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特表2024-534263Ｂ７－Ｈ３及びＴＧＦβに特異的に結合する二重特異性分子、並びにその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-18
(54)【発明の名称】Ｂ７－Ｈ３及びＴＧＦβに特異的に結合する二重特異性分子、並びにその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240910BHJP
C07K 16/22 20060101ALI20240910BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240910BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20240910BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240910BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240910BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240910BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240910BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240910BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240910BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240910BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240910BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240910BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240910BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K16/22
C12N15/13
C12N15/115 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61K45/00
A61P35/00
A61P35/02
A61P43/00 121
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024537288
(86)(22)【出願日】2022-08-29
(85)【翻訳文提出日】2024-02-27
(86)【国際出願番号】 KR2022012859
(87)【国際公開番号】W WO2023027561
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】10-2021-0114096
(32)【優先日】2021-08-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0108139
(32)【優先日】2022-08-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524074792
【氏名又は名称】セラノティックス カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥＲＡＮＯＴＩＣＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】（Ｍｉｓａｇａｎｇｂｙｅｏｎ Ｓｋｙｐｏｌｉｓ， Ｍａｎｇｗｏｌ－ｄｏｎｇ） ５４３Ｈｏ， ５ｔｈ Ｆｌｏｏｒ， Ｎａ－ｄｏｎｇ， １３５， Ｍｉｓａｇａｎｇｂｙｅｏｎｈａｎｇａｎｇ－ｒｏ， Ｈａｎａｍ－ｓｉ Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ １２９０２， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100137095
【弁理士】
【氏名又は名称】江部 武史
(74)【代理人】
【識別番号】100091627
【弁理士】
【氏名又は名称】朝比 一夫
(72)【発明者】
【氏名】ジョン， ビョン ホン
(72)【発明者】
【氏名】リ， ジョン ウク
(72)【発明者】
【氏名】パク， ドン ウン
(72)【発明者】
【氏名】リ， ジョン ウン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C084ZC412
4C084ZC75
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB17
4C085CC23
4C085EE01
4C085EE03
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片と、それに結合したＴＧＦβ結合部とを含む二重特異性分子およびその用途に関し、より詳細には、Ｂ７－Ｈ３及びＴＧＦβに二重特異的に結合することにより、癌を含む様々な疾患の免疫チェックポイント阻害剤として利用できる、二重特異性分子に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片と、それに結合したＴＧＦβ結合部とを含む、二重特異性分子。
【請求項2】
前記Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片は、下記ＨＣＤＲを含む重鎖可変領域および下記ＬＣＤＲを含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の二重特異性分子：（ａ）配列番号１、１０及び１９のＨＣＤＲと配列番号２８、３７及び４５のＬＣＤＲ；
（ｂ）配列番号２、１１及び２０のＨＣＤＲと配列番号２９、３８及び４６のＬＣＤＲ；
（ｃ）配列番号３、１２及び２１のＨＣＤＲと配列番号３０、３９及び４７のＬＣＤＲ；
（ｄ）配列番号４、１３及び２２のＨＣＤＲと配列番号３１、４０及び４８のＬＣＤＲ；
（ｅ）配列番号５、１４及び２３のＨＣＤＲと配列番号３２、４１及び４９のＬＣＤＲ；
（ｆ）配列番号６、１５及び２４のＨＣＤＲと配列番号３３、４２及び５０のＬＣＤＲ；
（ｇ）配列番号７、１６及び２５のＨＣＤＲと配列番号３４、４３及び５１のＬＣＤＲ；
（ｈ）配列番号８、１７及び２６のＨＣＤＲと配列番号３５、４４及び５２のＬＣＤＲ；または、
（ｉ）配列番号９、１８及び２７のＨＣＤＲと配列番号３６、４２及び５３のＬＣＤＲ。
【請求項3】
前記ＴＧＦβ結合部は、ＴＧＦβに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、アプタマーおよびＴＧＦβ受容体からなる群より選択される、請求項１に記載の二重特異性分子。
【請求項4】
前記ＴＧＦβ結合部は、リンカーによって連結されている、請求項１に記載の二重特異性分子。
【請求項5】
前記ＴＧＦβ結合部は、配列番号２８０のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の二重特異性分子。
【請求項6】
前記ＴＧＦβ結合部は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３からなる群より選択されるいずれか１つのＴＧＦβに特異的に結合する、請求項１に記載の二重特異性分子。
【請求項7】
前記重鎖可変領域は、下記ＨＦＲからなる群より選択されるいずれか１つのフレームワーク配列を含み、前記軽鎖可変領域は、下記ＬＦＲからなる群より選択されるいずれか１つのフレームワーク配列を含む、請求項２に記載の二重特異性分子：（ｈｆ１）配列番号５４、６３、６８及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ２）配列番号５５、６３、６９及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ３）配列番号５６、６４、７０及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ４）配列番号５６、６４、７１及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ５）配列番号５７、６４、７０及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ６）配列番号５８、６４、７２及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ７）配列番号５９、６５、７３及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ８）配列番号６０、６５、７３及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ９）配列番号６１、６６、７４及び３３４のＨＦＲ；および、
（ｈｆ１０）配列番号６２、６７、７５及び３３４のＨＦＲ、
（ｌｆ１）配列番号７６、８２、８６及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ２）配列番号７７、８２、８７及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ３）配列番号７８、８３、８８及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ４）配列番号７９、８４、８９及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ５）配列番号８０、８４、９０及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ６）配列番号８０、８４、９１及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ７）配列番号８１、８５、９２及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ８）配列番号９３、９８、１０１及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ９）配列番号９３、９８、１０２及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ１０）配列番号９３、９８、１０３及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ１１）配列番号９３、９８、１０４及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ１２）配列番号９４、９８、１０５及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ１３）配列番号９５、９９、１０６及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ１４）配列番号９６、９９、１０７及び３３６のＬＦＲ；および、
（ｌｆ１５）配列番号９７、１００、１０８及び３３６のＬＦＲ。
【請求項8】
前記重鎖可変領域は、配列番号１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３５、１４２及び１５２からなる群より選択されるいずれか１つであり、前記軽鎖可変領域は、配列番号２１１、２２１、２２３、２２４、２２５、２３１、３０７、３０９及び３１７からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項２に記載の二重特異性分子。
【請求項9】
請求項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性分子をコードする遺伝子。
【請求項10】
請求項９に記載の遺伝子が挿入されたベクターが導入された細胞。
【請求項11】
請求項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性分子を含む、癌の治療または予防用薬学組成物。
【請求項12】
前記癌は、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、神経膠腫、神経芽腫、前立腺癌、膵臓癌、大腸癌、結腸癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、腎癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、皮膚癌、脳腫瘍、脳脊髄癌、副腎腫瘍、黒色腫、肉腫、多発性骨髄腫、神経内分泌腫瘍、末梢神経鞘腫瘍および小円形細胞腫瘍からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１１に記載の癌の治療または予防用薬学組成物。
【請求項13】
ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤およびＴＩＧＩＴ阻害剤からなる群より選択される免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む、請求項１１に記載の癌の治療または予防用薬学組成物。
【請求項14】
ＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲ－Ｔ、細胞傷害性Ｔリンパ球、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫおよびＣＡＲ－ＮＫからなる群より選択される細胞治療剤をさらに含む、請求項１１に記載の癌の治療または予防用薬学組成物。
【請求項15】
薬剤として使用するための請求項１～８のいずれか一項に記載の二重特異性分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｂ７－Ｈ３及びＴＧＦβに特異的に結合する二重特異性分子に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｂ７ホモロジー３タンパク質（Ｂ７ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ３ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｂ７－Ｈ３）（ＣＤ２７６及びＢ７ＲＰ－２とも呼ばれ、本明細書ではＢ７－Ｈ３と総称する。）は、免疫グロブリンスーパーファミリーのＩ型膜貫通糖タンパク質である。
【0003】
ヒトＢ７－Ｈ３は、推定シグナルペプチド、Ｖ様およびＣ様Ｉｇドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインを含む。ヒトにおけるエクソンの重複は、いくつかの保存されたシステイン残基を含むＩｇＶ－ＩｇＣ－ＩｇＶ－ＩｇＣ様ドメイン（４ＩｇＢ７－Ｈ３アイソタイプ）、または単一のＩｇＶ－ＩｇＣ様ドメイン（２ＩｇＢ７－Ｈ３アイソタイプ）のいずれか１つを有する２つのＢ７－Ｈ３アイソタイプの発現につながる。ヒト組織および細胞株における主なＢ７－Ｈ３アイソタイプは、４ＩｇＢ７－Ｈ３アイソタイプである。
【0004】
Ｂ７－Ｈ３は、共刺激および共阻害シグナリング機能の両方を有することが報告されている。
【0005】
Ｂ７－Ｈ３は、多くの免疫細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、および抗原提示細胞（ＡＰＣ））で常時発現されるものではなく、その発現は誘導され得る。
【0006】
また、Ｂ７－Ｈ３の発現は免疫細胞に限定されない。Ｂ７－Ｈ３転写体は、結腸、心臓、肝臓、胎盤、前立腺、小腸、精巣および子宮を含む様々なヒト組織、並びに造骨細胞、線維芽細胞、上皮細胞および他の非リンパ球系細胞で発現され、潜在的に免疫学的および非免疫学的機能を示す。しかし、正常組織におけるタンパク質の発現は典型的に低レベルに維持され、そのため、転写後調節が加えられ得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、Ｂ７－Ｈ３及びＴＧＦβに二重特異的に結合する、新規な二重特異性分子を提供することを目的とする。
【0008】
本発明は、Ｂ７－Ｈ３及びＴＧＦβに特異的に結合する二重特異性分子の医学用途（薬学組成物、治療方法など）を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0009】
１．Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片と、それに結合したＴＧＦβ結合部とを含む、二重特異性分子。
【0010】
２．前記項目１において、Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片は、下記ＨＣＤＲを含む重鎖可変領域と、下記ＬＣＤＲを含む軽鎖可変領域とを含む、二重特異性分子：
（ａ）配列番号１、１０及び１９のＨＣＤＲと配列番号２８、３７及び４５のＬＣＤＲ；
（ｂ）配列番号２、１１及び２０のＨＣＤＲと配列番号２９、３８及び４６のＬＣＤＲ；
（ｃ）配列番号３、１２及び２１のＨＣＤＲと配列番号３０、３９及び４７のＬＣＤＲ；
（ｄ）配列番号４、１３及び２２のＨＣＤＲと配列番号３１、４０及び４８のＬＣＤＲ；
（ｅ）配列番号５、１４及び２３のＨＣＤＲと配列番号３２、４１及び４９のＬＣＤＲ；
（ｆ）配列番号６、１５及び２４のＨＣＤＲと配列番号３３、４２及び５０のＬＣＤＲ；
（ｇ）配列番号７、１６及び２５のＨＣＤＲと配列番号３４、４３及び５１のＬＣＤＲ；
（ｈ）配列番号８、１７及び２６のＨＣＤＲと配列番号３５、４４及び５２のＬＣＤＲ；または、
（ｉ）配列番号９、１８及び２７のＨＣＤＲと配列番号３６、４２及び５３のＬＣＤＲ。
（ａ）配列番号１、１０及び１９のＨＣＤＲと配列番号２８、３７及び４５のＬＣＤＲ；
（ｂ）配列番号２、１１及び２０のＨＣＤＲと配列番号２９、３８及び４６のＬＣＤＲ；
（ｃ）配列番号３、１２及び２１のＨＣＤＲと配列番号３０、３９及び４７のＬＣＤＲ；
（ｄ）配列番号４、１３及び２２のＨＣＤＲと配列番号３１、４０及び４８のＬＣＤＲ；
（ｅ）配列番号５、１４及び２３のＨＣＤＲと配列番号３２、４１及び４９のＬＣＤＲ；
（ｆ）配列番号６、１５及び２４のＨＣＤＲと配列番号３３、４２及び５０のＬＣＤＲ；
（ｇ）配列番号７、１６及び２５のＨＣＤＲと配列番号３４、４３及び５１のＬＣＤＲ；
（ｈ）配列番号８、１７及び２６のＨＣＤＲと配列番号３５、４４及び５２のＬＣＤＲ；または、
（ｉ）配列番号９、１８及び２７のＨＣＤＲと配列番号３６、４２及び５３のＬＣＤＲ。
【0011】
３．前記項目１において、ＴＧＦβ結合部は、ＴＧＦβに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、アプタマーおよびＴＧＦβ受容体からなる群より選択される、二重特異性分子。
【0012】
４．前記項目１において、ＴＧＦβ結合部は、リンカーによって連結されている、二重特異性分子。
【0013】
５．前記項目１において、ＴＧＦβ結合部は、配列番号２８０のアミノ酸配列からなる、二重特異性分子。
【0014】
６．前記項目１において、ＴＧＦβ結合部は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３からなる群より選択されるいずれか１つのＴＧＦβに特異的に結合する、二重特異性分子。
【0015】
７．前記項目２において、重鎖可変領域は、下記ＨＦＲからなる群より選択されるいずれか１つのフレームワーク配列を含み、軽鎖可変領域は、下記ＬＦＲからなる群より選択されるいずれか１つのフレームワーク配列を含む、二重特異性分子：
（ｈｆ１）配列番号５４、６３、６８及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ２）配列番号５５、６３、６９及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ３）配列番号５６、６４、７０及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ４）配列番号５６、６４、７１及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ５）配列番号５７、６４、７０及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ６）配列番号５８、６４、７２及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ７）配列番号５９、６５、７３及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ８）配列番号６０、６５、７３及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ９）配列番号６１、６６、７４及び３３４のＨＦＲ；および、
（ｈｆ１０）配列番号６２、６７、７５及び３３４のＨＦＲ、
（ｌｆ１）配列番号７６、８２、８６及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ２）配列番号７７、８２、８７及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ３）配列番号７８、８３、８８及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ４）配列番号７９、８４、８９及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ５）配列番号８０、８４、９０及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ６）配列番号８０、８４、９１及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ７）配列番号８１、８５、９２及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ８）配列番号９３、９８、１０１及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ９）配列番号９３、９８、１０２及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ１０）配列番号９３、９８、１０３及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ１１）配列番号９３、９８、１０４及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ１２）配列番号９４、９８、１０５及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ１３）配列番号９５、９９、１０６及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ１４）配列番号９６、９９、１０７及び３３６のＬＦＲ；および、
（ｌｆ１５）配列番号９７、１００、１０８及び３３６のＬＦＲ。
（ｈｆ１）配列番号５４、６３、６８及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ２）配列番号５５、６３、６９及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ３）配列番号５６、６４、７０及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ４）配列番号５６、６４、７１及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ５）配列番号５７、６４、７０及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ６）配列番号５８、６４、７２及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ７）配列番号５９、６５、７３及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ８）配列番号６０、６５、７３及び３３４のＨＦＲ；
（ｈｆ９）配列番号６１、６６、７４及び３３４のＨＦＲ；および、
（ｈｆ１０）配列番号６２、６７、７５及び３３４のＨＦＲ、
（ｌｆ１）配列番号７６、８２、８６及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ２）配列番号７７、８２、８７及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ３）配列番号７８、８３、８８及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ４）配列番号７９、８４、８９及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ５）配列番号８０、８４、９０及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ６）配列番号８０、８４、９１及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ７）配列番号８１、８５、９２及び３３５のＬＦＲ；
（ｌｆ８）配列番号９３、９８、１０１及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ９）配列番号９３、９８、１０２及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ１０）配列番号９３、９８、１０３及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ１１）配列番号９３、９８、１０４及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ１２）配列番号９４、９８、１０５及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ１３）配列番号９５、９９、１０６及び３３６のＬＦＲ；
（ｌｆ１４）配列番号９６、９９、１０７及び３３６のＬＦＲ；および、
（ｌｆ１５）配列番号９７、１００、１０８及び３３６のＬＦＲ。
【0016】
８．前記項目２において、重鎖可変領域は、配列番号１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３５、１４２及び１５２からなる群より選択されるいずれか１つであり、軽鎖可変領域は、配列番号２１１、２２１、２２３、２２４、２２５、２３１、３０７、３０９及び３１７からなる群より選択されるいずれか１つである、二重特異性分子。
【0017】
９．前記項目１～８のいずれか１つの二重特異性分子をコードする遺伝子。
【0018】
１０．前記項目９の遺伝子が挿入されたベクターが導入された細胞。
【0019】
１１．前記項目１～８のいずれか１つの二重特異性分子を含む、癌の治療または予防用薬学組成物。
【0020】
１２．前記項目１１において、癌は肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、神経膠腫、神経芽腫、前立腺癌、膵臓癌、大腸癌、結腸癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、腎癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、皮膚癌、脳腫瘍、脳脊髄癌、副腎腫瘍、黒色腫、肉腫、多発性骨髄腫、神経内分泌腫瘍、末梢神経鞘腫瘍および小円形細胞腫瘍からなる群より選択されるいずれか１つである、癌の治療または予防用薬学組成物。
【0021】
１３．前記項目１１において、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤およびＴＩＧＩＴ阻害剤からなる群より選択される免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む、癌の治療または予防用薬学組成物。
【0022】
１４．前記項目１１において、ＣＡＲ－Ｔ、ＴＣＲ－Ｔ、細胞傷害性Ｔリンパ球、腫瘍浸潤リンパ球、ＮＫおよびＣＡＲ－ＮＫからなる群より選択される細胞治療剤をさらに含む、癌の治療または予防用薬学組成物。
【0023】
１５．薬剤として使用するための前記項目１～８のいずれか１つの二重特異性分子。
【発明の効果】
【0024】
本発明の二重特異性分子は、Ｂ７－Ｈ３とＴＧＦβに特異的に結合する。
【0025】
本発明の二重特異性分子は、ＴＧＦβを細胞内に内在化することができる。
【0026】
本発明の二重特異性分子は、免疫チェックポイント阻害剤として活用することができる。
【0027】
本発明の二重特異性分子は、他の免疫チェックポイント阻害剤と併用投与することができる。
【0028】
本発明の二重特異性分子は、ＣＡＲ－Ｔ、ＣＡＲ－ＮＴなどの細胞治療剤と併用投与することができる。
【0029】
本発明の二重特異性分子を対象に投与して疾患を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【0030】
【図7】図７は、＃１～＃９二重特異性分子（＃１（ＴＲＡＰ）～＃９（ＴＲＡＰ））およびＴＧＦβ結合部なしのＢ７－Ｈ３モノクローナル抗体（＃１（ｍｏｎｏ）～＃９（ｍｏｎｏ））の濃度によるＢ７－Ｈ３及びＴＧＦβに対する二重特異性結合親和度を示す。ＴＧＦβ結合部なしのＢ７－Ｈ３モノクローナル抗体（＃１（ｍｏｎｏ）～＃９（ｍｏｎｏ））の処理時には、Ｂ７－Ｈ３及びＴＧＦβへの二重特異性結合が確認されなかった。
【図8】図８は、＃１～＃９二重特異性分子（＃１（ＴＲＡＰ）～＃９（ＴＲＡＰ））およびＴＧＦβ結合部なしのＢ７－Ｈ３モノクローナル抗体（＃１（ｍｏｎｏ）～＃９（ｍｏｎｏ））の濃度によるＢ７－Ｈ３及びＴＧＦβに対する二重特異性結合親和度を示す。ＴＧＦβ結合部なしのＢ７－Ｈ３モノクローナル抗体（＃１（ｍｏｎｏ）～＃９（ｍｏｎｏ））の処理時には、Ｂ７－Ｈ３及びＴＧＦβへの二重特異性結合が確認されなかった。
【図9】図９は、ｐＨＡｂアミンで標識された＃１～＃９二重特異性分子をＲＫＯ細胞株、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株に処理した後、二重特異性分子の内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）の程度を測定したものである。
【図10】図１０は、何も処理していないＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３（Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔ）；および＃１～＃９二重特異性分子を処理したＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株の浸潤アッセイ（ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）の結果を示す。顕微鏡を用いて浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）の程度を撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊを用いて浸潤された細胞の割合を計算した。
【図11】図１１は、何も処理していないＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３（Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔ）；および＃１～＃９二重特異性分子を処理したＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株の遊走アッセイ（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）の結果を示す。顕微鏡を用いて遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）の程度を撮影し、クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ）で染色された細胞の色を抽出して測定したＯＤ値の割合を計算した。
【図13】図１３は、Ｂ７－Ｈ３を過剰発現させた大腸癌細胞株（ＣＴ２６－ＴＮ）を移植したマウスに＃１～＃９二重特異性分子を投与した後の腫瘍の体積変化を示す。Ｇ１（賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ））、Ｇ２（ＩｇＧ）は陰性対照群、Ｇ３（＃５）は＃５二重特異性分子投与群、Ｇ４（＃５＋Ｃｏ）は＃５二重特異性分子およびＰＤ－１阻害剤（ａｎｔｉ ＰＤ－１）併用投与群、Ｇ５（Ｃｏ）はＰＤ－１阻害剤（ａｎｔｉ ＰＤ－１）投与群を示す。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本発明は、Ｂ７－Ｈ３およびＴＧＦβに特異的に結合可能な、二重特異性分子に関するものである。
【0032】
本発明は、Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片と、それに結合したＴＧＦβ結合部とを含む二重特異性分子を提供する。
【0033】
本発明におけるＢ７－Ｈ３抗体の抗原結合断片は、Ｂ７－Ｈ３に特異的に結合する能力を維持する抗体の１つ以上の断片を指す。
【0034】
抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ２など）、またはサブクラスのものであってもよい。
【0035】
抗原結合断片には、（ｉ）ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１およびＣＬドメインからなる１価（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ）の断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域において二硫化結合によって連結された２つのＦａｂ断片を含む２価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）の断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の１つのアーム（ｓｉｎｇｌｅ ａｒｍ）のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなる単一ドメインまたはｄＡｂ断片；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；および、（ｖｉｉ）合成リンカーによって選択的に連結された２つ以上の分離されたＣＤＲの組み合わせが含まれる。
【0036】
また、Ｆｖ断片のＶＬドメイン及びＶＨドメインは分離された遺伝子によって暗号化されるが、これらはＶＬ及びＶＨドメインと対をなすことにより、１価分子を有する単一タンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）または単鎖抗体と呼ばれる。）を生成できるように、組換え方法を用いて合成リンカーによって連結することができる。このような単鎖抗体（ｓｃＦｖ）もまた、抗原結合断片に含まれる。
【0037】
抗原結合断片は、当技術分野で公知の技術を用いて得られ、断片の機能的スクリーニングは、完全（ｉｎｔａｃｔ）な抗体と同様の方法で使用される。抗原結合部位は、組換えＤＮＡ技術により、あるいは完全（ｉｎｔａｃｔ）な免疫グロブリンの酵素的または化学的破壊によって産生することができる。抗体は、異なる表現型、例えばＩｇＧ（例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体として存在し得る。
【0038】
本発明のＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む。
【0039】
本発明のＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域は、以下の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）を含み、軽鎖可変領域は、以下の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）を含む：
（ａ）配列番号１、１０及び１９のＨＣＤＲと配列番号２８、３７及び４５のＬＣＤＲ；（ｂ）配列番号２、１１及び２０のＨＣＤＲと配列番号２９、３８及び４６のＬＣＤＲ；（ｃ）配列番号３、１２及び２１のＨＣＤＲと配列番号３０、３９及び４７のＬＣＤＲ；（ｄ）配列番号４、１３及び２２のＨＣＤＲと配列番号３１、４０及び４８のＬＣＤＲ；（ｅ）配列番号５、１４及び２３のＨＣＤＲと配列番号３２、４１及び４９のＬＣＤＲ；（ｆ）配列番号６、１５及び２４のＨＣＤＲと配列番号３３、４２及び５０のＬＣＤＲ；（ｇ）配列番号７、１６及び２５のＨＣＤＲと配列番号３４、４３及び５１のＬＣＤＲ；（ｈ）配列番号８、１７及び２６のＨＣＤＲと配列番号３５、４４及び５２のＬＣＤＲ；または、（ｉ）配列番号９、１８及び２７のＨＣＤＲと配列番号３６、４２及び５３のＬＣＤＲ。
（ａ）配列番号１、１０及び１９のＨＣＤＲと配列番号２８、３７及び４５のＬＣＤＲ；（ｂ）配列番号２、１１及び２０のＨＣＤＲと配列番号２９、３８及び４６のＬＣＤＲ；（ｃ）配列番号３、１２及び２１のＨＣＤＲと配列番号３０、３９及び４７のＬＣＤＲ；（ｄ）配列番号４、１３及び２２のＨＣＤＲと配列番号３１、４０及び４８のＬＣＤＲ；（ｅ）配列番号５、１４及び２３のＨＣＤＲと配列番号３２、４１及び４９のＬＣＤＲ；（ｆ）配列番号６、１５及び２４のＨＣＤＲと配列番号３３、４２及び５０のＬＣＤＲ；（ｇ）配列番号７、１６及び２５のＨＣＤＲと配列番号３４、４３及び５１のＬＣＤＲ；（ｈ）配列番号８、１７及び２６のＨＣＤＲと配列番号３５、４４及び５２のＬＣＤＲ；または、（ｉ）配列番号９、１８及び２７のＨＣＤＲと配列番号３６、４２及び５３のＬＣＤＲ。
【0040】
重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３からなり、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３からなる。例えば、前記配列（ａ）において、配列番号１のアミノ酸配列はＨＣＤＲ１、配列番号１０のアミノ酸配列はＨＣＤＲ２、配列番号１９のアミノ酸配列はＨＣＤＲ３であり、配列番号２８のアミノ酸配列はＬＣＤＲ１、配列番号３７のアミノ酸配列はＬＣＤＲ２、配列番号４５のアミノ酸配列はＬＣＤＲ３である。
【0041】
本発明のＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片は、前記のような相補性決定領域を含むだけで、フレームワーク配列に関係なくＢ７－Ｈ３抗原に特異的に結合する。
【0042】
本発明の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、様々なフレームワーク配列を含むことができる。
【0043】
本発明の重鎖可変領域は、例えば、以下の重鎖フレームワーク配列（ＨＦＲ）からなる群より選択されるいずれか１つの配列を含むことができる：
（ｈｆ１）配列番号５４、６３、６８及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ２）配列番号５５、６３、６９及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ３）配列番号５６、６４、７０及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ４）配列番号５６、６４、７１及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ５）配列番号５７、６４、７０及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ６）配列番号５８、６４、７２及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ７）配列番号５９、６５、７３及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ８）配列番号６０、６５、７３及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ９）配列番号６１、６６、７４及び３３４のＨＦＲ；および、（ｈｆ１０）配列番号６２、６７、７５及び３３４のＨＦＲ。
（ｈｆ１）配列番号５４、６３、６８及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ２）配列番号５５、６３、６９及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ３）配列番号５６、６４、７０及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ４）配列番号５６、６４、７１及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ５）配列番号５７、６４、７０及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ６）配列番号５８、６４、７２及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ７）配列番号５９、６５、７３及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ８）配列番号６０、６５、７３及び３３４のＨＦＲ；（ｈｆ９）配列番号６１、６６、７４及び３３４のＨＦＲ；および、（ｈｆ１０）配列番号６２、６７、７５及び３３４のＨＦＲ。
【0044】
本発明の軽鎖可変領域は、例えば、以下の軽鎖フレームワーク配列（ＬＦＲ）からなる群より選択されるいずれか１つの配列を含むことができる：
（ｌｆ１）配列番号７６、８２、８６及び３３５のＬＦＲ；（ｌｆ２）配列番号７７、８２、８７及び３３５のＬＦＲ；（ｌｆ３）配列番号７８、８３、８８及び３３５のＬＦＲ；（ｌｆ４）配列番号７９、８４、８９及び３３５のＬＦＲ；（ｌｆ５）配列番号８０、８４、９０及び３３５のＬＦＲ；（ｌｆ６）配列番号８０、８４、９１及び３３５のＬＦＲ；（ｌｆ７）配列番号８１、８５、９２及び３３５のＬＦＲ；（ｌｆ８）配列番号９３、９８、１０１及び３３６のＬＦＲ；（ｌｆ９）配列番号９３、９８、１０２及び３３６のＬＦＲ；（ｌｆ１０）配列番号９３、９８、１０３及び３３６のＬＦＲ；（ｌｆ１１）配列番号９３、９８、１０４及び３３６のＬＦＲ；（ｌｆ１２）配列番号９４、９８、１０５及び３３６のＬＦＲ；（ｌｆ１３）配列番号９５、９９、１０６及び３３６のＬＦＲ；（ｌｆ１４）配列番号９６、９９、１０７及び３３６のＬＦＲ；および、（ｌｆ１５）配列番号９７、１００、１０８及び３３６のＬＦＲ。
（ｌｆ１）配列番号７６、８２、８６及び３３５のＬＦＲ；（ｌｆ２）配列番号７７、８２、８７及び３３５のＬＦＲ；（ｌｆ３）配列番号７８、８３、８８及び３３５のＬＦＲ；（ｌｆ４）配列番号７９、８４、８９及び３３５のＬＦＲ；（ｌｆ５）配列番号８０、８４、９０及び３３５のＬＦＲ；（ｌｆ６）配列番号８０、８４、９１及び３３５のＬＦＲ；（ｌｆ７）配列番号８１、８５、９２及び３３５のＬＦＲ；（ｌｆ８）配列番号９３、９８、１０１及び３３６のＬＦＲ；（ｌｆ９）配列番号９３、９８、１０２及び３３６のＬＦＲ；（ｌｆ１０）配列番号９３、９８、１０３及び３３６のＬＦＲ；（ｌｆ１１）配列番号９３、９８、１０４及び３３６のＬＦＲ；（ｌｆ１２）配列番号９４、９８、１０５及び３３６のＬＦＲ；（ｌｆ１３）配列番号９５、９９、１０６及び３３６のＬＦＲ；（ｌｆ１４）配列番号９６、９９、１０７及び３３６のＬＦＲ；および、（ｌｆ１５）配列番号９７、１００、１０８及び３３６のＬＦＲ。
【0045】
本発明の重鎖フレームワーク配列（ＨＦＲ）はＨＦＲ１、ＨＦＲ２、ＨＦＲ３およびＨＦＲ４からなり、軽鎖フレームワーク配列（ＬＦＲ）はＬＦＲ１、ＬＦＲ２、ＬＦＲ３およびＬＦＲ４からなる。例えば、前記配列（ｈｆ１）において、配列番号５４のアミノ酸配列はＨＦＲ１、配列番号６３のアミノ酸配列はＨＦＲ２、配列番号６８のアミノ酸配列はＨＦＲ３、配列番号３３４のアミノ酸配列はＨＦＲ４である。また、例えば、前記配列（ｌｆ１）において、配列番号７６のアミノ酸配列はＬＦＲ１、配列番号８２のアミノ酸配列はＬＦＲ２、配列番号８６のアミノ酸配列はＬＦＲ３、配列番号３３５のアミノ酸配列はＬＦＲ４である。
【0046】
本発明の重鎖可変領域のフレームワーク配列（ｈｆ１～ｈｆ１０）と、軽鎖可変領域のフレームワーク配列（ｌｆ１～ｌｆ１５）は、任意に組み合わせることができる。
【0047】
本発明のＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片の重鎖および軽鎖相補性決定領域配列と、重鎖および軽鎖フレームワーク配列は、任意に組み合わせることができる。例えば、（ａ）～（ｉ）のいずれか１つの重鎖および軽鎖相補性決定領域配列と、（ｈｆ１）～（ｈｆ１０）のいずれか１つの重鎖フレームワーク配列と、（ｌｆ１）～（ｌｆ１５）のいずれか１つの軽鎖フレームワーク配列を任意に組み合わせることができる。
【0048】
本発明の重鎖可変領域は、例えば、配列番号１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３５、１４２及び１５２からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなっていてもよい。
【0049】
本発明の軽鎖可変領域は、例えば、配列番号２１１、２２１、２２３、２２４、２２５、２３１、３０７、３０９及び３１７からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなっていてもよい。
【0050】
本発明の（ａ）～（ｉ）の相補性決定領域を有する抗体またはその抗原結合断片は、そのエピトープ（抗原決定因子）が同一でも異なっていてもよい。エピトープとは、抗体または抗原結合断片が特異的に結合するＢ７－Ｈ３抗原の部位を意味する。本発明では、（ａ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、（ｈ）及び（ｉ）の相補性決定領域を有する抗体又はその抗原結合断片のエピトープが同じであり、（ｂ）及び（ｃ）の相補性決定領域を有する抗体またはその抗原結合断片のエピトープが同じである。
【0051】
本発明の一実施形態では、二重特異性分子のうちの＃１～＃９二重特異性分子は、以下のような重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む：＃１：配列番号１２７の重鎖可変領域および配列番号３０７の軽鎖可変領域；＃２：配列番号１２８の重鎖可変領域および配列番号３１７の軽鎖可変領域；＃３：配列番号１２９の重鎖可変領域および配列番号３０９の軽鎖可変領域；＃４：配列番号１３０の重鎖可変領域および配列番号２１１の軽鎖可変領域；＃５：配列番号１３１の重鎖可変領域および配列番号２２１の軽鎖可変領域；＃６：配列番号１３２の重鎖可変領域および配列番号２３１の軽鎖可変領域；＃７：配列番号１４２の重鎖可変領域および配列番号２２３の軽鎖可変領域；＃８：配列番号１５２の重鎖可変領域および配列番号２２４の軽鎖可変領域；および、＃９：配列番号１３５の重鎖可変領域および配列番号２２５の軽鎖可変領域。
【0052】
本発明の＃１～＃９二重特異性分子では、＃１、＃４、＃５、＃７、＃８及び＃９二重特異性分子のＢ７－Ｈ３エピトープが同じであり、＃２及び＃３二重特異性分子のＢ７－Ｈ３エピトープが同じである。
【0053】
本発明のＴＧＦβ結合部は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３からなる群より選択されるいずれか１つに特異的に結合することができる。例えば、ＴＧＦβ１のみに特異的に結合してもよく、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３のすべてに特異的に結合してもよい。
【0054】
本発明のＴＧＦβ結合部は、ＴＧＦβに特異的に結合できればその種類を限定せず、例えば抗体またはその抗原結合断片、アプタマー、または、ＴＧＦβ受容体であってもよい。
【0055】
ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合断片は、ＴＧＦβに特異的に結合することが知られている公知の抗体または抗原結合断片を使用することができ、例えば、韓国公開特許第１０－２０２２－００５２９１９号に記載の「ＴＧＦ－βリガンドに結合できるｓｃＦｖ」を使用することができる。
【0056】
ＴＧＦβに特異的に結合するアプタマーは、ＴＧＦβに特異的に結合することが知られている公知のアプタマーを使用することができ、例えば、核酸アプタマーまたはペプチドアプタマーを使用することができる。
【0057】
ＴＧＦβ受容体は公知のＴＧＦβ受容体、その変異体またはそれらの切片を使用することができ、例えば、韓国公開特許第１０－２０２２－００５２９１９号に記載の「ＴＧＦ－β受容体の細胞外部分」を使用するか、または配列番号３３７のアミノ酸配列を含むポリペプチドを使用することができる。
【0058】
本発明の二重特異性分子のＴＧＦβ結合部は、Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片に直接連結されていてもよく、リンカーで連結されていてもよい。
【0059】
リンカーは、二重特異性分子がＢ７－Ｈ３とＴＧＦβに結合することを阻害しないものであれば、長さおよび配列を制限せずに自由に使用できる。例えば、リンカーは、アミノ酸Ｇとアミノ酸Ｓを含む単位配列（例えば、ＧＧＧＧＳ）が１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上連続したものであってもよく、単位配列ＧＧＧＧＳが３個連続した配列番号３３８のアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。
【0060】
本発明のＴＧＦβ結合部は、Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片のＮ末端またはＣ末端にコンジュゲートされていてもよい。例えば、Ｂ７－Ｈ３抗体の重鎖Ｃ末端または軽鎖Ｃ末端にＴＧＦβ結合部がコンジュゲートされていてもよく、ｓｃＦｖのＮ末端またはＣ末端にＴＧＦβ結合部がコンジュゲートされていてもよい。
【0061】
本発明の二重特異性分子は、Ｂ７－Ｈ３またはＴＧＦβに結合することができ、Ｂ７－Ｈ３及びＴＧＦβの両方に二重結合することができる。
【0062】
本発明の二重特異性分子は、Ｂ７－Ｈ３への結合力に優れている。
【0063】
本発明の二重特異性分子は、癌微小環境のＴＧＦβと結合し、細胞表面に存在するＢ７－Ｈ３に結合することにより、ＴＧＦβを細胞内に内在化して除去することができる。
【0064】
本発明の二重特異性分子は、Ｂ７－Ｈ３の生成を抑制することができる。
【0065】
本発明の二重特異性分子はＴ細胞の活性化に寄与する。
【0066】
本発明は、前述のＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片と、それに結合したＴＧＦβ結合部とを含む二重特異性分子をコードする遺伝子を提供する。
【0067】
本発明の二重特異性分子をコードする遺伝子は発現ベクターに含まれ得る。発現ベクターは、プロモーター、プロモーターと作動可能に連結されたＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片遺伝子、制限酵素切断部位などを含む。
【0068】
本発明の発現ベクターは、ウイルスベクター、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、陽イオン性縮合剤と会合したＤＮＡまたはＲＮＡベクター、或いはリポソーム内にカプセル化されたＤＮＡまたはＲＮＡベクターであってもよい。
【0069】
本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入することができる。
【0070】
本発明の宿主細胞は、動物細胞、植物細胞、真核微生物などの真核細胞であってもよく、例えば、ＮＳ０細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫＩＩ細胞、Ｓｆ９細胞などであってもよい。
【0071】
本発明の宿主細胞は原核細胞であってもよく、例えば、大腸菌、古草菌などであってもよい。
【0072】
本発明は、前述の宿主細胞を培養して、Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片と、それに結合したＴＧＦβ結合部とを含む二重特異性分子を製造する方法を提供する。培養は公知の方法によって行うことができ、培養温度、培養時間、培地の種類およびｐＨなどの条件は、細胞の種類などによって適宜調整することができる。
【0073】
本発明の二重特異性分子の製造方法は、生産された二重特異性分子を分離、精製して回収するステップをさらに含むことができる。例えば、二重特異性分子の回収のために、ろ過、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ＨＰＬＣなどの方法を用いることができる。
【0074】
本発明は、前述のＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片と、それに結合したＴＧＦβ結合部とを含む二重特異性分子を含む、癌の治療または予防用薬学組成物を提供する。
【0075】
本発明の二重特異性分子は、Ｂ７－Ｈ３が発現された癌細胞のＢ７－Ｈ３に結合してＢ７－Ｈ３の活性を中和（抑制）し、ＴＧＦβを細胞内に内在化させて除去させることによって免疫細胞の活性化を誘導することができ、これにより癌を治療することができる。
【0076】
本発明の二重特異性分子は、癌細胞の表面に免疫チェックポイント分子であるＢ７－Ｈ３の発現を抑制することにより、免疫細胞の活性化を誘導し、これにより癌を治療することができる。
【0077】
本発明の二重特異性分子は、ＴＧＦβを除去することにより、免疫細胞の活性化を誘導し、これにより癌を治療することができる。
【0078】
本発明の癌はＥＧＦＲ過剰発現の癌であってもよい。
【0079】
本発明の癌は、肺癌（小細胞肺癌および非小細胞肺癌）、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、神経膠腫、神経芽腫、前立腺癌、膵臓癌、大腸癌、結腸癌、頭頸部癌、白血病、リンパ腫、腎癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、皮膚癌、脳腫瘍、脳脊髄癌、副腎腫瘍、黒色腫、肉腫（骨肉腫および軟部組織肉腫）、多発性骨髄腫、神経内分泌腫瘍、末梢神経鞘腫瘍および小円形細胞腫瘍からなる群より選択されるいずれか１つであってもよい。
【0080】
本発明の薬学組成物は固形癌にさらに効果的であり得る。
【0081】
本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、担体と共に製剤化することができる。「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せず投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤を意味する。
【0082】
液状組成物の薬学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの混合物を含む。必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【0083】
本発明の薬学組成物は製剤に制限がない。例えば、経口用または非経口用製剤で製造することができる。より具体的には、口腔（ｏｒａｌ）、直腸（ｒｅｃｔａｌ）、鼻腔（ｎａｓａｌ）、局所（ｔｏｐｉｃａｌ；頬および舌下を含む）、皮下、膣（ｖａｇｉｎａｌ）または筋肉内、皮下および静脈内投与を含む。また、吸入（ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）または注入（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ）による投与に適した形態を含む。
【0084】
本発明の薬学組成物は、薬学的に有効な量で投与する。有効量は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、排出割合、治療期間、同時使用される薬物を含む要素、およびその他の医学分野でよく知られている要素によって決定できる。
【0085】
本発明の薬学組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食物、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによって異なり得る。適正な投与量は、例えば、患者の体内に蓄積された薬物の量及び／又は使用される本発明の有効成分の効能程度によって異なり得る。
【0086】
一般に、インビボ動物モデルおよびインビトロで有効であると測定されたＥＣ５０に基づいて計算することができ、例えば、体重１ｋｇ当たりに０．０１μｇ～１ｇであってもよい。日、週、月、または年の単位期間に、単位期間当たりに一回または数回に分けて投与してもよく、若しくはインフュージョンポンプを用いて長期間連続して投与してもよい。反復投与の回数は、薬物の体内滞在時間、体内薬物濃度などを考慮して決定する。疾患の治療経過によっては、治療された後でも再発防止のために組成物を投与することができる。
【0087】
本発明の薬学組成物は、免疫チェックポイント阻害剤をさらに含むことができる。例えば、本発明の薬学組成物は、ＰＤ－１阻害剤、ＰＤ－Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ４阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、ＴＩＭ３阻害剤およびＴＩＧＩＴ阻害剤からなる群より選択される免疫チェックポイント阻害剤をさらに含むことができる。
【0088】
本発明の薬学組成物は、細胞治療剤をさらに含むことができる。例えば、本発明の薬学組成物は、ＣＡＲ－Ｔ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ）、ＴＣＲ－Ｔ（Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｔ ｃｅｌｌ）、細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＴＩＬ）、ＮＫ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）、およびＣＡＲ－ＮＫ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）からなる群より選択される細胞治療剤をさらに含むことができる。
【0089】
本発明の薬学組成物は、有効成分の溶解性および吸収性を維持ないし増加させる成分をさらに含有することができる。また、化学治療剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤、免疫調節剤などをさらに含むことができる。
【0090】
本発明の薬学組成物は、哺乳動物に投与された後に活性成分の迅速、持続または遅延された放出を提供できるように、当技術分野で公知の方法を用いて製剤化することができる。製剤は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質のゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末の形態であってもよい。
【0091】
本発明は、Ｂ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片と、それに結合したＴＧＦβ結合部とを含む二重特異性分子をコードする遺伝子を対象に投与するステップを含む癌の治療方法を提供する。治療可能な癌は前述の通りである。
【0092】
本発明の二重特異性分子、またはそれをコードする遺伝子は、治療を目的でヒト対象体に投与することができる。
【0093】
本発明の二重特異性分子、またはそれをコードする遺伝子は、獣医学的な目的でまたはヒト疾患の動物モデルとしてＢ７－Ｈ３を発現する非ヒト哺乳動物に投与することができる。
【0094】
本発明は、薬剤として使用するためのＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片と、それに結合したＴＧＦβ結合部とを含む二重特異性分子を提供する。
【0095】
本発明の二重特異性分子は、治療を目的で「Ｂ７－Ｈ３の活性が有害な疾患または障害」を患っている対象体に投与することができる。
【0096】
本発明の「Ｂ７－Ｈ３の活性が有害な疾患または障害」は、特定の疾患または障害を患っている対象体において、Ｂ７－Ｈ３の存在が障害の病理生理学に責任があるか、または障害の悪化に寄与する因子であることが判明したり、または疑われる疾患および障害を含む。
【0097】
本発明の薬剤は抗癌剤であってもよい。癌は前述の通りである。
【0098】
配列番号１～２７は、本発明のＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域における相補性決定領域（ＨＣＤＲ）配列である。配列番号１～９はＨＣＤＲ１配列、配列番号１０～１８はＨＣＤＲ２配列、配列番号１９～２７はＨＣＤＲ３配列である。
【0099】
配列番号２８～５３は、本発明のＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域における相補性決定領域（ＬＣＤＲ）配列である。配列番号２８～３６はＬＣＤＲ１配列、配列番号３７～４４はＬＣＤＲ２配列、配列番号４５～５３はＬＣＤＲ３配列である。
【0100】
配列番号５４～７５は、本発明のＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域におけるフレームワーク配列（ＨＦＲ）である。配列番号５４～６２はＨＦＲ１配列、配列番号６３～６７はＨＦＲ２配列、配列番号６８～７５はＨＦＲ３配列である。
【0101】
配列番号７６～９２は、本発明のＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片のκ軽鎖可変領域におけるフレームワーク配列（ＬＦＲ）である。配列番号７６～８１はＬＦＲ１配列、配列番号８２～８５はＬＦＲ２配列、配列番号８６～９２はＬＦＲ３配列である。
【0102】
配列番号９３～１０８は、本発明のＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片のλ軽鎖可変領域におけるフレームワーク配列（ＬＦＲ）である。配列番号９３～９７はＬＦＲ１配列、配列番号９８～１００はＬＦＲ２配列、配列番号１０１～１０８はＬＦＲ３配列である。
【0103】
配列番号１０９～１９８は、前述のＨＣＤＲおよびＨＦＲ配列を含む本発明のＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域（ＶＨ）配列である。
【0104】
配列番号１９９～３３３は、前述のＬＣＤＲおよびＬＦＲ配列を含む本発明のＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列である。
【0105】
配列番号３３４は、本発明のＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片の重鎖可変領域フレームワーク配列におけるＨＦＲ４配列である。配列番号３３５及び３３６は、本発明のＢ７－Ｈ３抗体またはその抗原結合断片の軽鎖可変領域フレームワーク配列におけるＬＦＲ４配列である。
【0106】
配列番号３３７は、本発明の一実施形態によるＴＧＦβ受容体のアミノ酸配列である。配列番号３３８は、本発明の一実施形態によるリンカーのアミノ酸配列である。
【0107】
配列番号３３９～３４７は、本発明の一実施形態による＃１～＃９二重特異性分子の「Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖配列」、「リンカー配列（配列番号３３８）」、「ＴＧＦβ受容体配列（配列番号３３７）」が順に連結されている配列である。Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖配列は、前述のＢ７－Ｈ３抗体の重鎖可変領域の後に配列番号３４８の重鎖定常領域配列が連結されている配列である。
【0108】
以下、本発明を、実施例を挙げてより詳細に説明する。
【実施例】
【0109】
本発明の一実施形態による二重特異性分子のＢ７－Ｈ３結合力、ＴＧＦβ結合力、ＴＧＦβ細胞内在化能、癌細胞の浸潤および遊走抑制能などに対する実験結果を下記実施例にまとめた。図表および本文中、＃１は、配列番号３３９の（Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖）－（リンカー）－（ＴＧＦβ結合部）および配列番号３０７のＢ７－Ｈ３抗体軽鎖可変領域を含む二重特異性分子；＃２は、配列番号３４０の（Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖）－（リンカー）－（ＴＧＦβ結合部）および配列番号３１７のＢ７－Ｈ３抗体軽鎖可変領域を含む二重特異性分子；＃３は、配列番号３４１の（Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖）－（リンカー）－（ＴＧＦβ結合部）および配列番号３０９のＢ７－Ｈ３抗体軽鎖可変領域を含む二重特異性分子；＃４は、配列番号３４２の（Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖）－（リンカー）－（ＴＧＦβ結合部）および配列番号２１１のＢ７－Ｈ３抗体軽鎖可変領域を含む二重特異性分子；＃５は、配列番号３４３の（Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖）－（リンカー）－（ＴＧＦβ結合部）および配列番号２２１のＢ７－Ｈ３抗体軽鎖可変領域を含む二重特異性分子；＃６は、配列番号３４４の（Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖）－（リンカー）－（ＴＧＦβ結合部）および配列番号２３１のＢ７－Ｈ３抗体軽鎖可変領域を含む二重特異性分子；＃７は、配列番号３４５の（Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖）－（リンカー）－（ＴＧＦβ結合部）および配列番号２２３のＢ７－Ｈ３抗体軽鎖可変領域を含む二重特異性分子；＃８は、配列番号３４６の（Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖）－（リンカー）－（ＴＧＦβ結合部）および配列番号２２４のＢ７－Ｈ３抗体軽鎖可変領域を含む二重特異性分子；＃９は、配列番号３４７の（Ｂ７－Ｈ３抗体重鎖）－（リンカー）－（ＴＧＦβ結合部）および配列番号２２５のＢ７－Ｈ３抗体軽鎖可変領域を含む二重特異性分子である。
【0110】
また、図表および本文中、＃１、＃２等で表記したものと、＃１（ＴＲＡＰ）、＃２（ＴＲＡＰ）等で表記したものは、本発明の一実施形態による二重特異性分子を意味するものであり、＃１（ｍｏｎｏ）、＃２（ｍｏｎｏ）等で表記した場合は、ＴＧＦβ結合部を含まないモノクローナル抗体を意味する。
【0111】
実施例１：ＥＬＩＳＡ法を用いたＢ７－Ｈ３結合力の試験
タンパク質Ｂ７－Ｈ３へのＢ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子の結合力を確認するために本実験を行った。
タンパク質Ｂ７－Ｈ３へのＢ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子の結合力を確認するために本実験を行った。
【0112】
実験方法
以下の方法により、＃１～＃９二重特異性分子の濃度によるＢ７－Ｈ３への結合力を確認した。
以下の方法により、＃１～＃９二重特異性分子の濃度によるＢ７－Ｈ３への結合力を確認した。
【0113】
１Ｘ ＰＢＳ溶液中の組換えヒトＢ７－Ｈ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃１０２７－Ｂ３－１００）（３０μＬ、２０ｎＭ）でプレートをコーティングした後、プレートを覆い、２～８℃で一晩コーティングした。その後、ウェル当たりに１５０μＬのＰＢＳで１回洗浄し、ブロッキングバッファー（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ, １Ｘ ＰＢＳ－Ｔ ｗ／３％ ＢＳＡ）をウェル当たりに１２０μＬで室温で２時間ブロッキングした。ブロッキングバッファーを捨て、一連の希釈液を用いて（ブロッキングバッファーを用いて、＃１～＃９二重特異性分子を一連的に２倍に希釈した；２－ｆｏｌｄ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）３０μＬの抗体溶液を加え、室温で１時間反応させ、ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液でウェルを３回洗浄した。ブロッキングバッファーに希釈した抗ＨＡタグ抗体のＨＲＰ接合体３０μＬを各ウェルに加え、室温で１時間反応させた。その後、ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液でウェルを３回洗浄し、ＴＭＢを用いてＨＲＰ反応を展開し、１Ｎ ＨＣｌを用いて反応を停止した後、４５０ｎｍにおける光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ, ＯＤ）を測定した。
【0114】
結果
＃１～＃９二重特異性分子の濃度によるＢ７－Ｈ３への結合力、および＃１～＃９二重特異性分子を処理した場合、５０％のＢ７－Ｈ３が抗原－抗体結合状態で存在することを可能にするそれぞれの二重特異性分子の濃度（ＥＣ５０）を確認した（図１、表１）。＃１～＃９二重特異性分子が優れた結合力でＢ７－Ｈ３に特異的に結合することが確認された。
＃１～＃９二重特異性分子の濃度によるＢ７－Ｈ３への結合力、および＃１～＃９二重特異性分子を処理した場合、５０％のＢ７－Ｈ３が抗原－抗体結合状態で存在することを可能にするそれぞれの二重特異性分子の濃度（ＥＣ５０）を確認した（図１、表１）。＃１～＃９二重特異性分子が優れた結合力でＢ７－Ｈ３に特異的に結合することが確認された。
【0115】
【表1】
【0116】
実施例２：Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡ法を用いた抗体のＢ７－Ｈ３結合力の試験
細胞膜に発現したＢ７－Ｈ３へのＢ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子の結合力を確認するために本実験を行った。
細胞膜に発現したＢ７－Ｈ３へのＢ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子の結合力を確認するために本実験を行った。
【0117】
実験方法
２．１．試薬の準備
１Ｘ ＰＢＳ及び１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）を準備した。ブロッキングバッファーは、ＢＳＡを３％ＢＳＡ ｉｎ １Ｘ ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）になるように作製した。抗体希釈バッファー（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）は、ＢＳＡを１％ＢＳＡ ｉｎ １Ｘ ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）になるように作製した。
２．１．試薬の準備
１Ｘ ＰＢＳ及び１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）を準備した。ブロッキングバッファーは、ＢＳＡを３％ＢＳＡ ｉｎ １Ｘ ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）になるように作製した。抗体希釈バッファー（Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）は、ＢＳＡを１％ＢＳＡ ｉｎ １Ｘ ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）になるように作製した。
【0118】
２．２．細胞の採取および播種
ＲＫＯ細胞株、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株から細胞を採取した後、３×１０４ ｃｅｌｌｓ、１００μＬ／ｗｅｌｌで播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）できるように培養培地（１０％ＦＢＳを追加）で希釈して細胞濃度を合わせた。細胞培養プレート、９６ウェルプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで播種した後、５％ＣＯ２、３７℃インキュベーターで一晩培養した。
ＲＫＯ細胞株、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株から細胞を採取した後、３×１０４ ｃｅｌｌｓ、１００μＬ／ｗｅｌｌで播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）できるように培養培地（１０％ＦＢＳを追加）で希釈して細胞濃度を合わせた。細胞培養プレート、９６ウェルプレートに１００μＬ／ｗｅｌｌで播種した後、５％ＣＯ２、３７℃インキュベーターで一晩培養した。
【0119】
２．３．細胞固定およびブロッキング
１）８％パラホルムアルデヒド溶液を９６ウェルプレートに１００μＬ添加し、３００ｇ、１０分間遠心分離を行った後、遠心分離時間を含めて合計２０分間室温で固定した。
１）８％パラホルムアルデヒド溶液を９６ウェルプレートに１００μＬ添加し、３００ｇ、１０分間遠心分離を行った後、遠心分離時間を含めて合計２０分間室温で固定した。
【0120】
２）その後、固定液を除去し、１Ｘ ＰＢＳを２５０μＬ／ｗｅｌｌで添加してウェルを３回洗浄した。
【0121】
３）洗浄後、ブロッキングバッファーを２５０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間反応させた。ブロッキングバッファーを除去した後、１Ｘ ＰＢＳ－Ｔを２５０μＬ／ｗｅｌｌで添加してウェルを再び洗浄し、ウェルに残っているＰＢＳ－Ｔは払った（この洗浄過程を３回繰り返した。）。
【0122】
２．４．抗体反応
＃１～＃９二重特異性分子を連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）法で希釈した後、下記表２に示す濃度の希釈試料（二重特異性分子）を１００μＬずつｄｕｐｌｉｃａｔｅで９６ウェルプレートに分注し、室温で２時間の間、二重特異性分子が結合するようにした。その後、洗浄を３回行った。
＃１～＃９二重特異性分子を連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）法で希釈した後、下記表２に示す濃度の希釈試料（二重特異性分子）を１００μＬずつｄｕｐｌｉｃａｔｅで９６ウェルプレートに分注し、室温で２時間の間、二重特異性分子が結合するようにした。その後、洗浄を３回行った。
【0123】
本実験で使用した二重特異性分子の濃度を下記表２に示す。
【0124】
【表2】
【0125】
２．５．検出抗体反応
抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２,ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ結合抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を、抗体希釈バッファーを用いて１：５，０００の割合で希釈し、各ウェルに１００μＬずつ分注した後、室温で１時間反応させた。その後、ウェルを３回洗浄し、１００μＬの１－ｓｔｅｐ ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液を各ウェルに分注した後、光を避けて１０分間室温で反応させた。１０分後、５０μＬの１Ｎ ＨＣｌを各ウェルに添加してＴＭＢ反応を停止させ、４５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ値を測定した。
抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２,ウサギＩｇＧペルオキシダーゼ結合抗体（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｒａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を、抗体希釈バッファーを用いて１：５，０００の割合で希釈し、各ウェルに１００μＬずつ分注した後、室温で１時間反応させた。その後、ウェルを３回洗浄し、１００μＬの１－ｓｔｅｐ ＴＭＢ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液を各ウェルに分注した後、光を避けて１０分間室温で反応させた。１０分後、５０μＬの１Ｎ ＨＣｌを各ウェルに添加してＴＭＢ反応を停止させ、４５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ値を測定した。
【0126】
結果
＃１～＃９二重特異性分子の濃度によるＲＫＯおよびＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株への結合親和度を確認した。
＃１～＃９二重特異性分子の濃度によるＲＫＯおよびＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株への結合親和度を確認した。
【0127】
Ｂ７－Ｈ３を過剰発現させなかったＲＫＯ細胞株に対しては＃１～＃９二重特異性分子のすべてが弱い結合力を示したが（図２）、細胞膜にＢ７－Ｈ３を過剰発現させたＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株に対しては＃１～＃９二重特異性分子のすべてが強い結合力を示した（図３および表３）。
【0128】
表３は、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞に対する各二重特異性分子のＥＣ５０濃度を示す。
【0129】
【表3】
【0130】
実施例３：ＥＬＩＳＡ法を用いたＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３結合力の試験
タンパク質ＴＧＦβ（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３）へのＢ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子の結合力を確認するために本実験を行った。
タンパク質ＴＧＦβ（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３）へのＢ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子の結合力を確認するために本実験を行った。
【0131】
実験方法
３．１．ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３への結合力の試験
１Ｘ ＰＢＳ溶液中の組換えヒトＴＧＦβ１タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃７７５４－ＢＨ－０２５／ＣＦ）およびＴＧＦβ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃８４２０－Ｂ３－０２５／ＣＦ）（３０μＬ、０．５μｇ／ｍｌ）をそれぞれプレートにコーティングした後、プレートを覆い、２～８℃で一晩培養した。その後、ウェル当たりに１５０μＬのＰＢＳで１回洗浄し、ブロッキングバッファー（１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ ｗ／３％ ＢＳＡ）をウェル当たりに１２０μＬで室温で２時間ブロッキングした。ブロッキングバッファーを捨て、＃１～＃９二重特異性分子を含む溶液（５倍連続希釈）３０μＬを加えて室温で１時間反応させ、ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液でウェルを３回洗浄した。ブロッキングバッファーに希釈したＨＲＰ接合抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ Ａｂ ３０μＬを各ウェルに加え、室温で１時間反応させた。その後、ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液でウェルを３回洗浄し、ＴＭＢを用いてＨＲＰ反応を展開し、３０μＬの１Ｎ ＨＣｌで反応を停止した。その後、４５０ｎｍにおける光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ, ＯＤ）を測定した。
３．１．ＴＧＦβ１またはＴＧＦβ３への結合力の試験
１Ｘ ＰＢＳ溶液中の組換えヒトＴＧＦβ１タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃７７５４－ＢＨ－０２５／ＣＦ）およびＴＧＦβ３タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃８４２０－Ｂ３－０２５／ＣＦ）（３０μＬ、０．５μｇ／ｍｌ）をそれぞれプレートにコーティングした後、プレートを覆い、２～８℃で一晩培養した。その後、ウェル当たりに１５０μＬのＰＢＳで１回洗浄し、ブロッキングバッファー（１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ ｗ／３％ ＢＳＡ）をウェル当たりに１２０μＬで室温で２時間ブロッキングした。ブロッキングバッファーを捨て、＃１～＃９二重特異性分子を含む溶液（５倍連続希釈）３０μＬを加えて室温で１時間反応させ、ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液でウェルを３回洗浄した。ブロッキングバッファーに希釈したＨＲＰ接合抗ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ Ａｂ ３０μＬを各ウェルに加え、室温で１時間反応させた。その後、ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液でウェルを３回洗浄し、ＴＭＢを用いてＨＲＰ反応を展開し、３０μＬの１Ｎ ＨＣｌで反応を停止した。その後、４５０ｎｍにおける光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ, ＯＤ）を測定した。
【0132】
３．２．ＴＧＦβ２への結合力の試験
＃１～＃９二重特異性分子を含む１Ｘ ＰＢＳ溶液（３０μＬ、０．５μＭ）でプレートをコーティングした後、プレートを覆い、２～８℃で一晩培養した。その後、ウェル当たりに１５０μＬのＰＢＳで１回洗浄し、ブロッキングバッファー（１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ ｗ／３％ ＢＳＡ）をウェル当たりに１２０μＬで室温で２時間ブロッキングした。ブロッキングバッファーを捨て、組換えヒトＴＧＦβ２タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃３０２－Ｂ２－０１０／ＣＦ）を３０ｎＭから４倍に連続希釈し、各希釈液をウェル当たりに３０μＬを加え、室温で１時間反応させた。ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液（１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ）でウェルを３回洗浄した後、組換えヒトＴＧＦβ２タンパク質と結合するＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ＴＧＦ－ｂｅｔａ２抗体をブロッキングバッファーに希釈し、各ウェル当たりに３０μＬずつ入れた後、室温で１時間反応させた。ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液（１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ）でウェルを３回洗浄した後、ブロッキングバッファーに希釈した３０μＬのストレプトアビジン（ｓｔｅｒｐｔａｖｉｄｉｎ）－ＨＲＰを各ウェルに加え、室温で１時間反応させた。ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液（１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ）でウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢを使用してＨＲＰ反応を展開し、３０μＬの１Ｎ ＨＣｌで反応を停止した。その後、４５０ｎｍにおける光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ, ＯＤ）を測定した。
＃１～＃９二重特異性分子を含む１Ｘ ＰＢＳ溶液（３０μＬ、０．５μＭ）でプレートをコーティングした後、プレートを覆い、２～８℃で一晩培養した。その後、ウェル当たりに１５０μＬのＰＢＳで１回洗浄し、ブロッキングバッファー（１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ ｗ／３％ ＢＳＡ）をウェル当たりに１２０μＬで室温で２時間ブロッキングした。ブロッキングバッファーを捨て、組換えヒトＴＧＦβ２タンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃３０２－Ｂ２－０１０／ＣＦ）を３０ｎＭから４倍に連続希釈し、各希釈液をウェル当たりに３０μＬを加え、室温で１時間反応させた。ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液（１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ）でウェルを３回洗浄した後、組換えヒトＴＧＦβ２タンパク質と結合するＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ－ＴＧＦ－ｂｅｔａ２抗体をブロッキングバッファーに希釈し、各ウェル当たりに３０μＬずつ入れた後、室温で１時間反応させた。ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液（１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ）でウェルを３回洗浄した後、ブロッキングバッファーに希釈した３０μＬのストレプトアビジン（ｓｔｅｒｐｔａｖｉｄｉｎ）－ＨＲＰを各ウェルに加え、室温で１時間反応させた。ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液（１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ）でウェルを３回洗浄した後、ＴＭＢを使用してＨＲＰ反応を展開し、３０μＬの１Ｎ ＨＣｌで反応を停止した。その後、４５０ｎｍにおける光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ, ＯＤ）を測定した。
【0133】
結果
＃１～＃９二重特異性分子の濃度によるＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３タンパク質への結合力、および＃１～＃９二重特異性分子を処理した場合、５０％が抗原－抗体結合状態で存在することを可能にする各抗体の濃度（ＥＣ５０）（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３）とＴＧＦβ２の濃度（ＥＣ５０）を確認した（図４及び６、表４及び６）。
＃１～＃９二重特異性分子の濃度によるＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３タンパク質への結合力、および＃１～＃９二重特異性分子を処理した場合、５０％が抗原－抗体結合状態で存在することを可能にする各抗体の濃度（ＥＣ５０）（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ３）とＴＧＦβ２の濃度（ＥＣ５０）を確認した（図４及び６、表４及び６）。
【0134】
また、ＴＧＦβ２タンパク質濃度による＃１～＃９二重特異性分子の結合力、およびＴＧＦβ２タンパク質を処理した場合、５０％が抗原－抗体結合状態で存在することを可能にするＴＧＦβ２タンパク質の濃度を確認した（図５および表５）。
【0135】
これにより、＃１～＃９二重特異性分子が優れた結合力でＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２及びＴＧＦβ３に特異的に結合することを確認した。
【0136】
表４は、＃１～＃９二重特異性分子を処理した場合、５０％がＴＧＦβ１と抗原－抗体結合状態で存在することになる二重特異性分子の濃度（ＥＣ５０）を示す。
【0137】
【表4】
【0138】
表５は、＃１～＃９二重特異性分子に抗原を処理した場合、５０％がＴＧＦβ２と抗原－抗体結合状態で存在することになるＴＧＦβ２の濃度（ＥＣ５０）を示す。
【0139】
【表5】
【0140】
表６は、＃１～＃９二重特異性分子を処理した場合、５０％がＴＧＦβ３と抗原－抗体結合状態で存在することになる二重特異性分子の濃度（ＥＣ５０）を示す。
【0141】
【表6】
【0142】
実施例４：ＥＬＩＳＡ法を用いたＢ７－Ｈ３及びＴＧＦβ１同時結合力の試験
Ｂ７－Ｈ３及びＴＧＦβ１へのＢ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子の同時結合力を確認するために本実験を行った。
Ｂ７－Ｈ３及びＴＧＦβ１へのＢ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子の同時結合力を確認するために本実験を行った。
【0143】
実験方法
１Ｘ ＰＢＳ溶液中の組換えヒトＴＧＦβ１タンパク質（３０μＬ、０．５μｇ／ｍｌ）をプレートにコーティングした後、プレートを覆い、２～８℃で一晩培養した。その後、ウェル当たりに１５０μＬのＰＢＳで１回洗浄し、ブロッキングバッファー（１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ ｗ／３％ ＢＳＡ）をウェル当たりに１２０μＬで室温で２時間ブロッキングした。ブロッキングバッファーを捨て、４－ｆｏｌｄで希釈した抗体溶液を３０μＬずつ加えて室温で２時間反応させ、ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液（１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ）でウェルを３回洗浄した。
１Ｘ ＰＢＳ溶液中の組換えヒトＴＧＦβ１タンパク質（３０μＬ、０．５μｇ／ｍｌ）をプレートにコーティングした後、プレートを覆い、２～８℃で一晩培養した。その後、ウェル当たりに１５０μＬのＰＢＳで１回洗浄し、ブロッキングバッファー（１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ ｗ／３％ ＢＳＡ）をウェル当たりに１２０μＬで室温で２時間ブロッキングした。ブロッキングバッファーを捨て、４－ｆｏｌｄで希釈した抗体溶液を３０μＬずつ加えて室温で２時間反応させ、ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液（１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ）でウェルを３回洗浄した。
【0144】
その後、ブロッキングバッファーに希釈したＨｉｓ－ｔａｇヒトＢ７－Ｈ３タンパク質３０μＬを各ウェルに加え、室温で２時間培養し、ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液でウェルを３回洗浄した。ブロッキングバッファーに希釈した抗ヒスタグ抗体のＨＲＰ接合体３０μＬを各ウェルに加え、室温で１時間反応させた。その後、ウェル当たりに１５０μＬの洗浄緩衝液でウェルを３回洗浄し、ＴＭＢを用いてＨＲＰ反応を展開し、３０μＬの１Ｎ ＨＣｌで反応を停止した。その後、４５０ｎｍにおける吸光度（Ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ、ＯＤ）を測定した。
【0145】
結果
＃１～＃９二重特異性分子（＃１（ＴＲＡＰ）～＃９（ＴＲＡＰ））がＢ７－Ｈ３タンパク質とＴＧＦβ１タンパク質に同時に結合することを確認した。また、ＴＧＦβ結合部なしのＢ７－Ｈ３モノクローナル抗体（＃１（ｍｏｎｏ）～＃９（ｍｏｎｏ））は、ＴＧＦβ１と結合しないことを確認した。
＃１～＃９二重特異性分子（＃１（ＴＲＡＰ）～＃９（ＴＲＡＰ））がＢ７－Ｈ３タンパク質とＴＧＦβ１タンパク質に同時に結合することを確認した。また、ＴＧＦβ結合部なしのＢ７－Ｈ３モノクローナル抗体（＃１（ｍｏｎｏ）～＃９（ｍｏｎｏ））は、ＴＧＦβ１と結合しないことを確認した。
【0146】
表７及び８は、＃１～＃９二重特異性分子（＃１（ＴＲＡＰ）～＃９（ＴＲＡＰ））を処理した場合、５０％がＢ７－Ｈ３およびＴＧＦβ１と抗原－抗体結合状態で存在することになる二重特異性分子の濃度（ＥＣ５０）を示す。
【0147】
【表7】
【0148】
【表8】
【0149】
実施例５：細胞内在化（Ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）の試験
Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子のＢ７－Ｈ３内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）能力を確認するために本実験を行った。
Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子のＢ７－Ｈ３内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）能力を確認するために本実験を行った。
【0150】
５．１．抗体－ｐＨＡｂアミン反応性染料コンジュゲーション（Ａｂ－ｐＨＡｂ ａｍｉｎｅ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｄｙｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）
炭酸水素ナトリウム０．０８４ｇを蒸留水に溶かした後、ｐＨメーターを用いてｐＨを８．５とし、最終ボリュームを１００ｍＬとした後、シリンジフィルターで異物をろ過して、平衡化バッファー（１０ｍＭ炭酸水素ナトリウムバッファー、ｐＨ８．５）を作製した。その後、脱塩カラムを用いて、抗体のバッファーを平衡化バッファーに交換した。カラムの保存液（ｓｔｏｒａｇｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を除去し、抗体の保存液を平衡化バッファーに変更するために、カラムのボトムクロージャー（ｂｏｔｔｏｍ ｃｌｏｓｕｒｅ）を除去した後、１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）に入れた。
炭酸水素ナトリウム０．０８４ｇを蒸留水に溶かした後、ｐＨメーターを用いてｐＨを８．５とし、最終ボリュームを１００ｍＬとした後、シリンジフィルターで異物をろ過して、平衡化バッファー（１０ｍＭ炭酸水素ナトリウムバッファー、ｐＨ８．５）を作製した。その後、脱塩カラムを用いて、抗体のバッファーを平衡化バッファーに交換した。カラムの保存液（ｓｔｏｒａｇｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を除去し、抗体の保存液を平衡化バッファーに変更するために、カラムのボトムクロージャー（ｂｏｔｔｏｍ ｃｌｏｓｕｒｅ）を除去した後、１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ（ｍｉｃｒｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）に入れた。
【0151】
１，５００ｇで１分間遠心分離を行い、新しいマイクロ遠心チューブに変えた。その後、洗浄を行った。平衡化バッファーを３００μＬ入れ、１，５００ｇで１分間遠心分離をし、２回行った。２回行った後、平衡化バッファーを３００μＬ入れ、１，５００ｇで２分間遠心分離した。その後、各抗体を７０μＬ入れ、１，５００ｇで２分間遠心分離を行った。
【0152】
アミン反応性染料を－８０℃で取り出し、１４，０００ｇで１０秒間遠心分離して沈殿させた染料にＤＭＳＯと蒸留水を１：１で混合し、１０ｍｇ／ｍＬに２５μＬを入れ、３分間ボルテックスして十分に溶かした。
【0153】
その後、抗体－ｐＨＡｂアミン反応性染料コンジュゲーションを行った。
【0154】
抗体１００μｇにｐＨＡｂアミン反応性染料１．２μＬを加えた後、室温で１時間ゆっくりと混合した。その後、脱塩カラムに抗体とｐＨＡｂアミン反応性染料コンジュゲーション試薬を入れ、１，５００ｇで２分間遠心分離して未反応の染料を除去した。ｐＨＡｂアミン染料とコンジュゲートした抗体の濃度は、以下の計算式を用いて換算した。
【0155】
【0156】
（但し、抗体の分子量（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ）＝１５０，０００、ｐＨＡｂ反応性染料の吸光係数（Ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｐＨＡｂ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｄｙｅ）＝７５，０００、ｐＨＡｂ反応性染料の補正係数（Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｐＨＡｂ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｄｙｅ）＝０．２５６）
【0157】
５．２．細胞播種（Ｃｅｌｌ ｓｅｅｄｉｎｇ）
ＲＫＯ細胞株およびＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株を採取した後、細胞計数を行った。培養培地を用いて３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で浮遊させた。
ＲＫＯ細胞株およびＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株を採取した後、細胞計数を行った。培養培地を用いて３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で浮遊させた。
【0158】
９６ウェルブラック、クリアボトムプレート（ｃｌｅａｒ－ｂｏｔｔｏｍ ｐｌａｔｅ）にウェル当たりに３×１０４ｃｅｌｌｓとなるように１００μＬずつ分注し、５％ＣＯ２、３７℃培養器で２４時間培養した。
【0159】
５．３．一次抗体とｐＨＡｂアミン標識された二次抗体のコンジュゲーション
ＲＰＭＩ１６４０（ｐｈｅｎｏｌ ｆｒｅｅ、ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）培地に一次抗体（ｃｏｎｔｒｏｌ ＩｇＧ、二重特異性分子＃１～＃９）の４μｇ／ｍＬとｐＨＡｂアミン標識された二次抗体を１：４の割合で入れて混合した。その後、３７℃の恒温水槽に入れて１時間反応させた。
ＲＰＭＩ１６４０（ｐｈｅｎｏｌ ｆｒｅｅ、ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ）培地に一次抗体（ｃｏｎｔｒｏｌ ＩｇＧ、二重特異性分子＃１～＃９）の４μｇ／ｍＬとｐＨＡｂアミン標識された二次抗体を１：４の割合で入れて混合した。その後、３７℃の恒温水槽に入れて１時間反応させた。
【0160】
５．４．コンジュゲーション抗体の処理
細胞播種時に入れた培養液を除去した後、一次抗体とｐＨＡｂアミン標識された二次抗体をコンジュゲートした溶液をウェル当たりに１００μＬずつ分注した。５％ＣＯ２、３７℃培養器で２４時間反させた。
細胞播種時に入れた培養液を除去した後、一次抗体とｐＨＡｂアミン標識された二次抗体をコンジュゲートした溶液をウェル当たりに１００μＬずつ分注した。５％ＣＯ２、３７℃培養器で２４時間反させた。
【0161】
５．５．固定および洗浄
コンジュゲートされた抗体を処理した培養液を除去し、４％ホルムアルデヒドを１００μＬずつ分注した。９６ウェルプレートを３００ｇで１０分間遠心分離した後、１０分間室温で反応させた。その後、１Ｘ ＰＢＳをウェル当たりに２５０μＬ加えて３回洗浄し、１Ｘ ＰＢＳをウェル当たりに１００μＬ加えた。
コンジュゲートされた抗体を処理した培養液を除去し、４％ホルムアルデヒドを１００μＬずつ分注した。９６ウェルプレートを３００ｇで１０分間遠心分離した後、１０分間室温で反応させた。その後、１Ｘ ＰＢＳをウェル当たりに２５０μＬ加えて３回洗浄し、１Ｘ ＰＢＳをウェル当たりに１００μＬ加えた。
【0162】
５．６．分析
マイクロプレートリーダーを用いて、Ｅｘ ５２０ｎｍ／Ｅｍ ５６５ｎｍにおけるＯＤ値で蛍光数値を測定した。
マイクロプレートリーダーを用いて、Ｅｘ ５２０ｎｍ／Ｅｍ ５６５ｎｍにおけるＯＤ値で蛍光数値を測定した。
【0163】
結果
Ｂ７－Ｈ３を過剰発現させなかったＲＫＯ細胞株では、＃１～＃９二重特異性分子を処理した群において蛍光強度の大きな差がなかった。このことから、内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）がほとんど起こらないことが分かった（図９）。
Ｂ７－Ｈ３を過剰発現させなかったＲＫＯ細胞株では、＃１～＃９二重特異性分子を処理した群において蛍光強度の大きな差がなかった。このことから、内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）がほとんど起こらないことが分かった（図９）。
【0164】
一方、Ｂ７－Ｈ３を過剰発現させたＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株では、＃１～＃９二重特異性分子を処理した群において蛍光強度が大幅に増加した。つまり、＃１～＃９二重特異性分子は、細胞表面に過剰発現したＢ７－Ｈ３と結合して内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）する能力が優れていることを確認した（図９）。
【0165】
実施例６：浸潤（Ｉｎｖａｓｉｏｎ）試験
Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子の癌細胞浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）抑制効果を確認するために本実験を行った。
Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子の癌細胞浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）抑制効果を確認するために本実験を行った。
【0166】
６．１．試薬の準備
培養培地：５００ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地に５０ｍＬのＦＢＳ、５ｍＬの抗生物質－抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）（１００Ｘ）、５ｍＬのＮＥＡＡ（Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、５ｍＬのピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｂａｔｅ）を加えて作製した。１Ｘ ＰＢＳ：９００ｍＬの三次蒸留水に１００ｍＬの１０Ｘ ＰＢＳを混合して作製した。０．２％クリスタルバイオレット：４０ｍＬのメタノールに１０ｍＬの１％クリスタルバイオレット溶液を加えて転倒（ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ）混和し、遮光して室温で保存した。
培養培地：５００ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地に５０ｍＬのＦＢＳ、５ｍＬの抗生物質－抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）（１００Ｘ）、５ｍＬのＮＥＡＡ（Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、５ｍＬのピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｂａｔｅ）を加えて作製した。１Ｘ ＰＢＳ：９００ｍＬの三次蒸留水に１００ｍＬの１０Ｘ ＰＢＳを混合して作製した。０．２％クリスタルバイオレット：４０ｍＬのメタノールに１０ｍＬの１％クリスタルバイオレット溶液を加えて転倒（ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ）混和し、遮光して室温で保存した。
【0167】
６．２．トランスウェル挿入およびマトリゲル・コーティング
アルコールランプで鉗子を加熱し、冷やす。トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）をＳＰＬ ２４ウェルプレートに取り付けた。ＳＦＭ（Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉａ、無血清培地）で１：１０の割合で希釈したマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）をインサートウェル（トランスウェルの内側）に２２μＬずつ分注した後、メンブレンに均一に広げた。その後、マトリゲルを固めるために室温で１～２時間乾燥した。
アルコールランプで鉗子を加熱し、冷やす。トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）をＳＰＬ ２４ウェルプレートに取り付けた。ＳＦＭ（Ｓｅｒｕｍ Ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉａ、無血清培地）で１：１０の割合で希釈したマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）をインサートウェル（トランスウェルの内側）に２２μＬずつ分注した後、メンブレンに均一に広げた。その後、マトリゲルを固めるために室温で１～２時間乾燥した。
【0168】
６．３．ＲＫＯ、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株の培養
１０ｃｍディッシュで培養中であったＲＫＯ、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３の培地を除去し、８ｍＬのＤＰＢＳで洗浄した後、１ｍＬのＴ／Ｅ（トリプシン－ＥＤＴＡ）溶液を入れ、３７℃の培養器で２～３分間置いて細胞を剥離した。剥離した細胞を６ｍＬのＳＦＭを用いて１５ｍＬチューブに回収した後、７００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清液を除去した後、細胞ペレットを３ｍＬのＳＦＭで溶いた後、セルカウントを行った。ＳＦＭを加えて細胞の濃度を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。
１０ｃｍディッシュで培養中であったＲＫＯ、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３の培地を除去し、８ｍＬのＤＰＢＳで洗浄した後、１ｍＬのＴ／Ｅ（トリプシン－ＥＤＴＡ）溶液を入れ、３７℃の培養器で２～３分間置いて細胞を剥離した。剥離した細胞を６ｍＬのＳＦＭを用いて１５ｍＬチューブに回収した後、７００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清液を除去した後、細胞ペレットを３ｍＬのＳＦＭで溶いた後、セルカウントを行った。ＳＦＭを加えて細胞の濃度を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。
【0169】
ＲＫＯ及びＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３をそれぞれ１×１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬのみインサートウェルにゆっくりと入れ、１０％ＦＢＳが添加されている培養培地６００μＬをアウターウェルに添加した。
【0170】
抗体処理効果を確認するために、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３（２Ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／２００μＬ）細胞株にそれぞれ２０μｇ／ｍＬ濃度の＃１～＃９抗体を混合してインサートウェルにゆっくり入れ、２０％ＦＢＳが添加されている培養培地６００μＬをアウターウェルに添加した。その後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で４８時間培養した。
【0171】
６．４．クリスタルバイオレット染色
２４ウェルプレートに、６００μＬの１Ｘ ＰＢＳ、０．２％クリスタルバイオレット、三次蒸留水を各ウェルに分注した。
２４ウェルプレートに、６００μＬの１Ｘ ＰＢＳ、０．２％クリスタルバイオレット、三次蒸留水を各ウェルに分注した。
【0172】
培養された細胞を取り出し、インサートウェルを逆さまにして内側の培地を除去した後、ＰＢＳに浸して洗浄した。その後、インサートウェルを０．２％クリスタルバイオレットに入れて３０分間室温で染色した。
【0173】
インサートウェルを取り出し、逆さまにして内側のクリスタルバイオレットを除去した後、三次蒸留水に浸して染色を止めた。
【0174】
鉗子でインサートウェルをつかみ、広い筒に入った三次蒸留水で振って洗浄した後、綿棒を用いて内側のメンブレンに浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）されていない細胞を拭き取った。
【0175】
６．５．写真撮影およびデータ分析
細胞の浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）の程度を写真撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊを用いて浸潤した細胞の数を数えた。
細胞の浸潤（ｉｎｖａｓｉｏｎ）の程度を写真撮影し、Ｉｍａｇｅ Ｊを用いて浸潤した細胞の数を数えた。
【0176】
結果
何も処理していないＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株（図１０のＮｏｎ－ｔｒｅａｔ）では、癌細胞の浸潤が活発に進行した。これに対し、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株に＃１～＃９二重特異性分子を処理して培養した場合には、浸潤が減少した（図１０）。Ｂ７－Ｈ３が過剰発現される場合には、癌細胞の浸潤が活発に進行するが、Ｂ７－Ｈ３抗体により浸潤が抑制され、特に、＃１～＃９二重特異性分子の浸潤抑制効果が優れていることを確認した。
何も処理していないＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株（図１０のＮｏｎ－ｔｒｅａｔ）では、癌細胞の浸潤が活発に進行した。これに対し、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株に＃１～＃９二重特異性分子を処理して培養した場合には、浸潤が減少した（図１０）。Ｂ７－Ｈ３が過剰発現される場合には、癌細胞の浸潤が活発に進行するが、Ｂ７－Ｈ３抗体により浸潤が抑制され、特に、＃１～＃９二重特異性分子の浸潤抑制効果が優れていることを確認した。
【0177】
実施例７：遊走（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）の試験
Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子の癌細胞の遊走抑制効果を確認するために本実験を行った。
Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子の癌細胞の遊走抑制効果を確認するために本実験を行った。
【0178】
実験方法
７．１．試薬の準備
培養培地：５００ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地に５０ｍＬのＦＢＳ、５ｍＬの抗生物質－抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）（１００Ｘ）、５ｍＬのＮＥＡＡ、５ｍＬのピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｂａｔｅ）を加えて作製した。１Ｘ ＰＢＳ：９００ｍＬの三次蒸留水に１００ｍＬの１０Ｘ ＰＢＳを混合して作製した。０．２％クリスタルバイオレット：４０ｍＬのメタノールに１０ｍＬの１％クリスタルバイオレット溶液を加えて混合した後、遮光して室温で保存した。
７．１．試薬の準備
培養培地：５００ｍＬのＲＰＭＩ １６４０培地に５０ｍＬのＦＢＳ、５ｍＬの抗生物質－抗真菌剤（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ）（１００Ｘ）、５ｍＬのＮＥＡＡ、５ｍＬのピルビン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｕｂａｔｅ）を加えて作製した。１Ｘ ＰＢＳ：９００ｍＬの三次蒸留水に１００ｍＬの１０Ｘ ＰＢＳを混合して作製した。０．２％クリスタルバイオレット：４０ｍＬのメタノールに１０ｍＬの１％クリスタルバイオレット溶液を加えて混合した後、遮光して室温で保存した。
【0179】
７．２．トランスウェル挿入
アルコールランプで鉗子を加熱して冷やし、トランスウェルをＳＰＬ ２４ウェルプレートに使用量のみ取り付けた。
アルコールランプで鉗子を加熱して冷やし、トランスウェルをＳＰＬ ２４ウェルプレートに使用量のみ取り付けた。
【0180】
７．３．ＲＫＯ、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３の播種および培養
１０ｃｍディッシュで培養中であったＲＫＯ、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３の培地を除去し、８ｍＬのＤＰＢＳで洗浄した後、１ｍＬのＴ／Ｅ溶液を入れ、３７℃の培養器で２～３分間置いて細胞を剥離した。剥離した細胞を６ｍＬのＳＦＭを用いて１５ｍＬチューブに回収し、７００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清液を除去した後、細胞ペレットを３ｍＬのＳＦＭで溶いた後、セルカウントを行った。ＳＦＭを加えて細胞の濃度を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした後、細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μＬの密度でインサートウェルにゆっくりと添加した後、１０％ＦＢＳが添加されている培養培地６００μＬをアウターウェルに加えた。その後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で１６時間培養した。
１０ｃｍディッシュで培養中であったＲＫＯ、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３の培地を除去し、８ｍＬのＤＰＢＳで洗浄した後、１ｍＬのＴ／Ｅ溶液を入れ、３７℃の培養器で２～３分間置いて細胞を剥離した。剥離した細胞を６ｍＬのＳＦＭを用いて１５ｍＬチューブに回収し、７００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清液を除去した後、細胞ペレットを３ｍＬのＳＦＭで溶いた後、セルカウントを行った。ＳＦＭを加えて細胞の濃度を１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした後、細胞を２×１０５ｃｅｌｌｓ／２００μＬの密度でインサートウェルにゆっくりと添加した後、１０％ＦＢＳが添加されている培養培地６００μＬをアウターウェルに加えた。その後、３７℃、５％ＣＯ２培養器で１６時間培養した。
【0181】
７．４．クリスタルバイオレット染色
２４ウェルプレートに、６００μＬのＰＢＳ、０．２％クリスタルバイオレット、三次蒸留水を各ウェルに分注した。培養された細胞を取り出し、インサートウェルを逆さまにして内側の培地を除去した後、ＰＢＳに浸して洗浄した。その後、インサートウェルを０．２％クリスタルバイオレットに入れて３０分間室温で染色した。インサートウェルを取り出し、逆さまにして内側のクリスタルバイオレットを除去した後、三次蒸留水に浸して染色を止めた。鉗子でインサートウェルをつかみ、広い筒に入った三次蒸留水で数回振って洗浄した後、綿棒を用いて内側のメンブレンに遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）されていない細胞を拭き取った。
２４ウェルプレートに、６００μＬのＰＢＳ、０．２％クリスタルバイオレット、三次蒸留水を各ウェルに分注した。培養された細胞を取り出し、インサートウェルを逆さまにして内側の培地を除去した後、ＰＢＳに浸して洗浄した。その後、インサートウェルを０．２％クリスタルバイオレットに入れて３０分間室温で染色した。インサートウェルを取り出し、逆さまにして内側のクリスタルバイオレットを除去した後、三次蒸留水に浸して染色を止めた。鉗子でインサートウェルをつかみ、広い筒に入った三次蒸留水で数回振って洗浄した後、綿棒を用いて内側のメンブレンに遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）されていない細胞を拭き取った。
【0182】
７．５．写真撮影
癌細胞の遊走の動度を顕微鏡により確認した後、撮影した。
癌細胞の遊走の動度を顕微鏡により確認した後、撮影した。
【0183】
７．６．クリスタルバイオレットの抽出
新しい２４ウェルに１００％メタノールを２００μＬずつ加えた後、写真撮影を終えたインサートウェルを入れ、インサートウェルの内側に１００μＬの１００％メタノールを入れた後、パラフィルムで密封した。その後、１時間室温で混合した後、染色した試薬を抽出した。インサートウェルを除去した後、２００μＬを取って９６ウェルプレートに移した後、５９０ｎｍにおけるＯＤ値を測定した。測定されたＯＤ値から遊走の程度を比較した。
新しい２４ウェルに１００％メタノールを２００μＬずつ加えた後、写真撮影を終えたインサートウェルを入れ、インサートウェルの内側に１００μＬの１００％メタノールを入れた後、パラフィルムで密封した。その後、１時間室温で混合した後、染色した試薬を抽出した。インサートウェルを除去した後、２００μＬを取って９６ウェルプレートに移した後、５９０ｎｍにおけるＯＤ値を測定した。測定されたＯＤ値から遊走の程度を比較した。
【0184】
７．７．データの分析
クリスタルバイオレット抽出により得られたＯＤ値の分析は、非処理（ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ）ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞の値を基準として実験群のＯＤ値を割って、遊走の程度をパーセントに換算して比較した。
クリスタルバイオレット抽出により得られたＯＤ値の分析は、非処理（ｎｏｎ－ｔｒｅａｔｅｄ）ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞の値を基準として実験群のＯＤ値を割って、遊走の程度をパーセントに換算して比較した。
【0185】
結果
何も処理していないＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株（図１１のＮｏｎ－ｔｒｅａｔ）では、癌細胞の遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）が活発に進行した。これに対し、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株に＃１～＃９二重特異性分子を処理して培養した場合には、癌細胞の遊走が減少した（図１１）。つまり、Ｂ７－Ｈ３が過剰発現される場合には、癌細胞の遊走が活発に進行するが、Ｂ７－Ｈ３抗体により癌細胞の遊走が抑制され、特に、＃１～＃９二重特異性分子の癌細胞の遊走抑制効果が優れていることを確認した。
何も処理していないＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株（図１１のＮｏｎ－ｔｒｅａｔ）では、癌細胞の遊走（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）が活発に進行した。これに対し、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株に＃１～＃９二重特異性分子を処理して培養した場合には、癌細胞の遊走が減少した（図１１）。つまり、Ｂ７－Ｈ３が過剰発現される場合には、癌細胞の遊走が活発に進行するが、Ｂ７－Ｈ３抗体により癌細胞の遊走が抑制され、特に、＃１～＃９二重特異性分子の癌細胞の遊走抑制効果が優れていることを確認した。
【0186】
実施例８：ＴＧＦβ分泌抑制効果の確認
Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子（＃１～＃９二重特異性分子）を処理した後、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞から分泌されたＴＧＦβ死滅効果を確認するために本実験を行った。
Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子（＃１～＃９二重特異性分子）を処理した後、ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞から分泌されたＴＧＦβ死滅効果を確認するために本実験を行った。
【0187】
実験方法
８．１．試薬の準備
１Ｘ ＰＢＳ、洗浄バッファー（Ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０））、ブロッキングバッファー（１％ ＢＳＡ ｉｎ １Ｘ ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）、抗体希釈バッファーおよび中和バッファー（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を準備した。抗体希釈バッファーとしては、洗浄バッファーと同一のバッファーを使用した。中和バッファーとしては、１Ｍ ＨＥＰＥＳを２５ｍＬ、５Ｎ ＮａＯＨを１２ｍＬ、三次蒸留水を１３ｍＬ加えて混合して調製した。
８．１．試薬の準備
１Ｘ ＰＢＳ、洗浄バッファー（Ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ、１Ｘ ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０））、ブロッキングバッファー（１％ ＢＳＡ ｉｎ １Ｘ ＰＢＳ－Ｔ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）、抗体希釈バッファーおよび中和バッファー（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を準備した。抗体希釈バッファーとしては、洗浄バッファーと同一のバッファーを使用した。中和バッファーとしては、１Ｍ ＨＥＰＥＳを２５ｍＬ、５Ｎ ＮａＯＨを１２ｍＬ、三次蒸留水を１３ｍＬ加えて混合して調製した。
【0188】
８．２．ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞株の培養、候補抗体の処理および上清液の採取
ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞を２４ウェルプレートにウェル当たりに１×１０５ｃｅｌｌｓとなるように分注した後、５％ＣＯ２、３７℃培養器で２４時間培養した。培地を除去し、ＳＦＭを各ウェルに２００μＬずつ分注して除去した後、各ウェルにＳＦＭを５００μＬずつ分注し、５％ＣＯ２、３７℃培養器で４８時間培養した。細胞培養４８時間後、Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子（＃１～＃９二重特異性分子）（２０ｎＭ）を処理し、２４時間培養した。抗体処理２４時間後、上清液を１．５ｍｌチューブに入れて３００ｇで３分間遠心分離し、上清液４００μＬを新しい１．５ｍチューブに集めて－８０℃で保存した。
ＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３細胞を２４ウェルプレートにウェル当たりに１×１０５ｃｅｌｌｓとなるように分注した後、５％ＣＯ２、３７℃培養器で２４時間培養した。培地を除去し、ＳＦＭを各ウェルに２００μＬずつ分注して除去した後、各ウェルにＳＦＭを５００μＬずつ分注し、５％ＣＯ２、３７℃培養器で４８時間培養した。細胞培養４８時間後、Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子（＃１～＃９二重特異性分子）（２０ｎＭ）を処理し、２４時間培養した。抗体処理２４時間後、上清液を１．５ｍｌチューブに入れて３００ｇで３分間遠心分離し、上清液４００μＬを新しい１．５ｍチューブに集めて－８０℃で保存した。
【0189】
８．３．捕捉抗体のコーティング（１００μＬ／ｗｅｌｌ；２μｇ／ｍｌ）
ヒトＴＧＦβ１捕捉抗体（保存濃度：２４０μｇ／ｍｌ、－２０℃）を溶解した後、２μｇ／ｍｌの濃度となるように１Ｘ ＰＢＳを用いて１：１２０の割合で希釈した。その後、０．２μｇ／ｗｅｌｌ（１００μｌ／ｗｅｌｌ）ずつ９６ウェルプレートにそれぞれ分注した後、室温で一晩反応させた。その後、洗浄バッファーを用いて各ウェルを３回洗浄し、各ウェルにブロッキングバッファー２５０μＬ／ｗｅｌｌを分注し、室温で２時間反応させた。
ヒトＴＧＦβ１捕捉抗体（保存濃度：２４０μｇ／ｍｌ、－２０℃）を溶解した後、２μｇ／ｍｌの濃度となるように１Ｘ ＰＢＳを用いて１：１２０の割合で希釈した。その後、０．２μｇ／ｗｅｌｌ（１００μｌ／ｗｅｌｌ）ずつ９６ウェルプレートにそれぞれ分注した後、室温で一晩反応させた。その後、洗浄バッファーを用いて各ウェルを３回洗浄し、各ウェルにブロッキングバッファー２５０μＬ／ｗｅｌｌを分注し、室温で２時間反応させた。
【0190】
８．４．ＥＬＩＳＡアッセイ
１）スタンダードの準備：ヒトＴＧＦβ１（ストック濃度（ｓｔｏｃｋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）：１９０ｎｇ／ｍｌ、－２０℃）を、抗体希釈バッファーを用いて１:９５の割合で希釈した後、２，０００ｐｇ／ｍｌの濃度から２倍連続希釈を行い、ヒトＴＧＦβ１スタンダードを製作した。
１）スタンダードの準備：ヒトＴＧＦβ１（ストック濃度（ｓｔｏｃｋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）：１９０ｎｇ／ｍｌ、－２０℃）を、抗体希釈バッファーを用いて１:９５の割合で希釈した後、２，０００ｐｇ／ｍｌの濃度から２倍連続希釈を行い、ヒトＴＧＦβ１スタンダードを製作した。
【0191】
２）サンプル（前記で得られたＲＫＯ／Ｂ７Ｈ３培養上清液に＃１～＃９二重特異性分子処理群および対照群（Ｎｏｎ－ｔｒｅａｔ））を９６ウェルプレートに１００μＬずつ分注し、１Ｎ ＨＣ１を２０μＬずつ加えた後、プレートを１０秒間振盪した。その後、室温で１０分間反応させ、１．２Ｎ ＮａＯＨ／０．５Ｍ ＨＥＰＥＳを２０μＬずつ加えて中和した。
【0192】
３）１）で作製したスタンダードとサンプルを各ウェル当たりに１００μＬずつ分注し、室温で２時間反応させた。その後、洗浄溶液を用いて３回洗浄した。
【0193】
４）抗体希釈バッファーを用いて検出抗体（ＴＧＦ－ｂｅｔａ１ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ＃ ＢＡＦ２４０）、ストック濃度（ｓｔｏｃｋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）：３μｇ／ｍｌ、２０℃）を１：６０の割合で希釈して５０ｎｇ／ｍｌの検出抗体を作製した。希釈した検出抗体を各ウェルに１００μＬ／ｍｌずつ分注した後、室温で２時間反応させた。その後、洗浄溶液を用いて３回洗浄した。
【0194】
５）抗体希釈バッファーを用いて１：４０の割合で希釈したストレプトアビジン－ＨＲＰを各ウェルに１００μＬ分注し、遮光して室温で２０分間反応させた。その後、洗浄溶液を用いて３回洗浄した。
【0195】
６）ＴＭＢを各ウェルに１００μＬずつ分注し、遮光して室温で２０分間反応させた。その後、停止液（Ｓｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）である１Ｎ ＨＣ１を各ウェル当たりに５０μＬずつ分注して基質反応を終了させた。
【0196】
７）４５０ｎｍにおける吸光度（Ｏ．Ｄ値）を測定した。
【0197】
結果
Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子（＃１～＃９二重特異性分子）投与群では、免疫抑制性物質であるＴＧＦβ１が完全に死滅したことを確認した（図１２）。
Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子（＃１～＃９二重特異性分子）投与群では、免疫抑制性物質であるＴＧＦβ１が完全に死滅したことを確認した（図１２）。
【0198】
実施例９：癌モデルにおける抗癌効果の評価（Ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｅｓｔ）
インビボ（Ｉｎ ｖｉｖｏ）マウス癌モデルにおいて、Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子（＃１～＃９二重特異性分子）を処理した場合に腫瘍増殖が抑制されることを確認するために本実験を行った。
インビボ（Ｉｎ ｖｉｖｏ）マウス癌モデルにおいて、Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子（＃１～＃９二重特異性分子）を処理した場合に腫瘍増殖が抑制されることを確認するために本実験を行った。
【0199】
９．１．動物モデルの作製
７週齢のＢａｌｂ／ｃ雌性（Ｋｏｒｅａ Ｂｉｏｌｉｎｋ）を用いた。マウス大腸癌細胞株であるＣＴ２６細胞にＢ７－Ｈ３を過剰発現して作製した細胞株ＣＴ２６－ＴＮ細胞を５Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度でＤＰＢＳに希釈し、個体当たりに１００μＬ（５Ｘ１０５ｃｅｌｌｓ）ずつ右フランク（ｆｌａｎｋ）に皮下移植した。細胞株移植後７日目に電子キャリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて、下記式より腫瘍体積を算出した。
７週齢のＢａｌｂ／ｃ雌性（Ｋｏｒｅａ Ｂｉｏｌｉｎｋ）を用いた。マウス大腸癌細胞株であるＣＴ２６細胞にＢ７－Ｈ３を過剰発現して作製した細胞株ＣＴ２６－ＴＮ細胞を５Ｘ１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度でＤＰＢＳに希釈し、個体当たりに１００μＬ（５Ｘ１０５ｃｅｌｌｓ）ずつ右フランク（ｆｌａｎｋ）に皮下移植した。細胞株移植後７日目に電子キャリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）を用いて、下記式より腫瘍体積を算出した。
【0200】
腫瘍体積（Ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ，ｍｍ３）＝＜長さ（ｌｅｎｇｔｈ，ｍｍ）ｘ幅（ｗｉｄｔｈ，ｍｍ）２＞ｘ０．５
【0201】
９．２．群分離
腫瘍細胞株の移植後７日目に移植された右腫瘍を測定し、ほとんどの個体の腫瘍サイズがそれぞれ約４０～１２０ｍｍ３に達したとき、１つの個体において両側に移植された腫瘍のサイズを測定し、当該平均値の腫瘍サイズを基準としてＺ配列法により群分離を行った。
腫瘍細胞株の移植後７日目に移植された右腫瘍を測定し、ほとんどの個体の腫瘍サイズがそれぞれ約４０～１２０ｍｍ３に達したとき、１つの個体において両側に移植された腫瘍のサイズを測定し、当該平均値の腫瘍サイズを基準としてＺ配列法により群分離を行った。
【0202】
９．３．抗体の投与
投与濃度：＃５二重特異性分子投与群－＃５二重特異性分子１０ｍｇ／ｋｇ、＃５二重特異性分子および抗ＰＤ－１抗体併用投与群－＃５二重特異性分子および抗ＰＤ－１抗体をそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇ。
投与濃度：＃５二重特異性分子投与群－＃５二重特異性分子１０ｍｇ／ｋｇ、＃５二重特異性分子および抗ＰＤ－１抗体併用投与群－＃５二重特異性分子および抗ＰＤ－１抗体をそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇ。
【0203】
全ての試験物質は週２回、２週間、合計４回静脈投与（ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｙｒｉｎｇｅを使用）を行った。陰性対照物質（賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ，ＰＢＳ）、ＩｇＧ）も同様に投与した。
【0204】
【表9】
【0205】
９．４．腫瘍サイズおよび体重の測定
群分離後、移植されたすべての腫瘍に対して、腫瘍体積を週２回、３週間測定した。同時に、全ての動物に対して群分離後に週２回測定して記録した。
群分離後、移植されたすべての腫瘍に対して、腫瘍体積を週２回、３週間測定した。同時に、全ての動物に対して群分離後に週２回測定して記録した。
【0206】
９．５．解剖
群分離日を０日（Ｄａｙ０）として、２２日（Ｄａｙ２２）に腫瘍を摘出して個体別に写真撮影した後、腫瘍の重量を測定した。
群分離日を０日（Ｄａｙ０）として、２２日（Ｄａｙ２２）に腫瘍を摘出して個体別に写真撮影した後、腫瘍の重量を測定した。
【0207】
結果
陰性対照群である賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ，ＰＢＳ）およびＩｇＧ投与群では、移植したＣＴ２６－ＴＮ細胞株の成長が急激に増加したが、＃５二重特異性分子投与群（Ｇ３）では、ｒｅｇｒｏｕｐｉｎｇ後７日目から腫瘍増殖が抑制されることを確認した。また、＃５二重特異性分子および抗ＰＤ－１抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、Ｃａｔ＃ＢＥ０１６）併用投与群（Ｇ４）では、腫瘍増殖が顕著に抑制されることを確認した（図１３）。
陰性対照群である賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ，ＰＢＳ）およびＩｇＧ投与群では、移植したＣＴ２６－ＴＮ細胞株の成長が急激に増加したが、＃５二重特異性分子投与群（Ｇ３）では、ｒｅｇｒｏｕｐｉｎｇ後７日目から腫瘍増殖が抑制されることを確認した。また、＃５二重特異性分子および抗ＰＤ－１抗体（ＢｉｏＸｃｅｌｌ、Ｃａｔ＃ＢＥ０１６）併用投与群（Ｇ４）では、腫瘍増殖が顕著に抑制されることを確認した（図１３）。
【0208】
実施例１０：マウス癌モデルにおける血清中のＴＧＦβの定量化
インビボマウス癌モデルにおいて、Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子（＃１～＃９二重特異性分子）を処理した後の血清中のＴＦＧβの変化を確認するために本実験を行った。
インビボマウス癌モデルにおいて、Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子（＃１～＃９二重特異性分子）を処理した後の血清中のＴＦＧβの変化を確認するために本実験を行った。
【0209】
実験方法
１０．１．材料
マウスＴＧＦ－β１ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ＃：ＤＹ１６７９）
インビボ癌モデルの抗癌試験を完了したマウスから分離した血清
１０．１．材料
マウスＴＧＦ－β１ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡキット（Ｃａｔ＃：ＤＹ１６７９）
インビボ癌モデルの抗癌試験を完了したマウスから分離した血清
【0210】
１０．２．抗体の準備
マウスＴＧＦβ１捕捉抗体をＰＢＳに１：１２０の割合で希釈し、マウスＴＧＦβ１検出抗体をＰＢＳに１：６０の割合で希釈し、ストレプトアビジン－ＨＲＰをＰＢＳに１：４０の割合で希釈した。
マウスＴＧＦβ１捕捉抗体をＰＢＳに１：１２０の割合で希釈し、マウスＴＧＦβ１検出抗体をＰＢＳに１：６０の割合で希釈し、ストレプトアビジン－ＨＲＰをＰＢＳに１：４０の割合で希釈した。
【0211】
１０．３．血清サンプルの準備
４０μＬの血清に１０μＬの１Ｎ ＨＣｌを加えた後、室温で１０秒間振盪した後、１０分間培養した。その後、反応停止のために１０μＬの１．２Ｎ ＮａＯＨ／０．５Ｍ ＨＥＰＥＳを入れ、ＰＢＳで１：２の割合で希釈した。
４０μＬの血清に１０μＬの１Ｎ ＨＣｌを加えた後、室温で１０秒間振盪した後、１０分間培養した。その後、反応停止のために１０μＬの１．２Ｎ ＮａＯＨ／０．５Ｍ ＨＥＰＥＳを入れ、ＰＢＳで１：２の割合で希釈した。
【0212】
１０．４．ＥＬＩＳＡアッセイ
１日前（１５～１８時間前）に９６ウェルプレートに希釈した捕捉抗体を１００μＬずつ分注して室温で培養した後、２００μＬのＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。
１日前（１５～１８時間前）に９６ウェルプレートに希釈した捕捉抗体を１００μＬずつ分注して室温で培養した後、２００μＬのＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄した。
【0213】
１５０μＬのブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋５％Ｔｗｅｅｎ２０）を入れて室温で１時間培養した後、２００μＬのＰＢＳ－Ｔで洗浄した。その後、Ｋｉｔに提供された標準溶液（ｓｔａｎｄａｒｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）とあらかじめ準備した血清サンプルをｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎで９６ウェルに１００μＬずつ分注して室温で２時間反応した後、２００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。１００μＬの検出抗体をウェルに分注して室温で２時間反応した後、２００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。１００μＬのストレプトアビジン－ＨＲＰを分注して室温で２０分間反応させた後、２００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。１００μＬのＴＭＢ溶液を分注した後、遮光して室温で発色反応した。その後、発色反応を終了させるために５０μＬの１Ｎ ＨＣｌを入れた。最後に、４５０ｎｍにおけるＯ．Ｄ値を測定した。
【0214】
結果
＃５二重特異性分子投与群（Ｇ３）と＃５二重特異性分子および抗ＰＤ－１抗体併用投与群（Ｇ４）におけるマウス血清中のＴＧＦβの濃度が、陰性対照群である賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ，ＰＢＳ）投与群（Ｇ１）およびＩｇＧ投与群（Ｇ２）と比較して有意に（賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ）群を基準としてｐ値（ｐ ｖａｌｕｅ）＜０．５）減少したことを確認した（図１４を参照）。
＃５二重特異性分子投与群（Ｇ３）と＃５二重特異性分子および抗ＰＤ－１抗体併用投与群（Ｇ４）におけるマウス血清中のＴＧＦβの濃度が、陰性対照群である賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ，ＰＢＳ）投与群（Ｇ１）およびＩｇＧ投与群（Ｇ２）と比較して有意に（賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ）群を基準としてｐ値（ｐ ｖａｌｕｅ）＜０．５）減少したことを確認した（図１４を参照）。
【0215】
実施例１１：Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ（ＴＩＬ）の分析
インビボマウス癌モデルにおいて、Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子（＃１～＃９二重特異性分子）を処理した場合、免疫細胞の癌組織内の免疫細胞であるリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）の浸透能力が増加するかどうかを確認するために本実験を行った。
インビボマウス癌モデルにおいて、Ｂ７－Ｈ３／ＴＧＦβ二重特異性分子（＃１～＃９二重特異性分子）を処理した場合、免疫細胞の癌組織内の免疫細胞であるリンパ球（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）の浸透能力が増加するかどうかを確認するために本実験を行った。
【0216】
実験方法
１１．１．腫瘍細胞の分離
インビボ癌モデルの抗癌試験を完了したマウスから摘出した腫瘍に１０ｍＬのＤＰＢＳを添加して洗浄した後、残っている血液を除去した。
１１．１．腫瘍細胞の分離
インビボ癌モデルの抗癌試験を完了したマウスから摘出した腫瘍に１０ｍＬのＤＰＢＳを添加して洗浄した後、残っている血液を除去した。
【0217】
６ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｃａｔ＃ ＣＭ０５８－０５０）培地を入れて、はさみで細かく刻んだ後、消化液（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（５０ｍＬ ＲＰＭＩ－１６４０＋１００ｍｇ コラゲナーゼＤ（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｄ）（Ｍｅｒｃｋ、Ｃａｔ＃ １１０８８８５８００１）＋１０ｍｇ ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ＃Ｄ４５１３））６００μＬを加え、３７℃、１２０ｒｐｍで１時間反応させた。
【0218】
７０μｍのセルストライナー（ＳＰＬ、Ｃａｔ＃ＳＰＬ９３０７０）に入れて大きな組織をろ過した後、１ｍＬを１５ｍＬチューブに入れて１５℃、２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上清液を除去し、ＤＰＢＳで１回洗浄した。その後、蒸留水に希釈した１Ｘ ＲＢＣ ｌｙｓｉｓバッファー（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃４２０３０１）を５００μＬ添加してペレットを溶いて、室温で５分間反応させた。
【0219】
前記と同様の方法によりＤＰＢＳで２回洗浄した後、ペレットをＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ＋１％ＦＢＳ＋０．１％アジ化ナトリウム）によく溶いて細胞を準備した。
【0220】
１１．２．ＦＡＣＳ分析抗体の情報
ＦＡＣＳ分析に使用される抗体としてはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製を使用した。その情報を下記表１０に示す。
ＦＡＣＳ分析に使用される抗体としてはＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製を使用した。その情報を下記表１０に示す。
【0221】
【表10】
【0222】
１１．３．蛍光染色
細胞分離の実験方法により分離された腫瘍の単一細胞は、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｒａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｍｏｕｓｅ ＢＤ Ｆｃ ＢｌｏｃｋＴＭ．ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｃａｔ＃５５３１４１）を１０分間前処理してＦＣブロッキングを行った後、ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ＋１％ＦＢＳ＋０．１％アジ化ナトリウム）に、抗体を提供されたデータシートに示されている希釈率で希釈した後、４℃で遮光して１時間反応させた。
細胞分離の実験方法により分離された腫瘍の単一細胞は、Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｒａｔ ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｍｏｕｓｅ ＢＤ Ｆｃ ＢｌｏｃｋＴＭ．ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｃａｔ＃５５３１４１）を１０分間前処理してＦＣブロッキングを行った後、ＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ＋１％ＦＢＳ＋０．１％アジ化ナトリウム）に、抗体を提供されたデータシートに示されている希釈率で希釈した後、４℃で遮光して１時間反応させた。
【0223】
反応が終わった細胞は、ＦＡＣＳバッファーを用いて２回洗浄した後、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて固定した。染色が終わった細胞は、フローサイトメーター（Ａｔｔｕｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏＴＭＶ１０（Ｆｌｏｗｊｏ、ＬＬＣ）を用いて分析した。
【0224】
結果
マウスから摘出した腫瘍のＣＤ４＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行ったところ、＃５二重特異性分子投与群（Ｇ３）と＃５二重特異性分子および抗ＰＤ－１抗体併用投与群（Ｇ４）では、ＣＤ８＋ ＴＩＬ免疫細胞の癌組織への浸透能力が賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ，ＰＢＳ）投与群（Ｇ１）およびＩｇＧ投与群（Ｇ２）と比較して増加したことを確認した。これに対し、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、陰性対照群と抗体投与群との間に差がないことを確認した。このことから、細胞障害性リンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）（ＣＤ８＋Ｔ細胞）が癌組織に浸透し、癌細胞に細胞傷害（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）効果を示すことができることが分かった（図１５）。
マウスから摘出した腫瘍のＣＤ４＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞に対してＦＡＣＳ分析を行ったところ、＃５二重特異性分子投与群（Ｇ３）と＃５二重特異性分子および抗ＰＤ－１抗体併用投与群（Ｇ４）では、ＣＤ８＋ ＴＩＬ免疫細胞の癌組織への浸透能力が賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ，ＰＢＳ）投与群（Ｇ１）およびＩｇＧ投与群（Ｇ２）と比較して増加したことを確認した。これに対し、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、陰性対照群と抗体投与群との間に差がないことを確認した。このことから、細胞障害性リンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）（ＣＤ８＋Ｔ細胞）が癌組織に浸透し、癌細胞に細胞傷害（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ）効果を示すことができることが分かった（図１５）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】