ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）に対するモル比ｂの総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）及び／または
総アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）に対するモル比ｃの総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）を含み、
前記ＲＮＡ分子が、
総グアノシン及び／または１つ以上の機能的グアノシン類似体（複数可）に対するモル比ｘの総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）、及び／または
総ウリジン及び／または１つ以上の機能的ウリジン類似体（複数可）に対するモル比ｙの総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）、及び／または
総アデノシン及び／または１つ以上の機能的アデノシン類似体（複数可）に対するモル比ｚの総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）を含み、
ａが、少なくとも１．２５であり、及び／またはａが、ｘの少なくとも約１．１０倍であり、及び／または
ｂが、少なくとも１．２５であり、及び／またはｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍であり、及び／または
ｃが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍である、前記方法。

【請求項2】

ａが、少なくとも１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、または１．８である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ａが、少なくとも１．５である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

ａが、ｘの少なくとも約１．１５倍、１．２０倍、１．２５倍、１．３０倍、１．３５倍、１．４０倍、１．４５倍、１．５０倍、１．５５倍、１．６０倍、１．６５倍、１．７０倍、または１．７５倍である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

ａが、ｘの少なくとも約１．１５倍である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

ａが、ｘの少なくとも約１．２０倍である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

ｂが、少なくとも１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、または１．８である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

ｂが、少なくとも１．５である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

ｂが、ｙの少なくとも約１．１５倍、１．２０倍、１．２５倍、１．３０倍、１．３５倍、１．４０倍、１．４５倍、１．５０倍、１．５５倍、１．６０倍、１．６５倍、１．７０倍、または１．７５倍である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

ｂが、ｙの少なくとも約１．１５倍である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

ｂが、ｙの少なくとも約１．２０倍である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

ｃが、少なくとも１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、または１．５０である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

ｃが、少なくとも１．２５である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

ｃが、ｚの少なくとも約１．１５倍、１．２０倍、１．２５倍、１．３０倍、１．３５倍、１．４０倍、１．４５倍、１．５０倍、１．５５倍、１．６０倍、１．６５倍、１．７０倍、または１．７５倍である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

ｃが、ｚの少なくとも約１．１５倍である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

ｃが、ｚの少なくとも約１．２０倍である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記反応混合物中に、
総ＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）に対するモル比ｄの総ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）、及び／または
総ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）に対するモル比ｅの総ＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）を組み合わせることを更に含み、
前記ＲＮＡ分子が、
総グアノシン及び／または１つ以上の機能的グアノシン類似体（複数可）に対するモル比ｖの総アデノシン及び／または１つ以上の機能的アデノシン類似体（複数可）、及び／または
総アデノシン及び／または１つ以上の機能的アデノシン類似体（複数可）に対するモル比ｗの総ウリジン及び／または１つ以上の機能的ウリジン類似体（複数可）を更に含み、
ｄが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍であり、及び／または
ｅが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

ｄが、少なくとも１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、または１．５０である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

ｄが、少なくとも１．２０である、請求項１７または１８に記載の方法。

【請求項20】

前記ｄが、ｖの少なくとも約１．１０倍、１．１５倍、１．２０倍、１．２５倍、１．３０倍、１．３５倍、１．４０倍、１．４５倍、または１．５０倍である、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

ｄが、ｖの少なくとも約１．１０倍である、請求項１７～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

ｄが、ｖの少なくとも約１．２０倍である、請求項１７～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

ｅが、少なくとも１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、または１．５０である、請求項１７～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

ｅが、少なくとも１．２０である、請求項１７～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記ｅが、ｗの少なくとも約１．１０倍、１．１５倍、１．２０倍、１．２５倍、１．３０倍、１．３５倍、１．４０倍、１．４５倍、または１．５０倍である、請求項１７～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

ｅが、ｗの少なくとも約１．１０倍である、請求項１７～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

ｅが、ｗの少なくとも約１．２０倍である、請求項１７～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）の一部分が、転写が始まる前及び／または転写の開始時に前記反応混合物に添加され、前記総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）の残りの部分が、前記転写の開始後に前記反応混合物に添加される、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）の全てが、転写が始まる前及び／または転写の開始時に前記反応混合物に添加される、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記総ＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）の一部分が、転写が始まる前及び／または転写の開始時に前記反応混合物に添加され、前記総ＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）の残りの部分が、前記転写の開始後に前記反応混合物に添加される、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記総ＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）の全てが、転写が始まる前及び／または転写の開始時に前記反応混合物に添加される、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

前記総ＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）の一部分が、転写が始まる前及び／または転写の開始時に前記反応混合物に添加され、前記総ＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）の残りの部分が、前記転写の開始後に前記反応混合物に添加される、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記総ＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）の全てが、転写が始まる前及び／または転写の開始時に前記反応混合物に添加される、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記総ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）の一部分が、転写が始まる前及び／または転写の開始時に前記反応混合物に添加され、前記総ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）の残りの部分が、前記転写の開始後に前記反応混合物に添加される、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記総ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）の全てが、転写が始まる前及び／または転写の開始時に前記反応混合物に添加される、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

前記ＲＮＡ分子が、一本鎖である、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

前記ＲＮＡ分子が、直鎖ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、及び／またはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡである、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記核酸テンプレートが、ＤＮＡテンプレートである、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記反応混合物が、前記核酸テンプレートを０．０５～２μｇ／μＬの濃度で含む、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記核酸ポリメラーゼが、ＲＮＡポリメラーゼである、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記核酸ポリメラーゼが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎ４ビリオンＲＮＡポリメラーゼ、またはそれらのバリアントもしくは機能ドメインである、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記反応混合物が、反応緩衝液、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、１つ以上の塩、還元剤、及びスペルミジンのうちの１つ以上を更に含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記反応緩衝液が、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、またはＰＢＳを含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記反応混合物が、前記反応緩衝液を２０～６０ｍＭの濃度で含む、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記反応緩衝液が、７～９のｐＨを有する、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

前記反応混合物が、前記ＲＮａｓｅ阻害剤を０．０１～０．１Ｕ／μＬの濃度で含む、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記ＲＮａｓｅ阻害剤の１つの単位（Ｕ）が、５ｎｇのＲＮａｓｅ Ａの活性を少なくとも５０％阻害する、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記ピロホスファターゼが、無機ピロホスファターゼである、請求項４２～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記反応混合物が、前記ピロホスファターゼを０．０１～０．２ｍＵ／μＬの濃度で含む、請求項４２～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

前記１つ以上の塩が、１つ以上のマグネシウム塩及び／または１つ以上のカルシウム塩を含む、請求項４２～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

前記１つ以上のマグネシウム塩が、酢酸マグネシウムまたは塩化マグネシウムを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記反応混合物が、前記１つ以上の塩を２０～６０ｍＭの濃度で含む、請求項４２～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

前記還元剤が、ジチオスレイトールまたは２－メルカプトエタノールを含む、請求項４２～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記反応混合物が、前記還元剤を５～１５ｍＭの濃度で含む、請求項４２～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記反応混合物が、前記スペリミジンを０．５～３ｍＭの濃度で含む、請求項４２～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

インビトロ転写が、少なくとも２０～１８０分間実施される、請求項１～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

インビトロ転写が、２５～５５℃の温度で実施される、請求項１～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記ＲＮＡ分子のインビトロ転写後に前記核酸テンプレートを消化することを更に含む、請求項１～５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

前記核酸テンプレートが、ＤＮａｓｅによって消化される、請求項５８に記載の方法。

【請求項60】

前記ＤＮａｓｅが、ＤＮａｓｅ Ｉを含む、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

前記ＲＮＡ分子のインビトロ転写後に前記核酸ポリメラーゼを消化することを更に含む、請求項１～５９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項62】

前記核酸ポリメラーゼが、プロテイナーゼによって消化される、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

前記プロテイナーゼが、プロテイナーゼＫを含む、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記ＲＮＡ分子のインビトロ転写のための１つ以上の品質管理パラメータを評価することを更に含む、請求項１～６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項65】

インビトロ転写のための前記１つ以上の品質管理パラメータが、転写中及び／または転写後の前記ＲＮＡ分子のＲＮＡ完全性、ＲＮＡ濃度、残留二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、及び／またはキャッピングを含む、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記ＲＮＡ完全性が、アガロースゲル電気泳動を使用して評価される、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記ＲＮＡ完全性が、キャピラリーゲル電気泳動を使用して評価される、請求項６５に記載の方法。

【請求項68】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の前記ＲＮＡ完全性が、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％である、請求項１～６７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項69】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の前記ＲＮＡ完全性が、ａが少なくとも１．２５ではなく、ｂが少なくとも１．２５ではなく、及び／またはｃが少なくとも１．１０ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する、請求項１～６８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項70】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の前記ＲＮＡ完全性が、
ｄが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが少なくとも１．１０ではない、
ａが少なくとも１．２５ではなく、ｂが少なくとも１．２５ではなく、ｃが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが少なくとも１．１０ではない、
ａが少なくとも１．２５ではなく、ｂが少なくとも１．２５ではなく、ｃが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが少なくとも１．１０であり、及び／またはｅが少なくとも１．１０である、及び／または
ａが少なくとも１．２５であり、ｂが少なくとも１．２５であり、及び／またはｃが少なくとも１．１０であり、及び／またはｄが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが少なくとも１．１０ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する、請求項１７～６９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項71】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の前記ＲＮＡ完全性が、ａがｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｃがｚの少なくとも約１．１０倍ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する、請求項１～７０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の前記ＲＮＡ完全性が、
ｄがｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍ではない、
ａがｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃがｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄがｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍ではない、
ａがｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃがｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄがｖの少なくとも約１．０５倍であり、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍である、及び／または
ａがｘの少なくとも約１．１０倍であり、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｃがｚの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｄがｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する、請求項１７～７１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項73】

前記ＲＮＡ完全性が、少なくとも約５％増加する、請求項６９～７２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項74】

前記ＲＮＡ完全性が、少なくとも約８％増加する、請求項７１または７２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項75】

前記ＲＮＡ濃度が、ＵＶ吸収分光光度法を使用して評価される、請求項６５～７４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項76】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の濃度が、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、または１５ｍｇ／ｍＬである、請求項１～７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項77】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の濃度が、ａが少なくとも１．２５ではなく、ｂが少なくとも１．２５ではなく、及び／またはｃが少なくとも１．１０ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％増加する、請求項１～７６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項78】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の濃度が、
ｄが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが少なくとも１．１０ではない、
ａが少なくとも１．２５ではなく、ｂが少なくとも１．２５ではなく、ｃが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが少なくとも１．１０ではない、
ａが少なくとも１．２５ではなく、ｂが少なくとも１．２５ではなく、ｃが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが少なくとも１．１０であり、及び／またはｅが少なくとも１．１０である、及び／または
ａが少なくとも１．２５であり、ｂが少なくとも１．２５であり、及び／またはｃが少なくとも１．１０であり、及び／またはｄが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが少なくとも１．１０ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する、請求項１７～７７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項79】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の濃度が、ａがｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｃがｚの少なくとも約１．１０倍ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％増加する、請求項１～７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項80】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の濃度が、
ｄがｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍ではない、
ａがｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃがｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄがｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍ではない、
ａがｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃがｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄがｖの少なくとも約１．０５倍であり、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍である、及び／または
ａがｘの少なくとも約１．１０倍であり、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｃがｚの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｄがｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する、請求項１７～７９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項81】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の濃度が、少なくとも約２０％増加する、請求項７７～８０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項82】

前記残留ｄｓＲＮＡが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、吸光度、蛍光染料、及び／またはゲル電気泳動を使用して評価される、請求項６５～８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項83】

前記残留ｄｓＲＮＡが、定量ＰＣＲを使用して評価される、請求項６５～８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項84】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の転写中及び／または転写後の前記残留ｄｓＲＮＡが、少なくとも約２５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、５０ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、７５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１２５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１５０ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１７５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２２５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２５０ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２７５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、または３００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡである、請求項１～８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項85】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の転写中及び／または転写後の前記残留ｄｓＲＮＡが、ａが少なくとも１．２５ではなく、ｂが少なくとも１．２５ではなく、及び／またはｃが少なくとも１．１０ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％減少する、請求項１～８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項86】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の転写中及び／または転写後の前記残留ｄｓＲＮＡが、
ｄが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが少なくとも１．１０ではない、
ａが少なくとも１．２５ではなく、ｂが少なくとも１．２５ではなく、ｃが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが少なくとも１．１０ではない、
ａが少なくとも１．２５ではなく、ｂが少なくとも１．２５ではなく、ｃが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが少なくとも１．１０であり、及び／またはｅが少なくとも１．１０である、及び／または
ａが少なくとも１．２５であり、ｂが少なくとも１．２５であり、及び／またはｃが少なくとも１．１０であり、及び／またはｄが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが少なくとも１．１０ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する、請求項１７～８５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項87】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の転写中及び／または転写後の前記残留ｄｓＲＮＡが、ａがｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｃがｚの少なくとも約１．１０倍ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％減少する、請求項１～８６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項88】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の転写中及び／または転写後の前記残留ｄｓＲＮＡが、
ｄがｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍ではない、
ａがｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃがｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄがｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍ではない、
ａがｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃがｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄがｖの少なくとも約１．０５倍であり、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍である、及び／または
ａがｘの少なくとも約１．１０倍であり、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｃがｚの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｄがｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する、請求項１７～８７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項89】

前記残留ｄｓＲＮＡ濃度が、少なくとも約７０％減少する、請求項８５～８８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項90】

前記ＲＮＡ分子のキャッピングが、
（ａ）機能的にキャッピングされたＲＮＡの翻訳を評価すること、
（ｂ）生体活性試験を実施して、前記ＲＮＡ分子が、正しいサイズのタンパク質に翻訳されていることを確認すること、
（ｃ）ヌクレアーゼベースのアッセイを行うこと、及び／または
（ｄ）触媒核酸ベースのアッセイを行うこと、によって評価される、請求項６５～８９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項91】

前記ヌクレアーゼベースのアッセイが、ＲＮａｓｅベースのアッセイを含み、前記ＲＮａｓｅベースのアッセイが、
（ａ）多数のＲＮＡ分子を、前記ＲＮＡ分子に結合する１つ以上のプローブにアニーリングして、ＲＮＡプローブ複合体を形成すること、
（ｂ）前記ＲＮＡプローブ複合体をＲＮａｓｅで消化して、前記ＲＮＡ分子の５’末端を含む断片を生成すること、
（ｃ）親和性ベースの精製、クロマトグラフィーベースの精製、もしくはそれらの組み合わせを使用して、前記断片を精製すること、
（ｄ）前記精製された断片を質量分析（ＭＳ）に供すること、
（ｅ）観察されたＭＳ値に基づいて、キャッピングされた及びキャッピングされていない断片を特定すること、及び／または
（ｆ）キャッピングされた及びキャッピングされていない断片の量を比較して、キャッピングされたＲＮＡの割合を計算すること、のうちの１つ以上を含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記ＲＮａｓｅが、ＲＮａｓｅ Ｈを含む、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

前記ヌクレアーゼベースのアッセイが、
（ａ）多数の前記ＲＮＡ分子を、５’ＲＮＡキャップもしくは前記ＲＮＡのキャッピングされていない最後から２番目の塩基に隣接する前記ＲＮＡ分子の５’非翻訳領域内の配列に相補的な１つ以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドと接触させること、
（ｂ）前記１つ以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドを前記ＲＮＡ分子の前記５’非翻訳領域内の前記配列にアニーリングして、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド複合体を形成すること、
（ｃ）前記ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド複合体及び／またはアニーリングされていないＲＮＡ分子を１つ以上のヌクレアーゼで分解して、キャッピングされた及びキャッピングされていない５’末端ＲＮＡ断片及び３’ＲＮＡ断片を産生すること、
（ｄ）親和性ベースの精製、クロマトグラフィーベースの精製、もしくはそれらの組み合わせを使用して、前記キャッピングされた及びキャッピングされていない５’末端ＲＮＡ断片を前記３’ＲＮＡ断片から分離すること、及び／または
（ｅ）キャッピングされた及びキャッピングされていない５’末端ＲＮＡ断片の量を比較して、キャッピングされたＲＮＡの割合を計算すること、のうちの１つ以上を含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項94】

触媒核酸ベースのアッセイが、
（ａ）多数のＲＮＡ分子を触媒核酸分子で５’末端ＲＮＡ断片及び少なくとも１つの３’ＲＮＡ断片に切断することであって、前記ＲＮＡ分子が前記触媒核酸分子の切断部位を有する、前記切断すること、
（ｂ）親和性ベースの精製、クロマトグラフィーベースの精製、もしくはそれらの組み合わせを使用して、５’末端ＲＮＡ断片及び３’ＲＮＡ断片を分離すること、
（ｃ）分光学、定量的質量分析、配列決定、もしくはそれらの組み合わせを使用して、キャッピングされた及びキャッピングされていない５’末端ＲＮＡ断片の量を測定すること、及び／または
（ｄ）キャッピングされた及びキャッピングされていない５’末端ＲＮＡ断片の量を比較して、キャッピングされたＲＮＡの割合を計算すること、のうちの１つ以上を含む、請求項９０に記載の方法。

【請求項95】

前記触媒核酸分子が、ＤＮＡザイムまたはリボザイムを含む、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％が、キャッピングされる、請求項１～９５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項97】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の前記キャッピングが、ａが少なくとも１．２５ではなく、ｂが少なくとも１．２５ではなく、及び／またはｃが少なくとも１．１０ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％増加する、請求項１～９６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項98】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の転写中及び／または転写後の前記残留ｄｓＲＮＡが、
ｄが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが少なくとも１．１０ではない、
ａが少なくとも１．２５ではなく、ｂが少なくとも１．２５ではなく、ｃが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが少なくとも１．１０ではない、
ａが少なくとも１．２５ではなく、ｂが少なくとも１．２５ではなく、ｃが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが少なくとも１．１０であり、及び／またはｅが少なくとも１．１０である、及び／または
ａが少なくとも１．２５であり、ｂが少なくとも１．２５であり、及び／またはｃが少なくとも１．１０であり、及び／またはｄが少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが少なくとも１．１０ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する、請求項１７～９７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項99】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の前記キャッピングが、ａがｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｃがｚの少なくとも約１．１０倍ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％増加する、請求項１～９８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項100】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の転写中及び／または転写後の前記残留ｄｓＲＮＡが、
ｄがｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍ではない、
ａがｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃがｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄがｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍ではない、
ａがｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃがｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄがｖの少なくとも約１．０５倍であり、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍である、及び／または
ａがｘの少なくとも約１．１０倍であり、ｂがｙの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｃがｚの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｄがｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅがｗの少なくとも約１．０５倍ではない反応混合物中のインビトロ転写と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する、請求項１７～９９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項101】

前記方法によって産生される前記ＲＮＡ分子の前記キャッピングが、少なくとも約５％増加する、請求項９７～１００のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

特に、治療モダリティとしての重要性が高まっていることに照らして、ＲＮＡを製造するための技術は重要であり、貴重である。

【発明の概要】

【0002】

本開示は、ＲＮＡ、特に治療用ＲＮＡ（例えば、治療用ｍＲＮＡ）を製造するための技術に関するある特定の洞察を提供する。いくつかの実施形態では、提供される技術は、例えば、治療グレードＲＮＡの大規模産生に使用される場合、特に有用であり、及び／または驚くべき利益及び／または利点を提供する。

【0003】

例えば、本開示は、インビトロ転写（ＩＶＴ）反応混合物中のシチジン三リン酸（ＣＴＰ）及び／またはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の特に有用な濃度に関する洞察を提供する（例えば、初期反応混合物中では、ＮＴＰは、補充されない限り、それらの濃度が時間の経過とともに減少するように、反応中に利用されることが当業者によって理解される）。

【0004】

いくつかの実施形態では、本開示は、ＲＮＡ収率、ＲＮＡ完全性、ＲＮＡキャッピングレベル、及び／または効率のうちの１つ以上を改善する技術を提供し、代替的にまたは追加的に、いくつかの実施形態では、本開示は、１つ以上の夾雑物または異常産物（例えば、ｄｓＲＮＡ）のレベルを低減する技術を提供する。

【0005】

いくつかの実施形態では、本開示は、反応で生成されるＲＮＡ転写物の配列とは無関係に有用であるＩＶＴ反応条件（例えば、反応混合物中のヌクレオチド濃度）を提供する。

【0006】

本開示は、特に大規模（例えば、商業規模）でのＩＶＴによるＲＮＡの産生に関する問題の認識を包含する。とりわけ、本開示は、インビトロで転写されたＲＮＡが、高収率及び／または完全性で、及び／または低レベルの異常産物（例えば、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ））で産生することが困難であり得ることを特定する。本開示は、そのような課題が、特に商業規模（例えば、０．１～１０ｇ、１０～５００ｇ、５００ｇ～１ｋｇ、７５０ｇ～１．５ｋｇ、当業者は、異なる産物が、例えば、患者集団サイズに応じて異なる規模で製造され得ることを理解するであろう）で、及び／または医薬品品質（これは、例えば、夾雑物及び／または完全性問題がそのような規模でより顕著であり得るため、例えば、より大きな規模で達成することが典型的により困難であり得る）で、治療用（例えば、動物（複数可）、及び特にヒトへの投与のための）ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を産生するときに特に緊急であり得ることを特に理解する。

【0007】

いくつかの実施形態では、提供される技術は、（例えば、転写物中のＧ及び／またはＵ含有量と比較して）比較的高いＣ及び／またはＡ含有量を有する転写物の産生に適用されるときに有用であり得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、本開示は、提供される反応条件（例えば、反応混合物中のＣＴＰ及び／またはＡＴＰ［またはその類似体］のレベル［例えば、絶対レベル及び／または相対レベル］）が、転写物配列とは無関係に有用であり得るという驚くべき洞察を提供する。

【0008】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の上昇したＣＴＰ及び／またはＡＴＰは、産生されるＲＮＡ中のヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド含有量）のパーセント及び／またはモル比とは独立して、収率及び／または完全性及び／またはキャッピングを改善し、及び／または１つ以上の異常産物（例えば、ｄｓＲＮＡ）の産生を低下させる。

【0009】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術は、商業的品質及び／または商業規模でのＲＮＡの製造に特に有用である。当業者は、異なる治療用ＲＮＡが、非常に異なる規模で利用されることを認識するであろう。例えば、対象特異的ＲＮＡが記載されており、個別化されたがんワクチンで使用されており（例えば、ＲＯ７１９８４５７を参照されたい）、これらは、関連する個体を処置するのに十分な規模でのみ製造される必要がある。対照的に、他の目的のために、例えば、一般的ながんワクチンとして、感染作用因子ワクチンとして、抗体、酵素、サイトカインなどの発現のためのベクターとして開発されたＲＮＡは、典型的には、より大きな規模（複数可）で製造され得る。治療用ＲＮＡは、前例のない規模での製造を必要とする最近のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２パンデミックにおいて特に価値があることが証明されている。本明細書で提供される技術は、様々な実施形態では、これらの規模の各々で利用され得る。したがって、例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術は、約０．０１ｇＲＮＡ／時間～約１ｇＲＮＡ／時間、１ｇＲＮＡ／時間～約１００ｇＲＮＡ／時間、約１ｇ ＲＮＡ／時間～約２０ｇ ＲＮＡ／時間、または約１００ｇ ＲＮＡ／時間～約１０，０００ｇ ＲＮＡ／時間の範囲内のＲＮＡを（例えば、製造規模で）産生するのに有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術は、バッチ当たり数十または数百ミリグラムから数十または数百グラム（またはそれ以上）のＲＮＡを産生する反応に利用される。当業者は、本開示を読むことで、達成されたある特定の利点（例えば、改善された完全性及び／または収率）が、医薬品グレードで、及び／または特に本明細書に記載されるような大規模での製造で、特に有利であり得ることを理解するであろう。

【0010】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術は、例えば、スループット容量を更に改善するために、並行して利用され得る。

【0011】

いくつかの特定の実施形態では、提供される技術は、少なくとも０．０１ｇ、０．０２ｇ、０．０３ｇ、０．０４ｇ、０．０５ｇ、０．０６ｇ、０．０７ｇ、０．０８ｇ、０．０９ｇ、０．１ｇ、０．５ｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ ＲＮＡ（例えば、少なくとも１５ｇ ＲＮＡ、少なくとも２０ｇ ＲＮＡ、少なくとも２５ｇ ＲＮＡ、少なくとも３０ｇ ＲＮＡ、少なくとも３５ｇ ＲＮＡ、少なくとも４０ｇ ＲＮＡ、少なくとも４５ｇ ＲＮＡ、少なくとも５０ｇ ＲＮＡ、少なくとも５５ｇ ＲＮＡ、少なくとも６０ｇ ＲＮＡ、少なくとも７０ｇ ＲＮＡ、少なくとも８０ｇ ＲＮＡ、少なくとも９０ｇ ＲＮＡ、少なくとも１００ｇ ＲＮＡ、少なくとも１５０ｇ ＲＮＡ、少なくとも２００ｇ ＲＮＡ、少なくとも３００ｇ ＲＮＡ、少なくとも４００ｇ ＲＮＡ、少なくとも５００ｇ ＲＮＡ、少なくとも７５０ｇ、少なくとも１ｋｇ、少なくとも１．１ｋｇ、少なくとも１．２ｋｇ、少なくとも１．３ｋｇ、少なくとも１．４ｋｇ、少なくとも１．５ｋｇ以上を含む）のバッチサイズでのＲＮＡ調製物（例えば、ＲＮＡ原薬）を製造するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供する技術を使用して、約０．０１ｇ～約５００ｇ ＲＮＡ、約０．０１ｇ～約１０ｇ ＲＮＡ、約１ｇ～約１０ｇ ＲＮＡ、約１０ｇ～約５００ｇ ＲＮＡ、約１０ｇ～約３００ｇ ＲＮＡ、約１０ｇ～約２００ｇ ＲＮＡ、または約３０ｇ～約６０ｇ ＲＮＡの範囲内のバッチサイズを産生することができる。

【0012】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術は、１時間当たり少なくとも１．５ｇ ＲＮＡ（例えば、１時間当たり少なくとも２ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも２．５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも３ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも３．５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも４ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも４．５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも５．５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも６ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも６．５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも７ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも７．５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも８ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも８．５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも９ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも１０ｇ ＲＮＡ以上を含む）の大規模スループットを産生する大規模な製造に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の大規模な製造方法は、１時間当たり１５ｇ ＲＮＡ～１時間当たり２０ｇ ＲＮＡ（例えば、１時間当たり約１７ｇ）の容量に達することができる。

【0013】

実際、いくつかの実施形態では、提供される技術は、様々な規模で、及び／または具体的には、非常に大きな製造規模（例えば、約数十または更には数百グラム／バッチを超える）で有用であること、及び／またはＲＮＡ配列から実質的に独立して（例えば、様々なＣ及び／またはＡ含有量を有するＲＮＡの産生のために）有用であること（例えば、そのような非常に大きな規模でさえ）という驚くべき利点を提供する。

【0014】

いくつかの態様では、本開示は、インビトロ転写を介してリボ核酸（ＲＮＡ）分子を産生する方法であって、反応混合物を反応条件下で作製して、ＲＮＡ分子を形成することを含み、反応混合物が、核酸ポリメラーゼ、核酸テンプレート、ならびに総グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）に対するモル比ａの総シチジン三リン酸（ＣＴＰ）及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）、及び／または総ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）に対するモル比ｂの総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）、及び／または総アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）に対するモル比ｃの総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）を含み、ＲＮＡ分子が、総グアノシン及び／または１つ以上の機能的グアノシン類似体（複数可）に対するモル比ｘの総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）、及び／または総ウリジン及び／または１つ以上の機能的ウリジン類似体（複数可）のモル比ｙの総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）、及び／または総アデノシン及び／または１つ以上の機能的アデノシン類似体（複数可）に対するモル比ｚの総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）を含み、ａが、少なくとも１．２５であり、及び／またはａが、ｘの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｂが、少なくとも１．２５であり、及び／またはｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｃが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍である、方法を提供する。

【0015】

いくつかの実施形態では、ａは、少なくとも１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、または１．８である。いくつかの実施形態では、ａは、少なくとも１．５である。いくつかの実施形態では、ａは、ｘの少なくとも約１．１５倍、１．２０倍、１．２５倍、１．３０倍、１．３５倍、１．４０倍、１．４５倍、１．５０倍、１．５５倍、１．６０倍、１．６５倍、１．７０倍、または１．７５倍である。いくつかの実施形態では、ａは、ｘの少なくとも約１．１５倍である。いくつかの実施形態では、ａは、ｘの少なくとも約１．２０倍である。

【0016】

いくつかの実施形態では、ｂは、少なくとも１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、または１．８である。いくつかの実施形態では、ｂは、少なくとも１．５である。いくつかの実施形態では、ｂは、ｙの少なくとも約１．１５倍、１．２０倍、１．２５倍、１．３０倍、１．３５倍、１．４０倍、１．４５倍、１．５０倍、１．５５倍、１．６０倍、１．６５倍、１．７０倍、または１．７５倍である。いくつかの実施形態では、ｂは、ｙの少なくとも約１．１５倍である。いくつかの実施形態では、ｂは、ｙの少なくとも約１．２０倍である。

【0017】

いくつかの実施形態では、ｃは、少なくとも１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、または１．５０である。いくつかの実施形態では、ｃは、少なくとも１．２５である。いくつかの実施形態では、ｃは、ｚの少なくとも約１．１５倍、１．２０倍、１．２５倍、１．３０倍、１．３５倍、１．４０倍、１．４５倍、１．５０倍、１．５５倍、１．６０倍、１．６５倍、１．７０倍、または１．７５倍である。いくつかの実施形態では、ｃは、ｚの少なくとも約１．１５倍である。いくつかの実施形態では、ｃは、ｚの少なくとも約１．２０倍である。

【0018】

いくつかの実施形態では、本開示は、反応混合物中に、総ＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）に対するモル比ｄの総ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）、及び／または総ＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）に対するモル比ｅの総ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）を組み合わせることを更に含み、ＲＮＡ分子が、総グアノシン及び／または１つ以上の機能的グアノシン類似体（複数可）に対するモル比ｖの総アデノシン及び／または１つ以上の機能的アデノシン類似体（複数可）、及び／または総ウリジン及び／または１つ以上の機能的ウリジン類似体（複数可）に対するモル比ｗの総アデノシン及び／または１つ以上の機能的アデノシン類似体（複数可）を更に含み、ｄが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍であり、及び／またはｅが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍である、方法を提供する。いくつかのそのような実施形態では、ｄは、少なくとも１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、または１．５０である。いくつかのそのような実施形態では、ｄは、少なくとも１．２０である。いくつかのそのような実施形態では、ｄは、ｖの少なくとも約１．１０倍、１．１５倍、１．２０倍、１．２５倍、１．３０倍、１．３５倍、１．４０倍、１．４５倍、または１．５０倍である。いくつかのそのような実施形態では、ｄは、ｖの少なくとも約１．１０倍である。いくつかのそのような実施形態では、ｄは、ｖの少なくとも約１．２０倍である。いくつかのそのような実施形態では、ｅは、少なくとも１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、または１．５０である。いくつかのそのような実施形態では、ｅは、少なくとも１．２０である。いくつかのそのような実施形態では、ｅは、ｗの少なくとも約１．１０倍、１．１５倍、１．２０倍、１．２５倍、１．３０倍、１．３５倍、１．４０倍、１．４５倍、または１．５０倍である。いくつかのそのような実施形態では、ｅは、ｗの少なくとも約１．１０倍である。いくつかのそのような実施形態では、ｅは、ｗの少なくとも約１．２０倍である。

【0019】

いくつかの実施形態では、総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）の一部分が、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加され、総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）の残りの部分が、転写の開始後に反応混合物に添加される。

【0020】

いくつかの実施形態では、総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）の全てが、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加される。

【0021】

いくつかの実施形態では、総ＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）の一部分が、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加され、総ＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）の残りの部分が、転写の開始後に反応混合物に添加される。

【0022】

いくつかの実施形態では、総ＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）の全てが、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加される。

【0023】

いくつかの実施形態では、総ＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）の一部分が、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加され、総ＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）の残りの部分が、転写の開始後に反応混合物に添加される。

【0024】

いくつかの実施形態では、総ＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）の全てが、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加される。

【0025】

いくつかの実施形態では、総ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）の一部分が、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加され、総ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）の残りの部分が、転写の開始後に反応混合物に添加される。

【0026】

いくつかの実施形態では、総ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）の全てが、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加される。

【0027】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、一本鎖である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、直鎖ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、及び／またはヌクレオシド修飾メッセンジャーＲＮＡである。

【0028】

いくつかの実施形態では、核酸テンプレートは、ＤＮＡテンプレートである。いくつかの実施形態では、テンプレートは、直鎖テンプレート（例えば、直鎖ＤＮＡテンプレート）である。いくつかの実施形態では、テンプレートは、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミド）である。いくつかの実施形態では、テンプレートは、（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応によって生成される）アンプリコンである。

【0029】

いくつかの実施形態では、反応混合物は、核酸テンプレートを０．０１～２μｇ／μＬの濃度で含む。

【0030】

いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎ４ビリオンＲＮＡポリメラーゼ、またはそれらのバリアントもしくは機能ドメインである。

【0031】

いくつかの実施形態では、反応混合物は、反応緩衝液、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、１つ以上の塩、還元剤、及びスペルミジンのうちの１つ以上を含む（例えば、更に含む）。いくつかの実施形態では、反応緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、またはＰＢＳを含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、反応緩衝液を２０～６０ｍＭまたは１００～１５０ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、反応緩衝液は、７～９のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、反応混合物は、ＲＮａｓｅ阻害剤を０．０１～０．１Ｕ／μＬの濃度で含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅ阻害剤の１つの単位（Ｕ）は、５ｎｇのＲＮａｓｅ Ａの活性を少なくとも５０％阻害する。いくつかの実施形態では、ピロホスファターゼは、無機ピロホスファターゼである。いくつかの実施形態では、反応混合物は、ピロホスファターゼを０．０１～０．２ｍＵ／μＬの濃度で含む。いくつかの実施形態では、反応混合物に含まれる１つ以上の塩は、１つ以上のマグネシウム塩及び／または１つ以上のカルシウム塩を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のマグネシウム塩は、酢酸マグネシウムまたは塩化マグネシウムを含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、１つ以上の塩を２０～６０ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、１つ以上の塩を１００～１５０ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、還元剤は、ジチオスレイトールまたは２－メルカプトエタノールを含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、還元剤を５～１５ｍＭの濃度で含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、スペリミジンを０．５～３ｍＭの濃度で含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、インビトロ転写は、少なくとも２０～１８０分間実施される。いくつかの実施形態では、インビトロ転写は、２５～５５℃の温度で実施される。

【0033】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＲＮＡ分子のインビトロ転写後に核酸テンプレートを消化することを更に含む。いくつかのそのような実施形態では、核酸テンプレートは、ＤＮａｓｅによって消化される。いくつかのそのような実施形態では、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅ Ｉを含む。

【0034】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、インビトロ転写後にＩＶＴ反応混合物のポリペプチド（例えば、核酸ポリメラーゼ、ピロホスファターゼ、ＤＮＡｓｅ ＩなどのＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ阻害剤）を消化して、ＲＮＡ分子を産生することを含む（例えば、更に含む）。いくつかのそのような実施形態では、核酸ポリメラーゼは、プロテイナーゼによって消化される。いくつかのそのような実施形態では、プロテイナーゼは、プロテイナーゼＫであるか、またはそれを含む。

【0035】

いくつかの実施形態では、本開示によって提供される技術は、インビトロ転写反応及び／またはそれによって産生されるＲＮＡの１つ以上の評価（例えば、１つ以上の品質管理パラメータの評価）を実施することを含む（例えば、更に含む）。いくつかのそのような実施形態では、１つ以上の品質管理パラメータは、転写中及び／または転写後のＲＮＡ分子のＲＮＡ完全性、ＲＮＡ濃度、残留二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、及び／またはキャッピングからなる群から選択される。いくつかのそのような実施形態では、ＲＮＡ完全性は、アガロースゲル電気泳動を使用して評価される。いくつかのそのような実施形態では、ＲＮＡ完全性は、キャピラリーゲル電気泳動を使用して評価される。いくつかのそのような実施形態では、本方法によって産生されるＲＮＡ分子のＲＮＡ完全性は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％である。

【0036】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）のＲＮＡ完全性は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、及び／またはｃが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ完全性は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも約１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｅが、少なくとも１．１０であり、及び／またはａが、少なくとも１．２５であり、ｂが、少なくとも１．２５であり、及び／またはｃが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ完全性は、適切な比較対照（例えば、他の方法では同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ完全性は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍であり、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍であり、及び／またはａが、ｘの少なくとも約１．１０倍であり、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかのそのような実施形態では、ＲＮＡ完全性は、少なくとも約５％増加する。いくつかのそのような実施形態では、ＲＮＡ完全性は、少なくとも約８％増加する。

【0037】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ濃度は、ＵＶ吸収分光光度法を使用して評価される。本開示のいくつかの実施形態では、本明細書で提供される技術に従って産生される関連する試料または調製物（例えば、ＩＶＴ溶液）中のＲＮＡ分子（複数可）の濃度は、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、または１５ｍｇ／ｍＬである。いくつかのそのような実施形態では、（例えば、ＩＶＴ溶液中などの関連する試料または調製物中の）ＲＮＡ分子（複数可）の濃度は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、及び／またはｃが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％増加する。いくつかのそのような実施形態では、ＲＮＡ分子（複数可）の濃度は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｅが、少なくとも１．１０であり、及び／またはａが、少なくとも１．２５であり、ｂが、少なくとも１．２５であり、及び／またはｃが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかのそのような実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）の濃度は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％増加する。いくつかのそのような実施形態では、ＲＮＡ分子（複数可）の濃度は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかのそのような実施形態では、ＲＮＡ分子（複数可）の濃度は、少なくとも約２０％増加する。

【0038】

いくつかの実施形態では、残留ｄｓＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、吸光度、蛍光染料、及び／またはゲル電気泳動を使用して評価される。いくつかの実施形態では、残留ｄｓＲＮＡ（例えば、ＩＶＴ溶液中の）は、定量的ＰＣＲを使用して評価される。いくつかのそのような実施形態では、ＲＮＡ分子の転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡは、少なくとも約２５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、５０ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、７５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１２５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１５０ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１７５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２２５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２５０ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２７５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、または３００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡである。いくつかのそのような実施形態では、転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡは、適切な比較対照（例えば、他の方法では同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、及び／またはｃが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して（例えば、適切な比較対照と比較して）、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％減少する。いくつかの実施形態では、転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡは、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも約１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｅが、少なくとも１．１０であり、及び／またはａが、少なくとも１．２５であり、ｂが、少なくとも１．２５であり、及び／またはｃが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかの実施形態では、転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡは、適切な比較対照（例えば、他の方法では同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％減少する。いくつかのそのような実施形態では、転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡは、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍であり、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍であり、及び／またはａが、ｘの少なくとも約１．１０倍であり、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかのそのような実施形態では、残留ｄｓＲＮＡ濃度は、少なくとも約７０％減少する。

【0039】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子（複数可）のキャッピングは、（ａ）機能的にキャッピングされたＲＮＡの翻訳を評価すること、（ｂ）生体活性試験を実施して、ＲＮＡ分子が、正しいサイズのポリペプチド（例えば、タンパク質）に翻訳されていることを確認すること、（ｃ）ヌクレアーゼベースのアッセイを行うこと、及び／または（ｄ）触媒核酸ベースのアッセイを行うことによって評価される。いくつかのそのような実施形態では、ヌクレアーゼベースのアッセイは、ＲＮａｓｅベースのアッセイを含み、例えば、ＲＮａｓｅベースのアッセイは、（ａ）多数のＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子に結合する１つ以上のプローブにアニーリングして、ＲＮＡプローブ複合体を形成すること、（ｂ）ＲＮＡプローブ複合体をＲＮａｓｅで消化して、ＲＮＡ分子の５’末端を含む断片を生成すること、（ｃ）親和性ベースの精製、クロマトグラフィーベースの精製、もしくはそれらの組み合わせを使用して、断片を精製すること、（ｄ）精製された断片を質量分析（ＭＳ）に供すること、（ｅ）観察されたＭＳ値に基づいて、キャッピングされた及びキャッピングされていない断片を特定すること、及び／または（ｆ）キャッピングされた及びキャッピングされていない断片の量を比較して、キャッピングされたＲＮＡの割合を計算することのうちの１つ以上を含む。いくつかのそのような実施形態では、ＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ Ｈを含む。いくつかのそのような実施形態では、ヌクレアーゼベースのアッセイは、（ａ）多数のＲＮＡ分子を、５’ＲＮＡキャップもしくはＲＮＡのキャッピングされていない最後から２番目の塩基に隣接するＲＮＡ分子の５’非翻訳領域内の配列に相補的な１つ以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドと接触させること、（ｂ）１つ以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＲＮＡ分子の５’非翻訳領域内の配列にアニーリングして、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド複合体を形成すること、（ｃ）ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド複合体及び／またはアニーリングされていないＲＮＡ分子を１つ以上のヌクレアーゼで分解して、キャッピングされた及びキャッピングされていない５’末端ＲＮＡ断片及び３’ＲＮＡ断片を産生すること、（ｄ）親和性ベースの精製、クロマトグラフィーベースの精製、またはそれらの組み合わせを使用して、キャッピングされた及びキャッピングされていない５’末端ＲＮＡ断片を３’ＲＮＡ断片から分離すること、及び／または（ｅ）キャッピングされた及びキャッピングされていない５’末端ＲＮＡ断片の量を比較して、キャッピングされたＲＮＡの割合を計算することのうちの１つ以上を含む。いくつかのそのような実施形態では、触媒核酸ベースのアッセイは、（ａ）多数のＲＮＡ分子を触媒核酸分子で５’末端ＲＮＡ断片及び少なくとも１つの３’ＲＮＡ断片に切断することであって、ＲＮＡ分子が、触媒核酸分子の切断部位を有する、切断すること、（ｂ）親和性ベースの精製、クロマトグラフィーベースの精製、またはそれらの組み合わせを使用して、５’末端ＲＮＡ断片及び３’ＲＮＡ断片を分離すること、（ｃ）分光学、定量的質量分析、配列決定、もしくはそれらの組み合わせを使用して、キャッピングされた及びキャッピングされていない５’末端ＲＮＡ断片の量を測定すること、及び／または（ｄ）キャッピングされた及びキャッピングされていない５’末端ＲＮＡ断片の量を比較して、キャッピングされたＲＮＡの割合を計算することのうちの１つ以上を含む。いくつかのそのような実施形態では、触媒核酸分子は、ＤＮＡザイムまたはリボザイムを含む。いくつかのそのような実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）の少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％は、キャッピングされる。いくつかのそのような実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）のキャッピングは、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、及び／またはｃが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％増加する。

【0040】

いくつかの実施形態では、転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡは、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも約１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｅが、少なくとも１．１０であり、及び／またはａが、少なくとも１．２５であり、ｂが、少なくとも１．２５であり、及び／またはｃが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。

【0041】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）のキャッピングは、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％増加する。

【0042】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）の転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡは、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはａが、ｘの少なくとも約１．１０倍であり、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。

【0043】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）のキャッピングは、少なくとも約５％増加する。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1】例示的なＩＶＴ反応混合物の成分及び条件を提供する。

【図2】２つの異なる構築物で実施された例示的な大規模ＩＶＴ反応（３６．７Ｌ）の後の残留ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を示す。構築物１は、ＢＮＴ１６２ｂ１であり、構築物２は、ＢＮＴ１６２ｂ２である。

【図3】＋０％ＣＴＰ体積を含む対照（例えば、標準）ＩＶＴ反応混合物と比較して、－１０％、＋１０％、＋２０％、または＋５０％ＣＴＰ体積のいずれかを含むＩＶＴ反応混合物を利用した例示的なＩＶＴ反応から産生されるＲＮＡのＲＮＡ完全性及びキャッピングパーセントを示す。これらの反応は、ＣＴＰ体積の増加が、＋２０％のＣＴＰ体積及び＋５０％のＣＴＰ体積でのＲＮＡ完全性及びキャッピングの増加をもたらしたが、対照ＩＶＴ反応混合物を使用して生成されたＲＮＡと比較して、＋／－１０％のＣＴＰ開始濃度で比較的安定していたことを示した。

【図4】＋０％ＣＴＰ体積を含む対照（例えば、標準）ＩＶＴ反応混合物と比較して、－１０％、＋１０％、＋２０％、または＋５０％ＣＴＰ体積のいずれかを含むＩＶＴ反応混合物を利用した例示的なＩＶＴ反応から産生されるＲＮＡのポリＡ完全性及びＲＮＡ完全性を示す。ＣＴＰの増加は、対照と比較して、産生されたＲＮＡのポリ（Ａ）及びＲＮＡの完全性の増加をもたらした。

【図5】＋０％ＣＴＰ体積を含む対照（例えば、標準）ＩＶＴ反応混合物と比較して、－１０％、＋１０％、＋２０％、または＋５０％のＣＴＰ体積のいずれかを含むＩＶＴ反応混合物を利用した例示的なＩＶＴ反応からの残留ＮＴＰ及びキャップレベル、ならびに収率を示す。収率の増加は、ＣＴＰ濃度の増加とともに観察された。対照を上回るＣＴＰ体積の増加は、定量限界を上回るＣＴＰ濃度の維持をもたらした。より高いＣＴＰ濃度は、ＡＴＰ濃度を定量限界未満にした。

【図6】＋０％ＣＴＰ体積を含む対照（例えば、標準）ＩＶＴ反応混合物と比較して、－１０％、＋１０％、＋２０％、または＋５０％のＣＴＰ体積のいずれかを含むＩＶＴ反応混合物を利用した例示的なＩＶＴ反応からのＲＮＡ完全性及びキャッピングパーセント、ならびに収率及び残留ＣＴＰレベルを実証する追加の例示的な研究を示す。薄いピンク色のマーカーは、この研究でアッセイされた以前の実験からの対照を示す。

【図7】図１に要約される条件を利用した例示的なＩＶＴ反応からの収率（上）、ＲＮＡ完全性（中央）、及び残留二本鎖ＲＮＡ（下）を示す。例示的なＩＶＴ反応は、対照（＋０％ＣＴＰ）と比較して、＋１０％、＋２０％、または＋５０％ＣＴＰのいずれかを含む反応混合物を比較した。ＧＴＰ／ｍ１ΨＴＰの開始濃度を開始濃度の０．５ｍＭ（１／１８＊９ｍＭ）に低下させ、最終濃度に達するまで１１回の添加で転写反応の過程にわたって供給した。

【図8】＋０％ＣＴＰ体積を含む対照（例えば、標準）ＩＶＴ反応混合物と比較して、＋４０％、＋５０％、または＋６０％ＣＴＰ体積のいずれかを含むＩＶＴ反応混合物を利用した例示的なＩＶＴ反応から産生されるＲＮＡのＲＮＡ完全性及びキャッピングパーセントを示す。

【図9】＋０％ＣＴＰ体積を含む対照（例えば、標準）ＩＶＴ反応混合物と比較して、＋４０％、＋５０％、または＋６０％ＣＴＰ体積のいずれかを含むＩＶＴ反応混合物を利用した例示的なＩＶＴ反応から産生されるＲＮＡのポリＡ完全性及びＲＮＡ完全性を示す。

【図10】＋０％ＣＴＰ体積を含む対照（例えば、標準）ＩＶＴ反応混合物と比較して、＋４０％、＋５０％、または＋６０％ＣＴＰ体積のいずれかを含むＩＶＴ反応混合物を利用した例示的なＩＶＴ反応からの残留ＮＴＰ及びキャッピングレベルならびに収率を示す。

【図11】＋０％ＣＴＰ体積を含む対照（例えば、標準）ＩＶＴ反応混合物と比較して、＋４０％、＋５０％、または＋６０％ＣＴＰ体積のいずれかを含むＩＶＴ反応混合物を利用した例示的なＩＶＴ反応からのＲＮＡ完全性及びキャッピングパーセント、ならびに収率及び残留ＣＴＰレベルを実証する追加の例示的な研究を示す。ＣＴＰを＋４０％、＋５０％、及び＋６０％ＣＴＰ体積に増加させると、ＡＴＰが定量限界を下回って枯渇し、収率が１０ｍｇ／ｍＬに増加し、完全性（ＦＡ）が７３．４％から８３．４％に増加した。

【図12】＋５０％ＣＴＰ体積及び＋０％ＡＴＰ体積を含む対照ＩＶＴ反応混合と比較して、＋５０％ＣＴＰ体積及び＋１０％ＡＴＰ体積または＋５０％ＣＴＰ体積及び＋２０％ＡＴＰ体積のいずれかを含むＩＶＴ反応混合物を利用する、例示的なＩＶＴ反応から産生されるＲＮＡのＲＮＡ完全性及びキャッピングパーセントを示す。

【図13】＋５０％ＣＴＰ体積及び＋０％ＡＴＰ体積を含む対照ＩＶＴ反応混合と比較して、＋５０％ＣＴＰ体積及び＋１０％ＡＴＰ体積または＋５０％ＣＴＰ体積及び＋２０％ＡＴＰ体積のいずれかを含むＩＶＴ反応混合物を利用する、例示的なＩＶＴ反応から産生されるＲＮＡのポリＡ完全性及びＲＮＡ完全性を示す。

【図14】＋５０％ＣＴＰ体積及び＋０％ＡＴＰ体積を含む対照ＩＶＴ反応混合と比較して、＋５０％ＣＴＰ体積及び＋１０％ＡＴＰ体積または＋５０％ＣＴＰ体積及び＋２０％ＡＴＰ体積のいずれかを含むＩＶＴ反応混合物を利用する、例示的なＩＶＴ反応からのＲＮＡ完全性及びキャッピングパーセント、ならびに収率及び残留ＮＴＰレベルを実証する追加の例示的な研究を示す。

【図15】＋５０％ＣＴＰ体積及び＋０％ＡＴＰ体積を含む対照ＩＶＴ反応混合と比較して、＋５０％ＣＴＰ体積及び＋１０％ＡＴＰ体積または＋５０％ＣＴＰ体積及び＋２０％ＡＴＰ体積のいずれかを含むＩＶＴ反応混合物を利用する、例示的なＩＶＴ反応からのＲＮＡ完全性及びキャッピングパーセント、ならびに収率及び残留ＣＴＰレベルを実証する追加の例示的な研究を示す。ＣＴＰが＋５０％であったとき、ＡＴＰを＋１０％に増加させると、収率及び完全性が増加したが、ＡＴＰは依然として枯渇しているか、またはほぼ枯渇していた。ＣＴＰが＋５０％であったとき、ＡＴＰを＋２０％に増加させると、収率が更に増加したが、完全性の有意な改善は観察されず、ＧＴＰは枯渇した。

【図16】様々なレベルのＣＴＰ（＋０％ＣＴＰに対して＋１０％ＣＴＰ、＋２０％ＣＴＰ、＋５０％ＣＴＰ）ならびに収率、ＲＮＡ完全性、ｄｓＲＮＡ含有量、及び残留ＤＮＡ含有量の特性評価を有するＩＶＴ反応混合物の追加の例示的な評価を示す。

【図17】収率（上）、ＲＮＡ完全性（中央）、及びｄｓＲＮＡ（下）の更なる例示的な研究を示す。例示的なＩＶＴ反応は、対照反応混合物（＋０％ＣＴＰ体積、＋０％ＡＴＰ体積）と比較して、＋５０％ＣＴＰ体積、＋５０％ＡＴＰ体積、または＋５０％ＣＴＰ体積及び＋５０％ＡＴＰ体積のいずれかを含むＩＶＴ反応混合物を利用した。

【図18】様々なレベルのＮＴＰ（対照と比較して＋５０％ＣＴＰ及び＋２０％ＡＴＰ、＋５０％ＣＴＰ、＋２０％ＡＴＰ）を有するＩＶＴ反応混合物の追加の例示的な評価を示す。収率、完全性、ｄｓＲＮＡ含有量、及び残留ＤＮＡ含有量を特性評価した。

【図19】＋５０％ＣＴＰ及び＋２０％ＡＴＰ（プロセス２ｂ）または標準／対照（例えば、１：１：１：１、例えば、各々９ｍＭ）反応混合物（プロセス２ａ）のいずれかを含む反応混合物を利用する、例示的なＩＶＴ反応の収率、残留ＮＴＰ、及び完全性の例示的な評価を示す。

【図20】１０．８ｍＭ ＡＴＰ、１３．５ｍＭ ＣＴＰ、９ｍＭ ＧＴＰ、及び９ｍＭ ＵＴＰを含む反応混合物と比較して、＋２５％ ＡＴＰ及び＋７％ ＣＴＰ、－２１％ ＡＴＰ及び－３７％ ＣＴＰ、＋２５％ ＡＴＰ、または＋７％ ＣＴＰのいずれかを含む反応混合物を利用する、例示的なＩＶＴ反応の収率、完全性、及び残留ｄｓＲＮＡ含有量の例示的な評価を示す。

【0045】

定義
約：「約」という用語は、値に関して本明細書で使用される場合、言及される値に関連して、同様である値を指す。一般に、文脈に精通している当業者は、その文脈において「約」に包含される妥当な差異の度合いを理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、「約」という用語は、参照される値の２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満内のある範囲の値を包含し得る。

【0046】

投与：本明細書で使用される場合、「投与」という用語は、典型的には、対象または系への組成物の投与を指す。当業者は、適切な状況下で、対象、例えばヒトへの投与に利用できる様々な経路を認識されよう。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、眼、経口、非経口、局所などであり得る。いくつかの特定の実施形態では、投与は、気管支（例えば、気管支滴下による）、頬側、真皮（例えば、真皮、皮内、皮間、経皮などの局所的なもののうちの１つ以上であり得るか、またはそれらを含み得る）、経腸、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、髄腔内、静脈内、心室内、特定の臓器内（例えば、肝内）、粘膜、鼻腔、経口、直腸、皮下、舌下、局所的、気管（例えば、気管内滴下による）、膣、硝子体などであり得る。いくつかの実施形態では、投与は、断続的（例えば、時間的に分離された複数の用量）及び／または定期的（例えば、共通の期間で分離された個々の用量）投与である投薬を伴い得る。いくつかの実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間の連続投薬（例えば、灌流）を伴い得る。

【0047】

作用因子：概して、本明細書で使用される「作用因子」という用語は、実体（例えば、脂質、金属、核酸、ポリペプチド、多糖、小分子など、またはそれらの複合体、組み合わせ、混合物もしくは系［例えば、細胞、組織、生物］）、または現象（例えば、熱、電流または電界、磁力または磁界など）を意味するように使用される。適切な状況下では、当業者には文脈から明らかになるように、この用語は、細胞もしくは生物、またはその画分、抽出物、もしくは成分である、またはそれを含む実体を意味するように用いられ得る。代替的にまたは追加的に、文脈から明らかになるように、この用語は、自然界で見出される、及び／または自然界から採取される、天然の産物を意味するように用いられ得る。場合によっては、再度、文脈から明らかになるように、この用語は、人工的に設計され、操作され、及び／または作製された人工の、及び／または自然界に見出されない１つ以上の実体を意味するように用いられ得る。いくつかの実施形態では、作用因子は、単離形態または純粋形態で利用されてよく、いくつかの実施形態では、作用因子は、粗製形態で利用され得る。いくつかの実施形態では、潜在的な作用因子は、例えば、それらの中で活性作用因子を特定または特性評価するためにスクリーニングされることがあるコレクションまたはライブラリとして提供されてよい。場合によっては、「作用因子」という用語は、高分子であるか、または高分子を含む化合物または実体を指し得、場合によっては、この用語は、１つ以上の高分子部分を含む化合物または実体を指し得る。いくつかの実施形態では、「作用因子」という用語は、高分子ではない、及び／または任意の高分子及び／または１つ以上の特定の高分子部分を実質的に含まない化合物または実体を指し得る。いくつかの実施形態では、この用語は、いかなる高分子部分も欠いているか、または実質的に含まない、化合物または実体を指し得る。

【0048】

対立遺伝子：本明細書で使用される場合、「対立遺伝子」という用語は、特定の多型ゲノム遺伝子座の２つ以上の既存の遺伝子バリアントのうちの１つを指す。

【0049】

アミノ酸：本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、最も広義には、ポリペプチド鎖であり得るか、ポリペプチド鎖であるか、または、例えば、１つ以上のペプチド結合の形成を通してポリペプチド鎖に組み込まれた化合物及び／または物質を意味する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、非天然アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｄ－アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドに一般的に見出される２０種類の標準的なＬ－アミノ酸のうちのいずれかを指す。「非標準アミノ酸」は、それが合成的に調製されるか天然源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、ポリペプチドにおけるカルボキシ末端及び／またはアミノ末端のアミノ酸を含め、上記の一般構造と比較して構造修飾を含んでもよい。例えば、いくつかの実施形態では、アミノ酸は、一般構造と比較して、（例えば、アミノ基、カルボン酸基、１つ以上のプロトン、及び／またはヒドロキシル基の）メチル化、アミド化、アセチル化、ペグ化、グリコシル化、リン酸化、及び／または置換によって修飾されていてもよい。いくつかの実施形態では、このような修飾は、例えば、修飾されたアミノ酸を含むポリペプチドの循環半減期を、修飾されていないことを除いては同一のアミノ酸を含むものと比較して変化させ得る。いくつかの実施形態では、このような修飾は、修飾されたアミノ酸を含むポリペプチドの関連する活性を、修飾されていないことを除いては同一のアミノ酸を含むものと比較して著しく変化させない。文脈から明らかになるように、いくつかの実施形態では、「アミノ酸」という用語は、遊離アミノ酸を指すように使用される場合があり、いくつかの実施形態では、この用語は、ポリペプチドのアミノ酸残基を指すように使用される場合がある。

【0050】

類似体：本明細書で使用される場合、「類似体」という用語は、１つ以上の特定の構造特徴、要素、成分、または部分を参照物質と共有する物質を指す。典型的には、「類似体」は、例えば、コアまたはコンセンサス構造を共有するなど、参照物質と著しい構造的類似性を示すが、ある特定の別個の方法でも異なる。いくつかの実施形態では、類似体は、参照物質から、例えば、参照物質の化学操作によって生成され得る物質である。いくつかの実施形態では、類似体は、参照物質を生成する合成プロセスと実質的に同様の（例えば、複数のステップを共有する）合成プロセスの実行を通じて生成され得る物質である。いくつかの実施形態では、類似体は、参照物質を生成するために使用される合成プロセスとは異なる合成プロセスの実行によって生成されるか、または生成され得る。

【0051】

動物：本明細書で使用される場合、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、いずれかの性別の、発達の任意の段階にあるヒトを指す。いくつかの実施形態では、「動物」は、発達の任意の段階にある非ヒト動物を指す。特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長目、及び／またはブタ）である。いくつかの実施形態では、動物としては、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、及び／または寄生虫が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は、遺伝子導入動物、遺伝子組換え動物、及び／またはクローンであり得る。

【0052】

抗原：本明細書で使用される「抗原」という用語は、免疫応答を誘発する作用因子、及び／またはＴ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子によって提示された場合）もしくは抗体に結合する作用因子を指す。いくつかの実施形態では、抗原は、液性応答（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発するし、いくつかの実施形態では、抗原は、細胞性応答（例えば、受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞の関与）を誘発する。いくつかの実施形態では、抗原は、抗体に結合し、生物における特定の生理学的応答を誘導する場合もしない場合もある。一般に、抗原は、例えば小分子、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、高分子（いくつかの実施形態では、生体高分子以外［例えば、核酸またはアミノ酸高分子以外］）などのような任意の化学的実体であるか、またはそれを含んでもよい。いくつかの実施形態では、抗原は、ポリペプチドであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、グリカンであるか、またはグリカンを含む。当業者は、一般に、抗原が、単離されたまたは純粋な形態で提供され得るか、代替的に粗製形態で（例えば、他の材料、例えば細胞抽出物または抗原含有供給源の他の比較的粗雑な調製物と一緒に）提供され得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、本発明に従って利用される抗原は、粗製形態で提供される。いくつかの実施形態では、抗原は、組換え抗原である。

【0053】

結合：本明細書で使用される「結合」という用語は、典型的には、２以上の実体間の非共有結合を指すものと理解される。「直接」結合は、実体または部分間の物理的接触を伴い、間接結合は、１つ以上の中間体実体による物理的接触による物理的相互作用を伴う。２以上の実体同士の間の結合は、典型的には、相互作用する実体または部分が単独で、またはより複雑な系との関連で（例えば、担体実体及び／または生物学的系もしくは細胞と共有結合的もしくは別様に結合した状態で）研究される場合を含め、種々の状況のうちのいずれかにおいて評価され得る。評価される条件下で、関連する実体同士が、他の有効な結合パートナーよりも、互いに結合する可能性が高い場合、２つの実体間の結合は、「特異的」であるとみなされ得る。

【0054】

特徴的な配列要素：本明細書で使用される場合、「特徴的な配列要素」という語句は、高分子（例えば、ポリペプチドまたは核酸）に見出される、その高分子の特徴的部分を表す配列要素を指す。いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素の存在は、高分子の特定の活性または性質の存在またはレベルと相関する。いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素の存在（または非存在）は、特定の高分子を、そのような高分子の特定のファミリーまたは群のメンバー（またはメンバーではない）として定義する。特徴的な配列要素は、典型的には、少なくとも２つの単量体（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の単量体（例えば、連続的に連結された単量体）を含む。いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素は、配列要素を共有する高分子間で長さが変化してもしなくてもよい１つ以上のスペーサ領域によって離隔された連続的単量体の少なくとも第１及び第２の区間を含む。

【0055】

比較可能な：本明細書で使用される場合、「比較可能な」という用語は、互いに同一ではない場合があるが、それらの間の比較が許容されるほどに十分に同様であるので、当業者は、観察される相違または類似性に基づいて結論を合理的に引き出すことができることを理解するであろう、２つ以上の作用因子、実体、状況、一連の条件などを指す。いくつかの実施形態では、条件、状況、個体、または集団の比較可能なセットは、複数の実質的に同一の特徴及び１つまたは少数の様々な特徴によって特徴付けられる。当業者は、文脈に応じて、任意の所与の状況において、２つ以上のかかる作用因子、実体、状況、条件のセットなどが比較可能とみなされるために、どの程度の同一性が必要とされるかを理解するであろう。例えば、当業者は、一連の状況、個体、または集団は、異なる一連の状況、個体、または集団の下で、またはそれらを用いて得られた結果または観察された現象の違いが、変動するそれらの特徴の変動によって引き起こされるか、または特徴の変動を示す合理的な結論を保証するのに十分な数及び種類の実質的に同一の特徴によって特徴付けられる場合、互いに比較可能であることを理解するであろう。

【0056】

組成物：当業者は、本明細書で使用される場合、「組成物」という用語が、１つ以上の定められた成分を含む別個の物理的実体を指すために使用され得ることを理解するであろう。一般に、別段の定めがない限り、組成物は、任意の形態、例えば、気体、ゲル、液体、固体などのものであり得る。

【0057】

含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）：１つ以上の列挙される要素またはステップを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」として本明細書に記載される組成物または方法は、オープンエンドであり、列挙される要素またはステップが必須であることを意味するが、他の要素またはステップが、組成物または方法の範囲内に追加され得る。冗長さを避けるために、名前を挙げた要素またはステップを１つ以上「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇまたはｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」と記載される任意の組成物または方法は、名前を挙げた同じ要素またはステップ「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆまたはｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という、対応する、より限定された組成物または方法も表し、これは、組成物または方法が、名前を挙げた必須の要素またはステップを含み、組成物または方法の基本的特性及び新規特性（複数可）に実質的に影響を与えない追加の要素またはステップを含んでもよいことを意味することも理解されたい。また、名前を挙げた要素またはステップを１つ以上「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」またはそれら「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」として本明細書に記載される任意の組成物または方法は、名前を挙げていない他のあらゆる要素またはステップを除外する、名前を挙げた要素またはステップ「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆまたはｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）という、対応する、より限定された、クローズエンドの組成物または方法も表すことを理解されたい。本明細書で開示されるあらゆる組成物または方法において、名前を挙げた必須の要素またはステップのいずれかの公知のまたは開示された均等物が、その要素またはステップの代わりに使用されてもよい。

【0058】

設計された：本明細書で使用される場合、「設計された」という用語は、（ｉ）その構造が人の手によって選択されるか、または選択された作用因子、（ｉｉ）人の手を必要とするプロセスによって産生される作用因子、及び／または（ｉｉｉ）天然物質及び他の既知の作用因子とは別個の作用因子を指す。

【0059】

ドメイン：本明細書で使用される「ドメイン」という用語は、実体のセクションまたは一部分を意味する。いくつかの実施形態では、「ドメイン」は、ドメインがその親実体の残部から物理的に分離したとき、特定の構造的特徴及び／または機能的特徴を実質的または完全に保持するように、実体の特定の構造的特徴及び／または機能的特徴に関連している。代替的に、または追加的に、ドメインは、その（親）実体から分離し、異なる（レシピエント）実体と結合したとき、親実体を特徴付ける１つ以上の構造的特徴及び／または機能的特徴を実質的に保持する、及び／またはそれをレシピエント実体に付与する実体の一部分であるか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、ドメインは、分子（例えば、小分子、炭水化物、脂質、核酸、またはポリペプチド）のセクションまたは一部分である。いくつかの実施形態では、ドメインは、ポリペプチドのセクションであり、いくつかのそのような実施形態では、ドメインは、特定の構造要素（例えば、特定のアミノ酸配列または配列モチーフ、αヘリックス特徴、βシート特徴、コイル状コイル特徴、ランダムコイル特徴など）、及び／または特定の機能的特徴（例えば、結合活性、酵素活性、折り畳み活性、シグナル伝達活性など）によって特徴付けられる。

【0060】

操作された：一般に、「操作された」という用語は、人の手によって操作された態様を指す。例えば、ポリヌクレオチドは、自然界でその順序で一緒に連結されていない２つ以上の配列が、操作されたポリヌクレオチド内で互いに直接連結されるように人の手によって操作される場合、及び／またはポリヌクレオチド内の特定の残基が非天然に存在している場合、及び／または人工的に、それが自然界で連結されていない実体または部分と連結されるように引き起こされる場合、「操作された」とみなされる。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、操作されたポリヌクレオチドは、第１のコード配列と作動可能に会合して自然に見出されるが、第２のコード配列とは作動可能に会合していない調節配列を含み、第２のコード配列と作動可能に会合するように、人の手によって連結される。比較的、細胞または生物は、その遺伝子、エピジェネティック、及び／または表現型の同一性が、そのように操作されていない他の同一の細胞などの適切な参照細胞と比較して変更されるように、操作された場合、「操作された」とみなされる。いくつかの実施形態では、操作は、その遺伝情報が変更されるように、遺伝的操作であるか、または遺伝的操作を含む（例えば、以前に存在しなかった新しい遺伝物質が、例えば、形質転換、交配、体細胞ハイブリダイゼーション、トランスフェクション、形質導入、もしくは他の機構によって導入されたか、または以前に存在した遺伝物質が、例えば、置換もしくは欠失変異、または交配プロトコルによって変更もしくは除去される）。いくつかの実施形態では、操作された細胞は、目的の特定の作用因子（例えば、ポリペプチド（例えば、タンパク質）、核酸、及び／またはその特定の形態）を、そのような適切な参照細胞に対して改変された量で、及び／または改変されたタイミングに従って含有する、及び／または発現するように操作されたものである。一般的な慣行であり、当業者に理解されるように、操作されたポリヌクレオチドまたは細胞の子孫は、実際の操作が以前の実体に対して実施されたにもかかわらず、典型的には依然として「操作された」と称される。

【0061】

エピトープ：本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン（例えば、抗体または受容体）の結合成分によって特異的に認識される部分を指す。いくつかの実施形態では、エピトープは、抗原上の複数の化学原子または基から構成される。いくつかの実施形態では、このような化学原子または基は、抗原が関連する三次元コンフォメーションの形をとる場合に、表面露出する。いくつかの実施形態では、このような化学原子または基は、抗原がそのようなコンフォメーションの形をとる場合に空間的に互いに、物理的に近くにある。いくつかの実施形態では、少なくともいくつかのそのような化学原子または基は、抗原が代替のコンフォメーションをとる（例えば、直鎖化される）とき、互いから物理的に分離される。

【0062】

発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」という用語は、核酸配列からの任意の遺伝子産物の生成を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は転写物であり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子産物はポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、核酸配列の発現は、（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの産生（例えば、転写による）、（２）ＲＮＡ転写物の処理（例えば、スプライシング、編集などによる）、（３）ポリペプチド（例えば、タンパク質）へのＲＮＡの翻訳、及び／または（４）ポリペプチド（例えば、タンパク質）の翻訳後修飾のうちの１つ以上を伴う。

【0063】

断片：本明細書に記載するような物質または実体の「断片」は、全体のうちの別個の部分を含むが、全体に見出される１つ以上の部分を欠いている構造を有する。いくつかの実施形態では、断片は、そのような別個の部分からなる。いくつかの実施形態では、断片は、全体に見出される特徴的な構造要素または部分からなるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、高分子の断片は、高分子全体に見出される、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００以上の単量体単位（例えば、残基）を含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、高分子の断片は、高分子全体に見出される単量体単位（例えば、残基）の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、２５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上を含むか、またはそれらからなる。物質または実体の全体は、いくつかの実施形態では、断片の「親」と称される場合がある。

【0064】

遺伝子：本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、産物（例えば、ＲＮＡ産物及び／またはポリペプチド産物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子は、コード配列（すなわち、特定の産物をコードする配列）を含み、いくつかの実施形態では、遺伝子は、非コード配列を含む。いくつかの特定の実施形態では、遺伝子は、コード（例えば、エキソン）配列と非コード（例えば、イントロン）配列との両方を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子は、例えば、１つ以上の態様の遺伝子発現（例えば、細胞型特異的発現、誘導性発現など）を制御し得るか、またはそれに影響を与え得る、１つ以上の制御性要素を含み得る。

【0065】

宿主：「宿主」という用語は、本明細書では、目的のポリペプチドが存在する系（例えば、細胞、生物など）を指すように使用される。いくつかの実施形態では、宿主は、特定の感染作用因子による感染に感受性がある系である。いくつかの実施形態では、宿主は、特定の目的のポリペプチドを発現する系である。

【0066】

宿主細胞：本明細書で使用される場合、外因性核酸（組換えかまたはそうでないもの）が導入された細胞を指す。当業者は、本開示を読めば、そのような用語が特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も意味することを理解するであろう。ある特定の修飾は、変異または環境の影響のいずれかにより後の世代で生じ得るため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一ではないが、依然として本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、外因性ＤＮＡ（例えば、組換え核酸配列）を発現するのに好適な生命界のいずれかから選択される原核細胞及び真核細胞が含まれる。例示的な細胞としては、原核生物及び真核生物のもの（単細胞または多細胞）、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの株）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または例えばハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウスの細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋｌ、ＤＸＢ－１ １ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ ２９３、２９３ＥＢＮＡ、ＭＳＲ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ヒーラ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ８０６５、ＨＬ－６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ ３ Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び前述の細胞に由来する細胞株などの真核性である。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子を含む。

【0067】

同一性：本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、高分子分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／またはＲＮＡ分子）間及び／またはポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、高分子分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一である場合、互いに「実質的に同一」であるとみなす。例えば、２つの核酸またはポリペプチド配列の同一性パーセントの計算は、最適な比較目的のために２つの配列をアラインすることによって実施することができる（例えば、最適な整列のために第１及び第２の配列のうちの一方または両方にギャップを導入することができ、非同一の配列は、比較目的のために無視することができる）。ある特定の実施形態では、比較目的のためのアラインされた配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。次いで、対応する位置にあるヌクレオチドを比較する。第１の配列の位置が、第２の配列の対応する位置と同一の残基（例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸）で占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、ギャップの数、及び２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある各ギャップの長さを考慮した配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。例えば、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，１９８９，４：１１－１７）のアルゴリズムを使用して、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントを決定することができる。いくつかの例示的な実施形態では、ＡＬＩＧＮプログラムで作製した核酸配列比較は、ＰＡＭ１２０重量残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用する。２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、代替的に、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。

【0068】

「改善された」、「増加された」、または「低減された」：本明細書で使用される場合、これらの用語または文法的に同等の比較用語は、同等の参照測定値に対して相対的な値を示す。例えば、いくつかの実施形態では、目的の作用因子によって達成された評価値は、同等の参照作用因子によって得られたものと比較して、「改善されている」場合がある。代替的にまたは追加的に、いくつかの実施形態では、目的の対象または系で達成された評価値は、同じ対象または系で異なる条件（例えば、目的の作用因子の投与などの事象の前後）下で、または異なる同等の対象で（例えば、目的の対象または系とは異なる同等の対象または系で、特定の目的の疾患、障害、または病態のうち１つ以上の指標の存在下で、あるいは、病態または作用因子に曝される前に）、得られたものと比較して、「改善されている」場合がある。いくつかの実施形態では、比較用語は、統計的に関連のある差（例えば、統計的関連性を達成するのに十分な発生率及び／または大きさのもの）を指す。当業者は、所与の文脈において、そのような統計的有意差を達成するのに必要であるか、または十分な差の程度及び／または発生率を知っているか、または容易に決定することができるであろう。

【0069】

インビトロ：本明細書で使用される「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工環境、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養物中などにおいて生じる事象を指す。

【0070】

リンカー：本明細書で使用される場合、異なる要素を互いに接続する多要素作用因子のその部分を指すために使用される。例えば、当業者は、その構造に２つ以上の機能的または組織的ドメインを含むポリペプチドが、多くの場合、それらを互いに連結するそのようなドメイン間の一続きのアミノ酸を含むことを理解する。いくつかの実施形態では、リンカー要素を含むポリペプチドは、一般形態Ｓ１－Ｌ－Ｓ２の全体的な構造を有し、Ｓ１及びＳ２が、同じであっても異なっていてもよく、リンカーによって互いに会合している２つのドメインを表し得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、長さが少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００以上のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、リンカーは、強固な三次元構造をとらない傾向があり、むしろポリペプチドに柔軟性を与えることを特徴とする。当該技術分野において既知のポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）を操作する場合に適切に使用することができる様々な異なるリンカー要素（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２：１ １２１－１１２３を参照されたい）。

【0071】

部分：当業者は、「部分」は、本明細書に記載するような特定の構造及び／または活性を有する、定義された化学基または実体であることを理解されるであろう。

【0072】

核酸：本明細書で使用される場合、その最も広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれる、または組み込むことができる、任意の化合物及び／または物質を意味する。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれているか、または組み込まれ得る化合物及び／または物質である。文脈から明らかであろうように、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指し、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであるか、またはそれを含み、いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然の核酸残基であるか、それを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の核酸類似体であるか、それを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を利用しないという点で核酸とは異なる。例えば、いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の「ペプチド核酸」であるか、それを含むか、またはそれからなり、ペプチド核酸は、当該技術分野において公知であり、ホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を骨格に有し、本発明の範囲内にあるとみなされる。代替的にまたは追加的に、いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合ではなく、１つ以上のホスホロチオエート及び／または５’－Ｎ－ホスホラミダイト結合を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）であるか、それを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、０（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、インターカレート塩基、及びそれらの組み合わせ）であるか、それを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸は、天然核酸のものと比較して、１つ以上の修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡまたはポリペプチド（例えば、タンパク質）などの機能的遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、１つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然源からの単離、相補的テンプレートに基づく重合による酵素合成（インビボまたはインビトロ）、組換え細胞または系における複製、及び化学合成のうちの１つ以上によって調製される。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００以上の残基長である。いくつかの実施形態では、核酸は部分的または全体的に一本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は部分的または全体的に二本鎖である。いくつかの実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードする、またはポリペプチドをコードする配列の相補体である、少なくとも１つの要素を含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、核酸は、酵素活性を有する。

【0073】

医薬組成物：本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、１つ以上の薬学的に許容される担体とともに製剤化された活性作用因子を指す。いくつかの実施形態では、活性作用因子は、適切な集団に投与された場合に既定の治療効果を達成する統計的に有意な確率を示す治療レジメンにおける投与に適切な単位用量で存在する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、経口投与、例えば、ドレンチ（水性または非水性の溶液または懸濁液）、錠剤、例えば、口腔、舌下、及び全身吸収を標的とするもの、ボーラス、粉末、顆粒、舌に適用するためのペースト；例えば、無菌溶液もしくは懸濁液、または持続放出製剤としての、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、もしくは硬膜外注射による非経口投与；皮膚、肺、もしくは口腔に適用される、例えば、クリーム、軟膏、または制御放出パッチもしくはスプレーとしての局所適用；例えば、ペッサリー、クリーム、もしくはフォームとして膣内もしくは直腸内；舌下；眼；経皮；または鼻、肺、及び他の粘膜表面に適合するものを含む、固体または液体の形態での投与のために特別に製剤化され得る。

【0074】

ポリペプチド：本明細書で使用される場合、アミノ酸の高分子鎖を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、人工的に設計及び／または産生されるという点で、操作されたアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、またはその両方を含むか、またはそれらからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然アミノ酸のみまたは非天然アミノ酸のみを含むか、またはそれらからなり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｄ－アミノ酸、Ｌ－アミノ酸、または両方を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｄ－アミノ酸のみを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、Ｌ－アミノ酸のみを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端で、ポリペプチドのＣ末端で、またはそれらの任意の組み合わせで、１つ以上のペンダント基または他の修飾、例えば、１つ以上のアミノ酸側鎖の修飾またはそれへの結合を含み得る。いくつかの実施形態では、そのようなペンダント基または修飾は、アセチル化、アミド化、脂質化、メチル化、ペグ化など、例えばそれらの組み合わせ、からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは環状であってもよく、及び／または環状部分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは環状ではなく、及び／または任意の環状部分を含まない。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは直鎖状である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ステープルポリペプチドであるか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、「ポリペプチド」という用語は、参照ポリペプチド、活性、または構造の名称に付加され得、そのような場合、これは、関連する活性または構造を共有し、したがってポリペプチドの同じクラスまたはファミリーのメンバーであると考えることができるポリペプチドを指すために本明細書で使用される。そのようなクラスごとに、アミノ酸配列及び／または機能が知られているクラス内の例示的なポリペプチドを本明細書が提供し、及び／または当業者はそれに気付くであろう。いくつかの実施形態では、そのような例示的なポリペプチドは、ポリペプチドのクラスまたはファミリーの参照ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドクラスまたはファミリーのメンバーは、クラスの参照ポリペプチドと（いくつかの実施形態では、クラス内の全てのポリペプチドと）、有意な配列相同性または同一性を示し、共通の配列モチーフ（例えば、特徴的な配列要素）を共有し、及び／または共通の活性を共有する（いくつかの実施形態では、同等のレベルで、または指定範囲内で）。例えば、いくつかの実施形態では、メンバーポリペプチドは、少なくとも約３０～４０％であり、多くの場合、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上を超える参照ポリペプチドとの全体的な程度の配列相同性または同一性を示し、及び／または、多くの場合９０％、または更に９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える非常に高い配列同一性を示す少なくとも１つの領域（例えば、いくつかの実施形態では、特徴的な配列要素であるか、またはそれを含み得る保存領域）を含む。このような保存領域は、通常、少なくとも３～４つ、多くの場合最大２０個以上のアミノ酸を包含し、いくつかの実施形態では、保存領域は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上の連続アミノ酸の区間を少なくとも１つ包含する。いくつかの実施形態では、関連するポリペプチドは、親ポリペプチドの断片を含むか、またはそれからなり得る。いくつかの実施形態では、有用なポリペプチドは、複数の断片を含むか、または複数の断片からなり得、その各々は、目的のポリペプチドに見出されるものとは互いに対し異なる空間配置で、同じ親ポリペプチドに見出され（例えば、親に直接連結された断片は、目的のポリペプチドでは空間的に分離されているか、またはその逆である場合があり、及び／または断片は、親とは異なる順序で目的のポリペプチドに存在する場合がある）、したがって、目的のポリペプチドは、その親ポリペプチドの誘導体である。

【0075】

予め定められた：予め定められたとは、例えば、ランダムに発生または達成するのとは対照的に、計画的に選択されることを意味する。

【0076】

防止するまたは防止：本明細書で使用される場合、疾患、障害、及び／または病態の発生に関連して使用される場合、疾患、障害、及び／または病態を発症するリスクを低減すること、及び／または疾患、障害、もしくは病態の１つ以上の特徴もしくは症状の発症を遅延させることを指す。防止は、事前に定義された期間の間、疾患、障害、または病態の発症を遅延させた場合、完了したとみなし得る。

【0077】

純粋：本明細書で使用される場合、作用因子または実体は、他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。例えば、約９０％超の特定の作用因子または実体を含有する調製物は、典型的には、純粋な調製物とみなされる。いくつかの実施形態では、作用因子または実体は、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％純粋である。

【0078】

参照：本明細書で使用される場合、それに対して比較が行われる、基準または対照について記載する。例えば、いくつかの実施形態では、目的の作用因子、動物、個体、集団、試料、配列、または値が、参照または対照の作用因子、動物、個体、集団、試料、配列、または値と比較される。いくつかの実施形態では、参照または対照は、目的の試験または決定と実質的に同時に試験及び／または決定される。いくつかの実施形態では、参照または対照は、任意選択で有形媒体に具現化された歴史的参照または対照である。典型的には、当業者に理解されるように、参照または対照は、評価対象と比較可能な条件または状況下で決定または特性評価される。当業者は、考えられる特定の参照または対照への依存及び／または比較を正当化するのに十分な類似性が存在する場合を理解するであろう。

【0079】

試料：本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、典型的には、本明細書に記載の目的の供給源から得られるか、またはそれに由来する材料のアリコートを指す。いくつかの実施形態では、目的の供給源は、生物学的または環境的供給源である。いくつかの実施形態では、目的の供給源は、細胞、または微生物、植物、もしくは動物（例えば、ヒト）などの生物であり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、目的の供給源は、生体組織または流体であるか、またはそれらを含む。いくつかの実施形態では、生体組織または流体は、羊水、房水、腹水、胆汁、骨髄、血液、母乳、脳脊髄液、耳垢、乳糜、チャイム（ｃｈｉｍｅ）、射精液、内リンパ液、滲出液、糞便、胃酸、胃液、リンパ、粘液、心嚢水、外リンパ液、腹腔液、胸膜液、膿、目ヤニ、唾液、皮脂、精液、血清、恥垢、痰、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、硝子体、嘔吐物、及び／またはそれらの組み合わせもしくは成分（複数可）であり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、生体液は、細胞内液、細胞外液、血管内液（血漿）、間質液、リンパ液、及び／または細胞間液であり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、生体液は、植物滲出物であり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、生体組織または試料は、例えば、吸引、生検（例えば、細針生検または組織生検）、スワブ（例えば、口腔、鼻、皮膚、または膣スワブ）、擦過、手術、洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）、または洗浄（ｌａｖａｇｅ）（例えば、気管支肺胞、乳管、鼻、眼、口腔、子宮、膣、または他の洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）もしくは洗浄（ｌａｖａｇｅ））によって得ることができる。いくつかの実施形態では、生体試料は、個体から得られた細胞であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、試料は、任意の適切な手段によって目的の供給源から直接得られる「一次試料」である。いくつかの実施形態では、文脈から明らかになるように、「試料」という用語は、一次試料の加工によって（例えば、１つ以上の成分を除去すること及び／または１つ以上の作用因子を加えることによって）得られる調製物を意味する。例えば、半透膜を使用する濾過。そのような「加工された試料」は、例えば、試料から抽出されたか、または核酸の増幅もしくは逆転写、ある特定の成分の単離及び／または精製などの１つ以上の技法を一次試料に施すことによって得られた、核酸またはポリペプチド（例えばタンパク質）を含み得る。

【0080】

対象：本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、生物、典型的には哺乳動物（例えば、いくつかの実施形態では出生前のヒト形態を含むヒト）を指す。いくつかの実施形態では、対象は、関連する疾患、障害、または病態に罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または病態に感受性がある。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害または病態の１つ以上の症状または特徴を示す。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または病態のいかなる症状または特性も示さない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、または病態への感受性またはそのリスクに特徴的な１つ以上の特徴を有する者である。いくつかの実施形態では、対象は、患者である。いくつかの実施形態では、対象は、診断及び／または療法が施される及び／または施された個体である。

【0081】

治療用作用因子：本明細書で使用される場合、「治療用作用因子」という用語は、概して、生物に投与されると所望の薬理学的効果を誘発するあらゆる作用因子を意味する。いくつかの実施形態では、作用因子は、適切な集団において統計的に有意な効果を示す場合、治療用作用因子であるとみなされる。いくつかの実施形態では、適切な集団は、モデル生物の集団であり得る。いくつかの実施形態では、適切な集団は、ある特定の年齢群、性別、遺伝的バックグラウンド、既存の臨床状態などの様々な基準によって定義され得る。いくつかの実施形態では、治療用作用因子は、疾患、障害、及び／または病態の１つ以上の症状または特徴を緩和する、改善する、軽減する、阻害する、防止する、発生を遅延させる、重症度を低下させる、及び／または発生率を低下させるために使用され得る物質である。いくつかの実施形態では、「治療用作用因子」は、ヒトへの投与のために販売可能となる前に、政府機関によって承認されているか、または承認が必要な作用因子である。いくつかの実施形態では、「治療用作用因子」は、ヒトへの投与のために医学的処方が必要とされる作用因子である。

【0082】

処置：本明細書で使用される場合、「処置」（また「処置する」または「処置すること」）という用語は、特定の疾患、障害、及び／または病態の１つ以上の症状、特徴、及び／または原因を部分的または完全に緩和する、改善する、軽減する、阻害する、その発生を遅延させる、その重症度を低下させる、及び／またはその発生率を低下させる療法の投与を指す。いくつかの実施形態では、そのような処置は、関連する疾患、障害及び／または状態の徴候を呈さない対象、及び／または、疾患、障害、及び／または病態の初期徴候のみを呈する対象の処置であり得る。代替的にまたは付加的に、そのような処置は、関連する疾患、障害及び／または状態の１つ以上の確立された徴候を呈する対象の処置であり得る。いくつかの実施形態では、処置は、関連する疾患、障害、及び／または病態に罹患していると診断された対象の処置であり得る。いくつかの実施形態では、処置は、関連する疾患、障害、及び／または病態の発生リスクの増加と統計的に相関している１つ以上の感受性因子を有することが分かっている対象の処置であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、処置は予防的であり得、いくつかの実施形態では、処置は治療的であり得る。

【0083】

ワクチン接種：本明細書で使用する場合、「ワクチン接種」という用語は、例えば、疾患関連（例えば、疾患を引き起こす）作用因子に対する、免疫応答を生成することを意図した組成物の投与を指す。いくつかの実施形態では、ワクチン接種は、疾患関連作用因子への曝露の前、その間、及び／またはその後、ならびにある特定の実施形態では、その作用因子への曝露の前、その間、及び／またはその直後に投与することができる。いくつかの実施形態では、ワクチン接種は、ワクチン組成物の適切な時間をおいた複数回の投与を含む。

【0084】

バリアント：分子、例えば、核酸、ポリペプチド（例えば、タンパク質）、または小分子の文脈で本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、参照分子との有意な構造的同一性を示すが、参照分子とは構造的に異なる、例えば、参照実体と比較して、１つ以上の化学部分の存在もしくは非存在、またはレベルが異なる分子を指す。いくつかの実施形態では、バリアントはまた、その参照分子と機能的にも異なる。一般に、特定の分子が参照分子の「バリアント」であると適切にみなされるかどうかは、当該参照分子との構造的同一性の程度に基づく。当業者によって理解されるように、任意の生物学的または化学的な参照分子は、ある特定の特徴的な構造要素を有する。定義上、バリアントは、１つ以上のそのような特徴的な構造要素を共有するが、参照分子とは少なくとも１つの側面が異なる別個の分子である。いくつか例を挙げると、ポリペプチドは、線形もしくは三次元空間において互いに対して指定された位置を有する、及び／または特定の構造モチーフ及び／または生物学的機能に寄与する、複数のアミノ酸から構成された特徴的な配列要素を有していてもよく、核酸は、線形または三次元空間において互いに対して指定された位置を有する複数のヌクレオチド残基から構成された特徴的な配列要素を有していてもよい。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、アミノ酸またはヌクレオチド配列における１つ以上の差、及び／または、ポリペプチドまたは核酸の共有結合的成分（例えば、ポリペプチドまたは核酸骨格が結合している）である化学的部分（例えば、炭水化物、脂質、リン酸基）における１つ以上の差の結果として、参照ポリペプチドまたは核酸とは異なる場合がある。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、または９９％である、参照ポリペプチドまたは核酸との全体的な配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、参照ポリペプチドまたは核酸と少なくとも１つの特徴的な配列要素を共有しない。いくつかの実施形態では、参照ポリペプチドまたは核酸は、１つ以上の生物学的活性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、参照ポリペプチドまたは核酸の生物学的活性のうちの１つ以上を共有する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、参照ポリペプチドまたは核酸の生物学的活性のうちの１つ以上が欠けている。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、参照ポリペプチドまたは核酸と比較して、１つ以上の生物学的活性の低下したレベルを示す。いくつかの実施形態では、対象のポリペプチドまたは核酸は、参照ポリペプチドまたは核酸のアミノ酸またはヌクレオチド配列が参照のアミノ酸またはヌクレオチド配列と同一であるが、特定の位置での少数の配列変化を有する場合、参照ポリペプチドまたは核酸の「バリアント」であるとみなされる。典型的には、バリアントにおける約２０％、約１５％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、または約２％未満の残基が、参照と比較して、置換されるか、挿入されるか、または欠失されている。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、参照と比較して、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、または約１個の置換された残基を含む。多くの場合、バリアントポリペプチドまたは核酸は、参照と比較して、非常に少数（例えば、約５、約４、約３、約２、または約１個未満）の、置換されたか、挿入されたか、または欠失された機能的残基（すなわち、特定の生物学的活性に関与する残基）を含む。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、参照と比較して、約５、約４、約３、約２、または約１つ以下の付加または欠失を含み、いくつかの実施形態では、参照と比較して、付加または欠失を含まない。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドまたは核酸は、参照と比較して、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６個未満、及び一般的には約５、約４、約３、または約２個未満の付加または欠失を含む。いくつかの実施形態では、参照ポリペプチドまたは核酸は、自然界に見出されるものである。いくつかの実施形態では、参照ポリペプチドまたは核酸は、ヒトポリペプチドまたは核酸である。

【0085】

ベクター：本明細書で使用される場合、その核酸分子に連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。１つの種類のベクターとして、更なるＤＮＡセグメントをライゲートすることができる環状二本鎖ＤＮＡループのことを指す「プラスミド」がある。別の種類のベクターとして、更なるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができるウイルスベクターがある。ある特定のベクターは、ベクターが導入された宿主細胞内で自律的に複製することが可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム性の哺乳動物ベクターなど）。他のベクター（例えば、非エピソーム性の哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内に導入されると宿主細胞のゲノムに組み込まれることができることにより、宿主ゲノムとともに複製される。更に、特定のベクターはベクターが機能的に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換の標準的な技術が使用され得る（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）。酵素反応及び精製技術は、製造業者の仕様書に従って、または当該技術分野において一般的に行われるようにして、または本明細書に記載されるようにして行うことができる。上記の技術及び手順は一般に、当該技術分野では周知の従来の方法に従って、かつ本明細書全体を通して引用され、考察される、一般的かつより具体的な様々な参考文献に記載されるようにして行うことができる。任意の目的のために、参照により本明細書に援用される、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。

【0086】

野生型：本明細書で使用される場合、「野生型」という用語は、（変異型、病変した、改変したなどとは対照的に）「正常」な状態または文脈において自然界に見出されるような構造及び／または活性を有する実体を指す、当該技術分野において理解される意味を有する。当業者は、野生型遺伝子及びポリペプチドが多くの場合複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在することを理解するであろう。

【0087】

特定の実施形態の詳細な説明
ＲＮＡ治療剤は、最近、がん、感染症、及び／またはある特定のポリペプチド（例えば、タンパク質）の欠乏に関連する疾患もしくは障害などの様々な疾患の処置及び／または予防のための比較的新しく有望なクラスの治療法として浮上している。特に、これらの技術の有望性、及び大規模な規模（例えば、インフルエンザ、コロナウイルス［例えば、ＳＡＲＳ、ＭＥＲＳなど］などの伝染性疾患に対する世界規模のワクチン接種及び／または処置）を含む多種多様な臨床状況への適応性を考慮すると、製造技術、特に大規模産生に適用可能な製造技術の改善は特に価値がある。

【0088】

本明細書に提供される技術は、とりわけ、例えば、商業規模及び／または商業条件下で、ＲＮＡを含む組成物及び／または調製物の、特に効果的及び／または効率的な産生を達成するのに有用である。例えば、様々な実施形態では、提供される技術は、例えば、バッチサイズ及び／または産生速度及び／または所定の品質管理パラメータなどの医薬品グレード（及び／または規模）の産生に固有の要件の達成を可能にする及び／または容易にする。

【0089】

本開示は、とりわけ、ＩＶＴによって、ＲＮＡ、例えば、治療用ｍＲＮＡなどの治療用ＲＮＡ及び／またはそれを含む組成物を製造するための技術を提供する。いくつかの実施形態では、提供される技術は、医薬品グレードのＲＮＡ及び／またはＲＮＡ治療剤を製造するのに有用である。いくつかの実施形態では、提供される技術は、ＲＮＡ治療剤、例えば、医薬品グレードのＲＮＡ治療剤の大規模な製造に有用である。

【0090】

例えば、いくつかのそのような実施形態では、本明細書に提供される技術を使用して、ＲＮＡ治療剤の少なくとも１，０００バイアル（例えば、少なくとも２，０００バイアル、少なくとも５，０００バイアル、少なくとも１０，０００バイアル、少なくとも２０，０００バイアル、少なくとも３０，０００バイアル、少なくとも４０，０００バイアル、少なくとも５０，０００バイアル、少なくとも６０，０００バイアル、少なくとも７０，０００バイアル、少なくとも８０，０００バイアル、少なくとも９０，０００バイアル、少なくとも１００，０００バイアル、少なくとも２００，０００バイアル、少なくとも３００，０００バイアル、少なくとも４００，０００バイアル、少なくとも５００，０００バイアル、６００，０００バイアル、７００，０００バイアル、８００，０００バイアル、９００，０００バイアル、１，０００，０００バイアル以上を含む）のバッチスループット（例えば、医薬品グレードのバッチスループット）を産生することができる。

【0091】

例えば、いくつかのそのような実施形態では、本明細書に提供される技術を使用して、ＲＮＡ治療剤の少なくとも５０Ｌ（例えば、少なくとも５０Ｌ、少なくとも６０Ｌ、少なくとも７０Ｌ、少なくとも８０Ｌ、少なくとも１００Ｌ、少なくとも１１０Ｌ、少なくとも１２０Ｌ、少なくとも１３０Ｌ、少なくとも１４０Ｌ、少なくとも１５０Ｌ以上を含む）のバッチスループット（例えば、医薬品グレードのバッチスループット）を産生することができる。いくつかの実施形態では、各バイアルは、０．０１ｍｇ～５ｍｇの量（例えば、０．０１ｍｇ、０．０２ｍｇ、０．０３ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．０５ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．０７ｍｇ、０．０８ｍｇ、０．０９ｍｇ、０．１ｍｇ、０．１５ｍｇ、０．２ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．３ｍｇ、０．３５ｍｇ、０．４ｍｇ、０．４５ｍｇ、０．５ｍｇ）のＲＮＡを含むことができる。

【0092】

とりわけ、本開示は、上昇したシチジン三リン酸（ＣＴＰ）及び／またはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）濃度が、産生されたＲＮＡ中のヌクレオチド（例えば、ヌクレオチド含有量）のパーセント及び／またはモル比とは無関係に、医薬品グレードのＲＮＡ組成物及び／または調製物の産生のためを含む、ＩＶＴ反応においてある特定の利点を提供することができるという洞察を提供する。

【0093】

本明細書に記載の技術は、ＲＮＡ組成物（例えば、例えば、ｍＲＮＡなどのＲＮＡ、及びそれを含む組成物）を製造するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術は、疾患、障害、または病態（例えば、がん、感染症、ポリペプチド（例えば、タンパク質）欠乏症に関連する疾患など）の処置及び／または予防のためのｍＲＮＡ組成物の製造に有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術は、ポリペプチド及び／または複数のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ組成物を製造するために有用であり得る。

【0094】

組成物
いくつかの実施形態では、本開示は、とりわけ、インビトロ転写（ＩＶＴ）によるＲＮＡを含む組成物及び／または調製物を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、組成物及び／または調製物は、治療用ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び／または調製物を製造する方法は、商業規模で、例えば、少なくとも０．０１ｇ、０．０２ｇ、０．０３ｇ、０．０４ｇ、０．０５ｇ、０．０６ｇ、０．０７ｇ、０．０８ｇ、０．０９ｇ、０．１ｇ、０．５ｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ ＲＮＡ（例えば、少なくとも１５ｇ ＲＮＡ、少なくとも２０ｇ ＲＮＡ、少なくとも２５ｇ ＲＮＡ、少なくとも３０ｇ ＲＮＡ、少なくとも３５ｇ ＲＮＡ、少なくとも４０ｇ ＲＮＡ、少なくとも４５ｇ ＲＮＡ、少なくとも５０ｇ ＲＮＡ、少なくとも５５ｇ ＲＮＡ、少なくとも６０ｇ ＲＮＡ、少なくとも７０ｇ ＲＮＡ、少なくとも８０ｇ ＲＮＡ、少なくとも９０ｇ ＲＮＡ、少なくとも１００ｇ ＲＮＡ、少なくとも１５０ｇ ＲＮＡ、少なくとも２００ｇ ＲＮＡ、少なくとも３００ｇ ＲＮＡ、少なくとも４００ｇ ＲＮＡ、少なくとも５００ｇ ＲＮＡ以上を含む）の大規模バッチスループットである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のそのような方法を使用して、約０．０１ｇ～約５００ｇ ＲＮＡ、約０．０１ｇ～約１０ｇ ＲＮＡ、約１ｇ～約１０ｇ ＲＮＡ、約１０ｇ～約５００ｇ ＲＮＡ、約１０ｇ～約３００ｇ ＲＮＡ、約１０ｇ～約２００ｇ ＲＮＡ、または約３０ｇ～約６０ｇ ＲＮＡの大規模バッチスループットを産生することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のそのような方法は、１時間当たり少なくとも１．５ｇ ＲＮＡ（例えば、１時間当たり少なくとも２ｇのＲＮＡ、１時間当たり少なくとも２．５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも３ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも３．５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも４ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも４．５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも５．５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも６ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも６．５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも７ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも７．５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも８ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも８．５ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも９ｇ ＲＮＡ、１時間当たり少なくとも１０ｇ ＲＮＡ以上を含む）の大規模バッチスループットを産生する大規模な製造に有用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の大規模な製造方法は、１時間当たり１５ｇ ＲＮＡ～１時間当たり２０ｇ ＲＮＡ（例えば、１時間当たり約１７ｇ）の容量に達することができる。

【0095】

ＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術に適応可能なＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡは、直鎖ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、そのヌクレオチド配列がオープンリーディングフレーム（またはその相補鎖）を含まないという点で非コードＲＮＡである。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡは、本開示のポリペプチドまたは複数のポリペプチド（例えば、エピトープ）をコードする（またはコードする配列の相補鎖である）ヌクレオチド配列を有する。

【0096】

多くの実施形態では、関連するＲＮＡは、ｍＲＮＡである。

【0097】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、非修飾ウリジン残基を含み、非修飾ウリジン残基のみを含むＲＮＡは、「ｕＲＮＡ」と称され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１つ以上の修飾されたウリジン残基を含み、いくつかの実施形態では、そのようなＲＮＡ（例えば、完全に修飾されたウリジン残基を含むＲＮＡ）は、「ｍｏｄＲＮＡ」と称される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、自己増幅ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、トランス増幅ＲＮＡであり得る（例えば、ＷＯ２０１７／１６２４６１を参照されたい）。

【0098】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術は、少なくとも５００個のリボヌクレオチド（例えば、少なくとも６００個のリボヌクレオチド、少なくとも７００個のリボヌクレオチド、少なくとも８００個のリボヌクレオチド、少なくとも９００個のリボヌクレオチド、少なくとも１０００個のリボヌクレオチド、少なくとも１２５０個のリボヌクレオチド、少なくとも１５００個のリボヌクレオチド、少なくとも１７５０個のリボヌクレオチド、少なくとも２０００個のリボヌクレオチド、少なくとも２５００個のリボヌクレオチド、少なくとも３０００個のリボヌクレオチド、少なくとも３５００個のリボヌクレオチド、少なくとも４０００個のリボヌクレオチド、少なくとも４５００個のリボヌクレオチド、少なくとも５０００個のリボヌクレオチド、またはそれ以上などの）の長さを有するＲＮＡ（例えば、一本鎖ＲＮＡ）の産生に特に有用であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術は、約８００リボヌクレオチド～５０００リボヌクレオチドの長さを有する一本鎖ＲＮＡを合成するために特に有用であり得る。

【0099】

いくつかの実施形態では、関連するＲＮＡは、ポリペプチドをコードする部分または複数のポリペプチドをコードする部分を含む。いくつかの特定の実施形態では、そのような１つ以上の部分は、抗原（またはそのエピトープ）、サイトカイン、酵素などであるか、またはそれらを含む１つ以上のポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、コードされたポリペプチド（複数可）は、腫瘍に関連する１つ以上の新抗原または新エピトープであってもよく、またはそれらを含んでもよい。いくつかの実施形態では、コードされたポリペプチド（複数可）は、感染作用因子（例えば、細菌、真菌、ウイルスなど）の１つ以上の抗原（またはそのエピトープ）であってもよく、またはそれらを含んでもよい。ある特定の実施形態では、コードされたポリペプチドは、野生型ポリペプチドのバリアントであり得る。

【0100】

いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、分泌シグナルをコードする領域（例えば、コードされた１つ以上の標的実体が細胞による翻訳時に分泌されることを可能にする分泌シグナルをコードする領域）を含み得る。いくつかの実施形態では、そのような分泌シグナルをコードする領域は、非ヒト分泌シグナルであり得るか、またはそれを含み得る。いくつかの実施形態では、そのような分泌シグナルをコードする領域は、ヒト分泌シグナルであり得るか、またはそれを含み得る。

【0101】

いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）は、（例えば、ＲＮＡの安定性及び／または翻訳効率を向上させるために）少なくとも１つの非コード配列要素を含んでもよい。非コード配列要素の例としては、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、５’ＵＴＲ、ｍＲＮＡの共転写キャッピングのためのキャップ構造、ポリアデニン（ポリＡ）尾部、及びこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0102】

形式
ＲＮＡ医薬組成物（例えば、免疫原性組成物またはワクチン）に有用な少なくとも４つの形式、すなわち、ｍＲＮＡ（ｕＲＮＡ）、ヌクレオシド修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）、自己増幅ｍＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、及びトランス増幅ＲＮＡを含有する非修飾ウリジンが開発されている。

【0103】

非修飾ウリジンプラットフォームの特徴は、例えば、固有のアジュバント効果、良好な忍容性及び安全性、ならびに強力な抗体及びＴ細胞応答のうちの１つ以上を含み得る。

【0104】

修飾されたウリジン（例えば、シュードウリジン）プラットフォームの特徴は、低減されたアジュバント効果、鈍化された免疫自然免疫センサ活性化能力、したがっての増加した抗原発現、良好な忍容性及び安全性、ならびに強い抗体及びＣＤ４－Ｔ細胞応答を含み得る。本明細書に記載のように、本開示は、そのような強力な抗体及びＣＤ４ Ｔ細胞応答が、ワクチン接種に特に有用であり得るという洞察を提供する。

【0105】

自己増幅プラットフォームの特徴は、例えば、ポリペプチド（例えば、タンパク質）発現の長期間、良好な忍容性及び安全性、非常に低いワクチン用量での有効性の高い可能性を含み得る。

【0106】

いくつかの実施形態では、自己増幅プラットフォーム（例えば、ＲＮＡ）は、２つの核酸分子を含み、１つの核酸分子は、レプリカーゼ（例えば、ウイルスレプリカーゼ）をコードし、もう１つの核酸分子は、トランス（トランス複製系）の当該レプリカーゼによって複製可能である（例えば、レプリコン）。いくつかの実施形態では、自己増幅プラットフォーム（例えば、ＲＮＡ）は、複数の核酸分子を含み、当該核酸は、複数のレプリカーゼ及び／またはレプリコンをコードする。

【0107】

いくつかの実施形態では、トランス複製系は、単一の宿主細胞内に核酸分子の両方の存在を含む。

【0108】

いくつかのそのような実施形態では、レプリカーゼ（例えば、ウイルスレプリカーゼ）をコードする核酸は、標的細胞及び／または標的生物において自己複製することができない。いくつかのそのような実施形態では、レプリカーゼ（例えば、ウイルスレプリカーゼ）をコードする核酸は、（＋）鎖テンプレートに基づく（－）鎖合成及び／または（－）鎖テンプレートに基づく（＋）鎖合成に重要な少なくとも１つの保存配列要素を欠く。

【0109】

いくつかの実施形態では、自己増幅ＲＮＡは、５’－キャップを含む。いかなる１つの理論に拘束されることを望むものではないが、５’－キャップが、トランスにおける目的の遺伝子の高レベル発現に重要であることが見出されている。いくつかの実施形態では、５’－キャップは、レプリカーゼの発現を駆動する。

【0110】

いくつかの実施形態では、自己増幅ＲＮＡは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含まない。いくつかのそのような実施形態では、目的の遺伝子及び／またはレプリカーゼの翻訳は、ＩＲＥＳ要素によって駆動されない。いくつかの実施形態では、ＩＲＥＳ要素は、５’－キャップによって置換される。いくつかのそのような実施形態では、５’－キャップによる置換は、ＲＮＡによってコードされるポリペプチドの配列に影響を与えない。

【0111】

いくつかの実施形態では、自己増幅プラットフォームは、ウイルス粒子の増殖を必要としない（例えば、望ましくないウイルス粒子形成と関連付けられない）。いくつかの実施形態では、自己増幅プラットフォームは、ウイルス粒子を形成することができない。

【0112】

５’－キャップ
いくつかの実施形態では、本開示に従って利用されるポリヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）は、５’－キャップを含む。ＲＮＡキャッピングは十分に研究されており、例えば、Ｄｅｃｒｏｌｙ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １０：５１－６５、及びＲａｍａｎａｔｈａｎ Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ；４４（１６）：７５１１－７５２６に記載されており、その各々の内容全体は、参照により本明細書に援用される。いくつかの実施形態では、本発明の文脈で好適であり得る５’－キャップ構造は、キャップ０（第１の核酸塩基のメチル化、例えば、ｍ７ＧｐｐｐＮ）、キャップ１（ｍ７ＧｐｐｐＮの隣接するヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、キャップ２（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の第２のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、キャップ３（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の第３のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、キャップ４（ｍ７ＧｐｐｐＮの下流の第４のヌクレオチドのリボースの追加のメチル化）、ＡＲＣＡ（抗リバースキャップ類似体）、修飾ＡＲＣＡ（ホスホロチオエート修飾ＡＲＣＡ、例えば、ベータ－Ｓ－ＡＲＣＡ）、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７－デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノ－グアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、及び２－アジド－グアノシンである。

【0113】

いくつかの実施形態では、利用される５’－キャップは、キャップ０（本明細書では「Ｃａｐ０」とも称される）、キャップ１（本明細書では「Ｃａｐ１」とも称される）、またはキャップ２（本明細書では「Ｃａｐ２」とも称される）である。例えば、Ｒａｍａｎａｔｈａｎ Ａ ｅｔ ａｌ．の図１、及びＤｅｃｒｏｌｙ Ｅ ｅｔ ａｌ．の図１を参照されたい。

【0114】

本明細書で使用される「５’－キャップ」という用語は、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡの５’－末端上に見出される構造を指し、概して、５’－５’－三リン酸結合を介して、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡに接続されたグアノシンヌクレオチドを含む（ＧｐｐｐまたはＧ（５’）ｐｐｐ（５’）とも称される）。いくつかの実施形態では、５’キャップに含まれるグアノシンヌクレオシドは、例えば、塩基（グアニン）上の１つ以上の位置での（例えば、７位での）メチル化、及び／またはリボースの１つ以上の位置でのメチル化によって修飾され得る。いくつかの実施形態では、５’キャップに含まれるグアノシンヌクレオシドは、リボースでの３’Ｏメチル化（３’ＯＭｅＧ）を含む。いくつかの実施形態では、５’キャップに含まれるグアノシンヌクレオシドは、グアニンの７位でのメチル化（ｍ７Ｇ）を含む。いくつかの実施形態では、５’キャップに含まれるグアノシンヌクレオシドは、グアニンの７位でのメチル化及びリボースでの３’Ｏメチル化（ｍ７（３’ＯＭｅＧ））を含む。

【0115】

いくつかの実施形態では、５’－キャップまたは５’－キャップ類似体を有する本明細書に開示のＲＮＡを提供することは、インビトロ転写によって達成され得、この場合、５’－キャップは、ＲＮＡ鎖内に共転写的に発現されるか、またはキャッピング酵素を使用して、転写後にＲＮＡに結合し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるキャップを用いた、例えば、ｃａｐ１またはｃａｐ１類似体を用いた同時転写キャッピングは、適切な参照比較対照を用いた同時転写キャッピングと比較して、ＲＮＡのキャッピング効率を改善する。いくつかの実施形態では、キャッピング効率を改善することは、ＲＮＡの翻訳効率及び／または翻訳速度を増加させ、及び／またはコードされたポリペプチドの発現を増加させることができる。

【0116】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、５’－キャップまたは５’キャップ類似体、例えば、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、またはＣａｐ２を含む。いくつかの実施形態では、提供されたＲＮＡは、キャッピングされていない５’－三リン酸塩を有しない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、５’－キャップ類似体でキャッピングされ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、Ｃａｐ０を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡは、例えば、本明細書に記載されるＣａｐ１を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、Ｃａｐ２を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの変化は、例えば、デキャッピングを防止し、ＲＮＡ半減期を増加させることができる、非加水分解性のキャップ構造を生成する。

【0117】

いくつかの実施形態では、Ｃａｐ０構造は、グアニンの７位でメチル化されたグアノシンヌクレオシド（ｍ７Ｇ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｐ０構造は、５’－５’－三リン酸結合を介してＲＮＡに接続されており、本明細書では、ｍ７Ｇｐｐｐまたはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）とも称される。

【0118】

いくつかの実施形態では、Ｃａｐ１構造は、ＲＮＡ中のグアニンの７位でメチル化されたグアノシンヌクレオシド（ｍ７Ｇまたは７ｍＧ）及び２’Ｏメチル化された第１のヌクレオチド（２’ＯＭｅＮ１またはＮ１２’ＯＭｅまたはＮ１２’ＯＭｅ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｐ１構造は、５’－５’－三リン酸結合を介してＲＮＡに接続されており、いくつかの実施形態では、Ｃａｐ１構造は、ｍ７Ｇｐｐｐ（Ｎ１２’ＯＭｅ）またはｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（Ｎ１２’ＯＭｅ）または７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ１２’－ＯＭｅ）として表され得る。いくつかの実施形態では、Ｎ１は、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択される。いくつかの実施形態では、Ｎ１は、Ａである。いくつかの実施形態では、Ｎ１は、Ｃである。いくつかの実施形態では、Ｎ１は、Ｇである。いくつかの実施形態では、Ｎ１は、Ｕである。

【0119】

当業者は、ある特定の位置（例えば、Ｎ１）におけるメチル基（例えば、２’ＯＭｅ基）の存在が、ＡＲＣＡ技術の基礎となる、例えば、特定のポリメラーゼ（例えば、Ｔ７）による伸長を妨げる可能性があるため、キャップ構造内の１つ以上の位置のメチル化が、組み込みモード（例えば、同時転写対転写後）に影響を与え得るか、または反映し得ることを理解するであろう。

【0120】

いくつかの実施形態では、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（Ｎ１２’ＯＭｅ）Ｃａｐ１構造は、＋２位のキャップ近位Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵである第２のヌクレオチド、Ｎ２を含む。いくつかの実施形態では、そのようなＣａｐ１構造は、（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（Ｎ１２’ＯＭｅ）ｐＮ２）として表される。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＵである。

【0121】

いくつかの実施形態では、Ｃａｐ１構造は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（Ａ１２’ＯＭｅ）ｐＧ２であるか、またはそれを含み、式中、Ａ１は、＋１位のキャップ近位Ａであり、Ｇ２は、＋２位のキャップ近位Ｇであり、以下の構造を有する。

【化1】

【0122】

いくつかの実施形態では、Ｃａｐ１構造は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（Ａ１２’ＯＭｅ）ｐＵ２ であるか、またはそれを含み、式中、Ａ１は、＋１位のキャップ近位Ａであり、Ｕ２は、＋２位のキャップ近位Ｕであり、以下の構造を有する。

【化2】

【0123】

いくつかの実施形態では、Ｃａｐ１構造は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（Ｇ１２’ＯＭｅ）ｐＧ２ であるか、またはそれを含み、式中、Ｇ１は、＋１位のキャップ近位Ｇであり、Ｇ２は、＋２位のキャップ近位Ｇであり、以下の構造を有する。

【化3】

【0124】

いくつかの実施形態では、Ｃａｐ１構造は、グアニン（ｍ７Ｇ）の７位でメチル化されたグアノシンヌクレオシド、ならびに１つ以上の追加の修飾、例えば、リボース上のメチル化、及びＲＮＡ中の２’Ｏメチル化された第１のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｐ１構造は、グアノシンの７位でメチル化されたグアノシンヌクレオシド、及びリボースでの３’Ｏメチル化（ｍ７Ｇ３’ＯＭｅ）または７ｍＧ３’ＯＭｅ、ならびにＲＮＡ中の２’Ｏメチル化された第１のヌクレオチド（Ｎ１２’ＯＭｅ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｐ１構造は、５’－５’三リン酸結合を介してＲＮＡに接続されており、本明細書では、（ｍ７Ｇ３’ＯＭｅ）ｐｐｐ（２’ＯＭｅＮ１）または（ｍ７Ｇ３’ＯＭｅ）（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＮ１）とも称される。いくつかの実施形態では、Ｎ１は、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択される。いくつかの実施形態では、Ｎ１は、Ａである。いくつかの実施形態では、Ｎ１は、Ｃである。いくつかの実施形態では、Ｎ１は、Ｇである。いくつかの実施形態では、Ｎ１は、Ｕである。

【0125】

いくつかの実施形態では、（ｍ７Ｇ３’ＯＭｅ）（５’）ｐｐｐ（５’）（Ｎ１２’ＯＭｅ）Ｃａｐ１構造は、２位のキャップ近位ヌクレオチドである第２のヌクレオチドＮ２を含み、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＵ（ｍ７Ｇ３’ＯＭｅ）（５’）ｐｐｐ（５’）（Ｎ１２’ＯＭｅ）ｐＮ２）から選択される。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＵである。

【0126】

いくつかの実施形態では、Ｃａｐ１構造は、（ｍ７Ｇ３’ＯＭｅ）（５’）ｐｐｐ（５’）（Ａ１２’ＯＭｅ）ｐＧ２であるか、またはそれを含み、式中、Ａ１は、＋１位のキャップ近位Ａであり、Ｇ２は、＋２位のキャップ近位Ｇであり、以下の構造を有する。

【化4】

【0127】

いくつかの実施形態では、Ｃａｐ１構造は、（ｍ７Ｇ３’ＯＭｅ）（５’）ｐｐｐ（５’）（Ｇ１２’ＯＭｅ）ｐＧ２であるか、またはそれを含み、式中、Ｇ１は、＋１位のキャップ近位Ｇであり、Ｇ２は、＋２位のキャップ近位Ｇであり、以下の構造を有する。

【化5】

【0128】

いくつかの実施形態では、Ｃａｐ１構造の第２のヌクレオチドは、１つ以上の修飾、例えば、メチル化を含むことができる。いくつかの実施形態では、２’Ｏメチル化を含む第２のヌクレオチドを含むＣａｐ１構造は、Ｃａｐ２構造である。

【0129】

いくつかの実施形態では、Ｃａｐ１構造を含むＲＮＡポリヌクレオチドは、適切な参照比較対照と比較して、増加した翻訳効率、増加した翻訳速度、及び／または増加したコードされたペイロードの発現を有する。いくつかの実施形態では、Ａ１が、＋１位のキャップ近位ヌクレオチドであり、かつＧ２が、＋２位のキャップ近位ヌクレオチドである、（ｍ７Ｇ３’ＯＭｅ）（５’）ｐｐｐ（５’）（Ａ１２’ＯＭｅ）ｐＧ２を有するＣａｐ１構造を含むＲＮＡポリヌクレオチドは、Ｇ１が、１位のキャップ近位ヌクレオチドであり、かつＧ２が、２位のキャップ近位ヌクレオチドである、（ｍ７Ｇ３’ＯＭｅ）（５’）ｐｐｐ（５’）（Ｇ１２’ＯＭｅ）ｐＧ２を有するＣａｐ１構造を含むＲＮＡポリヌクレオチドと比較して翻訳効率が向上している。いくつかの実施形態では、増加した翻訳効率は、ＲＮＡポリヌクレオチドを細胞または生物に投与するときに評価される。

【0130】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドに使用されるキャップ類似体は、ｍ７Ｇ３’ＯＭｅＧｐｐｐ（ｍ１２’－ＯＭｅ）ＡｐＧであり、（ｍ２７，３’－ＯＭｅＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ２’－ＯＭｅＡｐＧまたは（ｍ７Ｇ３’ＯＭｅ）（５’）ｐｐｐ（５’）（Ａ２’ＯＭｅ）ｐＧ）と称されることもある）以下の構造を有する。

【化6】

【0131】

以下は、ＲＮＡ及びｍ２７，３’ＯＭｅＧ（５’）ｐｐｐ（５’）ｍ２’－ＯＭｅＡｐＧを含む、例示的なＣａｐ１ ＲＮＡである。

【化7】

【0132】

以下は、別の例示的なＣａｐ１ ＲＮＡである。

【化8】

【0133】

以下は、例示的なＡＲＣＡである。

【化9】

【0134】

５’－ＵＴＲ及び近位配列
いくつかの実施形態では、本開示に従って利用される核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）は、５’－ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、５’－ＵＴＲは、複数の別個の配列要素を含み得、いくつかの実施形態では、そのような複数の配列要素は、１つ以上の特定の配列要素の複数のコピーであり得るか、またはそれを含み得る（例えば、特定の供給源に由来し得るか、またはそれ以外の場合、機能的もしくは特徴的配列要素として知られ得る）。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、複数の異なる配列要素を含む。

【0135】

「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、当該技術分野において、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子中の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子中の対応する領域に、一般的に利用される。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５’（上流）（５’－ＵＴＲ）及び／またはオープンリーディングフレームの３’（下流）（３’－ＵＴＲ）に存在し得る。存在する場合、５’－ＵＴＲは、ポリペプチド（例えば、タンパク質）コード領域の開始コドンの上流の５’末端に位置する。５’－ＵＴＲは、（存在する場合）５’－キャップの下流にあり、例えば、５’－キャップに直接隣接している。

【0136】

本開示のいくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、異種５’ＵＴＲであり、すなわち、異なるＯＲＦに関連する天然に見出される５’ＵＴＲである。別の実施形態では、５’ＵＴＲは、合成５’ＵＴＲであり、すなわち、天然には存在しない。いくつかの実施形態では、親参照５’ＵＴＲに対して配列が変更された５’ＵＴＲなどの合成５’ＵＴＲを利用してもよい。当業者は、例えば、バリアント５’ＵＴＲが関連するＯＲＦの発現を増加させると報告され得る様々な５’ＵＴＲ配列変化を認識するであろう。

【0137】

ほんの数例を挙げると、いくつかの実施形態では、利用される５’ＵＴＲは、例えば、Ｘｅｎｏｐｕｓまたはヒトα－グロビン、β－グロビン、もしくはオク－グロビンなどのα－グロビンまたはβ－グロビン（例えば、米国特許第８２７８０６３号及び／または米国特許第９０１２２１９号に記載されるような）遺伝子などの遺伝子、ヒトシトクロムｂ－２４５ａポリペプチド、ヒドロキシステロイド（１７ｂ）デヒドロゲナーゼ、タバコエッチウイルス（例えば、例えば、米国特許第８２７８０６３号及び／または米国特許第９０１２２１９号に記載されるような）からの５’ＵＴＲであり得るか、またはそれを含み得る。ＣＭＶ即時早期１（ＩＥ１）遺伝子（例えば、例えば、ＵＳ２０１４／０２０６７５３、Ｗ０２０１３／１８５０６９に記載されているような）；ＨＳＤ１７Ｂ４、ＲＰＬ３２、ＡＳＡＨ１、ＡＴＰ５Ａ１、ＭＰ６８、ＮＤＵＦＡ４、ＮＯＳＩＰ、ＲＰＬ３１、ＳＬＣ７Ａ３、ＴＵＢＢ４Ｂ、ＵＢＱＬＮ２、ＰＳＭＢ３、ＲＰＳ９、ＣＡＳＰ１、ＣＯＸ６Ｂ１、ＮＤＵＦＡ１、Ｒｐｌ３１、ＧＮＡＳ、ＡＬＢ７。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、α－グロビン遺伝子からの５’ＵＴＲ、もしくはそのバリアントであるか、またはそれを含む。

【0138】

いくつかの実施形態では、利用される５’ＵＴＲは、トップ遺伝子の５’ＵＴＲ、例えば、５’ＴＯＰモチーフを欠くＴＯＰ遺伝子の５’ＵＴＲ（オリゴピリミジントラクト）（例えば、例えば、ＷＯ／２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８、ＷＯ２０１５／０２４６６７、ＷＯ２０１５／０２４６６７に記載されているように）、リボソームタンパク質Ｌａｒｇｅ３２（Ｌ３２）遺伝子の５’ＵＴＲ要素（例えば、例えば、ＷＯ／２０１５／１０１４１４、ＷＯ２０１５／１０１４１５、ＷＯ／２０１５／０６２７３８に記載されているように）、ヒドロキシステロイド（１７－β）デヒドロゲナーゼ４遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ４）の５’ＵＴＲ要素（例えば、例えば、ＷＯ２０１５／０２４６６７に記載されているように）、またはＡＴＰ５Ａｌの５’ＵＴＲ要素（例えば、例えば、ＷＯ２０１５／０２４６６７に記載されているように）である。

【0139】

いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲの代わりにまたは５’ＵＴＲに加えて、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用する。

【0140】

いくつかの実施形態では、本開示に従って利用される５’ＵＴＲは、配列：

【化10】

であるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、本開示に従って利用される５’ＵＴＲは、配列：

【化11】

であるか、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、配列ＧＧＧＡＵＣＣＵＡＣＣであり得るか、またはそれを含み得る（例えば、ＷＯ２０１４／１４４１９６を参照）。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ＷＯ２０２１／１５６２６７の配列番号２３１～２５２、もしくは２２８４８～２２８７５のうちの１つに記載の配列または上記のいずれかの断片もしくはバリアントであり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ＷＯ２０１９／０７７００１Ａ１の請求項９に記載の、及び／または配列番号１～２０のうちの１つ以上の配列、または上記のいずれかの断片もしくはバリアントであり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ＷＯ２０１３／１４３７００に記載のもの、例えば、ＷＯ２０１３／１４３７００の配列番号１～１３６３、配列番号１３９５、配列番号１４２１、及び配列番号１４２２のうちの１つ以上、または上記のいずれかの断片もしくはバリアントであり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、５’－ＵＴＲは、ＷＯ２０１６／１０７８７７、例えば、ＷＯ２０１６／１０７８７７の配列番号２５～３０もしくは３１９～３８２に記載の５’ＵＴＲ、または上記のいずれかの断片もしくはバリアントであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、５’－ＵＴＲは、ＷＯ２０１７／０３６５８０、例えば、ＷＯ２０１７／０３６５８０の配列番号１～１５１に記載の５’ＵＴＲ、または前述のいずれかの断片もしくはバリアントであるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、ＷＯ２０１６／０２２９１４、例えば、ＷＯ２０１６／０２２９１４の配列番号３～１９に記載の５’－ＵＴＲ、または上記のいずれかの断片もしくはバリアントであるか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、５’ＵＴＲは、供給源及び／または異なる供給源からの第１のポリヌクレオチド断片及び第２のポリヌクレオチド断片を含み得る（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２９３６２５号及びＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０６９１５５に記載の５’ＵＴＲを参照されたい）。いくつかの実施形態では、本開示に従って利用される５’ＵＴＲは、例えば、本明細書に開示されるようなキャップ近位配列を含む。いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、５’－キャップに隣接する配列を含む。いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドの＋１、＋２、＋３、＋４、及び／または＋５位にヌクレオチドを含む。

【0141】

いくつかの実施形態では、Ｃａｐ構造は、キャップ近位配列の１つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｐ構造は、ｍ７グアノシンキャップ及びＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド＋１（Ｎ１）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｐ構造は、ｍ７グアノシンキャップ及びＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド＋２（Ｎ２）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｐ構造は、ｍ７グアノシンキャップ及びＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド＋１及び＋２（Ｎ１及びＮ２）を含む。

【0142】

当業者は、本開示を読むことで、いくつかの実施形態では、キャップ近位配列の１つ以上の残基（例えば、残基＋１、＋２、＋３、＋４、及び／または＋５のうちの１つ以上）が、（例えば、Ｃａｐ１構造などの）キャップ実体に含まれていることにより、ＲＮＡに含まれ得ることを理解するであろう。代替的に、いくつかの実施形態では、キャップ近位配列の残基の少なくともいくつかは、（例えば、Ｔ７ポリメラーゼなどのポリメラーゼによって）酵素的に付加され得る。例えば、ある特定の例示的な実施形態では、ｍ２７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ１２’－Ｏ）ＡｐＧキャップが利用され、＋１及び＋２が、キャップの（ｍ１２’－Ｏ）Ａ及びＧ残基であり、＋３、＋４、及び＋５がポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ）によって付加される。

【0143】

いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、Ｃａｐ構造のＮ１及びＮ２を含み、Ｎ１及びＮ２は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＵである。

【0144】

いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＵである。

【0145】

いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣであり、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣであり、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣであり、Ｎ２はＵである。

【0146】

いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧであり、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧであり、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧであり、Ｎ２はＵである。

【0147】

いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵであり、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵであり、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵであり、Ｎ２はＵである。

【0148】

いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、Ｃａｐ構造のＮ１及びＮ２ならびにＮ３、Ｎ４及びＮ５を含み、Ｎ１～Ｎ５は、ＲＮＡポリヌクレオチドの＋１、＋２、＋３、＋４、及び／または＋５位に対応する。

【0149】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0150】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0151】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0152】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0153】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0154】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0155】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0156】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0157】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0158】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0159】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0160】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0161】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0162】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0163】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0164】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0165】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0166】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0167】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0168】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0169】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0170】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0171】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0172】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0173】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0174】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0175】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0176】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0177】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0178】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0179】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0180】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0181】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0182】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0183】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0184】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0185】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0186】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0187】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0188】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0189】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0190】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0191】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0192】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0193】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0194】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0195】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0196】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0197】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0198】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0199】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0200】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＡである。

【0201】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0202】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0203】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0204】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＧである。

【0205】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0206】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0207】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0208】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＣである。

【0209】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0210】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0211】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0212】

いくつかの実施形態では、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、またはＮ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ３はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ４はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ５はＵである。

【0213】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される５’ＵＴＲは、例えば、本明細書に開示されるようなキャップ近位配列を含む。いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、５’－キャップに隣接する配列を含む。いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、ＲＮＡポリヌクレオチドの＋１、＋２、＋３、＋４、及び／または＋５位にヌクレオチドを含む。

【0214】

いくつかの実施形態では、Ｃａｐ構造は、キャップ近位配列の１つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｐ構造は、ｍ７グアノシンキャップ及びＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド＋１（Ｎ１）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｐ構造は、ｍ７グアノシンキャップ及びＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド＋２（Ｎ２）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｐ構造は、ｍ７グアノシンキャップ及びＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド＋１及び＋２（Ｎ１及びＮ２）を含む。

【0215】

いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、各々独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択される。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＵである。

【0216】

いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、各々独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択される。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＵである。

【0217】

いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＵである。

【0218】

いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣであり、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣであり、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣであり、Ｎ２はＵである。

【0219】

いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧであり、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧであり、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧであり、Ｎ２はＵである。

【0220】

いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵであり、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵであり、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵであり、Ｎ２はＵである。

【0221】

いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、Ｃａｐ構造のＮ１及びＮ２、及びＡ３Ａ４Ｘ５を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、各々独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択される。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ５は、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択される。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＡである。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＣである。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＵである。

【0222】

いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、キャッピング構造のＮ１及びＮ２、及びＣ３Ａ４Ｘ５を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、各々独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択される。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ５は、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択される。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＡである。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＣである。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＵである。

【0223】

いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、キャッピング構造のＮ１及びＮ２、ならびにＸ３Ｙ４Ｘ５を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、各々独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択される。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及びＸ５は、各々独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択される。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５はＡである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５はＣである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５はＵである。いくつかの実施形態では、Ｙ４はＣではない。いくつかの実施形態では、Ｙ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｙ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｙ４はＵである。

【0224】

いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、キャッピング構造のＮ１及びＮ２、ならびにＸ３Ｙ４Ｘ５を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、各々独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択される。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及びＸ５は、各々独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択される。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５はＡである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５はＣである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５はＵである。いくつかの実施形態では、Ｙ４はＧではない。いくつかの実施形態では、Ｙ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｙ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｙ４はＵである。

【0225】

いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、キャッピング構造のＮ１及びＮ２、ならびにＡ３Ｃ４Ａ５を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、各々独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択される。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。

【0226】

いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、キャッピング構造のＮ１及びＮ２、ならびにＡ３Ｕ４Ｇ５を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、各々独立して、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択される。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。

【0227】

いくつかの実施形態では、Ｃａｐ構造は、キャップ近位配列の１つ以上のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｐ構造は、ｍ７グアノシンキャップ及びＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド＋１（Ｎ１）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｐ構造は、ｍ７グアノシンキャップ及びＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド＋２（Ｎ２）を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｐ構造は、ｍ７グアノシンキャップ及びＲＮＡポリヌクレオチドのヌクレオチド＋１及び＋２（Ｎ１及びＮ２）を含む。

【0228】

いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＵである。

【0229】

いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ２はＵである。

【0230】

いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＵである。

【0231】

いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣであり、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣであり、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＣであり、Ｎ２はＵである。

【0232】

いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧであり、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧであり、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＧであり、Ｎ２はＵである。

【0233】

いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵであり、Ｎ２はＡである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵであり、Ｎ２はＣである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＵであり、Ｎ２はＵである。

【0234】

いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、Ｃａｐ構造のＮ１及びＮ２、及びＡ３Ａ４Ｘ５を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ５は、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵから選択される。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＡである。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＣである。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＵである。

【0235】

いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、Ｃａｐ構造のＮ１及びＮ２、及びＣ３Ａ４Ｘ５を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＡである。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＣである。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ５はＵである。

【0236】

いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、キャッピング構造のＮ１及びＮ２、ならびにＸ３Ｙ４Ｘ５を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及びＸ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５は、Ａである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５は、Ｃである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５は、Ｇである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５は、Ｕである。いくつかの実施形態では、Ｙ４は、Ｃではない。いくつかの実施形態では、Ｙ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｙ４はＧである。いくつかの実施形態では、Ｙ４はＵである。

【0237】

いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、キャッピング構造のＮ１及びＮ２、ならびにＸ３Ｙ４Ｘ５を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及びＸ５は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５は、Ａである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５は、Ｃである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５は、Ｇである。いくつかの実施形態では、Ｘ３及び／またはＸ５は、Ｕである。いくつかの実施形態では、Ｙ４は、Ｇではない。いくつかの実施形態では、Ｙ４はＡである。いくつかの実施形態では、Ｙ４はＣである。いくつかの実施形態では、Ｙ４はＵである。

【0238】

いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、Ｃａｐ構造のＮ１及びＮ２、ならびにＡ３Ｃ４Ａ５を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。

【0239】

いくつかの実施形態では、キャップ近位配列は、Ｃａｐ構造のＮ１及びＮ２、ならびにＡ３Ｕ４Ｇ５を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ１及びＮ２は、任意のヌクレオチド、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵである。いくつかの実施形態では、Ｎ１はＡであり、Ｎ２はＧである。

【0240】

例示的な５’ＵＴＲとしては、ヒトアルファグロビン（ｈＡｇ）５’ＵＴＲもしくはその断片、ＴＥＶ５’ＵＴＲもしくはその断片、ＨＳＰ７０ ５’ＵＴＲもしくはその断片、またはｃ－Ｊｕｎ ５’ＵＴＲもしくはその断片が挙げられる。

【0241】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡは、ｈＡｇ ５’ＵＴＲまたはその断片を含む。

【0242】

３’ＵＴＲ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＲＮＡは、３’－ＵＴＲを含む。「３’非翻訳領域」または「３’－ＵＴＲ」または「３’－ＵＴＲ要素」は、当業者によって認識され、理解されるであろう。当該技術分野で知られているように、３’ＵＴＲは、典型的には、コード配列の３’（すなわち、下流）に位置し、かつタンパク質に翻訳されない核酸分子の一部である。いくつかの実施形態では、３’－ＵＴＲは、コード配列と（任意選択の）末端ポリ（Ａ）配列との間に位置し得る。いくつかの実施形態では、３’－ＵＴＲは、調節要素と称され得るような、遺伝子発現を制御するための要素を含み得る。そのような調節要素は、例えば、リボソーム結合部位、ｍｉＲＮＡ結合部位などであり得るか、またはそれらを含み得る。

【0243】

存在する場合、３’－ＵＴＲは、ポリペプチド（例えば、タンパク質）コード領域の終端コドンの下流の３’末端に位置するが、「３’－ＵＴＲ」という用語は、好ましくは、ポリ（Ａ）配列を含まない。したがって、３’－ＵＴＲは、（存在する場合）ポリ（Ａ）配列の上流であり、例えば、ポリ（Ａ）配列に直接隣接する。

【0244】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡは、Ｆ要素及び／またはＩ要素を含む３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲまたはそれに対する近位配列は、制限部位を含む。いくつかの実施形態では、制限部位は、ＢａｍＨＩ部位である。いくつかの実施形態では、制限部位は、ＸｈｏＩ部位である。

【0245】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ構築物は、Ｆ要素を含む。いくつかの実施形態では、Ｆ要素配列は、スプリットのアミノ末端エンハンサー（ＡＥＳ）の３’－ＵＴＲである。

【0246】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示するＲＮＡは、ＣＵＧＧＵＡＣＵＧＣＡＵＧＣＡＣＧＣＡＡＵＧＣＵＡＧＣＵＧＣＣＣＣＵＵＵＣＣＣＧＵＣＣＵＧＧＧＵＡＣＣＣＣＧＡＧＵＣＵＣＣＣＣＣＧＡＣＣＵＣＧＧＧＵＣＣＣＡＧＧＵＡＵＧＣＵＣＣＣＡＣＣＵＣＣＡＣＣＵＧＣＣＣＣＡＣＵＣＡＣＣＡＣＣＵＣＵＧＣＵＡＧＵＵＣＣＡＧＡＣＡＣＣＵＣＣＣＡＡＧＣＡＣＧＣＡＧＣＡＡＵＧＣＡＧＣＵＣＡＡＡＡＣＧＣＵＵＡＧＣＣＵＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＣＡＣＧＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＧＵＧＡＵＵＡＡＣＣＵＵＵＡＧＣＡＡＵＡＡＡＣＧＡＡＡＧＵＵＵＡＡＣＵＡＡＧＣＵＡＵＡＣＵＡＡＣＣＣＣＡＧＧＧＵＵＧＧＵＣＡＡＵＵＵＣＧＵＧＣＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣ（配列番号６０）を含む配列を有する３’ＵＴＲに対して９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、または８０％の同一性を有する３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡは、配列番号６０に提供される３’ＵＴＲを含む。

【0247】

いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、ＷＯ２０１７／０６０３１４に記載のＦＩ要素である。

【0248】

ほんの数例を挙げると、いくつかの実施形態では、利用される３’ＵＴＲは、Ｘｅｎｏｐｕｓ β－グロビンＵＴＲ及びヒトβ－グロビンＵＴＲを含む、グロビンＵＴＲなどの遺伝子からの３’ＵＴＲであり得るか、またはそれを含み得る（例えば、８２７８０６３、９０１２２１９、ＵＳ２０１１／００８６９０７を参照されたい）。いくつかの実施形態では、いくつかの細胞型において向上した安定性を有する修飾β－グロビン構築物を利用してもよく、そのような構築物は、２つの連続ヒトβ－グロビン３’ＵＴＲを頭部から尾部へクローニングすることによって作製されたものとして報告されている（ＵＳ２０１２／０１９５９３６、Ｗ０２０１４／０７１９６３）。加えて、α２－グロビン、αｌ－グロビン、ＵＴＲ、及びそれらのバリアントも、当該技術分野で既知である（Ｗ０２０１５／１０１４１５、Ｗ０２０１５／０２４６６７）。非特許文献中のｍＲＮＡ構築物に記載されている例示的な３’ＵＴＲとしては、ＣＹＢＡ（Ｆｅｒｉｚｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５）及びアルブミン（Ｔｈｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，２０１５）からのものが挙げられる。いくつかの実施形態では、例示的な３’ＵＴＲとしては、ウシまたはヒト成長ホルモン（野生型または修飾）（Ｗ０２０１３／１８５０６９、ＵＳ２０１４／０２０６７５３、Ｗ０２０１４１５２７７４）、ウサギβグロビン及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、α－グロビン３’ＵＴＲ、ならびにウイルスＶＥＥＶ ３’ＵＴＲ配列のものが挙げられ、また、当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、配列ＵＵＵＧＡＡＵＵ（Ｗ０２０１４／１４４１９６）が使用される。いくつかの実施形態では、ヒト及び／またはマウスリボソームタンパク質の３’ＵＴＲが使用される。いくつかの実施形態では、例としては、ｒｐｓ９ ３’ＵＴＲ（Ｗ０２０１５／１０１４１４）、ＦＩＧ４（Ｗ０２０１５／１０１４１５）、及びヒトアルブミン７（Ｗ０２０１５／１０１４１５）が挙げられる。いくつかの実施形態では、核酸は、少なくとも１つの異種３’－ＵＴＲを含み、少なくとも１つの異種３’－ＵＴＲは、ＰＳＭＢ３、ＡＬＢ７、アルファ－グロビン（「ｍｕａｇ」と称される）、ＣＡＳＰ１、ＣＯＸ６Ｂ１、ＧＮＡＳ、ＮＤＵＦＡ１、及びＲＰＳ９から選択される遺伝子の３’－ＵＴＲ、またはこれらの遺伝子のうちのいずれか１つの相同体、断片、またはバリアントに由来する核酸配列を含む。

【0249】

いくつかの実施形態では、利用される３’ＵＴＲは、例えば、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ２０１９／０７７００１Ａ１、特に、ＷＯ２０１９／０７７００１Ａ１の請求項９に例示され得る。いくつかの実施形態では、３’ＵＴＲは、ＷＯ２０１９／０７７００１Ａ１の配列番号２３～３４のうちの１つ、またはその断片もしくはバリアントであり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、本開示に従って利用される３’ＵＴＲは、配列：

【化12】

を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の３’ＵＴＲは、配列：

【化13】

を含む。
いくつかの実施形態では、核酸は、ＷＯ２０１６／１０７８７７に記載される３’－ＵＴＲを含み得る。いくつかの実施形態では、好適な３’－ＵＴＲは、ＷＯ２０１６／１０７８７７の配列番号１～２４及び配列番号４９～３１８、またはこれらの配列の断片もしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＷＯ２０１７／０３６５８０に記載の３’－ＵＴＲが利用され得る。いくつかの実施形態では、好適な３’－ＵＴＲは、ＷＯ２０１７／０３６５８０の配列番号１５２～２０４、またはこれらの配列の断片もしくはバリアントである。いくつかの実施形態では、ＷＯ２０１６／０２２９１４に記載されている３’－ＵＴＲが利用される。いくつかの実施形態では、３’－ＵＴＲは、ＷＯ２０１６／０２２９１４の配列番号２０～３６に記載の配列、またはこれらの配列の断片もしくはバリアントであるか、もしくはそれらを含む。

【0250】

ポリＡ
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）は、例えば、本明細書に記載されるようなポリアデニル酸（ポリＡ）配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ配列は、３’－ＵＴＲの下流に、例えば、３’－ＵＴＲに隣接して位置する。

【0251】

本明細書で使用される場合、「ポリ（Ａ）配列」または「ポリＡ尾部」という用語は、典型的には、ＲＮＡポリヌクレオチドの３’末端に位置するアデニル酸塩残基の中断されていない配列または中断された配列を指す。ポリ（Ａ）配列は、当業者に既知であり、本明細書に記載のＲＮＡにおける３’－ＵＴＲに続いてもよい。中断されていないポリ（Ａ）配列は、連続したアデニル酸塩残基を特徴とする。自然界では、中断されていないポリ（Ａ）配列が典型的である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、中断されていないポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、中断されたポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡは、転写後にテンプレート非依存性ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡの遊離３’末端に付着したポリ（Ａ）配列、またはＤＮＡによってコードされ、テンプレート依存性ＲＮＡポリメラーゼによって転写されるポリ（Ａ）配列を有することができる。

【0252】

約１２０個のＡヌクレオチドのポリ（Ａ）配列は、トランスフェクトされた真核細胞におけるＲＮＡのレベル、ならびにポリ（Ａ）配列の上流（５’）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるポリヌクレオチド（例えば、タンパク質）のレベルに有益な影響を有することが実証されている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９－４０１７）。

【0253】

いくつかの実施形態では、本開示によるポリ（Ａ）配列は、特定の長さに限定されず、いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、任意の長さである。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０、または少なくとも１００、及び最大１０００、最大５００、最大４００、最大３００、最大２００、または最大１５０個のＡヌクレオチド、特に約１２０個のＡヌクレオチドを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。この文脈において、「本質的にからなる」とは、ポリ（Ａ）配列中の大部分のヌクレオチド、典型的にはポリ（Ａ）配列中のヌクレオチドの数によって少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％がＡヌクレオチドであるが、残りのヌクレオチドが、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチド、例えば、Ｕヌクレオチド（ウリジル酸塩）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸塩）、またはＣヌクレオチド（シチジル酸塩）であることを可能にすることを意味する。この文脈において、「からなる」とは、ポリ（Ａ）配列中の全てのヌクレオチド、すなわち、ポリ（Ａ）配列中のヌクレオチドの数によって１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。「Ａヌクレオチド」または「Ａ」という用語は、アデニル酸塩を指す。

【0254】

いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、ＲＮＡ転写の間、例えば、インビトロで転写されたＲＮＡの調製の間、コード鎖に相補的な鎖に反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸塩）を含むＤＮＡテンプレートに基づいて付着する。ポリ（Ａ）配列をコードするＤＮＡ配列（コード鎖）は、ポリ（Ａ）カセットと称される。

【0255】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡのコード鎖に存在するポリ（Ａ）カセットは、本質的に、ｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、及びｄＴ）のランダム配列によって中断される。かかるランダム配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。かかるカセットは、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／００５３２４Ａ１に開示される。ＷＯ２０１６／００５３２４Ａ１に開示される任意のポリ（Ａ）カセットを、本開示に従って使用してもよい。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）の等しい分布を有し、例えば、５～５０ヌクレオチドの長さを有するランダム配列によって中断されるポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルでは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるプラスミドＤＮＡの一定の増殖を示し、ＲＮＡレベルでは、やはり、ＲＮＡの安定性及び翻訳効率を支持することに関して有益な特性を包含する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡポリヌクレオチドに含まれるポリ（Ａ）配列は、本質的に、Ａヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）のランダム配列によって中断される。かかるランダム配列は、５～５０、１０～３０、または１０～２０ヌクレオチド長であり得る。

【0256】

いくつかの実施形態では、Ａヌクレオチド以外のヌクレオチドは、その３’末端でポリ（Ａ）配列に隣接しておらず、すなわち、ポリ（Ａ）配列は、マスクされていないか、またはその３’末端でＡ以外のヌクレオチドが続いていない。

【0257】

いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０、または少なくとも１００、及び最大５００、最大４００、最大３００、最大２００、または最大１５０個のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０、または少なくとも１００、及び最大５００、最大４００、最大３００、最大２００、または最大１５０個のヌクレオチドから本質的になってもよい。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも８０、または少なくとも１００、及び最大５００、最大４００、最大３００、最大２００、または最大１５０個のヌクレオチドからなってもよい。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも１００個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、約１５０個のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、約１２０個のヌクレオチドを含む。

【0258】

いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、約５０以上、約６０以上、約７０以上、約８０以上、約９０以上、約１００以上、約１２０、または約１５０もしくは約２００などの特定の数のアデノシンを含む。いくつかの実施形態では、ストリング構築物のポリＡ尾部は、２００個以下のＡ残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ストリング構築物のポリＡ尾部は、約２００個のＡ残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ストリング構築物のポリＡ尾部は、１８０個以下のＡ残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ストリング構築物のポリＡ尾部は、約１８０個のＡ残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、１５０個以下の残基を含み得る。

【0259】

いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、約１０～約５００個のアデノシンヌクレオチド、約１０～約２００個のアデノシンヌクレオチド、約４０～約２００個のアデノシンヌクレオチド、または約４０～約１５０個のアデノシンヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列の長さは、少なくとも約１０、５０、６４、７５、１００、２００、３００、４００、もしくは５００個またはそれを超えるアデノシンヌクレオチドでもよい。

【0260】

いくつかの実施形態では、核酸は、約３０個～約２００個のアデノシンヌクレオチドを含む少なくとも１つのポリ（Ａ）配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、約６４個のアデノシンヌクレオチド（Ａ６４）を含む。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、約１００個のアデノシンヌクレオチド（Ａ１００）を含む。いくつかの実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、約１５０個のアデノシンヌクレオチドを含む。

【0261】

いくつかの実施形態では、核酸は、約１００個のアデノシンヌクレオチドを含む少なくとも１つのポリ（Ａ）配列を含み、ポリ（Ａ）配列は、非アデノシンヌクレオチドによって、好ましくは１０個の非アデノシンヌクレオチドによって中断される（Ａ３０－Ｎ１０－Ａ７０）。

【0262】

オープンリーディングフレーム
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み、ＯＲＦは、例えば、目的のポリペプチドをコードするか、または目的の複数のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡは、複数のＯＲＦ（例えば、複数のポリペプチドをコードする）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書の技術に従って産生されるＲＮＡは、複数のポリペプチドをコードする単一のＯＲＦを含む。いくつかのそのような実施形態では、ポリペプチドは、抗原またはそのエピトープ（例えば、関連する抗原）であるか、またはそれを含む。

【0263】

いくつかの例を挙げると、いくつかの実施形態では、コードされたポリペプチドは、提供されたＲＮＡが投与される対象で発現されるとき、免疫応答（例えば、抗原またはその１つ以上のエピトープに特異的に向けられた抗体及び／またはＴ細胞によって特徴付けられる）となるように、抗原またはそのエピトープであり得るか、抗原またはそのエピトープを含み得、いくつかのそのような実施形態では、例えば、複数のポリペプチド要素を含むコードされたポリペプチドは、ポリエピトープ（ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｉｃ）であってもよく、それらの各々は、少なくとも１つのエピトープを含み、互いに連結され、任意選択的にリンカーによって分離される。当該技術分野で理解されるように、いくつかの実施形態では、ポリエピトープ構築物は、自然界で同じタンパク質の異なる部分に見出される個々のエピトープを含み得る。代替的にまたは追加的に、いくつかの実施形態では、ポリエピトープ構築物は、自然界の異なるタンパク質に見出される個々のエピトープを含み得る。当業者は、本開示に従って有用な、所望のポリエピトープ構築物、及び／またはその中に含まれるための抗原及び／またはエピトープの選択に関連する様々な考慮事項を認識するであろう（例えば、ＷＯ２０１４０８２７２９、ＷＯ２０１２１５９７５４、ＷＯ２０１７１７３３２１、ＷＯ２０１４１８０６５９、ＷＯ２０１６１２８３７６２、ＷＯ２０１７１９４６１０、ＷＯ２０１１１４３６５６、ＷＯ２０１５１０３０３７、Ｎｉｅｌｓｅｎ ＪＳ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１０ Ａｕｇ ３１；３６０（１－２）：１４９－５６．，“Ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．”Ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｅ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ，ｗｗｗ．ｃｒｅａｔｉｖｅ－ｂｉｏｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｖａｃｃｉｎｅ／ｐｏｌｙｅｐｉｔｏｐｅ－ｖａｃｃｉｎｅ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍ．、Ｌｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ １３，５６（２０２１）．、Ｃａｆｒｉ Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １３０，５９７６－５９８８（２０２０）、Ｋｈａｉｒｋｈａｈ Ｎ．ｅｔ ａｌ．（２０２０）ＰＬＯＳ ＯＮＥ １５（１０）：ｅ０２４０５７７．を参照されたい）。

【0264】

いくつかの実施形態では、関連する抗原は、感染性抗原（すなわち、感染性ウイルス、細菌、真菌などの感染性因子に関連する抗原）及び／またはがん抗原（例えば、腫瘍のクラスまたは特定の腫瘍に関連する抗原、いくつかの実施形態では、がん関連抗原は、新抗原または新エピトープであり得るか、またはそれを含み得る）、またはそのエピトープであり得るか、またはそれを含み得る。

【0265】

代替的または追加的に、いくつかの実施形態では、ＯＲＦは、例えば、抗体またはその部分（例えば、抗原結合部分）、酵素、サイトカイン、治療用タンパク質などをコードし得る（例えば、ＷＯ２０１７１８６９２８、ＷＯ２０１７１９１２７４、ＵＳ１０６６９３２２、Ｄａｍｍｅｓ ｅｔ ａｌ Ｔｒｅｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ ４：７５５，２０２０－１０－０１、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １９，４４１－４４２（２０２０）、Ｄａｍａｓｅ ｅｔ ａｌ Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８ Ｍａｒｃｈ ２０２１を参照されたい）。

【0266】

いくつかの実施形態では、本開示による使用のためのＯＲＦは、例えば、哺乳類細胞において機能的であるシグナル配列を含むポリペプチドをコードする。

【0267】

いくつかの実施形態では、利用されるシグナル配列は、自然界では、コードされたポリペプチドと会合する（例えば、連結される）という点で「内在的」である。

【0268】

いくつかの実施形態では、利用されるシグナル配列は、コードされたポリペプチドに対して異種であり、例えば、その配列がコードされたポリペプチドに含まれるポリペプチド（例えば、タンパク質）の天然部分ではない。

【0269】

いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、典型的には、約１５～３０アミノ酸の長さを特徴とする配列である。

【0270】

多くの実施形態では、シグナルペプチドは、本明細書に記載のコードされたポリペプチドのＮ末端に配置されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、好ましくは、それらが関連する本開示のＲＮＡによってコードされるポリペプチドの、規定の細胞区画、好ましくは、細胞表面、小胞体（ＥＲ）、またはエンドソーム－リソソーム区画への輸送を可能にする。

【0271】

いくつかの実施形態では、シグナル配列は、Ｓ１Ｓ２シグナルペプチド（ａａ１－１９）、免疫グロブリン分泌シグナルペプチド（ａａ１－２２）、ＨＳＶ－１ ｇＤシグナルペプチド（ＭＧＧＡＡＡＲＬＧＡＶＩＬＦＶＶＩＶＧＬＨＧＶＲＳＫＹ）、ＨＳＶ－２ ｇＤシグナルペプチド（ＭＧＲＬＴＳＧＶＧＴＡＡＬＬＶＶＡＶＧＬＲＶＶＣＡ）、ヒトＳＰＡＲＣシグナルペプチド、ヒトインスリンアイソフォーム１シグナルペプチド、ヒトアルブミンシグナルペプチド等から選択される。当業者は、例えば、ＷＯ２０１７／０８１０８２（例えば、配列番号１～１１１５及び１７２８、またはそれらの断片バリアント）ならびにＷＯ２０１９００８００１に開示されるような他の分泌シグナルペプチドを認識するであろう。

【0272】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ配列は、表１に列挙されるもの、または少なくともそれに対して１、２、３、４、または５つのアミノ酸差を有する配列などのシグナル配列（例えば、分泌配列）を含むか、またはそうでなければそれに連結され得るエピトープをコードする。いくつかの実施形態では、ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴなどのシグナル配列、または少なくともそれに対して１、２、３、４、または最大５つのアミノ酸差を有する配列が利用される。いくつかの実施形態では、ＭＦＶＦＬＶＬＬＰＬＶＳＳＱＣＶＮＬＴなどの配列、またはそれに対して１、２、３、４、もしくは最大５つのアミノ酸差を有する配列が利用される。

【0273】

いくつかの実施形態では、シグナル配列は、以下の表１に含まれるもの及び／または以下の表２の配列によってコードされるものから選択される。

【表1】

【表2】

【0274】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように利用されるＲＮＡは、多量体化要素（例えば、異種多量体化要素）をコードする。いくつかの実施形態では、異種多量体化要素は、二量体化、三量体化、または四量体化要素を含む。

【0275】

いくつかの実施形態では、多量体化要素は、ＷＯ２０１７／０８１０８２（例えば、配列番号１１１６～１１６７、またはその断片もしくはバリアント）に記載されるものである。

【0276】

例示的な三量体化及び四量体化要素としては、操作されたロイシンジッパー、腸内細菌ファージＴ４からのフィブリチンフォルドンドメイン、ＧＣＮ４ｐｌｌ、ＧＣＮ４－ｐｌｌ、及びｐ５３が挙げられるが、これらに限定されない。

【0277】

いくつかの実施形態では、提供されるコードされたポリペプチド（複数可）は、三量体複合体を形成することができる。例えば、利用されるコードされたポリペプチド（複数可）は、例えば、本明細書に記載のコードされたポリペプチド（複数可）を含むアミノ酸配列の特定の三量体複合体などの多量体複合体の形成を可能にするドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、多量体複合体の形成を可能にするドメインは、三量体化ドメイン、例えば、本明細書に記載の三量体化ドメインを含む。

【0278】

いくつかの実施形態では、コードされたポリペプチド（複数可）は、例えば、その免疫原性を増大させるために、Ｔ４－フィブリチン由来の「フォルドン」三量体化ドメインを付加することによって修飾され得る。

【0279】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、膜貫通ドメインなどの膜会合要素（例えば、異種膜会合要素）をコードする。

【0280】

膜貫通ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはコードされたポリペプチドの内部であり得る。膜貫通要素のコード配列は、典型的には、それが連結される配列（例えば、ポリペプチド（複数可）をコードする配列）のコード配列のフレーム（すなわち、同じリーディングフレーム）、５’、３’、または内部に配置される。

【0281】

いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）、ＨＩＶ－１のＥｎｖ、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、マウス乳がん腫瘍ウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のＧタンパク質、狂犬病ウイルス、または７つの膜貫通ドメイン受容体の膜貫通ドメインを含むか、またはそれである。

【0282】

コドン最適化
いくつかの実施形態では、本開示のＯＲＦコードポリペプチドは、コドン最適化されている。コドン最適化方法は、当該技術分野で既知である。例えば、本明細書で提供される配列のうちのいずれか１つ以上のＯＲＦが、コドン最適化され得る。いくつかの実施形態では、コドン最適化は、標的生物及び宿主生物におけるコドン頻度を一致させて、適切な折り畳みを確実にするために；ＧＣ含量をバイアスして、ｍＲＮＡ安定性を増加させるか、もしくは二次構造を低減するために；遺伝子構築もしくは発現を損なう可能性のあるタンデムリピートコドンもしくは塩基ランを最小化するために；転写及び翻訳制御領域をカスタマイズするために；ポリペプチド輸送配列を挿入もしくは除去するために；コードされたポリペプチドにおける翻訳後修飾部位（例えば、グリコシル化部位）を除去／付加するために；タンパク質ドメインを追加、除去、もしくはシャッフルするために；制限部位を挿入もしくは削除するために；リボソーム結合部位及びｍＲＮＡ分解部位を修飾するために；ポリペプチドの様々なドメインが適切に折り畳まれるように翻訳速度を調整するために；またはポリヌクレオチド内の問題の二次構造を低減または排除するために使用され得る。コドン最適化ツール、アルゴリズム、及びサービスは、当該技術分野で公知であり、非限定的な例としては、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ ＣＡ）からのサービス及び／または独自の方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列は、最適化アルゴリズムを使用して最適化される。

【0283】

いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するか、または野生型の配列ＯＲＦ（例えば、ポリペプチドをコードする天然に存在するか、または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して９５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するか、または野生型の配列（例えば、ポリペプチドをコードする天然に存在するか、または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して９０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するか、または野生型の配列（例えば、ポリペプチドをコードする天然に存在するか、または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して８５％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するか、または野生型の配列（例えば、ポリペプチドをコードする天然に存在するか、または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して８０％未満の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するか、または野生型の配列（例えば、ポリペプチドをコードする天然に存在するか、または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して７５％未満の配列同一性を共有する。

【0284】

いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するか、または野性型の配列（例えば、ポリペプチドをコードする天然に存在するか、または野性型のｍＲＮＡ配列）に対して６５％～８５％（例えば、約６７％～約８５％または約６７％～約８０％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、天然に存在するか、または野生型の配列（例えば、ポリペプチドをコードする天然に存在するか、または野生型のｍＲＮＡ配列）に対して６５％～７５％または約８０％の配列同一性を共有する。

【0285】

いくつかの実施形態では、コドン最適化配列は、非コドン最適化配列によってコードされるポリペプチドと免疫原性が同じか、またはそれよりも免疫原性が高い（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、または少なくとも２００％高い）ポリペプチド（例えば、抗原）をコードする。

【0286】

いくつかの実施形態では、哺乳動物宿主細胞にトランスフェクションされた場合、修飾ｍＲＮＡは、１２～１８時間、または１８時間超、例えば、２４、３６、４８、６０、７２、または７２時間超の安定性を有し、哺乳動物宿主細胞による発現が可能である。

【0287】

いくつかの実施形態では、コドン最適化ＲＮＡは、Ｇ／Ｃのレベルが向上され、及び／またはＡ／Ｕが向上されたものであり得る。いくつかの実施形態では、核酸分子（例えば、ｍＲＮＡ）のＧ／Ｃ含量は、ＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。グアニン（Ｇ）及び／またはシトシン（Ｃ）残基の量が増加したＲＮＡは、大量のアデニン（Ａ）及びチミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ）ヌクレオチドを含有するＲＮＡより機能的に安定し得る。一例として、ＷＯ０２／０９８４４３は、翻訳領域内の配列修飾によって安定化されたｍＲＮＡを含有する医薬組成物を開示している。いくつかの実施形態では、遺伝暗号の縮退のために、該修飾は、得られるアミノ酸を変更することなく、例えば、より大きなＲＮＡ安定性を促進するものに既存のコドンを置換することによって機能する。いくつかの実施形態では、該アプローチは、該ＲＮＡのコード領域に限定される。

【0288】

ヌクレオチド含有量
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＲＮＡ及び／またはＯＲＦは、ヌクレオチド三リン酸の特定の組成物を含み、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるようなＲＮＡ及び／またはＯＲＦは、ヌクレオチド三リン酸の任意の特定の組成物を含むことに限定されない。

【0289】

いくつかの実施形態では、ＯＲＦ及び／またはＲＮＡ分子は、ｘ個の総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）対総グアノシン及び／または１つ以上の機能的グアノシン類似体（複数可）のモル比を含む。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ及び／またはＲＮＡ分子は、総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）対総ウリジン及び／または１つ以上の機能的ウリジン類似体（複数可）のモル比ｙを含む。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ及び／またはＲＮＡ分子は、総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）対総アデノシン及び／または１つ以上の機能的アデノシン類似体（複数可）のモル比ｚを含む。いくつかのそのような実施形態では、ｘのモル比は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０である。いくつかのそのような実施形態では、ｙのモル比は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０である。いくつかのそのような実施形態では、ｙのモル比は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０である。いくつかのそのような実施形態では、ｚのモル比は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０である。

【0290】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ及び／またはＯＲＦにおける関連するモル比は、反応混合物における対応する比とは異なる。

【0291】

いくつかの実施形態では、ＯＲＦ及び／またはＲＮＡ分子は、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％以上のＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）のヌクレオチド含有量を含む。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ及び／またはＲＮＡ分子は、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％以上のＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）のヌクレオチド含有量を含む。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ及び／またはＲＮＡ分子は、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％以上のＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）のヌクレオチド含有量を含む。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ及び／またはＲＮＡ分子は、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％以上のＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）のヌクレオチド含有量を含む。

【0292】

いくつかの実施形態では、ＯＲＦ及び／またはＲＮＡ分子は、総アデノシン及び／または１つ以上の機能的アデノシン類似体（複数可）対総グアノシン及び／または１つ以上の機能的グアノシン類似体（複数可）のモル比ｖを含む。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ及び／またはＲＮＡ分子は、総アデノシン及び／または１つ以上の機能的アデノシン類似体（複数可）対総ウリジン及び／または１つ以上の機能的ウリジン類似体（複数可）のモル比ｗを含む。いくつかの実施形態では、ＯＲＦ及び／またはＲＮＡ分子は、総アデノシン及び／または１つ以上の機能的アデノシン類似体（複数可）対総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）のモル比ｑを含む。いくつかのそのような実施形態では、ｖのモル比は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０である。いくつかのそのような実施形態では、ｗのモル比は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０である。いくつかのそのような実施形態では、ｑのモル比は、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０である。

【0293】

産生
いくつかの実施形態では、本開示によって提供される技術は、ＩＶＴによって、例えば、バイオリアクタ内で、ＲＮＡを合成することによって、ＲＮＡ組成物及び／または調製物（例えば、大規模バッチ調製物を含む医薬品グレードＲＮＡ調製物）の産生を達成する。いくつかの実施形態では、産生されたＲＮＡを含む組成物及び／または調製物は、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも１．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも６ｍｇ／ｍＬ以上を含む）の特定の濃度のＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、産生されたＲＮＡは、１．５ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬまたは２ｍｇ／ｍＬ～４ｍｇ／ｍＬの濃度で存在してもよい。

【0294】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ（例えば、治療用ｍＲＮＡ）は、ＩＶＴによって、例えば、バイオリアクタ内で、例えば、少なくとも１つのＲＮＡ－ポリメラーゼ及びその適切なヌクレオチド三リン酸塩またはバリアント（例えば、修飾されたリボヌクレオチド三リン酸塩）を含む適切な試薬の存在下で、ＤＮＡテンプレートから合成される。いくつかの実施形態では、ＩＶＴに有用であるバイオリアクタは、例えば、少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０リットル以上を含む、少なくとも１リットルのＩＶＴ反応体積に十分な大きさである。いくつかの実施形態では、商業規模のＩＶＴに特に有用なバイオリアクタは、例えば、少なくとも２５、３０、４０、４５、５０リットル、またはそれ以上を含む、少なくとも２０リットルのＩＶＴ反応体積に十分な大きさである。

【0295】

例示的な出発材料
ＤＮＡテンプレート
当業者は、核酸テンプレート（例えば、ＤＮＡテンプレート）が、ＲＮＡ（例えば、一本鎖ＲＮＡ、例えば、治療用ＲＮＡ）の合成を指示するために使用されることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、直鎖ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡは、例えば、遺伝子合成、組換えＤＮＡ技術、またはそれらの組み合わせを含む、当該技術分野で既知の方法を使用して取得または生成されることができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、目的の転写された領域をコードする（例えば、本明細書に記載のＲＮＡをコードする）ヌクレオチド配列、及びＩＶＴで使用するために選択されたＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、目的の複数の転写された領域をコードするヌクレオチド配列、及びＩＶＴで使用するために選択されたＲＮＡポリメラーゼによって認識される１つ以上のプロモーター配列を含む。例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎ４ビリオンＲＮＡポリメラーゼ、またはそれらのバリアントもしくは機能ドメイン）を含む、様々なＲＮＡポリメラーゼは、当該技術分野において公知である。当業者は、本明細書で利用されるＲＮＡポリメラーゼが、組換えＲＮＡポリメラーゼ及び／または精製されたＲＮＡポリメラーゼであってもよく、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼ（複数可）に加えて他の成分を含有する細胞抽出物の一部としてではなく、及び／または野生ポリメラーゼのバリアントであり得ることを容易に理解するであろう（例えば、重合活性を付与するのに十分な１つ以上の特徴的な配列要素を、そのような野生型ポリメラーゼと共有する、及び／またはそのような野生型ポリメラーゼと少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％＜９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を共有する）。いくつかの実施形態では、利用されるポリメラーゼは、（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓなどの供給源からの）市販のポリメラーゼである。当業者は、選択されたＲＮＡポリメラーゼのための適切なプロモーター配列を認識するであろう。いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む。

【0296】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、本明細書に記載のＲＮＡをコードするヌクレオチド配列（例えば、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、任意選択的に、例えば、ポリＡ尾部、３’ＵＴＲ、及び／または５’ＵＴＲなどを含む、本明細書に記載のＲＮＡの特徴的な要素をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む）を含む。いくつかの実施形態では、そのようなコード配列は、遺伝子合成によって生成され得る。いくつかの実施形態では、そのようなコード配列は、当該技術分野で知られている任意の適切なクローニング方法（例えば、コールド融合クローニング、ギブソンアセンブリなど）によってベクターに挿入され得る。

【0297】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、（例えば、直鎖化に利用される）適切な制限エンドヌクレアーゼの認識配列、適切な耐性遺伝子、及び／または適切な複製起点のうちの１つ以上を更に含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、適切な制限エンドヌクレアーゼ（例えば、限定されないが、クラスＩＩ制限エンドヌクレアーゼなどの直鎖化に利用される）、適切な耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子に限定されない）、及び適切な複製起点の認識配列を更に含み得る。

【0298】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、プラスミドＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅され得る。いくつかの実施形態では、プラスミドＤＮＡは、例えば、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））から得られ、続いて、エンドトキシン及び動物産物を含まないプラスミド単離手順を経て得ることができる。

【0299】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレートは、ＰＣＲベースの増幅の非存在下で直鎖化プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）テンプレートであり得る。いくつかのそのような実施形態では、（例えば、本明細書に記載されるような）目的のｐＤＮＡについての細胞バンクまたは細胞ストックは、安定し得る。例えば、いくつかの実施形態では、そのような細胞バンクまたは細胞ストックは、所定の仕様を有する目的のｐＤＮＡテンプレート（例えば、本明細書に記載されるような）を含むように遺伝子操作されている細菌細胞（例えば、ＤＨ１０Ｂ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞などのＥ．ｃｏｌｉ細胞）の凍結ストックを含み得る。いくつかの実施形態では、ｐＤＮＡは、プロモーター配列（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ）を含有する。いくつかの実施形態では、ｐＤＮＡは、（例えば、直鎖化のための）エンドヌクレアーゼの認識配列を含有する。いくつかの実施形態では、ｐＤＮＡは、耐性遺伝子を含有する。いくつかの実施形態では、ｐＤＮＡは、複製起点を含有する。いくつかの実施形態では、ｐＤＮＡは、プロモーター配列、エンドヌクレアーゼの認識配列、耐性遺伝子、及び／または複製起点のうちの１つ以上を含有する。

【0300】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレート（例えば、直鎖ＤＮＡテンプレート）濃度（ｇ／Ｌ ＩＶＴ開始体積）は、少なくとも約０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５ｇ／Ｌである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレート（例えば、直鎖ＤＮＡテンプレート）開始濃度は、約０．０１～０．１５、０．０２～０．１４、０．０３～０．１３、０．０４～０．１２、０．０５～０．１１、０．０６～０．１１、０．０７～０．１１、０．０８～０．１１～０．０９～０．１１ｇ／Ｌである。

【0301】

リボヌクレオチド
インビトロ転写で使用するためのリボヌクレオチドは、少なくとも２つ以上（例えば、少なくとも３つ以上、少なくとも４つ以上、少なくとも５つ以上、少なくとも６つ以上）の異なるタイプのリボヌクレオチドを含み得、各タイプは、異なるヌクレオシドを有する。インビトロ転写で使用するためのリボヌクレオチドは、非修飾及び／または修飾リボヌクレオチドを含むことができる。非修飾リボヌクレオチドには、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。いくつかの実施形態では、非修飾リボヌクレオチドの４つのタイプ全てを、インビトロ転写に使用してもよい。

【0302】

いくつかの実施形態では、インビトロ転写に含まれるリボヌクレオチドの少なくとも１つのタイプは、修飾リボヌクレオチドである。修飾リボヌクレオチドは、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（例えば、リン酸化、脱リン酸化、コンジュゲーション、反転結合など）、３’末端修飾（例えば、コンジュゲーション、反転結合など）、（ｂ）塩基修飾、例えば、修飾塩基、安定化塩基、不安定化塩基、またはパートナーの拡大されたレパートリーと塩基対を有する塩基、または共役塩基への置換、（ｃ）糖修飾（例えば、２’位または４’位における）または糖の置換、ならびに（ｄ）ホスホジエステル結合の修飾または置換を含む、ヌクレオシド間結合修飾を含むが、これらに限定されない、１つ以上の修飾を含み得る。そのような修飾が翻訳を妨げる程度で（例えば、修飾の非存在と比較して、例えば、ウサギ網状赤血球インビトロ翻訳アッセイを使用して特徴付けられるように、５０％以上の翻訳の減少をもたらす）、そのような修飾されたリボヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるシステム及び方法での使用には望ましくない。

【0303】

いくつかの実施形態では、修飾リボヌクレオチドは、少なくとも１つのヌクレオシド（「塩基」）修飾または置換を有し得る。様々なヌクレオシド修飾または置換が当該技術分野で知られており、当業者は、修飾ヌクレオシドとしては、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、イソグアニシン、ツベルシジン、２－（ハロ）アデニン、２－（アルキル）アデニン、２－（プロピル）アデニン、２－（アミノ）アデニン、２－（アミノアルキル）アデニン、２－（アミノプロピル）アデニン、２－（メチルチオ）－Ｎ６－（イソペンテニル）アデニン、６－（アルキル）アデニン、６－（メチル）アデニン、７－（デアザ）アデニン、８－（アルケニル）アデニン、８－（アルキル）アデニン、８－（アルキニル）アデニン、８－（アミノ）アデニン、８－（ハロ）アデニン、８－（ヒドロキシル）アデニン、８－（チオアルキル）アデニン、８－（チオール）アデニン、Ｎ６－（イソペンチル）アデニン、Ｎ６－（メチル）アデニン、Ｎ６、Ｎ６－（ジメチル）アデニン、２－（アルキル）グアニン、２－（プロピル）グアニン、６－（アルキル）グアニン、６－（メチル）グアニン、７－（アルキル）グアニン、７－（メチル）グアニン、７－（デアザ）グアニン、８－（アルキル）グアニン、８－（アルケニル）グアニン、８－（アルキニル）グアニン、８－（アミノ）グアニン、８－（ハロ）グアニン、８－（ヒドロキシル）グアニン、８－（チオアルキル）グアニン、８－（チオール）グアニン、Ｎ－（メチル）グアニン、２－（チオ）シトシン、３－（デアザ）－５－（アザ）シトシン、３－（アルキル）シトシン、３－（メチル）シトシン、５－（アルキル）シトシン、５－（アルキニル）シトシン、５－（ハロ）シトシン、５－（メチル）シトシン、５－（プロピニル）シトシン、５－（プロピニル）シトシン、５－（トリフルオロメチル）シトシン、６－（アゾ）シトシン、Ｎ４－（アセチル）シトシン、３－（３アミノ－３カルボキシプロピル）ウラシル、２－（チオ）ウラシル、５－（メチル）－２－（チオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－２（チオ）ウラシル、４－（チオ）ウラシル、５－（メチル）－４（チオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－４（チオ）ウラシル、５－（メチル）－２，４－（ジチオ）ウラシル、５－（メチルアミノメチル）－２，４（ジチオ）ウラシル、５－（２－アミノプロピル）ウラシル、５－（アルキル）ウラシル、５－（アルキニル）ウラシル、５－（アリルアミノ）ウラシル、５－（アミノアリル）ウラシル、５－（アミノアルキル）ウラシル、５－（グアニジニウムアルキル）ウラシル、５－（１，３－ジアゾール－１アルキル）ウラシル、５－（シアノアルキル）ウラシル、５－（ジアルキルアミノアルキル）ウラシル、５－（ジメチルアミノアルキル）ウラシル、５－（ハロ）ウラシル、５－（メトキシ）ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸、５－（メトキシカルボニルメチル）－２－（チオ）ウラシル、５－（メトキシカルボニル－メチル）ウラシル、５－（プロピニル）ウラシル、５－（プロピニル）ウラシル、５－（トリフルオロメチル）ウラシル、６－（アゾ）ウラシル、ジヒドロウラシル、Ｎ３－（メチル）ウラシル、５－ウラシル（すなわち、シュードウラシル）、２－（チオ）シュードウラシル、４－（チオ）シュードウラシル、２，４－（ジチオ）シュードウラシル、５－（アルキル）シュードウラシル、５－（メチル）シュードウラシル、５－（アルキル）－２－（チオ）シュードウラシル、５－（メチル）－２－（チオ）シュードウラシル、５－（アルキル）－４（チオ）シュードウラシル、５－（メチル）－４（チオ）シュードウラシル、５－（アルキル）－２，４（ジチオ）シュードウラシル、５－（メチル）－２，４（ジチオ）シュードウラシル、１－置換シュードウラシル（例えば、１－メチル－シュードウリジン）、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロムウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、１－置換－２（チオ）－シュードウラシル、１－置換４（チオ）シュードウラシル、１－置換２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１－（アミノカルボニルエチレニル）－シュードウラシル、１－（アミノカルボニルエチレニル）－２（チオ）－シュードウラシル、１（アミノカルボニルエチレニル）－４（チオ）シュードウラシル、１－（アミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１－（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－シュードウラシル、１（アミノアルキルアミノ－カルボニルエチレニル）－２（チオ）－シュードウラシル、１－（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－４（チオ）シュードウラシル、１－（アミノアルキルアミノカルボニルエチレニル）－２，４－（ジチオ）シュードウラシル、１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－リル、１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－置換１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－置換１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、７－置換１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル，７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、７－（アミノアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェノキサジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１，３－（ジアザ）－２－（オキソ）－フェンチアジン－１－イル、７－（グアニジニウムアルキルヒドロキシ）－１－（アザ）－２－（チオ）－３－（アザ）－フェンチアジン－１－イル、１，３，５－（トリアザ）－２，６－（ジオキサ）－ナフタレン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン、ツベルシジン、イソグアニシン、イノシニル、２－アザ－イノシニル、７－デアザイノシニル、ニトロイミダゾリル、ニトロピラゾリル、ニトロベンゾイミダゾリル、ニトロインダゾリル、アミノインドリル、ピロロピリミジニル、３－（メチル）イソカルボスチリリル、５－（メチル）イソカルボスチリリル、３－（メチル）－７－（プロピニル）イソカルボスチリリル、７－（アザ）インドリル、６－（メチル）－７－（アザ）インドリル、イミジゾピリジニル、９－（メチル）－イミジゾピリジニル、ピロロピリジニル、イソカルボスチリリル、７－（プロピニル）イソカルボスチリリル、プロピニル－７－（アザ）インドリル、２，４，５－（トリメチル）フェニル、４－（メチル）インドリル、４，６－（ジメチル）インドリル、フェニル、ナフタレニル、アントラセニル、フェナントラセニル、ピレニル、スチルベニル、テトラセニル、ペンタセニル、ジフルオロトリル、４－（フルオロ）－６－（メチル）ベンズイミダゾール、４－（メチル）ベンズイミダゾール、６－（アゾ）チミン、２－ピリジノン、５ニトロインドール、３ニトロピロール、６－（アザ）ピリミジン、２（アミノ）プリン、２，６－（ジアミノ）プリン、５置換ピリミジン、Ｎ２－置換プリン、Ｎ６－置換プリン、０６－置換プリン、置換１，２，４－トリアゾール、ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、パラ置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、オルト－置換－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ビス－オルト－置換－６－フェニルピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、パラ－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ビス－オルト－（アミノアルキルヒドロキシ）－６－フェニル－ピロロ－ピリミジン－２－オン－３－イル、ピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－７－アミノ－ピリドピリミジン－３－イル、２－オキソ－ピリドピリミジン－３－イル、またはそれらの任意のＯ－アルキル化もしくはＮアルキル化誘導体などの合成及び天然の核酸塩基が挙げられるが、これらに限定されないことを理解するであろう。

【0304】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＶＴシステム及び／または方法で利用される修飾ヌクレオチドは、例えば、トール様受容体（ＴＬＲ）３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、レチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、黒色腫分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５）、タンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）、２’－５’オリゴアデニル酸合成酵素（ＯＡＳ）、及び遺伝学及び生理学研究室２（ＬＧＰ２）、ならびにそれらの組み合わせを含むが、限定されない１つ以上の哺乳類（例えば、ヒト）内因性ＲＮＡセンサ（例えば、先天性免疫ＲＮＡセンサ）へのＲＮＡの結合を破壊し得る。いくつかの実施形態では、そのような修飾リボヌクレオチドは、ＵＳ９，３３４，３２８に記載の修飾を含み得、その内容は、本明細書に記載の目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。修飾ヌクレオシドは、典型的には、宿主細胞において翻訳可能であることが望ましい（例えば、修飾ヌクレオシドの存在は、それぞれのポリペプチド配列へのＲＮＡ配列の翻訳を妨げない）。修飾ヌクレオチドの翻訳への影響は、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物翻訳アッセイを使用して、当業者によってアッセイされることができる。

【0305】

いくつかの実施形態では、修飾リボヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。様々なそのような修飾ヌクレオシド間結合が当業者に知られており、当業者は、本明細書で提供される技術で使用され得る修飾ヌクレオシド間結合の非限定的な例として、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルならびに３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホロミデートを含むホスホロアミデート、チオノホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホトリエステル、及びこれらの通常の３’－５’結合、２’－５’結合類似体を有するボラノホスフェート、ならびに隣接するヌクレオシド単位の対が３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’に結合される反転極性を有するものが挙げられることを理解するであろう。様々な塩、混合塩、及び遊離酸形態も含まれる。修飾ヌクレオシド間結合は、その中にリン原子を含まず、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間結合によって形成されるヌクレオシド間結合を有し得る。これらは、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホン酸塩及びスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、Ｓ、及びＣＨ２成分部分を混合した他のものを含む。

【0306】

いくつかの実施形態では、修飾リボヌクレオチドは、１つ以上の置換糖部分を含み得る。様々なそのような修飾糖部分が当該技術分野で知られており、当業者は、いくつかの実施形態では、リボヌクレオチドの糖部分が、２’位で以下：アルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換または非置換であり得る、Ｈ（デオキシリボース）；ＯＨ（リボース）；Ｆ；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル、Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル；Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキニル；またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキル）のうちの１つを含み得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、リボヌクレオチドの糖部分は、２’メトキシエトキシ（２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られている２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られているＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても当技術分野で知られている）、すなわち、２’－Ｏ－ＣＨ２－ＯＣＨ２－Ｎ（ＣＨ２）２、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）を含み得る。他の位置で、例えば、３’末端ヌクレオチドまたは２’－５’結合ヌクレオチドにおける糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位で同様の修飾が行われることができる。

【0307】

いくつかの実施形態では、インビトロ転写反応に有用なリボヌクレオチドの混合物は、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＮ１－メチルシュードウリジン－５’トリホスフェート（ｍ１ΨＴＰ）を含み得る。

【0308】

当業者は、多くの標準的なインビトロ転写反応が、リボヌクレオチド（すなわち、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰが１：１：１：１の比率で利用される（すなわち、ＡＴＰまたはＡＴＰ類似体のモル量（一緒に考慮される）が、反応混合物中のＣＴＰまたはＣＴＰ類似体のモル量（一緒に考慮される）と等しい）反応混合物を利用することを認識している。いくつかの実施形態では、標準または対照ＩＶＴ反応は、各リボヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰ）が９ｍＭの濃度で存在する反応混合物を利用する。

【0309】

いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応で使用するための反応混合物中のＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ（１つ以上のＮＴＰ類似体（複数可）を含む）の比率を最適化して、収率及び／または完全性を向上させ、及び／または異常産物（例えば、ｄｓＲＮＡ）の産生を低減させる。いくつかの実施形態では、総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）対総ＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的類似体（複数可）のモル比ａは、０．５、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２，１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ａは、少なくとも１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、１．８０、１．８５、１．９０以上である。いくつかの実施形態では、ａは、少なくとも１．５である。いくつかの実施形態では、ａは、ｘの少なくとも約１．１０倍、約１．１５倍、約１．２０倍、約１．２５倍、約１．３０倍、約１．３５倍、約１．４０倍、約１．４５倍、約１．５０倍、約１．５５倍、約１．６０倍、約１．６５倍、約１．７０倍、または約１．７５倍であり、ｘは、総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）対総グアノシン及び／または１つ以上の機能的グアノシン類似体（複数可）のモル比である。いくつかの実施形態では、ａは、ｘの少なくとも約１．１５倍である。いくつかの実施形態では、ａは、ｘの少なくとも約１．２０倍である。

【0310】

いくつかの実施形態では、総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的類似体（複数可）対総ＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）のモル比ｂは、０．５、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ｂは、少なくとも１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、１．８０、１．８５、１．９０以上である。いくつかの実施形態では、ｂは、少なくとも１．５である。いくつかの実施形態では、ｂは、ｙの少なくとも約１．１０倍、１．１５倍、１．２０倍、１．２５倍、１．３０倍、１．３５倍、１．４０倍、１．４５倍、１．５０倍、１．５５倍、１．６０倍、１．６５倍、１．７０倍、または１．７５倍であり、ｙは、総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）対総ウリジン及び／または１つ以上の機能的ウリジン類似体（複数可）のモル比である。いくつかの実施形態では、ｂは、ｙの少なくとも約１．１５倍である。いくつかの実施形態では、ｂは、ｙの少なくとも約１．２０倍である。

【0311】

いくつかの実施形態では、総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的類似体（複数可）対総アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）のモル比ｃは、０．５、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ｃは、少なくとも１．１０、１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、または１．５０である。いくつかの実施形態では、ｃは、少なくとも１．２５である。いくつかの実施形態では、ｃは、ｚの少なくとも約１．１０倍、１．１５倍、１．２０倍、１．２５倍、１．３０倍、１．３５倍、１．４０倍、１．４５倍、１．５０倍、１．５５倍、１．６０倍、１．６５倍、１．７０倍、または１．７５倍であり、ｚは、総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）対総アデノシン及び／または１つ以上の機能的アデノシン類似体（複数可）のモル比である。いくつかの実施形態では、ｃは、ｚの少なくとも約１．１５倍である。いくつかの実施形態では、ｃは、ｚの少なくとも約１．２０倍である。

【0312】

いくつかの実施形態では、ａは、少なくとも１．２５であり、及び／またはａは、ｘの少なくとも約１．１０倍である。いくつかの実施形態では、ｂは、少なくとも１．２５であり、及び／またはｂは、ｙの少なくとも約１．１０倍である。いくつかの実施形態では、ｃは、少なくとも１．１０であり、及び／またはｃは、ｚの少なくとも約１．１０倍である。

【0313】

いくつかの実施形態では、開始ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）体積（ｍｌ／Ｌ開始ＩＶＴ体積）は、少なくとも約８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０ｍｌ／Ｌ以上である。いくつかの実施形態では、開始ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）体積は、約８０～１５０、８５～１４５、または９０～１４０ｍｌ／Ｌである。

【0314】

いくつかの実施形態では、開始ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）体積（ｍｌ／Ｌ開始ＩＶＴ体積）は、少なくとも約８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０ｍｌ／Ｌ以上である。いくつかの実施形態では、開始ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）体積は、約８０～１５０、８５～１４５、８５～１４０、または８５～１３５ｍｌ／Ｌである。

【0315】

いくつかの実施形態では、開始ＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）体積（ｍｌ／Ｌ開始ＩＶＴ体積）は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｌ／Ｌ以上である。いくつかの実施形態では、開始ＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）体積は、約１～１０、２～９、３～８、４～７、４～６、または４～５ｍｌ／Ｌである。

【0316】

いくつかの実施形態では、開始ＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）体積（ｍｌ／Ｌ開始ＩＶＴ体積）は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｌ／Ｌ以上である。いくつかの実施形態では、開始ＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）体積は、約１～１０、２～９、３～８、４～７、４～６、または４～５ｍｌ／Ｌである。

【0317】

いくつかの実施形態では、本開示によるインビトロ転写で使用するための反応混合物中のＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びｍ１ΨＴＰの比率は、生成される転写物中に存在するものとは無関係である。

【0318】

５’－キャップ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の技術によって産生されるＲＮＡは、その５’端にキャップを含み得る。当業者は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に５’キャップを付加することで、ＲＮＡの認識及びリボソームへの付着を容易にして、翻訳を開始し、翻訳効率を高めることができることを理解するであろう。当業者は、５’キャップはまた、５’エキソヌクレアーゼ媒介分解からＲＮＡ産物を保護し、したがって半減期を増加させることができることも理解するであろう。キャッピングのための方法は、当該技術分野で既知であり、当業者は、いくつかの実施形態では、キャッピングが、キャッピングシステム（例えば、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素などの酵素ベースのキャッピングシステム）の存在下でインビトロ転写の後に実施され得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、キャッピングされたＲＮＡは、キャッピング酵素系（例えば、ワクシニアキャッピング酵素系またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅキャッピング酵素系を含むが限定されない）を有する、５’三リン酸基を有するＲＮＡまたは５’二リン酸基を有するＲＮＡのインビトロキャッピングによって得られ得る。いくつかの実施形態では、キャッピング剤は、転写中にキャップがＲＮＡに組み込まれる（共転写キャッピングとしても知られる）ように、複数のリボヌクレオチドとともに、インビトロ転写反応混合物（例えば、本明細書に記載のもの）に導入され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡに５’キャップを含むことが望ましい場合があるが、いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、５’－キャップを有さない場合がある。

【0319】

いくつかの実施形態では、５’－キャッピング剤は、インビトロ転写反応混合物に添加することができる。いくつかの実施形態では、５’－キャッピング剤は、修飾ヌクレオチド、例えば、修飾グアニンヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、５’－キャッピング剤は、例えば、メチル基または複数の基、グリセリル、逆デオキシ脱塩基部分、４’５’メチレンヌクレオチド、ｌ－（ベータ－Ｄ－エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’チオヌクレオチド、カルボ環式ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ－ヌクレオチド、アルファヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、トレオ－ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’、４’－セコヌクレオチド、非環式３，４－ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５－ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’－３’－逆ヌクレオチド部分、３’－３’－逆脱塩基部分、３’－２’－逆ヌクレオチド部分、３’－２’－逆脱塩基部分、１，４－ブタンジオールホスフェート、３’－ホスホルアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’－ホスフェート、３’ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または架橋もしくは非架橋メチルホスホネート部分、イノシン、Ｎ１－メチル－グアノシン、２’－フルオロ－グアノシン、７’デアザ－グアノシン、８－オキソ－グアノシン、２－アミノグアノシン、ＬＮＡ－グアノシン、２－アジド－グアノシンを含み得る。いくつかの実施形態では、５’－キャッピング剤は、ジヌクレオチドキャップ類似体（例えば、ｍ７ＧｐｐｐＧキャップ類似体またはＮ７－メチル、２’－Ｏ－メチル－ＧｐｐｐＧアンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップ類似体またはＮ７－メチル、３’－Ｏ－メチル－ＧｐｐｐＧ ＡＲＣＡキャップ類似体を含む）であり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの実施形態では、５’キャッピング剤は、５’Ｎ７－メチル－３’－Ｏ－メチルグアノシン構造、例えば、ＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）試薬（Ｔｒｉｌｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む。いくつかの実施形態では、５’－キャッピング剤は、特定のリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド（例えば、ＧＴＰ、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、またはそれらの修飾バージョン）に過剰に添加され、ＲＮＡ転写物への第１の添加として５’－キャップの組み込みを可能にする。

【0320】

ポリメラーゼ
ＲＮＡポリメラーゼを含むが限定されない、転写反応に好適である様々なＲＮＡポリメラーゼは、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｎ４ビリオンＲＮＡポリメラーゼ、またはそれらのバリアントもしくは機能ドメインである。天然に触媒されるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、典型的には、レトロウイルスを除く全てのＲＮＡウイルスによってコードされる。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするウイルスの典型的な代表は、アルファウイルスである。当業者は、本明細書で利用されるＲＮＡポリメラーゼが、組換えＲＮＡポリメラーゼ、及び／または精製されたＲＮＡポリメラーゼであってもよく、すなわち、ＲＮＡポリメラーゼに加えて他の成分を含有する細胞抽出物の一部としてではないことを理解するであろう。いくつかの実施形態では、商業規模の転写に有用なＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、無機ピロホスファターゼを添加して、転写反応の収率を改善し得る（例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって触媒される）。

【0321】

例示的なインビトロ転写反応
当業者は、典型的にはＩＶＴ反応混合物に含まれる成分を認識するであろう。例えば、ＩＶＴ反応混合物は、典型的には、核酸テンプレート（例えば、本明細書に記載されるような、例えば、ＤＮＡテンプレート）、リボヌクレオチド（例えば、本明細書に記載されるような）、ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）を含む。

【0322】

いくつかの実施形態では、反応混合物は、０．０５～２μｇ／μＬ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２．０μｇ／μＬを含む）の濃度で核酸テンプレートを含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、約７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０ｍｌ／ＬのＲＮＡポリメラーゼ体積（ｍｌ／Ｌ開始ＩＶＴ体積）を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、約７０～９０、７２～８８、７２～９０、または７０～８８ｍｌ／ＬのＲＮＡポリメラーゼ体積を含む。

【0323】

いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応混合物は、反応緩衝液、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、１つ以上の塩、還元剤、及び／またはスペルミジンのうちの１つ以上を更に含む。

【0324】

いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応混合物は、反応緩衝液を更に含む。いくつかの実施形態では、反応緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、またはＰＢＳを含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、２０～６０ｍＭの濃度で反応緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、反応緩衝液は、７～９（例えば、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、及び９．０を含む）のｐＨを有する。

【0325】

いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応混合物は、ＲＮＡｓｅ阻害剤を更に含み得る。いくつかのそのような実施形態では、ＲＮＡｓｅ阻害剤は、０．０１～０．１Ｕ／μＬ（例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、または０．１０Ｕ／μＬを含む）の濃度である。いくつかの実施形態では、１つの単位（Ｕ）のＲＮＡｓｅ阻害剤は、５ｎｇのＲＮＡｓｅ（例えば、ＲＮＡｓｅ Ａ）の活性を少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％以上を含む）阻害する。

【0326】

いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応混合物は、ピロホスファターゼ（例えば、無機ピロホスファターゼ）を更に含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応混合物は、０．０１～０．２ｍＵ／μＬの濃度でピロホスファターゼ（例えば、無機ピロホスファターゼ）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応混合物は、０．０１、０．０５、０．１、０．１５、または０．２０ｍＵ／μＬの濃度のピロホスファターゼ（例えば、無機ピロホスファターゼ）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応混合物は、約０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１．０、１．０５、１．１０ｍｌ／Ｌのピロホスファターゼ体積（ｍｌ／Ｌ開始ＩＶＴ体積）を含む。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応混合物は、０．８０～１．１０、０．８０～１．０５、０．８５～１．１０、０．８５～１．０５、０．９０～１．１０、０．９０～１．０５、０．９５～１．１０、または０．９５～１．０５ｍｌ／Ｌのピロホスファターゼ体積を含む。

【0327】

いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応混合物は、１つ以上の塩（例えば、一価塩及び／または二価塩）を更に含み得る。いくつかの実施形態では、反応混合物は、２０～６０ｍＭの濃度で１つ以上の塩を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の塩は、１つ以上のマグネシウム塩及び／または１つ以上のカルシウム塩を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のマグネシウム塩は、酢酸マグネシウムまたは塩化マグネシウムを含む。

【0328】

いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応混合物は、還元剤（例えば、ジチオスレイトール、２－メルカプトエタノールなど）を更に含み得る。いくつかのそのような実施形態では、反応混合物は、５～１５ｍＭの濃度で還元剤を含む。

【0329】

いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応混合物は、スペリミジンを更に含み得る。いくつかのそのような実施形態では、反応混合物は、０．５～３ｍＭの濃度でスペリミジンを含む。

【0330】

いくつかの実施形態では、特定の反応混合物成分は、特定の順序で添加される。いくつかの実施形態では、総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）の一部分は、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加され、総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）の残りの部分は、転写の開始後に反応混合物に添加される。いくつかの実施形態では、総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）の全ては、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加される。いくつかの実施形態では、総ＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）の一部分は、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加され、総ＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）の残りの部分は、転写の開始後に反応混合物に添加される。いくつかの実施形態では、総ＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）の全ては、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加される。いくつかの実施形態では、総ＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）の一部分は、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加され、総ＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）の残りの部分は、転写の開始後に反応混合物に添加される。いくつかの実施形態では、総ＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）の全ては、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加される。いくつかの実施形態では、総ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）の一部分は、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加され、総ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）の残りの部分は、転写の開始後に反応混合物に添加される。いくつかの実施形態では、総ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）の全ては、転写が始まる前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加される。いくつかの実施形態では、複数のヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及び／またはＵＴＰ、及び／またはその１つ以上の機能的類似体（複数可））の合計の一部分は、転写が開始される前及び／または転写の開始時に、反応混合物に添加され、残りの部分は、転写の開始後に反応混合物に添加される。いくつかの実施形態では、複数のヌクレオチド（例えば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及び／またはＵＴＰ、及び／またはそれらの１つ以上の機能的類似体（複数可））の合計の全ては、転写が開始される前及び／または転写の開始時に反応混合物に添加される。

【0331】

いくつかの実施形態では、ＧＴＰ及び／またはＵＴＰ及び／またはその１つ以上の機能的類似体（複数可）は、ＩＶＴ反応中に制限される（例えば、十分に低い濃度で維持される）。いくつかのそのような実施形態では、ＧＴＰ及び／またはＵＴＰ及び／またはそれらの１つ以上の機能的類似体（複数可）は、例えば、フェドバッチアプローチを使用することによって、十分に低い濃度で維持される。いかなる１つの理論によっても拘束されることを望むものではないが、ｃａｐ類似体は、初期ヌクレオチド（開始ヌクレオチド）としての組み込みのためにＧＴＰと直接競合することができ、任意の他のヌクレオチドと同様に容易に組み込まれる（ＷＯ２００６／００４６４８）。ｃａｐ類似体の組み込みを有利にするために、典型的には、ＧＴＰよりもキャップ類似体のモル過剰が使用され（例えば、４：１の比で）、ＧＴＰ濃度は、他のリボヌクレオシド三リン酸（例えば、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及び／またはＵＴＰ、またはそれらの類似体）と比較して低減される。これらの条件下では、ＧＴＰは通常、ＲＮＡ分子の合成のための制限因子となる。したがって、他のＮＴＰの高い割合（通常、４０～７０％）は、ＲＮＡ合成に使用されず、無駄にされる。このアプローチでは、ＲＮＡ収率は、典型的には、約１ｍｇ／ｍｌに制限される（ＷＯ２００６／００４６４８）。

【0332】

低ＧＴＰ濃度に起因する限られた収率を補償するために、キャッピングされたＲＮＡの収率は、１：１～１：５０のＧＴＰ対キャップ類似体の比率が維持されるように、競合するヌクレオチド（Ａキャップを使用する場合はＧＴＰまたはＡＴＰ）で反応を補充することによって、増加する。このアプローチにより、反応ごとに産生されるキャッピングされたＲＮＡの量を２倍にすることができることが報告されている（ＷＯ２００６／００４６４８）。

【0333】

任意の１つの理論に拘束されることを望むものではないが、直鎖化ＤＮＡテンプレートのランオフ転写中にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって合成されるＲＮＡ分子は、コードされたＲＮＡよりも長くなり得る（Ｔｒｉａｎａ－Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＪＢＣ；２７０（１１）：６２９８－６３０７）。ＤＮＡテンプレートを去った後、ＲＮＡポリメラーゼは、転写物をテンプレート部位に結合し、転写物の３’末端を産物部位に結合し、３’末端が、安定した二次構造の一部でない場合、それを伸長することができる（自己相補性３’伸長）。この効果は、ＵＴＰ濃度に特に感受性があるようであり、ＵＴＰ濃度の排他的な減少は、忠実な転写につながる。しかしながら、ＵＴＰ濃度を低下させることはまた、ＲＮＡ収率に影響を及ぼし得る。特に、ＲＮＡが、ｍＲＮＡなどのＲＮＡで一般的であるように、ポリ（Ａ）尾部を含有する場合、転写反応における過剰な組み込みされていないＵＴＰは、ポリＡ配列とは反対のウリジンヌクレオチドのＲＮＡテンプレート依存的組み込みをもたらし得、先天性免疫応答を活性化し、ポリペプチド合成を低下させ得る二本鎖ＲＮＡ分子をもたらし得る（Ｋａｒｉｋｏ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．；３９（２１）：ｅ１４２）。

【0334】

インビトロ転写反応は、いくつかの実施形態では、全ての成分が組み合わされ、次いでインキュベートされて、反応が終了するまでＲＮＡ分子の合成を可能にするバッチ反応として実施される。インビトロ転写反応の効率を高めるために、フェドバッチ反応を開発した（Ｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１３，７４７－７５６、Ｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１５，１７４－１８４）。いくつかの実施形態では、フェドバッチシステムでは、全ての成分が組み合わされるが、次いで、一定の反応条件を維持するために、一部の試薬（例えば、ＮＴＰ及びマグネシウム）の追加量が経時的に添加される。

【0335】

いくつかの実施形態では、総ＧＴＰ及び／またはその１つ以上の機能的類似体（複数可）は、ＩＶＴ反応の期間を通して（例えば、フェドバッチによって）ＩＶＴ反応混合物に添加される。いくつかのそのような実施形態では、総ＧＴＰ及び／またはその１つ以上の機能的類似体（複数可）ボーラス体積（ｍｌ／Ｌ開始ＩＶＴ体積）は、約１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、または１９０ｍｌ／Ｌで添加される。いくつかのそのような実施形態では、総ＧＴＰ及び／またはその１つ以上の機能的類似体（複数可）ボーラス体積（ｍｌ／Ｌ開始ＩＶＴ体積）は、約１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、または１９０ｍｌ／Ｌで添加される。いくつかのそのような実施形態では、総ＧＴＰ及び／またはその１つ以上の機能的類似体（複数可）ボーラス体積は、約１４０～２００、１４５～１９５、または１５０～１９０ｍｌ／Ｌの範囲で添加される。

【0336】

いくつかの実施形態では、総ＵＴＰ及び／またはその１つ以上の機能的類似体（複数可）は、ＩＶＴ反応の期間を通して（例えば、フェドバッチによって）ＩＶＴ反応混合物に添加される。いくつかのそのような実施形態では、総ＵＴＰ及び／またはその１つ以上の機能的類似体（複数可）ボーラス体積（ｍｌ／Ｌ開始ＩＶＴ体積）は、約１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、または１９０ｍｌ／Ｌで添加される。いくつかのそのような実施形態では、総ＵＴＰ及び／またはその１つ以上の機能的類似体（複数可）ボーラス体積（ｍｌ／Ｌ開始ＩＶＴ体積）は、約１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、または１９０ｍｌ／Ｌで添加される。いくつかのそのような実施形態では、総ＵＴＰ及び／またはその１つ以上の機能的類似体（複数可）ボーラス体積は、約１４０～２００、１４５～１９５、または１５０～１９０ｍｌ／Ｌの範囲で添加される。いくつかの実施形態では、ＧＴＰ及び／またはＵＴＰは制限され、ＣＴＰ及び／またはＡＴＰのいずれかまたは両方が、ＩＶＴ反応中の初期ＩＶＴ反応混合物中及び／または１つ以上の時点で増加される（例えば、本明細書の他の場所で論じられるように）。

【0337】

例示的なインビトロ転写反応条件
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応は、例えば、本明細書に記載される（例えば、本明細書に記載されるようなある特定のＩＶＴ反応体積に対して選択される）バイオリアクタ内で一定期間行われる。いくつかの実施形態では、期間は、例えば、少なくとも２５分、少なくとも３０分、少なくとも４０分、少なくとも５５分、少なくとも６０分、少なくとも７５分、少なくとも９０分、少なくとも１０５分、少なくとも１２０分、少なくとも１３５分、少なくとも１５０分、少なくとも１６５分、または少なくとも１８０分を含む、少なくとも２０分である。いくつかの実施形態では、期間は、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、または１８０分である。いくつかの実施形態では、期間は、約１．５～３時間である。いくつかの実施形態では、期間は、約２５～３０分である。

【0338】

いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応は、例えば、本明細書に記載されるバイオリアクタにおいて、（例えば、本明細書に記載されるような）期間、選択されるＲＮＡポリメラーゼが機能的に活性である温度で行われる。典型的なファージＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＩＶＴ反応を実施するＴ７ポリメラーゼは、通常、高温（例えば、４５℃を超える）では活性化されないが、熱安定性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ＵＳ１０５１９４３１に記載されるものなどのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性バリアントであって、その内容は、本明細書に記載される目的のために参照により組み込まれる）は、高温で増加した安定性を示すことができる。いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応は、例えば、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃を含む、約２５℃以上の温度で実施される。いくつかの実施形態では、インビトロ転写は、例えば、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃以上を含む、約４５℃以上の温度で実施される。

【0339】

いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応は、例えば、約６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９のｐＨで、本明細書に記載のバイオリアクタ内で行われる。いくつかの実施形態では、インビトロ転写に好適なｐＨは、約７．０～９．０であり得る。

【0340】

いくつかの実施形態では、本開示に従って（例えば、本明細書に記載されるようなバイオリアクタで）実施されるインビトロ転写反応は、連続的な供給反応として実施され得、いくつかの実施形態では、それらは、バッチフェド反応として実施され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のヌクレオチドを、段階的に（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のボーラス供給）インビトロ転写反応に添加してもよい。いくつかの実施形態では、攪拌速度は、ＲＮＡ合成中に修飾ヌクレオチド溶液及び１つ以上の他のヌクレオチド溶液の最適な利用可能性を確実にするためにボーラス添加物の急速な混合を可能にするための特定のブレンド時間が達成されるように選択される。

【0341】

バイオリアクタ
いくつかの実施形態では、ＩＶＴ反応は、本明細書に記載のバイオリアクタで（すなわち、バイオリアクタを使用して）行われる。

【0342】

本明細書で使用される「バイオリアクタ」または「転写リアクタ」という用語は、チャンバまたは試験管またはカラムなどの容器を指し、転写反応は、本明細書に記載されるような特定の条件下で行われる。転写のためのバイオリアクタは、当該技術分野で知られている（ＷＯ１９９５／０８６２６及びＥＰ３１５５１２９を参照されたい）。バイオリアクタは、典型的には、反応成分が供給ラインによって反応器コアに送達され、ＲＮＡ産物が限外濾過膜（ＥＰ３１５５１２９及びｖａｎ ｄｅ Ｍｅｒｂｅｌ，（１９９９），Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ８５６（１－２）：５５～８２）を通過することによって出口ストリームに移動するように構成されている。本発明の方法に有用なバイオリアクタは、転写反応を行うための反応モジュールと、転写されたＲＮＡ分子を一時的に捕捉するための捕捉モジュールと、反応混合物の成分の反応モジュールへのインフィードを制御するための制御モジュールと、を含み得、反応モジュールは、反応混合物からヌクレオチドを分離するための濾過膜を含み得、制御モジュールによる反応混合物の成分のインフィードの制御は、分離されたヌクレオチドの測定濃度に基づき得る。バイオリアクタは、本明細書に記載される転写反応の温度、例えば、通常、４℃～４０℃などの特定の温度を正確に維持するように、熱的に調節され得る。バイオリアクタは、流入フィート及び出口ポートを含み得る。バイオリアクタは、転写反応中に、例えば、可変の攪拌速度で反応混合物を攪拌することを可能にし得る。攪拌は、連続的であっても、間隔を空けるなど不連続であってもよい。

【0343】

本発明による使用のためのバイオリアクタは、例えば、０．２リットル、０．３リットル、０．４リットル、０．５リットル、０．６リットル、０．７リットル、０．８リットル、０．９リットル、１．０リットル、１．１リットル、１．２リットル、１．３リットル、１．４リットル、１．５リットル、１．６リットル、１．７リットル、１．８リットル、１．９リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、３５リットル、４０リットル、４５リットル、５０リットル以上、またはその間の任意の体積などの、例えば、０．２リットル以上のサイズであり得る。ｐＨ及び温度を含むがこれらに限定されないバイオリアクタの内部条件は、典型的には、本明細書に記載の転写反応中に制御される。バイオリアクタは、ガラス、プラスチック、または金属を含む、本明細書に記載される条件下でインビトロ転写に好適な任意の材料で構成され得る。

【0344】

いくつかの実施形態では、バイオリアクタには、反応混合物を補充するためのポンプが装備されてもよい。いくつかの実施形態では、プログラム可能なポンプは、補充のために使用され得る。いくつかの実施形態では、プログラム可能なシリンジポンプは、例えば、１つ以上の反応混合物成分の段階的な添加を自動的に実施するために使用され得る。代替的にまたは追加的に、いくつかの実施形態では、モニタ（例えば、センサ）は、１つ以上の成分のレベル（複数可）を検出するために利用されてもよく、いくつかのそのような実施形態では、モニタは、例えば、そのような成分（複数可）の減少した量の検出時に追加の供給物を放出し得るように、ポンプと自動的に通信してもよい。

【0345】

ヌクレオチドレベルを制御する方法
いくつかの実施形態では、本開示に従って（例えば、本明細書に記載されるようなバイオリアクタで）実施されるインビトロ転写反応は、連続的な供給反応として実施され得、いくつかの実施形態では、それらは、バッチフェド反応として実施され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のヌクレオチドを、段階的に（例えば、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のボーラス供給）インビトロ転写反応に添加してもよい。いくつかの実施形態では、攪拌速度は、ＲＮＡ合成中に修飾ヌクレオチド溶液及び１つ以上の他のヌクレオチド溶液の最適な利用可能性を確実にするためにボーラス添加物の急速な混合を可能にするための特定のブレンド時間が達成されるように選択される。

【0346】

例示的な処理
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＩＶＴによって産生されるＲＮＡは、１つ以上の処理ステップ（例えば、精製）を受ける。

【0347】

本明細書に記載の核酸の精製には、核酸クリーンアップ、品質保証、及び品質管理が含まれ得るが、これらに限定されない。クリーンアップは、限定されるものではないが、例えば、プロテイナーゼＫ及びＤＮａｓｅＩ、ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ（登録商標）ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ポリＴビーズ、ＬＮＡＴＭオリゴ－Ｔキャプチャプローブ（ＥＸＩＱＯＮ（登録商標）Ｉｎｃ，Ｖｅｄｂａｅｋ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって残留タンパク質消化及び／またはＤＮＡ消化などの当該技術分野で知られている方法、または限定されるものではないが、強陰イオン交換ＨＰＬＣ、弱陰イオン交換ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ－ＨＰＬＣ）、及び疎水性相互作用ＨＰＬＣ（ＨＩＣ－ＨＰＬＣ）などのＨＰＬＣベースの精製方法によって実施され得る。「精製された」という用語は、「精製された核酸」などの核酸に関して使用される場合、少なくとも１つの夾雑物から分離されたものを指す。「夾雑物」とは、別の不適切なもの、不純なもの、または粗悪なものにする任意の物質である。したがって、精製された核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）は、それが天然に見出されるものとは異なる形態もしくは設定で、またはそれに処置もしくは精製方法を施す前に存在していたものとは異なる形態もしくは設定で存在する。

【0348】

特性評価
いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１つ以上の品質管理パラメータによって評価することができる。いくつかの実施形態では、品質管理パラメータは、ＲＮＡ及び／またはそれを含む組成物の産生プロセス中の任意の時点で評価及び／または監視され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ完全性、ＲＮＡ濃度、残留ｄｓＲＮＡ、及び／またはキャッピングのうちの１つ以上を含むＲＮＡ品質管理パラメータは、ＲＮＡ製造進行の各ステップまたはある特定のステップの間、及び／または後、例えば、ＩＶＴ及び／または各精製ステップの後に評価及び／または監視され得る。

【0349】

いくつかの実施形態では、１つ以上の品質管理パラメータは、ＲＮＡの製造または他の調製もしくは使用中に（例えば、放出試験として）利用され得る。

【0350】

いくつかの実施形態では、１つ以上の品質管理パラメータを評価して、本明細書に記載されるＲＮＡが（例えば、後続の製剤及び／または流通へのリリースに向けた）許容基準を満たすか、または超えるかを決定し得る。いくつかの実施形態では、そのような品質管理パラメータは、ＲＮＡ完全性、ＲＮＡ濃度、残留ｄｓＲＮＡ、及び／またはキャッピングを含み得るが、これらに限定されない。

【0351】

ＲＮＡ品質を評価するためのある特定の方法は、当該技術分野で知られており、例えば、当業者は、いくつかの実施形態では、１つ以上の分析試験をＲＮＡ品質評価に使用することができることを認識するであろう。そのようなある特定の分析試験の例としては、ゲル電気泳動（例えば、アガロースゲル電気泳動、キャピラリーゲル電気泳動）、ＵＶ吸収、及び／またはＰＣＲアッセイが挙げられ得るが、これらに限定されない。

【0352】

ＲＮＡ完全性
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ完全性は、評価及び／または監視される（例えば、経時的に１つ以上の点で決定される）。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ完全性は、アガロースゲル電気泳動によって評価及び／または監視することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ完全性は、キャピラリーゲル電気泳動によって評価及び／または監視することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ完全性は、キャピラリー電気泳動を使用して定量的に決定することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ溶液は、標準的なラダーの保持時間と比較して、予想される長さと一致する予想される保持時間に単一のピークを生じさせなければならない。いくつかの実施形態では、主要ＲＮＡピークの定量は、分解産物が検出可能である電気泳動図におけるシグナル強度に関連して計算される。

【0353】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供する技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）のＲＮＡ完全性は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応）と比較して、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）のＲＮＡ完全性は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、及び／またはｃが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかの実施形態では、本開示によって産生されるＲＮＡ分子（複数可）のＲＮＡ完全性は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｅが、少なくとも１．１０であり、及び／またはａが、少なくとも１．２５であり、ｂが、少なくとも１．２５であり、及び／またはｃが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）のＲＮＡ完全性は、適切な比較対照（例えば、本明細書に開示されていないＩＶＴ反応によって産生されるＲＮＡ）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）のＲＮＡ完全性は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかの実施形態では、本開示によって産生されるＲＮＡ分子（複数可）のＲＮＡ完全性は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍であり、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍であり、及び／またはａが、ｘの少なくとも約１．１０倍であり、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。

【0354】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ完全性は、適切な比較対照と比較して、少なくとも約５％増加する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ完全性は、適切な比較対照と比較して、少なくとも約８％増加する。

【0355】

ＲＮＡ濃度
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ濃度（例えば、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子）を評価及び／または監視する（例えば、時間の経過とともに１つ以上の点で、例えば、ＩＶＴ反応中またはＩＶＴ反応後に決定する）。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ濃度は、ＵＶ吸収分光光度法を使用して決定される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ濃度は、Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．２．２５内に記載の方法に従って決定される。いくつかの実施形態では、所望の特定のＲＮＡ濃度は、特定のバッチ規模で達成される。いくつかの特定の実施形態では、高ＲＮＡ濃度は、大規模な製造プロセスで達成される。

【0356】

いくつかの実施形態では、達成されたＲＮＡ濃度（例えば、本明細書に記載のＩＶＴ反応によって産生されるＲＮＡの）は、少なくとも１ｍｇ／ｍＬ（例えば、少なくとも１．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも２．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも３．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも４．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも６ｍｇ／ｍＬ、またはそれ以上を含む）であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ濃度は、１．５ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬまたは２ｍｇ／ｍＬ～４ｍｇ／ｍＬまたは２．０～２．５ｍｇ／ｍＬであり得る。

【0357】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される技術に従って（例えば、本明細書に記載されるＩＶＴ反応で）産生されるＲＮＡ分子の濃度は、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、または１５ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術によって産生されるＲＮＡ分子（複数可）の濃度は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、及び／またはｃが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％である。いくつかの実施形態では、本開示の技術によって産生されるＲＮＡ分子の濃度は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく；ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく；ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｅが、少なくとも１．１０であり；及び／またはａが、少なくとも１．２５であり、ｂが、少なくとも１．２５であり、及び／またはｃが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子の濃度は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子の濃度は、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍であり、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍であり、及び／またはａが、ｘの少なくとも約１．１０倍であり、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子の濃度は、適切な比較対照と比較して、少なくとも約２０％（例えば、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％以上を含む）増加する。

【0358】

残留二本鎖ＲＮＡ
とりわけ、本開示は、提供される技術が、例えば、ｄｓＲＮＡのレベルの低下などのある特定の利点を提供し得るという洞察を提供する。いくつかの実施形態では、低いｄｓＲＮＡレベルは、治療用ＲＮＡの調製に特に有用である。代替的にまたは追加的に、ｄｓＲＮＡを低減する能力は、大規模（例えば、本明細書に記載されるような商業規模）のＲＮＡ製造において特に有益であり得る。

【0359】

いくつかの実施形態では、残留ｄｓＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、吸光度、蛍光染料、及び／またはゲル電気泳動を使用して評価及び／または監視することができる。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、定量的ＰＣＲを使用して評価及び／または監視される。

【0360】

いくつかの特定の実施形態では、例えば、ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡ試料を評価することによって評価及び／または監視され、許容される残留ｄｓＲＮＡ含有量の上限を表すｄｓＲＮＡ参照（２０００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１５００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１０００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、５００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、またはそれ以下）は、正に荷電したナイロン膜上に固定され、ｄｓＲＮＡ特異的モノクローナル抗体とともにインキュベートされる。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体とのインキュベーション後、増強された化学発光（ＥＣＬ）基質を膜に添加し、化学発光をバイオイメージャーシステムによって検出する。シグナル強度は、密度測定によって定量化され、ＲＮＡ試料の値は、ｄｓＲＮＡ参照のシグナル強度と比較される。結果は、指定された上限に準拠しているとして報告される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ特異的モノクローナル抗体は、マウスＩｇＧクローンＪ２である。いくつかの実施形態では、ＨＲＰ標識二次抗体は、抗マウスＩｇＧ二次抗体である。

【0361】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子の転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡは、少なくとも約２５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、５０ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、７５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１２５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１５０ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１７５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２２５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２５０ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２７５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、または３００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）の転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡは、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、及び／またはｃが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）の転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡは、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも約１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｅが、少なくとも１．１０であり、及び／またはａが、少なくとも１．２５であり、ｂが、少なくとも１．２５であり、及び／またはｃが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）の転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡは、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子の転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡは、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍であり、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍であり、及び／またはａが、ｘの少なくとも約１．１０倍であり、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかの実施形態では、残留ｄｓＲＮＡ濃度は、例えば、少なくとも約６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％以下を含む、少なくとも約７０％減少する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）の転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡは、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではなく、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも約１．２５ではなく、ｃが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｄが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｅが、少なくとも１．１０であり、及び／またはａが、少なくとも１．２５であり、ｂが、少なくとも１．２５であり、及び／またはｃが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｄが、少なくとも１．１０ではなく、及び／またはｅが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子（複数可）の転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡは、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはａが、ｘの少なくとも約１．１０倍であり、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍であり、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍ではなく、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する。

【0362】

本開示は、とりわけ、本明細書で提供される技術が、ＩＶＴ反応におけるｄｓＲＮＡのレベルの低下を達成することができることを文書化する。いくつかの実施形態では、ＡＴＰのレベルの上昇を含む反応混合物を利用するＩＶＴ反応は、（例えば、適切な比較対照、例えば、本明細書に記載されるような標準的な反応混合物を利用するＩＶＴ反応と比較して）ｄｓＲＮＡのレベルの低下をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＴＰのレベルの上昇を含む反応混合物を利用するＩＶＴ反応は、（例えば、適切な比較対照、例えば、本明細書に記載されるような標準的な反応混合物を利用するＩＶＴ反応と比較して）ｄｓＲＮＡのレベルの低下をもたらす。いくつかの実施形態では、ＣＴＰ及び／またはＡＴＰのレベルの上昇を含む反応混合物を利用するＩＶＴ反応は、（例えば、適切な比較対照、例えば、本明細書に記載の標準反応混合物を利用するＩＶＴ反応と比較して）ｄｓＲＮＡのレベルの低下をもたらす。

【0363】

特定の実施形態では、本開示は、提供される技術（例えば、反応混合物中のＣＴＰ及び／またはＡＴＰレベルの上昇、特に、ＡＴＰレベルの上昇）が、ｄｓＲＮＡレベルの低下を達成することができることを文書化する。更に、本開示は、そのような利益が、異なるＣ及び／またはＡ含有量を有する様々なＲＮＡ転写産物の産生において達成されることができることを文書化する。したがって、いくつかのそのような実施形態では、本明細書に提供される技術は、産生されたＲＮＡのヌクレオチド含有量とは無関係に、ＩＶＴ反応におけるｄｓＲＮＡレベルの低下を達成し、いくつかのそのような実施形態では、産生されたＲＮＡのヌクレオチド含有量は、任意のポリ（Ａ）尾部を除いて評価される。

【0364】

キャッピング
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子のキャッピング（例えば、本開示の技術によって産生される）は、評価及び／または監視される（例えば、経時的に１つ以上の点で決定される）。いくつかの実施形態では、インビトロで転写されたＲＮＡのキャッピングは、例えば、（典型的には、機能的キャップの存在を必要とする）翻訳を評価することによって検証することができる。いくつかの実施形態では、例えば、動物試験材料のプロセス特性評価の間に実施され得る生体活性試験は、ＲＮＡが、正しいサイズのポリペプチド（例えば、タンパク質）に翻訳されることを確認するものである。いくつかの実施形態では、インビトロで転写されるＲＮＡのキャッピングは、ヌクレアーゼベースのアッセイを行うことによって評価される。いくつかの実施形態では、インビトロで転写されるＲＮＡのキャッピングは、触媒核酸ベースのアッセイを行うことによって評価される。代替的にまたは追加的に、いくつかの実施形態では、非臨床試験を実施して、様々な異なるｍＲＮＡバッチのキャッピングを実証する。

【0365】

いくつかの実施形態では、（例えば、本明細書に開示される技術によって産生される）ＲＮＡ分子のキャッピングは、（ａ）機能的にキャッピングされたＲＮＡの翻訳を評価すること、（ｂ）生体活性試験を実施して、ＲＮＡ分子が、正しいサイズのポリペプチド（例えば、タンパク質）に翻訳されていることを確認すること、（ｃ）ヌクレアーゼベースのアッセイを行うこと、及び／または（ｄ）触媒核酸ベースのアッセイを行うこと、によって評価される。

【0366】

いくつかのそのような実施形態では、ヌクレアーゼベースのアッセイは、ＲＮａｓｅベースのアッセイを含む。いくつかのそのような実施形態では、ＲＮａｓｅベースのアッセイは、（ａ）多数のＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子に結合する１つ以上のプローブにアニーリングして、ＲＮＡプローブ複合体を形成すること、（ｂ）ＲＮＡプローブ複合体をＲＮａｓｅで消化して、ＲＮＡ分子の５’末端を含む断片を生成すること、（ｃ）親和性ベースの精製、クロマトグラフィーベースの精製、もしくはそれらの組み合わせを使用して、断片を精製すること、（ｄ）精製された断片を質量分析（ＭＳ）に供すること、（ｅ）観察されたＭＳ値に基づいて、キャッピングされた及びキャッピングされていない断片を特定すること、及び／または（ｆ）キャッピングされた及びキャッピングされていない断片の量を比較して、キャッピングされたＲＮＡの割合を計算することのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ Ｈを含む。

【0367】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼベースのアッセイは、（ａ）多数のＲＮＡ分子を、５’ＲＮＡキャップもしくはＲＮＡのキャッピングされていない最後から２番目の塩基に隣接するＲＮＡ分子の５’非翻訳領域内の配列に相補的な１つ以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドと接触させること、（ｂ）１つ以上のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＲＮＡ分子の５’非翻訳領域内の配列にアニーリングして、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド複合体を形成すること、（ｃ）ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド複合体及び／またはアニーリングされていないＲＮＡ分子を１つ以上のヌクレアーゼで分解して、キャッピングされた及びキャッピングされていない５’末端ＲＮＡ断片及び３’ＲＮＡ断片を産生することと、（ｄ）親和性ベースの精製、クロマトグラフィーベースの精製、またはそれらの組み合わせを使用して、キャッピングされた及びキャッピングされていない５’末端ＲＮＡ断片を３’ＲＮＡ断片から分離することと、及び／または（ｅ）キャッピングされた及びキャッピングされていない５’末端ＲＮＡ断片の量を比較して、キャッピングされたＲＮＡの割合を計算すること、のうちの１つ以上を含む。

【0368】

いくつかの実施形態では、触媒核酸ベースのアッセイは、（ａ）多数のＲＮＡ分子を触媒核酸分子で５’末端ＲＮＡ断片及び少なくとも１つの３’ＲＮＡ断片に切断することであって、ＲＮＡ分子が、触媒核酸分子の切断部位を有する、切断すること、（ｂ）親和性ベースの精製、クロマトグラフィーベースの精製、またはそれらの組み合わせを使用して、５’末端ＲＮＡ断片及び３’ＲＮＡ断片を分離すること、（ｃ）分光学、定量的質量分析、配列決定、もしくはそれらの組み合わせを使用して、キャッピングされた及びキャッピングされていない５’末端ＲＮＡ断片の量を測定すること、及び／または（ｄ）キャッピングされた及びキャッピングされていない５’末端ＲＮＡ断片の量を比較して、キャッピングされたＲＮＡの割合を計算すること、のうちの１つ以上を含む。いくつかのそのような実施形態では、触媒核酸分子は、ＤＮＡザイムまたはリボザイムを含む。

【0369】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子の少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％は、キャッピングされる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子のキャッピングは、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、少なくとも１．２５ではなく、ｂが、少なくとも１．２５ではなく、及び／またはｃが、少なくとも１．１０ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子のキャッピングは、適切な比較対照（例えば、他の方法で同等のインビトロ転写反応、例えば、ａが、ｘの少なくとも約１．１０倍ではなく、ｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍ではなく、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍ではない反応混合物を利用する）と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される技術に従って産生されるＲＮＡ分子のキャッピングは、適切な比較対照と比較して、少なくとも約５％増加する。

【0370】

収率
いくつかの実施形態では、本開示の技術によって産生されるＲＮＡ分子の収率が評価される。いくつかの実施形態では、収率は、ｇ／Ｌ開始ＩＶＴ体積として決定される。いくつかの実施形態では、収率は、ＩＶＴ反応によって産生されるように計算されたＲＮＡの理論値と比較して、ＩＶＴ反応で生成されるＲＮＡの総量を測定することによって決定される。いくつかの実施形態では、収率は、式：
推定ＲＮＡ収率（例えば、ｍｇ／ｍＬ）＝（Ｄ）×（Ｗ）×（Ｚ）／（Ｘ）＝（Ｙ）に従って決定され、
式中、（Ｄ）、（Ｗ）（例えば、ｍｇ／ｍＬ）、Ｚ（例えば、ｍＬ）、Ｘ（例えば、ｍＬ）、及びＹ（例えば、ｍｇ／ｍＬ）は、それぞれ、ペレットを（例えば、水、例えば、ＲＮａｓｅを含まない水中で）再懸濁させるために使用された希釈係数、ＲＮＡ濃度（例えば、ＡＲＤによって測定される）、プロテイナーゼＫ消化ステップ後の理論上の総反応体積、ＩＶＴプロセスの初期体積、及び収率を表す。

【0371】

いくつかの実施形態では、収率は、理論値の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％、１２５％以上、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、収率は、約７０～１２５％、７５～１２５％、８０～１２５％、８５～１２５％、７０～１２０％、７５～１２０％、８０～１２０％、または８５～１２０％である。いくつかの実施形態では、収率（ｇ／Ｌ開始ＩＶＴ体積）は、３．３０、３．３１、３．３２、３．３３、３．３４、３．３５、３．３６、３．３７、３．３８、３．３９、３．４０、３．５０、３．６０、３．７０、３．８０、３．９０、４．０以上である。

【0372】

使用
いくつかの実施形態では、本開示の技術によって産生されるＲＮＡ（例えば、治療用ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、収率、完全性、及び／またはキャッピングの増加、及び／または異常な産物及び／または夾雑物（例えば、ｄｓＲＮＡ）の減少した形成を有する。いくつかの実施形態では、産生されるＲＮＡは、医薬品グレードのＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本開示の技術によって産生されるＲＮＡは、感染（例えば、細菌、ウイルス）及び／または疾患及び／または障害を治療または予防するための治療薬として使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡは、感染及び／または疾患及び／または障害に関連する病態を治療及び／または防止するための治療薬として使用することができる。

【0373】

いくつかの実施形態では、本開示の技術によって産生されるＲＮＡは、免疫応答の特徴のうちの１つ以上を（例えば、感染及び／または疾患及び／または障害を有する対象からの血清によって、提供される抗原への結合を検出することによって）検出及び／または特性評価するのに有用であり得る。

【0374】

いくつかの実施形態では、本開示の技術によって産生されるＲＮＡは、本明細書に含まれる１つ以上のエピトープに対する抗体を呼び起こすのに有用であり、そのような抗体自体は、例えば、感染症及び／または疾患及び／または障害の検出及び／または治療のために有用であり得る。

【0375】

いくつかの実施形態では、本開示は、コードされた抗原を産生するためのＲＮＡの使用、及び／またはＲＮＡを産生するためのＤＮＡ構築物の使用を提供する。

【実施例】

【0376】

実施例１：例示的な参照インビトロ転写（ＩＶＴ）反応
本実施例は、例示的な参照ＩＶＴ反応を提供する。

【0377】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡテンプレート（直鎖化プラスミド）、共転写キャッピングのためのｍ２７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ２’－Ｏ）ＡｐＧ（ＣＣ４１３）キャップ類似体（１．５ｍＭ）、及びヌクレオシド三リン酸塩（ＧＴＰ、ＡＴＰ、及びｍ１ΨＴＰ（各々９ｍＭの最終濃度））の存在下で、参照（例えば、対照または標準）ＩＶＴ反応を実施した。ＧＴＰ／ｍ１ΨＴＰの開始濃度を開始濃度の０．５ｍＭ（１／１８＊９ｍＭ）に低下させ、最終濃度に達するまで１１回の添加で転写反応の過程にわたって供給した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｒｉｂｏｌｏｃｋ）、及び無機ピロホスファターゼ（０．０００１Ｕ／μｌ）の存在下、酢酸マグネシウム（ＭｇＡｃ、４０ｍＭ）、ジチオスレイトール、及びスペルミジンを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液（４０ｍＭ、ｐＨ８．３）を用いて、３７℃で１０５分間反応を実施した。ＩＶＴ後、ＤＮＡテンプレートをＤＮａｓｅ消化を介して除去し、ＲＮＡを固定化のために磁性ビーズを使用して精製した（例えば、Ｂｅｒｅｎｓｍｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７３，４９５－５０４；１０．１００７／ｓ００２５３－００６－０６７５－０（２００６）を参照されたい）。ＲＮＡを水中で溶出した。

【0378】

利用した構築物は、ＢＮＴ１６２ｂ１またはＢＮＴ１６２ｂ２であった（例えば、Ｓｈｏｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ｓｐｉｋｅ－ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｍＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｖａｃｃｉｎｅｓ ＢＮＴ－１６２ｂ２ ａｎｄ ｍＲＮＡ－１２７３，ＰＣＴ／ＥＰ２１／５９９４７，ＵＳ１７／２３３，３９６）を参照されたい）。

【0379】

実施例２：インビトロ転写（ＩＶＴ）によってＲＮＡを産生する例示的な方法
本実施例は、本明細書に記載の戦略を利用するＩＶＴによってＲＮＡを産生する例示的な方法を実証する。

【0380】

Ｎ１－メチル－シュードウリジン（ｍ１ΨＴＰ）フェドバッチを使用して、ＩＶＴ反応を行った。ＩＶＴ反応混合物の成分及び条件を図１に要約する。当業者は、（例えば、図７及び／または図１７を参照して）本開示を読むことで、いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、上昇したＣを使用する場合、上昇したＡを使用する場合、及び／または上昇したＣ及び上昇したＡの両方を使用する場合に低くなり得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、Ｃが、本明細書に記載の適切な比較対照と比較して、例えば、＋１０％～＋５０％の範囲内の濃度で使用される場合、ｄｓＲＮＡは、減少し得る（例えば、約２５～約５０ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡの範囲内の量）。いくつかの実施形態では、Ａが、本明細書に記載の適切な比較対照と比較して、例えば、＋２０％～＋５０％の範囲内の濃度で使用される場合、ｄｓＲＮＡは、減少し得る（例えば、約０～１０ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡの範囲内の量）。いくつかの実施形態では、Ｃが、例えば、＋１０％～＋５０％の範囲内の濃度で使用され、Ａが、本明細書に記載の適切な比較対照と比較して、例えば、＋２０～＋５０％の範囲内の濃度で使用される場合、ｄｓＲＮＡは、減少し得る（例えば、約０～約１０ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡの範囲内の量）。

【0381】

例示的な大規模ＩＶＴ産生（３７．６Ｌ）の後の残留ヌクレオチド三リン酸（ＮＴＰ）を、２つの構築物について分析した（図２）。

【0382】

実施例３：ＣＴＰ及び／またはＡＴＰが増加した例示的なＩＶＴ反応混合物
本実施例は、例示的なＩＶＴ反応を提供し、反応混合物中のＡＴＰ及び／またはＣＴＰの開始体積は、実施例１に記載されるような対照反応から調整された（用語「＋０％」のＣＴＰ及び／またはＡＴＰは、対照条件を示すために使用される）。例示的なＲＮＡを、ＩＶＴを使用してＤＮＡテンプレートから合成し、更に、ＤＮＡｓｅ Ｉ消化（例えば、ＤＮＡテンプレートを除去するため）及びプロテイナーゼＫ消化（例えば、限外濾過／ダイアフィルトレーションによるタンパク質、例えば、ポリメラーゼの除去を容易にするため）を含むステップによって処理した。プロテイナーゼＫ消化ステップの後に反応試料を採取し、分析のために精製した。ＩＶＴは、表２．１に要約された条件に従って、マイクロバイオリアクタ（例えば、ＡＭＢＲ１５（登録商標））で行った。

【表3】

【0383】

産生されたＲＮＡ試料を、ＲＮＡ濃度、ＲＮＡ完全性、５’－キャッピング、残留ＮＴＰ、及びポリ（Ａ）尾部完全性について分析した。いかなる１つの理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＴＰ濃度の変化からの潜在的な影響のために、これらの特徴を分析のために選択した。各規模のＲＮＡ収率を計算するために、以下の式：
推定ＲＮＡ収率（ｍｇ／ｍＬ）＝（Ｄ）×（Ｗ）×（Ｚ）／（Ｘ）＝（Ｙ）を利用し、
式中、（Ｄ）、Ｗ（ｍｇ／ｍＬ）、Ｚ（ｍＬ）、Ｘ（ｍＬ）、及びＹ（ｍｇ／ｍＬ）は、水中でＲＮＡを再懸濁させるために利用される希釈係数を表す。それぞれ、プロテイナーゼＫ消化ステップ後の理論上の総反応体積、ＩＶＴプロセスの初期体積、及び収率。小規模での収率に対するサンプリングの影響を最小化するために、理論上の総反応体積を使用して、ＩＶＴプロセスで産生されるＲＮＡの総量を推定した。

【0384】

残留ＮＴＰ分析のための試料を、プロテイナーゼＫ消化後に採取した。残留ＮＴＰ分析に際して、ＣＴＰは、定量限界未満であることが同定された（表２．２）。

【表4】

【0385】

観察されたＣＴＰ枯渇に基づいて、産生されたＲＮＡを改善するために、ＩＶＴ反応混合物中のＣＴＰ濃度を、対照／標準（＋０％ＣＴＰ）と比較して、１０％少ないＣＴＰ体積から５０％追加のＣＴＰ体積まで評価した（表２．３）。

【表5】

【0386】

次いで、表２．３の様々な例示的な条件から産生されたＲＮＡを、ＲＮＡ完全性及びキャッピングについて評価した。ＣＴＰ体積の増加は、＋２０％ＣＴＰ体積及び＋５０％ＣＴＰ体積での完全性及びキャッピングの増加を示したが、＋／－１０％ＣＴＰ開始濃度では比較的安定していた（図３）。追加的に、産生されたＲＮＡを、デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）によってポリ（Ａ）完全性及びＲＮＡ完全性について評価した。ＣＴＰの増加は、産生されたＲＮＡのポリ（Ａ）及びＲＮＡの完全性の増加をもたらした（図４）。収率の増加もまた、ＣＴＰ濃度の増加とともに観察された（図５）。対照（＋０％）を超えるＣＴＰ体積の増加はまた、定量限界を超えるＣＴＰ濃度の維持をもたらした（図５）。しかしながら、より高いＣＴＰ濃度（例えば、対照から＋５０％）は、ＡＴＰ濃度を定量限界未満にした（図５）。

【0387】

更なる研究は、例示的なＩＶＴ反応混合物におけるＣＴＰ開始濃度の増加（対照と比較して＋１０％ＣＴＰ、＋２０％ＣＴＰ、＋５０％ＣＴＰ）が、完全性及びキャッピングの増加をもたらすことを更に実証した。収率はまた、評価され、ＣＴＰ開始濃度の増加が収率の増加をもたらすことを更に確認した（図６）。

【0388】

更なる例示的なＩＶＴ反応は、ＤＮＡテンプレート（直鎖化プラスミド）、同時転写キャッピングのためのｍ２７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ２’－Ｏ）ＡｐＧ（ＣＣ４１３）キャップ類似体（１．５ｍＭ）、及びヌクレオシド三リン酸塩（ＧＴＰ、ＡＴＰ、及びｍ１ΨＴＰ（各々９ｍＭの最終濃度））の存在下で、実施された。開始ＣＴＰ濃度は、９ｍＭ（標準／対照）、９．９ｍＭ（＋１０％）、１０．８ｍＭ（＋２０％）、及び１３．５ｍＭ（＋５０％）であった。ＧＴＰ／ｍ１ΨＴＰの開始濃度を開始濃度の０．５ｍＭ（１／１８＊９ｍＭ）に減少させ、最終濃度に達するまで１１回の添加で転写反応の過程にわたって供給し、任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、そのようなアプローチが、キャッピング効率を向上させ、及び／またはｄｓＲＮＡを低減し得ることを提言する。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｒｉｂｏｌｏｃｋ）、及び無機ピロホスファターゼ（０．０００１Ｕ／μｌ）の存在下、酢酸マグネシウム（ＭｇＡｃ、４０ｍＭ）、ジチオスレイトール、及びスペルミジンを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液（４０ｍＭ、ｐＨ８．３）を用いて、３７℃で１０５分間反応を実施した。ＩＶＴ後、ＤＮＡテンプレートをＤＮａｓｅ消化を介して除去し、ＲＮＡを固定化のために磁性ビーズを使用して精製した（例えば、Ｂｅｒｅｎｓｍｅｉｅｒ，Ｓ．Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７３，４９５－５０４；１０．１００７／ｓ００２５３－００６－０６７５－０（２００６）を参照されたい）。ＲＮＡを水中で溶出した。ＲＮＡ濃度を、ＵＶ（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）によって測定し、ＩＶＴの収率を計算した（μｇの生成されたＲＮＡ／μｌのＩＶＴ反応体積）。ＲＮＡの完全性をＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒで分析した。このために、５０％ホルムアミド中の２５０ｎｇのＲＮＡを７０℃で１０分間変性させ、Ａｇｉｌｅｎｔ ＲＮＡ ６０００ Ｎａｎｏ Ｋｉｔ（５０６７－１５１１、Ａｇｉｌｅｎｔ）で更に処理した。完全性は後に、完全な電気泳動図の積分に対する主要ピーク積分の関係によって計算された。ｄｓＲＮＡの量を決定するために、ナイロンブロッティング膜（Ｎｙｔｒａｎ ＳｕＰｅｒＣｈａｒｇｅ（ＳＰＣ）Ｎｙｌｏｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｔ＃１０４１６２１６）上に、５μｌのアリコートで１μｇのＲＮＡをスポットした。次いで、膜を、５％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有するＴＢＳ－Ｔ緩衝液（２０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ－２０）中で１時間ブロックした。ｄｓＲＮＡの検出のために、膜を、１％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有するＴＢＳ－Ｔ緩衝液中で１：１０，０００希釈したＪ２ ｄｓＲＮＡ特異的マウスｍＡｂ（Ｅｎｇｌｉｓｈ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ，Ｓｚｉｒａｋ，Ｈｕｎｇａｒｙ）と１時間インキュベートした。ＴＢＳ－Ｔで洗浄した後、膜を、１％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳を含有するＴＢＳ－Ｔ緩衝液中で１：１０，０００希釈したＨＲＰ標識ロバ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ＃７１５－０３５－１５０）で１時間インキュベートし、ＴＢＳ－Ｔで洗浄し、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ＃ＲＰＮ２２３２）及びＣｈｅｍｉＤｏｃ ＭＰイメージングシステム（ＢＩＯ－ＲＡＤ）を使用して発色させた。

【0389】

例示的なＩＶＴ反応混合物におけるＣＴＰレベルの濃縮は、産生されたＲＮＡ収率を高めた（図７Ａ）。いかなる１つの理論に拘束されることを望むものではないが、これは、ＩＶＴ反応中のＣＴＰの減少が、より少ないＲＮＡが産生され得る点に達することを示す。ＣＴＰ開始濃度を増加させることは、この効果を回避することができる。完全性についても同様の効果が見られる。ここで、ＣＴＰレベルを制限することは、ほとんどの場合、未完成のＲＮＡ転写物を介して、完全性を低下させる。繰り返しになるが、この効果は、ＣＴＰレベルの上昇によって救済することができる（図７Ｂ）。追加のプラスの効果として、ＣＴＰ開始濃度を増加させることは、ｄｓＲＮＡ形成を減少させる（図７Ｃ）。本開示によって提供される１つの洞察は、本明細書に記載されるような上昇したＣＴＰ及び／またはＡＴＰの使用が、枯渇とは無関係であってもある特定の利点を提供し得ることである。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、提供される反応条件が、構築物配列とは無関係に利用され得るという洞察を提供する（例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ及び／またはＡが、反応混合物中よりも低いレベル及び／または関連する比率で（本明細書に記載されるように）転写物中に存在する場合）。とりわけ、この洞察は、本明細書に記載されるような標準化されたＩＶＴ産生技術に、商業用グレード及び／または規模の産生のための特定の利点及び効率を提供する。例えば、様々な複数の産生物（例えば、異なるＲＮＡ転写産物の）のために同等の条件及び／または成分を利用する能力は、そのような商業用グレード及び／または規模の産生の再現性、実現可能性、及び／または信頼性を著しく促進及び／または改善することができる。

【0390】

ＣＴＰ濃度を増加させることは、完全性を向上させるだけでなく、収率を向上させ、ｄｓＲＮＡ含有量を減少させる。

【0391】

増加したＣＴＰ濃度を含む追加のＩＶＴ反応混合物を評価した。全ての特性を、プロテイナーゼＫ消化後に測定した。

【表6】

【0392】

表２．４の様々な例示的な条件から産生されたＲＮＡを、プロテイナーゼＫ消化後に測定したＣＴＰ体積によって完全性及びキャッピングについて評価した（図８）。追加的に、産生されたＲＮＡを、デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）によってポリ（Ａ）完全性及びＲＮＡ完全性について評価した。ＣＴＰの増加は、産生されたＲＮＡのポリ（Ａ）及びＲＮＡの完全性の増加をもたらした（図９）。ＩＶＴ反応混合物を含む＋４０％～＋６０％のＣＴＰは、（フラグメントアナライザによる）完全性、５’－キャップ、ポリ（Ａ）尾部、及びｄｄＰＣＲによる完全性のためのこれらの条件の間にほとんど差を示さないが、これらの条件は、対照ＩＶＴ反応混合物（＋０％ＩＶＴ）よりも改善を示す。図１０は、＋４０％～＋６０％のＩＶＴ反応混合物の対照を上回る収率の増加を示すが、＋４０％～＋６０％の範囲で一貫している。残留ヌクレオチド分析は、全ての条件がＡＴＰを枯渇させ続けたことを示した（図１０）。

【0393】

更なる研究は、例示的なＩＶＴ反応混合物における開始ＣＴＰ濃度の増加（対照と比較して＋４０％ＣＴＰ、＋５０％ＣＴＰ、＋６０％ＣＴＰ）が収率及び残留ＣＴＰの増加をもたらす一方、ＡＴＰがこの反応において制限ＮＴＰになったことを更に実証した。興味深いことに、＋４０％を超えるＣＴＰを有するこれらの反応混合物では、更なる収率または完全性の改善は観察されなかった。開始ＣＴＰ濃度が増加したＩＶＴ反応混合物によって産生されたＲＮＡの完全性及びキャッピングは、対照と比較して増加した（図１１）。

【0394】

ＣＴＰ及びＡＴＰが増加したＩＶＴによって、生成された例示的なＲＮＡを評価するために、ＩＶＴ反応を、反応混合物中の＋５０％ＣＴＰ体積及び増加したＡＴＰ体積で行った。いかなる１つの理論に拘束されることを望むものではないが、ＡＴＰは、とりわけ、ポリ（Ａ）尾部の合成のために特に重要であり得る。追加的に増加するＡＴＰ体積の効果を評価するために試験した条件を表２．５に要約する。

【表7】

【0395】

次いで、表２．５の様々な例示的な条件から産生されたＲＮＡを、プロテイナーゼＫ消化後に測定したＣＴＰ体積によって、完全性及びキャッピングについて評価した（図１２）。追加的に、産生されたＲＮＡを、デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応（ｄｄＰＣＲ）によってポリ（Ａ）完全性及びＲＮＡ完全性について評価した。ＣＴＰの増加は、産生されたＲＮＡのポリ（Ａ）及びＲＮＡの完全性の増加をもたらした（図１３）。図１４は、ＩＶＴ反応混合物を含む＋１０％及び＋２０％のＡＴＰの対照を上回る収率の増加、ならびにＩＶＴ反応混合物を含む＋１０及び＋２０％のＡＴＰからの増加を示す。ＡＴＰレベルは、ＩＶＴ反応混合物を含む＋２０％ＡＴＰについては定量下限を超えていたが、ＡＴＰレベルは、対照及びＩＶＴ反応混合物を含む＋１０％ＡＴＰについては定量下限以下であった（図１４）。

【0396】

更なる研究は、例示的なＩＶＴ反応混合物中の開始ＣＴＰ濃度の増加（対照と比較して＋５０％ＣＴＰ）に加えて、開始ＡＴＰ濃度の増加（対照と比較して＋１０％ＡＴＰ、＋２０％ＡＴＰ）が、＋１０％ＡＴＰでの収率、完全性、及びキャッピングの増加をもたらしたが、ＡＴＰは依然として枯渇またはほぼ枯渇していることを更に実証した。＋２０％ＡＴＰ ＩＶＴ反応混合物は、収率の更なる増加を実証したが、完全性またはキャッピングにおいて有意な改善は実証されず、ＧＴＰは、枯渇する（図１５）。

【0397】

実施例４：ＩＶＴ反応混合物の追加の例示的な評価
本実施例は、ＩＶＴ反応混合物の追加の例示的な評価を実証する。図１６は、評価される例示的なＩＶＴ反応混合物、及びＩＶＴ反応混合物中のＣＴＰが増加したときの、産生されたＲＮＡの例示的な特性評価を要約する。ＲＮＡ収率及び完全性の両方は、より高いＣＴＰ開始濃度で増加したが、ｄｓＲＮＡ含有量は、より高いＣＴＰ濃度で減少した。残留ＤＮＡは、より高いＣＴＰ開始濃度で増加した（図１６）。任意の１つの理論に拘束されることを望むものではないが、残留ＤＮＡは、ＤＮＡｓｅ Ｉの活性が、例えば、より低い遊離マグネシウムカチオンレベルから減少していることに起因して、より高いＣＴＰ開始濃度で増加していた可能性がある。

【0398】

追加のＣＴＰのプラスの効果（複数可）は、その制限を回避することによってのみ引き起こされるものではない。他のＮＴＰレベル（例えば、ＡＴＰ）の上昇は、ＩＶＴ性能を更に増加させることができる。任意の１つの理論に拘束されることを望むものではないが、追加のＡＴＰは、「遊離」Ｍｇ２＋イオンを低減し、ポリＡ尾部の転写に寄与し、転写終結の改善をもたらし、潜在的に、ｄｓＲＮＡの形成を更に低減することができる。４０ｍＭ ＭｇＡｃを有するＩＶＴ反応混合物中のＣＴＰ及び／またはＡＴＰの濃縮は、ＧＴＰ及びＵＴＰを供給し、かつ全体的なＮＴＰ濃度を十分に低く保つことにより、ＡＴＰ及びＣＴＰの濃縮がＩＶＴ性能を損なわないため、この範囲においてのみ可能である。

【0399】

例示的なＩＶＴは、ＤＮＡテンプレート（直鎖化プラスミド）、同時転写キャッピングのためのｍ２７，３’－ＯＧｐｐｐ（ｍ２’－Ｏ）ＡｐＧ（ＣＣ４１３）キャップ類似体（１，５ｍＭ）、及びヌクレオシド三リン酸ＧＴＰ及びｍ１ΨＴＰ（各々９ｍＭの最終濃度）の存在下で、実施した。開始ＣＴＰ及びＡＴＰ濃度は、９ｍＭ（標準／対照）及び１３．５ｍＭ（＋５０％）であった。ＣＴＰ及びＡＴＰ濃度の上昇を、単独で及び組み合わせて試験した。

【0400】

実施例２に記載されるように、ＲＮＡをインビトロで転写し、精製し、分析した。

【0401】

ＩＶＴ反応混合物中のＣＴＰレベルの濃縮は、産生されたＲＮＡ収率を増加させた（図１７Ａ）。いずれの１つの理論に拘束されることを望むものではないが、これらの反応において、反応が進行するにつれて、ＣＴＰの減少が、より少ないＲＮＡが産生され得る点に達したことを提言する。ＣＴＰ開始濃度を増加させることは、この効果を回避した。同様の効果が、完全性について見られた。ここで、ＣＴＰレベルを制限することが、未完成のＲＮＡ転写物を介して、完全性を低下させた可能性が最も高い。再度、この効果は、ＣＴＰレベルの上昇によって救済された（図１７Ｂ）。追加のプラスの効果として、ＣＴＰ開始濃度を増加させると、ｄｓＲＮＡの形成が減少した（図１７Ｃ）。

【0402】

とりわけ、本開示は、ＣＴＰ開始濃度の増加が、産生された転写物におけるＣＴＰ表現とは無関係に有益であり得るという洞察を提供する。例えば、任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ｄｓＲＮＡ形成の低減は、転写物中のＣＴＰのレベルとは無関係に観察され得ることを提言する。代替的にまたは追加的に、いくつかの実施形態では、上昇したＣＴＰは、産生された転写物中のＣＴＰ表現とは無関係に完全性を改善し得る。かかわらず、本開示は、ＣＴＰを、産生された転写物に表されるレベルを上回るレベルまで増加させることは、多くの実施形態では、インビトロ転写反応に害を及ぼさないことを教示するため、とりわけ、いくつかの実施形態では、本開示は、様々な転写物、例えば、異なる長さ及び／または異なるヌクレオチド組成物の産生に、一般的に、または普遍的に適用され得るＩＶＴ反応条件（例えば、それにおいて有用な反応混合物ＮＴＰ濃度）を提供する。

【0403】

図１８は、評価される例示的なＩＶＴ反応混合物、ならびにＩＶＴ反応混合物中のＣＴＰ及び／またはＡＴＰが増加したときの、産生されたＲＮＡの例示的な特性評価を要約する。更に、ＩＶＴ反応混合物が、＋５０％ＣＴＰ及び＋２０％ＡＴＰでより高いＲＮＡ収率及びより高いＲＮＡ完全性をもたらしたことを確認した（図１８及び図１９）。ＡＴＰ体積が増加するにつれて、収率、完全性、及び残留ＮＴＰは安定していた。ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びｍｏｄＵＴＰのレベルは、定量下限を超えており、ＡＴＰの量が増加するにつれて安定していた（図１９）。

【0404】

図２０は、対照と比較して、＋２５％ＡＴＰ及び＋７％ＣＴＰ、－２１％ＡＴＰ及び－３７％ＣＴＰ、＋２５％ＡＴＰ、または＋７％ＣＴＰのいずれかを含む反応混合物を利用した、例示的なＩＶＴ反応の収率、完全性、及び残留ｄｓＲＮＡ含有量の例示的な評価を示す。

【0405】

追加の転写物（例えば、非ＢＮＴ１６２ｂ１及びＢＮＴ１６２ｂ２）を、様々なヌクレオチド含有量で評価した。更なるＡＴＰ及び／またはＣＴＰを、例示的なＩＶＴ反応中の反応混合物に添加して、転写物を産生した。１３．５ｍＭ、１０．８ｍＭ ＡＴＰ、９ｍＭ ＧＴＰ、及び９ｍＭ ＵＴＰを含む対照反応混合物と比較して、＋５０％ ＡＴＰまたは＋５０％ ＡＴＰ及び＋２０％ ＣＴＰのいずれかを利用した。追加の転写物及び例示的な反応混合物のヌクレオチド含有量を表４．１に示す。

【表8】

【0406】

均等物
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または定型的な実験のみを使用してそれらを確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、以下の特許請求の範囲に記述されるようなものである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【配列表】

2024534120000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-08-30

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

インビトロ転写を介してリボ核酸（ＲＮＡ）分子を産生する方法であって、反応混合物を反応条件下で作製して、前記ＲＮＡ分子を形成することを含み、前記反応混合物が、核酸ポリメラーゼ、核酸テンプレート、ならびに
総グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）に対するモル比ａの総シチジン三リン酸（ＣＴＰ）及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）及び／または
総ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）に対するモル比ｂの総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）及び／または
総アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）に対するモル比ｃの総ＣＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ類似体（複数可）を含み、
前記ＲＮＡ分子が、
総グアノシン及び／または１つ以上の機能的グアノシン類似体（複数可）に対するモル比ｘの総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）、及び／または
総ウリジン及び／または１つ以上の機能的ウリジン類似体（複数可）に対するモル比ｙの総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）、及び／または
総アデノシン及び／または１つ以上の機能的アデノシン類似体（複数可）に対するモル比ｚの総シチジン及び／または１つ以上の機能的シチジン類似体（複数可）を含み、
ａが、少なくとも１．２５であり、及び／またはａが、ｘの少なくとも約１．１０倍であり、及び／または
ｂが、少なくとも１．２５であり、及び／またはｂが、ｙの少なくとも約１．１０倍であり、及び／または
ｃが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｃが、ｚの少なくとも約１．１０倍である、前記方法。

【請求項2】

ａが、少なくとも１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、または１．８である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ａが、ｘの少なくとも約１．１５倍である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

ｂが、少なくとも１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、１．５０、１．５５、１．６０、１．６５、１．７０、１．７５、または１．８である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

ｂが、ｙの少なくとも約１．１５倍である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

ｃが、少なくとも１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、または１．５０である、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

ｃが、ｚの少なくとも約１．１５倍である、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記反応混合物中に、
総ＧＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＧＴＰ類似体（複数可）に対するモル比ｄの総ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）、及び／または
総ＵＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＵＴＰ類似体（複数可）に対するモル比ｅの総ＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＡＴＰ類似体（複数可）を組み合わせることを更に含み、
前記ＲＮＡ分子が、
総グアノシン及び／または１つ以上の機能的グアノシン類似体（複数可）に対するモル比ｖの総アデノシン及び／または１つ以上の機能的アデノシン類似体（複数可）、及び／または
総ウリジン及び／または１つ以上の機能的ウリジン類似体（複数可）に対するモル比ｗの総アデノシン及び／または１つ以上の機能的アデノシン類似体（複数可）を更に含み、
ｄが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｄが、ｖの少なくとも約１．０５倍であり、及び／または
ｅが、少なくとも１．１０であり、及び／またはｅが、ｗの少なくとも約１．０５倍である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

ｄが、少なくとも１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、または１．５０である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

ｄが、ｖの少なくとも約１．１０倍である、請求項８または９に記載の方法。

【請求項11】

ｅが、少なくとも１．１５、１．２０、１．２５、１．３０、１．３５、１．４０、１．４５、または１．５０である、請求項８～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記ｅが、ｗの少なくとも約１．１０倍、１．１５倍、１．２０倍、１．２５倍、１．３０倍、１．３５倍、１．４０倍、１．４５倍、または１．５０倍である、請求項８～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記総ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、またはＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、またはＡＴＰ類似体（複数可）の一部分または全部が、転写が始まる前及び／または転写の開始時に前記反応混合物に添加され、前記総ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、またはＡＴＰ及び／または１つ以上の機能的ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ、またはＡＴＰ類似体（複数可）の残りの部分が、前記転写の開始後に前記反応混合物に添加される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記ＲＮＡ分子が、一本鎖である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記核酸テンプレートが、ＤＮＡテンプレートである、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記反応混合物が、反応緩衝液、ＲＮａｓｅ阻害剤、ピロホスファターゼ、１つ以上の塩、還元剤、及びスペルミジンのうちの１つ以上を更に含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記方法によって産生されるＲＮＡ分子のＲＮＡ完全性が、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

前記方法によって産生されるＲＮＡ分子のＲＮＡ完全性が、ａが少なくとも１．２５ではなく、ｂが少なくとも１．２５ではなく、及び／またはｃが少なくとも１．１０ではない反応混合物中でのインビトロ転写と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％増加する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

前記方法によって産生されるＲＮＡ分子の濃度が、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、または１５ｍｇ／ｍＬである、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記方法によって産生されるＲＮＡ分子の転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡが、少なくとも約２５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、５０ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、７５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１２５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１５０ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、１７５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２２５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２５０ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、２７５ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡ、または３００ｐｇ ｄｓＲＮＡ／μｇ ＲＮＡである、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

前記方法によって産生されるＲＮＡ分子の転写中及び／または転写後の残留ｄｓＲＮＡが、ａが少なくとも１．２５ではなく、ｂが少なくとも１．２５ではなく、及び／またはｃが少なくとも１．１０ではない反応混合物中でのインビトロ転写と比較して、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％減少する、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記方法によって産生されるＲＮＡ分子の少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％が、キャッピングされる、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

ＲＮＡ分子の配列から実質的に独立している、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

ＲＮＡが、治療用ＲＮＡである、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

ＲＮＡの大規模産生のためのものである、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【国際調査報告】