特表 2024-534231 ＣＫ２媒介リン酸化を阻害する線状ペプチド及びそれを含む組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-18

(54)【発明の名称】ＣＫ２媒介リン酸化を阻害する線状ペプチド及びそれを含む組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 7/06 20060101AFI20240910BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20240910BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240910BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240910BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20240910BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240910BHJP

   C07K 14/00 20060101ALI20240910BHJP

   C07K 7/08 20060101ALN20240910BHJP

   C07K 14/16 20060101ALN20240910BHJP

【ＦＩ】

C07K7/06

A61K38/08 ZNA

A61P35/00

A61P35/02

A61K47/42

C07K19/00

C07K14/00

C07K7/08

C07K14/16

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024514574

(86)(22)【出願日】2022-07-07

(85)【翻訳文提出日】2024-03-05

(86)【国際出願番号】 CU2022050007

(87)【国際公開番号】W WO2023280330

(87)【国際公開日】2023-01-12

(31)【優先権主張番号】2021-0058

(32)【優先日】2021-07-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CU

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】304012895

【氏名又は名称】セントロ デ インジエニエリア ジエネテイカ イ バイオテクノロジア

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】マスフォロール ゴンザレス、ヨルダンカ

(72)【発明者】

【氏名】ガライ ペレス、ヒルダ、エリサ

(72)【発明者】

【氏名】レジェス アコスタ、オズワルド

(72)【発明者】

【氏名】ペレラ ネグリン、ヤセル

(72)【発明者】

【氏名】カバレロ メネンデス、エヴェリン

(72)【発明者】

【氏名】ゴンザレス レぺス、ルイス、ハビエル

(72)【発明者】

【氏名】ベサーダ ペレス、ウラジミール、アルマンド

(72)【発明者】

【氏名】ペレア ロドリゲス、シルビオ、エルネスト

(72)【発明者】

【氏名】ギレン ニエト、ジェラルド、エンリケ

(72)【発明者】

【氏名】ゴンザレス ブランコ、ソニア

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB21

4C076CC27

4C076EE41N

4C076FF34

4C084AA02

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA09

4C084BA17

4C084BA23

4C084CA59

4C084DC32

4C084MA52

4C084MA56

4C084MA65

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA15

4H045BA17

4H045BA40

4H045CA05

4H045DA55

4H045EA20

(57)【要約】

配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５７～配列番号６２として特定される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、酵素カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）によって媒介されるリン酸化を阻害する線状ペプチド、ならびに前記ペプチド及び細胞内透過性ペプチドを含むポリペプチド。これらの線状ペプチド又はポリペプチドの少なくとも１つと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。本発明はまた、薬物の製造のための前記ペプチド又はポリペプチドの使用、及び前記薬物が投与される固形又は液状腫瘍を治療する方法を開示する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５７～配列番号６２として特定される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を特徴とする、酵素カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）によって媒介されるリン酸化を阻害する線状ペプチド。

【請求項2】

請求項１に記載の酵素カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）によって媒介されるリン酸化を阻害する線状ペプチドと、細胞内透過性ペプチドとを含むポリペプチド。

【請求項3】

細胞内透過性ペプチドが、ヒト免疫不全ウイルスのＴａｔ１タンパク質由来のペプチドである、請求項２に記載のポリペプチド。

【請求項4】

細胞内透過性ペプチドが、配列番号６５又は配列番号６６として特定されるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載のポリペプチド。

【請求項5】

配列番号３５、配列番号４７、配列番号４８及び配列番号５１～配列番号５６として特定される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項４に記載のポリペプチド。

【請求項6】

請求項１に記載のカゼインキナーゼ２（ＣＫ２）媒介リン酸化を阻害する少なくとも１つの線状ペプチド又は請求項２～５のいずれかに記載のポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。

【請求項7】

全身、腫瘍内、経口、又は粘膜経路による投与のために製剤化される、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

固形又は液状腫瘍の治療に有用である、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項9】

医薬を製造するための、請求項１に記載のカゼインキナーゼ２（ＣＫ２）によって媒介されるリン酸化を阻害する線状ペプチド、又は請求項２～５のいずれかに記載のポリペプチドの使用。

【請求項10】

医薬が、固形又は液状腫瘍の治療に使用される、請求項９に記載の使用。

【請求項11】

治療有効量の請求項６に記載の医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする個体における固形又は液状腫瘍の治療方法。

【請求項12】

固形腫瘍が、肺、子宮頸部、喉頭、膵臓又は膀胱のものである、請求項１１に記載の治療方法。

【請求項13】

液状腫瘍が、慢性リンパ性白血病、Ｔ型急性リンパ芽球性白血病、又は急性骨髄性白血病である、請求項１１に記載の治療方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、分子薬理学及びヒト医学の分野に関する。特に、本発明は、基質上のホスホアクセプター部位との直接相互作用を介して、酵素カゼインキナーゼ２（ＣＫ２）によって媒介されるリン酸化事象を阻害する線状ペプチドを得ることに関する。それらの生物学的活性によって、本発明のペプチド及びポリペプチドは、固形腫瘍及び他の起源の異なるタイプの治療に有用である。

【背景技術】

【0002】

ＣＫ２は、細胞増殖の増加に関与するセリン／トレオニン酵素であり、その細胞内局在は、基本的に悪性転換の過程中の核である（Ｔａｗｆｉｃ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２００１、Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１６：５７３－５８２）。したがって、この酵素は、魅力的な治療標的となる。（Ｄｕｎｃａｎ Ｊ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７８４：３３－４７）。

【0003】

ＣＫ２酵素媒介リン酸化事象は、４，５，６，７－テトラブロモベンゾトリアゾール（ＴＢＢ）（Ｐａｇａｎｏ Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４７：６２３９－６２４７）、アンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｓｌａｔｏｎ Ｊ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２：７１２－７２０）及び酵素の触媒サブユニットと調節サブユニットとの間の相互作用を遮断するペプチド（Ｌａｕｄｅｔ Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，４０８：３６３－３７３）に由来する化学化合物を使用することによって、実験腫瘍学において操作されている。化学化合物ＣＸ－４９４５は、酵素ＣＫ２の２つの触媒サブユニットを阻害し（Ｓｉｄｄｉｑｕｉ－Ｊａｉｎ Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０：１０２８８－１０２９８）、インビトロでの強力な細胞増殖阻害剤であり、５．５μＭの平均最大阻害濃度（ＩＣ_５０）を有する。このＣＫ２酵素阻害剤のみがヒトで十分に評価され、第Ｉ相臨床試験で好ましい薬物動態及び安全性パラメータが記録された（Ｌｉｍ Ｊ．Ｋ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０：２７６３－２７６６）。このＣＫ２酵素阻害剤のみがヒトで十分に評価され、第Ｉ相臨床試験で好ましい薬物動態及び安全性パラメータが記録された。（特許請求ＷＯ０３／０５４００２；Ｐｅｒｅａ Ｓ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６４：７１２７－７１２９）。

【0004】

ＣＩＧＢ－３００ペプチドは、基質上のＣＫ２ホスホアクセプター部位と相互作用する環状ペプチドと、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＴａｔ１タンパク質由来の「細胞内浸透」ペプチドとを含むキメラ分子であり、細胞内でのその内在化を確保する。ＣＩＧＢ－３００は、固形腫瘍の様々な系統、例えば肺、子宮頸部、喉頭（Ｐｅｒｅｒａ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２（６）：９３５－９４４）、ならびに液状腫瘍、例えば慢性リンパ性白血病（Ｍａｒｔｉｎｓ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，５（１）：２５８－２６３）及びＴ型急性リンパ芽球性白血病（Ｐｅｒｅｒａ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ｃａｎｃｅｒｓ，１２，１３７７）において、インビトロ及びインビボで抗増殖特性及びアポトーシス促進特性を示している。さらに、このペプチドは、第Ｉ／ＩＩ相臨床試験で検証された臨床的利益の徴候を示した（Ｐｅｒｅａ Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３５６（１－２）：４５－５０）（Ｓａｒｄｕｙ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１１２：１６３６－１６４３）。

【0005】

しかしながら、ＣＩＧＢ－３００は、２５アミノ酸のペプチドであり、その配列中にメチオニン及び分子内ジスルフィド結合を含有する。これらは、分子内の化学的不安定性の原因であり、液体又は凍結乾燥製剤及び安定性研究のいずれにおいても、製品開発のより高い段階での不一致の原因となり得る。（Ｆｒｏｋｊａｅｒ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ）。このペプチドに存在する主な不純物は、メチオニンの酸化、及び分子間ジスルフィド結合の形成による凝集体（二量体及び三量体）の形成に起因する。（Ｇａｒａｙ Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｊ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．２４（６）：ｅ３０８１）．一方、システインを含有するペプチドの合成プロセスは、より厄介であり、（Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｆｍｏｃ ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．Ｃｈａｐｔｅｒ ４，７７－１１４）、分子内ジスルフィド結合の形成は、製造プロセスに追加の工程を導入し、製造コストを増加させる。したがって、線状ペプチドタイプであり、よりサイズ及び構造的複雑性が減少した、合成がより単純かつ安価である、ＣＫ２酵素によって媒介されるリン酸化の阻害剤を、種々の腫瘍に対する治療の開発のために得ることは依然として興味深い。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、ＣＫ２媒介リン酸化を阻害し、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５７～配列番号６２として特定される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する線状ペプチドを提供することによって、上記の問題を解決する。これらの配列を以下に示す：

【表1】

【0007】

これらのペプチドは、それらが線状であり、サイズがより小さく、化学的により安定であるという点でＣＩＧＢ－３００とは異なる。それらは、それらの配列中にメチオニン又はシステインを有さず、それは利点である。加えて、生産的な観点から、獲得はより実現可能である。

【0008】

配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５７～配列番号６２として特定される線状ペプチドが、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）－１６（ＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩ）のＥ７基質上のＣＫ２酵素のホスホアクセプター部位と相互作用する能力、及びこのがんタンパク質のＣＫ２媒介リン酸化を阻害する能力のために選択された。本発明の例に見られるように、これらの線状ペプチドは、ペプチドＣＩＧＢ－３００と同様の様式でＥ７タンパク質のＣＫ２媒介リン酸化を阻害することができる。

【0009】

内因性ＣＫ２基質に対する細胞内作用を達成するために、本発明のペプチドは、とりわけ、ＨＩＶのＴａｔ１タンパク質（Ｓｃｈｗａｒｚｅ Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２１：４５－４８）、ｌａ ｐｒｏｔｅｉｎａ ＶＰ２２ ｄｅｌ Ｖｉｒｕｓ Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｓ（Ｌｉｎｄｇｒｅｅｎ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ，２１：９９－１０３）、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ及びＴｒａｎｓｐｏｒｔａｎ（Ｇａｒｉｅｐｙ Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ １９：２１－２８）などのタンパク質に属する「細胞内透過」のペプチドと化学的にコンジュゲートすることができる。

【0010】

したがって、本発明はまた、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０、及び配列番号５７～配列番号６２として特定される配列から選択されるアミノ酸配列を有する線状ペプチドと、１つの細胞透過性ペプチドとを含むポリペプチドを提供する。

【0011】

本発明の一実施形態では、これらのポリペプチド中の細胞内透過性ペプチドは、ＨＩＶのＴａｔ１タンパク質由来のペプチドである。その一実施形態では、細胞内透過性ペプチドは、配列番号６５、配列番号６６いずれかとして特定されるアミノ酸配列を有する。

【0012】

特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号３５、配列番号４７、配列番号４８及び配列番号５１～配列番号５６として特定される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。これらの配列を以下に示す：

【表2】

【0013】

これらのポリペプチドのほとんどは、様々ながん細胞株（肺、膀胱、喉頭、膵臓、及び白血病）においてＩＣ_５０が低いため、ペプチドＣＩＧＢ－３００よりも活性である。ポリペプチドは、がん細胞の増殖に対して用量依存的効果をもたらすことができた。さらに、配列番号３５として特定されるポリペプチドは、これらの細胞株においてＣＩＧＢ－３００と同様のＩＣ_５０値を示す。しかしながら、それは、よりサイズが小さく、より化学的に安定した線状アミノ酸配列を有しており、治療用製品の開発を促進する生産的利点を有するので、優れていると考えられる。

【0014】

本発明に記載されるペプチドの特定のために、１６００万を超える種々のペプチド配列を含む、タイプ「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ－ｂｅａｄ－ｏｎｅ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」による線状ペプチドのコンビナトリアルライブラリーを合成し、ビオチンで修飾されたＥ７がんタンパク質の２８～３８領域を含む合成ペプチドを用いてスクリーニングを行った。質量分析を用いて、スクリーニングに陽性であった９つのビーズに含まれるペプチドの配列を指定した。配列番号１～配列番号９と特定されたペプチドを化学合成し、それらがＨＰＶ－１６のＥ７がんタンパク質におけるＣＫ２媒介リン酸化を阻害できることを確認した。内在性ＣＫ２基質に対する細胞内作用を達成するために、９つのペプチドを含むポリペプチドを設計及び合成し、ＨＩＶ Ｔａｔ１タンパク質に対応する細胞内透過ペプチドをＮ末端に付加した（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ、配列番号６５として特定）。次に、ＮＣＩ－Ｈ１２５株（非小細胞肺がん）の細胞増殖に対するこれら９つのポリペプチドの効果を評価した。評価した濃度の範囲では、いずれのポリペプチドもＣＩＧＢ－３００と同様の阻害値に達しなかった。それらのうち、配列番号１８～配列番号２０として特定される３つのみが、試験した最高濃度で２０％～３０％の細胞増殖を阻害したので、それらの配列を修飾して、それらの生物学的活性を改善した。

【0015】

配列番号１８～配列番号２０として特定されたポリペプチドの生物学的活性に対するＴｒｐ取り込みの影響を評価するために、Ｔｒｐポジショナルスキャニングライブラリーを設計及び入手した。次に、Ｔｒｐライブラリーで生成された２４個のポリペプチド（配列番号２１～配列番号４４として特定される）のＮＣＩ－Ｈ１２５細胞株における抗増殖効果。２４個のポリペプチドのうち、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３２、配列番号３５及び配列番号４３として特定された６個は、評価された最高濃度でペプチドＣＩＧＢ－３００と同様の細胞増殖阻害率を示した。ＮＣＩ－Ｈ１２５及びＡｓＰＣ－１（膵臓腺がん）細胞株において得られた、配列番号３５として特定されるポリペプチド及びＣＩＧＢ－３００のＩＣ_５０値は同等である。特に、配列番号３５として特定されるポリペプチドは、より小さいサイズの線状配列であり、化学的により安定であり、生産上の利点を有するので、ＣＩＧＢ－３００よりも優れていると考えられる。

【0016】

本発明において配列番号４７及び配列番号４８として特定される、ＣＩＧＢ－３００ペプチドよりも活性な他の２つの線状ポリペプチドは、配列番号３５として特定されるポリペプチドの３つの位置に第２のＴｒｐ残基を導入した試験の結果である。配列番号４７及び配列番号４８として特定されるポリペプチドは、膵臓がん（ＡｓＰＣ－１、ＰａｎＣ－１）及び急性骨髄性白血病（ＯＣＩ－ＡＭＬ３）細胞株における細胞増殖を阻害する能力において、ペプチドＣＩＧＢ－３００よりも強力であり、使用した肺がん細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１２５）ではＣＩＧＢ－３００と同様であることが示された。

【0017】

配列番号４７及び配列番号４８として特定される配列に非天然アミノ酸を酵素分解を受けやすい部位に導入した結果、配列番号５１～配列番号５６として特定される、ＣＩＧＢ－３００よりも活性な６個の新しい線状ポリペプチドが得られた。ＮＣＩ－Ｈ１２５、Ｈｅｐ２Ｃ（喉頭がん）細胞株及び２つの膀胱がん株（ＭＧＨ－Ｕ３及びＭＧＨ－Ｕ４）で抗増殖アッセイを行った。ＮＣＩ－Ｈ１２５、Ｈｅｐ２Ｃ、ＭＧＨ－Ｕ３及びＭＧＨ－Ｕ４細胞株で得られた配列番号５１～配列番号５６として特定されたペプチドのＩＣ_５０値は、ＣＩＧＢ－３００で得られたものよりも低く、それらがより強力であることを示している。膀胱がん系統（ＭＧＨ－Ｕ３及びＭＧＨ－Ｕ４）の場合、ＣＩＧＢ－３００と比較してＩＣ_５０値が一桁低いことは非常に魅力的であり、なぜなら、それはわずかに調査されたニッチであり、分解されず、健康に大きな影響を与えるからである。非天然アミノ酸の導入を行って、プロテアーゼに対する安定性を高めた。驚くべきことに、ＣＫ２媒介リン酸化を阻害するこれらのポリペプチドの能力を増強することも可能であった。

【0018】

本発明はまた、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５７～配列番号６２として特定される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの線状ペプチド、又は配列番号３５、配列番号４７、配列番号４８及び配列番号５１～配列番号５６として特定される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。

【0019】

本発明の医薬組成物の一部を形成することができる賦形剤は、当業者に公知である。本発明の一実施形態では、医薬組成物は、全身、腫瘍内、経口、又は粘膜経路による投与のために製剤化される。本発明の一実施形態では、医薬組成物は、それを必要とする個体における固形又は液状腫瘍の治療に有用である。

【0020】

本発明の目的は、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５７～配列番号６２として特定される配列からなる群から選択される配列を有する線状ペプチド、又は配列番号３５、配列番号４７、配列番号４８及び配列番号５１～配列番号５６として特定される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドの、薬物を製造するための使用である。

【0021】

本発明の一実施形態では、前記医薬は、固形又は液状腫瘍の治療に使用される。

【0022】

別の態様において、本発明は、必要とする個体における固形又は液状腫瘍を治療する方法を開示し、方法は、治療有効量の、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５０及び配列番号５７～配列番号６２として特定される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つの線状ペプチド、又は配列番号３５、配列番号４７、配列番号４８及び配列番号５１～配列番号５６として特定される配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む。本発明の一実施形態では、治療される固形腫瘍は、肺、子宮頸部、喉頭、膵臓、又は膀胱の腫瘍である。本発明の別の実施形態では、治療される液状腫瘍は、慢性リンパ性白血病、Ｔ型急性リンパ芽球性白血病、又は急性骨髄性白血病である。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】ＨＰＶ－１６Ｅ７がんタンパク質のＣＫ２媒介リン酸化に対する、配列番号１～配列番号９の合成ペプチドの効果。ＣＫ２酵素のホスホアクセプター部位と相互作用しない２つのペプチド（配列番号１０及び配列番号１１として特定される）。毎分カウント（ｃｐｍ）をＹ軸にプロットする。

【図2】配列番号１２～配列番号２０として特定される９つのポリペプチドの、ＮＣＩ－Ｈ１２５細胞株における細胞増殖の阻害率（％Ｉ）。ペプチドＣＩＧＢ－３００及びＴａｔをアッセイの陽性対照（ポジティブコントロール）及び陰性対照（ネガティブコントロール）としてそれぞれ使用した。２０％以上の細胞増殖の阻害率を示すポリペプチドを選択した。

【図3】ＮＣＩ－Ｈ１２５細胞株におけるポリペプチドＦ１１Ｐ１９、Ｆ１１Ｐ２０及びＦ１１Ｐ２１（配列番号１８～配列番号２０）の用量－効果曲線。アッセイの陽性対照として使用したＣＩＧＢ－３００ペプチドの用量－効果曲線を含める。％ Ｉ：細胞増殖の阻害率Ｃ：濃度

【図4】配列番号１８～配列番号２０として特定される配列から、電荷でのＴｒｐ残基の位置掃引（ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｓｗｅｅｐ）により（配列番号２１～配列番号４４）生成されたポリペプチドについての、ＮＣＩ－Ｈ１２５細胞株における細胞増殖の阻害率（％ Ｉ）。Ａ．２つの濃度での、配列番号２１～配列番号４４として特定されるポリペプチドによって達成される阻害率。配列番号１８～配列番号２０として特定される前駆体ペプチド及び陽性対照としてのＣＩＧＢ－３００。破線の囲みは、２００μＭで６０％超の細胞増殖阻害を示した６つのポリペプチド及びＣＩＧＢ－３００を概説している。Ｂ．最も活性な６つのポリペプチドの、１２．５μＭ～２００μＭの様々な濃度によって達成される阻害率。

【図5】ＮＣＩ－Ｈ１２５細胞株におけるポリペプチドＡ１４Ｐ２７（配列番号２１）、Ａ１４Ｐ３１（配列番号２５）、Ａ１４Ｐ３３（配列番号２７）、Ａ１４Ｐ４３（配列番号３２）、Ａ１４Ｐ４６（配列番号３５）、Ａ１４Ｐ５９（配列番号４３）の用量－効果曲線。対照ペプチドとして使用したＣＩＧＢ－３００ペプチドの用量－効果曲線を含める。％ Ｉ：細胞増殖の阻害率Ｃ：濃度

【図6】ＡｓＰＣ－１細胞株におけるポリペプチドＡ１４Ｐ４６（配列番号３５）及びＣＩＧＢ－３００ペプチドの用量－効果曲線。％ Ｉ：細胞増殖の阻害率。Ｃ：濃度

【図7】ＮＣＩ－Ｈ１２５細胞株におけるポリペプチドＡ１５Ｐ３５、Ａ１５Ｐ３６及びＡ１５Ｐ３７（配列番号４６～配列番号４８）の用量－効果曲線。前駆体ポリペプチドＡ１４Ｐ４６（配列番号３５）、及び対照として使用したＣＩＧＢ－３００ペプチドが含まれる用量－効果曲線。％ Ｉ：細胞増殖の阻害率。Ｃ：濃度

【図8】ＮＣＩ－Ｈ１２５細胞株におけるポリペプチドＥ１７Ｐ０１、Ｅ１７Ｐ０２及びＥ１７Ｐ０３（配列番号５１～配列番号５３）の用量－効果曲線。前駆体ポリペプチドＡ１５Ｐ３６の用量－効果曲線が含まれる。（配列番号４７）及び対照として使用したＣＩＧＢ－３００。％ Ｉ：細胞増殖の阻害率。Ｃ：濃度

【図9】ＮＣＩ－Ｈ１２５細胞株におけるポリペプチドＤ１７Ｐ７８、Ｄ１７Ｐ７９及びＤ１７Ｐ８０（配列番号５４～配列番号５６）の用量－効果曲線。前駆体ポリペプチドＡ１５Ｐ３７（配列番号４８）、及び対照として使用したＣＩＧＢ－３００が含まれる用量－効果曲線。％ Ｉ：細胞増殖の阻害率。Ｃ：濃度

【図10】胸腺欠損マウスに移植したヒト膀胱腫瘍モデルにおける、ＣＫ２リン酸化のポリペプチド阻害剤Ｅ１７Ｐ０１（配列番号５１）の抗腫瘍効果。

【発明を実施するための形態】

【実施例】

【0024】

例１．ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質中のＣＫ２酵素のホスホアクセプター部位と相互作用する線状ペプチドの選択。
ＣＫ２酵素のホスホアクセプター部位と相互作用する生物活性線状ペプチドを特定するために、１６００万を超える種々のペプチド配列を含む、「１ビーズ１化合物（ｏｎｅ－ｂｅａｄ－ｏｎｅ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」のタイプによりＢＣＰ－１と命名された合成線状ペプチドのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングした。このライブラリーは、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）配列分析（Ｍａｓｆｏｒｒｏｌ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＡＣＳ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４（３）：１４５－９）に適合するように設計された。スクリーニングは、ＨＰＶ－１６（配列番号６３として特定されるＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩ）のＥ７基質中にＣＫ２酵素のホスホアクセプター部位を含有する、ＢＩＯＴと呼ばれるビオチン化合成ペプチドを用いて行った。ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼコンジュゲートを認識分子として使用し、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルリン酸ｐ－トルイジン塩（ＢＣＩＰ）を成長用基質として使用した。青色は、ＢＣＰ－１ライブラリーにおけるＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂の明るい淡黄色と比較して、ＢＩＯＴペプチドによって認識される生物活性配列を含有するビーズの視覚的識別を容易にする。ＢＩＯＴペプチドは、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を用いて４－メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂上で合成した（Ｆｉｅｌｄ ＧＢ ａｎｄ Ｎｏｂｌｅ ＲＬ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．１９９０；３５（３）：１６１－２１４）。これを逆相クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）によって精製し、その同一性をＥＳＩ－ＭＳによって確認した。それは９５％を超える純度で得られ、ＥＳＩ－ＭＳ分析により、その分子量（ＭＭ）が１５７４．６Ｄａであることが確認された。

【0025】

ＢＣＰ－１ライブラリーを、真空濾過システム及び機械的撹拌を備えたポリプロピレン反応器に入れた。これを精製水及び生理食塩水リン酸緩衝液（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で洗浄し、ＰＢＳ ｐＨ７．４中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロックした。溶媒及び試薬を真空濾過によって除去した。ライブラリーを、ＰＢＳ ｐＨ７．４中１％ ＢＳＡ中１５０μｇ／ｍＬのＢＩＯＴペプチド溶液８０ｍＬと共に４℃で１６時間インキュベートした。これをＴｗｅｅｎ－ＰＢＳ（Ｔ－ＰＢＳ）ｐＨ７．４で洗浄し、ＰＢＳ ｐＨ７．４中の１％ ＢＳＡの溶液中でストレプトアビジン－アルカリホスファターゼコンジュゲート（０．４μｇ／ｍＬ）とインキュベートした。２時間後、これをＴ－ＰＢＳ ｐＨ７．４で洗浄し、基質溶液中のＢＣＩＰ（０．５ｍｇ／ｍＬ）と共に３０分間インキュベートした。青色が現れたら、濾過及びＰＢＳ ｐＨ７．４での十分な洗浄によって反応を停止させた。

【0026】

陽性ビーズを、接眼レンズを用いて目視検査によって残りから分離し、フリットを備えた反応器に移し、再生した。続いて、ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼコンジュゲート及びＢＣＩＰによる非特異的認識を排除する試験を行った。スクリーニングは、より高いストリンジェンシーの条件下で実施して、より高い親和性の配列を選択し、陽性ビーズの数を減少させ、このため、ＢＩＯＴペプチドの濃度は１２０μｇ／ｍＬまで減少した。上記の手順に従って、陽性ビーズを再生し、ｎａｎｏＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによって配列を特定した（Ｍａｓｆｏｒｒｏｌ Ｙ．，ｅｔ ａｌ，２０１２，ＡＣＳ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４（３）：１４５－９）。

【0027】

１５０μｇ／ｍＬのペプチドＢＩＯＴによる初期スクリーニングの結果、５６個の陽性ビーズを選択した。より低い濃度のＢＩＯＴ（１２０μｇ／ｍＬ）を用いた２回目のスクリーニングの後、最初のスクリーニングでの陽性ビーズのうち、これらのペプチドのＣＫ２ホスホアクセプター部位への親和性がより大きいことを証明する、残りのものよりも強い青色着色を示した９個の陽性ビーズを選択した。９個の陽性ビーズから得られたｎａｎｏＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＢＣＰ－１データベースを検索するためにＭａｓｃｏｔプログラムを使用して、手動デノボシーケンシング及び自動シーケンシングによって並行して分析した。表１は、特定された９つのペプチドの配列を示す（配列番号１～配列番号９）。各ペプチドに割り当てられた配列の分析から、手動での特定と自動シーケンシングとの間にｍ／ｚシグナルの割り当ての完全な対応関係が得られ、これにより、各ケースでのペプチド配列の正確な特定が可能になった。

【表3】

【0028】

表１に示す９つのペプチドのアミノ酸組成に類似性が認められた。これは、塩基性アミノ酸（Ｋ，Ｒ）の優位性及び疎水性アミノ酸（Ｌ、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｙ）の存在を特徴とする。

【0029】

ｎａｎｏＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによって特定された９個の配列がＥ７タンパク質中のＣＫ２酵素のホスホアクセプター部位と相互作用することを補強するために、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を用いてペプチドをＴｅｎｔａｇｅｌ樹脂上で直接合成した（Ｆｉｅｌｄ Ｇ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，３５（３）：１６１－２１４）。１２０μｇ／ｍＬの濃度のＢＩＯＴペプチドを用いて、樹脂に結合したペプチドに対して酵素反応を行った。ストレプトアビジン－アルカリホスファターゼコンジュゲートを認識分子として使用し、ＢＣＩＰを成長のための基質として使用した。樹脂に結合した符号化されたペプチド（Ｐ１～Ｐ９）１５ｍｇを含有する９つの反応器を、機械的に撹拌しながら真空濾過システムに入れた。樹脂に結合された、Ｅ７タンパク質上のＣＫ２ホスホアクセプター部位と相互作用しない２つの対照ペプチド（配列番号１０として特定されるＰ１０及び配列番号１１として特定されるＰ１１）を使用した。各反応器について５００μＬの作業体積でＢＣＰ－１ライブラリースクリーニングアッセイを再現するように手順を調整した。結果は、樹脂（Ｐ１～Ｐ９）に結合された９個のペプチドが酵素アッセイ後に強い青色を発生させることを示し、９個の特定された線状ペプチドの、基質Ｅ７モデル中のＣＫ２酵素のホスホアクセプター部位と相互作用する能力を証明している。対照的に、樹脂結合対照ペプチド（Ｐ１０及びＰ１１）は青色呈色を発生させなかった。

【0030】

例２．配列番号１～配列番号９として特定されたペプチドの、ＨＰＶ－１６ Ｅ７がんタンパク質のＣＫ２媒介リン酸化に対する効果。
ペプチドは、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を用いてＭＢＨＡ樹脂上で合成した（Ｆｉｅｌｄ ＧＢ ａｎｄ Ｎｏｂｌｅ ＲＬ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．１９９０；３５（３）：１６１－２１４）。ペプチドをＲＰ－ＨＰＬＣによって精製し、それらの同一性をＥＳＩ－ＭＳによって確認した。合成のために、それらをＦ１１Ｐ０４～Ｆ１１Ｐ１２と命名し、それらのアミノ酸配列は、配列番号１～配列番号９として特定された配列に対応する。表２に見られるように、全てが９５％を超える純度で得られ、ＥＳＩ－ＭＳ分析によりその同一性が確認された。

【表4】

【0031】

ＨＰＶ－１６ Ｅ７がんタンパク質のＣＫ２媒介リン酸化に対するこれらのペプチドの効果を測定するためのアッセイは、インビトロリン酸化反応に基づいており、そこでは大腸菌で発現されたＨＰＶ－１６のＥ７がんタンパク質が基質として使用された。このがんタンパク質を、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼに対する融合タンパク質として得た。アッセイは、前述の手順に従って実施した。（Ｐｅｒｅａ Ｓ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６４：７１２７－７１２９）。結果は図１に示され、配列番号１～配列番号９として特定されたペプチドが、ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質のＣＫ２媒介リン酸化を阻害することができることを示す。

【0032】

例３．非小細胞肺がん株ＮＣＩ－Ｈ１２５における細胞増殖に対する、配列番号１２～配列番号２０として特定される合成ポリペプチドの効果。
内在性ＣＫ２基質に対する細胞内作用を達成するために、ＨＩＶのＴａｔ１タンパク質に対応する、配列番号１～配列番号９として特定された配列の細胞内透過ペプチドＴａｔをＮ末端に付加した（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）。ベータアラニン（βＡ）残基を、目的のペプチドとＴａｔペプチドとの間のスペーサーとして導入した。ポリペプチドは、合成のためにＦ１１Ｐ１３～Ｆ１１Ｐ２１として符号化され、表３に示すように、配列番号１２～配列番号２０として特定された配列に対応する。ペプチドＣＩＧＢ－３００を配列番号６４として特定し、Ｔａｔペプチドを配列番号６５として特定した。ペプチドの合成、精製及び同一性分析を例２に示すように行った。表３に示されるように、それらの全てが９５％を超える純度で得られ、ＥＳＩ－ＭＳ分析によりそれらの同一性が確認された。

【表5】

【0033】

ＮＣＩ－Ｈ１２５細胞株に対して、ポリペプチドＦ１１Ｐ１３～Ｆ１１Ｐ２１（配列番号１２～配列番号２０）の抗増殖活性の評価を行った。細胞株は、低濃度の評価中の薬物に対して高い感受性を示す（ＨＵ Ｌ．－Ｙ．，ｅｔ ａｌ，２０１８，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｒｅｖｉｅｗ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２２：４５５１－４５５６）。ＣＩＧＢ－３００ペプチドの抗増殖効果は、この株で広く特徴付けられており（Ｃｉｒｉｇｌｉａｎｏ Ｓ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１７，４２）、したがって、これを陽性対照として選択した。Ｔａｔペプチドを陰性対照として使用した。ポリペプチドを２５、５０、１００及び２００μＭの濃度で評価した。細胞増殖アッセイを、以前に説明された手順によって行った（Ｐｅｒｅｒａ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ，１８（４）：２１５－２３）。

【0034】

図２は、ＮＣＩ－Ｈ１２５細胞における抗増殖アッセイからのデータを示す。各バーは、評価したポリペプチドの濃度（２５、５０、１００及び２００μＭ）で到達した細胞増殖阻害率（％ Ｉ）の値に対応する。２０％以上の細胞増殖阻害値を示したポリペプチドを、このパーセンテージ値がアッセイの変動係数の範囲内であるので選択した。ポリペプチドＦ１１Ｐ１９、Ｆ１１Ｐ２０及びＦ１１Ｐ２１のみが、２００μＭの濃度で２０％～３０％の細胞増殖を阻害した。対照として使用したペプチドＣＩＧＢ－３００では、達成された増殖阻害は５０％のみであった。

【0035】

図３は、ペプチドＣＩＧＢ－３００と比較した、ポリペプチドＦ１１Ｐ１９、Ｆ１１Ｐ２０及びＦ１１Ｐ２１の用量－効果曲線を示す。ポリペプチドＦ１１Ｐ１９、Ｆ１１Ｐ２０、Ｆ１１Ｐ２１及びＣＩＧＢ－３００のＩＣ_５０値は、それぞれ３３６μＭ、３０５μＭ、６６８μＭ及び６４μＭであった。ポリペプチドＦ１１Ｐ１９、Ｆ１１Ｐ２０、Ｆ１１Ｐ２１のＩＣ_５０値は、ＣＩＧＢ－３００について得られたＩＣ_５０値からまだ遠いので、前記一次構造を最適化して、それらの生物学的活性を改善する必要がある。

【0036】

例４．電荷でのトリプトファンスキャンによる、配列番号１８～配列番号２０として特定された配列の最適化。
Ｔｒｐアミノ酸を設計によりＢＣＰ－１ライブラリー合成から除外した（Ｍａｓｆｏｒｒｏｌ Ｙ．，ｅｔ ａｌ、２０１２、ＡＣＳ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１４（３）：１４５－９）。このために、Ｔｒｐポジショナルスキャニングライブラリーを、配列番号１８～配列番号２０として特定される配列について設計し、そこで電荷のＴｒｐの各アミノ酸残基への置換を時間通りに行った（表４）。これにより、カーゴ配列の各位置におけるＴｒｐの寄与を調査することができた。

【0037】

Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学（Ｆｉｅｌｄ ＧＢ ｙ Ｎｏｂｌｅ ＲＬ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．１９９０；３５（３）：１６１－２１４）を使用してＭＢＨＡ樹脂上でＴｒｐポジショナルスキャニングライブラリーポリペプチドを合成し、ＲＰ－ＨＰＬＣ精製し、ＥＳＩ－ＭＳによって同一性を確認した。アミノ酸配列を示す表４に見られるように、それらは全て９５％を超える純度で得られ、ＥＳＩ－ＭＳ分析により、設計された分子との同一性が確認された。

【表6】

【0038】

Ｔｒｐによる修飾が、Ｅ７タンパク質中のＣＫ２酵素のホスホアクセプター部位と相互作用するポリペプチドの能力に影響を及ぼさないことを実証するために、例１に記載の手順に従った。樹脂に結合された２４個のポリペプチドは、酵素アッセイ後に青色が強く現れ、モデルＥ７基質のＣＫ２酵素のホスホアクセプター部位との相互作用が証明された。一方、Ｔｒｐによる修飾が、ＣＫ２によるＥ７タンパク質のリン酸化に対するポリペプチドの効果に影響を及ぼさないことを実証するために、例２に記載の手順に従った。６０～８５％のリン酸化阻害値が得られたので、配列番号２１～配列番号４４として特定される２４個のポリペプチドは、ＣＫ２によって媒介されるＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質のリン酸化を阻害する能力を維持した。ＣＩＧＢ－３００は、リン酸化の８７％の阻害を示した。

【0039】

Ｔｒｐのポジショナルスキャニングによって生成された合成ポリペプチド（配列番号２１～配列番号４４）の、ＮＣＩ－Ｈ１２５細胞株に対する抗増殖活性の評価を行った。試験は、前述の手順によって実施した。（Ｐｅｒｅｒａ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ，１８（４）：２１５－２３）。前駆体ポリペプチド（Ｆ１１Ｐ１９、Ｆ１１Ｐ２０、Ｆ１１Ｐ２１）及びペプチドＣＩＧＢ－３００を陽性対照として含めた。ポリペプチドを１２．５、２５、５０、１００及び２００μＭの濃度で評価した。図４Ａは、１００及び２００μＭのポリペプチド濃度での細胞増殖の阻害率の結果を示す。結果は、評価した２４個のポリペプチドのうち６個（Ａ１４Ｐ２７（配列番号２１）、Ａ１４Ｐ３１（配列番号２５）、Ａ１４Ｐ３３（配列番号２７）、Ａ１４Ｐ４３（配列番号３２）、Ａ１４Ｐ４６（配列番号３５）、Ａ１４Ｐ５９（配列番号４３））が、ペプチドＣＩＧＢ－３００で見られる効果と同様に、２００μＭで６０％を超える細胞増殖の阻害を示したことを示す。図４Ｂは、評価された濃度で、６個の選択されたポリペプチドについて得られた細胞増殖の阻害率の値を示す。図から分かるように、Ａ１４Ｐ４６ポリペプチドは、ＣＩＧＢ－３００の挙動と同様に、１００及び２００μＭを超える濃度で細胞増殖の５０％超を阻害する。より低い濃度では、Ａ１４Ｐ４６ポリペプチドは、ＣＩＧＢ－３００ペプチドの性能と比較して、より良好な用量－効果相関を示した。

【0040】

図５は、ポリペプチドＡ１４Ｐ２７、Ａ１４Ｐ３１、Ａ１４Ｐ３３、Ａ１４Ｐ４３、Ａ１４Ｐ４６、Ａ１４Ｐ５９及びＣＩＧＢ－３００の用量－効果曲線を示す。その部分に関して、表５は、これらの６つのポリペプチドのＩＣ_５０値が、それらの前駆体ポリペプチドＦ１１Ｐ１９（３３６μＭ）、Ｆ１１Ｐ２０（３０５μＭ）及びＦ１１Ｐ２１（６６８μＭ）について得られたものよりも低いことを示す。Ａ１４Ｐ４６ポリペプチド（７２μＭ）のＩＣ_５０は、ＣＩＧＢ－３００参照ペプチド（６４μＭ）のＩＣ_５０に匹敵する。

【0041】

ペプチド配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８に対して行った構造研究により、位置Ｘ_７でのＤのＷへの変更が生物学的活性を増強するために必須であると結論付けることができ（Ａ１４Ｐ４６＞＞Ａ１４Ｐ３３＞Ａ１４Ｐ５９）、ポリペプチドＡ１４Ｐ４６での応答が最高であった。さらに、位置Ｘ４＞Ｘ５＞Ｘ１も生物学的活性に関して顕著な結果を示すと結論付けられ、前記位置の置換における第２のアミノ酸Ｗの導入を示唆した。

【表7】

【0042】

ポリペプチドＡ１４Ｐ４６（配列番号３５）の生物学的活性がそれらの電荷位置（ＲＫＲＳＲＹＷＰ）のみに起因することを実証するために、この例に記載の合成手順を使用して、Ｔａｔ及びβＡ配列を含まない類似のペプチドを合成した。配列番号４５として特定されたペプチドＤ１４Ｐ１６５は、９５％の純度で得られ、ＥＳＩ－ＭＳによる分析によって、そのＭＷが１１４６，７Ｄａであることが実証された。リン酸化阻害アッセイを例２に記載のように実施し、８５％の阻害が得られ、ＨＰＶ－１６ Ｅ７タンパク質のＣＫ２媒介リン酸化を阻害するペプチドの能力を確認した。

【0043】

ポリペプチドＡ１４Ｐ４６がＮＣＩ－Ｈ１２５細胞株においてＣＩＧＢ－３００と同様の生物学的活性結果を示したことを考慮して、膵臓腺がん腫瘍系統（ＡｓＰＣ－１）におけるそのようなポリペプチドの挙動を、ＣＩＧＢ－３００と比較して試験した。細胞増殖アッセイを、以前に説明された手順に従って行った（Ｐｅｒｅｒａ Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ，１８（４）：２１５－２３）。図６に示されるように、両方の分子は、ＡｓＰＣ－１細胞の増殖に対して用量依存的な効果を生じさせることができる。Ａ１４Ｐ４６での１２５μＭのＩＣ_５０値及びＣＩＧＢ－３００での１０２μＭのＩＣ_５０値が得られ、両方のペプチドがこの細胞株において同様の効力を有することを示している。

【0044】

ポリペプチドＡ１４Ｐ４６（配列番号３５）は、ＮＣＩ－Ｈ１２５及びＡｓＰＣ－１細胞株における細胞増殖を阻害するその能力においてＣＩＧＢ－３００に匹敵することが示されるが（図５及び図６）、より小さいサイズの線状ポリペプチドであり、化学的により安定であり、その配列中にメチオニン又はシステインのいずれも含まず、それによって生産的な観点からより魅力的になるので、優れている。

【0045】

例５．配列中に第２のＴｒｐ残基を導入することによる、配列番号３５として特定されるポリペプチドの最適化。
例４で得られた結果に基づいて、Ａ１４Ｐ４６ポリペプチドの位置Ｘ_１、Ｘ_４及びＸ_５に別のＴｒｐ残基を導入し、生物活性に対するその影響を評価した。Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学（Ｆｉｅｌｄ ＧＢ ｙ Ｎｏｂｌｅ ＲＬ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．１９９０；３５（３）：１６１－２１４）を使用してＭＢＨＡ樹脂上でポリペプチドを合成し、ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製し、ＥＳＩ－ＭＳによって同一性を確認した。表６に示されるように、３つのペプチドが９５％を超える純度で得られ、ＥＳＩ－ＭＳ分析により分子の同一性が確認された。

【表8】

【0046】

合成ポリペプチドＡ１５Ｐ３５、Ａ１５Ｐ３６及びＡ１５Ｐ３７（配列番号４６～配列番号４８）の抗増殖活性の評価を、ＮＣＩ－Ｈ１２５、ＡｓＰＣ－１、ＰａｎＣ－１（膵臓がん）及びＯＣＩ－ＡＭＬ３（急性骨髄性白血病－３）細胞株に対して行った。以前に記載された手順に従って試験を行った（Ｐｅｒｅｒａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ，１８（４）：２１５－２３）。図７は、ＮＣＩ－Ｈ１２５細胞株における３つのポリペプチドの用量－効果曲線を、その前駆体Ａ１４Ｐ４６及び対照ペプチドＣＩＧＢ－３００と比較して示す。ポリペプチドＡ１５Ｐ３５、Ａ１５Ｐ３６及びＡ１５Ｐ３７は、ＮＣＩ－Ｈ１２５細胞の増殖に対して用量依存的効果をもたらすことができた。ＡｓＰＣ－１、ＰａｎＣ－１及びＯＣＩ－ＡＭＬ３株では、３つのポリペプチドは用量反応パターンも示した。

【0047】

表７は、ＮＣＩ－Ｈ１２５、ＡｓＰＣ－１、ＰａｎＣ－１及びＯＣＩ－ＡＭＬ３細胞株で得られたＡ１５Ｐ３５、Ａ１５Ｐ３６及びＡ１５Ｐ３７ポリペプチドのＩＣ_５０値を、それらの前駆体Ａ１４Ｐ４６及び対照ペプチドＣＩＧＢ－３００と比較してまとめたものである。ポリペプチドＡ１５Ｐ３５のＩＣ_５０値は、試験した４つの系統において、その前駆体Ａ１４Ｐ４６及びＣＩＧＢ－３００について得られたものと同様であり、配列の位置Ｘ１におけるＴｒｐの導入は無関係であることを示している。対照的に、ポリペプチドＡ１５Ｐ３６及びＡ１５Ｐ３７について得られたＩＣ_５０値は、特に膵臓がん細胞株（ＡｓＰＣ－１、ＰａｎＣ－１）及び急性骨髄性白血病（ＯＣＩ－ＡＭＬ３）において、ポリペプチドＡ１４Ｐ４６及びペプチドＣＩＧＢ－３００について得られたものよりも低かった。

【表9】

【0048】

Ａ１５Ｐ３６ポリペプチド（配列番号４７）及びＡ１５Ｐ３７（配列番号４８）の生物学的活性が電荷ＲＫＲＷＲＹＷＰ及びＲＫＲＳＷＹＷＰのみに起因することを実証するために、この例に記載の合成手順を用いて、両ペプチドをＴａｔ又はβＡ配列なしで合成した。ペプチドＤ１５Ｐ１０５（配列番号４９）及びＤ１５Ｐ１０６（配列番号５０）が９５％を超える純度で得られ、ＥＳＩ－ＭＳ分析により、それぞれ１２４５．７Ｄａ及び１１７６．６Ｄａの分子量が確認された。リン酸化アッセイを例２に記載のように実施し、８７％及び８２％のリン酸化阻害値がそれぞれ得られ、ＨＰＶ－１６ Ｅ７タンパク質のＣＫ２媒介リン酸化を阻害する両方のペプチドの能力を確認した。

【0049】

この例の結果は、ポリペプチド配列Ａ１４Ｐ４６（配列番号３５）の位置Ｘ４及びＸ５における第２のＴｒｐの導入が、ペプチドとホスホアクセプター部位との相互作用、したがってＣＫ２によるリン酸化を阻害するその能力を支持することを示す。Ａ１５Ｐ３６及びＡ１５Ｐ３７ポリペプチドは、膵臓がん（ＡｓＰＣ－１、ＰａｎＣ－１）及び急性骨髄性白血病（ＯＣＩ－ＡＭＬ３）細胞株における細胞増殖を阻害するそれらの能力において、ＣＩＧＢ－３００よりも強力であることが示されている。両方のポリペプチドは、メチオニン及びシステインなどの感受性残基を有しないので、より小さいサイズの化学的により安定な線状配列であるという、さらなる利点を有する。加えて、それらは生産的な観点からより魅力的である。

【0050】

例６．非天然アミノ酸（Ｄ－及びＬ－Ｎ－メチルアミノ酸）を導入することによる、配列番号４７及び配列番号４８として特定されるポリペプチドの最適化。
ポリペプチドＡ１５Ｐ３６（配列番号４７）及びＡ１５Ｐ３７（配列番号４８）を体液中のエンドペプチダーゼの作用から保護するために、非天然アミノ酸を、トリプシン及びキモトリプシンによる分解をより受けやすい配列の部位に導入した。タンパク質分解に最も感受性の部位は、Ｅｘｐａｓｙサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３１（１３）：３７８４－３７８８）の助けを借りて予測した。Ｄ－ＡｒｇをＴａｔのＲ８に組み込み、Ｋ１６、Ｒ１７及びＹ２０の保護を、Ｄ－Ｌｙｓ、Ｄ－Ａｒｇ及びＮＭｅ－Ｔｙｒをそれぞれ導入して評価した。各ポリペプチドのＮ末端をアセチル化してＮ－ペプチダーゼから保護した。ポリペプチドＥ１７Ｐ０１、Ｅ１７Ｐ０２及びＥ１７Ｐ０３（配列番号５１～配列番号５３）はＡ１５Ｐ３６の誘導体であり、ポリペプチドＤ１７Ｐ７８、Ｄ１７Ｐ７９及びＤ１７Ｐ８０（配列番号５４～配列番号５６）はＡ１５Ｐ３７の誘導体である。Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ化学を使用してＭＢＨＡ樹脂上でポリペプチドを合成し、ＲＰ－ＨＰＬＣによって精製し、ＥＳＩ－ＭＳによって同一性を確認した。表８に示されるように、全てが９５％を超える純度で得られ、ＥＳＩ－ＭＳ分析により分子の同一性が確認された。

【表10】

【0051】

非天然アミノ酸の導入が、Ｅ７タンパク質中のＣＫ２酵素のホスホアクセプター部位と相互作用するポリペプチドの能力に影響を及ぼさないことを実証するために、例１に記載の手順に従った。樹脂に結合された６個のポリペプチドは、酵素アッセイ後に濃い青色が現れ、モデルＥ７基質のＣＫ２酵素のホスホアクセプター部位との相互作用が証明された。一方、修飾が酵素ＣＫ２によるＥ７タンパク質でのリン酸化に対するペプチドの効果に影響を及ぼさないことを実証するために、例２に記載の手順に従った。配列番号５１～配列番号５６として特定されるポリペプチドＥ１７Ｐ０１～Ｅ１７Ｐ０３及びＤ１７Ｐ７８～Ｄ１７Ｐ８０は、ＨＰＶ－１６のＥ７タンパク質でのＣＫ２媒介リン酸化を阻害する能力を維持し、８３～９０％のリン酸化阻害値が得られた。

【0052】

ＮＣＩ－Ｈ１２５、Ｈｅｐ２Ｃ（喉頭がん）細胞株及び２つの膀胱がん株（ＭＧＨ－Ｕ３及びＭＧＨ－Ｕ４）で抗増殖アッセイを行った。以前に記載された手順に従って試験を行った（Ｐｅｒｅｒａ Ｙ．，ｅｔ ａｌ，２０１２，Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ，１８（４）：２１５－２３）。

【0053】

図８及び９は、それぞれポリペプチドＥ１７Ｐ０１、Ｅ１７Ｐ０２及びＥ１７Ｐ０３（配列番号５１～配列番号５３）ならびにＤ１７Ｐ７８、Ｄ１７Ｐ７９及びＤ１７Ｐ８０（配列番号５４～配列番号５６）のＮＣＩ－Ｈ１２５細胞株における用量－効果曲線を示す。対照ＣＩＧＢ－３００ペプチドならびに前駆体ポリペプチドＡ１５Ｐ３６及びＡ１５Ｐ３７をそれぞれ含めた。６つのポリペプチドは、ＮＣＩ－Ｈ１２５の細胞株の増殖に対して用量依存的効果をもたらすことができた。Ｈｅｐ２Ｃ、ＭＧＨ－Ｕ３及びＭＧＨ－Ｕ４細胞株では、６つ全てのポリペプチドは用量－応答パターンも示した。

【0054】

表９は、細胞株ＮＣＩ－Ｈ１２５、Ｈｅｐ２Ｃ、ＭＧＨ－Ｕ３及びＭＧＨ－Ｕ４で得られたポリペプチドＥ１７Ｐ０１、Ｅ１７Ｐ０２、Ｅ１７Ｐ０３、Ｄ１７Ｐ７８、Ｄ１７Ｐ７９及びＤ１７Ｐ８０（配列番号５１～配列番号５６）のＩＣ_５０値を、それらの前駆体及び対照ペプチドＣＩＧＢ－３００と比較してまとめたものである。

【0055】

表９は、配列番号５１～配列番号５６として特定されたポリペプチドのＩＣ_５０値が、ＮＣＩ－Ｈ１２５、Ｈｅｐ２Ｃ、ＭＧＨ－Ｕ３及びＭＧＨ－Ｕ４細胞株において、ペプチドＣＩＧＢ－３００で得られたものよりも低く、それらがそれらの抗増殖効果の点でより強力であることを示している。驚くべきことに、膀胱がん系統（ＭＧＨ－Ｕ３及びＭＧＨ－Ｕ４）の場合、ＩＣ_５０値はＣＩＧＢ－３００と比較して一桁低く、非常に魅力的であり、なぜなら、それはわずかに調査されたニッチであり、分解されず、健康に大きな影響を与えるからである。プロテアーゼに対する安定性を高めるために、Ａ１５Ｐ３６及びＡ１５Ｐ３７ポリペプチドへの修飾を導入した。しかしながら、驚くべきことに、ＣＫ２リン酸化を阻害する能力も増強された。

【表11】

【0056】

配列番号５１～配列番号５６として特定されたペプチドの生物学的活性がそれらの電荷のみに起因することを実証するために、この同じ例に記載の合成手順を使用して、Ｔａｔ及びβＡ配列を含まないペプチドを合成した。ペプチドＤ１７Ｐ８１～Ｄ１７Ｐ８６（配列番号５７～配列番号６２）が９５％を超える純度で得られ、ＥＳＩ－ＭＳ分析により、設計されたもので得られた分子の同一性が確認された（表１０）。

【表12】

【0057】

リン酸化アッセイを例２に記載のように実施し、８３～９０％のリン酸化阻害値が得られ、ＨＰＶ－１６ Ｅ７タンパク質のＣＫ２媒介リン酸化を阻害するこれらのペプチドの能力を確認した。

【0058】

要約すると、配列番号５１～配列番号５６として特定されるポリペプチドは、細胞増殖を阻害する能力、特に膀胱がんの系統（ＭＧＨ－Ｕ３及びＭＧＨ－Ｕ４）における阻害活性に関して、ペプチドＣＩＧＢ－３００よりも強力である。さらに、これらのペプチドは、線状であり、サイズがより小さく、化学的により安定であり、製造の観点から明白な利点をもたらす。

【0059】

例７．胸腺欠損マウスに移植したヒト膀胱腫瘍モデルにおける、ＣＫ２リン酸化のポリペプチド阻害剤の抗腫瘍効果。
これらの試験のために、６～８週齢の胸腺欠損雌ＢａｌｂＣマウスを使用した。膀胱細胞がん由来のＭＧＨ－Ｕ３細胞を使用した。このモデルにおける腫瘍移植のために、細胞を１００００００細胞／ミリリットルの濃度でＰＢＳに懸濁した。細胞懸濁液を動物の腹腔内に皮下接種した。Ｅ１７Ｐ０１ポリペプチド（配列番号５１として特定される）又はＣＩＧＢ－３００の投与を、腫瘍細胞を接種した５日後に開始し、５日間連続して腹腔内投与し続けた。ポリペプチド及びペプチドをＰＢＳに溶解した。投与量は２０μｇであり、１ｍｇ／ｋｇ体重に相当する。異なる時点で、ポリペプチドの抗腫瘍効果を評価するためのパラメータとして、腫瘍体積（ｍｍ^３）を測定した。図１０に見られるように、Ｅ１７Ｐ０１ポリペプチドは、ＣＩＧＢ－３００で観察されるものよりも大きい、腫瘍進行を阻害するその能力を示した。これらの結果は、実験動物に移植されたヒト腫瘍のモデルにおいて、配列番号５１として特定されるポリペプチドの抗腫瘍効果を証明した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

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【国際調査報告】