特表 2024-534123 バキュロウイルス発現システム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-18

(54)【発明の名称】バキュロウイルス発現システム

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/866 20060101AFI20240910BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240910BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240910BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240910BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240910BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240910BHJP

【ＦＩ】

C12N15/866 Z ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024512005

(86)(22)【出願日】2022-08-19

(85)【翻訳文提出日】2024-03-28

(86)【国際出願番号】 US2022075186

(87)【国際公開番号】W WO2023028440

(87)【国際公開日】2023-03-02

(31)【優先権主張番号】PCT/US2021/047218

(32)【優先日】2021-08-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/310,038

(32)【優先日】2022-02-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】512147244

【氏名又は名称】バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】トンヤオ・リウ

(72)【発明者】

【氏名】アジャイ・メゴディア

(72)【発明者】

【氏名】フィリップ・ザカス

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BC01

4B065CA44

(57)【要約】

所望のタンパク質の産生のためのバキュロウイルス発現ベクターが本明細書において提供される。一態様において、所望のタンパク質は、ウイルスファミリーパルボウイルス科のメンバーのゲノムに由来する野生型および／または切断型逆方向末端反復を含むクローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細菌レプリコン；
選択可能なマーカー配列；
トランスポゾンの挿入のための第１の選択的標的部位を含む第１のレポーター遺伝子；
バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された第２のレポーター遺伝子；および
部位特異的組換え事象を媒介することができる第２の選択的標的部位
を含むｂａｃｍｉｄ。

【請求項2】

細菌レプリコンは、低コピー数レプリコンである、請求項１に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項3】

低コピー数レプリコンは、ミニＦレプリコンである、請求項２に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項4】

選択可能なマーカー配列は、抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項5】

抗生物質耐性遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子である、請求項４に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項6】

第１のレポーター遺伝子は、発色基質を代謝することができる酵素をコードする、請求項１～５のいずれか１項に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項7】

酵素は、ＬａｃＺαまたはその機能的部分である、請求項６に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項8】

発色基質は、Ｂｌｕｅ－ｇａｌまたはＸ－ｇａｌである、請求項６または７に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項9】

トランスポゾンの挿入のための第１の選択的標的部位は、第１のレポーター遺伝子のリーディングフレームを妨害しない、請求項１～８のいずれか１項に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項10】

第１の選択的標的部位は、細菌性トランスポゾンのための付着部位である、請求項１～９のいずれか１項に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項11】

第１の選択的標的部位は、Ｔ７トランスポゾンのための付着部位である、請求項１～１０のいずれか１項に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項12】

トランスポゾンは、Ｔ７トランスポゾンである、請求項１１に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項13】

第２のレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする、請求項１～１２のいずれか１項に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項14】

蛍光タンパク質は、赤色蛍光タンパク質である、請求項１３に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項15】

バキュロウイルス誘導性プロモーターは、３９Ｋプロモーターである、請求項１～１４のいずれか１項に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項16】

第２の選択的標的部位は、ＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項17】

部位特異的組換え事象は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介される、請求項１～１６のいずれか１項に記載のｂａｃｍｉｄ。

【請求項18】

ミニＦレプリコン；
抗生物質耐性遺伝子；
Ｔ７トランスポゾンのための付着部位を含むＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分；
バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子；および
ＬｏｘＰ部位またはそのバリアント
を含むｂａｃｍｉｄ。

【請求項19】

細菌レプリコン；
第１の選択可能なマーカー配列；
第１のレポーター遺伝子に挿入された異種配列であって、挿入された異種配列が第１のレポーター遺伝子のリーディングフレームを妨害する、異種配列；
バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された第２のレポーター遺伝子；および
部位特異的組換え事象を媒介することができる選択的標的部位
を含む組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項20】

異種配列は、異種遺伝子を含む、請求項１９に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項21】

異種遺伝子は、タンパク質をコードする配列を含む、請求項１９または２０に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項22】

異種配列は、発現制御配列を含む、請求項２０または２１に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項23】

発現制御配列は、タンパク質をコードする配列に作動可能に連結される、請求項２２に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項24】

発現制御配列は、バキュロウイルスプロモーターを含む、請求項２２または２３に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項25】

バキュロウイルスプロモーターは、最初期、初期、後期、または最晩期の遺伝子プロモーターである、請求項２４に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項26】

バキュロウイルスプロモーターは、ポリヘドリンプロモーター、最初期１プロモーター、および最初期２プロモーターからなる群から選択される、請求項２４または２５に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項27】

発現制御配列は、ポリアデニル化シグナルを含む、請求項２２～２６のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項28】

タンパク質は、ウイルスファミリーパルボウイルス科のメンバーのゲノムから単離されたＲｅｐタンパク質である、請求項２１～２７のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項29】

タンパク質は、パルボウイルスＲｅｐタンパク質である、請求項２１～２８のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項30】

パルボウイルスＲｅｐタンパク質は、Ｂ１９ Ｒｅｐ、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ、ＨＢｏＶ１ Ｒｅｐ、およびＧＰＶ Ｒｅｐからなる群から選択される、請求項２９に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項31】

異種配列は、第２の選択可能なマーカー配列を含む、請求項１９～３０のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項32】

第２の選択可能なマーカー配列は、ゲンタマイシン耐性遺伝子を含む、請求項３１に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項33】

細菌レプリコンは、ミニＦレプリコンである、請求項１９～３２のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項34】

第１の選択可能なマーカー配列は、カナマイシン耐性遺伝子を含む、請求項１９～３３のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項35】

第１のレポーター遺伝子は、ＬａｃＺαまたはその機能的部分をコードする、請求項１９～３４のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項36】

第２のレポーター遺伝子は、赤色蛍光タンパク質をコードする、請求項１９～３５のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項37】

バキュロウイルス誘導性プロモーターは、３９Ｋプロモーターである、請求項１９～３６のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項38】

選択的標的部位は、ＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む、請求項１９～３７のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項39】

部位特異的組換え事象は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介される、請求項１９～３８のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項40】

ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された異種配列であって、Ｒｅｐをコードし、ならびに挿入されたＲｅｐがＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、異種配列；および
ＬｏｘＰ部位またはそのバリアント
を含む組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項41】

細菌レプリコン；
第１の抗生物質耐性遺伝子；
ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された異種配列であって、Ｒｅｐをコードし、ならびに挿入されたＲｅｐがＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、異種配列；
バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子；および
ＬｏｘＰ部位またはそのバリアント
を含む組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項42】

細菌レプリコン；
第１の抗生物質耐性遺伝子；
ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された異種配列であって、Ｂ１９ Ｒｅｐをコードし、ならびに挿入されたＢ１９ ＲｅｐがＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、異種配列；
バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子；および
ＬｏｘＰ部位またはそのバリアント
を含む組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項43】

細菌レプリコン；
第１の抗生物質耐性遺伝子；
ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された異種配列であって、ＧＰＶ Ｒｅｐをコードし、ならびに挿入されたＧＰＶ ＲｅｐがＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、異種配列；
バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子；および
ＬｏｘＰ部位またはそのバリアント
を含む組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項44】

細菌レプリコン；
第１の抗生物質耐性遺伝子；
ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された異種配列であって、ＡＡＶ２ Ｒｅｐをコードし、ならびに挿入されたＡＡＶ２ ＲｅｐがＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、異種配列；
バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子；および
ＬｏｘＰ部位またはそのバリアント
を含む組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項45】

第１の細菌株における核酸ベクターを伝搬するための第１の複製起点であって、条件付きの複製起点である、第１の複製起点；
第２の細菌株における核酸ベクターを伝搬するための第２の複製起点；
異種配列の挿入のための多重クローニング部位；
選択可能なマーカー配列；
レポーター遺伝子；および
部位特異的組換え事象を媒介することができる選択的標的部位
を含む核酸ベクター。

【請求項46】

第１の複製起点は、π－タンパク質の存在に関して条件付きである、請求項４５に記載のベクター。

【請求項47】

第１の複製起点は、Ｒ６Ｋγである、請求項４５または４６に記載のベクター。

【請求項48】

第１の細菌株は、π－タンパク質を含む、請求項４５～４７のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項49】

第２の複製起点は、ｐＵＣ５７である、請求項４５～４８のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項50】

選択可能なマーカー配列は、抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項４５～４９のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項51】

抗生物質耐性遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子である、請求項５０に記載のベクター。

【請求項52】

レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする、請求項４５～５１のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項53】

蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質である、請求項５２に記載のベクター。

【請求項54】

選択的標的部位は、ＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む、請求項４５～５３のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項55】

部位特異的組換え事象は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介される、請求項４５～５４のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項56】

第１の細菌株における核酸ベクターを伝搬するための第１の複製起点であって、条件付きの複製起点である、第１の複製起点；
第２の細菌株における核酸ベクターを伝搬するための第２の複製起点；
異種配列；
選択可能なマーカー配列；
レポーター遺伝子；および
部位特異的組換え事象を媒介することができる選択的標的部位
を含む核酸ベクター。

【請求項57】

異種配列は、異種遺伝子を含む、請求項５６に記載のベクター。

【請求項58】

異種遺伝子は、タンパク質をコードする配列を含む、請求項５７に記載のベクター。

【請求項59】

異種配列は、発現制御配列を含む、請求項５７または５８に記載のベクター。

【請求項60】

発現制御配列は、タンパク質をコードする配列に作動可能に連結される、請求項５９に記載のベクター。

【請求項61】

発現制御配列は、組織特異的プロモーターを含む、請求項５９または６０に記載のベクター。

【請求項62】

組織特異的プロモーターは、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）またはマウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである、請求項６１に記載のベクター。

【請求項63】

発現制御配列は、ポリアデニル化シグナルを含む、請求項５９～６２のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項64】

ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、請求項６３に記載のベクター。

【請求項65】

発現制御配列は、転写後調節エレメントを含む、請求項５９～６４のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項66】

転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項６５に記載のベクター。

【請求項67】

タンパク質は、治療用タンパク質である、請求項５８～６６のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項68】

治療用タンパク質が凝固因子である、請求項６７に記載のベクター。

【請求項69】

凝固因子は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である、請求項６６に記載のベクター。

【請求項70】

凝固因子は、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮである、請求項６８または６９に記載のベクター。

【請求項71】

異種配列は、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項５６～７０のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項72】

異種配列は、３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項５６～７１のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項73】

５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、パルボウイルスに由来する、請求項７１または７２に記載のベクター。

【請求項74】

パルボウイルスは、Ｂ１９、ＧＰＶ、ＨＢｏＶ１、およびＡＡＶ２からなる群から選択される、請求項７３に記載のベクター。

【請求項75】

５’ＩＴＲは、Ｂ１９に由来する野生型またはバリアント５’ＩＴＲである、請求項７１～７４のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項76】

５’ＩＴＲは、ＧＰＶに由来する野生型またはバリアント５’ＩＴＲである、請求項７１～７４のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項77】

５’ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来する野生型またはバリアント５’ＩＴＲである、請求項７１～７４のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項78】

５’ＩＴＲは、ＨＢｏＶ１に由来する野生型５’ＩＴＲである、請求項７１～７４のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項79】

バリアント５’ＩＴＲは、切断型５’ＩＴＲである、請求項７５～７７のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項80】

３’ＩＴＲは、Ｂ１９に由来する野生型またはバリアント３’ＩＴＲである、請求項７１～７９のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項81】

３’ＩＴＲは、ＧＰＶに由来する野生型またはバリアント３’ＩＴＲである、請求項７１～７８のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項82】

３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来する野生型またはバリアント３’ＩＴＲである、請求項７１～７８のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項83】

３’ＩＴＲは、ＨＢｏＶ１に由来する野生型３’ＩＴＲである、請求項７１～７８のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項84】

バリアント３’ＩＴＲは、切断型３’ＩＴＲである、請求項８０～８２のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項85】

第１の複製起点は、π－タンパク質の存在に関して条件付きである、請求項５６～７６のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項86】

第１の複製起点は、Ｒ６Ｋγである、請求項８５に記載のベクター。

【請求項87】

第１の細菌株は、π－タンパク質を含む、請求項８５または８６に記載のベクター。

【請求項88】

第２の複製起点は、ｐＵＣ５７である、請求項５６～８７のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項89】

選択可能なマーカー配列は、抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項５６～８８のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項90】

抗生物質耐性遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子である、請求項８９に記載のベクター。

【請求項91】

レポーター遺伝子が蛍光タンパク質をコードする、請求項５６～９０のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項92】

蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質である、請求項９１に記載のベクター。

【請求項93】

選択的標的部位は、ＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む、請求項５６～９２のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項94】

部位特異的組換え事象は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介される、請求項５６～９３のいずれか１項に記載のベクター。

【請求項95】

第１のレポーター遺伝子に挿入された第１の異種配列であって、挿入された異種配列が第１のレポーター遺伝子のリーディングフレームを妨害する、第１の異種配列；
部位特異的組換え事象を媒介することができる第１の選択的標的部位；
第２の異種配列を含む多重クローニング部位；および
部位特異的組換え事象を媒介することができる第２の選択的標的部位
を含む組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項96】

第１の異種配列は、第１の異種遺伝子を含む、請求項９５に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項97】

第１の異種配列は、タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む、請求項９６に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項98】

発現制御配列は、バキュロウイルスプロモーターを含む、請求項９７に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項99】

バキュロウイルスプロモーターは、最初期、初期、後期、または最晩期のプロモーターである、請求項９８に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項100】

バキュロウイルスプロモーターは、ポリヘドリンプロモーター、最初期１プロモーター、および最初期２プロモーターからなる群から選択される、請求項９９に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項101】

タンパク質は、ウイルスファミリーパルボウイルス科のメンバーのゲノムから単離されたＲｅｐタンパク質である、請求項９７～１００のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項102】

タンパク質は、パルボウイルスＲｅｐタンパク質である、請求項９７～１０１のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項103】

パルボウイルスＲｅｐタンパク質は、Ｂ１９ Ｒｅｐ、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ、ＨＢｏＶ１ Ｒｅｐ、およびＧＰＶ Ｒｅｐからなる群から選択される、請求項１０２に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項104】

第２の異種配列は、第２の異種遺伝子を含む、請求項９５～１０３のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項105】

第２の異種配列は、タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む、請求項１０４に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項106】

発現制御配列は、組織特異的プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および／または転写後調節エレメントを含む、請求項１０５に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項107】

組織特異的プロモーターは、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）またはマウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである、請求項１０６に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項108】

ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、請求項１０７に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項109】

転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項１０７に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項110】

タンパク質は、治療用タンパク質である、請求項１０５～１０９のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項111】

治療用タンパク質が凝固因子である、請求項１１０に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項112】

凝固因子は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である、請求項１１１に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項113】

凝固因子は、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮである、請求項１１１または１１２に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項114】

第２の異種配列は、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項９５～１１３のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項115】

第２の異種配列は、３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む、請求項９５～１１４のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項116】

５’ＩＴＲは、ウイルスファミリーパルボウイルス科の第１のメンバーのゲノムに由来し、ならびに３’ＩＴＲは、ウイルスファミリーパルボウイルス科の第２のメンバーのゲノムに由来する、請求項１１５に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項117】

第１および第２のメンバーは、同じである、請求項１１６に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項118】

第１および第２のメンバーは、異なる、請求項１１６に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項119】

５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、Ｂ１９、ＧＰＶ、ＨＢｏＶ１、およびＡＡＶ２からなる群から選択されるパルボウイルスに由来する、請求項１１４～１１８のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項120】

５’ＩＴＲは、Ｂ１９に由来する野生型または切断型５’ＩＴＲである、請求項１１９に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項121】

５’ＩＴＲは、ＧＰＶに由来する野生型または切断型５’ＩＴＲである、請求項１１９に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項122】

５’ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来する野生型または切断型５’ＩＴＲである、請求項１１９に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項123】

５’ＩＴＲは、ＨＢｏＶ１に由来する野生型５’ＩＴＲである、請求項１１９に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項124】

３’ＩＴＲは、Ｂ１９に由来する野生型または切断型３’ＩＴＲである、請求項１１９に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項125】

３’ＩＴＲは、ＧＰＶに由来する野生型または切断型３’ＩＴＲである、請求項１１９に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項126】

３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来する野生型または切断型３’ＩＴＲである、請求項１１９に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項127】

３’ＩＴＲは、ＨＢｏＶ１に由来する野生型３’ＩＴＲである、請求項１１９に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項128】

さらに、細菌レプリコンを含む、請求項９５～１２６のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項129】

細菌レプリコンは、ミニＦレプリコンである、請求項１２８に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項130】

さらに、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー配列を含む、請求項９５～１２９のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項131】

１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー配列は、１つまたはそれ以上の抗生物質耐性遺伝子を含む、請求項１３０に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項132】

１つまたはそれ以上の抗生物質耐性遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、およびゲンタマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される、請求項１３１に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項133】

第１のレポーター遺伝子は、ＬａｃＺαまたはその機能的部分をコードする、請求項９５～１３２のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項134】

さらに、少なくとも第２および第３のレポーター遺伝子を含む、請求項９５～１３３のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項135】

第２および第３のレポーター遺伝子はそれぞれ、蛍光タンパク質をコードする、請求項１３４に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項136】

蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質である、請求項１３５に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項137】

第１および第２の選択的標的部位は、ＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む、請求項９５～１３６のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項138】

部位特異的組換え事象は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介される、請求項９５～１３７のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項139】

Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＲｅｐ配列がＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列：および
異種配列であって、５’から３’に向かって：
ウイルスファミリーパルボウイルス科のメンバーの第１のゲノムに由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；
タンパク質をコードする配列；
タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；および
ウイルスファミリーパルボウイルス科のメンバーの第２のゲノムに由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復
を含む異種配列
を含む組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項140】

ウイルスファミリーパルボウイルス科の第１および第２のゲノムは、同じである、請求項１３９に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項141】

ウイルスファミリーパルボウイルス科の第１および第２のゲノムは、異なる、請求項１４０に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項142】

Ｒｅｐは、ウイルスファミリーパルボウイルス科のメンバーの第１または第２のゲノムに由来する、請求項１３９～１４１のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項143】

Ｂ１９ Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＢ１９ Ｒｅｐ配列がＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；および
異種配列であって、５’から３’に向かって：
Ｂ１９に由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；
タンパク質をコードする配列；
タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；および
Ｂ１９に由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復
を含む異種配列
を含む組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項144】

ＧＰＶ Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＧＰＶ Ｒｅｐ配列がＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；および
異種配列であって、５’から３’に向かって：
ＧＰＶに由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；
タンパク質をコードする配列；
タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；および
ＧＰＶに由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復
を含む異種配列
を含む組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項145】

ＡＡＶ２ Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＡＡＶ２ Ｒｅｐ配列がＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；および
異種配列であって、５’から３’に向かって：
ＡＡＶ２に由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；
タンパク質をコードする配列；
タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；および
ＡＡＶ２に由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復
を含む異種配列
を含む組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項146】

ＨＢｏＶ１ Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＨＢｏＶ１ Ｒｅｐ配列がＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；および
異種配列であって、５’から３’に向かって：
ＨＢｏＶ１に由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；
タンパク質をコードする配列；
タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；および
ＨＢｏＶ１に由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復
を含む異種配列
を含む組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項147】

タンパク質は、治療用タンパク質である、請求項１３９～１４６のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項148】

治療用タンパク質が凝固因子である、請求項１４７に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項149】

凝固因子は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である、請求項１４８に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項150】

凝固因子は、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮである、請求項１４８または１４９に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項151】

Ｒｅｐタンパク質をコードする配列であって、Ｒｅｐがレポーター遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；および
配列番号２０の核酸配列を含む異種配列
を含む組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項152】

異種配列は、配列番号１９の核酸配列を含む、請求項１４７に記載の組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項153】

Ｒｅｐタンパク質をコードする配列であって、Ｒｅｐがレポーター遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；および
配列番号２９の核酸配列を含む異種配列
を含む組換えｂａｃｍｉｄ。

【請求項154】

請求項１～１８のいずれか１項に記載のｂａｃｍｉｄを含む宿主細胞。

【請求項155】

請求項１９～４４のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄを含む宿主細胞。

【請求項156】

請求項４５～５５のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項157】

請求項５６～９４のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項158】

請求項９５～１５３のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄを含む宿主細胞。

【請求項159】

請求項１９～４４のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄを生成する方法であって、
細菌細胞に：
請求項１～１８のいずれか１項に記載のｂａｃｍｉｄ；および
請求項１９～４４のいずれか１項に記載の異種配列を含むトランスポゾンに作動可能に連結された細菌レプリコンを含むドナー核酸分子、
を導入すること；
転移が生じる条件下において細菌細胞をインキュベートすること；および
細菌細胞から組換えｂａｃｍｉｄを単離すること
を含む方法。

【請求項160】

請求項９５～１５３のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄを生成する方法であって、
細菌細胞に：
請求項１９～４４のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄ；
請求項５６～９４のいずれか１項に記載のベクター；および
Ｃｒｅリコンビナーゼ、
を導入すること；
部位特異的組換えが生じる条件下において細菌細胞をインキュベートすること；および
細菌細胞から組換えｂａｃｍｉｄを単離すること
を含む方法。

【請求項161】

組換えバキュロウイルスを生成する方法であって、
適切な条件下において、請求項９５～１５３のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄを昆虫細胞にトランスフェクトすること
を含む方法。

【請求項162】

クローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、
昆虫細胞に、請求項１～４４および９５～１５３のいずれか１項に記載のｂａｃｍｉｄを含む組換えバキュロウイルスを感染させること
を含む方法。

【請求項163】

クローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、
組換えバキュロウイルスを生成するために適切な条件下において請求項１３９～１５３のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄを昆虫細胞へトランスフェクトすること；および
ｃｅＤＮＡ分子を生成するのに適切な条件下において第２の昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させること
を含む方法。

【請求項164】

組換えバキュロウイルスは、単一のｂａｃｍｉｄを含む、請求項１６１～１６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項165】

野生型または切断型Ｂ１９逆方向末端反復を含むクローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、
組換えバキュロウイルスを生成するために適切な条件下において請求項１３９に記載の組換えｂａｃｍｉｄを昆虫細胞へトランスフェクトすること；および
ｃｅＤＮＡ分子を生成するのに適切な条件下において第２の昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させること
を含む方法。

【請求項167】

野生型または切断型ＧＰＶ逆方向末端反復を含むクローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、
組換えバキュロウイルスを生成するために適切な条件下において請求項１３９に記載の組換えｂａｃｍｉｄを昆虫細胞へトランスフェクトすること；および
ｃｅＤＮＡ分子を生成するのに適切な条件下において第２の昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させること
を含む方法。

【請求項168】

野生型または切断型ＡＡＶ２逆方向末端反復を含むクローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、
組換えバキュロウイルスを生成するために適切な条件下において請求項１３９に記載の組換えｂａｃｍｉｄを昆虫細胞へトランスフェクトすること；および
ｃｅＤＮＡ分子を生成するのに適切な条件下において第２の昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させること
を含む方法。

【請求項169】

野生型ＨＢｏＶ１逆方向末端反復を含むクローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、
組換えバキュロウイルスを生成するために適切な条件下において請求項１３９に記載の組換えｂａｃｍｉｄを昆虫細胞へトランスフェクトすること；および
ｃｅＤＮＡ分子を生成するのに適切な条件下において第２の昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させること
を含む方法。

【請求項170】

核酸配列を含むプラスミドであって、５’から３’に向かって：
ウイルスファミリーパルボウイルス科の第１のメンバーのゲノムに由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；
タンパク質をコードする配列；
タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；および
ウイルスファミリーパルボウイルス科の第２のメンバーのゲノムに由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復
を含むプラスミド。

【請求項171】

１つまたはそれ以上の発現制御配列は、組織特異的プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および／または転写後調節エレメントを含む、請求項１７０に記載のプラスミド。

【請求項172】

組織特異的プロモーターは、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）またはマウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである、請求項１７１に記載のプラスミド。

【請求項173】

ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである、請求項１７０または１７１に記載のプラスミド。

【請求項174】

転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である、請求項１７０～１７３のいずれか１項に記載のプラスミド。

【請求項175】

タンパク質は、治療用タンパク質である、請求項１７０～１７４のいずれか１項に記載のプラスミド。

【請求項176】

治療用タンパク質が凝固因子である、請求項１７５に記載のプラスミド。

【請求項177】

凝固因子は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である、請求項１７６に記載のプラスミド。

【請求項178】

凝固因子は、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮである、請求項１７６または１７７に記載のプラスミド。

【請求項179】

凝固因子は、配列番号２０の核酸配列を含む、請求項１７６～１７８のいずれか１項に記載のプラスミド。

【請求項180】

第１および／または第２のメンバーは、Ｂ１９、ＧＰＶ、ＨＢｏＶ１、およびＡＡＶ２からなる群から選択される、請求項１７０～１７９のいずれか１項に記載のプラスミド。

【請求項180】

第１および／または第２のメンバーは、同じである、請求項１８０に記載のプラスミド。

【請求項181】

第１および第／または２のメンバーは、異なる、請求項１８０に記載のプラスミド。

【請求項182】

核酸配列は、安定細胞株のゲノムに安定に組み込まれる、請求項１７０～１８１のいずれか１項に記載の核酸配列を含む安定細胞株。

【請求項183】

安定細胞株は、安定昆虫細胞株である、請求項１８２に記載の安定細胞株。

【請求項184】

安定昆虫細胞株は、Ｓｆ９である、請求項１８３に記載の安定細胞株。

【請求項185】

野生型または切断型逆方向末端反復を含むクローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、
請求項１８２～１８４のいずれか１項に記載の安定細胞株にＲｅｐタンパク質をコードするバキュロウイルスを導入することを含む方法。

【請求項186】

安定細胞株は、昆虫細胞株である、請求項１８５に記載の方法。

【請求項187】

昆虫細胞株は、Ｓｆ９である、請求項１８６に記載の方法。

【請求項188】

第１のｂａｃｍｉｄおよび第２のｂａｃｍｉｄを含む組換えｂａｃｍｉｄのセットであって、
第１のｂａｃｍｉｄが、ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入されたＲｅｐをコードする配列を含み、挿入されたＲｅｐがレポーター遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害し、ならびに
第２のｂａｃｍｉｄが異種配列を含み、異種配列が、５’から３’に向かって：
ウイルスファミリーパルボウイルス科のメンバーの第１のゲノムに由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）；
タンパク質をコードする配列；
タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；および
ウイルスファミリーパルボウイルス科のメンバーの第２のゲノムに由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）
を含む、
組換えｂａｃｍｉｄのセット。

【請求項189】

５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、Ｂ１９、ＧＰＶ、ＨＢｏＶ１、およびＡＡＶ２からなる群から選択されるパルボウイルスに由来する、請求項１８２に記載の組換えｂａｃｍｉｄのセット。

【請求項190】

異種配列は、配列番号２０の核酸配列を含む、請求項１８８または１８９に記載の組換えｂａｃｍｉｄのセット。

【請求項191】

異種配列は、配列番号１９の核酸配列を含む、請求項１８８または１８９に記載の組換えｂａｃｍｉｄのセット。

【請求項192】

異種配列は、配列番号２９の核酸配列を含む、請求項１８８または１８９に記載の組換えｂａｃｍｉｄのセット。

【請求項193】

クローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、
昆虫細胞に請求項１８８～１９２のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄのセットを含む組換えバキュロウイルスを感染させること
を含む方法。

【請求項194】

クローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、
組換えバキュロウイルスを生成するために適切な条件下において請求項１８８～１９２のいずれか１項に記載の組換えｂａｃｍｉｄのセットを昆虫細胞へトランスフェクトすること；および
ｃｅＤＮＡ分子を生成するのに適切な条件下において第２の昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させること
を含む方法。

【請求項195】

細菌レプリコン；
第１の抗生物質耐性遺伝子；
ＨＢｏＶ１ Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＨＢｏＶ１ Ｒｅｐ配列がＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；
バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子；および
ＬｏｘＰ部位またはそのバリアント
を含む組換えｂａｃｍｉｄ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本願は、２０２１年８月２３日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０４７２１８号および２０２２年２月１４日に出願された米国特許仮出願第６３／３１０，０３８号に対する優先権を主張するものであり、なお、当該特許の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

【0002】

電子的に提出された配列一覧に対する参照
ＡＳＣＩＩテキストファイルで電子的に提出された配列リスト（名前：７３２８４１＿ＳＡ９－４７４ＢＰＣ＿ＳＴ２６．ｘｍｌ；サイズ：８６．２ＫＢ；および作成年月日２０２２年８月１７日）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

【背景技術】

【0003】

遺伝子療法は、様々な疾患を治療する永続的な手段の可能性を提供する。遺伝子療法治療における最近の進展は、ウイルスまたは非ウイルスベクターの使用を採用している。現在、遺伝子療法ベクターの産生のためにいくつかの技術が使用されている。

【0004】

例えば、バキュロウイルス発現ベクターシステム（ＢＥＶＳ）は、遺伝子療法ベクターの産生のための確立したシステムである。このシステムでは、昆虫宿主細胞が、組換えバキュロウイルスに感染させられる。昆虫宿主細胞は、遺伝子組換えバキュロウイルスによってコードされる産物を産生するために、必要なタンパク質加工機構を提供する。ＢＥＶＳは、多くの異なる用途、例えば、ワクチン、治療用タンパク質、タンパク質結晶学、および基礎および応用研究のための産物など、のための産物を産生するために使用されてきた。遺伝子療法のためのウイルスベクターを作製する場合、いくつかのバキュロウイルス発現ベクターがしばしば使用され、昆虫宿主細胞に感染させられた。それぞれのバキュロウイルス発現ベクターの生成は時間がかかり、ならびに、製造のためのコストを引き上げる。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、既存のシステムの制限を避けつつ、改良されたバキュロウイルス発現バキュロウイルス発現ベクターシステムが、当技術分野において必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0006】

治療薬産物を産生するように設計されたバキュロウイルスシャトルベクター（ｂａｃｍｉｄ）および／または安定細胞株を含むバキュロウイルス発現ベクターシステムが、本明細書において提供される。本明細書において提供されるバキュロウイルス発現ベクターシステムは、１つまたはそれ以上の外来配列挿入部位、および外来配列挿入部位への外来配列（例えば、異種遺伝子）の挿入を媒介することができる１つまたはそれ以上のドナーベクターを含む組換えｂａｃｍｉｄを含む。

【0007】

一態様において、細菌レプリコン；選択可能なマーカー配列；トランスポゾンの挿入のための第１の選択的標的部位を含む第１のレポーター遺伝子；バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された第２のレポーター遺伝子；および部位特異的組換え事象を媒介することができる第２の選択的標的部位を含むｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0008】

ある特定の例示的実施形態において、細菌レプリコンは、低コピー数レプリコンである。ある特定の例示的実施形態において、低コピー数レプリコンは、ミニＦレプリコンである。

【0009】

ある特定の例示的実施形態において、選択可能なマーカー配列は、抗生物質耐性遺伝子を含む。ある特定の例示的実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子である。

【0010】

ある特定の例示的実施形態において、第１のレポーター遺伝子は、発色基質を代謝することができる酵素をコードする。ある特定の例示的実施形態において、当該酵素は、ＬａｃＺαまたはその機能的部分である。ある特定の例示的実施形態において、発色基質は、Ｂｌｕｅ－ｇａｌまたはＸ－ｇａｌである。

【0011】

ある特定の例示的実施形態において、トランスポゾンの挿入のための第１の選択的標的部位は、第１のレポーター遺伝子のリーディングフレームを妨害しない。ある特定の例示的実施形態において、第１の選択的標的部位は、細菌性トランスポゾンのための付着部位である。ある特定の例示的実施形態において、第１の選択的標的部位は、Ｔ７トランスポゾンのための付着部位である。ある特定の例示的実施形態において、トランスポゾンは、Ｔ７トランスポゾンである。

【0012】

ある特定の例示的実施形態において、第２のレポーター遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする。ある特定の例示的実施形態において、蛍光タンパク質は、赤色蛍光タンパク質である。

【0013】

ある特定の例示的実施形態において、バキュロウイルス誘導性プロモーターは、３９Ｋプロモーターである。

【0014】

ある特定の例示的実施形態において、第２の選択的標的部位は、ＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む。

【0015】

ある特定の例示的実施形態において、部位特異的組換え事象は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介される。

【0016】

別の態様において、ミニＦレプリコン；抗生物質耐性遺伝子；Ｔ７トランスポゾンのための付着部位を含むＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分；バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子；およびＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含むｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0017】

別の態様において、以下：細菌レプリコン；第１の選択可能なマーカー配列；挿入された異種配列が第１のレポーター遺伝子のリーディングフレームを妨害する、第１のレポーター遺伝子に挿入された異種配列；バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された第２のレポーター遺伝子；および部位特異的組換え事象を媒介することができる選択的標的部位を含む組換えｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0018】

ある特定の例示的実施形態において、異種配列は、異種遺伝子を含む。ある特定の例示的実施形態において、異種遺伝子は、タンパク質をコードする配列を含む。

【0019】

ある特定の例示的実施形態において、異種配列は、さらに、発現制御配列を含む。ある特定の例示的実施形態において、発現制御配列は、タンパク質をコードする配列に作動可能に連結される。

【0020】

ある特定の例示的実施形態において、発現制御配列は、バキュロウイルスプロモーターを含む。ある特定の例示的実施形態において、バキュロウイルスプロモーターは、最初期、初期、後期、または最晩期の遺伝子プロモーターである。ある特定の例示的実施形態において、バキュロウイルスプロモーターは、ポリヘドリンプロモーター；最初期１プロモーター；および最初期２プロモーターからなる群から選択される。

【0021】

ある特定の例示的実施形態において、発現制御配列は、ポリアデニル化シグナルを含む。

【0022】

ある特定の例示的実施形態において、タンパク質は、ウイルスファミリーパルボウイルス科のメンバーのゲノムから単離されたＲｅｐタンパク質である。ある特定の例示的実施形態において、タンパク質は、パルボウイルスＲｅｐタンパク質である。ある特定の例示的実施形態において、パルボウイルスＲｅｐタンパク質は、Ｂ１９ Ｒｅｐ、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ、ＨＢｏＶ１ Ｒｅｐ、およびＧＰＶ Ｒｅｐからなる群から選択される。

【0023】

ある特定の例示的実施形態において、異種配列は、第２の選択可能なマーカー配列を含む。ある特定の例示的実施形態において、第２の選択可能なマーカー配列は、ゲンタマイシン耐性遺伝子を含む。

【0024】

ある特定の例示的実施形態において、細菌レプリコンは、ミニＦレプリコンである。ある特定の例示的実施形態において、第１の選択可能なマーカー配列は、カナマイシン耐性遺伝子を含む。ある特定の例示的実施形態において、第１のレポーター遺伝子は、ＬａｃＺαまたはその機能的部分をコードする。ある特定の例示的実施形態において、第２のレポーター遺伝子は、赤色蛍光タンパク質をコードする。ある特定の例示的実施形態において、バキュロウイルス誘導性プロモーターは、３９Ｋプロモーターである。ある特定の例示的実施形態において、第２の選択的標的部位は、ＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む。ある特定の例示的実施形態において、部位特異的組換え事象は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介される。

【0025】

別の態様において、以下：ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された異種配列であって、Ｒｅｐをコードし、挿入されたＲｅｐがＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、異種配列；およびＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む組換えｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0026】

別の態様において、以下：細菌レプリコン；第１の抗生物質耐性遺伝子；ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された異種配列であって、Ｒｅｐをコードし、挿入されたＲｅｐがＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、異種配列；バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子；およびＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む組換えｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0027】

別の態様において、以下：細菌レプリコン；第１の抗生物質耐性遺伝子；ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された異種配列であって、Ｂ１９ Ｒｅｐをコードし、挿入されたＢ１９ ＲｅｐがＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、異種配列；バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子；およびＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む組換えｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0028】

別の態様において、以下：細菌レプリコン；第１の抗生物質耐性遺伝子；ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された異種配列であって、ＧＰＶ Ｒｅｐをコードし、挿入されたＧＰＶ ＲｅｐがＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、異種配列；バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子；およびＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む組換えｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0029】

別の態様において、以下：
細菌レプリコン；第１の抗生物質耐性遺伝子；ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された異種配列であって、ＡＡＶ２ Ｒｅｐをコードし、挿入されたＡＡＶ２ ＲｅｐがＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、異種配列；バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子；およびＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む組換えｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0030】

別の態様において、第１の細菌株における核酸ベクターを伝搬するための第１の複製起点であって、条件付きの複製起点（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）である、第１の複製起点；第２の細菌株における核酸ベクターを伝搬するための第２の複製起点；異種配列の挿入のための多重クローニング部位；選択可能なマーカー配列と；レポーター遺伝子と；および部位特異的組換え事象を媒介することができる選択的標的部位を含む核酸ベクターが、本明細書において提供される。

【0031】

ある特定の例示的実施形態において、第１の複製起点は、π－タンパク質の存在に関して条件付きである。ある特定の例示的実施形態において、第１の複製起点は、Ｒ６Ｋγである。

【0032】

ある特定の例示的実施形態において、第１の細菌株は、π－タンパク質を含む。

【0033】

ある特定の例示的実施形態において、第２の複製起点は、ｐＵＣ５７である。

【0034】

ある特定の例示的実施形態において、選択可能なマーカー配列は、抗生物質耐性遺伝子を含む。ある特定の例示的実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子である。

【0035】

ある特定の例示的実施形態において、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする。ある特定の例示的実施形態において、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質である。

【0036】

ある特定の例示的実施形態において、選択的標的部位は、ＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む。ある特定の例示的実施形態において、部位特異的組換え事象は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介される。

【0037】

別の態様において、第１の細菌株における核酸ベクターを伝搬するための第１の複製起点であって、条件付きの複製起点である、第１の複製起点；第２の細菌株における核酸ベクターを伝搬するための第２の複製起点；異種配列を含む多重クローニング部位；選択可能なマーカー配列；レポーター遺伝子；および部位特異的組換え事象を媒介することができる選択的標的部位を含む核酸ベクターが、本明細書において提供される。

【0038】

ある特定の例示的実施形態において、異種配列は、異種遺伝子を含む。ある特定の例示的実施形態において、異種遺伝子は、タンパク質をコードする配列を含む。

【0039】

ある特定の例示的実施形態において、異種配列は、さらに、発現制御配列を含む。ある特定の例示的実施形態において、発現制御配列は、タンパク質をコードする配列に作動可能に連結される。ある特定の例示的実施形態において、発現制御配列は、組織特異的プロモーターを含む。ある特定の例示的実施形態において、組織特異的プロモーターは、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）またはマウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである。ある特定の例示的実施形態において、発現制御配列は、ポリアデニル化シグナルを含む。ある特定の例示的実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである。ある特定の例示的実施形態において、発現制御配列は、転写後調節エレメントを含む。ある特定の例示的実施形態において、転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。

【0040】

ある特定の例示的実施形態において、タンパク質は、治療用タンパク質である。ある特定の例示的実施形態において、治療用タンパク質は、凝固因子である。ある特定の例示的実施形態において、凝固因子は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である。ある特定の例示的実施形態において、凝固因子は、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮである。

【0041】

ある特定の例示的実施形態において、異種配列は、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。ある特定の例示的実施形態において、異種配列は、３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。ある特定の例示的実施形態において、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、パルボウイルスに由来する。ある特定の例示的実施形態において、パルボウイルスは、Ｂ１９、ＧＰＶ、ＨＢｏＶ１、およびＡＡＶ２からなる群から選択される。ある特定の例示的実施形態において、５’ＩＴＲは、Ｂ１９に由来する野生型またはバリアント５’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、５’ＩＴＲは、ＧＰＶに由来する野生型またはバリアント５’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、５’ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来する野生型またはバリアント５’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、５’ＩＴＲは、ＨＢｏＶ１に由来する野生型またはバリアント５’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、バリアント５’ＩＴＲは、切断型５’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、３’ＩＴＲは、Ｂ１９に由来する野生型またはバリアント３’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、３’ＩＴＲは、ＧＰＶに由来する野生型またはバリアント３’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来する野生型またはバリアント３’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、バリアント３’ＩＴＲは、切断型３’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、３’ＩＴＲは、ＨＢｏＶ１に由来する野生型３’ＩＴＲである。

【0042】

ある特定の例示的実施形態において、第１の複製起点は、π－タンパク質の存在に関して条件付きである。ある特定の例示的実施形態において、第１の複製起点は、Ｒ６Ｋγである。

【0043】

ある特定の例示的実施形態において、第１の細菌株は、π－タンパク質を含む。

【0044】

ある特定の例示的実施形態において、第２の複製起点は、ｐＵＣ５７である。

【0045】

ある特定の例示的実施形態において、選択可能なマーカー配列は、抗生物質耐性遺伝子を含む。ある特定の例示的実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子である。

【0046】

ある特定の例示的実施形態において、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする。ある特定の例示的実施形態において、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質である。

【0047】

ある特定の例示的実施形態において、選択的標的部位は、ＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む。ある特定の例示的実施形態において、部位特異的組換え事象は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介される。

【0048】

別の態様において、以下：第１のレポーター遺伝子のリーディングフレームを妨害する、第１のレポーター遺伝子に挿入された第１の異種配列；部位特異的組換え事象を媒介することができる第１の選択的標的部位；第２の異種配列を含む多重クローニング部位；部位特異的組換え事象を媒介することができる第２の選択的標的部位を含む組換えｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0049】

ある特定の例示的実施形態において、第１の異種配列は、第１の異種遺伝子を含む。ある特定の例示的実施形態において、第１の異種配列は、タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む。

【0050】

ある特定の例示的実施形態において、発現制御配列は、バキュロウイルスプロモーターを含む。ある特定の例示的実施形態において、バキュロウイルスプロモーターは、最初期、初期、後期、または最晩期のプロモーターである。ある特定の例示的実施形態において、バキュロウイルスプロモーターは、ポリヘドリンプロモーター、最初期１プロモーター、および最初期２プロモーターからなる群から選択される。

【0051】

ある特定の例示的実施形態において、タンパク質は、ウイルスファミリーパルボウイルス科のメンバーのゲノムから単離されたＲｅｐタンパク質である。ある特定の例示的実施形態において、タンパク質は、パルボウイルスＲｅｐタンパク質である。ある特定の例示的実施形態において、パルボウイルスＲｅｐタンパク質は、Ｂ１９ Ｒｅｐ、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ、ＨＢｏＶ１ Ｒｅｐ、およびＧＰＶ Ｒｅｐからなる群から選択される。

【0052】

ある特定の例示的実施形態において、第２の異種配列は、第２の異種遺伝子を含む。ある特定の例示的実施形態において、第２の異種配列は、タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む。ある特定の例示的実施形態において、発現制御配列は、組織特異的プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および／または転写後調節エレメントを含む。ある特定の例示的実施形態において、組織特異的プロモーターは、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）またはマウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである。ある特定の例示的実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである。ある特定の例示的実施形態において、転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。

【0053】

ある特定の例示的実施形態において、タンパク質は、治療用タンパク質である。ある特定の例示的実施形態において、治療用タンパク質は、凝固因子である。ある特定の例示的実施形態において、凝固因子は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である。ある特定の例示的実施形態において、凝固因子は、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮである。

【0054】

ある特定の例示的実施形態において、第２の異種配列は、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。ある特定の例示的実施形態において、第２の異種配列は、３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。ある特定の例示的実施形態において、５’ＩＴＲは、ウイルスファミリーパルボウイルス科の第１のメンバーのゲノムに由来し、ならびに、３’ＩＴＲは、ウイルスファミリーパルボウイルス科の第２のメンバーのゲノムに由来する。ある特定の例示的実施形態において、第１および第２のメンバーは、同じであるある特定の例示的実施形態において、第１および第２のメンバーは、異なる。ある特定の例示的実施形態において、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、Ｂ１９、ＧＰＶ、およびＡＡＶ２からなる群から選択されるパルボウイルスに由来する。ある特定の例示的実施形態において、５’ＩＴＲは、Ｂ１９に由来する野生型または切断型５’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、５’ＩＴＲは、ＧＰＶに由来する野生型または切断型５’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、５’ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来する野生型または切断型５’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、５’ＩＴＲは、ＨＢｏＶ１に由来する野生型または切断型５’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、３’ＩＴＲは、Ｂ１９に由来する野生型または切断型３’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、３’ＩＴＲは、ＧＰＶに由来する野生型または切断型３’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、３’ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来する野生型または切断型３’ＩＴＲである。ある特定の例示的実施形態において、５’ＩＴＲは、ＨＢｏＶ１に由来する野生型３’ＩＴＲである。

【0055】

ある特定の例示的実施形態において、組換えｂａｃｍｉｄは、さらに、細菌レプリコンを含む。ある特定の例示的実施形態において、細菌レプリコンは、ミニＦレプリコンである。

【0056】

ある特定の例示的実施形態において、組換えｂａｃｍｉｄは、さらに、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー配列を含む。ある特定の例示的実施形態において、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー配列は、１つまたはそれ以上の抗生物質耐性遺伝子を含む。ある特定の例示的実施形態において、１つまたはそれ以上の抗生物質耐性遺伝子は、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、およびゲンタマイシン耐性遺伝子からなる群から選択される。

【0057】

ある特定の例示的実施形態において、第１のレポーター遺伝子は、ＬａｃＺαまたはその機能的部分をコードする。

【0058】

ある特定の例示的実施形態において、組換えｂａｃｍｉｄは、さらに、少なくとも第２および第３のレポーター遺伝子を含む。ある特定の例示的実施形態において、第２および第３のレポーター遺伝子はそれぞれ、蛍光タンパク質をコードする。ある特定の例示的実施形態において、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質である。

【0059】

ある特定の例示的実施形態において、第１および第２の選択的標的部位は、ＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む。ある特定の例示的実施形態において、部位特異的組換え事象は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介される。

【0060】

別の態様において、以下：ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入されたＲｅｐをコードする配列であって、挿入されたＲｅｐがＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；異種配列を含む多重クローニング部位であって、異種配列が、５’から３’に向かって：ウイルスファミリーパルボウイルス科のメンバーの第１のゲノムに由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；およびウイルスファミリーパルボウイルス科のメンバーの第２のゲノムに由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復を含む、多重クローニング部位を含むｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0061】

ある特定の例示的実施形態において、ウイルスファミリーパルボウイルス科の第１および第２のゲノムは、同じである。ある特定の例示的実施形態において、ウイルスファミリーパルボウイルス科の第１および第２のゲノムは、異なる。

【0062】

ある特定の例示的実施形態において、Ｒｅｐは、ウイルスファミリーパルボウイルス科のメンバーの第１または第２のゲノムに由来する。

【0063】

別の態様において、以下：ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入されたＢ１９ Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＢ１９ ＲｅｐがＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；異種配列を含む多重クローニング部位であって、異種配列が、５’から３’に向かって：Ｂ１９に由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；およびＢ１９に由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復を含む、多重クローニング部位を含むｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0064】

別の態様において、以下：ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入されたＧＰＶ Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＧＰＶ ＲｅｐがＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；異種配列を含む多重クローニング部位であって、異種配列が、５’から３’に向かって：ＧＰＶに由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；およびＧＰＶに由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復を含む、多重クローニング部位を含むｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0065】

別の態様において、以下：ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入されたＡＡＶ２ Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＡＡＶ２ ＲｅｐがＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；異種配列を含む多重クローニング部位であって、異種配列が、５’から３’に向かって：ＡＡＶ２に由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；およびＡＡＶ２に由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復を含む、多重クローニング部位を含むｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0066】

別の態様において、以下：ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入されたＡＡＶ２ ＨＢｏＶ１ Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＨＢｏＶ１ ＲｅｐがＬａｃＺα遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；および異種配列を含む多重クローニング部位であって、異種配列が、５’から３’に向かって：ＨＢｏＶ１に由来する野生型５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；およびＨＢｏＶ１に由来する野生型３’逆方向末端反復、含む、多重クローニング部位を含むｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0067】

ある特定の例示的実施形態において、タンパク質は、治療用タンパク質である。ある特定の例示的実施形態において、治療用タンパク質は、凝固因子である。ある特定の例示的実施形態において、凝固因子は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である。ある特定の例示的実施形態において、凝固因子は、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮである。

【0068】

別の態様において、本明細書において説明されるｂａｃｍｉｄを含む宿主細胞が提供される。別の態様において、本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄを含む宿主細胞が提供される。別の態様において、本明細書において説明されるベクターを含む宿主細胞が提供される。

【0069】

別の態様において、本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄを生成する方法であって、本明細書において説明されるｂａｃｍｉｄ；および本明細書において説明される異種配列を含むトランスポゾンに作動可能に連結された細菌レプリコンを含むドナー核酸分子を細菌細胞中に導入すること；転移が生じる条件下において細菌細胞をインキュベートすること；ならびに細菌細胞から組換えｂａｃｍｉｄを単離することを含む方法が、本明細書において提供される。

【0070】

別の態様において、本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄを生成する方法であって、本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄ；本明細書において説明されるベクター；およびＣｒｅリコンビナーゼを細菌細胞中に導入すること；部位特異的組換えが生じる条件下において細菌細胞をインキュベートすること；ならびに細菌細胞から組換えｂａｃｍｉｄを単離することを含む方法が、本明細書において提供される。

【0071】

別の態様において、組換えバキュロウイルスを生成する方法であって、本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄを適切な条件下で昆虫細胞にトランスフェクトすることを含む方法が、本明細書において提供される。

【0072】

別の態様において、クローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄを、組換えバキュロウイルスを生成するのに適切な条件下において昆虫細胞にトランスフェクトすること；ならびにｃｅＤＮＡ分子を生成するのに適切な条件下において第２の昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させることを含む方法が、本明細書において提供される。

【0073】

別の態様において、野生型または切断型Ｂ１９逆方向末端反復を含むクローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、野生型または切断型Ｂ１９逆方向末端反復を含む本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄを、組換えバキュロウイルスを作製するのに適切な条件下において昆虫細胞にトランスフェクトすること；ならびにｃｅＤＮＡ分子を生成するのに適切な条件下において第２の昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させることを含む方法が、本明細書において提供される。

【0074】

別の態様において、野生型または切断型ＧＰＶ逆方向末端反復を含むクローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、野生型または切断型ＧＰＶ逆方向末端反復を含む本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄを、組換えバキュロウイルスを生成するのに適切な条件下において昆虫細胞にトランスフェクトすること；ならびにｃｅＤＮＡ分子を生成するのに適切な条件下において第２の昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させることを含む方法が、本明細書において提供される。

【0075】

別の態様において、野生型または切断型ＡＡＶ２逆方向末端反復を含むクローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、野生型または切断型ＡＡＶ２逆方向末端反復を含む本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄを、組換えバキュロウイルスを生成するのに適切な条件下において昆虫細胞にトランスフェクトすること；ならびにｃｅＤＮＡ分子を生成するのに適切な条件下において第２の昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させることを含む方法が、本明細書において提供される。

【0076】

別の態様において、野生型ＨＢｏＶ１逆方向末端反復を含むクローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、野生型ＨＢｏＶ１逆方向末端反復を含む本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄを、組換えバキュロウイルスを生成するのに適切な条件下において昆虫細胞にトランスフェクトすること；ならびにｃｅＤＮＡ分子を生成するのに適切な条件下において第２の昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させることを含む方法が、本明細書において提供される。

【0077】

別の態様において、５’から３’に向かって：ウイルスファミリーパルボウイルス科の第１のメンバーのゲノムに由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；およびウイルスファミリーパルボウイルス科の第２のメンバーのゲノムに由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復を含む核酸配列を含むプラスミドが、本明細書において提供される。

【0078】

いくつの実施形態において、第１のｂａｃｍｉｄおよび第２のｂａｃｍｉｄを含む組換えｂａｃｍｉｄのセットであって、第１のｂａｃｍｉｄが、ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入されたＲｅｐをコードする配列を含み、挿入されたＲｅｐがレポーター遺伝子またはその機能的部分のリーディングフレームを妨害し；ならびに第２のｂａｃｍｉｄが異種配列を含み、この場合、異種配列が５’から３’に向かって：ウイルスファミリーパルボウイルス科のメンバーの第１のゲノムに由来する、野生型または切断型５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；およびウイルスファミリーパルボウイルス科のメンバーの第２のゲノムに由来する、野生型または切断型３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む、組換えｂａｃｍｉｄのセットが、本明細書において開示される。いくつの実施形態において、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、Ｂ１９、ＧＰＶ、ＨＢｏＶ１、およびＡＡＶ２からなる群から選択されるパルボウイルスに由来する。

【0079】

ある特定の例示的実施形態において、１つまたはそれ以上の発現制御配列は、組織特異的プロモーター、ポリアデニル化シグナル、および／または転写後調節エレメントを含む。ある特定の例示的実施形態において、組織特異的プロモーターは、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）またはマウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーターである。ある特定の例示的実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルである。ある特定の例示的実施形態において、転写後調節エレメントは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）である。

【0080】

ある特定の例示的実施形態において、タンパク質は、治療用タンパク質である。ある特定の例示的実施形態において、治療用タンパク質は、凝固因子である。ある特定の例示的実施形態において、凝固因子は、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）である。ある特定の例示的実施形態において、凝固因子は、ＦＶＩＩＩ－ＸＴＥＮである。

【0081】

ある特定の例示的実施形態において、第１および／または第２のメンバーは、Ｂ１９、ＧＰＶ、ＨＢｏＶ１、およびＡＡＶ２からなる群から選択される。ある特定の例示的実施形態において、第１および第２のメンバーは、同じである。ある特定の例示的実施形態において、第１および第２のメンバーは、異なる。

【0082】

別の態様において、本明細書において説明される核酸配列を含む安定細胞株であって、核酸配列が安定細胞株のゲノムに安定に組み込まれる、安定細胞株が、本明細書において提供される。

【0083】

ある特定の例示的実施形態において、安定細胞株は、安定昆虫細胞株である。ある特定の例示的実施形態において、安定昆虫細胞株は、Ｓｆ９である。

【0084】

別の態様において、野生型または切断型逆方向末端反復を含むクローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄを本明細書において説明される安定細胞株に導入することを含む方法が、本明細書において提供される。

【0085】

別の態様において、野生型または切断型逆方向末端反復を含むクローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）分子を生成する方法であって、以下：本明細書において説明されるプラスミド；および本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄを宿主細胞中に導入することを含む方法が、本明細書において提供される。

【0086】

ある特定の例示的実施形態において、宿主細胞は、昆虫細胞である。ある特定の例示的実施形態において、昆虫細胞は、Ｓｆ９である。

【図面の簡単な説明】

【0087】

【図1】図１Ａ－１Ｄは、本発明の一実施形態による組換えｂａｃｍｉｄの概略図である。図１Ａは、カナマイシン抵抗性マーカー（ＫａｎＲ）、インフレームでＬａｃＺαに融合したミニａｔｔＴｎ７挿入部位、およびミニＦ複製起点（ミニＦ）をコードするｂＭＯＮ１４２７２の模式図を示す。図１Ｂは、ＡｃＭＮＰＶ ３９Ｋプロモーター（ｐ３９Ｋ）とその後に続くｅｔｓポリアデニル化シグナル（ｅｔｓＰＡＳ）の存在下において赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をコードする遺伝子、ＬｏｘＰ組換え部位、およびＥＧＴ隣接遺伝子配列を含む合成トランスファーベクターの概略線形図を示す。図１Ｃは、カナマイシン抵抗性マーカー（ＫａｎＲ）、インフレームでＬａｃＺαと融合したミニａｔｔＴｎ７挿入部位、ミニＦ複製起点（ミニＦ）、ＡｃＭＮＰＶ ３９Ｋプロモーター（ｐ３９Ｋ）とその後に続くｅｔｓポリアデニル化シグナル（ｅｔｓＰＡＳ）の存在下において赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子をコードする遺伝子、およびＬｏｘＰ組換え部位をコードする組換えｂａｃｍｉｄ（ＢＩＶＶＢａｃ）の模式図を示す。図１Ｄは、ＢＩＶＶＢａｃ ｂａｃｍｉｄを保持する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＢＩＶＶＢａｃＤＨ１０Ｂ）およびトランスポザーゼをコードするＴｎ７ヘルパープラスミドの模式図を示す。

【図2】図２Ａ－２Ｂは、本発明の一実施形態によるＣｒｅ－ＬｏｘＰドナーベクターの概略図である。図２Ａは、ＡｃＭＮＰＶ最初期１（ｐＩＥ１）プロモーターとそれに先行するＡｃＭＮＰＶ転写エンハンサーｈｒ５エレメントおよび後に続くＡｃＭＮＰＶ ｐ１０ポリアデニル化シグナル（ｐ１０ＰＡＳ）の存在下において増強されたＧＦＰをコードする遺伝子、ＬｏｘＰ組換え部位（ＬｏｘＰ）、アンピシリン抗生物質耐性遺伝子、多重クローニング部位（ＭＣＳ）、ＣｏｌＥ１、およびＲ６Ｋγ複製起点（Ｏｒｉ）を含む合成ＤＮＡの概略線形図を示す。図２Ｂは、合成ＤＮＡ（図２Ａ）をｐＵＣ５７ベクターに挿入することによって作製された、本発明の一実施形態によるＣｒｅ－ＬｏｘＰドナーベクターの概略マップを示す。

【図3-1】図３Ａ－３Ｆは、本発明の実施形態による複製（Ｒｅｐ）タンパク質発現コンストラクトの概略図である。図３Ａは、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンまたは最初期１（ｉｅ１）プロモーターとその後に続くＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ ＰＡＳ）の存在下においてＢ１９ Ｒｅｐ遺伝子をコードする合成ＤＮＡの概略線形マップを示す。図３Ｂは、Ｂ１９．Ｒｅｐ合成ＤＮＡ（図３Ａ）をｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入することによって作製された、本発明の実施形態によるＴｎ７トランスファーベクターの概略マップを示す。図３Ｃは、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターとその後に続くＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ ＰＡＳ）の存在下においてＧＰＶ Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２挿入遺伝子をコードする合成ＤＮＡの概略線形マップを示す。改変ｍＲＮＡ転写物（伝令ＲＮＡ）が、Ｒｅｐ７８の非標準開始コドン（ＣＵＧ）、Ｒｅｐ５２の標準開始コドン（ＡＵＧ）、および停止コドン（ＵＡＡ）を伴う波線として示されている。図３Ｄは、ＧＰＶ．Ｒｅｐ合成ＤＮＡ（図３Ｃ）をｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入することによって作製された、本発明の実施形態によるＴｎ７トランスファーベクターの概略マップを示す。図３Ｅは、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターとその後に続くＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ ＰＡＳ）の存在下においてＡＡＶ２ Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２挿入遺伝子をコードする合成ＤＮＡの概略線形マップを示す。改変ｍＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡ）が、Ｒｅｐ７８の非標準開始コドン（ＣＵＧ）、Ｒｅｐ５２の標準開始コドン（ＡＵＧ）、および停止コドン（ＵＡＡ）を伴う波線として示されている。図３Ｆは、ＡＡＶ２．Ｒｅｐ合成ＤＮＡ（図３Ｅ）をｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入することによって作製された、本発明の実施形態によるＴｎ７トランスファーベクターの概略マップを示す。

【図3-2】図３－１の続き。

【図3-3】図３－２の続き。

【図4A】ヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現コンストラクトの概略図である。図４Ａは、肝臓特異的ＴＴＰｐプロモーターの制御下においてＸＴＥＮ１４４ペプチド（ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ）を含むコドン最適化ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩｃｏ６）をコードする発現コンストラクト、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナルの概略線形マップを示す。ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットには、それぞれ、Ｂ１９（Δ１３５、ＷＴ）、ＧＰＶ（Δ１６２、ＷＴ、およびＡｓｙ）、またはＡＡＶ２（ＷＴ、Ａｓｙ１、Ａｓｙ２、Ａｓｙ３）の、対称切断型（Δ）ＩＴＲ、対称野生型（ＷＴ）ＩＴＲ、および非対称（Ａｓｙ）ＩＴＲが隣接する。示されるＩＴＲ配列は、表１に見出すことができる。

【図4B】ヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現コンストラクトの概略図である。図４Ｂは、図２Ｂにおいて説明されるＣｒｅ－ＬｏｘＰドナーベクターへクローニングされた図４Ａにおいて説明されるＢ１９、ＧＰＶ、またはＡＡＶ２のＩＴＲが隣接するｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットをコードするＣｒｅ－ＬｏｘＰドナーベクターの概略線形マップを示す。

【図5-1】図５Ａ－５Ｇは、Ｒｅｐをコードする配列を含む組換えバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）、ならびにその確認研究の概略図を示す。図５Ａは、親ＢＩＶＶＢａｃおよびｂＭＯＮ１４２７２ ｂａｃｍｉｄｓと比較した、Ｂ１９．Ｒｅｐ、ＧＰＶ．Ｒｅｐ、またはＡＡＶ２．Ｒｅｐをコードする組換えＢＩＶＶＢａｃ ｂａｃｍｉｄｓ（それぞれ、ＢＩＶＶＢａｃ．ＩＥ１．Ｂ１９．Ｒｅｐ^Ｔｎ７、ＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．Ｒｅｐ^Ｔｎ７、およびＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ^Ｔｎ７）の制限酵素マッピングのアガロースゲル電気泳動画像である。図５Ｂは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ＩＥ１．Ｂ１９．Ｒｅｐ^Ｔｎ７の概略マップを示す。図５Ｃは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．Ｒｅｐ^Ｔｎ７の概略マップを示す。図５Ｄは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ^Ｔｎ７の概略マップを示す。図５Ｅは、一次抗体としてのポリクローナル抗Ｂ１９ ＮＳ１（１：２５００）および二次抗体としてのＩＲＤｙｅ＠６８０ＲＤロバ抗ウサギＬＩ－ＣＯＲ（１：１０，０００）を伴う組換えＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ＩＥ１．Ｂ１９．Ｒｅｐ^Ｔｎ７ ＢＥＶのプラーク精製クローン（クローン１～６；Ｃｌ＃１、Ｃｌ＃２、Ｃｌ＃３、Ｃｌ＃４、Ｃｌ＃５、Ｃｌ＃６）におけるＢ１９．ＲＥＰ免疫ブロッティングを示している。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）が、標準として使用され、左側に示されている。図５Ｆは、一次抗体としてのポリクローナル抗ＧＰＶ ＲＥＰペプチド抗体（１：５００）および二次抗体としてのＩＲＤｙｅ＠６８０ＲＤロバ抗ウサギＬＩ－ＣＯＲ（１：１０，０００）を伴う組換えＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．Ｒｅｐ^Ｔｎ７ＢＥＶのプラーク精製クローン（クローン１～６；Ｃｌ＃１、Ｃｌ＃２、Ｃｌ＃３、Ｃｌ＃４、Ｃｌ＃５、Ｃｌ＃６）におけるＧＰＶ．ＲＥＰ免疫ブロッティングを示している。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）が、標準として使用され、左側に示されている。図５Ｇは、一次抗体としてのモノクローナル抗ＡＡＶ２ Ｒｅｐ（１：５００）および二次抗体としてのＩＲＤｙｅ＠８００ＣＷロバ抗マウスＬＩ－ＣＯＲ（１：１０，０００）を伴う組換えＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ^Ｔｎ７ＢＥＶのプラーク精製クローンにおけるＡＡＶ２．ＲＥＰ免疫ブロッティングを示している。Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）が、標準として使用され、左側に示されている。

【図5-2】図５－１の続き。

【図6-1】図６Ａ－６Ｃは、ＲｅｐおよびｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードする配列を含むＢＥＶの概略図である。図６Ａは、示されるようなＢ１９ ＩＴＲが隣接するＢ１９．Ｒｅｐ発現カセットおよびｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットをコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ（Ｂ１９．Ｒｅｐ）ＦＶＩＩＩ．Ｂ１９．ＩＴＲｓ^ＬｏｘＰ）の概略マップを示す。図６Ｂは、示されるようなＧＰＶ ＩＴＲが隣接するＧＰＶ．Ｒｅｐ発現カセットおよびｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットをコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ（ＧＰＶ．Ｒｅｐ）ＦＶＩＩＩ．ＧＰＶ．ＩＴＲｓ^ＬｏｘＰ）の概略マップを示す。図６Ｃは、ＡＡＶ２ ＩＴＲが隣接するＡＡＶ２．Ｒｅｐ発現カセットおよびｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットをコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ（ＡＡＶ２．Ｒｅｐ）ＦＶＩＩＩ．ＡＡＶ２．ＩＴＲｓ^ＬｏｘＰ）の概略マップを示す。図６Ａ～６Ｃに示されるＩＴＲ配列は、表１に見出すことができる。

【図6-2】図６－１の続き。

【図7】図７Ａ－７Ｃは、本発明の一実施形態によるバキュロウイルス発現ベクターシステムを使用したヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの作製を示す。図７Ａは、ＧＰＶ非対称ＩＴＲが隣接するＧＰＶ．Ｒｅｐ発現カセットおよびｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットをコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ（ＧＰＶ．Ｒｅｐ）ＦＶＩＩＩ．ＧＰＶ．Ａｓｙ．ＩＴＲｓ^ＬｏｘＰ）の概略マップである。示されるＩＴＲ配列は、表１に見出すことができる。図７Ｂは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ（ＧＰＶ．Ｒｅｐ）ＦＶＩＩＩ．ＧＰＶ．Ａｓｙ．ＩＴＲｓ^ＬｏｘＰＢＥＶ（クローン１～６；Ｃｌ＃１、Ｃｌ＃２、Ｃｌ＃３、Ｃｌ＃４、Ｃｌ＃５、Ｃｌ＃６）のプラーク精製クローンを感染させたＳｆ９細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターのアガロースゲル電気泳動画像である。ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮのサイズに対応するＤＮＡバンドは、矢印によって示される。図７Ｃは、異なる量においてロードされた組換えＡｃＢＩＶＶＢａｃ（ＧＰＶ．Ｒｅｐ）ＦＶＩＩＩ．ＧＰＶ．Ａｓｙ．ＩＴＲｓ^ＬｏｘＰ ＢＥＶクローン＃４（図７Ｂに示されるような）から得られるｃｅＤＮＡベクターのアガロースゲル電気泳動画像である。ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮのサイズに対応するＤＮＡバンドは、矢印によって示される。

【図8】図８Ａ－８Ｂは、昆虫細胞系をコードする安定ヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮを生成する際に使用される材料を示す。図８Ａは、ＡｃＭＮＰＶ最初期１（ｉｅ１）プロモーターとそれに先行する転写エンハンサーｈｒ５エレメントおよび後に続くＡｃＭＮＰＶ ｐ１０ポリアデニル化シグナルの存在下においてネオマイシン耐性マーカーをコードするプラスミドの概略マップを示す。図８Ｂは、安定細胞株を生成するためにＳｆ９細胞ゲノムに安定に組み込まれる、Ｂ１９、ＧＰＶ、またはＡＡＶ２ ＩＴＲが隣接するｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットの概略マップを示す。作製された安定細胞株のリストは、表５に示され、ならびにＩＴＲの配列は、表１に示される。

【図9】図９Ａ－９Ｃは、安定細胞株からのヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの産生を示すアガロースゲル電気泳動画像である。図９Ａは、それぞれ対称切断型（Ｂ１９Δ１３５）または対称野生型（Ｂ１９．ＷＴ）ＩＴＲが隣接し、ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードする、Ｓｆ細胞株－１および－２から単離されたｃｅＤＮＡベクターのアガロースゲル電気泳動画像である。図９Ｂは、それぞれ、対称切断型（ＧＰＶΔ１６２）、対称野生型（ＧＰＶ．ＷＴ）、または非対称（ＧＰＶ．Ａｓｙ）ＩＴＲが隣接し、ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードする、Ｓｆ細胞株－３、－４、および－５から単離されたｃｅＤＮＡベクターのアガロースゲル電気泳動画像である。図９Ｃは、それぞれ、対称野生型（ＡＡＶ２．ＷＴ）、非対称１（ＡＡＶ２．Ａｓｙ１）、非対称２（ＡＡＶ２．Ａｓｙ２）、または非対称３（ＡＡＶ２．Ａｓｙ３）が隣接し、ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードする、Ｓｆ細胞株－６、－７、－８、および－９から単離されたｃｅＤＮＡベクターのアガロースゲル電気泳動画像である。図９Ａ～９Ｃにおいて使用された安定細胞株は、表５に示され、ならびにＩＴＲの配列は、表１に示される。

【図10】Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ第ＶＩＩＩ因子発色アッセイによって測定されたｈＦＶＩＩＩ活性を示すプロットである。安定細胞株から単離されたｃｅＤＮＡがＨｕｈ７細胞へトランスフェクトされ、無細胞上清が、トランスフェクションの４８および７２時間後に収集され、発色アッセイによってｈＦＶＩＩＩ検出のために試験される。実線はｃｅＤＮＡ試料を表し、点線は、コントロールとして使用されたプラスミドＤＮＡ試料を表す。

【図11-1】図１１Ａ－１１Ｆは、本発明の実施形態による複製（Ｒｅｐ）タンパク質発現コンストラクトの概略図である。図１１Ａは、ＯｐＭＮＰＶ最初期（ＯｐＩＥ２）プロモーターと後に続くＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ ＰＡＳ）の存在下においてＢ１９ Ｒｅｐ遺伝子をコードする合成ＤＮＡの概略線形マップを示す。図１１Ｂは、図３Ｂに示されるｐＦａｓｔＢａｃ．ＩＥ１．Ｂ１９．ＲｅｐコンストラクトにおいてＩＥ１プロモーターをＯｐＩＥ２で交換することによって作製された一過性発現プラスミドの概略マップを示す。図１１Ｃは、ＯｐＭＮＰＶ最初期（ＯｐＩＥ２）プロモーターと後に続くＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ ＰＡＳ）の存在下においてＧＰＶ Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２挿入遺伝子をコードする合成ＤＮＡの概略線形マップを示す。改変ｍＲＮＡ転写物（伝令ＲＮＡ）が、Ｒｅｐ７８の非標準開始コドン（ＣＵＧ）、Ｒｅｐ５２の標準開始コドン（ＡＵＧ）、および停止コドン（ＵＡＡ）を伴う波線として示される。図１１Ｄは、図３Ｄに示されるｐＦａｓｔＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．ＲｅｐコンストラクトにおいてポリヘドリンプロモーターをＯｐＩＥ２で交換することによって作製された一過性発現プラスミドの概略マップを示す。図１１Ｅは、ＯｐＭＮＰＶ最初期（ＯｐＩＥ２）プロモーターと後に続くＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０ ＰＡＳ）の存在下においてＡＡＶ２ Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２挿入遺伝子をコードする合成ＤＮＡの概略線形マップを示す。改変ｍＲＮＡ転写物（伝令ＲＮＡ）が、Ｒｅｐ７８の非標準開始コドン（ＣＵＧ）、Ｒｅｐ５２の標準開始コドン（ＡＵＧ）、および停止コドン（ＵＡＡ）を伴う波線として示される。図１１Ｆは、図３Ｆに示されるｐＦａｓｔＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．ＲｅｐコンストラクトにおいてポリヘドリンプロモーターをＯｐＩＥ２で交換することによって作製された一過性発現プラスミドの概略マップを示す。

【図11-2】図１１－１の続き。

【図11-3】図１１－２の続き。

【図12】図１２Ａ－１２Ｃは、本発明の実施形態によるパルボウイルスＩＴＲ、肝臓特異的改変マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーター（ｍＴＴＲ４８２）、および（Ｖ２．０）コドン最適化ＢＤＤｃｏ－ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ導入遺伝子（Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）（配列番号１９）を伴う改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットの概略図である。図１２Ａは、ＡＡＶ２ ＷＴ ＩＴＲ（配列番号５、配列番号６）が隣接する改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットの概略線形マップを示す。図１２Ｂは、Ｂ１９ ＷＴ（配列番号２）またはＢ１９最小（配列番号１６）が隣接する改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットの概略線形マップを示す。図１２Ｃは、ＧＰＶΔ１２０（配列番号１７）またはＧＰＶΔ１８６（配列番号１８）が隣接する改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットの概略線形マップを示す。

【図13】図１３Ａ－１３Ｃは、本発明の一実施形態によるバキュロウイルスシステムにおけるｃｅＤＮＡ産生のために使用したアプローチの概略図である。図１３Ａは、ｃｅＤＮＡ作製のために、異なる遺伝子座においてＶ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮおよびＲｅｐ遺伝子をコードする単一の組換えＢＥＶを、Ｓｆ９細胞の感染に使用したＯｎｅ ＢＡＣアプローチの概略図を示す。図１３Ｂは、ｃｅＤＮＡ産生のために、Ｓｆ９細胞に、Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮおよび／またはＲｅｐ遺伝子をコードする組換えＢＥＶを共感染させた、２ＢＡＣアプローチの概略図を示す。図１３Ｃは、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットが、Ｓｆ９細胞ゲノムに安定に組み込まれ、ならびにｃｅＤＮＡ作製のために、Ｒｅｐ遺伝子をコードする組換えＢＥＶを感染させることによってレスキューされた、安定細胞株アプローチの概略図を示す。

【図14】図１４Ａ－１４Ｃは、本発明の一実施形態によるＡＡＶ２ Ｏｎｅ ＢＡＣからのヒトＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの産生を示す。図１４Ａは、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターとＶ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮを含みＡＡＶ２ ＷＴ ＩＴＲが隣接するヒトＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットとの存在下においてＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子をコードする組換えＢＥＶを使用する、Ｓｆ９細胞でのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター産生のＯｎｅ ＢＡＣアプローチ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ（ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＡＡＶ２．ＷＴ．ＩＴＲｓ）Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ^ＬｏｘＰ）の概略図である。図１４Ｂは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ（ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＡＡＶ２．ＷＴ．ＩＴＲｓ）Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ^ＬｏｘＰ ＢＥＶの概略マップを示す。図１４Ｃは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ（ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＡＡＶ２．ＷＴ．ＩＴＲｓ）Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ^ＬｏｘＰ ＢＥＶの力価測定されたウイルスストック（Ｐ２）を感染させたＳｆ９細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターのアガロースゲル電気泳動画像である。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）、バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、およびＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）のサイズに対応するＤＮＡバンドが、矢印によって示される。

【図15】図１５Ａ－１５Ｃは、本発明の一実施形態によるＢ１９ Ｏｎｅ ＢＡＣからのヒトＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの産生を示す。図１５Ａは、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターとＶ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮを含みＢ１９ ＷＴ ＩＴＲが隣接するヒトＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットとの存在下においてＢ１９ ＮＳ１遺伝子をコードする組換えＢＥＶを使用した、Ｓｆ９細胞でのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター産生のＯｎｅ ＢＡＣアプローチ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ（ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．Ｂ１９．ＷＴ．ＩＴＲｓ）Ｐｏｌｈ．Ｂ１９．ＮＳ１^ＬｏｘＰ）の概略図である。図１５Ｂは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ（ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．Ｂ１９．ＷＴ．ＩＴＲｓ）Ｐｏｌｈ．Ｂ１９．ＮＳ１^ＬｏｘＰ ＢＥＶの概略マップを示す。図１５Ｃは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ（ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．Ｂ１９．ＷＴ．ＩＴＲｓ）Ｐｏｌｈ．Ｂ１９．ＮＳ１^ＬｏｘＰ ＢＥＶの力価測定されたウイルスストック（Ｐ２）を感染させたＳｆ９細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターのアガロースゲル電気泳動画像である。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）、バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、およびＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）のサイズに対応するＤＮＡバンドは、矢印によって示される。

【図16】図１６Ａ－１６Ｃは、本発明の一実施形態によるＡＡＶ２ Ｔｗｏ ＢＡＣからのヒトＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの産生を示す。図１６Ａは、Ｓｆ９細胞に、Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮを含みＡＡＶ２ ＷＴ ＩＴＲが隣接するＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセット（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＡＡＶ２．ＷＴ．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７）をコードする組換えＢＥＶ、ならびに／あるいは、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの存在下においてＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子をコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ^Ｔｎ７）を共感染させたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの産生のＴｗｏ ＢＡＣアプローチの概略図である。図１６Ｂは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＡＡＶ２．ＷＴ．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７およびＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ^Ｔｎ７ ＢＥＶｓの概略マップを示す。図１６Ｃは、示されたＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＡＡＶ２．ＷＴ．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７およびＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ^Ｔｎ７ ＢＥＶｓの異なるＭＯＩにおいて共感染されたＳｆ９細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターのアガロースゲル電気泳動画像である。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）、バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、およびＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）のサイズに対応するＤＮＡバンドは、矢印によって示される。

【図17】図１７Ａ－１７Ｃは、本発明の一実施形態によるＢ１９ Ｔｗｏ ＢＡＣからのヒトＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの産生を示す。図１７Ａは、Ｓｆ９細胞に、Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮを含みＢ１９ ＷＴ ＩＴＲが隣接するＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットをコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．Ｂ１９．ＷＴ．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７）ならびに／あるいは、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの存在下においてＢ１９ ＮＳ１遺伝子をコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．Ｂ１９．ＮＳ１^Ｔｎ７）を共感染された、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター産生のＴｗｏ ＢＡＣアプローチの概略図である。図１７Ｂは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．Ｂ１９．ＷＴ．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７およびＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．Ｂ１９．ＮＳ１^Ｔｎ７ ＢＥＶの概略マップを示す。図１７Ｃは、示されたＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．Ｂ１９．ＷＴ．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７およびＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．Ｂ１９．ＮＳ１^Ｔｎ７ ＢＥＶｓの異なるＭＯＩにおいて共感染させたＳｆ９細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターのアガロースゲル電気泳動画像である。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）、バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、およびＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）のサイズに対応するＤＮＡバンドは、矢印によって示される。

【図18】図１８Ａ－１８Ｃは、本発明の一実施形態によるＧＰＶ Ｔｗｏ ＢＡＣからのヒトＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの作製を示す。図１８Ａは、Ｓｆ９細胞に、Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮを含みＧＰＶΔ１２０ ＩＴＲが隣接するＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットをコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＧＰＶΔ１２０．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７）ならびに／あるいは、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの存在下においてＧＰＶ ＮＳ１遺伝子をコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．ＮＳ１^Ｔｎ７）を共感染された、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター産生のＴｗｏ ＢＡＣアプローチの概略図である。図１８Ｂは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＧＰＶΔ１２０．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７およびＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．ＮＳ１^Ｔｎ７ ＢＥＶの概略マップを示す。図１８Ｃは、示されたＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＧＰＶΔ１２０．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７およびＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．ＮＳ１^Ｔｎ７ ＢＥＶの異なるＭＯＩにおいて共感染されるＳｆ９細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターのアガロースゲル電気泳動画像である。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）、バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、およびＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）のサイズに対応するＤＮＡバンドは、矢印によって示される。

【図19】図１９Ａ－１９Ｃは、本発明の一実施形態によるＡＡＶ２安定細胞株からのヒトＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの産生を示す。図１９Ａは、Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮを含みＡＡＶ２ ＷＴ ＩＴＲが隣接するＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットをコードする安定細胞株に、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの存在下においてＡＡＶ２ Ｒｅｐ遺伝子をコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ^Ｔｎ７）を感染させる、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター産生の安定細胞株アプローチの概略図を示す。図１９Ｂは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ^Ｔｎ７ ＢＥＶの概略マップを示す。図１９Ｃは、図示されるＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ^Ｔｎ７ ＢＥＶの異なるＭＯＩにおいて感染させたＡＡＶ２安定細胞株から単離されたｃｅＤＮＡベクターのアガロースゲル電気泳動画像である。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）、バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、およびＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）のサイズに対応するＤＮＡバンドは、矢印によって示される。

【図20】図２０Ａ－２０Ｃは、本発明の一実施形態によるＢ１９安定細胞株からのヒトＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの産生を示す。図２０Ａは、Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮを含みＢ１９最小ＩＴＲが隣接するＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットをコードする安定細胞株に、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの存在下においてＢ１９ ＮＳ１遺伝子をコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．Ｂ１９．ＮＳ１^Ｔｎ７）を感染させる、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター産生の安定細胞株アプローチの概略図を示す。図２０Ｂは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．Ｂ１９．ＮＳ１^Ｔｎ７ ＢＥＶの概略マップを示す。図２０Ｃは、図示されるＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．Ｂ１９．ＮＳ１^Ｔｎ７ ＢＥＶの異なるＭＯＩにおいて感染させたＢ１９安定細胞株から単離されたｃｅＤＮＡベクターのアガロースゲル電気泳動画像である。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）、バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、およびＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）のサイズに対応するＤＮＡバンドは、矢印によって示される。

【図21】図２１Ａ－２１Ｃは、本発明の一実施形態によるＧＰＶ安定細胞株からのヒトＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの産生を示す。図２１Ａは、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター産生の安定細胞株アプローチの概略図を示し、この場合、Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮを含みＧＰＶΔ１２０ ＩＴＲが隣接するＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットをコードする安定細胞株は、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの存在下においてＧＰＶ ＮＳ１遺伝子をコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．ＮＳ１^Ｔｎ７）を感染される。図２１Ｂは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．ＮＳ１^Ｔｎ７ ＢＥＶの概略マップを示す。図２１Ｃは、図示されるＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．ＮＳ１^Ｔｎ７ ＢＥＶの異なるＭＯＩにおいて感染させたＧＰＶ安定細胞株から単離されたｃｅＤＮＡベクターのアガロースゲル電気泳動画像である。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）、バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、およびＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）のサイズに対応するＤＮＡバンドは、矢印によって示される。

【図22】図２２Ａ－２２Ｅは、本発明の一実施形態によるＴｗｏ ＢＡＣアプローチを使用したＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター産生および精製のワークフローを示す。図２２Ａは、細胞増殖および持続期間（０～２日目）の概略図を示し、この場合、細胞は、無血清ＥＳＦ９２１培地における２．５～３．０ｘ１０^６／ｍＬの細胞密度を達成するために、少量細胞（０．５Ｌ）から大量培養（１．５Ｌ）フラスコへと連続してスケールアップされる。図２２Ｂは、Ｓｆ９の大きい培養（１．５Ｌ）フラスコでの感染およびインキュベーションの持続期間（２～６日目）の概略図を示し、この場合、細胞は、それぞれ、０．１および０．０１のプラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞のＭＯＩにおいて、Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮを含みＨＢｏＶ１ ＩＴＲが隣接するＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットをコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＨＢｏＶ１．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７）、ならびに／あるいは、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの存在下においてＨＢｏＶ１ ＮＳ１遺伝子をコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＨＢｏＶ１．ＮＳ１^Ｔｎ７）を共感染される。図２２Ｃは、感染細胞の細胞密度と生存率を毎日測定し、細胞生存率が７０～８０％に達した後に、細胞を低速遠心沈殿によってペレット化した、処理の持続期間（６～７日目）におけるＰｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａ Ｐｒｅｐ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットおよびアガロースゲル電気泳動の画像を示す。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ^ＴＭ ＨｉＰｕｒｅ Ｅｘｐｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって感染細胞ペレットから精製し、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）、バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、および／またはＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）の産生能を特定するために、アリコートをアガロースゲル電気泳動に供した。図２２Ｄは、高分子量ＤＮＡからＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ（約８．５ｋｂの断片）を分離するために、Ｇｉｇａ－ｐｒｅｐ精製ＤＮＡを、Ｐｒｅｐ細胞における分取アガロースゲルにロードさせた、処理の持続期間（７～１２日目）におけるＢｉｏ－Ｒａｄモデル４９１ Ｐｒｅｐ細胞およびアガロースゲル電気泳動の画像を示す。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡの純度を特定するために、分取アガロースゲル電気泳動から７０～８０分間隔で採取した溶出分画を、０．８～１．２％のアガロースゲルにおいて分析した。図２２Ｅは、Ｐｒｅｐ細胞から採取した分画を収集し、精製されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡを得るために、１／１０倍の量の３ＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）および３倍の量の１００％のエタノールによって沈殿させた、アガロースゲル電気泳動の画像を示す。ゲル画像は、出発材料と比較したＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡの純度を示しており、矢印は、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）、バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、およびＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）のサイズに対応するＤＮＡバンドを示している。

【図23】Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ第ＶＩＩＩ因子発色アッセイによって測定した血漿ＦＶＩＩＩ活性レベルのグラフ表示を示す。図２３は、８０、４０、または１２μｇ／ｋｇのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＨＢｏＶ１（ｗｔＨＢｏＶ１）またはＡＡＶ２ （ｗｔＡＡＶ２）ＩＴＲｓ ｃｅＤＮＡによる尾静脈水圧注入によって全身注入されたｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスから異なる間隔で採取した血液試料において測定した血漿ＦＶＩＩＩ活性レベルのグラフプロットを示す。

【図24】図２４Ａ－２４Ｃは、本発明の一実施形態によるＯｎｅ ＢＡＣアプローチを使用したＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの産生を示す。図２４Ａは、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターおよびＨＢｏＶ１ ＩＴＲが隣接するヒトＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットとの存在下においてＨＢｏＶ１ ＮＳ１遺伝子をコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ（ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＨＢｏＶ１．ＩＴＲｓ）Ｐｏｌｈ．ＨＢｏＶ１．ＮＳ１^ＬｏｘＰ）を使用したＳｆ９細胞でのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター産生のＯｎｅ ＢＡＣアプローチの概略図である。図２４Ｂは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ（ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＨＢｏＶ１．ＩＴＲｓ）Ｐｏｌｈ．ＨＢｏＶ１．ＮＳ１１^ＬｏｘＰ ＢＥＶの概略マップを示す。図２４Ｃは、（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ（ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＨＢｏＶ１．ＩＴＲｓ）Ｐｏｌｈ．ＨＢｏＶ１．ＮＳ１１^ＬｏｘＰ）ＢＥＶの力価測定されたウイルスストック（Ｐ２）を感染させたＳｆ９細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターのアガロースゲル電気泳動画像である。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）、バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、およびＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）のサイズに対応するＤＮＡバンドは、矢印によって示される。

【図25】図２５Ａ－２５Ｃは、本発明の一実施形態によるＴｗｏ ＢＡＣアプローチを使用したＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの産生を示す。図２５Ａは、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター産生のＴｗｏ ＢＡＣアプローチの概略図であり、この場合、Ｓｆ９細胞は、ＨＢｏＶ１ ＩＴＲが隣接するＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットをコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＨＢｏＶ１．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７）、ならびに／あるいは、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの存在下においてＨＢｏＶ１ ＮＳ１遺伝子をコードする組換えＢＥＶ（ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＨＢｏＶ１．ＮＳ１^Ｔｎ７）を共感染される。図２５Ｂは、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＨＢｏＶ１．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７およびＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＨＢｏＶ１．ＮＳ１^Ｔｎ７ ＢＥＶの概略マップを示す。図２５Ｃは、図示されたＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＨＢｏＶ１．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７およびＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＨＢｏＶ１．ＮＳ１^Ｔｎ７ ＢＥＶの一定の比率の異なるＭＯＩまたは一定のＭＯＩの異なる比率において共感染させたＳｆ９細胞から単離されたｃｅＤＮＡベクターのアガロースゲル電気泳動画像である。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡ）、バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）、およびＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）のサイズに対応するＤＮＡバンドは、矢印によって示される。

【発明を実施するための形態】

【0088】

２つ以上の外来配列の発現にとって好適なバキュロウイルス発現ベクターシステムが、本明細書において提供される。例えばｃｅＤＮＡを作製するために、本明細書において説明されるバキュロウイルス発現ベクターシステムを使用する方法も、提供される。

【0089】

Ｉ．定義
ここで、用語「ａ」または「ａｎ」の付いた名詞は、その名詞の１つまたはそれ以上を意味し：例えば、「ヌクレオチド配列（ａ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、１つまたはそれ以上のヌクレオチド配列を表すと理解される。同様に、「治療用タンパク質（ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）」および「ｍｉＲＮＡ（ａ ｍｉＲＮＡ）」は、それぞれ、１つまたはそれ以上の治療用タンパク質ならびに１つまたはそれ以上のｍｉＲＮＡを表すと理解される。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたはそれ以上」、および「少なくとも１つ」は、本明細書において相互互換的に使用することができる。

【0090】

用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、およそ（「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ」、「ｒｏｕｇｈｌｙ」、「ａｒｏｕｎｄ」、または「ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ」）を意味するために本明細書において使用される。用語「約」が、数値範囲に関連して使用される場合、説明された数値の上限および下限を拡張することによってその範囲を修飾する。一般的に、用語「約」は、１０パーセント高いまたは低い変動によって、言明された値を上回るおよび下回る数値を修飾するために使用される。

【0091】

本明細書において使用される場合、「および／または」は、関連する一覧された項目の１つまたはそれ以上のあらゆる可能な組合せ、ならびに二者択一（「または」）において解釈される場合には組合せの欠如も意味し、それを包含する。

【0092】

「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、および「ポリヌクレオチド」は、相互互換的に使用され、ならびに、一本鎖形態または二本鎖ヘリックスのどちらかにおけるリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジン、またはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）のリン酸エステル重合形態あるいはその任意のホスホエステル類似物、例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステルなどを意味する。一本鎖核酸配列は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）または一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を意味する。二本鎖ＤＮＡ－ＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡおよびＲＮＡ－ＲＮＡヘリックスは可能である。核酸分子、特にＤＮＡまたはＲＮＡ分子という用語は、分子の一次および二次構造のみを意味し、それを任意の特定の三次形態に限定しない。したがって、この用語は、とりわけ、直鎖状もしくは環状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）、プラスミド、超螺旋ＤＮＡおよび染色体において見出される二本鎖ＤＮＡを包含する。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造の説明において、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに対して同種の配列を有する鎖）に沿って５’から３’への方向における配列のみを与える通常の慣習に従って本明細書において説明することができる。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けているＤＮＡ分子である。ＤＮＡとしては、これらに限定されるわけではないが、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および半合成ＤＮＡが挙げられる。本開示の「核酸組成物」は、本明細書において説明される１つまたはそれ以上の核酸を含む。

【0093】

本明細書において使用される場合、「逆方向末端反復」（または「ＩＴＲ」）は、下流にその逆相補配列、すなわち、パリンドローム配列、が続くヌクレオチドのセットを含む、一本鎖核酸配列の５’または３’末端のどちらかに位置された核酸サブ配列を意味する。初期配列と逆相補配列との間におけるヌクレオチドの介在配列は、ゼロを含む任意の長さであり得る。一実施形態において、本開示にとって有用なＩＴＲは、１つまたはそれ以上の「パリンドローム配列」を含む。ＩＴＲは、任意の数の機能を有することができる。いくつの実施形態において、本明細書において説明されるＩＴＲは、ヘアピン構造を形成する。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、Ｔ形のヘアピン構造を形成する。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、非Ｔ形のヘアピン構造、例えば、Ｕ形のヘアピン構造を形成する。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、細胞核での核酸分子の長期生存を促進する。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、細胞核での核酸分子の永久的生存（例えば、細胞の寿命全体に対する）を促進する。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、細胞核での核酸分子の安定性を促進する。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、細胞核での核酸分子の維持を促進する。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、細胞核での核酸分子の持続性を促進する。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、細胞核での核酸分子の分解を阻害または予防する。

【0094】

したがって、「ＩＴＲ」は、本明細書に使用される場合、それ自体に折り重なることができ、ならびに二本鎖セグメントを形成する。例えば、配列ＧＡＴＣＸＸＸＸＧＡＴＣは、折り畳まれて二重螺旋を形成する場合、ＧＡＴＣの初期配列およびその補体（３’ＣＴＡＧ５’）を含む。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、初期配列と逆相補配列との間に連続パリンドローム配列（例えば、ＧＡＴＣＧＡＴＣ）を含む。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、初期配列と逆相補配列との間に中断されたパリンドローム配列（例えば、ＧＡＴＣＸＸＸＸＧＡＴＣ）を含む。いくつの実施形態において、連続したまたは中断されたパリンドローム配列の相補部分は、お互いに相互作用して「ヘアピンループ」構造を形成する。本明細書において使用される場合、二本鎖セクションを形成する一本鎖ヌクレオチド分子塩基対上の少なくとも２つの相補配列である場合、結果として「ヘアピンループ」構造が生じる。いくつの実施形態において、ＩＴＲの一部のみが、ヘアピンループを形成する。他の実施形態では、ＩＴＲ全体が、ヘアピンループを形成する。

【0095】

本開示において、少なくとも１つのＩＴＲは、非アデノウイルス関連ウイルス（非ＡＡＶ）のＩＴＲである。ある特定の実施形態において、ＩＴＲは、ウイルスファミリーパルボウイルスの非ＡＡＶメンバーのＩＴＲである。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、ディペンドウイルス属またはエリスロウイルス属の非ＡＡＶメンバーのＩＴＲである。特定の実施形態において、ＩＴＲは、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）、ノバリケンパルボウイルス（ＭＤＰＶ）、またはエリスロウイルスパルボウイルスＢ１９（パルボウイルスＢ１９（本明細書において「Ｂ１９」とも呼ばれる）、霊長類エリスロパルボウイルス１、Ｂ１９ウイルス、およびエリスロウイルスとしても知られる）のＩＴＲである。ある特定の実施形態において、２つのＩＴＲの一方のＩＴＲは、ＡＡＶのＩＴＲである。他の実施形態において、コンストラクトの２つのＩＴＲのうちの一方のＩＴＲは、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、およびそれらの任意の組合せから選択されるＡＡＶ血清型のＩＴＲである。特定の一実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型２に由来し、例えば、ＡＡＶ血清型２のＩＴＲである。

【0096】

本開示のある特定の態様において、核酸分子は、２つのＩＴＲである５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含み、この場合、５’ＩＴＲは、核酸分子の５’末端に位置され、ならびに３’ＩＴＲは、核酸分子の３’末端に位置される。５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、同じウイルスまたは異なるウイルスに由来し得る。ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲは、ＡＡＶに由来し、ならびに３’ＩＴＲは、ＡＡＶウイルスに由来しない（例えば、非ＡＡＶ）。いくつの実施形態において、３’ＩＴＲは、ＡＡＶに由来し、ならびに５’ＩＴＲは、ＡＡＶウイルスに由来しない（例えば、非ＡＡＶ）。他の実施形態において、５’ＩＴＲは、ＡＡＶウイルスに由来せず（例えば、非ＡＡＶ）、ならびに３’ＩＴＲは、同じまたは異なる非ＡＡＶウイルスに由来する。

【0097】

用語「パルボウイルス」は、本明細書に使用される場合、パルボウイルス属のファミリー、例えば、これらに限定されるわけではないが、自己複製性パルボウイルスおよびディペンドウイルスなどを包含する。自律性パルボウイルスとしては、例えば、ボカウイルス属（Ｂｏｃａｖｉｒｕｓ）、ディペンドウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ）、エリスロウイルス属（Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ）、アムドウイルス属（Ａｍｄｏｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス属（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，）、デンソウイルス属（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、イテラウイルス属（Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ）、コントラウイルス属（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）、アベパルボウイルス属（Ａｖｅｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、コピパルボウイルス属（Ｃｏｐｉｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、プロトパルボウイルス属（Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、テトラパルボウイルス属（Ｔｅｔｒａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、アンビデンソウイルス属（Ａｍｂｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ブレビデンソウイルス属（Ｂｒｅｖｉｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、ヘパンデンソウイルス属（Ｈｅｐａｎｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）、およびペンスチルデンソウイルス属（Ｐｅｎｓｔｙｌｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）のメンバーが挙げられる。

【0098】

例示的な自律性パルボウイルスは、としては、これらに限定されるわけではないが、ブタパルボウイルス、マウスマイニュートウイルス、イヌパルボウイルス、ミンク腸炎（ｅｎｔｅｒｔｉｔｕｓ）ウイルス、ウシパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、ノバリケンパルボウイルス、ヘビパルボウイルス、およびＢ１９ウイルスが挙げられる。他の自律性パルボウイルスは、当業者に既知である。例えば、ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ，２巻，６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。

【0099】

用語「非ＡＡＶ」は、本明細書に使用される場合、核酸、タンパク質、ならびにパルボウイルスファミリーの全てのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を除くファミリーパルボウイルスからのウイルスを包含する。「非ＡＡＶ」としては、これらに限定されるわけではないが、ボカウイルス属、ディペンドウイルス属、エリスロウイルス属、アムドウイルス属、パルボウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属、コントラウイルス属、アベパルボウイルス属、コピパルボウイルス属、プロトパルボウイルス属、テトラパルボウイルス属、アンビデンソウイルス属、ブレビデンソウイルス属、ヘパンデンソウイルス属、およびペンスチルデンソウイルス属の自己複製性メンバーが挙げられる。

【0100】

本明細書において使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、これらに限定されるわけではないが、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、ＡＡＶタイプ１２、ＡＡＶタイプ１３、ヘビＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、それらのＡＡＶ血清型、およびＧａｏら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１（２００４））およびＭｏｒｉｓら（Ｖｉｒｏｌ．３３：３７５（２００４））によって開示されるクレード、ならびに現在既知であるかまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを包含する。例えば、ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。

【0101】

用語「に由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」は、本明細書に使用される場合、明示された分子または有機体から単離されるかそれを使用して作製された成分、あるいは明示された分子または有機体からの情報（例えば、アミノ酸または核酸配列）を意味する。例えば、第２の核酸配列（例えば、ＩＴＲ）に由来する核酸配列（例えば、ＩＴＲ）は、第２の核酸配列のヌクレオチド配列と同一であるかまたは実質的に同様であるヌクレオチド配列を含み得る。ヌクレオチドまたはポリペプチドの場合、由来する種は、例えば、自然に生じる変異誘発、人工的な定方向変異誘発、または人工的な無作為変異誘発によって得ることができる。ヌクレオチドまたはポリペプチドを誘導するために使用される変異誘発は、故意に指向され得るか、または故意に無作為化され得るか、または、それぞれの混合であり得る。第１に由来する異なるヌクレオチドまたはポリペプチドを作り出すためのヌクレオチドまたはポリペプチドの変異誘発は、偶発的な事象（例えば、ポリメラーゼのインフィデリティによる）であり得、ならびに、由来するヌクレオチドまたはポリペプチドの識別は、例えば、本明細書において説明されるような、適切なスクリーニング方法によって行うことができる。ポリペプチドの変異誘発は、典型的には、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの操作を伴う。いくつの実施形態において、第２ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に由来するヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、それぞれ、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し、この場合、第１のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の生物活性を維持する。他の実施形態において、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）に対して少なくとも９０％同一であり、この場合、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）ＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を維持する。いくつの実施形態において、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）に対して少なくとも８０％同一であり、この場合、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）ＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を維持する。いくつの実施形態において、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）に対して少なくとも７０％同一であり、この場合、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）ＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を維持する。いくつの実施形態において、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）に対して少なくとも６０％同一であり、この場合、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）ＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を維持する。いくつの実施形態において、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）に対して少なくとも５０％同一であり、この場合、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）ＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を維持する。

【0102】

ある特定の実施形態において、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲの断片を含むかまたはそれからなる。いくつの実施形態において、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲの断片を含むかまたはそれからなり、この場合、断片は、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約５５ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約６５ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約８５ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約９５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約１２５ヌクレオチド、少なくとも約１５０ヌクレオチド、少なくとも約１７５ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約２２５ヌクレオチド、少なくとも約２５０ヌクレオチド、少なくとも約２７５ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約３２５ヌクレオチド、少なくとも約３５０ヌクレオチド、少なくとも約３７５ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約４２５ヌクレオチド、少なくとも約４５０ヌクレオチド、少なくとも約４７５ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約５２５ヌクレオチド、少なくとも約５５０ヌクレオチド、少なくとも約５７５ヌクレオチド、または少なくとも約６００ヌクレオチドを含み；非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を維持する。ある特定の実施形態において、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲの断片を含むかまたはそれからなり、この場合、断片は、少なくとも約１２９のヌクレオチドを含み、ならびに非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を維持する。ある特定の実施形態において、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲの断片を含むかまたはそれからなり、この場合、断片は、少なくとも約１０２のヌクレオチドを含み、ならびに非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）の機能的特性を維持する。

【0103】

いくつの実施形態において、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲの断片を含むかまたはそれからなり、この場合、断片は、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲの長さの少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を含む。

【0104】

ある特定の実施形態において、第２ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に由来するヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、適切にアラインメントされた場合に、それぞれ、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の相同部分に対して少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有し、この場合、第１のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の生物活性を維持する。他の実施形態において、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、適切にアラインメントされた場合に、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）の相同部分に対して少なくとも９０％同一であり、この場合、第１のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の生物活性を維持する。いくつの実施形態において、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、適切にアラインメントされた場合に、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）の相同部分に対して少なくとも８０％同一であり、この場合、第１のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の生物活性を維持する。いくつの実施形態において、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、適切にアラインメントされた場合に、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）の相同部分に対して少なくとも７０％同一であり、この場合、第１のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の生物活性を維持する。いくつの実施形態において、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、適切にアラインメントされた場合に、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）の相同部分に対して少なくとも６０％同一であり、この場合、第１のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の生物活性を維持する。いくつの実施形態において、非ＡＡＶ（またはＡＡＶ）のＩＴＲに由来するＩＴＲは、適切にアラインメントされた場合に、非ＡＡＶ ＩＴＲ（または、それぞれ、ＡＡＶ ＩＴＲ）の相同部分に対して少なくとも５０％同一であり、この場合、第１のヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の生物活性を維持する。

【0105】

「無カプシド（ｃａｐｓｉｄ－ｆｒｅｅ）」または「カプシドなし（ｃａｐｓｉｄ－ｌｅｓｓ）」ベクターまたは核酸分子は、カプシドのないベクターコンストラクトを意味する。いくつの実施形態において、カプシドなしベクターまたは核酸分子は、例えば、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質などをコードする配列を含まない。いくつの実施形態において、無カプシドまたはカプシドなしベクターは、共有結合性クローズドエンドを含み得、本明細書において「クローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）」と呼ばれる。概して、本明細書において説明されるｃｅＤＮＡは、本発明のバキュロウイルス発現システムを使用して作製することができ、ならびにｃｅＤＮＡは、概して、どちらか側でＩＴＲ（例えば、ＡＡＶまたは非ＡＡＶ ＩＴＲ）が隣接する異種遺伝子産物をコードする少なくとも１つの核酸を含む。

【0106】

本明細書において使用される場合、「コード領域」または「コード配列」は、アミノ酸へ翻訳可能なコドンからなる、ポリヌクレオチドの一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、典型的には、アミノ酸へと翻訳されないが、コード領域の一部であると見なすことができ、しかし、任意の隣接配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。コード領域の境界は、典型的には、結果のポリペプチドのアミノ末端をコードする、５’末端における開始コドンおよび結果のポリペプチドのカルボキシル末端をコードする、３’末端における開始コドン翻訳停止コドンによって決定される。単一のポリヌクレオチドコンストラクトに、例えば、単一のベクターに、あるいは別々のポリヌクレオチドコンストラクトに、例えば、別々の（異なる）ベクターに、２つまたはそれ以上のコード領域が存在することができる。したがって、単一のベクターが、単一のコード領域のみを含み得るか、あるいは２つまたはそれ以上のコード領域を含み得るということになる。

【0107】

哺乳動物細胞によって分泌されるある特定のタンパク質は、粗面小胞体を越えて成長タンパク質鎖の搬出が開始された後に成熟タンパク質から切断される分泌シグナルペプチドに関連する。当業者は、シグナルペプチドは、概して、ポリペプチドのＮ末端に融合され、ならびに、完全または「全長」ポリペプチドから切断されて、分泌されたまたは「成熟した」形態のポリペプチドを産生することを承知している。ある特定の実施形態において、天然のシグナルペプチドまたはその配列の機能的誘導体は、それに作動可能に関連付けられたポリペプチドの分泌を指示する能力を維持する。あるいは、異種哺乳動物のシグナルペプチド、例えば、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ－グルクロニダーゼシグナルペプチドまたはその機能的誘導体を使用することができる。

【0108】

用語「下流」は、基準ヌクレオチド配列の３’側に位置されるヌクレオチド配列を意味する。ある特定の実施形態において、下流ヌクレオチド配列は、転写の開始点に続く配列に関連する。例えば、遺伝子の翻訳開始コドンは、転写の開始部位の下流に位置される。

【0109】

用語「上流」は、基準ヌクレオチド配列の５’側に位置されるヌクレオチド配列を意味する。ある特定の実施形態において、上流ヌクレオチド配列は、コード領域または転写の開始点の５’側に位置される配列に関する。例えば、ほとんどのプロモーターは、転写の開始部位の上流に位置される。

【0110】

本明細書において使用される場合、用語「遺伝子カセット」または「発現カセット」は、目的のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、適切な宿主細胞における特定のポリヌクレオチド配列の発現を指示することができるＤＮＡ配列を意味する。遺伝子のカセットは、コード領域の上流（５’非コード配列）、内、下流（３’非コード配列）に位置され、転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、または関連コード領域の翻訳に影響を及ぼす、ヌクレオチドを包含する。コード領域が、真核細胞における発現を意図される場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置されるであろう。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、ｍｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、異種ポリヌクレオチド配列を含む。

【0111】

産物、例えば、ｍｉＲＮＡなど、または遺伝子産物（例えば、治療用タンパク質などのポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターおよび／または、１つもしくはそれ以上のコード領域に作動可能に関連付けられた他の発現（例えば、転写または翻訳）制御配列を含むことができる。作動可能な関連において、遺伝子産物、例えば、ポリペプチドなど、のためのコード領域は、遺伝子産物の発現を調節領域の影響下または制御下に置くような様式において、１つまたはそれ以上の調節領域に関連する。例えば、プロモーター機能の誘導が、結果として、コード領域によってコードされた遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を生じる場合、ならびにプロモーターとコード領域との間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を指示するプロモーターの能力を妨げないか、またはＤＮＡ鋳型の転写される能力を妨げない場合、コード領域およびプロモーターは、「作動可能に関連付けられている」。プロモーター以外の他の発現制御配列、例えば、エンハンサー、オペレーター、レプレッサー、および転写停止シグナルも、遺伝子産物の発現を指示するように、コード領域に作動可能に関連付けられている。

【0112】

「発現制御配列」は、宿主細胞におけるコード配列の発現を提供する調節ヌクレオチド配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどを意味する。発現制御配列は、概して、作動可能に連結されたコード核酸の効率的な転写および翻訳を促進する任意の調節ヌクレオチド配列を包含する。発現制御配列の非限定的な例としては、プロモーター、エンハンサー、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、またはステム－ループ構造が挙げられる。様々な発現制御配列が、当業者に既知である。そのようなものとしては、これらに限定されるわけではないが、脊椎動物細胞において機能する発現制御配列、例えば、これに限定されるわけではないが、サイトメガロウイルスからのプロモーターおよびエンハンサーセグメント（イントロンＡに関連して、最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（ラウス肉腫ウイルスなど）など、が挙げられる。他の発現制御配列としては、脊椎動物遺伝子に由来するもの、例えば、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン、およびウサギβ－グロビン、ならびに真核生物細胞において遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。追加の好適な発現制御配列としては、組織特異的プロモーターおよびエンハンサーならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。他の発現制御配列としては、イントロン配列、転写後調節エレメント、およびポリアデニル化シグナルが挙げられる。追加の例示的発現制御配列は、本開示における他の場所で説明される。

【0113】

同様に、様々な翻訳制御エレメントは、当業者に既知である。そのようなものとして、これらに限定されるわけではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび終止コドンならびにピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、内部リボソーム侵入部位、またはＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。

【0114】

用語「発現」は、本明細書に使用される場合、ポリヌクレオチドが遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを産生するプロセスを意味する。そのようなものとしては、これらに限定されるわけではないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または任意の他のＲＮＡ産物へのポリヌクレオチドの転写、ならびにポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳が挙げられる。発現は、「遺伝子産物」を産生する。本明細書において使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば遺伝子の転写によって産生されるメッセンジャーＲＮＡなど、または転写物から翻訳されるポリペプチド、のどちらかであり得る。本明細書において説明される遺伝子産物は、さらに、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化またはスプライシングを伴う核酸、あるいは翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の追加、他のタンパク質サブユニットとの会合、またはタンパク質分解的切断を伴うポリペプチドを含む。用語「収量」は、本明細書に使用される場合、遺伝子の発現によって産生されるポリペプチドの量を意味する。

【0115】

「ベクター」は、宿主細胞への核酸のクローニングおよび／または移送のための任意の運搬体を意味する。ベクターは、結合させたセグメントの複製を行うために別の核酸セグメントを結合させることができるレプリコンであり得る。「レプリコン」は、インビボにおいて複製の自動ユニットとして機能する、すなわち、自身の制御下において複製することができる任意の遺伝的エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）を意味する。用語「ベクター」は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいて核酸を細胞に導入するための運搬体を包含する。例えば、プラスミド、改変された真核生物ウイルス、または改変された細菌ウイルスなど、多くのベクターが知られており、当技術分野において使用される。好適なベクターへのポリヌクレオチドの挿入は、適切なポリヌクレオチド断片を、相補凝集性終端にライゲートすることによって達成することができる。

【0116】

ベクターは、ベクターを組み込んだ細胞の選択または識別を提供する選択可能なマーカーまたはレポーターをコードするように操作することができる。選択可能なマーカーまたはレポーターの発現は、含まれた他のコード領域を組み込みベクター上において発現させる宿主細胞の識別および／または選択を可能にする。既知であり当技術分野において使用される選択可能なマーカーの例としては：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホアミドなどに対する耐性を提供する遺伝子；ならびに表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子など、が挙げられる。既知の当技術分野において使用されるレポーターの例としては：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、βガラクトシダーゼ、（ＬａｃＺ）、βグルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）など、が挙げられる。選択可能なマーカーは、レポーターであると見なすことができる。

【0117】

用語「宿主細胞」は、本明細書に使用される場合、例えば、ｓｓＤＮＡまたはベクターのレシピエントとして使用することができるかまたは使用された、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を意味する。この用語は、形質導入された原細胞の子孫を包含する。したがって、「宿主細胞」は、本明細書に使用される場合、概して、外因性ＤＮＡ配列を形質導入された細胞を意味する。単一の親細胞の子孫は、自然の、偶発的な、または、故意の変異により、元の親に対してモルホロジーまたはゲノムまたは全ＤＮＡ補体において必ずしも完全に同一であり得るわけではない。いくつの実施形態において、宿主細胞は、インビトロ宿主細胞であり得る。

【0118】

用語「選択可能なマーカー」は、識別因子（通常は、抗生物質もしくは化学物質耐性遺伝子、これは、マーカー遺伝子の効果、すなわち、抗生物質に対する耐性、除草剤に対する耐性に基づいて選択することができる）、比色マーカー、酵素、蛍光マーカーなどを意味し、この場合、効果は、目的の核酸の遺伝物を追跡するため、および／または目的の核酸を受け継いだ細胞または生物体を識別するために使用される。既知であり当技術分野において使用される選択可能なマーカーの例としては：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホアミドなどに対する耐性を提供する遺伝子；ならびに表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子など、が挙げられる。

【0119】

用語「レポーター遺伝子」は、レポーター遺伝子の効果に基づいて識別することができる識別因子をコードする核酸を意味し、この場合、効果は、目的の核酸の遺伝物を追跡するため、目的の核酸を受け継いだ細胞または生物体を識別するため、および／または、遺伝子発現誘導または転写を測定するために使用される。既知の当技術分野において使用されるレポーター遺伝子の例としては：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、βグルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などが挙げられる。選択可能なマーカー遺伝子は、レポーター遺伝子であると見なすことができる。

【0120】

「プロモーター」および「プロモーター配列」は、相互互換的に使用され、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を意味する。概して、コード配列は、’プロモーター配列の３’側に位置される。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来し得るか、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成され得るか、または合成ＤＮＡセグメントをも含み得る。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞型において、または異なる発生段階において、または異なる環境的生理的条件に応じて、遺伝子の発現を指示することができる。ほとんどの場合に遺伝子を大抵の細胞型において発現させるプロモーターは、一般的に「構成的プロモーター」と呼ばれる。遺伝子を特定の細胞型において発現させるプロモーターは、一般的に「細胞特異的プロモーター」または「組織特異的プロモーター」と呼ばれる。遺伝子を発生または細胞分化の特定の段階において発現させるプロモーターは、一般的に「発生特異的プロモーター」または「細胞分化特異的プロモーター」と呼ばれる。薬剤、生物学的分子、化学物質、リガンド、光、またはプロモーターを誘導する同様のもの、による細胞の曝露または処理の後に遺伝子を発現させるかまたは発現を誘導するプロモーターは、一般的に「誘導性プロモーター」または「調節可能なプロモーター」と呼ばれる。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は、完全に定義されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が、同じプロモーター活性を有することができる。

【0121】

プロモーター配列は、典型的には、転写開始部位によってその３’終端において境界され、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルにおいて転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含むように上流（５’方向）に広がる。転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１によるマッピングなどによって簡便に定義される）、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が、プロモーター配列内に見出されるであろう。

【0122】

いくつの実施形態において、核酸分子は、組織特異的プロモーターを含む。ある特定の実施形態において、組織特異的プロモーターは、肝臓における、例えば、肝細胞および／または内皮細胞における、治療用タンパク質、例えば、凝固因子の発現を駆動する。特定の実施形態において、プロモーターは、マウストランスチレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、天然ヒト因子ＶＩＩＩプロモーター、ヒトアルファ－１－アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、マウスアルブミンプロモーター、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）プロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつの実施形態において、プロモーターは、肝臓特異的プロモーター（例えば、α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ））、筋肉特異的プロモーター（例えば、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ミオシン重鎖α（αＭＨＣ）、ミオグロビン（ＭＢ）、およびデスミン（ＤＥＳ））、合成のプロモーター（例えば、ＳＰｃ５－１２、２Ｒ５Ｓｃ５－１２、ｄＭＣＫ、およびｔＭＣＫ）、ならびにそれらの任意の組合せから選択される。特定の一実施形態において、プロモーターは、ＴＴＰプロモーターを含む。

【0123】

用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、相互互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に結合して切断する酵素を意味する。

【0124】

用語「プラスミド」は、しばしば、通常は、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態において、細胞の中心的な代謝の一部でない遺伝子を運搬する染色体外エレメントを意味する。そのようなエレメントは、任意の供給源に由来する、自己複製性配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列、直鎖状、環状、もしくは高次コイル状の一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、この場合、多くのヌクレオチド配列が、ユニークコンストラクトに接合または再結合しており、それらは、適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞内に導入することができる。

【0125】

使用することができる真核ウイルスベクターとしては、これらに限定されるわけではないが、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルス、例えば、種痘疹ウイルスベクター、パキュロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターが挙げられる。非ウイルスベクターは、プラスミド、リポソーム、荷電された脂質（サイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ））、ＤＮＡ－タンパク質複合体、およびバイオポリマーを含む。

【0126】

「クローニングベクター」は、「レプリコン」を意味し、それは、連続して複製する核酸のユニット長であり、複製起点を含み、例えば、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどであり、それらは、結合したセグメントの複製を行うために、別の核酸セグメントを結合させることができる。ある特定のクローニングベクターは、ある細胞型、例えば細菌、における複製と、別の細胞、例えば、真核生物細胞、における発現を可能にする。クローニングベクターは、典型的には、目的の核酸配列の挿入のためのベクターおよび／または１つもしくはそれ以上の複数のクローニング部位を含む細胞の選択のために使用することができる１つまたはそれ以上の配列を含む。

【0127】

用語「発現ベクター」は、宿主細胞への挿入の後に、挿入された核酸配列の発現を可能にするように設計された運搬体を意味する。挿入された核酸配列は、上記において説明されるような調節領域との作動可能な関連において配置される。

【0128】

ベクターは、当技術分野において周知の方法、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソゾーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポータ、によって宿主細胞内に導入される。「培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ）」、「培養する（ｔｏ ｃｕｌｔｕｒｅ）」、および「培養すること（ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）」は、本明細書に使用される場合、細胞の増殖または分裂を可能にするかまたは細胞を生きた状態に維持することを可能にするインビトロ条件下において細胞をインキュベートすることを意味する。「培養細胞」は、本明細書に使用される場合、インビトロにおいて伝搬される細胞を意味する。

【0129】

当技術分野において知られる用語「パーセント同一性」は、配列を比較することによって特定される、２つもしくはそれ以上のポリペプチド配列または２つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係性である。当技術分野において、「同一性」は、それが可能な場合、そのような配列の鎖の間の一致によって特定されるようなポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」は、既知の方法、例えば、これらに限定されるわけではないが、以下：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）、に記載の方法などによって容易に計算することができる。同一性を特定するための好ましい方法は、試験された配列間での最大の一致を与えるように設計される。同一性を特定する方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムにおいて成文化される。配列アライメントおよびパーセント同一性の計算は、配列解析ソフトウェア、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ ｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラム、プログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＣＧスイート、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））、およびＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．１２２８ Ｓ．Ｐａｒｋ Ｓｔ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ ５３７１５ ＵＳＡ）などを使用して実施することができる。この適用の文脈中において、配列解析ソフトウェアが解析のために使用される場合、解析の結果は、特に明記されない限り、参照されたプログラムの「デフォルト値」に基づくであろうことは理解されるであろう。本明細書において使用される場合、「デフォルト値」は、最初に開始されたときソフトウェアによって元々ロードされた値またはパラメータの任意のセットを意味するであろう。

【0130】

本明細書において使用される場合、本開示の特定の配列のヌクレオチドに対応するヌクレオチドは、参照配列に対する同一性を最大にするために、本開示の配列のアライメントによって識別される。参照配列における同等のアミノ酸を識別するために使用される数値は、本開示の配列における対応するアミノ酸を識別するために使用される数値に基づく。

【0131】

本明細書において使用される場合、用語「異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」または「外因性」は、所定の状況において、例えば、細胞またはポリペプチドにおいて通常は見出されない分子を意味する。例えば、外因性または異種分子は、細胞に導入することができ、ならびに、例えば、トランスフェクションなどによる細胞の操作の後にのみ存在し、または遺伝子操作されたまたは異種アミノ酸配列の他の形態は、それが天然には見出されないようなタンパク質に存在することができる。

【0132】

本明細書において使用される場合、用語「異種ヌクレオチド配列」は、所定のポリヌクレオチド配列によって自然には生じないヌクレオチド配列を意味する。一実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、治療用タンパク質、例えば、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩ、の半減期を延長することができるポリペプチドをコードする。別の実施形態において、異種ヌクレオチド配列は、治療用タンパク質、例えば、凝固因子、例えば、ＦＶＩＩＩ、の流体力学半径を増加させるポリペプチドをコードする。他の実施形態では、異種ヌクレオチド配列は、その生物活性または機能（例えば、プロコアグラント活性）にあまり影響を及ぼすことなく、治療用タンパク質の１つまたはそれ以上の薬物動態特性を改善するポリペプチドをコードする。いくつの実施形態において、治療用タンパク質は、異種ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに、リンカーによって連結されるかまたは接続される。異種ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド部分の非限定的な例としては、免疫グロブリンの定常領域またはその一部分、アルブミンまたはその断片、アルブミン結合部分、トランスフエリン、米国特許出願公開第２０１００２９２１３０号のＰＡＳポリペプチド、ＨＡＰ配列、トランスフエリンまたはその断片、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのβサブユニットのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）、アルブミン結合小分子、ＸＴＥＮ配列、ＦｃＲｎ結合部分（例えば、ＦｃＲｎに結合する完全な定常領域またはその一部分）、単鎖Ｆｃ領域（例えば、米国特許第２００８／０２６０７３８号、国際公開第２００８／０１２５４３号、または国際公開第２００８／１４３９５４５号に記載されるような、ＳｃＦｃ領域）、ポリグリシンリンカー、ポリセリンリンカー、中でも５０％未満から５０％超の二次構造の様々な程度のグリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）から選択される２つのタイプのアミノ酸の６～４０のアミノ酸によるペプチドおよび低分子ポリペプチド、あるいはそれらの２つまたはそれ以上の組合せが挙げられる。いくつの実施形態において、異種ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは、非ポリペプチド部分に連結される。非ポリペプチド部分の非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルブミン結合小分子、ポリシアル酸、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、その誘導体、またはその任意の組合せが挙げられる。

【0133】

本明細書において使用される場合、ヌクレオチド配列に関して、用語「最適化された（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を意味し、この場合、ポリヌクレオチド配列は、そのポリヌクレオチド配列の特性を強化するように変異されている。いくつの実施形態において、最適化は、転写レベルを増加させるため、翻訳レベルを増加させるため、定常状態ｍＲＮＡレベルを増加させるため、一般転写因子などの調節タンパク質の結合を増加もしくは減少させるため、スプライシングを増加もしくは減少させるため、またはポリヌクレオチド配列によって産生されるポリペプチドの収量を増加させるために行われる。ポリヌクレオチド配列を最適化するためにポリヌクレオチド配列に対して為される変更の例としては、コドン最適化、Ｇ／Ｃ含量最適化、反復配列の除去、ＡＴリッチエレメントの除去、隠れた切断部位の除去、転写または翻訳を抑制するシス作用性エレメントの除去、ポリＴまたはポリＡ配列の追加または除去、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列など、転写機能を高める転写開始部位周囲への配列の追加、ステムループ構造を形成することができる配列の除去、不安定化配列の除去、ならびにそれらの２つまたはそれ以上の組合せが挙げられる。

【0134】

本明細書において使用される場合、用語「ｂａｃｍｉｄ」は、大腸菌および昆虫細胞の両方において伝搬することができるシャトルベクターを意味する。組換えｂａｃｍｉｄは、異種配列（例えば、異種遺伝子をコードする異種配列）を含むｂａｃｍｉｄを意味する。

【0135】

ＩＩ．バキュロウイルス発現ベクターシステム
バキュロウイルスシャトルベクター（ｂａｃｍｉｄ）および／または、治療薬産物を産生するように操作された安定細胞株を含むバキュロウイルス発現ベクターシステムが、本明細書において提供される。本明細書において提供されるバキュロウイルス発現ベクターシステムは、２つまたはそれ以上の外来配列挿入部位を含む組換えｂａｃｍｉｄ、ならびに外来配列挿入部位への外来配列（例えば、異種遺伝子）の挿入を媒介することができる１つまたはそれ以上のドナーベクターを含む。

【0136】

いくつの実施形態において、治療薬産物は、タンパク質である。いくつの実施形態において、治療薬産物は、核酸である。いくつの実施形態において、治療薬産物は、例えば、ワクチン、タンパク質置換療法（例えば、酵素置換療法）、ならびに基礎および応用研究のための組換えタンパク質などの様々な用途において使用される組換えタンパク質である。ある特定の実施形態において、治療薬産物は、ＤＮＡ治療薬物質であり、それは、標的配列をコードする、プラスミド様の無カプシド核酸分子である。ＤＮＡ治療薬物質は、共有結合性クローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）の形態であり得る。概して、ｃｅＤＮＡは、第１の逆方向末端反復（５’ＩＴＲ）と第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）との間に位置された治療用タンパク質－コード遺伝子を含む。

【0137】

ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲまたは非ＡＡＶ ＩＴＲである。ある特定の実施形態において、非ＡＡＶ ＩＴＲは、ウイルスファミリーパルボウイルス属のメンバーから得られるＩＴＲである。好適なＩＴＲ配列は、当業者に既知のＡＡＶ血清型のＡＡＶ ＩＴＲを含む。好適なＡＡＶおよび非ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、国際公開第２０１９０３２８９８（Ａ１）号、国際公開第２０２００３３８６３（Ａ１）号、および国際公開第２０１７１５２１４９（Ａ１）号に記載されており、なお、当該文献の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。例えば、非ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）またはパルボウイルスＢ１９（本明細書において「Ｂ１９」とも呼ばれる）に由来し得る。

【0138】

Ａ．バキュロウイルスシャトルベクター（Ｂａｃｍｉｄ）
バキュロウイルスは、昆虫に感染する最も顕著なウイルスである。５００を超えるバキュロウイルス分離株が特定されており、その大部分が、鱗翅目の昆虫に起源を有する。２つの最も一般的な分離株は、オートグラファカリフォルニア核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）およびカイコ核多角体病ウイルス（ＢｍＮＰＶ）である。遺伝子療法のためのウイルスもしくは非ウイルスベクターを製造する場合、しばしば、いくつかのバキュロウイルス発現ベクターを昆虫宿主細胞に感染させる必要がある。それぞれのバキュロウイルス発現ベクターの生成は時間がかかり、製造のためのコストを引き上げ、このことは、本発明の前のバキュロウイルス発現ベクターシステムの重要な短所を代表している。

【0139】

ある特定の実施形態において、本明細書において提供されるバキュロウイルス発現ベクターシステムは、本明細書において「ＢＩＶＶＢａｃ」と呼ばれる組換えｂａｃｍｉｄを含む。ＢＩＶＶＢａｃの代表的な概略図が、図１Ｃに示される。ある特定の実施形態において、ＢＩＶＶＢａｃは、少なくとも２つの外来配列挿入部位を含む遺伝子改変ＡｃＭＮＰＶである。少なくとも２つの外来配列挿入部位を含むｂａｃｍｉｄを含むバキュロウイルス発現ベクターシステムは、生成する必要があるバキュロウイルス発現ベクターの総数の減少を可能にする。いくつの実施形態において、本発明の単一のバキュロウイルス発現ベクターは、遺伝子療法ベクターを製造するために必要である。

【0140】

ある特定の実施形態において、ＢＩＶＶＢａｃは、第１および第２の外来配列挿入部位を含む。第１および第２の外来配列挿入部位は、異なっていてもよく、外来配列の挿入を駆動するために様々な機構を利用する（例えば、異種配列、異種遺伝子）。外来配列の挿入は、当技術分野において既知の任意の方法によって駆動される。例えば、外来配列は、転移または部位特異的組換えによって挿入される。外来配列挿入部位は、外来配列の挿入においてレポーター遺伝子が妨害されるようにレポーター遺伝子内に含まれるように設計される。レポーター遺伝子の妨害は、そこに挿入された外来配列を有するｂａｃｍｉｄクローンの識別に役立ち得る。そのような実施形態において、外来配列挿入部位がインフレームにおいてレポーター遺伝子と融合されるか、または、レポーター遺伝子がインフレームにおいて外来配列挿入部位と融合される。

【0141】

ある特定の実施形態において、第１および第２の外来配列挿入部位は、ＡｃＭＮＰＶ内の異なる遺伝子座に位置される。ある特定の実施形態において、第１および第２の外来配列挿入部位は、ＡｃＭＮＰＶ内の異なる非必須遺伝子座に位置される。ＡｃＭＮＰＶの様々な非必須遺伝子座は、当業者に既知である。例えば、ポリヘドリン遺伝子およびＥＧＴ遺伝子は、昆虫細胞でのウイルス複製のための非必須ＡｃＭＮＰＶ遺伝子である。したがって、ある特定の実施形態において、第１の外来配列挿入部位は、ＡｃＭＮＰＶのポリヘドリン遺伝子座に位置され、ならびに第２の外来配列挿入部位は、ＡｃＭＮＰＶのＥＧＴ遺伝子座に位置される。

【0142】

ある特定の実施形態において、第１の外来配列挿入部位は、転移による外来配列の挿入を可能にする。ある特定の実施形態において、第１の外来配列挿入部位は、トランスポゾンの挿入のための選択的標的部位を含む。ある特定の実施形態において、第１の外来配列挿入部位は、トランスポゾンの挿入のための選択的標的部位である。ある特定の実施形態において、第１の外来配列挿入部位は、細菌トランスポゾンのための付着部位である選択的標的部位である。好適な細菌トランスポゾンおよびそれらの対応する付着部位は、当業者に既知である。例えば、トランスポゾンＴｎ７は、高頻度において細菌染色体（ａｔｔＴｎ７）の特定の部位に転移するその能力で知られる。したがって、ある特定の実施形態において、第１の外来配列挿入部位は、Ｔｎ７トランスポゾン（例えば、ａｔｔＴｎ７）のための付着部位である選択的標的部位である。いくつの実施形態において、第１の外来配列挿入部位は、ミニＴｎ７トランスポゾン（例えば、ミニ－ａｔｔＴｎ７、Ｔｎ７転移因子による認識およびＴｎ７トランスポゾンの結合のために必要な最小ＤＮＡ配列）のための付着部位である選択的標的部位である。

【0143】

ある特定の実施形態において、第１の外来配列挿入部位は、レポーター遺伝子とインフレームにおいて融合される。レポーター遺伝子は、例えば、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、特定の色の蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、βグルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）などの当技術分野において既知の任意のレポーター遺伝子であり得る。ある特定の実施形態において、第１の外来配列挿入部位は、発色基質を代謝することができる酵素をコードするレポーター遺伝子とインフレームにおいて融合される。発色基質を代謝することができる酵素は、同じ特性を有する当技術分野において既知の酵素、例えば、ＬａｃＺまたはその機能的部分であり得る。発色基質を代謝することができる酵素をコードするレポーター遺伝子は、陽性挿入事象の色ベースのスクリーニングにおいて使用される。例えば、ＬａｃＺは、ブルー・ホワイトスクリーニングにおいて使用され、この場合、機能的ＬａｃＺ遺伝子産物は、発色基質Ｘ－ｇａｌまたはＢｌｕｅ－ｇａｌを切断し、結果として青色色素の産生を生じる。ブルー・ホワイトスクリーニングにおいて、α相補性による機能的ＬａｃＺの存在は、挿入事象が失敗したことを意味し、青色コロニーは、外来配列が挿入されなかったクローンを表す。その一方で、白色コロニーは、外来配列が首尾よく挿入されたクローンを表しており、それにより、機能的ＬａｃＺ遺伝子産物の製造を妨害し、発色基質（例えば、Ｘ－ｇａｌ）の切断を表す。

【0144】

したがって、ある特定の実施形態において、第１の外来配列挿入部位は、ＬａｃＺαまたはその機能的部分をコードする配列とインフレームにおいて融合される細菌トランスポゾンのための選択的標的部位である。ある特定の実施形態において、第１の外来配列挿入部位は、ＬａｃＺαまたはその機能的部分をコードする配列とインフレームにおいて融合されるＴｎ７トランスポゾン（例えば、ａｔｔＴｎ７）のための付着部位である選択的標的部位である。首尾よい転移に関して、トランスポゾンは、ＬａｃＺαをコードする配列を妨害し、その結果として、機能的ＬａｃＺ遺伝子産物の製造の妨害を生じる。

【0145】

ある特定の実施形態において、第２の外来配列挿入部位は、部位特異的組換えによる外来配列の挿入を可能にする。ある特定の実施形態において、第２の外来配列挿入部位は、部位特異的組換え事象を媒介することができる選択的標的部位を含む。様々な部位特異的リコンビナーゼ技術は、当業者に既知である。例えば、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰシステムは、ｌｏｘＰ部位と呼ばれる３４の塩基対ＤＮＡ配列を認識することができるＣｒｅリコンビナーゼによる部位特異的組換えを媒介する。したがって、第２の外来配列挿入部位は、Ｃｒｅ媒介性組換えのための選択的標的部位である。ある特定の実施形態において、第２の外来配列挿入部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識されることができるＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む選択的標的部位である。

【0146】

本発明の組換えｂａｃｍｉｄは、細菌細胞（例えば、大腸菌）および昆虫細胞の両方において伝搬されるその能力のために必要な他のエレメントを含む。例えば、本発明の組換えｂａｃｍｉｄは、細菌レプリコンを含む。ある特定の実施形態において、ｂａｃｍｉｄは、細菌レプリコンを含む。様々な細菌レプリコンは、当業者に既知であり、例えば、Ｆプラスミド起源のレプリコンを含む。ある特定の実施形態において、好適な細菌レプリコンは、ミニＦレプリコンであり、それは、複製および調整のために必要なＤＮＡ領域ｏｒｉＳおよびｉｎｃＣで構成されたＦプラスミドの誘導体である。ある特定の実施形態において、細菌レプリコンは、低コピー数レプリコンである。ある特定の実施形態において、低コピー数レプリコンは、ミニＦレプリコンである。

【0147】

本発明の組換えｂａｃｍｉｄの他のエレメントは、１つまたはそれ以上の選択可能なマーカー配列、および他のレポーター遺伝子を含む。当技術分野において既知であり使用される選択可能なマーカーの例としては：アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホアミドなどに対する耐性を提供する遺伝子；ならびに表現型マーカーとして使用される遺伝子、すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子など、が挙げられる。ある特定の実施形態において、組換えｂａｃｍｉｄは、抗生物質耐性遺伝子を含む選択可能なマーカー配列を含む。ある特定の実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子であり、ならびにカナマイシンに対する耐性を付与する。当技術分野において既知であり使用されるレポーターの例としては：ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、βガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、βグルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）など、が挙げられる。いくつかの場合において、選択マーカーは、レポーターであると見なすことができる。ある特定の実施形態において、組換えｂａｃｍｉｄは、蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子を含む。ある特定の実施形態において、蛍光タンパク質は、赤色蛍光タンパク質である。

【0148】

当業者は、本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄの様々なエレメントがお互いに作動可能な連結状態にあることを認識する。ｂａｃｍｉｄにおける様々なコード配列のそれぞれは、例えば、プロモーター配列などを含む調節領域と作動可能な連結状態にあり得る。当技術分野において既知の任意のプロモーター配列は、好適であり得る。

【0149】

したがって、本発明の組換えｂａｃｍｉｄは、ミニＦレプリコン、抗生物質耐性遺伝子、Ｔｎ７トランスポゾンのための付着部位を含むＬａｃＺαまたはその機能的部分、バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子、ならびにＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含む。

【0150】

ある特定の例示的実施形態において、本発明の組換えｂａｃｍｉｄは、図１Ｃに示されるＢＩＶＶＢａｃである。ある特定の実施形態において、ＢＩＶＶＢａｃは、ＡｃＭＮＰＶ Ｃ６ゲノムをコードし、ならびに、２つの外来配列挿入部位：１）ポリヘドリン遺伝子座におけるミニａｔｔＴｎ７、および２）ＥＧＴ遺伝子座におけるＬｏｘＰをコードするように操作されている。ミニａｔｔＴｎ７挿入配列は、Ｔｎ７媒介性転移の後の、組換えｂａｃｍｉｄのＸ－ｇａｌ媒介性ブルー／ホワイトスクリーニングのためのＬａｃ－プロモーター駆動大腸菌ＬａｃＺα断片、ならびにＣｒｅ媒介性インビトロまたはインビボ組換えのためのＬｏｘＰ部位、とインフレームにおいて融合される。ＢＩＶＶＢａｃは、ＡｃＭＮＰＶ３９Ｋプロモーターの制御下の赤色蛍光タンパク質遺伝子も含み、その後に、ｅｔｓポリアデニル化シグナルが続く。

【0151】

ある特定の例示的実施形態において、ＢＩＶＶＢａｃは、Ｔｎ７媒介性転移を可能にすることができる細菌株に導入される。ある特定の実施形態において、細菌株は、大腸菌株である。ある特定の実施形態において、細菌株は、大腸菌ＤＨ１０Ｂ細菌である。ある特定の実施形態において、Ｔｎ７トランスポザーゼ遺伝子ｔｎｓＡ－Ｅおよびテトラサイクリン抵抗性をコードするヘルパープラスミドが、ＢＩＶＶＢａｃを保持するＤＨ１０Ｂ大腸菌に導入される。ＢＩＶＶＢａｃおよびヘルパープラスミドを保持するＤＨ１０Ｂ大腸菌は、本明細書においてＢＩＶＶＢａｃ^{ＤＨ１０Ｂ}と呼ばれる。

【0152】

任意の外来配列（例えば、異種配列）を、Ｔｎ７媒介性転移を介してＢＩＶＶＢａｃに導入することができる。ある特定の実施形態において、外来配列は、外来配列を含むＴｎ７トランスファーベクターをＢＩＶＶＢａｃ^{ＤＨ１０Ｂ}に導入することによってＴｎ７媒介性転移を介してＢＩＶＶＢａｃに導入され、その結果として、外来配列を含むＢＩＶＶＢａｃを生じる。ある特定の実施形態において、外来配列を含むＢＩＶＶＢａｃは、細菌レプリコン、第１の選択可能なマーカー配列、第１のレポーター遺伝子に挿入された外来配列（例えば、異種配列）を含み、この場合、挿入された外来配列は、第１のレポーター遺伝子のリーディングフレーム、バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された第２のレポーター遺伝子、および部位特異的組換え事象を媒介することができる選択的標的部位を妨害する。

【0153】

ある特定の例示的実施形態において、遺伝子療法ベクターを作製する目的のために、ＡＡＶまたは非ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子が、Ｔｎ７媒介性転移を介してＢＩＶＶＢａｃに導入される。ある特定の実施形態において、ＡＡＶまたは非ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子を含むＴｎ７トランスファーベクターが、ＢＩＶＶＢａｃ^{ＤＨ１０Ｂ}、に導入され、その結果として、Ｒｅｐ遺伝子を含むＢＩＶＶＢａｃを生じる。ある特定の実施形態において、組換えｂａｃｍｉｄは：ミニＦレプリコン；第１の抗生物質耐性遺伝子；ＬａｃＺαまたはその機能的部分に挿入されたＢ１９ Ｒｅｐをコードする配列を含み、この場合、挿入されたＢ１９ Ｒｅｐは、ＬａｃＺαまたはその機能的部分のリーディングフレーム；バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子；ならびにＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを妨害する。ある特定の実施形態において、組換えｂａｃｍｉｄは：ミニＦレプリコン；第１の抗生物質耐性遺伝子；ＬａｃＺαまたはその機能的部分に挿入されたＧＰＶ Ｒｅｐをコードする配列を含み、この場合、挿入されたＧＰＶ Ｒｅｐは、ＬａｃＺαまたはその機能的部分のリーディングフレーム；バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子；ならびにＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを妨害する。ある特定の実施形態において、組換えｂａｃｍｉｄは、ミニＦレプリコン、第１の抗生物質耐性遺伝子；ＬａｃＺαまたはその機能的部分に挿入されたＡＡＶ２ Ｒｅｐをコードする配列を含み、この場合、挿入されたＡＡＶ２ Ｒｅｐは、ＬａｃＺαまたはその機能的部分のリーディングフレーム；バキュロウイルス誘導性プロモーターに作動可能に連結された蛍光タンパク質をコードする遺伝子；ならびにＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを妨害する。

【0154】

任意の外来配列（例えば、異種配列）を、Ｃｒｅ媒介性組換えを介してＢＩＶＶＢａｃに導入することができる。ある特定の実施形態において、外来配列は、Ｃｒｅ媒介性組換えを介してＢＩＶＶＢａｃに導入され、この場合、外来配列は、本明細書において説明されるＣｒｅ－ＬｏｘＰトランスファーベクター上に存在する。Ｃｒｅ媒介性組換えの方法は、当業者に周知である。

【0155】

ある特定の例示的実施形態において、遺伝子療法ベクターを作製する目的のために、対称または非対称ＡＡＶまたは非ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接した治療用タンパク質－コード遺伝子が、Ｃｒｅ媒介性組換えを介してＢＩＶＶＢａｃに導入される。ある特定の実施形態において、組換えｂａｃｍｉｄは：ミニＦレプリコン；抗生物質耐性遺伝子；Ｔ７トランスポゾンのための付着部位を含むＬａｃＺαまたはその機能的部分；部位特異的組換え事象を媒介することができる第１の選択的標的部位（例えば、第１のＬｏｘＰ部位）；対称性または非対称性ＡＡＶまたは非ＡＡＶＩＴＲが隣接した治療用タンパク質－コード遺伝子；ならびに部位特異的組換えイベントを媒介することができる第２の選択的標的部位（例えば、第２のＬｏｘＰ部位）を含む。

【0156】

したがって、遺伝子療法ベクターを作製する目的のために、組換えｂａｃｍｉｄは：ＬａｃＺαまたはその機能的部分に挿入されたＢ１９ Ｒｅｐをコードする配列を含み、この場合、挿入されたＢ１９ Ｒｅｐは、ＬａｃＺαまたはその機能的部分のリーディングフレーム；および異種配列を含む多重クローニング部位を妨害し、この場合、異種配列は、５’から３’に向かって：パルボウイルスＢ１９に由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；およびパルボウイルスＢ１９に由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復を含む。

【0157】

したがって、遺伝子療法ベクターを作製する目的のために、組換えｂａｃｍｉｄは：ＬａｃＺαまたはその機能的部分に挿入されたＧＰＶ Ｒｅｐをコードする配列を含み、この場合、挿入されたＧＰＶ Ｒｅｐは、ＬａｃＺαまたはその機能的部分のリーディングフレーム；ならびに異種配列を含む多重クローニング部位を妨害し、この場合、異種配列は、５’から３’に向かって：ＧＰＶに由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；およびＧＰＶに由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復を含む。

【0158】

したがって、遺伝子療法ベクターを作製する目的のために、組換えｂａｃｍｉｄは：ＬａｃＺαまたはその機能的部分に挿入されたＡＡＶ２ Ｒｅｐをコードする配列を含み、この場合、挿入されたＡＡＶ２ Ｒｅｐは、ＬａｃＺαまたはその機能的部分のリーディングフレーム；ならびに異種配列を含む多重クローニング部位を妨害し、この場合、異種配列は、５’から３’に向かって：ＡＡＶ２に由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；およびＡＡＶ２に由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復を含む。

【0159】

したがって、遺伝子療法ベクターを作製する目的のために、組換えｂａｃｍｉｄは：ミニａｔｔＴｎ７部位に挿入されたヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ１）Ｒｅｐをコードする配列、ＬａｃＺα、またはその機能的部分を含み、この場合、挿入されたＨＢｏＶ１ Ｒｅｐは、ＬａｃＺαまたはその機能的部分のリーディングフレーム；ならびに異種配列を含む多重クローニング部位を妨害し、この場合、異種配列は、５’から３’に向かって：ＨＢｏＶ１に由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；およびＨＢｏＶ１に由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復を含む。

【0160】

ある特定の実施形態において、ＢＩＶＶＢａｃ ｂａｃｍｉｄは、クローズドエンドＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）を作製するために使用される。いくつの実施形態において、ｃｅＤＮＡは、単一のバキュロウイルス発現ベクターを使用することによって作製される。この「ＯｎｅＢＡＣ」アプローチにおいて、単一のバキュロウイルス発現ベクター（例えば、ＢＩＶＶＢａｃ）は、バキュロウイルスシステムにおけるｃｅＤＮＡ作製のために必要な全ての必須エレメントをコードし、ならびに、潜在的に、ｃｅＤＮＡ作製のための任意のバキュロウイルス許容細胞株において使用することができた。このアプローチは、図１３Ａに表される。

【0161】

ある特定の実施形態において、ｃｅＤＮＡは、複数のバキュロウイルス発現ベクターを使用することによって作製される。この「ＴｗｏＢＡＣ」アプローチにおいて、ｃｅＤＮＡ作製のために必要な全ての必須エレメントは、２つの異なるバキュロウイルス（例えば、２つのＢＩＶＶＢａｃ ｂａｃｍｉｄｓ）に挿入され、ならびに、バキュロウイルス感染に対して許容的である任意の細胞株における共感染のために使用されるであろう。このアプローチは、図１３Ｂに表される。

【0162】

ある特定の実施形態において、ｃｅＤＮＡは、安定細胞株によって産生される。このアプローチにおいて、ｃｅＤＮＡ作製にとって必要な必須エレメントは、バキュロウイルスシステムの両方の成分に挿入される。このアプローチは、図１３Ｃに表される。安定細胞株は、バキュロウイルス遺伝子プロモーター（例えば、バキュロウイルス構成的プロモーター）の制御下において配列をコードするタンパク質を安定に組み込むことによって生成することができる。ある特定の実施形態において、安定細胞株は、安定昆虫細胞株である。

【0163】

Ｂ．トランスファーベクター
本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄは、少なくとも２つの外来配列挿入部位を含む。ある特定の実施形態において、当該少なくとも２つの外来配列挿入部位は、１）Ｔｎ７媒介性転移のためのミニａｔｔＴｎ７、および２）Ｃｒｅ媒介性部位特異的組換えのためのＬｏｘＰである。したがって、本発明のバキュロウイルス発現ベクターシステムは、さらに、組換えｂａｃｍｉｄの外来配列挿入部位に挿入された外来配列を含む２つまたはそれ以上のトランスファーベクターを含む。

【0164】

Ｔｎ７トランスファーベクター
ある特定の実施形態において、トランスファーベクターは、組換えｂａｃｍｉｄのミニａｔｔＴｎ７に挿入される外来配列を含む。ある特定の実施形態において、トランスファーベクターは、Ｔｎ７トランスファーベクターである。ある特定の実施形態において、トランスファーベクターは、ミニＴｎ７トランスファーベクターである。ある特定の実施形態において、Ｔｎ７トランスファーベクターは、組換えｂａｃｍｉｄのミニａｔｔＴｎ７への外来配列の転移を媒介することができるＴｎ７の左端および右端（Ｔｎ７ＬおよびＴｎ７Ｒ）を含む。

【0165】

ある特定の例示的実施形態において、遺伝子療法ベクターを作製する目的のために、Ｔｎ７トランスファーベクターは、ＡＡＶまたは非ＡＡＶ Ｒｅｐに対するコード配列を含む。いくつの実施形態において、Ｒｅｐ発現コンストラクトが提供され、この場合、ｒｅｐ遺伝子は、ｐＦａｓｔＢａｃ１トランスファーベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるバキュロウイルス遺伝子プロモーターの制御下においてクローンされた非ＡＡＶまたはＡＡＶの遺伝子である。ある特定の実施形態において、バキュロウイルス遺伝子プロモーターは、最初期（ｉｅ１）のためのプロモーターである。ある特定の実施形態において、バキュロウイルス遺伝子プロモーターは、ポリヘドリン遺伝子のためのプロモーターである。好適なバキュロウイルス遺伝子プロモーターは、当業者に既知である。ある特定の実施形態において、好適なバキュロウイルス遺伝子プロモーターは、最初期、初期、後期、または最晩期の遺伝子プロモーターである。

【0166】

ある特定の実施形態において、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ７８の標準開始コドンが非標準開始コドンへと改変されるように改変される。ある特定の実施形態において、Ｒｅｐ５２の開始コドンの前の他のＡＵＧコドンは、漏出性リボソーマルスキャンニングメカニズムによって単一ｍＲＮＡ転写物からのＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２ポリペプチドの発現を可能にするために、いずれかのサイレント変異に耐えるように変異されるか（フレーム外の場合）または保存的アミノ酸置換をコードするように変異される（インフレームの場合）。

【0167】

ある特定の実施形態において、Ｔｎ７トランスファーベクターは、Ｒｅｐ遺伝子に作動可能に連結されたバキュロウイルス遺伝子プロモーターに隣接するＴｎ７の左端および右端（Ｔｎ７ＬおよびＴｎ７Ｒ）を含む。ある特定の実施形態において、Ｒｅｐ遺伝子は、Ｂ１９ Ｒｅｐ、ＧＰＶ Ｒｅｐ、ＨＢｏＶ１、およびＡＡＶ２ Ｒｅｐからなる群から選択される。ある特定の実施形態において、Ｔｎ７トランスファーベクターは、図３Ａおよび３Ｂに示されるように、Ｂ１９ Ｒｅｐに作動可能に連結されたポリヘドリンプロモーターに隣接するＴｎ７の左および右端を含む。ある特定の実施形態において、Ｔｎ７トランスファーベクターは、図３Ａおよび３Ｂに示されるように、Ｂ１９ Ｒｅｐに作動可能に連結されたｉｅ１プロモーターに隣接するＴｎ７の左および右端を含む。ある特定の実施形態において、Ｔｎ７トランスファーベクターは、図３Ｃおよび３Ｄに示されるように、ＧＰＶ Ｒｅｐに作動可能に連結されたポリヘドリンプロモーターに隣接するＴｎ７の左および右端を含む。ある特定の実施形態において、Ｔｎ７トランスファーベクターは、図３Ｅおよび３Ｆに示されるように、ＡＡＶ２ Ｒｅｐに作動可能に連結されたポリヘドリンプロモーターに隣接するＴｎ７の左および右端を含む。ある特定の実施形態において、Ｔｎ７トランスファーベクターは、ＨＢｏＶ１ Ｒｅｐに作動可能に連結されたポリヘドリンプロモーターに隣接するＴｎ７の左および右端を含む（データは提供されない）。

【0168】

Ｃｒｅ－ＬｏｘＰトランスファードナーベクター
ある特定の実施形態において、トランスファーベクターは、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰトランスファードナーベクターである。ある特定の実施形態において、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰトランスファードナーベクターは、第１の細菌株において核酸ベクターを伝搬するための第１の複製起点を含む核酸ベクターであり、この場合、第１の複製起点は、条件付きの複製起点；第２の細菌株において核酸ベクターを伝搬するための第２の複製起点；外来配列（例えば、異種配列）の挿入のための多重クローニング部位；選択可能なマーカー配列；レポーター遺伝子；および／または部位特異的組換え事象を媒介することができる選択的標的部位である。ある特定の実施形態において、第１の複製起点は、π－タンパク質、例えば、Ｒ６Ｋγ複製起点など、の存在において条件付きである。ある特定の実施形態において、第１の複製起点は、Ｒ６Ｋγ複製起点である。したがって、ある特定の実施形態において、第１の細菌株は、π－タンパク質を含む。ある特定の実施形態において、第２の複製起点は、ｐＵＣ５７複製起点である。ある特定の実施形態において、部位特異的組換え事象を媒介することができる選択的標的部位は、ＬｏｘＰ部位またはそのバリアントを含み、ならびに、部位特異的組換え事象は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって媒介される。本明細書において説明されるＣｒｅ－ＬｏｘＰトランスファーベクターは、ベクターを含む宿主細胞の適切な識別にとって好適な任意の他のエレメントを有することができる。例えば、当業者に既知の任意の選択可能なマーカー配列および／またはレポーター遺伝子は、本明細書において説明されるＣｒｅ－ＬｏｘＰトランスファーベクターに組み込むことができる。

【0169】

ある特定の実施形態において、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰトランスファーベクターは、ＬｏｘＰ組換え部位、ＡｃＭＮＰＶ ｉｅ１プロモーターとそれに先行する転写エンハンサーｈｒ５エレメントおよび後に続くＡｃＭＮＰＶ ｐ１０ポリアデニル化シグナルの存在下の増強されたＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マーカー遺伝子、アンピシリン耐性マーカー、条件付きＲ６Ｋγ複製起点、ならびに多重クローニング部位を含むｐＵＣ５７ベクターである。Ｃｒｅ－ＬｏｘＰトランスファーベクターの特徴としては、１）導入遺伝子を挿入するための多重クローニング部位（ＭＣＳ）；２）Ｃｒｅ媒介性インビトロまたはインビボ組換えのためのＬｏｘＰ部位；３）以下：ｉ）大腸菌株、例えば、ＤＨ５α、ＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ、ＰＭＣ１０３、およびＤＨ１０Ｂなど、にこのベクターを伝搬するためのＣｏｌＥ１ Ｏｒｉ；ならびにｉｉ）π（パイ）タンパク質、例えば、ｐｉｒ＋およびｐｉｒ１１６などを発現する大腸菌株へこのベクターを伝搬するための条件付きＲ６ＫγＯｒｉを含む２つ複製起点；４）Ｃｒｅ媒介性組換えによってＢＩＶＶＢａｃのＬｏｘＰ部位にＣｒｅ－ＬｏｘＰドナーベクターを挿入した後にカナマイシンおよびアンピシリンを伴う組換えｂａｃｍｉｄを選択するためのアンピシリン抗生物質耐性遺伝子；ならびに５）連続継代において昆虫細胞において複製しつつ組換えＢＥＶにおける導入遺伝子の安定性を特定するために増強されたＧＦＰレポーター遺伝子、が挙げられる。多重クローニング部位が、外来配列がどのようにそこに挿入されたか（例えば、端末制限部位または非端末制限部位を使用することによって、またはそこで外来配列をクローニングするために使用される制限酵素の性質）に応じて、外来配列（例えば、導入遺伝子）を含むＣｒｅ－ＬｏｘＰトランスファーベクターにおいて維持されるか否かは、当業者によって理解できるであろう。

【0170】

ある特定の例示的実施形態において、遺伝子療法ベクターを作製する目的のために、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰトランスファーベクターは、外来配列（例えば、異種配列）を含む。例えば、ある特定の実施形態において、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰトランスファーベクターは、対称性または非対称性ＡＡＶまたは非ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接した治療用タンパク質－コード遺伝子を含む。ある特定の実施形態において、対称性または非対称性ＡＡＶまたは非ＡＡＶＩＴＲが隣接した治療用タンパク質－コード遺伝子は、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰトランスファーベクターの多重クローニング部位の位置に存在する。

【0171】

Ｔｎ７トランスファーベクターおよびＣｒｅ－ＬｏｘＰトランスファードナーベクターは、本発明の組換えｂａｃｍｉｄを生成するために外来配列の挿入のために用いることができるトランスファーベクターの例であることは、当業者によって認識されるであろう。ある特定の実施形態において、本明細書において説明されるトランスファーベクターを使用して挿入される外来配列は、トランスファーベクターの間においての交換可能である。例えば、遺伝子療法ベクターを作製する目的のために、Ｒｅｐ遺伝子は、Ｔｎ７トランスファーベクターによって組換えｂａｃｍｉｄに導入され、ならびに、治療用タンパク質－コード遺伝子は、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰトランスファーベクターによって導入される。別の例において、遺伝子療法ベクターを作製する目的のために、Ｒｅｐ遺伝子は、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰトランスファーベクターによって組換えｂａｃｍｉｄに導入され、ならびに、治療用タンパク質－コード遺伝子は、Ｔｎ７トランスファーベクターによって導入される。

【0172】

ある特定の実施形態において、本発明のＣｒｅ－ＬｏｘＰトランスファーベクターは、ＬｏｘＰ配列および増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）コード遺伝子を含み、ならびに、治療用タンパク質－コード遺伝子（例えば、隣接する対称または非対称ＩＴＲを伴うｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ、この場合、ＩＴＲは、非ＡＡＶまたはＡＡＶのＩＴＲである）をクローニングするために使用される。

【0173】

ある特定の実施形態において、組換えｂａｃｍｉｄが提供され、この場合、Ｒｅｐコード遺伝子は、転移によってポリヘドリン遺伝子座のミニａｔｔＴｎ７部位に挿入され、ならびに、対称または非対称ＩＴＲを伴う治療用タンパク質－コード遺伝子は、Ｃｒｅ媒介性組換えによってＥＧＴ遺伝子座のＬｏｘＰ部位に挿入される。ある特定の実施形態において、Ｒｅｐ遺伝子およびＩＴＲは、非ＡＡＶまたはＡＡＶのそれである。

【0174】

したがって、ある特定の実施形態において、以下：ＬａｃＺαまたはその機能的部分に挿入された（例えば、ＬａｃＺα内のミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された）ＡＡＶ Ｒｅｐ（例えば、ＡＡＶ２ Ｒｅｐ）をコードする配列であって、挿入されたＲｅｐがＬａｃＺαまたはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；ならびに異種配列を含む多重クローニング部位であって、異種配列が５’から３’に向かって：由来する野生型または切断型ＡＡＶ ５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；および野生型または切断型ＡＡＶ ３’逆方向末端反復を含む、多重クローニング部位を含む、組換えｂａｃｍｉｄが提供される。

【0175】

ある特定の実施形態において、以下：ＬａｃＺαまたはその機能的部分に挿入された（例えば、ＬａｃＺα内のミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された）非ＡＡＶ Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＲｅｐがＬａｃＺαまたはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；ならびに異種配列を含む多重クローニング部位であって、異種配列が５’から３’に向かって：第１のパルボウイルス非ＡＡＶゲノムに由来する野生型または切断型非ＡＡＶ ５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；および第２のパルボウイルス非ＡＡＶゲノムに由来する野生型または切断型非ＡＡＶ３’逆方向末端反復を含む、多重クローニング部位を含む、組換えｂａｃｍｉｄが提供される。ある特定の実施形態において、第１および第２のパルボウイルス非ＡＡＶゲノムは、異なる。

【0176】

ある特定の実施形態において、以下：ＬａｃＺαまたはその機能的部分に挿入された（例えば、ＬａｃＺα内のミニａｔｔＴｎ７部位に挿入されたＢ１９ Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＢ１９ ＲｅｐがＬａｃＺαまたはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；ならびに異種配列を含む多重クローニング部位であって、異種配列が５’から３’に向かって：パルボウイルスＢ１９に由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；およびパルボウイルスＢ１９に由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復を含む、多重クローニング部位を含む、組換えｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0177】

ある特定の実施形態において、以下：ＬａｃＺαまたはその機能的部分に挿入された（例えば、ＬａｃＺα内のミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された）ＧＰＶ Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＧＰＶ ＲｅｐがＬａｃＺαまたはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；ならびに異種配列を含む多重クローニング部位であって、異種配列が５’から３’に向かって：ＧＰＶに由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；およびＧＰＶに由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復を含む、多重クローニング部位を含む組換えｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0178】

ある特定の実施形態において、以下：ＬａｃＺαまたはその機能的部分に挿入された（例えば、ＬａｃＺα内のミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された）ＡＡＶ２ Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＡＡＶ２ ＲｅｐがＬａｃＺαまたはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；ならびに異種配列を含む多重クローニング部位であって、異種配列が５’から３’に向かって：ＡＡＶ２に由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；およびＡＡＶ２に由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復を含む、多重クローニング部位を含む組換えｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0179】

ある特定の実施形態において、以下：ＬａｃＺαまたはその機能的部分に挿入された（例えば、ＬａｃＺα内のミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された）ＨＢｏＶ１ Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＨＢｏＶ１ ＲｅｐがＬａｃＺαまたはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；ならびに異種配列を含む多重クローニング部位であって、異種配列が５’から３’に向かって：ＨＢｏＶ１に由来する野生型または切断型５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；およびＨＢｏＶ１に由来する野生型または切断型３’逆方向末端反復を含む、多重クローニング部位を含む組換えｂａｃｍｉｄが、本明細書において提供される。

【0180】

ある特定の実施形態において、以下：ＬａｃＺαまたはその機能的部分に挿入された（例えば、ＬａｃＺα内のミニａｔｔＴｎ７部位に挿入された）非ＡＡＶ Ｒｅｐをコードする配列であって、挿入されたＲｅｐがＬａｃＺαまたはその機能的部分のリーディングフレームを妨害する、配列；ならびに異種配列を含む多重クローニング部位であって、異種配列が５’から３’に向かって：野生型または切断型非ＡＡＶ ５’逆方向末端反復；タンパク質をコードする配列；タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の発現制御配列；および野生型または切断型非ＡＡＶ３’逆方向末端反復を含む、多重クローニング部位を含む組換えｂａｃｍｉｄが提供される。ある特定の実施形態において、非ＡＡＶ Ｒｅｐおよび非ＡＡＶ逆方向末端反復は、ウイルスファミリーパルボウイルス属の非ＡＡＶゲノムのＩＴＲから選択される。ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、同じパルボウイルス非ＡＡＶゲノムのＩＴＲである。ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、異なるパルボウイルス非ＡＡＶゲノムのＩＴＲである。そのような実施形態において、非ＡＡＶ Ｒｅｐは、パルボウイルス非ＡＡＶゲノムのうちの少なくとも１つのＲｅｐである。そのような実施形態において、当業者は、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲが異なるパルボウイルス非ＡＡＶゲノムのＩＴＲである実施形態において使用されるべき最も好適なＲｅｐを決定することができるであろう。

【0181】

ある特定の実施形態において、組換えｂａｃｍｉｄは、野生型または切断型ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ならびに野生型または切断型パルボウイルス非ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。ある特定の実施形態において、組換えｂａｃｍｉｄは、野生型または切断型パルボウイルス非ＡＡＶ ５’ＩＴＲ、ならびに野生型または切断型ＡＡＶ ３’ＩＴＲを含む。そのような実施形態において、当業者は、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲが異なるパルボウイルスゲノムのＩＴＲである実施形態において使用されるべき最も好適なＲｅｐを決定することができるであろう。

【0182】

ＩＩＩ．外来配列
本明細書において説明されるバキュロウイルス発現ベクターシステムは、任意の所望の産物の作製のために使用することができることは、当業者によって理解できるであろう。例えば、本明細書において説明されるバキュロウイルス発現ベクターシステムは、遺伝子治療のための組換えタンパク質またはウイルスもしくは非ウイルスベクターの作製のために使用することができる。したがって、核酸分子の作製の下記の説明は、いかなる点においても制限ではない。

【0183】

核酸分子
ある特定の実施形態において、本明細書において説明されるバキュロウイルス発現ベクターシステムは、核酸分子の作製のために使用することができる。例えば、遺伝子療法のための核酸分子の作製。したがって、本明細書において説明されるある特定の実施形態は、標的配列をコードする、プラスミド様の無カプシド核酸分子の作製に関する。ウイルスのタンパク質シェルであるカプシドは、ウイルスの遺伝物質を囲んでいる。カプシドは、ウイルスゲノムを保護し、ゲノムを宿主に送達し、ならびに宿主と相互作用することによってビリオンの機能を支援することが知られている。とはいえ、ウイルスカプシドは、ベクターのパッケージング能力を制限し、および／または、とりわけ遺伝子療法において使用される場合、免疫反応を引き起こす要因であり得る。

【0184】

ＡＡＶベクターは、遺伝子療法ベクターのより一般的なタイプの１つとして台頭した。しかしながら、カプシドの存在は、遺伝子療法によるＡＡＶベクターの有用性を制限する。特に、カプシド自体が、ベクターに含まれる導入遺伝子のサイズを４．５ｋｂ未満まで低く制限し得る。遺伝子療法において有用であり得る様々な治療用タンパク質は、発現制御配列が加えられる前でさえ、このサイズを容易に超え得る。

【0185】

さらに、カプシドを構成するタンパク質は、対象の免疫系が標的にし得る抗原として機能し得る。ＡＡＶは、一般集団において非常に一般的であり、ほとんどの人が、その人生を通してＡＡＶに曝されている。結果として、最も可能性のある遺伝子療法レシピエントは、おそらく既にＡＡＶに対する免疫反応を発生させており、したがって、この療法を拒絶する可能性が高い。

【0186】

ある特定の実施形態において、本発明は、第１のＩＴＲ、第２のＩＴＲ、および遺伝子カセット、例えば、治療用タンパク質および／またはｍｉＲＮＡをコードする遺伝子カセットを含む核酸分子の作製を対象とする。いくつの実施形態において、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、異種ポリヌクレオチド配列を含む遺伝子カセットに隣接する。いくつの実施形態において、核酸分子は、カプシドタンパク質、複製タンパク質、および／または集合タンパク質をコードする遺伝子を含まない。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、治療用タンパク質をコードする。いくつの実施形態において、治療用タンパク質は、凝固因子を含む。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、ｍｉＲＮＡをコードする。ある特定の実施形態において、遺伝子カセットは、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲの間に位置される。いくつの実施形態において、核酸分子は、さらに、１つまたはそれ以上の非コード領域を含む。ある特定の実施形態において、１つまたはそれ以上の非コード領域は、プロモーター配列、イントロン、転写後調節エレメント、３’ＵＴＲポリ（Ａ）配列、またはそれらの任意の組合せを含む。

【0187】

一実施形態において、遺伝子カセットは、一本鎖核酸である。別の実施形態において、遺伝子カセットは、二本鎖核酸である。

【0188】

本開示のいくつかの態様は、遺伝子カセット、例えば、治療用タンパク質および／またはｍｉＲＮＡをコードする遺伝子カセットを含む核酸分子を対象とする。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、治療用タンパク質をコードする。いくつの実施形態において、治療用タンパク質は、凝固因子を含む。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、ｍｉＲＮＡをコードする。いくつの実施形態において、核酸分子は、さらに、少なくとも１つの非コード領域を含む。ある特定の実施形態において、少なくとも１つの非コード領域は、プロモーター配列、イントロン、転写後調節エレメント、３’ＵＴＲポリ（Ａ）配列、またはそれらの任意の組合せを含む。

【0189】

いくつの実施形態において、本明細書において開示される核酸分子は、イントロンまたはイントロン配列を含む。いくつの実施形態において、イントロン配列は、天然に存在するイントロン配列である。いくつの実施形態において、イントロン配列は、合成配列である。いくつの実施形態において、イントロン配列は、天然に存在するイントロン配列に由来する。いくつの実施形態において、イントロン配列は、ハイブリッド合成イントロンまたはキメライントロンである。いくつの実施形態において、イントロン配列は、ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンイントロンからなるキメライントロンであり、ならびに、偽の翻訳開始を減少させるために５つの既存のＡＴＧ配列を排除するように改変されている。ある特定の実施形態において、イントロン配列は、ＳＶ４０低分子Ｔイントロンを含む。いくつの実施形態において、イントロン配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする核酸配列の５’側に位置される。いくつの実施形態において、キメライントロンは、プロモーター配列、例えば、ｍＴＴＲプロモーターなど、の５’側に位置される。いくつの実施形態において、キメライントロンは、配列番号２３の核酸配列を含む。

【0190】

一実施形態において、遺伝子カセットは、一本鎖核酸である。別の実施形態において、遺伝子カセットは、二本鎖核酸である。別の実施形態において、遺伝子カセットは、閉鎖型二本鎖核酸（ｃｅＤＮＡ）である。

【0191】

いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、この場合、ヌクレオチド配列は、コドン最適化される。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、ｍＴＴＲプロモーターおよび合成イントロンによって駆動されるコドン最適化ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１５８７９号において開示されるヌクレオチド配列を含み、なお、当該特許は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１５８７９号において説明される「ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ」遺伝子カセットである。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、ＸＴＥＮ １４４ペプチドと融合したＢドメイン削除（ＢＤＤ）コドン最適化ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＢＤＤｃｏＦＶＩＩＩ）をコードするコドン最適化ｃＤＮＡを含む。

【0192】

いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、ｍＴＴＲプロモーターによって駆動されるコドン最適化ＦＶＩＩＩをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつの実施形態において、ｍＴＴＲプロモーターは、配列番号２２の核酸配列を含む。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、さらに、Ａ１ＭＢ２エンハンサーエレメントを含む。いくつの実施形態において、Ａ１ＭＢ２エンハンサーエレメントは、配列番号２１の核酸配列を含む。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、さらに、キメラまたは合成イントロンを含む。いくつの実施形態において、キメライントロンは、ニワトリβ－アクチン／ウサギβ－グロビンイントロンからなり、ならびに、偽の翻訳開始を減少させるために５つの既存のＡＴＧ配列を排除するように改変されている。いくつの実施形態において、イントロン配列は、ＦＶＩＩＩポリペプチドをコードする核酸配列の５’側に位置される。いくつの実施形態において、キメライントロンは、プロモーター配列、例えば、ｍＴＴＲプロモーターなど、の５’側に位置される。いくつの実施形態において、キメライントロンは、配列番号２３の核酸配列を含む。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、さらに、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。いくつの実施形態において、ＷＰＲＥは、配列番号２４の核酸配列を含む。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、さらに、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナルを含む。いくつの実施形態において、ｂＧＨｐＡシグナルは、配列番号２５の核酸配列を含む。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、配列番号１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、配列番号１９の核酸配列を含む。

【0193】

いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、Ａ１ＭＢ２エンハンサーエレメント、ハイブリッド合成イントロン（キメライントロン）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナルを含む肝臓特異的改変マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーター（ｍＴＴＲ４８２）によって駆動されるコドン最適化ＦＶＩＩＩおよびＸＴＥＮペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、配列番号１９の核酸配列を含む。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、配列番号１９に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0194】

逆方向末端反復
ある特定の実施形態において、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＩＴＲまたは非ＡＡＶ ＩＴＲである。ある特定の実施形態において、非ＡＡＶ ＩＴＲは、ウイルスファミリーパルボウイルスのメンバーから得られるＩＴＲである。好適なＩＴＲ配列は、当業者に既知のＡＡＶ血清型のＡＡＶ ＩＴＲを含む。好適なＡＡＶおよび非ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、国際公開第２０１９０３２８９８（Ａ１）号、国際公開第２０２００３３８６３（Ａ１）号、および国際公開第２０１７１５２１４９（Ａ１）号に記載されており、なお、当該文献の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。例えば、非ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）またはパルボウイルスＢ１９（本明細書において「Ｂ１９」とも呼ばれる）に由来し得る。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶゲノムに由来しない。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、非ＡＡＶのＩＴＲである。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、これらに限定されるわけではないが、ボカウイルス属、ディペンドウイルス属、エリスロウイルス属、アムドウイルス属、パルボウイルス属、デンソウイルス属、イテラウイルス属、コントラウイルス属、アベパルボウイルス属、コピパルボウイルス属、プロトパルボウイルス属、テトラパルボウイルス属、アンビデンソウイルス属、ブレビデンソウイルス属、ヘパンデンソウイルス属、ペンスチルデンソウイルス属、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択されるウイルスファミリーパルボウイルス属の非ＡＡＶゲノムのＩＴＲである。ある特定の実施形態において、ＩＴＲは、エリスロウイルスパルボウイルスＢ１９（ヒトウイルス；本明細書において「Ｂ１９」とも呼ばれる）に由来する。別の実施形態において、ＩＴＲは、ノバリケンパルボウイルス（ＭＤＰＶ）株に由来する。ある特定の実施形態において、ＭＤＰＶ株は、弱毒化された、例えばＭＤＰＶ株ＦＺ９１－３０である。他の実施形態において、ＭＤＰＶ株は、病原性の、例えばＭＤＰＶ株ＹＹである。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、ブタパルボウイルス、例えばブタパルボウイルスＵ４４９７８、に由来する。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、マウスマイニュートウイルス、例えばマウスマイニュートウイルスＵ３４２５６、に由来する。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、イヌパルボウイルス、例えばイヌパルボウイルスＭ１９２９６、に由来する。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、ミンク腸炎ウイルス例えばミンク腸炎ウイルスＤ００７６５に由来する。いくつの実施形態において、ＩＴＲは、デペンドパルボウイルス属（Ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）に由来する。一実施形態において、デペンドパルボウイルス属は、ディペンドウイルス属ガチョウパルボウイルス（ＧＰＶ）株である。特定の実施形態において、ＧＰＶ株は、弱毒化された、例えばＧＰＶ株８２－０３２１Ｖである。別の特定の実施形態において、ＧＰＶ株は、病原性の、例えばＧＰＶ株Ｂである。好適なパルボウイルスＩＴＲ配列の例は、表１に記載される。

【0195】

【表1-1】

【表1-2】

【0196】

治療用タンパク質
いくつかの態様において、第１のＩＴＲ、第２のＩＴＲ、および標的配列をコードする遺伝子カセットであって、標的配列が治療用タンパク質をコードする、遺伝子カセットを含む核酸分子の作製が、本明細書において提供される。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、１つの治療用タンパク質をコードする。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、２つ以上の治療用タンパク質をコードする。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、同じ治療用タンパク質の２つまたはそれ以上のコピーをコードする。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、同じ治療用タンパク質の２つまたはそれ以上のバリアントをコードする。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、２つまたはそれ以上の異なる治療用タンパク質をコードする。

【0197】

本開示のある特定の実施形態は、第１のＩＴＲ、第２のＩＴＲ、および治療用タンパク質をコードする遺伝子カセットを含む核酸分子を対象とする。全ての治療用タンパク質は、これらに制限されるわけではないが、凝固因子の作製など、本開示のバキュロウイルス発現ベクターシステムによって作製することができる。いくつの実施形態において、凝固因子は、ＦＩ、ＦＩＩ、ＦＩＩＩ、ＦＩＶ、ＦＶ、ＦＶＩ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ、ＦＸＩＩ、ＦＸＩＩＩ、ＶＷＦ、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン、フィブロネクチン、アンチトロンビンＩＩＩ、ヘパリン補因子ＩＩ、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、プロテインＺ関連のプロテアーゼ阻害因子（ＺＰＩ）、プラスミノーゲン、α２－アンチプラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子１（ＰＡＩ－１）、プラスミノーゲン活性化因子阻害因子２（ＰＡＩ２）、その任意のチモーゲン、その任意の活性形態、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。一実施形態において、凝固因子は、ＦＶＩＩＩまたはそのバリアントもしくは断片を含む。別の実施形態において、凝固因子は、ＦＩＸまたはそのバリアントもしくは断片を含む。別の実施形態において、凝固因子は、ＦＶＩＩまたはそのバリアントもしくは断片を含む。別の実施形態において、凝固因子は、ＶＷＦまたはそのバリアントもしくは断片を含む。

【0198】

増殖因子
いくつかの態様において、第１のＩＴＲ、第２のＩＴＲ、および標的配列をコードする遺伝子カセットであって、標的配列が治療用タンパク質をコードし、治療用タンパク質が増殖因子を含む、遺伝子カセットを含む核酸分子の作製が、本明細書において提供される。増殖因子は、当技術分野において既知の任意の増殖因子から選択することができる。いくつの実施形態において、増殖因子は、ホルモンである。他の実施形態において、増殖因子は、サイトカインである。いくつの実施形態において、増殖因子は、ケモカインである。

【0199】

いくつの実施形態において、増殖因子は、アドレノメジュリン（ＡＭ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、アンジオポイエチン（Ａｎｇ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、オートクリン運動因子である。いくつの実施形態において、増殖因子は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）である。いくつの実施形態において、ＢＭＰは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、およびＢＭＰ７から選択される。いくつの実施形態において、増殖因子は、毛様体神経栄養因子ファミリーメンバーである。いくつの実施形態において、毛様体神経栄養因子ファミリーメンバーは、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）から選択される。いくつの実施形態において、増殖因子は、コロニー刺激因子である。いくつの実施形態において、コロニー刺激因子は、マクロファージコロニー刺激因子（ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）から選択される。いくつの実施形態において、増殖因子は、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、エフリンである。いくつの実施形態において、エフリンは、エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、およびエフリンＢ３から選択される。いくつの実施形態において、増殖因子は、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）である。いくつの実施形態において、ＦＧＦは、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１５、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、およびＦＧＦ２３から選択される。いくつの実施形態において、増殖因子は、ウシ胎児成長ホルモン（ＦＢＳ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、ＧＤＮＦファミリーメンバーである。いくつの実施形態において、ＧＤＮＦファミリーメンバーは、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、パーセフィン、およびアルテミンから選択される。いくつの実施形態において、増殖因子は、増殖分化因子９（ＧＤＦ－９）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、肝がん由来増殖因子（ＨＤＧＦ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、インスリンである。いくつの実施形態において、増殖因子は、インスリン様増殖因子である。いくつの実施形態において、インスリン様増殖因子は、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）またはＩＧＦ－２である。いくつの実施形態において、増殖因子は、インターロイキン（ＩＬ）である。いくつの実施形態において、ＩＬは、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、およびＩＬ－７から選択される。いくつの実施形態において、増殖因子は、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、移動刺激因子（ＭＳＦ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）または肝細胞増殖因子様タンパク質（ＨＧＦＬＰ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、ニューレグリンである。いくつの実施形態において、ニューレグリンは、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ＮＲＧ２、ＮＲＧ３、およびＮＲＧ４から選択される。いくつの実施形態において、増殖因子は、ニューロトロフィンである。いくつの実施形態において、増殖因子は、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、神経成長因子（ＮＧＦ）である。いくつの実施形態において、ＮＧＦは、ニューロトロフィン３（ＮＴ－３）またはＮＴ－４である。いくつの実施形態において、増殖因子は、胎盤増殖因子（ＰＧＦ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、レナラーゼ（ｒｅｎａｌａｓｅ）（ＲＮＬＳ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、トランスフォーミング増殖因子である。いくつの実施形態において、トランスフォーミング増殖因子は、形質転換増殖因子α（ＴＧＦ－α）またはＴＧＦ－βである。いくつの実施形態において、増殖因子は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）である。いくつの実施形態において、増殖因子は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）である。

【0200】

ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、翻訳を阻害することかまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分解を誘導することによって遺伝子発現を負に調節する低分子非コードＲＮＡ分子（約１８～２２ヌクレオチド）である。それらの発見以来、ｍｉＲＮＡは、様々な細胞プロセス、例えば、アポトーシス、分化、および細胞増殖など、に関与しており、ならびに、それらは、発癌において重要な役割を果たすことがわかっている。遺伝子発現を調節するｍｉＲＮＡｓの能力は、ｍｉＲＮＡの発現を、遺伝子療法におけるインビボでの有益なツールにする。

【0201】

いくつかの態様において、第１のＩＴＲ、第２のＩＴＲ、および標的配列をコードする遺伝子カセットであって、標的配列がｍｉＲＮＡをコードし、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲが非アデノ随伴ウイルスのＩＴＲ（例えば、第１のＩＴＲおよび／または第２のＩＴＲは非ＡＡＶ由来である）である、遺伝子カセットを含む核酸分子の作製が、本明細書において提供される。ｍｉＲＮＡは、当技術分野において既知の任意のｍｉＲＮＡであり得る。いくつの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子の発現を下方制御する。ある特定の実施形態において、標的遺伝子は、ＳＯＤ１、ＨＴＴ、ＲＨＯ、またはそれらの任意の組合せから選択される。

【0202】

いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、１つのｍｉＲＮＡをコードする。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、２つ以上のｍｉＲＮＡをコードする。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、２つまたはそれ以上の異なるｍｉＲＮＡをコードする。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、同じｍｉＲＮＡの２つまたはそれ以上のコピーをコードする。いくつの実施形態において、遺伝子カセットは、同じ治療用タンパク質の２つまたはそれ以上のバリアントをコードする。ある特定の実施形態において、遺伝子カセットは、１つまたはそれ以上のｍｉＲＮＡおよび１つまたはそれ以上の治療用タンパク質をコードする。

【0203】

いくつの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、天然に存在するｍｉＲＮＡである。いくつの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、操作されたｍｉＲＮＡである。いくつの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、人工ｍｉＲＮＡである。ある特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、Ｅｖｅｒｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２６（９）：１～１５（２０１８年６月の印刷前のｅｐｕｂ）によって開示されたｍｉＨＴＴ操作ｍｉＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、Ｄｉｒｒｅｎら，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２（２）：１６７～８４（２０１５年２月）によって開示されたｍｉＲ ＳＯＤ１人工ｍｉＲＮＡを含む。ある特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡは、ＲＨＯを標的にするｍｉＲ－７０８を含む（Ｂｅｈｒｍａｎら，ＪＣＢ １９２（６）：９１９～２７（２０１１）。

【0204】

いくつの実施形態において、ｍｉＲＮＡは、遺伝子の阻害剤の発現を下方制御することによって遺伝子の発現を上方制御する。いくつの実施形態において、阻害剤は、天然の、例えば野生型の、阻害剤である。いくつの実施形態において、阻害剤は、変異した、異種の、および／または誤発現した遺伝子の結果として生じる。

【0205】

発現制御エレメント
いくつの実施形態において、本明細書において説明されるバキュロウイルス発現ベクターシステムによって作製される核酸分子またはベクターは、さらに、少なくとも１つの発現制御配列を含む。本明細書において使用される発現制御配列は、配列が作動可能に連結されるコード核酸の効率的な転写および翻訳を促進する、任意の調節ヌクレオチド配列、例えば、プロモーター配列またはプロモーターエンハンサー組合せ物である。例えば、本開示の方法によって作製される単離された核酸分子は、少なくとも１つの転写調節配列に作動可能に連結させることができる。

【0206】

遺伝子発現制御配列は、例えば、哺乳類またはウイルスプロモーター、例えば、構成的または誘導性プロモーターなどであり得る。構成的哺乳類プロモーターとしては、これらに限定されるわけではないが、以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、β－アクチンプロモーター、に対するプロモーター、ならびに他の構成的プロモーターが挙げられる。真核生物細胞において構成的に機能する例示的ウイルスプロモーターとしては、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（例えば、ＳＶ４０）、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、および他のレトロウイルス、に由来するプロモーター、ならびに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、が挙げられる。

【0207】

他の構成的プロモーターは、当業者に既知である。本開示の遺伝子発現配列として有用なプロモーターは、誘導性プロモーターも含む。誘導性プロモーターは、誘導剤の存在下において発現される。例えば、メタロチオネインプロモーターは、ある特定の金属イオンの存在下において転写および翻訳を促進するように誘導される。他の誘導性プロモーターは、当業者に既知である。

【0208】

一実施形態において、本開示は、組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーの制御下における導入遺伝子の発現を含む。別の実施形態において、当該プロモーターまたは他の発現制御配列は、肝臓細胞での導入遺伝子の発現を選択的に高める。肝臓特異的プロモーターの例としては、これらに限定されるわけではないが、マウストランスチレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、天然ヒト因子ＶＩＩＩプロモーター、天然ヒト因子ＩＸプロモーター、ヒトアルファ－１－アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターが挙げられる。特定の実施形態において、プロモーターは、ｍＴＴＲプロモーターを含む。ｍＴＴＲプロモーターは、Ｒ．Ｈ．Ｃｏｓｔａら，１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：４６９７に記載される。Ｆ８プロモーターは、Ｆｉｇｕｅｉｒｅｄｏ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１１８２８～１１８３８に記載される。ある特定の実施形態において、プロモーターは、米国特許出願公開第２０１９／００４８３６２号において開示されるような、ｍＴＴＲプロモーターのいずれか（例えば、ｍＴＴＲ２０２プロモーター、ｍＴＴＲ２０２ｏｐｔプロモーター、ｍＴＴＲ４８２プロモーター）を含み、なお、当該文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

【0209】

いくつの実施形態において、核酸分子は、組織特異的プロモーターを含む。ある特定の実施形態において、組織特異的プロモーターは、肝臓において、例えば、肝細胞および／または内皮細胞において、治療用タンパク質、例えば、凝固因子、の発現を駆動する。特定の実施形態において、プロモーターは、マウストランスチレチンプロモーター（ｍＴＴＲ）、天然ヒト因子ＶＩＩＩプロモーター、ヒトアルファ－１－アンチトリプシンプロモーター（ｈＡＡＴ）、ヒトアルブミン最小プロモーター、マウスアルブミンプロモーター、トリステトラプロリン（ＴＴＰ）プロモーター、ＣＡＳＩプロモーター、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびそれらの任意の組合せからなる群から選択される。いくつの実施形態において、プロモーターは、肝臓特異的プロモーター（例えば、α１－アンチトリプシン（ＡＡＴ））、筋肉特異的プロモーター（例えば、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）、ミオシン重鎖α（αＭＨＣ）、ミオグロビン（ＭＢ）、およびデスミン（ＤＥＳ））、合成のプロモーター（例えば、ＳＰｃ５－１２、２Ｒ５Ｓｃ５－１２、ｄＭＣＫ、およびｔＭＣＫ）、およびそれらの任意の組合せから選択される。

【0210】

発現レベルは、１つまたはそれ以上のエンハンサーを使用して治療効率を達成するために、さらに高めることができる。１つまたはそれ以上のエンハンサーは、単独においてまたは１つもしくはそれ以上のプロモーターエレメントと一緒のどちらかにおいて提供することができる。典型的には、発現制御配列は、複数のエンハンサーエレメントおよび組織特異的プロモーターを含む。一実施形態において、エンハンサーは、α－１－ミクログロブリン／ビクニンエンハンサーの１つまたはそれ以上のコピーを含む（Ｒｏｕｅｔら，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２０７６５－２０７７３；Ｒｏｕｅｔら，１９９５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３９５～４０４；Ｒｏｕｅｔら，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３４：５７７～５８４；Ｉｌｌら，１９９７，Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ８：Ｓ２３～Ｓ３０）。別の実施形態において、エンハンサーは、ＨＮＦ１、（センス）－ＨＮＦ３、（センス）－ＨＮＦ４、（アンチセンス）－ＨＮＦ１、（アンチセンス）－ＨＮＦ６、（センス）－ＥＢＰ、（アンチセンス）－ＨＮＦ４（アンチセンス）を含むＥｎｈ１を伴う、肝臓特異的転写因子結合部位、例えば、ＥＢＰ、ＤＢＰ、ＨＮＦ１、ＨＮＦ３、ＨＮＦ４、ＨＮＦ６など、に由来する。

【0211】

特定の実施例において、本開示のために有用なプロモーターは、ＥＴプロモーターであり、これは、ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＹ６６１２６５としても知られている。Ｖｉｇｎａら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １１（５）：７６３（２００５）も参照されたい。他の好適ベクターおよび発現制御配列の例は、国際公開第０２／０９２１３４号、欧州特許第１３９５２９３号、または米国特許第６，８０８，９０５号、同第７，７４５，１７９号、または同第７，１７９，９０３号に記載されており、なお、当該文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

【0212】

概して、発現制御配列シェルは、必要に応じて、それぞれ、転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列、例えば、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などを含む。とりわけ、そのような５’非転写配列は、作動可能に連結されたコード核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むであろう。遺伝子発現配列は、場合により、所望に応じてエンハンサー配列または上流活性化因子配列を含む。

【0213】

ある特定の実施形態において、本明細書において説明されるバキュロウイルス発現ベクターシステムによって作製される核酸分子は、例えば、導入遺伝子に作動可能に連結される、１つまたはそれ以上のｍｉＲＮＡ標的配列を含む。

【0214】

いくつの実施形態において、標的配列は、骨髄系前駆細胞および少なくとも部分的により原始的なＨＳＰＣにおいて、最も効果的に発現をブロックすると報告されているｍｉＲ－２２３標的である。ｍｉＲ－２２３標的は、分化した骨髄系細胞、例えば、顆粒球、単核細胞、マクロファージ、骨髄樹状細胞など、における発現をブロックすることができる。ｍｉＲ－２２３標的は、リンパ球系または赤血球系の系統におけるロバストな導入遺伝子発現に依拠する遺伝子療法適用に対しても好適であり得る。ｍｉＲ－２２３標的は、ヒトＨＳＣにおける発現も非常に効果的にブロックすることができる。

【0215】

いくつの実施形態において、標的配列は、ｍｉＲ－１４２標的である。いくつの実施形態において、造血特異的ｍｉｃｒｏＲＮＡの相補配列、例えば、ｍｉＲ－１４２（１４２Ｔ）など、は、導入遺伝子を含む核酸分子に組み込まれ、導入遺伝子をコードする転写物を、ｍｉＲＮＡ－媒介性下方制御を受けやすくする。この方法によって、非造血細胞において維持しつつ、導入遺伝子の発現を、造血系抗原提供細胞（ＡＰＣ）において防ぐことができる（Ｂｒｏｗｎら，Ｎａｔ Ｍｅｄ ２００６）。この戦略は、導入遺伝子の発現におけるストリンジェントな転写後制御を強いることができ、結果として、導入遺伝子の安定な送達および長期間の発現を可能にする。いくつの実施形態において、ｍｉＲ－１４２制御は、形質導入細胞の免疫媒介性クリアランスを防ぎ、および／または抗原特異的御性Ｔ細胞（Ｔ ｒｅｇ）を誘導し、導入遺伝子をコードした抗原に対するロバストな免疫寛容性を媒介する。

【0216】

いくつの実施形態において、標的配列は、ｍｉＲ１８１標的である。Ｃｈｅｎ Ｃ－Ｚ ａｎｄ Ｌｏｄｉｓｈ Ｈ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００５）１７（２）：１５５～１６５では、マウス骨髄内のＢ細胞において特異的に発現されるｍｉＲＮＡであるｍｉＲ－１８１が開示されている（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｌｏｄｉｓｈ，２００５）。いくつかのヒトｍｉＲＮＡが白血病に関連することも開示されている。

【0217】

標的配列は、ｍｉＲＮＡに対して完全にまたは部分的に相補的であり得る。用語「完全に相補的」は、標的配列が標的配列を認識するｍｉＲＮＡの配列に対して１００％相補的である当該核酸配列を有することを意味する。用語「部分的に相補的」は、標的配列が、標的配列を認識するｍｉＲＮＡの配列に対して一部においてのみ相補的であることを意味し、それにより、部分的に相補的な配列は、依然としてｍｉＲＮＡによって認識される。換言すると、本開示との関連における部分的に双方的な標的配列は、対応するｍｉＲＮＡの認識ならびにｍｉＲＮＡを発現する細胞での導入遺伝子の発現の予防または減少の実行において有効である。ｍｉＲＮＡ標的配列の例は、国際公開第２００７／０００６６８号、国際公開第２００４／０９４６４２号、国際公開第２０１０／０５５４１３号、または国際公開第２０１０／１２５４７１号に記載されており、なお、当該特許仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

【0218】

異種部分
いくつの実施形態において、導入遺伝子は、異種アミノ酸配列をコードする。異種アミノ酸配列は、導入遺伝子産物に連結させることができる。いくつの実施形態において、異種アミノ酸配列は、導入遺伝子産物のＮ末端またはＣ末端に連結させることができる。例えば、ＦＶＩＩＩをコードする導入遺伝子に関して、異種アミノ酸配列は、ＦＶＩＩＩアミノ酸のＮ末端もしくはＣ末端に連結させることができ、またはＦＶＩＩＩアミノ酸配列における２つのアミノ酸の間に挿入することができる。いくつの実施形態において、異種アミノ酸配列は、国際公開第２０１３／１２３４５７（Ａ１）号および国際公開第２０１５／１０６０５２（Ａ１）号または米国特許出願公開第２０１５／０１５８９２９（Ａ１）号において開示される任意の部位においてＦＶＩＩＩポリペプチドの中に挿入することができ、なお、当該文献は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる。

【0219】

いくつの実施形態において、異種アミノ酸配列は、ＦＶＩＩＩのＢドメインまたはその断片内に挿入される。

【0220】

いくつの実施形態において、異種部分は、１つもしくはそれ以上のＸＴＥＮ配列、その断片、バリアント、または誘導体を含む。本明細書において使用される場合、「ＸＴＥＮ 配列」は、主に低分子親水性アミノ酸で構成される天然に存在しない、実質的に非反復性の配列によって長さの延長されたポリペプチドを意味し、この場合、当該配列は、生理的条件下において二次または三次構造を有さないかまたは低い程度しか有さない。異種部分として、ＸＴＥＮは、半減期延長部分として機能することができる。さらに、ＸＴＥＮは、望ましい特性、例えば、これらに限定されるわけではないが、高められた薬物動態パラメータおよび溶解特性などを提供することができる。

【0221】

いくつの実施形態において、本開示にとって有用なＸＴＥＮ配列は、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、または２０００超のアミノ酸残基を有するペプチドもしくはポリペプチドである。ある特定の実施形態において、ＸＴＥＮは、約２０から約３０００超のアミノ酸残基、３０から約２５００超の残基、４０から約２０００超の残基、５０から約１５００超の残基、６０から約１０００超の残基、７０から約９００超の残基、８０から約８００超の残基、９０から約７００超の残基、１００から約６００超の残基、１１０から約５００超の残基、または１２０から約４００超の残基を有するペプチドもしくはポリペプチドである。特定の一実施形態において、ＸＴＥＮは、４２超かつ１４４未満のアミノ酸長のアミノ酸配列
を含む。

【0222】

本開示のＸＴＥＮ配列は、５～１４個（例えば、９～１４個）のアミノ酸残基の１つもしくはそれ以上の配列モチーフ、または配列モチーフと少なくとも８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むことができ、この場合、モチーフは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、グルタメート（Ｅ）、およびプロリン（Ｐ）からなる群から選択される、４～６のタイプのアミノ酸（例えば、５アミノ酸）を含むか、それから実質的になるか、またはそれからなる。本開示のキメラタンパク質において異種部分として使用することができるＸＴＥＮ配列の例は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２３９５５４（Ａ１）号、同第２０１０／０３２３９５６（Ａ１）号、同第２０１１／００４６０６０（Ａ１）号、同第２０１１／００４６０６１（Ａ１）号、同第２０１１／００７７１９９（Ａ１）号、もしくは同第２０１１／０１７２１４６（Ａ１）号、または国際公開第２０１０／０９１１２２（Ａ１）号、同第２０１０／１４４５０２（Ａ２）号、同第２０１０／１４４５０８（Ａ１）号、同第２０１１／０２８２２８（Ａ１）号、同第２０１１／０２８２２９（Ａ１）号、もしくは同第２０１１／０２８３４４（Ａ２）号において開示されており、なお、当該文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

【0223】

ＩＶ．宿主細胞
好適な宿主細胞は、当業者に既知である。「宿主細胞」は、目的の任意の物質を保持するかまたは保持することができる任意の細胞を意味する。

【0224】

いくつの実施形態において、本発明における使用にとって好適な宿主細胞は、昆虫起源の細胞である。いくつの実施形態において、好適な昆虫宿主細胞としては、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ）から単離された細胞株またはイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）（Ｔｎｉ）から単離された細胞株が挙げられる。当業者は、容易に任意のＳｆまたはＴｎｉ細胞株の適性を特定することができるであろう。昆虫宿主細胞の例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｓｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（商標）細胞が挙げられる。昆虫宿主細胞の例としては、これらに限定されるわけではないが、外来ウイルス混入のない任意のＳｆまたはＴｎｉ細胞株、例えば、Ｓｆ－ラブドウイルス（ｒｈａｄｏｖｉｒｕｓ）陰性（Ｓｆ－ＲＶＮ）およびＴｎ－ノダウイルス陰性（Ｔｎ－ＮＶＮ）細胞、も挙げられる。他の好適な宿主昆虫細胞は、当業者に既知である。特定の一実施形態において、昆虫宿主細胞は、Ｓｆ９細胞である。

【0225】

いくつの実施形態において、本発明における使用にとって好適な宿主細胞は、細菌起源の細胞である。いくつの実施形態において、好適な細菌宿主細胞は、当業者に既知の任意の細菌宿主細胞であり得る。ある特定の実施形態において、好適な細菌宿主細胞は、十字型のＤＮＡ構造を解くことができない。ある特定の実施形態において、好適な細菌宿主株は、ＳｂｃＣＤ複合体における破壊を含む。いくつの実施形態において、ＳｂｃＣＤ複合体における破壊は、ＳｂｃＣ遺伝子および／またはＳｂｃＤの遺伝子における遺伝子破壊を含む。ある特定の実施形態において、ＳｂｃＣＤ複合体における破壊は、ＳｂｃＣ遺伝子における遺伝子破壊を含む。ＳｂｃＣ遺伝子における遺伝子破壊を含む様々な細菌宿主株は、当技術分野において既知である。例えば、これらに限定されるものではないが、細菌宿主株ＰＭＣ１０３は、遺伝子型ｓｂｃＣ、ｒｅｃＤ、ｍｃｒＡ、ΔｍｃｒＢＣＦを含み；細菌宿主株ＰＭＣ１０７は、遺伝子型ｒｅｃＢＣ、ｒｅｃＪ、ｓｂｃＢＣ、ｍｃｒＡ、ΔｍｃｒＢＣＦを含み；ならびに細菌宿主株ＳＵＲＥは、遺伝子型ｒｅｃＢ、ｒｅｃＪ、ｓｂｃＣ、ｍｃｒＡ、ΔｍｃｒＢＣＦ、ｕｍｕＣ、ｕｖｒＣを含む。

【0226】

いくつの実施形態において、本発明における使用にとって好適な宿主細胞は、哺乳類起源、例えばヒト起源の細胞である。当業者は、彼らの目的に対して最も適した特定の宿主細胞株を優先的に決定する能力を認められている。例示的宿主細胞株としては、これらに限定されるわけではないが、ＣＨＯ、ＤＧ４４、およびＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頚部癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を伴うＣＶＩの誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター繊維芽細胞）ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス繊維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓株）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、Ｐ３．ｔｉｍｅｓ．６３－Ａｇ３．６５３（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ－１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）、ＮＳ０、ＣＡＰ、ＢＨＫ２１、およびＨＥＫ２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。

【0227】

宿主細胞内への本開示のベクターの導入は、当業者に周知の様々な技術によって達成することができる。これらとしては、これらに限定されるわけではないが、トランスフェクション（例えば、電気泳動、およびエレクトロポレーション）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡとの細胞融合、マイクロインジェクション、および完全なウイルス（ｉｎｔａｃｔ ｖｉｒｕｓ）の感染が挙げられる。Ｒｉｄｇｗａｙ，Ａ．Ａ．Ｇ．「Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｃｈａｐｔｅｒ ２４．２，ｐｐ．４７０－４７２ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ａｎｄ Ｄｅｎｈａｒｄｔ，Ｅｄｓ．（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．１９８８）を参照されたい。

【0228】

本開示のベクターを含む宿主細胞は、適切な増殖培地において増殖される。本明細書において使用される場合、用語「適切な増殖培地」は、細胞の増殖のために必要な栄養素を含む培地を意味する。細胞の増殖のために必要な栄養素は、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラル、および増殖因子を含み得る。場合により、培地は、１つまたはそれ以上の選択因子を含有し得る。場合により、培地は、仔ウシ血清またはウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有し得る。概して、増殖培地は、例えば、ベクターの選択可能なマーカーによって補足される必須栄養素での薬剤の選択または欠乏によって、ベクターを含む細胞を選択するであろう。

【0229】

Ｖ．使用方法
本明細書において提供されるバキュロウイルス発現ベクターシステムは、本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄに挿入された外来配列によってコードされる産物の作製において使用される。産物のスケーラブルな作製は、当技術分野において既知のいくつかのアプローチによって達成することができる。

【0230】

アプローチの１つは、バキュロウイルスの増殖を支援する好適な昆虫宿主細胞の感染を含む。ある特定の実施形態において、本明細書において説明される外来配列を含む組換えｂａｃｍｉｄは、最初に、好適な細菌宿主細胞（例えば、大腸菌）において伝搬される。次いで、組換えｂａｃｍｉｄが細菌宿主細胞から単離され、好適なトランスフェクション試薬（例えば、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ）を使用して好適な昆虫宿主細胞へとトランスフェクトされる。昆虫宿主細胞は、組換えバキュロウイルス粒子を生成し、次いで、それは、外来配列のウイルス増幅のために、宿主昆虫細胞に感染させることができる。

【0231】

ある特定の実施形態において、外来配列によってコードされる産物を作製する方法であって、組換えバキュロウイルスを生成するために、本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄを適切な条件下において好適な昆虫細胞内へトランスフェクトすること；および外来配列によってコードされる産物を製造するために、適切な条件下において、組換えバキュロウイルスを第２の好適な昆虫細胞に感染させることを含む方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態において、遺伝子療法を作製する目的のために、組換えｂａｃｍｉｄは、Ｒｅｐコード配列およびＩＴＲが両側で隣接するタンパク質をコードする配列を含む。

【0232】

ある特定の実施形態において、核酸分子を生成する方法であって、組換えバキュロウイルスを生成するために、本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄを適切な条件下において好適な昆虫細胞内へトランスフェクトすること；ならびに核酸分子を作製するために、適切な条件下において、組換えバキュロウイルスを第２の好適な昆虫細胞に感染させることを含む方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態において、ｃｅＤＮＡを生成する方法であって、組換えバキュロウイルスを生成するために、本明細書において説明される組換えｂａｃｍｉｄを適切な条件下において好適な昆虫細胞内へトランスフェクトすること；ならびにｃｅＤＮＡを作製するために、適切な条件下において、組換えバキュロウイルスを第２の好適な昆虫細胞に感染させることを含む方法が、本明細書において提供される。

【0233】

別のアプローチにおいて、安定細胞株は、バキュロウイルス遺伝子プロモーター（例えば、バキュロウイルス構成的遺伝子プロモーター）の制御下において配列をコードするタンパク質を安定に組み込むことによって生成することができる。ある特定の実施形態において、安定細胞株は、安定昆虫細胞株である。配列の安定な組込みは、当業者に既知の任意の方法によって実施することができる。様々な宿主細胞株への核酸の安定な組込みのための方法は、当技術分野において既知である（核酸の安定な組込みによって作り出される例示的プロデューサー細胞株のより詳細な説明は下記の実施例を参照されたい）。例えば、反復選択（例えば、選択可能なマーカーの使用による）は、選択可能なマーカー（およびＡＡＶキャップならびにｒｅｐ遺伝子および／またはｒＡＡＶゲノム）を含む核酸が組み込まれた細胞を選択するために使用され得る。他の実施形態において、核酸は、プロデューサー細胞株を生成するために、部位特異的方式において細胞株に組み込まれる。いくつかの部位特異的組換えシステムは、例えば、ＦＬＰ／ＦＲＴ（例えば、Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１～１３５５を参照されたい）、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ（例えば、Ｓａｕｅｒ，Ｂ．ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５１６６～５１７０を参照されたい）、およびｐｈｉ Ｃ３１－ａｔｔ（例えば、Ｇｒｏｔｈ，Ａ．Ｃ．ら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：５９９５～６０００を参照されたい）など、当技術分野において既知である。

【0234】

安定細胞株アプローチにおいて、一実施形態において、配列をコードするタンパク質の適切な発現のために必要な補体タンパク質をコードするＢＥＶが、安定細胞株に導入される。ある特定の実施形態において、遺伝子療法を製造する目的のために、安定細胞株は、そこに安定に組み込まれた対称または非対称ＡＡＶもしくは非ＡＡＶＩＴＲに隣接する治療用タンパク質－コード遺伝子を含む。好適なＲｅｐをコードすることを含むＢＥＶは、次いで、遺伝子治療の作製のために必要な条件下において、安定細胞株に導入される。

【0235】

特異的安定細胞株を生成する方法が、本明細書において説明される（実施例８を参照されたい）。ｃｅＤＮＡを作製するための特異的安定細胞系の例としては、そこに安定に組み込まれる図８Ｂに示されるプラスミドを有する細胞株が挙げられる。これらの安定細胞株は、表５に一覧される。ある特定の方法において、ｃｅＤＮＡを作製するために、好適なＲｅｐをコードするＢＥＶが、ｃｅＤＮＡの作製のために必要な条件下において、安定細胞株に導入される。

【0236】

さらなる別のアプローチにおいて、外来配列によってコードされる産物の作製は、無バキュロウイルスの方式において安定細胞株を使用して達成することができる。ある特定の実施形態において、遺伝子療法を製造する目的のために、安定細胞株は、そこに安定に組み込まれた対称または非対称ＡＡＶもしくは非ＡＡＶ ＩＴＲに隣接する治療用タンパク質－コード遺伝子を含む。ある特定の実施形態において、安定細胞株における無バキュロウイルスの作製は、バキュロウイルスプロモーターの制御下での安定細胞株におけるＲｅｐタンパク質の一過性発現を含む。好適なバキュロウイルス遺伝子プロモーターは、当業者に既知である。ある特定の実施形態において、バキュロウイルス遺伝子プロモーターは、オルギア・シュードツガタ核多角体病ウイルス（Ｏｒｇｙｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａｔａ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｎｕｃｌｅｏｐｏｌｙｈｅｄｒｏｖｉｒｕｓ：ＯｐＭＮＰＶ）の最初期（ｉｅ）遺伝子プロモーターである。ある特定の実施形態において、バキュロウイルス遺伝子プロモーターは、ＯｐＭＮＰＶのＯｐＩＥ２プロモーターである。一過性遺伝子発現を媒介する様々な方法は、当業者に既知である。ある特定の実施形態において、一過性遺伝子発現は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性トランスフェクションによって達成することができる。

【0237】

産物の下流精製は、当業者に既知の任意の方法を伴う。例えば、遺伝子療法のためのウイルスまたは非ウイルスベクターのために、目的物は、イオン交換クロマトグラフィによってＲＮＡ、高分子量ＤＮＡ、タンパク質、および他の不純物から低分子ＤＮＡを分離するシリカベースのカラムを含むプラスミドＤＮＡ単離キットによって精製される。

【0238】

本明細書において説明される様々な態様、実施形態、および選択肢の全ては、あらゆるバリエーションにおいて組み合わせることができる。

【0239】

本明細書において言及した全ての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み入れられることが具体的かつ個別的に示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられるものとする。

【0240】

本開示を一般的に説明してきたが、本明細書において提供される実施例を参照することによって、さらなる理解を得ることができる。これらの実施例は、例示目的のみのためであり、制限であることを意図するものではない。

【実施例1】

【0241】

ＢＩＶＶＢａｃ前駆体Ｂａｃｍｉｄ
発現ベクターの中でも、バキュロウイルスが傑出するが、その理由は、１００ｋｂの報告もある最大で数１０ｋｂのそれらの特大の遺伝子積載能力のためである。この導入遺伝子の能力は、組換えＡＡＶベクター（最大３８ｋｂまでの発現カセット）の作製のために利用されてきた。バキュロウイルスの大きな導入遺伝子積載能力も、非ウイルス遺伝子療法のためのＤＮＡ治療薬物質の作製のために利用することができることが推察された。したがって、新規の多能なバキュロウイルスシャトルベクター（ｂａｃｍｉｄ）を、既存のｂａｃｍｉｄツールによって達成できるよりも多数の導入遺伝子を収容できるように明確に設計して作製した。この多能なｂａｃｍｉｄ（「ＢＩＶＶＢａｃ」と呼ばれる）は、インビボ遺伝子療法のためのｒＡＡＶベクター作製のため、ならびに任意の所望のタンパク質、例えば、組換えタンパク質の製造のためにも使用することができた。

【0242】

ＢＩＶＶＢａｃ ｂａｃｍｉｄは、ＡｃＭＮＰＶ Ｃ６ゲノムをコードするｂＭＯＮ１４２７２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来し（図１Ａ）、ならびに、２つの挿入部位：１）ポリヘドリン遺伝子座におけるミニａｔｔＴｎ７、および２）ＥＧＴ遺伝子座におけるＬｏｘＰをコードするように操作した。ミニａｔｔＴｎ７挿入配列は、Ｔｎ７媒介性転移の後の組換えｂａｃｍｉｄのＸ－ｇａｌ媒介性ブルー／ホワイトスクリーニングのためのＬａｃ－プロモーター駆動大腸菌ＬａｃＺα断片ならびにＣｒｅ媒介性インビトロまたはインビボ組換えのためのＬｏｘＰ部位とインフレームにおいて融合される。ＬｏｘＰ組換え部位を、２段階において、ポリヘドリン遺伝子座におけるミニａｔｔＴｎ挿入配列を含むｂＭＯＮ１４２７２に挿入した。最初に、ＡｃＭＮＰＶ ３９Ｋプロモーターと後に続くｅｔｓポリアデニル化シグナルの存在下のＲｕｄｏｌｐｈ赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子、ＬｏｘＰ組換え部位、およびＡｃＭＮＰＶ ＥＧＴ遺伝子座に隣接する配列で構成されるプラスミドを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）（ピスキャタウェイ、ＮＪ）によって合成した（図１Ｂ）（配列番号９）。次いで、合成プラスミドＤＮＡに、製造元の取扱説明書に従ってセルフェクチン（Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬を使用してＳｆ９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１７１１）においてＡｖｒＩＩ線形化ｂＭＯＮ１４２７２を共トランスフェクトさせた。ＲＦＰ発現カセットおよびＬｏｘＰ配列を、Ｓｆ９細胞における相同的組換えによって、ＥＧＴ遺伝子座において組み換えた。無細胞上清において作製した子孫ウイルスを、プラーク精製し、ＲＦＰ＋プラークを、Ｐ１（継代１）ウイルスを生成するためにＳｆ９細胞において増幅させた。次いで、バキュロウイルスＤＮＡをＰ１ウイルスから単離し、ＰＣＲに対する鋳型として使用した。ＰＣＲは、トランスファープラスミドの内側および外側のプライマーを使用して、予想された組換え結合部にわたる領域を増幅し、結果として生じるアンプライマーを配列決定した。組換えウイルスをさらに増幅し、ウイルスＤＮＡ単離のために使用し、次いで、大腸菌ＤＨ１０Ｂ細菌へと形質転換させ（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら、１９９２）、その後に、カナマイシン、Ｘ－Ｇａｌ、およびＩＰＴＧによる選択を行った。カナマイシン耐性青色大腸菌クローンから分離されたＢａｃｍｉｄ ＤＮＡを、制限酵素マッピングによって解析し、「ＢＩＶＶＢａｃ」と命名した（図１Ｃ）。Ｔｎ７トランスポザーゼ遺伝子ｔｎｓＡ－Ｅおよびテトラサイクリン耐性をコードするｐＭＯＮ７１２４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のヘルパープラスミドを、ＢＩＶＶＢａｃを保持するＤＨ１０Ｂ大腸菌へ形質転換させ、その後に、カナマイシンおよびテトラサイクリンによる選択を行った。以前に記載されているように（Ｓｈａｒｍａ ａｎｄ Ｓｃｈｉｍｋｅ，１９９６）、二重耐性クローンの１つを使用してエレクトロコンピテント（Ｅｌｅｃｔｒｏ－ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞を作製し、結果として得られる新規の大腸菌株を、ＢＩＶＶＢａｃ^{ＤＨ１０Ｂ}と命名した（図１Ｄ）。次いで、下記において説明されるように、この株を、Ｔｎ７転移によってＡＡＶ２、Ｂ１９、またはＧＰＶ複製（Ｒｅｐ）タンパク質遺伝子をポリヘドリン遺伝子座に挿入するために使用した。

【実施例2】

【0243】

Ｃｒｅ－ＬｏｘＰドナーベクター
ＬｏｘＰ組換え部位、転写エンハンサーｈｒ５エレメントによって先行されＡｃＭＮＰＶ ｐ１０ポリアデニル化シグナルが後に続くＡｃＭＮＰＶ ｉｅ１プロモーターの存在下の増強されたＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マーカー遺伝子、アンピシリン耐性マーカー、条件付きＲ６Ｋγ複製起点、および多重クローニング部位で構成されるＤＮＡコンストラクトを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）（ピスキャタウェイ、ＮＪ）によって合成した（配列番号１０）（図２Ａ）。この合成ＤＮＡを、ｐＵＣ５７ベクターへクローニングし、結果として得られるコンストラクトを「Ｃｒｅ－ＬｏｘＰドナーベクター」と命名した（図２Ｂ）。
Ｃｒｅ－ＬｏｘＰドナーベクターの重要な特徴は：（１）導入遺伝子を挿入するための多重クローニング部位（ＭＣＳ）；（２）Ｃｒｅ媒介性インビトロまたはインビボ組換えのためのＬｏｘＰ部位；（３）２つの複製起点：（３ａ）このベクターを大腸菌株、例えば、ＤＨ５α、ＮＥＢ Ｓｔａｂｌｅ、ＰＭＣ１０３、およびＤＨ１０Ｂなど、へ伝搬するためのＣｏｌＥ１ Ｏｒｉ；および（３ｂ）πタンパク質、例えば、ｐｉｒ＋およびｐｉｒ１１６などを発現する大腸菌株へこのベクターを伝搬するための条件付きＲ６ＫγＯｒｉ；（４）Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ組換えによって「ＢＩＶＶＢａｃ」のＬｏｘＰ部位にＣｒｅ－ＬｏｘＰドナーベクターを挿入した後にカナマイシンおよびアンピシリンを伴う組換えｂａｃｍｉｄを選択するためのアンピシリン抗生物質耐性遺伝子；ならびに（５）連続継代においてＳｆ９細胞において複製しつつ組換えＢＥＶにおける形質転換遺伝子の安定性を特定するための増強されたＧＦＰレポーター遺伝子である。

【実施例3】

【0244】

複製（Ｒｅｐ）タンパク質発現コンストラクト
Ｂ１９．Ｒｅｐ：
Ｂ１９ Ｒｅｐのコード配列を、Ｂ１９株ＨＶ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１６２２７３）から得、ならびに野生型配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）（ピスキャタウェイ、ＮＪ）によって合成した（配列番号１１）（図３Ａ）。合成ＤＮＡを、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの存在下においてｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターへクローニングし、ゲンタマイシン耐性クローンを使用してｐＦａｓｔＢａｃ．Ｐｏｌｈ．Ｂ１９．Ｒｅｐトランスファーベクターを生成した。下記において説明されるように、このベクターをＢＩＶＶＢａｃ^{ＤＨ１０Ｂ}大腸菌へ形質転換することにより組換えＢＥＶ、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．Ｂ１９．ＲｅｐＴｎ７を作製した。次いで、力価測定されたＢＥＶを、対称Ｂ１９ ＩＴＲを伴うｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードするポリクローナルＳｆ細胞株における感染のために使用し、ならびに、下記において説明されるように、ｃｅＤＮＡベクターを感染細胞ペレットから精製した。予備結果により、ポリヘドリンプロモーター駆動Ｂ１９．ＲｅｐがｃｅＤＮＡを「レスキュー」できないことが明らかとなった。バキュロウイルス感染サイクルの最晩期フェーズでの非スプライスＢ１９．Ｒｅｐ発現の高いレベルは非効率的であり、および／または細胞に対して毒性であると仮定した。この仮説に対して、ポリヘドリンプロモーターをＡｃＭＮＰＶ－構成的最初期（ｉｅ１）プロモーターで置き換えることにより、ｐＦａｓｔＢａｃ．ＩＥ１．Ｂ１９．Ｒｅｐトランスファーベクターを生成した（図３Ｂ）。このベクターを使用することにより、組換えＢＥＶであるＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ＩＥ１．Ｂ１９．Ｒｅｐ^Ｔｎ７を生成し、次いで、対称Ｂ１９ ＩＴＲを伴うｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードするポリクローナルＳｆ細胞株において試験した。結果は、ＡｃＭＮＰＶ－構成的ｉｅ１－駆動Ｂ１９．Ｒｅｐが、ポリヘドリン駆動Ｒｅｐと比較して、試験した両方の細胞株からｃｅＤＮＡベクターをレスキューすることができることを示した。このデータは、ｒＡＡＶ作製について前に観察されたように、Ｒｅｐタンパク質の化学量論的発現は、Ｓｆ９細胞でのｃｅＤＮＡ作製にとって重要であることを示唆している。

【0245】

ＧＰＶ．Ｒｅｐ：
ＧＰＶ Ｒｅｐのコード配列を、ＧＰＶ株Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＰＵ２５７４９）から得た。Ｂ１９と異なり、ＧＰＶ．Ｒｅｐは、単一のｍＲＮＡ転写物からスプライスされたタンパク質（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２）を産生し、ならびに、両方タンパク質の化学量論的発現を達成するために、漏出性リボソーマルスキャンニングメカニズムによって単一のｍＲＮＡ種からのＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２ポリペプチドの発現を可能にするように、Ｒｅｐ７８コード配列を遺伝子改変した。Ｒｅｐ７８オープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）のＡＵＧの開始コドン、隣接するプロリンコドン、およびＲｅｐ５２ｏｒｆの開始コドンの前に生じる１２の下流ＡＵＧトリプレットを、遺伝子合成によって変更した。Ｒｅｐ７８開始コドンおよび近接ヌクレオチドを、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列の文脈において示されたＣＵＧトリプレットで構成される非効率的翻訳開始シグナルに変異させた。Ｒｅｐ７８ ｏｒｆの開始コドンとＲｅｐ５２ ｏｒｆのＡＵＧ開始コドンとの間に生じるＡＵＧトリプレットを、いずれかのサイレント変異に耐えるように変更するか（フレーム外ＡＵＧコドンの場合）、または保存的アミノ酸置換をコードするように変更した（インフレームＡＵＧコドンの場合）。最後に、改変ＧＰＶ．Ｒｅｐコード配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）によって合成し（配列番号１２）（図３Ｃ）、ならびに、ｐＦａｓｔＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．Ｒｅｐトランスファーベクターを生成するために、合成ＤＮＡを、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの存在下においてｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターへクローニングした（図３Ｃ）。下記において説明されるように、次いで、このベクターをＢＩＶＶＢａｃ^{ＤＨ１０Ｂ}大腸菌へ形質転換することにより、組換えＢＥＶ、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．Ｒｅｐ^Ｔｎ７を作製した。

【0246】

ＡＡＶ２．Ｒｅｐ：
ＡＡＶ２ Ｒｅｐのコード配列を、ＡＡＶ２ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＣ＿００１４０１）から得た。Ｂ１９．Ｒｅｐと異なり、ＡＡＶ２．Ｒｅｐは、単一のｍＲＮＡ転写物からスプライスされたタンパク質（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２）も産生し、ならびに、以前に記載されているように（Ｓｍｉｔｈら，２００９）、両方タンパク質の化学量論的発現を達成するために、漏出性リボソーマルスキャンニングメカニズムによって単一ｍＲＮＡ転写物からのＲｅｐ７８およびＲｅｐ５２ポリペプチドの発現を可能にするようにＲｅｐ７８コード配列を遺伝子改変した（図３Ｅ）。改変ＡＡＶ２．Ｒｅｐコード配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）によって合成し（配列番号１３）（図３Ｅ）、ならびに、ｐＦａｓｔＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐトランスファーベクターを生成するために、ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの存在下において合成ＤＮＡをｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ベクターへクローニングした（図３Ｆ）。下記において説明されるように、次いで、このベクターをＢＩＶＶＢａｃ^{ＤＨ１０Ｂ}大腸菌へ形質転換することにより、組換えＢＥＶ、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．ＲｅｐＴｎ７を作製した。

【実施例4】

【0247】

ヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現コンストラクト
非ＡＡＶまたはＡＡＶ ＩＴＲを伴うヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現コンストラクト：
肝臓特異的ＴＴＰｐプロモーターの存在下においてＸＴＥＮ １４４ペプチドを伴うコドン最適化ヒトＦＶＩＩＩ（ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ）を含む遺伝子コンストラクト、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナルおよび非ＡＡＶまたはＡＡＶの切断型隣接ＩＴＲは、国際公開第２０１９０３２８９８（Ａ１）号に記載されている。ここで、５’または３’ＩＴＲのどちらかを非ＡＡＶまたはＡＡＶの野生型配列で置き換えることによって作製されたこれらのコンストラクトを、新しいコンストラクトと平行して、試験した（表２）。これらの新しいコンストラクトを培養し、十字型ＤＮＡ構造を認識して排除するエキソヌクレアーゼをコードする、削除されたｓｂｃＣ遺伝子を含む大腸菌株ＰＭＣ１０３において維持した。ＰＭＣ１０３大腸菌は、温度および細菌培養の増殖条件を最適化した後に非ＡＡＶまたはＡＡＶの対称または非対称ＩＴＲを伴うｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮコンストラクトの増殖を支援することができた。全ての新規のコンストラクトを、アンピシリン耐性プレート上において選択し、正しい遺伝構造を決定するために、制限酵素マッピングによってスクリーニングした。次いで、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰドナーベクターを作製するために、ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットコンストラクトを使用した。

【0248】

【表2】

【0249】

非ＡＡＶまたはＡＡＶ ＩＴＲを伴うヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ Ｃｒｅ－ＬｏｘＰドナーベクター
コンストラクト－１、－３、および－７（表２）からのｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットをＰｓｔＩ酵素で切除し、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰドナーベクターの同じ部位においてクローニングした。結果として得られるコンストラクトを、ＮＥＢ（登録商標）安定コンピテント大腸菌株（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）へ形質転換し、アンピシリン抵抗性クローンを、制限酵素マッピングによってスクリーニングした。正しいクローンを、ｐＣＬＤＶ－１、－３、および－７（表２）における「プラスミドＣｒｅ－ＬｏｘＰ」に対して接頭語「ｐＣＬ」を用いて命名した（図４Ｂ）、同様に、他のドナーベクターを生成するために、コンストラクト－２、－４、－５、－６、－８、および－９からのｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットを、ＰｓｔＩおよび／またはＰｖｕＩＩ酵素で切除し、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰドナーベクターの同じ部位においてクローニングした。これらのコンストラクトを、野生型ＩＴＲ配列の長い回帰性反復に起因して、ＰＭＣ１０３大腸菌株へと形質転換し、アンピシリン抵抗性クローンを、制限酵素マッピングによってスクリーニングした。次いで、結果として得られるＣｒｅ－ＬｏｘＰドナーベクター、ｐＣＬＤＶ－２、－４、－５、－６、－８、および－９を、ＬｏｘＰ組換え部位において、それぞれ、Ｔｎ７部位でＢ１９、ＧＰＶ、またはＡＡＶ２ Ｒｅｐのいずれかをコードする「ＢＩＶＶＢａｃ」ｂａｃｍｉｄに挿入した（表３）。表３のＩＴＲの配列は、表１に記載される。

【0250】

【表3】

【実施例5】

【0251】

複製（Ｒｅｐ）バキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）
ＡＡＶの複製は、非構造的（複製）タンパク質；Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０に依存する。例えば、ＡＡＶ ＩＴＲへの結合、配列および鎖特異的エンドヌクレアーゼ活性、およびＡＴＰ依存性ＤＮＡヘリカーゼ活性など、ウイルスＤＮＡ複製に関与することを特徴としたＡＡＶ Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８のいくつかの活性が存在する。Ｒｅｐ６８またはＲｅｐ７８のどちらかは、ＩＴＲ内の特定の領域（Ｒｅｐ結合部位）に結合し、末端解離部位（Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｓｉｔｅ：ＴＲＳ）と呼ばれるユニーク部位において二本鎖複製中間体の一本鎖に切れ目を入れる。エンドヌクレアーゼ反応は、結果として、新たに生成された５’末端へのＲｅｐの共有結合を生じる。切れ目の３’末端は、ＩＴＲの拡張のためのプライマーとして機能する。共有結合したＲｅｐ分子のヘリカーゼ活性は、ＩＴＲの二次構造を解き得る。末端解離のプロセスは、末端の回復および子孫ウイルスゲノムの生成ための手段を提供する。したがって、Ｒｅｐは、真核生物細胞におけるＩＴＲ媒介性ベクター作製にとって必須であり、ならびに、Ｓｆ９細胞からＩＴＲ隣接ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮベクターゲノムを「レスキューする」ために、発明者らは、非ＡＡＶまたはＡＡＶ Ｒｅｐをコードする組換えＢＥＶを生成した。これらのＢＥＶを生成するために、最初に、ＢＩＶＶＢａｃ^{ＤＨ１０Ｂ}大腸菌（図１Ｄ）を、トランスファーベクター、ｐＦａｓｔＢａｃ．ＩＥ１．Ｂ１９．Ｒｅｐ（図３Ｂ）、ｐＦａｓｔＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．Ｒｅｐ（図３Ｄ）、およびｐＦａｓｔＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ（図３Ｆ）によって超形質転換し、次いで、形質転換体を、カナマイシン、ゲンタマイシン、Ｘ－Ｇａｌ、およびＩＰＴＧにおいて選択した。ＢＩＶＶＢａｃのミニａｔｔＴｎ７挿入部位におけるＲｅｐ発現カセットおよびゲンタマイシン耐性遺伝子の部位特異的転移は、ＬａｃＺα（インフレームにおいてミニａｔｔＴｎ７と融合した）を妨害し、結果として、Ｘ－Ｇａｌ媒介性二重抗生物質選択において大腸菌のホワイトコロニーを生じた。その結果、組換えｂａｃｍｉｄ ＤＮＡを、アルカリ溶菌ミニプレップによって大腸菌ホワイトコロニーから単離し、正しい遺伝構造を決定するために制限酵素で消化させた。制限酵素マッピングの結果は、各組換えｂａｃｍｉｄに対する予想された断片を示し、それは、ＢＩＶＶＢａｃのポリヘドリン遺伝子座におけるＲｅｐの部位特異的転移を示唆した（図５Ａ）。トランスファープラスミドの内側および外側のプライマーを使用して予想された挿入部位にわたる領域をＰＣＲ増幅して、結果として生じるアンプライマーを配列決定することによってさらなる確認を得た。

【0252】

Ｂ１９．Ｒｅｐ、ＧＰＶ．Ｒｅｐ、またはＡＡＶ２．Ｒｅｐをコードする正しい組換えｂａｃｍｉｄを、製造元の取扱説明書に従って、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬を使用してＳｆ９細胞においてトランスフェクトした。トランスフェクション後の４～５日間に、記載されるように（Ｊａｒｖｉｓ，２０１４）、子孫バキュロウイルスを収集し、Ｓｆ９細胞においてプラーク精製した。それぞれの組換えＢＥＶ、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ＩＥ１．Ｂ１９．Ｒｅｐ^Ｔｎ７（図５Ｂ）、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．Ｒｅｐ^Ｔｎ７（図５Ｃ）、およびＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ^Ｔｎ７（図５Ｄ）の６つのプラーク精製ＲＦＰ＋クローンを、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補ったＥＳＦ－９２１培地のＴ２５フラスコにおいて、０．５×１０^６／ｍＬで播種したＳｆ９細胞においてＰ１（継代１）へと増幅した。感染後の４～５日間に、低速遠心沈殿によってＰ１ウイルスを収集し、感染細胞ペレットを、それぞれ、抗Ｂ１９ ＮＳ１（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，Ｉｎｃ．）、抗ＧＰＶ．ＲＥＰ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標））、および抗ＡＡＶ２．ＲＥＰ３０３．９（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｉｎｃ．）モノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用した免疫ブロット法によって、Ｂ１９．ＲＥＰ、ＧＰＶ．ＲＥＰ、またはＡＡＶ２．ＲＥＰ検出のために試験した。ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ＩＥ１．Ｂ１９．Ｒｅｐ^Ｔｎ７プラーク精製クローン（図５Ｅ）の免疫ブロット分析は、７４ｋＤａの予測された質量のＢ１９．ＲＥＰの単一種を示し、それは、Ｓｆ９細胞において非スプライスｍＲＮＡから発現されたＢ１９．ＲＥＰを示唆した。興味深いことに、試験した全てのウイルスクローンにおいて同等レベルのＢ１９．ＲＥＰの発現が観察され、それは、Ｓｆ９細胞におけるＡｃＭＮＰＶ ＩＥ１プロモーターの存在下での化学量論的レベルのＢ１９．ＲＥＰの発現を示唆した。Ｂ１９．Ｒｅｐと異なり、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．Ｒｅｐ^Ｔｎ７（図５Ｆ）、またはＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ^Ｔｎ７（図５Ｇ）プラーク精製クローンの免疫ブロット分析は、７３ｋＤａおよび４９ｋＤａの予測された質量でのＲＥＰの２つの種が、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２ポリペプチドに対応することを示し、それは、Ｓｆ９細胞においてスプライスｍＲＮＡ転写物から発現されたＧＰＶ．ＲＥＰおよびＡＡＶ２．ＲＥＰを示唆した。試験した全てのウイルスクローンにおいて同等レベルのＲｅｐ７８またはＲｅｐ５２が観察され、それは、Ｓｆ９細胞におけるＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの存在下での安定したＧＰＶ．ＲＥＰおよびＡＡＶ２．ＲＥＰ発現を示唆した。ＲＥＰ７８発現のレベルは、ＲＥＰ５２のおよそ半分であり、このことはさらに、両方のポリペプチドの正しい化学量論的発現が、漏出性リボソーマルスキャンニングメカニズムによって単一ｍＲＮＡ転写物から達成されることを示唆した。Ｓｆ９細胞でのさらなる増幅のために、それぞれのＢＥＶの最も高いＲＥＰ発現性クローンを選択し、次いで、ｃｅＤＮＡベクター作製のために、非ＡＡＶおよびＡＡＶの対称または非対称ＩＴＲが隣接するｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードする安定細胞株における感染のために使用した。

【実施例6】

【0253】

複製（Ｒｅｐ）およびヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮバキュロウイルス発現ベクター（ＢＥＶ）
複数の導入遺伝子に対応するためにＢＩＶＶＢａｃを使用することができるか否かを試験するために、２つの導入遺伝子発現カセット：１）Ｒｅｐおよび、２）非ＡＡＶおよびＡＡＶの対称または非対称ＩＴＲが隣接するｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードする誘導体ベクターのファミリーを生成した。これらのＢＥＶを、２段階において作製した。最初に、上記において説明されるように、Ｒｅｐ発現カセットを、Ｔｎ７転移によってポリヘドリン遺伝子座のミニａｔｔＴｎ７部位に挿入した。次いで、結果として生じる組換えｂａｃｍｉｄを、Ｃｒｅリコンビナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用したインビトロＣｒｅ－ＬｏｘＰ組換えによってＥＧＴ遺伝子座のＬｏｘＰ部位にｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットを挿入するために使用した。当該プロセスにおいて、Ｂ１９ ＩＴＲ、ＧＰＶ ＩＴＲ、およびＡＡＶ ＩＴＲを伴うｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードするＣｒｅ－ＬｏｘＰドナーベクター（ｐＣＬＤＶ－１から－９）（表２）を、それぞれ、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ＩＥ１．Ｂ１９．Ｒｅｐ７（図５Ｂ）、ＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ．Ｒｅｐ（図５Ｃ）、またはＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ（図５Ｄ）ｂａｃｍｉｄに挿入した。組換え反応物を、ＤＨ１０Ｂ大腸菌において形質転換し、形質転換体をカナマイシン、ゲンタマイシン、およびアンピシリンにおいて選択した。三重抗生物質耐性コロニーを、制限酵素マッピングによって、および／またはトランスファープラスミドの内側および外側のプライマーを使用して予想された挿入部位にわたる領域を増幅し、結果として生じるアンプライマーを配列決定することによるＰＣＲによって、スクリーニングした。

【0254】

両方の導入遺伝子カセットをコードする正しい組換えｂａｃｍｉｄを、マキシプレップ（ｍａｘｉ ｐｒｅｐ）精製し、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）トランスフェクション試薬を使用してＳｆ９細胞においてトランスフェクトした。トランスフェクション後の４～５日間に、子孫バキュロウイルスを収集し、Ｓｆ９細胞においてプラーク精製した。各組換えＢＥＶ（ＢＥＶ－１から－９）（表４）の６つのプラーク精製ＲＦＰ＋およびＧＦＰ＋クローン（図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃ）を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補ったＥＳＦ９２１培地のＴ２５フラスコにおいて０．５×１０^６／ｍＬで播種したＳｆ９細胞においてＰ１（継代１）へと増幅した。感染後の４～５日間において、全てのクローンは、感染の進行を示し、それは、それぞれの組換えＢＥＶに対して、ＧＦＰ＋およびＲＦＰ＋細胞の数によって特定され、このことは、ウイルスを正常に複製することができ、同じバキュロウイルスゲノムにおける複数の導入遺伝子の挿入は、子孫ウイルス作製に悪影響を全く及ぼさないことを示唆した。低速遠心沈殿によってＰ１ウイルスを収集し、免疫ブロット法によるＲＥＰ検出またはＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したｃｅＤＮＡ単離のどちらかのために、感染細胞ペレットを処理した。上記において説明されるように、Ｂ１９．ＲＥＰ、ＧＰＶ．ＲＥＰ、またはＡＡＶ２．ＲＥＰを検出するために、免疫ブロット法を実施した。免疫ブロット法の結果は、試験した各ＲＥＰに対して６つ全てのクローンが陽性であることを示し、これは、ＥＧＴ遺伝子座でのｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮカセットの挿入が最初期またはポリヘドリン駆動ＲＥＰ発現に悪影響を全く及ぼさなかったことを示唆した。最後に、ＢＥＶのワーキングストック（Ｐ２）を作製するために、それぞれのＢＥＶの最も高いＲＥＰ発現性クローンをさらに増幅させ、その後に、Ｓｆ９細胞において力価測定を行った。下記において説明されるように、ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターを作製するために、力価測定されたＢＥＶをＳｆ９細胞における感染に使用した。

【0255】

【表4】

【実施例7】

【0256】

バキュロウイルスからのヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター作製
ｃｅＤＮＡ製造のために、ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮおよびＲｅｐ遺伝子の両方をコードする組換えＢＥＶ（表４）を試験した。Ｓｆ９細胞に、それぞれのＢＥＶの力価測定されたワーキングストック（Ｐ２）を３ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）において感染させた。細胞を、室温において１．５時間穏やかにタンブルし、５分間かけて５００ｘｇでペレット化し、上清を吸引して、細胞を、１０ｍＬの新鮮なＥＳＦ－９２１培地で１回洗浄した。細胞を５０ｍＬのＥＳＦ－９２１培地に懸濁させ、次いで、シェーカーインキュベーターにおいて２８℃で７２時間インキュベートした。感染の７２時間後、感染細胞を収集し、残留バキュロウイルス粒子および／または培養培地を除去するために、ペレットを１×ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、ｃｅＤＮＡベクターを、製造元の取扱説明書に従って、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって単離した。各ｃｅＤＮＡベクターの収量および純度を特定するために、溶出分画を０．８～１．２％のアガロースゲルによって分析した。分析の最初のラウンドとして、ＢＥＶ－５（（表４）、図７Ａ）を感染させたＳｆ９細胞から分離されたｃｅＤＮＡベクターを試験した。ＢＥＶ－５の６つ全てのクローンを、ｃｅＤＮＡ作製に対して試験した。クローンの１つは、ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ導入遺伝子（約７．０ｋｂ）のサイズに対応するＤＮＡバンドを示し、このことは、ポリヘドリン駆動ＧＰＶ ＲＥＰが非対称ＩＴＲ隣接ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮベクターＤＮＡをレスキューすることができることを示している（図７Ｂ）。バンディングパターンを可視化しｃｅＤＮＡのサイズを確認するために、試料を異なる量において再び試験した。高分子量の多重バンドが観察された（図７Ｃ）。このデータは、非ＡＡＶ Ｒｅｐをコードする単一の組換えＢＥＶからのｃｅＤＮＡ作製の概念、ならびにＩＴＲ隣接ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ導入遺伝子を裏付ける。

【実施例8】

【0257】

ヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ安定昆虫細胞株
昆虫細胞ゲノムも、バキュロウイルス感染後にＤＮＡ治療薬物質を産生するように改変することができることが推察された。この目標を達成するために、転写エンハンサーｈｒ５エレメントによって先行されＡｃＭＮＰＶ ｐ１０ポリアデニル化シグナルが後に続くＡｃＭＮＰＶ最初期１（ｉｅ１）プロモーターの存在下においてネオマイシン耐性マーカーをコードするプラスミドを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）（ピスキャタウェイ、ＮＪ）から合成した（配列番号１４）（図８Ａ）。この合成ＤＮＡを、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^ＴＭ）を使用してＳｆ９細胞において非ＡＡＶおよびＡＡＶの対称および非対称ＩＴＲが隣接するｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセット（表３）をコードするプラスミドによって共トランスフェクトした。トランスフェクトの２４時間後、トランスフェクション効率を特定するために、細胞を蛍光顕微鏡の下で視覚化したところ、結果は、＞８０％のＧＦＰ＋細胞を示し、これは、より高いトランスフェクション効率を示唆している。トランスフェクションの７２時間後、１．０ｍｇ／ｍＬの最終濃度において完全なＴＮＭＦＨ培地（１０％のＦＢＳ＋０．１％のプルロニックＦ６８を補ったＧｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ）に懸濁されたＧ４１８抗生物質（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）によって細胞を選択した。選択の約１週間後に、形質転換された細胞の約５０％が回収され、このことは、ネオマイシン耐性マーカーがこの細胞集団に安定に組み込まれたことを示唆した。生存細胞を選択培地から取り出し、コンフルエンス増殖まで新鮮な完全なＴＮＭＦＨ培地を供給した。付着培養として、コンフレント細胞をそれらが分裂を続けられるようなより大きい培養容器へと徐々に拡大した。その後、各細胞株は、完全なＴＮＭＦＨにおける１回の継代および１０％のＦＢＳを補ったＥＳＦ－９２１培地における１回の継代において振盪フラスコでの懸濁培養に適合させた。最後に、各細胞株を、懸濁培養として振盪フラスコでの無血清ＥＳＦ－９２１に適合させた。これらの振盪フラスコ培養を、４日毎の継代によって無血清ＥＳＦ－９２１培地において日常作業的に維持し、細胞増殖をモニターした。各細胞株を、挿入されたｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮコンストラクトに従い、接頭語「Ｓｆ」を用いて命名した（図８Ｂ）（表５）。

【0258】

【表5】

【実施例9】

【0259】

安定細胞株からのヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの作製
安定細胞株アプローチを試験するために、非ＡＡＶおよびＡＡＶの対称または非対称ＩＴＲを伴うｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットをコードする各細胞株（表４）のポリクローナル集団を使用した。細胞に、３ｐｆｕ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）において、Ｒｅｐをコードする各組換えＢＥＶの力価測定されたワーキングストック（Ｐ２）（ＦＩＧ．５Ｂ～Ｄ）を感染させた。細胞を、室温において１．５時間穏やかにタンブルし、５分間かけて５００ｘｇでペレット化して、上清を吸引し、細胞を、１０ｍＬの新鮮なＥＳＦ－９２１培地で１回洗浄した。最後に、細胞を５０ｍＬのＥＳＦ－９２１培地に懸濁させ、次いで、シェーカーインキュベーターにおいて２８℃で７２時間インキュベートした。感染の７２時間後、感染細胞を収集し、残留バキュロウイルス粒子および／または培養培地を除去するために、ペレットを１×ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、製造元の取扱説明書に従って、ｃｅＤＮＡベクターを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって単離した。各ｃｅＤＮＡベクターの収量および純度を特定するために、溶出分画を０．８～１．２％のアガロースゲル電気泳動によって分析した。結果は、以前に観察されたように、ＤＮＡバンドは、異なる程度の強度ならびに高分子量バンドによって、ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮのサイズ（約７．０ｋｂ）に対応することを示した（図９Ａ～Ｃ）。興味深いことに、試験した全ての細胞株は、ＤＮＡバンドが、隣接する対称および／または非対称ＩＴＲにかかわらず、ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットのサイズに対応することを示した。Ｂ１９またはＡＡＶ２株と比較して、ＧＰＶ細胞株－３、－４、および－５は、様々なサイズの多重バンドを示した。

【実施例10】

【0260】

ｃｅＤＮＡからのヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現
ｃｅＤＮＡを血友病Ａ患者を治療するための非ウイルス遺伝子療法ベクターとして使用することができるかどうかを特定するため、肝細胞由来癌腫ヒトＨｕｈ７細胞におけるｃｅＤＮＡからのヒトＦＶＩＩＩ発現を試験するためにインビトロ分析を実施した。最初に、Ｈｕｈ７細胞を、２４ウェルプレートにおいて、１０％のＦＢＳおよび０．１％の抗生物質の混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を補った改質ＩＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ（商標））に５×１０^５細胞／ｍＬにおいて播種し、次いで、静止細胞の増殖による単層を達成するために、ＣＯ_２（５％）を伴う３７℃のインキュベーターにおいて４８時間インキュベートした。インビボでの非分裂性肝臓細胞の核におけるｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現を模倣するために、この増殖条件を達成した。製造元の取扱説明書に従って、リポフェクタミン３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用して、この単層を、ｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットのサイズに対応する約１μｇのゲル精製ｃｅＤＮＡによってトランスフェクトした。対称切断型ＩＴＲが隣接するｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮをコードするプラスミドＤＮＡを、コントロール（ｐＣＬＤＶ－１、－３、および－７、表３）として使用した。トランスフェクションの１８時間後、トランスフェクション混合物を吸引し、細胞に、１０％のＦＢＳおよび０．１％の抗生物質の混合物を補った新鮮なＩＭＥＭ培地を供給した。供給の４８時間後および７２時間後に、無細胞上清を各治療から分取し、分泌されたｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮを、製造元の取扱説明書に従って、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ Ｃｏａｔｅｓｔ（登録商標）ＳＰ第ＶＩＩＩ因子発色アッセイによって測定した。ＦＶＩＩＩ活性を、標準物質によって正規化し、図１０にＵ／ｍＬにおいてプロットした。アッセイ結果は、ｈＦＶＩＩＩ．Ｂ１９Δ１３５．ｃｅＤＮＡを除く試験した全ての試料において、時間経過におけるｈＦＶＩＩＩ発現のレベルの増加を示した。このデータは、ＦＶＩＩＩが、Ｈｕｈ７細胞の非分裂性単層の核において潜在的にトランスフェクトされたｃｅＤＮＡベクターから発現されたことを示唆している。ＧＰＶ細胞株－３、－４、および－５から得られたｃｅＤＮＡは、ＡＡＶ株－６および－８と比較して低いＦＶＩＩＩ発現のレベルを示し、このことは、上記において説明されるように、ＧＰＶ ＩＴＲが、細胞ゲノムに組み込まれる間に切断されている可能性が高いことを示唆している。驚くべきことに、Ｂ１９細胞株－１および－２から得られたｃｅＤＮＡは、検出可能なｈＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現を示さず、その一方で、コントロールとして使用したプラスミドＤＮＡ（ｐＣＬＤＶ－１、表３）では検出可能であった。全体的に、ＧＰＶおよびＡＡＶのｃｅＤＮＡベクターは、Ｈｕｈ７細胞での生理的レベルにおいて持続的ｈＦＶＩＩＩ発現を示し、このことは、ｃｅＤＮＡを、非ウイルス遺伝子療法ベクターとして使用することができることを示唆している（図１０）。個々の細胞株は、表５に記載される。

【実施例11】

【0261】

一過性トランスフェクションによるヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの作製
一過性遺伝子発現システムは、バキュロウイルス昆虫細胞システムの機能解析を行うための最も重要な技術の１つである。このシステムは、一過性発現プラスミドにおいて、バキュロウイルスプロモーターの制限下で外来遺伝子を発現させるために開発された。さらに、このシステムは、ベクター構築およびタンパク質合成におけるより短いターンアラウンドを提供し、ウイルス感染および細胞溶解に関連する困難を回避し、タンパク質の細胞輸送を観察するためのロバストな手段を提供する。バキュロウイルス遺伝子プロモーターは、一般的に、感染サイクルにおける転写の開始に従って最初期、初期、晩期、および最晩期のプロモーターに分けられる。この中で、最初期（ｉｅ）遺伝子プロモーターのみが、宿主ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識され、ならびにウイルス転写因子と無関係であり、このことにより、それらは、昆虫細胞における無バキュロウイルス異種タンパク質発現に対して好適である。最も広く市販されている一過性遺伝子発現システムは、オルギア・シュードツガタ多核大型核ポリヘドロシスウイルス（ＯｐＭＮＰＶ）の最初期（ｉｅ）遺伝子プロモーターに基づいて開発される。他の最初期（ｉｅ）遺伝子プロモーターと比較して、ＯｐＭＮＰＶのＯｐＩＥ２プロモーターは、Ｓｆ細胞における異種タンパク質発現に対する強い活性を提供することが明らかとなった（Ｂｌｅｃｋｍａｎｎら，２０１６）。より近年では、ＯｐＩＥ２プロモーターの制御下でのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介性一過性遺伝子発現に基づく無バキュロウイルスのシステムも記載された（Ｐｕｅｎｔｅ－Ｍａｓｓａｇｕｅｒら，２０２０）。

【0262】

したがって、Ｒｅｐタンパク質の一過性発現は安定細胞株からのヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターを「レスキューする」ことができると仮定した。この仮説を調べるために、安定細胞株における無バキュロウイルスの作製のためのＯｐＭＮＰＶ最初期（ＯｐＩＥ２）プロモーターの存在下でのＰＥＩ媒介性一過性Ｒｅｐタンパク質発現を利用した。ＯｐＭＮＰＶゲノム（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＣ＿００１８７５．２）からのＯｐＩＥ２プロモーター配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（登録商標）（ピスキャタウェイ、ＮＪ）によって合成した（配列番号１５）。Ｒｅｐタンパク質発現コンストラクトにおけるポリヘドリンまたは最初期プロモーターを置き換えるために、合成プロモーター配列をクローニングした（図１１Ａ、１１Ｃ、１１Ｅ）。結果として得られた一過性発現プラスミドである、ｐＦａｓｔＢａｃ．ＯｐＩＥ２．Ｂ１９．Ｒｅｐ（図１１Ｂ）、ｐＦａｓｔＢａｃ．ＯｐＩＥ２．ＧＰＶ．Ｒｅｐ（図１１Ｄ）、およびｐＦａｓｔＢａｃ．ＯｐＩＥ２．ＡＡＶ２．Ｒｅｐ（図１１Ｆ）は、非ＡＡＶおよびＡＡＶの対称または非対称ＩＴＲを伴うヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットをコードする安定細胞株（表５）をトランスフェクトするために使用されるであろう。

【0263】

非ＡＡＶおよびＡＡＶの対称または非対称ＩＴＲを伴うヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットをコードする安定細胞株（表５）は、安定細胞株の新しいセットを生成するために、ＯｐＭＮＰＶ最初期（ＯｐＩＥ２）プロモーターの存在下においてＢ１９．Ｒｅｐ、ＧＰＶ．Ｒｅｐ、またはＡＡＶ２．Ｒｅｐをコードする一過性発現プラスミド（図１１）、ならびに、転写エンハンサーｈｒ５エレメントによって先行されＡｃＭＮＰＶ ｐ１０ポリアデニル化シグナルが後に続くＡｃＭＮＰＶ最初期１（ｉｅ１）プロモーターの存在下においてピューロマイシン耐性マーカーをコードするｐｌａｍｉｄ、によって超形質転換されるであろう。形質転換された細胞は、実施例８において説明されるように、ピューロマイシンによって選択され、振盪フラスコ培養へと増幅されるであろう。これらの細胞株は、無バキュロウイルスヒトＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター作製のためのプロデューサー細胞株として使用されるであろう。

【実施例12】

【0264】

改変ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセット
導入遺伝子発現カセットのレベルは、標的にされた宿主に対してｃＤＮＡをコドン最適化することによって増加させることができると仮定した。Ｖ１．０ ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮ発現カセットからのＦＶＩＩＩ発現の生理的レベルは、米国特許出願公開第２０１９０１８５５４３号に記載されるように、以前の研究において実証されている。しかしながら、標的特異性をさらに改善し、免疫原性を減少させるため、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃＤＮＡを、パルボウイルスＩＴＲを伴うＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットをコードするＤＮＡベクターに対して生じた先天性免疫応答を回避するように、枯渇したＣｐＧ反復によってコドン最適化した。エンハンサーエレメント（Ａ１ＭＢ２）、ハイブリッド合成イントロン（キメライントロン）、ウッドチャック転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化（ｂＧＨｐＡ）シグナルを伴う肝臓特異的改変マウストランスチレチン（ｍＴＴＲ）プロモーター（ｍＴＴＲ４８２）の制御下においてＸＴＥＮ １４４ペプチド（ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）と融合したＢドメイン欠失（ＢＤＤ）コドン最適化ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＢＤＤｃｏＦＶＩＩＩ）を含む、改変されたＶ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットを生成した。Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットは、配列番号１９の核酸配列を含む。

【0265】

初期のインビボ効果研究は、Ｖ１．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットと比較して、ＦＶＩＩＩ活性におけるかなりの改善を示した（データは示されず）。したがって、上記（実施例６））において説明されるように、組換えＢＩＶＶＢａｃ ｂａｃｍｉｄを生成するために、Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットを使用した。次いで、ＡＡＶ２ ＷＴ（図１２Ａ）、Ｂ１９ ＷＴまたは最小（配列番号１６）（図１２Ｂ）、およびＧＰＶΔ１２０（配列番号１７）もしくはＧＰＶΔ１８６（配列番号１８）（図１２Ｃ）を含む操作されたパルボウイルスＩＴＲを、Ｖ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセット（配列番号１９）に挿入し、ならびに、下記において説明されるように、３つの異なるアプローチを使用してバキュロウイルスシステムでのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの作製のために試験した。

【実施例13】

【0266】

ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ作製のアプローチ
バキュロウイルス昆虫細胞システムにおいて、組換えＢＥＶは、強いプロモーターの存在下において目的の遺伝子を送達し、ならびに昆虫細胞でのウイルス複製にとって必須である転写複合体を提供する。このシステムは、バキュロウイルスゲノムおよび／または安定細胞株の形態の昆虫細胞ゲノムにおける目的の導入遺伝子の挿入の柔軟性を提供する。バキュロウイルスシステムのこれらの利点は、スケーラビリティの容易さによるプラットフォーム選択の柔軟性を提供するためのｃｅＤＮＡ作製の３つの異なるアプローチの設計において活用された。

【0267】

ＯｎｅＢＡＣ：
導入遺伝子発現に対するＯｎｅＢａｃアプローチの使用を調査するために、ＢＩＶＶＢａｃ ｂａｃｍｉｄを使用した。実施例１において説明されるように、バキュロウイルスゲノム内の２つの異なる部位における２つの異なるメカニズムによって複数の導入遺伝子の挿入を受け入れるようにＢＩＶＶＢａｃを設計した。最適化されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセット（配列番号１９）を、同じ骨格において、Ｔｎ７転移によってＢＩＶＶＢａｃにおけるポリヘドリン遺伝子座のミニａｔｔＴｎ７部位にパルボウイルスＩＴＲと共に挿入し、上記（実施例６）において説明されるように、ＩＴＲ特異的複製（Ｒｅｐ）遺伝子発現カセットを、Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ組換えによってＥＧＴ遺伝子座のＬｏｘＰ部位に挿入した。次いで、組換えＢＥＶを生成し、図１３Ａに示されるように、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡを作製するために、Ｓｆ９細胞での感染に使用した。下記において説明されるように、ｃｅＤＮＡ製造のためのＯｎｅＢａｃアプローチの概念を証明するために、Ｒｅｐ発現レベルを制御するための異なるプロモーターを使用した。

【0268】

ＴｗｏＢＡＣ：
導入遺伝子の発現に対するＴｗｏＢａｃアプローチの使用を調査するため、上記の実施例５において説明されるように、最適化されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットを、パルボウイルスＩＴＲと共に挿入し、および／または、ＩＴＲ特異的複製（Ｒｅｐ）遺伝子発現カセットを、Ｔｎ７転移によって２つの異なるＢＩＶＶＢａｃ ｂａｃｍｉｄのポリヘドリン遺伝子座におけるミニａｔｔＴｎ７部位に挿入した。次いで、組換えＢＥＶを生成し、図１３Ｂに示されるように、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡを作製するためにＳｆ９細胞における共感染に使用した。ＴｗｏＢＡＣアプローチに関連している困難を、下記の実験において説明されるように、２つのバキュロウイルスの感染多重度（ＭＯＩ）を異なる比率において使用し、ならびに再現可能なｃｅＤＮＡの産生能を得るためにＲｅｐ発現レベルを微調節することによって調査した。

【0269】

安定細胞株：
導入遺伝子の発現に対する安定細胞株アプローチの使用を調査するために、実施例８において説明されるように、パルボウイルスＩＴＲを伴う最適化されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットを用いて安定細胞株を生成した。上記の実施例５において説明されるように、Ｔｎ７転移により、ＢＩＶＶＢａｃ ｂａｃｍｉｄのポリヘドリン遺伝子座におけるミニａｔｔＴｎ７部位にＩＴＲ特異的複製（Ｒｅｐ）遺伝子発現カセットを挿入することによって、組換えｂａｃｍｉｄも生成した。次いで、組換えＲｅｐ．ＢＥＶを生成し、図１３Ｃに示されるように、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡを作製するために、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ安定細胞株における感染に使用した。安定細胞株アプローチに関連する困難を、下記の実験において説明されるように、安定細胞株を生成するプロセスを促進するためにプロキシとしてＧＦＰを使用したＦＡＣＳ細胞選別により、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ形質転換体を富化することによって調査した。

【実施例14】

【0270】

ＯｎｅＢＡＣからのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ（ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）ベクター作製
ＡｃＭＮＰＶポリヘドリンプロモーターの存在下においてＡＡＶ２ ＷＴもしくはＢ１９ ＷＴ ＩＴＲおよびそれらのそれぞれのＲｅｐ遺伝子を伴うＶ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮをコードする組換えＢＥＶを、上記において説明されるように、ＯｎｅＢＡＣアプローチを使用して、Ｓｆ９細胞におけるＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ（ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）産生に対して試験した。約２．０×１０^６／ｍＬの細胞に、０．１、０．５、１．０、２．０、または３．０プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞のＭＯＩにおいてＯｎｅＢＡＣ ＢＥＶを感染させた（図１４Ａ、１５Ａ）。細胞を、５０ｍＬの無血清ＥＳＦ－９２１培地に懸濁させ、次いで、２８℃のシェーカーインキュベーターにおいて、７２～９６時間または生存率が６０～７０％に達するまでインキュベートした。感染の約９６時間後、感染細胞を収集し、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ単離のために、製造元の取扱説明書に従って、Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してペレットを処理した。ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの産生能を特定するために、最終溶出分画を０．８～１．２％のアガロースゲル電気泳動において分析した。

【0271】

ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＡＡＶ２ ＩＴＲ
ＡＡＶ２ ＯｎｅＢＡＣのアガロースゲル分析（図１４Ｂ）は、他の治療と比較して、１．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩにおいて得られた最も高い産生能によって試験した全てのＭＯＩにおいて、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＡＡＶ２ ＩＴＲのサイズ（約８．５ｋｂ）に対応するＤＮＡバンドを示した（図１４Ｃ）。この結果は、ＨＢｏＶ１ ＩＴＲコンストラクトから得られたｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮがウイルス負荷の増加と共に産生能の増加を示したことを示す初期データに反した（データは示さず）。理論に束縛されるわけではないが、このことは、ＨＢｏＶ１－ＮＳ１タンパク質と比較して、ＡＡＶ２ Ｒｅｐが、異なる結合のメカニズムおよびＤＮＡ複製のためのＡＡＶ２ ＷＴ ＩＴＲの末端解離部位でのエンドヌクレアーゼ活性を有し、それが、それぞれのＩＴＲにおける異なるヘアピン構造（Ｔ字形対Ｕ字形）に起因し得ることを示唆し得る。

【0272】

ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ Ｂ１９ ＩＴＲ
Ｂ１９ ＯｎｅＢＡＣのアガロースゲル分析（図１５Ｂ）は、低レベルの産生能によって試験した全てのＭＯＩにおいて、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ Ｂ１９ ＩＴＲのサイズ（約８．５ｋｂ）に対応するＤＮＡバンドを示した（図１５Ｃ）。ＡＡＶ２またはＨＢｏＶ１と異なり、Ｂ１９ ＯｎｅＢＡＣのより高いウイルス負荷は、強い（ポリヘドリン）バキュロウイルスプロモーターの存在下において感染の後期に発現されたＢ１９－ＮＳ１のより高いレベルに潜在的に起因して、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの産生能を改善しなかった。これらの結果は、全長（ＷＴ）パルボウイルスＩＴＲと化学量論的ＲＥＰ発現との組合せが、バキュロウイルスシステムにおいてより高いｃｅＤＮＡ産生能を得ることにとって重要であり得ることを示唆している。

【0273】

結論として、これらの実験は、ＯｎｅＢＡＣアプローチが、パルボウイルスＩＴＲおよびＮＳ１導入遺伝子を伴うＦＶＩＩＩＸＴＥＮをコードする単一組換えＢＥＶからのｃｅＤＮＡ産生の概念を証明することを示した。それは、バキュロウイルスシャトルベクター（ＢＩＶＶＢａｃ）の異なる遺伝子座に挿入された複数の導入遺伝子の実行可能性および機能性、ならびにバキュロウイルス昆虫細胞システムにおける組換えＡＡＶベクター作製のためのその潜在的使用を示している。

【実施例15】

【0274】

ＴｗｏＢＡＣからのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ（ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）ベクター作製
ｃｅＤＮＡ導入遺伝子発現に対するＴｗｏＢＡＣアプローチを調査するために、共感染のいくつかの異なる条件を、比率を一定に維持して異なるＭＯＩにおいてＴｗｏＢＡＣをＳｆ９に共感染させるか、またはＭＯＩを一定に維持して異なる比率においてＴｗｏＢＡＣをＳｆ９に共感染させるかのどちらかによって試験した。各場合において、ウイルス種菌は除去せずに、２８℃のシェーカーインキュベーターにおいて生存率が６０～７０％に達するまで、細胞をインキュベートした。感染の約９６時間後、感染細胞を収集し、製造元の取扱説明書に従って、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ単離のために、Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してペレットを処理した。ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの産生能を特定するために、最終溶出分画を０．８～１．２％のアガロースゲル電気泳動において分析した。

【0275】

ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＡＡＶ２ ＩＴＲ
５０ｍＬの無血清ＥＳＦ－９２１培地に播種した約２．０×１０^６／ｍＬの細胞に、それぞれ、比率１：１０を一定に維持するための、０．０１、０．１、０．３、１．０、または３．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでのＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＡＡＶ２．ＷＴ．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７ ＢＥＶ、ならびに０．００１、０．０１、０．０３、０．１、または０．３ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでのＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．ＲｅｐΔＶＰ８０^Ｔｎ７ ＢＥＶ（以前に米国特許出願第６３／０６９，１１５号において記載される）、の力価測定されたワーキングストック（Ｐ２）を共感染させた（図１６Ａ～１６Ｂ）。共感染の異なるＭＯＩでの汚染バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）と比較して、ＡＡＶ２ ＴｗｏＢＡＣのアガロースゲル分析は、異なる程度のｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＤＮＡ）産生能を示した。０．１～０．０１および３．０～０．３ｐｆｕ／細胞のＭＯＩは、同じ程度のｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＤＮＡ）産生能を示したが、晩期の共感染ＭＯＩは、汚染ｖＤＮＡのより低いレベルを示した（図１６Ｃ）。

【0276】

これらの結果は、ＡＡＶ２ ＴｗｏＢＡＣアプローチはＯｎｅＢＡＣに対して同等なレベルのｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ産生能を示すが、精製のこの方法によって同時精製した他の不純物のレベルに著しい違いが存在することを示唆している。理論に束縛されるわけではないが、このことは、Ｓｆ９細胞においてより高いｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ産生能を達成するための化学量論的ＡＡＶ２ ＲＥＰ７８／ＲＥＰ５２発現の重要性をさらに強調し得る。

【0277】

ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ Ｂ１９ ＩＴＲ
５０ｍＬの無血清ＥＳＦ－９２１培地に播種した約２．０×１０^６／ｍＬの細胞に、０．１、０．３、０．５、１．０、３．０、または５．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでのＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．Ｂ１９．ＷＴ．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７ ＢＥＶ、ならびにそれぞれ、比率１：１０を維持するための０．０１、０．０３、０．０５、０．１、０．３、もしくは０．５ｐｆｕ／細胞のＭＯＩまたは比率１：５を一定に維持するための０．０２、０．０６、０．１、０．２、もしくは０．６ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでのＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．Ｂ１９－ＮＳ１^Ｔｎ７ ＢＥＶ、の力価測定されたワーキングストック（Ｐ２）を共感染させた（図１７Ａ～１７Ｂ）。ＡＡＶ２ ＴｗｏＢＡＣと異なり、Ｂ１９ ＴｗｏＢＡＣのアガロースゲル分析は、共感染の異なるＭＯＩにおいて、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＤＮＡ）および汚染バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）の産生能において同等なレベルを示した（図１７Ｃ）。興味深いことに、試験したいずれの条件も、Ｂ１９ ＯｎｅＢＡＣによって得られた結果のようなｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ Ｂ１９ ＩＴＲの産生能における改善を示さなかった。

【0278】

結論として、Ｂ１９ ＯｎｅＢＡＣおよびＢ１９ ＴｗｏＢＡＣアプローチの両方は、バキュロウイルスシステムにおける非ＡＡＶパルボウイルスＩＴＲからのｃｅＤＮＡ産生の概念を証明する。

【0279】

ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＧＰＶ ＩＴＲ
５０ｍＬの無血清ＥＳＦ－９２１培地に播種した約２．０×１０^６／ｍＬの細胞に、０．１、０．３、０．５、１．０、３．０、もしくは５．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでのＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＧＰＶΔ１２０．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７ ＢＥＶ、ならびにそれぞれ、比率１：１０を維持するための０．０１、０．０３、０．０５、０．１、０．３、もしくは０．５ｐｆｕ／細胞のＭＯＩまたは比率１：５を一定に維持するための０．０２、０．０６、０．１、０．２ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでのＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ－ＮＳ１^Ｔｎ７ ＢＥＶ、の力価測定されたワーキングストック（Ｐ２）を共感染させた（図１８Ａ～１８Ｂ）。ＡＡＶ２またはＢ１９ ＴｗｏＢＡＣと異なり、ＧＰＶ ＴｗｏＢＡＣのアガロースゲル分析は、５．０～０．５ｐｆｕ／細胞共感染のＭＯＩにおいて観察されるかすかなバンドを除く、試験した全てのＭＯＩにおいて、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮのサイズ（約８．５ｋｂ）に対応する検出可能なＤＮＡバンドを示さなかった（図１８Ｃ）。ＧＰＶ ＴｗｏＢＡＣによって得られたｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ産生能は、ＧＰＶ ＯｎｅＢＡＣと相関し、この場合、上記において説明されるように、Ｖ１．０ ＦＶＩＩＩｃｏ６ＸＴＥＮを、ＧＰＶ非対称ＩＴＲと共に使用した（図７Ｂ、実施例７を参照されたい）。

【0280】

両方の研究において、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ導入遺伝子カセットの両端の全長ＷＴ ＧＰＶ ＩＴＲの入手におけるクローニングの複雑さに起因して、切断型ＧＰＶ ＩＴＲを試験した。それにもかかわらず、ＧＰＶ ＯｎｅＢＡＣおよびＧＰＶ ＴｗｏＢＡＣアプローチの両方は、ｃｅＤＮＡ産生の概念を証明し、ならびに、最適なＭＯＩ比の有意性およびＳｆ９細胞におけるＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡのより高い産生能を達成するためのプロモーター選択を実証する。

【実施例16】

【0281】

安定細胞株からのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ（ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）ベクター作製
安定細胞株アプローチを試験するために、ＡＡＶ２ ＷＴ、Ｂ１９最小、またはＧＰＶΔ１２０ＩＴＲが隣接するＶ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮで作製された各細胞株のポリクローナル集団に、５０ｍＬの無血清ＥＳＦ９２１培地に約２．０×１０^６／ｍＬにおいて播種し、ならびに、示されるように、異なるＭＯＩでのＩＴＲ特異的ＲＥＰ．ＢＥＶの力価測定されたワーキングストック（Ｐ２）を感染させた。各場合において、ウイルス種菌は除去せずに、細胞を、７２～９６時間または２８℃のシェーカーインキュベーターにおいて生存率が６０～７０％に達するまでインキュベートした。感染の約９６時間後、感染細胞を収集し、製造元の取扱説明書に従って、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ単離のために、ペレットを処理した。ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの産生能を特定するために、最終溶出分画を０．８～１．２％のアガロースゲル電気泳動において分析した。

【0282】

ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＡＡＶ２ ＩＴＲ
以前（実施例８）に説明したように、ＡＡＶ２ ＷＴ ＩＴＲを伴うＶ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮをコードする細胞株を開発した。次いで、ポリクローナルＳｆ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＡＡＶ２．ＷＴ．ＩＴＲ細胞集団に、０．００１、０．０１、０．０３、０．１、０．３、または０．５ｐｆｕ／細胞のＭＯＩにおいてＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＡＡＶ２．ＲｅｐΔＶＰ８０^Ｔｎ７ ＢＥＶ（米国特許出願第６３／０６９，１１５号に記載される）の力価測定されたワーキングストック（Ｐ２）を感染させた（図１９Ａ、１９Ｂ）。ＡＡＶ２安定細胞株から単離されたｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮのアガロースゲル分析は、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮのサイズ（約８．５ｋｂ）に対応する検出可能なＤＮＡバンドを示さなかった０．００１ｐｆｕ／細胞の最低ＭＯＩを除いて、試験した全てのＭＯＩにおいて同等なレベルの産生能を示した。興味深いことに、０．０１および０．０３ｐｆｕ／細胞のＭＯＩにおいてＲＥＰ．ＢＥＶを感染させた細胞は、より高いＭＯＩと比較して、汚染バキュロウイルスＤＮＡ（ｖＤＮＡ）と同時に、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮによるより高い産生能を示した（図１９Ｃ）。これらの結果は、ＡＡＶ２ ＯｎｅＢＡＣまたはＡＡＶ２ ＴｗｏＢＡＣアプローチと異なり、安定細胞株アプローチは、Ｓｆ９細胞ゲノムのＡＡＶ２ ＷＴ ＩＴＲが隣接する安定に組み込まれたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットを「レスキューする」ために、より低いウイルス種菌を必要とすることを示唆している。

【0283】

結論として、この研究は、パルボウイルスＩＴＲｓが隣接するＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットを安定に組み込まれた細胞株によるｃｅＤＮＡ産生の概念を証明する。

【0284】

ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ Ｂ１９ ＩＴＲｓ
Ｂ１９最小 ＩＴＲを伴うＶ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮをコードする細胞株を、以前（実施例８）に説明したように開発した。次いで、ポリクローナルＳｆ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．Ｂ１９．最小．ＩＴＲ細胞集団に、０．０１、０．０３、０．０５、０．１、０．３、０．５、１．０、３．０、または５．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩにおいてＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．Ｂ１９－ＮＳ１^Ｔｎ７ ＢＥＶの力価測定されたワーキングストック（Ｐ２）を感染させた（図２０Ａ、２０Ｂ）。Ｂ１９安定細胞株から単離されたｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮのアガロースゲル分析は、ＲＥＰ．ＢＥＶのＭＯＩの増加と共にＤＮＡバンド強度のレベルが増加することを示した。しかしながら、ＤＮＡバンドは、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの予想されたサイズ（約８．５ｋｂ）よりわずかに低かった（図２０Ｃ）。興味深いことに、異なるＩＴＲを伴うが、Ｂ１９安定細胞株から得られたＶ１．０ ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（実施例９、図９Ａ）に対して、同様のバンドパターンが観察された。対照的に、Ｂ１９ ＷＴ ＩＴＲを伴うＦＶＩＩＩＸＴＥＮをコードするＢ１９ ＯｎｅＢＡＣまたはＴｗｏＢＡＣを感染させたＳｆ９細胞から得られたｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮは、Ｖ２．０ ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮに対する予想されたＤＮＡバンドのサイズ（約８．５ｋｂ）を示した（図１５Ｃおよび図１７Ｃ）。

【0285】

これらの結果は、末端解離部位およびＲＥＰ結合エレメントが、Ｂ１９ ＩＴＲの切断型または最小バリアントに存在するが、効率的複製のためには、Ｂ１９－ＮＳ１がＤＮＡに結合して切断するために全長（ＷＴ）配列が必要とされることを示唆している。

【0286】

ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＧＰＶ ＩＴＲ
ＧＰＶΔ１２０ ＩＴＲを伴うＶ２．０ ＦＶＩＩＩＸＴＥＮをコードする細胞株を、以前（実施例８）に説明したように開発した。次いで、ポリクローナルＳｆ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＧＰＶΔ１２０．ＩＴＲ細胞集団に、０．０１、０．０３、０．０５、０．１、０．３、０．５、１．０、３．０、または５．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩにおいてＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＧＰＶ－ＮＳ１^Ｔｎ７ ＢＥＶの力価測定されたワーキングストック（Ｐ２）を感染させた（図２１Ａ、２１Ｂ）。Ｂ１９細胞株と異なり、ＧＰＶ安定細胞株から単離されたｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮのアガロースゲル分析は、感染のＭＯＩの増加と共に産生能のレベルも減少することを示した。

【0287】

興味深いことに、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＧＰＶ ＩＴＲの場合、他方のパルボウイルスＩＴＲと比較して、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ産生能において逆の傾向が観察された。ＧＰＶ細胞株での感染のために使用される最低ＭＯＩ（０．０１ｐｆｕ／細胞）は、試験した他のＭＯＩと比較して、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（ｃｅＤＮＡ）に対して最も高いバンド強度を示した（図２１Ｃ）。これらの結果は、少なくとも安定細胞株の場合、ＧＰＶ－ＩＴＲ－媒介性ｃｅＤＮＡ産生のためには、ＧＰＶ－ＮＳ１の非常に低いレベルが必要とされることを示唆している。さらに、このデータは、ＧＰＶ ＯｎｅＢＡＣまたはＴｗｏＢＡＣにおいて観察されたｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの低い産生能（図７Ｃ、１８Ｃ）は、おそらく、高いウイルス負荷に起因し、それが、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ作製のために元々必要とされるよりも高いレベルのＧＰＶ－ＮＳ１発現に間接的に対応していることを示唆している。

【0288】

それにもかかわらず、安定細胞株アプローチは、非ＡＡＶパルボウイルスが隣接するＦＶＩＩＩＸＴＥＮ発現カセットと安定に組み込まれた細胞株からのｃｅＤＮＡ産生の概念を証明する。

【実施例17】

【0289】

ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ（ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）ベクター作製
バキュロウイルス昆虫細胞システムにおいて、組換えＢＥＶは、強いプロモーターの存在下において目的の遺伝子を送達し、ならびに、昆虫細胞でのウイルス複製にとって必須である転写複合体を提供する。典型的には、バキュロウイルスＤＮＡゲノムは、核において複製して、それぞれが全長ＤＮＡゲノムを含んだ数千万の子孫ウイルス粒子を産生する。バキュロウイルスゲノムＤＮＡは、プラスミドＤＮＡベースの精製方法、例えば、シリカゲルカラムなどを使用して昆虫細胞からＤＮＡを単離しつつ、ｃｅＤＮＡと共に同時精製されることは実証されている。市販のプラスミドＤＮＡキットのカラムは、一般的に、ＤＮＡの分子量に基づいてＤＮＡを分離するように設計されておらず、したがって、典型的には、試料中に存在するＤＮＡの全ての形態がこれらのカラム結合し得る。その上、高分子量のＤＮＡの結合能力は、低分子量ＤＮＡとは異なり得、アニオン交換ベースのキットのカラムは、ＤＮＡの異なるサイズの結合効率に基づいて最適化されていない。

【0290】

ｃｅＤＮＡプレップにおいて観察された高分子量ＤＮＡ（＞２０ｋｂ）は、おそらく、低分子量ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（約８．５ｋｂ）と共に同時精製されたバキュロウイルスおよび／またはＳｆ９細胞ゲノムＤＮＡであると仮定した（例えば、図１４Ｃ～２１Ｃを参照されたい）。以前に、感染性の子孫ウイルス産生のために必要である、バキュロウイルスカプシド遺伝子、例えば、ＶＰ８０などをノックアウトすることによって、バキュロウイルスＤＮＡを減じるために、間接的アプローチを用いた。このアプローチは、ノックアウトＢＥＶから得られたｃｅＤＮＡプレップにおけるバキュロウイルスＤＮＡの著しい減少を示した（米国特許出願第６３／０６９，１１５号を参照されたい）。このアプローチは、バキュロウイルスＤＮＡ混入を低減することにおいて効率的であるが、このアプローチは、感染細胞ペレットから得られる全ＤＮＡの有意量（約６０％）に存在する細胞ゲノムＤＮＡを減少させることができない。

【0291】

この研究において、残りの所望でないＤＮＡからＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡを分離する直接アプローチを用い、感染細胞ペレットからの全ＤＮＡプレップから、精製されたＦＶＩＩＩＸＴＥＮ（＞９５％の純度）を効率的に得ることを実証した。この新規のアプローチは、サイズおよび電荷に従って異なるタンパク質分子を分離するために広く使用される分取電気泳動を活用する。例えば、Ｍｉｃｈｏｖ，Ｂ．（２０２０）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｂｅｒｌｉｎ，Ｂｏｓｔｏｎ：Ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ，ｐｐ．４０５～４２４を参照されたい。例えば、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｍｏｄｅｌ ４９１プレップ細胞または他のそのようなユニットを使用することにより、複合体分子のサイズに基づいてそれらを分離することができる。

【0292】

本研究において、高分子量ＤＮＡからＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡを分離するために分取電気泳動技術を用い、下記において説明されるように、インビボ研究のために使用される、精製されたｃｅＤＮＡを首尾よく得た。

【0293】

ｃｅＤＮＡ精製のワークフロー全体が図２２に示されており、この場合、プロセスは、無血清昆虫細胞培養培地における０．５Ｌから１．５Ｌまたはより大きい量へのＳｆ９細胞培養のスケールアップで開始される（図２２Ａ）。約２．５×１０^６／ｍＬの所望の細胞密度に達することに関して、典型的には、約１．３×１０^６／ｍＬの播種密度による２日間のインキュベーションの後に、細胞に、最適化されたＭＯＩにおいてＯｎｅＢＡＣまたはＴｗｏＢＡＣ ＢＥＶを感染させ（ｃｅＤＮＡ産生のために使用されるアプローチに依存する）、生存率が約６０～７０％に達するまで（典型的には、約４日を要する）、２８℃のシェーカーインキュベーターにおいて細胞をインキュベートした（図２２Ｂ）。生存率が約７０％に達した後、細胞を収集し、アニオン交換クロマトグラフキットのカラム、例えば、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＨｉＰｕｒｅ Ｅｘｐｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａｐｒｅｐ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など、によって、製造元の取扱説明書に従って、全ＤＮＡ精製のために処理した。ＤＮＡ産生能および無欠陥性を特定するために、精製したＤＮＡ物質の分取を、０．８～１．２％のアガロースゲル電気泳動において点検した（図２２Ｃ）。精製された材料は、次いで、製造元の取扱説明書に従って組み立てた、０．５％の分取アガロースゲルおよび０．２５％のスタッキングアガロースゲルを含む分取アガロースゲル電気泳動装置にロードさせた。フラクション収集チャンバーにおいて各フラクションを７０～８０分間収集するために、試料を、低電圧（一定の約４０ボルト）において、約５０ｍＬ／分のバッファー再循環流速、および５０μＬ／分の溶出バッファー速度において４℃で６～７日間電気泳動させる。連続溶出電気泳動の後に、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡの純度を特定するために、各フラクションの２０μＬを、０．８～１．２％のアガロースゲル電気泳動において点検した（図２２Ｄ）。所望のフラクションを収集して、３ＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５、および１００％のＥｔＯＨにより－２００℃で１～２時間かけて沈殿させた。最後に、沈殿したＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡを、高速においてペレット化し、ｐＨ８．０のバッファーであるＴＥに再懸濁させる前に、７０％のＥｔＯＨで１回洗浄した。精製したＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡを、インビボ効率研究のために動物に注入する前に純度および無欠陥性を確認するために０．８～１．２％のアガロースゲル電気泳動において再び点検した（図２２Ｅ）。

【実施例18】

【0294】

ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ（ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ）のインビボ効果
ＨｅｍＡマウスのｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ全身性投与
インビボでのｃｅＤＮＡの機能性を検証するために、ＡＡＶ２またはＨＢｏＶ１ ＷＴ ＩＴＲを伴う精製ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮを、０．３μｇ、１．０μｇ、または２．０μｇ／マウスにおいて（それぞれ、１２μｇ、４０μｇ、および８０μｇ／ｋｇに相当する）、ｈＦＶＩＩＩＲ５９３Ｃ^＋／＋／ＨｅｍＡマウスに尾静脈水圧注入によって全身注入した。注入されたマウスから血漿試料を７日間の間隔で採取し、上記において説明されるように、発色アッセイによってＦＶＩＩＩ活性を測定した。

【0295】

ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ注入コホートに対する正常のパーセントに対して正規化した血漿ＦＶＩＩＩ活性を、図２３に示す。結果は、ＦＶＩＩＩ発現の超生理学的レベル（正常の＞５００％）のＨｅｍＡマウスにおける用量依存性応答が、試験したＡＡＶ２もしくはＨＢｏＶ１ ｃｅＤＮＡの最も高い用量において観察されることを示した。しかしながら、注入後の最長１４０日目まで、ＦＶＩＩＩ発現レベルの段階的な減少が観察され、その後、レベルは、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＡＡＶ２ ＩＴＲ注入コホートにおいて安定した。興味深いことに、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＨＢｏＶ１ ＩＴＲのＦＶＩＩＩ発現レベルは、ｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＡＡＶ２ ＩＴＲを注入したマウスと同様の発現傾向を示した（データは示されず）。

【0296】

結論として、これらのインビボ効果研究は、ｃｅＦＶＩＩＩＸＴＥＮの機能性を確認し、パルボウイルスＩＴＲがバキュロウイルス昆虫細胞システムにおける目的の導入遺伝子をコードする機能的ｃｅＤＮＡを作製するために使用することができることを実証している。

【実施例19】

【0297】

ＯｎｅＢＡＣからのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＨＢｏＶ１ ＩＴＲｓ ｃｅＤＮＡベクター作製
ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＨＢｏＶ１ ＩＴＲおよびＨＢｏＶ１ ＮＳ１遺伝子の両方をコードするＯｎｅＢＡＣ ＢＥＶを、Ｓｆ９細胞でのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ産生について試験した。約２．５×１０^６／ｍＬの細胞に、各ＢＥＶの力価測定されたワーキングストック（Ｐ２）を０．１、０．５、１．０、２．０、または３．０プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）において感染させた（図２４Ａ）。細胞を、５０ｍＬの無血清ＥＳＦ－９２１培地に懸濁させ、次いで、７２～９６時間または２８℃のシェーカーインキュベーターにおいて生存率が６０～７０％に達するまでインキュベートした。感染の約９６時間後、感染細胞を収集し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター単離のために、製造元の取扱説明書に従って、ペレットを処理した。ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの産生能を特定するために、最終溶出分画を、０．８～１．２％のアガロースゲル電気泳動において分析した。

【0298】

ＨＢｏＶ１ ＩＴＲおよびポリヘドリン駆動ＨＢｏＶ１－ＮＳ１を伴うＦＶＩＩＩＸＴＥＮをコードするＡｃＢＩＶＶＢａｃ（ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＨＢｏＶ１．ＩＴＲｓ）Ｐｏｌｈ．ＨＢｏＶ１．ＮＳ１^ＬｏｘＰ ＢＥＶ（図２４Ｂ）のアガロースゲル分析が、図２４Ｃに示される。結果は、ＤＮＡバンドは、試験した全て用量において、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＨＢｏＶ１ ＩＴＲ（約８．５ｋｂ）ｃｅＤＮＡのサイズに対応し、ＭＯＩの増加と共に産生能が増加することを示した。

【0299】

この結果は、産生能の減少が、ウイルス負荷の増加の前に観察された、ＡＡＶ２ ＩＴＲｓ ＯｎｅＢＡＣによって得られたｃｅＤＮＡの産生能に反していた。理論に束縛されるわけではないが、ＨＢｏＶ１－ＮＳ１タンパク質は、ＤＮＡ複製のための独特な結合のメカニズムおよびＨＢｏＶ１ ＩＴＲの末端解離部位でのエンドヌクレアーゼ活性を有し得、それらは、ＲＥＨおよびＬＥＨ ＩＴＲの独特な構造に起因し得る。

【0300】

結論として、これらの実験は、ＯｎｅＢＡＣアプローチが、ＨＢｏＶ１ ＩＴＲおよびＮＳ１導入遺伝子を伴うＦＶＩＩＩＸＴＥＮをコードする単一組換えＢＥＶからのｃｅＤＮＡ産生の概念を証明することを示した。それは、バキュロウイルスシャトルベクター（ＢＩＶＶＢａｃ）の異なる遺伝子座に挿入された複数の導入遺伝子の実行可能性および機能性、ならびにバキュロウイルス昆虫細胞システムにおける組換えＡＡＶベクター作製のためのその潜在的使用も示している。

【実施例20】

【0301】

ＴｗｏＢＡＣからのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＨＢｏＶ１ ＩＴＲｓ ｃｅＤＮＡベクター作製
導入遺伝子発現に対するＴｗｏＢＡＣアプローチを調査するため、Ｓｆ９細胞でのＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクターの製造のための１：１０および１：５の比率の異なるＭＯＩでの、または０．３、１．０、３．０、および５．０ｐｆｕ／細胞での異なる比率での共感染に対して、ポリヘドリン駆動ＨＢｏＶ１－ＮＳ１ ＢＥＶを伴うＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＨＢｏＶ１ ＩＴＲをコードするクローナル組換えＢＥＶを試験した（図２５Ａ）。詳細には、約２．０×１０^６／ｍＬの細胞を、５０ｍＬの無血清ＥＳＦ－９２１培地に播種し、０．１、０．３、０．５、１．０、３．０、５．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでのＡｃＢＩＶＶＢａｃ．ｍＴＴＲ．ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ．ＨＢｏＶ１．ＩＴＲｓ^Ｔｎ７ ＢＥＶと、それぞれ、一定の１：１０の比率を維持するための０．０１、０．０３、０．０５、０．１、０．３、０．５ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでの、または一定の１：５の比率を維持するための０．０２、０．０６、０．１、０．２、０．６、１．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでのＡｃＢＩＶＶＢａｃ．Ｐｏｌｈ．ＨＢｏＶ１－ＮＳ１^Ｔｎ７ ＢＥＶの力価測定されたワーキングストック（Ｐ２）を共感染された。同様に、細胞に、０．３、１．０、３．０、または５．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩでの１：１、１：２、１：５、または１：１０の比率においても共感染させた（図２５Ｂ）。各場合において、ウイルス種菌は除去せずに、２８℃のシェーカーインキュベーターにおいて生存率が６０～７０％に達するまで細胞をインキュベートした。感染の約９６時間後、感染細胞を収集し、製造元の取扱説明書に従って、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡベクター単離のために、ペレットを処理した。ｃｅＤＮＡ産生能を特定するために、最終溶出分画を０．８～１．２％のアガロースゲル電気泳動において分析した。

【0302】

予想されるように、アガロースゲル分析は、異なる条件により、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ産生能の異なる程度を示した。しかしながら、試験した他の条件と比較して、３．０ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで共感染させたＴｗｏＢＡＣは、最も高い１：１０のウイルス負荷の比率の増加に伴うＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡ産生能の増加を示した（図２５Ｃ）。より高いウイルス負荷は、ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ＨＢｏＶ１ ＩＴＲｓ ｃｅＤＮＡの産生能を改善するように見え、それは、ＯｎｅＢＡＣ ＢＥＶにおける観察（実施例６を参照されたい）と一致する。このことは、Ｓｆ９細胞でのＨＢｏＶ１－ＩＴＲ依存性ＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡの複製に対する、ＨＢｏＶ１－ＮＳ１のより高いレベルの要件を、さらに示唆している。

【0303】

ＯｎｅＢＡＣまたはＴｗｏＢＡＣによる結果は、ＨＢｏＶ１－ＮＳ１複製のレベルが、バキュロウイルスシステムにおけるＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡの産生能に対して著しい影響を有することを示している。

【0304】

結論として、これらの実験は、ＴｗｏＢＡＣアプローチがＨＢｏＶ１ ＩＴＲおよび／またはＮＳ１導入遺伝子を伴うＦＶＩＩＩＸＴＥＮをコードする２つの組換えＢＥＶからのｃｅＤＮＡ産生の概念を証明することを示した。これらの実験は、最適なＭＯＩ比および／またはＳｆ９細胞においてＦＶＩＩＩＸＴＥＮ ｃｅＤＮＡのより高い産生能を達成するためのプロモーターの重要性も実証している。

【0305】

配列

【0306】

【表6-1】

【表6-2】

【表6-3】

【表6-4】

【表6-5】

【表6-6】

【表6-7】

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4A】

【図4B】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【配列表】

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【国際調査報告】