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特表2024-534214調節ＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子転写の調節
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-18
(54)【発明の名称】調節ＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子転写の調節
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240910BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240910BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20240910BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20240910BHJP
A61K 31/7115 20060101ALI20240910BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240910BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240910BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61K31/7105
A61K31/7125
A61K31/712
A61K31/7115
A61P3/00
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513894
(86)(22)【出願日】2022-09-02
(85)【翻訳文提出日】2024-04-09
(86)【国際出願番号】 US2022075934
(87)【国際公開番号】W WO2023034983
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】63/240,838
(32)【優先日】2021-09-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/292,792
(32)【優先日】2021-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】520051908
【氏名又は名称】キャンプ４ セラピューティクス コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】セーガル アルフィカ
(72)【発明者】
【氏名】マシューズ ブライアン ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】スミス シンシア エム．
(72)【発明者】
【氏名】バムクロット デイビッド エイ．
(72)【発明者】
【氏名】カラベラ ジャスティン エイ．
(72)【発明者】
【氏名】ガンボア マリオ エステバン コントレラス
(72)【発明者】
【氏名】ケルカー ラチャナ エス．
(72)【発明者】
【氏名】ジョン ユン ジュン
(72)【発明者】
【氏名】リュウ ユーティン
(72)【発明者】
【氏名】ロイ サブハディープ
(72)【発明者】
【氏名】オーケルベリ ブリン ニコール－ヨシコ
(72)【発明者】
【氏名】パイ ルトゥジャ スダカー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA01
4B065CA44
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086NA14
4C086ZC21
(57)【要約】
プロモーター関連ＲＮＡ及びエンハンサーＲＮＡなどの調節ＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いてＯＴＣ遺伝子転写を調節する方法が本明細書に記載される。これらの方法は、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）の発現を増大させるのに有用であり、それによって、異常な遺伝子発現に関連する疾患を治療する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）の調節ＲＮＡの少なくとも８個の連続するヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であって、前記調節ＲＮＡは、配列番号１～４または１０７７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
前記ｒｅｇＲＮＡの３’末端から２００ヌクレオチド以下である前記ｒｅｇＲＮＡ中の配列に相補的である、請求項１に記載のＡＳＯ。
【請求項3】
前記ｒｅｇＲＮＡの５’末端から２００ヌクレオチド以下である前記ｒｅｇＲＮＡ中の配列に相補的である、請求項１に記載のＡＳＯ。
【請求項4】
前記ｒｅｇＲＮＡがポリアデニル化ＲＮＡではない、請求項１～３のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項5】
前記ＡＳＯが前記ｒｅｇＲＮＡのＲＮＡｓｅ Ｈ媒介性分解を誘導しない、請求項１～３のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項6】
前記調節ＲＮＡが、配列番号１のヌクレオチド配列を有し、前記ＡＳＯが、配列番号６～１４、１８～３５、３９、４１、７５、７６、７７、７８、８７～１２４または１４３～８９２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１、２、４または５のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項7】
前記調節ＲＮＡが、配列番号２のヌクレオチド配列を有し、前記ＡＳＯが、配列番号１５～１７、３６～３８、６４～７４、１２５～１４２、または８９３～１０２９のヌクレオチド配列を含む、請求項１、２、４、または５のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項8】
前記調節ＲＮＡが、配列番号２のヌクレオチド配列を有し、前記ＡＳＯが、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む、請求項１、または３～５のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項9】
前記ＡＳＯが、５０、４０、３０、または２５ヌクレオチド長以下である、請求項１～８のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項10】
前記ＡＳＯが、１つ以上の化学修飾を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項11】
前記ＡＳＯの５’末端の少なくとも３、４、または５個のヌクレオチド、及び３’末端の少なくとも３、４、または５個のヌクレオチドが、１つ以上の化学修飾を有するリボヌクレオチドを含む、請求項１０に記載のＡＳＯ。
【請求項12】
前記１つ以上の化学修飾が、２’－Ｏ－Ｃ１～４アルキル、例えば、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－デオキシ（２’－Ｈ）、２’－Ｏ－Ｃ１～３アルキル－Ｏ－Ｃ１～３アルキル、例えば、２’－メトキシエチル（「２’－ＭＯＥ」）、２’－フルオロ（「２’－Ｆ」）、２’－アミノ（「２’－ＮＨ２」）、２’－アラビノシル（「２’－アラビノ」）ヌクレオチド、２’－Ｆ－アラビノシル（「２’－Ｆ－アラビノ」）ヌクレオチド、２’－ロックド核酸（「ＬＮＡ」）ヌクレオチド、２’－アミド架橋核酸（ＡｍＮＡ）、２’－アンロックド核酸（「ＵＬＮＡ」）ヌクレオチド、Ｌ型の糖（「Ｌ－糖」）、４’－チオリボシルヌクレオチド、拘束エチル（ｃＥＴ）、２’－フルオロ－アラビノ（ＦＡＮＡ）、またはチオモルホリノのうち１つ以上を含むヌクレオチド糖修飾を含む、請求項１０または１１に記載のＡＳＯ。
【請求項13】
前記１つ以上の化学修飾が、ホスホロチオエート（「ＰＳ」または（Ｐ（Ｓ）））、ホスホロアミデート（Ｐ（ＮＲ１Ｒ２）、例えば、ジメチルアミノホスホロアミデート（Ｐ（Ｎ（ＣＨ３）２））、ホスホノカルボキシレート（Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、例えば、ホスホノアセテート「ＰＡＣＥ」（Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））、チオホスホノカルボキシレート（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、例えば、チオホスホノアセテート「ｔｈｉｏＰＡＣＥ」（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））、アルキルホスホネート（Ｐ（Ｃ１～３アルキル）、例えば、メチルホスホネート－Ｐ（ＣＨ３）、ボラノホスホネート（Ｐ（ＢＨ３））、またはホスホロジチオエート（Ｐ（Ｓ）２）のうちの１つ以上を含むヌクレオチド間結合修飾を含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項14】
前記１つ以上の化学修飾が、２－チオウラシル（「２－チオＵ」）、２－チオシトシン（「２－チオＣ」）、４－チオウラシル（「４－チオＵ」）、６－チオグアニン（「６－チオＧ」）、２－アミノアデニン（「２－アミノＡ」）、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルシトシン（「５－メチルＣ」）、５－メチルウラシル（「５－メチルＵ」）、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルウラシル（「５－アリルＵ」）、５－アリルシトシン（「５－アリルＣ」）、５－アミノアリルウラシル（「５－アミノアリルＵ」）、５－アミノアリル－シトシン（「５－アミノアリルＣ」）、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ塩基、Ｐ塩基、非構造核酸（「ＵＮＡ」）、イソグアニン（「ｉｓｏＧ」）、イソシトシン（「ｉｓｏＣ」）グリセロール核酸（ＧＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、またはチオホスホルアミデートモルホリノ（ＴＭＯ）のうちの１つ以上を含む核酸塩基修飾を含む、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項15】
前記１つ以上の化学修飾が、２’－Ｏ－メトキシエチル、シチジン上の５－メチル、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホジエステル（ＰＯ）ヌクレオチド間結合、またはホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を含む、請求項１０～１４のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項16】
配列番号１８～３９または６７～７４のヌクレオチド配列を含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項17】
非修飾ＤＮＡの１０個以上の連続するヌクレオチドを含まない、請求項１０～１５のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項18】
デオキシリボヌクレオチドを含まない、請求項１７に記載のＡＳＯ。
【請求項19】
非修飾リボヌクレオチドを含まない、請求項１０～１８のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項20】
前記ＡＳＯの長さが５×ｎ＋５ヌクレオチド（ｎは３以上の整数）であり、５×ｍ位のヌクレオチドが、ＬＮＡによって修飾されたリボヌクレオチドであり（ｍは１～ｎの整数）、残りの位置のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メトキシエチルによって修飾されたリボヌクレオチドである、請求項１０～１９のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項21】
ＧａｌＮＡｃ部分、任意選択でＧａｌＮＡｃ３部分をさらに含む、請求項２０に記載のＡＳＯ。
【請求項22】
配列番号１４２のヌクレオチド配列を含む、請求項２０または２１に記載のＡＳＯ。
【請求項23】
前記ＡＳＯの長さが３×ｎ＋２ヌクレオチド（ｎは６以上の整数）であり、３×ｍ位の前記ヌクレオチドが、ＬＮＡによって修飾されたリボヌクレオチドであり（ｍは１～ｎの整数）、残りの位置のヌクレオチドが、２’－Ｏ－メトキシエチルによって修飾されたリボヌクレオチドである、請求項１０～１９のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項24】
配列番号２１のヌクレオチド配列を含む、請求項２３に記載のＡＳＯ。
【請求項25】
ＧａｌＮＡｃ部分、任意選択でＧａｌＮＡｃ３部分をさらに含む、請求項２３または２４に記載のＡＳＯ。
【請求項26】
配列番号１２２のヌクレオチド配列を含む、請求項２５に記載のＡＳＯ。
【請求項27】
前記ＡＳＯの各リボヌクレオチドが２’－Ｏ－メトキシエチルにより修飾される、請求項１０～１９のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項28】
配列番号２５のヌクレオチド配列を含む、請求項２７に記載のＡＳＯ。
【請求項29】
前記ＡＳＯの各ヌクレオチドが２’－Ｏ－メトキシエチルにより修飾されるリボヌクレオチドである、請求項１０～１９のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項30】
配列番号３６のヌクレオチド配列を含む、請求項２９に記載のＡＳＯ。
【請求項31】
５’末端及び３’末端の各々において修飾リボヌクレオチドの少なくとも３つのヌクレオチドが隣接する非修飾ＤＮＡの１０個以上の連続するヌクレオチドを含む、請求項１０～１５のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項32】
配列番号１８のヌクレオチド配列を含む、請求項３１に記載のＡＳＯ。
【請求項33】
前記ＡＳＯ中の各シチジンが５－メチルによって修飾される、請求項１０～３２のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項34】
前記ｒｅｇＲＮＡがｅＲＮＡである、請求項１～３３のいずれか１項に記載のＡＳＯ。
【請求項35】
請求項１～３４のいずれか１項に記載のＡＳＯ、及び薬学的に許容される担体または賦形剤担体を含む、医薬組成物。
【請求項36】
ヒト細胞におけるＯＴＣの転写を増大させる方法であって、細胞を請求項１～３４のいずれか１項に記載のＡＳＯまたは請求項３５に記載の医薬組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項37】
前記細胞が肝細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記ＡＳＯが、前記細胞中の前記調節ＲＮＡの量を増大させる、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項39】
前記ＡＳＯが、前記細胞中の前記調節ＲＮＡの安定性を増大させる、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
尿素サイクル異常症の処置方法であって、それを必要とする対象に、請求項１～３４のいずれか１項に記載のＡＳＯまたは請求項３５に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項41】
前記ＡＳＯが前記対象の細胞における前記調節ＲＮＡの量を増大させる、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記ＡＳＯが、前記対象の細胞内の前記調節ＲＮＡの安定性を増大させる、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項43】
前記細胞が肝細胞である、請求項４１または４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月３日出願の米国仮出願第６３／２４０，８３８号及び２０２１年１２月２２日出願の米国仮出願第６３／２９２，７９２号の利益を主張するものであり、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年９月３日出願の米国仮出願第６３／２４０，８３８号及び２０２１年１２月２２日出願の米国仮出願第６３／２９２，７９２号の利益を主張するものであり、これらの各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出され、その全体が参照により本明細書に援用される配列表が含まれる。２０ＸＸ年、ＸＸ月に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと称され、サイズがＸ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。
本出願には、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出され、その全体が参照により本明細書に援用される配列表が含まれる。２０ＸＸ年、ＸＸ月に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、ＸＸＸＸＸＵＳ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと称され、サイズがＸ，ＸＸＸ，ＸＸＸバイトである。
【0003】
発明の分野
本発明は、プロモーター関連ＲＮＡ及びエンハンサーＲＮＡなどのＯＴＣ調節ＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いて、ＯＴＣ遺伝子転写をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする方法に関する。
本発明は、プロモーター関連ＲＮＡ及びエンハンサーＲＮＡなどのＯＴＣ調節ＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いて、ＯＴＣ遺伝子転写をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする方法に関する。
【背景技術】
【0004】
転写因子は、プロモーター及びエンハンサーＤＮＡエレメント中の特定の配列に結合して、遺伝子転写を調節する。活性プロモーター及びエンハンサーエレメントはそれ自体が転写され、プロモーター関連ＲＮＡ（ｐａＲＮＡ）及びエンハンサーＲＮＡ（ｅＲＮＡ）などの非コード調節ＲＮＡ（ｒｅｇＲＮＡ）を生成することが最近報告された（Ｓａｒｔｏｒｅｌｌｉ及びＬａｕｂｅｒｔｈ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０２０）２７，５２１－２８（非特許文献1）を参照されたい）。コードＲＮＡとは異なり、ｒｅｇＲＮＡは双方向に転写される。ヌクレオソームリモデリング（Ｍｏｕｓａｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０１３）５１（５）：６０６－１７（非特許文献2）を参照されたい）、エンハンサー－プロモーターループの調節（Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１３）４９４（７４３８）：４９７－５０１（非特許文献3）を参照されたい）、及び転写調節因子との直接相互作用（Ｓｉｇｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５）３５０，９７８－８１（非特許文献4）を参照されたい）を含む、ｒｅｇＲＮＡの機能のための様々なモデルが提案されている。
【0005】
遺伝子発現は、一般に、創薬不可能な生物学的過程（ｕｎｄｒｕｇａｂｌｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ）として公知である。遺伝子転写及びｒｅｇＲＮＡの生物学を理解することに対する努力に関わらず、臨床的に適切な遺伝子発現を調節する方法は限定される。異常な遺伝子発現に関連する疾患を治療するための新規かつ有用な方法の必要性が残っている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｓａｒｔｏｒｅｌｌｉ及びＬａｕｂｅｒｔｈ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ． Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０２０）２７，５２１－２８
【非特許文献2】Ｍｏｕｓａｖｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ（２０１３）５１（５）：６０６－１７
【非特許文献3】Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２０１３）４９４（７４３８）：４９７－５０１
【非特許文献4】Ｓｉｇｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５）３５０，９７８－８１
【発明の概要】
【0007】
本発明は、プロモーター関連ＲＮＡ及びエンハンサーＲＮＡのような調節ＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ならびに遺伝子発現を調節するためにこれらのＡＳＯを用いる方法を提供する。これらの方法は、遺伝子産物のレベルを調節するために、例えば、疾患を引き起こす遺伝子（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ））の発現レベルを調節し、それによって、異常な遺伝子発現に関連する疾患（例えば、尿素サイクル異常）を処置するために有用である。
【0008】
１つの態様において、本明細書に提供されるのは、ヒトオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）の調節ＲＮＡの少なくとも８個の連続するヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）であり、この調節ＲＮＡは、配列番号１～４または１０７７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を有する。
【0009】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ｒｅｇＲＮＡの３’末端から２００ヌクレオチド以下であるｒｅｇＲＮＡ中の配列に相補的である。
【0010】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ｒｅｇＲＮＡの５’末端から２００ヌクレオチド以下であるｒｅｇＲＮＡ中の配列に相補的である。
【0011】
いくつかの実施形態では、ｒｅｇＲＮＡはポリアデニル化ＲＮＡではない。
【0012】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ｒｅｇＲＮＡのＲＮＡｓｅ Ｈ媒介性分解を誘導しない。
【0013】
いくつかの実施形態では、調節ＲＮＡは、配列番号１のヌクレオチド配列を有し、ＡＳＯは、配列番号６～１４、１８～３５、３９、４１、７５、７６、７７、７８、８７～１２４または１４３～８９２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
【0014】
いくつかの実施形態では、調節ＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列を有し、ＡＳＯは、配列番号１５～１７、３６～３８、６４～７４、１２５～１４２、または８９３～１０２９のヌクレオチド配列を含む。
【0015】
いくつかの実施形態では、調節ＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列を有し、ＡＳＯは、配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、長さが５０、４０、３０、または２５ヌクレオチド以下である。
【0017】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の化学修飾を含むＲＮＡポリヌクレオチドを含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯの５’末端の少なくとも３、４、または５個のヌクレオチド、及び３’末端の少なくとも３、４、または５個のヌクレオチドは、１つ以上の化学修飾を有するリボヌクレオチドを含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、１つ以上の化学修飾は、２’－Ｏ－Ｃ１～４アルキル、例えば、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－デオキシ（２’－Ｈ）、２’－Ｏ－Ｃ１～３アルキル－Ｏ－Ｃ１～３アルキル、例えば、２’－メトキシエチル（「２’－ＭＯＥ」）、２’－フルオロ（「２’－Ｆ」）、２’－アミノ（「２’－ＮＨ２」）、２’－アラビノシル（「２’－アラビノ」）ヌクレオチド、２’－Ｆ－アラビノシル（「２’－Ｆ－アラビノ」）ヌクレオチド、２’－ロックド核酸（「ＬＮＡ」）ヌクレオチド、２’－アミド架橋核酸（ＡｍＮＡ）、２’－アンロックド核酸（「ＵＬＮＡ」）ヌクレオチド、Ｌ型の糖（「Ｌ－糖」）、４’－チオリボシルヌクレオチド、拘束エチル（ｃＥＴ）、２’－フルオロ－アラビノ（ＦＡＮＡ）、またはチオモルホリノのうち１つ以上を含むヌクレオチド糖修飾を含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、１つ以上の化学修飾は、ホスホロチオエート（「ＰＳ」または（Ｐ（Ｓ）））、ホスホロアミデート（Ｐ（ＮＲ１Ｒ２）、例えばジメチルアミノホスホロアミデート（Ｐ（Ｎ（ＣＨ３）２））、ホスホノカルボキシレート（Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、例えば、ホスホノアセテート「ＰＡＣＥ」（Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））、チオホスホノカルボキシレート（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、例えば、チオホスホノアセテート「ｔｈｉｏＰＡＣＥ」（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））、アルキルホスホネート（Ｐ（Ｃ１～３アルキル）、例えば、メチルホスホネート－Ｐ（ＣＨ３）、ボラノホスホネート（Ｐ（ＢＨ３））、またはホスホロジチオエート（Ｐ（Ｓ）２）のうちの１つ以上を含むヌクレオチド間修飾を含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、１つ以上の化学修飾は、２－チオウラシル（「２－チオＵ」）、２－チオシトシン（「２－チオＣ」）、４－チオウラシル（「４－チオＵ」）、６－チオグアニン（「６－チオＧ」）、２－アミノアデニン（「２－アミノＡ」）、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルシトシン（「５－メチルＣ」）、５－メチルウラシル（「５－メチルＵ」）、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルウラシル（「５－アリルＵ」）、５－アリルシトシン（「５－アリルＣ」）、５－アミノアリルウラシル（「５－アミノアリルＵ」）、５－アミノアリル－シトシン（「５－アミノアリルＣ」）、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ塩基、Ｐ塩基、非構造核酸（「ＵＮＡ」）、イソグアニン（「ｉｓｏＧ」）、イソシトシン（「ｉｓｏＣ」）グリセロール核酸（ＧＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、またはチオホスホルアミデートモルホリノ（ＴＭＯ）のうちの１つ以上を含む核酸塩基修飾を含む。
【0022】
いくつかの実施形態では、１つ以上の化学修飾は、２’－Ｏ－メトキシエチル、シチジン上の５－メチル、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホジエステル（ＰＯ）ヌクレオチド間結合、またはホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、１つ以上の化学修飾は、２’－Ｏ－メトキシエチル、シチジン上の５－メチル、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホジエステル（ＰＯ）ヌクレオチド間結合、またはホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１８～３９または６７～７４のヌクレオチド配列を含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、非修飾ＤＮＡの１０個以上の連続するヌクレオチドを含まない。
【0026】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、デオキシリボヌクレオチドを含まない。
【0027】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、非修飾リボヌクレオチドを含まない。
【0028】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯの長さは、５×ｎ＋５ヌクレオチド（ｎは３以上の整数）であり、５×ｍ位のヌクレオチドは、ＬＮＡによって修飾されたリボヌクレオチドであり（ｍは１～ｎの整数）、残りの位置のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチルによって修飾されたリボヌクレオチドである。
【0029】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＧａｌＮＡｃ部分をさらに含む。
【0030】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１４２のヌクレオチド配列を含む。
【0031】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯの長さは、３×ｎ＋２ヌクレオチド（ｎは６以上の整数）であり、３×ｍ位のヌクレオチドは、ＬＮＡによって修飾されたリボヌクレオチドであり（ｍは１～ｎの整数）、残りの位置のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチルによって修飾されたリボヌクレオチドである。
【0032】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＧａｌＮＡｃ部分をさらに含む。
【0034】
ＡＳＯが配列番号１２２のヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載のＡＳＯ。
【0035】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯの各リボヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチルによって修飾される。
【0036】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、配列番号２５のヌクレオチド配列を含む。
【0037】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯの各ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチルによって修飾されるリボヌクレオチドである。
【0038】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、配列番号３６のヌクレオチド配列を含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、５’末端及び３’末端の各々において修飾リボヌクレオチドの少なくとも３つのヌクレオチドが隣接する非修飾ＤＮＡの１０個以上の連続するヌクレオチドを含む。
【0040】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１８のヌクレオチド配列を含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯ中の各シチジンは、５－メチルにより修飾される。
【0042】
いくつかの実施形態では、ｒｅｇＲＮＡはｅＲＮＡである。
【0043】
一態様では、本明細書に提供されるのは、本明細書に記載のＡＳｏ、及び薬学的に許容される担体または賦形剤担体を含む、医薬組成物である。
【0044】
一態様において、ヒト細胞におけるＯＴＣの転写を増大させる方法であって、細胞を本明細書に記載のＡＳＯまたは本明細書に記載の医薬組成物と接触させることを含む方法が、本明細書に提供される。
【0045】
いくつかの実施形態では、細胞は肝細胞である。
【0046】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、細胞内の調節ＲＮＡの量を増大させる。
【0047】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、細胞内の調節ＲＮＡの安定性を増大させる。
【0048】
一態様において、尿素サイクル異常を治療する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本明細書に記載のＡＳＯまたは本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む方法が本明細書に提供される。
【0049】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、対象の細胞内の調節ＲＮＡの量を増大させる。
【0050】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、対象の細胞内の調節ＲＮＡの安定性を増大させる。
【0051】
いくつかの実施形態では、細胞は肝細胞である。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図1】染色体上の遺伝子のｅＲＮＡ、ｐａＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及び天然アンチセンス転写物（ＮＡＴ）の例示的な概略図を示す。ｅＲＮＡ、ｐａＲＮＡ、及びＮＡＴは、すべて非コードＲＮＡである。ｅＲＮＡは、遺伝子のエンハンサーから二方向に転写される。ｐａＲＮＡは、遺伝子のプロモーターから、ｍＲＮＡと同じであるが、アンチセンス方向に転写される。ＮＡＴは、それ自体の下流プロモーターからアンチセンス方向に転写され、その結果、転写物は、ｍＲＮＡと少なくとも部分的に重複する。一般に、ｅＲＮＡ及びｐａＲＮＡは遺伝子発現をアップレギュレートし、ＮＡＴは遺伝子発現を下方制御する。
【0053】
【図2】Ａ～Ｄは、示されたＡＳＯによる処理が用量依存的にＯＴＣのｍＲＮＡアップレギュレーションをもたらすことを示す。Ａは、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１１による処理後のＯＴＣのｍＲＮＡを示す。Ｂは、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－８による処理後のＯＴＣのｍＲＮＡを示す。Ｃは、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ２－１による処理後のＯＴＣのｍＲＮＡを示す。Ｄは、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１による処理後のＯＴＣのｍＲＮＡを示す。
【0054】
【図3A】ＯＴＣのｍＲＮＡが、ＡＳＯ ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０及びｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－２ｃによる処理後にＯＴＣ欠損ドナー由来の細胞において増大したことを示す。
【図3B】ＡＳＯ ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０及びｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－２ｃによる処理後にＯＴＣ欠損ドナー由来の細胞において尿素生成が増大したことを示す。
【図3C】ＡＳＯ ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－２ａによる処理後にＷＴ細胞においてＯＴＣのｍＲＮＡが増大したことを示す。
【図3D】ＡＳＯ ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－２ａによる処理後にＷＴ細胞において尿素生成が増大したことを示す。
【0055】
【図4】示されたマウスＡＳＯが、野生型マウス由来の初代マウス肝臓細胞においてＯＴＣのｍＲＮＡレベルを増大させたことを示す。一元配置ＡＮＯＶＡ＊：ｐ０．０５－０．００５；＊＊：ｐ＜０．００５。
【0056】
【図5】示されたマウスＡＳＯが、ｓｐｆａｓｈ初代マウス肝臓細胞におけるＯＴＣのｍＲＮＡレベルを増大させたことを示す。一元配置ＡＮＯＶＡ＊＊：ｐ＜０．００５。
【0057】
【図6】Ａは、ＩＦＮｙによる処理後、Ｓｅｒｐｉｎｇ１のアップレギュレーションを示す。Ｂは、ＪＡＫ阻害剤トファシチニブによる処理後のＳｅｒｐｉｎｇ１のダウンレギュレーションを示す。
【0058】
【図7】ＩＦＮｙ誘導後の、Ｓｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡとタンパク質分泌との相関を示す。
【0059】
【図8】ＩＦＮｙで処理した、マウス肝臓におけるＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡ及びｒｅｇＲＮＡの誘導を示す。
【0060】
【図9】Ａは、ＩＦＮｙによる処置後の経時的研究における、マウス肝細胞におけるＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡ及びｒｅｇＲＮＡレベルを示す。Ｂは、ＩＦＮｙによる処理後の、経時的研究におけるマウス肝細胞におけるＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡ及びｒｅｇＲＮＡのレベルを示す。
【0061】
【図10】ＩＦＮｇまたはＰＢＳ（対照）による処理後のＳｅｒｐｉｎｇ１エンハンサー２のＲＮＡ及びプロモーター２のＲＮＡレベルを示す。
【0062】
【0063】
【図12】示されたＡＳＯによる処理後のＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡレベルを示す。
【0064】
【図13】示されたＡＳＯによる処理の２４、４８及び７２時間後のＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡレベルを示す。
【0065】
【図14】Ａは、インビボのマウス研究のタイムラインの図を示す。Ｂは、ＡＳＯ－２による処理後にインビボで増大したＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡ発現を示す。
【0066】
【図15】Ａは、ＩＦＮｙ＋示されたＡＳＯのＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡ発現に対する相加効果を、未処理細胞に対して正規化して示す。Ｂは、ＩＦＮｙ＋示されたＡＳＯのＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡ発現に対する相加効果を、未処理細胞に対して正規化して示す。
【0067】
【図16】ＪＡＫ１阻害剤トファシチニブまたはＪＡＫ１阻害剤トファシチニブ＋ＡＳＯ－２処理後のＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡ発現を、未処理細胞に対して正規化して示す。
【0068】
【図17】ＪＡＫ１阻害剤トファシチニブを使用するＳｅｒｐｉｎｇ１ノックダウン系における示されたＡＳＯ処理が、Ｓｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡ発現を増大させたことを示す。
【0069】
【図18A】化学修飾を有する種々のヒトＯＴＣ ＡＳＯの概略図を示す。薄い灰色は、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－ＭＯＥ）修飾を示す。濃い灰色は、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾を示す。線括弧は、ホスホジエステル（ＰＯ）結合を示す。＊Ｃは、シチジン上の５－メチルを示す。＾は、ＦＡＮＡヌクレオシドを示す。この図に示される特定の化学修飾を有するヌクレオチド配列に、固有の配列識別子を割り当てる。
【図18B】化学修飾を有する種々のヒトＯＴＣ ＡＳＯの概略図を示す。薄い灰色は、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－ＭＯＥ）修飾を示す。濃い灰色は、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾を示す。線括弧は、ホスホジエステル（ＰＯ）結合を示す。＊Ｃは、シチジン上の５－メチルを示す。＾は、ＦＡＮＡヌクレオシドを示す。この図に示される特定の化学修飾を有するヌクレオチド配列に、固有の配列識別子を割り当てる。
【図18C】化学修飾を有する、様々なマウスＯＴＣ ＡＳＯの概略図を示す。薄い灰色は、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－ＭＯＥ）修飾を示す。＊Ｃは、シチジン上の５－メチルを示す。この図に示される特定の化学修飾を有するヌクレオチド配列に、固有の配列識別子を割り当てる。
【0070】
【図19】化学修飾を有する種々のＳｅｒｐｉｎｇ１ ＡＳＯの概略図を示す。薄い灰色は、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－ＭＯＥ）修飾を示す。＊Ｃは、シチジン上の５－メチルを示す。固有の配列識別子が、この図に示される特定の化学修飾を有するヌクレオチド配列に割り当てられる。
【0071】
【図20】Ａは、示されたＡＳＯによる処理が、用量依存的様式でヒトＯＴＣのｍＲＮＡアップレギュレーションをもたらすことを示す。Ｂは、示されたＡＳＯによる処理が用量依存的にＯＴＣのｍＲＮＡアップレギュレーションをもたらすことを示す。
【0072】
【図21】示されたＡＳＯによる処理が、用量依存的様式でヒトＯＴＣのｍＲＮＡアップレギュレーションをもたらすことを示す。
【0073】
【図22】示されたＡＳＯによる処理が、用量依存的様式でヒトＯＴＣのｍＲＮＡアップレギュレーションをもたらすことを示す。
【0074】
【図23】ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ａが、ＰＢＭＣによるＩＬ６、ＴＮＦａ、ＩＦＮａ、またはＩＦＮｂサイトカイン放出を誘導しなかったことを示す。
【0075】
【図24A】示されたＡＳＯによる処理が、用量依存的様式でマウスＯＴＣのｍＲＮＡアップレギュレーションをもたらすことを示す。
【図24B】Ｏｔｃ ｒｅｇＲＮＡ標的化ＡＳＯ ＣＯ－４４７４がＯｔｃｄｅｆマウスにおいてマウスＯＴＣのｍＲＮＡを増大させなかったことを示す。
【図24C】ＣＯ－４４７４がアンモニアをＷＴレベルまで減少させたことを示す。
【0076】
【図25】Ａは、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０による処理後のＯＴＣ遺伝子発現のアップレギュレーションを示す。Ｂは、ヒトｈｇ３８ゲノムに対するペアエンド配列決定ＣｈＩＰ－ｓｅｑライブラリーのアラインメント及びピークを示す。Ｃは、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０による処理後にＯＴＣエンハンサー、ＯＴＣプロモーター、及び対照領域（ＧＡＰＤＨ、ＲＰＧＲ、ＴＳＰＡＮ７）における差次的ピークが同定されたことを示す。
【0077】
【図26】ＯＴＣプロモーター、及びエンハンサー及び隣接するＲＰＧＲプロモーターにおけるアクセス可能なクロマチン領域を示す（囲まれた領域で示す）。
【0078】
【図27】Ａは、ＡＳＯ処理後の経時的なＯＴＣエンハンサーから転写されたマイナス鎖ｒｅｇＲＮＡ（ＲＲ１）の相対発現レベルを示す。Ｂは、ＡＳＯ処理後の経時的な、ＯＴＣエンハンサーから転写されたプラス鎖ｒｅｇＲＮＡ（ＲＲ２）の相対発現レベルを示す。Ｃは、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０処理後の経時的なＯＴＣのｍＲＮＡ効果を示す。Ｄは、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０処理後のＨ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲの結果を示す。Ｅは、ＯＴＣ ＡＳＯに対する転写及びクロマチン応答の時間的モデルを提供する。
【0079】
【図28】Ａは、ＮＴＣ ＡＳＯと比較した、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０による処理後の示された負の調節因子に対する結合の相対的損失を示す。Ｂは、ＲＮａｓｅ処理後の肝細胞において、ＨＤＡＣ５及びＮＣＯＲ１の結合がＯＴＣエンハンサーで減少しないことを示す。
【0080】
【図29】Ａは、ｓｉＨＤＡＣ５またはｓｉＮＣＯＲ１による処理が、標的ｍＲＮＡレベルの少なくとも５０％の低下をもたらすことを示す。Ｂは、ＨＤＡＣ５またはＮＣＯＲ１ノックダウンのｓｉＲＮＡノックダウンが、肝細胞におけるＯＴＣのｍＲＮＡ発現の増大を導くことを示す。Ｃは、未処理の肝細胞、ならびにｓｉＨＤＡＣ５またはｓｉＮＣＯＲ１で処理した肝細胞における、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０で処理した後のＯＴＣのｍＲＮＡの倍率変化を示す。
【0081】
【図30】ＯＴＣ ｒｅｇＲＮＡ標的化ＡＳＯで処理した後のＯＴＣ遺伝子発現のモデルを提供する。
【0082】
【図31】示したＡＳＯで処理した後の、ＮＨＰにおけるアンモニア及び尿素レベルを示す。
【0083】
【図32】ヒト化マウスモデルにおいて示されたＡＳＯで処理した後の相対的なＯＴＣ、ＮＡＧＳ、ＣＰＳ１、ＡＳＳ１、ＡＳＬ、またはＡＲＧ１のｍＲＮＡ発現を示す。
【0084】
【図33】ヒト化マウスにおけるＣＯ－５３１８及びＣＯ－５３１９処理が、経時的にアンモニアの減少及び尿素の対応する増大を示したことを示す。
【0085】
【図34】Ａは、ＡＳＯ ＣＯ－３２６５、ＣＯ－３２７９、ＣＯ－２０４３、及びＣＯ－２０５１が、Ｓｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡ発現を用量依存的に増大させたことを示す。Ｂは、ＡＳＯ ＣＯ－２０４３、ＣＯ－２０５１、ＣＯ－３２６５、ＣＯ－３４１９、ＣＯ－４０６９、及びＣＯ－３２７９が、Ｃ１ＮＨ＋／－肝細胞におけるＳｅｒｐｉｎｇ１遺伝子発現を用量依存的に増大させたことを示す。
【0086】
【図35】示されたＡＳＯが、マウスにおいて、Ｓｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡを増大させたことを示す。
【0087】
【図36】ＣＯ－２０５１が、ＣＩＮＨ＋／－マウスの耳及び結腸の両方における色素溢出の量を減少させたことを示す。
【0088】
【図37】Ａは、ＣＯ－２０５１が、ＷＴマウスにおいてＳｅｒｐｉｎｇ１タンパク質発現を増大させたことを示す。Ｂは、ＣＯ－２０５１がＣ１ＮＨ＋／－マウスにおいてＳｅｒｐｉｎｇ１タンパク質発現を増大させたことを示す。Ｃは、ＣＯ－２０５１－ＧａｌＮＡｃが、Ｃ１ＮＨ＋／－マウスにおいてＳｅｒｐｉｎｇ１タンパク質発現を増大させたことを示す。Ｄは、ＣＯ－２０５１－ＧａｌＮＡｃによる処理後の色素溢出の定量を示す。
【発明を実施するための形態】
【0089】
詳細な説明
本発明は、プロモーター関連ＲＮＡ及びエンハンサーＲＮＡのような調節ＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ならびに遺伝子発現を調節するためにこれらのＡＳＯを用いる方法を提供する。これらの方法は、遺伝子産物のレベルを調節するために、例えば、疾患を引き起こす遺伝子（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ））の発現レベルを調節し、それによって、異常な遺伝子発現に関連する疾患（例えば、尿素周期疾患）を処置するために有用である。
本発明は、プロモーター関連ＲＮＡ及びエンハンサーＲＮＡのような調節ＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ならびに遺伝子発現を調節するためにこれらのＡＳＯを用いる方法を提供する。これらの方法は、遺伝子産物のレベルを調節するために、例えば、疾患を引き起こす遺伝子（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ））の発現レベルを調節し、それによって、異常な遺伝子発現に関連する疾患（例えば、尿素周期疾患）を処置するために有用である。
【0090】
本出願に記載される多重特異的結合タンパク質の様々な態様を、以下の節に記載する。
【0091】
定義
本出願の理解を促進するために、多数の用語及び語句を下記に定義する。
本出願の理解を促進するために、多数の用語及び語句を下記に定義する。
【0092】
本明細書で使用されるとき、用語「ある、１つの（ａ：不定冠詞）」及び「ある、１つの（ａｎ：不定冠詞）」は、「１つ以上」を意味し、文脈が不適切でない限り複数を含む。
【0093】
本明細書で使用される場合、「オルニチントランスカルバミラーゼ」または「ＯＴＣ」という用語は、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ００４８０のタンパク質ならびに関連するアイソフォーム及びオルソログを指す。
【0094】
本明細書で使用される場合、「調節ＲＮＡ」及び「ｒｅｇＲＮＡ」という用語は、遺伝子の調節エレメントから転写された非コードＲＮＡ（例えば、タンパク質コード遺伝子）であって、この遺伝子が非コードＲＮＡ自体ではない非コードＲＮＡを指して互換的に使用される。例示的な調節エレメントとしては、限定するものではないが、プロモーター、エンハンサー、及びスーパーエンハンサーが挙げられる。プロモーターからアンチセンス方向に転写された非コードＲＮＡは、「プロモーターＲＮＡ」または「ｐａＲＮＡ」とも呼ばれる。センス方向またはアンチセンス方向のいずれかで、エンハンサーまたはスーパーエンハンサーから転写された非コードＲＮＡはまた、「エンハンサーＲＮＡ」または「ｅＲＮＡ」とも呼ばれる。遺伝子の転写物の少なくとも一部と相補的な天然のアンチセンス転写物（ＮＡＴ）は、本明細書で使用される調節ＲＮＡではないことが理解される。
【0095】
本明細書で使用される場合、「新生ＲＮＡ」という用語は、依然として転写されているか、またはＲＮＡポリメラーゼによって転写されたばかりであり、転写されたＤＮＡに繋がれたままであるＲＮＡを指す。転写されるＤＮＡから解離したＲＮＡは、「非係留ＲＮＡ（ｕｎｔｅｔｈｅｒｅｄ ＲＮＡ）」とも呼ばれる。
【0096】
本明細書で使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ＡＳＯ」という用語は、適切な条件下で標的核酸とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチド、またはそのような一本鎖オリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを指す。
【0097】
本明細書で使用される場合、ｒｅｇＲＮＡの安定性は、ｒｅｇＲＮＡの分解速度と逆相関する。ＡＳＯがｒｅｇＲＮＡの安定性を増大させる場合、ｒｅｇＲＮＡの分解速度を低下させる。ＡＳＯがｒｅｇＲＮＡの安定性を低減させる場合、ｒｅｇＲＮＡの分解速度を増大させる。ｒｅｇＲＮＡの分解速度は、新しいｒｅｇＲＮＡの合成をブロックし、既存のｒｅｇＲＮＡの半減期を評価することによって測定され得る。
【0098】
本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書に記載の方法及び組成物によって治療される生物体を指す。そのような生物体としては、好ましくは、限定するものではないが、哺乳動物（例えば、げっ歯類、霊長類、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が挙げられ、及びさらに好ましくは、ヒトが挙げられる。
【0099】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な化合物（例えば、本出願の化合物）の量を指す。有効量は、１回以上の投与、適用、または投薬において投与されてもよく、特定の処方または投与経路に限定する意図はない。本明細書で使用されるとき、「治療する」と言う用語は、病態、疾患、障害などの改善をもたらす、例えば、低下、低減、調節、改良、もしくは排除などの任意の効果、またはそれらの症状の改良を含む。
【0100】
本明細書で使用されるとき、「医薬組成物」という用語は、活性薬剤と、その組成物をインビボまたはエキソビボにおける診断的または治療的使用に本質的に好適にさせる不活性または活性な担体との組み合わせを指す。
【0101】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝食塩水、水、エマルション（例えば、水中油型または油中水型のエマルション）、及び種々のタイプの湿潤剤のいずれかを指す。また、組成物は、安定剤及び防腐剤を含んでもよい。担体、安定化剤及びアジュバントの例に関しては、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ． Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９７５）を参照されたい。
【0102】
この説明を通して、組成物が特定の構成要素を有する、含む、もしくは備えると説明されるか、またはプロセス及び方法が特定のステップを有する、含む、もしくは備えると説明される場合、それに加えて、記載される構成要素から本質的になるか、もしくはそれからなる本出願に記載の組成物が存在すること、ならびに記載されるプロセスステップから本質的になるか、もしくはそれからなる本出願によるプロセス及び方法が存在することが企図される。
【0103】
一般事項として、パーセンテージを特定する組成物は、特に明記しない限り、重量基準である。さらに、可変要素が定義を伴わない場合、その可変要素の以前の定義が優先する。
【0104】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、標的遺伝子の調節エレメントから転写されたｒｅｇＲＮＡとハイブリダイズする。ｅＲＮＡ及びｐａＲＮＡの両方が、遺伝子発現を促進またはアップレギュレーションするｒｅｇＲＮＡであることが理解される（図１）。特定の実施形態では、標的ｒｅｇＲＮＡは、ｅＲＮＡである。特定の実施形態では、標的ｒｅｇＲＮＡは、ｐａＲＮＡである。特定の実施形態では、標的ｒｅｇＲＮＡは、ポリアデニル化ＲＮＡではない。ｅＲＮＡは、当技術分野で公知の方法、例えば、配列決定（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）を用いたトランスポザーゼ－アクセッシブルクロマチンのアッセイ、グローバルランオンシーケンシング、精密ランオンシーケンシング、キャップ分析遺伝子発現、及びヒストン修飾分析（例えば、Ｓａｒｔｏｒｅｌｌｉ ＆ Ｌａｕｂｅｒｔｈ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０２０）２７：５２１－２８；ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２０１３／１７７２４８を参照されたい）を用いて同定され得る。ｐａＲＮＡは、アンチセンス方向の標的遺伝子のプロモーターから転写されたＲＮＡである（センス方向の転写物は、標的遺伝子のｍＲＮＡである）。それらは、それらの特定の位置及び向きを考慮して、類似の方法によって同定され得る。ヒトＯＴＣにおいて、ｅＲＮＡは、同じエンハンサー領域から転写することが特定されている。マウスＳＥＲＰＩＮＧ１において、ｐａＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＧ１プロモーターから転写されるが、Ｓｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡとは反対方向に転写されることが特定されている。例示的なｒｅｇＲＮＡのヌクレオチド配列を、以下の表１に示す。これらのｒｅｇＲＮＡのいずれも、本明細書に開示されるＡＳＯの標的ｒｅｇＲＮＡとして企図される。
本明細書に開示されるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、標的遺伝子の調節エレメントから転写されたｒｅｇＲＮＡとハイブリダイズする。ｅＲＮＡ及びｐａＲＮＡの両方が、遺伝子発現を促進またはアップレギュレーションするｒｅｇＲＮＡであることが理解される（図１）。特定の実施形態では、標的ｒｅｇＲＮＡは、ｅＲＮＡである。特定の実施形態では、標的ｒｅｇＲＮＡは、ｐａＲＮＡである。特定の実施形態では、標的ｒｅｇＲＮＡは、ポリアデニル化ＲＮＡではない。ｅＲＮＡは、当技術分野で公知の方法、例えば、配列決定（ＡＴＡＣ－ｓｅｑ）を用いたトランスポザーゼ－アクセッシブルクロマチンのアッセイ、グローバルランオンシーケンシング、精密ランオンシーケンシング、キャップ分析遺伝子発現、及びヒストン修飾分析（例えば、Ｓａｒｔｏｒｅｌｌｉ ＆ Ｌａｕｂｅｒｔｈ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０２０）２７：５２１－２８；ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２０１３／１７７２４８を参照されたい）を用いて同定され得る。ｐａＲＮＡは、アンチセンス方向の標的遺伝子のプロモーターから転写されたＲＮＡである（センス方向の転写物は、標的遺伝子のｍＲＮＡである）。それらは、それらの特定の位置及び向きを考慮して、類似の方法によって同定され得る。ヒトＯＴＣにおいて、ｅＲＮＡは、同じエンハンサー領域から転写することが特定されている。マウスＳＥＲＰＩＮＧ１において、ｐａＲＮＡは、ＳＥＲＰＩＮＧ１プロモーターから転写されるが、Ｓｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡとは反対方向に転写されることが特定されている。例示的なｒｅｇＲＮＡのヌクレオチド配列を、以下の表１に示す。これらのｒｅｇＲＮＡのいずれも、本明細書に開示されるＡＳＯの標的ｒｅｇＲＮＡとして企図される。
【0105】
（表１）例示的なｒｅｇＲＮＡ
【0106】
本発明は、標的ｒｅｇＲＮＡの量または安定性を増大させ、それによって標的遺伝子の発現を増大させるＡＳＯを記載する。これは、ｅＲＮＡを阻害するように設計された先に記載されたＡＳＯとは異なる（例えば、ＰＣＴ出願番号ＷＯ２０１３／１７７２４８及びＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２０１７／０７５４０６を参照されたい）。理論に拘束されることを望むものではないが、ｒｅｇＲＮＡをアップレギュレートするＡＳＯの能力は、ｒｅｇＲＮＡにおける標的配列の選択及び／またはＡＳＯの化学修飾に起因すると仮定される。
【0107】
いくつかの実施形態では、調節ＲＮＡは、配列番号１のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、調節ＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、調節ＲＮＡは、配列番号３のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、調節ＲＮＡは、配列番号４のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、調節ＲＮＡは、配列番号５のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、調節ＲＮＡは、配列番号１０７３のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、調節ＲＮＡは、配列番号１０７４のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、調節ＲＮＡは、配列番号１０７５のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、調節ＲＮＡは、配列番号１０７６のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、調節ＲＮＡは、配列番号１０７７のヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、調節ＲＮＡは、配列番号１０７８のヌクレオチド配列を有する。
【0108】
ＡＳＯの配列
本明細書に開示されるように、ＯＴＣ標的ｒｅｇＲＮＡの５’または３’末端により近い配列に結合するＡＳＯは、ｒｅｇＲＮＡをアップレギュレートする可能性がより高い。理論に拘束されることを望むものではないが、このようなＡＳＯは、ＯＴＣ ｒｅｇＲＮＡの末端部分にハイブリダイズし、ｒｅｇＲＮＡの機能的領域をブロックすることなく、５’→３’及び／または３’→５’ＲＮＡ分解を防止または遅延させると仮定される。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、標的ｒｅｇＲＮＡの５’または３’末端から３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド以下である標的ｒｅｇＲＮＡ中の配列に相補的である。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、標的ｒｅｇＲＮＡの５’末端から３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド以下である標的ｒｅｇＲＮＡ中の配列に相補的である（すなわち、ＡＳＯと二本鎖を形成するｒｅｇＲＮＡ配列の最も５’側のヌクレオチドは、標的ｒｅｇＲＮＡの５’末端から３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド以下である）。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、標的ｒｅｇＲＮＡの３’末端から３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド以下である標的ｒｅｇＲＮＡ中の配列に相補的である（すなわち、ＡＳＯと二本鎖を形成するｒｅｇＲＮＡ配列の最も３’側のヌクレオチドは、標的ｒｅｇＲＮＡの３’末端から３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド以下である）。
本明細書に開示されるように、ＯＴＣ標的ｒｅｇＲＮＡの５’または３’末端により近い配列に結合するＡＳＯは、ｒｅｇＲＮＡをアップレギュレートする可能性がより高い。理論に拘束されることを望むものではないが、このようなＡＳＯは、ＯＴＣ ｒｅｇＲＮＡの末端部分にハイブリダイズし、ｒｅｇＲＮＡの機能的領域をブロックすることなく、５’→３’及び／または３’→５’ＲＮＡ分解を防止または遅延させると仮定される。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、標的ｒｅｇＲＮＡの５’または３’末端から３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド以下である標的ｒｅｇＲＮＡ中の配列に相補的である。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、標的ｒｅｇＲＮＡの５’末端から３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド以下である標的ｒｅｇＲＮＡ中の配列に相補的である（すなわち、ＡＳＯと二本鎖を形成するｒｅｇＲＮＡ配列の最も５’側のヌクレオチドは、標的ｒｅｇＲＮＡの５’末端から３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド以下である）。特定の実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、標的ｒｅｇＲＮＡの３’末端から３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド以下である標的ｒｅｇＲＮＡ中の配列に相補的である（すなわち、ＡＳＯと二本鎖を形成するｒｅｇＲＮＡ配列の最も３’側のヌクレオチドは、標的ｒｅｇＲＮＡの３’末端から３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、または１０ヌクレオチド以下である）。
【0109】
特定の実施形態では、ＡＳＯは、８、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチド長以下である。特定の実施形態では、ＡＳＯは、少なくとも８、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ＡＳＯは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長である。
【0110】
特定の実施形態では、ＡＳＯは、それ自体の内部または互いの間に形成される安定な二次構造を欠くように設計され、それによって、標的ｒｅｇＲＮＡとハイブリダイズする準備ができた一本鎖形態のＡＳＯの量を増大させる。二次構造を予測する方法は、当該技術分野で公知である（例えば、Ｓｅｅｔｉｎ ａｎｄ Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２）９０５：９９－１２２；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ．（２０２１）１７（８）：ｅ１００９２９１）及びｗｅｂベースのプログラム（例えば、ＲＮＡｆｏｌｄ）は、公開ユーザーに利用可能である。
【0111】
例えば、ＡＳＯは、ヒトＯＴＣ ｅＲＮＡまたはマウスＳＥＲＰＩＮＧ１ ｐａＲＮＡを標的とするように設計されている。これらのＡＳＯのヌクレオチド配列を以下の表２に示す。
【0112】
（表２）ｒｅｇＲＮＡを標的とする例示的ＡＳＯ配列
【0113】
表３及び４は、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１及びｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ２－２の追加の化学修飾を提供する。
【0114】
（表３）
【0115】
（表４）
【0116】
ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１（配列番号６）は、ヒトＯＴＣ ｅＲＮＡ－１Ａの３’末端から離れた配列１ヌクレオチドに相補的である。配列番号６と少なくとも部分的に重複する、配列番号７～１４は、ヒトＯＴＣ ｅＲＮＡ－１Ａの３’末端に近い配列にも相補的である。ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ２－１（配列番号１５）は、ヒトＯＴＣ ｅＲＮＡ－２Ａの３’末端から９ヌクレオチド離れた配列及びヒトＯＴＣ ｅＲＮＡ－２Ｂの３’末端から８７ヌクレオチド離れた配列に相補的である。配列番号１６と部分的に重複する、配列番号１７は、ヒトＯＴＣ ｅＲＮＡ－２Ａ及びヒトＯＴＣ ｅＲＮＡ－２Ｂの３’末端に近接する配列にも相補的である。ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ２－２（配列番号１６）は、ヒトＯＴＣ ｅＲＮＡ－２Ａの５’末端から５７ヌクレオチド離れた配列に相補的である。
【0117】
ハイブリダイゼーション及びΔＧ
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向鎖上の塩基対の間に水素結合を形成し、それによって二重鎖を形成すると理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）に関して記載される場合が多い。生理学的条件Ｔｍでは、親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１３：５１５－５３７）。標準状態Ｇｉｂｂｓ自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性のより正確な表現であり、ΔＧ°＝－ＲＴＩｎ（Ｋｄ）による反応の解離定数（Ｋｄ）に関連する（式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である）。従って、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映する。ΔＧ°は、水溶液濃度が１Ｍ、ｐＨが７、及び温度が３７℃の場合の反応に伴う自由エネルギーである。オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションは自発的反応であり、自発的反応の場合、ΔＧ°はゼロより小さい。ΔＧ°は、実験的に、例えば、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｃｈｅｍ，Ｃｏｍｍ．３６－３８及びＨｏｌｄｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載の等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）法を用いて測定され得る。当業者には、市販の装置がΔＧ°測定のために入手可能であることは公知である。ΔＧ°は、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６及びＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５に記載の適切に誘導された熱力学的パラメータを用いる、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃｅｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：１４６０－１４６５に記載の最近傍モデルを用いて数値的に推定され得る。ハイブリダイゼーションによってその意図される核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態Ｇｉｂｂｓ自由エネルギーΔＧ°によって測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドに対して、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、例えば－２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のような－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲より低い推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、例えば、－１２～－４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１５～－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１６～－２７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、または－１８～－２５ｋｃａｌ／ｍｏｌの推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が対向鎖上の塩基対の間に水素結合を形成し、それによって二重鎖を形成すると理解されるべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度（Ｔｍ）に関して記載される場合が多い。生理学的条件Ｔｍでは、親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ ａｎｄ Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ１３：５１５－５３７）。標準状態Ｇｉｂｂｓ自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性のより正確な表現であり、ΔＧ°＝－ＲＴＩｎ（Ｋｄ）による反応の解離定数（Ｋｄ）に関連する（式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である）。従って、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映する。ΔＧ°は、水溶液濃度が１Ｍ、ｐＨが７、及び温度が３７℃の場合の反応に伴う自由エネルギーである。オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションは自発的反応であり、自発的反応の場合、ΔＧ°はゼロより小さい。ΔＧ°は、実験的に、例えば、Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９６５，Ｃｈｅｍ，Ｃｏｍｍ．３６－３８及びＨｏｌｄｇａｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙに記載の等温滴定熱量測定法（ＩＴＣ）法を用いて測定され得る。当業者には、市販の装置がΔＧ°測定のために入手可能であることは公知である。ΔＧ°は、Ｓｕｇｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１２１１－１１２１６及びＭｃＴｉｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３：５３８８－５４０５に記載の適切に誘導された熱力学的パラメータを用いる、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃｅｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：１４６０－１４６５に記載の最近傍モデルを用いて数値的に推定され得る。ハイブリダイゼーションによってその意図される核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０～３０ヌクレオチド長であるオリゴヌクレオチドについて－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満の推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態Ｇｉｂｂｓ自由エネルギーΔＧ°によって測定される。オリゴヌクレオチドは、８～３０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドに対して、－１５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、例えば－２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、例えば－２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満のような－１０ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲より低い推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、－１０～－６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、例えば、－１２～－４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１５～－３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、－１６～－２７ｋｃａｌ／ｍｏｌ、または－１８～－２５ｋｃａｌ／ｍｏｌの推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。
【0118】
二重鎖領域
語句「二重鎖領域（ｄｕｐｌｅｘ ｒｅｇｉｏｎ）」とは、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成、または相補的もしくは実質的に相補的であるポリヌクレオチド鎖の間の安定化された二重鎖を可能にする任意の他の様式のいずれかによって、互いに塩基対を形成する２つの相補的もしくは実質的に相補的なポリヌクレオチド中の領域を指す。例えば、２１のヌクレオチド単位を有するポリヌクレオチド鎖は、「二本鎖領域」が１９の塩基対であるように、まだ各鎖上の１９の塩基のみが相補的または十分に相補的である別の２１のヌクレオチド単位のポリヌクレオチドと塩基対を形成し得る。残りの塩基は、例えば、５’及び／または３’のオーバーハングとして存在し得る。さらに、二本鎖内で１００％の相補性は必要ではなく、実質的な相補性が二本鎖内で許容可能である。実質的な相補性とは、７０％以上の相補性を指す。例えば、１９の塩基対から成る二本鎖でのミスマッチは９４．７％の相補性をもたらし、十分に相補的な二本鎖領域を与える。二本鎖領域は、２つの別個のオリゴヌクレオチド鎖によって、ならびに二本鎖領域を含むヘアピン構造を形成し得る単一のオリゴヌクレオチド鎖によって形成され得る。
語句「二重鎖領域（ｄｕｐｌｅｘ ｒｅｇｉｏｎ）」とは、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対形成、または相補的もしくは実質的に相補的であるポリヌクレオチド鎖の間の安定化された二重鎖を可能にする任意の他の様式のいずれかによって、互いに塩基対を形成する２つの相補的もしくは実質的に相補的なポリヌクレオチド中の領域を指す。例えば、２１のヌクレオチド単位を有するポリヌクレオチド鎖は、「二本鎖領域」が１９の塩基対であるように、まだ各鎖上の１９の塩基のみが相補的または十分に相補的である別の２１のヌクレオチド単位のポリヌクレオチドと塩基対を形成し得る。残りの塩基は、例えば、５’及び／または３’のオーバーハングとして存在し得る。さらに、二本鎖内で１００％の相補性は必要ではなく、実質的な相補性が二本鎖内で許容可能である。実質的な相補性とは、７０％以上の相補性を指す。例えば、１９の塩基対から成る二本鎖でのミスマッチは９４．７％の相補性をもたらし、十分に相補的な二本鎖領域を与える。二本鎖領域は、２つの別個のオリゴヌクレオチド鎖によって、ならびに二本鎖領域を含むヘアピン構造を形成し得る単一のオリゴヌクレオチド鎖によって形成され得る。
【0119】
ｄｓＲＮＡは、相補的であり、かつｄｓＲＮＡが使用される条件下でハイブリダイズして二重鎖構造を形成する２つのＲＮＡ鎖を含む。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、標的配列に対して実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である相補性の領域を含む。標的配列は、ｅＲＮＡまたはｐａＲＮＡなどのＯＴＣまたはＳｅｒｐｉｎｇ１ ｒｅｇＲＮＡの配列に由来し得る。もう一方の鎖（センス鎖）は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、その結果、２つの鎖は、適切な条件下で組み合わされると、ハイブリダイズし、二重鎖構造を形成する。本明細書の他の箇所に記載されるように、及び当技術分野で公知であるように、ｄｓＲＮＡの相補配列は、別個のオリゴヌクレオチド上にあるのとは対照的に、単一の核酸分子の自己相補的領域として含まれてもよい。一般に、二重鎖構造は、１５～５０塩基対の長さ、例えば、１５～５０、１５～４９、１５～４８、１５～４７、１５～４６、１５～４５、１５～４４、１５～４３、１５～４２、１５～４１、１５～４０、１５～３９、１５～３８、１５～３７、１５～３６、１５～３５、１５～３４、１５～３３、１５～３２、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～５０、１８～４９、１８～４８、１８～４７、１８～４６、１８～４５、１８～４４、１８～４３、１８～４２、１８～４１、１８～４０、１８～３９、１８～３８、１８～３７、１８～３６、１８～３５、１８～３４、１８～３３、１８～３２、１８～３１、１８～３０、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～５０、１９～４９、１９～４８、１９～４７、１９～４６、１９～４５、１９～４４、１９～４３、１９～４２、１９～４１、１９～４０、１９～３９、１９～３８、１９～３７、１９～３６、１９～３５、１９～３４、１９～３３、１９～３２、１９～３１、１９～３０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～５０、２０～４９、２０～４８、２０～４７、２０～４６、２０～４５、２０～４４、２０～４３、２０～４２、２０～４１、２０～４０、２０～３９、２０～３８、２０～３７、２０～３６、２０～３５、２０～３４、２０～３３、２０～３２、２０～３１、２０～３０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～５０、２１～４９、２１～４８、２１～４７、２１～４６、２１～４５、２１～４４、２１～４３、２１～４２、２１～４１、２１～４０、２１～３９、２１～３８、２１～３７、２１～３６、２１～３５、２１～３４、２１～３３、２１～３２、２１～３１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、２１～２２、２２～５０、２２～４９、２２～４８、２２～４７、２２～４６、２２～４５、２２～４４、２２～４３、２２～４２、２２～４１、２２～４０、２２～３９、２２～３８、２２～３７、２２～３６、２２～３５、２２～３４、２２～３３、２２～３２、２２～３１、２２～３０、２２～２９、２２～２８、２２～２７、２２～２６、２２～２５、２２～２４、２２～２３、２３～５０、２３～４９、２３～４８、２３～４７、２３～４６、２３～４５、２３～４４、２３～４３、２３～４２、２３～４１、２３～４０、２３～３９、２３～３８、２３～３７、２３～３６、２３～３５、２３～３４、２３～３３、２３～３２、２３～３１、２３～３０、２３～２９、２３～２８、２３～２７、２３～２６、２３～２５、または２３～２４の間の塩基対の長さである。上記の範囲及び長さの中間の範囲及び長さもまた、本発明の一部であることが企図される。
【0120】
同様に、標的配列に相補性の領域は、１５～５０ヌクレオチドの長さ、例えば、１５～５０、１５～４９、１５～４８、１５～４７、１５～４６、１５～４５、１５～４４、１５～４３、１５～４２、１５～４１、１５～４０、１５～３９、１５～３８、１５～３７、１５～３６、１５～３５、１５～３４、１５～３３、１５～３２、１５～３１、１５～３０、１５～２９、１５～２８、１５～２７、１５～２６、１５～２５、１５～２４、１５～２３、１５～２２、１５～２１、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１８～５０、１８～４９、１８～４８、１８～４７、１８～４６、１８～４５、１８～４４、１８～４３、１８～４２、１８～４１、１８～４０、１８～３９、１８～３８、１８～３７、１８～３６、１８～３５、１８～３４、１８～３３、１８～３２、１８～３１、１８～３０、１８～３０、１８～２９、１８～２８、１８～２７、１８～２６、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１８～２０、１９～５０、１９～４９、１９～４８、１９～４７、１９～４６、１９～４５、１９～４４、１９～４３、１９～４２、１９～４１、１９～４０、１９～３９、１９～３８、１９～３７、１９～３６、１９～３５、１９～３４、１９～３３、１９～３２、１９～３１、１９～３０、１９～３０、１９～２９、１９～２８、１９～２７、１９～２６、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～５０、２０～４９、２０～４８、２０～４７、２０～４６、２０～４５、２０～４４、２０～４３、２０～４２、２０～４１、２０～４０、２０～３９、２０～３８、２０～３７、２０～３６、２０～３５、２０～３４、２０～３３、２０～３２、２０～３１、２０～３０、２０～３０、２０～２９、２０～２８、２０～２７、２０～２６、２０～２５、２０～２４、２０～２３、２０～２２、２０～２１、２１～５０、２１～４９、２１～４８、２１～４７、２１～４６、２１～４５、２１～４４、２１～４３、２１～４２、２１～４１、２１～４０、２１～３９、２１～３８、２１～３７、２１～３６、２１～３５、２１～３４、２１～３３、２１～３２、２１～３１、２１～３０、２１～２９、２１～２８、２１～２７、２１～２６、２１～２５、２１～２４、２１～２３、２１～２２、２２～５０、２２～４９、２２～４８、２２～４７、２２～４６、２２～４５、２２～４４、２２～４３、２２～４２、２２～４１、２２～４０、２２～３９、２２～３８、２２～３７、２２～３６、２２～３５、２２～３４、２２～３３、２２～３２、２２～３１、２２～３０、２２～２９、２２～２８、２２～２７、２２～２６、２２～２５、２２～２４、２２～２３、２３～５０、２３～４９、２３～４８、２３～４７、２３～４６、２３～４５、２３～４４、２３～４３、２３～４２、２３～４１、２３～４０、２３～３９、２３～３８、２３～３７、２３～３６、２３～３５、２３～３４、２３～３３、２３～３２、２３～３１、２３～３０、２３～２９、２３～２８、２３～２７、２３～２６、２３～２５、または２３～２４ヌクレオチドの間の長さであってもよい。上記の範囲及び長さの中間の範囲及び長さもまた、本発明の一部であることが企図される。
【0121】
ＡＳＯの化学修飾
特定の実施形態では、ＡＳＯはＤＮＡのみからなるのではない。特定の実施形態では、ＡＳＯは、天然ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド）に対して少なくとも１つの化学修飾を含む。種々の化学修飾が、本開示のＡＳＯに含まれ得る。修飾は、リボース基における１つ以上の修飾、リン酸基における１つ以上の修飾、核酸塩基における１つ以上の修飾、１つ以上の末端修飾、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、表２に示されるｒｅｇＲＮＡを標的とする例示的なＡＳＯ配列は化学的に修飾される。例えば、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１は、図１８Ａに示されるようなｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ａからｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｈのいずれか１つの修飾を含むように化学修飾され得る。そのような修飾は、限定するものではないが、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－ＭＯＥ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、シチジン上の５－メチル、拘束エチル（ｃＥＴ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、及び／またはホスホジエステル（ＰＯ）結合、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。ＲＮＡの化学修飾は当技術分野で公知であり、例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１３／１７７２４８に記載されている。特定の実施形態では、ＡＳＯ中の各シチジンは、５－メチルにより修飾される。
特定の実施形態では、ＡＳＯはＤＮＡのみからなるのではない。特定の実施形態では、ＡＳＯは、天然ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチド）に対して少なくとも１つの化学修飾を含む。種々の化学修飾が、本開示のＡＳＯに含まれ得る。修飾は、リボース基における１つ以上の修飾、リン酸基における１つ以上の修飾、核酸塩基における１つ以上の修飾、１つ以上の末端修飾、またはそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、表２に示されるｒｅｇＲＮＡを標的とする例示的なＡＳＯ配列は化学的に修飾される。例えば、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１は、図１８Ａに示されるようなｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ａからｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｈのいずれか１つの修飾を含むように化学修飾され得る。そのような修飾は、限定するものではないが、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－ＭＯＥ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、シチジン上の５－メチル、拘束エチル（ｃＥＴ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合、及び／またはホスホジエステル（ＰＯ）結合、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。ＲＮＡの化学修飾は当技術分野で公知であり、例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１３／１７７２４８に記載されている。特定の実施形態では、ＡＳＯ中の各シチジンは、５－メチルにより修飾される。
【0122】
本開示のＡＳＯと共に使用するための種々の化学修飾としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：３’－末端デオキシチミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、高次構造制限ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミデート、ヌクレオチドを含む非天然塩基、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－ホスフェートを含むヌクレオチド、及び５’－ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド。
【0123】
特定の実施形態では、ＡＳＯは、１つ以上の核ＲＮａｓｅ（例えば、エキソソーム複合体またはＲＮａｓｅＨ）に対して耐性であるように化学的に修飾されたＲＮＡポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、全てのヌクレオチド塩基がＡＳＯにおいて修飾される。特定の実施形態では、化学修飾は、β－Ｄ－リボヌクレオシド、２’－修飾ヌクレオシド（例えば、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－ＣＨ３、または２’－フルオロ－アラビノ（ＦＡＮＡ））、二環式糖修飾ヌクレオシド（例えば、拘束エチルまたはロックド核酸（ＬＮＡ）を有する）、及び／または１つ以上の修飾ヌクレオチド間結合（例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合）を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、２’－ＭＯＥ及びホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。特定の実施形態では、ＡＳＯの少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続するヌクレオチドが２’－ＭＯＥによって修飾される。特定の実施形態では、ＡＳＯの各ヌクレオチドは２’－ＭＯＥにより修飾される。特定の実施形態では、ＡＳＯの少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続するヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合である。特定の実施形態では、ＡＳＯの各ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合である。
【0124】
本開示のＡＳＯと共に使用され得るヌクレオチド間結合修飾としては、限定するものではないが、ホスホロチオエート「ＰＳ」（Ｐ（Ｓ））、ホスホロアミデート（Ｐ（ＮＲ１Ｒ２）、例えば、ジメチルアミノホスホロアミデート（Ｐ（Ｎ（ＣＨ３）２））、ホスホノカルボキシレート（Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、例えば、ホスホノアセテート「ＰＡＣＥ」（Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））、チオホスホノカルボキシレート（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、例えば、チオホスホノアセテート、「チオＰＡＣＥ」（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））、アルキルホスホネート（Ｐ（Ｃ１～３アルキル）、例えば、メチルホスホン酸－Ｐ（ＣＨ３）、ボランホスホン酸（Ｐ（ＢＨ３））、及びホスホロジチオエート（Ｐ（Ｓ）２）が挙げられる。
【0125】
特定の実施形態では、ＡＳＯは、５’末端、３’末端、または両方に１つ以上の化学修飾を含む。理論に拘束されることを望むものではないが、ポリヌクレオチドの一方または両方の末端における化学修飾（例えば、ポリリボヌクレオチド）は、ポリヌクレオチドを安定化し得る。特定の実施形態では、ＡＳＯは、ＡＳＯの５’末端の少なくとも１、２、３、４、または５ヌクレオチドに１つ以上の化学修飾を含む。特定の実施形態では、ＡＳＯは、ＡＳＯの３’末端の少なくとも１、２、３、４、または５ヌクレオチドに１つ以上の化学修飾を含む。特定の実施形態では、ＡＳＯは、ＡＳＯの５’末端の少なくとも１、２、３、４、または５ヌクレオチドに１つ以上の化学修飾を含み、ＡＳＯの３’末端の少なくとも１、２、３、４、または５ヌクレオチドに１つ以上の化学修飾を含む。
【0126】
化学構造はまた、書き込みにおいても記載され得る。そのような場合、「Ｍ」は、ＭＯＥを示す。「ｄ」はＤＮＡを示し、「Ｌ」はＬＮＡを示し、「＝」はホスホロチオエート（ＰＳ）結合を示し、「－」はホスホジエステル（ＰＯ）結合を示し；「５Ｃ」は５－メチルシトシンを示し、「ａｇ」は、ＧａｌＮＡｃを示し、「ｔｇ」は、Ｔｅｇ－ＧａｌＮＡｃを示し、「＾」はＦＡＮＡを示す。
【0127】
曖昧さを回避するために、このＬＮＡは、次式を有する：
式中、Ｂは特定の指定された塩基である。
【0128】
【0129】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、配列番号６～１４、１８～３５、３９、４１、７５、７６、７７、７８、８７～１２４または１４３～８９２からなる群から選択される配列及び／または化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１５～１７、３６～３８、６４～７４、１２５～１４２、または８９３～１０２９からなる群から選択される配列及び／または化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、配列番号８７～１２４からなる群から選択される配列及び化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１２５～１４２からなる群から選択される配列及び化学修飾を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、配列番号１０３０～１０７２からなる群から選択される配列及び化学修飾を含む。
【0130】
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定される場合に、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、１つの修飾ヌクレオシド当たり、＋０．５～＋１２℃、例えば、＋１．５～＋１０℃または＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野で公知であり、これには例えば、多数の２’置換ヌクレオシドならびにロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３を参照されたい）（これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、例えば融解温度（Ｔｍ）によって測定される場合に、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、１つの修飾ヌクレオシド当たり、＋０．５～＋１２℃、例えば、＋１．５～＋１０℃または＋３～＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当該技術分野で公知であり、これには例えば、多数の２’置換ヌクレオシドならびにロックド核酸（ＬＮＡ）が挙げられる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３を参照されたい）（これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。
【0131】
糖修飾
本明細書に記載のＡＳＯは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、主に、オリゴヌクレオチドの特定の特性、例えば、親和性及び／またはヌクレアーゼ耐性を改善することを目的として作製されている。そのような修飾としては、リボース環構造が、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）または二環式環（これは、典型的には、リボース環（ＬＮＡ）上のＣ２とＣ４炭素との間に二半径架橋を有する）、または非連結リボース環（これは、典型的には、Ｃ２とＣ３炭素との間に結合を欠く）（例えば、ＵＮＡ）での置換によって修飾される修飾が挙げられる。他の糖修飾ヌクレオシドとしては、例えば、ビシクロヘキソース核酸（ＷＯ２０１１／０１７５２１）または三環式核酸（ＷＯ２０１３／１５４７９８）が挙げられ、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。修飾ヌクレオシドは、糖部分が非糖部分で置き換えられているヌクレオシド、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ核酸の場合も含む。
本明細書に記載のＡＳＯは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、主に、オリゴヌクレオチドの特定の特性、例えば、親和性及び／またはヌクレアーゼ耐性を改善することを目的として作製されている。そのような修飾としては、リボース環構造が、例えば、ヘキソース環（ＨＮＡ）または二環式環（これは、典型的には、リボース環（ＬＮＡ）上のＣ２とＣ４炭素との間に二半径架橋を有する）、または非連結リボース環（これは、典型的には、Ｃ２とＣ３炭素との間に結合を欠く）（例えば、ＵＮＡ）での置換によって修飾される修飾が挙げられる。他の糖修飾ヌクレオシドとしては、例えば、ビシクロヘキソース核酸（ＷＯ２０１１／０１７５２１）または三環式核酸（ＷＯ２０１３／１５４７９８）が挙げられ、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。修飾ヌクレオシドは、糖部分が非糖部分で置き換えられているヌクレオシド、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルホリノ核酸の場合も含む。
【0132】
糖修飾としては、リボース環上の置換基を水素以外の基、またはＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシド中に天然に見出される２’－ＯＨ基に変更することによって行われる修飾も含む。置換基は、例えば、２’、３’、４’または５’位置に導入されてもよい。
【0133】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’ＯＭｅ）部分、２’－Ｏ－メトキシエチル部分、二環式糖部分、ＰＮＡ（例えば、糖リン酸骨格の代わりに反復単位としてアミド結合またはカルボニルメチレン結合によって連結された１つ以上のＮ－（２－アミノエチル）－グリシン単位を含むオリゴヌクレオチド）、ロックドヌクレオシド（ＬＮＡ）（例えば、１つ以上のロックドリボースを含み、２’－デオキシヌクレオチドまたは２’ＯＭｅヌクレオチドの混合物であり得るオリゴヌクレオチド）、ｃ－ＥＴ（例えば、１つ以上のｃＥＴ糖を含むオリゴヌクレオチド）、ｃＭＯＥ（例えば、１つ以上のｃＭＯＥ糖を含むオリゴヌクレオチド）、モルホリノオリゴマー（例えば、１つ以上のホスホロジアミデートモルホリオノオリゴマーを含む骨格を含むオリゴヌクレオチド）、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオシド（例えば、１つ以上の２’－フルオロ－β－Ｄ－アラビノヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド）、ｔｃＤＮＡ（例えば、１つ以上のｔｃＤＮＡ修飾糖を含むオリゴヌクレオチド）、拘束エチル２’－４’架橋核酸（ｃＥｔ）、Ｓ－ｃＥｔ、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）（例えば、１つ以上のＥＮＡ修飾糖を含むオリゴヌクレオチド）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）（例えば、１つ以上のＨＮＡ修飾糖を含むオリゴヌクレオチド）、または三環式類似体（ｔｃＤＮＡ）（例えば、１つ以上のｔｃＤＮＡ修飾糖を含むオリゴヌクレオチド）のいずれか１つなどの修飾糖部分を含む。
【0134】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２－チオウラシル（「２－チオＵ」）、２－チオシトシン（「２－チオＣ」）、４－チオウラシル（「４－チオＵ」）、６－チオグアニン（「６－チオＧ」）、２－アミノアデニン（「２－アミノＡ」）、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルシトシン（「５－メチルＣ」）、５－メチルウラシル（「５－メチルＵ」）、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルウラシル（「５－アリルＵ」）、５－アリルシトシン（「５－アリルＣ」）、５－アミノアリルウラシル（「５－アミノアリルＵ」）、５－アミノアリル－シトシン（「５－アミノアリルＣ」）、脱塩基ヌクレオチド、Ｚ塩基、Ｐ塩基、非構造核酸（「ＵＮＡ」）、イソグアニン（「ｉｓｏＧ」）、及びイソシトシン（「ｉｓｏＣ」）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、チオモルホリノ（Ｃ４Ｈ９ＮＳ）またはチオホスホルアミデートモルホリノ（ＴＭＯ）からなる群から選択される核酸塩基修飾を含む。グリセロール核酸（ＧＮＡ）（グリコール核酸としても公知）の合成は、参照によって本明細書に援用される、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４．４０．１－４．４０．１８，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１０に記載されている。チオホスホロアミデート・モルホリノ・オリゴヌクレオチドの合成は、Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０２０，１４２，３８，１６２４０－１６２５３に記載されている。
【0135】
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨまたは－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）であるか、またはリボース環中の２’炭素と第２炭素との間に架橋を形成し得る２’結合二環、例えばＬＮＡ（２’－４’二環架橋）ヌクレオシドを含む。
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨまたは－ＯＨ以外の置換基を有するヌクレオシド（２’置換ヌクレオシド）であるか、またはリボース環中の２’炭素と第２炭素との間に架橋を形成し得る２’結合二環、例えばＬＮＡ（２’－４’二環架橋）ヌクレオシドを含む。
【0136】
理論に拘束されることを望むものではないが、２’修飾糖は、オリゴヌクレオチドに対する増強された結合親和性及び／または増大されたヌクレアーゼ耐性を提供し得る。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’－アミノ－ＤＮＡ、２’－フルオロ－ＲＮＡ、及び２’－Ｆ－ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えば、Ｆｒｅｉｅｒ ＆ Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９－４４４３及びＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３－２１３、ならびにＤｅｌｅａｖｅｙ ａｎｄ Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１２，１９，９３７（各々が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0137】
ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡヌクレオシド）
「ＬＮＡヌクレオシド」とは、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’及びＣ４’を連結するビラジカル（「２’－４’架橋」とも呼ばれる）を含む２’－糖修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の高次構造を制限またはロックする。言い換えれば、ロックドヌクレオシドとは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオシドである。この構造は、３’－エンド構造の高次構造でリボースを効果的に「ロック」する。オリゴヌクレオチドへのロックドヌクレオシドの付加は、血清中のオリゴヌクレオチドの安定性を高め、オフターゲット効果を減らすことが示されている（Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。これらのヌクレオシドは、架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる場合もある。リボースの高次構造のロックは、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子に対するオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の増強（二重鎖安定化）と関連する。これは、オリゴヌクレオチド／補体二重鎖の融解温度を測定することによって慣用的に決定され得る。例示的なＬＮＡヌクレオシドとしては、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡが挙げられる。
「ＬＮＡヌクレオシド」とは、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’及びＣ４’を連結するビラジカル（「２’－４’架橋」とも呼ばれる）を含む２’－糖修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の高次構造を制限またはロックする。言い換えれば、ロックドヌクレオシドとは、４’－ＣＨ２－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオシドである。この構造は、３’－エンド構造の高次構造でリボースを効果的に「ロック」する。オリゴヌクレオチドへのロックドヌクレオシドの付加は、血清中のオリゴヌクレオチドの安定性を高め、オフターゲット効果を減らすことが示されている（Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。これらのヌクレオシドは、架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる場合もある。リボースの高次構造のロックは、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子に対するオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の増強（二重鎖安定化）と関連する。これは、オリゴヌクレオチド／補体二重鎖の融解温度を測定することによって慣用的に決定され得る。例示的なＬＮＡヌクレオシドとしては、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、例えば（Ｓ）－６’－メチル－ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡが挙げられる。
【0138】
本発明のポリヌクレオチドでの使用のための二環式ヌクレオシドの例としては、限定するものではないが、４’リボシル環原子と２’リボシル環原子との間に架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド剤は、４’から２’への架橋を含む１つ以上の二環式ヌクレオシドを含む。そのような４’から２’への架橋の二環式ヌクレオシドの例としては、限定するものではないが、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（「拘束エチル」または「ｃＥｔ」とも呼ばれる）及び４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第７，３９９，８４５号を参照されたい）；４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，２８３号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２５号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－ＯＮ（ＣＨ３）２－２’（例えば、米国特許公開第２００４／０１７１５７０号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’〔式中、ＲはＨ、Ｃ１～Ｃ１２アルキル、または保護基である〕（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号を参照されたい）；４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８－１３４を参照されたい）；ならびに４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（及びその類似体；例えば、米国特許第８，２７８，４２６号を参照されたい）が挙げられる。前述の各々の内容の全体が、本明細書に参照によって組み込まれる。
【0139】
ロックド核酸ヌクレオチドの調製を教示する追加の代表的な米国特許及び米国特許出願公開には、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２６８，４９０号、同第６，５２５，１９１号、同第６，６７０，４６１号、同第６，７７０，７４８号、同第６，７９４，４９９号、同第６，９９８，４８４号、同第７，０５３，２０７号、同第７，０３４，１３３号、同第７，０８４，１２５号、同第７，３９９，８４５号、同第７，４２７，６７２号、同第７，５６９，６８６号、同第７，７４１，４５７号、同第８，０２２，１９３号、同第８，０３０，４６７号、同第８，２７８，４２５号、同第８，２７８，４２６号、同第８，２７８，２８３号、ＵＳ２００８／００３９６１８、及びＵＳ２００９／００１２２８１が含まれるが、これらに限定されない。
【0140】
例えばα－Ｌ－リボフラノース及びβ－Ｄ－リボフラノース等の１つ以上の立体化学的糖配置を有する前述の任意の二環式ヌクレオシドを調製し得る（内容が参照により本明細書に組み込まれる国際公開ＷＯ９９／１４２２６を参照されたい）。
【0141】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の拘束エチルヌクレオシドを含むように改変され得る。本明細書で使用されるとき、「拘束エチルヌクレオシド」または「ｃＥｔ」とは、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むロックドヌクレオシドである。一実施形態では、拘束エチルヌクレオシドは、本明細書で「Ｓ－ｃＥｔ」と呼ばれるＳ高次構造にある。
【0142】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、１つ以上の「高次構造的に制限されたヌクレオシド」（「ＣＲＮ」）を含み得る。ＣＲＮとは、リボースのＣ２’とＣ４’炭素、またはリボースのＣ３と－－Ｃ５’炭素を接続するリンカーを有するヌクレオシド類似体である。ＣＲＮはリボース環を安定した高次構造にロックし、ｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション親和性を高める。リンカーは、安定性及び親和性のために酸素を最適な位置に配置するのに十分な長さであり、リボース環パッカリングを少なくする。
【0143】
上述の特定のＣＲＮの調製を教示する代表的な刊行物には、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３号、及びＰＣＴ刊行物ＷＯ２０１３／０３６８６８が含まれるが、これらに限定されない。
【0144】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ＵＮＡ（アンロックドヌクレオシド）ヌクレオシドである１つ以上のモノマーを含む。ＵＮＡは、アンロックド非環式ヌクレオシドであり、糖の結合が除去され、アンロックド「糖」残基を形成する。一例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’－Ｃ４’間の結合（すなわち、Ｃ１’炭素とＣ４’炭素の間の共有炭素－酸素－炭素結合）が除去されているモノマーを包含する。別の例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’炭素とＣ３’炭素の間の共有炭素－炭素結合）が除去されている（参照により本明細書に組み込まれる、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒｉｅｓ，５２，１３３－１３４（２００８）、及びＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９を参照されたい）。
【0145】
ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国特許公開には、それぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，３１４，２２７号、ならびに米国特許出願公開２０１３／００９６２８９号、同第２０１３／００１１９２２号、及び同第２０１１／０３１３０２０号が含まれるが、これらに限定されない。
【0146】
リボース分子はまた、シクロプロパン環で修飾されて、トリシクロデオキシ核酸（トリシクロＤＮＡ）を生成し得る。リボース部分は、別の糖、例えば、１，５－アンヒドロヘキシトールと置換してもよく、トレオースと置換してトレオースヌクレオシド（ＴＮＡ）を生成してもよく、またはアラビノースと置換してアラビノヌクレオシドを生成してもよい。リボース分子は、非糖、例えば、シクロヘキセンと置き換えてシクロヘキセンヌクレオシドを生成してもよいし、またはグリコールで置き換えてグリコールヌクレオシドを生成してもよい。
【0147】
ヌクレオシド分子の末端に対する潜在的に安定化する修飾には、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－Ｏ－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３”－リン酸、逆塩基ｄＴ（ｉｄＴ）などが含まれ得る。この修飾の開示は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／００５８６１号に見出され得る。
【0148】
本発明のオリゴヌクレオチドの他の代替の化学組成は、オリゴヌクレオチドの５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣体、例えば、５’末端ホスフェートまたはホスフェート模倣体が挙げられる。適切なホスフェート模倣体は、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１２／０１５７５１１号に開示されている。
【0149】
追加の非限定的な例示的なＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ００／０４７５９９、ＷＯ２００７／１３４１８１、ＷＯ２０１０／０７７５７８、ＷＯ２０１０／０３６６９８、ＷＯ２００７／０９００７１、ＷＯ２００９／００６４７８、ＷＯ２０１１／１５６２０２、ＷＯ２００８／１５４４０１、ＷＯ２００９／０６７６４７、ＷＯ２００８／１５０７２９、Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３－７６，Ｓｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，Ｖｏｌ ７５（５）ｐｐ．１５６９－８１、Ｍｉｔｓｕｏｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００９，３７（４），１２２５－１２３８、ならびにＷａｎ及びＳｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６，５９，９６４５－９６６７（各々が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【0150】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯの長さは、５×ｎ＋５ヌクレオチド（ｎは３以上の整数）であり、５×ｍ位のヌクレオチドはＬＮＡによって修飾されたリボヌクレオチドであり（ｍは１～ｎの整数）、残りの位置のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチルによって修飾されたリボヌクレオチドである。
【0151】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド糖修飾は、２’－Ｏ－Ｃ１～４アルキル、例えば、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）、２’－デオキシ（２’－Ｈ）、２’－Ｏ－Ｃ１～３アルキル－Ｏ－Ｃ１～３アルキル、例えば、２’－メトキシエチル（「２’－ＭＯＥ」）、２’－フルオロ（「２’－Ｆ」）、２’－アミノ（「２’－ＮＨ２」）、２’－アラビノシル（「２’－アラビノ」）ヌクレオチド、２’－Ｆ－アラビノシル（「２’－Ｆ－アラビノ」）ヌクレオチド、２’－ロックド核酸（「ＬＮＡ」）ヌクレオチド、２’－アミド架橋核酸（ＡｍＮＡ）、２’－アンロックド核酸（「ＵＬＮＡ」）ヌクレオチド、Ｌ型の糖（「Ｌ－糖」）、または４’－チオリボシルヌクレオチドである。
【0152】
ミックスマー（Ｍｉｘｍｅｒ）及びギャップマー（Ｇａｐｍｅｒ）
ＡＳＯは、例えば、図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃ、または図１９のＡＳＯによって開示されるパターンで、ミックスマー及び／またはギャップマー構造を有し得る。
ＡＳＯは、例えば、図１８Ａ、図１８Ｂ、図１８Ｃ、または図１９のＡＳＯによって開示されるパターンで、ミックスマー及び／またはギャップマー構造を有し得る。
【0153】
特定の実施形態では、ＡＳＯはミックスマーである。本明細書で使用される場合、「ミックスマー」という用語は、オリゴヌクレオチド配列の少なくとも一部にわたってＤＮＡモノマー及びヌクレオシド類似体モノマーの交互組成物を含むオリゴヌクレオチドを指す。特定の実施形態では、ＡＳＯは、ギャップマー構造に基づくミックスマーであり、ギャップ中にＤＮＡヌクレオチドと２’－ＭＯＥヌクレオチドとの混合物を含んでおり、ウイング中にＲＮＡ配列が隣接している。ミックスマーは、親和性増強ヌクレオチド類似体の混合物を、例えば、非限定的な例において、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡモノマー、２’－アミノ－ＤＮＡモノマー、２’－フルオロ－ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’－フルオロ－ＡＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＩＮＡモノマー、２’－ＭＯＥ－ＲＮＡ（２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ）、２’フルオロ－ＤＮＡ及びＬＮＡを含むように設計され得る。いくつかの実施形態では、ミックスマーは、ＲＮａｓｅ Ｈを補充できない。いくつかの実施形態では、このミックスマーは、ＤＮＡ及び／またはＲＮＡと共に、１つのタイプの親和性増強ヌクレオチド類似体を含む。
【0154】
複数の異なる修飾は、ミックスマー内で間隔を空けて配置されてもよい。例えば、ＡＳＯは、複数のヌクレオチドにおいてＬＮＡ修飾を含んでもよく、残りのヌクレオチドの一部または全部において異なる修飾を含んでもよい。いくつかの実施形態では、任意の２つの隣接するＬＮＡ修飾ヌクレオチドは、少なくとも１、２、３、４、または５ヌクレオチドだけ分離される。ＡＳＯ全体を通して、隣接するＬＮＡ修飾ヌクレオチド間の距離は、一定であってもよく（例えば、任意の２つの隣接するＬＮＡ修飾ヌクレオチドは、１、２、３、４、または５ヌクレオチドだけ分離される）、または可変であってもよい。いくつかの実施形態では、ＡＳＯの長さは、３×ｎ、３×ｎ－１、または３×ｎ－２ヌクレオチド（ｎは６以上の整数）であり、（ａ）（ｉ）位置３×ｍ－２（ｍは１～ｎの整数）のヌクレオチドは、第１の修飾（例えば、ＬＮＡ）を含むリボヌクレオチドである、（ｉｉ）位置３×ｍ－１（ｍは１～ｎの整数）のヌクレオチドは、第１の修飾（例えば、ＬＮＡ）を含むリボヌクレオチドであるか、または（ｉｉｉ）位置３×ｍ（ｍは１～ｎの整数）のヌクレオチドは、第１の修飾（例えば、ＬＮＡ）を含むリボヌクレオチドである；かつ（ｂ）残りの位置のヌクレオチドは、第２の異なる修飾（例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル）を含む。本明細書でｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｄと呼ばれるＡＳＯは、このような構造を有する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯの長さは、２×ｎまたは２×ｎ－１ヌクレオチド（ｎは９以上の整数）であり、ここで（ａ）（ｉ）位置２×ｍ－１（ｍは１～ｎの整数）のヌクレオチドは、第１の修飾（例えば、ＬＮＡ）を含むリボヌクレオチドであるか、または（ｉｉ）位置２×ｍ（ｍは１～ｎの整数）のヌクレオチドは、第１の修飾（例えば、ＬＮＡ）を含むリボヌクレオチドであり；かつ（ｂ）残りの位置のヌクレオチドは、第２の異なる修飾（例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル）を含む。本明細書でｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｅと呼ばれるＡＳＯは、このような構造を有する。同様の修飾パターン、例えば、第１の修飾がまさしく４、５、またはそれ以上のヌクレオチドで繰り返されるパターンも企図される。いくつかの実施形態では、ＡＳＯの長さは、４×ｎ、４×ｎ－１、または４×ｎ－２ヌクレオチド（ｎは６以上の整数）であり、（ａ）（ｉ）位置４×ｍ－２（ｍは１～ｎの整数）のヌクレオチドは、第１の修飾（例えば、ＬＮＡ）を含むリボヌクレオチドであるか、（ｉｉ）位置４×ｍ－１（ｍは１～ｎの整数）のヌクレオチドは、第１の修飾（例えば、ＬＮＡ）を含むリボヌクレオチドであるか、または（ｉｉｉ）位置３×ｍ（ｍは１～ｎの整数）のヌクレオチドは、第１の修飾（例えば、ＬＮＡ）を含むリボヌクレオチドであり；かつ（ｂ）残りの位置のヌクレオチドは、第２の異なる修飾（例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＳＯの長さは、５×ｎ、５×ｎ－１、または５×ｎ－２ヌクレオチド（ｎは６以上の整数）であり、（ａ）（ｉ）位置５×ｍ－２（ｍは１～ｎの整数）のヌクレオチドは、第１の修飾（例えば、ＬＮＡ）を含むリボヌクレオチドであるか、（ｉｉ）位置５×ｍ－１（ｍは１～ｎの整数）のヌクレオチドは、第１の修飾（例えば、ＬＮＡ）を含むリボヌクレオチドであるか、または（ｉｉｉ）位置５×ｍ（ｍは１～ｎの整数）のヌクレオチドは、第１の修飾（例えば、ＬＮＡ）を含むリボヌクレオチドであり；かつ（ｂ）残りの位置のヌクレオチドは、第２の異なる修飾（例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル）を含む。
【0155】
いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、ＡＳＯの５’または３’末端にＧａｌＮＡｃまたはＴｅｇ－ＧａｌＮＡｃ部分をさらに含む。
【0156】
特定の実施形態では、ＡＳＯは、ＲＮＡ配列に隣接する、ＤＮＡ配列（例えば、非修飾ＤＮＡの少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の連続するヌクレオチドを有する）を含む。このような構造は「ギャップマー」として公知であり、内部ＤＮＡ領域は「ギャップ」と呼ばれ、外部ＲＮＡ領域は「ウィング」と呼ばれる（例えば、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１３／１７７２４８を参照されたい）。ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）は、核ＲＮＡｓｅ（例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ）を動員することによって標的ＲＮＡの分解を促進することが公知である。驚くべきことに、本開示において、ギャップマーがｒｅｇＲＮＡ（例えば、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ａ）に結合すれば、同じ配列を有するが、異なる化学修飾を有するｒｅｇＲＮＡ（例えば、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｄ及びｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｈ）と同様、標的遺伝子発現を増大し得ることが発見されている。特定の実施形態では、ＡＳＯは、ＲＮＡ配列に隣接するＤＮＡ配列を含み、ＲＮＡｓｅまたはＲＮＡｓｅ Ｈ媒介性分解を誘導しない。
【0157】
特定の実施形態では、ギャップマーは、約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ギャップは、約７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のヌクレオチド長である。特定の実施形態では、一方または両方のウィングは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のヌクレオチド長である。特定の実施形態では、一方または両方のウィングは、ＲＮＡ修飾、例えば、β－Ｄ－リボヌクレオシド、２’－修飾ヌクレオシド（例えば、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－ＣＨ３、または２’－フルオロ－アラビノ（ＦＡＮＡ））、及び二環式糖修飾ヌクレオシド（例えば、拘束エチルまたはロックド核酸（ＬＮＡ）を有する）を含む。特定の実施形態では、ギャップマー中の各リボヌクレオチドは２’－ＭＯＥによって修飾される。特定の実施形態では、ギャップマーは、１つ以上の修飾されたヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を含む。特定の実施形態では、ギャップマー中の各２つの隣接するヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって連結される。
【0158】
特定の実施形態では、ＡＳＯは、非修飾ＤＮＡの７以上、８以上、９以上、１０以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、または１５以上の連続するヌクレオチドを含まない。いくつかの実施形態では、そのようなＤＮＡ配列は、修飾（例えば、２’－ＭＯＥ修飾）リボヌクレオチドによって、２、３、４、５、またはそれ以上のヌクレオチド毎に破壊される。本明細書でｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｆと呼ばれるＡＳＯは、このような構造を有する。いくつかの実施形態では、ＡＳＯは、リボヌクレオチドのみを含み、デオキシリボヌクレオチドは含まない。
【0159】
ミックスマー及びギャップマーの構造的特徴を組み合わせてもよい。特定の実施形態では、ＡＳＯは、ギャップで第２の修飾が第３の修飾（例えば、デオキシリボヌクレオチド）に変更されていることを除いて、本明細書に開示されるミックスマーの構造と同様の構造を有する（例えば、介在する修飾を有する構造）。本明細書においてｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｃ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－２ｂ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－５ａ、及びｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－６ａと呼ばれるＡＳＯは、このような構造を有する。特定の実施形態では、ＡＳＯは、ギャップにおいてヌクレオチドがミックスマーパターンで修飾されていることを除いて、本明細書に開示されるギャップマーの構造と同様の構造を有する。本明細書でｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｂと呼ばれるＡＳＯは、このような構造を有する。
【0160】
特定の実施形態では、ＡＳＯは、リガンド部分、例えば、対象の組織または器官を特異的に標的とするリガンド部分をさらに含む。例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）は肝臓を特異的に標的とする。特定の実施形態では、リガンド部分は、ＧａｌＮＡｃを含む。特定の実施形態では、リガンド部分は、３クラスターＧａｌＮＡｃ部分（一般にＧＡｌＮＡｃ３と示される）を含む。他のタイプのＧａｌＮＡｃ部分は、ＧＡｌＮＡｃ１、ＧＡｌＮＡｃ２、またはＧＡｌＮＡｃ４と表記される、１クラスター、２クラスター、または４クラスターのＧＡｌＮＡｃである。特定の実施形態では、リガンド部分は、ＧａｌＮＡｃ１、ＧＡＬＮＡｃ２、ＧＡｌＮＡｃ３、またはＧａｌＮＡｃ４を含む。
【0161】
医薬組成物
特定の実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、医薬組成物に存在し得る。医薬組成物は、種々の薬物送達システムにおける使用のために処方され得る。１つ以上の薬学的に許容される賦形剤または担体もまた、適切な処方のために組成物に含まれてもよい。本開示における使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５に見出される。薬剤送達のための方法の簡潔な論評については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３，１９９０）を参照されたい。
特定の実施形態では、本明細書に開示されるＡＳＯは、医薬組成物に存在し得る。医薬組成物は、種々の薬物送達システムにおける使用のために処方され得る。１つ以上の薬学的に許容される賦形剤または担体もまた、適切な処方のために組成物に含まれてもよい。本開示における使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．，１９８５に見出される。薬剤送達のための方法の簡潔な論評については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３，１９９０）を参照されたい。
【0162】
核酸を送達するのに適した例示的な担体及び医薬製剤は、Ｄａｒｙｍａｎｏｖ ａｎｄ Ｒｅｉｎｅｋｅ（２０１８）Ｆｒｏｎｔ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．９：９７１；Ｂａｒｂａ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ １１（８）：３６０；Ｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｌｉｆｅ（Ｂａｓｅｌ）９（３）：５９に記載されている。ＡＳＯにコンジュゲートしたリガンド部分の存在は、リガンド部分によって標的とされる組織または器官への送達のための担体の必要性を回避し得ることが理解される。
【0163】
細胞、例えば、対象、例えば、ヒト対象、例えば、それを必要とする対象、例えば、ＯＴＣ関連障害を有する対象内の細胞に対する本発明のオリゴヌクレオチドの送達は、多くの異なる方法で達成され得る。例えば、送達は、インビトロまたはインビボのいずれかで、本発明のオリゴヌクレオチドを細胞と接触させることによって行ってもよい。インビボ送達はまた、オリゴヌクレオチドを含む組成物を対象に投与することによって直接実施され得る。これらの代替については、以下でさらに考察される。
【0164】
一般に、核酸分子を送達する任意の方法（インビトロまたはインビボ）は、本発明のオリゴヌクレオチドと共に使用するように適合してもよい（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ Ｒ Ｌ．，（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９－１４４及びＷＯ９４／０２５９５を参照されたい）。インビボ送達の場合、オリゴヌクレオチド分子を送達するために考慮すべき要因としては、例えば、送達される分子の生物学的安定性、非特異的効果の防止、及び標的組織における送達される分子の蓄積が挙げられる。オリゴヌクレオチドの非特異的効果は、局所投与によって、例えば、組織への直接注射もしくは移植によって、または調製物を局所投与することによって最小限に抑えてもよい。治療部位への局所投与は、薬剤の局所濃度を最大化し、さもなければ薬剤によって害される可能性があるか、または薬剤を分解する可能性がある全身組織への薬剤の曝露を制限し、そしてより低い総用量のオリゴヌクレオチド分子の投与を可能にする。
【0165】
疾患の治療のためにオリゴヌクレオチドを全身投与するために、オリゴヌクレオチドは、代替核酸塩基、代替糖部分、及び／または代替ヌクレオシド間結合を含んでもよいし、または代替的には薬物送達システムを使用して送達され；両方の方法とも、インビボでのエンド及びエキソヌクレアーゼによるオリゴヌクレオチドの急速な分解を防ぐように作用する。オリゴヌクレオチドまたは医薬担体の修飾はまた、オリゴヌクレオチド組成物の標的組織への標的化を可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避し得る。オリゴヌクレオチド分子は、コレステロールなどの親油性基への化学的コンジュゲーションによって修飾され、細胞への取り込みを促進し、分解を防ぎ得る。代替の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子、脂質ナノ粒子、ポリプレックスナノ粒子、リポプレックスナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達システムなどの薬物送達システムを使用して送達され得る。正に帯電したカチオン性送達システムは、オリゴヌクレオチド分子（負に帯電）の結合を促進し、また、負に帯電した細胞膜での相互作用をも増強して、細胞によるオリゴヌクレオチドの効率的な取り込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、オリゴヌクレオチドに結合するか、またはオリゴヌクレオチドを包むベシクルまたはミセルを形成するように誘導され得る。ベシクルまたはミセルの形成は、全身投与された場合にオリゴヌクレオチドの分解をさらに防ぐ。一般に、当該技術分野で知られている核酸の送達の任意の方法は、本発明のオリゴヌクレオチドの送達に適応可能であり得る。カチオン性オリゴヌクレオチド複合体を作製及び投与するための方法は、当業者の能力の範囲内である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｄ Ｒ．，ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１－７６６；Ｖｅｒｍａ，Ｕ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１－１３００；Ａｒｎｏｌｄ，Ａ Ｓ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７－２０５を参照されたい）。オリゴヌクレオチドの全身送達に有用な薬物送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｄ Ｒ．，ｅｔ ａｌ（２００３）、前出；Ｖｅｒｍａ，Ｕ Ｎ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）、前出）、オリゴフェクタミン、「固体核酸脂質粒子」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ｔ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，Ｐ Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１－３２８；Ｐａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７－１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ Ｍ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ １６ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ；Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２－４８７）、及びポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，Ｄ Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１－６７；Ｙｏｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９－１８０４）が挙げられる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。オリゴヌクレオチド及びシクロデキストリンの投与方法及び医薬組成物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，４２７，６０５号に見出され得る。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ポリプレックスまたはリポプレックスナノ粒子によって送達される。オリゴヌクレオチド及びポリプレックスナノ粒子及びリポプレックスナノ粒子の投与方法及び医薬組成物は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２０１７／０１２１４５４号；同第２０１６／０３６９２６９号；同第２０１６／０２７９２５６号；同第２０１６／０２５１４７８号；同第２０１６／０２３０１８９号；同第２０１５／０３３５７６４号；同第２０１５／０３０７５５４号；同第２０１５／０１７４５４９号；同第２０１４／０３４２００３号；同第２０１４／０１３５３７６号；及び同第２０１３／０３１７０８６号に見出し得る。
【0166】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物は、追加の治療薬と組み合わせて投与され得る。追加の治療法の例には、キニジン及び／またはナトリウムチャネル遮断薬などの標準治療の抗てんかん薬が含まれる。さらに、本明細書に記載の化合物は、ケトン食療法などの推奨されるライフスタイルの変更と組み合わせて投与してもよい。
【0167】
膜分子アセンブリの送達方法
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、当該技術分野で公知のポリマー、生分解性微粒子、またはマイクロカプセル送達デバイスを含む様々な膜分子アセンブリ送達方法を使用して送達してもよい。例えば、コロイド分散系を、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤の標的化送達に使用してもよい。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベース系が挙げられる。リポソームは、インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして有用な人工膜ベシクルである。０．２～４．０μｍの範囲のサイズの大きな単層ベシクル（ＬＵＶ）は、大きな高分子を含む水性緩衝液のかなりの割合をカプセル化し得ることが示されている。リポソームは、有効成分の作用部位への導入及び送達に有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似しているため、リポソームを組織に適用すると、リポソーム二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進むにつれて、オリゴヌクレオチドを含む内部の水性内容物が細胞に送達され、そこでオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡに特異的に結合し得る。場合によっては、リポソームはまた、例えば、オリゴヌクレオチドを特定の細胞型に誘導するために、特異的に標的化される。リポソームの組成は、通常、リン脂質の組み合わせであり、通常、ステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質もまた使用され得る。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、及び二価陽イオンの存在に依存する。
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、当該技術分野で公知のポリマー、生分解性微粒子、またはマイクロカプセル送達デバイスを含む様々な膜分子アセンブリ送達方法を使用して送達してもよい。例えば、コロイド分散系を、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド剤の標的化送達に使用してもよい。コロイド分散系としては、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質ベース系が挙げられる。リポソームは、インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして有用な人工膜ベシクルである。０．２～４．０μｍの範囲のサイズの大きな単層ベシクル（ＬＵＶ）は、大きな高分子を含む水性緩衝液のかなりの割合をカプセル化し得ることが示されている。リポソームは、有効成分の作用部位への導入及び送達に有用である。リポソーム膜は生体膜と構造的に類似しているため、リポソームを組織に適用すると、リポソーム二重層は細胞膜の二重層と融合する。リポソームと細胞の融合が進むにつれて、オリゴヌクレオチドを含む内部の水性内容物が細胞に送達され、そこでオリゴヌクレオチドは標的ＲＮＡに特異的に結合し得る。場合によっては、リポソームはまた、例えば、オリゴヌクレオチドを特定の細胞型に誘導するために、特異的に標的化される。リポソームの組成は、通常、リン脂質の組み合わせであり、通常、ステロイド、特にコレステロールとの組み合わせである。他のリン脂質または他の脂質もまた使用され得る。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、及び二価陽イオンの存在に依存する。
【0168】
オリゴヌクレオチドを含むリポソームは、様々な方法で調製され得る。一例では、リポソームの脂質成分を界面活性剤に溶解して、脂質成分とミセルを形成する。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質コンジュゲートであってもよい。界面活性剤は、高い臨界ミセル濃度を有し、非イオン性であってもよい。例示的な界面活性剤には、コレート、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコレート、及びラウロイルサルコシンが含まれる。次いで、オリゴヌクレオチド製剤が、脂質成分を含むミセルに添加される。脂質上のカチオン性基はオリゴヌクレオチドと相互作用し、オリゴヌクレオチドの周りで凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、例えば透析によって界面活性剤を除去して、オリゴヌクレオチドのリポソーム製剤を得る。
【0169】
必要に応じて、凝縮反応中に、例えば、制御された添加により、凝縮を助ける担体化合物を添加してもよい。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）であってもよい。凝縮を促進するようにｐＨを調整してもよい。
【0170】
送達ビヒクルの構造成分としてのポリヌクレオチド／カチオン性脂質複合体を組み込む安定したポリヌクレオチド送達ビヒクルを生成するための方法は、例えば、全内容が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９６／３７１９４にさらに記載されている。リポソーム形成はまた、Ｆｅｉｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７；米国特許第４，８９７，３５５号；米国特許第５，１７１，６７８号；Ｂａｎｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９６５）Ｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３：２３８；Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９７９）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ５５７：９；Ｓｚｏｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５：４１９４；Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ７７５：１６９；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ７２８：３３９；及びＦｕｋｕｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１１５：７５７に記載される例示的な方法の１つ以上の態様を含み得る。送達ビヒクルとして使用するための適切なサイズの脂質凝集体を調製するために一般的に使用される技術には、超音波処理及び凍結融解プラス押し出しが含まれる（例えば、Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ８５８：１６１．を参照されたい）。マイクロ流動化は、一貫して小さく（５０～２００ｎｍ）、比較的均一な凝集体が必要な場合に使用され得る（Ｍａｙｈｅｗ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ７７５：１６９）。これらの方法は、オリゴヌクレオチド製剤をリポソームにパッケージングするのに容易に適合される。
【0171】
リポソームは大きく２つのクラスに分類される。カチオン性リポソームは、負に帯電した核酸分子と相互作用して安定した複合体を形成する正に帯電したリポソームである。正に帯電した核酸／リポソーム複合体は負に帯電した細胞表面に結合し、エンドソームに取り込まれる。エンドソーム内の酸性ｐＨにより、リポソームは破裂し、その内容物を細胞質に放出する（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１４７：９８０－９８５）。
【0172】
ｐＨ感受性または負に帯電したリポソームは、核酸と複合体を形成するのではなく、核酸を捕捉する。核酸と脂質の両方が同様に帯電しているため、複合体形成ではなく反発が発生する。それにもかかわらず、一部の核酸はこれらのリポソームの水性内部に閉じ込められる。ｐＨ感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードする核酸を培養中の細胞単層に送達するために使用されている。外因性遺伝子の発現が標的細胞で検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９：２６９－２７４）。
【0173】
リポソーム組成物の１つの主要なタイプには、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方、アニオン性融合性リポソームは、主にジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、大豆ＰＣ、及び卵ＰＣから形成される。別のタイプは、リン脂質及び／またはホスファチジルコリン及び／またはコレステロールの混合物から形成される。
【0174】
インビトロ及びインビボで細胞にリポソームを導入する他の方法の例としては、米国特許第５，２８３，１８５号；米国特許第５，１７１，６７８号；ＷＯ９４／００５６９；ＷＯ９３／２４６４０；ＷＯ９１／１６０２４；Ｆｅｉｇｎｅｒ，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５５０；Ｎａｂｅｌ，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１１３０７；Ｎａｂｅｌ，（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．３：６４９；Ｇｅｒｓｈｏｎ，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：７１４３；及びＳｔｒａｕｓｓ，（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：４１７が挙げられる。
【0175】
非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含むシステムもまた、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性を判定するために調べられている。ＮＯＶＡＳＯＭＥ（商標）Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）及びＮＯＶＡＳＯＭＥ（商標）ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポリン－Ａをマウスの皮膚の真皮に送達した。結果は、そのような非イオン性リポソームシステムが、皮膚の異なる層へのシクロスポリンＡの沈着を促進するのに効果的であることを示した（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ． Ｓｃｉ．，４（６）：４６６）。
【0176】
リポソームはまた、立体的に安定化されたリポソームであり得、そのような特殊な脂質を欠くリポソームと比較して、循環寿命の延長をもたらす１つ以上の特殊な脂質を含む。立体的に安定化されたリポソームの例は、リポソームの小胞形成脂質部分の一部が、（Ａ）モノシアロガングリオシドＧＭ１などの１つ以上の糖脂質を含むか、または（Ｂ）１つ以上の親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分で誘導体化されているリポソームである。いかなる特定の理論に拘束されることをも望まないが、少なくともガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含む立体的に安定化されたリポソームについて、これらの立体的に安定化されたリポソームの増強された循環半減期は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞への取り込みの減少に由来すると当該技術分野では考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２３：４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：３７６５）。
【0177】
１つ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが当該技術分野で知られている。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，（１９８７），５０７：６４）は、リポソームの血中半減期を改善するモノシアロガングリオシドＧＭ１、ガラクトセレブロシド硫酸、及びホスファチジルイノシトールの能力を報告した。これらの発見は、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，（１９８８），８５：６９４９）によって、詳しく解説された。両方ともＡｌｌｅｎらに対する米国特許第４，８３７，０２８号及びＷＯ８８／０４９２４は、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームを開示している。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂら）は、スフィンゴミエリンを含むリポソームを開示している。１，２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームは、ＷＯ９７／１３４９９（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ）に開示されている。
【0178】
一実施形態では、カチオン性リポソームが使用される。カチオン性リポソームは、細胞膜に融合できるという利点がある。非カチオン性リポソームは、原形質膜と効率的に融合することはできないが、インビボでマクロファージに取り込まれ、オリゴヌクレオチドをマクロファージに送達するために使用され得る。
【0179】
リポソームのさらなる利点としては、天然リン脂質から得られるリポソームは生体適合性及び生分解性であること；リポソームは、広範囲の水溶性及び脂溶性薬物を組み込むことができること；リポソームは、内部区画にカプセル化されたオリゴヌクレオチドを代謝及び分解から保護することができること；が挙げられる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，”Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な考慮事項は、脂質の表面電荷、ベシクルのサイズ、及びリポソームの水量である。
【0180】
正に帯電した合成カチオン性脂質、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を使用して、核酸と自発的に相互作用する小さなリポソームを形成し、組織培養細胞の細胞膜の負に帯電した脂質と融合してオリゴヌクレオチドを送達できる脂質－核酸複合体を形成し得る（例えば、Ｆｅｉｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８：７４１３－７４１７、ならびにＤＯＴＭＡ及びそのＤＮＡでの使用の説明については、米国特許第４，８９７，３５５号を参照されたい）。
【0181】
ＤＯＴＭＡ類似体である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）をリン脂質と組み合わせて使用すると、ＤＮＡ複合体化ベシクルを形成できる。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）は、負に帯電したポリヌクレオチドと自発的に相互作用して複合体を形成する正に帯電したＤＯＴＭＡリポソームを含む生体組織培養細胞に高度にアニオン性の核酸を送達するための効果的な薬剤である。十分な正に帯電したリポソームが使用される場合、得られる複合体の正味の電荷も正になる。このようにして調製された正に帯電した複合体は、負に帯電した細胞表面に自発的に付着し、原形質膜と融合し、機能性核酸を例えば組織培養細胞に効率的に送達する。別の市販のカチオン性脂質である１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３，３－（トリメチルアンモニア）プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）は、オレオイル部分がエーテル結合ではなくエステルによって連結されているという点でＤＯＴＭＡとは異なる。
【0182】
他の報告されたカチオン性脂質化合物としては、例えば、二種類の脂質のいずれかにコンジュゲートされたカルボキシスペルミンを含む種々の部分にコンジュゲートされた化合物が挙げられ、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタオレオイルアミド（「ＤＯＧＳ」）（ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標），Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン５－カルボキシスペルミル－アミド（「ＤＰＰＥＳ」）（例えば、米国特許第５，１７１，６７８号を参照されたい）などの化合物を含む。
【0183】
別のカチオン性脂質コンジュゲートは、ＤＯＰＥと組み合わせてリポソームに製剤化されたコレステロール（「ＤＣ－Ｃｈｏｌ」）による脂質の誘導体化を含む（Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：２８０を参照されたい）。ポリリジンをＤＯＰＥにコンジュゲートさせることによって作製されたリポポリリジンは、血清の存在下でのトランスフェクションに有効であることが報告されている（Ｚｈｏｕ，Ｘ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １０６５：８）。ある特定の細胞株では、コンジュゲートされたカチオン性脂質を含むこれらのリポソームは、ＤＯＴＭＡを含む組成物よりも毒性が低く、より効率的なトランスフェクションを提供すると言われている。他の市販のカチオン性脂質製品としては、ＤＭＲＩＥ及びＤＭＲＩＥ－ＨＰ（Ｖｉｃａｌ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）及びリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）が挙げられる。オリゴヌクレオチドの送達に適した他のカチオン性脂質はＷＯ９８／３９３５９及びＷＯ９６／３７１９４に記載される。
【0184】
リポソーム製剤は局所投与に特に適しており、リポソームは他の製剤に比べていくつかの利点を示す。そのような利点としては、投与された薬物の高い全身吸収に関連する副作用の減少、所望の標的での投与された薬物の蓄積の増大、及びオリゴヌクレオチドを皮膚に投与する能力が挙げられる。いくつかの実施において、リポソームは、オリゴヌクレオチドを表皮細胞に送達するために、また、皮膚組織、例えば、皮膚へのオリゴヌクレオチドの浸透を増強するためにも使用される。例えば、リポソームは局所的に適用してもよい。リポソームとして製剤化された薬物の皮膚への局所送達が文書化されている（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ｖｏｌ．２，４０５－４１０ ａｎｄ ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８：２５９－２６５；Ｍａｎｎｉｎｏ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ Ｆｏｕｌｄ－Ｆｏｇｅｒｉｔｅ，Ｓ．，（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２－６９０；Ｉｔａｎｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ ５６：２６７－２７６；Ｎｉｃｏｌａｕ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１５７－１７６；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ，Ｒ．Ｍ．ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｄ．（１９８３）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：５１２－５２７；Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｙ．ａｎｄ Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８５１－７８５５を参照されたい）。
【0185】
非イオン性リポソームシステム、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールを含むシステムもまた、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性を判定するために調べられている。ＮＯＶＡＳＯＭＥ Ｉ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）及びＮＯＶＡＳＯＭＥ ＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、薬物をマウスの皮膚の真皮に送達した。オリゴヌクレオチドを含むそのような製剤は、皮膚障害を治療するのに有用である。
【0186】
リポソームの標的化はまた、例えば、臓器特異性、細胞特異性、及びオルガネラ特異性に基づいて可能であり、当該技術分野で知られている。リポソーム標的化送達システムの場合、リポソーム二重層との安定した会合で標的化リガンドを維持するために、脂質基をリポソームの脂質二重層に組み込んでもよい。脂質鎖を標的リガンドに結合するために、様々な連結基を使用してもよい。追加の方法は当該技術分野で知られており、例えば、米国特許出願公開第２００６００５８２５５号に記載されており、その連結基は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0187】
オリゴヌクレオチドを含むリポソームは、高度に変形可能にし得る。そのような変形能は、リポソームがリポソームの平均半径よりも小さい細孔を貫通することを可能にし得る。例えば、トランスファーソームはさらに別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補である高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、非常に変形しやすいため、液滴よりも小さい細孔を容易に貫通できる脂肪滴として描写され得る。トランスファーソームは、標準的なリポソーム組成物に通常は界面活性剤である表面エッジ活性化因子を加えることによって作ってもよい。オリゴヌクレオチドを含むトランスファーソームは、オリゴヌクレオチドを皮膚のケラチノサイトに送達するために、例えば、感染によって皮下に送達してもよい。無傷の哺乳動物の皮膚を通過するために、脂質ベシクルは、適切な経皮勾配の影響下で、それぞれが直径が５０ｎｍ未満の一連の微細な細孔を通過しなければならない。さらに、脂質の特性に起因して、これらのトランスファーソームは、自己最適化（例えば皮膚において、細孔の形状に適応）、自己修復し得、断片化することなく、しばしば自己ローディングで標的に到達し得る場合が多い。トランスファーソームは、血清アルブミンを皮膚に送達するために使用されている。トランスファーソームを介した血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射と同じくらい効果的であることが示されている。
【0188】
本発明に適した他の製剤は、参照によの全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／０８８８９１号、ＷＯ２００９／１３２１３１号、及びＷＯ２００８／０４２９７３号に記載されている。
【0189】
界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）及びリポソームなどの製剤に広く使用されている。天然と合成の両方の多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類及びランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）の使用によるものである。親水性基（「ヘッド」としても知られる）の性質は、製剤に使用されるさまざまな界面活性剤を分類するための最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【0190】
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、それは非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品及び化粧品に幅広く使用されており、幅広いｐＨ値で使用可能である。一般に、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２～約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤には、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、及びエトキシル化エステルなどの非イオン性エステルが含まれる。非イオン性アルカノールアミド及びエーテル、例えば、脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーもこのクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤クラスの最も人気のあるメンバーである。
【0191】
界面活性剤分子が水に溶解または分散したときに負電荷を帯びている場合、その界面活性剤はアニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、石鹸などのカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルサルフェート及びエトキシル化アルキルサルフェートなどの硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート及びスルホスクシネート、及びホスフェートが挙げられる。アニオン性界面活性剤クラスの最も重要なメンバーは、硫酸アルキル及び石鹸である。
【0192】
界面活性剤分子が水に溶解または分散したときに正電荷を帯びている場合、その界面活性剤はカチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤には、第四級アンモニウム塩及びエトキシル化アミンが含まれる。第四級アンモニウム塩は、このクラスで最も使用されているメンバーである。
【0193】
界面活性剤分子が正または負のいずれかの電荷を帯びる能力を持っている場合、界面活性剤は両性として分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタイン、及びホスファチドが含まれる。
【0194】
医薬品、製剤、及びエマルションにおける界面活性剤の使用は考察されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【0195】
本発明の方法で使用するためのオリゴヌクレオチドはまた、ミセル製剤として提供され得る。ミセルは、両親媒性分子が、分子の全ての疎水性部分が内側に向けられ、親水性部分が周囲の水相と接触したままになるように球形構造に配置される特定のタイプの分子集合体である。環境が疎水性である場合、逆の配置が存在する。
【0196】
脂質ナノ粒子ベースの送達方法
本発明におけるオリゴヌクレオチドは、脂質製剤、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、または他の核酸－脂質粒子に完全にカプセル化され得る。ＬＮＰは、静脈内（ｉｖ）注射後に循環寿命が延長され、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するので、全身投与に有用である。ＬＮＰには、「ｐＳＰＬＰ」が含まれ、これには、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０３６８３号に記載されているカプセル化された縮合剤－核酸複合体が含まれる。本発明の粒子は、典型的には、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に無毒である。さらに、核酸は、本発明の核酸－脂質粒子中に存在するとき、ヌクレアーゼによる分解に対して水溶液中で耐性がある。核酸－脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，５３４，４８４号；同第６，５８６，４１０号；同第６，８１５，４３２号；米国公開第２０１０／０３２４１２０号及びＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４０９６４号に開示されている。
本発明におけるオリゴヌクレオチドは、脂質製剤、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、または他の核酸－脂質粒子に完全にカプセル化され得る。ＬＮＰは、静脈内（ｉｖ）注射後に循環寿命が延長され、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）に蓄積するので、全身投与に有用である。ＬＮＰには、「ｐＳＰＬＰ」が含まれ、これには、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０３６８３号に記載されているカプセル化された縮合剤－核酸複合体が含まれる。本発明の粒子は、典型的には、約５０ｎｍ～約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ～約１１０ｎｍ、最も典型的には約７０ｎｍ～約９０ｎｍの平均直径を有し、実質的に無毒である。さらに、核酸は、本発明の核酸－脂質粒子中に存在するとき、ヌクレアーゼによる分解に対して水溶液中で耐性がある。核酸－脂質粒子及びそれらの調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号；同第５，９８１，５０１号；同第６，５３４，４８４号；同第６，５８６，４１０号；同第６，８１５，４３２号；米国公開第２０１０／０３２４１２０号及びＰＣＴ公開第ＷＯ９６／４０９６４号に開示されている。
【0197】
カチオン性脂質の非限定的な例としては、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリール－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－－（Ｉ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレオキシ－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノレオキシ－３－モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノレオイル－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノレイルチオ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノレオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレオイル－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ，Ｎ－ジリノレイルアミノ）－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）またはその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ、１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニエテトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イルエチルアザネジエジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはそれらの混合物が挙げられる。カチオン性脂質は、例えば、粒子に存在する総脂質の約２０モル％～約５０モル％、または約４０モル％を構成し得る。
【0198】
イオン化可能／非カチオン性脂質は、アニオン性脂質または中性脂質であってもよく、これには、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。非カチオン性脂質は、例えば、コレステロールが含まれている場合、粒子に存在する総脂質の約５モル％～約９０モル％、約１０モル％、または約６０モル％であり得る。
【0199】
粒子の凝集を阻害するコンジュゲートした脂質は、例えば、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物を含むがこれらに限定されないポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質であり得る。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧジラウリルオキシプロピル（Ｃ１２）、ＰＥＧジミリスチルオキシプロピル（Ｃ１４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃ１６）、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ１８）であり得る。粒子の凝集を防ぐコンジュゲートした脂質は、例えば、粒子に存在する総脂質の０モル％～約２０モル％、または約２モル％であり得る。
【0200】
いくつかの実施形態では、核酸－脂質粒子は、例えば、粒子に存在する総脂質の約１０モル％～約６０モル％、または約５０モル％のコレステロールをさらに含む。
【0201】
ＡＳＯはまた、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）で送達され得る。リピドイドの合成は広範に記載されており、これらの化合物を含有する製剤は、修飾核酸分子またはＡＳＯの送達に特に適している（Ｍａｈｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２０１０ ２１：１４４８－１４５４；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２０１０ ２６７：９－２１；Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００８：２６：５６１－５６９；Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ａ．２０１０ １０７：１８６４－１８６９；Ｓｉｅｇｗａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１１ １０８：１２９９６－３００１（これらの全てはその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【0202】
ＲＮＡ送達のための脂質組成物は、ＷＯ２０１２１７０９３０Ａ１、ＷＯ２０１３１４９１４１Ａ１、及びＷＯ２０１４１５２２１１Ａ１に開示され、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
【0203】
治療への適用
本発明は、遺伝子発現の減少（例えば、ＯＴＣ遺伝子発現を減少させた）に関連する疾患及び障害を治療する方法を提供する。この方法は、標的遺伝子（例えば、ＯＴＣ）の調節エレメントから転写された調節ＲＮＡとハイブリダイズするＡＳＯまたはＡＳＯを含む医薬組成物を使用する。本明細書に記載のオリゴヌクレオチド組成物は、本発明の方法において有用であり、理論に束縛されないが、対象（例えば、哺乳動物、霊長類、またはヒト）の細胞において、ＯＴＣのレベル、状態及び／または活性を、例えば、ＯＴＣタンパク質タンパク質のレベルを増大することによって、調整する能力を通じて、それらの望ましい効果を発揮すると考えられている。
本発明は、遺伝子発現の減少（例えば、ＯＴＣ遺伝子発現を減少させた）に関連する疾患及び障害を治療する方法を提供する。この方法は、標的遺伝子（例えば、ＯＴＣ）の調節エレメントから転写された調節ＲＮＡとハイブリダイズするＡＳＯまたはＡＳＯを含む医薬組成物を使用する。本明細書に記載のオリゴヌクレオチド組成物は、本発明の方法において有用であり、理論に束縛されないが、対象（例えば、哺乳動物、霊長類、またはヒト）の細胞において、ＯＴＣのレベル、状態及び／または活性を、例えば、ＯＴＣタンパク質タンパク質のレベルを増大することによって、調整する能力を通じて、それらの望ましい効果を発揮すると考えられている。
【0204】
本発明の一態様は、ＯＴＣに関連する障害（例えば、尿素サイクル異常症）を治療することを、それを必要とする対象において行う方法に関する。本発明の別の態様は、ＯＴＣ関連障害を有すると特定された対象の細胞におけるＯＴＣのレベルを増大させることを含む。さらに別の態様は、対象の細胞におけるＯＴＣの発現を阻害する方法を含む。この方法は、細胞におけるＯＴＣの発現を増大するのに有効な量で、細胞とオリゴヌクレオチドまたはＡＳＯとを接触させ、それにより、その細胞におけるＯＴＣの発現を増大することを含み得る。
【0205】
上述の方法に基づいて、本発明のさらなる態様は、治療に使用するため、または医薬として使用するため、またはそれを必要とする対象におけるＯＴＣまたは尿素サイクル関連障害の治療に使用するための、またはＯＴＣ関連障害を有すると特定された対象の細胞におけるＯＴＣのレベルを増大させるのに使用するため、または対象の細胞におけるＯＴＣの発現を増大するのに使用するための、本発明のオリゴヌクレオチド、またはそのようなオリゴヌクレオチドを含む組成物を含む。この使用は、細胞とオリゴヌクレオチドとを、その細胞におけるＯＴＣの発現を増大するのに有効な量で接触させ、それにより、その細胞におけるＯＴＣの発現を増大することを含む。本発明の方法に関して以下に記載する実施形態はまた、これらのさらなる態様にも適用可能である。
【0206】
細胞とオリゴヌクレオチドとの接触は、インビトロでおこなっても、エキソビボで行っても、またはインビボで行ってもよい。オリゴヌクレオチドとインビボで細胞を接触させることには、オリゴヌクレオチドを、対象内の、例えば、ヒト対象の細胞または細胞集団と接触させることが含まれる。インビトロ及びインビボの細胞を接触させる方法の組み合わせも可能である。上述したように、細胞への接触は直接的であっても、または間接的であってもよい。さらに、細胞との接触は、本明細書に記載されているかまたは当該技術分野で知られている任意のリガンドを含む標的化リガンドを介して達成され得る。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、炭水化物部分、例えば、ＧａｌＮＡｃ３リガンド、または目的の部位にオリゴヌクレオチドを導く他のリガンドである。細胞は肝臓細胞（例えば、幹細胞）であってもよい。
【0207】
本明細書に開示されるＡＳＯまたは医薬組成物の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、腔内（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔａｒｙ）、カテーテルを通した灌流または直接病変注射によるものであってもよい。特定の実施形態では、ＡＳＯまたは医薬組成物は、全身投与される。特定の実施形態では、ＡＳＯまたは医薬組成物は、非経口経路によって投与される。例えば、特定の実施形態では、ＡＳＯまたは医薬組成物は、静脈内に（例えば、静脈内注入により）、例えば、プレフィルドバッグ（ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ ｂａｇ）、プレフィルドペン（ｐｒｅｆｉｌｌｅｄ ｐｅｎ）、またはプレフィルドシリンジを用いて投与される。他の実施形態では、ＡＳＯまたは医薬組成物は、標的遺伝子発現の増大が望ましい臓器または組織に局所的に投与される（例えば、肝臓）。
【0208】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが対象内の特定の部位に送達されるように、対象に投与される。このような標的化送達は、全身投与または局所投与のいずれかによって達成され得る。ＯＴＣの発現の増大は、対象内の特定の部位に由来する試料中のＯＴＣのｍＲＮＡまたはＯＴＣタンパク質のレベルまたはレベルの変化の測定を使用して評価され得る。特定の実施形態では、方法は、例えば、ＯＴＣの発現を減少させる薬剤で対象を治療した後の臨床的に関連する結果によって示されるように、ＯＴＣの発現の臨床的に関連する増大を含む。
【0209】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、血中高アンモニアレベルのような、ＯＴＣ障害の１つ以上の症状の軽減（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の）をもたらすのに有効な量及び期間で投与される。
【0210】
ＯＴＣ発現レベルの増大
ＯＴＣを標的とするＡＳＯを使用する、本明細書に開示される治療方法は、対象におけるＯＴＣ発現レベルを増大させるように設計する。ＯＴＣ遺伝子の発現の増大は、ＯＴＣ遺伝子の任意のレベルの増大、例えば、ＯＴＣ遺伝子の発現の少なくとも部分的な増大を含む。増大は、対照レベルと比較して、これらの可変要素の１つ以上の絶対レベルまたは相対レベルの増大によって評価され得る。対照レベルは、当該技術分野で利用される対照レベル、例えば、投与前のベースラインレベル、または類似の対象、細胞から決定されるレベル、または、未処理または対照（例えば、緩衝液のみの対照または非活性薬剤の対照）で処理された試料である、任意のタイプの対照であり得る。特定の実施形態では、この方法は、例えば、ＯＴＣの発現を増大させる薬剤で対象を治療した後の臨床的に関連する結果によって示されるように、ＯＴＣの発現の臨床的に関連する増大を生じる。
ＯＴＣを標的とするＡＳＯを使用する、本明細書に開示される治療方法は、対象におけるＯＴＣ発現レベルを増大させるように設計する。ＯＴＣ遺伝子の発現の増大は、ＯＴＣ遺伝子の任意のレベルの増大、例えば、ＯＴＣ遺伝子の発現の少なくとも部分的な増大を含む。増大は、対照レベルと比較して、これらの可変要素の１つ以上の絶対レベルまたは相対レベルの増大によって評価され得る。対照レベルは、当該技術分野で利用される対照レベル、例えば、投与前のベースラインレベル、または類似の対象、細胞から決定されるレベル、または、未処理または対照（例えば、緩衝液のみの対照または非活性薬剤の対照）で処理された試料である、任意のタイプの対照であり得る。特定の実施形態では、この方法は、例えば、ＯＴＣの発現を増大させる薬剤で対象を治療した後の臨床的に関連する結果によって示されるように、ＯＴＣの発現の臨床的に関連する増大を生じる。
【0211】
特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、投与前のベースラインのレベルに対して、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％までＯＴＣ遺伝子発現を増大する。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＯＴＣ遺伝子発現を、投与前のベースラインのレベルと比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍増大させる。特定の実施形態では、対象はＯＴＣ発現の欠乏を有し、本明細書に開示される方法は、ＯＴＣ発現レベルまたは活性を、同様の年齢及び性別の種の対象における平均ＯＴＣ発現レベルまたは活性の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも１００％に回復させる。
【0212】
ＯＴＣ遺伝子の発現は、ＯＴＣ遺伝子発現に関連する任意の可変要素のレベル、例えば、ＯＴＣのｍＲＮＡレベルまたはＯＴＣのタンパク質レベルに基づいて評価され得る。ＯＴＣは、特定の哺乳動物（例えば、ヒト及びマウス）におけるＸ－染色体遺伝子であり、雌性対象は、Ｘ染色体不活性化のモザイクパターンを示すことが理解される。特定の実施形態では、本明細書におけるＯＴＣの発現レベルまたは活性は、肝臓における平均発現レベルまたは活性を指す。
【0213】
特定の実施形態では、代替マーカーを使用して、ＯＴＣ発現レベルの増大を検出してもよい。例えば、ＯＴＣ発現を増大させる薬剤による許容可能な診断及びモニタリング基準によって示されるような、ＯＴＣ関連障害の効果的な治療は、ＯＴＣの臨床的に関連する減少を示すと理解され得る。
【0214】
ＯＴＣ遺伝子の発現の増大は、ＯＴＣ遺伝子が転写され、処理するか、（例えば、細胞（複数可）を本発明のオリゴヌクレオチドと接触させることによって、または細胞が存在するかまたは存在した対象に本発明のオリゴヌクレオチドを投与することによって）処理される第１の細胞または細胞の群（このような細胞は、例えば、対象に由来する試料中に存在し得る）によって発現されるｍＲＮＡの量の増大によって明白になり得、その結果、ＯＴＣ遺伝子の発現は、そのように処理されてないか、または処理されていない第１の細胞または細胞群（オリゴヌクレオチドで処理されていないか、目的の遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチドによって処理されていない対照細胞（複数可））に対して実質的に同一の第２の細胞または細胞群と比較した場合、増大されている。
【0215】
他の実施形態では、ＯＴＣ遺伝子の発現の増大は、ＯＴＣ遺伝子発現に機能的に関連するパラメーター、例えば、ＯＴＣタンパク質発現またはＯＴＣ活性の増大に関して評価され得る。ＯＴＣ増大は、発現構築物からの内因性または異種のいずれかで、ＯＴＣを発現する任意の細胞において、当該技術分野で公知の任意のアッセイによって決定され得る。
【0216】
ＯＴＣの発現の増大は、対照細胞または細胞の対照群と比較した、細胞または細胞群によって発現されるＯＴＣタンパク質のレベル（例えば、対象に由来する試料で発現されるタンパク質のレベル）の増大によって明らかになり得る。ＯＴＣ発現の増大はまた、対照細胞または対照細胞群と比較した、処理された細胞または細胞群におけるＯＴＣのｍＲＮＡレベルの増大によって明らかにされ得る。
【0217】
ＯＴＣ遺伝子の発現の増大を評価するために使用され得る対照細胞または細胞群としては、本発明のオリゴヌクレオチドとまだ接触されていない細胞または細胞群が挙げられる。例えば、対照細胞または細胞群は、オリゴヌクレオチドで対象を処理する前の、個々の対象（例えば、ヒトまたは動物の対象）に由来し得る。
【0218】
細胞または細胞群によって発現されるＯＴＣのｍＲＮＡのレベルは、ｍＲＮＡ発現を評価するための当該技術分野で公知の任意の方法を使用して決定され得る。一実施形態では、試料中のＯＴＣの発現レベルは、転写されたポリヌクレオチド、またはその一部、例えば、ＯＴＣ遺伝子のｍＲＮＡを検出することによって決定される。ＲＮＡは、例えば、酸フェノール／グアニジンイソチオシアネート抽出（ＲＮＡｚｏｌ Ｂ；Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、ＲＮＥＡＳＹＴＭ ＲＮＡ調製キット（Ｑｉａｇｅｎ）またはＰＡＸｇｅｎｅ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用することを含むＲＮＡ抽出技術を使用して細胞から抽出され得る。リボ核酸ハイブリダイゼーションを利用する典型的なアッセイフォーマットには、核ランオンアッセイ、ＲＴ－ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、及びマイクロアレイ分析が挙げられる。循環ＯＴＣのｍＲＮＡは、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／１７７９０６に記載されている方法を使用して検出され得る。いくつかの実施形態では、ＯＴＣの発現のレベルは、核酸プローブを使用して決定される。本明細書で使用されるとき、「プローブ」という用語は、特定のＯＴＣ配列に対して、例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドに対して、選択的に結合し得る任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成されてもよいし、または適切な生物学的調製物から誘導してもよい。プローブは、ラベルを付けるように特別に設計してもよい。プローブとして利用され得る分子の例としては、限定するものではないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が挙げられる。
【0219】
単離されたｍＲＮＡは、サザンまたはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、及びプローブアレイを含むがこれらに限定されないハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで使用され得る。ｍＲＮＡレベルを決定するための１つの方法は、単離されたｍＲＮＡを、ＯＴＣのｍＲＮＡにハイブリダイズし得る核酸分子（プローブ）と接触させることを含む。一実施形態では、ｍＲＮＡを、固体表面に固定し、例えば、単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で泳動し、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜に移すことによって、プローブと接触させる。代替の実施形態では、プローブ（複数可）は固体表面に固定化され、ｍＲＮＡは、例えば、ＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ遺伝子チップアレイにおいてプローブ（複数可）と接触される。当業者は、ＯＴＣのｍＲＮＡのレベルを決定する際に使用するために、公知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適合し得る。
【0220】
試料中のＯＴＣの発現レベルを決定するための代替方法には、例えば試料中のｍＲＮＡの核酸増幅及び／または逆転写（ｃＤＮＡを調製する）のプロセスであって、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号に記載されている実験的実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８９－１９３）、自己持続性配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４－１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３－１１７７）、Ｑ－ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号）、または他の任意の核酸増幅法による、続いて当業者に周知の技術を使用する増幅された分子の検出によるプロセスが含まれる。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合、そのような分子の検出に特に役立つ。本発明の特定の態様において、ＯＴＣの発現のレベルは、定量的蛍光発生ＲＴ－ＰＣＲ（すなわち、ＴＡＱＭＡＮＴＭシステム）またはＤＵＡＬ－ＧＬＯ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイによって決定される。
【0221】
ＯＴＣのｍＲＮＡの発現レベルは、メンブレンブロット（ノーザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析で使用されるものなど）、またはマイクロウェル、試料チューブ、ゲル、ビーズ、もしくはファイバー（または結合した核酸を含む任意の固体担体）を使用してモニターされ得る。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７７０，７２２号、同第５，８７４，２１９号、同第５，７４４，３０５号、同第５，６７７，１９５号、及び同第５，４４５，９３４号を参照されたい。ＯＴＣ発現レベルの決定はまた、溶液中で核酸プローブを使用することも含み得る。
【0222】
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ発現のレベルは、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）アッセイ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＲＴ－ｑＰＣＲ、マルチプレックスｑＰＣＲまたはＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡ－ｓｅｑ、またはマイクロアレイ分析を用いて評価される。このような方法はまた、ＯＴＣ核酸の検出にも使用され得る。
【0223】
ＯＴＣタンパク質発現のレベルは、タンパク質レベルの測定のための当該技術分野で公知の任意の方法を使用して決定され得る。そのような方法としては、例えば、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー、流体またはゲル沈降反応、吸収分光法、比色分析、分光光度分析、フローサイトメトリー、ＦＡＣＳ、免疫拡散（シングルまたはダブル）、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、電気化学発光アッセイ、Ｌｕｍｉｎｅｘ、ＭＳＤ、ＦＩＳＨなどが挙げられる。このようなアッセイはまた、ＯＴＣタンパク質の存在または複製を示すタンパク質の検出にも使用され得る。
【実施例】
【0224】
以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の実施例である。これらの実施例は、例証目的で提示されているにすぎず、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に対する正確さを確保する努力がなされているが、当然いくつかの実験によるエラー及び偏差が許容されるはずである。
【0225】
本発明の実施は、別途指示のない限り、当業者の範囲内で、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ手法、及び薬理学の従来の方法を用いるであろう。そのような手法は、文献で完全に説明される。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ． （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。
【0226】
実施例１：ｒｅｇＲＮＡ標的化ＡＳＯを用いたＯＴＣ発現の調節
２つのヒトＯＴＣ ｒｅｇＲＮＡ標的（ＲＲ１及びＲＲ２）がヒトＯＴＣについて特定された。ＲＲ１を標的とする６９個のＡＳＯ及びＲＲ２を標的とする１３３個のＡＳＯを合成した。これらの２０２個の初期ＡＳＯを、ＯＴＣのｍＲＮＡの増大における有効性について、５μΜの初代ヒト肝細胞においてスクリーニングした。有効性を示したＡＳＯを、初代ヒト肝細胞及び初代ヒトドナー肝細胞における１．２５μΜ、２．５μΜ及び５μΜでの用量依存性有効性についてさらに試験した。用量依存性有効性を示した陽性ＡＳＯを、ｒｅｇＲＮＡヒット領域の周りのＡＳＯベースウォーキング及びタイリングのために選択した。最初のスクリーニングに基づいて、最初のＡＳＯヒットの周りのベースウォーキング及びタイリングのために、３１個のＲＲ１ ＡＳＯ及び３５個のＲＲ２ ＡＳＯを選択した。これらの追加のＡＳＯを、用量依存性有効性についてさらに試験した。ＡＳＯは、選択されたＡＳＯの化学的修飾の化学的性質、タイプ、及び位置を変更することによって、化学的微調整（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｉｎｅ ｔｕｎｉｎｇ）のために選択された。ＲＲ１を標的とする７１個のＡＳＯ及びＲＲ２を標的とする６７個のＡＳＯを特定した。
２つのヒトＯＴＣ ｒｅｇＲＮＡ標的（ＲＲ１及びＲＲ２）がヒトＯＴＣについて特定された。ＲＲ１を標的とする６９個のＡＳＯ及びＲＲ２を標的とする１３３個のＡＳＯを合成した。これらの２０２個の初期ＡＳＯを、ＯＴＣのｍＲＮＡの増大における有効性について、５μΜの初代ヒト肝細胞においてスクリーニングした。有効性を示したＡＳＯを、初代ヒト肝細胞及び初代ヒトドナー肝細胞における１．２５μΜ、２．５μΜ及び５μΜでの用量依存性有効性についてさらに試験した。用量依存性有効性を示した陽性ＡＳＯを、ｒｅｇＲＮＡヒット領域の周りのＡＳＯベースウォーキング及びタイリングのために選択した。最初のスクリーニングに基づいて、最初のＡＳＯヒットの周りのベースウォーキング及びタイリングのために、３１個のＲＲ１ ＡＳＯ及び３５個のＲＲ２ ＡＳＯを選択した。これらの追加のＡＳＯを、用量依存性有効性についてさらに試験した。ＡＳＯは、選択されたＡＳＯの化学的修飾の化学的性質、タイプ、及び位置を変更することによって、化学的微調整（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｉｎｅ ｔｕｎｉｎｇ）のために選択された。ＲＲ１を標的とする７１個のＡＳＯ及びＲＲ２を標的とする６７個のＡＳＯを特定した。
【0227】
マウスＯＴＣ ｒｅｇＲＮＡについてこのプロセスを繰り返して、マウスＯＴＣ発現を変化させるＡＳＯを特定した。マウスＯＴＣについて、４つのマウスＯＴＣ ｒｅｇＲＮＡ標的を特定した。ｒｅｇＲＮＡを標的とする１２６個のＡＳＯを合成した。これらの１２６個の初期ＡＳＯを、ＯＴＣのｍＲＮＡの増大における有効性について、初代マウス肝細胞においてスクリーニングした。用量依存性有効性を示した陽性ＡＳＯを、ｒｅｇＲＮＡヒット領域の周りのＡＳＯベースウォーキング及びタイリングのために選択した。最初のスクリーニングに基づいて、最初のＡＳＯヒットの周りのベースウォーキング及びタイリングのために、２４個のＡＳＯを選択した。これらの追加のＡＳＯを、用量依存性有効性についてさらに試験した。選択されたＡＳＯの化学的修飾の化学的性質、タイプ、及び位置を変更することによって、化学的微調整（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｉｎｅ ｔｕｎｉｎｇ）に関して４つのＡＳＯを選択した。
【0228】
ヒト及びマウスＡＳＯの選択及び化学修飾を、表２、３、４、ならびに図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃ、１８Ｄ、及び１８Ｅに示す。
【0229】
この実施例は、ヒトＯＴＣのエンハンサーから転写されたｅＲＮＡを標的とするＡＳＯを用いて、ヒト肝細胞におけるＯＴＣ発現の調節を評価するように設計した。
【0230】
４人のドナー（ＨＵＭ４１７８、ＨＵＭ１８１５１１Ａ、ＨＵＭ１９０１７１、ＨＵＭ１８１３７１）由来の肝細胞を、インビトロで培養した。細胞を増殖培地にプレートし、プレートの４～６時間後、最終濃度１．２５μΜ、２．５μΜ、５μΜ、または１０μΜのｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｄ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｈ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ２－１、またはｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ａで処理した（ヒトＯＴＣ配列及び選択されたＡＳＯの化学修飾については、図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｄ、及び１８Ｅを参照し、マウスＯＴＣ配列及び選択されたＡＳＯの化学修飾については図１８Ｃを参照されたい）。処理の４８時間後に細胞を回収し、ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成及びＱＰＣＲ分析のために処理した。ＯＴＣ発現には、ＴａｑｍａｎプローブＨｓ００１６６８９２＿ｍ１（ＯＴＣ）６０Ｘを用いた。ＯＴＣレベルを、Ｂ２Ｍ発現に対して正規化した。
【0231】
図２Ａは、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１１による処理後のＯＴＣのｍＲＮＡを示す。図２Ｂは、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－８による処理後のＯＴＣのｍＲＮＡを示す。図２Ｃは、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ２－１による処理後のＯＴＣのｍＲＮＡを示す。図２Ｄは、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１による処理後のＯＴＣのｍＲＮＡを示す。各ＡＳＯによる処理は、各ドナーにおけるＯＴＣ発現の用量依存性増大をもたらした。従って、同じｒｅｇＲＮＡを標的とする４つの異なるＲＮＡアクチュエータは、ヒトＯＴＣのｍＲＮＡ用量依存的物質を増大させた。
【0232】
ＯＴＣ欠損ドナー由来の肝細胞を、インビトロで培養した。細胞を増殖培地にプレートし、プレート４時間後、最終濃度５ｕＭのＡＳＯ ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０及びｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－２ｃで処理した。ランダム配列を含む非標的化対照（ＮＴＣ）ＡＳＯを、陰性対照として使用した。上清を尿素生成分析のために回収し、細胞溶解物を処理後２日目にｍＲＮＡのために回収した。ｍＲＮＡ分析のために、ｔａｑｍａｎプローブＨｓ００１６６８９２＿ｍ１を、ＯＴＣ発現のために使用した。ＯＴＣレベルを、Ｂ２Ｍ発現に対して正規化した。尿素生成については、回収した上清を、Ｕｒｅａ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＢＵＮ）比色検出キット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号：ＥＩＡＢＵＮ）により測定し、及びＡｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ、カタログ番号：Ｅ８８－１２９）により正規化した。統計は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）の一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。
【0233】
尿素アッセイも、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－２ａを用いて野生型肝細胞において用量研究で繰り返した。細胞を増殖培地にプレートし、プレート後４時間、最終濃度１．２５ｕＭ、２．５ｕＭ、５ｕＭ、及び１０ｕＭのＡＳＯ ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－２ａで処理した。ランダム配列を含む非標的化対照（ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＮＴＣ）ＡＳＯを、陰性対照として使用した。上清を尿素生成分析のために回収し、細胞溶解物を処理後６日目にｍＲＮＡのために回収した。試料を上記のように処理した。
【0234】
図３Ａ及び図３Ｂに示すように、両方のＡＳＯによる治療は、患者細胞における増大した自己発生を生じ（図３Ｂ）、これは、ＯＴＣのｍＲＮＡアップレギュレーションと相関した（図３Ａ）。尿素生成アッセイにおける正常範囲は、アルブミン１ｍｇあたり１８～３０ｕｇの尿素である。１つのＡＳＯは、平均濃度を約１３μｇの尿素／アルブミン１ｍｇまで増大させ、陰性対照試料として７μｇの尿素／アルブミン１ｍｇのほぼ２倍まで増大させ、ほぼ正常な尿素生成範囲内であった。加えて、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－２ａは、ＷＴ肝細胞においてＯＴＣのｍＲＮＡ（図３Ｃ）及び尿素（図３Ｄ）の用量依存的な増大を誘導した。
【0235】
ｒｅｇＲＮＡの大部分には、ヒトゲノムとマウスゲノムとの間で保存されている大きな配列領域はない。概念のインビボ証明のために、マウスＯｔｃ領域の周囲のｒｅｇＲＮＡを同定し、これらのマウスｒｅｇＲＮＡ（プロモーター及びエンハンサー）を標的とするＡＳＯを設計し、野生型（Ｂ６ＥｉＣ３ＳｎＦ１／Ｊ，［ＷＴ］）初代マウス肝細胞及びＯｔｃ欠損ドナー（Ｂ６ＥｉＣ３Ｓｎａ／Ａ－Ｏｔｃｓｐｆ－ａｓｈ／Ｊ，［ＯＴＣＤ］）初代マウス肝細胞の両方でスクリーニングした。
【0236】
初代肝細胞を、雄性マウスのマウス株Ｂ６ＥｉＣ３ＳｎＦ１／Ｊ（対照ＷＴ）及びＯｔｃ欠損ドナー（Ｂ６ＥｉＣ３Ｓｎａ／Ａ－Ｏｔｃｓｐｆ－ａｓｈ／Ｊ，カタログ：００１８１１）（ＪＡＸ ｌａｂ）から単離した。ｓｐｆａｓｈマウスは、バリアントｃ．３８６Ｇ＞Ａ、ｐ．Ａｒｇ１２９Ｈｉｓを、スプライシングに影響を与える Ｏｔｃ遺伝子中に有し、ｓｐｆ／ａｓｈ肝臓中のＯＴＣのｍＲＮＡレベルの低下をもたらす（野性型対照の５～１２％）。従って、雄性ｓｐｆａｓｈマウスは、ＯＴＣ活性が低い軽度の生化学的表現型を有する（野生型の５％～１０％）。
【0237】
初代肝細胞を、０日目に１ウェルあたり２０，０００細胞で播種した。２日目に細胞を最終濃度５μＭのマウスＡＳＯで処理した。細胞を２日間インキュベートし、処理後の２日目に溶解物をｍＲＮＡ分析のために回収した。ｔａｑｍａｎプローブＭｍ０１２８８０５３＿ｍ１を、マウスＯＴＣ発現に使用した。Ｐｐｉａ及びＨｐｒｔを、遺伝子発現正規化のためのハウスキーパー遺伝子として使用した。統計は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）の一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。
【0238】
６種のＡＳＯのうち５種は、インビトロでＷＴ肝細胞におけるＯＴＣのｍＲＮＡを増大させた（一元配置ＡＮＯＶＡ＊：ｐ０．０５－０．００５；＊＊：ｐ＜０．００５）（図４）。６種のＡＳＯのうち４種は、インビトロでＯＴＣＤ肝細胞におけるＯＴＣのｍＲＮＡを増大させた（一元配置ＡＮＯＶＡ＊：ｐ０．０５－０．００５；＊＊：ｐ＜０．００５）（図５）。したがって、ＡＳＯ標的化ｒｅｇＲＮＡを使用して、罹患マウス肝臓細胞におけるＯＴＣ発現を増大してもよい。ＯＴＣ欠損マウス細胞におけるＡＳＯ媒介性ＯＴＣアップレギュレーションは、これらを疾患モデルにおいて試験することを可能にし、インビボ表現型読み出しをする。
【0239】
ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１に追加の化学修飾を施した。修飾は、表３及び図１８Ｄに示される。新しいＡＳＯを、５ｕＭ、９ｕＭ、または１０ｕＭ濃度で前に記載したように肝細胞において評価した。表５は、示されたＡＳＯについてのＯＴＣのｍＲＮＡの倍率変化及び標準偏差を示す。
【0240】
（表５）
【0241】
ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ２－２に追加の化学修飾を施した。修飾は、表４及び図１８Ｅに示される。新しいＡＳＯを、５ｕＭ、９ｕＭ、または１０ｕＭ濃度で前に記載したように肝細胞において評価した。表６は、示されたＡＳＯについてのＯＴＣのｍＲＮＡの倍率変化及び標準偏差を示す。
【0242】
（表６）
【0243】
２つのＡＳＯ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｄ及びｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ２－２ｅの用量応答も評価した。細胞を、上記のように各ＡＳＯの濃度を増大させながらインキュベートした。ＯＣＴ ｍＲＮＡを、ｑＲＴ－ＰＣＲによって決定した。
【0244】
表７に示すように、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｄの量を増大させた肝細胞の処理は、ＯＴＣのｍＲＮＡの用量依存的な増大を生じた。
【0245】
（表７）ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｄ
【0246】
表８に示すように、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ２－２ｅの量を増大させた肝細胞の処理は、ＯＴＣのｍＲＮＡの用量依存的な増大を生じた。
【0247】
（表８）ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ２－２ｅ
【0248】
追加のＡＳＯを生成し、上記のように肝細胞で試験した。ＡＳＯ配列、Ｘ染色体の開始及び終了位置、ならびにＯＴＣのｍＲＮＡの倍率変化（ＦＣ）及び標準偏差（ＳＤ）を表９に示す。
【0249】
配列番号１４３－８９２標的ヒトＯＴＣ ｅＲＮＡ－１のＡＳＯ（配列番号１）。全ての塩基は、２’－Ｏ－メトキシエチルであり、全てのシチジンは５－メチル（シチジン上の５－メチル）を有する。
【0250】
配列番号８９３～１０２９のＡＳＯは、ヒトＯＴＣ ｅＲＮＡ－２（配列番号２）を標的とする。ＡＳＯは、塩基６、１１及び１６にＬＮＡを有する２’－Ｏ－メトキシエチルである。このようなＡＳＯは、５×ｎ＋５ヌクレオチド（ｎは３以上の整数）として記載されてもよく、ここで、５×ｍ位のヌクレオチドは、ＬＮＡによって修飾されたリボヌクレオチド（ｍは１～ｎの整数）であり、残りの位置のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシエチルによって修飾されたリボヌクレオチドであり、全てのシチジンは５－メチル（シチジン上の５－メチル）を有する。
【0251】
配列番号１０３０～１０７２のＡＳＯは、ヒトＯＴＣ ｐａＲＮＡ－１のＡＳＯ（配列番号１０７７）を標的とする。全ての塩基は、２’－Ｏ－メトキシエチルであり、全てのシチジンは５－メチル（シチジン上の５－メチル）を有する。
【0252】
（表９）
【0253】
実施例２：ｐａＲＮＡ－またはｅＲＮａ－標的化ＡＳＯを用いたＳＥＲＰＩＮＧ１発現の調節
本実施例は、マウスＳＥＲＰＩＮＧ１プロモーターから転写されたｐａＲＮＡを標的とするＡＳＯを用いて、マウス肝細胞におけるＳＥＲＰＩＮＧ１発現の調節を評価するように設計した。
本実施例は、マウスＳＥＲＰＩＮＧ１プロモーターから転写されたｐａＲＮＡを標的とするＡＳＯを用いて、マウス肝細胞におけるＳＥＲＰＩＮＧ１発現の調節を評価するように設計した。
【0254】
選択したマウスＳｅｒｐｉｎｇ１ ＡＳＯの配列及び化学修飾については図１９を参照されたい。
【0255】
雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（約６～７週齢）を、単回５ｍｇ／ｋｇのＩＰの用量のＩＦＮｙ（マウスあたり１２５μｇ）または陰性対照としてのＰＢＳを用いて処置し、処置の３０分後、１時間後、２時間後、６時間後、１０時間後、及び２４時間後に屠殺した。雄性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（７週齢）を、１５ｍｇ／ｋｇのＩＰ用量のトファシチニブで２回処置し（１２時間離して）、処置の２時間後及び６時間後に屠殺した。両方の実験におけるマウス由来の肝臓を列挙した時点で回収し、ＲＮＡ単離及びｃＤＮＡ合成のために処理して相対的ＲＮＡ測定を行った（Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲ（Ｍｍ００４３７８３５＿ｍ１））。
【0256】
Ｓｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡは、ＩＦＮｙを用いて時間依存的にアップレギュレートしたところ、投与後２４時間で最高の倍率変化（約３倍の誘導）が起こった（図６Ａ）。Ｓｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡは、Ｊａｋ１阻害剤トファシチニブを用いて下方制御され、５０％の減少が６時間で起こった（図６Ｂ）。したがって、Ｓｅｒｐｉｎｇ１は、ＩＦＮｙ－Ｊａｋ経路によって制御される可能性が高い。
【0257】
雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（約６～７週齢）を、単回５ｍｇ／ｋｇのＩＰ用量のＩＦＮｇ（マウス１匹あたり１２５ｕｇ）を用いて処置し、処置の２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に屠殺した。ｍＲＮＡ及びＷｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔによるタンパク質分析のために、血清を回収した。使用したｓｅｒｐｉｎｇ１抗体は、ＳＥＲＰＩＮＧ１（ａｂ１３４９１８）に対するウサギのモノクローナル［ＥＰＲ８０１５］であった。タンパク質レベルをトランスフェリンタンパク質（ウサギＡｂｃａｍ ８２４１１）に対して正規化した。Ｓｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡを、ハウスキーピング遺伝子としてＨｍｂｓに対して正規化した。
【0258】
血清中のＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡ及びタンパク質の持続的な増大は、２４～４８時間から観察された（図７）。ＩＦＮｇ処理後の血清ｍＲＮＡレベルを、表１０に示す。
【0259】
（表１０）
【0260】
次に、雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（約６～７週齢）を、単回５ｍｇ／ｋｇのＩＰの用量のＩＦＮｙ（マウスあたり１２５μｇ）または陰性対照としてＰＢＳを用いて処置し、処置の６時間後及び２４時間後に屠殺した。６時間及び２４時間の時点由来の肝臓を、Ｑｉａｇｅｎ Ｔｒｉｚｏｌ法によって処理し、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲによって測定した。ＰＣＲを用いて、Ｓｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡ及びｒｅｇＲＮＡ発現レベルを決定した。
【0261】
図８に示すように、ｒｅｇＲＮＡレベルは、最初に増大し、その後、ＩＦＮｇによる誘導後のｍＲＮＡの増大が続く。
【0262】
次に、凍結保存したマウス肝細胞（Ｌｏｎｚａ）をコラーゲンコーティングしたプレート上にプレートし、２４時間付着させ、１０００ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮｙで刺激し、処理後０．５時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、及び３０時間で回収した。細胞を、Ｑｉａｇｅｎ ＲＬＴ緩衝液中で溶解し、Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ Ｚｙｍｏキットを用いて処理し、ｒｅｇＲＮＡ特異的プライマーを用いてＳＹＢＲグリーンｑＰＣＲによってｍＲＮＡを測定した。
【0263】
図９Ａ及び図９Ｂに示すように、ＩＦＮｙ刺激はＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡをアップレギュレートする前にＳｅｒｐｉｎｇ１ ｒｅｇＲＮＡを増大させた。Ｓｅｒｐｉｎｇ１ ｒｅｇＲＮＡレベルは２時間でピークに達したが、Ｓｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡは３０時間でピークに達した。従って、ＩＦＮｇ処理は、マウス肝細胞におけるＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡの時間依存性増大をもたらす。
【0264】
雌性Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（約６～７週齢）を単回５ｍｇ／ｋｇのＩＰ用量のＩＦＮｇ（マウス１匹あたり１２５ｕｇ）を用いて処置し、処置の６時間後、及び２４時間後に回収した。６時間及び２４時間の時点由来の肝臓粉末を、ＡＴＡＣ－ｓｅｑについて処理した。エピゲノムデータは、２つのホットスポット、エンハンサー２及びプロモーター２を、標的化及びアップレギュレーションのための理想的な領域として示した（図１０）。
【0265】
次に、凍結保存したマウス肝細胞（Ｌｏｎｚａ）を、１日目（プレート２４時間後）に自由取り込み法によって用量反応でパワー培地中の選択されたＡＳＯ（ｍＳｅｒｐｉｎｇ１ｐａ－ＡＳＯ－１、ｍＳｅｒｐｉｎｇ１ｐａ－ＡＳＯ－２、及びｍＳｅｒｐｉｎｇ１ｐａ－ＡＳＯ－３）で処理し、３日目に収集した。スクランブルＡＳＯ（ＮＴＣ－３Ｓ）を対照として用いた。細胞を、ＲＬＴ Ｑｉａｇｅｎ緩衝液中で溶解し、ＲＮＡｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ９６ Ｋｉｔによって処理し、ｍＲＮＡをＴａｑｍａｎ ｑＰＣＲによって測定した。ｍＳｅｒｐｉｎｇ１ｐａ－ＡＳＯ－１は、ｍＳｅｒｐｉｎｇ１ｐａ－ＡＳＯ－２の最適化された配列である。
【0266】
Ｓｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡは、ｐａＲＮＡを標的とする選択されたＡＳＯを用いて用量依存的にアップレギュレートされ（図１１Ｂ）、一方、隣接する遺伝子Ｉｒｆ１及びＵｂｅｌ２６はアップレギュレートされなかった。Ｓｅｒｐｉｎｇ１染色体近傍の概略図を図１１Ａに示す。
【0267】
次に、リードＡＳＯ配列の最適化されたバージョンを設計し、新たに単離されたマウス肝細胞において試験した。１日目（プレートした２４時間後）に自由取り込み法によって用量反応でＡＳＯを用いてパワー培地中で細胞を処理し、３日目に収集した。スクランブルＡＳＯ（ＮＴＣ－３Ｓ）を、対照として用いた。ｍＳＥＲＰＩＮＧ１－ＡＳＯｐａ－６は、Ｓｅｒｐｉｎｇ１を標的とするＩＯＮＩＳマウス配列である（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，２０１３）。
【0268】
図１２に示すように、Ｓｅｒｐｉｎｇ１を、ｒｅｇＲＮＡを標的とするＡＳＯを用いて用量依存的にアップレギュレートした。ＡＳＯによる処理後のＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡの倍率変化を表１１に示す。
【0269】
（表１１）
【0270】
より長い時間のアッセイも行った。新たに単離されたマウス肝細胞を、１日目（プレート２４時間後）に自由取り込み法によってパワー培地中の１０μΜの選択されたＡＳＯ（ｍＳｅｒｐｉｎｇ１ｐａ－ＡＳＯ－２、ｍＳｅｒｐｉｎｇ１ｐａ－ＡＳＯ－３、ｍＳｅｒｐｉｎｇ１ｐａ－ＡＳＯ－４）で処理し、ＲＮＡプロセシングのために８時間、２４時間、４８時間、及び７２時間で回収した。スクランブルＡＳＯ（ＮＴＣ－Ｓｃｒ３Ｓ）を対照として使用した。ｍＲＮＡをＮＴＣに対して正規化した。
【0271】
選択されたＡＳＯは、Ｓｅｒｐｉｎｇ１を２４時間で約１．５～２×に増大させた（図１３）
【0272】
次に、インビボアッセイを行った。雄性Ｃ５７／Ｂｌ６マウス（約８週）を、１日目及び４日目にＳＣ注射を介してＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされた選択されたＡＳＯ（ｍＳｅｒｐｉｎｇ１ ＡＳＯ－２ ＧａｌＮＡｃ）で処理し、６日目に回収した血清を回収した。ＰＢＳ及びスクランブルＡＳＯ ＮＴＣを対照として用いた。血清採血を用いて、ウエスタンブロットによってＳｅｒｐｉｎｇ１タンパク質を測定した。研究設計の概略図を図１４Ａに示す。
【0273】
ＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされた２用量のＡＳＯの後、Ｓｅｒｐｉｎｇ１タンパク質レベルは、陰性対照と比較して約１．５倍に増大する（図１４Ｂ）。
【0274】
次に、Ｓｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡ発現に対するＩＦＮｇ＋ＡＳＯ処理の相加効果を評価した。凍結保存したマウス肝細胞を、２日目に自由取り込み法によって、パワー培地中の５μΜのｍＳｅｒｐｉｎｇ１ ＡＳＯ－２＋１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮｇで処理した。細胞をｍＲＮＡ分析のために４日目に回収した。未処置マウス及びスクランブルＡＳＯ ＮＴＣを、対照として使用した。ＩＦＮｇと組み合わせた５μΜのｍＳｅｒｐｉｎｇ１ ＡＳＯ－２は、負の対照と比較して最も高い倍率変化、約２．７５倍を導く（図１５Ａ）。
【0275】
併用療法のためのタイムコースアッセイも行った。新たに単離したマウス肝細胞を、１日目（プレート２４時間後）に自由取り込み法によって、パワー培地中の、１０μΜのｍＳｅｒｐｉｎｇ１ ＡＳＯ－２、ｍＳｅｒｐｉｎｇ１ ＡＳＯ－３、またはｍＳｅｒｐｉｎｇ１ ＡＳＯ－４＋１０００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮｇで処理し、ＲＮＡプロセシングのために８時間、２４時間、４８時間、及び７２時間で回収した。スクランブルＡＳＯ ＮＴＣ＋ＩＦＮｇを対照として使用した。
【0276】
より高い濃度のＡＳＯもまた、対照マウスよりもＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡの約３倍の増大をもたらした（図１５Ｂ）。
【0277】
次に、Ｓｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡに対するＪａｋ１阻害剤＋ＡＳＯのレスキューされた効果を評価した。凍結保存したマウス肝細胞を、２日目に自由取り込み法によって、パワー培地中の５μΜのｍＳｅｒｐｉｎｇ１ ＡＳＯ－２＋３μＭのＪａｋ１阻害剤トファシチニブで処理した。細胞をｍＲＮＡ分析のために４日目に回収した。
【0278】
Ｊａｋ１阻害と組み合わせたｍＳｅｒｐｉｎｇ１ ＡＳＯ－２は、正常レベルへのＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡの回収をもたらした（図１６）。
【0279】
同様の救済実験を、１μΜ Ｊａｋ１阻害剤トファシチニブを用いてＳｅｒｐｉｎｇ１ノックダウン（ＫＤ）系で行った。ＨＡＥでは、Ｓｅｒｐｉｎｇ１の健康なコピーが１つしかないため、この系はＨＡＥ疾患を模倣しており、したがって、絶対レベルはＷＴ個体の５０％である。
【0280】
新たに単離したマウス肝細胞を、１日目の自由取り込み法により、Ｊａｋ１を１μＭで含むパワー培地中の、１０μΜ及び５μΜのｍＳｅｒｐｉｎｇ１ ＡＳＯ－２及びｍＳｅｒｐｉｎｇ１ ＡＳＯ－３を用いて処理した。細胞を、ｍＲＮＡ分析のために４日目に回収した。
【0281】
Ｊａｋ１阻害剤は、ＨＡＥ疾患と同様に、Ｓｅｒｐｉｎｇ１を正常発現の５０％まで減少させた。選択されたＡＳＯによる処理後、Ｓｅｒｐｉｎｇ１レベルは１．５倍を超えて回復し、これはＷＴレベルに近かった（図１７）。
【0282】
追加のＡＳＯを、ｍＳＥＲＰＩＮＧ１－ＡＳＯｐａ－１（ＣＯ－３１４９）、ｍＳＥＲＰＩＮＧ１－ＡＳＯｐａ－２（ＣＯ－２０４３）、及びｍＳＥＲＰＩＮＧ１－ＡＳＯｐａ－３（ＣＯ－２０５１）の周りにタイル状に配置した。新たな配列を以下に示す：
【0283】
ＡＳＯ類は、先に記載したように試験した。簡単に述べると、マウス肝細胞をプレートし、１日目にプレートから２４時間後にＡＳＯで処理した。細胞を処理４８時間後に収集した。図３４Ａに示すように、ＡＳＯ類のＣＯ－３２６５、ＣＯ－３２７９、ＣＯ－２０４３、及びＣＯ－２０５１は、Ｓｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡ発現を用量依存的に増大させた。
【0284】
次に、選択したＳｅｒｐｉｎｇ１ ＡＳＯ類を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＣ１ＮＨ＋／－肝細胞において試験した。Ｃ１ＮＨ＋／－肝細胞は、Ｓｅｒｐｉｎｇ１発現を欠いている。図３４Ｂに示すように、ＡＳＯ類のＣＯ－２０４３、ＣＯ－２０５１、ＣＯ－３２６５、ＣＯ－３４１９、ＣＯ－４０６９、及びＣＯ－３２７９は、Ｃ１ＮＨ＋／－肝細胞におけるＳｅｒｐｉｎｇ１遺伝子発現を用量依存的に増大させた。
【0285】
ＧＡｌＮＡｃ－ＡＳＯもＣ１ＮＨ欠損マウスで試験した。マウスから採血し、１日目及び３日目にＡＳＯ ＣＯ－２０５１及びＣＯ－３２６５を投与し、６日目に屠殺した。図３５に示すとおり、両方のＡＳＯとも、マウスでＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡを増大した。
【0286】
次に、血管透過性アッセイを行った。Ｃ５７ Ｂｌ６マウスにＡＳＯを２６０ｍｇ／ｋｇ／週の用量で皮下注射した。エヴァン（Ｅｖａｎ）ブルー処理は、参考文献Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００２；１０９（８）：１０５７－１０６３に基づき、１５０ｍｇ／ｋｇでＩＰ注射し、６日及び８日に行った。色素の定量は、８日目に終了したマウスで行った。剖検時に、組織を乾燥させ、秤量して、１ｍＬのホルムアミドに加えた。色素を組織から抽出し、ＯＤ ６２０ｎｍで測定した。図３６に示すように、ＣＯ－２０５１は、ＣＩＮＨ＋／－マウスの耳及び結腸の両方における色素溢出の量を減少させた。
【0287】
ＣＯ－２０５１はまた、ＷＴ及びＣ１ＮＨ＋／－マウスの両方においてＳｅｒｐｉｎｇ１のｍＲＮＡを増大させた。２６０ｍｇ／ｋｇのＡＳＯでＷＴまたはＣ１ＮＨ＋／－マウスを処置した。血液を回収し、一定負荷容量（例えば、１ｕＬの血清）を用いたウエスタンブロットによるタンパク質測定のために１、３、５、及び７日目に血清に処理した。標準的な方法を用いて、Ｓｅｒｐｉｎｇ１及びトランスフェリンアバカム（ａｂｃａｍ）抗体を添加した。ＬｉＣＯＲスキャナを用いてそれぞれのバンドを画像化し、ＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて定量した。図３７Ａ及び３Ｂに示すように、Ｓｅｒｐｉｎｇ１アップレギュレーションは、ＷＴ及び罹患マウスにおいて裸のＡＳＯで観察された。
【0288】
このアッセイを繰り返し、より低い用量のＧａｌＮＡｃ－ＡＳＯ ＣＯ－２０５１を用いて持続的なタンパク質のアップレギュレーションを観察した（１５ｍｇ／ｋｇ）（図３７Ｃ及び３７Ｄ）。
【0289】
実施例３：ヒトＯＴＣ ｒｅｇＲＮＡ標的化ＡＳＯのタイリング及び最適化
塩基ウォーキング及びｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－２ａ周囲の伸長によって作製された追加のＡＳＯを合成し、特徴付けた。加えて、ＡＳＯは、化学的修飾の化学、型、及び位置を変えることによって微調整した。合成され、さらに特徴付けられたＡＳＯは、ＡＳＯ配列ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ａ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－３ａ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－４ａ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｈ、及びｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｄであった。
塩基ウォーキング及びｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－２ａ周囲の伸長によって作製された追加のＡＳＯを合成し、特徴付けた。加えて、ＡＳＯは、化学的修飾の化学、型、及び位置を変えることによって微調整した。合成され、さらに特徴付けられたＡＳＯは、ＡＳＯ配列ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ａ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－３ａ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－４ａ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｈ、及びｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｄであった。
【0290】
塩基ウォーキング及びｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ２－２ａ周囲の伸長によって作製された追加のＡＳＯも合成し、特徴付けた。加えて、ＡＳＯは、化学的修飾の化学、型、及び位置を変えることによって微調整した。合成され、さらに特徴付けられたＡＳＯは、ＡＳＯ配列ｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－２ａ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－２ｂ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－２ｃ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－２ｄ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－２ｅ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－４、ｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－５、ｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－６、及びｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－７であった。ヒトＯＴＣ配列及び選択されたＡＳＯの化学修飾については、表２、３、４、ならびに図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｄ、及び１８Ｅを参照されたい。
【0291】
１人のドナー由来の肝細胞を、インビトロで培養した。細胞を増殖培地にプレートし、１μΜ、３μΜ、または９μΜのｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ１－４ａ（図２０Ａ、塩基ウォーキングＡＳＯ）、または１．２５μΜ、２．５μΜ、５μΜ、または１０μΜのｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｄ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ｈ、またはｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ａ（図２０Ｂ、微調整ＡＳＯ）という最終濃度で、プレートの４～６時間後に処理した。
【0292】
１人のドナー由来の肝細胞を、インビトロで培養した。細胞を増殖培地にプレートし、プレート４～６時間後、最終濃度１μΜ、３μΜ、または９μΜのｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－２ａ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－２ｂ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－２ｃ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－２ｄ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－２ｅ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－４、ｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－５、ｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－６、及びｈＯＴＣ－ＡＳＯ－ｅ２－７で処理した。
【0293】
処理の４８時間後に細胞を回収し、ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成及びＱＰＣＲ分析のために処理した。ＯＴＣ発現には、ＴａｑｍａｎプローブＨｓ００１６６８９２＿ｍ１（ＯＴＣ）６０Ｘを用いた。ＯＴＣレベルを、Ｂ２Ｍ発現に対して正規化した。
【0294】
ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－２ａの周囲の塩基ウォーキング及び伸長は、親配列ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－２ａと比較して、効力の３倍の改善を導く（図２０Ａ）。修飾のタイプ、化学的性質、及び位置を変更することによる追加の微調整によって、初代肝細胞におけるＯＴＣのｍＲＮＡの用量依存的増大によって示されるように、親配列ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－２ａと比較して増大した有効性がもたらされた（図２０Ｂ）。
【0295】
ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ２－２ａに基づく修飾のタイプ、化学的性質、及び位置を変更することによる微調整によって、初代肝細胞におけるＯＴＣのｍＲＮＡの用量依存的増大によって示されるように、親配列と比較して有効性の増大がもたらされた（図２１）。
【0296】
次に、選択されたＡＳＯを、ＯＴＣ欠損ドナー細胞株において特徴付けた。ＯＴＣ欠損ドナー由来の肝細胞を、インビトロで培養した。細胞を増殖培地にプレートし、プレートの４時間後、最終濃度１μΜ、３μΜ、及び９μΜのＡＳＯ ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－２ａ、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１２、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１１、及びｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ａで処理した。ランダム配列を含む非標的化対照（ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）（ＮＴＣ）ＡＳＯを、陰性対照（ＳＲＣ３）として使用した。上清を尿素生成分析のために回収し、細胞溶解物を処理後２日目及び６日目にｍＲＮＡのために回収した。ｍＲＮＡ分析のために、ｔａｑｍａｎプローブＨｓ００１６６８９２＿ｍ１を、ＯＴＣ発現のために使用した。ＯＴＣレベルを、Ｂ２Ｍ発現に対して正規化した。尿素生成については、回収した上清を、Ｕｒｅａ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＢＵＮ）比色検出キット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号：ＥＩＡＢＵＮ）により測定し、Ａｌｂｕｍｉｎ ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ、カタログ番号：Ｅ８８－１２９）によって正規化した。統計は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）の一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。
【0297】
図２２に示すように、ＯＴＣのｍＲＮＡの用量依存性の増大が、２日目及び６日目に複数のＡＳＯによる治療後に観察された。
【0298】
次に、インビトロでＰＢＭＣアッセイを行って、ＡＳＯ毒性を評価した。
【0299】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、新鮮なヒト全血（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ＬＬＣにより提供）から単離した。１５ｍｌの全血の容積を、１５ｍｌのＰＢＳ＋２％ＦＢＳと混合し、１５ｍｌのＦｉｃｏｌｌを含有するＳｅｐＭａｔｅ単離チューブ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に添加し、８００ｇで２０分間遠心分離した。得られた最上層を除去し、残りの単核細胞層を、２０ｍｌのＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄し、続いて３００ｇで８分間遠心分離した。ＰＢＳ＋２％のＦＢＳによる２回のさらなる洗浄を行った。３回目の洗浄の後、細胞ペレットを、赤血球溶解緩衝液（Ａｂｃａｍ，ａｂ２０４７３３）に１０分間再懸濁し、続いて４００ｇで５分間遠心分離した。次いで、ペレットを１０ｍｌのＰＢＳ＋２％ＦＢＳに再懸濁し、１２０ｇで１０分間遠心分離し、最後のＰＢＭＣペレットをＲＰＭＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に再懸濁した。単離したＰＢＭＣを、Ｖ底９６ウェルプレートに１ウェル当たり１０万細胞の密度で播種し、０．７μΜまたは１．４μΜのｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ａまたはＮＴＣで処理した。２４時間後、プレートを１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清をサイトカイン分析のために回収した。ヒトＴＮＦα、ＩＬ６、ＩＬ１β、ＩＦΝα及びＩＦΝβを、ダナ・ファーバーがん研究所（Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）と協同して、Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームを用いて定量した。
【0300】
図２３に示すように、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ａによる細胞の処理は、ＰＢＭＣによるサイトカイン放出を誘導しなかった。
【0301】
実施例４：マウスＯＴＣ ｒｅｇＲＮＡ標的化ＡＳＯのタイリング及び最適化
追加のマウスｒｅｇＲＮＡを標的とするマウスＡＳＯを作製し、試験した。合成され、特徴付けられたＡＳＯは、ｍＯＴＣ－ＡＳＯｅ－３、ｍＯＴＣ－ＡＳＯｅ－４、ｍＯＴＣ－ＡＳＯｅ－５、及びｍＯＴＣ－ＡＳＯｅ－６であった。
追加のマウスｒｅｇＲＮＡを標的とするマウスＡＳＯを作製し、試験した。合成され、特徴付けられたＡＳＯは、ｍＯＴＣ－ＡＳＯｅ－３、ｍＯＴＣ－ＡＳＯｅ－４、ｍＯＴＣ－ＡＳＯｅ－５、及びｍＯＴＣ－ＡＳＯｅ－６であった。
【0302】
新たに合成されたマウスＡＳＯを、上記のようにマウス初代肝細胞において試験した。要するに、初代肝細胞を、０日目に１ウェルあたり２０，０００細胞で播種した。２日目に細胞を１０、５、２．５、１．２５または０．６２５μＭのマウスＡＳＯで処理した。細胞を２日間インキュベートし、処理後の２日目に溶解物をｍＲＮＡ分析のために回収した。ｔａｑｍａｎプローブＭｍ０１２８８０５３＿ｍ１を、マウスＯＴＣ発現に使用した。Ｐｐｉａ及びＨｐｒｔを、遺伝子発現正規化のためのハウスキーパー遺伝子として使用した。統計は、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）の一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。
【0303】
図２４Ａに示すように、新たなマウスＡＳＯは、マウスＯｔｃ発現を用量依存的に増大させた。
【0304】
末端ＧａｌＮＡｃを、ｍＯＴＣ－ＡＳＯｅ－３にコンジュゲートさせ、ＡＳＯ ＣＯ－４４７４を得た。このＡＳＯを、ＯＴＣ欠損マウス（ＯＴＣｄｅｆ）においてアンモニウムチャレンジアッセイで試験した。簡単に述べると、１０匹の雄性Ｂ６ＥｉＣ３Ｓｎ ａ／Ａ－Ｏｔｃｓｐｆ－ａｓｈ／Ｊマウス（ホモ接合）及び１０匹のＣ５７ ＷＴマウスを、１週間に１回アンモニウムを用いて４週間処置し、１、３、５、８、１０、１２、１５及び１７日目にＡＳＯを投与した。マウスに１００ｍｇ／ｋｇ／週ＡＳＯまたは５０ｍｇ／週ＡＳＯのいずれかを投与した。試料は、先に記載したように、ＯＴＣのｍＲＮＡ定量のための研究の最後に回収した。
【0305】
図２４Ｂに示すように、Ｏｔｃ ｒｅｇＲＮＡ標的化ＡＳＯ ＣＯ－４４７４は、ＯｔｃｄｅｆマウスにおいてマウスＯＴＣのｍＲＮＡを増大させなかった。さらに、Ｏｔｃ ｒｅｇＲＮＡ標的化ＡＳＯ ＣＯ－４４７４は、他のマウスＵＣＤ遺伝子発現を変化させなかった。しかし、図２４Ｃに示すように、ＣＯ－４４７４は、アンモニアをＷＴレベルまで減少させた。従って、マウスＯｔｃ ＡＳＯは、Ｏｔｃ欠損表現型をレスキューできた。
【0306】
実施例５：ｒｅｇＲＮＡ標的化ＡＳＯは、エピゲノムＨ３Ｋ２７アセチル化の増大をもたらす
次に、ＡＳＯ処理後のヒト肝細胞における相対エンハンサー活性を評価した。
次に、ＡＳＯ処理後のヒト肝細胞における相対エンハンサー活性を評価した。
【0307】
単一ドナー（ＨＵＭ１８１３７１、Ｌｏｎｚａ）由来の初代ヒト肝細胞を、インビトロで培養した。７．５×１０６個の細胞を、１０ｃｍ２コラーゲンコーティングしたプレートを用いてプレート培地中にプレートし、プレートを１５分毎に攪拌して、細胞密度がプレート全体にわたって均一であることを確実にした。プレート４時間後にプレーティング培地を増殖培地に変更し、６日間４８時間毎に増殖培地を変更した。４日目の培地交換で、２μΜ ＡＳＯを増殖培地で希釈した。７．５×１０６個の肝細胞を、ＯＴＣエンハンサーから転写された（マイナス鎖）非コードＲＮＡ（ｒｅｇＲＮＡ）を標的とする非ターゲティング対照（ＮＴＣ）ＡＳＯまたはｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０のいずれかで処理した。肝細胞を、ＡＳＯで４８時間処理し、１１％ホルムアルデヒド（最終１％）を６日目に培養培地に添加することによって１５分間架橋した。ホルムアルデヒドを、２００ｍＭグリシンの添加により５分間クエンチし、細胞を掻き取り、氷冷１×ＰＢＳで３回洗浄した。
【0308】
架橋の前に、ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成（ランダムヘキサマー）及びｑＰＣＲ分析（それぞれＯＴＣｍＲＮＡ及びＰＰＩＡ ＴａｑＭａｎプローブ＃Ｈｓ００１６６８９２＿ｍ１及び＃Ｈｓ０４１９４５２１＿ｓ１）のために小さな周辺細胞掻き取りを回収して、ＮＴＣ ＡＳＯ処理と比較して、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０処理肝細胞におけるＯＴＣｍＲＮＡアップレギュレーションを検証した。サイクル閾値（ＣＴ）値を、内因性対照遺伝子（すなわち、ＰＰＩＡ）ＣＴ値（＝ｄＣＴ）に対して正規化し、相対倍率変化を、ＮＴＣ ＡＳＯ ｄＣＴ値からｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０ ｄＣＴを差し引くことによって算出した（図２５Ａ）。
【0309】
ＮＴＣ ＡＳＯまたはｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０のいずれかで処理した架橋肝細胞試料に対して、Ｈ３Ｋ２７ａｃクロマチン免疫沈降、続いてハイスループットシークエンシング（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）を行った。細胞ペレットを、氷冷ＬＢ１（５０ｍΜ Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ、ｐＨ７．５、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１４０ ｍＭ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１０％グリセロール溶液、０．５％ＮＰ－４０、０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）及び新鮮なプロテアーゼ阻害剤を用いて、４℃で１０分間溶解し、続いてＬＢ２（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ ｐＨ８．０、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＧＴＡ、ｐＨ８．０）及び新鮮なプロテアーゼ阻害剤を用いて４Ｃで１０分間インキュベートした。核を１３５０ ｒｃｆ、５分、４℃で遠心分離し、１ｍＬの超音波処理緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ、ｐＨ７．５、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．１％のＮａ－デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ）＋新鮮なプロテアーゼ阻害剤に再懸濁した。クロマチンを、Ｃｏｖａｒｉｓ ｆｏｃｕｓｅｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ（一点集中型超音波照射装置）及び条件（１０分の時間、充填レベル５、デューティサイクル５、ピーク入射パワー１４０、サイクル／バースト２００）を用いて断片化した。断片化されたクロマチンを２０，０００ｒｃｆ、５分、４℃で遠心分離して、上清をＤＮＡ低結合チューブに移した。５０μＬを、インプット用に保存した。５μｇの抗Ｈ３Ｋ２７ａｃ（ａｂｃａｍ＃ａｂ４７２９）を、ブロックした（０．５％ ＢＳＡ／１ＸＰＢＳ）プロテインＡコンジュゲート磁気ビーズと共に前日プレインキュベートした。クロマチン及びビーズ－抗体結合複合体を、合わせて、４℃で回転しながら、一晩インキュベートした。翌日、結合したクロマチン－ビーズを、１ｍＬの以下の緩衝液を用いて、それぞれ２Ｘ、５分、４℃で洗浄した：超音波処理緩衝液、洗浄緩衝液２（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ ｐＨ７．５、３５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．２％Ｎａ－デオキシコール酸塩、０．１％ＳＤＳ）、及び洗浄緩衝液３（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭのＬｉＣｌ、０．５％のＮａ－デオキシコール酸塩）。試料を、ＴＥ＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で１Ｘ、続いてＴＥで２Ｘ洗浄した。クロマチンを溶出し、ＳＤＳ溶出緩衝液中で６５℃で一晩逆架橋した（５０ｍＭ Ｔｒｉ－ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、１％ＳＤＳ）。ＣｈＩＰ試料を磁石上に置き、溶出した（逆架橋クロマチン（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｃｈｒｏｍａｔｉｎ））を新しいチューブに移した。試料（ＣｈＩＰ及びインプット）を、ＲＮａｓｅ Ａで３７℃で３０分間処理し、続いてプロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬ）で５５℃で９０分間処理した。ＤＮＡは、６００ｕＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを各試料に添加することによって精製し、ＭａＸｔｒａｃｔ高密度ゲル管（Ｑｉａｇｅｎ＃１２９０５６）を使用して、１６，０００ｒｃｆ、５分、４℃で遠心分離した。上清を酢酸Ｎａ及びエタノールで－２０℃で一晩沈殿させ、２０，０００ｒｃｆ、４℃で遠心分離し、１ｍＬの７５％エタノールで洗浄し、２５μＬのヌクレアーゼを含まない水に溶出した。製造業者のガイドラインに従って、ＮＥＢＮｅｘｔ ＤＮＡライブラリー準備キットを使用して、ハイスループットシークエンシングのためのライブラリー合成にｃｈＩＰ ＤＮＡ及びインプットＤＮＡを供した。各々２つの技術的複製からなる２つの生物学的複製（各ＡＳＯ処理について４つの試料）を、このアッセイに供した。
【0310】
Ｎｏｖｏｓｅｑ ＳＰ（１５０ｂｐ）を用いて、ＣｈＩＰ－ｓｅｑライブラリーをペアエンド配列決定し、Ｂｏｗｔｉｅ２を用いてヒトｈｇ３８ゲノムにアラインメントさせ、アラインメントファイルをＳａｍＴｏｏｌｓ及びＭＡＣＳ２を用いて呼び出されたピークを用いて処理した（図２５Ｂ）。ＯＴＣエンハンサー、ＯＴＣプロモーター及び対照領域（ＧＡＰＤＨ、ＲＰＧＲ、ＴＳＰＡＮ７）における示差的ピークを、正規化方法を通しかつＤＥＳｅｑ２を用いて、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０とＮＴＣ ＡＳＯ処理との間で同定した（図２５Ｃ）。
【0311】
図２５Ａは、処理の４８時間後のＮＴＣ ＡＳＯ及び未処理肝細胞と比較した場合の、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０によるＯＴＣのｍＲＮＡのアップレギュレーションを示しており、ＡＳＯ処理がＯＴＣのｍＲＮＡのアップレギュレーションに成功したことを示している。これらの試料を、その後のＨ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰ－ｓｅｑ実験に使用した。
【0312】
図２５Ｂは、ＯＴＣエンハンサー、ＯＴＣプロモーター及び隣接遺伝子ＲＰＧＲに対するゲノム・ブラウザ・トラック画像を示す。エンハンサー及びプロモーター領域は、実験的ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０及びＮＴＣ ＡＳＯ処理肝細胞の両方においてヒストンＨ３Ｋ２７アセチル化によって示され、ＯＴＣエンハンサーが培養ヒト肝細胞において活性である、ということを示す。
【0313】
図２５Ｃは、非標的化ＡＳＯ治療及び偽発見率（ＦＤＲ）と比較した、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０治療についてのＨ３Ｋ２７ａｃ後成的マークの倍率変化（ＦＣ）定量化を示す。このデータによって、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０による４８時間の処理が、非標的化ＡＳＯ処理の場合と比較して、ＯＴＣエンハンサーにおけるヒストンアセチル化（ＦＣ， １．７２－１．９３）を有意に増大させることが示される。ＧＡＰＤＨ、隣接遺伝子、ＲＰＧＲ、及びＴＳＰＡＮ７プロモーターなどの負の対照領域は、有意な増大したＨ３Ｋ２７ａｃ沈着を示さない。理論に拘束されることを望むものではないが、この結果は、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０からの観察された後成的効果（Ｈ３Ｋ２７ａｃの増大）が、ＯＴＣ遺伝子を調節すると予測される、標的領域（ＯＴＣエンハンサー）に特異的であることを示唆する。従って、理論に拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載のＡＳＯは、ＯＴＣエンハンサーにおけるエピゲノムシグネチャーを改変することによってＯＴＣ遺伝子発現を調節する。
【0314】
実施例６：ＡＳＯ処理は、ＯＴＣエンハンサーにおけるクロマチンの接近性を変化しない
次に、ｒｅｇＲＮＡのｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０結合は、ＡＳＯによって標的とされるエンハンサーにおけるクロマチンの接近性を直接的または間接的に増大させたことを評価した。
次に、ｒｅｇＲＮＡのｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０結合は、ＡＳＯによって標的とされるエンハンサーにおけるクロマチンの接近性を直接的または間接的に増大させたことを評価した。
【0315】
単一ドナー（ＨＵＭ１８１３７１、Ｌｏｎｚａ）由来の初代ヒト肝細胞を、インビトロで培養した。プレート４時間後にプレーティング培地を増殖培地に変更し、６日間４８時間毎に増殖培地を変更した。５日目に、培地を交換し、２μΜのＡＳＯを増殖培地で希釈した。肝細胞を、非標的化ＡＳＯまたはｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０のいずれかで２４時間処理した。単培養における初代ヒト肝細胞に最適化されたＡＴＡＣ－ｓｅｑを、Ｏｍｎｉ－ＡＴＡＣプロトコルを用いて行った。プレート上でのＤＮａｓｅ処理に続いて、肝細胞を取り外し、磁気死細胞除去キット（Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＃１３０－０９０－１０１）を用いて生細胞を濃縮した。１複製当たり約５万の生細胞を、Ｏｍｎｉ－ＡＴＡＣプロトコルに使用した。処理毎に３つの技術的複製を作成した。
【0316】
ＡＴＡＣ－ｓｅｑライブラリーを、Ｎｏｖｏｓｅｑ ＳＰ（１５０ｂｐ）を用いて対末端配列決定し、ヒトゲノムｈｇ３８にアラインメントさせた。アラインメントした読み取りを、それに従って処理し、Ｃｏｒｃｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７に使用した方法に記載のＭＡＣＳ２パイプラインを使用して、アクセス可能なクロマチン領域を特定した。
【0317】
図２６は、ＯＴＣプロモーター、及びエンハンサー及び隣接するＲＰＧＲプロモーターにおけるアクセス可能なクロマチン領域を示す（囲まれた領域で示す）。これらの結果は、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０がＯＴＣエンハンサーまたはプロモーターにおけるクロマチンのアクセス性の変化を引き起こさないことを示しており、ＡＳＯが転写因子（活性化因子）結合の下流で作用することを示唆している。
【0318】
実施例７：ｒｅｇＲＮＡに対するＡＳＯ効果は、ＯＴＣｍＲＮＡ転写バーストに先行する
次に、ＯＴＣｍＲＮＡの誘導によるＡＳＯ処理の際のｒｅｇＲＮＡ活性化の時間的応答、ならびにエンハンサーヒストン修飾「記憶」の活性化を評価した。
次に、ＯＴＣｍＲＮＡの誘導によるＡＳＯ処理の際のｒｅｇＲＮＡ活性化の時間的応答、ならびにエンハンサーヒストン修飾「記憶」の活性化を評価した。
【0319】
単一ドナー（ＨＵＭ１８１３７１、Ｌｏｎｚａ）由来の初代ヒト肝細胞を、インビトロで培養した。プレート４時間後にプレーティング培地を増殖培地に変更し、６日間４８時間毎に増殖培地を変更した。４～５日目に、細胞を種々の時点で（図２７Ａ～図２７Ｃに注記）、収集前に増殖培地中で希釈した５μΜのＡＳＯを用いて処理した。全てのウェルを、細胞溶解緩衝液を用いて同時に収集し、その後のＲＮＡ単離（ＭａｇＭａｘ ＭｉｒＶａｎａ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ｃＤＮＡ合成（ランダム六量体）、結晶デジタルＰＣＲ（ｃｄＰＣＲ；ｒｅｇＲＮＡ検出）及び定量－ＰＣＲ（ｑＰＣＲ；ｍＲＮＡ検出）を行った。実験は、生物学的三連（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）で行い、各々は技術三連を有する。
【0320】
ｃｄＰＣＲは、Ｓｔｉｌｌａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのｎａｉｃａ（登録商標）Ｃｒｙｓｔａｌ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（商標）システムを用いて行った。ｒｅｇＲＮＡの濃度を、カスタムＴａｑＭａｎアッセイを用いて決定し、内因性対照ＨＰＲＴ１（ＴａｑＭａｎアッセイ＃４３２６３２１Ｅ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に対して正規化した。相対倍率変化を、それぞれの時点でＮＴＣ ＡＳＯ処理細胞に対して正規化することによって算出した。
【0321】
ＯＴＣのｍＲＮＡに特異的なＴａｑＭａｎプローブ＃Ｈｓ００１６６８９２＿ｍ１を用いて定量ＰＣＲを行い、それぞれの値を内因性対照ＰＰＩＡ（ＴａｑＭａｎ内因性対照アッセイ＃４３２６３１６Ｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）に対して正規化した。相対倍率変化を、それぞれの時点でＮＴＣ ＡＳＯ処理細胞に対して正規化することによって算出した。技術的な三連を、各生物学的な三連について平均し、それらの値を棒グラフにプロットした（ｎ＝２生物学的）。各エラーバーは、標準偏差を表す。
【0322】
Ｈ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰ、続いてｑＰＣＲを、上記実施例５に記載のように、培養初代肝細胞に対して、５μΜ ＡＳＯを用いるという相違で行い、４日目または５日目のいずれかに処理し、６日目に収集した。ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ実験は、生物学的な一連および二連（それぞれ２４時間及び４８時間）で行った。ｑＰＣＲは、ＯＴＣエンハンサーのゲノム領域を増幅するように設計されたＳＹＢＲ及びプライマーを用いて行った。プロットされた値は、ＮＴＣ ＡＳＯ処理肝細胞に対して正規化されたｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０処理肝細胞の相対倍率変化である。
【0323】
エンハンサー（ｒｅｇＲＮＡ）で生成されたｅＲＮＡは、双方向に転写され、エンハンサー活性は、転写されたｅＲＮＡの量と相関することが示されている。ＯＴＣエンハンサーから転写された両ｒｅｇＲＮＡの相対発現レベルは、ＡＳＯ処理後に経時的に得られた（図２７Ａ及び図２７Ｂ）。
【0324】
図２７Ａは、ＡＳＯ処理後の経時的な標的（マイナス鎖）ｒｅｇＲＮＡの相対レベルを示す。効果は、処理後２時間という早い時点で測定され、効果サイズは８～１６時間まで減少される。アップレギュレーションは１８時間で再び観察され（赤い矢頭）、これらの遺伝子座が文献６に以前に記載されているように転写バーストを受けることを示唆している。
【0325】
図２７Ｂは、初期（１時間）及び後期（１８時間）（赤矢頭）の二峰性のアップレギュレーションを有する非標的（プラス）鎖に対する同様の効果を示す。
【0326】
図２７Ｃは、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０ ＡＳＯ処理後の経時的なＯＴＣのｍＲＮＡ効果を示す。ＯＴＣのｍＲＮＡは１２時間アップレギュレートされ、再び２４／４８時間後にアップレギュレートされる（矢頭）。この効果は、ｒｅｇＲＮＡ（マイナス及びプラス）で観察される類似の転写「バースト」現象を模倣する。予想通り、ｒｅｇＲＮＡのアップレギュレーションは、ＯＴＣのｍＲＮＡアップレギュレーションに先行し、ｒｅｇＲＮＡ濃度の増大の効果が、ＯＴＣのｍＲＮＡレベルの増大をもたらすことを示している。
【0327】
Ｈ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ結果（図２７Ｄ）は、Ｈ３Ｋ２７ａｃが、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０ ＡＳＯ処理の後（２４時間）の後に沈着することを示し、ＲＮＡに対する効果がこのエンハンサーにおける後成的変化に先行することを示している。ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０処理は、２４～４８時間のＨ３Ｋ２７ａｃ ＣｈＩＰシグナルの増大をもたらす。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの結果は、ヒストンＨ３上の残基Ｋ２７のアセチル化が、初期ｒｅｇＲＮＡ／ｍＲＮＡ誘導後にエンハンサー活性を維持するために重要であり得ることを示唆する。ＯＴＣ ＡＳＯに対する転写及びクロマチン応答の時間的モデルを、図２７Ｅに示す。
【0328】
実施例８：負の調節因子タンパク質結合は、ＡＳＯ処理により低減される
次に、ヒト肝細胞におけるｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０による処理後のＯＴＣエンハンサーにおけるリプレッサータンパク質複合体相互作用の摂動を評価した。ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０処理では、クロマチン到達性の有意な変化は観察されなかった（図２６）。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、任意の効果が、負の調節因子のような他のタンパク質の置換に起因し得ることを示した。
次に、ヒト肝細胞におけるｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０による処理後のＯＴＣエンハンサーにおけるリプレッサータンパク質複合体相互作用の摂動を評価した。ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０処理では、クロマチン到達性の有意な変化は観察されなかった（図２６）。理論に拘束されることを望むものではないが、これは、任意の効果が、負の調節因子のような他のタンパク質の置換に起因し得ることを示した。
【0329】
候補の負の調節因子を、ＨｅｐＧ２細胞から公的に入手可能なＥＮＣＯＤＥ ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータを用いて選択した。簡単に述べると、ＨｅｐＧ２細胞におけるＥＮＣＯＤＥ転写因子（ＴＦ）データを、ＯＴＣエンハンサーにおけるＴＦ占有についてフィルタリングし、さらなるフィルタリング基準により、負の制御機構に関連しない全てのＴＦを排除した。合計５つの負の調節因子タンパク質が、ＨｅｐＧ２細胞（ＡＲＩＤ１、ＢＣＬ６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ５及びＮＣＯＲ１）においてＯＴＣエンハンサーに結合することが見出された。ＳＰ１は、一般的な転写活性化に関与する転写因子であり、ＯＴＣエンハンサーに結合して見られ、対照として使用される。
【0330】
単一ドナー（ＨＵＭ１８１３７１、Ｌｏｎｚａ）由来の初代ヒト肝細胞を、インビトロで培養した。７．５×１０６個の細胞を、１０ｃｍ２コラーゲンコーティングしたプレートを用いてプレーティング培地中にプレートし、プレートを１５分毎に攪拌して、細胞密度がプレート全体にわたって均一であることを確実にした。プレート４時間後にプレーティング培地を増殖培地に変更し、６日間４８時間毎に増殖培地を変更した。５日目に、培地を交換し、５μΜのＡＳＯを増殖培地で希釈した。１．５×１０７個の肝細胞を、ＯＴＣエンハンサー（２ｘ１０ｃｍ２プレート）から転写された（マイナス鎖）非コードＲＮＡ（ｒｅｇＲＮＡ）を標的とするＮＴＣ ＡＳＯまたはｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０のいずれかで処理した。肝細胞を、特定のＡＳＯで２４時間処理し、１１％ホルムアルデヒド（最終１％）を６日目に培養培地に添加することによって１５分間架橋した。ホルムアルデヒドを、２００ｍＭグリシンの添加により５分間クエンチし、細胞を掻き取り、氷冷１×ＰＢＳで３×洗浄した。
【0331】
架橋の前に、小さな周辺細胞掻き取りを、ＲＮＡ単離のために回収して、実施例１に記載のＮＴＣ ＡＳＯ処理と比較して、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０処理肝細胞におけるＯＴＣのｍＲＮＡのアップレギュレーションを確認した（図１Ａ）。
【0332】
肝細胞をＡＳＯで２４時間処理し、続いてＣｈＩＰ ｑＰＣＲを、各リプレッサーＴＦ ＣｈＩＰ’ｄに対して生物学的三連で行った。
【0333】
ＡＲＩＤ１、ＢＣＬ６、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ５、ＮＣＯＲ１及びＳＰ１に対する特異的抗体を用いて、実施例１（図１Ｂ）に記載されるように、培養初代肝細胞に対して、各それぞれの負の調節因子に対するｃｈＩＰ及びその後のｑＰＣＲを行った（それぞれ、ｓｃ－３２７６１Ｘ、ＰＡ５２７３９０、４０９６７ＡＣＴＭＯＴＩＦ、４０９７０ＡＣＴＭＯＴＩＦ、＃Ａ３０１１４５Ａ、ｓｃ－１７８２４Ｘ）。ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ実験を、生物学的三連法（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｒｉｐｌｉｅｓ）で行った。ｑＰＣＲは、ＯＴＣエンハンサーのゲノム領域を増幅するように設計されたＳＹＢＲ及びプライマーを用いて、行った。プロットされた値は、ＮＴＣ ＡＳＯ処理肝細胞に対して正規化されたｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０処理肝細胞の相対倍率変化である。
【0334】
【0335】
ｒＣｈＩＰ－ｑＰＣＲを行って、標的タンパク質－クロマチン相互作用に対するＲＮＡの要件を評価した。アッセイは、標準的なＣｈＩＰプロトコルを用い、クロマチン－タンパク質複合体の免疫精製後にＲｎａｓｅ Ａ処理ステップを加えて行った。
【0336】
図２８Ａは、示された負の調節因子に対する結合の相対的損失を示す。５つの負の調節因子のうち、ＨＤＡＣ５及びＮＣＯＲのみが、ＮＴＣ ＡＳＯ処理と比較した場合に、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０で処理した肝細胞においてＯＴＣエンハンサーでの減少した結合を示した。これによって、ｒｅｇＲＮＡへのｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０結合が、これらのｒｅｇＲＮＡ及び関連するクロマチン（エンハンサー）が、ＨＤＡＣ５及びＮＣＯＲを含むリプレッサー複合体と相互作用することを（直接または間接的に）阻害することが示唆される。
【0337】
図２８Ｂによって、負の調節因子が、ＲＮＡ分子がそれらの標的に結合することを必要としないことが示される。架橋クロマチンをＲＮａｓｅで処理してＲＮＡを分解する場合、ＨＤＡＣ５及びＮＣＯＲ１の結合は、肝細胞（処理なし）中のＯＴＣエンハンサーでは低減されない。この結果、ｒｅｇＲＮＡがリプレッサータンパク質と相互作用せず、むしろ相互作用がＯＴＣエンハンサーへのそれらの動員に必須ではないことは示唆されない。
【0338】
実施例９：リプレッサー複合体のノックダウンは、ＯＴＣのｍＲＮＡアップレギュレーションに対するＡＳＯ処理の効果を低減する
次に、ＡＳＯ処理で観察された効果を低減するＯＴＣエンハンサーにおける結合リプレッサー複合体のノックダウンを評価した。
次に、ＡＳＯ処理で観察された効果を低減するＯＴＣエンハンサーにおける結合リプレッサー複合体のノックダウンを評価した。
【0339】
単一ドナー（ＨＵＭ１８１３７１，Ｌｏｎｚａ）由来の初代ヒト肝細胞を、４８ウェルのコラーゲンコーティングした組織培養プレートを用いてインビトロで培養した。プレート４時間後にプレーティング培地を増殖培地に変更し、４８時間毎に６日間増殖培地を変更した。３日目に、リポフェクタミンＲＮＡｉＭａｘ及び製造業者の推奨プロトコル（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、１３７７８１５０）を用いて、ＨＤＡＣ５、ＮＣＯＲ１（それぞれＤｈａｒｍａｃｏｎ Ｍ－００３４９８－０２－０００５及びＭ－００３５１８－０１－０００５）を標的とする１０ｎＭ ｓｉＲＮＡで細胞を１８時間トランスフェクトした。培地を翌日（４日目）に交換し、５μΜ ＮＴＣ ＡＳＯまたはｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０のいずれかを増殖培地で希釈し、４８時間培養し、肝細胞をＲＮＡ単離（ＭａｇＭａｘ ＭｉｒＶａｎａキット，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ＃Ａ２７８２８）、ランダムヘキサマーを用いたｃＤＮＡ合成、及びＯＴＣのｍＲＮＡ（ＴａｑＭａｎプローブ＃Ｈｓ０１０９４５４１＿ｍ１、Ｈｓ００６０８３５１＿ｍ１、Ｈｓ００１６６８９２＿ｍ１）に対するノックダウン効率及び効果を評価するためのｑＰＣＲ分析のために収集した。ＡＳＯ処理と組み合わせたノックダウン実験を、各々が３回の技術的複製（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）（１処理当たり）を伴う生物学的三連法で行った。グラフにプロットされた値は、各生物学的実験に対する技術的複製（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）の平均である（ｎ＝３）。
【0340】
各試料の相対ＣＴ値を内因性対照（ＰＰＩＡ）に対して正規化すること、及びｓｉＲＮＡ処理を行わない試料に基づいて倍率変化を算出することによって、ＨＤＡＣ５またはＮＣＯＲ１ ｓｉＲＮＡ処理のノックダウン効率を決定した。
【0341】
ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０活性に対するｓｉＨＤＡＣ５またはｓｉＮＣＯＲ１の効果を理解するために、全ての処理を、ノックダウンの交絡効果を減少させるためにそれぞれのｓｉＲＮＡ実験内でＮＴＣ ＡＳＯに対して正規化した。
【0342】
図２９Ａ～図２９Ｃにプロットされた値は、３つの生物学的複製実験由来の技術的三連（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）の平均である。各エラーバーは、標準偏差を表す。Ｐ－値は、各生物学的複製の平均を用いて、不対スチューデントｔ検定で算出する（ｎ＝３）。
【0343】
ｓｉＨＤＡＣ５またはｓｉＮＣＯＲ１の処理は、未処理の肝細胞と比較して、図２９Ａに示すように、標的ｍＲＮＡレベルの少なくとも５０％の低下をもたらした。
【0344】
図２９Ｂは、ＯＴＣのｍＲＮＡに対するＨＤＡＣ５またはＮＣＯＲ１ノックダウンの効果を示す。これらの因子のいずれかについてのｓｉＲＮＡ処理は、肝細胞におけるＯＴＣのｍＲＮＡ発現の増大をもたらし、これらの複合体がＯＴＣのｍＲＮＡ抑制に関与することが実証される。ＯＴＣエンハンサーにおけるこの抑制機構の緩和は、基礎ＯＴＣレベルの限界増大を引き起こす。
【0345】
ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０に対するノックダウンの効果を図２９Ｃに示す。ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０は、ＯＴＣのｍＲＮＡを有意に（ｐ値＝０．０１５４）アップレギュレートした（ＦＣ＝１．８１、ｓｉＲＮＡ処理なし）。ｓｉＨＤＡＣ５またはｓｉＮＣＯＲ１で処理した肝細胞は、ＮＴＣ ＡＳＯと比較して、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０を用いたＯＴＣのｍＲＮＡの有意なアップレギュレーションを示した（それぞれ、ＦＣ＝１．４１及び１．２８）。この実験によって、ＯＴＣのｍＲＮＡレベルが既にわずかに増大しているので、リプレッサー複合体タンパク質がノックダウンされた場合に、ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０がＯＴＣのｍＲＮＡに対して効果を有することが示される。
【0346】
理論に束縛されるものではないが、正常な恒常的細胞条件下では、ＯＴＣエンハンサー及び遺伝子体からそれぞれ転写されるｒｅｇＲＮＡ及びｍＲＮＡのレベルは低い。ＨＤＡＣ５及びＮＣＯＲ１のような負の調節因子は、エンハンサーに結合し、その低活性を調節する可能性が高く、ならびに転写活性化因子が遺伝子座をプライミングする（ｐｒｉｍｉｎｇ）ことが見出される。ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１０処理は、おそらくリプレッサー複合体結合の阻害を通じて、ｒｅｇＲＮＡレベルの増大をもたらす。このＯＴＣエンハンサーの活性化は、ＯＴＣ遺伝子において正の転写応答を促進し、従って、ＯＴＣエンハンサー及びプロモーターにおいて転写バーストを生じる（図３０）。
【0347】
実施例１０：非ヒト霊長類（Ｎｏｎ－Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｔｅ）におけるＡＳＯの特徴付け
材料及び方法
１５Ｎ－塩化アンモニウムを、ケンブリッジアイソトープ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ｉｓｏｔｏｐｅ）（Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）から得た。
材料及び方法
１５Ｎ－塩化アンモニウムを、ケンブリッジアイソトープ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ｉｓｏｔｏｐｅ）（Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）から得た。
【0348】
ＮＨＰについてのアンモニア測定及び尿素生成
カニクイザル［ＮＨＰ］におけるアンモニアチャレンジ及び尿素生成アッセイを、絶食状態、すなわち、一晩の食物離脱で、アンモニアチャレンジの前に行った。１５Ｎ－塩化アンモニア溶液をＮＨＰに皮下注射し、複数回の採血を０～１２０分間にわたって行い、直ちに血漿を遠心分離により得た。血漿のアリコートを、４℃でＩＤＥＸＸに輸送して、アンモニア レベルを測定した。他のアリコートをスナップ凍結し、ＮｏｖａＢｉｏＡｓｓａｙ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）に輸送して、１５Ｎ－尿素／総尿素レベルを測定した。
カニクイザル［ＮＨＰ］におけるアンモニアチャレンジ及び尿素生成アッセイを、絶食状態、すなわち、一晩の食物離脱で、アンモニアチャレンジの前に行った。１５Ｎ－塩化アンモニア溶液をＮＨＰに皮下注射し、複数回の採血を０～１２０分間にわたって行い、直ちに血漿を遠心分離により得た。血漿のアリコートを、４℃でＩＤＥＸＸに輸送して、アンモニア レベルを測定した。他のアリコートをスナップ凍結し、ＮｏｖａＢｉｏＡｓｓａｙ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）に輸送して、１５Ｎ－尿素／総尿素レベルを測定した。
【0349】
ＮＨＰのＡＳＯ処理
雄性カニクイザル（２～４歳齢）に、１回の５０ｍｇ／ｋｇ ＡＳＯを０日目に皮下注射し、２回目の用量を２１日目に与えた。陰性対照としてＰＢＳ。
雄性カニクイザル（２～４歳齢）に、１回の５０ｍｇ／ｋｇ ＡＳＯを０日目に皮下注射し、２回目の用量を２１日目に与えた。陰性対照としてＰＢＳ。
【0350】
結果
ＣＯ－５３１８（ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ａｓ）及びＣＯ－５３１９（ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ２－２ｗ）は、アンモニアを減少させ、ＮＨＰにおける尿素を増大させた（図３１）。従って、ＡＳＯは、ＮＨＰにおいて治療有効性を示す。
ＣＯ－５３１８（ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ１－１ａｓ）及びＣＯ－５３１９（ｈＯＴＣ－ＡＳＯｅ２－２ｗ）は、アンモニアを減少させ、ＮＨＰにおける尿素を増大させた（図３１）。従って、ＡＳＯは、ＮＨＰにおいて治療有効性を示す。
【0351】
実施例１１：ヒト化マウスにおけるＡＳＯの特徴付け
材料及び方法
ヒト化Ｙｅｃｕｒｉｓ ＦＲＧマウス研究のためのアンモニア測定及び尿素生成
Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドを有する雌性肝臓ヒト化Ｆａｈ－／－Ｒａｇ２－／－Ｉｌ２ｒｇ－／－［ＦＲＧ］マウスにおけるアンモニアチャレンジ及び尿素生成アッセイを、健常ヒト肝細胞で再増殖させ、絶食状態、すなわち、一晩の食物離脱で、アンモニアのチャレンジ前に行った。１、８、１５、及び２２日目（最終の収集後）に一晩の絶食後、腹腔内注射によって動物を１５ＮＨ４Ｃｌ（１５Ｎ－アンモニア）でチャレンジした。３０分後、尿及び血液（血漿に処理された）を回収した。血漿のアリコートを４度でＩＤＥＸＸ（Ｎｏｒｔｈ Ｇｒａｆｔｏｎ，ＭＡ）に輸送して、アンモニアレベルを測定した。他のアリコートをスナップ凍結し、ＮｏｖａＢｉｏＡｓｓａｙ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）に輸送して、１５Ｎ－尿素／総尿素レベルを測定した。
材料及び方法
ヒト化Ｙｅｃｕｒｉｓ ＦＲＧマウス研究のためのアンモニア測定及び尿素生成
Ｃ５７Ｂｌ／６バックグラウンドを有する雌性肝臓ヒト化Ｆａｈ－／－Ｒａｇ２－／－Ｉｌ２ｒｇ－／－［ＦＲＧ］マウスにおけるアンモニアチャレンジ及び尿素生成アッセイを、健常ヒト肝細胞で再増殖させ、絶食状態、すなわち、一晩の食物離脱で、アンモニアのチャレンジ前に行った。１、８、１５、及び２２日目（最終の収集後）に一晩の絶食後、腹腔内注射によって動物を１５ＮＨ４Ｃｌ（１５Ｎ－アンモニア）でチャレンジした。３０分後、尿及び血液（血漿に処理された）を回収した。血漿のアリコートを４度でＩＤＥＸＸ（Ｎｏｒｔｈ Ｇｒａｆｔｏｎ，ＭＡ）に輸送して、アンモニアレベルを測定した。他のアリコートをスナップ凍結し、ＮｏｖａＢｉｏＡｓｓａｙ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）に輸送して、１５Ｎ－尿素／総尿素レベルを測定した。
【0352】
マウス研究のためのＡＳＯ処理
８日目、１２日目、１５日目、及び１９日目に、５ヶ月齢の雌性ヒト化Ｙｅｃｕｒｉｓ ＦＲＧマウスに５０ｍｇ／ｋｇ／週のＡＳＯを皮下注射した。ＰＢＳを対照に用いた。
８日目、１２日目、１５日目、及び１９日目に、５ヶ月齢の雌性ヒト化Ｙｅｃｕｒｉｓ ＦＲＧマウスに５０ｍｇ／ｋｇ／週のＡＳＯを皮下注射した。ＰＢＳを対照に用いた。
【0353】
Ｏｔｃｓｐｆ／ａｓｈマウス研究のためのアンモニア測定及び尿素生成
野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ［ＷＴ］及びａ／Ａ－Ｏｔｃｓｐｆ－ａｓｈ／Ｊ，［ＯＴＣＤ］の両方におけるアンモニアチャレンジ及び尿素生成アッセイを、絶食状態、すなわち、一晩の食物離脱でアンモニアチャレンジ前に実施した。１５Ｎ－塩化アンモニア溶液を、ＷＴ及びＯＴＯＣＤマウスに皮下注射し、塩化アンモニア注射の３０分後に血液を採取し、直ちに血漿を遠心分離により得た。血漿のアリコートを、４度でＩＤＥＸＸに輸送して、アンモニアレベルを測定した。他のアリコートをスナップ凍結し、ＮｏｖａＢｉｏＡｓｓａｙ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ） に輸送して、１５Ｎ－尿素／総尿素レベルを測定した。
野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ［ＷＴ］及びａ／Ａ－Ｏｔｃｓｐｆ－ａｓｈ／Ｊ，［ＯＴＣＤ］の両方におけるアンモニアチャレンジ及び尿素生成アッセイを、絶食状態、すなわち、一晩の食物離脱でアンモニアチャレンジ前に実施した。１５Ｎ－塩化アンモニア溶液を、ＷＴ及びＯＴＯＣＤマウスに皮下注射し、塩化アンモニア注射の３０分後に血液を採取し、直ちに血漿を遠心分離により得た。血漿のアリコートを、４度でＩＤＥＸＸに輸送して、アンモニアレベルを測定した。他のアリコートをスナップ凍結し、ＮｏｖａＢｉｏＡｓｓａｙ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ） に輸送して、１５Ｎ－尿素／総尿素レベルを測定した。
【0354】
マウス研究のためのＡＳＯ処理
雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ［ＷＴ］及びａ／Ａ－Ｏｔｃｓｐｆ－ａｓｈ／Ｊ，［ＯＴＣＤ］（６～７週齢）に、１、３、５、８、１０、１２、１５、及び１７日目に、５０または１００ｍｇ／ｋｇ／週のいずれかでＡＳＯを皮下注射した。陰性対照としてＰＢＳ。
雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ［ＷＴ］及びａ／Ａ－Ｏｔｃｓｐｆ－ａｓｈ／Ｊ，［ＯＴＣＤ］（６～７週齢）に、１、３、５、８、１０、１２、１５、及び１７日目に、５０または１００ｍｇ／ｋｇ／週のいずれかでＡＳＯを皮下注射した。陰性対照としてＰＢＳ。
【0355】
Ｔａｑｍａｎプローブ（すべてＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ製）
【0356】
結果
ＮＨ４Ｃｌチャレンジをヒト化マウスに与えて、ＡＳＯの尿素生成に対する影響を測定した。図３２に示すように、ＣＯ－５３１８及びＣＯ－５３１９の両方がＯＴＣ及びＣＰＳ１ ｍＲＮＡ発現を変化させる。しかし、図３３に示されるとおり、ヒト化マウスにおけるＣＯ－５３１８及びＣＯ－５３１９処理は、経時的にアンモニアの減少及び尿素の対応する増大を示した。二元配置ＡＮＯＶＡ、＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１，＊＊＊：Ｐ＜０．００１，＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１。
ＮＨ４Ｃｌチャレンジをヒト化マウスに与えて、ＡＳＯの尿素生成に対する影響を測定した。図３２に示すように、ＣＯ－５３１８及びＣＯ－５３１９の両方がＯＴＣ及びＣＰＳ１ ｍＲＮＡ発現を変化させる。しかし、図３３に示されるとおり、ヒト化マウスにおけるＣＯ－５３１８及びＣＯ－５３１９処理は、経時的にアンモニアの減少及び尿素の対応する増大を示した。二元配置ＡＮＯＶＡ、＊：Ｐ＜０．０５，＊＊：Ｐ＜０．０１，＊＊＊：Ｐ＜０．００１，＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１。
【0357】
参照による組み込み
別段の記載がない限り、本明細書において参照される特許資料及び科学論文の各々のすべての開示は、あらゆる目的のために参照により援用される。
別段の記載がない限り、本明細書において参照される特許資料及び科学論文の各々のすべての開示は、あらゆる目的のために参照により援用される。
【0358】
等価物
本発明は、その精神または本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得る。したがって、前述の実施形態は、本明細書に説明される本発明を限定するものではなく、あらゆる点において例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明によってではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び均等の範囲内に入るすべての変更は、その中に含まれることが意図される。
本発明は、その精神または本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得る。したがって、前述の実施形態は、本明細書に説明される本発明を限定するものではなく、あらゆる点において例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明によってではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び均等の範囲内に入るすべての変更は、その中に含まれることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【図18C】
【図18D】
【図18E】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【図24C】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【国際調査報告】