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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-18
(54)【発明の名称】調製プロセス
(51)【国際特許分類】
A61K 47/68 20170101AFI20240910BHJP
C07K 1/107 20060101ALI20240910BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240910BHJP
C07K 16/40 20060101ALI20240910BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20240910BHJP
【ＦＩ】
A61K47/68
C07K1/107
C07K16/00
C07K16/40
C07K16/30
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513816
(86)(22)【出願日】2022-09-01
(85)【翻訳文提出日】2024-04-30
(86)【国際出願番号】 AU2022051071
(87)【国際公開番号】W WO2023028658
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】2021902837
(32)【優先日】2021-09-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522003486
【氏名又は名称】テリックス ファーマシューティカルズ （イノベーションズ） ピーティーワイ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】スターリット、オリヴァー ウィリアム
(72)【発明者】
【氏名】ウィートクロフト、マイケル ポール
【テーマコード（参考）】
4C076
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA50
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA50
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、デスフェリオキサミンキレート配位子とタンパク質とで鉄錯体化コンジュゲートを調製するプロセスであって、実質的に中性のｐＨで実施されるプロセスを提供する。また、鉄錯体化コンジュゲートからキレート化鉄を除去するために、鉄錯体化コンジュゲートを、実質的に中性のｐＨで、デスフェリオキサミン、デスフェリオキサミン類似体及びＨＢＥＤから選択される遊離キレート配位子に曝露するプロセスも開示する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
タンパク質と連結したデスフェリオキサミン（desferrioxamine）キレート配位子のコンジュゲートを調製するためのプロセスであって、タンパク質と連結し鉄と錯体を形成したデスフェリオキサミンキレート配位子を含む、鉄錯体化コンジュゲート（iron complexed conjugate）を、実質的に（substantially）中性のｐＨで、デスフェリオキサミン、デスフェリオキサミン類似体（analogue）及びＨＢＥＤ又はそれらの組合せから選択される遊離キレート配位子（free chelating ligand）に曝露することにより、鉄をキレートした前記コンジュゲートの前記デスフェリオキサミンキレート配位子から鉄を除去し、キレート化鉄（chelated iron）を実質的に含まない、前記デスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質に連結したコンジュゲートを得ることを含む、プロセス。
【請求項2】
前記タンパク質がタンパク質標的捕捉剤（protein targeting agent）である、請求項１に記載のプロセス。
【請求項3】
前記タンパク質が抗体である、請求項１又は請求項２に記載のプロセス。
【請求項4】
前記タンパク質がギレンツキシマブ（girentuximab）である、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項5】
前記デスフェリオキサミンキレート配位子が、ＤＦＯ、ＤＦＯ＊、ＤＦＯＳｑ、ＤＦＯＮＣＳ、ＤＦＯ＊Ｓｑ及びＤＦＯ＊ＮＣＳから選択される、請求項１～請求項４のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項6】
前記ペプチド又はタンパク質が、共有結合及びスクシニルから選択される共有結合リンカーを介して前記デスフェリオキサミンキレート配位子に結合している、請求項１～請求項５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項7】
前記鉄錯体化コンジュゲートを前記遊離キレート剤に曝露する工程を周囲温度で実施する、請求項１～請求項６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項8】
前記周囲温度が約２０℃～約２５℃である、請求項７に記載のプロセス。
【請求項9】
前記実質的に中性のｐＨが生理的ｐＨである、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項10】
前記ｐＨが約７～約８である、請求項１～請求項８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項11】
前記ｐＨが、約７．２又は約７．４である、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項12】
前記コンジュゲートを、水を含む溶媒中で前記遊離キレート配位子に曝露する、請求項１～請求項１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項13】
前記デスフェリオキサミン類似体が、ＤＦＯ＊、ＤＦＯＳｑ、ＤＦＯＮＣＳ、ＤＦＯ＊Ｓｑ及びＤＦＯ＊ＮＣＳから選択される、請求項１～請求項１２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項14】
前記鉄錯体化コンジュゲートを、過剰モルの前記遊離キレート剤に曝露する、請求項１～請求項１３のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項15】
前記鉄錯体化コンジュゲートと前記遊離キレート剤とのモル比が約１：５０～約１：５０００である、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項16】
曝露する工程の前に、鉄をキレート化したデスフェリオキサミンキレート配位子をタンパク質とコンジュゲートして、鉄と錯体を形成したデスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質に連結したコンジュゲートを得ることをさらに含む、請求項１～請求項１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項17】
デスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質に連結したコンジュゲートを調製するプロセスであって、実質的に中性のｐＨで、鉄をキレートしたデスフェリオキサミンキレート配位子と極性有機溶媒とを含む第１の組成物と、
タンパク質を含む第２の組成物と、
を組み合わせることにより、鉄と錯体を形成したデスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質と連結した鉄錯体化コンジュゲートを形成することを含む、プロセス。
【請求項18】
前記極性有機溶媒が、アセトニトリル（ＡＣＮ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はそれらの組み合わせを含む、請求項１７に記載のプロセス。
【請求項19】
前記タンパク質に対して過剰モルの、鉄をキレートした前記デスフェリオキサミンキレート配位子を組み合わせることを含む、請求項１７又は請求項１８に記載のプロセス。
【請求項20】
前記過剰モルが、前記タンパク質に対して少なくとも約２モル当量の、鉄にキレートした前記デスフェリオキサミンキレート配位子である、請求項１９に記載のプロセス。
【請求項21】
前記タンパク質と連結し鉄と錯体を形成したデスフェリオキサミンキレート配位子を含む、前記鉄錯体化コンジュゲートを、実質的に中性のｐＨで、デスフェリオキサミン、デスフェリオキサミン類似体及びＨＢＥＤ又はそれらの組み合わせから選択される遊離キレート配位子に曝露することにより、鉄をキレートした前記コンジュゲートの前記デスフェリオキサミンキレート配位子から鉄を除去し、キレート化鉄を実質的に含まない、前記デスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質に連結したコンジュゲートを得ることをさらに含む、請求項１７～請求項２０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項22】
デスフェリオキサミンキレート配位子がタンパク質に連結したコンジュゲートを調製するプロセスであって、鉄をキレートしたデスフェリオキサミンキレート配位子をタンパク質とコンジュゲートして、鉄と錯体を形成した前記デスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質に連結した鉄錯体化コンジュゲートを得ることと、
前記タンパク質と連結し鉄と錯体を形成した、前記デスフェリオキサミンキレート配位子を含む、前記鉄錯体化コンジュゲートを、実質的に中性のｐＨで、デスフェリオキサミン、デスフェリオキサミン類似体及びＨＢＥＤ又はそれらの組合せから選択される遊離キレート配位子に曝露することにより、鉄をキレートしたコンジュゲートのデスフェリオキサミンキレート配位子から鉄を除去し、キレート化鉄を実質的に含まない、前記デスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質に連結したコンジュゲートを得ることと、
を含む、プロセス。
【請求項23】
請求項１～請求項２２のいずれか一項に記載のプロセスによって製造される、タンパク質コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、オーストラリア仮出願第２０２１９０２８３７号（２０２１年９月１日出願）の優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、オーストラリア仮出願第２０２１９０２８３７号（２０２１年９月１日出願）の優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、タンパク質とデスフェリオキサミン（ＤＦＯ）又はその類似体とのコンジュゲートから鉄を除去するためのプロセスに関する。
【背景技術】
【0003】
キレート配位子（chelating ligand）を有するタンパク質コンジュゲートは、例えば、その治療剤、診断剤又はセラノスティック剤として使用できる可能性があるため、継続的に関心が寄せられている。
【0004】
キレート配位子は、典型的には多座であり、好ましくは治療又は診断に有望な核種に対して選択的である。
【0005】
特に商業規模でタンパク質コンジュゲートを調製する際に生じる１つの問題点として、様々な調製段階に必要とされる比較的厳しい合成条件に起因する凝集体の形成がある。タンパク質凝集体は、固体凝集体又は可溶性凝集体であり得る。
【0006】
凝集を軽減する戦略としては、凝集体形成を減少させるコンジュゲートの調製方法又は凝集したタンパク質をタンパク質コンジュゲートから分離する精製方法を適合させることが挙げられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
したがって、凝集体が少なく、意味のある収率で所望のコンジュゲートを得ることが可能な、キレート配位子を有するタンパク質コンジュゲートを調製するための、少なくとも代替的なプロセスを提供することが継続的に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本明細書における任意の先行技術への言及は、この先行技術が任意の管轄区域における共通の一般知識の一部を形成すること、又はこの先行技術が当業者によって理解され、関連性があると見なされ、且つ／又は他の先行技術と組み合わされると合理的に予想され得ることを認めるものでも示唆するものでもない。
【0009】
一態様では、本発明は、ＤＦＯキレート配位子と連結したタンパク質を含むコンジュゲートを調製するためのプロセスであって、鉄をキレートしたコンジュゲートを周囲温度及び中性ｐＨでＥＤＴＡ以外の遊離キレート配位子（free chelating ligand）に曝露することを含むプロセスを提供する。いくつかの実施形態では、前記遊離キレート配位子は、デスフェリオキサミン（desferrioxamine）、デスフェリオキサミン類似体（analogue）及びＨＢＥＤ、又はそれらの組合せから選択される。
【0010】
キレート配位子は、金属と安定な錯体を形成可能な官能基を本質的に含む。コンジュゲート合成の過程で、前記キレート配位子上の配位部位は、ほかの不活性な金属と錯体を形成することによって都合よく保護され得る。例えば、ＤＦＯは、ＤＦＯ－タンパク質コンジュゲートの調製過程で鉄と錯体を形成し得る。保護金属は、特に半減期が比較的短い可能性がある放射性核種については、最終的な治療剤、診断剤又はセラノスティック剤の形成前に除去されなければならない。
【0011】
別の態様では、本発明は、タンパク質と連結したデスフェリオキサミンキレート配位子のコンジュゲートを調製するためのプロセスであって、実質的に中性のｐＨで、鉄をキレートしたデスフェリオキサミンキレート配位子と極性有機溶媒とを含む第１の組成物と、タンパク質を含む第２の組成物とを、組み合わせることにより、鉄と錯体を形成したデスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質と連結した鉄錯体化コンジュゲートを形成することを含む、プロセスを提供する。
【0012】
さらなる態様では、本発明は、タンパク質と連結したデスフェリオキサミンキレート配位子のコンジュゲートを調製するプロセスであって、
鉄をキレートしたデスフェリオキサミンキレート配位子をタンパク質とコンジュゲートして、鉄と錯体を形成した前記デスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質に連結した鉄錯体化コンジュゲートを得ることと、
前記タンパク質と連結し鉄と錯体を形成した、前記デスフェリオキサミンキレート配位子を含む、前記鉄錯体化コンジュゲートを、実質的に中性のｐＨで、デスフェリオキサミン、デスフェリオキサミン類似体及びＨＢＥＤ又はそれらの組合せから選択される遊離キレート配位子に曝露することにより、鉄をキレートしたコンジュゲートのデスフェリオキサミンキレート配位子から鉄を除去し、実質的にキレート化鉄を含まない、前記デスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質に連結したコンジュゲートを得ることとを、
含む、プロセスを提供する。
鉄をキレートしたデスフェリオキサミンキレート配位子をタンパク質とコンジュゲートして、鉄と錯体を形成した前記デスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質に連結した鉄錯体化コンジュゲートを得ることと、
前記タンパク質と連結し鉄と錯体を形成した、前記デスフェリオキサミンキレート配位子を含む、前記鉄錯体化コンジュゲートを、実質的に中性のｐＨで、デスフェリオキサミン、デスフェリオキサミン類似体及びＨＢＥＤ又はそれらの組合せから選択される遊離キレート配位子に曝露することにより、鉄をキレートしたコンジュゲートのデスフェリオキサミンキレート配位子から鉄を除去し、実質的にキレート化鉄を含まない、前記デスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質に連結したコンジュゲートを得ることとを、
含む、プロセスを提供する。
【0013】
別の態様は、本発明のプロセスによって製造されるタンパク質コンジュゲートを提供する。
【0014】
選択した定義
化学用語は、それらの一般的な意味を有することが意図される。
化学用語は、それらの一般的な意味を有することが意図される。
【0015】
「アルキル」という用語は、飽和直鎖炭化水素基及び分岐鎖炭化水素基を含むことが意図される。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１～１２個、１～１０個、１～８個、１～６個又は１～４個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、アルキル基は、５～２１個、９～２１個又は１１～２１個の炭素原子、例えば、１１個、１３個、１５個、１７個又は１９個の炭素原子を有する。直鎖アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル及びｎ－オクチルが挙げられるが、これらに限定されない。分岐アルキル基の例としては、イソプロピル、ｉｓｏ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ネオペンチル、イソペンチル及び２，２－ジメチルプロピルが挙げられるが、これらに限定されない。
【0016】
「ハロ」という用語は、クロロ（－Ｃｌ）基、ブロモ（－Ｂｒ）基、フルオロ（－Ｆ）基及びヨード（－Ｉ）基を含むことが意図される。いくつかの実施形態では、ハロは、クロロ、ブロモ及びフルオロから選択されてもよく、好ましくはフルオロから選択される。
【0017】
本明細書で使用される場合、「セラノスティック」という用語は、化合物／材料が診断及び治療に使用できるものであることを指す。「セラノスティック試薬」という用語は、患者の疾患又は病態の検出、診断及び／又は治療の両方に適した任意の試薬に関するものでる。セラノスティック化合物／材料の目的は、異なる診断剤と治療剤との間にみられる生体内分布及び選択性の望ましくない差を克服することである。
【0018】
本明細書で使用される場合、「及び（並びに）／又は（若しくは）」という用語は、「及び（並びに）」若しくは「又は（若しくは）」、又はその両方を意味する。
【0019】
名詞の後に続く「（ｓ）」という用語は、単数形及び複数形、又はその両方を意図する。
【0020】
本明細書で使用される場合、文脈から別段必要とされる場合を除き、用語「含む」並びに、「含んでいる」、「含む」及び「含まれる」などの前記用語の変化形は、さらなる添加物、構成要素、整数及び工程を除外することを意図するものではない。
【0021】
本明細書に開示されている数の範囲（例えば、１～１０）への言及には、その範囲内のすべての有理数（例えば、１、１．１、２、３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９及び１０）への言及、及びその範囲内の任意の範囲の有理数（例えば、２～８、１．５～５．５及び３．１～４．７）への言及も包含され、したがって、本明細書に明示的に開示されているすべての範囲のすべての部分範囲が本明細書に明示的に開示されていることが意図される。これらは具体的に意図されるものの例に過ぎず、列挙される最低値と最高値の間にある数値の可能な組み合わせはすべて、本出願で同様に明示的に記載されているものと見なされるべきである。
【0022】
本発明の様々な特徴は、特定の値又は値の範囲を参照しながら説明される。これらの値は、様々な適切な測定技術の結果に関連することが意図されるものであり、したがって、任意の特定の測定技術に固有の誤差の範囲を含むものと解釈されるべきである。本明細書で言及される値の一部は、少なくとも部分的にこの変動を説明するために、「約」という用語で示される。「約」という用語は、値を記載するために使用される場合、その値の±１０％、±５％、±１％又は±０．１％以内の量を意味し得る。
【0023】
文脈上別段の指示がない限り、任意の実施形態を、本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせてもよい。
【0024】
本発明のさらなる態様及び上述の諸段落に記載された態様のさらなる実施形態は、実施例として記載され、添付の図面を参照する、以下の説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】実施例３に記載のＤＦＯトランスキレーション条件について、本明細書に記載のプロセスの様々な工程にわたってサイズ排除クロマトグラフィ高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）によって求めた、単量体に対する高分子量凝集体のパーセント（％ＨＭＷ）のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0026】
本発明は、タンパク質と連結したＤＦＯキレート配位子のコンジュゲートを調製するプロセスに関する。本明細書に記載されるコンジュゲートは、ＤＦＯキレート配位子とタンパク質とをコンジュゲートすることによって好都合に調製され得る。前記ＤＦＯキレート配位子は、典型的には、ＤＦＯキレート剤の保護基として働く鉄と錯体を形成している。コンジュゲーション後、鉄保護基をトランスキレーションによって除去し得る。これらの工程をそれぞれ別々に実施してもよく、又は、好ましい実施形態では、これらの工程を一般には市販の出発材料から順次、実施してもよい。
【0027】
本明細書に記載のプロセスは、本明細書に記載の改良されたコンジュゲーション工程及び／又はトランスキレーション工程のいずれか又は両方を含む。改良されたコンジュゲーション工程のみによって製造したコンジュゲートを、（ＥＤＴＡを介するトランスキレーションを含めた）当技術分野で公知の任意の手段によってさらに処理し得ることが理解されよう。さらに、当技術分野で公知の任意の手段によって調製したコンジュゲートを、本明細書に記載のいずれかのトランスキレーション条件に供し得る。また、あるプロセスは、本明細書に記載のコンジュゲーション工程及びトランスキレーション工程の両方を含み得ることも理解されよう。
【0028】
コンジュゲーション
一態様では、プロセスは、鉄と錯体を形成したデスフェリオキサミンキレート配位子をタンパク質とコンジュゲート（又はカップリング）することを含む、コンジュゲートを形成する工程を含む。この工程を当技術分野で公知の任意の既知のコンジュゲーション技術によって実施してもよい。
一態様では、プロセスは、鉄と錯体を形成したデスフェリオキサミンキレート配位子をタンパク質とコンジュゲート（又はカップリング）することを含む、コンジュゲートを形成する工程を含む。この工程を当技術分野で公知の任意の既知のコンジュゲーション技術によって実施してもよい。
【0029】
コンジュゲートする工程は、実質的に中性のｐＨで実施するのが好都合であり得る。本発明より前には、コンジュゲートする工程にはｐＨの上昇が好ましいと考えられていたが、本発明者らは、驚くべきことに、カップリング反応が実質的に中性のｐＨの下で進行することを発見した。一部のタンパク質カップリングパートナーは高ｐＨ（例えばｐＨ＞８）下で分解され得るため、実質的に中性のｐＨが有利である。これらのタンパク質カップリングパートナーは、変性によって、又は望ましくない高分子量凝集体を形成することによって、分解され得る。さらに、コンジュゲーション工程及びトランスキレーション工程の両方を含む本明細書に記載のプロセスの諸態様及び諸実施形態では、両方の工程にわたって実質的に同じｐＨ条件を維持することが可能であることによって、時間のかかる工程間の滴定が回避されるため、製造プロセス全体の時間が短縮される。
【0030】
前記コンジュゲーション工程は、実質的に中性のｐＨで実施するのが有利である。本発明者らは、コンジュゲーション反応が、実質的に中性のｐＨで、以前は必須であると考えられていた高ｐＨ条件に少なくとも匹敵する収率で進行する（ｐＨ７．２とｐＨ８．４とｐＨ９．６とを比較する実施例１を参照されたい）ことを示した（実施例を参照されたい）。この工程では、許容可能なコンジュゲートとタンパク質との比が達成され、前記プロセスによって凝集体形成が回避される。いくつかの実施形態では、前記コンジュゲーション工程のｐＨは、前記トランスキレーション工程のｐＨと実質的に同じである。したがって、いくつかの実施形態では、前記ｐＨは約７～約８である。いくつかの実施形態では、前記ｐＨは、生理的ｐＨ、例えば約７．４である。いくつかの実施形態では、前記ｐＨは、約７．２である。前記コンジュゲートは、既に三次構造を取っている可能性のあるタンパク質を含むため、実質的に中性のｐＨ（及び／又は生理的ｐＨ）を維持することは、前記コンジュゲートが、前記タンパク質の三次構造の溶媒に露出している位置に形成され、前記タンパク質の目的とする機能に干渉する可能性を減じるようにするのに有利である。
【0031】
鉄をキレートしたデスフェリオキサミンキレート配位子を前記タンパク質と直接連結させてもよく、又は、これらの部分を連結基を介して連結させてもよい。前記連結基は、本明細書に記載される連結基のいずれかを含めた任意の適切な連結基であり得る。
【0032】
前記コンジュゲートする工程は、任意の適切な溶媒中で実施してもよく、典型的には、前記タンパク質を水性担体中に、好ましくは水性緩衝液中に準備し、前記ＤＦＯキレート配位子を、極性有機溶媒を含む組成物として準備してもよい。
【0033】
したがって、典型的には、前記第２の組成物は、水をさらに含んでいてもよく、好ましくは水性緩衝液をさらに含んでいてもよい。任意の適合する水性緩衝液を使用し得る。適切な緩衝液としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記第２の組成物は、前記第１の組成物と組み合わせる前に有機溶媒を実質的に含まない。
【0034】
前記第１の組成物は、水と混和性の任意の極性有機溶媒、例えばアセトニトリル（ＡＣＮ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はそれらの組み合わせを含み得る。
【0035】
いくつかの実施形態では、（例えば、抗体などの前記タンパク質を含む）前記第２の組成物を（例えば、鉄をキレートしたＤＦＯ部分を含む）前記第１の組成物に加えてもよい。しかし、典型的には、前記第１の組成物を前記第２の組成物に加える。前記第１の組成物と前記第２の組成物を、任意の適切な手段によって、任意の適切な速度で、組み合わせ得る。
【0036】
これらの実施形態では、前記第１の組成物中の鉄錯体化ＤＦＯキレート配位子の最小濃度は、約１．２５ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌであり得る。キレート配位子の最大濃度は、約１０ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌ又は５ｍｇ／ｍｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、溶媒を含む前記第１の組成物中のキレート配位子の濃度は、約１．２５ｍｇ／ｍｌ～約１０ｍｇ／ｍｌ又は１．５ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌであり得る。前記第２の組成物は、典型的には水性であることから、タンパク質の安定性に影響を及ぼし得る極性有機溶媒の添加を最小限に抑えるために、前記第１の組成物中のＤＦＯキレート配位子の濃度は高い方が好ましい。
【0037】
前記デスフェリオキサミンキレート配位子は、鉄との錯体として準備するのが好都合である。前記鉄は、鉄（ＩＩ）又は鉄（ＩＩＩ）であり得る。典型的には、前記鉄を前記デスフェリオキサミンキレート配位子でキレート化する。
【0038】
前記タンパク質とのコンジュゲーション前の前記デスフェリオキサミンキレート配位子を、前記コンジュゲーション反応のための活性化基又は活性化基を形成することができる基で官能化してもよい。例えば、前記デスフェリオキサミンキレート配位子は、カルボン酸、酸ハロゲン化物（例えば、酸塩化物）、混合無水物又は活性化エステル（例えば、テトラフルオロフェニルエステル）の形態で活性化されている、カルボニル部分を含み得る。典型的には、前記コンジュゲーション工程は、前記タンパク質のアミノ酸残基の側鎖とアミド結合又はエステル結合を形成することを含む。
【0039】
前記タンパク質とのコンジュゲーション前の前記デスフェリオキサミンキレート配位子は、所望の連結基に対応する部分を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、前記ＤＦＯキレート配位子は、一端がＤＦＯに連結しており、他端が、前記コンジュゲーション反応のための活性化基又は活性化基を形成することができる基で官能化されている、スクシニル部分を含む。
【0040】
いくつかの実施形態では、前記連結基は、鉄と錯体を形成した前記デスフェリオキサミンキレート配位子に連結した第１の部分と前記タンパク質に連結した第２の部分とで分けられ得る。これらの実施形態では、前記コンジュゲートする工程は、前記第１の部分と前記第２の部分とをカップリングして、前記連結基を、したがって前記コンジュゲートを形成することを含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質を前記連結基で官能化し、次いで、それを鉄と錯体を形成した前記デスフェリオキサミンキレート配位子とコンジュゲートする。
【0042】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質と、前記連結基と、鉄と錯体を形成したデスフェリオキサミンキレート配位子とが、三成分カップリングでコンジュゲートされ、前記タンパク質と前記連結基との間、及び前記連結基と、鉄と錯体を形成した前記デスフェリオキサミンキレート配位子との間で、結合が形成される。
【0043】
典型的には、前記コンジュゲートする工程では、過剰モル量の前記デスフェリオキサミンキレート配位子を前記タンパク質に対して供する。例えば、前記デスフェリオキサミンキレート配位子を前記タンパク質に対して少なくとも約１．１：１、１．５：１、１．６：１、１．７：１、１．８：１、１．９：１、２：１、２．１：１、２．２：１、２．３：１、２．４：１、２．５：１、２．６：１、２．７：１、２．８：１、２．９：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、７．５：１、８：１、９：１、１０：１、１１：１又は１２：１の最小過剰量で供し得る。タンパク質に対するデスフェリオキサミンキレート配位子の最大過剰モル量は、約１００：１、９０：１、８０：１、７０：１、６０：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１５：１、１２．５：１、１０：１、８：１、７．５：１、７：１、６．５：１、６：１又は５：１以下であり得る。前記コンジュゲートする工程における前記デスフェリオキサミンキレート配位子と前記タンパク質とのモル比は、最小値が最大値よりも小さい限り、上記の最小値のいずれかから任意の最大値までであってもよく、例えば、約１．１：１～約１００：１又は約１．５：１～約１５：１、約２：１～約８：１、又は約１．１：１～約５：１であってもよい。
【0044】
いくつかの実施形態では、前記プロセスは、コンジュゲーション後に精製工程を含まず、鉄と錯体を形成し前記コンジュゲーション反応のための活性化基又は活性化基を形成することができる基で任意に官能化された未反応のデスフェリオキサミンキレート配位子の存在下で、前記鉄錯体化コンジュゲートを、本明細書に記載の曝露工程に供する。
【0045】
トランスキレーション
一態様では、本明細書に記載のプロセスは、鉄錯体化形態のコンジュゲートを、実質的に中性のｐＨで前遊離キレート配位子に曝露することを含む。前記鉄錯体化コンジュゲートは、前記ＤＦＯキレート配位子への鉄キレート化を含む。前記遊離キレート配位子は、ＥＤＴＡ以外の任意の鉄キレート剤であってもよい。
一態様では、本明細書に記載のプロセスは、鉄錯体化形態のコンジュゲートを、実質的に中性のｐＨで前遊離キレート配位子に曝露することを含む。前記鉄錯体化コンジュゲートは、前記ＤＦＯキレート配位子への鉄キレート化を含む。前記遊離キレート配位子は、ＥＤＴＡ以外の任意の鉄キレート剤であってもよい。
【0046】
ＤＦＯ及び（ＤＦＯ＊、ＤＦＯｓｑ、ＤＦＯＮＣＳ、ＤＦＯ＊ｓｑ及びＤＦＯ＊ＮＣＳを含めた）その類似体は、治療、診断及び／又はセラノスティックスに有望な所望の核種に対して選択的なキレート配位子である。具体的には、ＤＦＯ及びその類似体は、８９Ｚｒに対する選択的キレート剤である。８９Ｚｒは、半減期が３．３日に及ぶベータプラスエミッター（ａｖ）（０．３９６ＭｅＶ）である。８９Ｚｒは、陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）画像化に応用できる可能性があり、タンパク質コンジュゲート（本発明の方法によって製造されるものなど）に含ませると、抗体の循環半減期と一致する３．３日という長時間にわたる半減期のため、免疫ＰＥＴ（イムノＰＥＴ）画像化において特に興味深いものとなる。イムノＰＥＴ画像化では、適切な抗体にコンジュゲートされた放射性核種複合体を使用することによって、腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原の発現に基づいて腫瘍が画像化される。
【0047】
ジルコニウムに加えて、ＤＦＯ及びその類似体も鉄のキレート剤である。合成的変換によってＤＦＯを取り扱うための従来のプロセスは、鉄キレート化ＤＦＯを含むのが好都合である。鉄キレート化形態のＤＦＯは、保護形態として働き、ＤＦＯの配位部位に連結し、それらが他のいくつかの合成的変換に関与するのを妨げる。
【0048】
コンジュゲートのＤＦＯのキレート部分にキレート化された鉄原子は、任意の適切な形態であり得る。例えば、前記鉄は、鉄（ＩＩ）若しくは鉄（ＩＩＩ）又はそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、前記鉄は鉄（ＩＩ）である。他の実施形態では、前記鉄は鉄（ＩＩＩ）である。
【0049】
前記鉄錯体化コンジュゲートへの前記遊離キレート配位子の曝露は、実質的に中性のｐＨで実施するのが有利である。本発明者らは、本プロセスのこの工程で実質的に中性のｐＨを維持することによって、凝集体形成が回避され、したがって、収率が大幅に改善されることを示した（実施例を参照されたい）。いくつかの実施形態では、前記鉄錯体化コンジュゲートへの前記遊離キレート配位子の曝露を、約７～約８のｐＨで実施する。いくつかの実施形態では、前記実質的に中性のｐＨは、生理的ｐＨであり、典型的には約７．４である。いくつかの実施形態では、前記ｐＨは、約７．２である。コンジュゲートは、既に三次構造を取っている可能性のあるペプチドを含むため、実質的に中性のｐＨ（及び／又は生理的ｐＨ）を維持することは、凝集体形成の回避に役立つと考えられる。
【0050】
前記鉄錯体化コンジュゲートを前記遊離キレート配位子に曝露すると、コンジュゲートに連結した鉄が実質的に除去され得る。鉄の除去は事実上、ＤＦＯキレート部分から遊離キレート配位子への鉄の移動であり、したがって、本明細書ではトランスキレーション工程又はトランスキレーションプロセスと称されることがある。いくつかの実施形態では、トランスキレーション後、コンジュゲートは、約１ｐｐｍ、０．７５ｐｐｍ、０．５ｐｐｍ、０．４ｐｐｍ、０．３ｐｐｍ、０．２５ｐｐｍ又は０．２ｐｐｍ以下の錯体化鉄を含み得る。錯体化鉄を実質的に含まないコンジュゲートは、検出可能な濃度ゼロから上記のいずれかの濃度までの錯体化鉄を含んでもよく、例えば、検出可能な量ゼロから約１ｐｐｍまでの錯体化鉄又は検出可能な量ゼロから０．３ｐｐｍまでの錯体化鉄を含んでもよい。トランスキレーション後の錯体化鉄の濃度は、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ－ＭＳ）によって測定され得る。
【0051】
タンパク質
本発明の方法によって製造されるコンジュゲートのタンパク質は、前記デスフェリオキサミンキレート配位子とコンジュゲートすることができ、望ましくない凝集体を形成する可能性のある、任意のタンパク質であり得る。
本発明の方法によって製造されるコンジュゲートのタンパク質は、前記デスフェリオキサミンキレート配位子とコンジュゲートすることができ、望ましくない凝集体を形成する可能性のある、任意のタンパク質であり得る。
【0052】
前記凝集体は、微粒子を形成し、それらが形成された溶液から沈殿し得る不溶性凝集体であってもよく、又は前記凝集体は可溶性凝集体であってもよい。本明細書で使用される場合、「凝集体」という用語は、前記タンパク質の高分子量（ＨＭＷ）凝集体、典型的には、二量体よりも大きい多量体を含むものと理解される。前記凝集体は、微粒子を形成し、それらが形成された溶液から沈殿し得る不溶性凝集体であってもよく、又は前記凝集体は可溶性凝集体であってもよい。
【0053】
特に関心のあるＤＦＯ－タンパク質コンジュゲートの種類の１つは、タンパク質部分が、投与後に被験体内にコンジュゲートを局在化させて、例えばＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ又はそれ以外の適切な画像化技術による画像化を補助することができるものである。したがって、いくつかの実施形態では、前記タンパク質はタンパク質標的捕捉剤（protein targeting agent）であり得る。
【0054】
本明細書で使用される場合、「タンパク質標的捕捉剤」は、
１．（遊離形態であっても放射性核種などの核種をキレート化するときであっても）前記デスフェリオキサミンキレート基との安定なコンジュゲーションが可能であり、
２．取り扱う過程で有害な凝集体を形成する可能性があり、
３．投与後、被験体内で局在化する（例えば、前記タンパク質標的捕捉剤は、１又は複数の器官、細胞小器官、細胞型又は受容体型に局在し得る）ことが可能である、
任意のタンパク質を指す。
１．（遊離形態であっても放射性核種などの核種をキレート化するときであっても）前記デスフェリオキサミンキレート基との安定なコンジュゲーションが可能であり、
２．取り扱う過程で有害な凝集体を形成する可能性があり、
３．投与後、被験体内で局在化する（例えば、前記タンパク質標的捕捉剤は、１又は複数の器官、細胞小器官、細胞型又は受容体型に局在し得る）ことが可能である、
任意のタンパク質を指す。
【0055】
前記タンパク質標的捕捉剤は、ポリペプチド、ある特定の生物学的標的に結合することができる、又はある特定の代謝活性を発現することができるタンパク質（例えば、抗体及びその誘導体、例えばナノボディ、ダイアボディ、抗体フラグメントなど）であり得る。
【0056】
適切な標的化剤の非限定的な例としては、ＶＥＧＦ受容体を標的とする分子、ボンベシン又はＧＲＰ受容体を標的とする分子の類似体、ソマトスタチン受容体を標的とする分子、ＲＧＤペプチド又はａｖｐ３及びａｖＰ５を標的とする分子、アネキシンＶ又はアポトーシス過程を標的とする分子、エストロゲン受容体を標的とする分子、プラークを標的とする生体分子、ＰＳＭＡを標的とする分子、炭酸脱水酵素を標的とする分子（例えば、炭酸脱水酵素ＩＸ；ＣＡＩＸ）が挙げられる。
【0057】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、ナノボディ、ダイアボディ、抗体フラグメントなどを含めた抗体又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、抗体又はその抗原結合フラグメントである。
【0058】
任意の実施形態では、前記タンパク質は、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）に結合するための抗体又はその抗原結合フラグメントである。好ましい抗体はｃＧ２５０、好ましくはギレンツキシマブ（girentuximab）（ＩＮＮ）であり、本明細書ではＧｍＡｂとも称される。別の特に好ましい実施形態は、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭＡＣＣ２５２６によって産生されるモノクローナル抗体Ｇ２５０である。抗体ｃＧ２５０は、本来のマウスモノクローナル抗体ｍＧ２５０のｌｇＧ１カッパ軽鎖キメラ型である。その抗原結合フラグメントの抗体はまた、ギレンツキシマブのヒト化形態であってもよい。特に好ましい実施形態では、前記ＣＡＩＸに結合するための抗体は、国際公開第２０２１／００００１７号パンフレットに記載されている抗体であり、上記パンフレットの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0059】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質はポリペプチドである。前記ポリペプチドは、少なくとも約２０個、２５個又は３０個アミノ酸残基の最小限の配列を含み得る。前記ポリペプチドは、最大約３５個、４０個、４５個又は５０個のアミノ酸残基を含み得る。前記ポリペプチドは、例えば約２０個～約５０個のアミノ酸残基を含めた、上記の最小値のいずれかから任意の最大値までの任意のアミノ酸配列長を含み得る。ペプチドの凝集については、Ｚａｐａｄｋａ ＫＬ、Ｂｅｃｈｅｒ ＦＪ、Ｇｏｍｅｓ ｄｏｓ Ｓａｎｔｏｓ ＡＬ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＳＥによる（２０１７）「Ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｆｏｃｕｓ第７巻、２０１７００３０、ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９８／ｒｓｆｓ．２０１７．００３０で概説されており、上記文献は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0060】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、天然タンパク質であり、その供給源から単離される。いくつかの実施形態では、前記タンパク質は合成又は半合成である。前記タンパク質は、所望のタンパク質を形成する直接的なアミノ酸合成、組換え技術及びフラグメントの連結を含めた、当技術分野で公知の任意の手段によって調製され得る。
【0061】
リンカー
コンジュゲートは、前記ＤＦＯキレート剤と連結した前記タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質とＤＦＯキレート剤は、共有結合を介して直接結合している。いくつかの実施形態では、前記タンパク質とＤＦＯキレート剤は、連結基を介して結合している。
コンジュゲートは、前記ＤＦＯキレート剤と連結した前記タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質とＤＦＯキレート剤は、共有結合を介して直接結合している。いくつかの実施形態では、前記タンパク質とＤＦＯキレート剤は、連結基を介して結合している。
【0062】
いくつかの実施形態では、前記連結基は二官能性リンカーである。前記二官能性リンカーは、前記ＤＦＯキレート剤と前記タンパク質とを共有結合によって連結させることができる、任意のジラジカル種であり得る。
【0063】
適切な二官能性リンカーとしては、ブロモアセチル、チオール、スクシンイミドエステル（例えばスクシニル）、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル、マレイミド、（天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を含めた）アミノ酸、ニコチンアミド、ニコチンアミド誘導体、又は当技術分野で公知の任意のアミン系若しくはチオール系修飾化学物質の使用が挙げられる。
【0064】
いくつかの実施形態では、前記二官能性リンカーはスクシニルである。
【0065】
いくつかの実施形態では、前記二官能性リンカーは、前記ＤＦＯキレート部分と前記タンパク質との間で２個～１０個の原子の最長線形経路を定める一連の原子を含む。
【0066】
いくつかの実施形態では、前記二官能性リンカーは、－Ｏ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＲＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ－から選択される１又は複数の基によって任意に中断される、Ｃ１～１０アルキル又はハロＣ１～１０アルキルであってもよく、上式中、Ｒは、Ｈ及びＣ１～４アルキルから選択される。
【0067】
いくつかの実施形態では、前記二官能性リンカーは、キレート部分を含み得る。これらの実施形態では、前記リンカーのキレート部分は、（１又は複数の）異なる放射性核種を前記ＤＦＯキレート配位子に連結させ得る。いくつかの実施形態では、前記キレート部分は、６－ヒドラジニルニコチンアミド部分であり得る。前記６－ヒドラジニルニコチンアミド部分は、典型的には、テクネチウム－９９（９９ｍＴｃ）に結合する。
【0068】
遊離キレート配位子
本明細書に記載のプロセスは、鉄連結形態のＤＦＯキレート配位子－タンパク質コンジュゲートを遊離キレート配位子に曝露することを含む。前記ＤＦＯキレート部分をコンジュゲーション工程で、その鉄連結形態で前記タンパク質とコンジュゲートして、望ましくない化学反応から前記ＤＦＯキレート部分を効果的に保護する。
本明細書に記載のプロセスは、鉄連結形態のＤＦＯキレート配位子－タンパク質コンジュゲートを遊離キレート配位子に曝露することを含む。前記ＤＦＯキレート部分をコンジュゲーション工程で、その鉄連結形態で前記タンパク質とコンジュゲートして、望ましくない化学反応から前記ＤＦＯキレート部分を効果的に保護する。
【0069】
好ましくは、前記遊離キレート配位子は、ＥＤＴＡよりも鉄に対して高い親和性を有する。したがって、典型的には、前記遊離キレート配位子はＥＤＴＡ以外のものである。
【0070】
また、好ましくは、前記遊離キレート配位子は、鉄に対して、前記コンジュゲートのＤＦＯキレート部分と同等の、又はそれより優れた親和性を有する。
【0071】
ＥＤＴＡは、広く使用されている鉄キレート剤である。その使用は、生体システムで例えばキレート療法として使用される場合を含め、化学変換において鉄と連結し、溶液から鉄を除去するためであることが記載されている。しかし、本明細書に記載のタンパク質コンジュゲートのＤＦＯキレート部分による鉄のキレート化の阻害には、高温及び低ｐＨが必要であった（実施例１及び２）。これらの反応条件は、タンパク質コンジュゲートの不可逆的凝集の形成を生じさせ、収率の著しい低下をもたらした。驚くべきことに、本発明者らは、鉄連結コンジュゲート中間体をＥＤＴＡ以外のキレート配位子に曝露することによって、高温の必要性が回避され、反応を周囲温度で進行させることが可能になることを発見した。さらなる試験により、高温であっても、実質的に中性のｐＨで反応を実施すると、凝集体の形成が回避されることが明らかになった（実施例２）。
【0072】
遊離キレート配位子は鉄のキレート剤である。前記遊離キレート配位子は、二座、三座、四座、五座、六座、七座又は八座であり得る。
【0073】
前記遊離キレート配位子は、ＤＦＯ、ＤＦＯ類似体及びＮ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ－二酢酸（ＨＢＥＤ）又はそれらの組合せから選択され得る。
【0074】
いくつかの実施形態では、前記遊離キレート配位子は、ＤＦＯ又はその類似体である。
【0075】
いくつかの実施形態では、前記遊離キレート配位子はＨＢＥＤである。
【0076】
いくつかの実施形態では、前記遊離キレート配位子は、（６，６”－ビス［Ｎ，Ｎ”，Ｎ”’－テトラ（カルボキシメチル）アミノメチル）－４’－（３－アミノ－４－メトキシフェニル）－２，２’：６’，２”－テルピリジン）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’－四酢酸、テトラキセタンとしても知られている）、ＴＣＭＣ（ＤＯＴＡのテトラ－第１アミド）、ＤＯ３Ａ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリス（酢酸）－１０－（２－チオエチル）アセトアミド）、ＣＢ－ＤＯ２Ａ（４，１０－ビス（カルボキシメチル）－１，４，７，１０－テトラアザビシクロ［５．５．２］テトラデカン）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－三酢酸）Ｄｉａｍｓａｒ（３，６，１０，１３，１６，１９－ヘキサアザビシクロ［６．６．６］エイコサン－１，８－ジアミン）、ＤＴＰＡ（ペンテト酸又はジエチレントリアミン五酢酸）、ＣＨＸ－Ａ”－ＤＴＰＡ（［（Ｒ）－２－アミノ－３－（４－イソチオシアナトフェニル）プロピル］－トランス－（Ｓ，Ｓ）－シクロヘキサン－１，２－ジアミン－五酢酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－四酢酸）、Ｔｅ２Ａ（４，１１－ビス（カルボキシメチル）－１，４，８，１１－テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン）、ＨＢＥＤ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ－二酢酸）、ＤＦＯ（デスフェリオキサミン）並びにその類似体又は誘導体、例えばＤＦＯ＊及びＤＦＯｓｑ（ＤＦＯ－スクアラミド）、ＨＹＮＩＣ（６－ヒドラジノニコチンアミド）及びＨＯＰＯ（３，４，３－（ＬＩ－１，２－ＨＯＰＯ）など、又は本明細書に記載の他の配位子又はその誘導体からなる群より選択される。適切な誘導体は、分子の非配位部分への修飾を含み、カルボキシル基の代わりにアミドが存在するなど、官能基相互変換を含み得る。
【0077】
いくつかの実施形態では、前記遊離キレート配位子は、コンジュゲートに含まれるＤＦＯキレート部分と一致し、例えば、前記ＤＦＯキレート部分はＤＦＯ＊であってもよく、これらの実施形態では、前記遊離キレート配位子はＤＦＯ＊も含み得る。
【0078】
鉄をキレートしたコンジュゲートに対して過剰モルの前記遊離キレート配位子を使用してよい。遊離キレート配位子の当量数を増加させることは、コンジュゲート連結キレート剤と遊離キレート剤との間の鉄キレート化の平衡を利用することによって、鉄キレート化を阻害するのに役立ち得る。しかし、コストの観点からみて、及び反応生成物の精製が複雑になる可能性があることから、不必要に過剰な試薬を避けることが望ましい。
【0079】
いくつかの実施形態では、鉄をキレートしたコンジュゲートに対する前記遊離キレート配位子の最小モル当量数は、少なくとも約５０モル当量、５５モル当量、６０モル当量、６５モル当量、７０モル当量、７５モル当量、８０モル当量、９０モル当量、１００モル当量、１１０モル当量、１２０モル当量、１３０モル当量、１４０モル当量、１５０モル当量、２００モル当量、２５０モル当量、３００モル当量、２５０モル当量、４００モル当量、４５０モル当量、５００モル当量、５５０モル当量、６００モル当量、６５０モル当量、７００モル当量、７５０モル当量、８００モル当量、８５０モル当量、９００モル当量、９５０モル当量、１０００モル当量、１１００モル当量、１２００モル当量、１３００モル当量、１４００モル当量又は１５００モル当量であり得る。鉄をキレートしたコンジュゲートに対する前記遊離キレート配位子の最大モル当量数は、約５０００モル当量、４７５０モル当量、４５００モル当量、４２５０モル当量、４０００モル当量、３７５０モル当量、３５００モル当量、３２５０モル当量、３０００モル当量、２７５０モル当量、２５００モル当量、２２５０モル当量、２０００モル当量、１７５０モル当量、１５００モル当量、１２５０モル当量、１０００モル当量、７５０モル当量、５００モル当量、４５０モル当量、４００モル当量、３５０モル当量、３００モル当量、２７５モル当量、２５０モル当量、２２５モル当量、２００モル当量、１７５モル当量又は１５０モル当量以下であり得る。鉄をキレートしたコンジュゲートに対する前記遊離キレート配位子の当量数は、選択する最小値が最大値よりも小さい限り、上記の最小量のいずれかから上記の最大量のいずれかまでであってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、前記遊離キレート配位子のモル当量数は、鉄をキレートしたコンジュゲートに対して約５０～約５０００モル当量、約１００～約２００モル当量又は約１２００～約２０００モル当量である。
【0080】
あるいは、モル当量数をモル比で表してもよい。前記鉄連結コンジュゲートに対して前記遊離キレート配位子の過剰モルが５０であることを、前記鉄連結コンジュゲートと前記遊離キレート配位子とのモル比１：５０で表してもよい。したがって、いくつかの実施形態では、前記鉄錯体化コンジュゲートと前記遊離キレート配位子との最小比は、少なくとも約１：５０、１：５５、１：６０、１：６５、１：７０、１：７５、１：８０、１：９０、１：１００、１：１１０、１：１２０、１：１３０、１：１４０、１：１５０、１：２００、１：２５０、１：３００、１：２５０、１：４００、１：４５０、１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、１：１０００、１：１１００、１：１２００、１：１３００、１：１４００又は１：１５００であり得る。前記鉄錯体化コンジュゲートと前記遊離キレート配位子との最大比は、約１：５０００モル当量、１：４７５０モル当量、１：４５００モル当量、１：４２５０モル当量、１：４０００モル当量、１：３７５０モル当量、１：３５００モル当量、１：３２５０モル当量、１：３０００モル当量、１：２７５０モル当量、１：２５００モル当量、１：２２５０モル当量、１：２０００モル当量、１：１７５０モル当量、１：１５００モル当量、１：１２５０モル当量、１：１０００モル当量、１：７５０モル当量、１：５００モル当量、１：４５０モル当量、１：４００モル当量、１：３５０モル当量、１：３００モル当量、１：２７５モル当量、１：２５０モル当量、１：２２５モル当量、１：２００モル当量、１：１７５モル当量又は１：１５０モル当量以下であり得る。前記鉄錯体化コンジュゲートと前記遊離キレート配位子との比は、最小比が最大比よりも小さい限り、上記の最小比のいずれかから任意の最大比までであってもよく、例えば、約１：５０～約１：５０００、約１：１００～約１：２００又は約１：１２００～約１：２０００であってもよい。
【0081】
前記遊離キレート配位子を任意の適切な形態で前記鉄錯体化コンジュゲートと組み合わせてもよい。いくつかの実施形態では、前記遊離キレート配位子を液体組成物として準備するのが好都合であり得る。前記液体組成物は、溶媒などの液体担体を含み得る。典型的には、前記液体組成物は、遊離キレート配位子の水溶液である。前記液体組成物中の遊離キレート配位子の最小濃度は、少なくとも約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ又は６５ｍＭであり得る。前記液体組成物中の遊離キレート配位子の最大濃度は、約２００ｍＭ、１７５ｍＭ、１５０ｍＭ、１２５ｍＭ、１００ｍＭ、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７５ｍＭ又は７０ｍＭ以下であり得る。前記液体組成物中の遊離キレート配位子の濃度は、上記の最小濃度のいずれかから上記のこれらの最大濃度のいずれかまでであってもよく、例えば、約１ｍＭ～約２００ｍＭ又は約６５ｍＭ～約７０ｍＭであってもよい。
【0082】
いくつかの実施形態では、前記鉄錯体化コンジュゲートへの前記遊離キレート配位子の曝露は、周囲温度であり得る。典型的には、周囲温度は、約１５℃～約３０℃、約２０℃～約２５℃又は約２０℃±約５℃であり得る。典型的には、先行するコンジュゲートする工程は、周囲温度で実施され、温度変化を最小限に抑えることによって過程全体の時間を短縮し、また、より大きな規模（例えば、数グラムスケール、数百グラムスケール又はキログラムスケールから）で凝集体形成を回避するのにも役立ち得るため、周囲温度が好ましい。
【0083】
いくつかの実施形態では、本プロセスは、タンパク質にコンジュゲートされていない未コンジュゲート鉄錯体化ＤＦＯキレート部分の存在下で、鉄錯体化コンジュゲートを遊離キレート配位子に曝露することを含み、タンパク質とのコンジュゲーションのためのＤＦＯキレート部分を活性化する官能基（例えば、ペンタフルオロフェニルエステル、混合無水物又は酸ハロゲン化物）又はコンジュゲーションのために活性化することができる官能基（例えば、カルボン酸、Ｃ１～６アルキルＯＣ（Ｏ）－又はアミド）を含み得る。
【0084】
さらなる工程
いくつかの実施形態では、本プロセスは、曝露工程の後にコンジュゲートを精製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、この精製工程は、本プロセスに含まれる唯一の精製工程である。精製工程は、遊離キレート配位子、鉄錯体化遊離キレート配位子及び任意に存在する未コンジュゲートＤＦＯキレート部分からコンジュゲートを分離することを含み得る。前記コンジュゲートは、精製後、溶媒をさらに含む溶液中に保持され得る。前記溶媒は、ＡＣＮ、ＤＭＳＯ、水又はそれらの組み合わせから選択され得る。精製工程は、典型的には、カラムクロマトグラフィ、例えば、ＰＤ－１０カラム又はタンジェンシャルフローろ過（例えば限外ろ過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ））によってコンジュゲートを精製することを含む。いくつかの実施形態では、本プロセスは、１又は複数のろ過工程（例えば、ＰＤ－１０カラム）とＵＦ／ＤＦとを含む、精製を含み得る。これらの実施形態では、前記精製は、第１のろ過工程（例えば、ＰＤ－１０カラムによるろ過）と、ＵＦ／ＤＦプロセスと、第２のろ過工程（例えば、ＰＤ－１０カラムによるろ過）とを、含み得る。
いくつかの実施形態では、本プロセスは、曝露工程の後にコンジュゲートを精製する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、この精製工程は、本プロセスに含まれる唯一の精製工程である。精製工程は、遊離キレート配位子、鉄錯体化遊離キレート配位子及び任意に存在する未コンジュゲートＤＦＯキレート部分からコンジュゲートを分離することを含み得る。前記コンジュゲートは、精製後、溶媒をさらに含む溶液中に保持され得る。前記溶媒は、ＡＣＮ、ＤＭＳＯ、水又はそれらの組み合わせから選択され得る。精製工程は、典型的には、カラムクロマトグラフィ、例えば、ＰＤ－１０カラム又はタンジェンシャルフローろ過（例えば限外ろ過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ））によってコンジュゲートを精製することを含む。いくつかの実施形態では、本プロセスは、１又は複数のろ過工程（例えば、ＰＤ－１０カラム）とＵＦ／ＤＦとを含む、精製を含み得る。これらの実施形態では、前記精製は、第１のろ過工程（例えば、ＰＤ－１０カラムによるろ過）と、ＵＦ／ＤＦプロセスと、第２のろ過工程（例えば、ＰＤ－１０カラムによるろ過）とを、含み得る。
【0085】
本プロセスは、任意の粒子状物質を除去し、且つ／又はバイオバーデンを減じるための、１又は複数のさらなるろ過工程を任意に含んでもよい。
【0086】
本明細書に記載のプロセスの任意の工程は、例えば、磁性撹拌子又はオーバーヘッド式機械的撹拌機による混合を含み得る。
【0087】
本プロセスは、遊離ＤＦＯ－タンパク質コンジュゲートの濃度を調整する工程を含み得る。標的最終濃度は、前記タンパク質の性質に依存し、当業者は、前記遊離ＤＦＯ－タンパク質コンジュゲートを取り扱うのに望ましい濃度を理解するであろう。前記タンパク質が抗体であるいくつかの実施形態では、前記標的濃度は、約１．８ｍｇ／ｍｌ～約２．２ｍｇ／ｍｌであり得る。
【0088】
具体的な実施形態
別の態様では、デスフェリオキサミンキレート配位子がタンパク質に連結したコンジュゲートを調製するプロセスであって、
鉄をキレートしたデスフェリオキサミンキレート配位子をタンパク質とコンジュゲートして、鉄と錯体を形成したデスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質と連結した鉄錯体化コンジュゲートを得ることと、
前記タンパク質と連結し鉄と錯体を形成した、前記デスフェリオキサミンキレート配位子を含む、前記鉄錯体化コンジュゲートを、実質的に中性のｐＨで、デスフェリオキサミン、デスフェリオキサミン類似体及びＨＢＥＤ又はそれらの組合せから選択される遊離キレート配位子に曝露することにより、鉄をキレートしたコンジュゲートのデスフェリオキサミンキレート配位子から鉄を除去し、キレート化鉄を実質的に含まない、前記デスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質に連結したコンジュゲートを得ることと、
を含む、プロセスが提供される。
別の態様では、デスフェリオキサミンキレート配位子がタンパク質に連結したコンジュゲートを調製するプロセスであって、
鉄をキレートしたデスフェリオキサミンキレート配位子をタンパク質とコンジュゲートして、鉄と錯体を形成したデスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質と連結した鉄錯体化コンジュゲートを得ることと、
前記タンパク質と連結し鉄と錯体を形成した、前記デスフェリオキサミンキレート配位子を含む、前記鉄錯体化コンジュゲートを、実質的に中性のｐＨで、デスフェリオキサミン、デスフェリオキサミン類似体及びＨＢＥＤ又はそれらの組合せから選択される遊離キレート配位子に曝露することにより、鉄をキレートしたコンジュゲートのデスフェリオキサミンキレート配位子から鉄を除去し、キレート化鉄を実質的に含まない、前記デスフェリオキサミンキレート配位子が前記タンパク質に連結したコンジュゲートを得ることと、
を含む、プロセスが提供される。
【0089】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートする工程と曝露工程のｐＨは、実質的に同じである。
【0090】
いくつかの実施形態では、前記コンジュゲートする工程と前記曝露工程のｐＨは、約７～約８であり、好ましくは約７．２又は約７．４である。
【0091】
いくつかの態様では、前記タンパク質はギレンツキシマブ（girentuximab）である。
【0092】
いくつかの実施形態では、前記デスフェリオキサミンキレート配位子と前記タンパク質は、スクシニル結合基を介して結合している。
【0093】
いくつかの実施形態では、前記デスフェリオキサミンキレート配位子はデスフェリオキサミンである。
【0094】
いくつかの実施形態では、鉄をキレートしたデスフェリオキサミンキレート配位子を、極性有機溶媒、好ましくはＡＣＮ、ＤＭＳＯ又はそれらの組み合わせから選択される極性有機溶媒をさらに含む組成物に準備する。
【0095】
いくつかの実施形態では、前記タンパク質に対して過剰モルの、鉄をキレートしたデスフェリオキサミンキレート配位子を供する。
【0096】
いくつかの実施形態では、過剰モルの前記遊離キレート配位子を前記鉄錯体化コンジュゲートに対して供する。前記過剰モルは、本明細書に記載のいずれかのものであり得る。
【0097】
いくつかの実施形態では、本プロセスは、コンジュゲーション工程（１又は複数）とトランスキレーション（又は曝露）工程との間に精製工程を含まない。
【0098】
いくつかの実施形態では、前記コンジュゲーション工程及び前記曝露工程を周囲温度（例えば、約１８～２５℃）で実施する。
【0099】
本明細書に記載のプロセスによって得られるコンジュゲート
別の態様は、本明細書に記載のプロセスによって得られる又は製造される、タンパク質にコンジュゲートされたＤＦＯキレート部分を含むコンジュゲートに関する。
別の態様は、本明細書に記載のプロセスによって得られる又は製造される、タンパク質にコンジュゲートされたＤＦＯキレート部分を含むコンジュゲートに関する。
【0100】
別の態様は、本明細書に記載のプロセスによって得られる又は製造されるコンジュゲートを含む、組成物を提供する。
【0101】
前記コンジュゲートは、タンパク質に対するコンジュゲートの最小比が少なくとも約０．２、０．２５、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８又は０．９であることを特徴とし得る。前記コンジュゲートは、タンパク質に対するコンジュゲートの最大比が約４、３．５、３、２．５、２、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１又は０．９以下であることを特徴とし得る。前記コンジュゲートのタンパク質に対するコンジュゲートの比は、最小値が最大値よりも小さい限り、上記の最小比のいずれかから上記の最大比のいずれかまでであり得る。例えば、タンパク質に対するコンジュゲートの比は、約０．２～約４又は約０．９～約１であり得る。典型的には、タンパク質に対するコンジュゲートの比は、この工程を含むプロセスにおけるコンジュゲーション工程の条件によって最も影響を受ける。
【0102】
鉄を実質的に含まないコンジュゲートを含む組成物は、単量体コンジュゲートに対して、約１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００５％、０．０００１％以下の濃度の高分子量（ＨＭＷ）タンパク質凝集体を含み得る。前記コンジュゲートを含む組成物は、上記の割合のいずれかから任意の他のパーセントまで、例えば、約０．０１％～約１％、好ましくは０．０００１％～約０．１％のＨＭＷ凝集体を含み得る。単量体コンジュゲートに対するＨＭＷ種の濃度は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及び前記ＨＭＷ種に起因するピーク下面積と前記単量体タンパク質のピーク下面積との比較によって求め得る。実施例に、適切なＳＥＣ－ＨＰＬＣプロトコルの一例がＤＦＯ－スクシニル－ギレンツキシマブコンジュゲートについて記載されている。
【0103】
いくつかの実施形態では、前記組成物は、二量体コンジュゲートをさらに含み得る。典型的には、前記二量体は、約１％、０．９％、０．８％又は０．７％以下の濃度で存在する。前記二量体は、上記のいずれかの濃度の間、例えば約０．７％～約１％で存在し得る。二量体の濃度は、例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びそれぞれの関連するピークのピーク下面積の比較によって、ＨＭＷ種の濃度と同様の方法で求め得る。
【0104】
前記コンジュゲートを含む組成物は、溶媒を含み得る。前記溶媒は、本明細書に記載の任意の溶媒であり得る。いくつかの実施形態では、前記溶媒は、ＡＣＮ、ＤＭＳＯ、水及びそれらの組み合わせから選択され得る。いくつかのタンパク質では、より高い濃度で凝集が起こることが知られている。放射性標識を目的とするコンジュゲートを含む組成物は、放射性標識工程に適した濃度、好ましくはその後の対象への投与に適した濃度のコンジュゲートを有するべきである。したがって、いくつかの実施形態では、鉄及び溶媒を実質的に含まないコンジュゲートを含む組成物中のコンジュゲートの最大濃度は、最大約１０ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、２．４ｍｇ／ｍｌ、２．３ｍｇ／ｍｌ、２．２ｍｇ／ｍｌであり得る。鉄及び溶媒を実質的に含まないコンジュゲートを含む組成物中のコンジュゲートの最小濃度は、少なくとも約０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ又は１．８ｍｇ／ｍｌであり得る。例えば、そのような組成物中のコンジュゲートの濃度は、約１～約１０ｍｇ／ｍＬ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約５ｍｇ／ｍｌ又は約１．８～約２．２ｍｇ／ｍＬであり得る。
【0105】
＜実施例＞
定義
％ＣＶ：変動係数：標準偏差を平均値で除してパーセントで表したもの。Ｓｙｎ．：％ＲＳＤ（相対標準偏差）
Ａ２８０：２８０ｎｍでの吸光度
Ａ４２８：４２８ｎｍでの吸光度
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＢＤＳ：バルク原薬
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＡＲ：キレート剤対抗体比
ＣＥ：キャピラリ電気泳動法同様にｉＣＥ：イメージキャピラリ電気泳動法及びＣＥＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（を使用する）キャピラリ電気泳動法
ｃＩＥＦ：キャピラリ等電点電気泳動法同様にｉｃＩＥＦ：イメージキャピラリ等電点電気泳動法
ＤＣＵ：デジタル制御ユニット
ＤＦＯ：デスフェリオキサミン（ｓｙｎ．：デフェロキサミン又はデスフェラール（登録商標））
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＤＳ：原薬
定義
％ＣＶ：変動係数：標準偏差を平均値で除してパーセントで表したもの。Ｓｙｎ．：％ＲＳＤ（相対標準偏差）
Ａ２８０：２８０ｎｍでの吸光度
Ａ４２８：４２８ｎｍでの吸光度
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＢＤＳ：バルク原薬
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＣＡＲ：キレート剤対抗体比
ＣＥ：キャピラリ電気泳動法同様にｉＣＥ：イメージキャピラリ電気泳動法及びＣＥＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム（を使用する）キャピラリ電気泳動法
ｃＩＥＦ：キャピラリ等電点電気泳動法同様にｉｃＩＥＦ：イメージキャピラリ等電点電気泳動法
ＤＣＵ：デジタル制御ユニット
ＤＦＯ：デスフェリオキサミン（ｓｙｎ．：デフェロキサミン又はデスフェラール（登録商標））
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＤＳ：原薬
【0106】
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着測定法
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化法
ＧｍＡｂ：キメラギレンツキシマブ、ｓｙｎ．ＷＸ－Ｇ２５０、未改変抗体
ＧｍＡｂ－ＤＦＯ：キメラギレンツキシマブ－Ｎ－スクシニルデスフェラルコンジュゲート、ｓｙｎ．：ＧｍＡｂ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ
ＧｍＡｂ－ＤＦ－Ｆｅ：鉄（ＩＩＩ）を除去してＧｍＡｂ－ＤＦＯが製剤として生成する前の中間体コンジュゲート
ＨＢＥＤ：Ｎ，Ｎ’－ジ（２－ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－二酢酸一塩酸塩
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ｋＤａ：キロダルトン
ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化法
ＧｍＡｂ：キメラギレンツキシマブ、ｓｙｎ．ＷＸ－Ｇ２５０、未改変抗体
ＧｍＡｂ－ＤＦＯ：キメラギレンツキシマブ－Ｎ－スクシニルデスフェラルコンジュゲート、ｓｙｎ．：ＧｍＡｂ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ
ＧｍＡｂ－ＤＦ－Ｆｅ：鉄（ＩＩＩ）を除去してＧｍＡｂ－ＤＦＯが製剤として生成する前の中間体コンジュゲート
ＨＢＥＤ：Ｎ，Ｎ’－ジ（２－ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－二酢酸一塩酸塩
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ｋＤａ：キロダルトン
【0107】
ＬＣ：液体クロマトグラフィ
ＭＳ：質量分析法
ＭＷ：分子量
ＰＤ：プロセス進行
ＰＤＡ：フォトダイオードアレイ。Ｓｙｎ．：ＤＡＤ－ダイオードアレイ検出器
ＱＴＯＦ：四重極飛行時間
ＱＳ：必要量
ＲＭ：標準物質
ＲＣＰ：放射化学的純度
ＲＰＭ：毎分回転数
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィ；ＳＥ－ＨＰＬＣ：サイズ排除高速液体クロマトグラフィも参照のこと
ＳＯＰ：標準操作手順
ＳＲ：置換率。Ｓｙｎ．：キレート剤対抗体比（ＣＡＲ）
Ｓｙｎ．：同義語
ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ：Ｎ－スクシニルデスフェラル：Ｆｅ（ＩＩＩ）テトラフルオロフェニルエステル、（ｓｙｎ：ＤＦＯＴＦＰ）；二官能性キレート剤
ＵＳＰ：米国薬局方
ＷＦＩ：洗浄用水
Ｚｒ－８９：Ｓｙｎ．８９Ｚｒ、陽電子放出放射性核種
ＭＳ：質量分析法
ＭＷ：分子量
ＰＤ：プロセス進行
ＰＤＡ：フォトダイオードアレイ。Ｓｙｎ．：ＤＡＤ－ダイオードアレイ検出器
ＱＴＯＦ：四重極飛行時間
ＱＳ：必要量
ＲＭ：標準物質
ＲＣＰ：放射化学的純度
ＲＰＭ：毎分回転数
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
ＳＥＣ：サイズ排除クロマトグラフィ；ＳＥ－ＨＰＬＣ：サイズ排除高速液体クロマトグラフィも参照のこと
ＳＯＰ：標準操作手順
ＳＲ：置換率。Ｓｙｎ．：キレート剤対抗体比（ＣＡＲ）
Ｓｙｎ．：同義語
ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ：Ｎ－スクシニルデスフェラル：Ｆｅ（ＩＩＩ）テトラフルオロフェニルエステル、（ｓｙｎ：ＤＦＯＴＦＰ）；二官能性キレート剤
ＵＳＰ：米国薬局方
ＷＦＩ：洗浄用水
Ｚｒ－８９：Ｓｙｎ．８９Ｚｒ、陽電子放出放射性核種
【0108】
実施例１：ＤＦＯとギレンツキシマブとの鉄をキレートしたコンジュゲート（ＧｍＡｂ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ）の調製
この実施例では、スクシニル結合基を介してギレンツキシマブに結合したＤＦＯの鉄をキレートしたコンジュゲートの調製、並びにＤＦＯ－ギレンツキシマブコンジュゲートを得るためのギレンツキシマブ（ＧｍＡｂ）とテトラフルオロフェニル－Ｎ－スクシニルデスフェリオキサミン鉄キレートのコンジュゲーション反応の至適化の試験について記載する。この手順は、標準的な諸プロセスと自動反応システムの使用とを組み合わせたものである。自動反応装置で実施する任意の工程を代替的に従来の設備で実施してもよく、同様に、各工程のスケールを調整することによって、プロセス全体を自動システムで実施されるよう適合させることも可能である。
この実施例では、スクシニル結合基を介してギレンツキシマブに結合したＤＦＯの鉄をキレートしたコンジュゲートの調製、並びにＤＦＯ－ギレンツキシマブコンジュゲートを得るためのギレンツキシマブ（ＧｍＡｂ）とテトラフルオロフェニル－Ｎ－スクシニルデスフェリオキサミン鉄キレートのコンジュゲーション反応の至適化の試験について記載する。この手順は、標準的な諸プロセスと自動反応システムの使用とを組み合わせたものである。自動反応装置で実施する任意の工程を代替的に従来の設備で実施してもよく、同様に、各工程のスケールを調整することによって、プロセス全体を自動システムで実施されるよう適合させることも可能である。
【0109】
出発材料
ギレンツキシマブ（ＧｍＡｂ）抗体、４．９１ｍｇ／ｍＬ、２～８℃で保存。
ギレンツキシマブ（ＧｍＡｂ）抗体、４．９１ｍｇ／ｍＬ、２～８℃で保存。
【0110】
二官能性キレート剤：テトラフルオロフェニル－Ｎ－スクシニルデスフェリオキサミン鉄キレート（ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ）、－２０±５℃で保存。
【0111】
手順
ＧｍＡｂ溶液の調製
ＧｍＡｂを１０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液、１５０ｍＭＮａＣｌ水溶液（ｐＨ７．２）に溶かした４．９１ｍｇ／ｍｌの溶液をＧｍＡｂ出発プールとする。一旦調製したすべての溶液を、使用前に０．２μｍのろ過装置でろ過した。ＧｍＡｂ出発プールはｐＨが７．２であり、ＧｍＡｂ出発プールの一部を分割し、ｐＨ８．４又はｐＨ９．６に滴定して、ＧｍＡｂｐＨ調整済みプール（本明細書ではｐＨ調整済みＧｍＡｂプールと称することもある）を得た。ＧｍＡｂｐＨ調整済みプールの濃度は、合計体積又はＧｍＡｂ出発プールと添加した塩基の体積に基づいて計算することができ、又は濃度は、ＵＶ－ｖｉｓ分光光度測定法によって実験的に求めることができる（以下のプロトコルを参照されたい）。
ＧｍＡｂ溶液の調製
ＧｍＡｂを１０ｍＭリン酸ナトリウム水溶液、１５０ｍＭＮａＣｌ水溶液（ｐＨ７．２）に溶かした４．９１ｍｇ／ｍｌの溶液をＧｍＡｂ出発プールとする。一旦調製したすべての溶液を、使用前に０．２μｍのろ過装置でろ過した。ＧｍＡｂ出発プールはｐＨが７．２であり、ＧｍＡｂ出発プールの一部を分割し、ｐＨ８．４又はｐＨ９．６に滴定して、ＧｍＡｂｐＨ調整済みプール（本明細書ではｐＨ調整済みＧｍＡｂプールと称することもある）を得た。ＧｍＡｂｐＨ調整済みプールの濃度は、合計体積又はＧｍＡｂ出発プールと添加した塩基の体積に基づいて計算することができ、又は濃度は、ＵＶ－ｖｉｓ分光光度測定法によって実験的に求めることができる（以下のプロトコルを参照されたい）。
【0112】
ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ溶液の調製
選択した溶媒（ＡＣＮ又はＤＭＳＯ）をそれぞれ用いて、各容器中の溶媒の全体積に影響を及ぼさずに当量数を変えることができるように、ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅの溶液を３種類の異なる濃度値、つまり、
（ｉ）のちのコンジュゲーション工程でＧｍＡｂに対して３モル当量のＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅを供するための２．５ｍｇ／ｍｌ
（ｉｉ）７．５当量を供するための６．２５ｍｇ／ｍｌ
（ｉｉｉ）１２当量を供するための１０．０ｍｇ／ｍｌ
の濃度値で調製した。
選択した溶媒（ＡＣＮ又はＤＭＳＯ）をそれぞれ用いて、各容器中の溶媒の全体積に影響を及ぼさずに当量数を変えることができるように、ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅの溶液を３種類の異なる濃度値、つまり、
（ｉ）のちのコンジュゲーション工程でＧｍＡｂに対して３モル当量のＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅを供するための２．５ｍｇ／ｍｌ
（ｉｉ）７．５当量を供するための６．２５ｍｇ／ｍｌ
（ｉｉｉ）１２当量を供するための１０．０ｍｇ／ｍｌ
の濃度値で調製した。
【0113】
ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－ＦｅとＧｍＡｂのコンジュゲーション
ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ溶液をそれぞれ、ＧｍＡｂ出発プール又はＧｍＡｂｐＨ調整済みプールの入った別個の容器に添加した。添加中は、各反応容器の混合速度を維持し、次いでインキュベーション時間中は、混合速度を低下させた。インキュベーション時間終了時の溶液は、溶液中にＧｍＡｂ－Ｎ－ｓｕｂＤｆ－Ｆｅを含有するコンジュゲート済み生成物プール（コンジュゲート済みプール）となる。コンジュゲート済み生成物プールを（必要に応じて）標的ｐＨ７．０に滴定して、ｐＨ調整コンジュゲート済み生成物プール（本明細書では、コンジュゲートｐＨ調整済みプールと称されることもある）を得た。プロセスのこの段階における反応混合物の色は、淡橙色から暗橙色の範囲内にあった。ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－ＦｅとＧｍＡｂとのモル比が３：１から１２：１に増大するにつれて、反応混合物の橙色が濃くなった。すべての反応混合物の外観は透明で、微粒子は含まれていなかった。
ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ溶液をそれぞれ、ＧｍＡｂ出発プール又はＧｍＡｂｐＨ調整済みプールの入った別個の容器に添加した。添加中は、各反応容器の混合速度を維持し、次いでインキュベーション時間中は、混合速度を低下させた。インキュベーション時間終了時の溶液は、溶液中にＧｍＡｂ－Ｎ－ｓｕｂＤｆ－Ｆｅを含有するコンジュゲート済み生成物プール（コンジュゲート済みプール）となる。コンジュゲート済み生成物プールを（必要に応じて）標的ｐＨ７．０に滴定して、ｐＨ調整コンジュゲート済み生成物プール（本明細書では、コンジュゲートｐＨ調整済みプールと称されることもある）を得た。プロセスのこの段階における反応混合物の色は、淡橙色から暗橙色の範囲内にあった。ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－ＦｅとＧｍＡｂとのモル比が３：１から１２：１に増大するにつれて、反応混合物の橙色が濃くなった。すべての反応混合物の外観は透明で、微粒子は含まれていなかった。
【0114】
ＧｍＡｂ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－ＦｅからのＦｅの除去
コンジュゲートｐＨ調整済みプールを３５℃に加熱した（加熱コンジュゲート済みプール又は温度調整コンジュゲート済み生成物プール）。加熱した溶液をｐＨ４．４～４．５に滴定して、低ｐＨコンジュゲート済み生成物プールを得た。３５℃に予熱した２５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡジナトリウム水溶液をＧｍＡｂ１グラム当たり１５ｍＬのＥＤＴＡ溶液の比で添加し、撹拌しながら１１０分間インキュベートすることによってキレート化鉄を除去して、トランスキレート化生成物プールを得た。この反応の進行を４２８ｎｍでの吸光度測定によってモニターした。典型的には、トランスキレーション溶液は、最大４０分間透明のままであり、次いで、若干乳白色に見え始めた。１１０分の間、いずれの試料にも目に見える微粒子は観察されなかった。インキュベーション後、トランスキレート化生成物プールをｐＨ６．８～７．２に滴定して、中和済みトランスキレート化生成物プールを得た。標的生成物をＰＤ－１０カラムクロマトグラフィによって精製して、ＰＤ－１０生成物プールを得た。全試料について、０．９％塩化ナトリウムでカラムを平衡化した後、試料１．９ｍＬをＰＤ－１０カラムに添加し、試料に０．９％塩化ナトリウム０．６ｍＬを添加することによって積層して、負荷体積２．５ｍＬを得た後、追加の移動相をＰＤ－１０カラムに流し、出口溶液を清浄な容器に収集した。
コンジュゲートｐＨ調整済みプールを３５℃に加熱した（加熱コンジュゲート済みプール又は温度調整コンジュゲート済み生成物プール）。加熱した溶液をｐＨ４．４～４．５に滴定して、低ｐＨコンジュゲート済み生成物プールを得た。３５℃に予熱した２５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡジナトリウム水溶液をＧｍＡｂ１グラム当たり１５ｍＬのＥＤＴＡ溶液の比で添加し、撹拌しながら１１０分間インキュベートすることによってキレート化鉄を除去して、トランスキレート化生成物プールを得た。この反応の進行を４２８ｎｍでの吸光度測定によってモニターした。典型的には、トランスキレーション溶液は、最大４０分間透明のままであり、次いで、若干乳白色に見え始めた。１１０分の間、いずれの試料にも目に見える微粒子は観察されなかった。インキュベーション後、トランスキレート化生成物プールをｐＨ６．８～７．２に滴定して、中和済みトランスキレート化生成物プールを得た。標的生成物をＰＤ－１０カラムクロマトグラフィによって精製して、ＰＤ－１０生成物プールを得た。全試料について、０．９％塩化ナトリウムでカラムを平衡化した後、試料１．９ｍＬをＰＤ－１０カラムに添加し、試料に０．９％塩化ナトリウム０．６ｍＬを添加することによって積層して、負荷体積２．５ｍＬを得た後、追加の移動相をＰＤ－１０カラムに流し、出口溶液を清浄な容器に収集した。
【0115】
各ＰＤ－１０精製済み生成物プールを０．２２μｍ再生セルロースシリンジフィルタでろ過した。ろ液を清浄な滅菌容器に収集して、バルク原薬（ＢＤＳ）を得た。
【0116】
Ａ２８０によって評価した収率はすべて８７％超であった。
【0117】
プロセスのこの段階における反応混合物の色は、無色から薄黄色の範囲内にあった。リンカーとＧｍＡｂとのモル比が３：１から１２：１に増大するにつれて、反応混合物がより黄色を帯びるようになった。すべての反応混合物の外観は、透明からわずかな乳白色であり、微粒子は含まれていなかった。
【0118】
ＬＣ－ＭＳによるコンジュゲート対抗体比（ＣＡＲ）の決定
選択したＢＤＳ試料について、ＣＡＲをＬＣ－ＭＳによって求めた。最小体積２００μＬの試料を使用して、約２ｍｇ／ｍＬで試験を実施した。ＧｍＡｂ－Ｎ－ｓｕｃＤｆコンジュゲートの標的ＣＡＲ値を０．９とした。
選択したＢＤＳ試料について、ＣＡＲをＬＣ－ＭＳによって求めた。最小体積２００μＬの試料を使用して、約２ｍｇ／ｍＬで試験を実施した。ＧｍＡｂ－Ｎ－ｓｕｃＤｆコンジュゲートの標的ＣＡＲ値を０．９とした。
【0119】
求めたＣＡＲ値は、０．５９から４．１０の範囲内にあった。アルカリ条件下でコンジュゲーションを実施したところ、ＣＡＲ値が増大した。得られたＣＡＲ値のうち、コンジュゲーション工程のｐＨをｐＨ７．２から８．４又は９．６に上昇させた（ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－ＦｅとＧｍＡｂとのモル比は一定に保持した）場合にＣＡＲの増大がみられた。中性ｐＨ条件下で実施したコンジュゲーション（ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－ＦｅとＧｍＡｂとのモル比は３：１）では、最低ＣＡＲ値０．５９が得られたが、ｐＨ値８．４及び９．６では、同じＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－ＦｅとＧｍＡｂとのモル比でそれぞれ、ＣＡＲ値が１．２６及び１．１６であった。
【0120】
ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－ＦｅとＧｍＡｂとのモル比１２：１でコンジュゲーションを実施したところ、４．１０もの高いＣＡＲ値が得られた。モル比７．５：１では、ｐＨに応じてＣＡＲ値が１．８８から２．８０の範囲内にあった。
【0121】
得られたＣＡＲデータに基づくと、好ましいＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－ＦｅとＧｍＡｂとのモル比は、ＣＡＲ値が０．５９から１．２６の範囲内に収まった３：１である。
【0122】
ナノドロップ（商標）分光光度計によるギレンツキシマブ（ＧｍＡｂ）の濃度の決定
ナノドロップにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準物質を使用して、システム適合性の測定を実施した。このシステム適合性の測定では、各実行の開始時及び終了時に０．９５～１．０５ｍｇ／ｍＬの範囲内でＢＳＡ濃度の判定基準をすべて満たし、ナノドロップ機器が各試験日に適切に機能していることが確認された。
ナノドロップにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準物質を使用して、システム適合性の測定を実施した。このシステム適合性の測定では、各実行の開始時及び終了時に０．９５～１．０５ｍｇ／ｍＬの範囲内でＢＳＡ濃度の判定基準をすべて満たし、ナノドロップ機器が各試験日に適切に機能していることが確認された。
【0123】
ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を使用して、ナノドロップのブランク測定を実施した。
【0124】
ＧｍＡｂ溶液のＯ．Ｄ．（Ａ２８０）をナノドロップ分光光度測定法によって測定した。Ａ２８０測定値は６．６２９であった。
【0125】
吸光係数１．３５（ｍｇ／ｍＬ）－１ｃｍ－１及び以下の式（１）を用いて、ＧｍＡｂ出発材料の濃度を算出した。
【0126】
【数1】
【0127】
ＧｍＡｂ開始プール中のＧｍＡｂ濃度は、４．９１ｍｇ／ｍｌであることがわかった。
【0128】
算出したＧｍＡｂの濃度（４．９１ｍｇ／ｍＬ）に各反応物の体積（２．３ｍＬ）及び毎日実施する反応の総数を乗じることによって、利用可能な総ＧｍＡｂタンパク質を算出した。毎日３回反応を実施したため、ＧｍＡｂの量は、全日程とも３３．９ｍｇと算出された。
【0129】
各反応物の体積（２．３ｍＬ）に毎日実施する反応の総数を乗じることによって、ＧｍＡｂプールの総体積を算出した。
【0130】
同様のプロトコルを適用して、２８０ｎｍでの吸光度検出（Ａ２８０）を用いることによって、プロセス全体を通して得られた試料中のＧｍＡｂ及びＧｍＡｂ含有コンジュゲートの濃度を評価した。
【0131】
結論
ＣＡＲ値が０．９に近く、単量体の純度の高いＧｍＡｂ－ＤＦＯコンジュゲートの生成のためのコンジュゲーション条件を検討した。検討したパラメータには、３種類の値のｐＨ（７．２、８．４及び９．６）、３種類の値のＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－ＦｅとＧｍＡｂとのモル比（３：１、７．５：１及び１２：１）及び溶媒（アセトニトリル及びＤＭＳＯ）を含めた。
ＣＡＲ値が０．９に近く、単量体の純度の高いＧｍＡｂ－ＤＦＯコンジュゲートの生成のためのコンジュゲーション条件を検討した。検討したパラメータには、３種類の値のｐＨ（７．２、８．４及び９．６）、３種類の値のＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－ＦｅとＧｍＡｂとのモル比（３：１、７．５：１及び１２：１）及び溶媒（アセトニトリル及びＤＭＳＯ）を含めた。
【0132】
コンジュゲーションの程度は、中性ｐＨ条件下よりもアルカリ性条件下の方が高くなる傾向がみられた。ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－ＦｅとＧｍＡｂとのモル比３：１では、中性ｐＨでＣＡＲ値が最も低かった（アセトニトリル及びＤＭＳＯのリンカー溶液を使用したときのＣＡＲは、それぞれ０．７８及び０．５９）。リンカーとＧｍＡｂとのモル比が同じ（３：１）で、ｐＨ値がよりアルカリ性であるとき、ＣＡＲ値はすべて１．０を上回り、最大１．２６に達した（ｐＨ８．４、ＤＭＳＯのＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ溶液を使用）。
【0133】
大きいＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－ＦｅとＧｍＡｂとのモル比を用いた条件下でも、コンジュゲーションの程度が増大した。中性ｐＨ、モル比１２：１では、ＣＡＲ値は、アセトニトリル及びＤＭＳＯのリンカー溶液を使用したとき、それぞれ２．９７及び２．７９に達した。よりアルカリ性の条件下では、ＣＡＲ値は４．１０（モル比１２：１、ｐＨ８．４）にまで達した。
【0134】
いくつかの場合には、ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－ＦｅとＧｍＡｂとのモル比が３：１から１２：１に増大したとき、ＨＭＷ凝集体の形成（単量体ピークに対する相対保持時間「ＲＲＴ」が７０％）が、若干ではあるものの、増大する傾向がみられた。ＢＤＳの全体的な単量体純度は、いずれの場合も許容範囲内にあった。しかし、以前の製造キャンペーンでみられた通り、より大きな規模でのＨＭＷ凝集体形成のレベルが問題となり得ることが示されている。小規模で生成するＨＭＷ凝集体のレベルが大規模で同じ条件下で生成するＨＭＷ凝集体のレベルと相関するという傾向はみられない。したがって、ＨＭＷ凝集体の相対量は、規模が大きくなると増大し、相当な濃度のＨＷＭ凝集体及びそれに応じた収率の損失につながることが予想される。
【0135】
この試験の結果を考慮すると、０．９に近いＣＡＲ値を得るには、ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－ＦｅとＧｍＡｂとのモル比を３：１にするのが理想的である。ｐＨ９．６では、得られたＣＡＲ値は１．１０であった。しかし、中性ｐＨ条件下であっても、ＣＡＲ値０．７８を達成することができる。良好なＣＡＲ値はアルカリ性条件下で得ることができるが、中性ｐＨ条件では、より合理化された（必要な滴定工程がより少ない）プロセスを用いて、許容可能な条件を維持して顕著な凝集を回避しながら、許容可能なＣＡＲが得られる。
【0136】
この実施例で得られた結果から、３種類の最良のコンジュゲーション条件は、以下のコンジュゲーション条件、つまり、（１）ｐＨ７．２、モル比３：１、ＤＭＳＯに溶かしたＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ、（２）ｐＨ７．２、モル比３：１、ＡＣＮに溶かしたＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ及び（３）ｐＨ８．４、モル比３：１、ＡＣＮに溶かしたＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅを用いるものであることが示唆された。
【0137】
これらの３種類の条件及びＢＤＳ（ｐＨ９．６、モル比３：１、ＡＣＮに溶かしたＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅで調製したもの）を実施例２の出発材料として使用した。
【0138】
実施例２では、これらのコンジュゲーション生成物を使用して、ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅの添加速度、ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ添加濃度及びＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ製造業者を含めた追加のコンジュゲーション反応パラメータを評価した。測定した応答には、ＳＥＣ－ＨＰＬＣによる高分子量（ＨＭＷ）種の％、ＬＣ／ＭＳによるキレート対抗体比（ＣＡＲ）及びＡ２８０によって測定される反応の収率が含まれる。
【0139】
実施例２：ＧｍＡｂ－ＮｓｕｃＤｆ－ＦｅからのＦｅ除去の改善
この実施例に記載する試験には、実施例１に記載した通りに調製したＢＤＳを出発材料として使用した。反応混合物を３等分した。
この実施例に記載する試験には、実施例１に記載した通りに調製したＢＤＳを出発材料として使用した。反応混合物を３等分した。
【0140】
１つの容器には、実施例１に記載のものと同様の条件（ＥＤＴＡ、ｐＨ４．４及び３５℃）を用いた。これらの条件下、実施例１で概説したプロトコルに従って、Ａ４２８によってトランスキレーションの過程をモニターした。
【0141】
第２の容器では、周囲温度及び中性ｐＨ（ｐＨ７．０）でＤＦＯメシラートを使用してトランスキレーションを実施することによって、評価を実施した。これらの条件下、色の変化は全く予想されなかったが、Ａ２８０及びＡ４２８によってトランスキレーションをモニターした。
【0142】
第３の容器では、周囲温度及び中性ｐＨでＨＢＥＤ（Ｎ，Ｎ’－ジ（２－ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ’－二酢酸一塩酸塩）を使用してトランスキレーションを実施することによって、評価を実施した。Ａ４２８によってトランスキレーションをモニターしたが、ＨＢＥＤは４２８ｎｍで吸収する。
【0143】
コンジュゲートをＰＤ－１０カラムを使用して精製し、単量体純度に関するＳＥＣ－ＨＰＬＣ、プロセス収率に関するＡ２８０及びトランスキレーションプロセスの効率を求める放射化学的純度によって、特性を解析した。
【0144】
この実施例で試験したスクリーニング反応を表１にまとめる。
【0145】
表１：第ＩＡ相及び第ＩＩ相の実験計画
【表1】
【0146】
ＥＤＴＡジナトリウム、ＤＦＯ又はＨＢＥＤを用いたキレート化鉄の除去
リンカーを安定化するために使用したキレート化鉄を、ＥＤＴＡジナトリウム、ＤＦＯ又はＨＢＥＤ（それぞれトランスキレート剤と称する）を用いて、ＧｍＡｂ１グラム当たりＥＤＴＡ溶液１５ｍＬの比又はトランスキレート剤とＧｍＡｂとのモル比１５０：１で除去した。
リンカーを安定化するために使用したキレート化鉄を、ＥＤＴＡジナトリウム、ＤＦＯ又はＨＢＥＤ（それぞれトランスキレート剤と称する）を用いて、ＧｍＡｂ１グラム当たりＥＤＴＡ溶液１５ｍＬの比又はトランスキレート剤とＧｍＡｂとのモル比１５０：１で除去した。
【0147】
Ａ２８０値を測定して濃度を実験的に求め、その結果を各試料について報告する。Ａ２８０による濃度は理論的濃度よりも高く、この結果は、未コンジュゲートＤＦＯ出発材料の存在及び試料のわずかな混濁に起因するものである可能性が高い。
【0148】
反応混合物へのＥＤＴＡジナトリウム溶液（３５℃に予熱）、ＤＦＯ又はＨＢＥＤの添加
この工程を開始する前に、ＥＤＴＡ溶液が３５℃に平衡化されていることを確認した。ＤＦＯ又はＨＢＥＤ溶液は加熱せず、周囲温度（２０～２５℃）のままにした。
この工程を開始する前に、ＥＤＴＡ溶液が３５℃に平衡化されていることを確認した。ＤＦＯ又はＨＢＥＤ溶液は加熱せず、周囲温度（２０～２５℃）のままにした。
【0149】
各反応容器の混合速度を維持した。
【0150】
手動ピペットを使用して、各反応容器に各トランキレート剤溶液を添加した。
【0151】
トランスキレーション反応混合物のインキュベーション
実施例１で考察した結果に基づいて、ＥＤＴＡジナトリウム溶液を添加した後、各反応容器を３５±２℃で１１０分間インキュベートした。ＤＦＯ又はＨＢＥＤを使用して実施したトランスキレーションを周囲温度（２０～２５℃）でインキュベートした。
混合速度を維持した。
２０分、４０分、８０分及び１００分のインキュベーション後、溶液の色及び４２８ｎｍでの吸光度を観察することによって、各トランスキレーション反応の進行を確認した。１１０分後にインキュベーションを停止した。
実施例１で考察した結果に基づいて、ＥＤＴＡジナトリウム溶液を添加した後、各反応容器を３５±２℃で１１０分間インキュベートした。ＤＦＯ又はＨＢＥＤを使用して実施したトランスキレーションを周囲温度（２０～２５℃）でインキュベートした。
混合速度を維持した。
２０分、４０分、８０分及び１００分のインキュベーション後、溶液の色及び４２８ｎｍでの吸光度を観察することによって、各トランスキレーション反応の進行を確認した。１１０分後にインキュベーションを停止した。
【0152】
トランスキレート剤としてＥＤＴＡを使用した反応では、色が薄橙色から透明に変化した。ＤＦＯ又はＨＢＥＤを使用した反応では、色の変化は観察されなかった。さらに、１１０分間のインキュベーションの過程では、いずれの反応でも目に見える微粒子は観察されなかった。
【0153】
ｐＨ６．８～７．２への調整
トランスキレーション反応を停止させるために、（必要に応じて）反応物をｐＨ７．０±０．２に滴定した。この滴定は、自動反応装置に接続されたドーズシリンジポンプ及びｐＨプローブを使用して自動化されたものである。反応容器をインキュベータから取り出した。混合速度を維持された。プロセスのこの段階における各反応混合物の外観は、無色で、わずかに乳白色であり、微粒子は含まれていなかった。
トランスキレーション反応を停止させるために、（必要に応じて）反応物をｐＨ７．０±０．２に滴定した。この滴定は、自動反応装置に接続されたドーズシリンジポンプ及びｐＨプローブを使用して自動化されたものである。反応容器をインキュベータから取り出した。混合速度を維持された。プロセスのこの段階における各反応混合物の外観は、無色で、わずかに乳白色であり、微粒子は含まれていなかった。
【0154】
ＰＤ－１０カラムを使用した中和済みトランスキレート化生成物プールの精製
滴定後、中和済みトランスキレーション生成物を、ＰＤ－１０カラムを用いるカラムクロマトグラフィによって精製した。各ＰＤ－１０カラムを０．９％塩化ナトリウム２５ｍＬで平衡化した。すべての試料について、その体積の試料をＰＤ－１０カラムに加え、試料にさらに０．９％塩化ナトリウムを積層して、総負荷体積２．５ｍＬを得た。２．５ｍＬの試料が利用可能である場合は、０．９％塩化ナトリウムは必要とされなかった。通過画分を廃棄した。０．９％塩化ナトリウム３．５ｍＬを各ＰＤ－１０カラムに加え、溶液を完全に充填層に入れた。通過画分を清浄な収集容器に収集した。
滴定後、中和済みトランスキレーション生成物を、ＰＤ－１０カラムを用いるカラムクロマトグラフィによって精製した。各ＰＤ－１０カラムを０．９％塩化ナトリウム２５ｍＬで平衡化した。すべての試料について、その体積の試料をＰＤ－１０カラムに加え、試料にさらに０．９％塩化ナトリウムを積層して、総負荷体積２．５ｍＬを得た。２．５ｍＬの試料が利用可能である場合は、０．９％塩化ナトリウムは必要とされなかった。通過画分を廃棄した。０．９％塩化ナトリウム３．５ｍＬを各ＰＤ－１０カラムに加え、溶液を完全に充填層に入れた。通過画分を清浄な収集容器に収集した。
【0155】
各試料についてＡ２８０値を用いた実験濃度を測定して、希釈が必要であるかどうかを判定した。希釈が必要である場合、０．９％塩化ナトリウムを使用して、各試料の濃度を１．８～２．２ｍｇ／ｍＬの範囲内に収めた。
【0156】
トランスキレート剤としてＥＤＴＡを使用した反応では、プロセスのこの段階における各反応混合物の外観は、無色で、わずかな乳白色から透明であり、微粒子は含まれていなかった。
【0157】
トランスキレート剤としてＤＦＯ又はＨＢＥＤを使用した反応では、プロセスのこの段階での各反応混合物の外観は淡黄色で、わずかな乳白色から透明であり、微粒子は含まれていなかった。
【0158】
バルク原薬（ＢＤＳ）を生成するための最終ろ過
各ＰＤ－１０精製済み生成物プールを０．２２μｍ再生セルロースシリンジフィルタでろ過した。ろ液を清浄な滅菌容器に収集して、バルク原薬を得た。
各ＰＤ－１０精製済み生成物プールを０．２２μｍ再生セルロースシリンジフィルタでろ過した。ろ液を清浄な滅菌容器に収集して、バルク原薬を得た。
【0159】
Ａ２８０を用いて濃度を測定し、各試料の最終濃度を求めた。
各反応の収率は８６％超であった。
各反応の収率は８６％超であった。
【0160】
トランスキレート剤としてＥＤＴＡを使用した反応では、各ＢＤＳの外観は、無色で透明であり、微粒子は含まれていなかった。
【0161】
トランスキレート剤としてＤＦＯ又はＨＢＥＤを使用した反応では、各ＢＤＳの外観は、淡黄色で、透明であり、微粒子は含まれていなかった。
【0162】
得られたＢＤＳ試料を、２～８℃又は－２０℃で保存するために微量遠心管に分注した。
【0163】
分析試験
Ａ２８０によるタンパク質濃度
実施例１に記載の手順に従ってタンパク質濃度を測定した。
Ａ２８０によるタンパク質濃度
実施例１に記載の手順に従ってタンパク質濃度を測定した。
【0164】
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ
試験用の試料をすべて、（必要に応じて）試料緩衝液を使用して２ｍｇ／ｍＬに希釈した。試料緩衝液には、試料の土台成分がＧｍＡｂ抗体以外すべて含まれていた。
試験用の試料をすべて、（必要に応じて）試料緩衝液を使用して２ｍｇ／ｍＬに希釈した。試料緩衝液には、試料の土台成分がＧｍＡｂ抗体以外すべて含まれていた。
【0165】
試料を試料緩衝液で２ｍｇ／ｍＬに希釈した後、試料９０％に対し移動相１０％の比で試料を混合した。
【0166】
ＨＰＬＣに注入する前に、試料はろ過しなかった。代わりに、試料を１３，０００×ｇで５分間遠心分離した。次いで、上清溶液をＨＰＬＣバイアルに移した。
オートサンプラの温度を４℃に設定した。
オートサンプラの温度を４℃に設定した。
【0167】
ＳＥＣ－ＨＰＬＣの結果を下の表２に示す。
【0168】
表２：ＳＥＣ－ＨＰＬＣの結果１。反応番号は表１に詳述したものに対応する。
【表2-1】
【表2-2】
【0169】
【表2-3】
【0170】
【表2-4】
【0171】
【表2-5】
【0172】
注：
ＰＤ工程番号：（１）ｐＨ調整済みＧｍＡｂプール（ｐＨ９．６）、（２）コンジュゲート済み生成物プール、（３）ｐＨ調整コンジュゲート済み生成物プール（ｐＨ７．０）、（４）温度調整コンジュゲート済み生成物プール（３５℃）、（５）低ｐＨコンジュゲート済み生成物プール（ｐＨ４．４）、（６）トランスキレート化生成物プール、（７）中和済みトランスキレート化生成物プール（ｐＨ７．０）、（８）ＰＤ－１０生成物プール、（９）バルク原薬。
ＰＤ工程番号：（１）ｐＨ調整済みＧｍＡｂプール（ｐＨ９．６）、（２）コンジュゲート済み生成物プール、（３）ｐＨ調整コンジュゲート済み生成物プール（ｐＨ７．０）、（４）温度調整コンジュゲート済み生成物プール（３５℃）、（５）低ｐＨコンジュゲート済み生成物プール（ｐＨ４．４）、（６）トランスキレート化生成物プール、（７）中和済みトランスキレート化生成物プール（ｐＨ７．０）、（８）ＰＤ－１０生成物プール、（９）バルク原薬。
【0173】
加熱及びｐＨ４．４への滴定を必要とするいくつかの反応では、凝集体の形成が生じた（ＨＭＷ７０％ＲＲＴ）。凝集体形成は、トランスキレーションの過程全体を通して生じ続けた。
【0174】
ＤＦＯ又はＨＢＥＤを使用した反応（中性トランスキレート化条件）では、ＨＭＷ種の形成は観察されなかった。
【0175】
ＧｍＡｂへの添加前にＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ溶液を１５分間保持した反応（ＲＸＮ番号２５及び２８）では、ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ溶液を５分間保持した反応（ＲＸＮ番号２３及び２６）又は１０分間保持した反応（ＲＸＮ番号２４及び２７）ではＨＭＷ種が最大０．５％に達するにとどまったのに比して、ＨＭＷ含有量が高かった（最大１．７％）。
【0176】
より希釈した１．２５ｍｇ／ｍＬのＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ溶液を添加したところ、ＨＭＷ形成が最大４．４％と比較的高くなり、これは、反応混合物に導入されたアセトニトリルが多いことに起因する可能性が高い。
【0177】
いずれの反応も、二量体含有量は０．８±０．１％で比較的変化はみられなかった。
【0178】
ＬＣ－ＭＳによるＣＡＲ
選択したＢＤＳ試料をＬＣ－ＭＳによって分析して、ＣＡＲを求めた。最小体積２００μＬの試料を使用して、約２ｍｇ／ｍＬで試験を実施した。
選択したＢＤＳ試料をＬＣ－ＭＳによって分析して、ＣＡＲを求めた。最小体積２００μＬの試料を使用して、約２ｍｇ／ｍＬで試験を実施した。
【0179】
ＣＡＲの結果を表３に示す。
【0180】
表３：選択した試料のＣＡＲ及びＲＣＰの結果
【表3】
【0181】
平均ＣＡＲ値は、０．５９から１．３６の範囲内であった。
【0182】
放射化学的純度
選択したＢＤＳ試料について、最小０．５ｍｇを使用して放射化学的純度（ＲＣＰ）の試験を実施した。ＲＣＰの結果は上の表３に含まれている。
選択したＢＤＳ試料について、最小０．５ｍｇを使用して放射化学的純度（ＲＣＰ）の試験を実施した。ＲＣＰの結果は上の表３に含まれている。
【0183】
放射化学的純度の値は、６４％～１００％の範囲内であった。ＲＸＮ番号１で得られたＢＤＳでは、１００％のＲＣＰがみられた。コンジュゲーション及びトランスキレーション（ＨＢＥＤトランスキレート剤）の両方をｐＨ８．４で実施する条件（ＲＸＮ番号１２）では、ＲＣＰが最低値の６４％であった。
【0184】
ＤＦＯをトランスキレート剤として使用した中性ｐＨ下でのトランスキレーション条件（ＲＸＮ番号２）では、放射化学的純度９５．３％が得られた。
【0185】
結論
この試験では、いくつかの代替的なコンジュゲーション条件及びトランスキレーション条件を検討した。７．１、８．４及び９．６の様々なｐＨ値を用いて、代替的なコンジュゲーション戦略を探求した。また、リンカーの添加速度、リンカーの濃度及び添加前のリンカーの保持時間も検討した。代替のトランスキレート剤としてＤＦＯ及びＨＢＥＤをＥＤＴＡと比較して検討した。
この試験では、いくつかの代替的なコンジュゲーション条件及びトランスキレーション条件を検討した。７．１、８．４及び９．６の様々なｐＨ値を用いて、代替的なコンジュゲーション戦略を探求した。また、リンカーの添加速度、リンカーの濃度及び添加前のリンカーの保持時間も検討した。代替のトランスキレート剤としてＤＦＯ及びＨＢＥＤをＥＤＴＡと比較して検討した。
【0186】
中性ｐＨでのコンジュゲーション条件では、有望な結果が得られ、０．７８という許容可能なＣＡＲ値が得られた。ＣＡＲ値は、リンカーの濃度を２．５ｍｇ／ｍＬ（標準濃度）から１．２５ｍｇ／ｍＬ及び５．０ｍｇ／ｍＬに変えた場合、比較的変化が少なかった（ＣＡＲの範囲１．０６～１．１３）。しかし、希薄な方の１．２５ｍｇ／ｍＬのリンカー溶液を使用した場合、凝集体の増加がみられた。リンカーの保持時間及びリンカーの添加速度もＣＡＲの変化をほとんどもたらすことはなかったが、ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅの添加保持時間が１５分に達すると、凝集体の形成が増大した。
【0187】
ＤＦＯを中性ｐＨのトランスキレーション条件下でトランスキレート剤として使用して、９５．３％という高い放射化学純度が得られた。ＨＢＥＤをトランスキレーションに使用した場合、放射化学純度が低くなった（ＲＸＮ番号３、９０％及びＲＸＮ番号１２、６４％）。ＥＤＴＡを使用するトランスキレーション条件では、１００％という最良の放射化学的純度が得られたが、ＨＭＷの％が高くなるｐＨ４．４への滴定及び加熱が必要となり、より大きな規模には適さない。
【0188】
実施例３
実施例１及び２に記載した試験に従い、鉄除去（トランスキレーション）工程にＤＦＯを遊離キレート配位子として使用して、以下の一般手順を開発した。同様のプロセスでＤＦＯ類似体及びＨＢＥＤを含めた他の遊離キレート配位子に置き換え得ることが想定される。
実施例１及び２に記載した試験に従い、鉄除去（トランスキレーション）工程にＤＦＯを遊離キレート配位子として使用して、以下の一般手順を開発した。同様のプロセスでＤＦＯ類似体及びＨＢＥＤを含めた他の遊離キレート配位子に置き換え得ることが想定される。
【0189】
ＤＦＯプロセスの概要
ＡＣＮでＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅの溶液を調製し、出発材料ＧｍＡｂプールに直接添加した。反応物を周囲温度で３０±２分間インキュベートして、コンジュゲート済み生成物プールを得た。遊離ＤＦＯの添加によってＧｍＡｂ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅから鉄を除去した。反応物を周囲温度でインキュベートして、トランスキレート化生成物プールを得た。トランスキレート化生成物プールを０．０５ｍ２のＳａｒｔｏｂｒａｎ（登録商標）セルロースアセテートフィルタを使用してろ過し、ろ過済みトランスキレート化プールを得た。フィルタを０．９％ＮａＣｌで洗い流した。次いで、ろ過済みトランスキレート化生成物プールを０．９％ＮａＣｌ中へのＵＦ／ＤＦプロセスに供して、ＵＦＤＦコンジュゲーションプールを得た。０．０５ｍ２のＳａｒｔｏｂｒａｎ（登録商標）セルロースアセテートフィルタを使用してＵＦＤＦコンジュゲーションプールをろ過して、ろ過済みＵＦＤＦコンジュゲーションプールを得た。生成物が完全に回収されるようにフィルタを０．９％ＮａＣｌで洗い流して、ろ過済みＵＦＤＦコンジュゲーションプールを得た。
ＡＣＮでＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅの溶液を調製し、出発材料ＧｍＡｂプールに直接添加した。反応物を周囲温度で３０±２分間インキュベートして、コンジュゲート済み生成物プールを得た。遊離ＤＦＯの添加によってＧｍＡｂ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅから鉄を除去した。反応物を周囲温度でインキュベートして、トランスキレート化生成物プールを得た。トランスキレート化生成物プールを０．０５ｍ２のＳａｒｔｏｂｒａｎ（登録商標）セルロースアセテートフィルタを使用してろ過し、ろ過済みトランスキレート化プールを得た。フィルタを０．９％ＮａＣｌで洗い流した。次いで、ろ過済みトランスキレート化生成物プールを０．９％ＮａＣｌ中へのＵＦ／ＤＦプロセスに供して、ＵＦＤＦコンジュゲーションプールを得た。０．０５ｍ２のＳａｒｔｏｂｒａｎ（登録商標）セルロースアセテートフィルタを使用してＵＦＤＦコンジュゲーションプールをろ過して、ろ過済みＵＦＤＦコンジュゲーションプールを得た。生成物が完全に回収されるようにフィルタを０．９％ＮａＣｌで洗い流して、ろ過済みＵＦＤＦコンジュゲーションプールを得た。
【0190】
【0191】
このＤＦＯプロセスの結果を表４にまとめる。
【0192】
表４
【表4】
【0193】
注：
ＩｇＧ＝免疫グロブリン、すなわちＧｍＡｂ
％ＨＣ＝重鎖のパーセント
％ＬＣ＝軽鎖のパーセント
ｐＩ＝等電点
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィ
ＩｇＧ＝免疫グロブリン、すなわちＧｍＡｂ
％ＨＣ＝重鎖のパーセント
％ＬＣ＝軽鎖のパーセント
ｐＩ＝等電点
ＴＬＣ＝薄層クロマトグラフィ
【0194】
実施例４：プロセスの１．０ｇへのスケールアップ
この実施例では、実施例１と同様のプロセスのスケールアップについて記載する。
この実施例では、実施例１と同様のプロセスのスケールアップについて記載する。
【0195】
ＧｍＡｂ－ＤＦＯの調製
１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭＮａＣｌにＧｍＡｂを溶かした溶液（５ｍｇ／ｍＬ、１０００ｍｇ）を出発材料として使用した。
１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭＮａＣｌにＧｍＡｂを溶かした溶液（５ｍｇ／ｍＬ、１０００ｍｇ）を出発材料として使用した。
【0196】
ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ溶液を、最終濃度２．５ｍｇ／ｍＬになるまでＡＣＮに溶解して調製した。
【0197】
ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ溶液をリンカーとｍＡｂとのモル比３：１でＧｍＡｂ出発材料に直接添加した。
【0198】
ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ溶液を添加した後、反応物を室温で３０分間、絶えず混合しながらインキュベートして、コンジュゲート済み生成物プールを得た。
【0199】
Ｆｅ錯体化抗体コンジュゲートからＦｅを除去するためのトランスキレート剤として使用するＤＦＯメシラートを水で調製して、最終濃度６７．２ｍＭにした。
【0200】
ＤＦＯメシラートトランスキレート剤を、トランスキレート剤とｍＡｂとのモル比１５００：１でコンジュゲート済み生成物プールに直接添加した。
【0201】
反応混合物を室温で１１０分間、絶えず混合しながらインキュベートして、トランスキレーションプロセスを完了させ、トランスキレート化生成物プールを得た。
【0202】
トランスキレート化生成物プールを０．０５ｍ２の０．２μｍセルロースアセテートフィルタでろ過した後、ＵＦ／ＤＦプロセスに供して、５０ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用して未反応のＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ、ＤＦＯメシラート－Ｆｅ錯体、他の小分子を除去し、生成物を最終製剤緩衝液に製剤化した。これにより、ＵＦ／ＤＦコンジュゲートプールが得られた。
【0203】
ＵＦ／ＤＦコンジュゲートプールを０．０５ｍ２の０．２μｍセルロースアセテートフィルタでろ過した後、濃度を調整して製剤化生成物プールを得た。
【0204】
製剤化生成物プールをミリパック２０フィルタを使用して滅菌ろ過して、バルク原薬を得た。
【0205】
表５．実施例４に従って調製したＧｍＡｂ－ＤＦＯの特性解析
【表5】
【0206】
注：（１）以下に記載の一般プロトコルに従って試験を実施した。（２）残存ＤＦＯのＬＯＱ（定量限界）は２．２１μｇ／ｍＬである。（３）ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。
【0207】
実施例５：プロセスの５．０ｇへのスケールアップ
この実施例では、実施例１と同様のプロセスのスケールアップについて記載する。
この実施例では、実施例１と同様のプロセスのスケールアップについて記載する。
【0208】
ＧｍＡｂ－ＤＦＯの調製
１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭＮａＣｌにＧｍＡｂを溶かした溶液（５ｍｇ／ｍＬ、５０００ｍｇ）を出発材料として使用した。
１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）、１５０ｍＭＮａＣｌにＧｍＡｂを溶かした溶液（５ｍｇ／ｍＬ、５０００ｍｇ）を出発材料として使用した。
【0209】
ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ溶液を、最終濃度５．０ｍｇ／ｍＬになるまでＡＣＮに溶解して調製した。
【0210】
ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ溶液をリンカーとｍＡｂとのモル比６：１でＧｍＡｂ出発材料に直接添加した。
【0211】
ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ溶液を添加した後、反応物を室温で３０分間、絶えず混合しながらインキュベートして、コンジュゲート済み生成物プールを得た。
【0212】
Ｆｅ錯体化抗体コンジュゲートからＦｅを除去するためのトランスキレート剤として使用するＤＦＯメシラートを水で調製して、最終濃度６７．２ｍＭにした。
【0213】
ＤＦＯメシラートトランスキレート剤を、トランスキレート剤とｍＡｂとのモル比１５００：１でコンジュゲート済み生成物プールに直接添加した。
【0214】
反応混合物を室温で１１０分間、絶えず混合しながらインキュベートして、トランスキレーションプロセスを完了させ、トランスキレート化生成物プールを得た。
【0215】
トランスキレート化生成物プールをＵＦ／ＤＦプロセスに供して、３０ｋＤａのＭＷＣＯ膜を使用して未反応のＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ、ＤＦＯ－メシラート－Ｆｅ錯体、他の小分子を除去し、生成物を最終製剤緩衝液に製剤化した。これにより、ＵＦ／ＤＦコンジュゲートプールが得られた。
【0216】
ＵＦ／ＤＦコンジュゲートプールの濃度を調整して、製剤化生成物プールを得た。
【0217】
製剤化生成物プールをミリパック２０フィルタを使用して滅菌ろ過して、バルク原薬を得た。バルク原薬の純度を（以下に概説する一般プロトコルに従って）ＳＥＣ－ＨＰＬＣによって評価したところ、以下のことが明らかになった。
【0218】
単量体ピーク９９．４％超
ＲＲＴ（％）：１００±２％
ＨＭＷ凝集体０．０５％
ＲＲＴ（％）：約７０％
ＲＲＴ（％）：１００±２％
ＨＭＷ凝集体０．０５％
ＲＲＴ（％）：約７０％
【0219】
バルク原薬は、実施例４の生成物の特性解析で利用されるいずれかの技術によって、及び以下に概説する通りに、さらに特性を解析してもよい。
【0220】
表４～表５に記載の分析試験のための一般プロトコル
ドデシル硫酸ナトリウムを使用するキャピラリ電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）（非還元）。試料をアッセイ緩衝液に緩衝液交換し、ヨードアセトアミドと混合した。試料を７０℃に加熱し、冷却した後、９６ウェルプレートに加えた。試料及び適切な対照を、モーリス（商標）キャピラリ電気泳動システムを使用して泳動させた。
ドデシル硫酸ナトリウムを使用するキャピラリ電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）（非還元）。試料をアッセイ緩衝液に緩衝液交換し、ヨードアセトアミドと混合した。試料を７０℃に加熱し、冷却した後、９６ウェルプレートに加えた。試料及び適切な対照を、モーリス（商標）キャピラリ電気泳動システムを使用して泳動させた。
【0221】
ＣＥ－ＳＤＳ（還元）。
試料をアッセイ緩衝液に緩衝液交換し、２－メルカプトエタノールと混合した。試料を７０℃に加熱し、冷却した後、９６ウェルプレートに加えた。試料及び適切な対照を、モーリス（商標）キャピラリ電気泳動システムを使用して泳動させた。
試料をアッセイ緩衝液に緩衝液交換し、２－メルカプトエタノールと混合した。試料を７０℃に加熱し、冷却した後、９６ウェルプレートに加えた。試料及び適切な対照を、モーリス（商標）キャピラリ電気泳動システムを使用して泳動させた。
【0222】
キャピラリ等電点電気泳動法（ｃＩＥＦ）。
試料を水で希釈し、９６ウェルプレートに加え、モーリスキャピラリ電気泳動システムを使用して分析した。酸性種及び塩基性種の相対面積を主要ピークのｐＩとともに求めた。
試料を水で希釈し、９６ウェルプレートに加え、モーリスキャピラリ電気泳動システムを使用して分析した。酸性種及び塩基性種の相対面積を主要ピークのｐＩとともに求めた。
【0223】
ＴＬＣ。
放射性標識試料をＴＬＣ紙にスポットし、展開緩衝液の入った展開槽に入れた。展開後、ラジオクロマトグラムを取得し、放射性標識効率をＧｍＡｂ－ＤＦＯに結合した８９Ｚｒのパーセントとして算出した。
放射性標識試料をＴＬＣ紙にスポットし、展開緩衝液の入った展開槽に入れた。展開後、ラジオクロマトグラムを取得し、放射性標識効率をＧｍＡｂ－ＤＦＯに結合した８９Ｚｒのパーセントとして算出した。
【0224】
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ。
実施例２に記載した通りである。
実施例２に記載した通りである。
【0225】
ＳＥＣ－ＨＰＬＣ（ＲＡＤ）。
放射性標識した試料を、必要に応じて移動相で希釈した。Ｙａｒｒａ（商標）ＳＥＣ－３０００カラムを使用して試料を分析した。ＵＶ及び放射能検出器の両方を使用してデータを取得した。単量体８９Ｚｒ－ＤＦＯ－ＧｍＡｂのピーク面積を観察可能なピーク面積全体と比較することによって、放射化学的純度を求めた。
放射性標識した試料を、必要に応じて移動相で希釈した。Ｙａｒｒａ（商標）ＳＥＣ－３０００カラムを使用して試料を分析した。ＵＶ及び放射能検出器の両方を使用してデータを取得した。単量体８９Ｚｒ－ＤＦＯ－ＧｍＡｂのピーク面積を観察可能なピーク面積全体と比較することによって、放射化学的純度を求めた。
【0226】
液体クロマトグラフィ質量分析（ＬＣ－ＭＳ）。
ＬＣ－ＭＳは、コンジュゲート抗体と未コンジュゲート抗体とを分離することができるカラムを使用して、標準的な方法の下で操作した。
ＬＣ－ＭＳは、コンジュゲート抗体と未コンジュゲート抗体とを分離することができるカラムを使用して、標準的な方法の下で操作した。
【0227】
相対結合活性。
当技術分野で公知の任意の手段によって測定してもよい。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイ又は任意の他の適切な免疫学的アッセイによって相対結合活性を求めてもよい。
当技術分野で公知の任意の手段によって測定してもよい。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡアッセイ又は任意の他の適切な免疫学的アッセイによって相対結合活性を求めてもよい。
【図1】
【国際調査報告】