特表 2024-534182 ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性回復のためのコンジュゲート、組成物、および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-18

(54)【発明の名称】ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性回復のためのコンジュゲート、組成物、および方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 47/54 20170101AFI20240910BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240910BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 31/437 20060101ALI20240910BHJP

【ＦＩ】

A61K47/54

A61P35/00

A61P43/00 107

A61K31/437

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024513345

(86)(22)【出願日】2022-08-30

(85)【翻訳文提出日】2024-04-18

(86)【国際出願番号】 US2022042094

(87)【国際公開番号】W WO2023034341

(87)【国際公開日】2023-03-09

(31)【優先権主張番号】63/238,300

(32)【優先日】2021-08-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】598063203

【氏名又は名称】パーデュー・リサーチ・ファウンデーション

【氏名又は名称原語表記】ＰＵＲＤＵＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100153693

【弁理士】

【氏名又は名称】岩田 耕一

(72)【発明者】

【氏名】ロウ，フィリップ，スチュワート

(72)【発明者】

【氏名】ナポレオン，ジョン，ヴィクター

【テーマコード（参考）】

4C076

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC27

4C076DD59

4C076EE59

4C076FF68

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086CB05

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA13

4C086ZB22

4C086ZB26

(57)【要約】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞活性回復コンジュゲートおよび組成物ならびに消耗したＣＡＲ Ｔ細胞を活性回復させる使用方法。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ＣＡＲが、第１の標的化部分、第２の標的化部分、または第１の標的化部分および第２の標的化部分に結合する、（ｉ）前記ＣＡＲをコードする核酸配列に作動的に連結されたプロモーターを含むベクターまたは（ｉｉ）前記ＣＡＲを発現するＴ細胞、ならびに
（ｂ）特異性を持ってがん細胞に結合し、前記第１の標的化部分にコンジュゲートしたリガンドを含むがん結合コンジュゲートであって、前記がんおよび前記第１の標的化部分によって結合された前記リガンドが、第１のリンカーを介して場合によりコンジュゲートされる、がん結合コンジュゲート
によって処置されているがんを有する対象において、消耗したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を活性回復させる方法であって、
前記第１の標的化部分または前記第２の標的化部分のいずれかとコンジュゲートした、ｔｏｌｌ様受容体７、ｔｏｌｌ様受容体８、またはｔｏｌｌ様受容体７およびｔｏｌｌ様受容体８のアゴニスト（ＴＬＲ７／８のアゴニスト）を含むＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートを前記対象に投与するステップであって、前記アゴニストおよび前記第１の標的化部分または前記第２の標的化部分のいずれかが第２のリンカーを介してコンジュゲートされる、ステップを含み、
前記ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートが、構造：

【化1】

［式中：
Ｒ^１は、アルキル、ハロ、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって場合により置換される、非環状アルキルまたは環状アルキルであり；
Ｒ^２は、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、水素（Ｈ）、－ＯＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、またはＮ_３（式中：
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立して、Ｈ、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくはオキソ、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つもしくは複数の置換基によって場合により置換されるアルキルであり；
各Ｒ^Ｚは、独立して、Ｈもしくは場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換される３～１０員の単環式もしくは二環式ヘテロシクロアルキルを形成する）であり；
各Ｒ^３は、独立して、Ｈ、ハロ、－Ｎ_３、－ＣＮ、－ＮＯ_２、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、ヒドロキシ、カルボニル、またはチオールであり、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルまたはアルコキシは、場合により置換され；
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、アルキル、アルコキシ、ハロ、またはシクロアルキルであり、アルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルは場合により置換され；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＮまたはＣＲ^ｑ（式中、各Ｒ^ｑは、独立してＨ、ハロ、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｚは、Ｇ－Ｌ－（式中、Ｌは、前記第２のリンカーであり、Ｇは、前記第１の標的化部分または前記第２の標的化部分である）であり；
式（Ｉ）のｎは、１～６であり；
式（Ｉ）のｍは、０～４である］
もしくはその薬学的に許容される塩を有し、または
前記ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートが、構造：

【化2】

［式中：
Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシル、アルケニル、アルキニル、脂環式、アリール、ビアリール、ハロ、ヘテロアリール、－ＣＯＲ^２ｘ、

【化3】

（式中、Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙのそれぞれは、Ｈ、－ＯＨ、－ＣＨ_２－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＨ_２－ＮＨ_２、－ＣＯＯＭｅ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＣＨ_３、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂環式、アリール、ビアリール、およびヘテロアリールからなる群から独立して選択される）であり；
Ｚは、Ｇ－Ｌ－（式中、Ｌは、前記第２のリンカーであり、Ｇは、前記第１の標的化部分または前記第２の標的化部分である）であり；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＣＲ^ｑまたはＮ（式中、各Ｒ^ｑは、独立してＨ、ハロ、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｙは、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、－ＳＲ^ｚ、－ＳＯＲ^ｚ、－ＳＯ_３Ｒ^ｚ、－Ｎ_３、－ＣＯＲ^ｚ、－ＣＯＯＲ^ｚ、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＳＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、または－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２（式中：
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立してＨ、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくは場合により置換されるアルキルであり；
各Ｒ^ｚは、独立してＨもしくは場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換されるヘテロシクロアルキルを形成する）であり；
式（ＩＩ）のｎは、０～３０である］
を有するか、もしくはその薬学的に許容される塩であり、または
前記ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートが、構造：

【化4】

［式中：
Ｒ^１は、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって場合により置換される、非環状アルキルまたは環状アルキルであり；
Ｙは、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、－ＳＲ^ｚ、－ＳＯＲ^ｚ、－ＳＯ_３Ｒ^ｚ、－Ｎ_３、－ＣＯＲ^ｚ、－ＣＯＯＲ^ｚ、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＳＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、または－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２（式中：Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立してＨ、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくはオキソ、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、もしくはシクロアルキルから独立して選択される１つもしくは複数の置換基によって場合により置換されるアルキルであり；
各Ｒ^Ｚは、独立して、Ｈもしくは場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換される３～１０員の単環式もしくは二環式ヘテロシクロアルキルを形成する）であり；
各Ｒ^３は、独立して、ハロ、－Ｎ_３、－ＣＮ、－ＮＯ_２、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、ヒドロキシ、カルボニル、またはチオールであり、アルキル、アルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルは、場合により置換され；
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、またはシクロアルキルであり、アルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルは場合により置換され；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＣＲ^ｑまたはＮ（式中、各Ｒ^ｑは、独立してＨ、ハロゲン、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｚは、Ｌ－Ｇ（式中、Ｌは、前記第２のリンカーであり、Ｇは、前記第１の標的化部分または前記第２の標的化部分である）であり；
式（ＩＩＩ）のｎは、０～３０であり；
式（ＩＩＩ）のｍは、０～４である］
を有するか、もしくはその薬学的に許容される塩である、前記方法。

【請求項2】

式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）のＸ^１、Ｘ^２、およびＸ^３のそれぞれがＮである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートが、構造：

【化5】

または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩を有する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートが、構造：

【化6】

を有するか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートが、ＴＬＲ７／８のアゴニストを含み、構造：

【化7】

を有するか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記第１の標的化部分、前記第２の標的化部分、または前記第１の標的化部分および前記第２の標的化部分が、構造：

【化8】

を有する基であるか、またはその基を含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記第１の標的化部分、前記第２の標的化部分、または前記第１の標的化部分および前記第２の標的化部分が、構造：

【化9】

を有する基であるか、またはその基を含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。

【請求項8】

前記ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートが、構造：

【化10】

を有するか、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートが、構造：

【化11】

［式中、ｎ＝０～２００である］、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートが、構造：

【化12】

を有するか、またはその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートが、

【化13】

から選択される構造を有するか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートが、

【化14】

から選択される構造を有するか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートが、

【化15】

から選択される構造を有するか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートが、

【化16】

から選択される構造を有するか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

特異性を持ってがん細胞に結合する前記リガンドが、葉酸塩、５－メチルテトラヒドロ葉酸、２－［３－（１，３－ジカルボキシプロピル）ウレイド］ペンタン二酸（ＤＵＰＡ）リガンド、ニューロキニン１受容体（ＮＫ－１Ｒ）リガンド、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）リガンド、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼのリガンド、黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨＲ）のリガンド、ＣＤ７３のリガンド、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のリガンド、グルコーストランスポーター１（ｇｌｕｔ－１）のリガンド、線維芽細胞活性化タンパク質のリガンド、ナチュラルキラーグループ２Ｄ受容体（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、およびコレシストキニンＢ受容体（ＣＣＫＢＲまたはＣＣＫ２）リガンドからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記第１の標的化部分および前記第２の標的化部分が、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、Ｌ－ラムノース、タクロリムス（ＦＫ５０６）、２，４，６－トリニトロフェノール（ＴＮＰ）、ビオチン、ラパマイシン、ジゴキシゲニン、葉酸塩、５－メチルテトラヒドロ葉酸、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＮＨＳ－フルオレセイン、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ノッチン、センチリン、およびＤＡＲＰｉｎからなる群から独立して選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記第１の標的化部分および前記第２の標的化部分が、ＤＮＰ、ＦＫ５０６、ＴＮＰ、ビオチン、ラパマイシン、ジゴキシゲニン、葉酸塩、５－メチルテトラヒドロ葉酸、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＮＨＳ－フルオレセイン、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ノッチン、センチリン、およびＤＡＲＰｉｎからなる群から独立して選択され；
特異性を持ってがん細胞に結合する前記リガンドが、葉酸塩、ＤＵＰＡリガンド、ＮＫ－１Ｒリガンド、ＣＡＩＸリガンド、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼのリガンド、ＬＨＲＨＲのリガンド、ＣＤ７３のリガンド、ＨＳＰのリガンド、ｇｌｕｔ－１のリガンド、線維芽細胞活性化タンパク質のリガンド、ＮＫＧ２ＤリガンドおよびＣＣＫＢＲまたはＣＣＫ２リガンドからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記第１のリンカーおよび前記第２のリンカーが、独立して、放出可能または放出不可能である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記第１のリンカーおよび前記第２のリンカーが、Ｃ_１～Ｃ_２０アルキル、アルキレン、ヘテロアルキレン、－Ｏ－アルキニレン、アルケニレン、アシル、アリール、ヘテロアリール、アミド、オキシム、エーテル、エステル、トリアゾール、－Ｓ－Ｓ、－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－Ｓ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、カルボン酸塩、炭酸塩、カルバミン酸塩、尿素、チオ尿素、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロリン、オリゴ－（４－ピペリジン）カルボン酸、オリゴピペリジン、アミノ酸、ペプチド、サッカロペプチド、糖、ペプチドグリカン、ポリビニルピロリドン、プルロニックＦ－１２７、または前述の２つもしくはそれ以上の任意の組合せを独立して含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記第１のリンカー、前記第２のリンカー、または前記第１のリンカーおよび前記第２のリンカーの両方が、ＰＥＧを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

特異性を持ってＣＡＲ Ｔ細胞のＣＡＲに結合する標的化部分とリンカーを介してコンジュゲートされるｔｏｌｌ様受容体７、ｔｏｌｌ様受容体８、またはｔｏｌｌ様受容体７およびｔｏｌｌ様受容体８のアゴニストを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞活性回復コンジュゲートであって、構造：

【化17】

［式中：
Ｒ^１は、アルキル、ハロ、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって場合により置換される、非環状アルキルまたは環状アルキルであり；
Ｒ^２は、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、またはＮ_３（式中：
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立して、水素（Ｈ）、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくはオキソ、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つもしくは複数の置換基によって場合により置換されるアルキルであり；
各Ｒ^Ｚは、独立して、Ｈもしくは場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換される３～１０員の単環式もしくは二環式ヘテロシクロアルキルを形成する）であり；
各Ｒ^３は、独立して、Ｈ、ハロ、－Ｎ_３、－ＣＮ、－ＮＯ_２、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、ヒドロキシ、カルボニル、またはチオールであり、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルまたはアルコキシは、場合により置換され；
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、アルキル、アルコキシ、ハロ、またはシクロアルキルであり、アルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルは場合により置換され；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＮまたはＣＲ^ｑ（式中、各Ｒ^ｑは、独立してＨ、ハロ、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｚは、Ｇ－Ｌ－（式中、Ｌはリンカーであり、Ｇは標的化部分である）であり；
式（Ｉ）のｎは、１～６であり；
式（Ｉ）のｍは、０～４である］
を有するか、もしくはその薬学的に許容される塩であり、または
構造：

【化18】

［式中：
Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシル、アルケニル、アルキニル、脂環式、アリール、ビアリール、ハロ、ヘテロアリール、－ＣＯＲ^２ｘ、

【化19】

（式中、Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙのそれぞれは、Ｈ、－ＯＨ、－ＣＨ_２－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＨ_２－ＮＨ_２、－ＣＯＯＭｅ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＣＨ_３、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂環式、アリール、ビアリール、およびヘテロアリールからなる群から独立して選択される）であり；
Ｚは、Ｇ－Ｌ－（式中、Ｌはリンカーであり、Ｇは標的化部分である）であり；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＣＲ^ｑまたはＮ（式中、各Ｒ^ｑは、独立してＨ、ハロ、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｙは、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、－ＳＲ^ｚ、－ＳＯＲ^ｚ、－ＳＯ_３Ｒ^ｚ、－Ｎ_３、－ＣＯＲ^ｚ、－ＣＯＯＲ^ｚ、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＳＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、または－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２（式中：
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立して水素、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくは場合により置換されるアルキルであり；
各Ｒ^ｚは、独立して水素もしくは場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換されるヘテロシクロアルキルを形成する）であり、
式（ＩＩ）のｎは、０～３０である］
を有するか、またはその薬学的に許容される塩であり、または
構造：

【化20】

［式中：
Ｒ^１は、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって場合により置換される、非環状アルキルまたは環状アルキルであり；
Ｙは、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、－ＳＲ^ｚ、－ＳＯＲ^ｚ、－ＳＯ_３Ｒ^ｚ、－Ｎ_３、－ＣＯＲ^ｚ、－ＣＯＯＲ^ｚ、－ＣＯＮＲ^ｚ _２、－ＣＯＳＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、または－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２（式中：
各Ｒ^Ｚは、独立してＨ、もしくは場合により置換されるアルキルであり；
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立してＨ、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくはオキソ、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つもしくは複数の置換基によって場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換される３～１０員の単環式もしくは二環式ヘテロシクロアルキルを形成する）であり；
各Ｒ^３は、独立して、ハロ、－Ｎ_３、－ＣＮ、－ＮＯ_２、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、ヒドロキシ、カルボニル、またはチオールであり、アルキル、アルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルは、場合により置換され；
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、またはシクロアルキルであり、アルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルは場合により置換され；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＣＲ^ｑまたはＮ（式中、各Ｒ^ｑは、独立して水素、ハロゲン、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｚは、Ｌ－Ｇ－（式中、Ｌはリンカーであり、Ｇは標的化部分である）であり；
式（ＩＩＩ）のｎは、０～３０であり；
式（ＩＩＩ）のｍは、０～４である］
を有するか、もしくはその薬学的に許容される塩であり、
式（Ｉ）、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）のＧは、構造：

【化21】

を有する基であるかもしくはその基を含み、またはその薬学的に許容される塩である、前記ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲート。

【請求項22】

式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）のＸ^１、Ｘ^２、およびＸ^３のそれぞれがＮである、請求項２１に記載のＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲート。

【請求項23】

構造：

【化22】

またはその薬学的に許容される塩を有する、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲート。

【請求項24】

【化23】

［式中、ｎ＝０～２００］
から選択される構造、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩を有する、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲート。

【請求項25】

【化24】

から選択される構造、またはその薬学的に許容される塩を有する、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲート。

【請求項26】

【化25】

から選択される構造を有するか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩である、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲート。

【請求項27】

【化26】

から選択される構造を有するか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩である、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲート。

【請求項28】

【化27】

から選択される構造を有するか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩である、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲート。

【請求項29】

【化28】

から選択される構造を有するか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩である、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲート。

【請求項30】

前記リンカーが、放出可能または放出不可能である、請求項２１に記載のＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲート。

【請求項31】

前記リンカーが、Ｃ_１～Ｃ_２０アルキル、アルキレン、ヘテロアルキレン、－Ｏ－アルキニレン、アルケニレン、アシル、アリール、ヘテロアリール、アミド、オキシム、エーテル、エステル、トリアゾール、カルボン酸塩、炭酸塩、カルバミン酸塩、尿素、チオ尿素、－Ｓ－Ｓ、－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－Ｓ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、ＰＥＧ、ポリプロリン、オリゴ－（４－ピペリジン）カルボン酸、オリゴピペリジン、アミノ酸（例えば、親水性アミノ酸）、ペプチド、サッカロペプチド、糖、ペプチドグリカン、ポリビニルピロリドン、プルロニックＦ－１２７、または前述の２つもしくはそれ以上の任意の組合せを含む、請求項２１または３０に記載のＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲート。

【請求項32】

前記リンカーが、ＰＥＧを含む、請求項２１または３０に記載のＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲート。

【請求項33】

請求項２１～３２のいずれか一項に記載のＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権
本特許出願は、２０２１年８月３０日に出願された米国仮特許出願第６３／２３８３００号の優先権の利益に関連し、それを主張する。上記出願の内容は、その全体が本開示へと参照によって本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）７／８アゴニスト（すなわち、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ７およびＴＬＲ８）を含むコンジュゲート、それらを含む組成物、および消耗したＣＡＲ Ｔ細胞を活性回復させるそれらの使用方法に関する。

【背景技術】

【0003】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞は、造血細胞がんの処置においてかなり有望であることが実証された。しかしながら、固形腫瘍を根絶するそれらの有用性は、増殖の減少およびエフェクター機能障害をもたらす、機能不全または消耗した表現型の発生により危うくなる。

【0004】

上記を考慮して、消耗したＣＡＲ Ｔ細胞を活性回復させる、満たされていない必要性がある。望ましくは、ＣＡＲ Ｔ細胞の活性回復は標的化され、それにより、除外しない場合、健康な細胞に対する毒性を最小にする。

【0005】

消耗したＣＡＲ Ｔ細胞を活性回復させるためのコンジュゲート、組成物、および方法を提供することが、本開示の目的である。このおよび他の目的、ならびに発明の特徴および利点は、本明細書において提供した説明から明らかであろう。

【発明の概要】

【0006】

（ａ）（ｉ）ＣＡＲをコードする核酸配列に作動的に連結されたプロモーターを含むベクターまたは（ｉｉ）ＣＡＲを発現するＴ細胞、および（ｂ）特異性を持ってがん細胞に結合し、第１の標的化部分とコンジュゲートしたリガンドを含むがん結合コンジュゲートによって処置されているがんを有する対象において、消耗したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）－Ｔ細胞を活性回復させる方法が提供される。ＣＡＲは、第１の標的化部分、第２の標的化部分、または第１の標的化部分および第２の標的化部分の両方に結合し、特異性を持ってがん細胞に結合するリガンドおよび第１の標的化部分は、第１のリンカーを介して場合によりコンジュゲートされ得る。方法は、第１の標的化部分または第２の標的化部分とコンジュゲートした、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）、ｔｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）、またはｔｏｌｌ様受容体７およびｔｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ７／８）のアゴニストを含むＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートを対象（例えば、消耗したＣＡＲ Ｔ細胞を有する）に投与するステップであって、アゴニストおよび第１の標的化部分または第２の標的化部分のいずれかが第２のリンカーを介してコンジュゲートされるステップを含み得る。

【0007】

ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0008】

【化1】

［式中：
Ｒ^１は、アルキル、ハロ、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって場合により置換される、非環状アルキルまたは環状アルキルであり；
Ｒ^２は、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、水素（Ｈ）、－ＯＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、またはＮ_３
（式中：
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立して、Ｈ、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくはオキソ、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つもしくは複数の置換基によって場合により置換されるアルキルであり；
各Ｒ^Ｚは、独立して、Ｈもしくは場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換される３～１０員の単環式もしくは二環式ヘテロシクロアルキルを形成する）
であり；
各Ｒ^３は、独立して、Ｈ、ハロ、－Ｎ_３、－ＣＮ、－ＮＯ_２、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、ヒドロキシ、カルボニル、またはチオールであり、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルまたはアルコキシは、場合により置換され；
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、アルキル、アルコキシ、ハロ、またはシクロアルキルであり、アルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルは場合により置換され；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＮまたはＣＲ^ｑ（式中、各Ｒ^ｑは、独立して水素、ハロ、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｚは、Ｇ－Ｌ－（式中、Ｌはリンカー（例えば、第２のリンカー）であり、Ｇは標的化部分（例えば、第１の標的化部分または第２の標的化部分）である）であり；
式（Ｉ）のｎは、１～６であり；
式（Ｉ）のｍは、０～４である］
を有し得るか、またはその薬学的に許容される塩であり得る。

【0009】

ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0010】

【化2】

［式中：
Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシル、アルケニル、アルキニル、脂環式、アリール、ビアリール、ハロ、ヘテロアリール、－ＣＯＲ^２ｘ、

【0011】

【化3】

（式中、Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙのそれぞれは、Ｈ、－ＯＨ、－ＣＨ_２－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＨ_２－ＮＨ_２、－ＣＯＯＭｅ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＣＨ_３、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂環式、アリール、ビアリール、およびヘテロアリールからなる群から独立して選択される）であり；
Ｚは、Ｇ－Ｌ－（式中、Ｌはリンカー（例えば、Ｌは第２のリンカーである）であり、Ｇは標的化部分（例えば、Ｇは第１の標的化部分または第２の標的化部分である）である）であり；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＣＲ^ｑまたはＮ（式中、各Ｒ^ｑは、独立してＨ、ハロ、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｙは、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、－ＳＲ^ｚ、－ＳＯＲ^ｚ、－ＳＯ_３Ｒ^ｚ、－Ｎ_３、－ＣＯＲ^ｚ、－ＣＯＯＲ^ｚ、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＳＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、または－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２（式中：
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立してＨ、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくは場合により置換されるアルキル（例えば、場合により、１つまたは複数の置換基によって置換され、各置換基は独立して、オキソ、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルである）であり；
各Ｒ^ｚは、独立してＨもしくは場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換されるヘテロシクロアルキル（例えば、場合により置換されるヘテロシクロアルキルは単環式または二環式ヘテロシクロアルキルであり、および／または場合により置換されるヘテロシクロアルキルは３～１０員のヘテロシクロアルキルである）を形成する）であり；
式（ＩＩ）のｎは、０～３０である］
を有し得るか、またはその薬学的に許容される塩であり得る。

【0012】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0013】

【化4】

［式中：
Ｒ^１は、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって場合により置換される、非環状アルキルまたは環状アルキルであり；
Ｙは、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、－ＳＲ^ｚ、－ＳＯＲ^ｚ、－ＳＯ_３Ｒ^ｚ、－Ｎ_３、－ＣＯＲ^ｚ、－ＣＯＯＲ^ｚ、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＳＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、または－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２（式中：Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立してＨ、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくは場合により置換されるアルキル（例えば、場合により、１つまたは複数の置換基によって置換され、各置換基は独立して、オキソ、ハロゲン、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルである）であり；
各Ｒ^Ｚは、独立して、Ｈもしくは場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換されるヘテロシクロアルキルを形成する（例えば、場合により置換されるヘテロシクロアルキルは単環式または二環式ヘテロシクロアルキルである、および／または場合により置換されるヘテロシクロアルキルは３～１０員のヘテロシクロアルキルである））であり；
各Ｒ^３は、独立して、ハロ、－Ｎ_３、－ＣＮ、－ＮＯ_２、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、ヒドロキシ、カルボニル、またはチオールであり、アルキル、アルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルは、場合により置換され；
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、またはシクロアルキルであり、アルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルは場合により置換され；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＣＲ^ｑまたはＮ（式中、各Ｒ^ｑは、独立して、Ｈ、ハロゲン、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｚは、Ｌ－Ｇ（式中、Ｌはリンカー（例えば、第２のリンカー）であり、Ｇは標的化部分（例えば、第１の標的化部分または第２の標的化部分）である）であり；
式（ＩＩＩ）のｎは、０～３０であり；
式（ＩＩＩ）のｍは、０～４である］
を有し得るか、またはその薬学的に許容される塩であり得る。

【0014】

使用中、対象中のＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、消耗したＣＡＲ Ｔ細胞）は、Ｔ細胞が、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートのアゴニストによって活性回復するように、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュケートに結合し、エンドサイトーシスすることができる。

【0015】

様々な実施形態では、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）のＸ^１、Ｘ^２、およびＸ^３のそれぞれはＮであり得る。

【0016】

ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0017】

【化5】

を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。あるいは、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0018】

【化6】

を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。

【0019】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートのアゴニストは、ＴＬＲ７／８のアゴニストであり、構造：

【0020】

【化7】

を有するか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩である。

【0021】

第１の標的化部分、第２の標的化部分、または第１の標的化部分および第２の標的化部分の両方は、構造：

【0022】

【化8】

を有する基であり得るか、またはその基を含み得る。

【0023】

あるいは、第１の標的化部分、第２の標的化部分、または第１の標的化部分および第２の標的化部分の両方は、構造：

【0024】

【化9】

を有する基であり得るか、またはその基を含み得る。

【0025】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0026】

【化10】

を有し得るか、またはその薬学的に許容される塩であり得る。あるいは、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0027】

【化11】

［式中、ｎ＝０～２００である］
を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。

【0028】

さらに代替的には、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0029】

【化12】

を有し得るか、またはその薬学的に許容される塩であり得る。またさらに、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0030】

【化13】

から選択される構造を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0031】

【化14】

から選択される構造を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0032】

【化15】

から選択される構造を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0033】

【化16】

から選択される構造を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。

【0034】

特異性を持ってがん細胞に結合するリガンドは、葉酸塩、５－メチルテトラヒドロ葉酸、２－［３－（１，３－ジカルボキシプロピル）ウレイド］ペンタン二酸（ＤＵＰＡ）リガンド、ニューロキニン１受容体（ＮＫ－１Ｒ）リガンド、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）リガンド、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼのリガンド、黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨＲ）のリガンド、ＣＤ７３のリガンド、線維芽細胞活性化タンパク質のリガンド、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のリガンド、グルコーストランスポーター１（ｇｌｕｔ－１）のリガンド、ナチュラルキラーグループ２Ｄ受容体（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、およびコレシストキニンＢ受容体（ＣＣＫＢＲまたはＣＣＫ２）リガンドからなる群から選択され得る。

【0035】

第１の標的化部分および第２の標的化部分は、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、Ｌ－ラムノース、タクロリムス（ＦＫ５０６）、２，４，６－トリニトロフェノール（ＴＮＰ）、ビオチン、ラパマイシン、ジゴキシゲニン、葉酸塩、５－メチルテトラヒドロ葉酸、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＮＨＳ－フルオレセイン、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ノッチン、センチリン、およびＤＡＲＰｉｎからなる群から独立して選択され得る。

【0036】

ある特定の実施形態では、第１の標的化部分および第２の標的化部分は、ＤＮＰ、ＦＫ５０６、ＴＮＰ、ビオチン、ラパマイシン、ジゴキシゲニン、葉酸塩、５－メチルテトラヒドロ葉酸、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＮＨＳ－フルオレセイン、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ノッチン、センチリン、およびＤＡＲＰｉｎからなる群から独立して選択され；特異性を持ってがん細胞に結合するリガンドは、葉酸塩、ＤＵＰＡリガンド、ＮＫ－１Ｒリガンド、ＣＡＩＸリガンド、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼのリガンド、ＬＨＲＨＲのリガンド、ＣＤ７３のリガンド、ＨＳＰのリガンド、ｇｌｕｔ－１のリガンド、線維芽細胞活性化タンパク質のリガンド、ＮＫＧ２ＤリガンドおよびＣＣＫＢＲまたはＣＣＫ２リガンドからなる群から選択される。

【0037】

第１のリンカーおよび第２のリンカーは、独立して、放出可能または放出不可能であってもよい。第１のリンカーおよび第２のリンカーは、Ｃ_１～Ｃ_２０アルキル、アルキレン、ヘテロアルキレン、－Ｏ－アルキニレン、アルケニレン、アシル、アリール、ヘテロアリール、アミド、オキシム、エーテル、エステル、トリアゾール、－Ｓ－Ｓ、－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－Ｓ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、カルボン酸塩、炭酸塩、カルバミン酸塩、尿素、チオ尿素、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧ_ｎ、ｎ＝１～２００）、ポリプロリン、オリゴ－（４－ピペリジン）カルボン酸、オリゴピペリジン、アミノ酸（例えば、親水性アミノ酸）、ペプチド、サッカロペプチド、糖、ペプチドグリカン（例えば、非天然ペプチドグリカン）、ポリビニルピロリドン、プルロニックＦ－１２７、または前述の２つもしくはそれ以上の任意の組合せを独立して含み得る。第１のリンカー、第２のリンカー、または第１のリンカーおよび第２のリンカーの両方が、ＰＥＧを含み得る。

【0038】

特異性を持ってＣＡＲ Ｔ細胞のＣＡＲに結合する標的化部分とリンカーを介してコンジュゲートされるＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ７／８のアゴニストを含むＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートであって、構造：

【0039】

【化17】

［式中：
Ｒ^１は、アルキル、ハロ、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって場合により置換される、非環状アルキルまたは環状アルキルであり；
Ｒ^２は、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、またはＮ_３（式中：
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立して、水素、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくはオキソ、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって場合により置換されるアルキルであり；
各Ｒ^Ｚは、独立して、Ｈもしくは場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換される３～１０員の単環式もしくは二環式ヘテロシクロアルキルを形成する）であり、
各Ｒ^３は、独立して、Ｈ、ハロ、－Ｎ_３、－ＣＮ、－ＮＯ_２、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、ヒドロキシ、カルボニル、またはチオールであり、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルまたはアルコキシは、場合により置換され；
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、アルキル、アルコキシ、ハロ、またはシクロアルキルであり、アルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルは場合により置換され；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＮまたはＣＲ^ｑ（式中、各Ｒ^ｑは、独立してＨ、ハロ、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｚは、Ｇ－Ｌ－（式中、Ｌはリンカーであり、Ｇは標的化部分である）であり；
式（Ｉ）のｎは、１～６であり；
式（Ｉ）のｍは、０～４である］
を有するか、もしくはその薬学的に許容される塩であり、または
構造：

【0040】

【化18】

［式中：
Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシル、アルケニル、アルキニル、脂環式、アリール、ビアリール、ハロ、ヘテロアリール、－ＣＯＲ^２ｘ、

【0041】

【化19】

（式中、Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙのそれぞれは、Ｈ、－ＯＨ、－ＣＨ_２－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＨ_２－ＮＨ_２、－ＣＯＯＭｅ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＣＨ_３、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂環式、アリール、ビアリール、およびヘテロアリールからなる群から独立して選択される）であり；
Ｚは、Ｇ－Ｌ－（式中、Ｌはリンカーであり、Ｇは標的化部分である）であり；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＣＲ^ｑまたはＮ（式中、各Ｒ^ｑは、独立してＨ、ハロ、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｙは、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、－ＳＲ^ｚ、－ＳＯＲ^ｚ、－ＳＯ_３Ｒ^ｚ、－Ｎ_３、－ＣＯＲ^ｚ、－ＣＯＯＲ^ｚ、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＳＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、または－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２（式中：
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立してＨ、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくは場合により置換されるアルキル（例えば、場合により、１つまたは複数の置換基によって置換され、各置換基は独立して、オキソ、ハロゲン、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルである）であり；
各Ｒ^ｚは、独立して水素もしくは場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換されるヘテロシクロアルキル（例えば、場合により置換されるヘテロシクロアルキルは単環式または二環式ヘテロシクロアルキルであり、および／または場合により置換されるヘテロシクロアルキルは３～１０員のヘテロシクロアルキルである）を形成する）であり、
式（ＩＩ）のｎは、０～３０である］
を有するか、もしくはその薬学的に許容される塩であり、または
構造：

【0042】

【化20】

［式中：
Ｒ^１は、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって場合により置換される、非環状アルキルまたは環状アルキルであり；
Ｙは、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、－ＳＲ^ｚ、－ＳＯＲ^ｚ、－ＳＯ_３Ｒ^ｚ、－Ｎ_３、－ＣＯＲ^ｚ、－ＣＯＯＲ^ｚ、－ＣＯＮＲ^ｚ _２、－ＣＯＳＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、または－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２（式中：
各Ｒ^Ｚは、独立してＨ、もしくは場合により置換されるアルキルであり；
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立してＨ、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、またはオキソ、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つもしくは複数の置換基によって場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換される３～１０員の単環式もしくは二環式ヘテロシクロアルキルを形成する）であり、
各Ｒ^３は、独立して、ハロ、－Ｎ_３、－ＣＮ、－ＮＯ_２、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、ヒドロキシ、カルボニル、またはチオールであり、アルキル、アルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルは、場合により置換され；
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、またはシクロアルキルであり、アルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルは場合により置換され；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＣＲ^ｑまたはＮ（式中、各Ｒ^ｑは、独立してＨ、ハロゲン、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｚは、Ｌ－Ｇ（式中、Ｌはリンカーであり、Ｇは標的化部分である）であり；
式（ＩＩＩ）のｎは、０～３０であり；
式（ＩＩＩ）のｍは、０～４である］
を有するか、もしくはその薬学的に許容される塩であり、
式（Ｉ）、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）のＧは、構造：

【0043】

【化21】

を有する基であるかもしくはその基を含み、またはその薬学的に許容される塩である、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートも提供される。様々な実施形態では、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）のＸ^１、Ｘ^２、およびＸ^３のそれぞれは窒素（Ｎ）であり得る。

【0044】

ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートの標的化部分は、ＤＮＰ、Ｌ－ラムノース、ＦＫ５０６、ＴＮＰ、ビオチン、ラパマイシン、ジゴキシゲニン、葉酸塩、５－メチルテトラヒドロ葉酸、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＮＨＳ－フルオレセイン、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ノッチン、センチリン、およびＤＡＲＰｉｎからなる群から選択され得る。

【0045】

ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートのリンカーは、放出可能であり得る。ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートのリンカーは、放出不可能であり得る。リンカーは、Ｃ_１～Ｃ_２０アルキル、アルキレン、ヘテロアルキレン、－Ｏ－アルキニレン、アルケニレン、アシル、アリール、ヘテロアリール、アミド、オキシム、エーテル、エステル、トリアゾール、－Ｓ－Ｓ、－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－Ｓ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、カルボン酸塩、炭酸塩、カルバミン酸塩、尿素、チオ尿素、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ_ｎ、ｎ＝１～２００）、ポリプロリン、オリゴ－（４－ピペリジン）カルボン酸、オリゴピペリジン、アミノ酸（例えば、親水性アミノ酸）、ペプチド、サッカロペプチド、糖、ペプチドグリカン（例えば、非天然ペプチドグリカン）、ポリビニルピロリドン、プルロニックＦ－１２７、または前述の２つもしくはそれ以上の任意の組合せを含み得る。リンカーは、ＰＥＧを含み得る。

【0046】

ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0047】

【化22】

を有し得るか、またはその薬学的に許容される塩であり得る。ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0048】

【化23】

［式中、ｎ＝０～２００］
から選択される構造を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0049】

【化24】

から選択される構造を有し得るか、またはその薬学的に許容される塩であり得る。またさらに代替的には、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0050】

【化25】

から選択される構造を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。

【0051】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0052】

【化26】

から選択される構造を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩である。ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートの他の構造は、

【0053】

【化27】

から選択される構造を含み、前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。またさらに、ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0054】

【化28】

から選択される構造を含み得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。

【0055】

医薬組成物も提供される。組成物は、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含み得る。

【0056】

本開示の実施形態および本明細書に含有される他の特徴、利点、および態様、ならびにそれらを達成することは、本開示の様々な例示的な実施形態の以下の詳細な説明に照らして明らかになるであろう。そのような詳細な説明は、添付の図面と併せるとより理解されるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0057】

【図1】図１Ａは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の活性回復戦略の図示である。図１Ａは、アダプター化合物の存在下でのＣＡＲ Ｔ細胞の細胞死滅効果を示す図である。図１Ｂは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の活性回復戦略の図示である。図１Ｂは、標的化された活性回復化合物の存在下でのＣＡＲ Ｔ細胞の活性回復を示す図である。

【図2】図２Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏで選択的にＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化する、抗フルオレセインＣＡＲおよびフルオレセイン－Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）７ａコンジュゲートを用いるＣＡＲ Ｔ細胞活性回復戦略の実施形態の図示である。図２Ａは、フルオレセイン－葉酸塩コンジュゲート（「がん死滅」コンジュゲートの実施形態）の、葉酸受容体発現腫瘍を有する対象への投与時に、「がん死滅」コンジュゲートが、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、抗フルオレセイン細胞表面受容体を有するＣＡＲ Ｔ細胞）と葉酸受容体発現がん細胞の間に架橋を形成し、がん細胞の死滅およびＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を促進したことを示す。図２Ｂは、ｉｎ ｖｉｖｏで選択的にＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化する、抗フルオレセインＣＡＲおよびフルオレセインＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）７ａコンジュゲートを用いるＣＡＲ Ｔ細胞活性回復戦略の実施形態の図示である。図２Ｂは、フルオレセイン－ＴＬＲ７ａコンジュゲート（「活性回復」コンジュゲートの実施形態）の、葉酸受容体発現腫瘍を有する対象への投与時に、「活性回復」コンジュゲートが、ＣＡＲ Ｔ細胞の表面上の同じ抗フルオレセイン受容体に結合し、それにより、ＣＡＲ Ｔ細胞によるＴＬＲ７ａのエンドサイトーシスおよびＣＡＲ－Ｔ細胞の活性回復を可能にすることを示す。図２Ｂの凡例は、図２Ａと図２Ｂの両方の図示に適用される。

【図3-1】図３Ａは、フルオレセインコンジュゲート蛍光色素が、抗フルオレセインＣＡＲ発現Ｔ細胞にのみ結合することを支持する図である。図３Ａは、フルオレセイン－近赤外線（ＮＩＲ）色素コンジュゲート（フルオレセイン－ＮＩＲ色素またはフルオレセイン－Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７のいずれか）が、１０００倍過剰なフルオレセインの添加により定量的にブロックされ得る方法で、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞に結合したことを実証する。フローサイトメトリーは、フルオレセイン－ＮＩＲ色素コンジュゲート（１０ｎＭ）の不在下（青いヒストグラム）もしくは存在下（緑のヒストグラム）、またはフルオレセイン－色素コンジュゲートと１０００倍過剰なフルオレセインの両方の存在下（マゼンタのヒストグラム）での抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞で実施した。図３Ｂは、フルオレセインコンジュゲート蛍光色素が、抗フルオレセインＣＡＲ発現Ｔ細胞にのみ結合することを支持する図である。図３Ｂは、ＣＡＲ陰性細胞株、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞およびＫＢ細胞が、フルオレセイン－色素コンジュゲート（１０ｎＭ）の結合部位を発現しなかったことを実証する。

【図3-2】図３Ｃは、フルオレセインコンジュゲート蛍光色素が、抗フルオレセインＣＡＲ発現Ｔ細胞にのみ結合することを支持する図である。図３Ｃは、まず４℃で１時間インキュベートしたＣＡＲ Ｔ細胞による、フルオレセイン－Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートの内部移行の共焦点顕微鏡評価を示す。横棒＝１０μｍ。図３Ｄは、フルオレセインコンジュゲート蛍光色素が、抗フルオレセインＣＡＲ発現Ｔ細胞にのみ結合することを支持する図である。図３Ｄは、図３Ｃからの細胞が続いて４時間、３７℃に移行された後、ＣＡＲ Ｔ細胞による、フルオレセイン－Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートの内部移行の共焦点顕微鏡評価を示す。横棒＝１０μｍ。

【図4-1】図４Ａは、異なる濃度のＴＬＲ７－５４またはＴＬＲ７－１ａアゴニストのいずれかの投与時の、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。図４Ａは、フローサイトメトリーによって測定した漸増濃度のＴＬＲ－５４またはＴＬＲ７－１ａの不在下または存在下で、単離されたヒト末梢血ＣＤ３＋Ｔ細胞が抗ＣＤ３＋ｍＡｂによって刺激された後、ＣＤ６９＋細胞のパーセント増加を示す。データは、ベースラインレベル（すなわち、ビヒクル（ＤＭＳＯ処置））を超えるこれらのパラメーターの増加を示す。棒グラフは、平均±標準偏差（ＳＤ）、ｎ＝３を表す。図４Ｂは、異なる濃度のＴＬＲ７－５４またはＴＬＲ７－１ａアゴニストのいずれかの投与時の、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。図４Ｂは、フローサイトメトリーによって測定した漸増濃度のＴＬＲ－５４またはＴＬＲ７－１ａの不在下または存在下で、単離されたヒト末梢血ＣＤ３＋Ｔ細胞が抗ＣＤ３＋モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によって刺激された後、ＣＤ２５＋細胞のパーセント増加を示す。データは、ベースラインレベル（すなわち、ビヒクル（ＤＭＳＯ処置））を超えるこれらのパラメーターの増加を示す。棒グラフは、平均±標準偏差（ＳＤ）、ｎ＝３を表す。

【図4-2】図４Ｃは、異なる濃度のＴＬＲ７－５４またはＴＬＲ７－１ａアゴニストのいずれかの投与時の、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。図４Ｃは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した、刺激したＴ細胞の２４時間での無細胞上清中のインターフェロンガンマ（ＩＮＦ－γ）のレベルを示す。データは、ベースラインレベル（すなわち、ビヒクル（ＤＭＳＯ処置））を超えるこれらのパラメーターの増加を示す。棒グラフは、平均±標準偏差（ＳＤ）、ｎ＝３を表す。図４Ｄは、異なる濃度のＴＬＲ７－５４またはＴＬＲ７－１ａアゴニストのいずれかの投与時の、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。図４Ｄは、ＥＬＩＳＡによって測定した、刺激したＴ細胞の２４時間での無細胞上清中の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）のレベルを示す。データは、ベースラインレベル（すなわち、ビヒクル（ＤＭＳＯ処置））を超えるこれらのパラメーターの増加を示す。棒グラフは、平均±標準偏差（ＳＤ）、ｎ＝３を表す。

【図5-1】図５Ａは、ｉｎ ｖｉ（ＴＲｏでのＣＡＲ Ｔ細胞消耗への、ＣＡＲ Ｔ細胞標的化および非標的化ＴＬＲ７－１ａアゴニストの効果を示す図である。図５Ａは、培養中の新しいＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳がん細胞への、１２時間毎のＣＡＲ Ｔ細胞の連続移行を含む、ＣＡＲ Ｔ細胞消耗の誘導のためのプロトコールを示す。図５Ｂは、ｉｎ ｖｉ（ＴＲｏでのＣＡＲ Ｔ細胞消耗への、ＣＡＲ Ｔ細胞標的化および非標的化ＴＬＲ７－１ａアゴニストの効果を示す図である。図５Ｂは、３ラウンドの連続移行後、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を死滅させる抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞の能力の減少を示す。図５Ｃは、ｉｎ ｖｉ（ＴＲｏでのＣＡＲ Ｔ細胞消耗への、ＣＡＲ Ｔ細胞標的化および非標的化ＴＬＲ７－１ａアゴニストの効果を示す図である。図５Ｃは、３ラウンドの連続移行後、Ｔ細胞消耗マーカー（プログラム細胞死タンパク質（ＰＤ－１^＋）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有－３（ＴＩＭ３^＋）、およびリンパ球活性化３（ＬＡＧ３^＋））の発現の増加を示す。

【図5-2】図５Ｄは、ｉｎ ｖｉ（ＴＲｏでのＣＡＲ Ｔ細胞消耗への、ＣＡＲ Ｔ細胞標的化および非標的化ＴＬＲ７－１ａアゴニストの効果を示す図である。図５Ｄは、標的化または非標的化ＴＬＲ７－１ａとのインキュベーション後、培養中のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を死滅させる抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞の能力の回復を示す。データは、ベースラインレベル（すなわち、ビヒクル（ＤＭＳＯ処置））を超えるこれらのマーカーの変化を示す。棒グラフは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。図５Ｅは、ｉｎ ｖｉ（ＴＲｏでのＣＡＲ Ｔ細胞消耗への、ＣＡＲ Ｔ細胞標的化および非標的化ＴＬＲ７－１ａアゴニストの効果を示す図である。図５Ｅは、活性回復した抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞による、細胞表面消耗マーカーの発現の減少を示す。データは、ベースラインレベル（すなわち、ビヒクル（ＤＭＳＯ処置））を超えるこれらのマーカーの変化を示す。棒グラフは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。

【図6-1】図６Ａは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍およびＫＢ腫瘍の増殖および免疫特性への、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞療法の効果を示す図である。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスは、４００万個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞および１００万個のＫＢ細胞を同じマウスの別の脇腹に移植し、２週間後に、生理食塩水または８×１０^６個の抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを注入した（すなわち、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍およびＫＢ腫瘍が、それぞれ、～１６０または８０ｍｍ^３に到達した場合（すなわち、それらの異なる増殖率を調整するため））。ＣＡＲ Ｔ細胞注入の４および２４時間後、全てのマウスに、５００ｎｍｏｌ／ｋｇのフルオレセイン－葉酸塩を静脈内注射し、この注射は、その後、１回／週で繰り返した。図６Ａは、未処置のまま（点線）または抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞とフルオレセイン－葉酸塩二重特異性アダプターの両方による処置（実線）のいずれかのコホートの腫瘍容積を示す。図６Ｂは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍およびＫＢ腫瘍の増殖および免疫特性への、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞療法の効果を示す図である。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスは、４００万個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞および１００万個のＫＢ細胞を同じマウスの別の脇腹に移植し、２週間後に、生理食塩水または８×１０^６個の抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを注入した（すなわち、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍およびＫＢ腫瘍が、それぞれ、～１６０または８０ｍｍ^３に到達した場合（すなわち、それらの異なる増殖率を調整するため））。ＣＡＲ Ｔ細胞注入の４および２４時間後、全てのマウスに、５００ｎｍｏｌ／ｋｇのフルオレセイン－葉酸塩を静脈内注射し、この注射は、その後、１回／週で繰り返した。図６Ｂは、腫瘍が切除され、フローサイトメトリーによる解析の前に、腫瘍解離キットを使用して、がん細胞および間質細胞の両方が放出された場合、１８日目のＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ（腫瘍中の全細胞のパーセンテージとして）を示す。図６Ｃは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍およびＫＢ腫瘍の増殖および免疫特性への、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞療法の効果を示す図である。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスは、４００万個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞および１００万個のＫＢ細胞を同じマウスの別の脇腹に移植し、２週間後に、生理食塩水または８×１０^６個の抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを注入した（すなわち、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍およびＫＢ腫瘍が、それぞれ、～１６０または８０ｍｍ^３に到達した場合（すなわち、それらの異なる増殖率を調整するため））。ＣＡＲ Ｔ細胞注入の４および２４時間後、全てのマウスに、５００ｎｍｏｌ／ｋｇのフルオレセイン－葉酸塩を静脈内注射し、この注射は、その後、１回／週で繰り返した。図６Ｃは、腫瘍が切除され、フローサイトメトリーによる解析の前に、腫瘍解離キットを使用して、がん細胞および間質細胞の両方が放出された場合、１８日目の消耗マーカーＰＤ－１＋およびＴＩＭ３＋（全てのヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージとして）を示す。

【図6-2】図６Ｄは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍およびＫＢ腫瘍の増殖および免疫特性への、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞療法の効果を示す図である。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスは、４００万個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞および１００万個のＫＢ細胞を同じマウスの別の脇腹に移植し、２週間後に、生理食塩水または８×１０^６個の抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを注入した（すなわち、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍およびＫＢ腫瘍が、それぞれ、～１６０または８０ｍｍ^３に到達した場合（すなわち、それらの異なる増殖率を調整するため））。ＣＡＲ Ｔ細胞注入の４および２４時間後、全てのマウスに、５００ｎｍｏｌ／ｋｇのフルオレセイン－葉酸塩を静脈内注射し、この注射は、その後、１回／週で繰り返した。図６Ｄは、腫瘍が切除され、フローサイトメトリーによる解析の前に、腫瘍解離キットを使用して、がん細胞および間質細胞の両方が放出された場合、１８日目のＣＤ２０６＋ Ｆ４／８０＋ ＣＤ１１ｂ＋骨髄性細胞に対するＣＤ８６＋ Ｆ４／８０＋ ＣＤ１１ｂ＋の比を示す。ｎ＝５匹のマウス／群。全てのデータは、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって解析し、平均±ＳＥＭとしてプロットした（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１）。示したデータは、２つの独立した実験の提示である。図６Ｅは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍およびＫＢ腫瘍の増殖および免疫特性への、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞療法の効果を示す図である。ＮＯＤ ＳＣＩＤガンマ（ＮＳＧ）マウスは、４００万個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞および１００万個のＫＢ細胞を同じマウスの別の脇腹に移植し、２週間後に、生理食塩水または８×１０^６個の抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞のいずれかを注入した（すなわち、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍およびＫＢ腫瘍が、それぞれ、～１６０または８０ｍｍ^３に到達した場合（すなわち、それらの異なる増殖率を調整するため））。ＣＡＲ Ｔ細胞注入の４および２４時間後、全てのマウスに、５００ｎｍｏｌ／ｋｇのフルオレセイン－葉酸塩を静脈内注射し、この注射は、その後、１回／週で繰り返した。図６Ｅは、ＭＤＡ－ＭＢ２３１およびＫＢ細胞固形腫瘍へのヒトＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤を示す代表的な画像を示す。横棒＝２００μｍ。

【図7】図７は、フルオレセインコンジュゲート蛍光色素（フルオレセイン－ＮＩＲ色素）が、ｉｎ ｖｉｖｏで、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞に特異的に標的化されることを示す図である。ＮＳＧマウスは、一方の脇腹に１００万個のＫＢ細胞を移植し、ＫＢ腫瘍容積が、～５０ｍｍ^３に達すると、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞（～５０％の抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞を含有する８×１０^６個の細胞）を注入した。５００ｎｍｏｌ／ｋｇのフルオレセイン－葉酸塩を、４時間後と２４時間後の両方、およびその後、１回／週で再び注入した。ＣＡＲ Ｔ細胞注入の１５日後、マウスに５００ｎｍｏｌ／ｋｇのフルオレセイン－ＮＩＲ色素を尾静脈注射し、４時間後に腫瘍を解離し、フルオレセイン－ＮＩＲ色素の取込みについてフローサイトメトリーによって解析した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＡＰＣ－Ｃｙ７チャネルで抗ヒトＣＤ３によって検出し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）－トランスフェクト抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞を、ＧＦＰチャネルを使用して検出した。

【図8-1】図８Ａ～図８Ｆは、フルオレセイン－ＴＬＲ７－１ａコンジュゲートの静脈注射後の、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞の活性回復を示す図である。図８Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏ研究のためのスキームを示す図である。マウスは、１０^６個のＫＢ細胞を－７日目に皮下注射し、８×１０^６個の抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞を１日目に注入した。６時間、２４時間および９日後、マウスにフルオレセイン－葉酸塩を静脈内注射し、葉酸受容体陽性ＫＢがん細胞とＣＡＲ Ｔ細胞の結合を誘導した。次いで、４～７日目および１１～１４日目に、マウスに、フルオレセイン－ＴＬＲ７－１ａを静脈内注射した。腫瘍容積（図８Ｂ）および動物の体重変化（図８Ｃ）を３日毎に測定した。腫瘍を切除し、１６日目に成分細胞へと解離し、ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞を、図８Ｄの全ての腫瘍細胞のパーセンテージとして決定した。全てのヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞のパーセンテージとしてＰＤ－１^＋ＴＩＭ３^＋細胞を図８Ｅに示し、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞処置群において骨髄マーカーＦ４／８０およびＣＤ１１ｂも発現するＣＤ２０６^＋細胞に対するマウスＣＤ８６^＋細胞の比を、図８Ｆに示す。全てのデータは、平均±ＳＥＭとしてプロットする。示したデータは、少なくとも２つの独立した実験の提示である。データは、二元配置ＡＮＯＶＡによって解析した（^＊＊ｐ＜０．０１；ｎ．ｓ．、顕著ではない）。

【図8-2】（上記の通り。）

【図8-3】（上記の通り。）

【発明を実施するための形態】

【0058】

本開示は、様々な改変および変更形態を許容するが、それらの例示的な実施形態は、図面の例により示され、本明細書に詳細に記載される。

【0059】

本開示は、消耗されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の活性回復を目的とする。活性回復は、細胞増殖を増加させ、エフェクター機能障害を回復させ、それにより、活性回復したＣＡＲ Ｔ細胞を固形腫瘍の根絶に有用にする。

【0060】

ＣＡＲ－Ｔ細胞は、機能不全になるかもしくは「消耗し」得、または腫瘍微小環境において、腫瘍抗原もしくは免疫抑制因子（例えば、骨髄由来抑制性細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、制御性Ｔ細胞（（ＴＲｅｇ）、および抑制性サイトカイン）に慢性的に曝露されると、増殖の減少が生じ得る。これらの問題を解決するため、少なくとも１つの実施形態では、ＣＡＲの一部である認識領域（例えばｓｃＦＶ断片）のエンドサイトーシスが利用され、活性回復化合物もしくはコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩をＣＡＲ－Ｔ細胞に送達する。

【0061】

活性回復コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩は、標的化部分（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＡＲを選択的に結合する）に、リンカーを介してコンジュゲートされたＣＡＲ Ｔ細胞活性回復のための活性剤を含む。Ｔ細胞活性回復コンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩は、消耗したＣＡＲ－Ｔ細胞を活性回復させるように製剤化された化合物、薬物または活性剤であり得る。「ＣＡＲ－Ｔ細胞活性回復」およびそのバリアントは、ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化すること、ＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を増加させること、消耗したもしくは機能不全ＣＡＲ－Ｔ細胞の阻害シグナル伝達をブロックすること、抗原非依存的な経路によりＣＡＲ－Ｔ細胞を再活性化すること、またはその他のＣＡＲ－Ｔ細胞の機能を増加させることを意味する。本コンジュゲートの実施形態は、Ｔ細胞消耗または機能不全、増殖の減少、および腫瘍微小環境によって誘導された同様の状況を防止または逆転することに特に有用であり得る。様々な実施形態では、活性回復化合物、またはその薬学的に許容される塩は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト（例えば、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ７およびＴＬＲ８（ＴＬＲ７／８のアゴニスト））からなる群から選択される。

【0062】

上記のように、Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、標的化部分をさらに含む。標的化部分は、ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＡＲに選択的に結合し得る。用語「選択的に結合する（selectively binds）」、「特異性を持って結合する（binds with specificity）」、「高親和性で結合する（binds with high affinity）」、または「特異的に結合する（specifically binds）」とは、リガンド／受容体、認識領域／標的化部分、または他の結合対に関する場合、タンパク質の異種性集団および他の生物製剤におけるタンパク質の存在を決定する結合反応を示す。したがって、指定した条件下で、特定したリガンドまたは標的化部分は、それぞれ特定の受容体（例えば、がん細胞に存在するもの）または標的化部分（例えば、ＣＡＲ認識領域に存在するもの）に結合し、試料（例えば、正常、健常細胞と関連するもの）中に存在する他のタンパク質に多量には結合しない。特異的結合または特異性を持ったもしくは高親和性での結合は、例えば、結合部分またはリガンドが、任意の他の受容体との親和性よりも、多くは少なくとも２５％高い、より多くは少なくとも５０％高い、最も多くは少なくとも１００％（２倍）高い、一般的には少なくとも１０倍高い、より一般的には少なくとも２０倍高い、最も一般的には少なくとも１００倍高い親和性でその標的に結合することも意味し得る。

【0063】

ある特定の実施形態では、本明細書のコンジュゲートは、「がん死滅」化合物と組み合わせて投与された場合、適用に有用であり得る。図１Ａは、ＣＡＲ Ｔ細胞をがん細胞に結合する「がん死滅」コンジュゲート（「がん死滅」は、容易に参照できるように本明細書において使用され、「活性回復」から区別される）の存在下でのＣＡＲ Ｔ細胞の細胞死滅効果を示す。図１Ｂは、ＣＡＲ Ｔ細胞の受容体、例えばフルオレセイン受容体に結合する活性回復化合物を含む、がん死滅コンジュゲートおよび「活性回復」コンジュゲートの存在下でのＣＡＲ Ｔ細胞の活性回復を示す。

【0064】

図２Ａは、フルオレセイン－葉酸塩コンジュゲート（「がん死滅」コンジュゲートの実施形態）の、葉酸受容体発現腫瘍および抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞（すなわち、抗フルオレセイン細胞表面受容体を有するＣＡＲ Ｔ細胞）を有する対象への投与時に、「がん死滅」コンジュゲートが、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞と葉酸受容体発現がん細胞の間に架橋を形成することができ、それががん細胞の死滅およびＣＡＲ Ｔ細胞の増殖を促進することを示す。フルオレセイン受容体は、本明細書において、様々な実施形態および例で言及されるが、ＣＡＲ Ｔ細胞の他の受容体が、本明細書の活性回復コンジュゲートによって標的化および／または結合され得ることが理解されるであろう。図２Ｂは、フルオレセイン－ＴＬＲ７ａコンジュゲート（「活性回復」コンジュゲートの実施形態）の、葉酸受容体発現腫瘍および消耗した抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞を有する対象への投与時に、「活性回復」コンジュゲートが、ＣＡＲ Ｔ細胞の表面の抗フルオレセイン受容体に結合し、活性回復コンジュゲートがＣＡＲ Ｔ細胞によってエンドサイトーシスされ、それによりＣＡＲ Ｔ細胞の活性回復をもたらすことを示す。

【0065】

上記を考慮して、ＣＡＲ Ｔ細胞療法によって処置されるがんを有する対象における、消耗したＣＡＲ Ｔ細胞の活性回復の方法が提供される。ＣＡＲ Ｔ細胞は、細胞傷害性リンパ球、例えば細胞傷害性Ｔ細胞であり得る。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＮＫ細胞と関連して使用され得る。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞と関連して使用され得る。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞、および／またはＴ細胞の組合せと関連して使用され得る。様々な操作した細胞療法が、現在、当技術分野で公知であり、ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、がんを処置または防止するために有用であり、本明細書のＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートと関連する使用から利益を得る、任意の現在公知のまたは以下に発見した操作した細胞または細胞療法を含み得ることが理解されるであろう。

【0066】

ある特定の実施形態では、操作した細胞は、前駆細胞または幹細胞から調製したＮＫ細胞である。ある特定の実施形態では、操作した細胞は、前駆細胞または幹細胞から調製したＴ細胞である。

【0067】

少なくとも１つの実施形態では、Ｔリンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）は、ＣＡＲを発現するように操作される。少なくとも１つの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＡＲを発現するように操作される。

【0068】

ＣＡＲは、認識領域、共刺激ドメイン、および活性化シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、高い特異性で免疫抑制細胞または癌細胞の細胞表面抗原に結合する。

【0069】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲの認識領域は、特異性（例えば、高い特異性）を持って細胞表面抗原（例えば、表面抗原分類１９（ＣＤ１９））に結合する、抗体のｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片等であり得る。ＣＡＲの認識領域が、ｓｃＦｖ領域を含む場合、ｓｃＦｖ領域は、（ｉ）標的部分に結合する当技術分野で公知の抗体、（ｉｉ）ハプテンのような、少なくとも１つの標的化部分を使用して新しく調製された抗体、および（ｉｉｉ）そのような抗体のｓｃＦｖ領域、例えば、それらが由来するｓｃＦｖ領域のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するｓｃＦｖ領域由来の配列バリアントから調製され得る。

【0070】

「パーセント（％）配列同一性」は、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列への言及に関して、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成し、配列同一性の一部として任意の保存置換を考慮しないように配列をアラインし、ギャップを導入した後、参照配列の残基と同一である候補配列のそれぞれアミノ酸または核酸残基のパーセンテージとして規定される。パーセント配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、例えば、公に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当技術分野内の様々な方法で達成され得る。例えば、配列間のパーセント同一性または類似性の決定は、例えばＧＡＰプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、ソフトウェア；Ａｃｃｅｌｒｙｓオンラインを介して現在利用可能である）を使用することによって行われてもよく、アライメントは、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（ＶＮＴＩソフトウェア、ＩｎｆｏｒＭａｘ Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を使用して行われてもよい。さらに、配列データベースは、目的の核酸またはアミノ酸配列を使用して検索することができる。データベース検索のためのアルゴリズムは、典型的には、ＢＬＡＳＴソフトウェアに基づくが、当業者は、比較される配列の全長にわたる最大アライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインするための適切なパラメーターを決定することができる。一部の実施形態では、パーセント同一性は、核酸またはアミノ酸配列の全長にそって決定され得る。

【0071】

ある特定の実施形態では、活性化シグナル伝達ドメインは、標的化部分へのＣＡＲの結合時に、リンパ球活性化シグナルを生成する。好適な活性化シグナル伝達ドメインとしては、限定されるものではないが、Ｔ細胞ＣＤ３鎖、ＣＤ３デルタ受容体タンパク質、ｍｂｌ受容体タンパク質、Ｂ２９受容体タンパク質、Ｆｃ受容体γ、４－１ＢＢドメイン、ＣＤ２８活性化ドメイン、またはＩＬ－１５／ＩＬ－２ドメインであり得る。当業者は、バリアントが、モデルとするドメインと同じまたは類似の活性を有する場合、これらの活性化シグナル伝達ドメインの配列バリアントが使用され得ることを理解するであろう。様々な実施形態では、そのようなバリアントは、それらが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する。

【0072】

ＣＡＲをコードする構築物は、遺伝子工学技術を使用して調製され得る。そのような技術は、両方ともその全体が参照によって本明細書に組み込まれるSambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2001)、およびGreen and Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2012)に詳細に記載される（総称して「プロトコール」）。

【0073】

非限定的な例により、プラスミドまたはウイルス発現ベクター（例えば、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙ、およびｐｉｇｇｙｂａｃｋ（非ウイルス媒介性ＣＡＲ遺伝子送達システムを含むトランスポゾン／トランスポザーゼシステム））が調製され、インフレームで５’から３’方向に連結された認識領域、１つまたは複数の共刺激ドメイン、および活性化シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質をコードする。

【0074】

他の配置も許容可能であり、認識領域、活性化シグナル伝達ドメイン、および１つまたは複数の共刺激ドメインを含む。

【0075】

用語「ベクター」は、目的の核酸を運ぶ、持つ、または発現するように機能する任意の核酸を意味する。核酸ベクターは、発現、パッケージング、シュードタイピング、または形質導入のような特定の機能を有し得る。ベクターは、クローニングまたはシャトルベクターとしての使用のために適用された場合、操作機能も有し得る。ベクターの構造は、作製するのが可能であり、特定の使用に望ましい任意の所望の形態を含み得る。そのような形態は、例えば、プラスミドおよびファージミドのような環状形態、ならびに線状または分岐状形態を含み得る。例えば、プラスミドおよびファージミドのような環状形態、ならびに線状または分岐状形態を含み得る。核酸ベクターは、例えばＤＮＡまたはＲＮＡから構成されてもよく、ならびに、部分的にまたは完全にヌクレオチド誘導体、類似体または模倣体を含有してもよい。そのようなベクターは天然源から得られてもよく、組換えまたは化学合成によって産生されてもよい。

【0076】

融合タンパク質の認識領域の位置は、通常、細胞の外側での領域の提示が達成されるようにであろう。所望であれば、ＣＡＲは、さらなるエレメント、例えば細胞表面への融合タンパク質の正確な輸送を確実にするシグナルペプチド（例えばＣＤ８αシグナルペプチド）、融合タンパク質が膜内在性タンパク質として維持されるのを確実にする膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、またはＣＤ３ζ膜貫通ドメイン）、および認識領域に可動性を与え、標的化部分への強い結合を可能にするヒンジドメイン（例えばＣＤ８αヒンジ）も含み得る。

【0077】

細胞傷害性リンパ球（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）は、ＣＡＲ構築物をコードする発現ベクターによってリンパ球の集団をトランスフェクトすることによってＣＡＲ構築物を発現するように遺伝子操作され得る。選択されたＣＡＲ構築物を発現するリンパ球の形質導入した集団を調製するための好適な方法は、当業者に周知である。

【0078】

一実施形態では、本明細書に記載される方法で使用される細胞は、処置される患者が、患者の免疫系を破壊する高用量の化学療法または放射線処置を受けた場合など、異種細胞も使用され得るが、自家細胞であり得る。一実施形態では、同種細胞が使用され得る。

【0079】

本明細書の方法と関連して、ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、対象が、ＣＡＲを発現するＴ細胞を受ける療法を含み得る。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、ＣＡＲをコードする核酸配列に作動的に連結されたプロモーターを含むベクターを介して対象に投与され得る。ＣＡＲは、第１の標的化部分、第２の標的化部分、または第１の標的化部分および第２の標的化部分の両方に結合することができる。ある特定の実施形態では、ＣＡＲは、特異性を持って、第１の標的化部分、第２の標的化部分、または第１の標的化部分および第２の標的化部分の両方に結合することができる。

【0080】

ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、少なくともＣＡＲの第１の標的化部分とコンジュゲートしたリガンドを含む、がん結合コンジュゲートを受ける対象をさらに含む。リガンドは、がん細胞の受容体に結合することができる（例えば、リガンドは、特異性を持ってがん細胞受容体に結合することができる）。ある特定の実施形態では、リガンドおよび第１の標的化部分は、第１のリンカーを介してコンジュゲートされる。本明細書で使用される場合、用語「リガンド」は、コンジュゲートの中心原子もしくはイオン（例えば薬物）に接着される分子、イオン、または原子である。

【0081】

方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートを対象（例えば、消耗したＣＡＲ Ｔ細胞を有する）に投与するステップをさらに含む。ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、第１の標的化部分または第２の標的化部分のいずれかとコンジュゲートした（例えば、ＣＡＲが第１の標的化部分および／または第２の標的化部分と結合できるように）、ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）、ｔｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ８）、またはｔｏｌｌ様受容体７およびｔｏｌｌ様受容体８（ＴＬＲ７／８）のアゴニストを含み得る。ある特定の実施形態では、アゴニストおよび第１の標的化部分または第２の標的化部分のいずれかは、第２のリンカーを介して場合によりコンジュゲートされる。

【0082】

ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0083】

【化29】

［式中：
Ｒ^１は、アルキル、ハロ、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって場合により置換される、非環状アルキルまたは環状アルキルであり；
Ｒ^２は、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、またはＮ_３（式中：
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立して、水素、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくはオキソ、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって場合により置換されるアルキルであり；
各Ｒ^Ｚは、独立して、水素もしくは場合により置換されるアルキルであり、または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換される３～１０員の単環式もしくは二環式ヘテロシクロアルキルを形成する）であり、
各Ｒ^３は、独立して、水素、ハロ、－Ｎ_３、－ＣＮ、－ＮＯ_２、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、ヒドロキシ、カルボニル、またはチオールであり、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルまたはアルコキシは、場合により置換され；
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、アルキル、アルコキシ、ハロ、またはシクロアルキルであり、アルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルは場合により置換され；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＮまたはＣＲ^ｑ（式中、各Ｒ^ｑは、独立して水素（Ｈ）、ハロ、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｚは、Ｇ－Ｌ－（式中、Ｌはリンカーであり、Ｇは第１の標的化部分または第２の標的化部分である（例えば、ＣＡＲが特異性を持って結合する））であり；
式（Ｉ）のｎは、１～６であり；
式（Ｉ）のｍは、０～４である］
を有するか、またはその薬学的に許容される塩である。

【0084】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0085】

【化30】

［式中：
Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルコキシル、アルケニル、アルキニル、脂環式、アリール、ビアリール、ハロ、ヘテロアリール、－ＣＯＲ^２ｘ、

【0086】

【化31】

（式中、Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙのそれぞれは、Ｈ、－ＯＨ、－ＣＨ_２－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＨ_２－ＮＨ_２、－ＣＯＯＭｅ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＣＨ_３、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂環式、アリール、ビアリール、およびヘテロアリールからなる群から独立して選択される）であり；
Ｚは、Ｇ－Ｌ－（式中、Ｌはリンカーであり、Ｇは第１の標的化部分または第２の標的化部分である（例えば、特異性を持ってＣＡＲと結合できる））であり；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＣＲ^ｑまたはＮ（式中、各Ｒ^ｑは、独立してＨ、ハロ、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｙは、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、－ＳＲ^ｚ、－ＳＯＲ^ｚ、－ＳＯ_３Ｒ^ｚ、－Ｎ_３、－ＣＯＲ^ｚ、－ＣＯＯＲ^ｚ、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＳＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、または－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２（式中：
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立してＨ、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくは場合により置換されるアルキル（例えば、場合により、１つまたは複数の置換基によって置換され、各置換基は独立して、オキソ、ハロゲン、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルである）であり；
各Ｒ^ｚは、独立してＨもしくは場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換されるヘテロシクロアルキル（例えば、場合により置換されるヘテロシクロアルキルは単環式または二環式ヘテロシクロアルキルであり、および／または場合により置換されるヘテロシクロアルキルは３～１０員のヘテロシクロアルキルである）を形成する）であり；
式（ＩＩ）のｎは、０～３０である］
を有するか、またはその薬学的に許容される塩である。

【0087】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0088】

【化32】

［式中、
Ｒ^１は、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって場合により置換される、非環状アルキルまたは環状アルキルであり；
Ｙは、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、－ＳＲ^ｚ、－ＳＯＲ^ｚ、－ＳＯ_３Ｒ^ｚ、－Ｎ_３、－ＣＯＲ^ｚ、－ＣＯＯＲ^ｚ、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＳＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、または－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２（式中：
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立してＨ、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくはオキソ、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルから独立して選択される１つもしくは複数の置換基によって場合により置換されるアルキルであり；
各Ｒ^ｚは、独立して、水素もしくは場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換される３～１０員の単環式もしくは二環式ヘテロシクロアルキルを形成する）であり；
各Ｒ^３は、独立して、ハロ、－Ｎ_３、－ＣＮ、－ＮＯ_２、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、ヒドロキシ、カルボニル、またはチオールであり、アルキル、アルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルは、場合により置換され；
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、またはシクロアルキルであり、アルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルは場合により置換され；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＣＲ^ｑまたはＮ（式中、各Ｒ^ｑは、独立してＨ、ハロゲン、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｚは、Ｌ－Ｇ－（式中、Ｌはリンカーであり、Ｇは第１の標的化部分または第２の標的化部分である）であり；
式（ＩＩＩ）のｎは、０～３０であり；
式（ＩＩＩ）のｍは、０～４である］
を有するか、またはその薬学的に許容される塩である。

【0089】

ある特定の実施形態では、対象中のＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、消耗したＣＡＲ Ｔ細胞）は、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュケートに結合およびエンドサイトーシスし、ＣＡＲ Ｔ細胞は、そのアゴニストによって活性回復される。様々な実施形態では、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および／または式（ＩＩＩ）のＸ^１、Ｘ^２、およびＸ^３のそれぞれは窒素（Ｎ）であり得る。

【0090】

ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0091】

【化33】

を有し得るか、またはその薬学的に許容される塩であり得る。あるいは、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0092】

【化34】

を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。また、あるいは、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0093】

【化35】

を有し得るか、またはその薬学的に許容される塩であり得る。

【0094】

第１の標的化部分、第２の標的化部分、または第１の標的化部分および第２の標的化部分は、構造：

【0095】

【化36】

またはその薬学的に許容される塩を有する基であり得るか、またはその基を含み得る。

【0096】

あるいは、第１の標的化部分、第２の標的化部分、または第１の標的化部分および第２の標的化部分は、構造：

【0097】

【化37】

またはその薬学的に許容される塩を有する基であり得るか、またはその基を含み得る。

【0098】

ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0099】

【化38】

またはその薬学的に許容される塩を有し得る。あるいは、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0100】

【化39】

［式中、ｎ＝０～２００である］
から選択される構造を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。さらに代替的には、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0101】

【化40】

から選択される構造を有し得るか、またはその薬学的に許容される塩であり得る。よりさらに代替的には、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0102】

【化41】

から選択される構造を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートの他の構造としては、

【0103】

【化42】

またはその薬学的に許容される塩が挙げられる。ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートのさらに他の構造としては、

【0104】

【化43】

または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩が挙げられる。

【0105】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0106】

【化44】

から選択される構造を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩である。

【0107】

一部の実施形態では、上記のように、ＣＡＲ Ｔ細胞療法は、リガンドおよび第１の標的化部分を含むがん結合コンジュゲートを含み、リガンドおよび第１の標的化部分は、第１のリンカーを介して場合によりコンジュゲートされる。

【0108】

リガンドは、がん（例えば、がん細胞）によって結合され得る（または結合のための親和性を有するかもしくは特異性を持って結合する）。がん細胞によって結合されたリガンド（または結合のための親和性を有するかもしくは特異性を持って結合する）は、葉酸塩、５－メチルテトラヒドロ葉酸、２－［３－（１，３－ジカルボキシプロピル）ウレイド］ペンタン二酸（ＤＵＰＡ）リガンド、ニューロキニン１受容体（ＮＫ－１Ｒ）リガンド、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）リガンド、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼのリガンド、黄体ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨＲ）のリガンド、ＣＤ７３のリガンド、線維芽細胞活性化タンパク質のリガンド、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のリガンド、グルコーストランスポーター１（ｇｌｕｔ－１）のリガンド、ナチュラルキラーグループ２Ｄ受容体（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、およびコレシストキニンＢ受容体（ＣＣＫＢＲまたはＣＣＫ２）リガンドからなる群から選択され得る。

【0109】

「葉酸塩」は、例えば、限定されるものではないが、葉酸（例えば、ロイコボリン）、プテロイルポリグルタミン酸、プテロイル－Ｄ－グルタミン酸、およびテトラヒドロプテリン、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸（例えば、５－メチルテトラヒドロ葉酸（５－ＭＴＨＦ））、ならびにそれらのデアザおよびジデアザ類似体のような葉酸受容体結合プテリジン（pterdines）のような、葉酸の類似体および誘導体を含む、葉酸、葉酸類似体、または別の葉酸受容体結合分子であり得る。

【0110】

ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に関する「類似体」または「誘導体」は、オリジナルのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質と類似または同一の機能を持つが、オリジナルのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の類似または同一のアミノ酸配列または構造を必ずしも含まない別のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。類似体は、好ましくは、以下の少なくとも１つを満たす：（ａ）オリジナルのアミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質性剤；（ｂ）オリジナルのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に厳密な条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質性剤；または（ｃ）オリジナルのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質性剤。

【0111】

用語「デアザ」および「ジデアザ」類似体は、自然発生の葉酸構造、またはその類似体もしくは誘導体の１つまたは２つの窒素原子を置換する炭素原子を有する当技術分野において承認されている類似体を指す。例えば、デアザ類似体は、葉酸、フォリン酸、プテロポリグルタミン酸および、テトラヒドロプテリン、ジヒドロ葉酸、およびテトラヒドロ葉酸のような葉酸受容体結合プテリジンの１－デアザ、３－デアザ、５－デアザ、８－デアザ、および１０－デアザ類似体を含み得る。ジデアザ類似体は、例えば、１，５－ジデアザ、５，１０－ジデアザ、８，１０－ジデアザ、および５，８－ジデアザ類似体を含む。前述の葉酸類似体は、葉酸受容体に結合するそれらの能力を反映して慣習的に「葉酸塩（folate）」と呼ばれる。他の葉酸受容体結合類似体は、アミノプテリン、アメトプテリン（メトトレキサート）、Ｎ１０－メチル葉酸、２－デアミノヒドロキシフォレート、１－デアザメトプテリンまたは３－デアザメトプテリンのようなデアザ類似体、および３’，５’－ジクロロ－４－アミノ－４－デオキシ－Ｎ^１０－メチルプテロイルグルタミン酸（ジクロロメトトレキサート）を含む。

【0112】

前述の類似体および／または誘導体は、葉酸受容体に結合するそれらの能力を反映して、「葉酸塩（a folate）」、「葉酸塩（the folate）」、または「葉酸塩（folates）」とも呼ばれる。そのような分子は、外因性分子とコンジュゲートされる場合、葉酸塩媒介性エンドサイトーシスを介するなど、膜貫通輸送を増強するのに有効であり得る。前述のものは本明細書に記載される葉酸受容体結合リガンドで使用され得る。

【0113】

第１の標的化部分および第２の標的化部分（例えば、ＣＡＲに結合する親和性を有する）は、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、Ｌ－ラムノース、タクロリムス（ＦＫ５０６）、２，４，６－トリニトロフェノール（ＴＮＰ）、ビオチン、ラパマイシン、ジゴキシゲニン、葉酸塩、５－メチルテトラヒドロ葉酸、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＮＨＳ－フルオレセイン、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ノッチン、センチリン、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アトリマー、アビマー、二環状ペプチド、ＦＮ３足場、ｃｙｓ－ノット、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、またはＯｂｏｄｙからなる群から独立して選択され得る。

【0114】

第１のリンカーおよび第２のリンカーは、適用可能である場合、独立して、放出可能または放出不可能であってもよい。第１のリンカーおよび第２のリンカーは、Ｃ_１～Ｃ_２０アルキル、アルキレン、ヘテロアルキレン、－Ｏ－アルキニレン、アルケニレン、アシル、アリール、ヘテロアリール、アミド、オキシム、エーテル、エステル、トリアゾール、－Ｓ－Ｓ、－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－Ｓ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、カルボン酸塩、炭酸塩、カルバミン酸塩、尿素、チオ尿素、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、ＰＥＧ_ｎ、ｎ＝１～２００）、ポリプロリン、オリゴ－（４－ピペリジン）カルボン酸、オリゴピペリジン、アミノ酸（例えば、親水性アミノ酸）、ペプチド、サッカロペプチド、糖、ペプチドグリカン（例えば、非天然ペプチドグリカン）、ポリビニルピロリドン、プルロニックＦ－１２７、または前述の２つもしくはそれ以上の任意の組合せを独立して含み得る。

【0115】

第１のリンカー、第２のリンカー、または第１のリンカーおよび第２のリンカーの両方が、ＰＥＧを含み得る。

【0116】

上記に示されるように、様々な式の様々な置換基は、「場合により置換される」。本明細書で使用される場合、用語「置換される」は、指定した原子の正常な原子価を超えず、置換が安定な化合物を結果として生じる限り、指定した原子または基の任意の１つまたは複数の水素が、置換基の示した基からの選択によって置き換えられることを意味する。置換がオキソ（ケト、すなわち、＝０）である場合、原子の２個の水素が置き換えられる。本開示は、本コンジュゲートで生じる原子の全ての同位体（放射性同位体を含む）を含む。

【0117】

コンジュゲートがさらに置換される場合、それらは、本明細書に開示のもののような１つまたは複数の好適な基によって、１つまたは複数の利用可能な位置、典型的には、１つ～３つまたは４つの位置で置換され得る。「置換される」基に存在し得る好適な基としては、例えば、限定されるものではないが、ハロゲン；シアノ；ヒドロキシル；ニトロ；アジド；アルカノイル（アシル等のようなＣ１～６アルカノイル基など）；カルボキサミド；アルキル基（１個～約８個の炭素原子を有する、シクロアルキル基を含む）；アルケニル基およびアルキニル基（１つまたは複数の不飽和結合および２個～約８個の炭素原子を有する基を含む）；１つまたは複数の酸素結合および１個～約８個の炭素原子を有するアルコキシ基；フェノキシのようなアリールオキシ；１つまたは複数のチオエーテル結合および１個～約８個の炭素原子を有するものを含むアルキルチオ基；１つまたは複数のスルフィニル結合および１個～約８個の炭素原子を有するものを含むアルキルスルフィニル基；１つまたは複数のスルフォニル結合および１個～約８個の炭素原子を有するものを含むアルキルスルフォニル基；１つまたは複数のＮ原子および１個～約８個の炭素原子を有する基を含むアミノアルキル基が挙げられる。

【0118】

本明細書で使用される場合、「アルキル」は、特定の数の炭素原子を有する、分岐および直鎖脂肪族飽和炭化水素基の両方を含む。アルキルの例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、およびｓ－ペンチルが挙げられる。好ましいアルキル基は、Ｃ１～６アルキル基である。特に好ましいアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、および３－ペンチルであり得る。

【0119】

一般に、用語「アシル」または「アシル置換基」は、無機酸を含む、オキソ酸から１つまたは複数のヒドロキシル基の除去により生じるものを指し、二重結合した酸素原子およびアルキル基を含有する。

【0120】

用語「アルキレン」は、それ自体または別の置換基の一部として、他に言及しない限り、アルキル、例としては、限定されるものではないが、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－に由来する二価のラジカルを意味する。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１個～２４個の炭素原子を有するであろう。

【0121】

用語「ヘテロアルキル」は、それ自体または別の用語と組み合わせて、他に言及しない限り、少なくとも１つの炭素原子ならびにＯ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ、およびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなる、安定な直鎖もしくは分岐鎖、またはこれらの組合せ（複数可）を意味し、窒素および硫黄原子は、場合により酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は、場合により四級化されてもよい。ヘテロ原子（複数可）Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、およびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置またはアルキル基が分子の残部に接着される位置に置かれてもよい。例としては、限定はされないが、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ（Ｏ）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_３、－ＣＨ_２＝ＣＨ－Ｏ－ＣＨ_３、－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、－ＣＨ_２－ＣＨ＝Ｎ－ＯＣＨ_３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３、－Ｏ－ＣＨ_３、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_３および－ＣＮが挙げられる。最大２つのヘテロ原子は、例えば－ＣＨ_２－ＮＨ－ＯＣＨ_３のような連続であり得る。

【0122】

同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自体または別の置換基の一部として、（他に言及しない限り）ヘテロアルキル、例としては、限定はされないが、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２および－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２に由来する二価のラジカルを意味する。ヘテロアルキレン基については、ヘテロ原子は、鎖末端（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ等）のいずれかまたは両方を占めてもよい。またさらに、アルキレンおよびヘテロアルキレン連結基については、連結基の方向が連結基の式が記載される方向によって意味されない。例えば、式－Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’－は、－Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’－と－Ｒ’Ｃ（Ｏ）_２－の両方を表す。上記のように、ヘテロアルキル基は、本明細書で使用される場合、ヘテロ原子によって分子の残部に接着されるそれらの基、例えば、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、－ＮＲ’Ｒ’’、－ＯＲ’、－ＳＲ’、および／またはＳＯ_２Ｒ’を含む。「ヘテロアルキル」が記載される場合、特定のヘテロアルキル基、例えば、－ＮＲ’Ｒ’’等の記載が続き、用語ヘテロアルキルおよび－ＮＲ’Ｒ’’は重複または相互排他的ではないことが理解されるであろう。むしろ、特定のヘテロアルキル基は明確さを加えるために記載する。したがって、用語「ヘテロアルキル」は、－ＮＲ’Ｒ’’等のような、特定のヘテロアルキル基を除外すると本明細書で解釈されるべきではない。

【0123】

上記を考慮して、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートが提供される。活性回復コンジュゲートは、特異性を持ってＣＡＲ Ｔ細胞のＣＡＲに結合する標的化部分と、リンカー（例えば、第２のリンカー）を介してコンジュゲートされる、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ７／８のアゴニストを含み得、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0124】

【化45】

［式中：
Ｒ^１は、アルキル、ハロ、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって場合により置換される、非環状アルキルまたは環状アルキルであり；
Ｒ^２は、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、またはＮ_３（式中：
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立して、水素、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくはオキソ、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つもしくは複数の置換基によって場合により置換されるアルキルであり；
各Ｒ^Ｚは、独立して、Ｈもしくは場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換される３～１０員の単環式もしくは二環式ヘテロシクロアルキルを形成する）であり、
各Ｒ^３は、独立して、水素、ハロ、－Ｎ_３、－ＣＮ、－ＮＯ_２、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、ヒドロキシ、カルボニル、またはチオールであり、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキルまたはアルコキシは、場合により置換され；
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、アルキル、アルコキシ、ハロ、またはシクロアルキルであり、アルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルは場合により置換され；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＮまたはＣＲ^ｑ（式中、各Ｒ^ｑは、独立してＨ、ハロ、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｚは、Ｇ－Ｌ－（式中、Ｌはリンカー（例えば、第２のリンカー）であり、Ｇは標的化部分（例えば、第１の標的化部分、第２の標的化部分、または第１の標的化部分および第２の標的化部分の両方）である）であり；
ｎは、１～６であり；
ｍは、０～４である］
を有するか、またはその薬学的に許容される塩である。

【0125】

ある特定の実施形態では、活性回復コンジュゲートは、ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＡＲに（例えば、特異性を持って）結合する標的化部分と、リンカー（例えば、第２のリンカー）を介してコンジュゲートされる、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ７／８のアゴニストを含み、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0126】

【化46】

［式中：
Ｒ^１、Ｒ^３、Ｒ^４、およびＲ^５は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルコキシル、アルケニル、アルキニル、脂環式、アリール、ビアリール、ハロ、ヘテロアリール、－ＣＯＲ^２ｘ、

【0127】

【化47】

（式中、Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙのそれぞれは、Ｈ、－ＯＨ、－ＣＨ_２－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＨ_２－ＮＨ_２、－ＣＯＯＭｅ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ_２、－ＣＯＣＨ_３、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂環式、アリール、ビアリール、およびヘテロアリールからなる群から独立して選択される）であり；
Ｚは、Ｇ－Ｌ－（式中、Ｌはリンカー（例えば、第２のリンカー）であり、Ｇは標的化部分（例えば、第１および／または第２の標的化部分）である）であり；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＣＲ^ｑまたはＮ（式中、各Ｒ^ｑは、独立して水素、ハロ、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｙは、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、－ＳＲ^ｚ、－ＳＯＲ^ｚ、－ＳＯ_３Ｒ^ｚ、－Ｎ_３、－ＣＯＲ^ｚ、－ＣＯＯＲ^ｚ、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＳＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、または－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２（式中：
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立してＨ、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくは場合により置換されるアルキル（例えば、場合により、１つまたは複数の置換基によって置換され、各置換基は独立して、オキソ、ハロゲン、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルである）であり；
各Ｒ^ｚは、独立して水素もしくは場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換されるヘテロシクロアルキル（例えば、場合により置換されるヘテロシクロアルキルは単環式または二環式ヘテロシクロアルキルであり、および／または場合により置換されるヘテロシクロアルキルは３～１０員のヘテロシクロアルキルである）を形成する）であり；
式（ＩＩ）のｎは、０～３０である］
を有するか、またはその薬学的に許容される塩である。

【0128】

ある特定の実施形態では、活性回復コンジュゲートは、ＣＡＲ Ｔ細胞のＣＡＲに（例えば、特異性を持って）結合する標的化部分と、リンカー（例えば、第２のリンカー）を介してコンジュゲートされる、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ７／８のアゴニストを含み、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0129】

【化48】

［式中、
Ｒ^１は、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つまたは複数の置換基によって場合により置換される、非環状アルキルまたは環状アルキルであり；
Ｙは、Ｈ、－ＯＲ^ｚ、－ＮＲ^２ｘＲ^２ｙ、－ＳＲ^ｚ、－ＳＯＲ^ｚ、－ＳＯ_３Ｒ^ｚ、－Ｎ_３、－ＣＯＲ^ｚ、－ＣＯＯＲ^ｚ、－ＣＯＮＲ^ｚ _２、－ＣＯＳＲ^ｚ、－ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、または－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２（式中：
各Ｒ^Ｚは、独立してＨ、または場合により置換されるアルキルであり；
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは、それぞれ独立してＨ、－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＯＮ（Ｒ^ｚ）_２、－Ｃ（Ｒ^ｚ）_２－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、－ＣＳ－Ｎ（Ｒ^ｚ）_２、もしくはオキソ、ハロ、アルキル、ヘテロアルキル、アルコキシ、およびシクロアルキルから独立して選択される１つもしくは複数の置換基によって場合により置換されるアルキルであり；または
Ｒ^２ｘおよびＲ^２ｙは一緒になって、場合により置換される３～１０員の単環式もしくは二環式ヘテロシクロアルキルを形成する）であり、
各Ｒ^３は、独立して、ハロ、－Ｎ_３、－ＣＮ、－ＮＯ_２、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクロアルキル、アミノ、ヒドロキシ、カルボニル、またはチオールであり、アルキル、アルコキシ、ヘテロアルキル、シクロアルキル、またはヘテロシクロアルキルは、場合により置換され；
Ｒ^４およびＲ^５は、それぞれ独立して、アルキル、アルコキシ、ハロゲン、またはシクロアルキルであり、アルキル、アルコキシ、またはシクロアルキルは場合により置換され；
Ｘ^１、Ｘ^２、およびＸ^３は、独立してＣＲ^ｑまたはＮ（式中、各Ｒ^ｑは、独立してＨ、ハロゲン、または場合により置換されるアルキルである）であり；
Ｚは、Ｌ－Ｇ（式中、Ｌはリンカー（例えば、第２のリンカー）であり、Ｇは標的化部分（例えば、第１および／または第２の標的化部分）である）であり；
ｎは、０～３０であり；
ｍは、０～４である］
を有するか、またはその薬学的に許容される塩である。

【0130】

式（Ｉ）、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）のＧ（標的化部分）は、構造：

【0131】

【化49】

または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩を有する基であり得るかまたはその基を含み得る。式（Ｉ）、（ＩＩ）、および／または（ＩＩＩ）のＸ^１、Ｘ^２、およびＸ^３のそれぞれは、窒素（Ｎ）であり得る。

【0132】

ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、構造：

【0133】

【化50】

またはその薬学的に許容される塩を有し得る。

【0134】

あるいは、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0135】

【化51】

［式中、ｎ＝０～２００］
から選択される構造を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。さらに代替的には、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0136】

【化52】

から選択される構造を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0137】

【化53】

から選択される構造を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートの他の構造は、

【0138】

【化54】

または前述のいずれかの薬学的に許容される塩を含み得る。ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、以下：

【0139】

【化55】

から選択される構造を有し得るか、または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩であり得る。

【0140】

ある特定の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、

【0141】

【化56】

または前述の構造のいずれかの薬学的に許容される塩を含み得る。

【0142】

上記のように、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、少なくとも１つの標的化部分（例えば、ＣＡＲを標的化する）を含み得る。式（Ｉ）～（ＩＩＩ）に関して、標的化部分は、ＤＮＰ、Ｌ－ラムノース、ＦＫ５０６、ＴＮＰ、ビオチン、ラパマイシン、ジゴキシゲニン、葉酸塩、５－メチルテトラヒドロ葉酸、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ＮＨＳ－フルオレセイン、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル、ノッチン、センチリン、およびＤＡＲＰｉｎからなる群から選択され得る。

【0143】

さらなる実施形態は、標的化部分と活性剤（すなわちＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ７／８のアゴニスト）の間に配置されたリンカーを含み得る。式（Ｉ）～（ＩＩＩ）に関して、用語「リンカー」は、第１の標的化部分または第２の標的化部分のいずれかとコンジュゲートしたＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ７／８のアゴニストと化学結合を形成するように生体機能的に適応された原子の鎖を含み、分子の２つまたはそれ以上の部分を接続して化合物を形成し得る。実例として、原子の鎖は、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、硫黄（Ｓ）、ケイ素（Ｓｉ）、およびリン（Ｓ）、またはＣ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＰ、Ｃ、Ｎ、ＯおよびＳから選択され得る。原子の鎖は、小分子リガンドおよびコンジュゲートの標的化部分のような異なる機能性能を共有結合により接続し得る。リンカー（例えば第１または第２のリンカー）は、連続骨格の約２～約２０００原子の範囲のような広範なリンクを含んでもよく、放出可能または放出不可能なリンカーを含み得る。ある特定の実施形態では、リンカーは、必要な場合に、オプションであり得る。

【0144】

リンカーは、Ｃ_１～Ｃ_２０アルキル、アルキレン、ヘテロアルキレン、－Ｏ－アルキニレン、アルケニレン、アシル、アリール、ヘテロアリール、アミド、オキシム、エーテル、エステル、トリアゾール、－Ｓ－Ｓ、－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－Ｏ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－Ｓ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－（ＣＨ_２）_ｎ－Ｓ－Ｓ－（ｎ＝２～６）、カルボン酸塩、炭酸塩、カルバミン酸塩、尿素、チオ尿素、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ_ｎ、ｎ＝１～２００）、ポリプロリン、オリゴ－（４－ピペリジン）カルボン酸、オリゴピペリジン、アミノ酸（例えば、親水性アミノ酸）、ペプチド、サッカロペプチド、糖、ペプチドグリカン（例えば、非天然ペプチドグリカン）、ポリビニルピロリドン、プルロニックＦ－１２７、または前述の２つもしくはそれ以上の任意の組合せを含み得る。

【0145】

リンカーは、ＰＥＧを含み得る。例により、リンカーは、式：

【0146】

【化57】

［式中、ｎは、０～２００の整数である］
を有する構造を含み得る。別の実施形態では、ｎは０～１５０、０～１１０、０～１００、０～９０、０～８０、０～７０、０～６０、０～５０、０～４０、０～３０、０～２０、０～１５、０～１４、０～１３、０～１２、０～１１、０～１０、０～９、０～８、０～７、０～６、０～５、０～４、０～３、０～２、０～１、１５～１６、１５～１７、１５～１８、１５～１９、１５～２０、１５～２１、１５～２２、１５～２３、１５～２４、１５～２５、１５～２６、１５～２７、１５～２８、１５～２９、１５～３０、１５～３１、１５～３２、１５～３３、１５～３４、１５～３５、１５～３６、１５～３７、１５～３８、１５～３９、１５～４０、１５～５０、１５～６０、１５～７０、１５～８０、１５～９０、１５～１００、１５～１１０、１５～１２０、１５～１３０、１５～１４０、１５～１５０の整数であり得るか、またはｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１０８、１１０、１２０、１３０、１４０、または１５０であり得る。

【0147】

リンカーは、直接結合（例えばＦＩＴＣのイソチオシアネート基とリガンドの遊離のアミン基の間の反応）であってもよく、または結合は仲介のリンカーを介してもよい。一実施形態では、存在する場合、仲介リンカーは、二価のリンカーのような当技術分野で公知の任意の生体適合性のリンカーであり得る。例示的な一実施形態では、リンカーは二価であり得る、および約１～約３０個の炭素原子（例えば１～３０個の炭素原子）を含み得る。別の例示的な実施形態では、二価のリンカーは、約２～約２０個の炭素原子（例えば２～２０個の炭素原子）を含み得る。他の実施形態では、低分子量の二価のリンカー（すなわち、約３０ダルトン～約３００ダルトンのおよその分子量を有するもの）が用いられる。別の実施形態では、好適であるリンカー長は、限定はされるものではないが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９もしくは４０、またはそれ以上の原子を有するリンカーを含む。

【0148】

二価のリンカーの例を表１に示し、（^＊）は、リガンド、標的化部分、または活性回復化合物（例えばＴＬＲ７／８アゴニスト）への接着点を示す。

【0149】

【表1-1】

【0150】

【表1-2】

【0151】

リンカー部分のための他の構造は：

【0152】

【化58】

［式中、ｎは０～２００の整数である］
を含み得る。

【0153】

リンカーは、放出可能または放出不可能であり得る。用語「放出可能」は、リンカーの文脈では、例えば、薬剤不安定性、ｐＨ不安定性、酸不安定性、塩基不安定性、酸化的不安定性、代謝的不安定性、生化学不安定性、酵素不安定性またはｐ－アミノベンジルベースの多価の放出可能な結合の減少によるなど、生理学的条件下で破壊され得る（例えば化学的または酵素的に加水分解する）、少なくとも１つの結合を含むリンカーを意味する。結合破壊をもたらす生理学的条件が、必ずしも生物学的または代謝プロセスを含まず、かわりに標準的な化学反応、例えば生理学的ｐＨで、または細胞質ｐＨよりも低いｐＨを有するエンドソームのような細胞オルガネラへの区画化の結果として加水分解反応を含み得ることが認識される。切断可能な結合は、放出可能なリンカー内の２つの隣接する原子を接続することができ、および／または本明細書に記載されるように、他のリンカー部分または標的化部分および／または活性成分（例えばＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ７／８のアゴニスト）を、例えば放出可能なリンカーのいずれかのまたは両末端で接続することができる。一部の例では、放出可能なリンカーは、２つまたはそれ以上の断片に破壊される。一部の例では、放出可能なリンカーは、標的化部分から分けられる。ある特定の実施形態では、放出可能なリンカーを含むＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートは、投与された場合、コンジュゲートがＣＡＲ発現細胞に進入する頃に、互いから放出される標的化部分およびアゴニストを生じる。

【0154】

反対に、用語「放出不可能」は、リンカーの文脈では、生理学的条件下で容易にまたはすぐに破壊されない少なくとも１つの結合を含むリンカーを意味する。一部の実施形態では、放出不可能なリンカーは、生理学的条件下で安定な骨格（例えば、骨格は、加水分解（水性加水分解または酵素的加水分解）に感受性ではない）を含む。一部の実施形態では、放出不可能なリンカーを含むＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートのＴＬＲ７、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ７／８のアゴニストは、標的化部分から放出されない。一部の実施形態では、放出不可能なリンカーは、骨格のジスルフィド結合（例えばＳ－Ｓ）またはエステルを欠如する。一部の実施形態では、コンジュゲートは、コンジュゲートの循環の全期間、実質的に安定である骨格によって接続される標的化部分および活性成分（例えば、アゴニスト）を含む。放出不可能なリンカーは：アミド、エステル、エーテル、アミン、および／またはチオエーテル（例えばチオ－マレイミド）を含み得る。特定の例が本明細書で提供されるが、生理学的条件下で容易にまたはすぐに破壊されない少なくとも１つの結合が形成される限り、任意の分子が放出不可能なリンカーで使用され得ることが理解されるであろう。

【0155】

放出可能と放出不可能なリンカーの両方は、（例えばそれぞれのコンジュゲートおよび／またはその活性成分の）体内分布、生物学的利用能、およびＰＫ／ＰＤを最適化し、および／または当技術分野で一般に公知の、またはＰＥＧ化等によるなど以下に開発された方法に従って、（例えばそれぞれのコンジュゲートおよび／またはその活性成分の）標的化された細胞への取込みを増加するように操作され得る。

【0156】

コンジュゲート、およびその薬学的に許容される塩は、当業者によって実施される有機合成の従来の方法によって調製され得る。コンジュゲートの説明は、当業者に公知の化学結合の原理によって限定される。したがって、基は１つまたは複数の数の置換基によって置換されてもよく、そのような置換は、化学結合の原理に応じるように、ならびに本質的に不安定ではないおよび／または水性、中性、およびいくつかの公知の生理条件のような周囲条件下で不安定であるようであると当業者に公知の化合物を与えるように選択される。例えば、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロアリールは、当業者に公知の化学結合の原理に従って環状ヘテロ原子を介して分子の残部に接着され、それにより本質的に不安定な化合物を避けることができる。

【0157】

コンジュゲート、およびその薬学的に許容される塩は、立体異性体として存在してもよい。したがって、様々な実施形態は、純粋な立体異性体またはコンジュゲートの立体異性体の混合物を含み得る。コンジュゲート、およびその薬学的に許容される塩は、水和形態を含む、非溶媒和形態および溶媒和形態でも存在し得る。一般に、溶媒和形態は、非溶媒和形態と等価であり、本開示の範囲内に包含される。

【0158】

用語「薬学的に許容される塩」は、その対イオンが薬学に使用され得るそれらの塩を指す。様々な実施形態では、そのような塩は、限定されるものではないが、１）塩酸、臭化水素酸、硝酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸等のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、（Ｄ）もしくは（Ｌ）リンゴ酸、マレイン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、サリチル酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸またはマロン酸等のような有機酸との親化合物の遊離塩基の反応によって得ることができる酸付加塩；または２）親化合物に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えばアルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン、またはアルミニウムイオンによって置き換えられるか；またはエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トリメタミン、Ｎ－メチルグルカミン等のような有機塩基と配位するかのいずれかの場合に形成される塩を含む。薬学的に許容される塩は当業者に周知であり、任意のそのような薬学的に許容される塩は、本明細書に記載される実施形態と関連して検討される。

【0159】

様々な実施形態では、好適な酸付加塩は、非毒性塩を形成する酸から形成される。例示的な例は、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、重炭酸塩／炭酸塩、重硫酸塩／硫酸塩、ホウ酸塩、カンシラート、クエン酸塩、エジシル酸塩、エシレート、ギ酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヒベンズ酸塩、塩酸塩／塩化物塩、臭化水素酸塩／臭化物塩、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物塩、イセチオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフチル酸塩（naphthylate）、２－ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オロチン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素／リン酸二水素、糖酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩およびトリフルオロ酢酸塩を含む。

【0160】

様々な実施形態では、好適な塩基付加塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成される。例示的な例としては、アルギニン、ベンザチン、カルシウム、コリン、ジエチルアミン、ジオラミン、グリシン、リジン、マグネシウム、メグルミン、オラミン、カリウム、ナトリウム、トロメタミンおよび亜鉛の塩が挙げられる。酸および塩基の半塩（hemisalt）、例えばヘミ硫酸塩およびヘミカルシウム塩が形成されてもよい。

【0161】

上記を考慮して、医薬組成物がさらに提供される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、ＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む。

【0162】

本明細書で使用される場合、用語「組成物」は、通常、本明細書に記載のコンジュゲートを含む、１つより多くの成分を含む任意の産物を指す。組成物は、単離された化合物（すなわち、コンジュゲート；「化合物」および「コンジュゲート」は本明細書で交換可能に使用される）からまたは塩、溶液、水和物、溶媒和物、およびＣＡＲ Ｔ細胞活性回復コンジュゲートの他の形態から調製され得る。ある特定の官能基、例えばヒドロキシ、アミノ、およびそのような基が、化合物の様々な物理的形態で、水および／または様々な溶媒と複合体を形成し得る。ある特定の状況では、化合物（および化合物を含む組成物）は、様々な非晶質、非非晶質、部分的に結晶、結晶、および／または化合物の他の形態型から調製することができ、組成物は、化合物の様々な水和物および／または溶媒和物から調製することができることは理解されるであろう。したがって、コンジュゲートを表す医薬組成物は、化合物の様々な形態型および／または溶媒和物もしくは水和物形態のそれぞれ、またはその任意の組合せ、またはその個々の形態を含む。

【0163】

化合物および組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される担体、アジュバント、希釈剤、賦形剤、および／またはビヒクル、ならびにこれらの組合せを含有する単位剤形および／または組成物で投与され得る。用語「投与すること」およびその形成は、通常、対象の細胞、組織、器官、または生体液へと本明細書に記載される化合物および組成物を導入する任意のおよび全ての手段を指す。

【0164】

本明細書で使用される場合、「対象」は、哺乳動物、好ましくはヒトであるが、非ヒト動物であってもよい（限定されないが、実験動物、農業動物、飼育動物、または野生動物を含む）。したがって、方法、化合物、および組成物は、ヒトおよび獣医学両方の疾患ならびに適用に適用可能である。様々な態様では、対象は、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター等）、ウサギ、サル、チンパンジーのような実験動物、イヌ、ネコ、もしくはウサギのような飼育動物、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、もしくはヤギのような農業動物、またはクマ、パンダ、ライオン、トラ、レオパード、ゾウ、シマウマ、キリン、ゴリラ、イルカ、またはクジラのような捕獲された野生動物であり得る。ある特定の実施形態では、対象は「患者」、すなわち疾患または状態のための医学的処置を受ける生きたヒトまたは動物であり、病変の兆候を評価している疾病を定義されていないヒトまたは動物を含む。ある特定の実施形態では、本明細書の方法を使用して処置され得る対象は、がんを有するかまたはがんを有するリスクがあるとして同定または選択された対象を含む。そのような同定および／または選択は、臨床または診断評価によって行われ得る。

【0165】

化合物は、医薬組成物として製剤化され、および／または選択した投与の経路に適応した様々な形態で、対象、例えばヒト患者に投与され得る。実際、当技術分野で公知の任意の好適な投与の方法が使用され得る。一態様では、化合物、もしくはその薬学的に許容される塩、または化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物は、従来の非毒性の薬学的に許容される担体、アジュバント、およびビヒクルを含有する単位剤形および／または製剤で投与され得る。

【0166】

さらに、化合物、もしくはその薬学的に許容される塩は、血流に、筋肉に、または内臓器官に直接投与され得る。様々な実施形態では、そのような非経口投与に好適な経路は、静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外、脳室内、尿道内、胸骨下、頭蓋内、腫瘍内、筋肉内および皮下送達を含む。一実施形態では、非経口投与のための手段は、針（極微針を含む）注射器、針なし注射器および注入技術を含む。その化合物および組成物は、同様に所望の投与様式のために製剤化され得る。

【0167】

例えば、非経口製剤は、典型的には水溶液であり、塩、炭水化物および緩衝剤のような担体または賦形剤を（好ましくは３～９のｐＨで）含有し得るが、好適な場合、滅菌、パイロゲンフリー水または滅菌生理食塩水のような好適なビヒクルと組み合わせて使用される滅菌非水溶液として、または乾燥形態として製剤化されてもよい。他の実施形態では、本明細書に記載される任意の液体製剤は、非経口投与に適用され得る。非経口製剤のための滅菌凍結乾燥粉末を産生する凍結乾燥による、滅菌条件下での調製は、当業者に周知の標準的な薬学的技術を使用して容易に達成され得る。非経口製剤の調製で使用される化合物、またはその薬学的に許容される塩の可溶性は、適切な製剤技術、例えば可溶性増強剤の組込みの使用によって増加され得る。

【0168】

注射または注入に好適である化合物の医薬剤形は、滅菌注射可能もしくは注入可能溶液または分散液の即席の調製のために適用される活性成分を含む滅菌水溶液、分散液または滅菌粉末を含むことができ、場合によりリポソームにカプセル化される。全ての場合では、最終的な剤形は、製造および保存の条件下で滅菌、液体、および安定であるはずである。液体担体またはビヒクルは、例えば、限定されないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ＰＥＧ等）、野菜油、非毒性グリセリルエステル、および／またはそれらの好適な混合物を含む、溶媒または液体分散培地であり得る。少なくとも一実施形態では、適切な流動性は、リポソームの形成により、分散剤の場合に必要とされる粒子サイズの維持により、または界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用は、様々な抗菌剤、抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の添加によって防ぐことができる。ある特定の場合では、１つまたは複数の等張剤、例えば糖、緩衝剤、または塩化ナトリウムを含むことが望ましいこともある。注射可能な組成物の吸収の延長は、吸収を遅らせるために配合された薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組み入れによってもたらされ得る。

【0169】

滅菌注射可能溶液は、上記の１つまたは複数の他の成分を含む、必要量の適切な溶媒中に活性成分の組み入れ、必要な場合、その後濾過滅菌により調製され得る。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合では、調製の好ましい方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、先に滅菌濾過した溶液中に存在する活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末を産生する。

【0170】

化合物の有用な投与量は、動物モデルにおけるそれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性およびｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較することにより決定され得る。マウスおよび他の動物で有効な投与量のヒト対象への推定の方法は、当技術分野で公知である。実際、化合物の投与量は、対象の状態、処置されるがん種、病理がどのくらい進行しているか、化合物の投与の経路および組織分布、ならびに他の治療処置（例えば、放射線療法または併用療法での追加の薬物）の共利用の可能性によって著しく変わり得る。処置での使用のために必要な組成物および／または化合物の量（例えば、治療または予防有効量または用量）は、特定の適用によってだけではなく、選択された塩（適用可能であれば）および対象の特徴（例えば年齢、状態、性別、対象の体表面積および／または体重、薬物に対する耐性）によっても変わり、最終的に担当医師、臨床医、またはその他の裁量であろう。「治療有効量」または「予防有効量」は、所望の応答を誘導するのに十分である試薬または医薬組成物の量として定義される。

【0171】

対象に投与される、化合物、またはその薬学的に許容される塩の量は、処置されるがん、化合物、またはその薬学的に許容される塩の投与の経路、および組織分布に応じて著しく変わり得る。対象に投与される量は、体表面積、体重、および医師のアセスメントに基づき得る。

【0172】

様々な実施形態では、投与される量は、例えば約０．０５ｍｇ～約３０ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約２５．０ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約２０．０ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約１５．０ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約１０．０ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約９．０ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約８．０ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約７．０ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約６．０ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約５．０ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約４．０ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約３．０ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約２．０ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約１．０ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約０．５ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約０．４ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約０．３ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約０．２ｍｇ、約０．０５ｍｇ～約０．１ｍｇ、約０．１ｍｇ～約２ｍｇ、約０．３ｍｇ～約１０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約２０ｍｇ、または約０．８ｍｇ～約３ｍｇの範囲であり得る。当業者は、用量が上記の因子に基づいて上記で提供される様々な範囲内で変わり得るおよび医師の裁量であり得ることを容易に認識するであろう。

【0173】

他の実施形態では、化合物、またはその薬学的に許容される塩の用量は、例えば、対象の体重の約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約３，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、対象の体重の約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２，８００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ 約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２，６００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ 約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２，４００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ 約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２，２００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ 約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２，１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ 約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約９００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約８００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約７００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約６００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約５００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約４００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約３００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約３００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約５００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇの範囲であり得る。他の実施形態では、用量は、対象の体重の約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約２０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約２５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約３０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約４０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約６０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約７０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、８０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約９０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約２００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約２５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約３００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約３５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約４００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約４５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約５００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約６００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約７００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約８００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約９００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約２，５００ｎｍｏｌｅ／ｋｇまたは約３，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇであり得る。さらに他の実施形態では、用量は、対象の体重の約０．１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．２ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．３ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．４ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、または約０．５ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約９００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約８５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約８００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約７００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約６００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約５００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約４００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約３００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、または約０．１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇであり得る。他の実施形態では、用量は、対象の体重の約０．３ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．３ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約９００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．３ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約８５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．３ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約８００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．３ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約７００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．３ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約６００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．３ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約５００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．３ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約４００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．３ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約３００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．３ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．３ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．３ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約０．３ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、または約０．３ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇであり得る。

【0174】

様々な他の実施形態では、化合物、またはその薬学的に許容される塩の用量は、例えば、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１０，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約３，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２，５００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約９００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約８００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約７００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約６００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約５００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約４００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約３００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約９０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約８０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約７０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約６０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約４０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約３０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約２００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約９００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約２００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約８００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約２００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約７００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約２００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約６００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約２００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約５００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約２５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約６００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約３００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約６００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約３００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約５００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、または約４００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約６００ｎｍｏｌｅ／ｋｇの範囲であり得る。

【0175】

様々な他の実施形態では、化合物、もしくはその薬学的に許容される塩の用量は、例えば、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１０，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約３，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２，５００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約９００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約８００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約７００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約６００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約５００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約４００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約３００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約１００ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約９０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約８０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約７０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約６０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約５０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約４０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約３０ｎｍｏｌｅ／ｋｇ、または約１ｎｍｏｌｅ／ｋｇ～約２０ｎｍｏｌｅ／ｋｇの範囲であり得る。

【0176】

別の実施形態では、約２０μｇ／ｋｇ体重～約３ｍｇ／ｋｇ体重の化合物、もしくはその薬学的に許容される塩が、対象に投与され得る。別の態様では、量は、約０．２ｍｇ／ｋｇ体重～約０．４ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、または約５０μｇ／ｋｇ体重であってもよい。

【0177】

他に指定しない限り、本明細書に記載される全ての投与量の実施形態では、「ｋｇ」は対象の体重のキログラムである。

【0178】

単回用量または複数回用量の化合物、もしくはその薬学的に許容される塩が、対象に投与され得る。

【0179】

当技術分野で公知の任意の適用可能な投与スケジュールは、化合物、その薬学的に許容される塩、またはそれを含む医薬組成物の投与のために使用され得る。例えば、１日１回投与（ａ．ｋ．ａ ｑｄ）、１日２回投与（ａ．ｋ．ａ ｂｉｄ）、１日３回投与（ａ．ｋ．ａ ｔｉｄ）、１週間に２回投与（ａ．ｋ．ａ ＢＩＷ）、１週間に３回投与（ａ．ｋ．ａ ＴＩＷ）、１週間に１回投与等が使用され得る。一態様では、選択された投与スケジュールは、投与される化合物／組成物の濃度（例えば、投与されるＣＡＲ－Ｔ細胞の数を含む）を考慮することができる。

【0180】

「がん」は、本明細書に照らして読まれる場合、その明白なおよび通常の意味を有し、限定されるものではないが、身体の他の部位に侵入または拡散する能力を有する異常な細胞増殖を含む疾患の群を含み得る。限定されないが、癌腫、肉腫、骨肉腫、リンパ腫、黒色腫、中皮腫、鼻咽頭癌、白血病、腺癌、および骨髄腫を含む、多くの種類のがんが、本明細書に記載される組成物、化合物、および方法を使用して処置され得る。他の、およびおそらくより具体的には、方法および／または本明細書の化合物および組成物の使用によって処置され得るがんの例としては、限定されるものではないが、肺がん（限定されないが、非小細胞性肺がんを含む）、骨がん（限定されないが、骨肉腫を含む）、膵臓がん、皮膚がん（限定されないが、皮膚黒色腫を含む）、頭部のがん、頸部のがん、眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、子宮内膜がん、直腸がん、胃がん、大腸がん、乳がん、三重陰性乳がん、卵管の癌、子宮頸部の癌、膣の癌、外陰の癌、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、前立腺がん、白血病（限定されないが、慢性白血病、急性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ球性リンパ腫、骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、およびヘアリー細胞白血病を含む）、胸膜中皮腫、膀胱のがん、バーキットリンパ腫、尿管のがん、腎臓のがん（限定されないが、腎細胞癌を含む）、腎盂の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、ＣＮＳ原発リンパ腫、脊椎軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、および胃食道接合部の腺癌を含む。

【0181】

これらの実施形態の一部の態様では、がんは、葉酸受容体を発現するがん、例えば、限定されないが、葉酸受容体αを発現するがんである。他の実施形態では、がんは、葉酸受容体βを発現するがんである。これらの実施形態の一部の態様では、がんは子宮内膜がん、非小細胞性肺がん、卵巣がん、または三重陰性乳がんである。

【0182】

処置されるがんは腫瘍であり得る。別の実施形態では、がんは悪性腫瘍であり得る。別の実施形態では、がんは、例えばがんが葉酸受容体－βを発現する急性骨髄性白血病のような急性骨髄性白血病である。

【0183】

本明細書で言及した全ての特許、特許出願公開、学術論文、テキスト、および他の論文は、本開示が関連する当業者のレベルの指標である。全てのそのような論文は、各個々の論文が特におよび個々に参照によって組み込まれることが示されたように、同程度まで参照によって本明細書に組み込まれる。

【0184】

上記の説明では、多くの特定の詳細が記載され、本開示の全体理解を提供する。特定の実施例は、これらの特定の詳細の一部または全て無しで実施されてもよく、本開示が特定の生物系、特定のがん、または特定の器官または組織に限定されず、もちろん、変わり得るが、本明細書で提供されるデータを考慮して適用可能なままであることが理解される。

【0185】

さらに、本開示の様々な技術およびメカニズムは、時々、２つの成分間の接続または連結を記載する。屈折形態素を有する接着した、連結した、結合した、接続したのような言葉、および類似の用語は、違いが記載されるかまたはそうでなければ文脈から明らかにされない限り、交換可能に使用される。これらの言葉および表現は、必ずしも直接接続を意味しないが、成分の媒介を通す接続を含む。２つの成分の間の接続は、様々な他の成分が記載した２つの成分間にあり得る場合、必ずしも直接、無妨害の接続を意味しないことに注意すべきである。結果として、接続は、他に記載しない限り、必ずしも直接、無妨害の接続を意味しない。

【0186】

さらに、本開示が、単に説明目的のためにこの方法で提示され、本明細書に記載される原理および実施形態は、本明細書に特に記載される以外の構成を有する化合物および／または組成物成分に適用され得ることが理解されるであろう。実際、本開示の組成物および化合物の成分が、それらの所望の適用の促進に合わせられ得ることが特に考えられる。

【0187】

他に規定しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、化学および生物学分野で当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似のまたは等価な任意の方法および材料は、本出願の対象の実施または試験に使用されてもよく、好ましい方法および材料が本明細書に記載される。さらに、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈が他に明確に指定しない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、化合物／組成物が、「１つの（an）」アルキルまたはアリールによって置換される場合、化合物／組成物は、場合により、少なくとも１つのアルキルおよび／または少なくとも１つのアリールによって置換される。

【0188】

物理的特性、例えば分子量、または化学特性、例えば化学式について範囲が本明細書で使用される場合、範囲の全ての組合せおよび部分的組合せならびにその特定の実施形態が含まれることが意図される。

【0189】

さらに、用語「約（about）」は、数、数値または範囲（例えば、全数、画分、およびパーセンテージを含む）を参照する場合、参照される数または数値範囲は、実験的な変化性内（または統計的実験誤差内）の近似値であり、したがって、当業者が記載した値と等価である（例えば同じ機能または結果を有する）と考える限り、数値または範囲は、記載した数または数値範囲の１％と１５％（例えば、記載した値の＋／－５％～１５％）の間で変わり得る。用語「含む（comprising）」（および「含む（comprise）」または「含む（comprises）」または「有する（having）」または「含む（including）」のような関連用語）は、本明細書に記載される他のある特定の実施形態、例えば任意の化合物、物質の組成、組成物、方法、またはプロセス等の実施形態を除外することを意図せず、記載した特徴「からなる（consist of）」または「本質的にからなる（consist essentially of）」ことがある。用語「実質的に」は、記載した値の、または記載した範囲の限界の、例えば、９０％以内、９５％以内、または９９％以内の値または範囲のある程度の変化性も可能にし得る。

【0190】

治療の方法が、１つより多くの処置、化合物、または組成物を対象に投与するステップを含み、投与の順序、タイミング、数、濃度、および容積が、医学的要求および処置の限界によってのみ限定されることが理解されるであろう（すなわち、例えば同時に、連続して、順番に、代わりに、または任意の他のレジメンに従って２つの処置が対象に投与され得る）。

【0191】

さらに、代表的な実施形態の記載において、本開示は、ステップの特定の順序として方法および／またはプロセスを提示してもよい。方法またはプロセスが、本明細書に記載のステップの特定の順番によらない限り、方法またはプロセスは記載されるステップの特定の順序に限定されないはずである。当業者が認識するように、ステップの他の順序も可能である。したがって、本明細書に開示されるステップの特定の順番は、特許請求の範囲の限定として結論付けられないはずである。さらに、方法および／またはプロセスを対象とする特許請求の範囲は、記載された順番でのそれらのステップの実施に限定されないはずであり、当業者は、順序が変わり得るが依然として本開示の趣旨および範囲内にあることを容易に理解できる。

【0192】

したがって、本明細書および添付の特許請求の範囲が、本開示に基づいて当業者に明らかである全ての改変および変更を包含することが意図される。

【実施例】

【0193】

以下の実施例は、本開示を例示するためのものである。実施例は、いずれによっても特許請求した本発明の範囲を限定することを意図しない。

【0194】

［実施例１］
がん細胞株およびヒト抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞の生成
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞およびＫＢ細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。熱不活性化した１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有する葉酸フリーのＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して、両細胞株を培養した。安定なｍＣｈｅｒｒｙ発現ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を得るため、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、まずレンチウイルスベクター（ｐＬｖ－ＮＬＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ｐｕｒｏ；Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｕｉｌｄｅｒ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）によって形質導入し、次いで、ピューロマイシン含有培地中で陽性クローンを選択した。

【0195】

ヒト抗フルオレセインキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の生成のため、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、インフォームドコンセント後に、Ｆｉｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）密度勾配遠心分離によって新しいヒト末梢血試料から単離した。次いで、ＣＤ３^＋Ｔ細胞を回収し、ＥａｓｙＳｅｐ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を使用して濃縮し、ヒト抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞を、公知のレンチウイルスベクタープロトコールに従って生成した。全ての細胞は、３７℃、５％ＣＯ_２下で維持し、マイコプラズマの夾雑を定期的に試験した。

【0196】

［実施例２］
ヒトＴ細胞におけるＴＬＲ７の発現の解析
Ｔｏｌｌ様受容体７（ＴＬＲ７）が初代ヒトＴ細胞において発現されるかどうか決定するため、新しく単離したＣＤ３^＋Ｔ細胞を、製造業者の説明書（Ｉｎ（ＴＲａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅ（ＴＲｙ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に従って、固定および透過処理し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗ＴＬＲ７（ＩＣ５８７５Ｇ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）によって染色した。次いで、細胞をＩｎ（ＴＲａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって２回洗浄し、フローサイトメトリーによる解析の前に、１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。

【0197】

［実施例３］
ｉｎ ｖｉ（ＴＲｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞へのフルオレセイン－ＮＩＲ色素結合の解析
抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞（陰性対照としてＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞またはＫＢ細胞と共に）を、１０００倍過剰なフルオレセインナトリウム（１０μＭ）の存在下または不在下でのインキュベーションの前に、室温で１時間、フルオレセイン近赤外線（ＮＩＲ）色素（１０ｎＭ）とインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＮＩＲ色素蛍光をフローサイトメトリーによって測定した。

【0198】

フルオレセイン－ＮＩＲ色素コンジュゲート（１０ｎＭ）の不在下（図３ＡのラベルＡ）もしくは存在下（図３ＡのラベルＢ）、またはフルオレセイン－ＮＩＲ色素コンジュゲート＋１０００倍過剰なフルオレセイン（図３ＡのラベルＣ）の両方の存在下での抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞のフローサイトメトリーは、１０００倍過剰なフルオレセインの添加によって定量的にブロックされ得る方法で、フルオレセイン－ＮＩＲ色素コンジュゲートが、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞に結合することを実証した。

【0199】

さらに、ＮＳＧマウスは、一方の脇腹に１００万個のＫＢ細胞を移植し、ＫＢ腫瘍容積が、～５０ｍｍ^３に達すると、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞（～５０％の抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞を含有する８×１０^６個の細胞）を注入した。フルオレセイン－葉酸塩（５００ｎｍｏｌ／ｋｇ）を、４時間後と２４時間後に、およびその後、週１回注射した。ＣＡＲ Ｔ細胞注入の１５日後、マウスに５００ｎｍｏｌ／ｋｇのフルオレセイン－ＮＩＲ色素を尾静脈注射した。４時間後に腫瘍を解離し、フルオレセイン－ＮＩＲ色素の取込みについてフローサイトメトリーによって解析した。ＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＡＰＣ－Ｃｙ７チャネルで抗ヒトＣＤ３によって検出し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）－トランスフェクト抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞を、ＧＦＰチャネルを使用して検出した。

【0200】

図３Ｂに示すように、ＣＡＲ陰性細胞（例えば、ＭＤＡ－ＭＤ－２３１細胞およびＫＢ細胞）は、フルオレセイン色素コンジュゲート（１０ｎＭ）の結合部位を発現しない。対照的に、共焦点顕微鏡評価は、フルオレセイン－Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートが、抗フルオレセイン細胞表面受容体を有するＣＡＲ Ｔ細胞によってエンドサイトーシスされることを示す（図３Ｃは、４℃で１時間のインキュベーション後のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７のエンドサイトーシスを示すが、図３Ｄは、３７℃で４時間へのＣＡＲ Ｔ細胞への移行後のＡｌｅｘａｆｌｕｏｒ６４７のエンドサイトーシスを示す）。横棒＝１０μｍ。

【0201】

［実施例４］
ＣＡＲ Ｔ細胞消耗の刺激およびｉｎ ｖｉ（ＴＲｏでの消耗の回復
ＣＡＲ Ｔ細胞消耗を誘導するため、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞（１０^４個／ウェル）を、葉酸フリーのＲＰＭＩ１６４０培地中の葉酸受容体発現ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（１０^４個／ウェル）に添加し、その後、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＣＡＲ Ｔ細胞媒介死滅を、１０ｎＭ フルオレセイン葉酸塩の添加によって開始した。次いで、その後１２時間毎に、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（１０^４個／ウェル）の新しいフラスコに移し、図５Ａに示したように腫瘍抗原への連続的な曝露を確実にした。抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞の画分を、１２時間後（第１ラウンド）、２４時間後（第２ラウンド）、および３６時間後（第３ラウンド）に回収し、フローサイトメトリーによって、消耗マーカーＰＤ－１、ＴＩＭ３、およびＬＡＧ３の発現を解析した。ＣＡＲ Ｔ細胞は、それらがＰＤ－１、ＴＩＭ３およびＬＡＧ３を同時に発現した場合に消耗したと考えられた。図５Ｃに示すように、Ｔ細胞消耗マーカーＰＤ－１、ＴＩＭ３、およびＬＡＧ３が増加した。生ｍＣｈｅｒｒｙ＋（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）細胞の数は、４時間毎にＩｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３によって数え、がん細胞死滅効率を算出するために使用した。図５Ｂに示すように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を死滅させる抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞の能力は減少した。

【0202】

消耗したＣＡＲ Ｔ細胞の活性回復の評価のため、消耗状態の第３ラウンドの開始時に、ＣＡＲ Ｔ細胞とＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を組み合わせた培養を、０．０１～１００ｎＭの範囲の濃度の所望の活性回復化合物と終夜インキュベートした。次いで、ＣＡＲ Ｔ細胞は、それらのがん細胞死滅効率を定量し、それらのＰＤ－１、ＴＩＭ３およびＬＡＧ３の発現を解析することによって活性回復を評価した。

【0203】

消耗した抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞の活性回復は、標的化または非標的化ＴＬＲ７－１ａのいずれかとのインキュベーションによって実証した。図５Ｅに示すように、Ｔ細胞消耗マーカー（プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１＋）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有－３（ＴＩＭ３^＋）、およびリンパ球活性化３（ＬＡＧ３^＋））が減少した。さらに、図５Ｄに示すように、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を死滅させる抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞の能力は増加した。示したデータは、ベースラインレベル（すなわち、ビヒクル（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）処置））を超えるマーカーの変化を示す。棒グラフは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。

【0204】

ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞は、図４に示すように、異なる濃度のＴＬＲ７－５４またはＴＬＲ７－１ａアゴニストのいずれかの投与時に活性化された。図４Ａは、フローサイトメトリーによって測定した、漸増濃度のＴＬＲ－５４またはＴＬＲ７－１ａの不在下または存在下で、抗ＣＤ３＋モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により、単離したヒト末梢血ＣＤ３＋Ｔ細胞が刺激された後のＣＤ６９＋細胞のパーセント増加を示す。図４Ｂは、フローサイトメトリーによって測定した、漸増濃度のＴＬＲ－５４またはＴＬＲ７－１ａの不在下または存在下で、抗ＣＤ３＋ｍＡｂにより、単離したヒト末梢血ＣＤ３＋Ｔ細胞が刺激された後のＣＤ２５＋細胞のパーセント増加を示す。図４Ｃは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した、刺激したＴ細胞の２４時間での無細胞上清中のインターフェロンガンマ（ＩＮＦ－γ）のレベルを示す。図４Ｄは、ＥＬＩＳＡによって測定した、刺激したＴ細胞の２４時間での無細胞上清中の腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）のレベルを示す。示したデータは、ベースラインレベル（すなわち、ビヒクル（ＤＭＳＯ処置））を超えるこれらのパラメーターの増加を支持する。棒グラフは、平均±ＳＤ、ｎ＝３を表す。

【0205】

［実施例５］
フルオレセイン－ＴＬＲ７－１ａコンジュゲートの静脈注射後のｉｎ ｖｉｖｏでの抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞の活性回復
マウスは、１０^６個のＫＢ細胞を－７日目に皮下注射し、次いで、８×１０^６個の抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞を１日目に注入した処置群を含む、４つの群に分けた。対照群は、ＣＡＲ Ｔ細胞を受けなかった。６時間、２４時間および９日後、２つの処置群のマウスにフルオレセイン－葉酸塩を静脈内注射し、葉酸受容体陽性ＫＢがん細胞とＣＡＲ Ｔ細胞の結合を誘導した。その後、処置群のマウスを２つのコホートに分け、４～７日目および１１～１４日目に、処置群の第２コホートのマウスに、フルオレセイン－ＴＬＲ７－１ａを静脈内注射した。ｉｎ ｖｉｖｏ試験のタイムラインを図８Ａに示す。

【0206】

腫瘍容積（図８Ｂ）および動物の体重変化（図８Ｃ）を３日毎に測定した。ＣＡＲ Ｔ＋フルオレセイン－葉酸塩＋フルオレセイン－ＴＬＲ７－１ａによって処置したコホートは、全ての他の群（対照と処置群の他のコホートの両方）と比較して、遅延した腫瘍増殖を示した。ＣＡＲ Ｔ＋フルオレセイン－葉酸塩＋フルオレセイン－ＴＬＲ７－１ａによって処置したコホートは、ＣＡＲ Ｔ＋フルオレセイン－葉酸塩によって処置したコホートと比較して、無視できるパーセント体重変化を示した。

【0207】

１６日目に腫瘍を切除し、成分細胞へと解離し、ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を、全ての腫瘍細胞（図８Ｄ）のパーセンテージとして決定した。全てのヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージとしてＰＤ－１＋ＴＩＭ３＋細胞も決定し（図８Ｅ）、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞処置群において骨髄マーカーＦ４／８０およびＣＤ１１ｂも発現するＣＤ２０６＋細胞に対するマウスＣＤ８６＋細胞の比も示す（図８Ｆ）。ＴＬＲ７－１ａの本発明者らの標的化送達は、骨髄細胞に影響することなく、消耗したＣＡＲ Ｔ細胞の活性回復に成功した。全てのデータは、平均±ＳＥＭとしてプロットした。示したデータは、少なくとも２つの独立した実験の提示である。データは、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって解析した（^＊＊ｐ＜０．０１；ｎ．ｓ．＝顕著ではない）。

【0208】

［実施例６］
フルオレセイン－ＴＬＲ７－１ａコンジュゲートの存在下および不在下での固形ＫＢおよびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞腫瘍のＣＡＲ Ｔ細胞根絶の比較
８週齢から１０週齢のＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂ 株番号００５５５７；Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）は、野生のヒトおよびマウスにおけるのと同様のレベルに、それらの血清葉酸濃度を減少させるため、葉酸欠乏食（ＴＤ．９５２４７、Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）に、到着時に移した。１週間後、マウスは、同じマウスの別の脇腹に～１０^６個のＫＢ細胞および４００万個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を皮下移植された。ＫＢ腫瘍が８０ｍｍ^３に達し、ＭＤＡ－ＭＤ－２３１腫瘍が～１６０ｍｍ^３に達するまで、腫瘍を約２週間増殖させた（すなわち、それらの異なる増殖速度を調整する）。次いで、マウスに、生理食塩水または８×１０^６個の抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞を静脈注射し、その後、ＣＡＲ Ｔ細胞注入後４時間と２４時間の両方に、５００ｎｍｏｌ／ｋｇのフルオレセイン葉酸塩を注射した。

【0209】

ＣＡＲ Ｔ細胞注入の４日後、ＣＡＲ Ｔ細胞処置したマウスは、活性回復群（フルオレセイン－ＴＬＲ７処置）と対照群（生理食塩水処置）に分けた。フルオレセイン－ＴＬＲ７処置したコホートは、５００ｎｍｏｌ／ｋｇのフルオレセイン－ＴＬＲ７を４×／週で受けたが、対照群は、同じスケジュールで等容積の生理食塩水を受けた。腫瘍容積は、式（ｌ×ｗ^２）／２（「ｌ」は腫瘍の最長の幅であり、「ｗ」は最長のトランセプトに対して垂直の寸法である）を使用してｃａｌｉｐｅｒによって同時に測定した。

【0210】

１８日目に、マウスを屠殺し、ヒト腫瘍解離キット（１３０－０９５－９２９、ＭｅＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して腫瘍断片を解離した。生じる単一細胞の懸濁液は、ヒトＣＤ３（抗ＣＤ３－ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎｄ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＰＤ－１（抗ＰＤ－１－ＰＥ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎｄ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＴＩＭ３（抗ＴＩＭ３－ＰＥ－Ｃｙ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎｄ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、マウスＣＤ１１ｂ（抗ＣＤ１１ｂ－ＰＥ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎｄ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｆ４／８０（抗Ｆ４／８０－ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎｄ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｍ２マクロファージマーカーＣＤ２０６（抗ＣＤ２０６－ＡＰＣ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎｄ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、およびＭ１マクロファージマーカーＣＤ８６（抗ＣＤ８６－ＰＥ－Ｃｙ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎｄ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）について染色した。次いで、全ての試料を、フローサイトメトリーによって解析した。

【0211】

図６は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍およびＫＢ腫瘍の増殖および免疫特性への、抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞療法の効果を示す。図６Ａは、未処置のまま（点線）または抗フルオレセインＣＡＲ Ｔ細胞とフルオレセイン－葉酸塩二重特異性アダプターの両方による処置（実線）のいずれかのコホートの腫瘍容積を示す。図６Ｂは、腫瘍が切除され、フローサイトメトリーによる解析の前に、腫瘍解離キットを使用して、がん細胞および間質細胞の両方が放出された場合、１８日目のＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージ（腫瘍中の全細胞のパーセンテージとして）を示す。図６Ｃは、腫瘍が切除され、フローサイトメトリーによる解析の前に、腫瘍解離キットを使用して、がん細胞および間質細胞の両方が放出された場合、１８日目の消耗マーカーＰＤ－１＋およびＴＩＭ３＋（全てのヒトＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージとして）を示す。図６Ｄは、腫瘍が切除され、フローサイトメトリーによる解析の前に、腫瘍解離キットを使用して、がん細胞および間質細胞の両方が放出された場合、１８日目のＣＤ２０６＋Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋骨髄性細胞に対するＣＤ８６＋Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋の比を示す。ｎ＝５匹のマウス／群。全てのデータは、二元配置ＡＮＯＶＡによって解析し、平均±ＳＥＭとしてプロットした（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１）。示したデータは、２つの独立した実験の提示である。図６Ｅは、ＭＤＡ－ＭＢ２３１およびＫＢ細胞固形腫瘍へのヒトＣＤ３＋Ｔ細胞浸潤を示す代表的な画像を示す。横棒＝２００μｍ。
化学実施例

【0212】

実施例Ａ
ＦＩＴＣ－ＴＣＲ７－１ａの合成

【0213】

【化59】

【0214】

３－アミノ－２，２－ジメチルプロパン－１－オール（２，１．５当量）およびトリエチルアミン（２当量）を、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１０ｍＬ）中４－クロロ－３－ニトロキノリン（１，１．２当量）の撹拌溶液に添加した（スキーム１の（ｉ））。反応混合物を７０℃で６０分間加熱し、液体クロマトグロフィー質量分析（ＬＣＭＳ）によってモニターした。次いで、それを冷却し、水によって希釈し、さらに１５分間撹拌した。沈殿した固体を濾過し、水によって洗浄した。固体は、真空下で乾燥し、黄色固体として物質３を得た。収率－８０％。

【0215】

その後、２，２－ジメチル－３－（３－ニトロキノリン－４－イルアミノ）プロパン－１－オール（１ｇ）をメタノール（１５ｍＬ）中に溶解し、水素バルーン条件下で４時間、触媒としてＰｄ／Ｃ（１００ｍｇ、１０ｍｏｌ％）で還元した（スキーム１の（ｉｉ））。次いで、溶液を濾過し、減圧下で蒸発させ、３－（３－アミノキノリン－４－イルアミノ）－２，２－ジメチルプロパン－１－オール（４）を得た。

【0216】

次いで、トリエチルアミン（２当量）および塩化バレリル（５，１．５当量）を、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１０ｍＬ）中の物質４（１ｇ）の撹拌溶液に添加した（スキーム１の（ｉｉｉ））。次いで、反応混合物を４時間撹拌し、続いて減圧下で溶媒を除去した。次いで、粗残留物を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）に溶解し、水、塩水によって洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。組み合わせた有機層を真空下で蒸発させ、乾燥し、中間アミド化合物６を得た。全収率－７０％。

【0217】

メタノール（ＭｅＯＨ）（１５ｍＬ）中のアミド化合物６（１ｇ）の撹拌溶液に、過剰な酸化カルシウム（１０当量）を添加し、溶液を１１０℃で９６時間加熱した（スキーム１の（ｉｖ））。次いで、真空下で溶媒を除去し、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ジクロロメタン移動相）を使用して精製し、化合物７を得た。収率－６０％。

【0218】

次いで、ＮａＨ（２当量）およびＮ－Ｂｏｃ－ＰＥＧ３－臭化物（８，２当量）を、ＴＨＦ（５ｍＬ）中の中間ヒドロキシル化合物７（５００ｍｇ）の撹拌溶液に添加した（スキーム１の（ｖ））。これを、窒素雰囲気下で約５時間撹拌し、次いでロータリーエバポレーターを使用して、溶媒を蒸発させ、乾燥させた。それを水によってクエンチし、ＤＭＳＯによって希釈した。粗反応混合物は、移動相として酢酸アンモニウムおよびアセトニトリルを使用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製し、無色の液体として産物を得た（９）。収率－６０％。

【0219】

無水ジクロロメタン（１ｍＬ）中の９（１００ｍｇ）の撹拌溶液に、３－クロロ過安息香酸（１０，１．５当量）を添加し、溶液を４５℃で３０分間還流した（スキーム１の（ｖｉ））。撹拌物質が完全に消費された場合、真空下で溶媒を蒸発させ、乾燥させた。次いで、残留物を無水ジクロロメタン（１ｍＬ）中に再溶解し、続いてトリクロロアセチルイソシアネート（１１，２．０当量）を添加し、反応混合物を４５℃で３０分間加熱した（スキーム１の（ｖｉ））。反応の完了後、溶媒を真空下で除去し、残留物を無水ＭｅＯＨ（１ｍＬ）中に再溶解し、その後２５％ナトリウムメトキシドメタノール溶液（０．２ｍＬ）を添加した。次いで、これを７５℃で１時間加熱し、冷却した（スキーム１の（ｖｉ））。溶媒を真空下で除去し、残留物をカラムクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ／ジクロロメタン）を使用して精製し、無色の液体として化合物１２を得た。全収率－４０％。

【0220】

ジクロロメタン（１ｍＬ）中の中間化合物１２（１００ｍｇ）の撹拌溶液に、トリフルオロ酢酸（１０当量）を添加した（スキーム１の（ｖｉｉ））。これを、窒素雰囲気下で約１時間撹拌し、ロータリーエバポレーターを使用して溶媒を蒸発させ、乾燥させた。残留酸の完全な除去後、それをＤＭＳＯ（１ｍＬ）中に溶解した。

【0221】

このＤＭＳＯ溶液に、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（カタログ番号Ｆ７２５０；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（１３，１．２当量）およびＤＩＰＥＡ（２当量）を添加し、溶液を１０分間撹拌した（スキーム１の（ｖｉｉ））。反応は、ＬＣＭＳによってモニターした。開始物質を完全に消費した後、移動相として酢酸アンモニウムおよびアセトニトリルを使用するＨＰＬＣによって精製し、黄色固体として産物（１４）（ＦＩＴＣ－ＴＬＲ７－１ａ）を得た。収率－９０％。
実施例Ｂ
フルオレセイン－薬物コンジュゲートの合成

【0222】

【化60】

【0223】

試薬および条件：（ａ）アミノ－ＰＥＧ_３－アミン、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１時間。（ｂ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（構造は、供給業者から開示されていない）、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＳＯ、１時間。

【0224】

ＦＩＴＣを、ＤＭＳＯ中アミノ－ＰＥＧ_３－アミン（３当量）およびＤＩＰＥＡ（５当量）の溶液に滴下添加した。溶液は、室温で１時間撹拌した。生じた産物は、分取逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した（９２％の収率）。ＦＩＴＣ－ＰＥＧ_３－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ＮＨＳエステル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を得るため、ＦＩＴＣ－ＰＥＧ_３－アミン（２当量）およびＤＩＰＥＡ（５当量）をＤＭＳＯに溶解し、溶液を１時間撹拌した。次いで、産物は、ＨＰＬＣを使用して精製し、９０％の収率で化合物を得た。

【0225】

【化61】

【0226】

試薬および条件：（ｃ）ＨＡＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＳＯ、１２時間。

【0227】

近赤外線（ＮＩＲ）色素、ＨＡＴＵ（１当量）、およびＤＩＰＥＡ（５当量）を、ＤＭＳＯ中に溶解し、２５分間撹拌した後、ＦＩＴＣ－ＰＥＧ_３－アミン（１当量）を添加した。反応は、室温で１２時間撹拌し、産物は、ＨＰＬＣを使用して精製した（７１％）。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【国際調査報告】