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特表2024-534234動脈硬化を標的としたリポソームナノキャリア送達システムおよびその調製方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-18
(54)【発明の名称】動脈硬化を標的としたリポソームナノキャリア送達システムおよびその調製方法
(51)【国際特許分類】
A61K 9/127 20060101AFI20240910BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240910BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240910BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20240910BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240910BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20240910BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20240910BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240910BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20240910BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20240910BHJP
A61K 31/505 20060101ALI20240910BHJP
A61K 31/40 20060101ALI20240910BHJP
A61K 31/616 20060101ALI20240910BHJP
A61K 31/47 20060101ALI20240910BHJP
A61K 31/366 20060101ALI20240910BHJP
A61K 31/22 20060101ALI20240910BHJP
A61K 31/192 20060101ALI20240910BHJP
A61K 31/405 20060101ALI20240910BHJP
A61K 31/4174 20060101ALI20240910BHJP
A61K 31/4465 20060101ALI20240910BHJP
A61K 31/195 20060101ALI20240910BHJP
【ＦＩ】
A61K9/127
A61P9/10
A61P9/10 101
A61P9/00
A61P9/04
A61K45/00
A61K9/51
A61K47/24
A61K39/395 N
A61K47/36
A61K47/42
A61K31/505
A61K31/40
A61K31/616
A61K31/47
A61K31/366
A61K31/22
A61K31/192
A61K31/405
A61K31/4174
A61K31/4465
A61K31/195
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024514613
(86)(22)【出願日】2022-09-05
(85)【翻訳文提出日】2024-05-07
(86)【国際出願番号】 CN2022117091
(87)【国際公開番号】W WO2023030524
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/116681
(32)【優先日】2021-09-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519367359
【氏名又は名称】北京茵諾医薬科技有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＢＥＩＪＩＮＧ ＩＮＮＯ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ １０１－３０１， ３ｒｄ Ｆｌｏｏｒ， Ｎｏ． ９ Ｂｕｉｌｄｉｎｇ， Ｚｏｎｅ ４， Ｘｉｓｈａｎ Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｐａｒｋ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９５， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100162684
【弁理士】
【氏名又は名称】呉 英燦
(74)【代理人】
【識別番号】100221523
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 渉
(74)【代理人】
【識別番号】100126778
【弁理士】
【氏名又は名称】品川 永敏
(72)【発明者】
【氏名】馬 茜
(72)【発明者】
【氏名】陳 小明
(72)【発明者】
【氏名】▲デン▼ 拓
(72)【発明者】
【氏名】王 惠靖
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C085
4C086
4C206
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA65
4C076AA95
4C076BB13
4C076CC11
4C076CC21
4C076DD63
4C076EE30
4C076EE37
4C076EE41
4C076EE43
4C076FF70
4C084AA17
4C084MA24
4C084MA38
4C084MA65
4C084NA13
4C084ZA36
4C084ZA45
4C084ZB26
4C084ZC33
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB31
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG02
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA17
4C086BC05
4C086BC13
4C086BC21
4C086BC28
4C086BC38
4C086BC42
4C086DA17
4C086MA02
4C086MA05
4C086MA24
4C086MA38
4C086MA65
4C086NA13
4C086ZA36
4C086ZA45
4C086ZB26
4C086ZC33
4C206AA01
4C206AA02
4C206DA30
4C206DB03
4C206DB56
4C206GA07
4C206GA28
4C206KA04
4C206MA02
4C206MA05
4C206MA44
4C206MA58
4C206MA85
4C206NA13
4C206ZA36
4C206ZA45
4C206ZB26
4C206ZC33
(57)【要約】
本開示は、能動的に封入されたリポソームナノキャリア送達システムを提供する。前記リポソームナノキャリア送達システムは、リポソームキャリア、ならびにそれによって能動的に封入されたアテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の予防および／または治療に使用するために物質を含む。ナノキャリア送達システムの調製は、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の予防および／または治療に使用するために、リポソームキャリアによって能動的に封入された物質を水和させるように、体の内外のリポソーム溶液の酸性勾配を引き起こす生理食塩水を添加する工程を含む。さらに、リポソームナノキャリア送達システムの調製方法およびその応用も提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
能動的に封入されたリポソームナノキャリア送達システムであって、前記リポソームナノキャリア送達システムが、リポソーム担体、ならびに前記リポソーム担体によって能動的に封入された、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の予防および／または治療で用いられる物質を含むことを特徴とする、前記リポソームナノキャリア送達システム。
【請求項2】
前記リポソーム担体の物質が、リン脂質およびコレステロールを含み；あるいは前記リン脂質が、下記：水素化大豆ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、ジシンナモイルホスファチジルコリン、ジシンナモイルホスファチジルエタノールアミン、ジシンナモイルホスファチジルセリン、ジシンナモイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、ジエルコイルホスファチジルコリン、ジエルコイルホスファチジルエタノールアミン、ジエルシルホスファチジルセリン、ジエルシルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルエタノールアミン、および卵ホスファチジルグリセロールから選択される１つまたはそれ以上であることを特徴とする、請求項１に記載のリポソームナノキャリア送達システム。
【請求項3】
前記アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の予防および／または治療で用いられる物質と前記リポソーム担体との質量比が、１：０．１～５０、あるいは１：０．２～３０、さらにあるいは１：０．５～２０であることを特徴とする、請求項１または２に記載のリポソームナノキャリア送達システム。
【請求項4】
前記アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の予防および／または治療で用いられる物質が、弱酸性物質であるか；前記アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の予防および／または治療で用いられる物質が、下記：スタチン、フィブラート、抗血小板薬、ＰＣＳＫ９阻害薬、抗凝固薬、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、カルシウムイオン拮抗薬、ＭＭＰ阻害薬、β受容体遮断薬、グルココルチコイド、およびこれらの医薬的に許容される塩、ならびに前記薬物または物質の活性製剤から選択される１つまたはそれ以上であるか；
前記アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の予防および／または治療で用いられる物質が、下記：ロバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ベザフィブラート、シプロフィブラート、ゲムフィブロジル、アスピリン、アセメタシン、オザグレルナトリウム、ベラプロストナトリウム、チロフィバン、およびこれらの薬力学的フラグメントまたは医薬的に許容される塩から選択される１つまたはそれ以上であるか；あるいは
前記アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の予防および／または治療で用いられる物質が、水溶性スタチン、またはロスバスタチン、プラバスタチンもしくはアトルバスタチンであることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載のリポソームナノキャリア送達システム。
【請求項5】
前記リポソームナノキャリア送達システムが、標的化リガンドで修飾可能であるか、あるいは前記標的化リガンドが、下記：ＧＡＧ、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、セレクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、モノクローナル抗体ＨＩ４４ａ、ＨＩ３１３、Ａ３Ｄ８、Ｈ９０およびＩＭ７、ならびにヒアルロン酸またはヒアルロン酸の誘導体から選択される１つまたはそれ以上であることを特徴とする、請求項１～４のいずれか１項に記載のリポソームナノキャリア送達システム。
【請求項6】
前記リポソーム担体が、小型一枚膜リポソーム、大型一枚膜リポソームまたは多重一枚膜リポソームから選択されることを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載のリポソームナノキャリア送達システム。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか１項に記載のリポソームナノキャリア送達システムの調製方法であって、前記リポソームの内側と外側との間に溶液酸性勾配を形成するために塩溶液を添加し、分離させることにより前記リポソーム担体を水和させる工程を含む、方法。
【請求項8】
前記塩が、弱酸と強アルカリの塩であるか；あるいは前記塩のアニオン部分が、下記：酢酸塩、エデト酸塩、炭酸水素塩、次亜塩素酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、およびグルコン酸塩から選択される１つまたはそれ以上であるか；および／または
前記塩のカチオン部分が、下記：カルシウムイオン、銅イオン、ニッケルイオン、バリウムイオン、マグネシウムイオン、および亜鉛イオンから選択される１つまたはそれ以上であるか；あるいは
前記塩が、酢酸カルシウム、炭酸水素カルシウム、クエン酸マグネシウム、およびグルコン酸銅から選択される１つまたはそれ以上であることを特徴とする、請求項７に記載のリポソームナノキャリア送達システムの調製方法。
【請求項9】
請求項７または８に記載のリポソームナノキャリア送達システムの調製方法であって、以下の工程：（１）前記リポソーム担体物質を良溶媒に溶解し；
（２）工程（１）で得られた生成物に、前記リポソームの内側と外側で溶液酸性勾配を形成する塩溶液を添加して水和させ、粗脂質溶液に分散させ；
（３）工程（２）で得られた粗脂質溶液の粒子径を減少させて、微小化されたリポソームを得；
（４）工程（３）で得られた微小化リポソーム溶液を精製して外部イオンを除去し、リポソームの内部と外部の間に酸性勾配を形成し；次いで
（５）工程（４）で得られたリポソーム溶液に封入される物質の溶液を加え、インキュベーションを行って前記薬剤を前記リポソームの内部に侵入させ、リポソームナノキャリア送達システムを得ることを含むことを特徴とする、方法。
【請求項10】
前記工程（１）が、前記溶媒を蒸発により除去して前記リポソームに脂質膜を形成させる工程をさらに含むか；前記蒸発の温度が、４０～８０℃、５０～７０℃、または５０～６０℃であるか；
前記蒸発の方法が、回転蒸発法であるか；あるいは
前記回転蒸発法が、５０～２００ｒ／分、７０～１２０ｒ／分、または８０～１００ｒ／分の速度で行われることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
工程（１）において、前記良溶媒が、下記：クロロホルム、エタノール、メタノール、塩化メチレン、アセトン、トルエン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、酢酸メチル、アセトニトリル、およびジクロロエタンから選択される１つまたはそれ以上であることを特徴とする、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項12】
工程（１）において、前記リポソーム担体の物質が、リン脂質およびコレステロールを含むか；前記リン脂質が、０．１～５００ｍｇ／ｍＬ、０．１～２００ｍｇ／ｍＬ、または０．２～１００ｍｇ／ｍＬの濃度であるか；ならびに／あるいは
前記コレステロールが、０．０５～２００ｍｇ／ｍＬ、あるいは０．１～１００ｍｇ／ｍＬ、または０．１～５０ｍｇ／ｍＬの濃度であることを特徴とする、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
工程（２）において、前記塩溶液が、１００～５００ｍＭ、２００～３００ｍＭ、または２００～２５０ｍＭの濃度であるか、ならびに／あるいは前記水和の温度が、３０～９０℃、４０～８０℃、あるいは４５～６５℃であることを特徴とする、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
工程（３）において、前記粒子径を減少させる方法が、前記粗脂質溶液をフィルター膜に通して押し出すことであるか；前記フィルター膜が、ポリカーボネート膜であるか；あるいは
前記フィルター膜が、３０～８００ｎｍ、例えば５０～４００ｎｍ、例えば１００～２００ｎｍ、例えば３０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍもしくは８００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍの孔径を有することを特徴とする、請求項９～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
工程（４）において、前記外部イオンを除去する方法が、下記：限外濾過膜パックによる分離、透析分離、およびイオン交換から選択される１つまたはそれ以上であることを特徴とする、請求項９～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
工程（５）において、前記封入される物質の溶液が、０．０１～１００ｍｇ／ｍＬ、０．０５～５０ｍｇ／ｍＬ、０．１～２０ｍｇ／ｍＬ、または０．１～１０ｍｇ／ｍＬの濃度であることを特徴とする、請求項９～１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
工程（５）において、前記インキュベーションの温度が、２０～８０℃、４０～７０℃、または５５～６５℃であることを特徴とする、請求項９～１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記リポソームナノキャリア送達システムが、標的化リガンドで修飾される場合、前記方法は、下記工程：（６）標的化リガンドを、工程（５）で得られたリポソームナノキャリア送達システムと共インキュベートして、修飾リポソームナノキャリア送達システムを得ることをさらに含むことを特徴とする、請求項９～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
請求項１～７のいずれか１項に記載のナノキャリア送達システム、または請求項８～１８のいずれか１項に記載の方法により調製されたナノキャリア送達システム、および医薬的に許容される担体を含むことを特徴とする、医薬。
【請求項20】
アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および／または治療するための医薬の製造における、請求項１～７のいずれか１項に記載のナノキャリア送達システム、請求項８～１８のいずれか１項に記載の方法により調製されたナノキャリア送達システム、および請求項１９に記載の医薬の使用であって、適宜、前記アテローム性動脈硬化症関連疾患が、アテローム性動脈硬化症、冠動脈アテローム性動脈硬化性心疾患（急性冠症候群、無症候性心筋虚血－潜在性冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、虚血性心疾患、突然死、ステント内再狭窄を含む）、脳動脈硬化症（脳虚血性脳卒中、出血性脳溢血を含む）、末梢血管アテローム性動脈硬化症（頸動脈アテローム性動脈硬化症、椎骨アテローム性動脈硬化症、鎖骨下アテローム性動脈硬化症、閉塞性末梢動脈硬化症、網膜アテローム性動脈硬化症、腎アテローム性動脈硬化症、下肢アテローム性動脈硬化症、上肢アテローム性動脈硬化症、腸間膜アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化性インポテンスを含む）、大動脈解離、血管腫、血栓塞栓症、心不全、および心原性ショックから選択される１つまたはそれ以上である、使用。
【請求項21】
血管プラークを治療するための医薬の製造における、請求項１～７のいずれか１項に記載のナノキャリア送達システム、請求項８～１８のいずれか１項に記載の方法により調製されたナノキャリア送達システム、および請求項１９に記載の医薬の使用であって、適宜、前記血管プラークが、動脈プラークであり；あるいは前記医薬が、動脈プラークの進行を抑制し、動脈プラークを逆転させ、および／または動脈プラークの量を減少させるために使用される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の分野
本開示は、医薬技術の技術分野に属し、特に、能動的に封入するリポソームナノキャリア送達システム、これを調製する方法およびその使用に関する。
本開示は、医薬技術の技術分野に属し、特に、能動的に封入するリポソームナノキャリア送達システム、これを調製する方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
心血管および脳血管疾患は、高い障害率、高い死亡率、高い医療リスク、高い医療費を伴う慢性疾患の第１位であり、世界的な死亡原因の第１位である。心血管疾患と脳血管疾患は、住民の全死亡率の４０％以上を占めており、動脈硬化関連疾患は心血管疾患と脳血管疾患の中でも最優先事項である。統計によると、世界には４億６，６００万人の動脈硬化患者が存在しており、そのうち１億５，４００万人が冠動脈性心疾患患者で、毎年２，７３０万人が新たに発症している。世界中で毎年１，９００万件の急性心筋梗塞が新たに発症し、死亡率は３４％から４２％である。たとえ患者が生存していても、心筋梗塞後１～５年の全死因死亡率および心血管事象の相対リスクは、一般集団のそれよりも少なくとも３０％高い。
【0003】
中国の心血管疾患に関する報告（２０１８年）において、２０１０年に実施された中国の第６回国勢調査のデータによると、現在、中国では冠状動脈性心臓病患者が１１００万人に上り、新規患者数は毎年１００万人を超え、毎年の心血管疾患による死亡者数は３９０万人に上り、病気による住民の死因の４０％以上を占めていることが示されている。多くの研究では、動脈硬化が心筋梗塞や虚血性脳卒中の主な原因であることが確認されている。また、これらの患者は突然死や心不全、脳梗塞の後遺症などの重篤な有害事象を起こしやすく、家族や社会に大きな医療負担をもたらす。
【0004】
しかし、このような深刻な病気を前にして、世界的に見てもこれ以上の予防法や治療法はまだない。アテローム性動脈硬化症に対する現在の治療法は、依然として全身投与によるものである。薬剤の経口投与はプラークの進行を遅らせることはできても、完全に治癒させることはおろか、プラークの進行を著しく逆転させることもできない。さらに、中国人はスタチンや他の薬剤に対する耐性が低く、肝機能異常、新規発症の糖尿病、横紋筋融解症、認知障害などの合併症を誘発しやすい。現在のところ、患者を治療する戦略は依然として生涯にわたる薬物治療であり、病気を治すことはできず、薬物による多くの副作用をもたらす。例えば、スタチンの経口投与によるアテローム性動脈硬化症の治療では、プラークを安定化させるために集中的な大量投与が必要であり、一方、スタチンの大量投与による全身治療では、重篤な副作用（肝機能異常、横紋筋融解症、ＩＩ型糖尿病など）の発生率が増加する危険性がある。。
【0005】
既存の全身投与の場合、薬剤が体内に入った後、実際に病変部位に作用できるのは、通常、有効成分のごく一部だけである。特に動脈硬化の場合は、血流の速い血管壁にあるため、薬剤がプラークに蓄積することはおろか、プラークに入り込むことも不可能である。これが薬効を制限し、薬物の有害な副作用を生み出す根本的な原因である。標的薬物送達システムとは、標的を定めて薬物を送達する能力を持つ薬物送達システムのことである。標的薬物送達システムに含まれる薬物は、一定の経路で投与された後、粒子径、電気的特性などに起因して標的部位に特異的に濃縮されるか、標的化プローブを有するキャリアによって標的部位に特異的に濃縮される。標的薬物送達システムは、薬物を特定の病変部位に標的化させ、標的病変部位で有効成分を放出させることができる。したがって、標的薬物送達システムは、標的病変部位における薬物の濃度を比較的高くし、血液循環における薬物の投与量を減少させることができ、その結果、毒性副作用を抑制しながら薬効を向上させ、正常組織や細胞への損傷を減少させることができる。
【0006】
リポソームは一般的な標的薬物送達システムである。リポソームには、薬効の向上、毒性の副作用の軽減、薬物のバイオアベイラビリティの向上、生物学的安全性の高さなどの明らかな利点がある。ＺＬ２０１９８０００１８４３．４は、受動的封入によって調製されたＣＤ４４標的化リポソームナノ薬物を開示しており、主に脆弱プラーク内に存在するマクロファージ、単球、内皮細胞、リンパ球および平滑筋細胞の表面におけるＣＤ４４の発現状態とヒアルロン酸（ＨＡ）との親和性を利用して、プラークまたは脆弱プラークに関連する疾患を標的とする標的薬物送達システムを構築し、徐放性を達成しながら脆弱プラークの診断または治療のためのリポソーム薬物送達システムを実現できるが；しかしながら、現在の方法は、受動的な薬物負荷方法に限られている。ＺＬ２０１９８０００１８３３．０は、一連の親水性または疎水性の治療薬や造影剤を、フィルム水和とプローブ超音波処理の２段階法によって親水性内腔または疎水性脂質層に封入し、さらに標的化リガンドと結合させることを開示している。この戦略は受動的封入に属する。この戦略は普遍性が高いが、封入率は十分でないことが多く、治療効果にはさらなる改善の余地がある。
【0007】
さらに、高脂溶性スタチンからリポソームを調製する研究により、高脂溶性スタチンをフィルム水和法や逆蒸発法を用いてリポソーム二重膜に封入することで、代謝時間の延長やバイオアベイラビリティの向上などの目的を達成できることが示されている。とはいえ、これらの方法は一定の水溶性を持つスタチンには適さない。このような問題を解決するために、本特許出願の発明者らは、標的薬物送達を達成するための活性薬物ローディング方法により一定の水溶性を有するスタチンを能動的に封入する方法を知見し、開示した。
【0008】
標的ナノ製剤の分野では、製剤の粒子径と標的化リガンドのカップリング濃度は治療効果と密接な相関があるが、結論は一様ではなく、言い換えれば、適応症ごとにナノ製剤の粒子径と表面リガンドのカップリング濃度に一律の基準はなく、適応症ごとに大きな差がある。動脈硬化という疾患に関しては、適切な粒子径とリガンド濃度の探索が薬効に重要な役割を果たす。本特許出願は、特定のナノ構造と特定のリガンド密度を用いてアテローム性動脈硬化症を治療するための、新しい薬物ローディング方法と製剤を開示する。
【発明の概要】
【0009】
先行技術の欠点を克服するために、本開示は、能動的に封入させたリポソームナノキャリア送達システム、その調製方法、およびその使用を提供することを意図している。一方、本開示は、特定の粒子径と表面リガンド密度が標的ナノ薬剤の薬効に及ぼす影響を開示している。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図2】図２は、エタノール注入法によりロスバスタチンを能動的に封入したナノリポソームＬＰ／ＲＡ９０、ＬＰ／ＲＡ１２０、およびＬＰ／ＲＡ１５０の凍結電子顕微鏡写真（Ａ、Ｂ、およびＣ）と水和粒子径（Ｄ、Ｅ、およびＦ）の結果を示す。
【図3】図３は、ハイブリッド水和によってロスバスタチンを能動的に封入したナノリポソームＬＰ／ＲＢ９０、ＬＰ／ＲＢ１２０、およびＬＰ／ＲＢ１５０の低温電子顕微鏡写真（Ａ、Ｂ、およびＣ）と水和粒子径（Ｄ、Ｅ、およびＦ）の結果である。
【図4】図４は、ロスバスタチンを能動的に封入したナノリポソームＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０、ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０、ＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０の低温電子顕微鏡写真（Ａ、Ｂ、およびＣ）と水和粒子径（Ｄ、Ｅ、およびＦ）の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
本開示の内容を記載する前に、本願で用いられる用語を以下のように定義する：
【0012】
「標的化薬物送達システム」という用語は、標的化薬物送達能力を有する薬物送達システムを意味する。ある経路で投与された後、標的化薬物送達システムに含まれる薬物は、特殊なキャリアまたは標的ヘッド（例えば、標的化リガンド）の作用により、標的部位に特異的に濃縮される。現在知られている標的化薬物送達を行う手法には、さまざまな微粒子薬物送達システムの受動的標的化特性を利用すること、微粒子薬物送達システムの表面に化学修飾を導入すること、いくつかの特殊な物理的・化学的特性を利用すること、抗体を介した標的化薬物送達を利用すること、リガンドを介した標的化薬物送達を利用すること、プロドラッグを利用した標的化薬物送達を利用することなどが含まれる。
【0013】
「アテローム性動脈硬化症」とは、動脈硬化症として知られる一般的で最も重要な血管疾患の一種であり、罹患した動脈の病変が内膜から始まり、脂質や複合糖質の蓄積、出血や血栓症、線維組織の過形成や石灰化、それに続く動脈の中間層の緩やかな変性や石灰化によって特徴づけられる。アテローム性動脈硬化症は、動脈の内膜に蓄積した脂質が黄色い粥状に見えることから、このように名付けられた。
【0014】
「能動的封入リポソーム」とは、ある種の親水性または両親媒性化合物を、膜貫通ｐＨまたはイオン勾配を利用して、あらかじめ形成されたリポソームに充填することを意味する。この技術は、能動的封入（active encapsulation）または遠隔封入（remote encapsulation）と呼ばれている。
【0015】
上記の目的を達成するために、本開示の第１の態様は、能動的に封入させたリポソームナノキャリア送達システムを提供する。リポソームナノキャリア送達システムは、リポソームキャリア、ならびにリポソームキャリアに能動的に封入させたアテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および／または治療するための物質を含む。
【0016】
リポソームキャリアの物質がリン脂質およびコレステロールを含む、本開示の第１の態様によるリポソームナノキャリア送達システムであり；
あるいは、リン脂質は、以下から選択される１つまたはそれ以上である：水素化大豆ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、ジシンナモイルホスファチジルコリン、ジシンナモイルホスファチジルエタノールアミン、ジシンナモイルホスファチジルセリン、ジシンナモイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、ジエルコイルホスファチジルコリン、ジエルコイルホスファチジルエタノールアミン、ジエルシルホスファチジルセリン、ジエルシルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルエタノールアミン、卵ホスファチジルグリセロール。
あるいは、リン脂質は、以下から選択される１つまたはそれ以上である：水素化大豆ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、ジシンナモイルホスファチジルコリン、ジシンナモイルホスファチジルエタノールアミン、ジシンナモイルホスファチジルセリン、ジシンナモイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、ジエルコイルホスファチジルコリン、ジエルコイルホスファチジルエタノールアミン、ジエルシルホスファチジルセリン、ジエルシルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルエタノールアミン、卵ホスファチジルグリセロール。
【0017】
本開示の第１の態様は、リポソームナノキャリア送達システムであって、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および／または治療するために用いられる物質とリポソームキャリアとの質量比が、１：０．１～５０、代替的には１：０．２～３０、さらに代替的には１：０．５～２０である、リポソームナノキャリア送達システムである。任意選択に、ナノキャリア送達システムの調製は、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の予防および／または治療に用いられる物質を能動的に封入させるために塩溶液で水和したリポソームキャリアを用いる工程をさらに含む。
【0018】
本開示の第１の態様は、リポソームナノキャリア送達システムであって、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および／または治療するために用いられる物質が、弱酸性物質であるか；
あるいは、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および／または治療するために用いられる物質が、スタチン、フィブラート、抗血小板薬、ＰＣＳＫ９阻害薬、抗凝固薬、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、カルシウムイオン拮抗薬、ＭＭＰ阻害薬、β受容体遮断薬、グルココルチコイド、およびこれらの医薬的に許容される塩、ならびに前記薬物または物質の活性製剤から選択される１つまたはそれ以上であるか；
あるいは、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および／または治療するために用いられる物質が、ロバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ベザフィブラート、シプロフィブラート、ゲムフィブロジル、アスピリン、アセメタシン、オザグレルナトリウム、チロフィバン、およびこれらの薬力学的フラグメントまたは医薬的に許容される塩から選択される１つまたはそれ以上である、リポソームナノキャリア送達システムである。
あるいは、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および／または治療するために用いられる物質が、スタチン、フィブラート、抗血小板薬、ＰＣＳＫ９阻害薬、抗凝固薬、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、カルシウムイオン拮抗薬、ＭＭＰ阻害薬、β受容体遮断薬、グルココルチコイド、およびこれらの医薬的に許容される塩、ならびに前記薬物または物質の活性製剤から選択される１つまたはそれ以上であるか；
あるいは、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および／または治療するために用いられる物質が、ロバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ベザフィブラート、シプロフィブラート、ゲムフィブロジル、アスピリン、アセメタシン、オザグレルナトリウム、チロフィバン、およびこれらの薬力学的フラグメントまたは医薬的に許容される塩から選択される１つまたはそれ以上である、リポソームナノキャリア送達システムである。
【0019】
本開示の第１の態様は、リポソームナノキャリア送達システムであって、リポソームナノキャリア送達システムが、ＧＡＧ、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、セレクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、モノクローナル抗体ＨＩ４４ａ、ＨＩ３１３、Ａ３Ｄ８、Ｈ９０およびＩＭ７、ならびにヒアルロン酸またはヒアルロン酸の誘導体などの標的化リガンドで修飾可能であるか；
あるいは、前記標的化リガンドが、ヒアルロン酸、セルグリシン、コラーゲン、フィブロネクチン、セレクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ならびにモノクローナル抗体ＨＩ４４ａおよびＩＭ７から選択される、リポソームナノキャリア送達システムである。
あるいは、前記標的化リガンドが、ヒアルロン酸、セルグリシン、コラーゲン、フィブロネクチン、セレクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、ならびにモノクローナル抗体ＨＩ４４ａおよびＩＭ７から選択される、リポソームナノキャリア送達システムである。
【0020】
本開示の第１の態様は、リポソームナノキャリア送達システムであって、リポソームキャリアが、小型一枚膜リポソーム（small unilamellar liposome）、大型一枚膜リポソーム（large unilamellar liposome）、および多重一枚膜リポソーム（multilamellar liposome）から選択される、リポソームナノキャリア送達システムである。
【0021】
本開示の第２の態様は、第１の態様によるリポソームナノキャリア送達システムを調製する方法であって、リポソームの内側と外側との間に溶液酸性勾配を形成させるために塩溶液を添加し、分離させることによりリポソームキャリアを水和させる工程を含む方法を提供する。
【0022】
本開示の第２の態様は、リポソームナノキャリア送達システムであって、塩が、弱酸および強アルカリの塩であるか；
あるいは、塩のアニオン部分が、酢酸塩、エデト酸塩、炭酸水素塩、クエン酸塩、安息香酸塩、およびグルコン酸塩から選択される１つまたはそれ以上であるか；ならびに／あるいは
塩のカチオン部分が、カルシウムイオン、銅イオン、ニッケルイオン、バリウムイオン、マグネシウムイオン、および亜鉛イオンから選択される１つまたはそれ以上であるか；
さらに別の方法として、塩は、酢酸カルシウム、炭酸水素カルシウム、クエン酸マグネシウムおよびグルコン酸銅から選択される１つまたはそれ以上である、リポソームナノキャリア送達システムである。
あるいは、塩のアニオン部分が、酢酸塩、エデト酸塩、炭酸水素塩、クエン酸塩、安息香酸塩、およびグルコン酸塩から選択される１つまたはそれ以上であるか；ならびに／あるいは
塩のカチオン部分が、カルシウムイオン、銅イオン、ニッケルイオン、バリウムイオン、マグネシウムイオン、および亜鉛イオンから選択される１つまたはそれ以上であるか；
さらに別の方法として、塩は、酢酸カルシウム、炭酸水素カルシウム、クエン酸マグネシウムおよびグルコン酸銅から選択される１つまたはそれ以上である、リポソームナノキャリア送達システムである。
【0023】
本開示の第２の態様は、調製方法であって、以下の工程：
（１）リポソームキャリアの物質を良溶媒に溶解し；
（２）工程（１）で得られた生成物に、リポソームの内側と外側で溶液酸性勾配を形成する塩溶液を加えて水和させ、粗脂質溶液に分散させ；
（３）工程（２）で得られた粗脂質溶液の粒子径を減少させて、微小化されたリポソームを得；
（４）工程（３）で得られた微小化リポソーム溶液を精製して外部イオンを除去し、リポソームの内部と外部の間に酸性勾配を形成し；次いで
（５）工程（４）で得られたリポソーム溶液に、封入される物質の溶液を加え、インキュベーションを行って薬剤をリポソームの内部に侵入させ、リポソームナノキャリア送達システムを得ることを含む、方法である。
（１）リポソームキャリアの物質を良溶媒に溶解し；
（２）工程（１）で得られた生成物に、リポソームの内側と外側で溶液酸性勾配を形成する塩溶液を加えて水和させ、粗脂質溶液に分散させ；
（３）工程（２）で得られた粗脂質溶液の粒子径を減少させて、微小化されたリポソームを得；
（４）工程（３）で得られた微小化リポソーム溶液を精製して外部イオンを除去し、リポソームの内部と外部の間に酸性勾配を形成し；次いで
（５）工程（４）で得られたリポソーム溶液に、封入される物質の溶液を加え、インキュベーションを行って薬剤をリポソームの内部に侵入させ、リポソームナノキャリア送達システムを得ることを含む、方法である。
【0024】
本開示の第２の態様は、調製方法であって、工程（１）が、溶媒を蒸発により除去してリポソームに脂質膜を形成させる工程をさらに含むか；
あるいは、蒸発の温度が、４０～８０℃、５０～７０℃、または５０～６０℃であるか；
さらに別の方法として、蒸発の方法が、回転蒸発法であるか；
さらに別の方法として、回転蒸発が、５０～２００ｒ／分、あるいは７０～１２０ｒ／分、さらに別の方法として８０～１００ｒ／分の速度で行われる、方法である。
あるいは、蒸発の温度が、４０～８０℃、５０～７０℃、または５０～６０℃であるか；
さらに別の方法として、蒸発の方法が、回転蒸発法であるか；
さらに別の方法として、回転蒸発が、５０～２００ｒ／分、あるいは７０～１２０ｒ／分、さらに別の方法として８０～１００ｒ／分の速度で行われる、方法である。
【0025】
本開示の第２の態様は、調製方法であって、工程（１）において、良溶媒が、クロロホルム、エタノール、メタノール、塩化メチレン、アセトン、トルエン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、酢酸メチル、アセトニトリル、およびジクロロエタンから選択される１つまたはそれ以上である、方法である。
【0026】
本開示の第２の態様は、調製方法であって、工程（１）において、リポソームキャリアの物質が、リン脂質およびコレステロールを含むか；
あるいは、リン脂質が、０．１～５００ｍｇ／ｍＬ、あるいは０．１～２００ｍｇ／ｍＬ、さらにあるいは０．２～１００ｍｇ／ｍＬの濃度であるか；ならびに／あるいは
コレステロールが、０．０５～２００ｍｇ／ｍＬ、あるいは０．１～１００ｍｇ／ｍＬ、さらには０．１～５０ｍｇ／ｍＬの濃度である、方法である。
あるいは、リン脂質が、０．１～５００ｍｇ／ｍＬ、あるいは０．１～２００ｍｇ／ｍＬ、さらにあるいは０．２～１００ｍｇ／ｍＬの濃度であるか；ならびに／あるいは
コレステロールが、０．０５～２００ｍｇ／ｍＬ、あるいは０．１～１００ｍｇ／ｍＬ、さらには０．１～５０ｍｇ／ｍＬの濃度である、方法である。
【0027】
本開示の第２の態様は、調製方法であって、工程（２）において、塩溶液が、１００～５００ｍＭ、代替的には２００～３００ｍＭ、さらに代替的には２００～２５０ｍＭの濃度であるか；ならびに／あるいは
水和の温度が、３０～９０℃、あるいは４０～８０℃、あるいは４５～６５℃である、方法である。
水和の温度が、３０～９０℃、あるいは４０～８０℃、あるいは４５～６５℃である、方法である。
【0028】
本開示の第２の態様は、調製方法であって、工程（３）において、粒子径を減少させる方法は、粗脂質溶液をフィルター膜に通して押し出すことであるか；
あるいは、フィルター膜が、ポリカーボネート膜であるか；
さらに代替的に、フィルター膜が、３０～８００ｎｍ、例えば５０～４００ｎｍ、例えば１００～２００ｎｍ、例えば３０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍまたは８００ｎｍ、代替的に１００～１５０ｎｍの孔径を有する、方法である。
あるいは、フィルター膜が、ポリカーボネート膜であるか；
さらに代替的に、フィルター膜が、３０～８００ｎｍ、例えば５０～４００ｎｍ、例えば１００～２００ｎｍ、例えば３０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍまたは８００ｎｍ、代替的に１００～１５０ｎｍの孔径を有する、方法である。
【0029】
本開示の第２の態様は、調製方法であって、工程（４）において、外部イオンを除去する方法が、限外濾過膜パックによる分離、透析分離およびイオン交換から選択される１つまたはそれ以上である、方法である。
【0030】
本開示の第２の態様による調製方法であって、工程（５）において、封入される物質の溶液は、０．０１～１００ｍｇ／ｍＬ、代替的には０．０５～５０ｍｇ／ｍＬ、さらに代替的には０．１～２０ｍｇ／ｍＬ、さらに代替的には０．１～１０ｍｇ／ｍＬの濃度である。
【0031】
本開示の第２の態様は、調製方法であって、工程（５）において、インキュベーションの温度が、２０～８０℃、あるいは２５～７０℃である、方法である。
【0032】
本開示の第２の態様は、調製方法であって、リポソームナノキャリア送達システムが、標的化リガンドで修飾される場合、本方法は、以下の工程：
（６）標的化リガンドを、工程（５）で得られたリポソームナノキャリア送達システムと共インキュベートして、修飾リポソームナノキャリア送達システムを得ることをさらに含む、方法である。
（６）標的化リガンドを、工程（５）で得られたリポソームナノキャリア送達システムと共インキュベートして、修飾リポソームナノキャリア送達システムを得ることをさらに含む、方法である。
【0033】
本開示の第３の態様は、第１の態様によるナノキャリア送達システム、または第２の態様による調製方法によって調製されたナノキャリア送達システム、および少なくとも１つの医薬的に許容されるキャリアを含む、医薬を提供する。
【0034】
本開示の第４の態様は、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および／または治療するための医薬の製造における、第１の態様によるナノキャリア送達システム、第２の態様による調製方法によって調製されたナノキャリア送達システム、および第３の態様による医薬の使用を提供する。
【0035】
あるいは、アテローム性動脈硬化症関連疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈アテローム性動脈硬化性心疾患（急性冠症候群、無症候性心筋虚血－潜在性冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、虚血性心疾患、突然死、ステント内再狭窄を含む）、脳動脈硬化症（脳虚血性脳卒中、出血性脳溢血を含む）、末梢血管アテローム性動脈硬化症（頸動脈アテローム性動脈硬化症、椎骨アテローム性動脈硬化症、鎖骨下アテローム性動脈硬化症、閉塞性末梢動脈硬化症、網膜アテローム性動脈硬化症、腎アテローム性動脈硬化症、下肢アテローム性動脈硬化症、上肢アテローム性動脈硬化症、腸間膜アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化性インポテンスを含む）、大動脈解離、血管腫、血栓塞栓症、心不全、および心原性ショックから選択される１つまたはそれ以上である。
【0036】
本開示の第５の態様は、血管プラークを治療するための医薬の製造における、第１の態様によるナノキャリア送達システム、第２の態様による調製方法によって調製されたナノキャリア送達システム、および第３の態様による医薬の使用を提供し；
あるいは、血管プラークが、動脈プラークであるか；
さらに別の方法として、医薬が、動脈プラークの進行を抑制し、動脈プラークを逆転させ、および／または動脈プラークの量を減少させるために使用される、使用である。
あるいは、血管プラークが、動脈プラークであるか；
さらに別の方法として、医薬が、動脈プラークの進行を抑制し、動脈プラークを逆転させ、および／または動脈プラークの量を減少させるために使用される、使用である。
【0037】
本開示は、標的化製剤の分野に属し、能動的標的化リポソームナノキャリア送達システム、その調製方法およびその使用、特に、アテローム性動脈硬化症を標的化した能動的封入リポソームナノ薬物を調製するための革新的な方法およびその使用、例えば、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の診断、予防および治療に関する。
【0038】
ナノ薬物送達システムの治療効果をさらに向上させ、ナノキャリアの薬物ローディング率と封入率を高め、標的化ナノ薬物の臨床変換能力を高めるために、本特許出願は、活性薬物ローディングによる標的化リポソームナノ薬物の調製方法を開示しており、本出願の発明者らは、予想外なことに、適切な粒子径とリガンド濃度が薬効に重要な役割を果たすことを見出した。本特許出願は、薬物ローディング技術、特定のキャリアナノ構造、特定のリガンド密度、および動脈硬化性疾患の治療のための新しい方法を開示しており、動脈硬化症の領域において、動脈硬化症薬物、抗炎症薬物、抗血小板薬物を含む様々な薬物の効率的な濃縮を達成する。
【0039】
本特許出願は、標的化リポソーム薬物の活性薬物ローディングに関する一連の新しいシステム、方法およびプロセスを開示しており、これらは薬物キャリアとしての大きな利点を反映し、９０％以上の薬物封入率を達成できる。本特許出願は、モデル動物における優れた治療効果をさらに検証し、動脈硬化を標的としたリポソーム薬物キャリアの応用を広げるものである。
【0040】
あるいは、リポソームの製剤は、リン脂質（０．２～１００ｍｇ／ｍＬ）、コレステロール（０．１～５０ｍｇ／ｍＬ）、および薬物（０．１～１０ｍｇ／ｍＬ）を含み、薬物と脂質物質との質量比は、１：０．５～１：２０である。
【0041】
本開示の一実施形態によれば、本特許出願は、アテローム性動脈硬化症の治療のために能動的な封入により薬物を担持するリポソーム製剤であって、粒子径が５０～３００ｎｍ、リン脂質濃度が０．２～１００ｍｇ／ｍＬ、コレステロール濃度が０．１～５０ｍｇ／ｍＬ、薬物濃度が０．１～１０ｍｇ／ｍＬであり、薬物と脂質物質との質量比が１：０．５～１：２０である、リポソーム製剤を提供する。あるいは、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および／または治療するために用いられる物質は、スタチン、フィブラート、抗血小板薬、ＰＣＳＫ９阻害薬、抗凝固薬、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、カルシウムイオン拮抗薬、ＭＭＰ阻害薬、β受容体遮断薬、グルココルチコイド、およびこれらの医薬的に許容される塩からなる群から選択される１つまたはそれ以上であり、上記の薬物または物質の活性製剤を含む。
【0042】
さらに別の方法として、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患を予防および／または治療するために用いられる物質は、ロバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ベザフィブラート、シプロフィブラート、ゲムフィブロジル、アスピリン、アセメタシン、オザグレルナトリウム、チロフィバン、および薬理学的製剤からなる群から選択される１つ以上である、プラバスタチン、ベザフィブラート、シプロフィブラート、ゲムフィブロジル、アスピリン、アセメタシン、オザグレルナトリウム、チロフィバン、およびそれらの薬力学的フラグメントまたは医薬的に許容される塩からなる群から選択される１つまたはそれ以上である。
【0043】
本開示の一実施形態は、ナノキャリア送達システムを調製するための方法であって、以下の工程：
（１）リン脂質膜物質を良溶媒に溶解し、次いで蒸発により溶媒を除去するか、または溶媒を除去せず；
（２）工程（１）で得られた溶液または蒸発乾燥物に、リポソームの内側と外側との間に溶液酸性勾配を形成する塩溶液を添加して水和させ、それを粗脂質溶液に前もって分散させ；
（３）粗脂質溶液の粒子径を減少させ、微小化リポソームを得；
（４）工程（３）で得られたリポソーム溶液から精製により外部イオンを除去し、リポソームの内部と外部の間に酸性勾配を形成させ；
（５）工程（４）で得られたリポソーム溶液に、封入させる薬液を添加して、前記薬液がリポソームの内部に侵入させ；次いで
（６）挿入法に基づいてリポソームの表面上で標的化リガンドを構築することを含む、方法を提供する。
（１）リン脂質膜物質を良溶媒に溶解し、次いで蒸発により溶媒を除去するか、または溶媒を除去せず；
（２）工程（１）で得られた溶液または蒸発乾燥物に、リポソームの内側と外側との間に溶液酸性勾配を形成する塩溶液を添加して水和させ、それを粗脂質溶液に前もって分散させ；
（３）粗脂質溶液の粒子径を減少させ、微小化リポソームを得；
（４）工程（３）で得られたリポソーム溶液から精製により外部イオンを除去し、リポソームの内部と外部の間に酸性勾配を形成させ；
（５）工程（４）で得られたリポソーム溶液に、封入させる薬液を添加して、前記薬液がリポソームの内部に侵入させ；次いで
（６）挿入法に基づいてリポソームの表面上で標的化リガンドを構築することを含む、方法を提供する。
【0044】
本開示は、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の診断、予防および治療用製品の製造における、能動的封入リポソームの使用を提供する。
【0045】
本開示のナノキャリア送達システムは、以下の有益な効果を有し得るが、これらに限定されない。
【0046】
本開示は、能動的に封入するリポソームナノキャリア送達システムを調製するプロセスおよびその最適化プロセスを提供しつつ、得られた標的送達系のプラークを逆転させる能力を検証する。このシステムは、高い封入率と薬物ローディング量を示し、封入された薬物を強力に保護し、長期保存中に薬物が放出されることがなく、体内での薬物の徐放を可能にし、病変部での薬物の局所濃縮濃度を高めることができ、低い毒性と高い効率の利点を有する。本開示の方法は、簡便で、環境に優しく、制御可能であり、高い薬物ローディング量、様々な薬物との良好な適合性、良好な生体適合性をもたらし、高い安全性を有し、標的化リガンドの修飾を容易に行うことができ、得られた標的化薬物は、アテローム性動脈硬化症の治療に良好な効果を有する。
【0047】
図面の簡単な説明
図面と併せて読めば、前述の本発明の概要および以下の実施形態の詳細な説明がよりよく理解されるであろう。本開示を説明するために、図面にはいくつかの異なる実施形態が示されているが、全ての異なる形態ではない。しかしながら、本開示は、図示された正確な配列や装置に限定されるものではないことを理解されたい。本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成するこれらの図面は、本開示の原理を説明するのに有用である。
図面と併せて読めば、前述の本発明の概要および以下の実施形態の詳細な説明がよりよく理解されるであろう。本開示を説明するために、図面にはいくつかの異なる実施形態が示されているが、全ての異なる形態ではない。しかしながら、本開示は、図示された正確な配列や装置に限定されるものではないことを理解されたい。本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成するこれらの図面は、本開示の原理を説明するのに有用である。
【0048】
図１は、ヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）とプラークを標的としたヒアルロン酸標的化物質（ＨＰＤ）の赤外スペクトルを示す。
【0049】
図２は、エタノール注入法によりロスバスタチンを能動的に封入したナノリポソームＬＰ／ＲＡ９０、ＬＰ／ＲＡ１２０、およびＬＰ／ＲＡ１５０の凍結電子顕微鏡写真（Ａ、Ｂ、およびＣ）と水和粒子径（Ｄ、Ｅ、およびＦ）の結果を示す。
【0050】
図３は、ハイブリッド水和によってロスバスタチンを能動的に封入したナノリポソームＬＰ／ＲＢ９０、ＬＰ／ＲＢ１２０、およびＬＰ／ＲＢ１５０の低温電子顕微鏡写真（Ａ、Ｂ、およびＣ）と水和粒子径（Ｄ、Ｅ、およびＦ）の結果である。
【0051】
図４は、ロスバスタチンを能動的に封入したナノリポソームＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０、ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０、ＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０の低温電子顕微鏡写真（Ａ、Ｂ、およびＣ）と水和粒子径（Ｄ、Ｅ、およびＦ）の結果を示す。
【0052】
図５は、ロスバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリア送達システムＨＡ－ＬＰ／ＲＣの低温電子顕微鏡写真（Ａ）と水和粒子径（Ｂ）の結果である。
【0053】
図６は、アトルバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＡＣの低温電子顕微鏡写真と水和粒子径（動的光散乱、ＤＬＳ）を示す。
【0054】
図７は、アスピリンを能動的に封入した標的化薬物リポソームＨＡ－ＬＰ／ＡＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0055】
図８は、ピタバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＰＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0056】
図９は、ロバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＬＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0057】
図１０はシンバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＳＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0058】
図１１は、プラバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＰＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0059】
図１２は、ベザフィブラートを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＢＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0060】
図１３は、シプロフィブラートを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＣＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0061】
図１４はアセメタシンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＡｍＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0062】
図１５は、オザグレルを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＯＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0063】
図１６は、チロフィバンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＴＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0064】
図１７は、ロスバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ＠ＬＰ／Ｒｄの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0065】
図１８は、アトルバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ＠ＬＰ／Ａｄの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0066】
図１９は、シプロフィブラートを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ＠ＬＰ／Ｃｄの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0067】
図２０は、ベザフィブラートを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／Ｂｄの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0068】
図２１は、本開示のナノ送達システムの長期安定性の実験結果を示す。
【0069】
図２２は、本開示のＨＡ－ＬＰ／Ｒナノ薬物送達システムと各コントロール群のプラーク体積の進行の割合を示す。
【0070】
図２３は、大動脈における異なる治療薬の濃縮度の比較である。
【0071】
図２４ａと２４ｂは、異なるＨＡ／脂質物質の質量比の薬効の比較を示す。
【0072】
図２５は、エンドサイトーシスアッセイにおける細胞溶解物の蛍光値の比較を示す。
【0073】
図２６ａは、エンドサイトーシスアッセイにおけるＬＰ／ＲＣリポソームの生存細胞アッセイの蛍光顕微鏡写真である。図２６ｂは、エンドサイトーシスアッセイにおけるＨＡ＠ＬＰ／ＲＣナノキャリア送達システムの生存細胞アッセイの蛍光顕微鏡写真であり、青色はＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で染色した核であり、赤色は細胞内のＣｙ５．５標識リポソームである。
【0074】
図２７は、異なる時間条件下での蛍光標識ＨＡ＠ＬＰ／ＲＣとＬＰ／ＲＣのインビボ分布と代謝の結果を示す。
【0075】
図２８は、ＨＡ＠ＬＰ／ＲＣ投与後の動物の体重変化を示す。
【0076】
図２９は、ＨＰＤ測定用の参照標準曲線を示す。
【実施例】
【0077】
実施形態の詳細な説明
以下、具体的な実施例によって本開示をさらに説明するが、これらの実施例はより詳細な説明を目的としたものに過ぎず、いかなる形でも本開示を限定するものと解釈されるべきではないことを理解されたい。
以下、具体的な実施例によって本開示をさらに説明するが、これらの実施例はより詳細な説明を目的としたものに過ぎず、いかなる形でも本開示を限定するものと解釈されるべきではないことを理解されたい。
【0078】
この項目では、本開示の試験で使用される材料と試験方法について説明する。本開示で使用される材料および操作方法は、特に断りのない限り、文脈上、当業者に周知であることは明らかである。
【0079】
以下の実施例で使用した試薬と器具は以下の通りである：
試薬：
ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧはＡＶＴものから購入した；
クロロホルム、無水エタノール、炭酸水素ナトリウム、ＥＤＣ、ＮＨＳ、酢酸カルシウム、およびロスバスタチンカルシウムは、Ｊ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した；
ＨＡは、Ｂｌｏｏｍａｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入し；ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨ２はＳｉｇｍａから購入した；
ポリカーボネート膜は、Ｗｈａｔｍａｎから購入した；
アトルバスタチンは、ルナルサン社から購入した；
アスピリン、ピタバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、ベザフィブラート、シプロフィブラート、アセメタシン、オザグレル、チロフィバンは、Ｊ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した；
試薬：
ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧはＡＶＴものから購入した；
クロロホルム、無水エタノール、炭酸水素ナトリウム、ＥＤＣ、ＮＨＳ、酢酸カルシウム、およびロスバスタチンカルシウムは、Ｊ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した；
ＨＡは、Ｂｌｏｏｍａｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入し；ＤＳＰＥ－ＰＥＧ－ＮＨ２はＳｉｇｍａから購入した；
ポリカーボネート膜は、Ｗｈａｔｍａｎから購入した；
アトルバスタチンは、ルナルサン社から購入した；
アスピリン、ピタバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、ベザフィブラート、シプロフィブラート、アセメタシン、オザグレル、チロフィバンは、Ｊ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した；
【0080】
装置：
押出機（ＡＴＳ、ＡＥ００１）；
Ｍａｌｖｅｒｎ社から購入したレーザー粒度分布測定機（モデル：Ｎａｎｏ－ＺＳ）を使用した。
ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ社から購入した（モデル：ｅ２６９５）。
押出機（ＡＴＳ、ＡＥ００１）；
Ｍａｌｖｅｒｎ社から購入したレーザー粒度分布測定機（モデル：Ｎａｎｏ－ＺＳ）を使用した。
ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ社から購入した（モデル：ｅ２６９５）。
【0081】
実施例１ プラークを標的としたヒアルロン酸を基にした標的化物質（ＨＰＤ）の合成
この実施例では、平均分子量１２，０００～１６，０００のヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）とＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨ２（ＤＰＮ）を原料として用い、ＥＤＣとＮＨＳＳの作用でアミド結合により縮合させた。結晶化後、エタノールで洗浄し、ＣＤ４４を標的とした標的化物質（ＨＰＤ）の完成品を得た。
この実施例では、平均分子量１２，０００～１６，０００のヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）とＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨ２（ＤＰＮ）を原料として用い、ＥＤＣとＮＨＳＳの作用でアミド結合により縮合させた。結晶化後、エタノールで洗浄し、ＣＤ４４を標的とした標的化物質（ＨＰＤ）の完成品を得た。
【0082】
具体的な方法は以下のとおりであった。７５ｇのＨＡを秤量し、精製水または注射用水で撹拌しながら溶解した。ＤＰＮまたはＤＰＮのＤＭＦ溶液を添加し、添加したＤＰＮとＨＡの質量比を１：１またはそれ以上に調整した。ＥＤＣまたはＥＤＣとＮＨＳＳを加え、十分に混合し、２５～４０℃で１０時間以上撹拌した。反応完了後、反応液に同等容量またはそれ以上の無水エタノールを加え、均一に撹拌し、２０分間またはそれ以上静置した。静置後、溶液を遠心分離して沈殿物を回収するか、あるいは溶液をメンブレンパックで濃縮し、次いで遠心分離して沈殿物を回収した。前記沈殿物をエタノールで再懸濁し、遠心分離し、次いで洗浄を２回またはそれ以上繰り返した。洗浄後に得られた遠心分離した沈殿物を、真空乾燥または凍結乾燥し、最終生成物の含水率を１０％未満に調節した。
【0083】
図１は、ＨＡとＨＰＤの赤外スペクトログラムを示す。
【0084】
実施例２ エタノール注入法によるロスバスタチンを能動的に封入したナノリポソームの調製
この実施例では、ロスバスタチンを担持したナノリポソームをエタノール注入および能動的封入法（active encapsulation method）で調製した。
この実施例では、ロスバスタチンを担持したナノリポソームをエタノール注入および能動的封入法（active encapsulation method）で調製した。
【0085】
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロールおよびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（質量比３：１：１または３：１：０．５）を秤量し、上記脂質材料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（１５０ｍＭ以上）を加え、４０～６０℃に保ちつつ攪拌しながら酢酸カルシウム水溶液に前記エタノール相を注入し、脂質原料溶液を十分に水和させて粗リポソーム懸濁液を形成させた（酢酸カルシウム水相とエタノール相溶液との体積比は２以上であった）。押出機を用いて、それぞれ６００ｎｍ、４００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍのポリカーボネート膜、またはそれらからなる多層膜に通して３回以上押出成形を行った。押し出されたナノリポソーム溶液を精製水で２０倍以上に希釈し、膜孔径を制御することにより、粒子径が約９０ｎｍ、約１２０ｎｍ、および約１５０ｎｍの３種類の大きさのナノ粒子（ＬＰ／ＲＡ９０、ＬＰ／ＲＡ１２０、ＬＰ／ＲＡ１５０）を得、いずれのナノ粒子もＰＤＩが０．２以下であった。透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、封入されなかった酢酸カルシウムを透析により分離した。前記内部液を回収し、ロスバスタチンカルシウム溶液またはロスバスタチンカルシウムとショ糖の混合溶液（全脂質原料に対するロスバスタチンカルシウムの質量比は０．２５未満であった）と十分に混合し、４～６６℃で１５分以上インキュベートすることにより、ロスバスタチンカルシウムを能動的に封入したナノリポソームを得た。調製したナノリポソームへの原薬の封入率は８０％以上であり、最終製剤中の原薬濃度は２０ｍｇ／ｍＬ以下であった。
【0086】
図２は、本実施例においてエタノール注入法によりロスバスタチンを能動的に封入したナノリポソームＬＰ／ＲＡ９０、ＬＰ／ＲＡ１２０、ＬＰ／ＲＡ１５０の凍結電子顕微鏡写真（Ａ、Ｂ、Ｃ）と水和粒子径（Ｄ、Ｅ、Ｆ）の結果を示す。
【0087】
実施例３ ハイブリッド水和によるロスバスタチンを能動的に封入したナノリポソームの調製
この実施例では、ハイブリッド水和および能動的封入法によって、ロスバスタチンを担持したナノリポソームを調製した。ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（重量比３：１：１～０．５）を秤量し、上記脂質材料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（１５０ｍＭ以上）を添加し、温度を４０～６０℃に保ちながら、ティーパイプ、マイクロ流体コントローラー等のミキサーを用いて、エタノール相を水相と一定比率で混合し、脂質材料を十分に水和させて粗リポソーム懸濁液を形成させた（酢酸カルシウム水相とエタノール相溶液の体積比は２以上であった）。押出機を用いて、それぞれ６００ｎｍ、４００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍのポリカーボネート膜、またはこれらからなる多層膜に通して３回以上押出成形を行った。押し出されたナノリポソーム溶液を精製水で２０倍以上に希釈し、最終的に膜孔径と押し出し時間を制御することにより、粒子径が約９０ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１５０ｎｍの３種類の大きさのナノ粒子（ＬＰ／ＲＢ９０、ＬＰ／ＲＢ１２０、ＬＰ／ＲＢ１５０）を得、いずれのナノ粒子もＰＤＩは０．２以下であった。透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、封入されなかった酢酸カルシウムを透析により分離した。内部液を回収し、ロスバスタチンカルシウム溶液またはロスバスタチンカルシウムとショ糖の混合溶液（全脂質原料に対するロスバスタチンカルシウムの質量比は０．２５以下であった）と十分に混合し、４～６６℃で１５分以上インキュベートすることにより、ロスバスタチンカルシウムを能動的に封入したナノリポソームを得た。調製したナノリポソームへの原薬の封入率は８０％以上であり、最終製剤中の原薬濃度は２０ｍｇ／ｍＬ以下であった。
この実施例では、ハイブリッド水和および能動的封入法によって、ロスバスタチンを担持したナノリポソームを調製した。ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（重量比３：１：１～０．５）を秤量し、上記脂質材料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（１５０ｍＭ以上）を添加し、温度を４０～６０℃に保ちながら、ティーパイプ、マイクロ流体コントローラー等のミキサーを用いて、エタノール相を水相と一定比率で混合し、脂質材料を十分に水和させて粗リポソーム懸濁液を形成させた（酢酸カルシウム水相とエタノール相溶液の体積比は２以上であった）。押出機を用いて、それぞれ６００ｎｍ、４００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍのポリカーボネート膜、またはこれらからなる多層膜に通して３回以上押出成形を行った。押し出されたナノリポソーム溶液を精製水で２０倍以上に希釈し、最終的に膜孔径と押し出し時間を制御することにより、粒子径が約９０ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１５０ｎｍの３種類の大きさのナノ粒子（ＬＰ／ＲＢ９０、ＬＰ／ＲＢ１２０、ＬＰ／ＲＢ１５０）を得、いずれのナノ粒子もＰＤＩは０．２以下であった。透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、封入されなかった酢酸カルシウムを透析により分離した。内部液を回収し、ロスバスタチンカルシウム溶液またはロスバスタチンカルシウムとショ糖の混合溶液（全脂質原料に対するロスバスタチンカルシウムの質量比は０．２５以下であった）と十分に混合し、４～６６℃で１５分以上インキュベートすることにより、ロスバスタチンカルシウムを能動的に封入したナノリポソームを得た。調製したナノリポソームへの原薬の封入率は８０％以上であり、最終製剤中の原薬濃度は２０ｍｇ／ｍＬ以下であった。
【0088】
図３は、本実施例におけるハイブリッド水和によってロスバスタチンを能動的に封入したナノリポソームＬＰ／ＲＢ９０、ＬＰ／ＲＢ１２０、ＬＰ／ＲＢ１５０の低温電子顕微鏡写真（Ａ、Ｂ、Ｃ）と水和粒子径（Ｄ、Ｅ、Ｆ）の結果を示す。
【0089】
実施例４ ロスバスタチンを能動的に封入した標的化ナノリポソーム製剤の調製
上記実施例１で調製した標的化物質ＨＰＤを、実施例２で調製した１３０ｎｍ薬物担持ナノリポソームＬＰ／ＲＡ１５０に挿入し、標的化薬物担持ナノリポソームを得た。具体的な挿入方法は以下の通りであった。実施例３で調製したロスバスタチンカルシウムを担持したナノリポソーム溶液を、予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液と混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。インキュベーション後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、ＨＰＤ濃度が２００±３１μｇ／ｍＬの高濃度のリガンド標的化リポソーム（ＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０）、ＨＰＤ濃度が１００±２４μｇ／ｍＬと中程度のリガンド標的化リポソーム（ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０）、ＨＰＤ濃度が１０±５μｇ／ｍＬと低濃度の標的化薬物担持リポソーム（ＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０）を得た。
上記実施例１で調製した標的化物質ＨＰＤを、実施例２で調製した１３０ｎｍ薬物担持ナノリポソームＬＰ／ＲＡ１５０に挿入し、標的化薬物担持ナノリポソームを得た。具体的な挿入方法は以下の通りであった。実施例３で調製したロスバスタチンカルシウムを担持したナノリポソーム溶液を、予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液と混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。インキュベーション後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、ＨＰＤ濃度が２００±３１μｇ／ｍＬの高濃度のリガンド標的化リポソーム（ＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０）、ＨＰＤ濃度が１００±２４μｇ／ｍＬと中程度のリガンド標的化リポソーム（ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０）、ＨＰＤ濃度が１０±５μｇ／ｍＬと低濃度の標的化薬物担持リポソーム（ＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０）を得た。
【0090】
図４は、本実施例のロスバスタチンを能動的に封入したナノリポソームＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０、ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０、ＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０の低温電子顕微鏡写真（Ａ、Ｂ、Ｃ）と水和粒子径（Ｄ、Ｅ、Ｆ）の結果を示す。
【0091】
キットは競合的酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた。試料、標準物質、ＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）および抗ＨＡＢＰ抗体を、ヒアルロン酸の誘導体（ＨＡ）で予めコーティングしたマイクロウェルに順に加え、インキュベーションと十分な洗浄の後、結合しなかった成分を除去した。その後、ＨＲＰ標識抗マウス免疫グロブリンＧ（酵素標識二次抗体）を加えた。インキュベーションと十分な洗浄後、未結合成分を除去し、抗原－ＨＡ結合タンパク質－ＨＡＢＰ抗体－酵素標識抗体の固相免疫複合体がマイクロウェルプレートの固相表面に形成された。基質ＡとＢを加え、ＨＲＰで触媒して青色の生成物が生成され、最終的に停止液（２Ｍ硫酸）の作用で黄色に変換し、色の濃さは試料中のヒアルロン酸（ＨＡ）と負の相関を示した。吸光度（ＯＤ値）をマイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの波長で測定し、標準曲線をあてはめ、試料中のヒアルロン酸（ＨＡ）濃度が算出されうる。
【0092】
実施例５ ロスバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリア送達システム（ＨＡ＠ＬＰ／Ｒ
Ｃ
）の調製
この実施例では、治療薬を担持したリポソームＨＡ＠ＬＰ／ＲＣを、フィルム分散法、活性薬物ローディング法、化学カップリング法により調製した。
この実施例では、治療薬を担持したリポソームＨＡ＠ＬＰ／ＲＣを、フィルム分散法、活性薬物ローディング法、化学カップリング法により調製した。
【0093】
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ＤＰＮ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：０．５：１：１）を秤量し、上記脂質材料をクロロホルム中に溶解させた。有機溶媒を低速回転蒸発法（５５℃の水槽，９０ｒ／分，３０分）で除去し、容器壁面に脂質膜を形成させた。酢酸カルシウム水溶液（２００ｍＭ）を加え、４５℃の恒温水槽で脂質膜を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、ロスバスタチンカルシウム（１３３ｍｇ）の２５ｍＬと十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、粒子径１６０ｎｍの薬物を能動的に封入されたリポソームＬＰ／ＲＣを得た。図５は、本開示の実施例１におけるＬＰ／ＲＣの粒度分布図を示す。
【0094】
調製したロスバスタチンカルシウムを担持したナノリポソーム溶液を予め溶解したＨＡ水溶液と混合し、カップリング剤のＥＤＣとＮＨＳＳを加えた。温度を２５℃以上に保ち、２時間以上反応させた。インキュベーション後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、結合しなかったＨＡを透析により分離し、最終生成物中のＨＡ濃度が１０～２００μｇ／ｍＬの薬物担持標的化リポソームＨＡ＠ＬＰ／ＲＣを得た。
【0095】
実施例６ アトルバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、治療薬を担持したリポソームＨＡ－ＬＰ／ＡＣを、エタノール注入能動的封入法と挿入法により調製した。
この実施例では、治療薬を担持したリポソームＨＡ－ＬＰ／ＡＣを、エタノール注入能動的封入法と挿入法により調製した。
【0096】
ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質材料を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。最終粒子径を１３０ｎｍに調節するため、押出機を用いてそれぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液１ｍＬとアトルバスタチンカルシウム（２．５ｍｇ）の２ｍＬを十分に混合した後、６０℃で１０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＡＣを得た。
【0097】
調製したアトルバスタチンカルシウムを担持したナノリポソーム溶液を、予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液と混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。インキュベーション後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、最終生成物中のＨＰＤ濃度が１０～２００μｇ／ｍＬの薬剤担持標的化リポソームを得た。
【0098】
図６は、本実施例でアトルバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＡＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0099】
実施例７ アスピリンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＡｓｐＣは、エタノール注入能動的封入法と後挿入法（post-insertion method）により調製した。アスピリン水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）をＮａＯＨでｐＨ調整して溶解した。ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとアスピリン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、４０℃で１０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＡｓｐＣを得た。
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＡｓｐＣは、エタノール注入能動的封入法と後挿入法（post-insertion method）により調製した。アスピリン水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）をＮａＯＨでｐＨ調整して溶解した。ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとアスピリン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、４０℃で１０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＡｓｐＣを得た。
【0100】
調製したアスピリン担持ナノリポソーム溶液を、予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液と混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。培養後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、最終生成物中のＨＰＤ濃度が１０～２００μｇ／ｍＬである薬剤担持標的化リポソームを得た。
【0101】
図７は、本実施例でアスピリンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＡＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0102】
実施例８ ピタバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＰＣはエタノール注入能動的封入法と後挿入法により調製した。
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＰＣはエタノール注入能動的封入法と後挿入法により調製した。
【0103】
ピタバスタチン水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとピタバスタチン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で１０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＰＣを得た。
【0104】
調製したピタバスタチン担持ナノリポソーム溶液を、予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液と混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。培養後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、最終生成物中のＨＰＤ濃度が１０－２００μｇ／ｍＬの薬剤担持標的化リポソーム（ＨＡ－ＬＰ／ＰＣ）を得た。
【0105】
図８は、この実施例でピタバスタチンを能動的に封入した標的ＨＡ－ＬＰ／ＰＣリポソームの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0106】
実施例９ ロバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＬＣは、エタノール注入能動的封入法と後挿入法により調製した。ロバスタチン水溶液（Ｌｏｖａ、１ｍｇ／ｍＬ）をＮａＯＨでｐＨを調整して溶解した。ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成した。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとロバスタチン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、６５℃で１０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＬＣを得た。
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＬＣは、エタノール注入能動的封入法と後挿入法により調製した。ロバスタチン水溶液（Ｌｏｖａ、１ｍｇ／ｍＬ）をＮａＯＨでｐＨを調整して溶解した。ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成した。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとロバスタチン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、６５℃で１０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＬＣを得た。
【0107】
調製したロバスタチン担持ナノリポソーム溶液を、予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液と混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。培養後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、最終生成物中のＨＰＤ濃度が１０－２００μｇ／ｍＬの薬剤担持標的化リポソーム（ＨＡ－ＬＰ／ＬＣ）を得た。
【0108】
図９は、この実施例でロバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＬＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0109】
実施例１０ シンバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＳＣは、エタノール注入、能動的封入、後挿入法により調製した。シンバスタチン水溶液（Ｓｉｍｖ、１ｍｇ／ｍＬ）は、ＮａＯＨでｐＨを調整し、１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ＤＳＰＣ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成した。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとシンバスタチン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＳＣを得た。
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＳＣは、エタノール注入、能動的封入、後挿入法により調製した。シンバスタチン水溶液（Ｓｉｍｖ、１ｍｇ／ｍＬ）は、ＮａＯＨでｐＨを調整し、１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ＤＳＰＣ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成した。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとシンバスタチン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＳＣを得た。
【0110】
調製したシンバスタチン担持ナノリポソーム溶液と予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液を混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。培養後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、最終生成物中のＨＰＤ濃度が１０－２００μｇ／ｍＬの薬剤担持標的化リポソーム（ＨＡ－ＬＰ／ＳＣ）を得た。
【0111】
図１０は、この実施例でシンバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＳＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0112】
実施例１１ プラバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＰＣをエタノール注入－能動的封入法で調製した。プラバスタチン水溶液（プラバス、１ｍｇ／ｍＬ）、ＤＳＰＣ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとプラバスタチン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、４０℃で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＰＣを得た。
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＰＣをエタノール注入－能動的封入法で調製した。プラバスタチン水溶液（プラバス、１ｍｇ／ｍＬ）、ＤＳＰＣ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとプラバスタチン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、４０℃で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＰＣを得た。
【0113】
調製したプラバスタチン担持ナノリポソーム溶液を、予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液と混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。培養後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、最終生成物中のＨＰＤ濃度が１０－２００μｇ／ｍＬの薬剤担持標的化リポソーム（ＨＡ－ＬＰ／ＰＣ）を得た。
【0114】
図１１は、本実施例においてプラバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＰＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0115】
実施例１２ ベザフィブラートを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＢＣは、エタノール注入－能動的封入－後挿入法により調製した。ＮａＯＨでｐＨを調整し、１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えてベザフィブラート水溶液（Ｂｅｚａ、１ｍｇ／ｍＬ）を溶解した。ＤＳＰＣ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとベザフィブラート水溶液１ｍＬを十分に混合した後、４０℃で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＢＣ１３０を得た。
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＢＣは、エタノール注入－能動的封入－後挿入法により調製した。ＮａＯＨでｐＨを調整し、１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えてベザフィブラート水溶液（Ｂｅｚａ、１ｍｇ／ｍＬ）を溶解した。ＤＳＰＣ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとベザフィブラート水溶液１ｍＬを十分に混合した後、４０℃で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＢＣ１３０を得た。
【0116】
調製したベザフィブラート担持ナノリポソーム溶液を、予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液と混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。培養後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、最終生成物中のＨＰＤ濃度が１０－２００μｇ／ｍＬの薬剤担持標的化リポソーム（ＨＡ－ＬＰ／ＢＣ）を得た。
【0117】
図１２は、この実施例でベザフィブラートを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＢＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0118】
実施例１３ シプロフィブラートを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＣＣはエタノール注入、能動的封入、後挿入法により調製された。ＮａＯＨでｐＨを６．０に調整し、シプロフィブラート水溶液（シプロ、１．５ｍｇ／ｍＬ）を溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成した。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとシプロフィブラート水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＣＣを得た。
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＣＣはエタノール注入、能動的封入、後挿入法により調製された。ＮａＯＨでｐＨを６．０に調整し、シプロフィブラート水溶液（シプロ、１．５ｍｇ／ｍＬ）を溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成した。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとシプロフィブラート水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＣＣを得た。
【0119】
調製したシプロフィブラート・ナノリポソーム溶液を、予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液と混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。培養後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、最終生成物中のＨＰＤ濃度が１０－２００μｇ／ｍＬの薬剤担持標的化リポソーム（ＨＡ－ＬＰ／ＣＣ）を得た。
【0120】
図１３は、この実施例でシプロフィブラートを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＣＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0121】
実施例１４ アセメタシンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＡｍＣは、エタノール注入、能動的封入、後挿入法により調製した。アセメタシン水溶液（アセメット、１ｍｇ／ｍＬ）に１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとアセメタシン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＡｍＣを得た。
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＡｍＣは、エタノール注入、能動的封入、後挿入法により調製した。アセメタシン水溶液（アセメット、１ｍｇ／ｍＬ）に１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとアセメタシン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＡｍＣを得た。
【0122】
調製したアセメタシンナノリポソーム溶液を、予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液と混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。培養後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、最終生成物中のＨＰＤ濃度が１０－２００μｇ／ｍＬの薬剤担持標的化リポソーム（ＨＡ－ＬＰ／ＡｍＣ）を得た。
図１４は、この実施例でアセメタシンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＡｍＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
図１４は、この実施例でアセメタシンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＡｍＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0123】
実施例１５ オザグレルを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＬＰ／ＯＣは、エタノール注入法、能動的封入法、後挿入法で調製した。オザグレル水溶液（オザグレル、２ｍｇ／ｍＬ）に１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとオザグレル水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＯＣを得た。
この実施例では、ＬＰ／ＯＣは、エタノール注入法、能動的封入法、後挿入法で調製した。オザグレル水溶液（オザグレル、２ｍｇ／ｍＬ）に１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとオザグレル水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＯＣを得た。
【0124】
調製したオザグレルナノリポソーム溶液を、予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液と混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。培養後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、最終生成物中のＨＰＤ濃度が１０－２００μｇ／ｍＬの薬剤担持標的化リポソーム（ＨＡ－ＬＰ／ＯＣ）を得た。
【0125】
図１５は、この実施例でオザグレルを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＯＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0126】
実施例１６ チロフィバンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＬＰ／ＴＣをエタノール注入法、能動的封入法、後挿入法で調製した。チロフィバン水溶液（チロフィバン、２ｍｇ／ｍＬ）に１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとチロフィバン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＴＣ１３０を得た。
この実施例では、ＬＰ／ＴＣをエタノール注入法、能動的封入法、後挿入法で調製した。チロフィバン水溶液（チロフィバン、２ｍｇ／ｍＬ）に１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとチロフィバン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＴＣ１３０を得た。
【0127】
調製したチロフィバンナノリポソーム溶液と予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液を混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。培養後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、最終生成物中のＨＰＤ濃度が１０－２００μｇ／ｍＬの薬剤担持標的化リポソーム（ＨＡ－ＬＰ／ＴＣ）を得た。
【0128】
図１６は、この実施例でチロフィバンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／ＴＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0129】
実施例１７ ロスバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリア送達システム（ＨＡ＠ＬＰ／Ｒｄ）の調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン、ＤＰＮ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：０．５：１：１）を秤量し、上記脂質原料をクロロホルム中に溶解させた。有機溶媒を低速回転蒸発法（５５℃の水槽、９０ｒ／分、３０分）で除去し、容器壁面に脂質膜を形成させた。グルコン酸銅水溶液（２００ｍＭ）を加え、４５℃の恒温水槽で脂質膜を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、ロスバスタチンカルシウム（１３３ｍｇ）２５ｍＬと十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／Ｒｄを得た。
水素添加大豆ホスファチジルコリン、ＤＰＮ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：０．５：１：１）を秤量し、上記脂質原料をクロロホルム中に溶解させた。有機溶媒を低速回転蒸発法（５５℃の水槽、９０ｒ／分、３０分）で除去し、容器壁面に脂質膜を形成させた。グルコン酸銅水溶液（２００ｍＭ）を加え、４５℃の恒温水槽で脂質膜を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、ロスバスタチンカルシウム（１３３ｍｇ）２５ｍＬと十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／Ｒｄを得た。
【0130】
カップリング剤ＥＤＣとＮＨＳＳをＨＡ水溶液に加え、得られた溶液をＬＰ／Ｒｄ脂質溶液と混合してカップリングを実現した。反応温度は２５℃以上に保ち、２時間以上反応させた。完了後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、透析により結合しなかったＨＡを分離し、最終生成物中のＨＡ濃度が１０～２００μｇ／ｍＬの薬物担持標的化リポソームＨＡ＠ＬＰ／Ｒｄを得た。
【0131】
図１７は、この実施例でロスバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ＠ＬＰ／Ｒｄの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0132】
実施例１８ アトルバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリア送達システム（ＨＡ＠ＬＰ／Ａ
ｄ
）の調製
ジパルミトイルホスファチジルコリン、ＤＰＮ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：０．５：１：１）を秤量し、上記脂質原料をクロロホルム中に溶解させた。有機溶媒を低速回転蒸発（５５℃の水槽、９０ｒ／分、３０分）で除去し、容器の壁に脂質膜を形成させた。酢酸カルシウム水溶液（３００ｍＭ）を加え、４５℃の恒温水槽で脂質膜を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、２５ｍＬのアトルバスタチンカルシウムと十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、粒子径１３０ｎｍの薬物能動的封入リポソームＬＰ／Ａｄを得た。
ジパルミトイルホスファチジルコリン、ＤＰＮ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：０．５：１：１）を秤量し、上記脂質原料をクロロホルム中に溶解させた。有機溶媒を低速回転蒸発（５５℃の水槽、９０ｒ／分、３０分）で除去し、容器の壁に脂質膜を形成させた。酢酸カルシウム水溶液（３００ｍＭ）を加え、４５℃の恒温水槽で脂質膜を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、２５ｍＬのアトルバスタチンカルシウムと十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、粒子径１３０ｎｍの薬物能動的封入リポソームＬＰ／Ａｄを得た。
【0133】
カップリング剤ＥＤＣとＮＨＳＳをＨＡ水溶液に加え、得られた溶液をＬＰ／Ａｄ脂質溶液と混合してカップリングを実現した。反応温度は２５℃以上に保ち、２時間以上反応させた。完了後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、透析により結合しなかったＨＡを分離し、最終生成物中のＨＡ濃度が１０～２００μｇ／ｍＬである薬物担持標的化リポソームＨＡ＠ＬＰ／Ａｄを得た。
【0134】
図１８は、本実施例でアトルバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ＠ＬＰ／Ａｄの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0135】
実施例１９ シプロフィブラートを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリア送達システム（ＨＡ＠ＬＰ／Ｃｄ）の調製
スフィンゴミエリン、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、上記脂質材料をクロロホルム中に溶解させた。有機溶媒を低速回転蒸発法（５５℃の水槽、９０ｒ／分、３０分）で除去し、容器壁面に脂質膜を形成させた。炭酸水素カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、４５℃の恒温水槽で脂質膜を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった炭酸水素カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、２５ｍＬのシプロフィブラートと十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、粒子径１３０ｎｍの薬物能動的封入リポソームＬＰ／Ｃｄを得た。
スフィンゴミエリン、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（質量比３：１：１）を秤量し、上記脂質材料をクロロホルム中に溶解させた。有機溶媒を低速回転蒸発法（５５℃の水槽、９０ｒ／分、３０分）で除去し、容器壁面に脂質膜を形成させた。炭酸水素カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、４５℃の恒温水槽で脂質膜を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった炭酸水素カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、２５ｍＬのシプロフィブラートと十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、粒子径１３０ｎｍの薬物能動的封入リポソームＬＰ／Ｃｄを得た。
【0136】
実施例１で調製したＨＰＤ水溶液を混合し、２５℃以上に保ちながら３０分以上インキュベートした。インキュベーション後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて透析により未挿入ＨＰＤを分離し、最終生成物中のＨＰＤ濃度が２００μｇ／ｍＬと高いリガンド標的化リポソームを得ることにより、最終生成物中のＨＡ濃度が１０～２００μｇ／ｍＬの薬物負荷標的化リポソームＨＡ＠ＬＰ／Ｃｄを得た。
【0137】
図１９は、本実施例でシプロフィブラートを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ＠ＬＰ／Ｃｄの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0138】
実施例２０ ベザフィブラートを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリア送達システム（ＨＡ－ＬＰ／Ｂ
ｄ
）の調製
本実施例では、ベザフィブラート担持ナノリポソームをエタノール注入・能動的封入法により調製した。
本実施例では、ベザフィブラート担持ナノリポソームをエタノール注入・能動的封入法により調製した。
【0139】
ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（質量比３：１：１）を秤量し、上記の脂質材料をエタノール中に溶解させた。クエン酸マグネシウム水溶液（２００ｍＭ）を加え、４０～６０℃に保ちつつ攪拌しながらエタノール相をクエン酸マグネシウム水溶液に注入し、脂質原料溶液を十分に水和させて粗リポソーム懸濁液を形成させた（酢酸カルシウム水相とエタノール相溶液の体積比は２以上であった）。透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、封入されなかった酢酸カルシウムを透析により分離した。内部液を回収し、ロスバスタチンカルシウム溶液またはロスバスタチンカルシウムとショ糖の混合溶液（全脂質原料に対するロスバスタチンカルシウムの質量比は０．２５以下であった）と十分に混合した後、４～６６℃で１５分以上インキュベートし、ロスバスタチンカルシウムを能動的に封入したナノリポソームを得た。調製したナノリポソームは、原薬の封入率が２０％以上であり、最終製剤の原薬濃度は２０ｍｇ／ｍＬ以下である。
【0140】
実施例１で調製したＨＰＤ水溶液を混合し、２５℃以上に保ちながら３０分以上インキュベートした。インキュベーション後、透析バッグまたは限外ろ過膜パックを用いて透析により未挿入ＨＰＤを分離し、最終生成物中のＨＰＤ濃度が２００μｇ／ｍＬと高いリガンド標的化リポソームを得ることにより、最終生成物中のＨＡ濃度が１０～２００μｇ／ｍＬの薬剤担持標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／Ｂｄを得た。
【0141】
図２０は、本実施例でベザフィブラートを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／Ｂｄの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【0142】
アッセイ実施例１ 本開示のナノキャリア送達システムの安定かつ調節可能な特性
本開示に開示される治療剤を担持した調製したナノキャリア送達システムは、本開示の送達系が安定で調節可能な特性を有し、それによりアテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の治療に適していることを示す実施例として記載する。
本開示に開示される治療剤を担持した調製したナノキャリア送達システムは、本開示の送達系が安定で調節可能な特性を有し、それによりアテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の治療に適していることを示す実施例として記載する。
【0143】
１．薬物濃度の測定方法
ローディング薬剤であるロスバスタチン、チロフィバン、オザグレル、アセメタシン、シプロフィブラート、ベザフィブラート、プラバスタチン、アスピリン、ピタバスタチンカルシウム、ロバスタチン、シンバスタチンは、強い紫外線吸収特性を有するため、ＨＰＬＣ－ＵＶ法を用いることにより、薬物溶液の濃度（Ｘ）とＨＰＬＣクロマトグラフィーのピーク面積（Ｙ）との標準定量式を確立することができる。
ローディング薬剤であるロスバスタチン、チロフィバン、オザグレル、アセメタシン、シプロフィブラート、ベザフィブラート、プラバスタチン、アスピリン、ピタバスタチンカルシウム、ロバスタチン、シンバスタチンは、強い紫外線吸収特性を有するため、ＨＰＬＣ－ＵＶ法を用いることにより、薬物溶液の濃度（Ｘ）とＨＰＬＣクロマトグラフィーのピーク面積（Ｙ）との標準定量式を確立することができる。
【0144】
ＨＰＬＣ分析法では、移動相Ａ（１．０％トリフルオロ酢酸：アセトニトリル：水（１：２９：７０））と移動相Ｂ（１．０％トリフルオロ酢酸：水：アセトニトリル（１：２４：７５））を用いた。カラム温度は４０℃、モデルはＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３（１５０＊３．０ｍｍ）であった。システムを平衡化し、ベースラインが安定した後、試料を注入した。
【0145】
２．水和された粒子径の測定
本開示の送達システムの粒子径は、Ｍａｌｖｅｒｎインテリジェントレーザー粒度分布測定装置で測定した。結果を表２に示す。
本開示の送達システムの粒子径は、Ｍａｌｖｅｒｎインテリジェントレーザー粒度分布測定装置で測定した。結果を表２に示す。
【0146】
３．製剤中のＨＰＤの測定
キットは競合的酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた。試料、標準物質、ＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）、および抗ＨＡＢＰ抗体を、ヒアルロン酸（ＨＡ）の誘導体で予めコーティングしたマイクロウェルに順に加え、インキュベーションと十分な洗浄の後、結合しなかった成分を除去した。その後、ＨＲＰ標識抗マウス免疫グロブリンＧ（酵素標識二次抗体）を加えた。インキュベーションと十分な洗浄後、結合しなかった成分を除去し、抗原－ＨＡ結合タンパク質－ＨＡＢＰ抗体－酵素標識抗体の固相免疫複合体がマイクロウェルプレートの固相表面に形成された。基質ＡとＢを加え、ＨＲＰで触媒して青色の生成物を生じ、最終的に停止液（２Ｍ硫酸）の作用で黄色に変換し、色の濃さは試料中のヒアルロン酸（ＨＡ）と負の相関を示した。吸光度（ＯＤ値）をマイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの波長で測定し、標準曲線をあてはめ、試料中のヒアルロン酸（ＨＡ）濃度を算出しうる。
キットは競合的酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた。試料、標準物質、ＨＡ結合タンパク質（ＨＡＢＰ）、および抗ＨＡＢＰ抗体を、ヒアルロン酸（ＨＡ）の誘導体で予めコーティングしたマイクロウェルに順に加え、インキュベーションと十分な洗浄の後、結合しなかった成分を除去した。その後、ＨＲＰ標識抗マウス免疫グロブリンＧ（酵素標識二次抗体）を加えた。インキュベーションと十分な洗浄後、結合しなかった成分を除去し、抗原－ＨＡ結合タンパク質－ＨＡＢＰ抗体－酵素標識抗体の固相免疫複合体がマイクロウェルプレートの固相表面に形成された。基質ＡとＢを加え、ＨＲＰで触媒して青色の生成物を生じ、最終的に停止液（２Ｍ硫酸）の作用で黄色に変換し、色の濃さは試料中のヒアルロン酸（ＨＡ）と負の相関を示した。吸光度（ＯＤ値）をマイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの波長で測定し、標準曲線をあてはめ、試料中のヒアルロン酸（ＨＡ）濃度を算出しうる。
【0147】
検出にはヒアルロン酸（ＨＡ）定量検出ＥＬＩＳＡキットを用いた。適量のＨＰＤを正確に秤量し、水を加えて約２．５ｍｇ／ｍＬの参照ストック溶液を調製した。コントロール原液を同等量の水で希釈し、直線状のワーキング溶液（０～１．２５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。ＨＰＤを含有しない製剤溶液を適量採取し、各線状ワーキング溶液とそれぞれ混合し、標準線状溶液とした。適量の製剤溶液を採取し、必要に応じてＨＰＤを含有しない製剤溶液で希釈し、適量の水を加えて試験製剤溶液中のリポソームの割合を標準線溶液中の割合と同一にして試験試料溶液とした。標準直線溶液と試験溶液をそれぞれ１０％トリトン溶液を加えて溶解し、十分に混合した後、ＥＬＩＳＡキットによる検出を行った。操作はＥＬＩＳＡキットの操作手順に従って行った。マイクロプレートリーダーにて波長４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ値）を測定し、４つのパラメータで標準曲線をあてはめ、試験試料中のＨＰＤ濃度を算出した。
【0148】
参照標準曲線図を図２９に示すが、適合式はｙ＝（Ａ－Ｄ）／［１＋（ｘ／Ｃ）＾Ｂ］＋Ｄであって、式中、Ａ＝２．７６３；Ｂ＝１．７７７；Ｃ＝３．６８１；Ｄ＝０．１４６；ｒ２＝０．９９９である。
【0149】
４．封入率の決定
一定量のナノキャリアを用いた。ＨＰＬＣ法で遊離薬物量と総薬物量を測定し、下記式１に従って封入率を算出した。結果を表２に示す。
封入率（％）＝（１－Ｍ遊離薬物量／Ｍ総薬物量）＊１００％ 式１
表１ 本開示のナノキャリア送達システムの方法の概略、平均粒子径および封入率の結果
留意：
上記のデータは全て、並行して３回測定した結果の「平均＋標準偏差」という形で表される。
一定量のナノキャリアを用いた。ＨＰＬＣ法で遊離薬物量と総薬物量を測定し、下記式１に従って封入率を算出した。結果を表２に示す。
封入率（％）＝（１－Ｍ遊離薬物量／Ｍ総薬物量）＊１００％ 式１
表１ 本開示のナノキャリア送達システムの方法の概略、平均粒子径および封入率の結果
【表1】
上記のデータは全て、並行して３回測定した結果の「平均＋標準偏差」という形で表される。
【0150】
５．長期安定性の調査
本開示のナノキャリア送達システムを４℃で保存し、異なる時点でサンプリングした。その水和された粒子径の変化は、レーザー粒子分析器によって検出した。ＨＰＬＣ法を用いて、含有量の変化と封入率を検出した。結果を図２１に示す。
本開示のナノキャリア送達システムを４℃で保存し、異なる時点でサンプリングした。その水和された粒子径の変化は、レーザー粒子分析器によって検出した。ＨＰＬＣ法を用いて、含有量の変化と封入率を検出した。結果を図２１に示す。
【0151】
アッセイ実施例２ 本開示の標的化リポソームナノキャリア送達システムの標的化能力の検証
このアッセイ実施例の目的は、ＨＡ＠ＬＰ／ＲＣキャリア送達システムなどの本開示の標的化リポソームナノ薬物キャリア送達システムのアテローム性動脈硬化症を標的とする能力を検証することである。具体的には、アテローム性動脈硬化プラークにはＣＤ４４受容体を高発現するマクロファージが多く存在することから、本研究ではＴＨＰ１マクロファージを選択し、リポ多糖で活性化し、次いで蛍光標識した標的ＨＡ＠ＬＰ／ＲＣまたは非標的化ＬＰ／ＲＣとともにインキュベートし、生存細胞顕微鏡観察と蛍光値測定を行った。ＣＤ４４受容体を高発現している活性化マクロファージに対するＨＡ標的化リポソームの標的化能力は、標的ヘッドＨＡ含有リポソーム群と非標的化リポソーム群の結果を比較することで評価した。
このアッセイ実施例の目的は、ＨＡ＠ＬＰ／ＲＣキャリア送達システムなどの本開示の標的化リポソームナノ薬物キャリア送達システムのアテローム性動脈硬化症を標的とする能力を検証することである。具体的には、アテローム性動脈硬化プラークにはＣＤ４４受容体を高発現するマクロファージが多く存在することから、本研究ではＴＨＰ１マクロファージを選択し、リポ多糖で活性化し、次いで蛍光標識した標的ＨＡ＠ＬＰ／ＲＣまたは非標的化ＬＰ／ＲＣとともにインキュベートし、生存細胞顕微鏡観察と蛍光値測定を行った。ＣＤ４４受容体を高発現している活性化マクロファージに対するＨＡ標的化リポソームの標的化能力は、標的ヘッドＨＡ含有リポソーム群と非標的化リポソーム群の結果を比較することで評価した。
【0152】
１．アッセイ試薬および機器
表２ アッセイに使用した試薬のリスト
表２ アッセイに使用した試薬のリスト
【表2】
【0153】
表３ 測定に使用した機器のリスト
【表3】
【0154】
２．アッセイ手順
２．１ 試験試料の蛍光標識
１．０ｍｇのＣｙ５．５色素を正確に量り、１ｍｌの無水エタノール中に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌのＣｙ５．５溶液を調製した。標的ＨＡ＠ＬＰ／ＲＣまたは非標的化ＬＰ／ＲＣリポソームをそれぞれ５ｍＬ入れ、１ｍｇ／ｍｌのＣｙ５．５溶液を０．１ｍＬ加えた。該混合物を１５０ｒｐｍで１２時間撹拌し、蛍光標識を行った。その後、限外ろ過チューブでろ過を行い、未反応の蛍光分子を除去した。濾過後に得られた蛍光標識リポソームについて、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて蛍光検出を行った。検出された蛍光標識リポソームを、その後のエンドサイトーシスアッセイに用いた。
２．１ 試験試料の蛍光標識
１．０ｍｇのＣｙ５．５色素を正確に量り、１ｍｌの無水エタノール中に溶解させ、１ｍｇ／ｍｌのＣｙ５．５溶液を調製した。標的ＨＡ＠ＬＰ／ＲＣまたは非標的化ＬＰ／ＲＣリポソームをそれぞれ５ｍＬ入れ、１ｍｇ／ｍｌのＣｙ５．５溶液を０．１ｍＬ加えた。該混合物を１５０ｒｐｍで１２時間撹拌し、蛍光標識を行った。その後、限外ろ過チューブでろ過を行い、未反応の蛍光分子を除去した。濾過後に得られた蛍光標識リポソームについて、蛍光マイクロプレートリーダーを用いて蛍光検出を行った。検出された蛍光標識リポソームを、その後のエンドサイトーシスアッセイに用いた。
【0155】
２．２ エンドサイトーシス・アッセイ
本プラットフォームの細胞蘇生の操作手順に従い、操作ステップを実行した。培地としては、本プラットフォームの従来のＴＨＰ１細胞培養培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ）を使用した。蘇生後、細胞を５×１０５／ｍｌの密度で再懸濁し、Ｔ７５培養フラスコに播種した。懸濁状態で増殖したＴＨＰ１細胞１０ｍｌを１５ｍｌの遠心チューブに移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、１ｍｌの培養液に再懸濁し、計数して１×１０５／２００μｌ濃度の細胞懸濁液を調製した。ＰＭＡを１×１０５／２００μｌの細胞懸濁液に最終濃度１００ｎｇ／ｍｌになるように添加した。均一に混合し、細胞懸濁液を９６ウェルプレートに播種し（２００μｌ／ウェル）、７２時間連続で刺激した。７２時間の刺激後、元の培地を捨て、リポ多糖（ＬＰＳ）を含む新しい培地（ＬＰＳ溶液を新しい培地で１，０００倍に希釈し、最終濃度を２．５μｇ／ｍＬとした）を加えた。ＬＰＳ処理を２時間行った。
本プラットフォームの細胞蘇生の操作手順に従い、操作ステップを実行した。培地としては、本プラットフォームの従来のＴＨＰ１細胞培養培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ ＦＢＳ）を使用した。蘇生後、細胞を５×１０５／ｍｌの密度で再懸濁し、Ｔ７５培養フラスコに播種した。懸濁状態で増殖したＴＨＰ１細胞１０ｍｌを１５ｍｌの遠心チューブに移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心し、１ｍｌの培養液に再懸濁し、計数して１×１０５／２００μｌ濃度の細胞懸濁液を調製した。ＰＭＡを１×１０５／２００μｌの細胞懸濁液に最終濃度１００ｎｇ／ｍｌになるように添加した。均一に混合し、細胞懸濁液を９６ウェルプレートに播種し（２００μｌ／ウェル）、７２時間連続で刺激した。７２時間の刺激後、元の培地を捨て、リポ多糖（ＬＰＳ）を含む新しい培地（ＬＰＳ溶液を新しい培地で１，０００倍に希釈し、最終濃度を２．５μｇ／ｍＬとした）を加えた。ＬＰＳ処理を２時間行った。
【0156】
アッセイには２つの群を設定し、添加を別々に行った。蛍光標識リポソーム１ｍｌを採取し、新しい培養培地で１０倍に希釈した。この時、ロスバスタチンの濃度は０．２ｍｇ／ｍｌであった。ＬＰＳを含む培養液を９６ウェルプレートから捨て、希釈した蛍光標識試験試料を加え、この操作を各群において３回繰り返し、３７℃で３０分間培養を続けた。
【0157】
プレートをＰＢＳで１回洗浄し、２μｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２母液を１０ｍｌの新しい培地で希釈し、希釈Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液を調製した。希釈したＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液を細胞とともに１０分間インキュベートし、核を染色した。写真はＬｉｏｎｈｅａｒｔ ＦＸインテリジェン生存細胞イメージング解析システムで撮影した。撮影後、ウェルプレートから染色液を捨て、１００μｌのＲＩＰＡ細胞溶解液を加え、ウェルプレート内の蛍光強度を蛍光プレートリーダーで測定した。得られたアッセイデータから、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェアを用いて平均値と標準偏差を算出し、ｔ検定の統計解析を行い、ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。
【0158】
３．アッセイ結果
エンドサイトーシスアッセイでは、ＬＰＳで刺激したＴＨＰ１細胞のエンドサイトーシス効率をＨＡ＠ＬＰ／ＲＣとＬＰ／ＲＣで比較した。アッセイ結果を図２５に示す。非標的化ＬＰ／ＲＣリポソーム群と比較して、ＨＡ＠ＬＰ／ＲＣ群の蛍光値は有意に増加し、非標的化リポソーム群の３倍であった。蛍光顕微鏡写真観察でも（図２６参照）、ＨＡ＠ＬＰ／ＲＣ群の細胞内赤色蛍光は、非標的化ＬＰ／ＲＣ群のものと比較して有意に増加した。このことは、ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ１細胞のＨＡ＠ＬＰ／ＲＣのエンドサイトーシス効率が、非標的化リポソームのものよりも有意に高いことを示す。
エンドサイトーシスアッセイでは、ＬＰＳで刺激したＴＨＰ１細胞のエンドサイトーシス効率をＨＡ＠ＬＰ／ＲＣとＬＰ／ＲＣで比較した。アッセイ結果を図２５に示す。非標的化ＬＰ／ＲＣリポソーム群と比較して、ＨＡ＠ＬＰ／ＲＣ群の蛍光値は有意に増加し、非標的化リポソーム群の３倍であった。蛍光顕微鏡写真観察でも（図２６参照）、ＨＡ＠ＬＰ／ＲＣ群の細胞内赤色蛍光は、非標的化ＬＰ／ＲＣ群のものと比較して有意に増加した。このことは、ＬＰＳで刺激されたＴＨＰ１細胞のＨＡ＠ＬＰ／ＲＣのエンドサイトーシス効率が、非標的化リポソームのものよりも有意に高いことを示す。
【0159】
その結果、標的化リポソーム群では非標的化リポソーム群と比較して、赤色蛍光を示す細胞が有意に多かった。さらに、非標的化リポソーム群と比較して、標的化群の蛍光値も有意に増加した。標的ヘッドとしてＨＡを含むリポソームは、ＣＤ４４受容体を高度に発現している活性化マクロファージに特異的に取り込まれると結論できる。
【0160】
アッセイ実施例３ 本開示の標的化リポソームナノキャリア送達システムのインビボ分布および代謝に関する実験
このアッセイ実施例の目的は、動物における本開示の標的化リポソームナノ薬物送達システムの分布と代謝を予備的に明らかにすることである。このアッセイでは、アッセイ実施例２のエンドサイトーシスアッセイで用いたＨＡ＠ＬＰ／ＲＣとＬＰ／ＲＣリポソームを動物における分布と代謝の予備実験でも用いた。
このアッセイ実施例の目的は、動物における本開示の標的化リポソームナノ薬物送達システムの分布と代謝を予備的に明らかにすることである。このアッセイでは、アッセイ実施例２のエンドサイトーシスアッセイで用いたＨＡ＠ＬＰ／ＲＣとＬＰ／ＲＣリポソームを動物における分布と代謝の予備実験でも用いた。
【0161】
具体的には、６週齢のＡｐｏＥ－／－マウスに高脂肪食を２８週間摂取させ、大動脈プラークを形成させてＡＳモデル動物を作製した。標的化ナノスタチン製剤（ＨＡ＠ＬＰ／ＲＣ、用量５ｍｇ／ｋｇ）と非標的化ナノ製剤を静脈内投与し、前記モデル動物における組織分布と代謝を調べた。図２７に示すように、ナノ製剤は生体内で主に肝臓に濃縮され、血液脳関門を通過することはできず、標的薬と非標的薬の生体内分布と代謝に有意差は認められなかった。
【0162】
さらに、アッセイ動物を無作為に以下の群に分け、それぞれ６匹ずつ入れた：
ロスバスタチン経口投与群：ロスバスタチン０．５ｍｇ／ｋｇ体重を経口投与した。
ロスバスタチン静脈内注射群：ロスバスタチン０．５ｍｇ／ｋｇ体重を静脈内投与した；
治療群に１日おきに１回、合計１１回投与した。
ロスバスタチン経口投与群：ロスバスタチン０．５ｍｇ／ｋｇ体重を経口投与した。
ロスバスタチン静脈内注射群：ロスバスタチン０．５ｍｇ／ｋｇ体重を静脈内投与した；
治療群に１日おきに１回、合計１１回投与した。
【0163】
【0164】
アッセイ実施例４ 動脈硬化に対する本開示の標的化リポソームナノキャリア送達システムの効果のインビボアッセイ
この試験例の目的は、ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０キャリア送達システムなどの本開示の標的化リポソームナノ薬物キャリア送達システムの動脈プラークに対するインビボ治療効果を検証することである。
この試験例の目的は、ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０キャリア送達システムなどの本開示の標的化リポソームナノ薬物キャリア送達システムの動脈プラークに対するインビボ治療効果を検証することである。
【0165】
１．動物モデルの樹立とアッセイ動物の群分け
（１）遊離ロスバスタチンの生理食塩液を調製し、上記実施例２に記載の方法で治療薬を担持したナノ送達システムを調製した。
（１）遊離ロスバスタチンの生理食塩液を調製し、上記実施例２に記載の方法で治療薬を担持したナノ送達システムを調製した。
【0166】
（２）ＡｐｏＥ－／－動脈硬化モデルマウスの樹立：
ＳＰＦグレードのＡｐｏＥ－／－マウス（４２匹、５～６週齢、体重２０±１ｇ）をアッセイ動物とした。マウスに適応する高脂肪食（脂肪１０％（ｗ／ｗ）、コレステロール２％（ｗ／ｗ）、コール酸ナトリウム０．５％（ｗ／ｗ）、残りは通常のマウス用飼料）を４週間与えた後、１％ペントバルビタールナトリウム（通常の生理食塩水１００ｍｌにペントバルビタールナトリウム１ｍｇを加えて調製）を４０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射して麻酔した。その後、マウスを仰臥位で手術用プレートに固定し、７５％（ｖ／ｖ）アルコールで頸部を消毒した。頸部皮膚を縦に切断し、前頸骨腺を大雑把に分離すると、気管の左側に拍動する左総頸動脈が見える。総頸動脈を慎重に分岐部まで分離した。長さ２．５ｍｍ、内径０．３ｍｍのシリコン製カニューレを左総頸動脈の外周に留置した。カニューレの近位部と遠位部は細く、フィラメントで固定した。局所を締め付けることにより、近位端では剪断力の増大とともに血流の乱れが生じ、血管内膜の損傷が生じた。頸動脈の位置を変え、前頸部皮膚を断続的に縫合した。すべての手術は１０倍の実体顕微鏡下で行われた。手術から目覚めたマウスをケージに戻し、周囲温度を２０～２５℃に保ち、照明を１２時間／１２時間の明暗サイクルに保った。術後４週目に、リポ多糖（ＬＰＳ）（０．２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｓｉｇｍａ、米国）を週２回１０週間にわたって腹腔内に注射し、慢性炎症を誘発した。術後８週目に、マウスを５０ｍｌのシリンジ（十分な通気孔を確保）に入れ、限定的な精神的ストレスを６時間／日、週５日、合計６週間与えた。動脈硬化モデルマウスは手術後１４週目に終了した。
ＳＰＦグレードのＡｐｏＥ－／－マウス（４２匹、５～６週齢、体重２０±１ｇ）をアッセイ動物とした。マウスに適応する高脂肪食（脂肪１０％（ｗ／ｗ）、コレステロール２％（ｗ／ｗ）、コール酸ナトリウム０．５％（ｗ／ｗ）、残りは通常のマウス用飼料）を４週間与えた後、１％ペントバルビタールナトリウム（通常の生理食塩水１００ｍｌにペントバルビタールナトリウム１ｍｇを加えて調製）を４０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射して麻酔した。その後、マウスを仰臥位で手術用プレートに固定し、７５％（ｖ／ｖ）アルコールで頸部を消毒した。頸部皮膚を縦に切断し、前頸骨腺を大雑把に分離すると、気管の左側に拍動する左総頸動脈が見える。総頸動脈を慎重に分岐部まで分離した。長さ２．５ｍｍ、内径０．３ｍｍのシリコン製カニューレを左総頸動脈の外周に留置した。カニューレの近位部と遠位部は細く、フィラメントで固定した。局所を締め付けることにより、近位端では剪断力の増大とともに血流の乱れが生じ、血管内膜の損傷が生じた。頸動脈の位置を変え、前頸部皮膚を断続的に縫合した。すべての手術は１０倍の実体顕微鏡下で行われた。手術から目覚めたマウスをケージに戻し、周囲温度を２０～２５℃に保ち、照明を１２時間／１２時間の明暗サイクルに保った。術後４週目に、リポ多糖（ＬＰＳ）（０．２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（１ｍｇ／ｋｇ）、Ｓｉｇｍａ、米国）を週２回１０週間にわたって腹腔内に注射し、慢性炎症を誘発した。術後８週目に、マウスを５０ｍｌのシリンジ（十分な通気孔を確保）に入れ、限定的な精神的ストレスを６時間／日、週５日、合計６週間与えた。動脈硬化モデルマウスは手術後１４週目に終了した。
【0167】
（３）試料動物の群分けと治療：
以下の群に各群６匹ずつ無作為に分けた：
アテローム性動脈硬化モデル対照群：この群の動物にはいかなる治療も施さない；
ロスバスタチン経口投与群：体重１ｋｇあたり０．６６ｍｇのロスバスタチンを経口投与した；
ロスバスタチン静脈内投与群：体重１ｋｇあたり０．６６ｍｇのロスバスタチンを静脈内投与した；
ナノ製剤（ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０）投与群：体重１ｋｇあたり０．６６ｍｇのロスバスタチンを静脈内投与した；
動脈硬化モデルの対照群を除き、治療群には１日おきに１回、合計４週間投与した。各群の動物について、プラークと管腔面積を検出するために毎週治療前後に頸動脈ＭＲＩスキャンを行い、スキャンした厚さに基づいてプラーク体積の進行の割合を算出した。
プラーク体積進行率＝（治療後のプラーク体積－治療前のプラーク体積）／治療前のプラーク体積。
以下の群に各群６匹ずつ無作為に分けた：
アテローム性動脈硬化モデル対照群：この群の動物にはいかなる治療も施さない；
ロスバスタチン経口投与群：体重１ｋｇあたり０．６６ｍｇのロスバスタチンを経口投与した；
ロスバスタチン静脈内投与群：体重１ｋｇあたり０．６６ｍｇのロスバスタチンを静脈内投与した；
ナノ製剤（ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０）投与群：体重１ｋｇあたり０．６６ｍｇのロスバスタチンを静脈内投与した；
動脈硬化モデルの対照群を除き、治療群には１日おきに１回、合計４週間投与した。各群の動物について、プラークと管腔面積を検出するために毎週治療前後に頸動脈ＭＲＩスキャンを行い、スキャンした厚さに基づいてプラーク体積の進行の割合を算出した。
プラーク体積進行率＝（治療後のプラーク体積－治療前のプラーク体積）／治療前のプラーク体積。
【0168】
図２２と２３は、動脈硬化に対する本開示のキャリア送達システムＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０のインビボ治療効果を示す。図２２で示されるように、遊離スタチンの経口および静脈内投与は、プラークの進行を遅らせるだけで、既存のプラークの退縮をもたらすことはできない。しかし、標的ナノ薬物担持療法は、プラークの進行を顕著に抑制しただけでなく、プラーク容積を最大３０．３％まで有意に逆転・退縮させた。図２３に示すように、スタチンの経口投与や注射と比較して、ナノキャリア送達システムは、大動脈濃縮という極めて大きな機能を示した。非標的送達システム（ＬＰ／ＲＡ１５０）と比較して、この濃縮効果は、標的ナノ製剤（ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０）の効果下でより明白になった。まとめると、マウスのアテローム性動脈硬化症に関しては、経口投与であれ静脈内投与であれ、遊離のロスバスタチンはプラークを逆転させる治療効果を示すことはできない。しかし、スタチンを本開示のナノキャリア送達システムに担持させると、動脈硬化に対する治療効果が著しく向上し、プラーク狭窄の治療効果が得られ、機能修飾を施したナノ系がより優れた効果を発揮する。
【0169】
２．異なるＨＡ／脂質材料の質量比による薬効の比較
６週齢のＡｐｏＥ－／－マウスに高脂肪食を２８週間与え、大動脈プラークを形成させ、ＡＳの動物モデルとした。血中脂質と体重に応じて、プラークモデルの対照群、非標的ナノスタチン製剤群（ＬＰ／ＲＡ１５０、５ｍｇ／ｋｇ）、標的ナノスタチン製剤－１（ＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０、用量は５ｍｇ／ｋｇである）、標的ナノスタチン製剤－２（ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０を５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射した）、標的ナノスタチン製剤－３（ＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０、用量５ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ）に無作為に分け、各群１０匹とした。治療は１日１回、合計２８日間行われ、治療期間は４週間であった。治療後、大動脈プラークの巨視的病理検査（ｅｎ－ｆａｃｅ）が行われた。ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０およびＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０製剤群は、ほぼ有意なプラークの逆転を示した。
６週齢のＡｐｏＥ－／－マウスに高脂肪食を２８週間与え、大動脈プラークを形成させ、ＡＳの動物モデルとした。血中脂質と体重に応じて、プラークモデルの対照群、非標的ナノスタチン製剤群（ＬＰ／ＲＡ１５０、５ｍｇ／ｋｇ）、標的ナノスタチン製剤－１（ＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０、用量は５ｍｇ／ｋｇである）、標的ナノスタチン製剤－２（ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０を５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射した）、標的ナノスタチン製剤－３（ＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０、用量５ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ）に無作為に分け、各群１０匹とした。治療は１日１回、合計２８日間行われ、治療期間は４週間であった。治療後、大動脈プラークの巨視的病理検査（ｅｎ－ｆａｃｅ）が行われた。ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０およびＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０製剤群は、ほぼ有意なプラークの逆転を示した。
【0170】
以上の研究から、リガンド結合能動的標的化ナノ送達システムを開発するためには、ナノキャリア表面上のリガンドの結合密度に注意を払う必要があることがわかる。特殊な生理機能を持つリガンド分子の場合、低密度でも過剰なカップリングでも良好な標的化効果は得られない。このことは、このような製品の開発においては、制御可能なカップリングプロセスを実現することが特に必要であることを示唆している。
【0171】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-07
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
能動的に封入されたリポソームナノキャリア送達システムであって、前記リポソームナノキャリア送達システムが、リポソームキャリア、ならびに前記リポソームキャリアによって能動的に封入された、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の予防および／または治療で用いられる物質を含むことを特徴とする、前記リポソームナノキャリア送達システム。
【請求項2】
前記リポソームキャリアの物質が、下記の定義：ｉ）リン脂質およびコレステロールを含み；あるいは
前記リン脂質が、下記：水素化大豆ホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルセリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、ジシンナモイルホスファチジルコリン、ジシンナモイルホスファチジルエタノールアミン、ジシンナモイルホスファチジルセリン、ジシンナモイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、ジエルコイルホスファチジルコリン、ジエルコイルホスファチジルエタノールアミン、ジエルシルホスファチジルセリン、ジエルシルホスファチジルエタノールアミン－ポリエチレングリコール、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルエタノールアミン、および卵ホスファチジルグリセロールから選択される１つまたはそれ以上であること；
ｉｉ）前記アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の予防および／または治療で用いられる物質と前記リポソームキャリアとの質量比が、１：０．１～５０、あるいは１：０．２～３０、さらにあるいは１：０．５～２０であること；
ｉｉｉ）前記アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の予防および／または治療で用いられる物質が、弱酸性物質であること；
前記アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の予防および／または治療で用いられる物質が、下記：スタチン、フィブラート、抗血小板薬、ＰＣＳＫ９阻害薬、抗凝固薬、アンジオテンシン変換酵素阻害薬、カルシウムイオン拮抗薬、ＭＭＰ阻害薬、β受容体遮断薬、グルココルチコイド、およびこれらの医薬的に許容される塩、ならびに前記薬物または物質の活性製剤から選択される１つまたはそれ以上であるか；
前記アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の予防および／または治療で用いられる物質が、下記：ロバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン、フルバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ベザフィブラート、シプロフィブラート、ゲムフィブロジル、アスピリン、アセメタシン、オザグレルナトリウム、ベラプロストナトリウム、チロフィバン、およびこれらの薬力学的フラグメントまたは医薬的に許容される塩から選択される１つまたはそれ以上であるか；あるいは
前記アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連疾患の予防および／または治療で用いられる物質が、水溶性スタチン、またはロスバスタチン、プラバスタチンもしくはアトルバスタチンであること；
ｉｖ）前記リポソームナノキャリア送達システムが、標的化リガンドで修飾可能であるか、あるいは
前記標的化リガンドが、下記：ＧＡＧ、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、セレクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、モノクローナル抗体ＨＩ４４ａ、ＨＩ３１３、Ａ３Ｄ８、Ｈ９０およびＩＭ７、ならびにヒアルロン酸またはヒアルロン酸の誘導体から選択される１つまたはそれ以上であること；ならびに
ｖ）前記リポソームキャリアが、小型一枚膜リポソーム、大型一枚膜リポソームまたは多重一枚膜リポソームから選択されること
のうちの１つまたはそれ以上を含むことを特徴とする、請求項１に記載のリポソームナノキャリア送達システム。
【請求項3】
請求項１に記載のリポソームナノキャリア送達システムの調製方法であって、前記リポソームの内側と外側との間に溶液酸性勾配を形成するために塩溶液を添加し、分離させることにより前記リポソームキャリアを水和させる工程を含む、方法。
【請求項4】
前記塩が、弱酸と強アルカリの塩であるか；あるいは前記塩のアニオン部分が、下記：酢酸塩、エデト酸塩、炭酸水素塩、次亜塩素酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、およびグルコン酸塩から選択される１つまたはそれ以上であるか；および／または
前記塩のカチオン部分が、下記：カルシウムイオン、銅イオン、ニッケルイオン、バリウムイオン、マグネシウムイオン、および亜鉛イオンから選択される１つまたはそれ以上であるか；あるいは
前記塩が、酢酸カルシウム、炭酸水素カルシウム、クエン酸マグネシウム、およびグルコン酸銅から選択される１つまたはそれ以上であることを特徴とする、請求項３に記載のリポソームナノキャリア送達システムの調製方法。
【請求項5】
請求項３に記載のリポソームナノキャリア送達システムの調製方法であって、以下の工程：（１）前記リポソームキャリア物質を良溶媒に溶解し；
（２）工程（１）で得られた生成物に、前記リポソームの内側と外側で溶液酸性勾配を形成する塩溶液を添加して水和させ、粗脂質溶液に分散させ；
（３）工程（２）で得られた粗脂質溶液の粒子径を減少させて、微小化されたリポソームを得；
（４）工程（３）で得られた微小化リポソーム溶液を精製して外部イオンを除去し、リポソームの内部と外部の間に酸性勾配を形成し；次いで
（５）工程（４）で得られたリポソーム溶液に封入される物質の溶液を加え、インキュベーションを行って前記薬剤を前記リポソームの内部に侵入させ、リポソームナノキャリア送達システムを得ることを含むことを特徴とする、方法。
【請求項6】
前記方法が、下記の定義：ｉ）前記工程（１）が、前記溶媒を蒸発により除去して前記リポソームに脂質膜を形成させる工程をさらに含むか；
前記蒸発の温度が、４０～８０℃、５０～７０℃、または５０～６０℃であるか；
前記蒸発の方法が、回転蒸発法であるか；あるいは
前記回転蒸発法が、５０～２００ｒ／分、７０～１２０ｒ／分、または８０～１００ｒ／分の速度で行われること；
ｉｉ）工程（１）において、前記良溶媒が、下記：クロロホルム、エタノール、メタノール、塩化メチレン、アセトン、トルエン、ジエチルエーテル、酢酸エチル、酢酸メチル、アセトニトリル、およびジクロロエタンから選択される１つまたはそれ以上であること；
ｉｉｉ）工程（１）において、前記リポソームキャリアの物質が、リン脂質およびコレステロールを含むか；
前記リン脂質が、０．１～５００ｍｇ／ｍＬ、０．１～２００ｍｇ／ｍＬ、または０．２～１００ｍｇ／ｍＬの濃度であるか；ならびに／あるいは
前記コレステロールが、０．０５～２００ｍｇ／ｍＬ、あるいは０．１～１００ｍｇ／ｍＬ、または０．１～５０ｍｇ／ｍＬの濃度であること；
ｉｖ）工程（２）において、前記塩溶液が、１００～５００ｍＭ、２００～３００ｍＭ、または２００～２５０ｍＭの濃度であるか、ならびに／あるいは
前記水和の温度が、３０～９０℃、４０～８０℃、あるいは４５～６５℃であること；
ｖ）工程（３）において、前記粒子径を減少させる方法が、前記粗脂質溶液をフィルター膜に通して押し出すことであるか；
前記フィルター膜が、ポリカーボネート膜であるか；あるいは
前記フィルター膜が、３０～８００ｎｍ、例えば５０～４００ｎｍ、例えば１００～２００ｎｍ、例えば３０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、２００ｎｍ、４００ｎｍ、６００ｎｍもしくは８００ｎｍ、または１００～１５０ｎｍの孔径を有すること；
ｖｉ）工程（４）において、前記外部イオンを除去する方法が、下記：限外濾過膜パックによる分離、透析分離、およびイオン交換から選択される１つまたはそれ以上であること；
ｖｉｉ）工程（５）において、前記封入される物質の溶液が、０．０１～１００ｍｇ／ｍＬ、０．０５～５０ｍｇ／ｍＬ、０．１～２０ｍｇ／ｍＬ、または０．１～１０ｍｇ／ｍＬの濃度であること；
ｖｉｉｉ）工程（５）において、前記インキュベーションの温度が、２０～８０℃、４０～７０℃、または５５～６５℃であること；ならびに
ｉｘ）前記リポソームナノキャリア送達システムが、標的化リガンドで修飾される場合、前記方法は、下記工程：
（６）標的化リガンドを、工程（５）で得られたリポソームナノキャリア送達システムと共インキュベートして、修飾リポソームナノキャリア送達システムを得ることをさらに含むこと
のうちの１つまたはそれ以上を含むことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
請求項１または２に記載のナノキャリア送達システム、または請求項３～６のいずれか１項に記載の方法により調製されたナノキャリア送達システム、および医薬的に許容されるキャリアを含むことを特徴とする、医薬。
【請求項8】
請求項１または２に記載のナノキャリア送達システム、または請求項３～６のいずれか１項に記載の方法により調製されたナノキャリア送達システムを含む、疾患を予防および／または治療するための医薬組成物であって、前記疾患が、アテローム性動脈硬化症またはアテローム性動脈硬化症関連であるか、あるいは前記疾患が、アテローム性動脈硬化症、冠動脈アテローム性動脈硬化性心疾患（急性冠症候群、無症候性心筋虚血－潜在性冠動脈疾患、狭心症、心筋梗塞、虚血性心疾患、突然死、ステント内再狭窄を含む）、脳動脈硬化症（脳虚血性脳卒中、出血性脳溢血を含む）、末梢血管アテローム性動脈硬化症（頸動脈アテローム性動脈硬化症、椎骨アテローム性動脈硬化症、鎖骨下アテローム性動脈硬化症、閉塞性末梢動脈硬化症、網膜アテローム性動脈硬化症、腎アテローム性動脈硬化症、下肢アテローム性動脈硬化症、上肢アテローム性動脈硬化症、腸間膜アテローム性動脈硬化症およびアテローム性動脈硬化性インポテンスを含む）、大動脈解離、血管腫、血栓塞栓症、心不全、および心原性ショックから選択される１つまたはそれ以上である、医薬組成物。
【請求項9】
請求項１または２に記載のナノキャリア送達システム、または請求項３～６のいずれか１項に記載の方法により調製されたナノキャリア送達システムを含む、疾患を治療するための医薬組成物であって、前記医薬組成物が、血管プラークを治療するために用いられるか、あるいは前記医薬組成物が、動脈プラークを治療するために用いられるか、あるいは前記医薬組成物が、動脈プラークの進行を抑制し、動脈プラークを逆転させ、および／または動脈プラークの量を減少させるために用いられる、医薬組成物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0089】
実施例４ ロスバスタチンを能動的に封入した標的化ナノリポソーム製剤の調製
上記実施例１で調製した標的化物質ＨＰＤを、実施例２で調製した１５０ｎｍ薬物担持ナノリポソームＬＰ／ＲＡ１５０に挿入し、標的化薬物担持ナノリポソームを得た。具体的な挿入方法は以下の通りであった。実施例３で調製したロスバスタチンカルシウムを担持したナノリポソーム溶液を、予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液と混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。インキュベーション後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、ＨＰＤ濃度が２００±３１μｇ／ｍＬの高濃度のリガンド標的化リポソーム（ＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０）、ＨＰＤ濃度が１００±２４μｇ／ｍＬと中程度のリガンド標的化リポソーム（ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０）、ＨＰＤ濃度が１０±５μｇ／ｍＬと低濃度の標的化薬物担持リポソーム（ＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０）を得た。
上記実施例１で調製した標的化物質ＨＰＤを、実施例２で調製した１５０ｎｍ薬物担持ナノリポソームＬＰ／ＲＡ１５０に挿入し、標的化薬物担持ナノリポソームを得た。具体的な挿入方法は以下の通りであった。実施例３で調製したロスバスタチンカルシウムを担持したナノリポソーム溶液を、予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液と混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。インキュベーション後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、ＨＰＤ濃度が２００±３１μｇ／ｍＬの高濃度のリガンド標的化リポソーム（ＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０）、ＨＰＤ濃度が１００±２４μｇ／ｍＬと中程度のリガンド標的化リポソーム（ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０）、ＨＰＤ濃度が１０±５μｇ／ｍＬと低濃度の標的化薬物担持リポソーム（ＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０）を得た。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0139】
ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（質量比３：１：１）を秤量し、上記の脂質材料をエタノール中に溶解させた。クエン酸マグネシウム水溶液（２００ｍＭ）を加え、４０～６０℃に保ちつつ攪拌しながらエタノール相をクエン酸マグネシウム水溶液に注入し、脂質原料溶液を十分に水和させて粗リポソーム懸濁液を形成させた（クエン酸マグネシウム水相とエタノール相溶液の体積比は２以上であった）。透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、封入されなかったクエン酸マグネシウムを透析により分離した。内部液を回収し、ロスバスタチンカルシウム溶液またはロスバスタチンカルシウムとショ糖の混合溶液（全脂質原料に対するロスバスタチンカルシウムの質量比は０．２５以下であった）と十分に混合した後、４～６６℃で１５分以上インキュベートし、ロスバスタチンカルシウムを能動的に封入したナノリポソームを得た。調製したナノリポソームは、原薬の封入率が２０％以上であり、最終製剤の原薬濃度は２０ｍｇ／ｍＬ以下である。
【手続補正書】
【提出日】2024-07-10
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0010】
【図2】図２は、エタノール注入法によりロスバスタチンを能動的に封入したナノリポソームＬＰ／ＲＡ９０、ＬＰ／ＲＡ１２０、およびＬＰ／ＲＡ１５０の凍結電子顕微鏡写真（Ａ、Ｂ、およびＣ）と水和粒子径（Ｄ、Ｅ、およびＦ）の結果を示す。
【図3】図３は、ハイブリッド水和によってロスバスタチンを能動的に封入したナノリポソームＬＰ／ＲＢ９０、ＬＰ／ＲＢ１２０、およびＬＰ／ＲＢ１５０の低温電子顕微鏡写真（Ａ、Ｂ、およびＣ）と水和粒子径（Ｄ、Ｅ、およびＦ）の結果である。
【図4】図４は、ロスバスタチンを能動的に封入したナノリポソームＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０、ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０、ＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０の低温電子顕微鏡写真（Ａ、Ｂ、およびＣ）と水和粒子径（Ｄ、Ｅ、およびＦ）の結果を示す。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0052】
図５は、ロスバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリア送達システムＨＡ＠ＬＰ／ＲＣの低温電子顕微鏡写真（Ａ）と水和粒子径（Ｂ）の結果である。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0054】
図７は、アスピリンを能動的に封入した標的化薬物リポソームＨＡ－ＬＰ／Ａ
ＳＰＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0079】
以下の実施例で使用した試薬と器具は以下の通りである：
試薬：
ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００はＡＶＴものから購入した；
クロロホルム、無水エタノール、炭酸水素ナトリウム、ＥＤＣ、ＮＨＳ、酢酸カルシウム、およびロスバスタチンカルシウムは、Ｊ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した；
ＨＡは、Ｂｌｏｏｍａｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入し；ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨ２はＳｉｇｍａから購入した；
ポリカーボネート膜は、Ｗｈａｔｍａｎから購入した；
アトルバスタチンは、ルナルサン社から購入した；
アスピリン、ピタバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、ベザフィブラート、シプロフィブラート、アセメタシン、オザグレル、チロフィバンは、Ｊ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した；
試薬：
ＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００はＡＶＴものから購入した；
クロロホルム、無水エタノール、炭酸水素ナトリウム、ＥＤＣ、ＮＨＳ、酢酸カルシウム、およびロスバスタチンカルシウムは、Ｊ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した；
ＨＡは、Ｂｌｏｏｍａｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入し；ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ＮＨ２はＳｉｇｍａから購入した；
ポリカーボネート膜は、Ｗｈａｔｍａｎから購入した；
アトルバスタチンは、ルナルサン社から購入した；
アスピリン、ピタバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、ベザフィブラート、シプロフィブラート、アセメタシン、オザグレル、チロフィバンは、Ｊ＆Ｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンは、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した；
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0089】
実施例４ ロスバスタチンを能動的に封入した標的化ナノリポソーム製剤の調製
上記実施例１で調製した標的化物質ＨＰＤを、実施例２で調製した１５０ｎｍ薬物担持ナノリポソームＬＰ／ＲＡ１５０に挿入し、標的化薬物担持ナノリポソームを得た。具体的な挿入方法は以下の通りであった。実施例２で調製したロスバスタチンカルシウムを担持したナノリポソーム溶液を、予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液と混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。インキュベーション後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、ＨＰＤ濃度が２００±３１μｇ／ｍＬの高濃度のリガンド標的化リポソーム（ＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０）、ＨＰＤ濃度が１００±２４μｇ／ｍＬと中程度のリガンド標的化リポソーム（ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０）、ＨＰＤ濃度が１０±５μｇ／ｍＬと低濃度の標的化薬物担持リポソーム（ＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０）を得た。
上記実施例１で調製した標的化物質ＨＰＤを、実施例２で調製した１５０ｎｍ薬物担持ナノリポソームＬＰ／ＲＡ１５０に挿入し、標的化薬物担持ナノリポソームを得た。具体的な挿入方法は以下の通りであった。実施例２で調製したロスバスタチンカルシウムを担持したナノリポソーム溶液を、予め溶解しておいたＨＰＤ水溶液と混合し、２５℃以上に保ちながら５分以上インキュベートした。インキュベーション後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、挿入されなかったＨＰＤを透析により分離し、ＨＰＤ濃度が２００±３１μｇ／ｍＬの高濃度のリガンド標的化リポソーム（ＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０）、ＨＰＤ濃度が１００±２４μｇ／ｍＬと中程度のリガンド標的化リポソーム（ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０）、ＨＰＤ濃度が１０±５μｇ／ｍＬと低濃度の標的化薬物担持リポソーム（ＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０）を得た。
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0093】
ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ＤＰＮ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：０．５：１：１）を秤量し、上記脂質材料をクロロホルム中に溶解させた。有機溶媒を低速回転蒸発法（５５℃の水槽，９０ｒ／分，３０分）で除去し、容器壁面に脂質膜を形成させた。酢酸カルシウム水溶液（２００ｍＭ）を加え、４５℃の恒温水槽で脂質膜を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、ロスバスタチンカルシウム水溶液（１３３ｍｇ）の２５ｍＬと十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、粒子径１６０ｎｍの薬物を能動的に封入されたリポソームＬＰ／ＲＣを得た。図５は、本開示の実施例５におけるＨＡ＠ＬＰ／ＲＣの粒度分布図を示す。
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0096】
ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質材料を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。最終粒子径を１３０ｎｍに調節するため、押出機を用いてそれぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液１ｍＬとアトルバスタチンカルシウム（２．５ｍｇ）の水溶液２ｍＬを十分に混合した後、６０℃で１０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＡＣを得た。
【手続補正8】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0099】
実施例７ アスピリンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＡｓｐＣは、エタノール注入能動的封入法と後挿入法（post-insertion method）により調製した。アスピリン水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）をＮａＯＨでｐＨ調整して溶解した。ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとアスピリン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、４０℃で１０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＡｓｐＣを得た。
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＡｓｐＣは、エタノール注入能動的封入法と後挿入法（post-insertion method）により調製した。アスピリン水溶液（２ｍｇ／ｍＬ）をＮａＯＨでｐＨ調整して溶解した。ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとアスピリン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、４０℃で１０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＡｓｐＣを得た。
【手続補正9】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0101】
図７は、本実施例でアスピリンを能動的に封入した標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／Ａ
ＳＰＣの低温電子顕微鏡写真とＤＬＳを示す。
【手続補正10】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0103】
ピタバスタチン水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）、ＤＳＰＣ、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとピタバスタチン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で１０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＰＣを得た。
【手続補正11】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0109】
実施例１０ シンバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＳＣは、エタノール注入、能動的封入、後挿入法により調製した。シンバスタチン水溶液（Ｓｉｍｖ、１ｍｇ／ｍＬ）は、ＮａＯＨでｐＨを調整し、１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ＤＳＰＣ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成した。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとシンバスタチン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＳＣを得た。
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＳＣは、エタノール注入、能動的封入、後挿入法により調製した。シンバスタチン水溶液（Ｓｉｍｖ、１ｍｇ／ｍＬ）は、ＮａＯＨでｐＨを調整し、１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ＤＳＰＣ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成した。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとシンバスタチン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＳＣを得た。
【手続補正12】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0112】
実施例１１ プラバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＰＣをエタノール注入－能動的封入法と後挿入法で調製した。プラバスタチン水溶液（プラバス、１ｍｇ／ｍＬ）、ＤＳＰＣ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとプラバスタチン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、４０℃で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＰＣを得た。
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＰＣをエタノール注入－能動的封入法と後挿入法で調製した。プラバスタチン水溶液（プラバス、１ｍｇ／ｍＬ）、ＤＳＰＣ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、エタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとプラバスタチン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、４０℃で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＰＣを得た。
【手続補正13】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0115】
実施例１２ ベザフィブラートを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＢＣは、エタノール注入－能動的封入－後挿入法により調製した。ＮａＯＨでｐＨを調整し、１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えてベザフィブラート水溶液（Ｂｅｚａ、１ｍｇ／ｍＬ）を溶解した。ＤＳＰＣ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとベザフィブラート水溶液１ｍＬを十分に混合した後、４０℃で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＢＣ１３０を得た。
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＢＣは、エタノール注入－能動的封入－後挿入法により調製した。ＮａＯＨでｐＨを調整し、１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えてベザフィブラート水溶液（Ｂｅｚａ、１ｍｇ／ｍＬ）を溶解した。ＤＳＰＣ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとベザフィブラート水溶液１ｍＬを十分に混合した後、４０℃で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＢＣ１３０を得た。
【手続補正14】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0118】
実施例１３ シプロフィブラートを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＣＣはエタノール注入、能動的封入、後挿入法により調製された。ＮａＯＨでｐＨを６．０に調整し、シプロフィブラート水溶液（シプロ、１．５ｍｇ／ｍＬ）を溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成した。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとシプロフィブラート水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＣＣを得た。
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＣＣはエタノール注入、能動的封入、後挿入法により調製された。ＮａＯＨでｐＨを６．０に調整し、シプロフィブラート水溶液（シプロ、１．５ｍｇ／ｍＬ）を溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成した。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとシプロフィブラート水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＣＣを得た。
【手続補正15】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0121】
実施例１４ アセメタシンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＡｍＣは、エタノール注入、能動的封入、後挿入法により調製した。アセメタシン水溶液（アセメット、１ｍｇ／ｍＬ）に１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとアセメタシン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＡｍＣを得た。
この実施例では、ＨＡ－ＬＰ／ＡｍＣは、エタノール注入、能動的封入、後挿入法により調製した。アセメタシン水溶液（アセメット、１ｍｇ／ｍＬ）に１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとアセメタシン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＡｍＣを得た。
【手続補正16】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0123】
実施例１５ オザグレルを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＬＰ／ＯＣは、エタノール注入法、能動的封入法、後挿入法で調製した。オザグレル水溶液（オザグレル、２ｍｇ／ｍＬ）に１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとオザグレル水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＯＣを得た。
この実施例では、ＬＰ／ＯＣは、エタノール注入法、能動的封入法、後挿入法で調製した。オザグレル水溶液（オザグレル、２ｍｇ／ｍＬ）に１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとオザグレル水溶液１ｍＬを十分に混合した後、室温で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＯＣを得た。
【手続補正17】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0126】
実施例１６ チロフィバンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリアの調製
この実施例では、ＬＰ／ＴＣをエタノール注入法、能動的封入法、後挿入法で調製した。チロフィバン水溶液（チロフィバン、２ｍｇ／ｍＬ）に１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとチロフィバン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＴＣ１３０を得た。
この実施例では、ＬＰ／ＴＣをエタノール注入法、能動的封入法、後挿入法で調製した。チロフィバン水溶液（チロフィバン、２ｍｇ／ｍＬ）に１０％の２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンを加えて溶解した。ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、脂質原料をエタノール中に溶解させた。酢酸カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、６５℃の恒温水槽で脂質原料溶液を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して１０回押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、内部液２ｍＬとチロフィバン水溶液１ｍＬを十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、薬剤を能動的に封入したリポソームＬＰ／ＴＣ１３０を得た。
【手続補正18】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0129】
実施例１７ ロスバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリア送達システム（ＨＡ＠ＬＰ／Ｒｄ）の調製
水素添加大豆ホスファチジルコリン、ＤＰＮ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：０．５：１：１）を秤量し、上記脂質原料をクロロホルム中に溶解させた。有機溶媒を低速回転蒸発法（５５℃の水槽、９０ｒ／分、３０分）で除去し、容器壁面に脂質膜を形成させた。グルコン酸銅水溶液（２００ｍＭ）を加え、４５℃の恒温水槽で脂質膜を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、ロスバスタチンカルシウム（１３３ｍｇ）２５ｍＬと十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／Ｒｄを得た。
水素添加大豆ホスファチジルコリン、ＤＰＮ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：０．５：１：１）を秤量し、上記脂質原料をクロロホルム中に溶解させた。有機溶媒を低速回転蒸発法（５５℃の水槽、９０ｒ／分、３０分）で除去し、容器壁面に脂質膜を形成させた。グルコン酸銅水溶液（２００ｍＭ）を加え、４５℃の恒温水槽で脂質膜を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、ロスバスタチンカルシウム（１３３ｍｇ）２５ｍＬと十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、薬物を能動的に封入したリポソームＬＰ／Ｒｄを得た。
【手続補正19】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0132】
実施例１８ アトルバスタチンを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリア送達システム（ＨＡ＠ＬＰ／Ａ
ｄ
）の調製
ジパルミトイルホスファチジルコリン、ＤＰＮ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：０．５：１：１）を秤量し、上記脂質原料をクロロホルム中に溶解させた。有機溶媒を低速回転蒸発（５５℃の水槽、９０ｒ／分、３０分）で除去し、容器の壁に脂質膜を形成させた。酢酸カルシウム水溶液（３００ｍＭ）を加え、４５℃の恒温水槽で脂質膜を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、２５ｍＬのアトルバスタチンカルシウムと十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、粒子径１３０ｎｍの薬物能動的封入リポソームＬＰ／Ａｄを得た。
ジパルミトイルホスファチジルコリン、ＤＰＮ、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：０．５：１：１）を秤量し、上記脂質原料をクロロホルム中に溶解させた。有機溶媒を低速回転蒸発（５５℃の水槽、９０ｒ／分、３０分）で除去し、容器の壁に脂質膜を形成させた。酢酸カルシウム水溶液（３００ｍＭ）を加え、４５℃の恒温水槽で脂質膜を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった酢酸カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、２５ｍＬのアトルバスタチンカルシウムと十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、粒子径１３０ｎｍの薬物能動的封入リポソームＬＰ／Ａｄを得た。
【手続補正20】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0135】
実施例１９ シプロフィブラートを能動的に封入した標的化リポソームナノキャリア送達システム（ＨＡ＠ＬＰ／Ｃｄ）の調製
スフィンゴミエリン、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、上記脂質材料をクロロホルム中に溶解させた。有機溶媒を低速回転蒸発法（５５℃の水槽、９０ｒ／分、３０分）で除去し、容器壁面に脂質膜を形成させた。炭酸水素カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、４５℃の恒温水槽で脂質膜を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった炭酸水素カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、２５ｍＬのシプロフィブラートと十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、粒子径１３０ｎｍの薬物能動的封入リポソームＬＰ／Ｃｄを得た。
スフィンゴミエリン、コレステロール、ポリエチレングリコール－ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）（質量比３：１：１）を秤量し、上記脂質材料をクロロホルム中に溶解させた。有機溶媒を低速回転蒸発法（５５℃の水槽、９０ｒ／分、３０分）で除去し、容器壁面に脂質膜を形成させた。炭酸水素カルシウム水溶液（２５０ｍＭ）を加え、４５℃の恒温水槽で脂質膜を完全に水和させ、粗リポソーム懸濁液を形成させた。押出機を用いて、それぞれ２００ｎｍと１００ｎｍのポリカーボネート膜に通して押出成形を行った。封入されなかった炭酸水素カルシウムは、限外ろ過膜パックを用いて分離した。内部液を回収し、２５ｍＬのシプロフィブラートと十分に混合した後、６５℃で３０分間インキュベートし、粒子径１３０ｎｍの薬物能動的封入リポソームＬＰ／Ｃｄを得た。
【手続補正21】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0136】
実施例１で調製したＨＰＤ水溶液を混合し、２５℃以上に保ちながら３０分以上インキュベートした。インキュベーション後、透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて透析により未挿入ＨＰＤを分離し、最終生成物中のＨＰＤ濃度が１０～２００μｇ／ｍＬの薬物負荷標的化リポソームＨＡ＠ＬＰ／Ｃｄを得た。
【手続補正22】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0139】
ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、コレステロール、ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００（質量比３：１：１）を秤量し、上記の脂質材料をエタノール中に溶解させた。クエン酸マグネシウム水溶液（２００ｍＭ）を加え、４０～６０℃に保ちつつ攪拌しながらエタノール相をクエン酸マグネシウム水溶液に注入し、脂質原料溶液を十分に水和させて粗リポソーム懸濁液を形成させた（クエン酸マグネシウム水相とエタノール相溶液の体積比は２以上であった）。透析バッグまたは限外濾過膜パックを用いて、封入されなかったクエン酸マグネシウムを透析により分離した。内部液を回収し、ベザフィブラート溶液（全脂質原料に対するベザフィブラートの質量比は０．２５以下であった）と十分に混合した後、４～６６℃で１５分以上インキュベートし、ベザフィブラートを能動的に封入したナノリポソームを得た。調製したナノリポソームは、原薬の封入率が２０％以上であり、最終製剤の原薬濃度は２０ｍｇ／ｍＬ以下である。
【手続補正23】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0140】
実施例１で調製したＨＰＤ水溶液を混合し、２５℃以上に保ちながら３０分以上インキュベートした。インキュベーション後、透析バッグまたは限外ろ過膜パックを用いて透析により未挿入ＨＰＤを分離し、最終生成物中のＨＰＤ濃度が１０～２００μｇ／ｍＬの薬剤担持標的化リポソームＨＡ－ＬＰ／Ｂｄを得た。
【手続補正24】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0145】
２．水和された粒子径の測定
本開示の送達システムの粒子径は、Ｍａｌｖｅｒｎインテリジェントレーザー粒度分布測定装置で測定した。結果を表１に示す。
本開示の送達システムの粒子径は、Ｍａｌｖｅｒｎインテリジェントレーザー粒度分布測定装置で測定した。結果を表１に示す。
【手続補正25】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0149】
４．封入率の決定
一定量のナノキャリアを用いた。ＨＰＬＣ法で遊離薬物量と総薬物量を測定し、下記式１に従って封入率を算出した。結果を表１に示す。
封入率（％）＝（１－Ｍ遊離薬物量／Ｍ総薬物量）＊１００％ 式１
表１ 本開示のナノキャリア送達システムの方法の概略、平均粒子径および封入率の結果
留意：
上記のデータは全て、並行して３回測定した結果の「平均＋標準偏差」という形で表される。
一定量のナノキャリアを用いた。ＨＰＬＣ法で遊離薬物量と総薬物量を測定し、下記式１に従って封入率を算出した。結果を表１に示す。
封入率（％）＝（１－Ｍ遊離薬物量／Ｍ総薬物量）＊１００％ 式１
表１ 本開示のナノキャリア送達システムの方法の概略、平均粒子径および封入率の結果
【表1】
上記のデータは全て、並行して３回測定した結果の「平均＋標準偏差」という形で表される。
【手続補正26】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0162】
さらに、アッセイ動物を無作為に以下の群に分け、それぞれ６匹ずつ入れた：
ロスバスタチン経口投与群：ロスバスタチン０．５ｍｇ／ｋｇ体重を経口投与した。
ロスバスタチン静脈内注射群：ロスバスタチンＨＡ＠ＬＰ／Ｒ Ｃ ０．５ｍｇ／ｋｇ体重を静脈内投与した；
治療群に１日おきに１回、合計１１回投与した。
ロスバスタチン経口投与群：ロスバスタチン０．５ｍｇ／ｋｇ体重を経口投与した。
ロスバスタチン静脈内注射群：ロスバスタチンＨＡ＠ＬＰ／Ｒ Ｃ ０．５ｍｇ／ｋｇ体重を静脈内投与した；
治療群に１日おきに１回、合計１１回投与した。
【手続補正27】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0169】
２．異なるＨＡ／脂質材料の質量比による薬効の比較
６週齢のＡｐｏＥ－／－マウスに高脂肪食を２８週間与え、大動脈プラークを形成させ、ＡＳの動物モデルとした。血中脂質と体重に応じて、プラークモデルの対照群、非標的ナノスタチン製剤群（ＬＰ／ＲＡ１５０、５ｍｇ／ｋｇ）、標的ナノスタチン製剤－１（ＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０、用量は５ｍｇ／ｋｇである）、標的ナノスタチン製剤－２（ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０を５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射した）、標的ナノスタチン製剤－３（ＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０、用量５ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ）に無作為に分け、各群１０匹とした。治療は１日１回、合計２８日間行われ、治療期間は４週間であった。治療後、大動脈プラークの巨視的病理検査（ｅｎ－ｆａｃｅ）が行われた。ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０およびＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０製剤群は、ほぼ有意なプラークの逆転を示した。
６週齢のＡｐｏＥ－／－マウスに高脂肪食を２８週間与え、大動脈プラークを形成させ、ＡＳの動物モデルとした。血中脂質と体重に応じて、プラークモデルの対照群、非標的ナノスタチン製剤群（ＬＰ／ＲＡ１５０、５ｍｇ／ｋｇ）、標的ナノスタチン製剤－１（ＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０、用量は５ｍｇ／ｋｇである）、標的ナノスタチン製剤－２（ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０を５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射した）、標的ナノスタチン製剤－３（ＨＡＨ－ＬＰ／ＲＡ１５０、用量５ｍｇ／ｋｇ、ｉｖ）に無作為に分け、各群１０匹とした。治療は１日１回、合計２８日間行われ、治療期間は４週間であった。治療後、大動脈プラークの巨視的病理検査（ｅｎ－ｆａｃｅ）が行われた。ＨＡＭ－ＬＰ／ＲＡ１５０およびＨＡＬ－ＬＰ／ＲＡ１５０製剤群は、ほぼ有意なプラークの逆転を示した。
【国際調査報告】