特表 2024-534211 凝集体分離方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-18

(54)【発明の名称】凝集体分離方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/00 20060101AFI20240910BHJP

   C07K 1/14 20060101ALI20240910BHJP

【ＦＩ】

C07K16/00

C07K1/14

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024513839

(86)(22)【出願日】2022-09-01

(85)【翻訳文提出日】2024-04-30

(86)【国際出願番号】 AU2022051067

(87)【国際公開番号】W WO2023028654

(87)【国際公開日】2023-03-09

(31)【優先権主張番号】2021902839

(32)【優先日】2021-09-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522003486

【氏名又は名称】テリックス ファーマシューティカルズ （イノベーションズ） ピーティーワイ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110001519

【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】スターリット、オリヴァー ウィリアム

(72)【発明者】

【氏名】ウィートクロフト、マイケル ポール

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA11

4H045AA30

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

(57)【要約】

本開示は、タンパク質、前記タンパク質の凝集体、及び液体キャリアを含む組成物から前記タンパク質の凝集体を除去する方法を提供する。前記方法は、前記組成物を酢酸セルロース膜に通すことを含む１つ以上のろ過ステップを前記組成物に対して行って、前記タンパク質が前記膜を通過することを実質的に可能としながらも前記凝集体の少なくとも一部を前記膜に選択的に吸着させることを含む。凝集体除去のための好ましいタンパク質組成物は、キレートリガンドに結合された抗体を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

タンパク質、前記タンパク質の凝集体、及び液体キャリアを含む組成物から前記タンパク質の凝集体を除去する方法であって、
前記組成物を酢酸セルロース膜に通すことを含む１つ以上のろ過ステップを前記組成物に対して行って、前記タンパク質が前記膜を通過することを実質的に可能としながらも前記凝集体の少なくとも一部を前記膜に選択的に吸着させることを含む、前記方法。

【請求項2】

前記タンパク質は、結合した（conjugated）化学部分を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記結合した化学部分がキレートリガンドを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記キレートリガンドが、デフェロキサミン（ＤＦＯ）及び１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸（ＤＯＴＡ）から選択される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記タンパク質がタンパク質標的指向剤（protein targeting agent）を含む、請求項１～４のうちいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記タンパク質は抗体を含む、請求項１～５のうちいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記タンパク質は、ギレンツキシマブ又はＨｕＪ５９１を含む、請求項１～４のうちいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記酢酸セルロース膜は、約０．０１５ｍ^２～約０．６ｍ^２のサイズを有する、請求項１～７のうちいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記酢酸セルロース膜は、平均直径が約０．２μｍ～約０．８μｍである孔を含む、請求項１～８のうちいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

各ろ過ステップにおける前記液体は、独立に、約４．０～約８．０のｐＨを有する、請求項１～９のうちいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

各ろ過ステップにおける前記液体キャリアは、独立に、水溶液である、請求項１～１０のうちいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

各ろ過ステップにおける前記液体キャリアは、独立に、緩衝溶液である、請求項１～１１のうちいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記ろ過ステップの各々は、独立に、前記組成物中の凝集体含有量を酢酸セルロース膜のサイズに対して約０．０２ｍｇ／ｃｍ^２～約０．１５ｍｇ／ｃｍ^２減少させる、請求項１～１２のうちいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記ろ過ステップの各々は、独立に、前記組成物中の凝集体含有量を前記組成物中のタンパク質種の総タンパク質含有量に対して約１０％以下に減少させる、請求項１～１３のうちいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

粒子状物又はバイオバーデンの除去のためではない、請求項１～１４のうちいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記組成物は、望まれない凝集体が形成されてしまう、タンパク質結合体を調製するためのプロセスから得られる、請求項１～１５のうちいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

請求項１～１６のうちいずれか１項に記載の方法によって得ることができる又は得られた、タンパク質。

【請求項18】

タンパク質、前記タンパク質の凝集体、及び液体キャリアを含む組成物から前記タンパク質の凝集体を除去するため；及び／又は、タンパク質、前記タンパク質の凝集体、及び液体キャリアを含む組成物から前記タンパク質の凝集体を選択的に吸着させるための、酢酸セルロース膜。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、組成物からタンパク質凝集体を選択的に除去する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

関連出願への相互参照
本願は、オーストラリア仮出願番号２０２１９０２８３９（２０２１年９月１日出願）からの優先権を主張し、該仮出願の内容はその全体が本開示中に参照により取り込まれる。

【0003】

タンパク質凝集は、タンパク質をその天然の環境の外で扱う際に生じる一般的な問題である。凝集は、取り扱いステップの間、又はタンパク質試料の保存の際に起こりうる。典型的には、凝集体は非凝集タンパク質と同じ機能は有しておらず、したがって、凝集は、タンパク質試料のロスにつながる経路の１つを表している。

【0004】

凝集が問題であるタンパク質の１つのクラスは、タンパク質結合体（protein conjugates）である。例えば、キレートリガンドとのタンパク質結合体は持続的な興味を集めており、これは例えば、治療剤、診断剤又は治療診断（theranostic）剤としてのその使用の可能性のためである。

【0005】

キレート剤は典型的には多座であり、好ましくは治療又は診断能力を有する核種に選択的である。

【0006】

タンパク質結合体の調製の際、特に商業スケールでの調製の際に生じる１つの問題は、種々の調製ステップのために必要とされる比較的厳しい合成条件のために凝集体が形成されることである。タンパク質凝集体は固体凝集体又は可溶性凝集体である。

【0007】

凝集を軽減させる戦略としては、凝集体形成を減少させるように結合体の調製手法を適合させる、またはタンパク質結合体から凝集したタンパク質を分離するように精製手法を適合させることが挙げられる。

【0008】

したがって、キレートリガンドとのタンパク質結合体を含め、タンパク質を調製するための少なくとも代替となるプロセスであって、低い凝集体レベルで有意義な収率で所望のタンパク質を提供することができるプロセスを提供することについての継続的なニーズが存在する。

【0009】

明細書中における先行技術への言及は、いかなる法域においてもその先行技術が技術常識の一部を形成することを認めた若しくは示唆したものではなく、また、その先行技術が当業者によって理解されているものと合理的に予測され、関連性があると認識され、及び／若しくは他の先行技術と結びつけられるものであると認めた若しくは示唆したものではない。

【発明の概要】

【0010】

１つの態様においては、本発明は、液体キャリア中にタンパク質及び前記タンパク質の凝集体を含む組成物から前記タンパク質の凝集体を除去する方法を提供する。この方法は、前記組成物を酢酸セルロース膜に通すことを含む１つ以上（one or more）のろ過ステップを前記組成物に対して行って、前記タンパク質が前記膜を通過することを実質的に可能としながらも前記凝集体を前記膜に選択的に吸着させることを含む。

【0011】

本願はまた、タンパク質を精製する方法も提供する。この方法は、液体キャリア中にタンパク質及び前記タンパク質の凝集体を含む組成物に対して、該組成物を酢酸セルロース膜に通すことを含む１つ以上（one or more）のろ過ステップを行って、前記タンパク質が前記膜を通過することを実質的に可能としながらも前記凝集体を前記膜に選択的に吸着させることを含む。

【0012】

本発明はまた、本開示に記載された方法によって得ることが可能な、又は得られたタンパク質も提供し、また、本開示に記載された方法によって得ることが可能な、又は得られたタンパク質を含む組成物も提供する。

【0013】

選択された定義

【0014】

用語「アルキル」は、飽和の直鎖炭化水素基及び飽和の分岐鎖炭化水素基を含むことが意図されている。いくつかの実施形態では、アルキル基は１～１２個、１～１０個、１～８個、１～６個、又は１～４個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、アルキル基は、５～２１個、９～２１個、又は１１～２１個の炭素原子を有し、例えば、１１個、１３個、１５個、１７個、又は１９個の炭素原子を有する。直鎖アルキル基の例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、及びｎ－オクチルが挙げられるがこれらに限定されない。分岐鎖アルキル基の例としては、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ネオペンチル、イソペンチル、及び２，２－ジメチルプロピルが挙げられるがこれらに限定されない。

【0015】

用語「ハロ」は、クロロ（－Ｃｌ）基、ブロモ（－Ｂｒ）基、フルオロ（－Ｆ）基、及びヨード（－Ｉ）基を含むことが意図されている。いくつかの実施形態では、ハロは、クロロ、ブロモ、及びフルオロから選択されてもよく、好ましくはフルオロである。

【0016】

本開示で用いられる場合、用語「治療診断」（theranostic）は、化合物／材料が診断と共に治療にも用いることが可能である能力を指す。用語「治療診断薬」（theranostic reagent）は、患者の疾患又は病状（condition）の検出、診断及び／又は治療の両方に適している任意の試薬に関係する。治療診断化合物／治療診断材料の目的は、別個である診断剤と治療剤との間に存在しうる、生体内分布及び選択性における望ましくない差異を解消することである。

【0017】

本開示で用いられる場合、用語「及び／又は」は「及び」、「又は」、又は両方を意味する。

【0018】

名詞の後の語「（ｓ）」は、単数形及び複数形、又はその両方を想定する。

【0019】

本開示で用いられる場合、文脈がそうではないことを必要とする場合を除き、用語「含む」（comprise）並びに「comprising」、「comprises」、及び「comprised」など、その派生形は、さらなる添加物、成分、整数又はステップを除外することを意図しない。

【0020】

本開示に開示された数字の範囲（例えば、１～１０）についての言及は、その範囲内の全ての有理数（例えば、１、１．１、２，３、３．９、４、５、６、６．５、７、８、９、及び１０）への言及をも含み、また、その範囲内の有理数の任意の範囲（例えば、２～８、１．５～５．５、３．１～４．７）への言及をも含み、並びに、したがって、本開示に明示的に開示された全ての範囲のサブ範囲もこれにより明示的に開示されていることとなることが意図されている。これらは、具体的に意図された内容のほんの例に過ぎず、同様にして、列挙された下限値と上限値との間の数値の全ての可能な組み合わせが、本出願中で明示的に記載されたものとみなされる。

【0021】

本発明の種々の特徴が、特定の値、又は値の範囲を参照して記載される。これらの値は、種々の適切な測定技術の結果に関するものであることが意図され、したがって、何であれ特定の測定技術に内在する誤差範囲を含むと解釈されるべきである。本開示において言及された値のうちいくつかは、少なくとも部分的にはこの可変性のために「約」によって表される。用語「約」は、値を記載するのに用いられる場合、その値の±１０％以内、±５％以内、±１％以内、又は±０．１％以内の量を意味してもよい。

【0022】

本発明のさらなる態様及び先行する段落に記載された態様のさらなる実施形態は、例として与えられる以下の記載から、また添付の図面を参照して、明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）前条件での種々の酢酸セルロースフィルターサイズの推定結合能（estimated binding capacity）を表すグラフである。

【0024】

【図2】ＴＦＦ後条件での種々の酢酸セルロースフィルターサイズの推定結合能を表すグラフである。

【0025】

【図3】ＴＦＦ前酢酸セルロースろ過ステップ及びＴＦＦ後酢酸セルロースろ過ステップを含む４つの適正製造規範（ＧＭＰ）ギレンツキシマブ－Ｎ－スクシニル－デフェロキサミン（desferrioxamine）結合体（GmAb-DFO）プロセスバッチのためのインプロセスサイズ排除クロマトグラフィー－高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）データを示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0026】

本発明は、タンパク質と前記タンパク質の凝集体とを含む組成物から前記タンパク質の凝集体を除去する方法に関する。この方法は、液体キャリア中にタンパク質及び前記タンパク質の凝集体を含む組成物に対して、該組成物を酢酸セルロース膜に通すことを含む、１つ以上（one or more）のろ過ステップを行うことを含む。

【0027】

本発明者らは、酢酸セルロース膜（酢酸セルロースフィルターとも称される）が典型的には滅菌及びタンパク質溶液から粒子状物及びバイオバーデンを除去するために用いられるものであるが、タンパク質と前記タンパク質の凝集体とを含む液体混合物から凝集体を効率的に除去することもできることを、驚くべきことに見いだした。

【0028】

この膜は酢酸セルロースを含む。理論に拘束されるものではないが、本開示に記載されたプロセスは、凝集サイズに基づいたろ過ではなく、凝集体と膜の酢酸セルロースとの相互作用を含むのではないかと考えられる。この相互作用は、同様の孔径ではあるが異なる材料からなる膜がタンパク質から凝集体を除去することができないのに対して、酢酸セルロースフィルターは、単量体タンパク質をも含む組成物からタンパク質凝集体を選択的に除去できたという驚くべき結果に寄与している可能性がある。凝集体と酢酸セルロースとの相互作用は、少なくとも主には、タンパク質凝集体の酢酸セルロースへの吸着であると考えられる。したがって、酢酸セルロース膜が、タンパク質は膜通過させながらも凝集体の少なくとも一部を該膜に選択的に吸着することにより、前記プロセスはタンパク質と凝集体とを含む組成物から凝集体を除去しうる。

【0029】

本開示には、タンパク質と前記タンパク質の凝集体とを含む組成物から前記タンパク質の凝集体を除去する方法も記載される。この方法は、液体キャリア中にタンパク質及び前記タンパク質の凝集体を含む組成物に対して、該組成物を酢酸セルロース膜に通すことを含む１つ以上（one or more）のろ過ステップを行って、それによって前記組成物から前記凝集体の少なくとも一部を除去することを含む。

【0030】

なお、本発明は、粒子状物及びバイオバーデンを除去するためという、酢酸セルロース膜の従来からの用途とは別個のものとして、複合タンパク質試料から凝集体を除去することができるという酢酸セルロース膜の能力に関することを理解されたい。したがって、いくつかの実施形態では、本開示に記載された方法及びプロセスは、粒子状物及び／又はバイオバーデンの除去のためではない。

【0031】

酢酸セルロース膜は、任意の適切なサイズであってよい。いくつかの実施形態では、酢酸セルロース膜は、約０．０１５ｍ^２～約０．６０ｍ^２のサイズ（ろ過面積とも称される）、例えば約０．０１５ｍ^２、約０．０３ｍ^２、約０．０５ｍ^２、約０．１０ｍ^２、約０．１５ｍ^２、約０．２０ｍ^２、約０．２５ｍ^２、０．３０ｍ^２、約０．３５ｍ^２、約０．４０ｍ^２、約０．４５ｍ^２、約０．５０ｍ^２、約０．５５ｍ^２、又は約０．６ｍ^２のサイズを有する。いくつかの実施形態では、前記サイズは、これらの値～任意の他の値のうちの任意のサイズ、例えば、約０．０１５ｍ^２～約０．１ｍ^２のサイズ又は約０．０３ｍ^２～約０．１０ｍ^２のサイズであってもよい。いくつかの実施形態では、酢酸セルロース膜は、０．０５ｍ^２のサイズを有する。本開示に記載される酢酸セルロース膜は、典型的には、タンパク質試料からバイオバーデン及び粒子状物を除去するために従来から用いられているものよりも大きなサイズを有することを理解されたい。

【0032】

酢酸セルロース膜は、任意の適切な形態で与えられてよい。例を挙げると、酢酸セルロース膜は、遠心フィルタ、シリンジフィルタ、又はカプセルフィルタの形態であってもよく、これらはいずれもプロセス（グラム）スケールに適したものであってよい。

【0033】

酢酸セルロース膜は、フロースルー（連続的）法又はプロセスにおける使用に適していてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上のろ過ステップの各々が独立にフロースルーモードで行われる。実施例に示されるように、これは、有利にも、大規模なタンパク質製造プロセスにおいて本開示に記載の酢酸セルロース膜を用いることを可能とし得る。

【0034】

いくつかの実施形態では、酢酸セルロース膜は、酢酸セルロースナノ粒子を含まない又は実質的に非含有である。Bee et al (Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 98, No 9, 3218-3238)は、タンパク質凝集体が酢酸セルロースナノ粒子への親和性を示すことを先に報告している。有利には、実施例に示すように、酢酸セルロースナノ粒子よりも比較上より小さな相対的表面積を有しながらも、本開示に記載の酢酸セルロース膜は、凝集体の含有量を許容可能な品質レベルまで減少させることが可能である。

【0035】

酢酸セルロース膜は任意の適切なサイズの孔を含んでもよい。いくつかの実施形態では、酢酸セルロース膜は、平均直径（孔サイズとも呼ばれる）が約０．２μｍ～約０．８μｍ、例えば、約０．２μｍ、約０．２５μｍ、約０．３μｍ、約０．３５、約０．４μｍ、約０．４５μｍ、約５．０μｍ、約５．５μｍ、約６．０μｍ、約６．５μｍ、約７．０μｍ、約７．５μｍ、又は約８．０μｍである孔を含む。いくつかの実施形態では、前記平均直径は、これらの値から任意の他の値までの任意の平均直径、例えば０．２μｍ～約０．４５μｍであってもよい。いくつかの実施形態では、酢酸セルロース膜は、平均直径が約０．２μｍである孔を含む。

【0036】

各ろ過ステップにおける液体キャリア（液体混合物とも呼ばれる）は、独立に、約４．０～約８．０のｐＨ、例えば約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１．約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、又は約８．０のｐＨを有していてもよい。いくつかの実施形態では、前記ｐＨはこれらの値から任意の他の値までの任意のｐＨ、例えば約４．４～約７．４のｐＨ又は約４．４～約５．９のｐＨであってもよい。有利には、クロマトグラフィー樹脂などタンパク質凝集体を除去するために典型的に用いられる他の技術とは対照的に、本開示に記載の酢酸セルロース膜の使用は、様々なｐＨ条件において凝集体の除去を可能にしうる。

【0037】

前記組成物は、タンパク質、前記タンパク質の凝集体、及び液体キャリアを含む。前記組成物は、液体キャリア中のタンパク質及び凝集体の溶液であってもよいし、または前記組成物は液体キャリア中のタンパク質及び／又は凝集体の懸濁物又は乳化物であってもよい。いくつかの実施形態では、タンパク質は液体キャリアを用いた溶液状態にあり、凝集体は該液体キャリア中に懸濁状態にある。典型的には、前記組成物は、液体キャリア中におけるタンパク質及び凝集体の均一な混合物である。前記組成物は、酢酸セルロース膜を通過させられることが可能な任意の形態であってよく、典型的には液体組成物である。

【0038】

各ろ過ステップにおける液体キャリアは、独立に、水溶液であってよく、例えば、塩化ナトリウム溶液又は緩衝溶液である。いくつかの実施形態では、液体キャリアは緩衝溶液を含む。タンパク質と適合する（compatible）任意の適切な緩衝溶液を用いてよく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ－ＮａＯＨ）、リン酸水素二ナトリウム、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ－ＫＯＨ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）及びＮ－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－Ｎ’－（２－エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、緩衝溶液はＰＢＳである。有利には、（例えば、特定の緩衝条件を必要とするクロマトグラフィー樹脂など）タンパク質凝集体を除去するために典型的に用いられる他の技術とは対照的に、本開示に記載の酢酸セルロース膜の使用は、様々なｐＨ条件において凝集体の除去を可能にしうる。

【0039】

いくつかの実施形態では、前記１つ以上のろ過ステップは、２つ以上のろ過ステップ、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上の数のろ過ステップを含む。ろ過ステップの数は、例えば出発組成物中の凝集体の量及び／又は酢酸セルロース膜のサイズに応じて適切に選択されてよい。

【0040】

いくつかの実施形態では、前記１つ以上のろ過ステップは２つのろ過ステップを含む。したがって、いくつかの実施形態では、前記１つ以上のろ過ステップは、
前記組成物を酢酸セルロース膜に通すことを含む第１のろ過ステップ；及び
前記組成物を酢酸セルロース膜に通すことを含む第２のろ過ステップ
を含む。

【0041】

言い方を変えれば、いくつかの実施形態では、前記方法は、
液体中にタンパク質及び前記タンパク質の凝集体を含む組成物を準備すること；
前記組成物を酢酸セルロース膜に通して、酢酸セルロース膜を通す前の前記組成物に比べて、凝集体に対してタンパク質が富化された第１のろ液を与えることを含む第１のろ過ステップを、前記組成物に対して行うこと；及び
第１のろ液を酢酸セルロース膜に通して、第１のろ液に比べて、凝集体に対してタンパク質がさらに富化された第２のろ液を与えることを含む第２のろ過ステップを、第１のろ液に対して行うこと
を含む。

【0042】

第１のろ液のｐＨは、第１のろ過ステップの前の前記組成物のｐＨとは異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、第１のろ液は、約５．６～約５．９のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、前記方法は、第２のろ過ステップの前に、第１のろ液のｐＨを調製することをさらに含む。

【0043】

なお、本開示に記載の方法は、当業界で知られた、望まれない凝集体を形成する可能性を有している任意のタンパク質（典型的には単量体）に適用してもよい。本開示で用いる場合、用語「凝集体」は、タンパク質の高分子量（ＨＭＷ）凝集体、典型的には二量体よりも大きいマルチマー、を含むと理解されるものとする。凝集体は、微粒子（particulates）を形成する不溶性凝集体であってよく、自らが形成された溶液中で凝集体が沈殿してもよく、または凝集体は可溶性凝集体であってもよい。

【0044】

本開示に用いる場合、用語「タンパク質」は、タンパク質結合体（protein conjugates）、例えば、他の（非タンパク質）化学部分が連結、典型的には共有結合によって連結されたタンパク質、をも包含すると理解されるものとする。したがって、いくつかの実施形態では、タンパク質はタンパク質結合体である。言い方を変えれば、いくつかの実施形態では、タンパク質は結合した（conjugated）化学部分、例えばタンパク質に連結した（非タンパク質）化学部分を含む。この化学部分（補欠分子族（prosthetic group）とも呼ばれる）は、当業界で知られた任意の適切な化学部分であってよい。いくつかの実施形態では、前記化学部分はキレート部分であってもよい。

【0045】

いくつかの実施形態では、タンパク質及び結合した化学部分は、共有結合によって直接連結されている。いくつかの実施形態では、タンパク質及び結合した化学部分は、連結基によって連結されている。

【0046】

いくつかの実施形態では、連結基は二官能性リンカーである。二官能性リンカーは、化学部分とタンパク質とを共有結合的に連結することができる任意の二ラジカル種であってよい。適切な二官能性リンカーとしては、ブロモアセチル、チオール類、スクシンイミドエステル（例えばスクシニル）、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル、マレイミド、アミノ酸（天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を含む）、ニコチンアミド、ニコチンアミド誘導体、又は当業界で知られた任意のアミン又はチオール改変化学反応（any amine or thiol- modifying chemistry）の使用が挙げられる。いくつかの実施形態では、二官能性リンカーはスクシニルである。

【0047】

いくつかの実施形態では、二官能性リンカーは、結合した化学部分とタンパク質との間に２～１０原子の最長直線経路を規定する原子の鎖を含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、二官能性リンカーは、－Ｏ－、－ＮＲ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、Ｃ（Ｏ）ＮＲ－、－ＯＣ（Ｏ）－、－ＮＲＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＮＲＣ（Ｏ）Ｏ－、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ－、－ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ－から選択される１つ又は複数の基を任意に（optionally）間に挟んだＣ１～１０アルキル又はハロＣ１～１０アルキルであってもよく、ここでＲはＨ及びＣ１～４アルキルから選択される。

【0049】

いくつかの実施形態では、タンパク質（又は結合した化学部分）は、キレートリガンド、つまりタンパク質に連結したキレートリガンド、を含む。キレートリガンドは、当業界で知られた、金属イオンをキレートすることができる任意の適切なキレーターであってよい。

【0050】

いくつかの実施形態では、キレートリガンドは放射性核種をキレートすることが可能である。適切なキレートリガンドの例としては、ＴＭＴ（６，６’’－ビス［Ｎ，Ｎ’’，Ｎ’’’－テトラ（カルボキシメチル）アミノメチル）－４’－（３－アミノ－４－メトキシフェニル）－２，２’：６’，２’’－テルピリジン）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’－四酢酸、テトラキセタンとしても知られる）、ＴＣＭＣ（ＤＯＴＡのテトラ－一級アミド）、ＤＯ３Ａ（１，４，７，１０－テトラアザシクロドデカン－１，４，７－トリス（酢酸）－１０－（２－チオエチル）アセトアミド）、ＣＢ－ＤＯ２Ａ（４，１０－ビス（カルボキシメチル）－１，４，７，１０－テトラアザビシクロ［５．５．２］テトラデカン）、ＮＯＴＡ（１，４，７－トリアザシクロノナン－三酢酸）、Ｄｉａｍｓａｒ（３，６，１０，１３，１６，１９－ヘキサアザビシクロ［６．６．６］エイコサン－１，８－ジアミン）、ＤＴＰＡ（ペンテト酸又はジエチレントリアミン五酢酸）、ＣＨＸ－Ａ”－ＤＴＰＡ（［（Ｒ）－２－アミノ－３－（４－イソチオシアナトフェニル）プロピル］－トランス－（Ｓ，Ｓ）－シクロヘキサン－１，２－ジアミン－五酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１－テトラアザシクロテトラデカン－１，４，８，１１－四酢酸）、Ｔｅ２Ａ（４，１１－ビス（カルボキシメチル）－１，４，８，１１－テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン）、ＨＢＥＤ（Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシベンジル）エチレンジアミン－Ｎ，Ｎ－二酢酸）、ＤＦＯ（デフェロキサミン）、及びそれらのアナログ又は誘導体、例えば、ＤＦＯ^＊及びＤＦＯｓｑ（ＤＦＯ－スクアラミド）、ＨＹＮＩＣ（６－ヒドラジノニコチンアミド）、及びＨＯＰＯ（３，４，３－（ＬＩ－１，２－ＨＯＰＯ）、若しくは本開示に記載されるようなその他のリガンド、又はそれらの誘導体が挙げられる。適切な誘導としては、分子の非配位部分への修飾が挙げられ、また、カルボキシル基の代わりにアミドの存在などの官能基相互変換が挙げられる。

【0051】

いくつかの実施形態では、キレートリガンドはＤＦＯ又はそのアナログである。ＤＦＯ及びそのアナログ（ＤＦＯ^＊、ＤＦＯｓｑ、ＤＦＯＮＣＳ、ＤＦＯ^＊ｓｑ、及びＤＦＯ^＊ＮＣＳなど）は、治療上、診断上、及び／又は治療診断上の能力を有する所望の核種に対する選択的キレートリガンドである。特には、ＤＦＯ及びそのアナログは、^８９Ｚｒに対する選択的キレーターである。^８９Ｚｒは、半減期が３．３日に及ぶベータプラス放射体（ａｖ）（０．３９６ＭｅＶ）である。^８９Ｚｒは、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）画像取得における潜在的な用途を有しており、タンパク質結合体（例えば、本発明の方法によって作製されたタンパク質結合体）に含まれた場合には、抗体の血中半減期（circulation half-life）に合致する３．３日という伸びた^８９Ｚｒの半減期のために、免疫学的ＰＥＴ（イムノ－ＰＥＴ）画像取得において特に興味深い。イムノ－ＰＥＴ画像取得において、適切な抗体に結合させられた放射性核種複合体を用いることによって、腫瘍細胞上の腫瘍関連抗原の発現に基づいて腫瘍が画像取得される。

【0052】

いくつかの実施形態では、キレートリガンドは放射性核種をキレートする。放射性核種は好ましくは治療上又は診断上の能力を有する放射性核種である。適切な同位体の例としては、アクチニウム－２２５（^２２５Ａｃ）、アスタチン－２１１（^２１１Ａｔ）、ビスマス－２１２及びビスマス－２１３（^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ）、銅－６４及び銅－６７（^６４Ｃｕ、^６７Ｃｕ）、ガリウム－６７及びガリウム－６８（^６７Ｇａ及び^６８Ｇａ）、インジウム－１１１（^１１１Ｉｎ）、ヨウ素－１２３、－１２４、－１２５又は－１３１（^１２３Ｉ、^１２４Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ）（^１２３Ｉ），鉛－２１２（^２１２Ｐｂ）、ルテチウム－１７７（^１７７Ｌｕ）、ラジウム－２２３（^２２３Ｒａ）、サマリウム－１５３（^１５３Ｓｍ）、スカンジウム－４４及びスカンジウム－４７（^４４Ｓｃ、^４７Ｓｃ）、ストロンチウム－９０（^９０Ｓｒ）、テクネチウム－９９（^９９ｍＴｃ）、イットリウム－８６及びイットリウム－９０（^８６Ｙ、^９０Ｙ）、ジルコニウム－８９（^８９Ｚｒ）が挙げられる。

【0053】

特に興味深いタンパク質結合体の１つのクラスは、投与後にタンパク質部分が前記結合体を対象内に局在化させることができ、それによって、画像取得、例えばＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ又はその他の適切な画像取得技術による画像取得を助けることができるタンパク質結合体である。したがって、いくつかの実施形態では、前記タンパク質はタンパク質標的指向剤（protein targeting agent）を含むか、タンパク質標的指向剤である。

【0054】

本開示において用いられる場合、「タンパク質標的指向剤」とは、
１．（遊離形態でも、放射性核種等の核種にキレートしている場合でも）結合対象のキレート基との安定な結合（conjugation）、
２．取り扱いの間に有害な凝集体を形成する、及び
３．投与後に対象内に局在化する（例えば、タンパク質標的指向剤は、１つ以上の器官、オルガネラ、細胞タイプ又は受容体タイプ内に局在化してもよい）
ことが可能な任意のタンパク質を指す。

【0055】

タンパク質標的指向剤は、特定の生物学的標的に結合することができる、あるいは特定の代謝活性を発現することができる、ポリペプチド、タンパク質（例えば、抗体及びその誘導体、例えばナノボディ、ダイアボディ、抗体フラグメント）であってもよい。

【0056】

適切な標的指向剤の非限定的な例としては、ＶＥＧＦ受容体へと標的指向する分子、ボンベシン又はＧＲＰ受容体へと標的指向する分子のアナログ、ソマトスタチン受容体へと標的指向する分子、ＲＧＤペプチド又はａｖｐ３及びａｖＰ５へと標的指向する分子、アネキシンＶ又はアポトーシスプロセスへと標的指向する分子、エストロゲン受容体へと標的指向する分子、プラークへと標的指向する生体分子、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）へと標的指向する分子、炭酸脱水酵素（例えば、炭酸脱水酵素ＩＸ；ＣＡＩＸ）へと標的指向する分子、が挙げられる。

【0057】

いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、抗体又はその誘導体を含むか、抗体又はその誘導体であり、抗体又はその誘導体には、ナノボディ、ダイアボディ、抗体フラグメント、等々が含まれる。

【0058】

ある実施形態では、前記タンパク質は、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）に結合するための抗体又はその抗原結合フラグメントである。特に好ましい抗体はｃＧ２５０であり、好ましくはギレンツキシマブ（ＩＮＮ）であり、これは本開示においてＧｍＡｂとも称される。別の特に好ましい実施形態は、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２５２６によって生産されるモノクローナル抗体Ｇ２５０である。抗体ｃＧ２５０は、元々はマウスのモノクローナル抗体ｍＧ２５０のＩｇＧ１カッパ軽鎖キメラ版である。抗体又はその抗原結合フラグメントは、ギレンツキシマブのヒト化形態であってもよい。特に好ましい実施形態では、ＣＡＩＸに結合するための抗体は、その内容が参照によって本開示に取り込まれる国際公開２０２１／００００１７に記載されている抗体である。

【0059】

ある実施形態では、前記タンパク質は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に結合するための抗体又はその抗原結合フラグメント、例えばＪ５９１又はｈｕＪ５９１、である。抗体Ｊ５９１は、Liu et al., Cancer Res 1997; 57: 3629-34に記載されている。前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、（参照により本開示に取り込まれるＵＳ２００６／００８８５３９の配列番号１、２、及び３に規定され、図１Ａに表される）マウスＪ５９１の重鎖可変領域；並びに（参照により本開示に取り込まれるＵＳ２００６／００８８５３９の配列番号４、５、及び６にを参照でき、図１Ｂに表される）マウスＪ５９１の軽鎖可変領域、由来の少なくとも１つ、２つ及び好ましくは３つのＣＤＲを有していてもよい。前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＵＳ２００６／００８８５３９に記載されたＪ５９１抗体の重鎖可変及び軽鎖、又はその任意の改変形態、を有していてもよい。前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＵＳ２００６／００８８５３９の図２Ａ及び図２Ｂに記載された脱免疫原化された（deimmunised）Ｊ５９１抗体の重鎖可変及び軽鎖、又はその任意の改変形態を有するものであってもよい。特に好ましい実施形態では、ＰＳＭＡに結合するための抗体は、その内容が参照により本開示に取り込まれるＷＯ２０２１／００００１７に記載された抗体である。

【0060】

いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、ＣＡＩＸ又はＰＳＭＡへと標的指向することができる抗体又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、前記タンパク質はギレンツキシマブ及びＨｕＪ５９１から選択され、ここで前記タンパク質は、任意に（optionally）キレートリガンドに結合している。いくつかの実施形態では、前記タンパク質はギレンツキシマブ（ＧｍＡｂ）を含むか、ギレンツキシマブ（ＧｍＡｂ）である。ＧｍＡｂは、ＣＡＩＸに対するモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、前記タンパク質はＨｕＪ５９１を含むか、ＨｕＪ５９１である。ＨｕＪ５９１は、ＰＳＭＡのモノクローナル抗体である。

【0061】

いくつかの実施形態では、前記タンパク質はポリペプチドを含む、又はポリペプチドである。該ポリペプチドは、最少で、約２０以上、約２５以上、又は約３０以上のアミノ酸残基の配列を含んでいてもよい。前記ポリペプチドは、約３５以下、約４０以下、約４５以下又は約５０以下のアミノ酸残基を含んでいてもよい。前記ポリペプチドは、これらの最少値のうちの任意のものから任意の最大値までの任意のアミノ酸配列長、例えば約２０～約５０アミノ酸残基、を含んでいてもよい。ペプチドの凝集は、Zapadka KL, Becher FJ, Gomes dos Santos AL, Jackson SE. 2017 Factors affecting the physical stability (aggregation) of peptide therapeutics. Interface Focus 7: 20170030. http://dx.doi.org/10.1098/rsfs.2017.0030にレビューされており、これはその全体が参照により本開示に取り込まれる。

【0062】

いくつかの実施形態では、前記タンパク質は、天然タンパク質（native protein）を含むか天然タンパク質であり、その由来源から単離されている。いくつかの実施形態では、前記タンパク質は合成又は半合成の残基を含む、または前記タンパク質自身が合成又は半合成のものである。前記タンパク質（あるいは、タンパク質結合体の場合、タンパク質部分）は、当業界で知られた任意の手段によって調製すればよく、例えば、所望のタンパク質を得るための、直接のアミノ酸合成、組み換え技術、及びフラグメントのライゲーションが挙げられる。

【0063】

いくつかの実施形態では、タンパク質及び凝集体を含む前記組成物は、その中で望まれない凝集体が形成されてしまう、タンパク質結合体（例えば、キレートリガンドがタンパク質に連結した結合体）を調製するためのプロセスから得られる。そのようなプロセスの一例が、実施例において、ＤＦＯ－ＧｍＡｂ結合体の調製のために記載される。

【0064】

いくつかの実施形態では、前記組成物は、二量体タンパク質、つまりタンパク質の二量体をさらに含む。

【0065】

前記１つ以上のろ過ステップの前の、タンパク質を含む組成物（出発組成物とも称される）は、タンパク質濃度に対して、又は組成物中のタンパク質種（protein species）（例えば、タンパク質、凝集体、及び存在するならば二量体）の総含有量に対して、約１０％以上、約１１％以上、約１２％以上、約１３％以上、約１４％以上、約１５％以上、約１６％以上、約１７％以上、約１８％以上、約１９％以上、約２０％以上、約２１％以上、約２２％以上、約２３％以上、約２４％以上、約２５％以上、約２６％以上、約２７％以上、約２８％以上、約２９％以上、約３０％以上又はさらに高い濃度の凝集体を含んでいてもよい。タンパク質を含む前記組成物は、これらのパーセント値のうち任意の１つから任意の他のパーセント値までの、例えば約１０％～約２５％又は約１１％～約１９％の、凝集体を含んでいてもよい。タンパク質（又は総タンパク質種）に対する凝集体の濃度は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及び凝集体種（aggregate species）に帰属するピーク下面積を単量体タンパク質（及び、存在するならその他のタンパク質種）についてのピーク下面積と比べることによって決定してもよい。

【0066】

前記１つ以上のろ過ステップの前のタンパク質を含む組成物は、凝集体に対して、又は組成物中のタンパク質種（protein species）（例えば、タンパク質、凝集体、及び存在するならば二量体）の総含有量に対して、約７４％以上、約７５％以上、約７６％以上、約７７％以上、約７８％以上、約７９％以上、約８０％以上、約８１％以上、約８２％以上、約８３％以上、約８４％以上、約８５％以上、約８６％以上、約８７％以上、約８８％以上、約８９％以上、約９０％以上又はさらに高い濃度である濃度でタンパク質を含んでいてもよい。タンパク質は、これらのパーセント値のうち任意の１つから任意の他のパーセント値までの濃度で、例えば約８０％～約９０％の濃度で存在してもよい。タンパク質の濃度は、凝集体種の濃度と同様のやり方、例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及び関係するそれぞれのピークについてのピーク下面積を比べることによって、決定してもよい。

【0067】

前記１つ以上のろ過ステップの前のタンパク質を含む組成物はさらに二量体タンパク質を含んでいてもよい。典型的には、二量体は、二量体濃度として多くとも約１５％以下、約１２．５％以下、約１０％以下、約８％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下又はさらに低い濃度で存在する。二量体は、これらのパーセント値のうち任意の１つから任意の他のパーセント値までの濃度で、例えば約２％～約１２．５％又は約３％～約６％の濃度で存在してもよい。二量体の濃度は、凝集体種の濃度と同様のやり方、例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及び関係するそれぞれのピークについてのピーク下面積を比べることによって、決定してもよい。

【0068】

前記方法は、ろ過ステップのうち任意の１つ又は複数の前に、組成物に対してバッファー交換を行うステップをさらに含んでいてもよい。あるいは、いくつかの実施形態では、ろ過ステップのうち任意の１つ又は複数の前に、組成物に対してバッファー交換を行うステップは行われない。有利には、クロマトグラフィー樹脂などタンパク質凝集体を除去するために典型的に用いられる他の技術とは対照的に、本開示に記載の酢酸セルロース膜の使用は、バッファー交換ステップを必要としない。

【0069】

いくつかの実施形態では、ろ過ステップのそれぞれは、独立に、タンパク質に対する、又は組成物中のタンパク質種（protein species）（例えば、タンパク質、凝集体、及び存在するならば二量体）の総含有量に対する凝集体の濃度として約２５％以下、例えば約２０％以下、約１５％以下、約１２．５％以下、約１０％以下、約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１％以下、約０．９％以下、約０．８％以下、約０．７％以下、約０．６％以下、約０．５％以下、約０．４％以下、約０．３％以下、約０．２％以下、約０．１％以下、約０．０５％以下、約０．０１％以下、約０．００５％以下、約０．００１％以下、約０．０００５％以下、約０．０００１％、又はさらに低い濃度へと組成物中の凝集体濃度を減少させる。凝集体濃度は、独立に、これらのパーセント値のうち任意の値からこれらのパーセント値のうちの任意の他の値まで、例えば約０．００１％～約１５％又は約０．１％～約５％、減少されてもよい。いくつかの実施形態では、ろ過ステップのそれぞれは、独立に、組成物中の凝集体濃度を約５％以下に減少させる。タンパク質（又は総タンパク質種）に対する凝集体の濃度は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及び凝集体種（aggregate species）に帰属するピーク下面積を単量体タンパク質（及び、存在するならその他のタンパク質種）についてのピーク下面積と比べることによって決定してもよい。

【0070】

いくつかの実施形態では、前記方法は、出発溶液中に存在する凝集体の重量のうち約５重量％以上、約１０重量％以上、約１５重量％以上、約２０重量％以上、約２５重量％以上、約３０重量％以上、約３５重量％以上、約４０重量％以上、約４５重量％以上、約５０重量％以上、約６０重量％以上、約７０重量％以上、約８０重量％以上、約９０重量％以上、約９５重量％以上、又はさらに高い程度分、タンパク質の凝集体を減少させてもよい。前記方法は、これらのパーセント値のうち任意の１つから任意の他のパーセント値までの程度分、凝集体を減少させてもよく、例えば前記方法は、出発溶液から、出発溶液中に存在する凝集体の重量のうち、約５重量％～約９５重量％分又は約１０重量％～約４０重量％分、凝集体を減少させてもよい。

【0071】

いくつかの実施形態では、ろ過ステップのそれぞれは、独立に、酢酸セルロース膜のサイズに対して約０．０２ｍｇ／ｃｍ^２～約０．１５ｍｇ／ｃｍ^２分、例えば、約０．０２ｍｇ／ｃｍ^２分、約０．０３ｍｇ／ｃｍ^２分、約０．０４ｍｇ／ｃｍ^２分、約０．０５ｍｇ／ｃｍ^２分、約０．０６ｍｇ／ｃｍ^２分、約０．０７ｍｇ／ｃｍ^２分、約０．０８ｍｇ／ｃｍ^２分、約０．０９ｍｇ／ｃｍ^２分、約０．１０ｍｇ／ｃｍ^２分、約０．１１ｍｇ／ｃｍ^２分、約０．１２ｍｇ／ｃｍ^２分、約０．１３ｍｇ／ｃｍ^２分、約０．１４ｍｇ／ｃｍ^２分、又は約０．１５ｍｇ／ｃｍ^２分、組成物中の凝集体含有量を減少させる。凝集体含有量は、独立に、これらの値のうち任意の１つから任意の他の値までの程度で、例えば酢酸セルロース膜のサイズに対して約０．０３ｍｇ／ｃｍ^２～約０．１３ｍｇ／ｃｍ^２分又は約０．０５ｍｇ／ｃｍ^２～約０．１０ｍｇ／ｃｍ^２分、減少させられてもよい。

【0072】

いくつかの実施形態では、ろ過ステップのそれぞれは、独立に、平均で、酢酸セルロース膜のサイズに対して約０．０５ｍｇ／ｃｍ^２～約０．１０ｍｇ／ｃｍ^２分、例えば、約０．０５ｍｇ／ｃｍ^２分、０．０６ｍｇ／ｃｍ^２分、０．０７ｍｇ／ｃｍ^２分、０．０８ｍｇ／ｃｍ^２分、０．０９ｍｇ／ｃｍ^２分、又は０．１０ｍｇ／ｃｍ^２分、組成物中の凝集体濃度を減少させる。凝集体含有量は、独立に、平均で、これらの値のうち任意の１つから任意の他の値までの程度で、例えば酢酸セルロース膜のサイズに対して約０．０６ｍｇ／ｃｍ^２～約０．０９ｍｇ／ｃｍ^２分、減少させられてもよい。

【0073】

いくつかの実施形態では、酢酸セルロース膜は、約８０％までの相対保持時間（ＲＲＴ）における０．０５ｍｇ凝集体／ｃｍ^２～約８０％までのＲＲＴにおける約０．１０ｍｇ凝集体／ｃｍ^２、例えば約８０％までのＲＲＴにおける約０．０５ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．０７ｍｇ、０．０８ｍｇ、０．０９ｍｇ又は０．１０ｍｇ凝集体／ｃｍ^２、の平均除去効率（平均結合能又は平均ろ過能とも称される）を有し、ここで、ＲＲＴは、単量体タンパク質に帰属するＳＥＣ－ＨＰＬＣピークに対する値である（つまり、凝集体ピークは、単量体タンパク質ピークの近似保持時間（approximate retention time）の約８０％までの近似保持時間を有する）。平均除去効率は、これらの値のうち任意の１つから任意の他の値までの値、例えば、約８０％までの相対保持時間（ＲＲＴ）における約０．０６ｍｇ凝集体／ｃｍ^２～約８０％までの相対保持時間（ＲＲＴ）における約０．０９ｍｇ凝集体／ｃｍ^２、であってもよい。ＲＲＴは、約８０％までの任意の値であってよく、例えば、約８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、又はさらに低いＲＲＴであってもよい。ＲＲＴは、これらの値のうち任意の１つから任意の他の値までの値、例えば、約４０％～約８０％、又は約６０％～約８０％、であってもよい。いくつかの実施形態では、ＲＲＴは約７０％ＲＲＴである。なお、二量体タンパク質ピークは典型的には約８５％のＲＲＴを有する。

【0074】

他のある態様は、タンパク質を精製する方法を提供する。この方法は、
液体キャリア中にタンパク質及び前記タンパク質の凝集体を含む組成物に対して、該組成物を酢酸セルロース膜に通すことを含む１つ以上（one or more）のろ過ステップを行って、前記タンパク質が前記膜を通過するようにしながらも前記凝集体のうち少なくとも一部を前記膜に選択的に吸着させること
を含む。

【0075】

本開示においては、タンパク質を精製する方法も提供される。この方法は、
液体キャリア中にタンパク質及び前記タンパク質の凝集体を含む組成物に対して、該組成物を酢酸セルロース膜に通すことを含む１つ以上（one or more）のろ過ステップを行って、それによって前記凝集体の少なくとも一部を除去すること
を含む。

【0076】

本開示で用いられる場合、用語「精製する」は、方法を行う前の凝集体含有量と比べて、組成物中の凝集体含有量が減少させられることを意味するものと理解されるものとする。

【0077】

他のある態様は、本開示に記載の方法によって得ることができる、又は本開示に記載の方法によって得られたタンパク質（精製タンパク質とも称される）に関する。

【0078】

他のある態様は、本開示に記載の方法によって得ることができる、又は本開示に記載の方法によって得られたタンパク質（又は精製タンパク質）を含む組成物を提供する。

【0079】

本開示に記載の方法によって得ることができる、又は本開示に記載の方法によって得られたタンパク質を含む組成物（最終組成物又は精製組成物とも称される）は、タンパク質濃度に対して、又は組成物中のタンパク質種（protein species）（例えば、タンパク質、凝集体、及び存在するならば二量体）の総含有量に対して、約２０％以下の、約１５％以下の、約１２．５％以下の、約１０％以下の、約９％以下の、約８％以下の、約７％以下の、約６％以下の、約５％以下の、約４％以下の、約３％以下の、約２％以下の、約１％１％以下の、約０．９％以下の、約０．８％以下の、約０．７％以下の、約０．６％以下の、約０．５％以下の、約０．４％以下の、約０．３％以下の、約０．２％以下の、約０．１％以下の、約０．０５％以下の、約０．０１％以下の、約０．００５％以下の、約０．００１％以下の、約０．０００５％以下の、約０．０００１％以下の、又はさらに低い濃度の凝集体を含んでいてもよい。前記タンパク質を含む組成物は、これらのパーセント値のうち任意のパーセント値から任意の他のパーセント値までの、例えば約０．０１％～約５％の、凝集体を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記組成物は、約５％以下の凝集体含有量を含む。タンパク質（又は総タンパク質種）に対する凝集体の濃度は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及び凝集体種（aggregate species）に帰属するピーク下面積を単量体タンパク質（及び、存在するならその他のタンパク質種）についてのピーク下面積と比べることによって決定してもよい。

【0080】

本開示に記載の方法によって得ることができる、又は本開示に記載の方法によって得られたタンパク質を含む組成物は、凝集体濃度に対して、又は組成物中のタンパク質種(protein species)（例えば、タンパク質、凝集体、及び存在するならば二量体）の総含有量に対して、９０％以上の濃度で、例えば、９１％以上の、９２％以上の、９３％以上の、９４％以上の、９５％以上の、９６％以上の、９７％以上の、９８％以上の、９９％以上の、又は１００％以上の濃度で、タンパク質を含んでいてもよい。タンパク質は、これらの濃度値のうち任意の値同士の間の濃度で、例えば、約９０％～約１００％又は約９５％～約１００％の濃度で、存在してもよい。タンパク質の濃度は、凝集体種の濃度と同様のやり方、例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及び関係するそれぞれのピークについてのピーク下面積を比べることによって、決定してもよい。

【0081】

いくつかの実施形態では、本開示に記載の方法によって得ることができる、又は本開示に記載の方法によって得られたタンパク質を含む組成物は、二量体タンパク質をさらに含んでいてもよい。典型的には、二量体は、約１．５％以下の、約１．４％以下の、約１．３％以下の、約１．２％以下の、１．１％以下の、約１％以下の、約０．９％以下の、約０．８％以下の又は約０．７％以下の濃度で存在する。二量体はこれらの濃度値のうち任意の値同士の間の濃度で、例えば、約０．７％～約１％の濃度で、存在してもよい。二量体の濃度は、凝集体種の濃度と同様のやり方、例えば、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及び関係するそれぞれのピークについてのピーク下面積を比べることによって、決定してもよい。

【0082】

タンパク質を含む前記組成物は、典型的には、液体キャリアを含む。液体キャリアは、本開示に記載の任意の液体キャリアであってよい。いくつかの実施形態では、液体キャリアは水溶液であり、例えば塩化ナトリウム溶液又は緩衝溶液である。好ましい実施形態では、液体キャリアは、本開示に記載の緩衝溶液などの緩衝溶液を含む。

【0083】

他のある態様は、キレートリガンドがタンパク質に連結した結合体を調製するプロセスに関する。該プロセスは、
前記タンパク質の凝集体の形成を促す条件下で、前記タンパク質に連結した、金属と錯体形成したキレートリガンドを含む金属錯体化結合体（metal complexed conjugate）から前記金属を除去して、それによって前記キレートリガンドが前記タンパク質に連結した結合体の組成物であって、キレートされた金属イオン及び前記凝集体を実質的に含まない組成物を与えること；並びに、
前記組成物に対し、前記組成物を酢酸セルロース膜に通すことを含む１つ以上（one or more）のろ過ステップを行って、それによって、前記キレートリガンドが前記タンパク質に連結した結合体が前記膜を通過するようにしながらも、前記凝集体の少なくとも一部を前記膜上に選択的に吸着させる、及び／又は、それによって前記凝集体の少なくとも一部を前記組成物から除去すること、
を含む。

【0084】

前記タンパク質及びキレートリガンドは、本開示に記載されたタンパク質及びキレートリガンドのうちいずれであってもよい。

【0085】

１つの実施形態においては、前記プロセスは、デフェロキサミンキレートリガンドがタンパク質に連結した結合体を調製するプロセスであって、該プロセスは、
前記タンパク質の凝集体の形成を促す条件下で、前記タンパク質に連結した、鉄と錯体形成したデフェロキサミンキレートリガンドを含む鉄錯体化結合体（metal complexed conjugate）から鉄を除去して、それによって前記デフェロキサミンキレートリガンドが前記タンパク質に連結した結合体を含む組成物であって、キレートされた鉄及び前記凝集体を実質的に含まない組成物を与えること；並びに、
前記組成物に対し、前記組成物を酢酸セルロース膜に通すことを含む１つ以上（one or more）のろ過ステップを行って、それによって、前記デフェロキサミンキレートリガンドが前記タンパク質に連結した結合体は前記膜を通過するようにしながらも、前記凝集体の少なくとも一部を前記膜上に選択的に吸着させる、及び／又は、それによって前記凝集体の少なくとも一部を前記組成物から除去すること、
を含む。

【0086】

本開示に記載されるように、前記１つ以上のろ過ステップは、独立に、個々のろ過ステップの前の凝集体含有量と比べて凝集体含有量が減少した組成物を与える。いくつかの実施形態では、前記プロセスは、これらのろ過ステップのうちの２つ以上を含み、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の数のろ過ステップを含んでもよい。

【0087】

前記プロセスは、前記タンパク質に連結した、金属と錯体形成したキレートリガンドを含む金属錯体化結合体を形成するステップを含んでもよい。この形成するステップは、金属イオンと錯体形成したキレートリガンドをタンパク質とカップリングすることを含んでもよい。このステップは、当業界で知られた任意のコンジュゲーション技術によって行われてよい。金属イオンと錯体形成した前記キレートリガンドは、タンパク質に直接連結してもよく、あるいは、これらの部分は本開示に記載されるように、連結基を通して連結されていてもよい。

【0088】

前記プロセスは、前記組成物に対して限外ろ過及びダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）を行う、例えばＴＦＦシステムを用いて行う、ステップをさらに含んでもよい。これらの実施形態では、前記１つ以上のろ過ステップのそれぞれは、独立に、ＵＦＤＦの前に、ＵＦＤＦの後に、又は両方において（この場合、前記プロセスは、２つ、又は２つ以上の、ろ過ステップを含む）行われてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、前記１つ以上のろ過ステップのうち少なくとも１つは、前記組成物に対してＵＦＤＦを行う前に行われる。これに代えて、または追加で、いくつかの実施形態では、前記１つ以上のろ過ステップのうち少なくとも１つは、前記組成物に対してＵＦＤＦを行った後で行われる。好ましい実施形態では、前記プロセスは２つの（又は２つ以上の）ろ過ステップを含み、それらろ過ステップのうち少なくとも１つは前記組成物に対してＵＦＤＦを行う前に行われ、そして、前記１つ以上のろ過ステップのうち他の少なくとも１つは前記組成物に対してＵＦＤＦを行った後に行われる。

【0089】

したがって、いくつかの実施形態では、前記プロセスは、
前記タンパク質の凝集体の形成を促す条件下で、前記タンパク質に連結した、鉄と錯体形成したデフェロキサミンキレートリガンドを含む鉄錯体化結合体（metal complexed conjugate）から鉄を除去して、それによって前記デフェロキサミンキレートリガンドが前記タンパク質に連結した結合体を含む組成物であって、キレートされた鉄及び前記凝集体を実質的に含まない組成物を与えること；
前記組成物に対し、前記組成物を酢酸セルロース膜に通すことを含む第１のろ過ステップを行って、それによって、前記デフェロキサミンキレートリガンドが前記タンパク質に連結した結合体は前記膜を通過するようにしながらも、前記凝集体の少なくとも一部を前記膜上に選択的に吸着させる、及び／又は、それによって前記凝集体の少なくとも一部を前記組成物から除去すること；
前記組成物に対して限外ろ過及びダイアフィルトレーションを行うこと；並びに
前記組成物に対し、前記組成物を酢酸セルロース膜に通すことを含む第２のろ過ステップを行って、それによって、前記デフェロキサミンキレートリガンドが前記タンパク質に連結した結合体は前記膜を通過するようにしながらも、前記凝集体の少なくとも一部を前記膜上に選択的に吸着させる、及び／又は、それによって前記凝集体の少なくとも一部を前記組成物から除去すること
を含む。

【0090】

これらのプロセスにおいて、ＵＦＤＦを受ける前記組成物は、第１のろ過ステップのろ液であり、第２のろ過ステップを受ける前記組成物は、ＵＦＤＦのろ液である。

【0091】

デフェロキサミンキレートリガンドがタンパク質に連結した結合体は、バルク原薬（bulk drug substance）（ＢＤＳ）として調製されてもよい。典型的には、ＢＤＳの調製における最終ステップ群は、滅菌グレードろ過、製剤化（formulation）及び充填（filling）を含む。好ましい実施形態では、前記１つ以上のろ過ステップは、最終の滅菌グレードろ過ステップより前に行われる。書き方を変えれば、好ましい実施形態では、前記１つ以上のろ過ステップは、前記プロセスにおける中間的な精製ステップである。

【0092】

他のある態様は、本開示に記載のプロセスによって得ることができる、又は本開示に記載のプロセスによって得られたキレートリガンドがタンパク質に連結した結合体（キレートリガンドがタンパク質に連結された精製結合体とも称される）に関する。

【0093】

他のある態様は、本開示に記載のプロセスによって得ることができる、又は本開示に記載のプロセスによって得られたキレートリガンドがタンパク質に連結した結合体（又はキレートリガンドがタンパク質に連結された精製結合体）を含む調合物に関する。

【0094】

本開示では、タンパク質、前記タンパク質の凝集体、及び液体キャリアを含む組成物から前記タンパク質の凝集体を除去するための酢酸セルロース膜も提供される。

【0095】

本開示では、タンパク質、前記タンパク質の凝集体、及び液体キャリアを含む組成物から前記タンパク質の凝集体を除去するのに用いるための酢酸セルロース膜もさらに提供される。

【0096】

本開示では、タンパク質、前記タンパク質の凝集体、及び液体キャリアを含む組成物から前記タンパク質の凝集体を除去するのに用いられる場合の酢酸セルロース膜もさらに提供される。

【0097】

本開示では、タンパク質、前記タンパク質の凝集体、及び液体キャリアを含む組成物から前記タンパク質の凝集体を除去するための酢酸セルロース膜の使用もさらに提供される。

【0098】

本開示では、タンパク質、前記タンパク質の凝集体、及び液体キャリアを含む組成物から前記タンパク質の凝集体を選択的に吸着させるための酢酸セルロース膜も提供される。

【0099】

本開示では、タンパク質、前記タンパク質の凝集体、及び液体キャリアを含む組成物から前記タンパク質の凝集体を選択的に吸着させるのに使用するための酢酸セルロース膜もさらに提供される。

【0100】

本開示では、タンパク質、前記タンパク質の凝集体、及び液体キャリアを含む組成物から前記タンパク質の凝集体を選択的に吸着させるのに使用する場合の酢酸セルロース膜もさらに提供される。

【0101】

本開示では、タンパク質、前記タンパク質の凝集体、及び液体キャリアを含む組成物から前記タンパク質の凝集体を選択的に吸着させるための酢酸セルロース膜の使用もさらに提供される。

【0102】

これらの酢酸セルロース膜は、本開示に記載の酢酸セルロース膜の任意の１つ以上の特徴を有してもよい。

【0103】

これらの酢酸セルロース膜は、本開示に記載のプロセスの任意の態様又は実施形態のためのものであっても、そのような態様又は実施形態における使用のためのものであっても、及び／又はそのような態様又は実施形態のために使用される場合のものであってもよい。

【0104】

いくつかの実施形態では、本開示に記載の酢酸セルロース膜は、フロースルー法又はフロースループロセスにおいて使用される。いくつかの実施形態では、前記酢酸セルロース膜は、組成物からの粒子状物及び／又はバイオバーデンの除去のために使用されるのではない。

【0105】

本発明は、以下の利点のうち１つ又は複数を与えてもよい：
・前記方法が、凝集体含有量を許容可能な品質レベルへと有利に減少させる。
・前記方法が、高い（＞８５％～９５％）タンパク質単量体回収を有利にも可能とする。
・前記方法が、有利にもスケーラブルである。
・前記方法が、大規模（グラムスケール）な工業プロセスに適用しうる。
・前記方法が、自動化しうる。

【0106】

なお、この明細書に開示され規定された発明は、言及された又は文章若しくは図面から明らかである個々の特徴のうち２つ以上の代替的な組み合わせの全てに拡張することを理解されたい。これら異なる組み合わせの全てが、本発明の種々の代替的態様を構築する。

【実施例】

【0107】

これから非限定的な例によって本発明をさらに説明する。なお、本発明の精神及び範囲から外れること無しに多くの改変をなし得ることが、本発明の分野の当業者に理解される。

【0108】

●実施例１ フィルター評価－小規模

【0109】

フィルター膜材料がＨＭＷ凝集体を試料からろ過することができるのかを評価するために、２つの異なるフィルタータイプを試験し、分析前に試料をろ過しなかった場合に得られた結果と比較した。種々異なるロットからのＧｍＡｂ－ＤＦＯ試料を試料：希釈剤が９０％：１０％となるように希釈した。最少２５０μＬの各試料タイプを、各フィルター膜に通した。

【0110】

以下のフィルターを評価した。
酢酸セルロース膜によるフィルター、孔サイズは０．２μｍ（ミリポアシグマ；製品番号ＣＬＳ８１６１－１００ＥＡ）
ポリ二フッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜によるフィルター、孔サイズは０．２μｍ

【0111】

ＹａｒｒａＳＥＣ－３００（３μｍ、２９０オングストローム、７．８×３００ｍｍ）ＳＥＣ－ＨＰＬＣカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＨＰＬＣシステムを用いたＳＥＣ－ＨＰＬＣによって試料を評価した。データは、各タンパク質種の面積を検出された総面積と比較することによって分析した。

【0112】

結果を表１に与える。結果は、未ろ過試料及びＰＶＤＦフィルターでろ過した試料のどちらと比べても、酢酸セルロース膜を用いた試料のろ過は、ろ液中における高分子量凝集体種のパーセント（ＨＭＷの％）がより低く、単量体タンパク質のパーセントがより高かったことを示した。この結果は、酢酸セルロース膜の特異な化学的性質の結果、単量体タンパク質に対して凝集体の選択的な除去がなされたことを示唆している。これは、酢酸セルロースフィルターが、複合タンパク質試料からタンパク質凝集体を除去するのに有用であり得ることを示している。

【0113】

●表１．フィルター評価

【表1】

【0114】

比較のために、凝集体除去のために典型的に用いられるその他の技術も評価したが、これはつまり、クロマトグラフィー樹脂であるEshmuno HCX、トヨパールhexyl、トヨパールNH2-750F、POROS 50 HS及びCapto Adhere、Sartobind phenyl膜、並びに硫酸アンモニウム分画であった。表２は、技術及びそれらそれぞれのバッファーを示す。試料は、表示されたバッファーへと交換された。それぞれの樹脂にロードする前に、試料を２８０ｎｍの吸収（Ａ２８０）及びＳＥＣ－ＨＰＬＣで分析した。それから、試料をそれぞれの予備平衡化させた樹脂又は膜にロードし、環境周囲温度でインキュベートした。これら樹脂及び膜を洗い、フロースルーを回収した。それからフロースルーをＡ２８０及びＳＥＣ－ＨＰＬＣによって分析して、単量体回収の％及びＨＭＷ（高分子量）凝集体除去の％を決定した。

【0115】

●表２．凝集体除去のための他の技術の評価

【表2】

【0116】

結果を表２に与える。概して、種々の技術は高い単量体回収を低い凝集体除去と共に示した。いくつかの技術は、二量体タンパク質の顕著な増加も示した。硫酸アンモニウム分画は良好な結果を示したが、この技術は１Ｍ硫酸アンモニウムの添加を必要とし、このことは許容不能及びプロセスリスクとみなされうる。Sartobind phenyl膜は、良好な単量体回収及び高い凝集体除去を示したが、二量体が顕著に増加した。このクロマトグラフィー樹脂及びその他のクロマトグラフィー樹脂の他の欠点は、試料を「クロマトグラフィー」バッファー中へと置くために追加的なバッファー交換ステップが必要であることである。クロマトグラフィー樹脂は、ＨＭＷ凝集体に結合して、それをタンパク質組成物から除去することが可能であるためには、これらの精密な条件を必要とする、つまり、作動時のバッファー条件のウインドウが狭く、バッファー交換ステップを必要とする。この追加的なステップは、プロセス時間を増大させ、そして材料ロス（より低い収率）を生じさせる。

【0117】

●実施例２．酢酸セルロースフィルター評価－大規模

【0118】

酢酸セルロースフィルター（酢酸セルロース０．２μｍフィルターSartobran、Sartorius、Cat:11107--25------N）を、抗体とデフェロキサミン（ＤＦＯ）との結合体、つまりギレンツキシマブ－Ｎ－スクシニルデフェロキサミン（ＧｍＡｂ－ＤＦＯ）を調製するプロセス中に生成した凝集体を除去することについて評価した。ＧｍＡｂ－ＤＦＯを調製するための典型的なプロセスの一例は、以下のステップを含む：Ｎ－スクシニルデスフェラル：Ｆｅ（ＩＩＩ）テトラフルオロフェニルエステル（ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅ、同義語：ＤＦＯＴＦＰ）を、抗体表面に露出したランダムなリシン残基のアミド化を通じてキメラギレンツキシマブ（ＧｍＡｂ）にコンジュゲートさせる。キレートされた鉄を、温和な温度（３５℃）及びｐＨ４．４で過剰量のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いたトランスキレート化によって除去した。未反応のリンカー及びその他の小分子をＴＦＦで除去し、コンジュゲート済みＧｍＡｂ－ＤＦＯを得た。これらの作業ステップは、高分子量凝集体種の形成を誘導した。

【0119】

●結合能試験（Binding capacity study）

【0120】

・試料調製

【0121】

表３は、試験のために調製した試料の概要を示す。０．２μｍ酢酸セルロースフィルターにロードする前、試料は清澄で、粒子状物は無かった。ロット番号１、ロット番号２、ロット番号３、ロット番号４の４つの異なる製造ロット由来のＧｍＡｂ－ＤＦＯ材料を評価した。各ロット由来の材料を解凍し、バッチ毎に別々にプールして合計４つの初期試料とし、各実験を行う前にポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜（Acrodisc）によって０．２μｍろ過した。ロット番号３とロット番号４の１：１混合物を調製し、均質化して、中間点試料を調製した。結合能試験のための選択したレベルを表３に表示する。

【0122】

●表３．試料調製

【表3】

【0123】

・ＴＦＦ前試料

【0124】

ＴＦＦ前試料を作製するために、ＧｍＡｂ－ＤＦＯ材料（ロット番号１及びロット番号２）をＴＦＦ前試料バッファーへとバッファー交換した。ＴＦＦ前試料バッファーは、ＧｍＡｂ出発材料の代わりにｐＨ７．１のＰＢＳを用いてブランクコンジュゲーションランを行うことによって調製した。加熱ステップはバッファー組成に何ら影響を及ぼさないため、加熱ステップはＴＦＦ前試料バッファー作製には含ませなかった。ＰＢＳをｐＨ９．６に調整し、それから溶液を３：１のモル比でリンカーと合わせ、室温でゆっくりと混合しながら３０分間維持した。それから容器のｐＨを酸を用いてｐＨ４．４にした。最後のステップとして、ＥＤＴＡ二ナトリウムを加え、そしてバッファーをインキュベートして、最終ｐＨを７．０に調整した。

【0125】

この試料バッファー交換は、ＰＤ－１０脱塩カラムを用いて行った。バッファー交換は、以下の標準的な手順を用いてなされた。溶出ステップのために、容器をカラムの下に配置して各試料を収集した。３．５ｍＬのＴＦＦ前試料バッファーを用いて各試料の溶出を行い、収集した。

【0126】

・結合能実験手順

【0127】

表３の試料を、０．２μｍ酢酸セルロースフィルターを用いてろ過した。フロースルー材料の特性解析は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＡ２８０によって行った。各フロースルー材料から２つのアリコートを取った。第１のアリコートは特性解析のために２～８℃で保存し、第２のアリコートは－８０℃のフリーザー中に２４時間置き、それから－２０℃のフリーザーに移してさらなる特性解析まで置いた。

【0128】

結合能実験の間、以下のプロトコールを実行した。試料調製の節に記載された手順にしたがってタンパク質溶液プールを調製した。対応する体積のロット番号１、ロット番号４、及びロット番号３／ロット番号４混合物を、Sartorious０．２μｍフィルター（Cat:11107--25------N）に通し、ろ過されたタンパク質溶液をさらなる特性解析のために収集した。酢酸セルロースフィルターをｐＨ７．１のＰＢＳで予備湿潤化し、試料を通し、それからフィルターをｐＨ７．１のＰＢＳ（エアパージ無しでシステム及びフィルター中に保持された体積である、システム－フィルターホールドアップ体積×１．５）でフラッシュして、未結合種の完全な回収を確実なものとした。

【0129】

●結合能試験結果

【0130】

・ＴＦＦ前ろ過ステップ

【0131】

ＨＭＷの％及び二量体減少

【0132】

ＴＦＦ前試料についてのフロースルー材料のＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＡ２８０による特性解析は表４に表示されている。７０％ＲＲＴでのＨＭＷ及び二量体のパーセント減少は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ ＨＭＷ凝集体及び二量体のデータに対するパーセント減少として正規化した。表４において、負荷容量（loading capacity）はＧｍＡｂ－ＤＦＯ／ｍ^２のｍｇから７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷのｍｇ／ｃｍ^２へと変換されているが、これは、これが酢酸セルロース膜と相互作用する主要な種であるからであり、ここで７０％ＲＲＴは、ＨＭＷ凝集体ピークが単量体ピークの近似保持時間の７０％の近似保持時間（approximate retention time）を有することを意味している。

【0133】

●表４．ＴＦＦ前試料についてのＨＭＷ及び二量体減少結果

【表4-1】

【表4-2】

【0134】

表４に示すように、７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの減少における差異が異なるバッチに由来する試料間で見られたが、これは主にフィード組成物における差異（つまり、試料組成、試料濃度、ＨＭＷ凝集体含有量）によるものである。ロット番号１の試料についての７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの減少は、７０％ＲＲＴにおける０．１８５ｍｇから０．４８８ｍｇの間のＨＭＷ／ｃｍ^２のローディング条件の場合、１０．８％～１７．６％であった。ロット番号２の材料については、７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷのより高い減少が見られ、７０％ＲＲＴにおける０．０７８ｍｇから０．２１４ｍｇの間のＨＭＷ／ｃｍ^２の負荷容量の場合、１２．８％～３０．６％であった。

【0135】

観察された差異にも関わらず、７０％ＲＲＴにおいて同様の量のＨＭＷ／ｃｍ^２が膜にロードされた場合、７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの％の同程度の減少がロット番号１の試料及びロット番号２の試料の両方について見られた（つまり、７０％ＲＲＴ（ロット番号１）における０．１８５ｍｇＨＭＷ／ｃｍ^２及び７０％ＲＲＴ（ロット番号２）における０．１７７ｍｇＨＭＷ／ｃｍ^２について７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの１３％の減少が見られた）。

【0136】

７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの最高のパーセント減少は、ロット番号２の試料についての７０％ＲＲＴにおける０．０７８ｍｇＨＭＷ／ｃｍ^２の負荷容量で行われた実験で見られ、７０％ＲＲＴにおける３１％のＨＭＷ減少であった。

【0137】

試験した全ての条件を通じて、二量体含有量における顕著な差異は観察されなかった。ろ過前試料とろ過後試料との間で観察された二量体における差異は、酢酸セルロースフィルターによるＨＭＷ凝集体の除去によるこの種（species）のわずかな富化によるものでありうる。

【0138】

総体的回収及び単量体回収

【0139】

表５は、評価対象の各々のＴＦＦ前条件について得られた総体的回収及び単量体回収の概要を示す。単量体回収パーセントは、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ単量体読み値からの純度結果を用いて、ろ過前及びろ過後に得られた単量体のｍｇ値に基づいて計算された。

【0140】

●表５．ＴＦＦ前試料についての回収結果

【表5-1】

【表5-2】

【0141】

酢酸セルロースろ過について評価された各ローディング条件の間で、単量体回収の点での顕著な違いは見られなかった。回収パーセントは８７．７３％～９４．４５％であり、単量体回収％は９０．１５％～９５．５４％であった。評価対象のローディング条件の全てについて高い単量体回収が見られ、このことは単量体ＧｍＡｂ－ＤＦＯは顕著なレベルでは酢酸セルロース膜に結合しなかったことを示している。このことは、酢酸セルロース膜ろ過に付随するロスが、ベンチスケールのフィルターのシステムホールドアップ体積（エアパージ無しでシステム及びフィルター中に保持される体積）に関係しうることを示してい得る。

【0142】

結合能結果

【0143】

この試験で使用された酢酸セルロース膜の７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷについての総結合能をバッチモードで測定し、評価されたフィード及びバッファー条件下での膜に結合した７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの最大量と称する。総結合能のサイズは、膜にロードされたフィード条件に伴って変動しうる。

【0144】

表６は、ＴＦＦろ過前条件についての酢酸セルロースフィルターについての結合能結果を表示する。

【0145】

●表６．ＴＦＦ前試料についての結合能結果

【表6-1】

【表6-2】

【0146】

７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷについて試験された負荷容量は、７０％ＲＲＴにおいて０．０７８から０．４８８ｍｇの間のＨＭＷ／ｃｍ^２であった。表６中のデータは、試験された異なるフィード材料間で幾分かのばらつき（variability）を示している。最も高い結合能はロット番号１の試料について見られ、７０％ＲＲＴにおいておおよそ０．４８８ｍｇのＨＭＷ／ｃｍ^２がロードされた場合に７０％ＲＲＴで０．１３４ｍｇＨＭＷ／ｃｍ^２の結合能であった。ロードされた７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの増加と共に、酢酸セルロースフィルターにロードされたロット番号１の試料及びロット番号２の試料の両方について結合能の増分が見られた。結合能データは、酢酸セルロース膜に結合した７０％ＲＲＴにおける総ＨＭＷについての傾向を示し、これは７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの漸増と共に増加した。評価されたローディング条件は、膜飽和容量（membrane saturation capacity）までは到達しなかったことを示している。

【0147】

酢酸セルロース膜に結合した７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの平均ｍｇを計算して、ＴＦＦ前条件下でのＨＭＷ凝集体についての結合能を推定した。ＴＦＦ前材料についての実験データからの平均結合能は、７０％ＲＲＴにおいて０．０６０５ｍｇのＨＭＷ／ｃｍ^２であった。この平均結合能を用いて、ＴＦＦ前バッファー条件でのＧＭＰバッチのフィルター要件を見積もった。図１は、種々の入手可能な酢酸セルロースフィルターサイズについての、線形性を想定して計算された平均結合能に基づく推定結合能を示したグラフである。なお、ラボスケールからプロセススケールへとスケールアップした場合の膜結合能に対して、いくつかの操作パラメータ（例えば、背圧、液流路、流速、フィードばらつき）が影響を与えうる。

【0148】

・ＴＦＦ後ろ過ステップ

【0149】

ＨＭＷの％及び二量体の減少

【0150】

ＴＦＦ後（つまり、製剤化バッファー；０．９％ＮａＣｌ溶液）試料についてのフロースルー材料のＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＡ２８０による特性解析は表７に表示されている。二量体及び７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷのパーセント減少は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ ＨＭＷ凝集体及び二量体のデータに対するパーセント減少として正規化した。負荷容量は、７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷのｍｇ／ｃｍ^２として与えられている。

【0151】

●表７．ＴＦＦ後試料についてのＨＭＷ及び二量体減少結果

【表7-1】

【表7-2】

【0152】

異なるバッチに由来する試料の間で、７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの減少における差異が見られたが、これはフィード組成物における差異（つまり、試料組成、試料濃度、ＨＭＷ凝集体含有量）によるものでありうる。ロット番号１の試料についての７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの減少は、７０％ＲＲＴにおける０．２２４ｍｇ／ｃｍ^２から０．５５１ｍｇ／ｃｍ^２の間のＨＭＷのローディングレートの場合、７．４％～２３．４％であった。ロット番号４の材料については、７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷのより高い減少が観察され、７０％ＲＲＴにおける０．１１３ｍｇ／ｃｍ^２から０．２９６ｍｇ／ｃｍ^２の間のＨＭＷのローディングレートの場合、２７．８％～６９．８％であった。ロット番号３／ロット番号４の１：１混合物試料については、７０％ＲＲＴにおける０．２０４ｍｇのＨＭＷ／ｃｍ^２が膜にロードされた場合に３５％の減少が見られた。類似の量がロードされた場合に、７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの２３％～３５％の減少が見られた。７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの最高の減少は、ロット番号４の試料について７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷのローディングレート０．１１３ｍｇ／ｃｍ^２での実験で見られ、７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの７０％の減少が生じた。

【0153】

試験した条件を通じて、二量体含有量における顕著な差異は観察されなかった。ろ過前試料とろ過後試料との間で観察された二量体における差異は、酢酸セルロースフィルターによるＨＭＷ凝集体の除去によるこの種（species）のわずかな富化によるものでありうる。

【0154】

・回収

【0155】

表８は、評価対象の各々のＴＦＦ後条件についての製品回収及び単量体回収の概要を示す。単量体回収は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣデータからの純度値を用いて、ろ過前及びろ過後に得られた単量体のｍｇ値に基づいて計算された。

【0156】

●表８．ＴＦＦ後試料についての回収結果

【表8-1】

【表8-2】

【0157】

酢酸セルロースろ過について評価された各ローディング条件の間で、単量体回収の点での顕著な違いは見られなかった。総体的回収パーセントは８７．８１％～９４．２５％であった；総体的回収は、ＨＭＷ凝集体含有試料ではＨＭＷ凝集体の除去のために、より低いと予想されうる。単量体回収は、９４．１５％～９８．６７％であった。評価対象のローディング条件及び材料の全てについて高い単量体回収が見られた。回収ロスは、酢酸セルロースフィルターを通したＴＦＦ後試料のためのベンチスケールのシステムホールドアップ体積（エアパージ無しでシステム及びフィルター中に保持される体積）のためであり得る。単量体の顕著なロスは見られず、このことは、単量体と酢酸セルロース膜との間に顕著な相互作用が無いことを示している。これらの結果に基づき、プロセススケールのための酢酸セルロースろ過ステップについてはフラッシュを相応に最適化することが有利であうる。

【0158】

・結合能の結果

【0159】

酢酸セルロース膜についての総ＨＭＷ凝集体結合能をバッチモードで推定し、これを、評価されたフィード及びバッファー条件下での膜媒体に結合することが可能である７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの最大量と考えた。

【0160】

表９は、ＴＦＦろ過後条件についての酢酸セルロースフィルターについての結合能結果を表示する。

【0161】

●表９．ＴＦＦ後試料についての結合能結果

【表9-1】

【表9-2】

【表9-3】

【0162】

ＨＭＷ凝集体について見られた負荷容量は、７０％ＲＲＴにおいて０．１１３ｍｇから０．５５１ｍｇの間のＨＭＷ／ｃｍ^２であった。表９におけるロット番号１の材料についてのデータは、この試料について試験した条件の下で７０％ＲＲＴにおける０．０８５ｍｇのＨＭＷ／ｃｍ^２のあたりでのフィルター飽和を示してい得る。しかし、ロット番号４の試料については、７０％ＲＲＴにおいて０．１２１ｍｇのＨＭＷ／ｃｍ^２というより高い結合能が見られた。このことは、膜の飽和点がフィードマテリアルに依存しうることを示してい得る。ロット番号４の試料について評価された負荷容量は、膜飽和容量（membrane saturation capacity）には達しなかったことを示している。

【0163】

膜に結合した７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷの平均ｍｇを計算して、先のＧＭＰ経験に基づいてプロセススケールで用いるのに適したフィルターサイズを推定するために、ＴＦＦ後条件下についてのフィルターの結合能を推定した。ＴＦＦ後材料についての実験データからの平均結合能は、７０％ＲＲＴにおいて０．０８４９ｍｇのＨＭＷ／ｃｍ^２であった。図２は、種々の入手可能な酢酸セルロースフィルターサイズについての、線形性を想定して計算された平均結合能に基づく推定結合能を示したグラフである。なお、ラボスケールからプロセススケールへとスケールアップした場合の膜結合能に対して、いくつかの操作パラメータ（例えば、背圧、液流路、流速、フィードばらつき）が影響を与えうる。

【0164】

●特性解析

【0165】

Ｎａｎｏｄｒｏｐ機器を用いてＳＥＣ－ＨＰＬＣ及びＡ２８０によって試料を特性解析した。各試料のアリコートを－８０℃のフリーザー中に２４時間置き、それから－２０℃のフリーザーに移して必要ならさらなる特性解析まで置いた。

【0166】

・Ａ２８０

【0167】

試料の濃度を２８０ｎｍにおける吸収によって決定した。システム適合性測定を、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準を用いてＮａｎｏｄｒｏｐで行った。システム適合性測定は、各ランの最初及び最後におけるＢＳＡ濃度が０．９５～１．０５ｍｇ／ｍＬであるという受け入れ基準の全てを満たし、このことは、ＮａｎｏＤｒｏｐ機器は適切に機能していることを確認するものである。ＮａｎｏｄｒｏｐをｐＨ７．１のＰＢＳバッファーを用いてブランク化した。ＧｍＡｂ－ＤＦＯ試料の濃度を、消光係数（extinction coefficient）１．３５（ｍｇ／ｍＬ）^－１ｃｍ^－１及び以下の等式（１）を用いて計算した。

【数1】

【0168】

表１０は、Ａ２８０によるタンパク質濃度の結果の概要を示す。

【0169】

表１０．Ａ２８０によるタンパク質濃度

【表10-1】

【表10-2】

【表10-3】

【0170】

・ＳＥＣ－ＨＰＬＣ

【0171】

Ｙａｒｒａ ＳＥＣ－３００（３μｍ、２９０オングストローム、７．８×３００ｍｍ）ＳＥ－ＨＰＬＣカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＨＰＬＣシステムを用いて試料を分析した。各タンパク質種の面積を検出された総面積と比較することによってデータを解析した。単量体についての相対的保持時間、７０％ＲＲＴにおけるＨＭＷ、ＨＭＷ及び二量体における顕著な変動（variation）は見られなかった。

【0172】

●ＧＭＰプロセスにおけるフィルター評価

【0173】

酢酸セルロース０．２μｍフィルター（Sartobran MidiCaps 0.05 m², Sartorius）を用いたろ過ステップを、プロセススケールでのＧｍＡｂ－ＤＦＯを調製するためのコンジュゲーション反応に、ＴＦＦステップの前及び後の両方において加えた。簡潔に述べると、出発材料であるギレンツキシマブ（ＧｍＡｂ；ＧｍＡｂ製品プール）の溶液をｐＨ９．６に調整して、ｐＨ調整されたＧｍＡｂプールを与えた。ＴＦＰ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅの溶液をアセトニトリル中に調製し、前記ｐＨ調製されたＧｍＡｂプールに加えた。反応系を周囲環境温度で３０±２分間インキュベートして、コンジュゲート済み製品プールを与えた。このコンジュゲート済み製品プールをｐＨ７．０に調整し、３５℃に加温して、さらにｐＨ４．４へと滴定して、低ｐＨコンジュゲート済み製品プールを与えた。ＥＤＴＡ二ナトリウムを添加することによって、ＧｍＡｂ－Ｎ－ｓｕｃＤｆ－Ｆｅから鉄を除去した。反応系を３５℃でインキュベートして、トランスキレートされた製品プールを与えた。トランスキレートされた製品プールを、０．０５ｍ^２Ｓａｒｔｏｂｒａｎ酢酸セルロースフィルター（０．２μｍ）を用いてろ過して、ろ過済みトランスキレートプールを与えた。フィルターを０．９％ＮａＣｌでフラッシュした。それから、ろ過済みトランスキレート製品プールに対して、０．９％ＮａＣｌへと限外ろ過ダイアフィルトレーション（ＵＦＤＦ）プロセスを行い、ＵＦＤＦコンジュゲーションプールを与えた。このＵＦＤＦコンジュゲーションプールを０．０５ｍ^２Ｓａｒｔｏｂｒａｎ酢酸セルロースフィルター（０．２μｍ）を用いてろ過して、ろ過済みＵＦＤＦコンジュゲーションプールを与えた。フィルターを０．９％ＮａＣｌでフラッシュして製品の完全な回収を確実とし、ろ過済みＵＦＤＦコンジュゲーションプールを得た。最終的なＢＤＳ材料を与えるために、最終バイオバーデン低減ステップとして、ろ過済みＵＦＤＦコンジュゲーションプールを、ＰＶＤＦ膜を有する０．０１ｍ^２ミリパック２０（０．２μｍ）フィルターに通した。バッチ番号１、バッチ番号２、バッチ番号３、バッチ番号４の４つのバッチを評価した。

【0174】

これらのバッチからのインプロセスＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を図３に表示し、表１１にまとめる。これらのデータは、ＴＦＦ前酢酸セルロースフィルターは、４つのバッチ全てを通して、ＨＭＷ凝集体含有量を約１５％から約４％へと減少させることが一貫して可能であったこと、一方、ＴＦＦ後酢酸セルロースフィルターは、ＨＭＷ凝集体「仕上げ」（HMW aggregate "polish"）を与え、ＨＭＷ含有量を約３％から約１％へと減少させたこと、を示している。解析した４つのバッチの全てにおいて、酢酸セルロースろ過戦略は、ＨＭＷ凝集体レベルを満足いく規格内レベルに効果的に制御することができ、そして高い（＞８５％～９５％）単量体回収を与えた。このことは、プロセススケールのコンジュゲーション反応の際に種々の条件の下で、酢酸セルロースフィルターがＨＭＷ凝集体を除去するのに有用であることを実証している。

【0175】

●表１１．プロセススケールのＧｍＡｂ－ＤＦＯバッチについてのインプロセスＳＥＣ－ＨＰＬＣデータ

【表11-1】

【表11-2】

【0176】

●実施例３．ＨｕＪ５９１－ＤＯＡＴ－１７７Ｌｕの凝集体の除去

【0177】

ＨｕＪ５９１－ＤＯＴＡ材料のｐＨをｐＨ４．０に調整しそして３５℃で６０分間インキュベートすることによって、凝集したＨｕＪ５９１－ＤＯＴＡの試料を作製した。

【0178】

凝集したＨｕＪ５９１－ＤＯＴＡの６０μＬを５０μＬの１７７Ｌｕ／ＨＣｌに加えて、３５℃で３５分間インキュベートして、凝集した１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－ＨｕＪ５９１を作製した。

【0179】

１１０μＬの凝集した１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－ＨｕＪ５９１を酢酸セルロース０．２２μｍフィルターに通した。

【0180】

ろ過前及びろ過後に、材料をＡ２８０（ナノドロップ）及びＳＥＣ－ＨＰＬＣで分析した（表１２を参照）。
●表１２．酢酸セルロースろ過前及び後における１７７Ｌｕ－ＤＯＴＡ－ＨｕＪ５９１の分析の概要

【表12】

【図1】

【図2】

【図3】

【国際調査報告】