特表 2024-534266 ヒト肝キメリズムと組合せたＡＡＶＲノックアウトマウス並びにその使用方法及び作製方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-18

(54)【発明の名称】ヒト肝キメリズムと組合せたＡＡＶＲノックアウトマウス並びにその使用方法及び作製方法

(51)【国際特許分類】

   A01K 67/0271 20240101AFI20240910BHJP

   A01K 67/0276 20240101ALI20240910BHJP

   C12Q 1/70 20060101ALI20240910BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240910BHJP

【ＦＩ】

A01K67/0271

A01K67/0276 ZNA

C12Q1/70

C12N15/09 110

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024537307

(86)(22)【出願日】2022-08-30

(85)【翻訳文提出日】2024-04-11

(86)【国際出願番号】 US2022075633

(87)【国際公開番号】W WO2023034775

(87)【国際公開日】2023-03-09

(31)【優先権主張番号】63/238,386

(32)【優先日】2021-08-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】524074895

【氏名又は名称】アバクローム，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】マリア デ ラス メルセデス バルシ ディエゲス

(72)【発明者】

【氏名】フランシス ピーター パンコウィッツ

(72)【発明者】

【氏名】カール－ディミター ビッシグ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA05

4B063QQ02

4B063QQ08

4B063QQ10

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR72

4B063QR77

4B063QR79

(57)【要約】

本開示は、ヒト肝細胞を含む、アデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は機能障害を伴う、免疫不全又は免疫障害のキメラ非ヒト動物、このヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物の調製方法、並びにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の形質導入効率を評価し、及びヒト肝細胞におけるＡＡＶ形質導入の阻害／修飾の機序を決定するために、このヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を利用する方法を提供する。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物であって、ここでこのキメラ非ヒト動物が：
ａ）非ヒト動物の肝臓においてヒトキメリズムを確立するヒト肝細胞の再構築を可能にする、Ｔ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞の欠乏又は機能障害；並びに
ｂ）非ヒト動物アデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠乏又は機能障害を生じるＡＡＶＲの欠失又は変異：を含む、キメラ非ヒト動物。

【請求項2】

前記キメラ非ヒト動物が、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－キメラ非ヒト動物であり、及び
ここでこのキメラ非ヒト動物が、非ヒト動物ＡＡＶＲの欠乏又は機能障害を生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含む、ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物。

【請求項3】

前記キメラ非ヒト動物が更に、Ｆａｈ^－／－を含む、請求項１～２のいずれか一項に記載のキメラ非ヒト動物。

【請求項4】

前記キメラ非ヒト動物が、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－非ヒト動物である、請求項１に記載のキメラ非ヒト動物。

【請求項5】

前記ヒト肝細胞が、キメラ非ヒト動物の肝臓内の全ての肝細胞の：
ｉ）少なくとも５％；
ｉｉ）少なくとも１０％；
ｉｉｉ）少なくとも２０％；
ｉｉｉ）少なくとも３０％；
ｉｖ）少なくとも４０％；
ｖ）少なくとも５０％；
ｖｉ）少なくとも７０％；
ｖｉｉ）少なくとも８０％；
ｖｉｉｉ）少なくとも９０％；
ｉｘ）少なくとも９５％；又は
ｘ）少なくとも９９％、を占める、請求項１～４のいずれか一項に記載のキメラ非ヒト動物。

【請求項6】

ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法であって、この方法が：
（ａ）非ヒト動物において、欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞を提供する工程であって、これが、非ヒト動物の肝臓におけるヒトキメリズムを確立するようヒト肝細胞の再構築を可能にし、ここでこの非ヒト動物が、非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含む工程；並びに
（ｂ）ヒト肝細胞をこの非ヒト動物へ移植する工程：を含む、方法。

【請求項7】

ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法であって、この方法が：
（ａ）ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物を提供する工程であって、ここでこの非ヒト動物が、非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含む工程；及び
（ｂ）ヒト肝細胞をこの非ヒト動物へ移植する工程：を含む、方法。

【請求項8】

前記非ヒト動物が更に、Ｆａｈ^－／－を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記キメラ非ヒト動物が、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－非ヒト動物である、請求項７～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記ヒト肝細胞が、キメラ非ヒト動物の肝臓内の全ての肝細胞の：
ｉ）少なくとも５％；
ｉｉ）少なくとも１０％；
ｉｉｉ）少なくとも２０％；
ｉｉｉ）少なくとも３０％；
ｉｖ）少なくとも４０％；
ｖ）少なくとも５０％；
ｖｉ）少なくとも７０％；
ｖｉｉ）少なくとも８０％；
ｖｉｉｉ）少なくとも９０％；
ｉｘ）少なくとも９５％；又は
ｘ）少なくとも９７％、を占める、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

ヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法であって、ここでこの方法が：
（ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載のキメラ非ヒト動物を提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物に、所定量のＡＡＶベクターを感染させる工程；及び
（ｃ）ヒト及びＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物の肝細胞（非ヒト動物肝細胞）へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む、方法。

【請求項12】

（ｄｃ）において、ヒト肝細胞又は非ヒト動物肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルが：
（ｉ）非ヒト動物における、各々、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率、もしくはＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率；又は
（ｉｉ）非ヒト動物における、各々、ヒト肝細胞もしくは非ヒト動物肝細胞に形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率：として測定される、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記方法が更に：
（ｄ）（ｉ）ＡＡＶベクターの総量の予め決定された百分率未満が、非ヒト動物肝細胞へ形質導入される場合；
（ｉｉ）ＡＡＶベクターの総量の少なくとも予め決定された百分率が、ヒト肝細胞へ形質導入される場合；
（ｉｉｉ）ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率が、既定値未満である場合；及び／又は
（ｉｖ）ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率が、既定値よりも大きい場合、
に、ヒト肝細胞を形質導入する効率的なものとしてＡＡＶベクターを選択する工程を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

ヒト肝細胞における２種以上の同一でないＡＡＶベクター（複数可）の形質導入効率を決定する方法であって、ここでこの方法が：
（ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載の２匹以上のキメラＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物を提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物の各々に、所定量の２種以上の同一でないＡＡＶベクターを感染させる工程であって、ここで１匹の非ヒト動物は、１種のＡＡＶベクターにより感染する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の２匹以上の非ヒト動物の各々におけるヒト肝細胞及びＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物肝細胞（非ヒト動物肝細胞）への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程、を含む、方法。

【請求項15】

前記方法が更に：
（ｄ）工程（ｃ）において決定された非ヒト肝細胞への２種以上のＡＡＶベクターの各々の形質導入のレベルを比較する工程；及び／又は
（ｅ）工程（ｃ）において決定されたヒト肝細胞への２種以上のＡＡＶベクターの各々の形質導入のレベルを比較する工程、を含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記方法が更に：
（ｆ）（ｉ）ＡＡＶベクターの総量の予め決定された百分率未満が、非ヒト動物肝細胞へ形質導入される場合；
（ｉｉ）ＡＡＶベクターの総量の少なくとも予め決定された百分率が、ヒト肝細胞へ形質導入される場合；
（ｉｉｉ）ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率が、既定値未満である場合；及び／又は
（ｉｖ）ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率が、既定値よりも大きい場合、
に、ヒト肝細胞を形質導入する効率的なものとして１又は複数のＡＡＶベクター（複数可）を選択する工程を含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前述の（ｉ）において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の予め決定された百分率が：
（１）≦９０％；
（２）≦８０％；
（３）≦７０％；
（４）≦５０％；
（５）≦２０％；
（６）≦１０％；及び
（７）≦５％、のいずれか１つである、請求項１３又は１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前述の（ｉｉ）において、ヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の予め決定された百分率が：
（１）≧９９％；
（２）≧９５％；
（３）≧９０％；
（４）≧８０％；
（５）≧７０％；
（６）≧５０％；
（７）≧２０％；及び
（８）≧１０％、のいずれか１つである、請求項１３又は１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前述の（ｉｉｉ）において、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率の既定値が：
（１）≦５０％；
（２）≦４０％；
（３）≦３０％；
（４）≦２０％；
（５）≦１０％；及び
（６）≦５％、のいずれか１つである、請求項１３又は１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前述の（ｉｖ）において、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率の既定値が：
（１）≧１０％；
（２）≧２０％；
（３）≧３０％；
（４）≧５０％；
（５）≧７０％；
（６）≧８０％；及び
（７）≧９０％、のいずれか１つである、請求項１３又は１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記ＡＡＶベクターが、検出可能なマーカーを発現する、請求項１１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記検出可能なマーカーが、蛍光タンパク質、酵素、又はペプチドである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記ＡＡＶベクターが、ベクターのゲノム内に独自の核酸配列を含み、ここでこの独自の核酸配列は、検出可能な又はバーコードＲＮＡ配列へ転写することができる、請求項１１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法であって、ここでこの方法が：
（ａ）請求項１～５のいずれか一項に記載のキメラ非ヒト動物を提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物に、所定量のＡＡＶベクターを、少なくとも初回感染させる工程；
（ｃ）このＡＡＶベクターの、ＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物のヒト肝細胞への形質導入のレベルを決定する工程、を含む、方法。

【請求項25】

前記方法が：
（ｄ）この非ヒト動物に、所定量のＡＡＶベクターを、２回目感染させる工程；及び
（ｅ）このＡＡＶベクターの、ＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物のヒト肝細胞への形質導入のレベルを決定する工程、を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記方法が更に：
（ｆ）初回及び２回目の感染の間の、このＡＡＶベクターの、ヒト肝細胞への形質導入のレベルを比較する工程：を含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記ＡＡＶベクターの量が、１×１０^１～１×１０^１５ウイルスゲノム／非ヒト動物である、請求項２４～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前述の初回及び２回目の感染におけるＡＡＶベクターの量が、同じである、請求項２４～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前述の初回及び２回目の感染におけるＡＡＶベクターの量が、異なる、請求項２４～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

ヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法であって、ここでこの方法が：
（ａ）Ａ群及びＢ群の２群へ分けられた２匹以上の非ヒト動物を提供する工程であって、各群は、１又は複数の非ヒト動物を含み、ここでＡ群は、野生型ヒト肝細胞が移植され、及びＢ群は、非機能性ヒトＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含むヒト肝細胞（Ｈｕ ＡＡＶＲ ＫＯヒト肝細胞）が移植される工程であって；
ここで、これら２匹以上の非ヒト動物は更に、Ｔ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞の欠乏又は機能障害、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／、及び／又はＦａｈ^－／－を含む工程；
（ｂ）工程（ａ）の各群の１又は複数の感染した非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；
（ｃ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物のヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程であって、
ここで、Ａ群における形質導入のレベルは、ＡＡＶベクターの、ＡＡＶＲ依存型形質導入効率の指標であり、及びＢ群における形質導入のレベルは、ＡＡＶベクターのＡＡＶＲ非依存型形質導入効率の指標である工程、を含む、方法。

【請求項31】

ヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法であって、この方法が：
（ａ）非ヒト動物の２群であるＡ群及びＢ群を提供する工程であって、ここでＡ群は、非ヒト動物において欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞の１又は複数を含み、並びにＢ群は、更に非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含む、非ヒト動物において欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞の１つを含み；
ここで、欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞の１又は複数は、非ヒト動物の肝臓においてヒトキメリズムを確立するヒト肝細胞の再構築を可能にする工程；
（ｂ）ヒト肝細胞を、工程（ａ）の両群の１又は複数の非ヒト動物へ移植する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の両群の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；並びに
（ｄ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物のヒト肝細胞及び非ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程、を含む、方法。

【請求項32】

ヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法であって、ここでこの方法が：
（ａ）非ヒト動物の２群であるＡ群及びＢ群を提供する工程であって、ここでＡ群が、１又は複数のＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物を含み、並びにＢ群が、更に非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含む、１又は複数のＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－の非ヒト動物を含む工程；
（ｂ）工程（ａ）の両群の１又は複数の非ヒト動物へ、ヒト肝細胞を移植する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の両群の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；並びに
（ｄ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物のヒト肝細胞及び非ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程、を含む、方法。

【請求項33】

前記非ヒト動物が更に、Ｆａｈ^－／－を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前述の方法が更に：
（ｅ）Ａ群とＢ群の間で非ヒト動物のヒト肝細胞及び非ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを比較する工程であって；
（ｉ）ここで、Ａ群の非ヒト肝細胞及びヒト肝細胞へのＡＡＶの形質導入のレベルの間の差異は、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの取込みのＡＡＶＲ依存型及び非依存型の両方の修飾及び／又は阻害の指標であり；
（ｉｉ）ここで、Ｂ群の非ヒト肝細胞及びヒト肝細胞へのＡＡＶの形質導入のレベルの間の差異は、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの取込みのＡＡＶＲ非依存型の両方の修飾及び／又は阻害の指標であり；並びに
（ｉｉｉ）ここで、Ｂ群及びＡ群におけるヒト肝細胞へのＡＡＶの形質導入のレベルの間の差異は、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの取込みのＡＡＶＲ依存型の修飾及び／又は阻害の指標である、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

少なくとも２種のヒト組織を含むキメラ非ヒト動物であって、ここでこのキメラ非ヒト動物が更に：
ａ）非ヒト動物においてヒトキメリズムを確立するよう１又は複数のヒト組織の再構築を可能にする、Ｔ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞の欠乏又は機能障害；並びに
ｂ）非ヒト動物ＡＡＶＲの欠乏又は機能障害を生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異、を含む、キメラ非ヒト動物。

【請求項36】

１又は複数のヒト組織を含むキメラ非ヒト動物であって：
ここでこのキメラ非ヒト動物が、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－キメラ非ヒト動物であり、及び
ここでこのキメラ非ヒト動物が更に、非ヒト動物ＡＡＶＲの欠乏又は機能障害を生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含む、キメラ非ヒト動物。

【請求項37】

前記キメラ非ヒト動物が、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－非ヒト動物である、請求項３５又は３６に記載のキメラ非ヒト動物。

【請求項38】

１又は複数のヒト組織を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法であって、この方法が：
（ａ）非ヒト動物においてヒトキメリズムを確立するヒト組織の再構築を可能にする、非ヒト動物において欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞を提供する工程であって、ここでこの非ヒト動物は、非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含む工程；並びに
（ｂ）１又は複数のヒト組織を、この非ヒト動物へ移植する工程、を含む、方法。

【請求項39】

１又は複数のヒト組織を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法であって、この方法が：
（ａ）ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物を提供する工程であって、ここでこの非ヒト動物が、非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含む工程；及び
（ｂ）ヒト組織を、この非ヒト動物へ移植する工程、を含む、方法。

【請求項40】

前記非ヒト動物が更に、Ｆａｈ^－／－を含む、請求項３８又は３９に記載の方法。

【請求項41】

１又は複数のヒト組織におけるＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法であって、ここでこの方法が：
（ａ）請求項３５～３７のいずれか一項に記載の非ヒト動物を提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物に、所定量のＡＡＶベクターを感染させる工程；及び
（ｃ）ＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程、を含む方法。

【請求項42】

少なくとも２種の、１又は複数のヒト組織における、２種以上の同一でないＡＡＶベクター（複数可）の形質導入効率を決定する方法であって、ここでこの方法が：
（ａ）請求項３５～３７のいずれか一項に記載の２匹以上のＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物を提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物の各々に、所定量の２種以上の同一でないＡＡＶベクターを感染させる工程であって、ここで各非ヒト動物が、１種のＡＡＶベクターにより感染する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の２匹以上の非ヒト動物の各々における少なくとも１種のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程、を含む、方法。

【請求項43】

全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法であって、ここでこの方法が：
（ａ）請求項３５～３７のいずれか一項に記載の非ヒト動物を提供する工程；
（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物に、所定量のＡＡＶベクターを、少なくとも初回感染させる工程；
（ｃ）ＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程、を含む、方法。

【請求項44】

１又は複数のヒト組織におけるＡＡＶベクターのアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法であって、ここでこの方法が：
（ａ）２群であるＡ群及びＢ群へ分けられた非ヒト動物を提供する工程であって、各群が、１又は複数の非ヒト動物を含み、ここでＡ群は、野生型ヒト組織が移植され、並びにＢ群は、非機能性ヒトＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含むヒト組織が移植され、
ここで、この２匹以上の非ヒト動物が更に、Ｔ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞の欠乏又は機能障害、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／、及び／又はＦａｈ^－／－を含む、工程；
（ｂ）工程（ａ）の各群の１又は複数の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；
（ｃ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物の１又は複数のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程であって、
ここで、Ａ群における形質導入のレベルは、ＡＡＶベクターの、ＡＡＶＲ依存型の形質導入効率の指標であり、及びＢ群における形質導入のレベルは、ＡＡＶベクターのＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率の指標である、方法。

【請求項45】

ヒト組織へのＡＡＶベクター形質導入のアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法であって、ここでこの方法が：
（ａ）非ヒト動物の群であるＡ群及びＢ群を提供する工程であって、ここでＡ群が、非ヒト動物において欠乏又は機能障害された１又は複数のＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞を含み、及びＢ群が、更に非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含む、非ヒト動物において欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞の１つを含み、
ここで、欠乏又は機能障害された１又は複数のＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞は、非ヒト動物におけるヒトキメリズムを確立するようヒト組織の再構築を可能にする工程；
（ｂ）工程（ａ）の両群の１又は複数の非ヒト動物へ、１又は複数のヒト組織を移植する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の両群の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；並びに
（ｄ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程、を含む、方法。

【請求項46】

１又は複数のヒト組織へのＡＡＶベクター形質導入のアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法であって、ここでこの方法が：
（ａ）非ヒト動物の２群であるＡ群及びＢ群を提供する工程であって、ここでＡ群が、１又は複数のＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物を含み、並びにＢ群が、更に非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含む、１又は複数のＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物を含む工程；
（ｂ）工程（ａ）の両群の１又は複数の非ヒト動物へ、１又は複数のヒト組織を移植する工程；
（ｃ）工程（ｂ）の両群の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；並びに
（ｄ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程、を含む、方法。

【請求項47】

前記非ヒト動物が更に、Ｆａｈ^－／－を含む、請求項４６に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年８月３０日に出願された、米国特許仮出願第６３／２３８，３８６号の優先権及び恩恵を主張するものであり、その内容は、その全体が引用により本明細書中に組み込まれている。

【0002】

配列表の参照としての組込み
本出願に関連した配列表ＸＭＬは、ＸＭＬファイル形式で電子的に提供され、並びに本明細書に引用により組込まれている。配列表ＸＭＬを含むＸＭＬファイルの名称は、ＡＶＣＲ－００３＿００１ＷＯ＿ＳＴ２６”である。このＸＭＬファイルは、サイズが３５，５０４バイトであり、２０２２年８月２４日に作製され、且つ米国特許商標庁（ＵＳＰＴＯ）パテントセンターを介して電子的に提出されている。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、遺伝子治療のため、及びヒト疾患モデル作製のための、ウイルス送達物質として使用される。キメラヒト化マウスモデルは、ＡＡＶベクター血清型及びそれらのバリアントの形質導入効率を決定するために、研究者により使用されているが、ほとんどのＡＡＶ血清型は、好ましくはマウス肝細胞をヒト肝細胞よりも形質導入するので、有用性が限定される。本開示は、アデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）ノックアウトヒト肝臓キメラ非ヒト動物モデル、及びＡＡＶ形質導入効率を評価するためにこれを使用する方法を提供することにより、当該技術分野におけるこれらの必要性を解決する。

【発明の概要】

【0004】

発明の概要
本開示は、ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を提供し、ここでこのキメラ非ヒト動物は、ａ）非ヒト動物の肝臓においてヒトキメリズム（ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ）を確立するヒト肝細胞の再構築（ｒｅ－ｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ）を可能にする、Ｔ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞の欠乏又は機能障害；並びに、ｂ）非ヒト動物ＡＡＶＲの欠乏又は機能障害を生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異、を含む。

【0005】

本開示は、ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を提供し、ここでこのキメラ非ヒト動物は、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－キメラ非ヒト動物であり、並びにここでこのキメラ非ヒト動物は、非ヒト動物ＡＡＶＲの欠乏又は機能障害を生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含む。一部の実施態様において、このキメラ非ヒト動物は更に、Ｆａｈ^－／－を含む。一部の実施態様において、このキメラ非ヒト動物は、導入遺伝子を含まない。一部の実施態様において、この導入遺伝子は、抗生物質耐性カセットである。

【0006】

本開示はまた、ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法も提供し、ここでこの方法は：（ａ）非ヒト動物の肝臓においてヒトキメリズムを確立するヒト肝細胞の再構築を可能にする、Ｔ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞の欠乏又は機能障害であり、ここでこの非ヒト動物は、非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含む工程；並びに、（ｂ）ヒト肝細胞を非ヒト動物へ移植する工程：を含む。本開示のヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法の一部の実施態様において、工程（ｂ）は更に、選択圧を適用することを含む。

【0007】

本開示はまた、ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法も提供し、ここでこの方法は：（ａ）ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物を提供する工程であって、ここでこの非ヒト動物は、非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含む工程；並びに、（ｂ）ヒト肝細胞をこの非ヒト動物へ移植する工程：を含む。この開示の方法の一部の実施態様において、この非ヒト動物は更に、Ｆａｈ^－／－を含む。本開示のヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法の一部の実施態様において、工程（ｂ）は更に、選択圧を適用することを含む。

【0008】

本開示の方法の一部の実施態様において、このキメラ非ヒト動物は、導入遺伝子を含まない。この開示の方法の一部の実施態様において、この導入遺伝子は、抗生物質耐性カセットである。本開示はまた、本明細書に開示された方法により作製された、キメラ非ヒト動物も提供する。

【0009】

前述の選択圧の適用は、本開示のヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法の工程（ｂ）の非ヒト動物へ、ニチシノン（ＮＴＢＣ）を提供しないことを含むことができる。ある態様において、この調製方法は、本明細書において開示された方法の工程（ｂ）後の、選択圧の除去を含む。選択圧の除去は、本明細書において開示された方法の工程（ｃ）後の、キメラ非ヒト動物へニチシノン（ＮＴＢＣ）を提供することを含むことができる。

【0010】

本開示はまた、ヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法を提供し、ここでこの方法は：（ａ）本開示の方法のいずれか１つにより調製されたキメラ非ヒト動物を提供する工程；（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物に、所定量の（ａｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ）ＡＡＶベクターを感染させる工程；並びに、（ｃ）このヒト肝細胞及びＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物の肝細胞（非ヒト動物肝細胞）へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。本開示の方法の一部の実施態様において、工程（ｃ）において、ヒト肝細胞又は非ヒト動物肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルは：（ｉ）非ヒト動物における、各々、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率、もしくはＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率；又は、（ｉｉ）非ヒト動物における、各々、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞もしくは非ヒト動物肝細胞の総量の百分率：として測定される。

【0011】

本開示の方法の一部の実施態様において、本方法は更に：（ｄ）（ｉ）ＡＡＶベクターの総量の予め決定された百分率未満が、非ヒト動物肝細胞へ形質導入される場合；（ｉｉ）ＡＡＶベクターの総量の少なくとも予め決定された百分率が、ヒト肝細胞へ形質導入される場合；（ｉｉｉ）ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率が、既定値未満である場合；及び／又は、（ｉｖ）ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率が、既定値よりも大きい場合：に、ヒト肝細胞を形質導入する効率的なものとしてこのＡＡＶベクターを選択する工程を含む。

【0012】

本開示はまた、ヒト肝細胞における２種以上の同一でないＡＡＶベクター（複数可）の形質導入効率を決定する方法を提供し、ここでこの方法は：（ａ）本開示の方法のいずれか１つにより作製された２匹以上のキメラＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物を提供する工程；（ｂ）工程（ｂ）の非ヒト動物の各々に、所定量の２種以上の同一でないＡＡＶベクターを感染させ、ここで１匹の非ヒト動物は、１種のＡＡＶベクターにより感染される工程；並びに、（ｃ）工程（ａ）の２匹以上の非ヒト動物の各々におけるヒト肝細胞及びＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物の肝細胞（非ヒト動物肝細胞）への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。この開示の方法の一部の実施態様において、この方法は更に：（ｄ）工程（ｃ）において決定された非ヒト肝細胞への２種以上のＡＡＶベクターの各々の形質導入のレベルを比較する工程；及び／又は、（ｅ）工程（ｃ）において決定されたヒト肝細胞への２種以上のＡＡＶベクターの各々の形質導入のレベルを比較する工程：を含む。本開示の方法の一部の実施態様において、この方法は：（ｆ）（ｉ）ＡＡＶベクターの総量の予め決定された百分率未満が、非ヒト動物肝細胞へ形質導入される場合；（ｉｉ）ＡＡＶベクターの総量の少なくとも予め決定された百分率が、ヒト肝細胞へ形質導入される場合；（ｉｉｉ）ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率が、既定値未満である場合；及び／又は、（ｉｖ）ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率が、既定値よりも大きい場合：に、ヒト肝細胞を形質導入する効率的なものとして１又は複数のＡＡＶベクター（複数可）を選択する工程を含む。

【0013】

本開示はまた、全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法も提供し、ここでこの方法は：（ａ）本開示の方法のいずれかにより調製されたキメラ非ヒト動物を提供する工程；（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物に、所定量のＡＡＶベクターを、少なくとも初回感染させる工程；並びに、（ｃ）このＡＡＶベクターの、ＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物のヒト肝細胞への形質導入のレベルを決定する工程：を含む。本開示の方法の一部の実施態様において、この方法は：（ｄ）この非ヒト動物に、所定量のＡＡＶベクターを、２回目感染させる工程；（ｅ）工程（ｄ）の感染した非ヒト動物を、所定時間維持する工程；並びに、（ｇ）このＡＡＶベクターの、ＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物のヒト肝細胞への形質導入のレベルを決定する工程：を含む。本開示の方法の一部の実施態様において、この方法は更に：（ｉ）初回及び２回目の感染の間の、このＡＡＶベクターの、ヒト肝細胞への形質導入のレベルを比較する工程：を含む。

【0014】

本開示はまた、ヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法も提供し、ここでこの方法は：（ａ）Ａ群及びＢ群の２群へ分けられた本開示の方法のいずれか１つにより調製された２匹以上の非ヒト動物を提供し、各群は、１又は複数の非ヒト動物を含み、ここでＡ群は、野生型ヒト肝細胞を受け取り、並びにＢ群は、非機能性ヒトＡＡＶＲを生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含むヒト肝細胞（Ｈｕ ＡＡＶＲ ＫＯヒト肝細胞）を受け取る工程；（ｂ）工程（ａ）の各群の１又は複数の感染した非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；並びに、（ｃ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物のヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程であって、ここで、ＡＡＶベクターの、Ａ群における形質導入のレベルは、ＡＡＶＲ依存型形質導入効率の指標であり、並びにＢ群における形質導入のレベルは、ＡＡＶＲ非依存型形質導入効率の指標である工程：を含む。

【0015】

本開示はまた、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入の、アデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法も提供し、この方法は：（ａ）非ヒト動物の２群Ａ群及びＢ群を提供し、ここでＡ群は、非ヒト動物において欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞の１又は複数を含み、並びにＢ群は、非ヒト動物において欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞の１を含み、更に非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含み、ここで、欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞の１又は複数は、非ヒト動物の肝臓においてヒトキメリズムを確立するヒト肝細胞の再構築を可能にする工程；（ｂ）ヒト肝細胞を、工程（ａ）の両群の１又は複数の非ヒト動物へ移植する工程；（ｃ）工程（ｂ）の両群の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；並びに、（ｄ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物のヒト肝細胞及び非ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。本開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、工程（ｂ）は更に、選択圧を適用することを含む。

【0016】

本開示はまた、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法も提供し、ここでこの方法は：（ａ）非ヒト動物の２群、Ａ群及びＢ群を提供する工程であって、ここでＡ群は、１又は複数のＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物を含み、並びにＢ群は、更に非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含む、１又は複数のＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－の非ヒト動物を含む工程；（ｂ）工程（ａ）の両群の１又は複数の非ヒト動物へ、ヒト肝細胞を移植する工程；（ｃ）工程（ｂ）の両群の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；並びに、（ｄ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物のヒト肝細胞及び非ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。この開示の方法の一部の実施態様において、非ヒト動物は更に、Ｆａｈ^－／－を含む。本開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、工程（ｂ）は更に、選択圧を適用することを含む。本開示の方法の一部の実施態様において、選択圧の適用は、工程（ｂ）の非ヒト動物へニチシノン（ＮＴＢＣ）を適用しないことを含む。本開示の方法の一部の実施態様において、この方法は更に、工程（ｂ）の後に選択圧を除去することを含む。

【0017】

本開示の方法の一部の実施態様において、この方法は更に：（ｅ）Ａ群とＢ群の間で非ヒト動物のヒト肝細胞及び非ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを比較する工程であって、（ｉ）ここで、Ａ群の非ヒト肝細胞及びヒト肝細胞へのＡＡＶの形質導入のレベルの間の差異は、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの取込みのＡＡＶＲ依存型及び非依存型の両方の修飾及び／又は阻害の指標であり；（ｉｉ）ここで、Ｂ群の非ヒト肝細胞及びヒト肝細胞へのＡＡＶの形質導入のレベルの間の差異は、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの取込みのＡＡＶＲ非依存型の両方の修飾及び／又は阻害の指標であり；並びに、（ｉｉｉ）ここで、Ｂ群及びＡ群におけるヒト肝細胞へのＡＡＶの形質導入のレベルの間の差異は、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの取込みのＡＡＶＲ依存型の修飾及び／又は阻害の指標である工程；を含む。

【0018】

別の態様において、少なくとも２種のヒト組織を含むキメラ非ヒト動物が、本明細書において提供され、ここでこのキメラ非ヒト動物は更に：（ａ）非ヒト動物においてヒトキメリズムを確立する１又は複数のヒト組織の再構築を可能にする、Ｔ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞の欠乏又は機能障害；並びに、（ｂ）非ヒト動物ＡＡＶＲの欠乏又は機能障害を生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異：を含む。別の態様において、１又は複数のヒト組織を含むキメラ非ヒト動物が、本明細書において提供され、ここでこのキメラ非ヒト動物は、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－キメラ非ヒト動物であり、並びに、ここで、このキメラ非ヒト動物は更に、非ヒト動物ＡＡＶＲの欠乏又は機能障害を生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含む。一部の実施態様において、このキメラ非ヒト動物は、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－非ヒト動物である。

【0019】

別の態様において、１又は複数のヒト組織を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法が、本明細書において提供され、ここでこの方法は：（ａ）非ヒト動物においてヒトキメリズムを確立するヒト組織の再構築を可能にする、非ヒト動物において欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞を提供する工程であって、ここでこの非ヒト動物は、非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含む工程；並びに、（ｂ）１又は複数のヒト組織を、この非ヒト動物へ移植する工程：を含む。別の態様において、１又は複数のヒト組織を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法が、本明細書において提供され、この方法は、（ａ）ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物を提供する工程であって、ここでこの非ヒト動物は、非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含む工程；並びに、（ｂ）ヒト組織を、この非ヒト動物へ移植する工程：を含む。一部の実施態様において、この非ヒト動物は更に、Ｆａｈ^－／－を含む。

【0020】

別の態様において、１又は複数のヒト組織におけるＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法が、本明細書において提供され、ここでこの方法は：（ａ）本明細書記載の非ヒト動物を提供する工程；（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物に、所定量のＡＡＶベクターを感染させる工程；並びに、（ｃ）ＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。

【0021】

別の態様において、少なくとも２種の１又は複数のヒト組織における、２種以上の同一でないＡＡＶベクター（複数可）の形質導入効率を決定する方法が、本明細書において提供され、ここでこの方法は：（ａ）本明細書記載の２匹以上のＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物を提供する工程；（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物の各々に、所定量の２種以上の同一でないＡＡＶベクターを感染させる工程であって、ここで各非ヒト動物は、１種のＡＡＶベクターにより感染される工程；（ｃ）工程（ｂ）の２匹以上の非ヒト動物の各々における少なくとも１つのヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。

【0022】

別の態様において、全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法が、本明細書において提供され、ここでこの方法は：（ａ）本明細書記載の非ヒト動物を提供する工程；（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物に、所定量のＡＡＶベクターを、少なくとも初回感染させる工程；（ｃ）ＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。

【0023】

別の態様において、１又は複数のヒト組織におけるＡＡＶベクターのアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法が、本明細書において提供され、ここでこの方法は：（ａ）２群、Ａ群及びＢ群へ分けられた非ヒト動物を提供する工程であって、各群は、１又は複数の非ヒト動物を含み、ここでＡ群は、野生型ヒト組織が移植され、並びにＢ群は、非機能性ヒトＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含むヒト組織が移植され、ここで、この２匹以上の非ヒト動物は更に、欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／、及び／又はＦａｈ^－／－を含む、工程；（ｂ）工程（ａ）の各群の１又は複数の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；並びに、（ｃ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物の１又は複数のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程であって、ここで、Ａ群における形質導入のレベルは、ＡＡＶベクターの、ＡＡＶＲ依存型の形質導入効率の指標であり、並びにＢ群における形質導入のレベルは、ＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率の指標である。

【0024】

別の態様において、ヒト組織へのＡＡＶベクター形質導入のアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法が、本明細書において提供され、ここでこの方法は：（ａ）非ヒト動物の群、Ａ群及びＢ群を提供する工程であって、ここでＡ群は、非ヒト動物において欠乏又は機能障害された１又は複数のＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞を含み、並びにＢ群は、非ヒト動物において欠乏又は機能障害された１のＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞を含み、更に非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含み、ここで欠乏又は機能障害された１又は複数のＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞は、非ヒト動物におけるヒトキメリズムを確立するヒト組織の再構築を可能にする工程；（ｂ）工程（ａ）の両群の１又は複数の非ヒト動物へ、１又は複数のヒト組織を移植する工程；（ｃ）工程（ｂ）の両群の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；並びに、（ｄ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。

【0025】

別の態様において、１又は複数のヒト組織へのＡＡＶベクター形質導入のアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法が、本明細書において提供され、ここでこの方法は：（ａ）非ヒト動物の２群、Ａ群及びＢ群を提供する工程であって、ここでＡ群は、１又は複数のＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物を含み、並びにＢ群は、更に非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含む、１又は複数のＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物を含む工程；（ｂ）工程（ａ）の両群の１又は複数の非ヒト動物へ、１又は複数のヒト組織を移植する工程；（ｃ）工程（ｂ）の両群の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；並びに、（ｄ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。一部の実施態様において、この非ヒト動物は更に、Ｆａｈ^－／－を含む。

【0026】

本明細書を通じて、語句「含んでいる」又はその変形、例えば「含む」もしくは「含んでいる」などは、言及された要素、整数もしくは工程、又は複数の要素、複数の整数、もしくは複数の工程の群の包含を暗示しているが、任意の他の要素、整数もしくは工程、又は複数の要素、複数の整数もしくは複数の工程の群を排除しないことは理解されるであろう。

【0027】

約とは、言及された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％以内として理解され得る。文脈からそうでないことが明らかでない限りは、本明細書に提供される全ての数値は、用語「約」により修飾される。

【0028】

本開示は、その詳細な説明と結びつけて説明されるが、先の説明は、本開示の範囲を例示するが限定しないことが意図され、これは、添付された請求項の範囲により規定される。別の態様、利点、及び修飾は、以下の請求項の範囲内である。

【0029】

本明細書において言及された特許文献及び科学文献は、当業者により入手可能である知識を確立する。本明細書に列挙された全ての米国特許及び公開もしくは未公開の米国特許出願は、引用により組み込まれている。本明細書に引用された全ての公開された外国特許及び特許出願は、引用により本明細書中に組み込まれている。本明細書に列挙された寄託番号により指定されたＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩ提出は、引用により本明細書中に組み込まれている。本明細書に列挙された全ての他の公開された参考文献、文書、原稿及び科学論文は、引用により本明細書中に組み込まれている。

【図面の簡単な説明】

【0030】

図面の簡単な説明
特許又は出願ファイルは、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を伴うこの特許又は特許出願の公開のコピーは、請求時に必要な料金を支払い、特許庁により提供されるであろう。

【0031】

上記の及び更なる特徴は、添付図面と結びつけて考慮される場合、以下の詳細な説明から、より明確に理解されるであろう。

【0032】

【図1】図１Ａ－１Ｂは、ＡＡＶＲのＣＲＩＳＰＲ－ＫＯ株の作製を描いている。図１Ａは、エキソン（エキソン１（Ｅ１）からエキソン６（Ｅ６））を描くボックスによる、ＡＡＶＲ遺伝子の概略図である。図１Ｂは、イントロンのプライマーを使用する、ホモ接合型及びヘテロ接合型ＡＡＶＲ ＫＯマウスの作製を示す、ＰＣＲ増幅のゲル電気泳動写真を描いている。ゲル電気泳動のゲルにおける、作製されたホモ接合型及びヘテロ接合型の動物に由来する野生型バンド（２．３ｋｂｐ）及びノックアウトバンド（０．２ｋｂｐ）が、示されている。

【0033】

【図2】図２Ａ－２Ｂは、ＴＩＲＦＡ（導入遺伝子フリーＩｌ２ｒｇ－／－／Ｒａｇ２－／－／Ｆａｈ－／－／ＡＡＶＲ－／－）ＫＯマウスに関する、ジェノタイピングスキーム及びプローブ／プライマーを描いている。図２Ａは、Ｔａｑｍａｎプローブを使用する、半－定量的ＰＣＲの概略図である。図２Ｂは、半－定量的ＰＣＲにおいて使用したプライマー配列及びレポーターを描いている。

【0034】

【図3】図３は、異なるＡＡＶ血清型による、ヒト肝臓キメラマウスの形質導入を描いている。ｘ－軸は、指定されたような、ＦＲＧ（Ｆａｈ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｉｌ２ｒｇ^－／－）ヒト肝臓キメラマウスを形質導入するために使用される、キャプシド（血清型／バリアント）、プロモーター型及び検出可能な／レポーター遺伝子に関する、ＡＡＶベクターの同一性を描いている。ｙ－軸は、ＦＲＧヒト肝臓キメラマウスのヒトキメラ肝臓における、ヒト肝細胞（白色バー）及びマウス肝細胞（黒色バー）の形質導入率を描いている。各バーに示されたデータは、各キメラマウス肝臓の画像の５－１１セットの平均±ＳＥＭである。図３は、Ｂｉｓｓｉｇ－Ｃｈｏｉｓａｔ Ｂ．らの文献（Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ２０１５）から部分的に適応されているデータを描いている。

【0035】

【図4】図４Ａ－４Ｆは、Ｂｉｓｓｉｇ－Ｃｈｏｉｓａｔ Ｂの文献（Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１５）から適応されている、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９による、ヒト肝臓キメラＦＲＧマウスの形質導入を描いている。図４Ａ－４Ｃは、ＡＡＶ８が形質導入されたＦＲＧマウスの肝細胞の形質導入を示す。図４Ｄ－４Ｆは、ＡＡＶ９が形質導入されたＦＲＧマウスの肝細胞の形質導入を示す。形質導入されたマウス肝細胞は、矢印により示され、及び形質導入されたヒト肝細胞は、矢尻により示されている。図４Ｂ及び４Ｆは、各々、図４Ａ及び４Ｄ中の白色四角によりマークされている拡大された標本である（スケールバーは５０∞ｍ）である。

【0036】

【図5】図５Ａ－５Ｌは、ＡＡＶ９による、ＡＡＶＲノックアウトヒト肝臓キメラＴＩＲＦＡ（導入遺伝子フリーＩｌ２ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－／ＡＡＶＲ^－／－）マウスの形質導入を描いている。図５Ａ－５Ｆは、ＡＡＶＲのホモ接合型欠失を伴うヒト肝臓キメラマウス（ＴＩＲＦＡ／ＡＡＶＲ^－／－）における、ＡＡＶ９による、肝細胞の形質導入を示している、２つ組実験からの代表的免疫蛍光染色パネルを描いている。図５Ｇ－５Ｌは、ＡＡＶＲヘテロ接合型欠失を伴うヒト肝臓キメラＴＩＲＦＡマウス（ＴＩＲＦＡ／ＡＡＶＲ^＋／－）における、ＡＡＶ９による、肝細胞の形質導入を示している、２つ組実験を描いている。図５Ａ、５Ｄ、５Ｇ及び５Ｊは、ＡＡＶベクター形質導入の染色（ｄＴｏｍａｔｏ）を示すパネルを描いている。図５Ｂ、５Ｅ、５Ｈ及び５Ｋは、ヒト肝細胞ＦＡＨの染色（ヒトＬＤＨＡ）を示すパネルを描いている。図５Ｃ、５Ｆ、５Ｉ及び５Ｌは、ＡＡＶベクター形質導入及びヒト肝細胞に関する染色の重ね合わせを描いている。

【0037】

【図6】図６Ａ及び６Ｂは、ヒト化されたＴＩＲＦ及びＴＩＲＦＡマウスにおける、ＡＡＶ８の形質導入を描いている。ヒト化されたＴＩＲＦ（導入遺伝子フリーＩｌ２ｒｇ^－／－／／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－／Ａａｖｒ^＋／＋）（図６Ａ）及びヒト化されたＴＩＲＦＡ（導入遺伝子フリーＩｌ２ｒｇ^－／－／／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－／Ａａｖｒ^－／－）（図６Ｂ）のマウスに、ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ発現カセットを保有するＡＡＶ８のマウス１匹につき１×１０^１２個ＧＣを注入した。マウスは、７２時間後に安楽死させ、肝臓を収集し、同時－局在化を示すために、ヒトマーカーＬＤＨ（明灰色）及びウイルス導入遺伝子ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ（黒色）を染色した。

【0038】

【図7】図７Ａ及び７Ｂは、ヒト化されたＴＩＲＦ及びＴＩＲＦＡマウスにおける、ＡＡＶ９の形質導入を描いている。ヒト化されたＴＩＲＦ（導入遺伝子フリーＩｌ２ｒｇ^－／－／／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－／Ａａｖｒ^＋／＋）（図７Ａ）及びヒト化されたＴＩＲＦＡ（導入遺伝子フリーＩｌ２ｒｇ^－／－／／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－／Ａａｖｒ^－／－）（図７Ｂ）のマウスに、１匹のｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ発現カセットを保有するＡＡＶ９のマウスにつき１×１０^１２個ＧＣを注入した。マウスは、７２時間後に安楽死させ、肝臓を収集し、同時－局在化を示すために、ヒトマーカーＬＤＨ（明灰色）及びウイルス導入遺伝子ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ（黒色）を染色した。

【0039】

【図8】図８Ａ及び８Ｂは、ヒト化されたＴＩＲＦＡマウスにおけるヒト肝細胞のＡＡＶ形質導入効率の定量を描いている。ヒト化されたＴＩＲＦマウス（導入遺伝子フリーＩｌ２ｒｇ^－／－／／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－／Ａａｖｒ^＋／＋）及びヒト化されたＴＩＲＦＡマウス（導入遺伝子フリーＩｌ２ｒｇ^－／－／／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－／Ａａｖｒ^－／－）に、１匹のｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ発現カセットを保有するＡＡＶ８（図８Ａ）又はＡＡＶ９（図８Ｂ）のマウスにつき１×１０^１２個ＧＣを注入した。マウスは、７２時間後に安楽死させ、肝臓を収集し、ヒトマーカーＬＤＨ及びウイルス導入遺伝子（ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ）を染色した。例えばＴＩＲＦ及びＴＩＲＦＡマウスにおけるヒト肝細胞のＡＡＶ形質導入など、ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ及びＬＤＨの同時局在化の定量が描かれている。各々３－５の肝臓切片を伴う３匹のマウスを、この定量に使用した。

【0040】

【図9】図９は、実施例５に記載されたテラトーマアッセイの実験設定を示す概略である。

【0041】

【図10】図１０は、新たに収集された肝臓及びテラトーマの蛍光を描いている。ヒト化されたＴＩＲＦＡマウス及びヒト化されないＴＩＲＦＡマウスに、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞～１×１０^７個を、皮下注入し、並びにテラトーマの発生後（注入後～３ヶ月）、１匹のＧＦＰの発現カセットを保有するＡＡＶ９のマウスにつき１×１０^１２個ＧＣを、静脈内に注入した。ＡＡＶ注入後７２時間で、マウスを安楽死させた。肝臓及びテラトーマを、低波長ランプに露光させ、組織の蛍光を明らかにした。留意点・ＴＩＲＦＡマウスの肝臓の斑状の蛍光は、ヒト肝臓領域に由来している。

【0042】

【図11】図１１は、ヒト肝臓を伴わないＴＩＲＦＡマウスのテラトーマにおけるヒト細胞のＡＡＶ９形質導入効率を描いている。ＴＩＲＦＡマウスに、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞～１×１０^７個を、皮下注入し、並びにテラトーマの発生後（注入後～３ヶ月）、１匹のＧＦＰの発現カセットを保有するＡＡＶ９のマウスにつき１×１０^１２個ＧＣを、静脈内に注入した。ＡＡＶ注入後７２時間で、マウスを安楽死させ、Ｈ＆Ｅ染色（１１Ａ）及びＧＦＰ免疫染色（１１Ｂ）により、テラトーマを分析した。テラトーマにおいて異なるヒト組織の示差的形質導入効率を示す、テラトーマの連続切片が、示されている。

【0043】

【図12】図１２は、ヒト肝臓を伴わないＴＩＲＦＡマウスのテラトーマにおけるヒト小腸細胞のＡＡＶ９形質導入効率を描いている。テラトーマは、図１１に示されたものと同じであるが、ここで示されたのは、例えば、ＡＡＶ９－ＧＦＰにより形質導入されたテラトーマ中の小腸組織などの、内胚葉組織の選別である。

【0044】

【図13】図１３は、ヒト肝臓を伴わないＴＩＲＦＡマウスのテラトーマにおけるヒト中胚葉のＡＡＶ９形質導入効率を描いている。テラトーマは、図１１に示されたものと同じであるが、ここで示されたのは、ＡＡＶ９－ＧＦＰにより形質導入された、中胚葉組織の選別である。

【0045】

【図14】図１４Ａ－１４Ｄは、ヒト肝臓を伴うＴＩＲＦＡマウスのヒトテラトーマのＡＡＶ９形質導入効率を描いている。ヒト肝臓ＴＩＲＦＡマウスに、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞～１０Ｅ７個を、皮下注入し、並びにテラトーマの発生後（注入後～３ヶ月）、１匹のＧＦＰの発現カセットを保有するＡＡＶ９のマウスにつき１×１０^１２個ＧＣを、静脈内に注入した。ＡＡＶ注入後７２時間で、マウスを安楽死させ、Ｈ＆Ｅ染色（１４Ａ及び１４Ｃ）及びＧＦＰ免疫染色（１４Ｂ及び１４Ｄ）により分析した。ヒトテラトーマ組織の示差的形質導入効率を示す、テラトーマの連続切片が、示されている。矢印（１４Ｃ及び１４Ｄ）は、形質導入されない平滑筋組織を示し、及び矢尻（１４Ｃ及び１４Ｄ）は、形質導入された腺構造を示す。１４Ａ中の四角は、１４Ｃにおけるテラトーマの拡大した領域であり、並びに１４Ｂ中の四角は、１４Ｄにおける拡大した領域である。

【発明を実施するための形態】

【0046】

発明の詳細な説明
本開示は、ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物であって、ここでこのキメラ非ヒト動物が：ａ）非ヒト動物の肝臓においてヒトキメリズムを確立するヒト肝細胞の再構築を可能にする、Ｔ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞の欠乏又は機能障害；並びに、ｂ）非ヒト動物ＡＡＶＲの欠乏又は機能障害を生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異：を含む、キメラ非ヒト動物を提供する。

【0047】

本開示は、ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物であって、ここでこのキメラ非ヒト動物が、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－キメラ非ヒト動物であり、並びにここでこのキメラ非ヒト動物は、非ヒト動物ＡＡＶＲの欠乏又は機能障害を生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含む、キメラ非ヒト動物を提供する。一部の実施態様において、このキメラ非ヒト動物は更に、Ｆａｈ^－／－を含む。

【0048】

本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、このキメラ非ヒト動物は、ＩＬ－２ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－非ヒト動物である。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、キメラ非ヒト動物の肝臓内の全ての肝細胞の少なくとも５％；少なくとも１０％；少なくとも２０％；少なくとも３０％；少なくとも４０％；少なくとも５０％；少なくとも７０％；少なくとも８０％；少なくとも９０％；少なくとも９５％又は少なくとも９９％を占めるヒト肝細胞は、ヒト肝細胞である。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、ヒト肝細胞は、このキメラ非ヒト動物の肝臓内の全ての肝細胞の少なくとも７０％（例えば、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９７％）を占める。

【0049】

本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターによる感染時に、非ヒトキメラ動物の内在性肝細胞の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満又は５％未満は、ＡＡＶベクターにより形質導入される。

【0050】

本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターによる感染時に、ヒト肝細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％は、ＡＡＶベクターにより形質導入される。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターによる感染時に、ヒト肝細胞の少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％）は、ＡＡＶベクターにより形質導入される。

【0051】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルスファミリーの一員であり、４．７キロベース（ｋｂ）～６ｋｂの１本鎖線状ＤＮＡゲノムを持つ、小型の包膜を持たない正二十面体ウイルスである。ＡＡＶの生活環は、感染後、ＡＡＶゲノムが宿主ゲノムへ組込まれる潜伏期、並びに、アデノウイルス又は単純ヘルペスウイルスのいずれかに感染した後に、組込まれたＡＡＶゲノムが、逐次レスキューされ、複製され、及び感染性ウイルスへパッケージングされる感染相を含む。非病原性であり、非分裂細胞を含む感染力の広い宿主範囲、並びに組込みの特性は、ＡＡＶを魅力的な送達ビヒクルとしている。

【0052】

本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、このＡＡＶは、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１のいずれか１種である。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、このＡＡＶは、ＡＡＶ血清型８である。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、このＡＡＶは、ＡＡＶ血清型９である。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、このＡＡＶは、対象の肝臓を特異的に感染するか又は遺伝子導入する、ＡＡＶ血清型である。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、このＡＡＶは、肝細胞を特異的に感染するか又は遺伝子導入する、ＡＡＶ血清型である。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、このＡＡＶは、２種以上のＡＡＶ血清型のハイブリッドである。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、このＡＡＶは、６．２、２、ｒｈ６４Ｒ１、ｒｈ１０、８、９及びＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂのいずれか１つから選択されたバリアントである。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、このＡＡＶベクターは、検出可能な分子をコードしている。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、この検出可能な分子は、蛍光タンパク質、酵素、又はペプチドである。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、この検出可能な分子は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ又はＬａｃＺ（β－ガラクトシダーゼ）である。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、このＡＡＶベクターは、誘導型プロモーター又は構成型プロモーターを含む。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、このＡＡＶベクターは、組織特異的プロモーターを含む。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、誘導型プロモーターは、テトラサイクリン－誘導型プロモーター又はＣＭＶプロモーターである。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、このＡＡＶベクターは、１又は複数の異種タンパク質をコードしている。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、この１又は複数の異種タンパク質は、免疫原性タンパク質又はペプチド、治療的タンパク質、制御性タンパク質又はマーカー／検出可能なタンパク質のいずれか１つから選択することができる。

【0053】

本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、キメラ非ヒト動物は、霊長類、トリ、マウス、ラット、家禽、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ及びブタのいずれか１種であることができる。本開示のキメラ非ヒト動物の一部の実施態様において、キメラ非ヒト動物は、マウスである。

【0054】

本開示はまた、ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法であって、この方法が：（ａ）非ヒト動物の肝臓におけるヒトキメリズムを確立するヒト肝細胞の再構築を可能にする、欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞を非ヒト動物に提供し、ここでこの非ヒト動物は、非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含む工程；並びに、（ｂ）ヒト肝細胞を非ヒト動物へ移植する工程：を含む方法も提供する。本開示のヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を調製する一部の実施態様において、工程（ｂ）は更に、選択圧を適用することを含む。

【0055】

本開示はまた、ヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法も提供し、この方法は：（ａ）ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物を提供する工程であって、ここでこの非ヒト動物は、非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含む工程；並びに（ｂ）ヒト肝細胞を非ヒト動物へ移植する工程：を含む。この開示の方法の一部の実施態様において、非ヒト動物は更に、Ｆａｈ^－／－を含む。本開示のヒト肝細胞を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法の一部の実施態様において、工程（ｂ）は更に、選択圧を適用することを含む。

【0056】

この開示の方法の一部の実施態様において、選択圧の適用は、工程（ｂ）の非ヒト動物へ、ニチシノン（ＮＴＢＣ）を提供しないことを含む。この開示の方法の一部の実施態様において、本方法は更に、本明細書において開示された方法の工程（ｃ）後に、選択圧を除去することを含む。選択圧の除去は、本明細書において開示された方法の工程（ｃ）後に、キメラ非ヒト動物へニチシノン（ＮＴＢＣ）を提供することを含むことができる。この開示の方法の一部の実施態様において、キメラ非ヒト動物は、導入遺伝子を含まない。この開示の方法の一部の実施態様において、この導入遺伝子は、抗生物質耐性カセットである。本開示はまた、本明細書において開示された方法により作製されたキメラ非ヒト動物も提供する。

【0057】

この開示の調製方法の一部の実施態様において、キメラ非ヒト動物は、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－非ヒト動物である。この開示の調製方法の一部の実施態様において、キメラ非ヒト動物は、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－非ヒト動物であり、ここでこのキメラ非ヒト動物は、抗生物質選択遺伝子カセットを含まない。

【0058】

本開示の調製方法の一部の実施態様において、キメラ非ヒト動物の肝臓内の全ての肝細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９７％は、ヒト肝細胞である。この開示の調製方法の一部の実施態様において、キメラ非ヒト動物の肝臓内の全ての肝細胞の少なくとも７０％（例えば、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９７％）を占めるヒト肝細胞は、ヒト肝細胞である。

【0059】

この開示の調製方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターによる感染後、非ヒトキメラ動物の内在性肝細胞の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満又は５％未満は、ＡＡＶベクターにより形質導入される。

【0060】

この開示の調製方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターによる感染後、ヒト肝細胞の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％又は少なくとも９０％は、ＡＡＶベクターにより形質導入される。この開示の調製方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターによる感染後、ヒト肝細胞の少なくとも５０％（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％）は、ＡＡＶベクターにより形質導入される。

【0061】

この開示の調製方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１のいずれか１つである。この開示の調製方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型８である。この開示の調製方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型９である。この開示の調製方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、対象の肝臓を特異的に感染及び／又は形質導入するＡＡＶ血清型である。この開示の調製方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、肝細胞を特異的に感染及び／又は形質導入するＡＡＶ血清型である。この開示の調製方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、２種以上のＡＡＶ血清型のハイブリッドである。この開示の調製方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、６．２、２、ｒｈ６４Ｒ１、ｒｈ１０、８、９及びＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂのいずれか１つから選択されるバリアントである。この開示の調製方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、検出可能な分子をコードしている。この開示の調製方法の一部の実施態様において、この検出可能な分子は、蛍光タンパク質、酵素、又はペプチドである。この開示の調製方法の一部の実施態様において、この検出可能なマーカーは、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ又はＬａｃＺ（β－ガラクトシダーゼ）である。この開示の調製方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、誘導型プロモーター又は構成型プロモーターを含む。この開示の調製方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、組織－特異的プロモーターを含む。この開示の調製方法の一部の実施態様において、誘導型プロモーターは、テトラサイクリン誘導型プロモーター又はＣＭＶプロモーターである。この開示の調製方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、１又は複数の異種タンパク質をコードしている。この開示の調製方法の一部の実施態様において、１又は複数の異種タンパク質は、免疫原性タンパク質又はペプチド、治療的タンパク質、制御性タンパク質又はマーカー／検出可能なタンパク質のいずれか１つから選択されることができる。この開示の調製方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、このベクターのゲノム内に独自の核酸配列を含み、ここでこの独自の核酸配列は、検出可能なＲＮＡ配列又はバーコードＲＮＡ配列へ転写され得る。ＡＡＶベクターの検出可能なＲＮＡ配列又はバーコードＲＮＡ配列は、本開示の方法において使用されるいずれか他のベクターの検出可能なＲＮＡ配列又はバーコードＲＮＡ配列とは異なる。このＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクターのゲノム内に任意の独自の核酸配列、又は当該技術分野において公知のＡＡＶベクターの検出可能なＲＮＡ配列もしくはバーコードＲＮＡ配列を含むことができる（例えば、Ａｄａｃｈｉ Ｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｖｏｌｕｍｅ ２２， Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １， Ｍａｙ ２０１４；Ａｄａｃｈｉ Ｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｖｏｌｕｍｅ ５， Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ： ３０７５ （２０１４）；Ｐｅｋｒｕｎ Ｋら、ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ． ２０１９；４（２２）：ｅ１３１６１０；ＵＳ２０１９０１３５８７１Ａ１；及び、ＷＯ２０２０１６０５０８Ａ１）。

【0062】

この開示の調製方法の一部の実施態様において、非ヒト動物のＡＡＶＲは、非ヒト動物ＡＡＶＲのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介欠失によるか、又は外因性物質によるノックダウン、又はＣｒｅリコンビナーゼもしくはＣｒｅトランスジェニック非ヒト動物をコードしているウイルスの初回投与量による、非ヒト動物ＡＡＶＲ遺伝子のフロックスされた（ｆｌｏｘｅｄ）対立遺伝子により、欠失されることができる。この開示の調製方法の一部の実施態様において、非ヒト動物のＡＡＶＲは、ＡＡＶＲ ｍＲＮＡを標的化する１又は複数のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により、欠失されることができる。この開示の調製方法の一部の実施態様において、バリアントＡＡＶＲは、野生型ＡＡＶＲのアミノ酸配列に対し１又は複数の改変されたアミノ酸を含むことができ、これは野生型ＡＡＶＲに比べ、表面発現レベル又は細胞表面輸送の減少を生じる。この開示の調製方法の一部の実施態様において、バリアントＡＡＶＲは、野生型ＡＡＶＲのアミノ酸配列に比べ、１又は複数の改変されたアミノ酸、及び／又はシグナル伝達ペプチド、１又は複数の多発性嚢胞腎－様（ＰＫＤ）ドメイン、Ｎ末端での８個のシステイン（ＭＡＮＥＣ）ドメイン、膜貫通ドメイン及び／又は細胞質ゾル性尾部によるモチーフの欠失を含む。

【0063】

この開示の調製方法の一部の実施態様において、キメラ非ヒト動物は、霊長類、トリ、マウス、ラット、家禽、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ及びブタのいずれか１つであることができる。この開示の調製方法の一部の実施態様において、キメラ非ヒト動物は、マウスである。

【0064】

本開示はまた、ヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法を提供し、ここでこの方法は：（ａ）本開示の方法のいずれか１つにより調製されたキメラ非ヒト動物を提供する工程；（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物に、所定量のＡＡＶベクターを感染させる工程；（ｃ）工程（ｂ）の感染した非ヒト動物を、所定時間維持する工程；並びに、（ｄ）ＡＡＶベクターの、ヒト肝細胞及びＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物の肝細胞（非ヒト動物肝細胞）への形質導入のレベルを決定する工程：を含む。

【0065】

本開示の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、工程（ｄ）における、ＡＡＶベクターのヒト肝細胞又は非ヒト動物肝細胞への形質導入のレベルは：（ｉ）非ヒト動物における、各々、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率もしくはＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率；又は、（ｉｉ）非ヒト動物における、各々、ヒト肝細胞又は非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率：として測定される。

【0066】

本開示の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、方法は更に：（ｆ）（ｉ）ＡＡＶベクターの総量の予め決定された百分率未満が、非ヒト動物肝細胞へ形質導入される場合；（ｉｉ）ＡＡＶベクターの総量の少なくとも予め決定された百分率が、ヒト肝細胞へ形質導入される場合；（ｉｉｉ）ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率が、既定値未満である場合；及び／又は、（ｉｖ）ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞（ｈｕｍａｎ ａｎｉｍａｌ ｈｅｐａｃｙｔｏｓｙｓ）の百分率が、既定値よりも大きい場合：に、ヒト肝細胞を形質導入する効率的なものとしてこのＡＡＶベクターを選択する工程を含む。

【0067】

本開示はまた、ヒト肝細胞において、２種以上の同一でないＡＡＶベクター（複数可）の形質導入効率を決定する方法も提供し、ここでこの方法は：（ａ）本開示の方法のいずれか１つにより作製された２匹以上のキメラＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物を提供する工程；（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物の各々に、所定量の２種以上の同一でないＡＡＶベクターを感染させる工程であって、ここで１匹の非ヒト動物は、１つのＡＡＶベクターにより感染され、及び他方の動物は、他のＡＡＶベクターにより感染される工程；（ｃ）工程（ｂ）の感染された非ヒト動物を、所定時間維持する工程；並びに、（ｄ）工程（ｃ）の２匹以上の非ヒト動物の各々において、ヒト肝細胞及びＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物肝細胞（非ヒト動物肝細胞）への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。この開示の方法の一部の実施態様において、本方法は更に、工程（ｂ）後に選択圧を除去することを含む。この開示の方法の一部の実施態様において、本方法は更に：（ｅ）工程（ｄ）において決定された非ヒト肝細胞への２種以上のＡＡＶベクターの各々の形質導入のレベルを比較する工程；及び／又は、（ｆ）工程（ｄ）において決定されたヒト肝細胞への２種以上のＡＡＶベクターの各々の形質導入のレベルを比較する工程：を含む。この開示の方法の一部の実施態様において、本方法は更に：（ｇ）（ｉ）ＡＡＶベクターの総量の予め決定された百分率未満が、非ヒト動物肝細胞へ形質導入される場合；（ｉｉ）ＡＡＶベクターの総量の少なくとも予め決定された百分率が、ヒト肝細胞へ形質導入される場合；（ｉｉｉ）ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率が、既定値未満である場合；及び／又は、（ｉｖ）ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率が、既定値よりも大きい場合：に、ヒト肝細胞を形質導入する効率的なものとして１又は複数のＡＡＶベクター（複数可）を選択する工程を含む。

【0068】

この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、（ｉ）において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の予め決定された百分率は、≦１００％、≦９０％、≦８０％、≦７０％、≦５０％、≦２０％、≦１０％、又は≦５％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、７０％～９０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、５０％～７０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、２０％～５０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、１０％～２０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、５％～１０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、０％～５％である。

【0069】

この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、（ｉｉ）において、ヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の予め決定された百分率は、≧９９％、≧９５％、≧９０％、≧８０％、≧７０％、≧５０％、≧２０％又は≧１０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、９５％～１００％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、９０％～９５％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、８０％～９０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、７０％～８０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、５０％～７０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、２０％～５０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、１０％～２０％である。

【0070】

この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、０％～５％であり、並びにヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、９５％～１００％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、５％～１０％であり、並びにヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、９０％～９５％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、１０％～２０％であり、並びにヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、８０％～９０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、２０％～５０％であり、並びにヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、５０％～８０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、５０％～７０％であり、並びにヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、２０％～５０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、７０％～８０％であり、並びにヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、１０％～２０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、８０％～９０％であり、並びにヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、１０％～２０％である。

【0071】

非ヒト動物肝細胞及び非ヒト肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、本開示のキメラ非ヒト動物を感染させるのに使用される特異的ＡＡＶ血清型によって決まる。一部の実施態様において、ＡＡＶベクターの非ヒト肝細胞への形質導入は、ＡＡＶＲによってのみ媒介され得る。一部の実施態様において、ＡＡＶベクターの非ヒト肝細胞への形質導入は、ＡＡＶＲ以外の１又は複数の受容体（非ＡＡＶＲ受容体）によってのみ媒介され得る。一部の実施態様において、ＡＡＶベクターの非ヒト肝細胞への形質導入は、ＡＡＶＲ及びＡＡＶＲ以外の１又は複数の受容体（非ＡＡＶＲ受容体）の両方により媒介され得る。

【0072】

非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、当該技術分野において公知の任意の方法により決定されることができ、これは、ＡＡＶベクターにより感染されたキメラ非ヒト動物の肝臓の収集、肝臓から単離された、ヒト肝細胞又は非ヒト肝細胞又は両方から回収されたＡＡＶベクター量の決定、並びに回収されたＡＡＶベクターの決定された量の、動物を感染させるために使用されたＡＡＶベクターの総量に対する比の比較又は決定を含む。一部の態様において、肝臓から回収されたＡＡＶベクターの決定された量、又は回収されたＡＡＶベクターの決定された量のＡＡＶベクター総量に対する比は、ＡＡＶで形質導入されたキメラ非ヒト動物の内在性細胞／非ヒト肝細胞の百分率と相関され得る。

【0073】

一部の実施態様において、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、非ヒト動物を形質導入するために使用された漸増量のＡＡＶベクターに関して／対しての対照非ヒト動物において形質導入されたマウス細胞／肝細胞の総数の平均検出可能なシグナル強度又は形質導入されたマウス細胞／肝細胞の総数を、比較／プロットすることにより標準曲線を作製することにより決定することができる。本明細書記載の対照非ヒト動物は、野生型もしくはＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物、又はＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－非ヒト動物、又はアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失もしくは変異を伴わずに、Ｔ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞の欠乏もしくは機能障害を伴う非ヒト動物であることができる。本開示の方法のキメラ非ヒト動物の非ヒト動物肝細胞又はヒト肝細胞又は両方へ形質導入されたＡＡＶベクターの総量の百分率は、本明細書記載の標準曲線を基に決定されることができる。一部の実施態様において、対照非ヒト動物を感染するのに使用されるＡＡＶベクターの総量の全て又は少なくとも９９％は、非ヒト動物肝細胞へ形質導入されると推定される。

【0074】

この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、（ｉｉｉ）における、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率の既定値は、≦５０％、≦４０％、≦３０％、≦２０％、≦１０％又は≦５％である。

【0075】

この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターにより形質導入された－非ヒト動物肝細胞の百分率は、４０％～５０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターにより形質導入された－非ヒト動物肝細胞の百分率は、３０％～４０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターにより形質導入された－非ヒト動物肝細胞の百分率は、２０％～３０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターにより形質導入された－非ヒト動物肝細胞の百分率は、１０％～２０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターにより形質導入された－非ヒト動物肝細胞の百分率は、５％～１０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターにより形質導入された－非ヒト動物肝細胞の百分率は、０％～５％である。

【0076】

この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、（ｉｖ）における、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率の既定値は、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧５０％、≧７０％、≧８０％又は≧９０％である。

【0077】

この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターにより形質導入された－ヒト肝細胞の百分率は、９０％～９７％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターにより形質導入された－ヒト肝細胞の百分率は、８０％～９０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターにより形質導入された－ヒト動物肝細胞の百分率は、７０％～８０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターにより形質導入された－ヒト肝細胞の百分率は、５０％～７０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターにより形質導入された－ヒト肝細胞の百分率は、２０％～５０％である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターにより形質導入された－ヒト肝細胞の百分率は、１０％～２０％である。

【0078】

この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、４０％～５０％、３０％～４０％、２０％～３０％、１０％～２０％、５％～１０％、又は０％～５％であることができ；並びに、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％であることができる。

【0079】

ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞及び非ヒト肝細胞の百分率は、本開示のキメラ非ヒト動物を感染させるのに使用された特異的ＡＡＶ血清型によって決まる。一部の実施態様において、ＡＡＶベクターのヒト又は非ヒト肝細胞への形質導入は、ＡＡＶＲによってのみ媒介され得る。一部の実施態様において、ＡＡＶベクターのヒト又は非ヒト肝細胞への形質導入は、ＡＡＶＲ以外の１又は複数の受容体（非ＡＡＶＲ受容体）によってのみ媒介され得る。一部の実施態様において、ＡＡＶベクターのヒト又は非ヒト肝細胞への形質導入は、ＡＡＶＲ及びＡＡＶＲ以外の１又は複数の受容体（非ＡＡＶＲ受容体）の両方により媒介され得る。ＡＡＶのヒト又は非ヒト肝細胞への形質導入は、ＡＡＶの特異的血清型又は血清型バリアントによって決まる、ＡＡＶＲ又は非ＡＡＶＲ受容体のいずれかにより媒介され得る。ＡＡＶのヒト又は非ヒト肝細胞への形質導入は、ＡＡＶの特異的キャプシドタンパク質によって決まる、ＡＡＶＲ又は非ＡＡＶＲ受容体のいずれかにより、媒介され得る。

【0080】

この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^１～１×１０^１５ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示の感染におけるＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^２～１×１０^１２ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^４～１×１０^１０ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^６～１×１０^８ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^１～１×１０^３ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^２～１×１０^５ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^５～１×１０^８ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^８～１×１０^１２ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^１２～１×１０^１５ウイルスゲノム／非ヒト動物である。

【0081】

この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも１日行われる。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも１週間行われる。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも２週間行われる。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも４週間行われる。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、１日～５日行われる。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、５日～１０日行われる。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、１０日～１５日行われる。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、１５日～２０日行われる。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、２０日～２５日行われる。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、２５日～３０日行われる。

【0082】

この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１のいずれか１種である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型８である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型９である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、対象の肝臓を特異的に感染又は形質導入するＡＡＶ血清型である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、肝細胞を特異的に感染又は形質導入するＡＡＶ血清型である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、２種以上のＡＡＶ血清型のハイブリッドである。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、６．２、２、ｒｈ６４Ｒ１、ｒｈ１０、８、９及びＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂのいずれか１つから選択されたバリアントである。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、検出可能なマーカーをコードしている。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、この検出可能なマーカーは、蛍光タンパク質、酵素、又はペプチドである。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、この検出可能なマーカーは、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ又はＬａｃＺ（β－ガラクトシダーゼ）である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、誘導型プロモーター又は構成型プロモーターを含む。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、組織特異的プロモーターを含む。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、誘導型プロモーターは、テトラサイクリン－誘導型プロモーター又はＣＭＶプロモーターである。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、１又は複数の異種タンパク質をコードしている。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、１又は複数の異種タンパク質は、免疫原性タンパク質又はペプチド、治療的タンパク質、制御性タンパク質又はマーカー／検出可能なタンパク質のいずれか１つから選択されることができる。

【0083】

本開示はまた、全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法も提供し、ここでこの方法は：（ａ）本開示の方法のいずれかにより調製されたキメラＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物を提供する工程；（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物に、所定量のＡＡＶベクターを、少なくとも初回感染させる工程；（ｃ）工程（ｂ）の感染した非ヒト動物を、所定時間維持する工程；並びに、（ｄ）このＡＡＶベクターの、ＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物のヒト肝細胞への形質導入のレベルを決定する工程：を含む。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、この方法は：（ｅ）この非ヒト動物に、所定量のＡＡＶベクターを、２回目感染させる工程；（ｆ）工程（ｅ）の感染した非ヒト動物を、所定時間維持する工程；並びに、（ｇ）このＡＡＶベクターの、ＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物のヒト肝細胞への形質導入のレベルを決定する工程：を含む。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、この方法は更に：（ｉ）このＡＡＶベクターの、初回及び２回目の感染の間の、ヒト肝細胞への形質導入のレベルを比較する工程：を含む。

【0084】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回及び２回目の感染におけるＡＡＶベクターの量は、同じである。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回及び２回目の感染におけるＡＡＶベクターの量は、異なる。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染におけるＡＡＶベクターの量は、２回目感染におけるＡＡＶベクターの量よりも高い。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染におけるＡＡＶベクターの量は、２回目感染におけるＡＡＶベクターの量よりも低い。

【0085】

本開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回及び／又は２回目感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^１～１×１０^１５ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回及び／又は２回目感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^２～１×１０^１２ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回及び／又は２回目感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^４～１×１０^１０ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回及び／又は２回目感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^６～１×１０^８ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回及び／又は２回目感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^１～１×１０^３ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回及び／又は２回目感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^２～１×１０^５ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回及び／又は２回目感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^５～１×１０^８ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回及び／又は２回目感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^８～１×１０^１２ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回及び／又は２回目感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^１２～１×１０^１５ウイルスゲノム／非ヒト動物である。

【0086】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも１日行われる。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも１週間行われる。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも２週間行われる。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも４週間行われる。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、１日～５日行われる。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、５日～１０日行われる。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、１０日～１５日行われる。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、１５日～２０日行われる。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、２０日～２５日行われる。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、２５日～３０日行われる。

【0087】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、≦５０％、≦４０％、≦３０％、≦２０％、≦１０％又は≦５％である。

【0088】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、４０％～５０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、３０％～４０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、２０％～３０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、１０％～２０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、５％～１０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、０％～５％である。

【0089】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、≦５０％、≦４０％、≦３０％、≦２０％、≦１０％又は≦５％である。

【0090】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、４０％～５０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、３０％～４０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、２０％～３０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、１０％～２０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、５％～１０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、０％～５％である。

【0091】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧５０％、≧７０％、≧８０％又は≧９０％である。

【0092】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、９０％～１００％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、８０％～９０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、７０％～８０％でる。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、５０％～７０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、２０％～５０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、１０％～２０％である。

【0093】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率は、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧５０％、≧７０％、≧８０％又は≧９０％である。

【0094】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、９０％～１００％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、８０％～９０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、７０％～８０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、５０％～７０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、２０％～５０％である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、１０％～２０％である。

【0095】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、４０％～５０％、３０％～４０％、２０％～３０％、１０％～２０％、５％～１０％、又は０％～５％であり；並びに、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率は、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％である。

【0096】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後の、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、４０％～５０％、３０％～４０％、２０％～３０％、１０％～２０％、５％～１０％、又は０％～５％であり；並びに、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率は、０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％である。

【0097】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、初回及び２回目の両方の感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率よりも大きい。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率よりも大きく、並びに２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率と同じである。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率よりも大きく、並びに２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率未満である。

【0098】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率と同じであり、並びに２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率未満である。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率と同じであり、並びに２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率よりも大きい。

【0099】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率未満であり、並びに２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率と同じである。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、初回感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率未満であり、並びに２回目感染後、ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率よりも大きい。

【0100】

この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後のＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、初回感染後よりも高い。この開示の全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法の一部の実施態様において、２回目感染後のＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、初回感染後よりも高い。

【0101】

本開示はまた、ヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法も提供し、ここでこの方法は：（ａ）Ａ群及びＢ群の２群へ分けられた本開示の方法のいずれか１つにより調製された２匹以上のキメラ非ヒト動物を提供し、各群は、１又は複数の非ヒト動物を含み、ここでＡ群は、野生型ヒト肝細胞を受け取り、並びにＢ群は、非機能性ヒトＡＡＶＲを生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含むヒト肝細胞（Ｈｕ ＡＡＶＲ ＫＯヒト肝細胞）を受け取る工程；（ｂ）工程（ａ）の各群の１又は複数の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；（ｃ）工程（ｂ）の各群の１又は複数の非ヒト動物を所定時間維持する工程；並びに、（ｄ）Ａ群及びＢ群の１又は複数の非ヒト動物のヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程であって、ここで、ＡＡＶベクターの、Ａ群における形質導入のレベルは、ＡＡＶＲ依存型形質導入効率の指標であり、並びにＢ群における形質導入のレベルは、ＡＡＶＲ非依存型形質導入効率の指標である工程：を含む。

【0102】

この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、工程（ａ）は更に、選択圧を適用することを含む。この開示の方法の一部の実施態様において、選択圧の適用は、工程（ａ）の非ヒト動物へニチシノン（ＮＴＢＣ）を提供しないことを含む。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、この方法は更に、工程（ｂ）の後に、選択圧を除去することを含む。一部の実施態様において、選択圧の除去は、本明細書において開示された方法の工程（ｂ）の後に、キメラ非ヒト動物へＮＴＢＣを提供することを含むことができる。

【0103】

この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群及びＢ群における非ヒト動物のヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルは、各々、Ａ群及びＢ群における、ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率により決定される。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率は、≧０％、≧５％、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧５０％、≧７０％、≧８０％又は≧９０％である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率は、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％である。

【0104】

この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、Ｂ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率は、≧０％、≧５％、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧５０％、≧７０％、≧８０％、又は≧９０％である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、Ｂ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率は、０％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％である。

【0105】

この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、Ｂ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率よりも高く、これは、このＡＡＶ形質導入は、ＡＡＶＲ非依存型よりもよりＡＡＶＲ依存型であることを指摘している。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、Ｂ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率よりも低く、これは、このＡＡＶ形質導入は、ＡＡＶＲ依存型よりもよりＡＡＶＲ非依存型であることを指摘している。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率は、Ｂ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト動物肝細胞の百分率と同じであり、これは、このＡＡＶ形質導入は、ＡＡＶＲ非依存型と同等にＡＡＶＲ依存型であることを指摘している。

【0106】

この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率は、≧５％、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧５０％、≧７０％、≧８０％、又は≧９０％であり、並びにＢ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率は、０％～５％であり、これは、このＡＡＶ形質導入は、ＡＡＶＲ依存型であることを指摘している。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率は、０％～５％であり、並びにＢ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率は、≧５％、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧５０％、≧７０％、≧８０％、又は≧９０％であり、これは、このＡＡＶ形質導入は、ＡＡＶＲ非依存型であることを指摘している。

【0107】

本開示の、各々Ａ群及びＢ群における、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型及びＡＡＶＲ非依存型の形質導入は、ＡＡＶの血清型又はバリアントによって決まる。本開示の、各々Ａ群及びＢ群における、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型及びＡＡＶＲ非依存型の形質導入は、ＡＡＶの特異的キャプシドタンパク質によって決まる。一部の実施態様において、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入は、ＡＡＶＲによってのみ媒介され得る。一部の実施態様において、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入は、ＡＡＶＲ以外の１又は複数の受容体（非ＡＡＶＲ受容体）によってのみ媒介され得る。一部の実施態様において、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入は、ＡＡＶＲ及びＡＡＶＲ以外の１又は複数の受容体（非ＡＡＶＲ受容体）の両方により媒介され得る。

【0108】

この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群及びＢ群の非ヒト動物の数は、等しい。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群及びＢ群の非ヒト動物の数は、異なる。

【0109】

この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^１～１×１０^１５ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^２～１×１０^１２ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^４～１×１０^１０ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^６～１×１０^８ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^１～１×１０^３ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^２～１×１０^５ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^５～１×１０^８ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^８～１×１０^１２ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^１２～１×１０^１５ウイルスゲノム／非ヒト動物である。

【0110】

この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも１日行われる。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも１週間行われる。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも２週間行われる。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも４週間行われる。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、１日～５日行われる。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、５日～１０日行われる。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、１０日～１５日行われる。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、１５日～２０日行われる。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、２０日～２５日行われる。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、２５日～３０日行われる。

【0111】

この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１のいずれか１種である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型８である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型９である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、対象の肝臓を特異的に感染又は形質導入するＡＡＶ血清型である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、肝細胞を特異的に感染又は形質導入するＡＡＶ血清型である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、２種以上のＡＡＶ血清型のハイブリッドである。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、６．２、２、ｒｈ６４Ｒ１、ｒｈ１０、８、９及びＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂから選択されたバリアントである。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、検出可能なマーカーをコードしている。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、この検出可能なマーカーは、蛍光タンパク質、酵素、又はペプチドである。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、この検出可能なマーカーは、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ又はＬａｃＺ（β－ガラクトシダーゼ）である。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、誘導型プロモーター又は構成型プロモーターを含む。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、組織特異性プロモーターを含む。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、誘導型プロモーターは、テトラサイクリン－誘導型プロモーター又はＣＭＶプロモーターである。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、１又は複数の異種タンパク質をコードしている。この開示のヒト肝細胞におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法の一部の実施態様において、１又は複数の異種タンパク質は、免疫原性タンパク質又はペプチド、治療的タンパク質、制御性タンパク質又はマーカー／検出可能なタンパク質から選択され得る。

【0112】

本開示はまた、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法も提供し、ここでこの方法は：（ａ）非ヒト動物の２群Ａ群及びＢ群を提供し、ここでＡ群は、非ヒト動物において欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞の１又は複数を含み、並びにＢ群は、更に非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含む、非ヒト動物において欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞の１を含む工程；（ｂ）ヒト肝細胞を、工程（ａ）の両群の１又は複数の非ヒト動物へ移植する工程；（ｃ）工程（ｂ）の両群の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；（ｄ）工程（ｃ）の各群の１又は複数の感染した非ヒト動物を、所定時間維持する工程；並びに、（ｅ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物のヒト肝細胞及び非ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。

【0113】

ＡＡＶベクター処理の「修飾」は、例えば、時期もしくは有効性もしくは形質導入の変化、及び／又はＡＡＶベクターにより形質転換された細胞集団の種類の変化を含む。

【0114】

本開示はまた、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法も提供し、ここでこの方法は：（ａ）非ヒト動物の２群、Ａ群及びＢ群を提供する工程であって、ここでＡ群は、１又は複数のＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物を含み、並びにＢ群は、更に非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含む、１又は複数のＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－の非ヒト動物を含む工程；（ｂ）工程（ａ）の両群の１又は複数の非ヒト動物へ、ヒト肝細胞を移植し、及び選択圧を適用する工程；（ｃ）工程（ｂ）の両群の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；（ｄ）工程（ｃ）の各群の１又は複数の感染した非ヒト動物を、所定時間維持する工程；並びに、（ｅ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物のヒト肝細胞及び非ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。この開示の方法の一部の実施態様において、非ヒト動物は更に、Ｆａｈ^－／－を含む。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、工程（ｂ）は更に、選択圧を適用することを含む。本開示の方法の一部の実施態様において、選択圧の適用は、工程（ｂ）の非ヒト動物へニチシノン（ＮＴＢＣ）を提供しないことを含む。本開示の方法の一部の実施態様において、本方法は更に、工程（ｂ）の後に、選択圧を除去することを含む。一部の実施態様において、選択圧の除去は、本明細書において開示された方法の工程（ｂ）の後に、キメラ非ヒト動物へＮＴＢＣを提供することを含むことができる。

【0115】

この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、この方法は更に：（ｆ）Ａ群とＢ群の間で非ヒト動物のヒト肝細胞及び非ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを比較する工程であって；（ｉ）ここで、Ａ群の非ヒト肝細胞及びヒト肝細胞へのＡＡＶの形質導入のレベルの間の差異は、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの取込みのＡＡＶＲ依存型及び非依存型の両方の修飾及び／又は阻害の指標であり；（ｉｉ）ここで、Ｂ群の非ヒト肝細胞及びヒト肝細胞へのＡＡＶの形質導入のレベルの間の差異は、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの取込みのＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害の指標であり；並びに、（ｉｉｉ）ここで、Ｂ群及びＡ群におけるヒト肝細胞へのＡＡＶの形質導入のレベルの間の差異は、ヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの取込みのＡＡＶＲ依存型の修飾及び／又は阻害の指標である。

【0116】

この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群及びＢ群における非ヒト動物のヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルは、各々、Ａ群及びＢ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率により決定される。

【0117】

この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、≧０％、≧５％、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧５０％、≧７０％、≧８０％、又は≧９０％である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、０％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％である。

【0118】

この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率は、≧０％、≧５％、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧５０％、≧７０％、≧８０％、又は≧９０％である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率は、０％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％である。

【0119】

この開示の非ヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、Ｂ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、≧０％、≧５％、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧５０％、≧７０％、≧８０％又は≧９０％である。この開示の非ヒト動物肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、Ｂ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト動物肝細胞の百分率は、０％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％である。

【0120】

この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、Ｂ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率は、≧０％、≧５％、≧１０％、≧２０％、≧３０％、≧５０％、≧７０％、≧８０％、又は≧９０％である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、Ｂ群におけるＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト肝細胞の百分率は、０％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、２０％～３０％、３０％～４０％、４０％～５０％、５０％～７０％、７０％～８０％、８０％～９０％、又は９０％～１００％である。

【0121】

この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、（ｉ）におけるＡ群の非ヒト肝細胞及びヒト肝細胞へのＡＡＶ形質導入レベル間の差異、（ｉｉ）におけるＢ群の非ヒト肝細胞及びヒト肝細胞へのＡＡＶ形質導入レベル間の差異、並びにＢ群及びＡ群におけるヒト肝細胞へのＡＡＶ形質導入レベルの間の差異は、百分率差又は倍率変化として表す又は示すことができる。

【0122】

ヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害は、ＡＡＶ血清型又はバリアントによって決まる。ヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害は、ＡＡＶベクターの特異的キャプシドタンパク質によって決まる。

【0123】

この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群及びＢ群における非ヒト動物の数は、同じである。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、Ａ群及びＢ群の非ヒト動物の数は、異なる。

【0124】

この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^１～１×１０^１５ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^２～１×１０^１２ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^４～１×１０^１０ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^６～１×１０^８ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^１～１×１０^３ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^２～１×１０^５ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^５～１×１０^８ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^８～１×１０^１２ウイルスゲノム／非ヒト動物である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、この感染におけるＡＡＶベクターの量は、１×１０^１２～１×１０^１５ウイルスゲノム／非ヒト動物である。

【0125】

この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも１日行われる。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも１週間行われる。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも２週間行われる。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、少なくとも４週間行われる。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、１日～５日行われる。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、５日～１０日行われる。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、１０日～１５日行われる。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、１５日～２０日行われる。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、２０日～２５日行われる。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、感染した非ヒト動物の維持は、２５日～３０日行われる。

【0126】

この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１のいずれか１つである。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型８である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、ＡＡＶ血清型９である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、対象の肝臓を特異的に感染又は形質導入するＡＡＶ血清型である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、肝細胞を特異的に感染又は形質導入するＡＡＶ血清型である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、２種以上のＡＡＶ血清型のハイブリッドである。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型）の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶは、６．２、２、ｒｈ６４Ｒ１、ｒｈ１０、８、９及びＡＡＶ９－ＰＨＰ．Ｂのいずれか１つから選択されたバリアントである。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、検出可能なマーカーをコードしている。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、この検出可能なマーカーは、蛍光タンパク質、酵素、又はペプチドである。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、この検出可能なマーカーは、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、又はＬａｃＺ（β－ガラクトシダーゼ）である。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、誘導型プロモーター又は構成型プロモーターを含む。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、組織特異的プロモーターを含む。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、誘導型プロモーターは、テトラサイクリン－誘導型プロモーター又はＣＭＶプロモーターである。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、１又は複数の異種タンパク質をコードしている。この開示のヒト肝細胞へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法の一部の実施態様において、１又は複数の異種タンパク質は、免疫原性タンパク質又はペプチド、治療的タンパク質、制御性タンパク質又はマーカー／検出可能なタンパク質であることができる。

【0127】

理論により結びつけられることを欲するものではないが、開示されたキメラ非ヒト又はヒト化された動物（例えばマウス）は、ヒト肝細胞の生理学的正確性を持つ非ヒト動物の実験上の扱いやすさを備えており、従ってヒト肝細胞へのＡＡＶベクターの形質導入の有効性を決定するための全く異なる方法論による幅のある研究からの結果の変動を考慮に入れる。これらのマウスは、疾患の分子をベースにした機能試験について、及び実験的治療の前臨床試験について、有用であると考えられる。一部の実施態様において、本開示のキメラ非ヒト動物は、霊長類、トリ、マウス、ラット、家禽、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ラクダ、ヒツジ及びブタのいずれか１つであることができる。

【0128】

別の態様において、１又は複数のヒト組織を含むキメラ非ヒト動物が、本明細書において提供され、ここでこのキメラ非ヒト動物は更に：（ａ）非ヒト動物においてヒトキメリズムを確立する１又は複数のヒト組織の再構築を可能にする、Ｔ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞の欠乏又は機能障害；並びに、（ｂ）非ヒト動物ＡＡＶＲの欠乏又は機能障害を生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異：を含む。一部の実施態様において、このキメラ非ヒト動物は更に、Ｆａｈ^－／－を含む。一部の実施態様において、このキメラ非ヒト動物は、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－非ヒト動物である。また１又は複数のヒト組織を含むキメラ非ヒト動物も、本明細書において提供され、ここでこのキメラ非ヒト動物は、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－キメラ非ヒト動物であり、並びにここでこのキメラ非ヒト動物は更に、非ヒト動物ＡＡＶＲの欠乏又は機能障害を生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含む。

【0129】

本明細書において提供される任意の非ヒト動物における１又は複数のヒト組織は、非ヒト動物への移植に適している任意の組織であってよい。一部の実施態様において、この１又は複数のヒト組織は、結合組織、上皮組織、筋肉組織（例えば、平滑筋組織、骨格筋組織、もしくは心筋組織）、又は神経組織である。一部の実施態様において、この組織は、初期神経、中胚葉、内胚葉、又は外胚葉組織である。一部の実施態様において、このヒト組織は、肝臓組織、腎臓組織、膵臓組織、小腸組織、脾臓組織、心臓組織、肺組織、皮膚組織、骨組織、眼組織、造血組織、リンパ組織、生殖組織、粘膜組織、又は胃組織である。

【0130】

この１又は複数のヒト組織は、任意の好適な手段により、非ヒト動物へ導入されてよい。例えば、非ヒト動物は、その後１又は複数のヒト組織へ分化する誘導多能性幹細胞が移植されてよい。一部の実施態様において、この１又は複数のヒト組織は、テラトーマ内に存在する。

【0131】

別の態様において、１又は複数のヒト組織を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法が、本明細書において提供され、この方法は：（ａ）非ヒト動物においてヒトキメリズムを確立するヒト組織の再構築を可能にする、非ヒト動物において欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞を提供する工程であって、ここでこの非ヒト動物は、非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるＡＡＶＲの欠失又は変異を含む工程；並びに、（ｂ）１又は複数のヒト組織を、この非ヒト動物へ移植する工程：を含む。一部の実施態様において、この非ヒト動物は更に、Ｆａｈ^－／－を含む。一部の実施態様において、この非ヒト動物は、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－非ヒト動物である。

【0132】

同じく、１又は複数のヒト組織を含むキメラ非ヒト動物を調製する方法であって、ここでこの方法が：（ａ）ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物を提供する工程であって、ここでこの非ヒト動物が、非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含む工程；並びに、（ｂ）ヒト組織を、この非ヒト動物へ移植する工程：を含む方法も、本明細書に提供される。一部の実施態様において、この非ヒト動物は更に、Ｆａｈ^－／－を含む。

【0133】

別の態様において、１又は複数のヒト組織におけるＡＡＶベクターの形質導入効率を決定する方法が、本明細書において提供され、ここでこの方法は：（ａ）本明細書記載の非ヒト動物を提供する工程；（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物に、所定量のＡＡＶベクターを感染させる工程；並びに、（ｃ）ＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物のヒト組織へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。

【0134】

同じく、少なくとも２種の１又は複数のヒト組織における、２種以上の同一でないＡＡＶベクター（複数可）の形質導入効率を決定する方法も、本明細書において提供され、ここでこの方法は：（ａ）本明細書記載の２匹以上のＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物を提供する工程；（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物の各々に、所定量の２種以上の同一でないＡＡＶベクターを感染させる工程であって、ここで各非ヒト動物は、１種のＡＡＶベクターにより感染される工程；並びに、（ｃ）工程（ｂ）の２匹以上の非ヒト動物の各々における少なくとも１つのヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。一部の実施態様において、この方法は更に、（ｄ）１又は複数のヒト組織への２種以上のＡＡＶベクターの各々の形質導入のレベルを比較する工程を含む。一部の実施態様において、この方法は更に、（ｆ）（ｉ）ＡＡＶベクターの総量の予め決定された百分率未満が、非ヒト動物の非ヒト組織へ形質導入される場合；（ｉｉ）ＡＡＶベクターの総量の少なくとも予め決定された百分率が、１又は複数のヒト組織へ形質導入される場合；（ｉｉｉ）ＡＡＶベクターにより形質導入された非ヒト組織の百分率が、既定値未満である場合；及び／又は、（ｉｖ）ＡＡＶベクターにより形質導入されたヒト組織の百分率が、既定値よりも大きい場合：に、ヒト肝細胞を形質導入する効率的なものとして１又は複数のＡＡＶベクター（複数可）を選択する工程を含む。

【0135】

本明細書において開示された方法の一部の実施態様において、このＡＡＶベクターは、検出可能なマーカー、例えば蛍光タンパク質、酵素、又はペプチドを発現する。一部の実施態様において、ＡＡＶベクターは、このベクターのゲノムの独自の核酸配列を含み、ここでこの独自の核酸配列は、検出可能なＲＮＡ配列又はバーコードＲＮＡ配列へ転写することができる。

【0136】

同じく、全身性ＡＡＶベクター媒介型遺伝子治療の効率を決定する方法も、本明細書において提供され、ここでこの方法は：（ａ）本明細書記載の非ヒト動物を提供する工程；（ｂ）工程（ａ）の非ヒト動物に、所定量のＡＡＶベクターを、少なくとも初回感染させる工程；並びに、（ｃ）ＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物の１又は複数のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。一部の実施態様において、この方法は更に：（ｄ）この非ヒト動物に、所定量のＡＡＶベクターを、２回目感染させる工程；並びに、（ｅ）ＡＡＶＲ ＫＯ非ヒト動物の１又は複数のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。一部の実施態様において、この方法は更に：（ｆ）初回及び２回目感染の間の、１又は複数のヒト組織へのＡＡＶベクターの形質導入のレベルを比較する工程を含む。一部の実施態様において、初回及び／又は２回目感染のＡＡＶベクターの量は、１×１０^１～１×１０^１５ウイルスゲノム／非ヒト動物である。一部の実施態様において、初回及び２回目感染のＡＡＶベクターの量は、同じである。一部の実施態様において、初回及び２回目感染のＡＡＶベクターの量は、異なる。

【0137】

別の態様において、１又は複数のヒト組織におけるＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率を決定する方法が、本明細書において提供され、ここでこの方法は：（ａ）２群、Ａ群及びＢ群へ分けられた非ヒト動物を提供する工程であって、各群は、１又は複数の非ヒト動物を含み、ここでＡ群は、野生型ヒト組織が移植され、並びにＢ群は、非機能性ヒトＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含むヒト組織が移植され、ここでこの２匹以上の非ヒト動物は更に、欠乏又は機能障害されたＴ－、Ｂ－及び／又はＮＫ細胞、ＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／、及び／又はＦａｈ^－／－を含む、工程；（ｂ）工程（ａ）の各群の１又は複数の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；（ｃ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物の１又は複数のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程であって、ここで、Ａ群における形質導入のレベルは、ＡＡＶベクターのＡＡＶＲ依存型の形質導入効率の指標であり、並びにＢ群における形質導入のレベルは、ＡＡＶＲ非依存型の形質導入効率の指標である工程：を含む。

【0138】

別の態様において、ヒト組織へのＡＡＶベクター形質導入のアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法が、本明細書において提供され、ここでこの方法は：（ａ）非ヒト動物の群、Ａ群及びＢ群を提供する工程であって、ここでＡ群は、非ヒト動物において欠乏又は機能障害された１又は複数のＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞を含み、並びにＢ群は、更に非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含む、非ヒト動物において欠乏又は機能障害された１のＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞を含み、ここで、欠乏又は機能障害された１又は複数のＴ－、Ｂ－及びＮＫ細胞は、非ヒト動物におけるヒトキメリズムを確立するヒト組織の再構築を可能にする工程；（ｂ）工程（ａ）の両群の１又は複数の非ヒト動物へ、１又は複数のヒト組織を移植する工程；（ｃ）工程（ｂ）の両群の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；並びに、（ｄ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。

【0139】

別の態様において、１又は複数のヒト組織へのＡＡＶベクター形質導入のＡＡＶＲ依存型又はＡＡＶＲ非依存型の修飾及び／又は阻害を決定する方法が、本明細書において提供され、ここでこの方法は：（ａ）非ヒト動物の２群、Ａ群及びＢ群を提供する工程であって、ここでＡ群は、１又は複数のＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物を含み、並びにＢ群は、更に非機能性非ヒト動物ＡＡＶＲを生じるアデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）の欠失又は変異を含む、１又は複数のＩＬ－２Ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－非ヒト動物を含む工程；（ｂ）工程（ａ）の両群の１又は複数の非ヒト動物へ、１又は複数のヒト組織を移植する工程；（ｃ）工程（ｂ）の両群の非ヒト動物に、ＡＡＶベクターを感染させる工程；並びに、（ｄ）Ａ群及びＢ群の非ヒト動物のヒト組織への、ＡＡＶベクターの形質導入のレベルを決定する工程：を含む。一部の実施態様において、この非ヒト動物は更に、Ｆａｈ^－／－を含む。

【0140】

本開示において、「キメラ非ヒト動物」の例は、この非ヒト動物の一部を含む。用語「キメラ非ヒト動物の一部（複数可）」は、例えば、非ヒト動物－由来の組織、体液、細胞、及びそれらの破壊された生成物又はそれらからの抽出物を指す（それらの例は、特にこれらに限定されない）。そのような組織の例は、心臓、肺、腎臓、肝臓、胆嚢、膵臓、脾臓、小腸、筋肉、血管、脳、精巣、卵巣、子宮、胎盤、骨髄、甲状腺、胸腺、及び乳腺を含むが、これらに限定されるものではない。体液の例は、血液、リンパ液、及び尿を含むが、これらに限定されるものではない。用語「細胞」は、前述の組織又は体液中に含まれる細胞を指し、並びにそれらの例は、培養された細胞、それらの単離又は培養により得られる精細胞、卵子、及び受精卵を含む。培養した細胞の例は、初代培養細胞及び樹立された細胞株の細胞の両方を含む。キメラ非ヒト動物の一部の例はまた、発生段階（胚形成期）の組織、体液、及び細胞、並びにそれらの破壊された生成物もしくは抽出物も含む。加えて、本開示のマウス由来の細胞株は、公知の方法を用いて樹立され得る（Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｃｅｌｌｓ （Ｓｈｉｎ Ｓｅｉｋａｇａｋｕ Ｊｉｋｋｅｎ Ｋｏｚａ （Ｎｅｗ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｌｅｃｔｕｒｅ Ｓｅｒｉｅｓ）， Ｖｏｌ． １８， ｐａｇｅｓ １２５－１２９， ＴＯＫＹＯ ＫＡＧＡＫＵ ＤＯＺＩＮ ＣＯ．， ＬＴＤ．、及びＭａｎｕａｌｓ ｆｏｒ． Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ， ｐａｇｅｓ ２６２－２６４， Ｋｉｎｄａｉ Ｓｈｕｐｐａｎ））。

【0141】

本開示のキメラ非ヒト動物は、免疫不全キメラ非ヒト動物（例えばマウス）であることができる。本開示の免疫不全キメラ非ヒト動物は、ヒト肝細胞の移植のための宿主マウスとして使用されることができる。「免疫不全非ヒト動物」の例は、異なる動物起源由来の肝細胞（特にヒト肝細胞）に対して拒絶を示さない任意のキメラ非ヒト動物であってよく、並びにＴ－及びＢ－細胞株の欠損を示すＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全）マウス、胸腺の遺伝子欠失のためにＴ細胞機能を喪失しているヌードマウス、及び公知の遺伝子標的化法によりＲＡＧ２遺伝子をノックアウトすることにより作製されたＲＡＧ２ノックアウトマウスを含むが、これらに限定されるものではない（Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４： １２８８－１２９２， １９８９）。

【0142】

更に本開示は、ヒト肝細胞を有するキメラ非ヒト動物を提供する。本開示のキメラ非ヒト動物は、免疫学的に欠損であることができる。本開示のキメラ非ヒト動物は、ヒト肝細胞を、本開示の免疫不全キメラ非ヒト動物へ移植することにより、調製することができる。

【0143】

移植に使用されるヒト肝細胞として、コラゲナーゼ灌流法などの従来型方法により正常なヒト肝臓組織から単離されたヒト肝細胞を、使用することができる。こうして分離された肝細胞はまた、凍結保存後にも使用することができる。或いは、キメラ非ヒト動物肝細胞がヒト肝細胞により置き換えられているキメラ非ヒト動物肝臓から、コラゲナーゼ灌流法などの技術により分離されたヒト肝細胞として定義される、キメラ非ヒト動物肝細胞は、新鮮な状態で使用することができ、並びに凍結保存されたキメラ非ヒト動物肝細胞も、解凍後利用される。

【0144】

そのようなヒト肝細胞は、本開示のキメラ非ヒト動物（例えばマウス）の脾臓を介して、肝臓へ移植されることができる。そのようなヒト肝細胞はまた、門脈を介して直接移植されることができる。移植されるべきヒト肝細胞の数は、約１～２，０００，０００個細胞の範囲であってよく、好ましくは約２００，０００～１，０００，０００個細胞の範囲である。本開示のキメラ非ヒト動物の性別は、特に限定されない。同じく、本開示のマウスの移植時の日齢も、特に限定されない。ヒト肝細胞が、若いキメラ非ヒト動物（早週齢）へ移植される場合、このキメラ非ヒト動物は成長するので、ヒト肝細胞はより活動的に増殖することができる。例えば、生後約０－～４０－日－齢のマウス、特に生後約８－～４０－日－齢のマウスが使用されるのが、好ましい。

【0145】

この移植されたヒト肝細胞は、キメラ非ヒト動物のキメラ肝臓内の全ての肝細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％のヒトキメリズムの任意の百分率を占める。

【0146】

１又は複数の遺伝子欠失を含む非ヒト動物が、本明細書において説明される。概して、遺伝子の両アレル欠失は、「－／－」により示され、例えば「Ｆａｈ－／－」である。

【0147】

本開示の例証的ＩＩ２－ｒｇタンパク質をコードしているヒトのヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：ＮＭ＿０００２０６．２からなるか又はこれを含む：

【化1】

【0148】

本開示の例証的ＩＩ２－ｒｇタンパク質の対応するヒトアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿０００１９７．１からなるか又はこれを含む：

【化2】

【0149】

本開示の例証的ＩＩ２－ｒｇタンパク質をコードしているマウスのヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：ＮＭ＿０１３５６３．４からなるか又はこれを含む：

【化3】

【0150】

本開示の例証的ＩＩ２－ｒｇタンパク質の対応するマウスアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿０３８５９１．１からなるか又はこれを含む：

【化4】

【0151】

本開示の例証的Ｒａｇ２タンパク質をコードしているヒトのヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：ＮＭ＿０００５３６．３からなるか又はこれを含む：

【化5】

【0152】

本開示の例証的Ｒａｇ２タンパク質の対応するヒトアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿０００５２７．２からなるか又はこれを含む：

【化6】

【0153】

本開示の例証的Ｒａｇ２タンパク質をコードしているマウスのヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：ＮＭ＿００９０２０．３からなるか又はこれを含む：

【化7-1】

【化7-2】

【0154】

本開示の例証的Ｒａｇ２遺伝子の対応するマウスアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿０３３０４６．１からなるか又はこれを含む：

【化8】

【0155】

本開示の例証的Ｆａｈタンパク質をコードしているヒトのヌクレオチド配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：ＮＭ＿０００１３７．２からなるか又はこれを含む：

【化9】

【0156】

本開示の例証的Ｆａｈタンパク質の対応するヒトアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿０００１２８．１からなるか又はこれを含む：

【化10】

【0157】

本開示の例証的Ｆａｈタンパク質をコードしている対応するマウス核酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：ＮＭ＿０１０１７６．４からなるか又はこれを含む：

【化11】

【0158】

本開示の例証的Ｆａｈタンパク質をコードしている対応するマウスのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿０３４３０６．２からなるか又はこれを含む：

【化12】

【0159】

本明細書に開示されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）受容体（ＡＡＶＲ）はまた、ディスレクシア－関連タンパク質、ＫＩＡＡ０３１９－様（ＫＩＡＡ０３１９Ｌ）タンパク質とも称され、これは、多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）ドメインとも称される、５つのＩｇ－様ドメインをそのエクトドメイン内に伴う、推定Ｉ型膜貫通タンパク質である。Ｉｇ－様ドメインは、細胞－細胞接着を媒介し、且つポリオウイルス、麻疹ウイルス及びレオウイルスの受容体を含む、様々な良く特徴付けられたウイルス受容体に存在する（Ｐｉｌｌａｙ Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１６；５３０：１０８－１１２）。ＡＡＶＲのＰＫＤは、２０面体の３回軸（ｔｈｒｅｅ－ｆｏｌｄ ａｘｉｓ）に隣接するＡＡＶ２キャプシドのスパイク領域に直接結合することが示されている（Ｚｈａｎｇ Ｒ．ら、Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２０１９ Ａｐｒ；４（４）：６７５－６８２）。

【0160】

本開示の例証的ＡＡＶＲのマウスアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：Ｑ８Ｋ１３５からなるか又はこれを含む：

【化13】

【0161】

本開示の例証的ＡＡＶＲタンパク質のヒトアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号：ＮＰ＿０７９１５０からなるか又はこれを含む：

【化14】

下記実施例は、特許請求された開示をより良く例示するために提供され、本開示の範囲を限定するものとして解釈されてはならない。具体的材料が言及される程度に、これは単に例示を目的とし、本開示を限定することを意図しない。当業者は、発明の能力を行使することなく且つ本開示の範囲から逸脱することなく、同等の手段又は反応物を開発してよい。

【実施例】

【0162】

実施例
実施例１：Ｉｌ２ｒｇ ^－／－ ／Ｒａｇ２ ^－／－ ／Ｆａｈ ^－／－ マウスモデルの作製
ＡＡＶベクターは、好ましくはマウス細胞を形質導入するので、遺伝子治療に関するＡＡＶベクターの使用を試験し且つ評価するためにはヒト化されたキメラマウスモデルを使用する。マウスＡＡＶ受容体は、ＡＡＶベクター血清型の形質導入にとって重要である。マウスアデノ随伴ウイルス受容体ノックアウト（ＡＡＶＲ ＫＯ）遺伝子欠失を伴う、導入遺伝子フリーＩｌ２ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－マウスモデルの作製、並びにＡＡＶベクターの形質導入効率を決定するためのこれの使用を説明する試験が、ここで説明される。肝臓の遺伝子治療のための良好な臨床候補となり得る多くの可能性のあるＡＡＶ血清型が存在するが、肝臓内であっても形質導入効率は、依然重要な点であり続ける。ウイルスキャプシドに対する免疫応答は、注入されたＡＡＶの投与量に正比例する（Ｎａｔｈｗａｎｉ ＡＣら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１４；３７１：１９９４－２００４．）。従って、免疫応答を低下するためにできるだけ少ないＡＡＶであるが、効果的形質導入及び治療効果を得るのに十分なＡＡＶを使用することは、重要である。本開示は、マウスのＡＡＶＲ欠失の背景を持つヒト肝臓キメラマウス（ＡＡＶＲノックアウトマウス）は、ヒトに対する遺伝子治療のバリデーション、例えばヒト状況における遺伝子治療ベクターのバリデーションにとって、より特異的且つ価値があることを示している。本開示のマウス組織の欠失されたＡＡＶ受容体を伴うヒト肝臓キメラマウスは、最も好適で且つ臨床的に翻訳可能なＡＡＶ遺伝子治療ベクターを同定し且つ形質導入効率を評価するために有用である。

【0163】

材料及び方法
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介型エキソン欠失によるＡＡＶＲ－ＫＯ株の作製
本明細書に開示されたＡＡＶＲ ＫＯノックアウトマウスの作製のためのｓｇＲＮＡのデザイン及びクローニングは、当該技術分野において先に説明されたように行った（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＣＧら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０２０；１３０：ｅ１１７）。マウスＡＡＶＲ遺伝子のエキソン４及び５を、標的化した（図１Ａ）。ここに記載した試験に使用したｓｇＲＮＡ配列は、以下に提供している：
ｓｇＲＮＡ Ｅｘ４ ＡＣＴＴＧＣＧＧＡＧＴＡＣＣＡＧＡＴＡＣ． ＡＧＧ （配列番号：１５）
ｓｇＲＮＡ Ｅｘ５ ＣＡＴＴＣＴＴＡＧＧＣＡＧＧＧＴＧＡＴＣ． ＴＧＧ （配列番号：１６）。

【0164】

これらのｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９は、各々、ＭＥＧＡｓｈｏｒｔｓｃｒｉｐｔ Ｔ７転写キット（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈ， ＡＭ１３５４）及びｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ウルトラキット（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈ ＡＭ１３４５）を用い、インビトロにおいて転写した。１×ＰＢＳ中の各ｓｇＲＮＡの１５ｎｇ／μＬ及びＣａｓ９ ｍＲＮＡの６０ｎｇ／μＬの混合物を、接合体の微量注入に使用した。Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを、ＴＩＲＦ（導入遺伝子フリーＩｌ２ｒｇ－／－／Ｒａｇ２－／－／Ｆａｈ－／－）マウス由来のホモ接合型接合体へ注入した。

【0165】

１９匹の創始マウスの仔（ｆｏｕｎｄｅｒ ｐｕｐ）を得、そのうちの４匹は誕生後に死亡した。全ての仔を、欠失についてスクリーニングした。生存した１５匹のマウスのうちの７匹は、欠失についてヘテロ接合体であった。合計４の欠失を得、これらの一部は、２匹以上のマウスにおいて存在が共有され、並びにそれら全ては、連結部の後ろの未熟な停止コドンに繋がった。

【0166】

陽性動物を、ＴＩＲＦ株と２回戻し交配させ、あらゆる可能性のある目的外の変異を取り除いた。ヘテロ接合体Ｆ２マウスを、互いに交配させ、ホモ接合体仔を得た。ホモ接合型マウスは、サイズは正常であり、いかなる異常な表現型も示さなかったが、妊孕性に問題があるように見え、並びにホモ接合型コロニーは、確立できなかった。

【0167】

ＴＩＲＦＡ株の遺伝子型決定
得られた全てのホモ接合型仔は、以下のプライマーを使用するＰＣＲによりスクリーニングした：
ＡＡＶＲ＿Ｅｘ４ Ｆｏｒ ５’ＡＣＡＧＴＴＧＣＣＧＧＴＴＣＣＴＴＣＡＣ ３’ （配列番号：１７）
ＡＡＶＲ＿Ｉｎ５ Ｒｅｖ ５’ ＣＣＡＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣＡＣＡＡＣＣＴＣ ３’ （配列番号：１８）。

【0168】

野生型マウス及びノックアウトマウスについて予想されたＰＣＲバンドは、各々、２．３Ｋｂ及び２００ｂｐであった（図１Ｂ）。欠失されたアレルに対応するＰＣＲバンドを、精製し、且つＳａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇへ送った。一旦連結部が規定されたならば、更なる子孫を、Ｔｒａｎｓｎｅｔｙｘ社で、Ｔａｑｍａｎプローブを使用する半定量的ＰＣＲにより、遺伝子型決定した（図２Ａ－２Ｂ）。Ｔａｑｍａｎプローブは、５’末端に共有結合されたフルオロフォア及び３’末端にクエンチャーを有する、１本鎖ＤＮＡプローブである。このクエンチャーは、フルオロフォアに近接近した際に、蛍光を吸収する。これらのプローブは、特異的プライマーを用い、Ｔａｑポリメラーゼにより増幅される、関心対象のゲノム領域に結合する。一旦これらの鎖が各増幅工程のために分離されると、プローブは、それが親和性を有する鎖に結合することができる。アニーリングされたプローブの分解が、次の増幅ラウンドにおいてＴａｑポリメラーゼの５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性により起こる。フルオロフォアが放出され、定量的ＰＣＲサーマルサイクラーは、放出された蛍光を検出し、これはこのサイクルを通じて蓄積する。

【0169】

ヒト肝細胞のＴＩＲＦＡ株への移植
ヒト凍結保存された肝細胞（Ｌｏｎｚａ）を、先に説明されたように、ＴＩＲＦＡ株へ移植した（Ｂｉｓｓｉｇ－Ｃｈｏｉｓａｔ Ｂら、Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１５；６：７３３９；Ｂａｒｚｉ Ｍら、Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１７；８：３９）。簡単に述べると、腹腔を、中央腹部切開により開き、容積１００μｌのＰＢＳ中の３×１０^６個ヒト肝細胞を、脾臓へ注入した。移植直後に、移植されたヒト肝細胞への選択圧を、以下の工程において飲料水から薬物ＮＴＢＣを取り除くことにより適用した：この薬物を完全に中断する前に、コロニー維持投与量（１００％＝７．５ｍｇ／ｌ）の２５％を２日間、その後１２％を２日間、及び最終的に６％を２日間（Ｂｉｓｓｉｇ ＫＤら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２０１０）。ヒトアルブミンレベルは、ヒト肝細胞の免疫染色により評価されるヒトキメリズムのレベルと相関するので、ヒトキメリズムの程度を決定するために、ヒトアルブミン（ＥＬＩＳＡ、Ｂｅｔｈｙｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、マウス血液中で測定した（Ｂｉｓｓｉｇ ＫＤら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２０１０）。ヒトキメリズム＞７０％を伴うマウスのみ、ＡＡＶ注入に使用した。

【0170】

ＡＡＶ生成
トリプル－プラスミドトランスフェクションプロトコールを使用し、ｒＡＡＶベクターを作製し（Ｓｈｅｎ Ｓら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１３；２８８：２８８１４－２８８２３）；このトランスフェクション混合物は：（１）ｐＸＲヘルパープラスミド；（２）アデノウイルスヘルパープラスミドｐＸＸ６－８０；及び、（３）ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接したＣＭＶプロモーターにより駆動された、ｄＴｏｍａｔｏ：を含んだ。ベクター精製は、イオジキサノール勾配超遠心分離を用い、それに続けてＺｅｂａＳｐｉｎ脱塩カラム（４０Ｋ ＭＷＣＯ；ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， ＵＳＡ）により脱塩し、実行した。ｖｇ力価は、ＡＡＶ２ ＩＴＲに選択的に結合するようにデザインされたプライマー（フォワード、５０－ＡＡＣＡＴＧＣＴＡＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧ－３０（配列番号：１９）；リバース、５０－ＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧ－３０（配列番号：２０））を使用する、ｑＰＣＲ（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０； Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）により得た。

【0171】

免疫染色は、ホルマリン－固定したパラフィン－埋植した肝臓上で行った。パラフィン切片（厚さ５μｍ）を、脱脂し、抗原検索を、クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で行った。免疫染色を、１％ロバ血清＋０．２％Ｔｒｉｔｏｎによるブロック後に、ｈＦＡＨに対するウサギ抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）により行った。ＰＢＳで洗浄後、切片を、１％ロバ血清中の蛍光－標識した二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により３０分間染色し、再度洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ ｐｌｕｓ ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）に搭載した。

【0172】

実施例２：異なるＡＡＶ血清型によるヒト肝臓キメラマウスのヒト及びマウス肝細胞の形質導入効率
遺伝子治療に関するヒトへの動物試験からの結果の外挿は、問題が多いので、ヒト肝臓キメラマウス（ヒト化された肝臓を持つマウス）を、インビボにおいてヒト肝細胞のＡＡＶ形質導入効率を決定するために使用した（Ｂｉｓｓｉｇ－Ｃｈｏｉｓａｔ Ｂら、Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１５；Ｌｉｓｏｗｓｋｉ Ｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１４）。組換えゲノムの取込み、核への送達、脱殻、第二鎖合成、並びに導入遺伝子の持続及び発現において、差が存在する可能性があり、これらは考慮されなければならない。従ってキメラヒト化肝臓マウスは、更にヒト肝細胞の形質導入効率に関して候補ＡＡＶ血清型を評価するために、独自のインビボプラットフォームを提供し（Ｂｉｓｓｉｇ－Ｃｈｏｉｓａｔ Ｂら、Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１５；Ｌｉｓｏｗｓｋｉ Ｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１４）、これらの制限の一部を克服している。ここに記載された試験において、ＦＲＧ（Ｆａｈ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｉｌ２ｒｇ^－／－）マウスは、異なるＡＡＶ血清型で形質導入された健常なヒト肝細胞が再構築された。各形質導入されたＡＡＶベクターは、異なる発現カセットを発現した。これらの形質導入効率は、ＦＡＨ又はヒト核染色、及び形質導入された細胞（ＬａｃＺ又はＧＦＰについて陽性）について免疫染色されたヒト細胞をカウントすることにより、ＦＲＧヒトキメラ肝臓マウスにおける、ＡＡＶ形質導入されたヒト及びマウスの肝細胞の百分率に関して、評価した。ここに記載した試験の結果は、ヒト化マウスにおける形質導入効率についてバリデートされた多くのＡＡＶ血清型は、マウス肝細胞を、ヒト肝細胞よりもはるかに良く形質導入することを示している（図３）。最も重要なことに、２種の臨床で使用される血清型であるＡＡＶ８及びＡＡＶ９も、マウス肝細胞をヒト肝細胞よりもはるかにより容易に形質導入するように見える（図４Ｂ－４Ｆ）（Ｂｉｓｓｉｇ－Ｃｈｏｉｓａｔ Ｂら、Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１５）。総ＡＡＶ粒子より少ないものが、ヒト細胞への結合に利用可能であるので、マウス肝細胞のこの「スケルチ（ｓｑｕｅｌｃｈｉｎｇ）」又は「シンク（ｓｉｎｋ）」効果は、ヒト肝細胞に関するＡＡＶベクターの形質導入効率の評価に関して、ヒト肝臓キメラマウスシステムの価値を低下する。本試験は、ヒト肝細胞へのＡＡＶ形質導入効率に対する、マウス肝細胞のこの「スケルチ」又は「シンク」効果の機序、並びにこれを低下する方法を調べる。

【0173】

実施例３：ＴＩＲＦＡマウスモデルの作製
最近、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）が同定された（Ｐｉｌｌａｙ Ｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１６）。ここに記載した試験において、ＡＡＶＲノックアウトヒト肝臓キメラマウスは、ヒト状況における遺伝子治療ベクターのバリデーションの良好なモデルであると仮定された。マウスＡＡＶＲ遺伝子を、ここに説明された方法及び材料を使用し、ＴＩＲＦマウスの接合体（導入遺伝子フリーＩｌ２ｒｇ^－／－／Ｒａｇ２^－／－／Ｆａｈ^－／－）（ＪＨＥＰ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｍａｒｃｈ ２０２１）においてＣＲＩＳＰＲ手法を使用し、欠失させた。ここに記載された方法を使用し作製されたこれらのＴＩＲＦＡマウスは、生存可能であり、且つＡＡＶＲ遺伝子ＫＯについてヘテロ接合型又はホモ接合型である場合に、明らかな病理は持たなかった。ここに記載したホモ接合型ＴＩＲＦＡマウスを繁殖する初期の試みは、巧くいかず、ここに記載した試験を、ヘテロ接合型繁殖対からの仔を使用し行った。ここに記載したＴＩＲＦ（Ａ）マウス（ＡＡＶＲについてホモ接合型、ヘテロ接合型及び野生型）を、先に説明されたようにヒト肝細胞によりヒト化した（Ｂｉｓｓｉｇ－Ｃｈｏｉｓａｔ Ｂら、Ｎａｔｕｒｅ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１５；Ｌｉｓｏｗｓｋｉ Ｌら、Ｎａｔｕｒｅ ２０１４）。ＴＩＲＦＡ動物のヒト化は、ここに記載した方法を使用し、ヒト特異的アルブミン試験を使用するマウス血液中のヒトアルブミンの測定により評価した。ヒトアルブミンは、１ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍｌ血清で検出され、これは高ヒト肝臓キメリズムに匹敵している（Ｂｉｓｓｉｇ ＫＤら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２０１０）。ここで明らかにされた結果は、本開示は、内在性ＡＡＶＲが欠乏又は枯渇している、並びにマウスの肝臓においてヒトキメリズムを確立するヒト肝細胞の再構築を可能にする、免疫枯渇されたキメラマウスモデルを提供することを示している。

【0174】

実施例４：ヒト化されたＴＩＲＦＡ肝臓内のヒト肝細胞におけるＡＡＶ血清型の形質導入効率の評価
ここに記載された試験において、ヒト化されたＴＩＲＦＡ肝臓内のヒト肝細胞におけるＡＡＶ血清型の形質導入効率が、評価された。実施例２に説明されたように、ユビキタスプロモーター（ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／トリβ－アクチン（ＣＢＡ））下のｄＴｏｍａｔｏの発現カセットを含む、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）遺伝子治療ベクターを作製した。全てのマウスに、ＡＡＶＲの存在する全てのマウス肝臓を形質導入する投与量である１×１０^１２ｖｇ／マウスを、尾静脈に注射した。注射後１ヶ月で、ヒト化マウスを、安楽死させ、肝臓を収集した。ここに記載した試験において、効率的ヒト化は、（ＦＡＨの免疫染色）により決定し、並びにＡＡＶ９によるヒト肝細胞の形質導入は、ｄＴｏｍａｔｏ免疫染色により決定した（図５Ｃ、５Ｆ、５Ｉ及び５Ｌ）。ここに記載した結果は、ＡＡＶ９は、ＡＡＶＲのホモ接合型欠失を伴うヒト化されたＴＩＲＦＡマウスにおいて、ヒト細胞を効率的に形質導入し、及びマウス細胞ごくわずかのみを形質導入したのに対し、ＡＡＶＲのヘテロ接合型欠失（ＡＡＶＲ^＋／－）を伴うヒト化されたＴＩＲＦＡマウスにおける形質導入された細胞の大半は、マウス肝細胞であり、両方共ＡＡＶＲ^＋／＋野生型である、ヒト化されたＴＩＲＦ又はＦＲＧと類似している（図４Ｄ）ことを示している。

【0175】

先に言及された実施例において明らかにされた実験データを基に、キメラ非ヒト動物モデルにおけるＡＡＶベクターによる形質導入に対するマウス肝細胞の「スケルチ」又は「シンク」効果は、低下又は阻害されることができ、並びにヒト肝細胞の形質導入は、非ヒト動物ＡＡＶＲのノックアウトにより達成されることができる。ここで明らかにされた実施例は、ここで明らかにされたキメラ非ヒト動物モデルは、ヒト細胞へのＡＡＶ形質導入の生物学及び効率を決定するために使用することができることを示している。

【0176】

実施例５：ＴＩＲＦＡマウスにおけるヒトｉＰＳ細胞由来のテラトーマの作製
ほとんどのＡＡＶ血清型及び組換えキャプシドは、肝臓への高い指向性を有し、且つＡＡＶを静脈内に注入した場合、大部分のＡＡＶは、肝細胞を形質導入する。このことは、多くの肝臓－指向性遺伝子治療手法にとって有益であるが、一部は、筋肉又は脳のような他の臓器を標的化することが意図される。従って肝臓は、ごくわずかなＡＡＶがこの標的組織を形質導入するための、スポンジとして作用することができる（スケルチ効果）。特異的キャプシドの指向性が、肝臓にとってのものよりも任意の所定の臓器にとってより高いかどうかを評価するために、ヒト化マウスは、同じマウスにおいて肝臓組織及び他のヒト組織を有することを必要としている。従ってキャプシドの指向性が、いわゆる筋肉よりも、肝臓についてはるかに高い場合には、この特異的キャプシドは、患者の筋肉の形質導入には適していない。ヒト肝臓ＴＩＲＦＡマウスにおいて二重又は多重の臓器システムを有するために、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞由来のテラトーマを作製した。テラトーマは、完全に分化され、３種の胚葉全て（内胚葉、外胚葉及び中胚葉）由来の機能性組織を有する。

【0177】

方法：
ヒトｉＰＳ細胞由来のテラトーマの作製
ヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を、標準ｉＰＳ細胞培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得たｍＴｅＳＲ）を用い、マトリゲル上で培養した。１０ｃｍディッシュ上で集密度が８０％に到達した時点で、細胞を培地中のプレートから優しく剥がし（細胞スクレーパー）、細胞凝集塊を形成し、５００ｇで５分間回転沈降させた。細胞凝集塊（～１×１０^７個細胞）を、新鮮な培地５０～１００μｌ中に再浮遊させ、ヒト肝臓キメラ又はヒト化されないＴＩＲＦＡマウスへ皮下注射した。

【0178】

キメラ肝臓及びテラトーマの免疫染色：
免疫染色は、ホルマリン－固定したパラフィン－埋植した肝臓について行った。パラフィン切片（厚さ５μｍ）を、脱脂し、抗原検索を、クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で行った。免疫染色を、１％ロバ血清によるか又は対応する試薬（免疫組織化学のための）によるブロック後に、肝臓切片については、ｈＬＤＨに対するマウス抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、１：１００希釈）及びウサギ抗－ＲＦＰ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、１：１００希釈）のいずれかと共に、又はテラトーマについては抗－ＧＦＰ（Ａｂｃａｍ、１：２００希釈）と共に、インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄後、これらの切片を、蛍光－標識した二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） によるか又はＩｍｐｒｅｓｓＤｕｅｔからの対応する二次抗体のいずれかにより染色し、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）の指示に従い呈色した。

【0179】

ヒト化された肝臓マウス（ヒト肝臓キメラマウス）は、先に説明されたようにＴＩＲＦＡマウスの肝臓を再構築することにより、作製された。高いヒト肝臓キメリズム（＞２０％ヒト組織）の作製後、ヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞を、皮下注射した。注射後３～４ヶ月で、マウスは明確に視認できる皮下テラトーマを形成した。テラトーマの形成後１～３週間で、ユビキタスＧＦＰ発現カセットを保持するＡＡＶ９を、静脈内注射した。

【0180】

結果
図６Ａ－８Ｂは、ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ発現カセットを保持する、１×１０^１２ＧＣ／マウスでＡＡＶ８（図６Ａ、６Ｂ、８Ａ及び８Ｂ）又はＡＡＶ９（図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、及び８Ｂ）が注射された、ヒト肝臓キメラＴＩＲＦＡマウス、例えばヒト肝細胞が再構築されたＴＩＲＦＡマウスを示す。マウスは、注射後７２時間で安楽死させ、肝臓を収集し、同時－局在化を示すために、ヒトマーカーＬＤＨ（明灰色）及びウルス導入遺伝子ｔｄ－Ｔｏｍａｔｏ（黒色）を染色した。これらの実験は、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９は、ヒト化されたＴＩＲＦＡマウスにおいて専らヒト肝細胞を形質導入するのに対し、これらの遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶＲを欠失しているので、これらはマウスＴＩＲＦＡ肝細胞を形質導入しないことを明らかにしている。対照ヒト化マウス（ＡＡＶＲ発現しているＴＩＲＦマウス）は、ほとんどのマウス肝細胞及び極わずかなヒト肝細胞の形質導入を明らかにしている（図６Ａ－７Ｂ）。

【0181】

ヒト肝細胞の形質導入は、キメラマウスの肝臓において認められ、並びにテラトーマのヒト細胞の形質導入が認められた（図１０－１４Ｄ）。注目すべきは、テラトーマにおける全てではないヒト細胞が、同等に良好に形質導入され、並びにテラトーマ、例えば異なるヒト組織において形質導入効率の有意差が存在したことである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【配列表】

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【国際調査報告】