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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-18
(54)【発明の名称】二重特異性組換えタンパク質及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/46 20060101AFI20240910BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240910BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240910BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240910BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240910BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240910BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240910BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240910BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20240910BHJP
A61K 38/21 20060101ALI20240910BHJP
A61K 47/65 20170101ALI20240910BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240910BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240910BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240910BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240910BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240910BHJP
C07K 16/24 20060101ALN20240910BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240910BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240910BHJP
【ＦＩ】
C07K16/46 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61K38/02
A61K38/21
A61K47/65
A61K39/395 N
A61P35/00
A61P1/16
A61P31/12
A61P35/02
C07K16/24
C07K16/28
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024533156
(86)(22)【出願日】2022-08-12
(85)【翻訳文提出日】2024-02-09
(86)【国際出願番号】 CN2022112300
(87)【国際公開番号】W WO2023016568
(87)【国際公開日】2023-02-16
(31)【優先権主張番号】202110926743.1
(32)【優先日】2021-08-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524056662
【氏名又は名称】上海才致薬成生物科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】何柯
(72)【発明者】
【氏名】宋利平
(72)【発明者】
【氏名】範藝
(72)【発明者】
【氏名】陳英嬌
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C076
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C076AA95
4C076CC16
4C076CC27
4C076CC35
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA02
4C084BA41
4C084DA21
4C084DA22
4C084NA13
4C084ZA75
4C084ZB26
4C084ZB27
4C084ZB33
4C085AA14
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、二重特異性組換えタンパク質及びその使用を開示する。前記二重特異性組換えタンパク質は、第１機能結合領域、第２機能結合領域及びＦｃ領域を含み、前記第１機能結合領域は、第１鎖及び第２鎖を含み、前記第１鎖のＣ末端及び前記第２機能結合領域のＣ末端は、別々に、Ｆｃ領域のＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、前記第２鎖のＣ末端は、第２機能結合領域のＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結される。本発明はまた、前記組換えタンパク質の抗腫瘍、抗ウイルス及び肝疾患の治療への使用を開示する。組換えタンパク質は、標的細胞に対する殺傷効果を有意に向上させると同時に、非標的細胞への結合によって引き起こされる毒性副作用を有意に減少させることができ、より優れた安全性及び良好な凍結融解安定性を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
二重特異性組換えタンパク質であって、前記二重特異性組換えタンパク質は、第１機能結合領域、第２機能結合領域及びＦｃ領域を含み、前記第１機能結合領域は、第１鎖及び第２鎖を含み、前記第１鎖のＣ末端及び前記第２機能結合領域のＣ末端は、別々に、Ｆｃ領域のＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、前記第２鎖のＣ末端は、第２機能結合領域のＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、前記第１機能結合領域は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、
前記第２機能結合領域は、インターフェロン、そのトランケート型変異体、又はその突然変異体を含み、
好ましくは、前記ＣＬ又はＣＨ１のＣ末端は、前記Ｆｃ領域のＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、対応するＣＨ１又はＣＬのＣ末端は、第２機能結合領域のＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結されることを特徴とする、二重特異性組換えタンパク質。
【請求項2】
前記インターフェロンは、Ｉ型インターフェロンであり、好ましくは、前記Ｉ型インターフェロンは、ＩＦＮαであり、より好ましくは、前記ＩＦＮαは、ＩＦＮ－α１ａ、ＩＦＮ－α１ｂ、ＩＦＮ－α２ａ、ＩＦＮ－α２ｂ、ＩＦＮ－α４ａ、ＩＦＮ－α４ｂ、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７及びＩＦＮ－α２１のうちの１つ又は複数から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性組換えタンパク質。
【請求項3】
前記インターフェロンは、ＩＦＮ－α２ｂであり、好ましくは、前記第２機能結合領域は、以下のａ１）～ａ２）のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む：ａ１）配列番号１７；ａ２）配列番号１７に示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、修飾及び／又は置換によって得られるアミノ酸配列であって、そのモノマーがＩＦＮα受容体に対する結合親和性を有し、当該結合親和性がＩＦＮα受容体に対するａ１）モノマーの結合親和性以下であることを特徴とする、請求項２に記載の二重特異性組換えタンパク質。
【請求項4】
ａ２）モノマーのアミノ酸配列は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列の対応する部位における置換によって得られるアミノ酸配列であり、前記対応する部位における置換は、Ｌ２６Ａ、Ｌ３０Ａ、Ａ１４５Ｇ、Ｒ１４９Ａ及びＳ１５２Ａのうちの１つ又は複数から選択され、好ましくは、前記ａ２）モノマーは、単一部位における置換であり、置換部位は、それぞれＬ２６Ａ、Ｌ３０Ａ、Ａ１４５Ｇ、Ｒ１４９Ａ又はＳ１５２Ａであり、対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８～２２に示される通りであることを特徴とする、請求項３に記載の二重特異性組換えタンパク質。
【請求項5】
前記ＶＨは、ＣＨ１又はＣＬに直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、前記ＶＬは、ＣＬ又はＣＨ１に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、好ましくは、ＶＬがＣＬに連結される場合、ＶＨはＣＨ１に連結され、ＶＬがＣＨ１に連結される場合、ＶＨはＣＬに連結されることを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性組換えタンパク質。
【請求項6】
前記第１機能結合領域は、腫瘍細胞又は免疫細胞を標的とし、好ましくは、前記第１機能結合領域は、標的ＧＰＣ３、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、Ｔｒｏｐ－２、５Ｔ４、ＡＧＳ－１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ－２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ｃ－ｆｍｓ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ－４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ－α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＣＡＭ－１、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＬＩＶ－１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ－１、ＣＳＦ－１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＣＤ１３８、Ｓｉｇｌｅｃ１５及びＣＤ１５５のうちのいずれか１つ又は複数を標的とすることを特徴とする、請求項１に記載の二重特異性組換えタンパク質。
【請求項7】
前記第１機能結合領域は、ＧＰＣ３を標的とし、前記第１機能結合領域は、特異的抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含み、好ましくは、前記特異的抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の配列は配列番号１に示される通りであり、軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列は配列番号２に示される通りであり、又は、前記第１機能結合領域は、ＰＤ－Ｌ１を標的とし、前記第１機能結合領域は、特異的抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含み、好ましくは、前記特異的抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の配列は配列番号５に示される通りであり、軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列は配列番号６に示される通りであり、
又は、前記第１機能結合領域は、ＢＣＭＡを標的とし、前記第１機能結合領域は、特異的抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含み、好ましくは、前記特異的抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の配列は配列番号７又は配列番号９に示される通りであり、軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列は配列番号８又は配列番号１０に示される通りであり、
又は、前記第１機能結合領域は、Ｔｒｏｐ－２を標的とし、前記第１機能結合領域は、特異的抗Ｔｒｏｐ－２モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含み、好ましくは、前記特異的抗Ｔｒｏｐ－２モノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の配列は配列番号１１に示される通りであり、軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列は配列番号１２に示される通りであることを特徴とする、請求項６に記載の二重特異性組換えタンパク質。
【請求項8】
前記リンカー配列は、２０個アミノ酸残基以下の長さを有し、前記リンカー配列は、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（Ｇ）ｎ、（ＧＳ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ又は（ＸＰ）ｎから選択され、ｎは自然数であり、好ましくは、前記リンカー配列のアミノ酸配列は、配列番号１３～１６に示される通りであることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の二重特異性組換えタンパク質。
【請求項9】
前記二重特異性組換えタンパク質は、Ａ鎖及びＢ鎖から構成され、ここで、Ａ鎖の構造はＶＨ－ＣＨ１－ＦｃＡ領域であり、Ｂ鎖の構造はＶＬ－ＣＬ－第２機能結合領域－ＦｃＢ領域であり、又は、Ａ鎖の構造はＶＨ－ＣＬ－ＦｃＡ領域であり、Ｂ鎖の構造はＶＬ－ＣＨ１－第２機能結合領域－ＦｃＢ領域であり、又は、Ａ鎖の構造はＶＬ－ＣＨ１－ＦｃＡ領域であり、Ｂ鎖の構造はＶＨ－ＣＬ－第２機能結合領域－ＦｃＢ領域であり、又は、Ａ鎖の構造はＶＬ－ＣＬ－ＦｃＡ領域であり、Ｂ鎖の構造はＶＨ－ＣＨ１－第２機能結合領域－ＦｃＢ領域であり、前記Ａ鎖及びＢ鎖は、分子間力、共有結合及びイオン結合からなる群より選択される１つ又は複数によって結合されることを特徴とする、請求項８に記載の二重特異性組換えタンパク質。
【請求項10】
二重特異性組換えタンパク質であって、前記二重特異性組換えタンパク質は、第１機能結合領域、第２機能結合領域及びＦｃ領域を含み、前記第１機能結合領域は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、前記第２機能結合領域は、インターフェロン、そのトランケート型変異体、又はその突然変異体を含み、前記二重特異性組換えタンパク質は、第１アーム及び第２アームから構成され、前記第１アームは、鎖１及び鎖２から構成され、ここで、前記鎖１の構造はＶＨ－ＣＨ１－ＦｃＡ領域であり、前記鎖２の構造はＶＬ－ＣＬであり、又は、前記鎖１の構造はＶＨ－ＣＬ－ＦｃＡ領域であり、前記鎖２の構造はＶＬ－ＣＨ１であり、又は、前記鎖１の構造はＶＬ－ＣＨ１－ＦｃＡ領域であり、前記鎖２の構造はＶＨ－ＣＬであり、又は、前記鎖１の構造はＶＬ－ＣＬ－ＦｃＡ領域であり、前記鎖２の構造はＶＨ－ＣＨ１であり、前記第２アームの構造は第２機能結合領域－ＦｃＢ領域であり、前記ＦｃＡ領域及びＦｃＢ領域は、前記二重特異性組換えタンパク質のＦｃ領域を構成し、前記第２アームにおいて、第２機能結合領域のアミノ酸配列は、配列番号１７～２２のいずれか１つを含み、前記第１機能結合領域がＧＰＣ３を標的とする場合、前記第１機能結合領域は、特異的抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含み、好ましくは、前記第１アームにおいて、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、
前記第１機能結合領域がＰＤ－Ｌ１を標的とする場合、前記第１機能結合領域は、特異的抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含み、好ましくは、前記第１アームにおいて、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、
前記第１機能結合領域がＢＣＭＡを標的とする場合、前記第１機能結合領域は、特異的抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含み、好ましくは、前記第１アームにおいて、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号７又は９を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号８又は１０を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、
前記第１機能結合領域がＴｒｏｐ－２を標的とする場合、前記第１機能結合領域は、特異的抗Ｔｒｏｐ－２モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含み、好ましくは、前記第１アームにおいて、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１１を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１２を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含むことを特徴とする、二重特異性組換えタンパク質。
【請求項11】
前記二重特異性組換えタンパク質のＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４由来のＦｃ領域であり、前記Ｆｃ領域は、天然配列又は非天然配列を含み、好ましくは、前記Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４由来のＦｃ領域であり、
より好ましくは、前記ＦｃＡ領域及びＦｃＢ領域は、ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓによって結合され、
更に好ましくは、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２５を含む場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２５を含み、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６を含む場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７を含み、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７を含む場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６を含み、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２８を含む場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２８を含み、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２９を含む場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号３０を含み、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号３０を含む場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２９を含むことを特徴とする、請求項９又は１０に記載の二重特異性組換えタンパク質。
【請求項12】
前記第１機能結合領域はＧＰＣ３を標的とし、前記Ａ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、ＦｃＡ領域のアミノ酸配列は配列番号２６又は配列番号２７を含み、前記Ｂ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、第２機能結合領域のアミノ酸配列は配列番号１７、１８、１９、２１又は２２を含み、ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７又は配列番号２６を含み、
好ましくは、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列において、配列番号２又は配列番号１のＣ末端は、配列番号３２のＮ末端に直接に連結され、配列番号３２のＣ末端は、リンカー配列によって配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１又は配列番号２２のＮ末端に連結され、前記リンカー配列は、配列番号１３～１６のいずれか１つから選択され、
より好ましくは、前記Ａ鎖のアミノ酸配列が順次連結した配列番号１、３１及びＦｃＡ領域から構成される場合、
前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１６、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１６、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１６、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１６、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１６、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６であることを特徴とする、請求項１１に記載の二重特異性組換えタンパク質。
【請求項13】
前記第１機能結合領域はＰＤ－Ｌ１を標的とし、前記Ａ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、ＦｃＡ領域のアミノ酸配列は配列番号２６又は配列番号２７又は配列番号２９又は配列番号３０を含み、前記Ｂ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、第２機能結合領域のアミノ酸配列は配列番号１７～２２のいずれか１つを含み、ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７又は配列番号２６又は配列番号３０又は配列番号２９を含み、
好ましくは、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列において、配列番号６又は配列番号５のＣ末端は、配列番号３２のＮ末端に直接に連結され、配列番号３２のＣ末端は、リンカー配列によって配列番号１７～２２のいずれか１つのＮ末端に連結され、前記リンカー配列は、配列番号１３～１６のいずれか１つから選択され、
より好ましくは、
前記Ａ鎖のアミノ酸配列が順次連結した配列番号５、３１及びＦｃＡ領域から構成される場合、
前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２９である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号３０であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号３０である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２９であることを特徴とする、請求項１１に記載の二重特異性組換えタンパク質。
【請求項14】
前記第１機能結合領域はＢＣＭＡを標的とし、好ましくは、前記Ａ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号７又は９を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号８又は１０を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、ＦｃＡ領域のアミノ酸配列は配列番号２６又は配列番号２７を含み、
前記Ｂ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号７又は９を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号８又は１０を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、第２機能結合領域のアミノ酸配列は配列番号１７～２２のいずれか１つを含み、ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７又は配列番号２６を含み、
より好ましくは、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列において、配列番号７、８、９又は１０のＣ末端は、配列番号３２のＮ末端に直接に連結され、配列番号３２のＣ末端は、リンカー配列によって配列番号１７～２２のいずれか１つのＮ末端に連結され、前記リンカー配列は、配列番号１３～１６のいずれか１つから選択され、
更に好ましくは、
前記Ａ鎖のアミノ酸配列が順次連結した配列番号７、３１及びＦｃＡ領域から構成される場合、
前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
前記Ａ鎖のアミノ酸配列が順次連結した配列番号９、３１及びＦｃＡ領域から構成される場合、
前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７であり、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６であることを特徴とする、請求項１１に記載の二重特異性組換えタンパク質。
【請求項15】
前記第１機能結合領域はＴｒｏｐ－２を標的とし、前記Ａ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１２を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、ＦｃＡ領域のアミノ酸配列は配列番号２６又は配列番号２７を含み、
前記Ｂ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１２を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、第２機能結合領域のアミノ酸配列は配列番号１７～２２のいずれか１つを含み、ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７又は配列番号２６を含み、
好ましくは、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列において、配列番号１２又は配列番号１１のＣ末端は、配列番号３２のＮ末端に直接に連結され、配列番号３２のＣ末端は、リンカー配列によって配列番号１７～２２のいずれか１つのＮ末端に連結され、前記リンカー配列は、配列番号１３～１６のいずれか１つから選択され、
より好ましくは、
前記Ａ鎖のアミノ酸配列が順次連結した配列番号１１、３１及びＦｃＡ領域から構成される場合、
前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７であり、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６であることを特徴とする、請求項１１に記載の二重特異性組換えタンパク質。
【請求項16】
前記第１機能結合領域がＧＰＣ３を標的とする場合、前記第１アームにおける鎖１のアミノ酸配列が順次連結した配列番号１、３１及びＦｃＡ領域から構成されると、鎖２のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２及び３２から構成され、前記第２アームのアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１７～２２のいずれか１つ及びＦｃＢ領域から構成され、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６であり、前記第１機能結合領域がＰＤ－Ｌ１を標的とする場合、前記第１アームにおける鎖１のアミノ酸配列が順次連結した配列番号５、３１及びＦｃＡ領域から構成されると、鎖２のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６及び３２から構成され、前記第２アームのアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１７～２２のいずれか１つ及びＦｃＢ領域から構成され、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２９である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号３０であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号３０である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２９であり、
前記第１機能結合領域がＢＣＭＡを標的とする場合、前記第１アームにおける鎖１のアミノ酸配列が順次連結した配列番号７、３１及びＦｃＡ領域から構成されると、鎖２のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８及び３２から構成され、又は、前記第１アームにおける鎖１のアミノ酸配列が順次連結した配列番号９、３１及びＦｃＡ領域から構成される場合、前記第１アームにおける鎖２のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０及び３２から構成され、前記第２アームのアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１７～２２のいずれか１つ及びＦｃＢ領域から構成され、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６であり、
前記第１機能結合領域がＴｒｏｐ－２を標的とする場合、前記第１アームにおける鎖１のアミノ酸配列が順次連結した配列番号１１、３１及びＦｃＡ領域から構成されると、鎖２のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２及び３２から構成され、前記第２アームのアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１７～２２のいずれか１つ及びＦｃＢ領域から構成され、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６であることを特徴とする、請求項１０に記載の二重特異性組換えタンパク質。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性組換えタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項18】
請求項１７に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクター。
【請求項19】
請求項１８に記載の発現ベクターによって宿主細胞を形質転換することによって得られる組換え細胞。
【請求項20】
請求項１９に記載の組換え細胞を使用して前記二重特異性組換えタンパク質を発現させる工程を含むことを特徴とする、請求項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性組換えタンパク質を調製する方法。
【請求項21】
請求項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性組換えタンパク質を含み、好ましくは、薬学的に許容される担体を更に含む薬剤又は医薬組成物。
【請求項22】
疾患の治療、補助療法又は予防のための薬剤の調製における、請求項１～１６のいずれか一項に記載の二重特異性組換えタンパク質、又は請求項２１に記載の薬剤又は医薬組成物の使用であって、好ましくは、前記疾患は、腫瘍、肝疾患及びウイルス感染症から選択され、
より好ましくは、前記疾患は、ＧＰＣ３、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、Ｔｒｏｐ－２、５Ｔ４、ＡＧＳ－１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ－２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ｃ－ｆｍｓ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ－４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ－α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＣＡＭ－１、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＬＩＶ－１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ－１、ＣＳＦ－１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＣＤ１３８、Ｓｉｇｌｅｃ１５又はＣＤ１５５陽性関連疾患である使用。
【請求項23】
前記腫瘍は、乳癌、腸癌、膵臓癌、食道癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、腎臓癌、子宮頸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝臓癌、上咽頭癌、精巣癌、肺癌、黒色腫、皮膚癌、肉腫、神経膠腫、中皮腫及び骨髄異形成症候群から選択され、好ましくは、前記腸癌は結腸直腸癌を含み、前記卵巣癌は卵黄嚢腫瘍を含み、前記神経内分泌癌はメルケル細胞癌を含み、前記肺癌は小細胞肺癌及び非小細胞肺癌を含み、前記皮膚癌は基底細胞癌及び扁平上皮癌を含み、前記肉腫は隆起性皮膚線維肉腫を含み、前記神経膠腫は神経膠芽腫を含み、前記子宮癌は子宮内膜癌及び子宮肉腫を含むことを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
本出願は出願日が２０２１年８月１２日である中国特許出願２０２１１０９２６７４３１の優先権を主張する。本出願は上記の中国特許出願の全文を引用する。
【0002】
［技術分野］
本発明は、生物医学の分野に属し、具体的に、二重特異性組換えタンパク質及びその使用に関する。
本発明は、生物医学の分野に属し、具体的に、二重特異性組換えタンパク質及びその使用に関する。
【0003】
［背景技術］
インターフェロンは、複数の機能を有する活性タンパク質のグループであり、主に単球及びリンパ球によって産生されるサイトカインであり、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型の３種類に分類され、Ｉ型インターフェロンには、ＩＦＮα及びＩＦＮβが含まれ、ＩＦＮαには、ＩＦＮα２、ＩＦＮα４などのＩＦＮαのサブタイプも含まれ、ＩＩ型及びＩＩＩ型インターフェロンには、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ１（ＩＬ－２９）、ＩＦＮλ２（ＩＬ－２８ａ）及びＩＦＮλ３（ＩＬ－２８ｂ）が含まれる。インターフェロンは、広範囲の抗ウイルス作用、細胞成長及び分化への影響、免疫機能の調節などの様々な生物活性を有する。インターフェロンα（ＩＦＮα）は、ＩＦＮα受容体との結合によるエフェクター細胞の活性化、ナチュラルキラー細胞などの免疫細胞の活性上昇、ウイルスや腫瘍細胞の増殖阻害、腫瘍細胞のアポトーシス誘導など、幅広い抗ウイルス・抗腫瘍作用を有するため、臨床現場で広く使用されている生物学的製剤の１つになり、主に肝疾患（例えば、慢性Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎）、ウイルス感染症（例えば、ウイルス性呼吸器疾患、皮膚疾患、血液疾患、婦人科疾患）及び特定の腫瘍（例えば、慢性骨髄性白血病、黒色腫、リンパ腫、腎臓癌）の治療、並びに腫瘍や悪性血液疾患の補助療法として使用されている。
インターフェロンは、複数の機能を有する活性タンパク質のグループであり、主に単球及びリンパ球によって産生されるサイトカインであり、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型の３種類に分類され、Ｉ型インターフェロンには、ＩＦＮα及びＩＦＮβが含まれ、ＩＦＮαには、ＩＦＮα２、ＩＦＮα４などのＩＦＮαのサブタイプも含まれ、ＩＩ型及びＩＩＩ型インターフェロンには、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ１（ＩＬ－２９）、ＩＦＮλ２（ＩＬ－２８ａ）及びＩＦＮλ３（ＩＬ－２８ｂ）が含まれる。インターフェロンは、広範囲の抗ウイルス作用、細胞成長及び分化への影響、免疫機能の調節などの様々な生物活性を有する。インターフェロンα（ＩＦＮα）は、ＩＦＮα受容体との結合によるエフェクター細胞の活性化、ナチュラルキラー細胞などの免疫細胞の活性上昇、ウイルスや腫瘍細胞の増殖阻害、腫瘍細胞のアポトーシス誘導など、幅広い抗ウイルス・抗腫瘍作用を有するため、臨床現場で広く使用されている生物学的製剤の１つになり、主に肝疾患（例えば、慢性Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎）、ウイルス感染症（例えば、ウイルス性呼吸器疾患、皮膚疾患、血液疾患、婦人科疾患）及び特定の腫瘍（例えば、慢性骨髄性白血病、黒色腫、リンパ腫、腎臓癌）の治療、並びに腫瘍や悪性血液疾患の補助療法として使用されている。
【0004】
しかし、ＩＦＮα受容体は体内の様々な組織や臓器に広く発現しているため、臨床使用中に発熱、疲労、筋肉痛、肝毒性、骨髄抑制、神経毒性などの毒性副作用を伴うことが多い。大量の臨床研究データによると、黒色腫の補助療法におけるＰＥＧ－ＩＦＮα（６μｇ／ｋｇ／週を８週間投与、３μｇ／ｋｇ／週を維持）は、６０％以上の患者にグレード３以上の重篤な有害事象（ＳＡＥ）を引き起こす可能性があり（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ａ－２ｂ Ｓｉｄｅ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ ２００８；１１２：９８２－９４）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の治療におけるＰＥＧ－ＩＦＮαの臨床最大耐量（ＭＴＤ）は７．５～９μｇ／ｋｇであり（Ｌｏｎｇ－Ｔｅｒｍ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ Ｐｈａｓｅ ＩＩＩ Ｔｒｉａｌ ＥＯＲＴＣ １８９９１ ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｗｉｔｈ Ｐｅｇｙｌａｔｅｄ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ａｌｆａ－２ｂ Ｖｅｒｓｕｓ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ Ｒｅｓｅｃｔｅｄ Ｓｔａｇｅ ＩＩＩ Ｍｅｌａｎｏｍａ．ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＯＮＣＯＬＯＧＹ，ＶＯＬＵＭＥ ３０，ＮＵＭＢＥＲ ３１，ＮＯＶＥＭＢＥＲ １ ２０１２）、前臨床インビボ及びインビトロ有効性試験データによると、最適な腫瘍抑制用量は臨床最大耐量の少なくとも１００倍である必要がある（Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ｗｉｔｈ ＰＥＧ Ｉｎｔｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｐｒｏｆｉｌｅ ａｎｄ Ｄｏｓｉｎｇ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ａｎ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－Ａｌｐｈａ－２ｂ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．ＴＡＬＰＡＺ ｅｔ ａｌ ＢＬＯＯＤ，１５ ＳＥＰＴＥＭＢＥＲ ２００１．ＶＯＬＵＭＥ ９８，ＮＵＭＢＥＲ ６）。
【0005】
更に、インターフェロンは、一般に、その製品特性から凍結融解安定性が低く、例えば、組換えヒトアルブミンインターフェロン－α２ｂ融合タンパク質（ｒＨＳＡ－ＩＦＮ－α２ｂ）は、凍結融解を繰り返すとポリマーが徐々に増加し、４回凍結融解するとポリマーの含有量が１７．９１％に達し、組換えヒトアルブミンインターフェロン－α２ｂ融合タンパク質は凍結融解に適していない（Ｘｉａ Ｙｉら，Ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ－ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ａｌｐｈａ－２ｂ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ，２００８，２５（００６）：３８－４０）ため、生産、輸送及び使用には多くの制限がある。
【0006】
従って、人体が耐容できることを前提に、ＩＦＮαの治療用量を有意に増加させ、抗腫瘍、抗ウイルス、肝疾患の治療などの効果を向上させることができる、高効率かつ低毒性の抗体－サイトカイン融合タンパク質（すなわち、二重特異性組換えタンパク質）の発明が急務である。同時に、当該二重特異性組換え蛋白質は、インターフェロンよりも優れた凍結融解安定性を備えている。
【0007】
［発明の概要］
本発明が解決しようとする技術的課題は、先行技術におけるモノクローナル抗体の有効性の低さ、並びにインターフェロンαの安全性及び凍結融解安定性の欠如を克服するために、二重特異性組換えタンパク質及びその使用を提供することである。本発明の二重特異性組換えタンパク質は、指向性免疫調節効果を有し、組換えタンパク質の標的へのターゲティングを有意に改善することができ、調製プロセス中に生成した、非標的臓器、組織及び細胞を標的とする非標的タンパク質によって引き起こされる毒性副作用を有意に低減することもできる。
本発明が解決しようとする技術的課題は、先行技術におけるモノクローナル抗体の有効性の低さ、並びにインターフェロンαの安全性及び凍結融解安定性の欠如を克服するために、二重特異性組換えタンパク質及びその使用を提供することである。本発明の二重特異性組換えタンパク質は、指向性免疫調節効果を有し、組換えタンパク質の標的へのターゲティングを有意に改善することができ、調製プロセス中に生成した、非標的臓器、組織及び細胞を標的とする非標的タンパク質によって引き起こされる毒性副作用を有意に低減することもできる。
【0008】
本発明は、以下の技術的解決策によって上記の技術的課題を解決する。
【0009】
本発明の第１態様は、二重特異性組換えタンパク質を提供し、前記二重特異性組換えタンパク質は、第１機能結合領域、第２機能結合領域及びＦｃ領域を含み、前記第１機能結合領域は、第１鎖及び第２鎖を含み、前記第１鎖のＣ末端及び前記第２機能結合領域のＣ末端は、別々に、Ｆｃ領域のＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、前記第２鎖のＣ末端は、第２機能結合領域のＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、
前記第１機能結合領域は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、
前記第２機能結合領域は、インターフェロン、そのトランケート型変異体、又はその突然変異体を含む。
前記第１機能結合領域は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、
前記第２機能結合領域は、インターフェロン、そのトランケート型変異体、又はその突然変異体を含む。
【0010】
本発明のいくつかの実施形態では、前記ＣＬ又はＣＨ１のＣ末端は、前記Ｆｃ領域のＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、対応するＣＨ１又はＣＬのＣ末端は、第２機能結合領域のＮ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結される。
【0011】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１鎖は、ＶＨとＣＨ１、ＶＨとＣＬ、ＶＬとＣＨ１、又はＶＬとＣＬを含み、前記第２鎖は、ＶＨとＣＨ１、ＶＨとＣＬ、ＶＬとＣＨ１、又はＶＬとＣＬを含む。前記第１鎖と第２鎖は異なり、第１鎖と第２鎖の組み合わせは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬという４つの要素を含む。例えば、前記第１鎖がＶＨとＣＨ１を含む場合、第２鎖はＶＬとＣＬを含み、前記第１鎖がＶＨとＣＬを含む場合、第２鎖はＶＬとＣＨ１を含む。
【0012】
本発明のいくつかの実施形態では、前記インターフェロンは、ＩＦＮαなどのＩ型インターフェロンである。
【0013】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記ＩＦＮαは、ＩＦＮ－α１ａ、ＩＦＮ－α１ｂ、ＩＦＮ－α２ａ、ＩＦＮ－α２ｂ、ＩＦＮ－α４ａ、ＩＦＮ－α４ｂ、ＩＦＮ－α５、ＩＦＮ－α６、ＩＦＮ－α７、ＩＦＮ－α８、ＩＦＮ－α１０、ＩＦＮ－α１４、ＩＦＮ－α１６、ＩＦＮ－α１７及びＩＦＮ－α２１のうちの１つ又は複数から選択される。
【0014】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、前記インターフェロンはＩＦＮ－α２ｂである。
【0015】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第２機能結合領域は、以下のａ１）～ａ２）のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む：ａ１）配列番号１７；ａ２）配列番号１７に示されるアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、修飾及び／又は置換によって得られるアミノ酸配列であって、そのモノマーがＩＦＮα受容体に対する結合親和性を有し、当該結合親和性がＩＦＮα受容体に対するａ１）モノマーの結合親和性以下である。
【0016】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ａ２）モノマーのアミノ酸配列は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列の対応する部位における置換によって得られるアミノ酸配列であり、対応する部位における前記置換は、Ｌ２６Ａ、Ｌ３０Ａ、Ａ１４５Ｇ、Ｒ１４９Ａ及びＳ１５２Ａのうちの１つ又は複数から選択される。
【0017】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、前記ａ２）モノマーは、単一部位における置換であり、置換部位は、それぞれＬ２６Ａ、Ｌ３０Ａ、Ａ１４５Ｇ、Ｒ１４９Ａ又はＳ１５２Ａであり、対応するアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８～２２に示される通りである。
【0018】
本発明のいくつかの実施形態では、前記ＶＨは、ＣＨ１又はＣＬに直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、前記ＶＬは、ＣＬ又はＣＨ１に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結される。
【0019】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、ＶＬがＣＬに連結される場合、ＶＨはＣＨ１に連結され、ＶＬがＣＨ１に連結される場合、ＶＨはＣＬに連結される。
【0020】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１機能結合領域は、腫瘍細胞又は免疫細胞を標的とする。
【0021】
具体的には、前記第１機能結合領域は、標的ＧＰＣ３、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、Ｔｒｏｐ－２、５Ｔ４、ＡＧＳ－１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ－２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ｃ－ｆｍｓ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ－４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ－α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＣＡＭ－１、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＬＩＶ－１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ－１、ＣＳＦ－１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＣＤ１３８、Ｓｉｇｌｅｃ１５及びＣＤ１５５のうちのいずれか１つ又は複数を標的とする。
【0022】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１機能結合領域は、ＧＰＣ３を標的とし、前記第１機能結合領域は、特異的抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含む。
【0023】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、前記特異的抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の配列は配列番号１に示される通りであり、軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列は配列番号２に示される通りである。
【0024】
本発明の他の実施形態では、前記第１機能結合領域は、ＰＤ－Ｌ１を標的とし、前記第１機能結合領域は、特異的抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含む。
【0025】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、前記特異的抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の配列は配列番号５に示される通りであり、軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列は配列番号６に示される通りである。
【0026】
本発明の他の実施形態では、前記第１機能結合領域は、ＢＣＭＡを標的とし、前記第１機能結合領域は、特異的抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含む。
【0027】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、前記特異的抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の配列は配列番号７又は配列番号９に示される通りであり、軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列は配列番号８又は配列番号１０に示される通りである。
【0028】
本発明の他の実施形態では、前記第１機能結合領域は、Ｔｒｏｐ－２を標的とし、前記第１機能結合領域は、特異的抗Ｔｒｏｐ－２モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含む。
【0029】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、前記特異的抗Ｔｒｏｐ－２モノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）の配列は配列番号１１に示される通りであり、軽鎖可変領域（ＶＬ）の配列は配列番号１２に示される通りである。
【0030】
本発明のいくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、２０個アミノ酸残基以下の長さを有し、前記リンカー配列は、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（Ｇ）ｎ、（ＧＳ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ又は（ＸＰ）ｎから選択され、ｎは自然数であり、例えば、前記リンカー配列のアミノ酸配列は、配列番号１３～１６に示される通りである。
【0031】
本発明のいくつかの実施形態では、前記二重特異性組換えタンパク質は、Ａ鎖及びＢ鎖から構成され、ここで、Ａ鎖の構造はＶＨ－ＣＨ１－ＦｃＡ領域であり、Ｂ鎖の構造はＶＬ－ＣＬ－第２機能結合領域－ＦｃＢ領域である。
【0032】
本発明の他の実施形態では、Ａ鎖の構造はＶＨ－ＣＬ－ＦｃＡ領域であり、Ｂ鎖の構造はＶＬ－ＣＨ１－第２機能結合領域－ＦｃＢ領域である。
【0033】
本発明の他の実施形態では、Ａ鎖の構造はＶＬ－ＣＨ１－ＦｃＡ領域であり、Ｂ鎖の構造はＶＨ－ＣＬ－第２機能結合領域－ＦｃＢ領域である。
【0034】
本発明の他の実施形態では、Ａ鎖の構造はＶＬ－ＣＬ－ＦｃＡ領域であり、Ｂ鎖の構造はＶＨ－ＣＨ１－第２機能結合領域－ＦｃＢ領域である。
【0035】
本発明において、前記Ａ鎖及びＢ鎖は、分子間力、共有結合及びイオン結合からなる群から選択される１つ又は複数によって結合される。
【0036】
本発明の第２態様は、二重特異性組換えタンパク質を提供し、前記二重特異性組換えタンパク質は、第１機能結合領域、第２機能結合領域及びＦｃ領域を含み、前記第１機能結合領域は、重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、前記第２機能結合領域は、インターフェロン、そのトランケート型変異体、又はその突然変異体を含み、前記二重特異性組換えタンパク質は、第１アーム及び第２アームから構成され、前記第１アームは、鎖１及び鎖２から構成され、ここで、前記鎖１の構造はＶＨ－ＣＨ１－ＦｃＡ領域であり、前記鎖２の構造はＶＬ－ＣＬであり、又は、前記鎖１の構造はＶＨ－ＣＬ－ＦｃＡ領域であり、前記鎖２の構造はＶＬ－ＣＨ１であり、又は、前記鎖１の構造はＶＬ－ＣＨ１－ＦｃＡ領域であり、前記鎖２の構造はＶＨ－ＣＬであり、又は、前記鎖１の構造はＶＬ－ＣＬ－ＦｃＡ領域であり、前記鎖２の構造はＶＨ－ＣＨ１であり、前記第２アームの構造は第２機能結合領域－ＦｃＢ領域であり、前記ＦｃＡ領域及びＦｃＢ領域は、前記二重特異性組換えタンパク質のＦｃ領域を構成し、前記第２アームにおいて、第２機能結合領域のアミノ酸配列は、配列番号１７～２２のいずれか１つを含み、
前記第１機能結合領域がＧＰＣ３を標的とする場合、前記第１機能結合領域は、特異的抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含み、前記第１機能結合領域がＰＤ－Ｌ１を標的とする場合、前記第１機能結合領域は、特異的抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含み、前記第１機能結合領域がＢＣＭＡを標的とする場合、前記第１機能結合領域は、特異的抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含み、前記第１機能結合領域がＴｒｏｐ－２を標的とする場合、前記第１機能結合領域は、特異的抗Ｔｒｏｐ－２モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含む。
前記第１機能結合領域がＧＰＣ３を標的とする場合、前記第１機能結合領域は、特異的抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含み、前記第１機能結合領域がＰＤ－Ｌ１を標的とする場合、前記第１機能結合領域は、特異的抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含み、前記第１機能結合領域がＢＣＭＡを標的とする場合、前記第１機能結合領域は、特異的抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含み、前記第１機能結合領域がＴｒｏｐ－２を標的とする場合、前記第１機能結合領域は、特異的抗Ｔｒｏｐ－２モノクローナル抗体の抗原結合フラグメントを含む。
【0037】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１機能結合領域がＧＰＣ３を標的とする場合、前記第１アームにおいて、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含む。
【0038】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１機能結合領域がＰＤ－Ｌ１を標的とする場合、前記第１アームにおいて、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含む。
【0039】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１機能結合領域がＢＣＭＡを標的とする場合、前記第１アームにおいて、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号７又は９を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号８又は１０を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含む。
【0040】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１機能結合領域がＴｒｏｐ－２を標的とする場合、前記第１アームにおいて、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１１を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１２を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含む。
【0041】
本発明において、前記二重特異性組換えタンパク質のＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４由来のＦｃ領域であり、前記Ｆｃ領域は、天然配列又は非天然配列を含む。
【0042】
本発明のいくつかの実施形態では、前記Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４由来のＦｃ領域である。
【0043】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記ＦｃＡ領域及びＦｃＢ領域は、ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓによって結合される。
【0044】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２５を含む場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２５を含む。
【0045】
本発明の他の特定の実施形態では、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６を含む場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７を含む。
【0046】
本発明の他の特定の実施形態では、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７を含む場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６を含む。
【0047】
本発明の他の特定の実施形態では、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２８を含む場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２８を含む。
【0048】
本発明の他の特定の実施形態では、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２９を含む場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号３０を含む。
【0049】
本発明の他の特定の実施形態では、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号３０を含む場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２９を含む。
【0050】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１機能結合領域はＧＰＣ３を標的とし、前記Ａ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、ＦｃＡ領域のアミノ酸配列は配列番号２６又は配列番号２７を含み、
前記Ｂ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、第２機能結合領域のアミノ酸配列は配列番号１７、１８、１９、２１又は２２を含み、ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７又は配列番号２６を含む。
前記Ｂ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号２を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、第２機能結合領域のアミノ酸配列は配列番号１７、１８、１９、２１又は２２を含み、ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７又は配列番号２６を含む。
【0051】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列において、配列番号２又は配列番号１のＣ末端は、配列番号３２のＮ末端に直接に連結され、配列番号３２のＣ末端は、リンカー配列によって配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１又は配列番号２２のＮ末端に連結され、前記リンカー配列は、配列番号１３～１６のいずれか１つから選択される。
【0052】
本発明のいくつかの実施形態では、前記Ａ鎖のアミノ酸配列が順次連結した配列番号１、３１及びＦｃＡ領域から構成される場合、
前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１６、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１６、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１６、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１６、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１６、２２及びＦｃＢ領域から構成される。
前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１３、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１４、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１５、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１６、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１６、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１６、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１６、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２、３２、１６、２２及びＦｃＢ領域から構成される。
【0053】
上記の実施形態では、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７である。前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６である。
【0054】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１機能結合領域はＰＤ－Ｌ１を標的とし、前記Ａ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、ＦｃＡ領域のアミノ酸配列は配列番号２６又は配列番号２７又は配列番号２９又は配列番号３０を含み、
前記Ｂ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、第２機能結合領域のアミノ酸配列は配列番号１７～２２のいずれか１つを含み、ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７又は配列番号２６又は配列番号３０又は配列番号２９を含む。
前記Ｂ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号５を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号６を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、第２機能結合領域のアミノ酸配列は配列番号１７～２２のいずれか１つを含み、ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７又は配列番号２６又は配列番号３０又は配列番号２９を含む。
【0055】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列において、配列番号６又は配列番号５のＣ末端は、配列番号３２のＮ末端に直接に連結され、配列番号３２のＣ末端は、リンカー配列によって配列番号１７～２２のいずれか１つのＮ末端に連結され、前記リンカー配列は、配列番号１３～１６のいずれか１つから選択される。
【0056】
本発明のいくつかの実施形態では、前記Ａ鎖のアミノ酸配列が順次連結した配列番号５、３１及びＦｃＡ領域から構成される場合、
前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、２２及びＦｃＢ領域から構成される。
前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１３、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１４、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１５、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６、３２、１６、２２及びＦｃＢ領域から構成される。
【0057】
上記の実施形態では、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７である。前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６である。前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２９である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号３０である。前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号３０である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２９である。
【0058】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１機能結合領域はＢＣＭＡを標的とする。
【0059】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、前記Ａ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号７又は９を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号８又は１０を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、ＦｃＡ領域のアミノ酸配列は配列番号２６又は配列番号２７を含み、
前記Ｂ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号７又は９を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号８又は１０を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、第２機能結合領域のアミノ酸配列は配列番号１７～２２のいずれか１つを含み、ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７又は配列番号２６を含む。
前記Ｂ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号７又は９を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号８又は１０を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、第２機能結合領域のアミノ酸配列は配列番号１７～２２のいずれか１つを含み、ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７又は配列番号２６を含む。
【0060】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列において、配列番号７、８、９又は１０のＣ末端は、配列番号３２のＮ末端に直接に連結され、配列番号３２のＣ末端は、リンカー配列によって配列番号１７～２２のいずれか１つのＮ末端に連結され、前記リンカー配列は、配列番号１３～１６のいずれか１つから選択される。
【0061】
本発明のいくつかの実施形態では、前記Ａ鎖のアミノ酸配列が順次連結した配列番号７、３１及びＦｃＡ領域から構成される場合、
前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、２２及びＦｃＢ領域から構成される。
前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１３、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１４、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１５、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８、３２、１６、２２及びＦｃＢ領域から構成される。
【0062】
本発明の他の実施形態では、前記Ａ鎖のアミノ酸配列が順次連結した配列番号９、３１及びＦｃＡ領域から構成される場合、
前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、２２及びＦｃＢ領域から構成される。
前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１３、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１４、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１５、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０、３２、１６、２２及びＦｃＢ領域から構成される。
【0063】
上記の実施形態では、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７である。前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６である。
【0064】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１機能結合領域はＴｒｏｐ－２を標的とし、前記Ａ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１２を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、ＦｃＡ領域のアミノ酸配列は配列番号２６又は配列番号２７を含み、
前記Ｂ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１２を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、第２機能結合領域のアミノ酸配列は配列番号１７～２２のいずれか１つを含み、ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７又は配列番号２６を含む。
前記Ｂ鎖において、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号１１を含み、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１２を含み、ＣＨ１のアミノ酸配列は配列番号３１を含み、ＣＬのアミノ酸配列は配列番号３２を含み、第２機能結合領域のアミノ酸配列は配列番号１７～２２のいずれか１つを含み、ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７又は配列番号２６を含む。
【0065】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列において、配列番号１２又は配列番号１１のＣ末端は、配列番号３２のＮ末端に直接に連結され、配列番号３２のＣ末端は、リンカー配列によって配列番号１７～２２のいずれか１つのＮ末端に連結され、前記リンカー配列は、配列番号１３～１６のいずれか１つから選択される。
【0066】
本発明のいくつかの実施形態では、前記Ａ鎖のアミノ酸配列が順次連結した配列番号１１、３１及びＦｃＡ領域から構成される場合、
前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、２２及びＦｃＢ領域から構成される。
前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１３、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１４、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１５、２２及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、１７及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、１８及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、１９及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、２０及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、２１及びＦｃＢ領域から構成され、
又は、前記Ｂ鎖のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２、３２、１６、２２及びＦｃＢ領域から構成される。
【0067】
上記の実施形態では、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７である。前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７である場合、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６である。
【0068】
本発明のいくつかの実施形態では、前記第１機能結合領域がＧＰＣ３を標的とする場合、前記第１アームにおける鎖１のアミノ酸配列が順次連結した配列番号１、３１及びＦｃＡ領域から構成されると、前記第１アームにおける鎖２のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号２及び３２から構成され、前記第２アームのアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１７～２２のいずれか１つ及びＦｃＢ領域から構成され、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６であると、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７であると、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６である。
【0069】
本発明の他の実施形態では、前記第１機能結合領域がＰＤ－Ｌ１を標的とする場合、前記第１アームにおける鎖１のアミノ酸配列が順次連結した配列番号５、３１及びＦｃＡ領域から構成されると、前記第１アームにおける鎖２のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号６及び３２から構成され、前記第２アームのアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１７～２２のいずれか１つ及びＦｃＢ領域から構成され、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６であると、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７であると、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２９であると、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号３０であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号３０であると、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２９である。
【0070】
本発明の他の実施形態では、前記第１機能結合領域がＢＣＭＡを標的とする場合、前記第１アームにおける鎖１のアミノ酸配列が順次連結した配列番号７、３１及びＦｃＡ領域から構成されると、前記第１アームにおける鎖２のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号８及び３２から構成され、又は、前記第１アームにおける鎖１のアミノ酸配列が順次連結した配列番号９、３１及びＦｃＡ領域から構成されると、前記第１アームにおける鎖２のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１０及び３２から構成され、前記第２アームのアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１７～２２のいずれか１つ及びＦｃＢ領域から構成され、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６であると、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７であると、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６である。
【0071】
本発明の他の実施形態では、前記第１機能結合領域がＴｒｏｐ－２を標的とする場合、前記第１アームにおける鎖１のアミノ酸配列が順次連結した配列番号１１、３１及びＦｃＡ領域から構成されると、前記第１アームにおける鎖２のアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１２及び３２から構成され、前記第２アームのアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１７～２２のいずれか１つ及びＦｃＢ領域から構成され、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２６であると、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２７であり、又は、前記ＦｃＡ領域のアミノ酸配列が配列番号２７であると、前記ＦｃＢ領域のアミノ酸配列は配列番号２６である。
【0072】
本発明の第３態様は、第１又は第２態様に記載の二重特異性組換えタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【0073】
本発明の第４態様は、第３態様に記載の核酸分子を含む組換え発現ベクターを提供する。
【0074】
本発明の第５態様は、第４態様に記載の発現ベクターによって宿主細胞を形質転換することによって得られる組換え細胞を提供する。
【0075】
本発明の第６態様は、第５態様に記載の組換え細胞を使用して前記二重特異性組換えタンパク質を発現させる工程を含む第１又は第２態様に記載の二重特異性組換えタンパク質を調製する方法を提供する。
【0076】
本発明の第７態様は、第１又は第２態様に記載の二重特異性組換えタンパク質を含む薬剤又は医薬組成物を提供する。
【0077】
本発明のいくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、薬学的に許容される担体を更に含む。
【0078】
本発明の第８態様は、疾患の治療、補助療法又は予防のための薬剤の調製における、第１又は第２態様に記載の二重特異性組換えタンパク質、又は第７態様に記載の薬剤又は医薬組成物の使用を提供する。
【0079】
本発明のいくつかの実施形態では、前記疾患は、腫瘍、肝疾患及びウイルス感染症から選択される。
【0080】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、前記疾患は、ＧＰＣ３、ＢＣＭＡ、ＰＤ－Ｌ１、Ｔｒｏｐ－２、５Ｔ４、ＡＧＳ－１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ－２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ｃ－ｆｍｓ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ－４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ－α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＣＡＭ－１、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＬＩＶ－１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ－１、ＣＳＦ－１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＣＤ１３８、Ｓｉｇｌｅｃ１５又はＣＤ１５５陽性関連疾患である。
【0081】
本発明のいくつかの実施形態では、前記腫瘍は、乳癌、腸癌、膵臓癌、食道癌、卵巣癌、胃癌、前立腺癌、腎臓癌、子宮頸癌、骨髄腫、リンパ腫、白血病、甲状腺癌、子宮癌、膀胱癌、神経内分泌癌、頭頸部癌、肝臓癌、上咽頭癌、精巣癌、肺癌、黒色腫、皮膚癌、肉腫、神経膠腫、中皮腫及び骨髄異形成症候群から選択される。
【0082】
本発明のいくつかの特定の実施形態では、前記腸癌は結腸直腸癌を含み、前記卵巣癌は卵黄嚢腫瘍を含み、前記神経内分泌癌はメルケル細胞癌を含み、前記肺癌は小細胞肺癌及び非小細胞肺癌を含み、前記皮膚癌は基底細胞癌及び扁平上皮癌を含み、前記肉腫は隆起性皮膚線維肉腫を含み、前記神経膠腫は神経膠芽腫を含み、前記子宮癌は子宮内膜癌及び子宮肉腫を含む。
【0083】
本明細書において、「組換えタンパク質」という用語は、天然に存在するタンパク質ではなく、人工的に設計／構築されたタンパク質を指す。本発明の「組換えタンパク質」における「組換え」は、その製造方法を表すものではなく、「組換えタンパク質」が天然に存在しないことを示すためにのみ使用される。本発明の組換えタンパク質は、発現されたタンパク質又は組み立てられたタンパク質であり得る。
【0084】
本明細書において、「抗体」という用語は、一般に、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子断片によって本質的にコードされる１つ又は複数のポリペプチドを含むタンパク質を指す。免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε及びμ定常領域遺伝子のほか、多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。本明細書において、軽鎖はκ又はλに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ又はεに分類され、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥという免疫グロブリンを定義する。本出願における抗体は、四量体からなる構造単位を有することができる。各四量体は２対の同一のポリペプチド鎖から構成され、各対は１つの「軽鎖」（約２５ｋＤ）及び１つの「重鎖」（約５０～７０ｋＤ）を有する。各メンバーのＮ末端は、主に抗原認識に関与する約１００～１１０個以上のアミノ酸からなる可変領域を定義することができる。本明細書において、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖可変領域（ＶＨ）という用語は、一般に、それぞれ軽鎖及び重鎖のこれらの領域を指す。抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼによる消化やデノボ発現によって生成される多くの完全に特徴付けられた断片として存在することができる（その他の抗体断片に関するより詳細な説明は、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照）。
【0085】
本明細書において、「第１機能抗原」又は「標的抗原」という用語は、第１機能結合領域に結合した抗原を指す。
【0086】
本明細書において、「第２機能抗原」という用語は、第２機能結合領域に結合した抗原を指す。
【0087】
本明細書において、「Ｆｃ領域」（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、Ｆｃ）という用語は、ＩｇＧ定常領域ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、並びにヒンジ領域から構成される。
【0088】
本明細書において、「抗原結合フラグメント」又は「Ｆａｂフラグメント」又は「Ｆａｂ」という用語は、軽鎖可変領域（ＶＬ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域１（ＣＬ１）ドメインから構成され、抗原に結合することができる。
【0089】
本明細書において、「ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ技術」又は「杵臼」技術又は「ノブ・イントゥ・ホール」技術又は「ボタン」技術という用語は、遺伝子工学技術を使用して、重鎖の２つのＣＨ３ドメインに異なる突然変異を導入して、重鎖のヘテロ二量体化を誘導し、一方の重鎖に１つのノブ（ｋｎｏｂ）を作製し、他方の重鎖にホール（ｈｏｌｅ）を作製した後、両者を優先的に結合させて非対称抗体を形成する（Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．‘Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ’ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＨ３ ｄｏｍａｉｎｓ ｆｏｒ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９６，９（７）：６１７－６２１）。当業者に知られているように、一方の重鎖に複数のノブ（ｋｎｏｂ）及び／又はホール（ｈｏｌｅ）を作製することができ、それに対応して、他方の重鎖に複数のホール（ｈｏｌｅ）及び／又はノブ（ｋｎｏｂ）を作製することができる。
【0090】
「抗原特異性」という用語は、抗原結合分子が特定の抗原又はそのエピトープを選択的に認識することを指す。
【0091】
本明細書において、アミノ酸残基に適用される場合、「置換」又は「変換」又は「突然変異」という用語は、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質において、天然に存在するか又は導入された１つ又は複数のアミノ酸を別のアミノ酸で置換して、新規なペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を形成することを指す（例えば、本明細書における「突然変異体」又は「突然変異型」という用語）。ポリペプチド又はタンパク質における置換は、ポリペプチド又はタンパク質の機能の低下又は不変をもたらす可能性がある。置換は「保存的置換」であってもよく、アミノ酸配列の文脈では、１つのアミノ酸残基を物理化学的特性が類似した別の側鎖の異なるアミノ酸残基で置換することを指し、又はポリペプチドの活性にとって重要ではないアミノ酸を置換することを指す。例えば、非極性側鎖アミノ酸残基間（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ及びＴｒｐ）、非荷電極性側鎖残基間（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ及びＧｌｎ）、酸性側鎖残基間（例えば、Ａｓｐ及びＧｌｕ）、塩基性側鎖アミノ酸間（例えば、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＡｒｇ）、β分岐側鎖アミノ酸間（例えば、Ｔｈｒ、Ｖａｌ及びＩｌｅ）、硫黄含有側鎖アミノ酸間（例えば、Ｃｙｓ及びＭｅｔ）、又は芳香族側鎖残基間（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ及びＰｈｅ）で保存的置換を実行することができる。いくつかの実施形態では、置換、欠失又は付加も「保存的置換」と見なすことができる。挿入又は欠失されるアミノ酸の数は、約１～５の範囲であり得る。保存的置換は、一般に、タンパク質の立体構造に大きな変化を引き起こさないため、タンパク質の生物学的活性を維持することができる。
【0092】
本明細書において、「二重陽性発現細胞」又は「標的細胞」又は「ターゲット細胞」という用語は、第１機能結合領域及び第２機能結合領域の両方と相互作用することができる細胞を指す。
【0093】
本明細書において、「第２機能抗原単一陽性細胞」又は「非標的細胞」又は「非ターゲット細胞」という用語は、第１機能結合領域と相互作用せず、第２機能結合領域とのみ相互作用する細胞を指す。
【0094】
本明細書において、「インターフェロン」（ＩＦＮ）という用語は、一般に、病原体（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫又は腫瘍細胞）の存在に応答して宿主細胞によって産生／放出されるシグナル伝達タンパク質を指す。インターフェロンには主に３つのタイプ（すなわち、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型）があり、Ｉ型インターフェロンにはＩＦＮα及びＩＦＮβが含まれ、ＩＦＮαにはＩＦＮα２、ＩＦＮα４などのＩＦＮαのサブタイプが含まれる。Ｉ型インターフェロンは、ウイルスの複製を阻害し、抗寄生虫活性を有し、細胞増殖を阻害し、免疫細胞の細胞傷害活性を刺激し、免疫調節に関与し、抗腫瘍効果を示すことができる。ＩＩ型及びＩＩＩ型インターフェロンには、ＩＦＮγ、ＩＦＮλ１（ＩＬ－２９）、ＩＦＮλ２（ＩＬ－２８ａ）及びＩＦＮλ３（ＩＬ－２８ｂ）が含まれる。本明細書において、「インターフェロン」という用語は、全長インターフェロン、又はそのフラグメント（例えば、トランケート型）又は変異体を含み、前記そのフラグメント又は変異体は、対応するインターフェロン受容体に結合し、その細胞増殖阻害生物学的活性を保持することができる。本明細書において、インターフェロンは、任意の哺乳類に由来する。いくつかの実施形態では、インターフェロンは、ヒト、ウマ、ウシ、マウス、ブタ、ウサギ、ネコ、イヌ、ラット、ヤギ、ヒツジ及び非ヒト霊長類からなる群より選択される種に由来する。
【0095】
本明細書において、「ＩＦＮα」又は「インターフェロンα」という用語は、すべての天然型又は組換えインターフェロンαを含み、特に好ましくは、ＩＦＮ－α ２ｂ（例えば、Ｉｎｔｒｏｎ（登録商標）Ａインターフェロン又はＶｉｒａｆｅｒｏｎ（登録商標）－Ａインターフェロン、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ社（ニュージャージー州ケニルワース）から入手可能）又はＩＦＮ－α ２ａ（例えば、Ｒｏｆｅｒｏｎ（登録商標）－Ａインターフェロン、Ｈｏｆｆｍａｎｎ－Ｌａ Ｒｏｃｈｅ（ニュージャージー州ナトリー）から入手可能）を含むがこれらに限定されない組換えヒトインターフェロンαなどのヒトインターフェロンαであり、別の例として、ＩＦＮ－α－ｎ１（例えば、Ｗｅｌｌｆｅｒｏｎ（登録商標）インターフェロンα－ｎ１、住友（日本）又はＧｌａｘｏ－Ｗｅｌｌｃｏｍｅ社（英国ロンドン）から入手可能）又はＩＦＮ－α－ｎ３（例えば、Ａｌｆｅｒｏｎ Ｎ（登録商標）インターフェロン、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能）を含むがこれらに限定されない天然型インターフェロンαの混合物である。本発明において、「ＩＦＮα」又は「インターフェロンα」という用語は、ＩＦＮαのＰＥＧ誘導体（ＰＥＧ－ＩＦＮα）などの突然変異又は修飾されたＩＦＮαなど、ＩＦＮαの生物学的活性を有する任意の物質も含む。本発明において、「ＩＦＮα」又は「インターフェロンα」という用語は、いかなる特定の入手源にも限定されず、商業的供給源から入手するか又は当業者に公知の従来の技術によって製造することができ、当該製造方法は、例えば、「Ｐｅｓｔｋａ Ｓ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９８３ Ｆｅｂ １５；２２１（１）：１－３７」に詳細に記載されている、生物源抽出法及び遺伝子工学的抽出法を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＦＮαは、ヒト、ウマ、ウシ、マウス、ブタ、ウサギ、ネコ、イヌ、ラット、ヤギ、ヒツジ及び非ヒト霊長類からなる群より選択される種に由来する。
【0096】
本明細書において、「ＩＦＮα２ｂ」又は「ＩＦＮ－α２ｂ」又は「ＩＦＮ－α ２ｂ」又は「インターフェロン－α ２ｂ」という用語は、ＩＦＮ－αのサブタイプであり、いずれもインターフェロン－α ２ｂを指す。シグナルペプチド含有ヒト野生型インターフェロン－α ２ｂのアミノ酸配列は、配列番号１５に示される通りである。
【0097】
本明細書において、「低親和性突然変異体」という用語は、野生型ＩＦＮαと比較して、増殖阻害活性又は抗ウイルス機能活性が変化しないか又は低下しているＩＦＮα突然変異体を指す。
【0098】
本明細書において、「リンカー配列」又は「Ｌｉｎｋｅｒ」という用語は、異なる機能結合フラグメント（例えば、第１機能結合領域及び第２機能結合領域、第１機能結合領域又は第２機能結合領域及びＦｃ領域）を連結するか又は同じ機能結合フラグメント内の異なるドメインを連結するアミノ酸配列を指す。
【0099】
本明細書において、「ＧＣ３３」、「Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ」、「抗ＧＰＣ３ ｍＡｂ」という用語は、本発明において交互に使用することができ、抗ＧＰＣ３抗体Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂを指す。
【0100】
本明細書において、「アテゾリズマブ」、「Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ」、「抗ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ」という用語は、本発明において交互に使用することができ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂを指す。
【0101】
本明細書において、「宿主細胞」という用語は、一般に、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含むか、又は本出願のタンパク質ヘテロ二量体（例えば、ヘテロ二量体タンパク質）を発現する、対象のプラスミド又はベクターのレシピエントであり得るか、又はレシピエントであった、単一の細胞、細胞株又は細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含むことができる。自然、偶発的又は意図的突然変異により、子孫は必ずしも元の親細胞と同一（形態学的にも総ゲノムＤＮＡ相補的にも）であるとは限らない。宿主細胞は、本明細書に開示されるベクターでインビトロでトランスフェクトされた細胞を含むことができる。宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、酵母細胞、又はＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞又は骨髄腫細胞などの他の真核細胞であり得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。
【0102】
本明細書において、「ベクター」という用語は、一般に、挿入された核酸分子を宿主細胞へ、及び／又は宿主細胞間で伝達する、適切な宿主内で自己複製可能な核酸分子を指す。当該用語は、主に細胞へのＤＮＡ又はＲＮＡの挿入に使用されるベクター、主にＤＮＡ又はＲＮＡの複製に使用されるベクター、及びＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳に使用される発現ベクターを含むことができる。また、上記の機能の複数を提供するベクターも含まれる。「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞に導入されたときに転写され、ポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現系」とは、一般に、所望の発現量を生成することができる発現ベクターを含む適切な宿主細胞を意味する。
【0103】
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、意図される使用（疾患治療を含むが、これに限定されない）を達成するのに十分な組成物（例えば、本明細書に記載の二重特異性組換えタンパク質）の量を指す。治療有効量は、意図される使用（例えば、インビトロ又はインビボ）、又は治療対象となる被験者及び病状（例えば、被験者の体重及び年齢、病状の重篤度、投与方法など）に応じて変化することができ、当業者によって容易に決定され得る。当該用語は、標的細胞において特定の応答（例えば、標的遺伝子の誘導、増殖及び／又はアポトーシス）を誘導する用量にも適用され得る。具体的な用量は、選択する特定の化合物、投与計画、他の化合物との併用投与、投与のタイミング、投与する組織、及び投与する物理的送達システムによって異なる。
【0104】
「治療」又は「治癒」又は「緩和」又は「改善」という用語は、本明細書において交互に使用することができ、有益な又は所望の結果（治療上の有益性及び／又は予防上の有益性を含むが、これらに限定されない）を得る方法を指す。本明細書において、治療上の有益性とは、一般に、治療対象となる基礎疾患の重篤度の根絶又は軽減を指す。更に、被験者において改善が観察されるように（被験者は依然として基礎疾患に罹患している可能性がある）、重篤度の根絶又は軽減、又は基礎疾患に関連する１つ又は複数の生理学的症状の発生率の低下によって治療上の有益性を達成する。予防上の有益性のために、特定の疾患を発症する危険性がある被験体、又は疾患の診断がなされていなくても、疾患の１つ又は複数の生理学的症状を報告する被験体に、組成物を投与することができる。
【0105】
本明細書において、「治療効果」という用語は、一般に、上記の治療上の有益性及び／又は予防上の有益性を含む。予防効果には、疾患又は病態の発症を遅延又は排除すること、疾患又は病態の症状の発症を遅延又は排除すること、疾患又は病態の進行を遅延、停止又は逆転させること、又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【0106】
本明細書において、「共投与」、「併用投与」という用語、及びそれらの文法的等価物は、一般に、試薬及び／又はそれらの代謝産物が被験体中に同時に存在するように、２つ以上の試薬を動物に投与することを含む。共投与は、別々の組成物での同時投与、別々の組成物で異なる時間での投与、又は両方の試薬が存在する組成物での投与を含む。
【0107】
本明細書において、「細胞増殖」という用語は、一般に、分裂によって細胞数が変化する現象を指す。例えば、細胞増殖は、細胞数の増加をもたらす可能性がある。当該用語には、増殖シグナルと一致する、細胞形態が変化した（例えば、サイズの増加）細胞成長も含まれる。
【0108】
本明細書において、「増殖阻害」又は「細胞増殖の阻害」という用語は、一般に、癌細胞の成長速度及び／又は増殖速度の低下を指す。例えば、当該用語には、癌細胞の死滅（例えば、アポトーシスによる）が含まれる。いくつかの実施形態では、当該用語はまた、固形腫瘍の成長及び／又は増殖を阻害すること、及び／又は腫瘍のサイズの縮小又は除去を誘導することを指す場合がある。
【0109】
本明細書において、「凍結融解安定性」という用語は、一般に、凍結と融解を交互に受ける場合のエマルション系の安定性を指す。
【0110】
本明細書において、「被験者」又は「個体」又は「動物」又は「患者」という用語は、疾患又は状態の診断、予後、緩和、予防及び／又は治療を必要とする、ヒト又はヒト以外の動物（哺乳類又は霊長類を含む）を指す。哺乳類の被験者には、ヒト、飼育動物、家畜、動物園の動物、運動場の動物又はペット、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ブタ、ウシ、クマなどが含まれる。
【0111】
本明細書において、「インビボ」という用語は、一般に、被験体の体内で起こる事象を指す。
【0112】
本明細書において、「インビトロ」という用語は、一般に、被験体の体外で起こる事象を指す。例えば、インビトロアッセイには、被験体の体外で実施されるあらゆるアッセイが含まれる。インビトロアッセイには、死細胞又は生細胞を使用する細胞ベースのアッセイが含まれる。インビトロアッセイには、無傷の細胞を使用しない無細胞アッセイも含まれる。
【0113】
本明細書において、「投与」という用語は、本発明の組換えタンパク質又は融合タンパク質を含む治療有効量の医薬組成物を被験体に送達することを指す。投与は、全身投与又は局所投与であり得る。投与は、注射器などの投与装置を用いて行うことができる。投与方法は、インプラント、経鼻吸入、噴霧、注射などを含むが、これらに限定されない。投与経路は、吸入、鼻腔内、経口、静脈内、皮下又は筋肉内投与などを含む。
【0114】
先行技術と比較して、本発明は以下の有益な効果を有する：
本発明により提供されるインターフェロン、そのトランケート型変異体、又はその突然変異体を含む、２種類の構造を有する新規な二重特異性組換えタンパク質は、高活性、高安全性及び高凍結融解安定性を有する。
本発明により提供されるインターフェロン、そのトランケート型変異体、又はその突然変異体を含む、２種類の構造を有する新規な二重特異性組換えタンパク質は、高活性、高安全性及び高凍結融解安定性を有する。
【0115】
ＩＦＮα受容体を発現する細胞は、以下の有益な効果を有する：
１、本発明の二重特異性組換えタンパク質は、等モル濃度のＩＦＮαよりも、標的抗原陽性の標的細胞に対する結合活性、ＡＤＣＣ活性及び増殖阻害活性が有意に強く、標的抗原陰性の非標的細胞（例えば、正常細胞）に対する結合活性及び増殖阻害活性が非有意に弱く、一部の実験では、二重特異性組換えタンパク質の非標的細胞に対する増殖阻害活性が陰性であると検出された場合さえある。すなわち、本発明の二重特異性組換えタンパク質が標的抗原を標的とする能力を持たない場合、ＩＦＮα受容体を発現する細胞に対する第２機能結合領域におけるＩＦＮαの活性は有意に低下するか、又は関連する活性が全く見られないことさえある。
１、本発明の二重特異性組換えタンパク質は、等モル濃度のＩＦＮαよりも、標的抗原陽性の標的細胞に対する結合活性、ＡＤＣＣ活性及び増殖阻害活性が有意に強く、標的抗原陰性の非標的細胞（例えば、正常細胞）に対する結合活性及び増殖阻害活性が非有意に弱く、一部の実験では、二重特異性組換えタンパク質の非標的細胞に対する増殖阻害活性が陰性であると検出された場合さえある。すなわち、本発明の二重特異性組換えタンパク質が標的抗原を標的とする能力を持たない場合、ＩＦＮα受容体を発現する細胞に対する第２機能結合領域におけるＩＦＮαの活性は有意に低下するか、又は関連する活性が全く見られないことさえある。
【0116】
２、抗原結合フラグメントにおけるＣＨ１ドメインのＣ末端又はＣＬドメインのＣ末端と第２機能結合領域のＮ末端との間の異なるリンカー配列によって連結された、本発明の第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質は、いずれも標的抗原陽性の標的細胞に対する増殖阻害活性が強く、当該増殖阻害活性（ＩＣ５０）はインターフェロン対照の増殖阻害活性よりも高く、リンカー配列が短い二重特異性組換えタンパク質の活性が比較的に弱いため、リンカー配列の長さを調節することにより、ＩＦＮα受容体を発現する細胞に対する第２機能結合領域の活性を調節することができる。
【0117】
３、野生型ＩＦＮ－α ２ｂを含む二重特異性組換えタンパク質の標的抗原陰性の非標的細胞に対する増殖阻害活性と比較して、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質の標的抗原陽性の標的細胞に対する増殖阻害活性と比較して、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む本発明の二重特異性組換えタンパク質の標的抗原陰性の非標的細胞に対する増殖阻害活性は同程度に低下するか、又は有意に低下する。
【0118】
４、本発明の二重特異性組換えタンパク質の潜在的危険性不純物（Ｂ鎖又は第２アームのホモ二量体）は、標的抗原陰性の非標的細胞に対する増殖阻害活性が極めて弱く、第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質の潜在的危険性不純物は、第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質の潜在的危険性不純物と比較して、標的抗原陰性の非標的細胞に対する増殖阻害活性が弱いため、本発明の二重特異性組換えタンパク質の潜在的危険性不純物がもたらす潜在的安全性リスク又は潜在的毒性副作用は極めて低く、第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質の潜在的危険性不純物がもたらす潜在的安全性リスク又は潜在的毒性副作用は更に低い。
【0119】
５、本発明の二重特異性組換えタンパク質は、良好な凍結融解安定性を有し、凍結融解を５回繰り返した後、純度はいずれも９５％以上であり、外観は透明であり、凍結融解安定性は、ＩＦＮ－α ２ｂモノマー又はＰＥＧ化ＩＦＮ－α ２ｂよりも有意に優れている。
【0120】
６、本発明の二重特異性組換えタンパク質の構造は、拡張性が高く、その第１機能結合領域は、臨床適応の必要に応じて標的抗原を標的とする特異的抗体の抗原結合フラグメントを構築することができるため、従来の抗体医薬品スクリーニングにかかる時間を有意に短縮し、医薬品スクリーニング効率を向上させ、スクリーニングコストを削減することができる。
【0121】
要約すると、本発明に係る二重特異性組換えタンパク質は、標的細胞に対する殺傷効果を有意に向上させると同時に、非標的細胞への結合によって引き起こされる毒性副作用を有意に減少させることができ、より優れた安全性及び良好な凍結融解安定性を有する。以下、本発明の目的、特徴及び効果を十分に理解するために、本発明の概念、具体的な構造及び技術的効果について、添付図面と併せてさらに説明する。
【0122】
［図面の簡単な説明］
［図１］本発明の第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質の構造模式図である。
［図１］本発明の第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質の構造模式図である。
【0123】
［図２］本発明の第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質の構造模式図である。
【0124】
［図３］本発明の第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質のアフィニティーキャプチャー後の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。
【0125】
［図４］本発明の第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質のアフィニティーキャプチャー後の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。
【0126】
［図５］本発明の第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質の精製後の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。
【0127】
［図６］本発明の第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質のカッパ精製後の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。
【0128】
［図７］フローサイトメトリーによって決定された、標的細胞ＨｅｐＧ２肝臓癌細胞に対する本発明の二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）及び対照試料の結合活性を示すグラフである。
【0129】
［図８］フローサイトメトリーによって決定された、標的細胞ＨｕＨ－７に対する本発明の二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）及び対照試料の結合活性を示すヒストグラムである。
【0130】
［図９］フローサイトメトリーによって決定された、標的細胞ＨｅｐＧ２に対する本発明の二重特異性組換えタンパク質（第２種構造）及び対照試料の結合活性を示すグラフである。
【0131】
［図１０］ＬＤＨ法によって決定された、標的細胞ＨｅｐＧ２に対する本発明の二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）のＡＤＣＣ活性を示すグラフである。
【0132】
［図１１］ＬＤＨ法によって決定された、標的細胞ＨｅｐＧ２に対する本発明の二重特異性組換えタンパク質（第２種構造）及び対照試料のＡＤＣＣ活性を示すグラフである。
【0133】
［図１２］標的細胞ＨｕＨ－７に対する、本発明のリンカー配列が異なる二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0134】
［図１３］ＧＰＣ３陽性の標的細胞ＨｕＨ－７に対する、ＧＰＣ３抗原を標的とする機能を有する二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）及び対照試料の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0135】
［図１４］ＰＤ－Ｌ１陽性の標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する本発明の二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0136】
［図１５］抗ＰＤ－Ｌ１抗体閉鎖後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する本発明の二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0137】
［図１６］ＧＰＣ３陽性の標的細胞ＨｕＨ－７に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0138】
［図１７］ＧＰＣ３陰性の非標的細胞ＳＷ４８０に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0139】
［図１８］ＧＰＣ３陰性の非標的細胞Ｕ２６６に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0140】
［図１９］Ｔｒｏｐ－２陽性の標的細胞ＯＶＣＡＲ３に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0141】
［図２０］Ｔｒｏｐ－２陽性の標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0142】
［図２１］Ｔｒｏｐ－２陰性の非標的細胞ＮＣＩ－Ｈ９２９に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0143】
［図２２］ＢＣＭＡ陽性の標的細胞ＮＣＩ－Ｈ９２９に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0144】
［図２３］ＢＣＭＡ陰性の非標的細胞ＨｕＨ－７に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0145】
［図２４］ＢＣＭＡ陰性の非標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0146】
［図２５］ＰＤ－Ｌ１陽性の標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0147】
［図２６］ＰＤ－Ｌ１陰性の標的細胞ＯＶＣＡＲ３に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0148】
［図２７］ＧＰＣ３陽性の標的細胞ＨｕＨ－７に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第２種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0149】
［図２８］ＧＰＣ３陰性の非標的細胞ＳＷ４８０に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第２種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0150】
［図２９］ＧＰＣ３陰性の非標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第２種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0151】
［図３０］ＧＰＣ３陰性の非標的細胞Ｕ２６６に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第２種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0152】
［図３１］ＧＰＣ３陰性の非標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する、本発明の二重特異性組換えタンパク質の潜在的危険性不純物の増殖阻害活性を示すグラフである。
【0153】
［図３２］ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスＨｕＨ－７皮下腫瘍モデルに対する、本発明の二重特異性組換えタンパク質の抗腫瘍効果を示すグラフである。
【0154】
［図３３］ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスＨｕＨ－７皮下腫瘍モデルにおける、本発明の二重特異性組換えタンパク質の抗腫瘍効果を示すヒストグラムである。
【0155】
［図３４］ＰＢＭＣヒト化Ｍ－ＮＳＧマウスＭＤＡ－ＭＢ－２３１モデルにおける、本発明の二重特異性組換えタンパク質の抗腫瘍効果を示すヒストグラムである。
【0156】
［発明を実施するための形態］
本発明の技術的手段、独創的特徴、目的及び効果を理解しやすくするために、以下、具体的な例示を参照して本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
本発明の技術的手段、独創的特徴、目的及び効果を理解しやすくするために、以下、具体的な例示を参照して本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0157】
実施例１：二重特異性組換えタンパク質の設計
本発明の二重特異性組換えタンパク質の構造は図１及び図２に示された通りであり、前記二重特異性組換えタンパク質は、標的抗原を標的とする第１機能結合領域と、ＩＦＮ－α２ｂ又はその低親和性突然変異体、又はＩＦＮα機能を保持したトランケート型変異体又はその突然変異体からなる第２機能結合領域と、Ｆｃ領域とを含む。ここで、第２機能結合領域のＣ末端は、Ｆｃ領域に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、第１機能結合領域のＣ末端は、Ｆｃ領域に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、第１機能結合領域の可変領域（Ｖ領域）及び定常領域（Ｃ領域）は、直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、Ｆｃ領域は、通常のＩｇＧ構造であり得るか、又はｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ技術を利用した領域であってもよく、第１機能結合領域と第２機能結合領域との連結関係には２つの構造があり、それぞれ下記のようである。
本発明の二重特異性組換えタンパク質の構造は図１及び図２に示された通りであり、前記二重特異性組換えタンパク質は、標的抗原を標的とする第１機能結合領域と、ＩＦＮ－α２ｂ又はその低親和性突然変異体、又はＩＦＮα機能を保持したトランケート型変異体又はその突然変異体からなる第２機能結合領域と、Ｆｃ領域とを含む。ここで、第２機能結合領域のＣ末端は、Ｆｃ領域に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、第１機能結合領域のＣ末端は、Ｆｃ領域に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、第１機能結合領域の可変領域（Ｖ領域）及び定常領域（Ｃ領域）は、直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結され、Ｆｃ領域は、通常のＩｇＧ構造であり得るか、又はｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ技術を利用した領域であってもよく、第１機能結合領域と第２機能結合領域との連結関係には２つの構造があり、それぞれ下記のようである。
【0158】
第２機能結合領域のＮ末端が、Ｆｃ領域に連結されていない第１機能結合領域のＣＬ又はＣＨ１のＣ末端に直接に連結されるか、又はリンカー配列によって連結される、第１種構造（図１に示される）、
第２機能結合領域のＮ末端が第１機能結合領域から分離されている、すなわち、第２機能結合領域のＮ末端が他の機能フラグメント（シグナルペプチドを除く）に連結されていない、第２種構造（図２に示される）。
第２機能結合領域のＮ末端が第１機能結合領域から分離されている、すなわち、第２機能結合領域のＮ末端が他の機能フラグメント（シグナルペプチドを除く）に連結されていない、第２種構造（図２に示される）。
【0159】
本実施例では、ヒトＩＦＮ－α ２ｂ（Ｇｅｎｅｂａｎｋ：ＡＡＰ２００９９．１）から選択される第２機能結合領域を例として、本発明の二重特異性組換えタンパク質の設計を説明する。ＩＦＮαファミリーは１５のサブタイプから構成され、異なるサブタイプは類似した構造と高い配列相同性（８０～９９％）を有し、同じＩＦＮ受容体に結合し、いずれも抗ウイルス、増殖阻害、抗腫瘍及び免疫調節機能を有する。ＩＦＮ－α ２ｂで得られる技術的効果については、ＩＦＮαの他のサブタイプでも一貫した技術的効果を達成することができる（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ （２０１３） １６８ １０４８－１０５８）ため、ここでは繰り返さない。
【0160】
第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質は表１に示される通りであり、第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質は表２に示される通りであり、対照試料は表３に示される通りである。
【0161】
【表1】
【0162】
【表2】
【0163】
【表3】
【0164】
上記の表１及び表２において、（Ｈ）は重鎖ＶＨ及びＣＨ１からなるドメインを指し、（Ｌ）は軽鎖ＶＬ及びＣＬからなるドメインを指し、ＧＣ３３は抗グリピカン３（ＧＰＣ３）モノクローナル抗体Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂを表し、Ｆｃは野生型Ｆｃ領域を表し、Ｆｃ１はｈｏｌｅ又はｈｏｌｅｓ突然変異を有するＦｃ領域を表し、Ｆｃ２はｋｎｏｂ又はｋｎｏｂｓ突然変異を有するＦｃ領域を表す。
【0165】
表１及び表２に記載の配列名に対応する配列番号は表４－１及び表４－２に示される通りである。ここで、第１種構造を有するＡ鎖及びＢ鎖のシグナルペプチド、及び第２種構造を有する第１アーム（Ｈ＋Ｌ）のシグナルペプチドは、配列番号２３に示される通りであり、第２種構造を有する第２アームのシグナルペプチドは、配列番号２４に示される通りであり、ＩＦＮα２ｂの天然型シグナルペプチドである。表３において、ＩＦＮ－α ２ｂ－Ｆｃのアミノ酸配列は、順次連結した配列番号１７及び配列番号２５から構成され、対応するシグナルペプチドの配列は配列番号２４に示される通りであり、ＩＦＮ－α ２ｂのアミノ酸配列は配列番号１７に示される通りである。Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂのアミノ酸配列は特許ＵＳ７９１９０８６から引用され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１に示される通りであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号２に示される通りである。Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂのアミノ酸配列は特許ＵＳ２０１００２０３０５６から引用され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号５に示される通りであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６に示される通りである。Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂのアミノ酸配列は特許ＷＯ１９９４０１７１０５から引用され、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３に示される通りであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４に示される通りである。Ｂｅｌａｎｔａｍａｂの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列は特許ＵＳ２０１９０１９４３３８から引用され、重鎖可変領域の配列は配列番号９に示される通りであり、軽鎖可変領域の配列は配列番号１０に示される通りである。Ｅｌｒａｎａｔａｍａｂの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列は特許ＵＳ２０１６０２９７８８５から引用され、重鎖可変領域の配列は配列番号７に示される通りであり、軽鎖可変領域の配列は配列番号８に示される通りである。ｈＲＳ７の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列は特許ＵＳ７５１７９６４から引用され、重鎖可変領域の配列は配列番号１１に示される通りであり、軽鎖可変領域の配列は配列番号１２に示される通りである。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｂ１１７９０１）は、Ｂｉｏｉｎｔｒｏｎ社から購入したものである。組換え発現ＩＦＮ－α ２ｂタンパク質（Ｚ０３００３）は、Ｎａｎｊｉｎｇ ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入したものである。
【0166】
【表4】
【0167】
【表5】
【0168】
実施例２：二重特異性組換えタンパク質のプラスミド構築、発現及び精製
１．プラスミド構築、細胞トランスフェクション及びタンパク質の発現
二重特異性組換えタンパク質発現プラスミドは、タンパク質配列に基づいてコドン最適化して、ＧＥＮＥＷＩＺ社によって合成され、ｐＣＤＮＡ３．１プラスミドにライゲーションされ、配列決定によって配列を確認した。
１．プラスミド構築、細胞トランスフェクション及びタンパク質の発現
二重特異性組換えタンパク質発現プラスミドは、タンパク質配列に基づいてコドン最適化して、ＧＥＮＥＷＩＺ社によって合成され、ｐＣＤＮＡ３．１プラスミドにライゲーションされ、配列決定によって配列を確認した。
【0169】
得られた発現プラスミドを０．２２μｍのフィルターで濾過した後、５０μｇのプラスミド（第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質の場合、Ａ鎖及びＢ鎖発現プラスミドの質量比は２：１又は３：１であり、第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質の場合、軽鎖、重鎖及び第２アーム発現プラスミドの質量比は３：２：２である）を２ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）にピペッティングし、よく混合した。１６０μＬのトランスフェクション試薬ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ＣＨＯ試薬を２ｍＬのＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ培地にピペッティングし、よく混合した。得られたトランスフェクション試薬の混合液をプラスミドを含む混合液に加え、よく混合した。プラスミドとトランスフェクション試薬の混合液を、５０ｍＬの容量と６×１０６生細胞／ｍＬの細胞密度を有する宿主細胞ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）の懸濁液にゆっくりと均一に加え、３７℃、８％ＣＯ２のインキュベーターで培養した。１日目（１８～２２時間後）に３００μＬのＥｘｐｉＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒと８ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ Ｆｅｅｄを加え、培養温度を３２℃に下げ、５日目に２回目のフィードとして８ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯ Ｆｅｅｄを加え、１２日間培養した後細胞懸濁液を収穫した。細胞懸濁液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、遠心分離によって得られた上清、すなわち細胞培養収穫液を標的タンパク質の精製に使用した。
【0170】
２．タンパク質の精製
２．１．試料キャプチャー
二重特異性組換えタンパク質の発現上清は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（すなわち、Ｃｙｔｉｖａ社から購入したプロテインＡ）アフィニティー担体を使用して標的タンパク質をキャプチャーし、実験プロセスは下記の通りである。
２．１．試料キャプチャー
二重特異性組換えタンパク質の発現上清は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（すなわち、Ｃｙｔｉｖａ社から購入したプロテインＡ）アフィニティー担体を使用して標的タンパク質をキャプチャーし、実験プロセスは下記の通りである。
【0171】
ａ）平衡化：平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を使用して、ＵＶ検出ラインが安定するまでクロマトグラフィーカラムを平衡化し、
ｂ）試料ローディング：試料ポンプを使用して試料をローディングし、保持時間は５分、ローディング容量は３０ｍｇ／ｍＬ以下であり、
ｃ）再平衡化：５カラム容量の平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を使用して、クロマトグラフィーカラムを洗浄し、
ｄ）溶出：溶出液（５０ｍＭ ＮａＡＣ－ＨＡＣ、ｐＨ３．５）を使用して標的タンパク質を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液で溶出液のｐＨを５．５に調整し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質の純度を検出した。
ｂ）試料ローディング：試料ポンプを使用して試料をローディングし、保持時間は５分、ローディング容量は３０ｍｇ／ｍＬ以下であり、
ｃ）再平衡化：５カラム容量の平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を使用して、クロマトグラフィーカラムを洗浄し、
ｄ）溶出：溶出液（５０ｍＭ ＮａＡＣ－ＨＡＣ、ｐＨ３．５）を使用して標的タンパク質を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液で溶出液のｐＨを５．５に調整し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質の純度を検出した。
【0172】
２．２．試料の精製
２．２．１．本実施例では、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０１を例として、第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質試料の精製プロセスを説明する。
２．２．１．本実施例では、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０１を例として、第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質試料の精製プロセスを説明する。
【0173】
二重特異性組換えタンパク質ＴＴＭ１０１－ＬＣ０１の発現上清は、ＳＵＬＦＡＴＥ ６５０Ｆ担体（ＴＯＳＯＨ）を使用して試料から凝集体及びその他の不純物を除去し、実験プロセスは下記の通りである。
【0174】
ａ）平衡化：平衡化バッファー（５０ｍＭ ＮａＡＣ－ＨＡＣ、ｐＨ５．５）を使用して、ＵＶ検出ラインが安定するまでクロマトグラフィーカラムを平衡化し、
ｂ）試料ローディング：試料ポンプを使用して試料をローディングし、保持時間は５分、ローディング容量は５０ｍｇ／ｍＬ以下であり、
ｃ）再平衡化：５カラム容量の平衡化バッファー（５０ｍＭ ＮａＡＣ－ＨＡＣ、ｐＨ５．５）を使用して、クロマトグラフィーカラムを洗浄し、
ｄ）溶出：溶出液（５０ｍＭ ＮａＡＣ－ＨＡＣ、２５０Ｍｍ、ｐＨ５．５）を使用して標的タンパク質を溶出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質の純度を検出した。
ｂ）試料ローディング：試料ポンプを使用して試料をローディングし、保持時間は５分、ローディング容量は５０ｍｇ／ｍＬ以下であり、
ｃ）再平衡化：５カラム容量の平衡化バッファー（５０ｍＭ ＮａＡＣ－ＨＡＣ、ｐＨ５．５）を使用して、クロマトグラフィーカラムを洗浄し、
ｄ）溶出：溶出液（５０ｍＭ ＮａＡＣ－ＨＡＣ、２５０Ｍｍ、ｐＨ５．５）を使用して標的タンパク質を溶出し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質の純度を検出した。
【0175】
２．２．２．本実施例では、ＴＴＭ１０１－０１を例として、第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質試料の精製プロセスを説明する。
【0176】
二重特異性組換えタンパク質ＴＴＭ１０１－０１の発現上清は、Ｋａｐｐａ ｓｅｌｅｃｔアフィニティー担体（Ｃｙｔｉｖａ社）を使用して試料から不純物を除去し、実験プロセスは下記の通りである。
【0177】
ａ）平衡化：平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を使用して、ＵＶ検出ラインが安定するまでクロマトグラフィーカラムを平衡化し、
ｂ）試料ローディング：試料ポンプを使用して試料をローディングし、保持時間は５分、ローディング容量は３０ｍｇ／ｍＬ以下であり、
ｃ）再平衡化：５カラム容量の平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を使用して、クロマトグラフィーカラムを洗浄し、
ｄ）溶出：溶出液（０．１Ｍ Ｇｌｙ－ＨＣｌ、ｐＨ２．７）を使用して標的タンパク質を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液で溶出液のｐＨを５．５に調整し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質の純度を検出した。
ｂ）試料ローディング：試料ポンプを使用して試料をローディングし、保持時間は５分、ローディング容量は３０ｍｇ／ｍＬ以下であり、
ｃ）再平衡化：５カラム容量の平衡化バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を使用して、クロマトグラフィーカラムを洗浄し、
ｄ）溶出：溶出液（０．１Ｍ Ｇｌｙ－ＨＣｌ、ｐＨ２．７）を使用して標的タンパク質を溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液で溶出液のｐＨを５．５に調整し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでタンパク質の純度を検出した。
【0178】
表３の対照試料Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ、ＩＦＮ－α ２ｂ－Ｆｃ及びＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂの精製方法は、２．１の方法と同様である。
【0179】
表１及び表２に示される二重特異性組換えタンパク質の理論分子量はいずれも約１２０ｋＤであり、表３に示される対照抗体Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂの分子量は１５０ｋＤであり、ＩＦＮ－α ２ｂ－Ｆｃの分子量は８８ｋＤであり、ＩＦＮα ２ｂモノマーの分子量は１９．２ｋＤである。第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質（図１を参照）のアフィニティーキャプチャー後（すなわち、プロテインＡによる精製後）の試料の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動検出結果は図３に示された通りであり、還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動検出結果は図４に示された通りであり、電気泳動の結果は、当該構造によって発現される抗体が多くの凝集体を含むことを示し、精製後（すなわち、ＳＵＬＦＡＴＥ ６５０Ｆによる精製後）の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動検出結果は図５に示された通りであり、陽イオン交換クロマトグラフィー担体により、大部分の凝集体を除去できることが分かる。第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質（図２を参照）の精製後（すなわち、カッパ精製後）の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥタンパク質電気泳動検出結果は図６に示された通りであり、プロテインＡによるアフィニティー精製及びカッパアフィニティー精製により、高純度の二重特異性組換えタンパク質を得る。
【0180】
実施例３：ＧＰＣ３陽性の肝癌細胞株（二重陽性発現細胞、標的細胞）に対するＧＰＣ３を標的とする二重特異性組換えタンパク質の結合活性の検出
標的ＧＰＣ３陽性の肝癌細胞株に対するＧＰＣ３を標的とする二重特異性組換えタンパク質の結合親和性をフローサイトメトリーによって測定した。下記の方法は、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０１、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０３及びＴＴＭ１０１－０１を例としており、第１機能結合領域がＧＰＣ３抗原に結合し、第２機能結合領域がＩＦＮ－α ２ｂ又はその低親和性突然変異体である二重特異性組換えタンパク質の検出に適用可能である。
標的ＧＰＣ３陽性の肝癌細胞株に対するＧＰＣ３を標的とする二重特異性組換えタンパク質の結合親和性をフローサイトメトリーによって測定した。下記の方法は、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０１、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０３及びＴＴＭ１０１－０１を例としており、第１機能結合領域がＧＰＣ３抗原に結合し、第２機能結合領域がＩＦＮ－α ２ｂ又はその低親和性突然変異体である二重特異性組換えタンパク質の検出に適用可能である。
【0181】
検出細胞はＨｅｐＧ２細胞（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｋｅｂａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．）及びＨｕＨ－７（Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ）であり、成長が良好な細胞を収集してカウントし、遠心分離してＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で１×１０６個細胞／ｍＬの濃度に再懸濁させた。細胞を１００μＬ／ウェルで９６ウェルＵ字型プレート（カタログ番号：３７９９、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に加え、７つの希釈度の二重特異性組換えタンパク質又は対照タンパク質（１００ｎＭから開始、３倍勾配希釈、合計７濃度）をそれぞれ加え、４℃で１時間培養し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ （Ｈ＋Ｌ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、４℃で１時間培養し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄して再懸濁させた後、フローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって蛍光値を検出した。
【0182】
実験結果は、図７及び図８に示された通りであり、第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質ＴＴＭ１０１－ＬＣ０１、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０３は、いずれもＧＰＣ３及びＩＦＮα受容体を同時に発現する標的細胞ＨｅｐＧ２細胞及びＨｕＨ－７細胞に対してある程度の結合活性を有し、ＨｅｐＧ２細胞及びＨｕＨ－７細胞に結合した二重特異性組換えタンパク質は、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体（抗ＧＰＣ３ ｍＡｂ、すなわち対照試料Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ）よりも高い最大平均蛍光強度を有することを示した。同時に、図７及び図８に示されるように、リンカー配列の長さは、二重特異性組換えタンパク質の標的細胞に対する結合活性に弱い影響を及ぼし、リンカー配列が１つのＧＧＧＧＳである場合、組換えタンパク質の結合活性（ＥＣ５０）は比較的に低い。
【0183】
図９に示されるように、第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質（ＴＴＭ１０１－０１）は、ＧＰＣ３及びＩＦＮ受容体を同時に発現する標的細胞ＨｅｐＧ２細胞に対してある程度の結合活性を有し、そのＥＣ５０は、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体（抗ＧＰＣ３ ｍＡｂ、すなわち対照試料Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ）のＥＣ５０と同程度であり、二重特異性組換えタンパク質（ＴＴＭ１０１－０１）は、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体（抗ＧＰＣ３ ｍＡｂ、すなわち対照試料Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ）よりも高い最大平均蛍光強度を有する。
【0184】
実施例４：ＧＰＣ３を標的とする二重特異性組換えタンパク質の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＡＤＣＣ）活性の検出
二重特異性組換えタンパク質の標的ＧＰＣ３陽性の肝癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性を乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）法によって測定した。下記の方法は、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０１、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０３及びＴＴＭ１０１－０１を例としており、第１機能結合領域がＧＰＣ３抗原に結合し、第２機能結合領域がＩＦＮ－α ２ｂ又はその低親和性突然変異体である二重特異性組換えタンパク質のＡＤＣＣ活性の検出に適用可能である。
二重特異性組換えタンパク質の標的ＧＰＣ３陽性の肝癌細胞株に対するＡＤＣＣ活性を乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）法によって測定した。下記の方法は、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０１、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０３及びＴＴＭ１０１－０１を例としており、第１機能結合領域がＧＰＣ３抗原に結合し、第２機能結合領域がＩＦＮ－α ２ｂ又はその低親和性突然変異体である二重特異性組換えタンパク質のＡＤＣＣ活性の検出に適用可能である。
【0185】
エフェクター細胞は、ヒト末梢血単核球細胞（Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ Ｃｅｌｌ、ＰＢＭＣ）であり、標的細胞は、ＧＰＣ３陽性のＨｅｐＧ２肝癌細胞株であり、ＬＤＨ検出キットは、ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥＴＭ－Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｃｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７８９２）である。標的細胞及びエフェクター細胞を１：２０の割合でプレイティングし、二重特異性組換えタンパク質又は対照タンパク質（１５０ｎＭから開始、５倍勾配希釈、合計８濃度）を加え、３７℃で４時間共培養した。３７℃で３．５時間培養した後、対照群に溶解試薬を加え、顕微鏡で細胞の状態を観察し、細胞が完全に溶解した後、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を９６ウェル黒クリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０４）に移し、反応基質とともに３７℃で３０分間培養し、停止液を加え、３～５分間光を避けて振とうし、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２）で信号値を検出し、詳細はＬＤＨ検出キットの説明書を参照できる。
【0186】
図１０及び図１１に示されるように、第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０１、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０３）及び第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＴＴＭ１０１－０１）は、いずれもＡＤＣＣ活性を保持しており、二重特異性組換えタンパク質のＡＤＣＣ活性は、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体（抗ＧＰＣ３ ｍＡｂ、すなわち対照試料Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ）のＡＤＣＣ活性と同程度である（図１１を参照）。
【0187】
実施例５：ＧＰＣ３を標的とする二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性の検出
異なる腫瘍細胞株に対するＧＰＣ３を標的とする二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性を、ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ：Ｇ７５５８）を使用して測定した。下記の方法は、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０１、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０３を例としており、第１機能結合領域がＧＰＣ３抗原に結合し、第２機能結合領域がＩＦＮ－α２ｂ又はその低親和性突然変異体である二重特異性組換えタンパク質の検出に適用可能である。
異なる腫瘍細胞株に対するＧＰＣ３を標的とする二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性を、ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ：Ｇ７５５８）を使用して測定した。下記の方法は、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０１、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０３を例としており、第１機能結合領域がＧＰＣ３抗原に結合し、第２機能結合領域がＩＦＮ－α２ｂ又はその低親和性突然変異体である二重特異性組換えタンパク質の検出に適用可能である。
【0188】
ＧＰＣ３陽性の細胞株ＨｕＨ－７又はＧＰＣ３陰性の腫瘍細胞株Ｕ２６６（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｋｅｂａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）及びＧＰＣ３陰性の腫瘍細胞株ＳＷ４８０（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｋｅｂａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）を９６ウェル黒クリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０４）にプレイティングし、二重特異性組換えタンパク質又は対照タンパク質（５２ｎＭから開始、１０倍勾配希釈、合計６ポイント、又は１０ｎＭから開始、５倍勾配希釈、合計８ポイント）を加え、３７℃、ＣＯ２のインキュベーターで３日間培養し、Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏを加え、Ｍｕｌｔｏｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０５）で信号値を検出した。
【0189】
その結果、ＧＰＣ３陽性（ＧＰＣ３＋）の標的細胞ＨｕＨ－７に対する二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０１、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０３）の増殖阻害活性（ＩＣ５０）は、いずれも対照ＩＦＮ－α ２ｂ（図１２を参照）よりも高く、抗ＧＰＣ３モノクローナル抗体（抗ＧＰＣ３ ｍＡｂ、すなわち対照試料Ｃｏｄｒｉｔｕｚｕｍａｂ、当該抗体のＨｕＨ－７に対する増殖阻害効果を示さなかった）よりも高いことを示した。図１３に示されるように、ＨｕＨ－７（ＧＰＣ３陽性の標的細胞）に対するＧＰＣ３を標的とする機能を欠く二重特異性組換えタンパク質ＴＴＭ１０１－ＬＣ０４及びＩＦＮ－α ２ｂのＦｃ融合タンパク質の増殖阻害活性は、いずれもＧＰＣ３を標的とする機能を有する二重特異性組換えタンパク質ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２よりも有意に低く、ＧＰＣ３を標的とする機能を有する二重特異性組換えタンパク質と標的細胞のＧＰＣ３との結合は、ＩＦＮ－α ２ｂの増殖阻害活性を有意に増加させるが、標的細胞を標的とする効果を有しない二重特異性組換えタンパク質のＩＦＮ－α ２ｂの増殖阻害活性が低いことを示し、本発明の二重特異性組換えタンパク質は、標的抗原を有する標的細胞に対してのみ強い増殖阻害効果を有し、標的抗原を有しない非標的細胞に対してはその効果が弱いか、又は結合しないことから、本発明の二重特異性組換えタンパク質の安全性が高いことを示した。
【0190】
更に、表５に示されるように、ＧＰＣ３陽性（ＧＰＣ３＋）の標的細胞（例えば、ＨｕＨ－７）に対する、リンカー配列が異なる第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０１、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０３）は、いずれもＩＦＮ－α ２ｂよりも強い増殖阻害活性を有し、リンカー配列が異なる二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性はわずかに異なり、リンカー配列として、１つのＧＧＧＧＳを含む二重特異性組換えタンパク質（すなわち、短いリンカー配列によって連結された二重特異性組換えタンパク質、例えば、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０１）の活性は比較的に低く（図１２、表５を参照）、図８に示されるようなリンカー配列が異なる組換えタンパク質の結合活性と一致する。ＧＰＣ３陰性（ＧＰＣ３－）の非標的細胞Ｕ２６６及びＳＷ４８０細胞株において、二重特異性組換えタンパク質（例えば、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０１、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０３）の増殖阻害活性は、ＩＦＮ－α ２ｂの増殖阻害活性よりも有意に低い（すなわち、二重特異性組換えタンパク質の相対活性は１よりはるかに小さい）ことから、ＧＰＣ３を発現しない細胞（すなわち、標的抗原を発現しない非標的細胞）において、二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性が極めて低いことを示し、その安全性が高いことを示した。同時に、表５に示されるように、標的細胞に対する二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性は、非標的細胞に対する当該二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性の少なくとも７００倍である。
【0191】
【表6】
【0192】
実施例６：ＰＤ－Ｌ１を標的とする二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性の検出
異なる腫瘍細胞株に対するＰＤ－Ｌ１を標的とする二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性を、ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ：Ｇ７５５８）を使用して測定した。下記の方法は、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０５、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０６及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０７を例としており、第１機能結合領域がＰＤ－Ｌ１抗原に結合し、第２機能結合領域がＩＦＮ－α ２ｂ又はその低親和性突然変異体である二重特異性組換えタンパク質に適用可能である。
異なる腫瘍細胞株に対するＰＤ－Ｌ１を標的とする二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性を、ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｃａｔ：Ｇ７５５８）を使用して測定した。下記の方法は、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０５、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０６及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０７を例としており、第１機能結合領域がＰＤ－Ｌ１抗原に結合し、第２機能結合領域がＩＦＮ－α ２ｂ又はその低親和性突然変異体である二重特異性組換えタンパク質に適用可能である。
【0193】
ＰＤ－Ｌ１陽性の細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（Ｎａｎｊｉｎｇ Ｋｅｂａｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ．から購入）（ヒト乳癌細胞）を９６ウェル黒クリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０４）にプレイティングし、二重特異性組換えタンパク質又は対照タンパク質（５２ｎＭから開始、１０倍勾配希釈、合計６濃度ポイント）を加え、３７℃、ＣＯ２のインキュベーターで３日間培養し、Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏを加え、Ｍｕｌｔｏｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０５）で信号値を検出した。
【0194】
図１４に示されるように、ＰＤ－Ｌ１陽性（ＰＤ－Ｌ１＋）の標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対して、ＰＤ－Ｌ１を標的とする二重特異性組換えタンパク質（ＴＴＭ１０１－ＬＣ０５、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０６及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０７）は、いずれも増殖阻害活性を有し、その活性は、ＰＤ－Ｌ１を標的とする機能を有しない対照二重特異性組換えタンパク質ＴＴＭ１０１－ＬＣ０４及びＩＦＮ－α ２ｂの活性よりも有意に高く、ＰＤ－Ｌ１を標的とすることは、ＩＦＮ－α ２ｂの増殖阻害活性を有意に増加させることを示した。ＰＤ－Ｌ１を標的とする機能を有する二重特異性組換えタンパク質と標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１のＰＤ－Ｌ１との結合は、ＩＦＮ－α ２ｂの増殖阻害活性を有意に増加させるが、標的細胞を標的とする効果を有しない二重特異性組換えタンパク質のＩＦＮ－α ２ｂの増殖阻害活性が低いことを示し、本発明の二重特異性組換えタンパク質は、標的抗原を有する標的細胞に対してのみ強い増殖阻害効果を有し、標的抗原を発現しない非標的細胞に対してはその効果が弱いか、又は結合しないことから、本発明の二重特異性組換えタンパク質の安全性が高いことを示した。
【0195】
ＰＤ－Ｌ１陽性の標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を９６ウェル黒クリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９０４）にプレイティングし、ＰＤ－Ｌ１抗体Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ又はアイソタイプ対照２００ｎＭを加え、３７℃で３０分間培養した。二重特異性組換えタンパク質又は対照タンパク質（開始濃度２０ｎＭ、６倍勾配希釈、合計６濃度ポイント）を加え、３７℃、ＣＯ２のインキュベーターで３日間培養し、Ｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏを加え、Ｍｕｌｔｏｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ２１０５）で信号値を検出した。
【0196】
図１５に示されるように、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂを加えてＰＤ－Ｌ１抗原と抗体の結合部位を閉鎖した後、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０７の増殖阻害活性が有意に低下したことから、試験細胞上の標的抗原の結合機能を閉鎖することにより、試験細胞に対する二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性が有意に低下したことを示し、別の観点から、標的抗原の結合機能を有しない非標的細胞に対しては本発明の二重特異性組換えタンパク質の効果が弱いか、又は結合しないことから、本発明の二重特異性組換えタンパク質の安全性が高いことを示した。
【0197】
実施例７：ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性の検出
ＩＦＮ－α ２ｂの人体耐量と従来の抗体の有効量に差があることを考慮し、標的抗原を標的とするハーフ抗体とＩＦＮ－α ２ｂの効果をより一致させ、高効率かつ低毒性を達成するために、本発明はまた、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む一連の二重特異性組換えタンパク質を設計した。本実施例では、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２に基づく突然変異設計を例として、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質を設計し、ＩＦＮＡＲ２（ＩＦＮα受容体２）に対する野生型ＩＦＮ－α ２ｂの突然変異部位に基づく突然変異体の相対親和性（データについては、Ｃｅｌｌ．２０１１ Ａｕｇｕｓｔ １９；１４６（４）：６２１－６３２を参照）を表６に示し、異なるＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性を検出し、実験方法は実施例５と同様である。
ＩＦＮ－α ２ｂの人体耐量と従来の抗体の有効量に差があることを考慮し、標的抗原を標的とするハーフ抗体とＩＦＮ－α ２ｂの効果をより一致させ、高効率かつ低毒性を達成するために、本発明はまた、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む一連の二重特異性組換えタンパク質を設計した。本実施例では、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２に基づく突然変異設計を例として、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質を設計し、ＩＦＮＡＲ２（ＩＦＮα受容体２）に対する野生型ＩＦＮ－α ２ｂの突然変異部位に基づく突然変異体の相対親和性（データについては、Ｃｅｌｌ．２０１１ Ａｕｇｕｓｔ １９；１４６（４）：６２１－６３２を参照）を表６に示し、異なるＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性を検出し、実験方法は実施例５と同様である。
【0198】
【表7】
【0199】
図１６～１８に示されるように、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を有する二重特異性組換えタンパク質が、ＧＰＣ３陽性の標的細胞（ＨｕＨ－７）又はＧＰＣ３陰性の非標的細胞（Ｕ２６６、ＳＷ４８０）、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２－Ｍ２、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２－Ｍ３及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０２－Ｍ４に対する増殖阻害活性がいずれもＴＴＭ１０１－ＬＣ０２と比較して低下したことを示した。例えば、ＨｕＨ－７（ＧＰＣ３陽性の細胞株、標的細胞）に対するＴＴＭ１０１－ＬＣ０２－Ｍ３の増殖阻害活性ＩＣ５０は、ＩＦＮ－α ２ｂのＩＣ５０と同程度であるが（ＩＣ５０ＩＦＮ－α ２ｂ＝０．１７９３、ＩＣ５０ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２－Ｍ３＝０．１７９）、ＧＰＣ３陰性の非標的細胞（Ｕ２６６）に対するＴＴＭ１０１－ＬＣ０２－Ｍ３の相対増殖阻害活性（ＩＣ５０ ＩＦＮ－α ２ｂ／二重特異性組換えタンパク質）はより弱く、例えば、Ｕ２６６に対するＴＴＭ１０１－ＬＣ０２－Ｍ３の相対増殖阻害活性（ＩＣ５０ ＩＦＮ－α ２ｂ／二重特異性組換えタンパク質）は０．０００６１５であり、ＩＦＮ－α ２ｂより有意に弱く、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２より弱く、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２－Ｍ２、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２－Ｍ４、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０３－Ｍ３及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０３－Ｍ４でも同様の結果を示した。
【0200】
上記の結果は、標的抗原陽性の標的細胞株に対する、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含むＧＰＣ３を標的とする第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質の活性は、ＩＦＮ－α ２ｂと同程度であるが、標的抗原を発現しない非標的細胞株に対する活性は低下したことを示した。Ａ１４５Ｇ又はＲ１４９Ａ突然変異では、ＧＰＣ３又はＰＤ－Ｌ１を標的とする第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質は、良好な標的化及び高い安全性を有することを示した。
【0201】
第１種構造の標的性を更に検証するために、標的陰性及び陽性の腫瘍細胞に対する、Ｔｒｏｐ－２、ＢＣＭＡ及びＰＤ－Ｌ１を標的とする二重特異性組換えタンパク質の活性の違いを検出した。実験方法は実施例５及び６と同様である。
【0202】
図１９～２１に示されるように、Ｔｒｏｐ－２陽性の標的細胞（ＯＶＣＡＲ３及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）及びＴｒｏｐ－２陰性の標的細胞（ＮＣＩ－Ｈ９２９）に対する、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を有する二重特異性組換えタンパク質の活性を検出した。その結果、Ｔｒｏｐ－２陰性及び陽性の細胞に対するＴＴＭ１０１－ＬＣ１０－Ｍ３及びＴＴＭ１０１－ＬＣ１０－Ｍ４の増殖阻害活性は、いずれもＴＴＭ１０１－ＬＣ１０と比較して低下したことを示した。しかし、Ｔｒｏｐ－２陽性の標的細胞（ＯＶＣＡＲ３及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）に対して、ＴＴＭ１０１－ＬＣ１０、ＴＴＭ１０１－ＬＣ１０－Ｍ３及びＴＴＭ１０１－ＬＣ１０－Ｍ４の増殖阻害活性はＩＦＮ－α ２ｂよりも高いもしくは同程度であり、Ｔｒｏｐ－２陰性の標的細胞（ＮＣＩ－Ｈ９２９）に対して、ＴＴＭ１０１－ＬＣ１０、ＴＴＭ１０１－ＬＣ１０－Ｍ３及びＴＴＭ１０１－ＬＣ１０－Ｍ４の増殖阻害活性はＩＦＮ－α ２ｂと比較して有意に低下し、特にＴＴＭ１０１－ＬＣ１０－Ｍ３及びＴＴＭ１０１－ＬＣ１０－Ｍ４の活性は、ＩＦＮ－α ２ｂと比較して２０倍以上低下したことを示した。上記の結果は、Ａ１４５Ｇ又はＲ１４９Ａ突然変異では、Ｔｒｏｐ－２を標的とする第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質は、良好な標的化及び高い安全性を有することを示した。
【0203】
図２２～２４に示されるように、ＢＣＭＡ陽性の標的細胞（ＮＣＩ－Ｈ９２９）に対する、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を有する二重特異性組換えタンパク質の活性を検出した結果、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０８－Ｍ３、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０９－Ｍ３及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０８－Ｍ４の増殖阻害活性はＩＦＮ－α ２ｂと同程度であり、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０９－Ｍ４の活性はＩＦＮ－α ２ｂと比較して約７倍低下した。ＢＣＭＡ陰性の非標的細胞（ＨｕＨ－７及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１）に対して、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０８－Ｍ３、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０９－Ｍ３、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０８－Ｍ４及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０９－Ｍ４の増殖阻害活性はＩＦＮ－α ２よりも有意に低かった。Ａ１４５Ｇ又はＲ１４９Ａ突然変異では、ＢＣＭＡを標的とする第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質は、良好な標的化及び高い安全性を有することを示した。
【0204】
図２５～２６に示されるように、ＰＤ－Ｌ１陽性の標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＰＤ－Ｌ１陰性の標的細胞ＯＶＣＡＲ３に対する、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を有する二重特異性組換えタンパク質の活性を検出した。その結果、ＰＤ－Ｌ１陽性の細胞に対するＴＴＭ１０１－ＬＣ０７－Ｍ３及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０７－Ｍ４の増殖阻害活性は、いずれもＴＴＭ１０１－ＬＣ０７と比較して低下したことを示した。ＴＴＭ１０１－ＬＣ０７及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０７－Ｍ３の増殖阻害活性はＩＦＮ－α ２ｂと比較して約５倍増加し、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０７－Ｍ４の活性はＩＦＮ－α ２ｂと同程度であるが、ＰＤ－Ｌ１陰性の細胞ＯＶＣＡＲ３に対するＴＴＭ１０１－ＬＣ０７－Ｍ３及びＴＴＭ１０１－ＬＣ０７－Ｍ４の増殖阻害活性はＩＦＮ－α ２ｂよりも有意に低いことから、Ａ１４５Ｇ又はＲ１４９Ａ突然変異では、ＰＤ－Ｌ１を標的とする第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質は、良好な標的化及び高い安全性を有することを示した。
【0205】
同時に、本発明者らは、Ａ１４５Ｇ又はＲ１４９Ａ突然変異を例として、ＧＰＣ３を標的とする第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質及びＰＤ－Ｌ１を標的とする第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質を構築した。
【0206】
本実施例では、ＴＴＭ１０１－０１－Ｍ３及びＴＴＭ１０１－０１－Ｍ４を例として、ＧＰＣ３陽性の標的細胞ＨｕＨ－７及びＧＰＣ３陰性の非標的細胞ＳＷ４８０、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１及びＵ２６６に対する、ＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含むＧＰＣ３を標的とする第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質の増殖阻害活性を検出し、実験方法は実施例５と同様であり、試験タンパク質及び対照タンパク質を１００ｎＭから５倍段階希釈し、合計９回の勾配希釈を行った。
【0207】
その結果、ＧＰＣ３陽性の標的細胞（ＨｕＨ－７、標的細胞）及びＧＰＣ３陰性の非標的細胞（Ｕ２６６、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１又はＳＷ４８０、非標的細胞）に対して、ＴＴＭ１０１－０１－Ｍ３及びＴＴＭ１０１－０１－Ｍ４の増殖阻害活性はＴＴＭ１０１－０１と比較して低下したが、標的細胞と非標的細胞における低下の程度は有意に異なっていた。ＧＰＣ３陽性の標的細胞ＨｕＨ－７に対するＴＴＭ１０１－０１－Ｍ３及びＴＴＭ１０１－０１－Ｍ４の増殖阻害活性ＩＣ５０は、基本的にＩＦＮ－α ２ｂと同程度であり（図２７）、ＧＰＣ３陰性の細胞株（すなわち、非標的細胞）に対するＴＴＭ１０１－０１－Ｍ３及びＴＴＭ１０１－０１－Ｍ４の増殖阻害活性は、ＩＦＮ－α ２ｂの増殖阻害活性よりも１００倍以上低く（図２８～３０）、特に、Ｕ２６６及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する増殖阻害活性は、ＩＦＮ－α ２ｂの増殖阻害活性よりも１００００倍以上低かった。
【0208】
上記の結果は、Ａ１４５Ｇ又はＲ１４９Ａ突然変異では、標的抗原陽性の細胞株に対する、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含むＧＰＣ３又はＰＤ－Ｌ１を標的とする第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質の活性はＩＦＮ－α ２ｂと同程度であるが、標的抗原を発現しない非標的細胞株に対する活性は有意に低下し、Ｒ１４９Ａ突然変異の場合には活性が比較的に低いことを示した。Ａ１４５Ｇ又はＲ１４９Ａ突然変異では、ＧＰＣ３又はＰＤ－Ｌ１を標的とする第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質は、良好な標的化及び高い安全性を有することを示した。
【0209】
要約すると、野生型ＩＦＮ－α ２ｂを含む二重特異性組換えタンパク質の標的抗原陰性の非標的細胞に対する増殖阻害活性と比較して、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質の標的抗原陽性の標的細胞に対する増殖阻害活性と比較して、ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む本発明の二重特異性組換えタンパク質の標的抗原陰性の非標的細胞に対する増殖阻害活性は同程度に低下するか、又は有意に低下する。
【0210】
実施例８：非標的細胞に対する、二重特異性組換えタンパク質の潜在的危険性不純物の増殖阻害活性の検出
二重特異性組換えタンパク質の将来の調製プロセスにおける不純物の潜在的安全性リスクを低減させるために、本発明は、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２及びＴＴＭ１０１－０１を例として、非標的細胞に対するその潜在的危険性不純物（Ｂ鎖又は第２アームのホモ二量体）の増殖阻害を分析した。
二重特異性組換えタンパク質の将来の調製プロセスにおける不純物の潜在的安全性リスクを低減させるために、本発明は、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２及びＴＴＭ１０１－０１を例として、非標的細胞に対するその潜在的危険性不純物（Ｂ鎖又は第２アームのホモ二量体）の増殖阻害を分析した。
【0211】
ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２の精製プロセス（実施例２に記載）において、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０２のＢ鎖のホモ二量体（図３、ホモ二量体の分子量は約１４０ｋＤである）を分離し、非標的細胞（ＧＰＣ３陰性の細胞）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１における、当該Ｂ鎖のホモ二量体及びＩＦＮ－α ２ｂ－Ｆｃ（ＴＴＭ１０１－０１の第２アームのホモ二量体）の増殖阻害活性を検出した。その結果、図３１に示されるように、１６．７ｎＭの濃度で、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＧＰＣ３陰性の細胞、非標的細胞）に対するＩＦＮ－α ２ｂの増殖阻害率は９１．３％であり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＧＰＣ３陰性の細胞、非標的細胞）に対するＴＴＭ１０１－０１の第２アームのホモ二量体（ＩＦＮ－α ２ｂ－Ｆｃ）の増殖阻害率は６６．８％（ＩＦＮ－α ２ｂと比較して約２４．５％減少）であり、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＧＰＣ３陰性の細胞、非標的細胞）に対するＴＴＭ１０１－ＬＣ０２のＢ鎖のホモ二量体の増殖阻害率はわずか１６．２％（ＩＦＮ－α ２ｂと比較して約７５．１％減少し、ＩＦＮ－α ２ｂ－Ｆｃと比較して約５０％減少）である。要約すると、非標的細胞に対する潜在的危険性不純物の効果は極めて弱く、すなわち、潜在的安全性リスク又は潜在的毒性副作用は極めて低い。
【0212】
実施例９：ＩＦＮ－α ２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質のインビボ抗腫瘍効果の活性の検出
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスＨｕＨ－７皮下腫瘍モデルに対する、ＧＰＣ３を標的とする二重特異性組換えタンパク質の抗腫瘍効果
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右背中に約３０ｍｍ３のＨｕＨ－７腫瘍塊を接種し、その後の実験のためのユニークな確認マーカーとして、接種と同時に実験動物の耳にタグを付けた。腫瘍増殖を待ち、平均腫瘍体積が１５０ｍｍ３に達したときに、マウスをランダムに各群６匹ずつ分けて投与を開始した。すべてのマウスに１０ｍＬ／ｋｇを３週間連続、週２回、計６回静脈内投与した。
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスＨｕＨ－７皮下腫瘍モデルに対する、ＧＰＣ３を標的とする二重特異性組換えタンパク質の抗腫瘍効果
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右背中に約３０ｍｍ３のＨｕＨ－７腫瘍塊を接種し、その後の実験のためのユニークな確認マーカーとして、接種と同時に実験動物の耳にタグを付けた。腫瘍増殖を待ち、平均腫瘍体積が１５０ｍｍ３に達したときに、マウスをランダムに各群６匹ずつ分けて投与を開始した。すべてのマウスに１０ｍＬ／ｋｇを３週間連続、週２回、計６回静脈内投与した。
【0213】
実験指標は、腫瘍増殖の阻害、遅延又は治癒の有無に関する研究である。ノギスを使用して腫瘍径を週２回測定した。腫瘍体積の計算式は、Ｖ＝０．５ａ×ｂ２であり、ａ及びｂはそれぞれ腫瘍の長径及び短径を表す。統計解析は、各群の各時点における腫瘍体積の平均値及び標準誤差（ＳＥＭ）を含む。片側Ｔ検定を用いて２群間の比較を分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてすべてのデータを分析した。ｐ＜０．０５を「有意差あり」とみなした。
【0214】
その結果、図３２及び図３３に示されるように、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０３－Ｍ３は用量依存的に腫瘍増殖を阻害し、その抗腫瘍効果は同用量のＧＣ３３よりも優れており、高用量のＰＥＧ－ＩＦＮ－α ２ｂ（臨床的耐容量を上回る用量）よりも優れていた。上記の結果は、Ａ１４５Ｇ減弱突然変異を有するＧＰＣ３を標的とするＩＦＮ－α ２ｂが、腫瘍増殖を効果的に阻害できることを示した。
【0215】
ＰＢＭＣヒト化Ｍ－ＮＳＧマウスＭＤＡ－ＭＢ－２３１モデルに対する、ＰＤ－Ｌ１を標的とする二重特異性組換えタンパク質の抗腫瘍効果
Ｍ－ＮＳＧマウス（６～８ｗ、雌）にＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（接種細胞数：１Ｅ７／匹＋３０％マトリゲル）を皮下接種し、０日目として記録し、翌日、マウスの生存状態と皮下腫瘍形成を観察した。接種後７日目にＰＢＭＣ細胞（０２０５Ｃ）（接種細胞数：５Ｅ６／匹）を尾静脈内投与し、ＰＢＭＣ接種後７日目にマウスの全血を採取し、フローサイトメトリーによってｈＣＤ４５％を検出し、平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）とｈＣＤ４５％比に基づいて、マウスをランダムに群分けを行い、群分けの日をＤ０とした。すべてのマウスに１０ｍＬ／ｋｇを３週間連続、週２回、計６回静脈内投与した。
Ｍ－ＮＳＧマウス（６～８ｗ、雌）にＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（接種細胞数：１Ｅ７／匹＋３０％マトリゲル）を皮下接種し、０日目として記録し、翌日、マウスの生存状態と皮下腫瘍形成を観察した。接種後７日目にＰＢＭＣ細胞（０２０５Ｃ）（接種細胞数：５Ｅ６／匹）を尾静脈内投与し、ＰＢＭＣ接種後７日目にマウスの全血を採取し、フローサイトメトリーによってｈＣＤ４５％を検出し、平均腫瘍体積（約２００ｍｍ３）とｈＣＤ４５％比に基づいて、マウスをランダムに群分けを行い、群分けの日をＤ０とした。すべてのマウスに１０ｍＬ／ｋｇを３週間連続、週２回、計６回静脈内投与した。
【0216】
実験指標は、腫瘍増殖の阻害、遅延又は治癒の有無に関する研究である。ノギスを使用して腫瘍径を週２回測定した。腫瘍体積の計算式は、Ｖ＝０．５ａ×ｂ２であり、ａ及びｂはそれぞれ腫瘍の長径及び短径を表す。統計解析は、各群の各時点における腫瘍体積の平均値及び標準誤差（ＳＥＭ）を含む。片側Ｔ検定を用いて２群間の比較を分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いてすべてのデータを分析した。ｐ＜０．０５を「有意差あり」とみなした。
【0217】
その結果、図３４に示されるように、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０７－Ｍ３（Ｎ２９７Ｇ）は用量依存的に腫瘍増殖を阻害し、その抗腫瘍効果は同用量のＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂよりも優れており、４ｍｇ／ｋｇのＴＴＭ１０１－ＬＣ０７－Ｍ３（Ｎ２９７Ｇ）の効果は、高用量のＰＥＧ－ＩＦＮ－α ２ｂ（臨床的耐容量を上回る用量）よりも優れていた。ＴＴＭ１０１－ＬＣ０７－Ｍ４（Ｎ２９７Ｇ）は、０．２ｍｇ／ｋｇの用量レベルで１ｍｇ／ｋｇのＡｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂと同等の効果を示した。上記の結果は、Ａ１４５Ｇ及びＲ１４９Ａ減弱突然変異を有するＰＤ－Ｌ１を標的とするＩＦＮ－α ２ｂが、腫瘍増殖を効果的に阻害できることを示した。
【0218】
実施例１０：二重特異性組換えタンパク質の凍結融解安定性に関する研究
既存の組換えヒトアルブミンインターフェロン－α ２ｂ融合タンパク質は、凍結融解安定性が低く、凍結融解を繰り返すのに適していなく、例えば、ＰＥＧ化長時間作用型インターフェロンは凍結・振とうできず、輸送及び保管条件に対する要求が高い。本発明の二重特異性組換えタンパク質の凍結融解安定性を研究するために、第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質に対して凍結融解安定性試験を繰り返し実行した。タンパク質を２０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ＝５）緩衝液に入れ、－４０℃で凍結融解を５回繰り返した。凍結融解前後の試料に対して純度（サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣ）及び外観を分析した。その結果、表７に示されるように、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０３及びその突然変異体の凍結融解安定性は良好であり、純度はいずれも９５％以上であり、凍結融解を５回繰り返した後、外観は透明であり、本発明の二重特異性組換えタンパク質のＩＦＮ－α ２ｂタンパク質部分の凍結融解安定性は、ＩＦＮ－α ２ｂモノマー又はＰＥＧ化ＩＦＮ－α ２ｂよりも有意に優れていることを示した。
既存の組換えヒトアルブミンインターフェロン－α ２ｂ融合タンパク質は、凍結融解安定性が低く、凍結融解を繰り返すのに適していなく、例えば、ＰＥＧ化長時間作用型インターフェロンは凍結・振とうできず、輸送及び保管条件に対する要求が高い。本発明の二重特異性組換えタンパク質の凍結融解安定性を研究するために、第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質に対して凍結融解安定性試験を繰り返し実行した。タンパク質を２０ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ＝５）緩衝液に入れ、－４０℃で凍結融解を５回繰り返した。凍結融解前後の試料に対して純度（サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＥＣ）及び外観を分析した。その結果、表７に示されるように、ＴＴＭ１０１－ＬＣ０３及びその突然変異体の凍結融解安定性は良好であり、純度はいずれも９５％以上であり、凍結融解を５回繰り返した後、外観は透明であり、本発明の二重特異性組換えタンパク質のＩＦＮ－α ２ｂタンパク質部分の凍結融解安定性は、ＩＦＮ－α ２ｂモノマー又はＰＥＧ化ＩＦＮ－α ２ｂよりも有意に優れていることを示した。
【0219】
【表8】
【0220】
第１機能結合領域が他の標的（例えば、５Ｔ４、ＡＧＳ－１６、ＡＬＫ１、ＡＮＧ－２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ｃ－ｆｍｓ、ｃ－Ｍｅｔ、ＣＡ６、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３０、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ９８、ＣＥＡ、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ＣＳ１、ＣＸＣＲ４、ＤＬＬ－４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ－１、ＥＮＰＰ３、ＥｐｈＡ３、ＥＴＢＲ、ＦＧＦＲ２、ＦＮ、ＦＲ－α、ＧＣＣ、ＧＤ２、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＣＡＭ－１、ＩＧＦ－１Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＬＩＶ－１、ＭＳＬＮ、ＭＵＣ１６、ＭＵＣ１、ＮａＰｉ２ｂ、ネクチン－４、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤＧＦＲ－α、ＰＳ、ＰＳＭＡ、ＳＬＴＲＫ６、ＳＴＥＡＰ１、ＴＥＭ１、ＶＥＧＦＲ、ＣＤ２５、ＣＤ２７Ｌ、ＤＫＫ－１、ＣＳＦ－１Ｒ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＣＤ１３８、Ｓｉｇｌｅｃ１５及びＣＤ１５５）を標的とする本発明の二重特異性組換えタンパク質も、上記の標的と同様の効果を達成することができる。
【0221】
本明細書で提供されるあらゆる実施例又は例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特に請求されない限り、本発明の範囲を限定しない。明細書中の言語は、保護要求されていない要素が本発明の実施に不可欠であることを示すものとして解釈されるべきではない。
【0222】
本明細書で引用されるすべての刊行物及び特許出願は、個々の出版物又は特許出願が、具体的かつ個別に参照により組み込まれるように、参照により本明細書に組み込まれる。なお、本明細書に記載の理論、メカニズム、証明又は発見は、本発明の理解をさらに高めることを意図しており、いかなる方法によって本発明をそのような理論、メカニズム、証明又は発見に限定することを決して意図していない。本発明は、添付図面及び前述の説明において詳細に示され説明されたが、本発明は限定的なものではなく例示的なものとみなされるべきである。
【図面の簡単な説明】
【0223】
【図1】本発明の第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質の構造模式図である。
【図2】本発明の第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質の構造模式図である。
【図3】本発明の第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質のアフィニティーキャプチャー後の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。
【図4】本発明の第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質のアフィニティーキャプチャー後の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。
【図5】本発明の第１種構造を有する二重特異性組換えタンパク質の精製後の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。
【図6】本発明の第２種構造を有する二重特異性組換えタンパク質のカッパ精製後の非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動図である。
【図7】フローサイトメトリーによって決定された、標的細胞ＨｅｐＧ２肝臓癌細胞に対する本発明の二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）及び対照試料の結合活性を示すグラフである。
【図8】フローサイトメトリーによって決定された、標的細胞ＨｕＨ－７に対する本発明の二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）及び対照試料の結合活性を示すヒストグラムである。
【図9】フローサイトメトリーによって決定された、標的細胞ＨｅｐＧ２に対する本発明の二重特異性組換えタンパク質（第２種構造）及び対照試料の結合活性を示すグラフである。
【図10】ＬＤＨ法によって決定された、標的細胞ＨｅｐＧ２に対する本発明の二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）のＡＤＣＣ活性を示すグラフである。
【図11】ＬＤＨ法によって決定された、標的細胞ＨｅｐＧ２に対する本発明の二重特異性組換えタンパク質（第２種構造）及び対照試料のＡＤＣＣ活性を示すグラフである。
【図12】標的細胞ＨｕＨ－７に対する、本発明のリンカー配列が異なる二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図13】ＧＰＣ３陽性の標的細胞ＨｕＨ－７に対する、ＧＰＣ３抗原を標的とする機能を有する二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）及び対照試料の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図14】ＰＤ－Ｌ１陽性の標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する本発明の二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図15】抗ＰＤ－Ｌ１抗体閉鎖後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する本発明の二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図16】ＧＰＣ３陽性の標的細胞ＨｕＨ－７に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図17】ＧＰＣ３陰性の非標的細胞ＳＷ４８０に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図18】ＧＰＣ３陰性の非標的細胞Ｕ２６６に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図19】Ｔｒｏｐ－２陽性の標的細胞ＯＶＣＡＲ３に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図20】Ｔｒｏｐ－２陽性の標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図21】Ｔｒｏｐ－２陰性の非標的細胞ＮＣＩ－Ｈ９２９に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図22】ＢＣＭＡ陽性の標的細胞ＮＣＩ－Ｈ９２９に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図23】ＢＣＭＡ陰性の非標的細胞ＨｕＨ－７に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図24】ＢＣＭＡ陰性の非標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図25】ＰＤ－Ｌ１陽性の標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図26】ＰＤ－Ｌ１陰性の標的細胞ＯＶＣＡＲ３に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第１種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図27】ＧＰＣ３陽性の標的細胞ＨｕＨ－７に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第２種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図28】ＧＰＣ３陰性の非標的細胞ＳＷ４８０に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第２種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図29】ＧＰＣ３陰性の非標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第２種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図30】ＧＰＣ３陰性の非標的細胞Ｕ２６６に対する、本発明の異なるＩＦＮ－α２ｂ低親和性突然変異体を含む二重特異性組換えタンパク質（第２種構造）の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図31】ＧＰＣ３陰性の非標的細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する、本発明の二重特異性組換えタンパク質の潜在的危険性不純物の増殖阻害活性を示すグラフである。
【図32】ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスＨｕＨ－７皮下腫瘍モデルに対する、本発明の二重特異性組換えタンパク質の抗腫瘍効果を示すグラフである。
【図33】ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスＨｕＨ－７皮下腫瘍モデルにおける、本発明の二重特異性組換えタンパク質の抗腫瘍効果を示すヒストグラムである。
【図34】ＰＢＭＣヒト化Ｍ－ＮＳＧマウスＭＤＡ－ＭＢ－２３１モデルにおける、本発明の二重特異性組換えタンパク質の抗腫瘍効果を示すヒストグラムである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【配列表】
【国際調査報告】