特表 2024-534269 神経変性疾患を治療するための方法および物質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-18

(54)【発明の名称】神経変性疾患を治療するための方法および物質

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/47 20060101AFI20240910BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240910BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240910BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240910BHJP

   G01N 33/543 20060101ALI20240910BHJP

   G01N 33/545 20060101ALI20240910BHJP

   G01N 33/552 20060101ALI20240910BHJP

【ＦＩ】

C07K14/47 ZNA

A61K39/395 N

A61P25/28

G01N33/53 D

G01N33/543 501A

G01N33/543 541A

G01N33/545 A

G01N33/552

G01N33/543 575

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024537808

(86)(22)【出願日】2022-08-30

(85)【翻訳文提出日】2024-04-17

(86)【国際出願番号】 US2022042073

(87)【国際公開番号】W WO2023034324

(87)【国際公開日】2023-03-09

(31)【優先権主張番号】63/238,252

(32)【優先日】2021-08-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/238,329

(32)【優先日】2021-08-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/346,240

(32)【優先日】2022-05-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/393,885

(32)【優先日】2022-07-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】503146324

【氏名又は名称】ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ．

(71)【出願人】

【識別番号】524076501

【氏名又は名称】アビシニア バイオロジクス，エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(72)【発明者】

【氏名】セルコエ，デニス ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】リウ，レイ

(72)【発明者】

【氏名】ロートン，ロバート レスリー

【テーマコード（参考）】

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C085AA14

4C085AA16

4C085CC23

4C085EE01

4H045BA18

4H045BA42

4H045BA50

4H045CA40

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA34

4H045GA21

(57)【要約】

本明細書には、アミロイドベータタンパク質の可溶性多量体（ｏＡβ）に特異的に結合する抗体を製作および使用するための方法、ならびにｏＡβの病原性多量体の形成に関連する疾患の診断および治療においてそれらを使用するための方法が記載されている。また、所望の抗原に対する標的化体液性免疫応答を刺激するようにペプチド免疫原にコンジュゲートすることができるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）担体ペプチドが提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体の発生を刺激するための合成ペプチド免疫原であって、アミロイドベータタンパク質の多量体（ｏＡβ）を含むアミロイドβタンパク質（Ａβ）の凝集形態に存在する立体構造エピトープに特異的であるが、単量体形態には特異的ではない合成ペプチド免疫原。

【請求項2】

単離されたアミロイドベータ配列ＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶ（配列番号１）または配列ＹＥＸＨＨ（配列番号４１）を含み、配列中Ｘは疎水性アミノ酸（Ｖ、Ｉ、またはＬ）である、請求項１に記載の合成ペプチド免疫原。

【請求項3】

ペプチド配列ＣＧＫＣＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＰＮＶＬＫＱＨＨＶＥＹＧＣＫ（配列番号２）もしくはＣＧＫＣＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＰＮＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＣＫ（配列番号３）または表Ａに示されている配列番号５～１７の１つのペプチド配列を含む、請求項１または２に記載の合成ペプチド免疫原。

【請求項4】

前記ペプチドは、Ｎ末端に連結された担体タンパク質をさらに含み、任意選択で、前記担体タンパク質は、マレイミドにより連結されている、請求項３に記載の合成ペプチド。

【請求項5】

前記担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはオボアルブミン（ＯＶＡ）を含む、請求項４に記載の合成ペプチド。

【請求項6】

前記担体タンパク質は、任意選択で（ｉ）Ｐａｍ３Ｃｙｓ（Ｎ－α－パルミトイル－Ｓ－２，３－ビス（パルミトイルオキシ）－（２ＲＳ）－プロピル－Ｌ－システインを有し、パルミトイル－Ｃｙｓ（（ＲＳ）－２，３）が２番目のリジン（Ｋ４）に付着している配列ＫＳＳＫＳＫＫＫＦＩＳＥＡＩＩＨＨＬＨＳＲＨＰＧＫ（配列番号４）を有するペプチドを含み、前記担体タンパク質はマレイミドを介して前記Ｎ末端にコンジュゲートされている、請求項４に記載の合成ペプチド。

【請求項7】

任意選択で（ｉ）Ｐａｍ３Ｃｙｓ（Ｎ－α－パルミトイル－Ｓ－２，３－ビス（パルミトイルオキシ）－（２ＲＳ）－プロピル－Ｌ－システインを有し、パルミトイル－Ｃｙｓ（（ＲＳ）－２，３）が２番目のリジン（Ｋ４）に付着している配列ＫＳＳＫＳＫＫＫＦＩＳＥＡＩＩＨＨＬＨＳＲＨＰＧＫ（配列番号４）を有する合成ペプチド。

【請求項8】

１つまたは複数の生物学的流体を含む試料中の、好ましくはヒト対象に由来する試料中のｏＡβを検出するための方法であって、
前記試料を、表面に結合した捕捉抗体と接触させるステップであって、前記捕捉抗体は７１Ａ１または１Ｇ５抗体を含む、ステップ、
前記試料を、検出可能な標識を含む標識検出抗体と接触させるステップであって、前記検出抗体は、前記検出抗体が前記捕捉抗体－αＡβ複合体に結合するのに十分な条件下で、前記捕捉抗体－αＡβ複合体に結合する、ステップ、および
前記検出可能な標識を検出し、任意選択で定量化するステップであって、前記検出可能な標識の量は、前記試料中のｏＡβの量に比例し、それにより前記試料中のｏＡβを検出するステップ
を含む方法。

【請求項9】

前記１つまたは複数の生物学的流体は、血液または血漿を含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記表面は、プレートまたはビーズの表面である、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記プレートは、マルチウェルプレートまたは試験ストリップである、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ビーズは、磁気ビーズ、プラスチックビーズ、セラミックビーズ、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、メチルスチレンビーズ、アクリルポリマービーズ、カーボングラファイトビーズ、二酸化チタンビーズ、ラテックスまたは架橋デキストラン、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥビーズ、セルロースビーズ、ナイロンビーズ、架橋ミセル、またはＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ビーズから選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項13】

前記捕捉抗体は、ビオチン部分にコンジュゲートされており、前記表面はストレプトアビジンでコーティングされており、前記抗体はビオチン－ストレプトアビジン結合を介して前記表面に付着している、請求項８に記載の方法。

【請求項14】

前記検出抗体は、前記捕捉抗体とは異なるエピトープでＡβに結合する、請求項８に記載の方法。

【請求項15】

前記捕捉抗体は親和性タグを含み、前記検出抗体は前記親和性タグに結合する、請求項８に記載の方法。

【請求項16】

前記検出可能な標識は、放射性同位体、化学発光物質、蛍光物質、金属錯体、ルシフェラーゼなどの生物発光物質、または核酸である、請求項８に記載の方法。

【請求項17】

前記試料中のｏＡβ濃度の検出および任意選択の定量化は、前記検出抗体が放射性同位体で標識されている場合は、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）を使用すること、前記検出抗体が化学発光物質で標識されている場合は、化学発光イムノアッセイ法（ＣＩＡ）を使用すること、前記検出抗体が蛍光物質で標識されている場合は、蛍光イムノアッセイ法（ＦＩＡ）を使用すること、前記検出抗体が金属錯体で標識されている場合は、電気化学発光イムノアッセイ法（ＥＣＬＩＡ）を使用すること、前記検出抗体がルシフェラーゼなどの生物発光物質で標識されている場合は、生物発光イムノアッセイ法（ＢＬＩＡ）を使用すること、前記検出抗体が核酸で標識されている場合は、抗体を標識した核酸をＰＣＲにより増幅することおよび前記核酸を検出することを含む免疫ＰＣＲ法を使用すること、免疫複合体の形成により生じる濁度を検出する比濁イムノアッセイ法（ＴＡＩ）を使用すること、複合体の形成により凝集したラテックスを検出することを含むラテックス凝集比濁アッセイ（ＬＡ）を使用すること、またはセルロース膜での反応を使用したイムノクロマトグラフィーアッセイを使用することを含む、請求項８～１４のいずれかに記載の方法。

【請求項18】

表面、任意選択でプレートまたはビーズ、
７１Ａ１または１Ｇ５から選択され、任意選択で前記表面に連結された捕捉抗体、
検出抗体、および
既知濃度のｏＡβを含む標準物質
を含むキット。

【請求項19】

前記表面は、プレートまたはビーズの表面である、請求項１８に記載のキット。

【請求項20】

前記プレートは、マルチウェルプレートまたは試験ストリップである、請求項１９に記載のキット。

【請求項21】

前記ビーズは、磁気ビーズ、プラスチックビーズ、セラミックビーズ、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、メチルスチレンビーズ、アクリルポリマービーズ、カーボングラファイトビーズ、二酸化チタンビーズ、ラテックスまたは架橋デキストラン、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥビーズ、セルロースビーズ、ナイロンビーズ、架橋ミセル、またはＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ビーズから選択される、請求項１９に記載のキット。

【請求項22】

前記捕捉抗体は、ビオチン部分にコンジュゲートされており、前記表面はストレプトアビジンでコーティングされており、前記抗体はビオチン－ストレプトアビジン結合を介して前記表面に付着している、請求項１８に記載のキット。

【請求項23】

前記検出抗体は、前記捕捉抗体とは異なるエピトープでＡβに結合する、請求項１８に記載のキット。

【請求項24】

前記捕捉抗体は親和性タグを含み、前記検出抗体は前記親和性タグに結合する、請求項１８に記載のキット。

【請求項25】

検出可能な標識は、放射性同位体、化学発光物質、蛍光物質、金属錯体、ルシフェラーゼなどの生物発光物質、または核酸である、請求項１８に記載のキット。

【請求項26】

対象におけるｏＡβの蓄積に関連付けられる神経障害を治療するための方法であって、治療有効量の７１Ａ１抗体もしくはその抗原結合性断片または１Ｇ５抗体もしくはその抗原結合性断片を前記対象に投与するステップを含む方法。

【請求項27】

前記障害は、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記抗体は、前記対象の脳に投与される、請求項２６または２７に記載の方法。

【請求項29】

前記抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項２６～２８に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

優先権の主張
本出願は、２０２１年８月３０日に出願された米国特許仮出願第６３／２３８，２５２号、２０２１年８月３０日に出願された米国特許仮出願第６３／２３８，３２９号、２０２２年５月２６日に出願された米国特許仮出願第６３／３４６，２４０号、および２０２２年７月３０日に出願された米国特許仮出願第６３／３９３，８８５号の利益を主張するものである。上述の文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府の支援を受けた研究または開発
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号ＡＧ００６１７３、ＡＧ０１５３７９、ＡＧ０７１８６５、およびＡＧ０６３０４６に基づく政府支援によりなされた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。

【0003】

本明細書には、アミロイドベータタンパク質の可溶性多量体（ｏＡβ）に特異的に結合する抗体を製作および使用するための組成物および方法、ならびにｏＡβの病原性多量体の形成に関連する疾患の診断および治療においてそれらを使用するための方法が記載されている。また、所望の抗原に対する標的化体液性免疫応答を刺激するようにペプチド免疫原にコンジュゲートすることができるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）担体ペプチドが提供される。

【背景技術】

【0004】

アルツハイマー病（ＡＤ）は、組織病理学的レベルおよび臨床レベルの両方においてゆっくりと進行する神経変性疾患であり、すべての認知症の約７０％の原因である。一時的な軽度記憶喪失および最小限の断続的な認知障害という初期症状は、５～１５年かけて徐々に重度の認知症および死亡に結び付く。現在、推定６２０万人のアメリカ人、世界中で４５００万人を超える人々がアルツハイマー病を抱えたまま暮らしており、多大な家族的、社会的、および経済的負担を引き起こしている。ＡＤは、高齢アメリカ人の死亡原因の第５位であり、２０２０年には認知症を有する患者の無報酬介護は、２５６７億ドルであると評価された（2021 Alzheimer's facts and figures）。２０２１年６月にアデュカヌマブが承認されるまで、ＡＤの治療に承認された薬物は、４つのコリンエステラーゼ阻害剤および１つのＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニストの５剤のみだったが、これらは対症療法に過ぎず効果は最小限であり、こうした薬物はいずれも、ＡＤの根本的な原因を治療するものでもなく、認知機能低下を遅らせるものでもない（Cummings et al, 2016）。アデュヘルムという商品名で販売されているアデュカヌマブは、アルツハイマー病の治療に利用可能な初めての疾患修飾療法である。アデュヘルムは、不溶性Ａβ凝集体に対して高い特異性を有し、時間依存的および用量依存的に脳Ａβ斑負荷を低減することが示されている（Arndt et al, 2018；Sevigny et al, 2016）。この承認は、アミロイド仮説に対して重要な臨床的裏付けを与え、Ａβが薬物標的であることを実証するものであるが、アデュヘルムは標的エンゲージメントが陽性であり斑負荷を低減することができるにも関わらず、認知機能低下に対するこの薬物の効果については深刻な疑念が残されている（Knopman et al, 2021）。アデュヘルムの承認は、ＡＤに苦しむ患者および家族にとって恩恵であり、より効果的で手頃な価格のＡＤ診断戦略および疾患修飾療法を開発する緊急の必要性を浮き彫りにしている。

【発明の概要】

【0005】

本明細書には、アミロイドベータタンパク質の可溶性多量体（ｏＡβ）に特異的に結合する抗体を製作および使用するための組成物および方法、ならびにｏＡβの病原性多量体の形成に関連する疾患の診断および治療においてそれらを使用するための方法が記載されている。また、所望の抗原に対する標的化体液性免疫応答を刺激するようにペプチド免疫原にコンジュゲートすることができるヘルパーＴ細胞（Ｔｈ）担体ペプチドが提供される。

【0006】

したがって、本明細書では、抗体の発生を刺激するための合成ペプチド免疫原であって、アミロイドベータタンパク質の多量体（ｏＡβ）を含むアミロイドβタンパク質（Ａβ）の凝集形態に存在する立体構造エピトープに特異的であるが、単量体形態には特異的ではない合成ペプチド免疫原が提供される。一部の実施形態では、合成ペプチド免疫原は、配列ＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶ（配列番号１）または配列ＹＥＸＨＨ（配列番号４１）を含み、配列中、Ｘは疎水性アミノ酸（Ｖ、Ｉ、またはＬ）である。

【0007】

一部の実施形態では、合成ペプチド免疫原は、配列ＣＧＫＣＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＰＮＶＬＫＱＨＨＶＥＹＧＣＫ（配列番号２）またはＣＧＫＣＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＰＮＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＣＫ（配列番号３）を含む。一部の実施形態では、合成ペプチド免疫原は、図１３に示されている配列、つまり配列番号５～１７を含む。一部の実施形態では、合成ペプチド免疫原は、ペプチド１、３、５、７、８、１１、または１３の配列を含み、好ましくはペプチド５、８、または７が最も良好である。

【0008】

一部の実施形態では、合成ペプチド免疫原は、Ｎ末端に連結された担体タンパク質をさらに含み、任意選択で、担体タンパク質は、マレイミドにより連結されている。一部の実施形態では、合成ペプチド免疫原は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、またはオボアルブミン（ＯＶＡ）を含む担体タンパク質を含む。

【0009】

一部の実施形態では、合成ペプチド免疫原は、任意選択で（ｉ）Ｐａｍ３Ｃｙｓ（Ｎ－α－パルミトイル－Ｓ－２，３－ビス（パルミトイルオキシ）－（２ＲＳ）－プロピル－Ｌ－システインを有し、パルミトイル－Ｃｙｓ（（ＲＳ）－２，３）が２番目のリジン（Ｋ４）に付着している配列ＫＳＳＫＳＫＫＫＦＩＳＥＡＩＩＨＨＬＨＳＲＨＰＧＫ（配列番号４）を有するペプチドを含む担体タンパク質を含み、担体タンパク質はマレイミドを介してＮ末端にコンジュゲートされている。

【0010】

また、本明細書では、任意選択で（ｉ）Ｐａｍ３Ｃｙｓ（Ｎ－α－パルミトイル－Ｓ－２，３－ビス（パルミトイルオキシ）－（２ＲＳ）－プロピル－Ｌ－システイン）を有し、パルミトイル－Ｃｙｓ（（ＲＳ）－２，３）が２番目のリジン（Ｋ４）に付着している配列ＫＳＳＫＳＫＫＫＦＩＳＥＡＩＩＨＨＬＨＳＲＨＰＧＫ（配列番号４）を有する合成ペプチド、および抗原に対する免疫応答を増加させるためにそれらを使用するための方法が提供される。

【0011】

さらに、本明細書に記載のペプチドを含む組成物が提供される。

【0012】

加えて、本明細書では、１つまたは複数の生物学的流体を含む試料中の、好ましくはヒト対象に由来する試料中のｏＡβを検出するための方法が提供される。こうした方法は、試料を、表面に結合した捕捉抗体であり、７１Ａ１抗体または１Ｇ５抗体を含む捕捉抗体と、捕捉抗体－ｏＡβ複合体の形成に十分な条件下で接触させ、任意選択で洗浄して未結合タンパク質を除去するステップ；試料を、検出可能な標識を含む標識検出抗体と接触させるステップであって、検出抗体は、捕捉抗体－ｏＡβ複合体に結合するのに十分な条件下で捕捉抗体－ｏＡβ複合体に結合する、ステップ；および検出可能な標識を検出し、任意選択で定量化するステップであって、検出可能な標識の量は、試料中のｏＡβの量に比例し、それにより試料中のｏＡβを検出するステップを含む。

【0013】

一部の実施形態では、１つまたは複数の生物学的流体は、全血、血漿、血清、尿、唾液、呼気、エキソソームまたはエキソソーム様微小胞、リンパ、脳脊髄液、または痰中血液もしくは血漿を含む。組織を使用することもできる。好ましくは、試料は、全血、血漿、または血清である。一部の実施形態では、試料は希釈されている。例えば、血漿を含む試料は、１：２～１６倍、例えば、１：４～１：８倍に希釈されている。ＣＳＦを含む試料は、１：１０～１：２０倍、例えば１：１２～１：１８、例えば１：１６倍に希釈されていてもよい。

【0014】

一部の実施形態では、表面は、プレートまたはビーズの表面である。一部の実施形態では、プレートは、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）または試験ストリップである。一部の実施形態では、ビーズは、磁気ビーズ、プラスチックビーズ、セラミックビーズ、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、メチルスチレンビーズ、アクリルポリマービーズ、カーボングラファイトビーズ、二酸化チタンビーズ、ラテックスまたは架橋デキストラン、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥビーズ、セルロースビーズ、ナイロンビーズ、架橋ミセル、またはＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ビーズから選択される。

【0015】

一部の実施形態では、捕捉抗体はビオチン部分にコンジュゲートされており、表面はストレプトアビジンでコーティングされており、抗体は、ビオチン－ストレプトアビジン結合を介して表面に付着している。

【0016】

一部の実施形態では、検出抗体は、捕捉抗体とは異なるエピトープにてＡβと結合する。

【0017】

一部の実施形態では、捕捉抗体は親和性タグを含み、検出抗体は親和性タグに結合する。

【0018】

一部の実施形態では、検出可能な標識は、放射性同位体、化学発光物質、蛍光物質、金属錯体、ルシフェラーゼなどの生物発光物質、または核酸である。

【0019】

一部の実施形態では、試料中のｏＡβ濃度の検出および任意選択の定量化は、検出抗体が放射性同位体で標識されている場合は、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）を使用すること、検出抗体が化学発光物質で標識されている場合は、化学発光イムノアッセイ法（ＣＩＡ）を使用すること、検出抗体が蛍光物質で標識されている場合は、蛍光イムノアッセイ法（ＦＩＡ）を使用すること、検出抗体が金属錯体で標識されている場合は、電気化学発光イムノアッセイ法（ＥＣＬＩＡ）を使用すること、検出抗体がルシフェラーゼなどの生物発光物質で標識されている場合は、生物発光イムノアッセイ法（ＢＬＩＡ）を使用すること、検出抗体が核酸で標識されている場合は、抗体を標識した核酸をＰＣＲにより増幅して核酸を検出することおよび核酸を検出することを含むイムノＰＣＲを使用すること、免疫複合体の形成により生じる濁度を検出する比濁イムノアッセイ法（ＴＡＩ）を使用すること、複合体の形成により凝集したラテックスを検出することを含むラテックス凝集比濁アッセイ（ＬＡ）を使用すること、またはセルロース膜上の反応を使用するイムノクロマトグラフィーアッセイを使用することを含む。

【0020】

加えて、本明細書では、表面、任意選択でプレートまたはビーズ；７１Ａ１または１Ｇ５から選択され、任意選択で表面に連結された捕捉抗体；検出抗体；および既知濃度のｏＡβを含む標準物質を含むキットが提供される。一部の実施形態では、表面は、プレートまたはビーズの表面である。一部の実施形態では、プレートは、マルチウェルプレートまたは試験ストリップである。

【0021】

一部の実施形態では、ビーズは、磁気ビーズ、プラスチックビーズ、セラミックビーズ、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、メチルスチレンビーズ、アクリルポリマービーズ、カーボングラファイトビーズ、二酸化チタンビーズ、ラテックスまたは架橋デキストラン、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥビーズ、セルロースビーズ、ナイロンビーズ、架橋ミセル、またはＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ビーズから選択される。

【0022】

一部の実施形態では、捕捉抗体はビオチン部分にコンジュゲートされており、表面はストレプトアビジンでコーティングされており、抗体はビオチン－ストレプトアビジン結合を介して表面に付着している。

【0023】

一部の実施形態では、検出抗体は、捕捉抗体とは異なるエピトープにてＡβと結合する。

【0024】

一部の実施形態では、捕捉抗体は親和性タグを含み、検出抗体は親和性タグに結合する。

【0025】

一部の実施形態では、検出可能な標識は、放射性同位体、化学発光物質、蛍光物質、金属錯体、ルシフェラーゼなどの生物発光物質、または核酸である。

【0026】

また、本明細書では、対象におけるｏＡβの蓄積に関連付けられる神経障害を治療するための方法であって、治療有効量の７１Ａ１抗体もしくはその抗原結合性断片または１Ｇ５抗体もしくはその抗原結合性断片を対象に投与するステップを含む方法が提供される。また、例えば、対象におけるｏＡβの蓄積に関連付けられる神経障害を治療するための方法で使用するための、７１Ａ１抗体もしくはその抗原結合性断片または１Ｇ５抗体もしくはその抗原結合性断片、および７１Ａ１抗体もしくはその抗原結合性断片または１Ｇ５抗体もしくはその抗原結合性断片を含む組成物が提供される。一部の実施形態では、障害は、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）またはアルツハイマー病（ＡＤ）である。一部の実施形態では、抗体は、対象の脳に投与される。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である。

【0027】

本明細書では、１つまたは複数の生物学的流体中に存在する標的分析物をアッセイするための定量方法が提供される。こうした方法は、（ｉ）ヒト患者から流体試料を得るステップ；（ｉｉ）前記流体中に存在する前記標的分析物を、前記流体から前記標的分析物を認識および単離する第１の作用剤またはプローブ（捕捉プローブ）を用いて捕捉するステップ；ならびに（ｉｉｉ）前記標的分析物の異なるエピトープを認識する、検出器シグナルとコンジュゲートされた第２の作用剤またはプローブ（検出器プローブ）を使用して、前記生物学的流体中の前記分析物の濃度を定量化するステップであって、前記標的分析物は、前記検出器シグナルにより定量される、ステップで構成されている。一部の実施形態では、標的分析物は、アミロイドβタンパク質（Ａβ）に由来する可溶性神経毒性多量体抗原（ｏＡβ）である。一部の実施形態では、ｏＡβは、Ａβペプチドアイソフォームで構成されている。一部の実施形態では、Ａβペプチドアイソフォームは、生物学的流体中に天然に分泌されるＡβペプチドである。一部の実施形態では、前記天然に分泌されるＡβペプチドとしては、Ａｓ３７、Ａｓ３８、Ａｓ３９、Ａβ４０、Ａβ４２、Ａｓ４３、およびそれらの任意のＮ末端バリアントが挙げられる。一部の実施形態では、捕捉プローブおよび検出器プローブとしては、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体の誘導体、モノクローナル抗体の修飾体、またはポリクローナル抗体が挙げられる。一部の実施形態では、前記捕捉モノクローナル抗体は、ｏＡβ選択的であり、本明細書に記載のＡｓペプチドのいずれかで構成されている可溶性多量体を認識して結合する。一部の実施形態では、捕捉モノクローナル抗体は、７１Ａ１または１Ｇ５．９である。一部の実施形態では、捕捉プローブまたはモノクローナル抗体は、相補的結合分子にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、相補的結合分子としては、これに限定されないが、ビオチンが挙げられる。一部の実施形態では、捕捉プローブは、基材または表面に結合している。一部の実施形態では、基材または表面は、ストレプトアビジンでコーティングされている。一部の実施形態では、捕捉プローブの基材または表面としては、ビーズ、粒子、ミクロスフェア、ナノチューブ、ポリマー、プレート、ディスク、またはディップスティックが挙げられる。一部の実施形態では、ビーズのタイプは、磁気ビーズ、プラスチックビーズ、セラミックビーズ、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、メチルスチレンビーズ、アクリルポリマービーズ、カーボングラファイトビーズ、二酸化チタンビーズ、ラテックスまたは架橋デキストラン、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥビーズ、セルロースビーズ、ナイロンビーズ、架橋ミセル、またはＴＥＦＬＯＮビーズとして特徴付けることができる。一部の実施形態では、検出器プローブまたはモノクローナル抗体は、ＡβのＮ末端エピトープを認識する。一部の実施形態では、検出器プローブまたはモノクローナル抗体としては、これに限定されないが、３Ｄ６が挙げられる。一部の実施形態では、検出器プローブまたはモノクローナル抗体は、これらに限定されないが、酵素標識、色素、蛍光標識、または金属標識にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、蛍光標識は、理想的には５９４ｎｍまたは６３３ｎｍレーザー線に好適な励起を示す明色近赤外蛍光色素である。一部の実施形態では、蛍光標識は、共焦点顕微鏡レンズおよび光検出器を使用して測定される。

【0028】

また、本明細書では、可溶性神経毒性Ａβ多量体の堆積および／または産生により特徴付けられる神経疾患または状態の存在および経過について、ヒト患者をスクリーニングするための非侵襲的方法であって、（ｉ）本明細書に記載の方法を使用して、前記ヒト患者に由来する体液中の可溶性神経毒性Ａβ多量体抗原の量を定量化するステップ；（ｉｉ）前記ヒト患者試料中の可溶性神経毒性Ａβ多量体の量を、正常なヒト参照集団から単離された流体試料中の可溶性神経毒性Ａβ多量体の量と比較するステップを含み、（ｉｉｉ）前記正常ヒト参照集団の流体試料中に存在する可溶性多量体の量と比べた、前記ヒト患者の流体試料中に存在する可溶性神経毒性Ａβ多量体の量の変化は、前記神経疾患もしくは状態の存在および／または経過に関するバイオマーカーまたは診断である、方法が提供される。一部の実施形態では、非侵襲的方法スクリーニングは、前記神経疾患または状態に対する療法的介入の有効性についてのバイオマーカーである。

【0029】

さらに本明細書では、ヒト患者から得られた試料中の可溶性神経毒性Ａβ多量体抗原の量を定量化するためのキットであって、（ｉ）本明細書に記載の捕捉および検出器試薬、ならびに（ｉｉ）前記ヒト患者試料中の可溶性神経毒性Ａβ多量体抗原を定量化するための前記試薬を使用するための説明書で構成されるキットが提供される。

【0030】

加えて、本明細書では、患者におけるアミロイドの病理学的細胞外堆積により部分的または全体的に特徴付けられる疾患を予防するための、進行を遅らせるための、または治療するための方法であって、アミロイドベータタンパク質（ｏＡβ）の神経毒性多量体を阻害する作用剤の１つまたは複数の治療有効用量を前記患者に投与するステップで構成される方法が提供される。一部の実施形態では、作用剤はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は７１Ａ１または１Ｇ５である。一部の実施形態では、作用剤は、これらに限定されないが、以下の経路：経口、舌下、非経口、腹腔内、筋肉内、静脈内、局所、眼内、鼻腔内、脳内、脳室内、および槽内により投与される。一部の実施形態では、疾患は、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病である。

【0031】

別様に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書には、本発明で使用するための方法および物質が記載されている。当技術分野で公知の他の適切な方法および物質も使用することができる。物質、方法、および例は説明のためのものに過ぎず、限定することを意図したものではない。本明細書で言及されているすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書が優先されることになる。

【0032】

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】本明細書ではＮＥＴＬ－１とも呼ばれる、例示的なペプチド免疫原の概略図である。この例では、マレイミド担体にコンジュゲートされたペプチドが示されている。

【図2】マレイミド活性化（ＳＨ反応性）マイクロタイタープレートにコンジュゲートされたＡβ４０、ＮＥＴＬ１、またはＮＥＴＬ２ペプチドに対する結合についてアッセイした、精製されたモノクローナル抗体を用いた標準的な酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）である。

【図3-1】図３Ａ～３Ｄ：１Ｇ５および７１Ａ１は、ヒト脳浸漬抽出物からＡβをプルダウンする。（Ａ）ヒト脳浸漬抽出物を調製するための概略図。

【図3-2】１Ｇ５および７１Ａ１は、ヒト脳浸漬抽出物からＡβをプルダウンする。（Ｂ）異なる抗体によるヒト脳浸漬抽出物からのプロテインＧを用いた免疫沈降の免疫ブロット。Ａβの中間領域およびＮ末端に対する２つの抗体により検出した。入力レーンには７．５μＬの抽出物を使用した。ＩＰは８００μＬの抽出物からのものだった。

【図3-3】１Ｇ５および７１Ａ１は、ヒト脳浸漬抽出物からＡβをプルダウンする。（Ｃ）ヒト脳浸漬抽出物からの指定の抗体による免疫沈降または免疫沈降後上清（すべて８Ｍ ＧｎＣｌで変性）のＥＬＩＳＡにより測定されたＡβｘ－４０およびｘ－４２。ｎ＝３、平均±ＳＤ。

【図3-4】１Ｇ５および７１Ａ１は、ヒト脳浸漬抽出物からＡβをプルダウンする。

【図4-1】図４Ａ～４Ｄ：１Ｇ５および７１Ａ１は、ヒト脳内のＡβをｉｎ ｓｉｔｕで認識する。（Ａ）ヒト脳凍結切片に対して１Ｃ２２、１Ｇ５、および７１Ａ１を使用した免疫組織化学的特徴。スケールバー＝２００μｍ。

【図4-2】１Ｇ５および７１Ａ１は、ヒト脳内のＡβをｉｎ ｓｉｔｕで認識する。（Ｂ）１Ｃ２２または７１Ａ１を使用した、ヒト脳凍結切片に対する免疫組織化学的特徴。Ａβ単量体抗体Ｄ５４Ｄ２で二重標識した。左側２つのパネルではバー＝２００μｍ、右側パネルでは１００μｍ。

【図4-3】１Ｇ５および７１Ａ１は、ヒト脳内のＡβをｉｎ ｓｉｔｕで認識する。（Ｃ）ａＣＳＦ（ｎ＝６）、ヒト脳浸漬抽出物（ｎ＝５）、２．１２ｕｇ／ｍＬの７１Ａ１（ｎ＝４）、または２．１２ｕｇ／ｍＬの７１Ａ１（ｎ＝４）と予め混合したヒト脳浸漬抽出物による処理後のＬＴＰ誘導。平均±ＳＤ。（Ｄ）ａＣＳＦ（ｎ＝６）または７１Ａ１で親和性精製されたｏＡβ（ｎ＝４）による処理後のＬＴＰ誘導。平均±ＳＤ。

【図4-4】図４Ｅ～４Ｆ：海馬スライスに対する電気生理学的記録の統計検定。（Ｅ）ヒト脳浸漬抽出物処理対２．１２ｕｇ／ｍＬの７１Ａ１と予め混合した同じ抽出物処理（図４Ｃ）の多重ｔ検定分析：６０分間の記録にわたるｑ値分布。

【図4-5】海馬スライスに対する電気生理学的記録の統計検定。（Ｆ）ａＣＳＦ処理対７１Ａ１で精製されたｏＡβ処理間（図４Ｄ）の多重ｔ検定分析：６０分間の記録にわたるｑ値分布。

【図5-1】図５Ａ～５Ｃ：１Ｇ５および７１Ａ１はヒトＣＳＦからＡβを認識する。（Ａ）異なる抗体による３つのヒトＣＳＦからの免疫沈降物または免疫沈降後上清（すべて８Ｍ ＧｎＣｌで変性）のＥＬＩＳＡにより測定されたＡβｘ－４０およびｘ－４２。技術的複製物＝３、平均±ＳＤ。

【図5-2】（図５Ａの続き）１Ｇ５および７１Ａ１はヒトＣＳＦからＡβを認識する。

【図5-3】１Ｇ５および７１Ａ１はヒトＣＳＦからＡβを認識する。（Ｂ）７１Ａ１による１９個の個々のヒトＣＳＦからの免疫沈降物または免疫沈降後上清（すべて８Ｍ ＧｎＣｌで変性）のＥＬＩＳＡにより測定されたＡβｘ－４０およびｘ－４２。技術的複製物＝３、平均±ＳＤ。

【図5-4】１Ｇ５および７１Ａ１はヒトＣＳＦからＡβを認識する。（Ｃ）７１Ａ１による免疫沈降物（すべて８Ｍ ＧｎＣｌで変性）のＥＬＩＳＡにより測定されたＡβｘ－４０およびｘ－４２と、同じＣＳＦからのＡＤｍａｒｋ Ａβ１－４２測定値との間の相関性。ピアソン相関が使用されている。

【図6-1】図６Ａ～６Ｉ：ｏＡβに特異的な７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイの開発。（Ａ）ＳＭＣｘＰＲＯビーズベースイムノアッセイの概略図。

【図6-2】ｏＡβに特異的な７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイの開発。（Ｂ～Ｃ）較正物質としてのＡＤＤＬに対する１Ｇ５／３Ｄ６および７１Ａ１／３Ｄ６アッセイ成績。（Ｄ）１Ｇ５／３Ｄ６および７１Ａ１／３Ｄ６アッセイを使用したＡＤＤＬシグナルの平均ＣＶおよび回収率。

【図6-3】ｏＡβに特異的な７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイの開発。（Ｅ）較正物質としてのＡＤＤＬに対する１Ｃ２２／３Ｄ６および７１Ａ１／３Ｄ６アッセイ成績。（Ｆ）ＤＴＴによる還元無し（－）または有り（＋）の、Ａβ１－４０ Ｓ２６二量体のＰＡＧＥ分析のＣＢＢ染色。

【図6-4】ｏＡβに特異的な７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイの開発。（Ｇ～Ｈ）ＤＴＴによる還元無し（天然）または有りの、Ａβ１－４０ Ｓ２６二量体に対する１Ｃ２２／３Ｄ６および７１Ａ１／３Ｄ６アッセイ成績。（Ｉ）ヒト脳浸漬抽出物に対する７１Ａ１／３Ｄ６アッセイ成績：左パネル：ＡＤＤＬにより較正された系列希釈脳抽出物からの７１Ａ１／３Ｄ６シグナルの生値；中央パネル：希釈係数により調整した計算値；右パネル；１：１Ｋに対して正規化した各希釈物の回収率；ｎ＝３、平均±ＳＤ。

【図6-5】（図６Ｉの続き）ｏＡβに特異的な７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイの開発。

【図7-1】図７Ａ～７Ｄ：７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイは、ヒト脳から高分子量ｏＡβを認識する。（Ａ～Ｂ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ ＳＥＣカラムにより分画された分子量較正物質およびヒト脳可溶性抽出物のクロマトグラム（ＵＶ２８０ｎｍ吸光度）。

【図7-2】７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイは、ヒト脳から高分子量ｏＡβを認識する。（Ｃ）ＳＥＣ画分から７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイにより測定された未変性ｏＡβ。ｎ＝３、平均±ＳＤ。

【図7-3】７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイは、ヒト脳から高分子量ｏＡβを認識する。（Ｄ）ＳＥＣ画分からＭＳＤ ＥＬＩＳＡにより測定された、未変性（赤色バー）のまたは変性（青色バー）単量体Ａβｘ－４２。ｎ＝２、平均±ＳＤ。

【図8-1】図８Ａ～８Ｆ：ＣＳＦ中の７１Ａ１／３Ｄ６免疫反応性ｏＡβは、ｔ－タウレベルおよびｐ－タウレベルと相関する。（Ａ）ヒトＣＳＦに対する７１Ａ１／３Ｄ６アッセイ成績：左パネル：系列希釈ＣＳＦからの７１Ａ１／３Ｄ６シグナルの生値（ＡＤＤＬ較正物質に対する）；中央パネル：希釈係数により調整した計算値；右パネル：１：２に正規化した各希釈物の回収率；ｎ＝３、平均±ＳＤ。

【図8-2】ＣＳＦ中の７１Ａ１／３Ｄ６免疫反応性ｏＡβは、ｔ－タウレベルおよびｐ－タウレベルと相関する。（Ｂ～Ｃ）ＣＳＦ中の７１Ａ１／３Ｄ６反応性ｏＡβレベルと、Ａβ１－４２、ｔ－タウ、およびｐ－タウのＡＤｍａｒｋ測定値との間の相関性。ｎ＝２９。ピアソン相関が使用されている。

【図8-3】ＣＳＦ中の７１Ａ１／３Ｄ６免疫反応性ｏＡβは、ｔ－タウレベルおよびｐ－タウレベルと相関する。（Ｄ）ＣＳＦ中の７１Ａ１／３Ｄ６反応性ｏＡβレベルと、Ａβ１－４２、ｔ－タウ、およびｐ－タウのＡＤｍａｒｋ測定値との間の相関性。ｎ＝２９。ピアソン相関が使用されている。

【図8-4】ＣＳＦ中の７１Ａ１／３Ｄ６免疫反応性ｏＡβは、ｔ－タウレベルおよびｐ－タウレベルと相関する。（Ｅ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ＳＥＣカラムで分画したヒトＣＳＦのクロマトグラム（ＵＶ２８０ｎｍ吸光度）。

【図8-5】ＣＳＦ中の７１Ａ１／３Ｄ６免疫反応性ｏＡβは、ｔ－タウレベルおよびｐ－タウレベルと相関する。（Ｆ）ＳＥＣ画分での７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイにより測定された未変性のｏＡβ。ｎ＝３、平均±ＳＤ。

【図9-1】図９Ａ～９Ｇ：７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイは、ヒト血漿からｏＡβを正確に定量化する。（Ａ）ヒト血漿に対する７１Ａ１／３Ｄ６アッセイ成績：左パネル：ＡＤＤＬ較正物質に対する系列希釈血漿からの７１Ａ１／３Ｄ６シグナルの生値；中央パネル：希釈係数により調整した計算値；右パネル：１：４に正規化した各希釈物の回収率；ｎ＝３、平均±ＳＤ。

【図9-2】７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイは、ヒト血漿からｏＡβを正確に定量化する。（Ｂ）ヒト脳ホモジネート（Ｂｒａｉｎ Ｈ）、ヒト脳浸漬抽出物（Ｂｒａｉｎ Ｓ）、またはヒトＣＳＦを、８倍希釈した個々の血漿にスパイクすることによるスパイクイン回収試験。ｎ＝３、平均±ＳＤ。

【図9-3】７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイは、ヒト血漿からｏＡβを正確に定量化する。（Ｃ）入力血漿と比較した、様々な抗体により免疫枯渇させた８倍希釈の個々の血漿からのｏＡβの７１Ａ１／３Ｄ６アッセイ。ｎ＝４。

【図9-4】７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイは、ヒト血漿からｏＡβを正確に定量化する。（Ｄ）８Ｍ ＧｎＣｌで変性させた（または変性させなかった）、ヒト脳浸漬抽出物、ＣＳＦ、および血漿からのｏＡβの７１Ａ１／３Ｄ６アッセイ。ｎ＝３、平均±ＳＤ。

【図9-5】７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイは、ヒト血漿からｏＡβを正確に定量化する。（Ｅ）７３個のヒト血漿（メイヨー高齢者コホート）からのｏＡβの７１Ａ１／３Ｄ６アッセイ、ｎ＝４。

【図9-6】７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイは、ヒト血漿からｏＡβを正確に定量化する。（Ｆ）系列希釈血漿からの７１Ａ１／３Ｄ６シグナルの生値（ＡＤＤＬ較正物質に対する）；ｎ＝３、平均±Ｓ．

【図9-7】７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイは、ヒト血漿からｏＡβを正確に定量化する。（Ｇ）すべての希釈物の平均に対して正規化した各希釈物の回収率；ｎ＝３、平均±ＳＤ。

【図10-1】図１０Ａ． ＡＰＰ ＮＬＧＦ／ＮＬＧＦマウス脳浸漬抽出物中のｏＡβの定量化は、マウス脳における７１Ａ１陽性ｏＡβの年齢依存性蓄積を示す。

【図10-2】図１０Ｂ． ６月齢のＡＰＰ ＮＬＧＦ／ＮＬＧＦマウスおよび年齢一致野生型マウスの海馬における長期増強（ＬＴＰ）の測定は、６月齢のＡＰＰ ＮＬＧＦ／ＮＬＧＦマウスにおけるＬＴＰ機能障害を示す。

【図10-3】図１０Ｃ． ６月齢のＡＰＰ ＮＬＧＦ／ＮＬＧＦマウスからの浸漬抽出物を使用して野生型マウス海馬を処理し、続いてＬＴＰ測定を行った。６月齢のＡＰＰ ＮＬＧＦ／ＮＬＧＦマウス脳抽出物は、処理した野生型マウス海馬のＬＴＰを損なうことができた。また、処理に７１Ａ１を混合すると、６月齢のＡＰＰ ＮＬＧＦ／ＮＬＧＦマウス脳抽出物により引き起こされる機能障害をレスキューすることになる。

【図11-1】図１１Ａ． 自発的交替行動（spontaneous alteration）およびアーム進入（arm entry）の両方により示される、７１Ａ１または対照抗体で処置したマウスのＹ迷路行動。７１Ａ１処置は、対照抗体処置と比較して、雄マウスの成績を有意に向上させたが、雌では向上させなかった。

【図11-2】（図１１Ａの続き）． 自発的交替行動（spontaneous alteration）およびアーム進入（arm entry）の両方により示される、７１Ａ１または対照抗体で処置したマウスのＹ迷路行動。７１Ａ１処置は、対照抗体処置と比較して、雄マウスの成績を有意に向上させたが、雌では向上させなかった。

【図11-3】図１１Ｂ． ７１Ａ１処置は、雄マウスの脳内のｏＡβ量を減少させた（統計的有意性のない傾向）。

【図12-1】図１２Ａ． 抗体試験ＡＰＰ ＮＬＧＦ／ＮＬＧＦマウスの脳抽出物で処置した野生型マウス海馬のＬＴＰ測定の概略図。

【図12-2】図１２Ｂ． 野生型マウス海馬を、７１Ａ１処置雄マウス（ｎ＝３）および対照抗体処置雄マウス（ｎ＝２）の脳抽出物で処理して、７１Ａ１処置がＡＰＰ ＮＬＧＦ雄マウス脳のシナプス毒性を低減したことを示した。これは、野生型マウス海馬のＬＴＰを阻害することができなかったことにより反映される。

【図13】Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂのＰｈ．Ｄ．－１２（商標）ファージディスプレイペプチドライブラリーキットを使用して単離した、Ｍａｂ７１Ａ１に結合する、合成ペプチド模倣体である１２個アミノ酸の配列。順に配列番号５～１７が表示されている。

【図14-1】１４Ａ～１４Ｂ：図１３に示されているような、マレイミド活性化マイクロタイタープレートにコンジュゲートされたペプチド模倣体（Ａ）１～７および（Ｂ）８～１３に対する結合についてアッセイした、精製されたモノクローナル抗体７１Ａ１を用いたＥＬＩＳＡ。

【図14-2】１４Ａ～１４Ｂ：図１３に示されているような、マレイミド活性化マイクロタイタープレートにコンジュゲートされたペプチド模倣体（Ａ）１～７および（Ｂ）８～１３に対する結合についてアッセイした、精製されたモノクローナル抗体７１Ａ１を用いたＥＬＩＳＡ。

【発明を実施するための形態】

【0034】

生化学的および形態学的研究は、ＡＤの臨床的機能障害には、早期シナプス機能不全（Tu et al, 2014；Anderton et al., 1998；Cummings et al., 1998）、続いてシナプス喪失の増加、広範な神経炎性ジストロフィー、神経原線維タングル、およびフランク神経細胞死（frank neuronal death）を含むより深刻な神経細胞変化が伴うことを示唆している（Serrano-Pozo et al, 2011；Tonnies & Trushina, 2017；Terry, 1963；Gomez-Isla et al., 1996；Sze et al., 1997；Anderton et al., 1998）。この進行性病態生理の開始の根底にある機序には、加齢性調節異常、ならびにアミロイドβタンパク質（Ａβ）の蓄積、ならびにその後の微小管関連タンパク質タウの過剰リン酸化および凝集が関与していると考えられており、これらは両方とも、剖検時に、それぞれ原線維を多く含む老人斑および神経原線維タングルにおいて観察することができる（Braak & Braak, 1996；Perl, 2010；Esiri et al., 1997）。死後脳組織においてこうした末期病変が観察されること、および神経原線維タングルの前にアミロイド斑が出現することは、原線維の蓄積それ自体がＡＤの進行の根底にあるという推定に結び付いている（Serrano-Pozo et al, 2011）。このような印象は、進行性神経変性が、高度に凝集した原線維状Ａβにより誘導され得るが、同等濃度のＡβ単量体では誘導され得ないという、一次神経細胞培養の研究により部分的に支持されてきた（Mattson et al., 1993b；Pike et al., 1993；Lorenzo et al., 1994）。さらに、幾つかの研究は、Ａβ調節異常が、タウ過剰リン酸化の前に起こり、タウ過剰リン酸化を誘導して、最終的には疾患の臨床症状に結び付く可能性が高いことを示している（Zheng et al 2002；Wu et al, 2018；Bloom 2014；Viola and Klein, 2015）。

【0035】

アルツハイマー病（ＡＤ）の特徴は、アミロイドｂタンパク質（Ａβ）で構成されており、脳細胞間の正常な情報伝達を妨害し、最終的には神経細胞死に結び付くと考えられていた原線維を多く含む斑の形成である。アミロイド斑の蓄積は、かつては、アルツハイマー病に見出される神経細胞毒性の唯一の原因であると考えられていたが、ベータアミロイドの小型可溶性凝集体は、より毒性である可能性がある（Hong et al, 2018；Cline et al, 2018）。

【0036】

Ａβは、アミロイド前駆体タンパク質またはＡＰＰと呼ばれるより大型のタンパク質のペプチド断片である。ＡＰＰの一部分は、ニューロンの表面に発現され、その後この部分が切断されて、Ａβと呼ばれる４０個または４２個アミノ酸の断片が産生される。多量体Ａβアセンブリ、およびプロトフィブリル（ＰＦ）と呼ばれるより大型の中間体が、原線維生成の過程で形成される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究では、Ａβおよびプロトフィブリルの可溶性多量体種は、神経生理を変化させる可能性があり、神経毒性を示す可能性があることが示されており、こうしたアセンブリがＡＤの病態生理において役割を果たしている可能性があることが強く示唆されている（Cleary et al, 2005；Hon et al, 2018；Shankar et al, 2018；O'Malley et al, 2016）。多量体形態のＡβを特異的に認識することができる抗体の開発は、脳機能不全および傷害の開始において多量体形態が果たす中心的な役割を理解する上で非常に貴重なものとなるだろう。特に、こうした抗体は、こうしたアセンブリがいつ生じ、それらがトランスジェニックマウスおよびＡＤ患者の記憶障害および認知機能低下とどのように相関し得るのかを特定するのに有用だろう。加えて、プロトフィブリルまたはＡβの固有の小型凝集体がヒトで形成される場合、こうした新規抗体は、血液および／または組織中でこうしたアセンブリを特定する上で貴重であり、ＡＤの初期段階の診断を助けることができる。

【0037】

Ａβは、ｉｎ ｖｉｖｏでは、脳細胞から構成的に分泌される単量体から基本的になる低分子量種（ＬＭＷ Ａβ）として蓄積し始めると考えられている（Haass et al., 1992；Shoji et al., 1992）。低分子量種は、ある特定の状況下では、成熟斑で観察されるように、多量体へと、最終的には幅７～１０ｎｍの成熟アミロイド原線維へと進行する可能性がある。Ａβ多量体（二量体、三量体、四量体、およびおそらくはより大型のアセンブリ）は、Ａβを構成的に分泌するＡＰＰを過剰発現するある特定の細胞株の条件培地中で（Podlisny et al., 1995；Xia et al., 1997；Podlisny et al., 1998）およびＡＤ患者の脳脊髄液中で（Pitschke et al., 1998；Walsh et al., 2000）特定されている。幾つかの研究室からの最近のデータは、Ａβ原線維形成中に形成される多量体種が神経傷害に寄与する可能性があることも示唆している（Hong et al, 2018；Li et al, 2018）。例えば、アミロイド原線維よりもゆっくりと沈降するＡβ複合体は、ＭＴＴ変換アッセイにより定量化すると、培養ＰＣ１２細胞に対して神経毒性効果を有することが示された（Oda et al., 1995）。加えて、β－１－抗キモトリプシンは、原線維形成を阻止することができるが、Ａβ誘導性神経毒性を減少させない（Aksenova et al., 1996）。混合脳培養物においてニューロンを死滅させる、ＡＤ大脳皮質から単離された可溶性Ａβ多量体種も報告されている（Giulian et al., 1996；Roher et al., 1996）。さらに、最近報告された、Ａβ由来拡散性リガンド（ＡＤＤＬ）と呼ばれる合成Ａβの可溶性形態は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで神経毒性である（Lambert et al., 1998）。この前原線維概念を裏付けるように、ヒトＡＰＰを過剰発現するトランスジェニックマウスは、あらゆる実質的なＡβ堆積または神経病理が観察される前に、行動変化および／または電気生理学的変化を示す（Holcomb et al., 1998；Chapman et al., 1999；Hsia et al., 1999）。こうしたデータは、Ａβの前原線維形態がシナプス機能不全を引き起こす可能性があり、したがって、ＡＤの初期段階における早期記憶喪失および軽度認知変化に寄与する可能性があることを明確に示唆している。興味深いことに、最近のヒト研究では、ＡＤ患者の精神状態とシナプス喪失との間の最も良好な相関性は、可溶性Ａβの量であることが見出された。しかしながら、可溶性Ａβ種の生物物理学的特質は決定されなかった（Lue et al., 1999）。

【0038】

上記に記載のように、原線維形成は、ＬＭＷ Ａβの準安定中間種への移行を介して進行し、準安定中間種が原線維の形成へと進んで行くと考えられている（Harper et al., 1997a；Teplow, 1998）。２つの研究室が、そのような中間体を合成Ａβ原線維の形成において特定し、それらはプロトフィブリル（ＰＦ）と呼ばれている（Harper et al., 1997a；Harper et al., 1997b；Walsh et al., 1997）。研究室では、低分子量Ａβ（ＬＭＷ）（つまり単量体／二量体）およびＰＦの両方の電気生理および神経毒性、ならびにそれらと原線維状Ａβとの関係性が調査された（Hartley et al., 1999）。こうしたより初期の種は両方とも、培養された一次皮質ニューロンにおいて数日間にわたって毒性を再現性よく誘導することが見出された。この毒性は、コンゴレッド結合および免疫電子顕微鏡法で測定して、アミロイド原線維の検出可能な出現とは関連付けられなかった（Hartley et al., 1999）。ＰＦは、固有の生物学的活性を有することと一致して、興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ）、興奮性シナプス後電位（ＥＰＳＰ）、活動電位（ＡＰ）、および膜脱分極（ＭＤ）を活発におよび再現性よく増加させた（Hartley et al., 1999）。重要なことには、ＰＦは、５０～１００ｎＭという低い用量でもそのような効果を示すのに対し、同じ濃度で同時に調製および適用した単量体Ａβは、電気生理学的応答を誘発しないことが見出された。ＰＦのこうした効果は、適用後６５分以内は完全に可逆性だった（Ye et al., 2000を参照）。

【0039】

ＰＦの生物学的活性を解明することは、ＡＤの神経機能不全の機序における初期Ａβ中間体の役割およびそれに付随する療法上の意義を決定する助けとなるはずである。興味深いことに、他のタンパク質の凝集は、パーキンソン病、プリオン病、ハンチントン病のようなポリグルタミン伸長障害、および前頭側頭型認知症において重要な役割を果たしている可能性がある（Kim et al., 1999；Lansbury et al., 2000）。したがって、初期Ａβ凝集およびそれに伴う神経機能不全の詳細を理解することは、タンパク質凝集が関与する他の脳疾患を理解するためのプロトタイプとしての役目を果たすことができる。したがって、病理学的種を特定するために重要なプロトフィブリル特異的抗体などの試薬は、こうした神経変性疾患におけるそれらの役割を決定する上で非常に貴重であると考えられる。

【0040】

アミロイドプロトフィブリルおよびアミロイド原線維の研究では、ポリペプチド鎖が原線維の長軸に対してほぼ垂直に延び、鎖間水素結合が軸に対して平行である特徴的なβシート構造が示されている。アルツハイマー病において「老人斑」を形成するのはアミロイド原線維である。原線維がどのように形成されるのか、および原線維形成に結び付く初期事象の正確な性質はあまりよく理解されていない。Ａβペプチドのβシート中間体は、プロトフィブリルと呼ばれることが多く、原線維形成の過程で形成される。こうした構造を疾患発症の初期に免疫学的に検出することができれば、ＡＤの病態形成におけるそれらの役割を決定する上で有用であり得る。さらに、こうした初期アセンブリは、ＡＤの発症に少なくとも部分的に関与している場合、診断マーカーとして使用することができる可能性があり、そうした構造を標的とする療法剤の開発に寄与することができる。プロトフィブリルを検出する抗体は、この取り組みにおいて非常に価値があると考えられ、療法有効性のモニターに有用であると考えられる。複数の研究により、抗Ａβ抗体によるＡＤ動物モデルの受動免疫化は、Ａβ負荷を低減することができ、行動欠陥を反転させることができることが示唆されている（Morgan, 2011）。これは、初期の病理学的種に対する抗Ａβ抗体による受動免疫化が、ＡＤの早期介入に重要な価値を有することになることを示していると考えられる。

【0041】

ペプチド免疫原
本明細書には、合成ペプチド免疫原、例えば、任意選択で６～５０アミノ酸長、例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、または１２個アミノ酸、最大で１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５個アミノ酸のペプチド、ならびにＡβ凝集体に結合するが、通常存在する単量体Ａβアミノ酸ペプチドには結合しない抗体の開発を容易にするために使用することができる、Ａβペプチド内の領域の構造および配列が記載されている。一部の実施形態では、合成ペプチド免疫原は、Ａβペプチド配列ＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶ（配列番号１）を含む。

【0042】

一部の実施形態では、合成ペプチド免疫原は、以下のペプチド配列を含む。
ＣＧＫＣＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＰＮＶＬＫＱＨＨＶＥＹＧＣＫ（配列番号２）

【0043】

ペプチド免疫原は、例えば、これらに限定されないが、ＩｇＧサブクラス１モノクローナル抗体７１Ａ１および１Ｇ５を含む単離されたおよび精製された抗体の生成に有用である。

【0044】

加えて、本明細書では、７１Ａ１可変領域に結合するペプチド模倣体配列を含むペプチド免疫原が提供される。こうしたペプチド模倣体は、ｍａｂ ７１Ａ１または１ｇ５に特異的なＡベータ多量体の三次元構造の一部を模倣する直線状ペプチド配列であり、したがって、こうした抗体にも結合する直線状配列を有する天然抗原構造を模倣する（図１３を参照）。

【0045】

こうしたペプチド模倣体を、モノクローナル抗体７１Ａ１および市販のファージディスプレイライブラリーキットを使用して親和性選択した（実施例６を参照）。したがって、図１３に示されている配列、例えば、配列番号５～１７の１つを含むペプチドも提供される。

【0046】

【表1】

【0047】

一部の実施形態では、ペプチド免疫原は、配列ＹＥＸＨＨ（配列番号４１）を含み、配列中、Ｘは疎水性アミノ酸（Ｖ、Ｉ、またはＬ）である。一部の実施形態では、ペプチド免疫原は、配列ＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶ（配列番号１）、またはこの配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、もしくは９９％同一である配列を含み、例えば、１、２、もしくは３つのアミノ酸に突然変異を含む。

【0048】

本発明のペプチドおよびペプチド免疫原は、当業者に周知の化学合成法により製作することができる。例えば、Fields et al., Chapter 3 in Synthetic Peptides: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77を参照されたい。したがって、ペプチドは、側鎖保護アミノ酸を使用してｔ－ＢｏｃまたはＦ－ｍｏｃ化学のいずれかにより保護されたアルファ－ＮＨ_２を用いた固相合成の自動メリフィールド技術を使用して、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓペプチド合成機モデル４３０Ａまたは４３１で合成することができる。Ｔｈエピトープに対するコンビナトリアルライブラリーペプチドを含むペプチド構築物の調製は、カップリングのための代替アミノ酸の混合物を所与の可変位置に提供することにより達成することができる。所望のペプチド免疫原が完全にアセンブリされた後、標準的な手順に従って樹脂を処理して、ペプチドを樹脂から切断し、アミノ酸側鎖の官能基を脱ブロッキングする。遊離ペプチドをＨＰＬＣで精製し、例えばアミノ酸分析または配列決定により生化学的に特徴付ける。ペプチドの精製および特徴付け方法は、当業者に周知である。

【0049】

ペプチドおよびペプチド免疫原は、例えば動物において免疫応答を誘発するために、例えば、Ａβ、例えばＡβ凝集体（ｏＡβ）に結合する抗体を生成するために使用することができる。抗体を製作するための方法は当技術分野で公知であり、本明細書に記載されている。また、本明細書では、本明細書に記載のペプチドおよびペプチド免疫原を使用するための方法、および本明細書に記載のペプチドおよびペプチド免疫原を含む組成物が提供される。一部の実施形態では、組成物はアジュバントを含む。一部の実施形態では、アジュバントはペプチドに共有結合で連結されている。一部の実施形態では、ペプチドは、Ｔｅｐｉ－２（配列番号４）を含む担体、またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、もしくはオボアルブミン（ＯＶＡ）に共有結合で連結されている。

【0050】

抗体７１Ａ１および１Ｇ５
上記に記載のように、本発明者らは、Ａβ多量体には特異的に結合するが、Ａβ単量体には結合しない抗体を得ることに成功した。つまり、本開示は、Ａβ多量体には結合するが、Ａβ単量体には結合しない抗体を提供する。

【0051】

本発明の方法および組成物に有用な抗体としては、７１Ａ１および１Ｇ５、ならびにそれらのバリアントおよび誘導体が挙げられる。
抗体７１Ａ１
重鎖：
ＤＮＡ配列

【0052】

【化1】

予測されるタンパク質配列（太字は相補性決定領域（ＣＤＲ）である）

【0053】

【化2】

軽鎖：
ＤＮＡ配列

【0054】

【化3】

予測されるタンパク質配列（太字は相補性決定領域（ＣＤＲ）である）

【0055】

【化4】

抗体１Ｇ５
重鎖：
ＤＮＡ配列

【0056】

【化5】

予測されるタンパク質配列（太字は相補性決定領域（ＣＤＲ）である）

【0057】

【化6】

軽鎖：
ＤＮＡ配列

【0058】

【化7】

予測されるタンパク質配列（太字は相補性決定領域（ＣＤＲ）である）

【0059】

【化8】

【0060】

抗体
本開示の抗体としては、未修飾（天然）モノクローナル抗体、非ヒト動物抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ミニボディ、二重特異性抗体（例えば、ｏＡβ、およびトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体（ＩＲ）、または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質－１（ＬＲＰ－１）など、ＲＭＴに関与する受容体に結合するもの）、アミノ酸配列修飾抗体、他の分子（例えば、ポリエチレングリコールなどのポリマー）にコンジュゲートされた修飾抗体、および糖鎖修飾抗体などの任意のタイプの抗体、ならびにそれらの抗原結合性断片を挙げることができる。

【0061】

本発明の方法および組成物に使用される抗体は、好ましくは単離されているかまたは精製されている。本明細書に記載の物質に使用される「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、天然源に含まれている可能性のある少なくとも１つの他の物質を実質的に含まないことを示す。したがって、「単離された抗体」および「精製された抗体」は、抗体（タンパク質）が由来する細胞源または組織源に由来する炭化水素、脂質、または他の夾雑タンパク質などの細胞物質を実質的に含まない抗体を指す。抗体が化学的に合成されている場合、この用語は、化学前駆体物質または他の化学物質を実質的に含まない抗体を指す。好ましい実施形態では、本明細書で提供される抗体は単離されているかまたは精製されている。

【0062】

「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、異なる抗体の混合物を含む「ポリクローナル」抗体調製物の抗体とは対照的に、共通の重鎖アミノ酸配列および共通の軽鎖アミノ酸配列を共有する抗体を含む抗体分子の調製物の１つを指すことが意図されている。モノクローナル抗体は、ファージ、細菌、酵母、またはリボソームディスプレイのような幾つかの新規技術、ならびにハイブリドーマ由来抗体（例えば、標準的なＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎハイブリドーマ技術（(1975) Nature 256:495-497）などのハイブリドーマ技術により調製されるハイブリドーマにより分泌される抗体）により例示される古典的な方法により生成することができる。したがって、非ハイブリドーマ由来抗体は、非古典的な方法論により得られた可能性のあるものであっても、依然としてモノクローナル抗体と呼ばれる。モノクローナル抗体には、上記で言及されている特異性に加えて、他の免疫グロブリンの夾雑がないハイブリドーマ培養物から合成することができるという利点がある。したがって、「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得ることができる抗体の特質を示す。この用語は、抗体を産生するための任意の特定の方法の要件を示すものではない。

【0063】

「単離された抗体」は、本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことが意図されている（例えば、グロブロマー（globulomer）と特異的に結合する単離された抗体は、グロブロマー以外の他の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、グロブロマーと特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原に対して交差反応性を示す可能性がある。さらに、単離された抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含んでいなくてもよい。

【0064】

抗体の「抗原結合性断片」または「抗原結合性部分」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原と特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により発揮させることができることが示されている。また、そのような抗体実施形態は、２つまたはそれよりも多くの異なる抗原と特異的に結合する、二重特異性、二特異性、または多重特異性形式であってもよい。抗体の「抗原結合性断片」という用語内に包含される結合性断片の例としては、（ｉ）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域のジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片（Ward et al., (1969) Nature 341:544-546）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によりコードされているが、組換え法を使用して、ＶＬ領域およびＶＨ領域が対合して一価分子（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426；およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）を形成する単一タンパク質鎖として製作することを可能にする合成リンカーにより接合されていてもよい。そのような単鎖抗体も、抗体の「抗原結合性断片」という用語に包含されることが意図されている。ダイアボディなどの他の形態の単鎖抗体も包含される。ダイアボディは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインが単一ポリペプチド鎖で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間での対合を可能にするには短過ぎるリンカーが使用されているため、ドメインが強制的に別の鎖の相補的ドメインと対合し、２つの抗原結合部位を作出する、二価の二重特異性抗体である（例えば、Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak, R. j., et al. (1994) Structure 2:1121-1123を参照）。そのような抗体結合性部分は当技術分野で公知である（Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5）。

【0065】

またさらに、抗体またはその抗原結合性断片は、抗体または抗体部分と１つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合的または非共有結合的会合により形成される、より大型の免疫接着分子の一部であってもよい。そのような免疫接着分子の例としては、四量体ｓｃＦｖ分子を製作するためのストレプトアビジンコア領域の使用（Kipriyanov, S. M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101）ならびに二価およびビオチン化ｓｃＦｖ分子を製作するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Kipriyanov, S. M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058）が挙げられる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、それぞれ完全抗体のパパイン消化またはペプシン消化などの、従来技法を使用して完全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分、および免疫接着分子は、本明細書に記載のような標準的組換えＤＮＡ技法を使用して得ることができる。

【0066】

「キメラ抗体」という用語は、１つの種に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列、ならびに別の種に由来する定常領域配列を含む抗体、例えば、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体を指す。

【0067】

「ＣＤＲ移植抗体」という用語は、１つの種に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域の１つまたは複数の配列が別の種のＣＤＲ配列で置き換えられている抗体、例えば、マウスＣＤＲの１つまたは複数（例えば、ＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列で置き換えられているマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体を指す。

【0068】

「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種（例えば、マウス）由来の重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨ配列および／またはＶＬ配列の少なくとも部分が、より「ヒト様」に、つまりヒト生殖系列可変配列により類似するように変更されている抗体を指す。ヒト化抗体の１つのタイプは、ヒトＣＤＲ配列が、対応する非ヒトＣＤＲ配列を置き換えるように、非ヒトＶＨ配列およびＶＬ配列に導入されているＣＤＲ移植抗体である。特に、「ヒト化抗体」という用語は、目的の抗原と免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク（ＦＲ）領域および実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗体またはそのバリアント、誘導体、アナログ、もしくは断片である。本明細書で使用される場合、ＣＤＲの状況における「実質的に」という用語は、非ヒト抗体ＣＤＲのアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを指す。ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリン（つまり、ドナー抗体）のＣＤＲ領域に対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である、少なくとも１つの、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂＣ、Ｆｖ）の実質的にすべてを含む。また、好ましくは、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも部分を含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖ならびに重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含む。また、抗体は、重鎖のＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、およびＣＨ４領域を含んでいてもよい。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖のみを含む。他の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖のみを含む。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメインおよび／またはヒト化重鎖のみを含む。

【0069】

ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む任意のクラスの免疫グロブリン、ならびに限定ではないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は、１つよりも多くのクラスまたはアイソタイプに由来する配列を含んでいてもよく、当技術分野で周知の技法を使用して所望のエフェクター機能を最適化するために、特定の定常ドメインを選択することができる。

【0070】

ヒト化抗体のフレームワーク領域およびＣＤＲ領域は、親配列と正確に対応する必要はなく、例えば、ドナー抗体ＣＤＲまたはコンセンサスフレームワークは、ＣＤＲまたはその部位のフレームワーク残基がドナー抗体にもコンセンサスフレームワークにも対応しないように、少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入、および／または欠失により突然変異されていてもよい。しかしながら、好ましい実施形態では、そのような突然変異は広範囲にわたるものではないだろう。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％が、親ＦＲおよびＣＤＲ配列の残基に対応することになる。本明細書で使用される場合、「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列のフレームワーク領域を指す。さらに、本明細書で使用される場合、「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連する免疫グロブリン配列のファミリーにおいて最も頻繁に出現するアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列を指す（例えば、Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987を参照)。免疫グロブリンのファミリーでは、コンセンサス配列の各位置は、ファミリー内のその位置に最も頻繁に出現するアミノ酸により占められている。２つのアミノ酸が等しい頻度で出現する場合、いずれがコンセンサス配列に含まれていてもよい。

【0071】

「組換えヒト抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現させた抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体（Hoogenboom H. R., (1997) TIB Tech. 15:62-70；Azzazy H., and Highsmith W. E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445；Gavilondo J. V., and Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145；Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378）、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295；Kellermann S-A., and Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597；Little M. et al (2000) Immunology Today 21:364-370を参照）、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、作出、もしくは単離された抗体など、組換え手段により調製、発現、作出、もしくは単離されたすべてのヒト抗体を含むことが意図されている。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかしながら、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックである動物が使用される場合は、ｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）を受け、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来および関連しているが、ｉｎ ｖｉｖｏではヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在していなくてもよい配列である。（Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication No 91-3242, 1991も参照されたい）。しかしながら、本明細書で提供されるヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダムまたは部位特異的突然変異誘発により、またはｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異により導入される突然変異）を含んでいてもよい。（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990も参照）。

【0072】

「キメラ抗体」という用語は、１つの種に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列、ならびに別の種に由来する定常領域配列とを含む抗体、例えば、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体を指す。

【0073】

「ＣＤＲ移植抗体」という用語は、１つの種に由来する重鎖および軽鎖可変領域配列を含むが、ＶＨおよび／またはＶＬのＣＤＲ領域の１つまたは複数の配列が、別の種のＣＤＲ配列に置き換えられている抗体、例えば、マウスＣＤＲの１つまたは複数（例えば、ＣＤＲ３）がヒトＣＤＲ配列で置き換えられているマウス重鎖および軽鎖可変領域を有する抗体を指す。

【0074】

本明細書で提供される組換えヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有し、また定常領域を含んでいてもよい。(Kabat et al. (1991) supraを参照されたい)。しかしながら、ある特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列に対してトランスジェニックである動物が使用される場合は、ｉｎ ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）を受け、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来および関連しているが、ｉｎ ｖｉｖｏではヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しなくてもよい配列である。しかしながら、ある特定の実施形態では、そのような組換え抗体は、選択的突然変異誘発もしくは復帰突然変異またはその両方の結果である。

【0075】

「復帰突然変異」という用語は、ヒト抗体の体細胞突然変異アミノ酸の一部またはすべてが、相同性生殖系列抗体配列の対応する生殖系列残基で置き換えられるプロセスを指す。本明細書に記載のヒト抗体の重鎖配列および軽鎖配列を、ＶＢＡＳＥデータベースの生殖系列配列と別々にアラインして、最も高い相同性を有する配列を特定する。ＶＢＡＳＥは、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータライブラリーの最新リリースを含む公開配列から収集されたすべてのヒト生殖系列可変領域配列の包括的な要覧である。このデータベースは、配列決定されたヒト抗体遺伝子の保管庫としてＭＲＣタンパク質工学センター（ケンブリッジ、英国）で開発された（ウェブサイト: mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-intro.php?menu=901）。本明細書に記載の抗体における差異を、そのような異なるアミノ酸をコードする規定のヌクレオチド位置を突然変異させることにより、生殖系列配列へと復帰させる。復帰突然変異の候補としてこのようにして特定された各アミノ酸の役割は、抗原結合における直接的または間接的な役割について調査されるべきであり、ヒト抗体の任意の望ましい特質に影響を及ぼす、突然変異後に見出されるあらゆるアミノ酸は、最終的なヒト抗体に含まれるべきではない。復帰突然変異を受けるアミノ酸の数を最小限に抑えるために、最も近い生殖系列配列とは異なるが、第２の生殖系列配列の対応するアミノ酸と同一であることが見出されたアミノ酸位置は、第２の生殖系列配列が、問題のアミノ酸の両側の少なくとも１０個、好ましくは１２個のアミノ酸に関してヒト抗体の配列と同一および共線性である限り、そのままであってもよい。復帰突然変異は、抗体最適化のいずれの段階でも生じる可能性がある。

【0076】

「標識結合タンパク質」は、抗体または抗体部分が、誘導体化されているかまたは別の機能性分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に連結されているタンパク質である。例えば、標識結合タンパク質は、抗体または抗体部分を、別の抗体（例えば、二重特異性抗体またはダイアボディ）、検出可能な作用剤、細胞傷害剤、医薬品、および／または抗体もしくは抗体部分と別の分子（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグなど）との会合を媒介することができるタンパク質もしくはペプチドなどの、１つまたは複数の他の分子実体に機能的に連結する（化学カップリングにより、遺伝子融合により、非共有結合的会合により、または別様に）ことにより導出することができる。

【0077】

本明細書で使用される場合、「グリコシル化結合タンパク質」は、抗体またはその抗原結合性断片が１つまたは複数の炭水化物残基を含むタンパク質を含む。初期ｉｎ ｖｉｖｏタンパク質産生では、翻訳後修飾として知られているさらなるプロセスが起きる可能性がある。特に、糖（グリコシル）残基が酵素的に付加される可能性があり、これはグリコシル化として知られているプロセスである。得られたタンパク質は、共有結合で連結されたオリゴ糖側鎖を有し、グリコシル化タンパク質または糖タンパク質として知られている。抗体は、Ｆｃドメインならびに可変ドメインに１つまたは複数の炭水化物残基を有する糖タンパク質である。Ｆｃドメインの炭水化物残基は、Ｆｃドメインのエフェクター機能に重要な効果を示し、抗原結合または抗体の半減期に対する効果は最小限である（R, Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16）。対照的に、可変ドメインのグリコシル化は、抗体の抗原結合活性に対して効果を示す可能性がある。可変ドメインのグリコシル化は、おそらくは立体障害のため抗体結合親和性に否定的な効果を示すか（Co, M. S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367）または抗原に対する親和性の増加をもたらす可能性がある（Wallick, S. C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109；Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717 2723）。さらに、結合タンパク質のＯ結合型またはＮ結合型グリコシル化部位が突然変異されているグリコシル化部位突然変異体を製作することができる。当業者であれば、標準的な周知の技術を使用してそのような突然変異体を生成することができる。生物学的活性を保持しているが、結合活性が増加または減少されているグリコシル化部位突然変異体も企図される。

【0078】

さらに、抗体または抗原結合性断片のグリコシル化を修飾することができる。例えば、非グリコシル化抗体を製作することができる（つまり、抗体はグリコシル化を欠如する）。グリコシル化を変更して、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させることができる。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を変更することにより達成することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域グリコシル化部位の排除をもたらす１つまたは複数のアミノ酸置換をなし、それによりその部位でのグリコシル化を排除することができる。そのようなグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させることができる。そのような手法は、国際出願公開第０３／０１６４６６号Ａ２パンフレット、米国特許第５，７１４，３５０号明細書および第６，３５０，８６１号明細書にさらに詳細に記載されており、こうした文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0079】

加えてまたは代替的に、フコシル残基の量が低減された低フコシル化抗体またはバイセクトＧｌｃＮＡｃ構造（bisecting GlcNAc structure）が増加された抗体など、変更されたタイプのグリコシル化を有する修飾抗体を製作することができる。そのようなグリコシル化パターンの変更は、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが示されている。そのような炭水化物修飾は、例えば、グリコシル化機構が変更された宿主細胞にて抗体を発現させることにより達成することができる。グリコシル化機構が変更された細胞は、当該技術分野に記載されており、組換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が変更された抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。（例えば、Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740；Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1、ならびに欧州特許第１，１７６，１９５号明細書；国際出願公開第０３／０３５８３５号パンフレットおよび国際公開第第９９／５４３４２８０号パンフレットを参照。こうした文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。）

【0080】

タンパク質グリコシル化は、目的のタンパク質のアミノ酸配列、ならびにタンパク質が発現される宿主細胞に依存する。生物が異なれば、異なるグリコシル化酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼ）が産生され、利用可能な基質（ヌクレオチド糖）が異なる。そのような要因により、タンパク質グリコシル化パターンおよびグリコシル残基の組成は、特定のタンパク質が発現される宿主系に依存して異なる場合がある。本発明に有用なグリコシル残基としては、これらに限定されないが、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、ｎ－アセチルグルコサミン、およびシアル酸を挙げることができる。好ましくは、グリコシル化結合タンパク質は、グリコシル化パターンがヒトであるようなグリコシル残基を含む。

【0081】

当業者であれば、異なるタンパク質グリコシル化は、異なるタンパク質特質をもたらす可能性があることは公知である。例えば、酵母などの微生物宿主で産生され、酵母内因性経路を使用してグリコシル化された療法用タンパク質の有効性は、ＣＨＯ細胞株などの哺乳動物細胞で発現される同じタンパク質の有効性と比較して低減される可能性がある。そのような糖タンパク質は、ヒトにおいても免疫原性であり、投与後のｉｎ ｖｉｖｏ半減期の低減を示す可能性もある。ヒトおよび他の動物の特定の受容体は、特定のグリコシル残基を認識し、そのタンパク質の血流からの迅速なクリアランスを促進することができる。他の有害効果としては、タンパク質フォールディング、溶解度、プロテアーゼに対する感受性、輸送、運搬、区画化、分泌、他のタンパク質もしくは因子による認識、抗原性、またはアレルギー誘発性の変化を挙げることができる。したがって、専門家は、グリコシル化の特定の組成およびパターン、例えばヒト細胞または意図されている対象動物の種特異的細胞で産生されるものと同一のまたは少なくとも類似したグリコシル化組成およびパターンを有する療法用タンパク質を選ぶ可能性がある。

【0082】

細胞のその宿主とは異なるグリコシル化タンパク質の発現は、異種性グリコシル化酵素を発現するように宿主細胞を遺伝子改変することにより達成することができる。専門家であれば、当技術分野で公知の技術を使用して、ヒトタンパク質グリコシル化を呈する抗体またはその抗原結合性断片を生成することができる。例えば、酵母菌株は、そうした酵母菌株で産生されるグリコシル化タンパク質（糖タンパク質）が、動物細胞、特にヒト細胞のものと同一のタンパク質グリコシル化を呈するように、天然に存在しないグリコシル化酵素を発現するように遺伝子改変されている（米国特許出願公開第２００４００１８５９０号明細書および第２００２０１３７１３４号明細書、ならびに国際出願公開第０５／１００５８４号Ａ２パンフレット）。

【0083】

さらに、当業者であれば、ライブラリーのメンバー宿主細胞が、バリアントグリコシル化パターンを有する目的のタンパク質を産生するように、種々のグリコシル化酵素を発現するように遺伝子操作された宿主細胞のライブラリーを使用して目的のタンパク質を発現することができることを理解するだろう。次いで、専門家であれば、特定の新規グリコシル化パターンを有する目的のタンパク質を選択および単離することができる。好ましくは、特に選択された新規グリコシル化パターンを有するタンパク質は、生物学的特性の向上または変更を呈する。

【0084】

「活性」という用語は、抗原に対する抗体の結合特異性／親和性などの活性を含む。

【0085】

本開示の目的では、配列の「断片」は、指定のヌクレオチド配列の領域に対応する、およそ少なくとも６個、好ましくは少なくとも約８個、より好ましくは少なくとも約１０個、さらにより好ましくは少なくとも約１５個ヌクレオチドの連続配列であると定義される。

【0086】

「同一性」という用語は、特定の比較ウィンドウまたはセグメントにわたる、ヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとの２つの配列の関連性を指す。したがって、同一性は、２つのＤＮＡセグメント（または２つのアミノ酸配列）の同じ鎖（センスまたはアンチセンスのいずれか）間の同様性、対応性、または同等性の度合いであると定義される。「配列同一性のパーセンテージ」は、特定の領域にわたって最適にアラインされた２つの配列を比較し、一致位置の数を得るために、同一の塩基またはアミノ酸が両配列に存在する位置の数を決定し、その数を、比較されているセグメントの位置の総数で除算し、その結果に１００を乗算することにより計算される。配列の最適なアラインメントは、Smith & Waterman, Appl. Math. 2:482 (1981)のアルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)のアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988)の方法により、および関連アルゴリズムを実装したコンピュータープログラム（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｍａｃａｗ Ｐｉｌｅｕｐ(Higgins et al., CABIOS. 5L151-153 (1989))、ＦＡＳＴＤＢ(Intelligenetics)、ＢＬＡＳＴ(National Center for Biomedical Information; Altschul et al., Nucleic Acids Research 25:3389-3402 (1997))、ＰＩＬＥＵＰ(Genetics Computer Group, Madison, Wis.)、またはＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ (Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, Madison, Wis.)により実施することができる（米国特許第５，９１２，１２０号明細書を参照）。

【0087】

本開示の目的では、「相補性」は、２つのＤＮＡセグメント間の関連性の度合いであると定義される。相補性は、一方のＤＮＡセグメントのセンス鎖が、適切な条件下で、他方のＤＮＡセグメントのアンチセンス鎖とハイブリダイズして、二重らせんを形成する能力を測定することにより決定される。「相補体」は、標準塩基対合規則に基づき所与の配列と対合する配列であると定義される。例えば、一方のヌクレオチド鎖の配列のＡ－Ｇ－Ｔは、他方のヌクレオチド鎖のＴ－Ｃ－Ａと「相補性」である。

【0088】

２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、両配列に一連の同一のならびに保存されたアミノ酸残基が存在することであると定義される。２つのアミノ酸配列間の類似性の度合いが高いほど、２つの配列の対応性、同様性、または同等性は高くなる。（「２つのアミノ酸配列間の同一性は、一連の全く同じかまたは不変のアミノ酸残基が両配列に存在することであると定義される。」）「相補性」、「同一性」、および「類似性」の定義は、当業者であれば周知である。

【0089】

「によりコードされる」は、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、ポリペプチド配列またはその部分は、核酸配列によりコードされるポリペプチドに由来する少なくとも３個アミノ酸、より好ましくは少なくとも８個アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも１５個アミノ酸のアミノ酸配列を含む。

【0090】

さらに、核酸分子の一本鎖形態が温度およびイオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニーリングすることができる場合、核酸分子は別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である（Sambrook et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)を参照）。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。

【0091】

「ハイブリダイゼーション」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、プローブ配列および標的配列の性質に応じて、当業者であれば容易に明らかになるようなストリンジェンシーの適切な条件での核酸のハイブリダイゼーションを意味するために使用される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は当技術分野で周知であり、インキュベーション時間、温度、および／または溶液のイオン強度を変えることにより、所望のストリンジェンシーに応じた条件の調整は容易に達成される。例えば、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold spring harbor Press, Cold Spring harbor, N.Y., 1989を参照。この文献は上述の通り、参照により本明細書に組み込まれる。（また、Short Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al.およびTijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993)を参照。両文献とも参照により本明細書に組み込まれる）。具体的には、条件の選択は、ハイブリダイズされる配列の長さ、特にプローブ配列の長さ、核酸の相対的ＧＣ含有量、および許容されるミスマッチの量により決定される。より低い度合いの相補性を有する鎖間の部分的なハイブリダイゼーションが所望の場合、低ストリンジェンシー条件が好ましい。完全なまたはほぼ完全な相補性が所望の場合、高ストリンジェンシー条件が好ましい。典型的な高ストリンジェンシー条件では、ハイブリダイゼーション溶液は、６×Ｓ．Ｓ．Ｃ．、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、１×デンハート液、および０．５％ＳＤＳを含む。ハイブリダイゼーションは、クローニングしたＤＮＡの断片の場合は約３～４時間、全真核生物ＤＮＡの場合は約１２～約１６時間、摂氏約６８度で実施される。中程度のストリンジェンシーの場合、３×塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、５０％ホルムアミド（ｐＨ７．５ではこの緩衝液の０．１Ｍ）、および５×デンハート液の溶液でのフィルタープレハイブリダイゼーション（filter pre-hybridizing）およびハイブリダイゼーションを使用することができる。次いで、摂氏３７度で４時間プレハイブリダイゼーションし、続いて３，０００，０００ｃｐｍに等しい量の標識プローブを用いて摂氏３７度で合計１６時間ハイブリダイゼーションし、続いて２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ溶液で洗浄し、室温で各回１分間の洗浄を４回行い、摂氏６０度で各回３０分間の洗浄を４回行ってもよい。乾燥後、フィルムに曝露する。より低いストリンジェンシーの場合、ハイブリダイゼーションの温度を、二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を摂氏約１２度下回る温度に低減させる。Ｔｍは、ＧＣ含有量および二本鎖長ならびに溶液のイオン強度の関数であることが知られている。

【0092】

「ハイブリダイゼーション」には、２つの核酸が相補的な配列を含むことが必要である。しかしながら、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間にはミスマッチがあってもよい。上述のように、核酸のハイブリダイゼーションに適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の度合いに依存する。そのような変数は当技術分野で周知である。より具体的には、２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の度合いが大きくなるほど、そうした配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。１００ヌクレオチド長よりも長いハイブリッドの場合、Ｔｍを計算する数式が導出されている（Sambrook et al., supraを参照）。より短い核酸とのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Sambrook et al., supraを参照）。

【0093】

本明細書で使用される場合、「単離された核酸断片または配列」は、任意選択で、合成、非天然、または改変ヌクレオチド塩基を含む、一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形態の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１つまたは複数のセグメントで構成されていてもよい。（指定のポリヌクレオチドの「断片」は、指定のヌクレオチド配列の領域と同一または相補的なおよそ少なくとも約６個ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約８個ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約１０個ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約１５個ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約２５ヌクレオチドの連続配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。）ヌクレオチド（通常は５’－一リン酸形態で見出される）は、以下のように１文字指定で参照される：「Ａ」はアデニル酸またはデオキシアデニル酸（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡ）、「Ｃ」はシチジル酸またはデオキシシチジル酸、「Ｇ」はグアニル酸またはデオキシグアニル酸、「Ｕ」はウリジル酸、「Ｔ」はデオキシチミジル酸、「Ｒ」はプリン（ＡまたはＧ）、「Ｙ」はピリミジン（ＣまたはＴ）、「Ｋ」はＧまたはＴ、「Ｈ」はＡまたはＣまたはＴ、「Ｉ」はイノシン、および「Ｎ」は任意のヌクレオチドを表す。

【0094】

「機能的に同等である断片または部分断片」および「機能的に同等の断片または部分断片」という用語は、本明細書では同義的に使用される。こうした用語は、断片または部分断片が活性酵素をコードするか否かに関わりなく、遺伝子発現を変更する能力またはある特定の表現型を産生する能力が保持されている、単離された核酸断片の一部分または部分配列を指す。例えば、断片または部分断片をキメラ構築物の設計に使用して、形質転換植物において所望の表現型を産生することができる。活性酵素をコードするか否かに関わらず、核酸断片またはその部分断片を、植物プロモーター配列に対して適切な方向性で連結することにより、共抑制またはアンチセンスに使用するためのキメラ構築物を設計することができる。

【0095】

「相同性」、「相同性の」、「実質的に類似する」、および「実質的に対応する」という用語は、本明細書では同義的に使用される。こうした用語は、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介するかまたはある特定の表現型を産生する核酸断片の能力に影響を及ぼさない核酸断片を指す。また、こうした用語は、初期の未修飾断片と比べて、得られた核酸断片の機能特性を実質的に変更しない、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入などの、本発明の核酸断片の修飾を指す。したがって、当業者であれば理解することになるように、本発明は、特定の例示的配列よりも多くを包含することが理解される。

【0096】

「遺伝子」は、コード配列の前（５’非コード配列）および後（３’非コード配列）に調節配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。

【0097】

「天然遺伝子」は、それ自体の調節配列を有する自然界に見出される遺伝子を指す。対照的に、「キメラ構築物」は、自然界では通常は一緒に見出されることがない核酸断片の組合せを指す。そのため、キメラ構築物は、異なる供給源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ供給源に由来するが自然界で通常見出されるものとは異なる様式で配置されている制御配列およびコード配列を含んでいてもよい。（「単離された」という用語は、配列がその天然の環境から取り出されていることを意味する。）

【0098】

「外来性」遺伝子は、宿主生物には通常見出されないが、遺伝子導入により宿主生物に導入されている遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物またはキメラ構築物に挿入された天然遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順によりゲノムに導入されている遺伝子である。

【0099】

「コード配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、その内部、またはその下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列としては、これらに限定されないが、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列を挙げることができる。

【0100】

「プロモーター」または「調節遺伝子配列」は、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。この配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントはエンハンサーと呼ばれることが多い。そのため、「エンハンサー」は、プロモーターまたは調節遺伝子配列の活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの固有エレメントであってもよくまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種性エレメントであってもよい。また、プロモーター配列は、遺伝子の転写部分内部におよび／または転写配列の下流に位置してもよい。プロモーターは、それらの全体が天然遺伝子に由来してもよく、または自然界に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントで構成されていてもよく、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。当業者であれば、異なるプロモーターは、異なる組織もしくは細胞タイプにおいて、または異なる発生段階において、または異なる環境条件に応答して遺伝子の発現を指図することができることが理解される。ほとんどの宿主細胞タイプにおいてほとんどの時間で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般的に「構成的プロモーター」と呼ばれる。植物細胞に有用な種々のタイプの新しいプロモーターが絶えず発見されている。数多くの例を、Okamuro and Goldberg, Biochemistry of Plants 15:1-82 (1989)に見出すことができる。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全に画定されていないため、一部の変異を有するＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する可能性があることが認識されている。

【0101】

「イントロン」は、タンパク質配列の一部分をコードしない遺伝子内の介在配列である。したがって、そのような配列はＲＮＡへと転写されるが、その後切除され、翻訳されない。この用語は、切除されたＲＮＡ配列にも使用される。「エキソン」は、転写される遺伝子配列の一部分であり、その遺伝子に由来する成熟メッセンジャーＲＮＡに見出されるが、必ずしも最終的な遺伝子産物をコードする配列の一部である必要はない。

【0102】

「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置するＤＮＡ配列を指す。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の上流の完全にプロセシングされたｍＲＮＡに存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写物のｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡ安定性、または翻訳効率に影響を及ぼす可能性がある。翻訳リーダー配列の例は記載されている（Turner, R. and Foster, G. D. (1995) Molecular Biotechnology 3:225）。

【0103】

「３’非コード配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの追加に影響を及ぼすことにより特徴付けられる。異なる３’非コード配列の使用は、Ingelbrecht et al., Plant Cell 1:671-680 (1989)により例示されている。

【0104】

「ＲＮＡ転写物」は、ＲＮＡポリメラーゼ触媒性のＤＮＡ配列転写からもたらされる産物を指す。ＲＮＡ転写物は、ＤＮＡ配列の完全な相補性コピーである場合は一次転写物と呼ばれるか、またはＲＮＡ転写物は、一次転写物の転写後プロセシングに由来するＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを有さず、細胞によりタンパク質へと翻訳され得るＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡテンプレートに対して相補性であり、酵素逆転写酵素を使用してｍＲＮＡテンプレートから合成されるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは一本鎖であってもよく、またはＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片を使用して二本鎖形態に変換されていてもよい。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含むＲＮＡ転写物を指し、細胞内またはｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質へと翻訳され得る。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的一次転写物またはｍＲＮＡのすべてまたは一部に相補的であり、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物の任意の部分、つまり５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン、またはコード配列に対するものであってもよい。「機能的ＲＮＡ」は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、または翻訳されなくてもよいが細胞プロセスに影響を及ぼす他のＲＮＡを指す。「相補体」および「逆相補体」という用語は、ｍＲＮＡ転写物に関して本明細書では同義的に使用され、メッセージのアンチセンスＲＮＡを画定することが意図される。

【0105】

「内因性ＲＮＡ」という用語は、天然に存在するかまたは天然に存在しない、つまり、組換え手段、突然変異誘発などにより導入されたかに関わらず、本明細書で提供される組換え構築物による形質転換前の宿主のゲノムに存在する任意の核酸配列によりコードされる任意のＲＮＡを指す。

【0106】

「天然に存在しない」という用語は、自然界に通常見出されるものと一致しない、人工的なものを意味する。

【0107】

「作動可能に連結した」という用語は、一方の機能が他方により調節されるように、単一の核酸断片上で核酸配列が付随していることを指す。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を調節することが可能な場合（つまり、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コード配列に作動可能に連結している。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結していてもよい。別の例では、相補的ＲＮＡ領域は、直接的または間接的のいずれかで、標的ｍＲＮＡの５’に、もしくは標的ｍＲＮＡの３’に、もしくは標的ｍＲＮＡ内部に作動可能に連結していてもよく、または第１の相補的領域は標的ｍＲＮＡの５’側であり、その相補体は標的ｍＲＮＡの３’側である。

【0108】

「発現」という用語は、本明細書で使用される場合、機能的な最終産物の産生を指す。遺伝子の発現には、遺伝子の転写およびｍＲＮＡの前駆体または成熟タンパク質への翻訳が伴う。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能なアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「共抑制」は、同一のまたは実質的に類似した外来性遺伝子または内因性遺伝子の発現を抑制することが可能なセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書）。

【0109】

「成熟」タンパク質は、翻訳後にプロセシングされたポリペプチドを指す。つまり、一次翻訳産物に存在するプレペプチドまたはプロペプチドが除去されたものである。「前駆体」タンパク質は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物を指す。つまり、プレペプチドおよびプロペプチドは依然として存在している。プレペプチドおよびプロペプチドは、細胞内局在化シグナルであってもよいが、それに限定されない。

【0110】

「安定的形質転換」は、宿主生物のゲノムへの核酸断片の移入を指し、遺伝子的に安定した遺伝がもたらされる。対照的に、「一過性形質転換」は、宿主生物の核またはＤＮＡ含有細胞小器官への核酸断片の移入を指し、組込みまたは安定的な遺伝を伴わない遺伝子発現がもたらされる。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック」生物と呼ばれる。「形質転換」という用語は、本明細書で使用される場合、安定的形質転換および一過性形質転換の両方を指す。

【0111】

本明細書で使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当技術分野で周知であり、Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, 1989 (以降は「Sambrook」)により詳細に記載されている。

【0112】

「組換え」という用語は、例えば、化学合成により、または遺伝子工学技法による核酸の単離されたセグメントを操作することにより、２つのそうでなければ分離されている配列のセグメントを人為的に組み合わせることを指す。

【0113】

「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、大量の特定のＤＮＡセグメントを合成するための技法であり、一連の反復サイクルからなる（Perkin Elmer Cetus Instruments, Norwalk, Conn.）。典型的には、二本鎖ＤＮＡを熱変性させ、標的セグメントの３’境界に相補的な２つのプライマーを低温でアニーリングさせ、次いで中間温度で伸長させる。この連続する３つのステップの１セットをサイクルと呼ぶ。

【0114】

ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）は、鋳型を繰り返して複製することにより、ＤＮＡを短時間で何百万倍も増幅するために使用される強力な技法である。（Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986)；Ｅｒｌｉｃｈら、欧州特許出願第５０，４２４号明細書；欧州特許出願第８４，７９６号明細書；欧州特許出願第２５８，０１７号明細書；欧州特許出願第２３７，３６２号明細書；Ｍｕｌｌｉｓ、欧州特許出願第２０１，１８４号明細書；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；Ｅｒｌｉｃｈ、米国特許第４，５８２，７８８号明細書；およびＳａｉｋｉら、米国特許第４，６８３，１９４号明細書）。このプロセスでは、特定のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成オリゴヌクレオチドのセットを使用してＤＮＡ合成を開始させる。プライマーの設計は、分析しようとするＤＮＡの配列に依存する。この技法は、高温で鋳型を融解させ、プライマーが鋳型内の相補的配列にアニーリングすることを可能にさせ、次いでＤＮＡポリメラーゼで鋳型を複製するというサイクルを数多く（通常は２０～５０回）行うことにより実施される。

【0115】

ＰＣＲ反応の産物は、アガロースゲルで分離し、続いて臭化エチジウム染色およびＵＶ透照により視覚化することにより分析される。代替的に、標識を産物に組み込むために、放射性ｄＮＴＰをＰＣＲに追加してもよい。この場合、ＰＣＲの産物は、ゲルをＸ線フィルムに曝露することにより視覚化される。ＰＣＲ産物を放射性標識することの追加の利点は、個々の増幅産物のレベルを定量化することができることである。

【0116】

「組換え構築物」、「発現構築物」、および「組換え発現構築物」という用語は、本明細書では同義的に使用される。こうした用語は、当業者に周知の標準的な方法論を使用して細胞のゲノムに挿入することができる遺伝物質の機能単位を指す。そのような構築物は、それ自体で使用してもよく、ベクターと併せて使用してもよい。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知のように宿主植物を形質転換するために使用されることになる方法に依存する。例えば、プラスミドを使用することができる。当業者であれば、本明細書に記載の単離された核酸断片のいずれかを含む宿主細胞の形質転換、選択、および増殖を成功させるためにベクターに存在しなければならない遺伝子エレメントを十分に承知している。当業者であれば、異なる独立した形質転換事象は異なる発現レベルおよびパターンをもたらし（Jones et al., (1985) EMBO J. 4:2411-2418；De Almeida et al., (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86）、したがって、所望の発現レベルおよびパターンを示す系統を得るためには、複数の事象をスクリーニングしなければならないことも認識しているだろう。そのようなスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウエスタン分析、または表現型分析により達成することができる。

【0117】

本明細書で提供される物質（抗体など）について使用される「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、天然源に含まれている可能性のある少なくとも１つの他の物質を実質的に含まないことを示す。したがって、「単離された抗体」および「精製された抗体」は、抗体（タンパク質）が由来する細胞源または組織源に由来する炭化水素、脂質、または他の夾雑タンパク質などの細胞物質を実質的に含まない抗体を指す。抗体が化学的に合成されている場合、この用語は、化学前駆体物質または他の化学物質を実質的に含まない抗体を指す。好ましい実施形態では、本発明の抗体は単離されているかまたは精製されている。

【0118】

抗体を製作するための方法
また、本発明は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物を本明細書に記載のペプチド免疫原で免疫することにより、非ヒト非マウス動物からモノクローナル抗体を製作するための方法を提供する。当技術分野で公知の方法を使用してそのような動物を生み出すことができる。好ましい実施形態では、非ヒト動物は、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマであってもよい。抗体産生不死化ハイブリドーマを、免疫動物から調製することができる。免疫化後、動物を犠牲にし、当技術分野で周知のように脾臓Ｂ細胞を不死化骨髄腫細胞と融合させる。例えば、上記のHarlow and Laneを参照されたい。好ましい実施形態では、骨髄腫細胞は、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌細胞株）。融合および抗生物質選択の後、抗原（例えば、グロブロマー）もしくはその部分、または目的の抗原を発現する細胞を使用して、ハイブリドーマをスクリーニングする。好ましい実施形態では、初期スクリーニングは、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、好ましくはＥＬＩＳＡを使用して実施される。ＥＬＩＳＡスクリーニングの例は、国際出願公開第００／３７５０４号パンフレットに提供されている。この文献は参照により本明細書に組み込まれる。

【0119】

抗体産生ハイブリドーマを選択し、クローニングし、下記でさらに考察されているように、ロバストなハイブリドーマ増殖、高い抗体産生、および望ましい抗体特質を含む望ましい特質についてさらにスクリーニングする。ハイブリドーマは、ｉｎ ｖｉｖｏでは、同系動物、免疫系を欠如する動物、例えばヌードマウスにおいて、またはｉｎ ｖｉｔｒｏでは細胞培養において培養および拡大増殖させることができる。ハイブリドーマを選択、クローニング、および拡大増殖させる方法は、当業者に周知である。好ましくは、免疫動物はヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する非ヒト動物であり、脾臓Ｂ細胞は非ヒト動物と同じ種に由来する骨髄腫に融合される。

【0120】

一態様では、本発明は、アルツハイマー病の治療、診断、および予防に使用されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。好ましい実施形態では、ハイブリドーマはマウスハイブリドーマである。別の好ましい実施形態では、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、またはウマなどの非ヒト非マウス種において産生される。別の実施形態では、ハイブリドーマは、ヒト非分泌性骨髄腫が、グロブロマーに対する抗体を発現するヒト細胞と融合されたヒトハイブリドーマである。

【0121】

組換え抗体は、米国特許第５，６２７，０５２号明細書、国際出願公開第９２／０２５５１号パンフレット、およびBabcock, J. S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848に記載のような、当該技術分野では選択リンパ球抗体法（ＳＬＡＭ、selected lymphocyte antibody method）と呼ばれる手順を使用して、単一の単離されたリンパ球から生成することができる。この方法では、目的の抗体を分泌する単一細胞（例えば、免疫動物に由来するリンパ球）を、抗原（例えば、グロブロマー）またはその断片がビオチンなどのリンカーを使用してヒツジ赤血球にカップリングされており、抗原に対して特異性を有する抗体を分泌する単一細胞を特定するために使用される抗原特異的溶血斑アッセイを使用してスクリーニングする。目的の抗体分泌細胞を特定した後、重鎖および軽鎖可変領域ｃＤＮＡを逆転写酵素ＰＣＲにより細胞からレスキューし、次いでこうした可変領域を、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞などの哺乳類宿主細胞において、適切な免疫グロブリン定常領域（例えば、ヒト定常領域）の背景で発現させることができる。次いで、ｉｎ ｖｉｖｏ選択されたリンパ球に由来する増幅された免疫グロブリン配列でトランスフェクトした宿主細胞を、例えば、トランスフェクトされた細胞をパニングしてＩＬ－１８に対する抗体を発現する細胞を単離することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのさらなる分析および選択にかけることができる。増幅された免疫グロブリン配列を、国際出願公開第９７／２９１３１号パンフレットおよび国際出願公開第００／５６７７２号パンフレットに記載のものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟法などにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏでさらに操作することができる。

【0122】

「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することが可能なあらゆるポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基としては、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリ（phosphory）、またはスルホニルなどの、分子の化学的活性表面群が挙げられ、ある特定の実施形態では、特定の三次元構造特質および／または特定の電荷特質を有していてもよい。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。ある特定の実施形態では、抗体は、タンパク質および／または巨大分子の複雑な混合物中でその標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると言われる。

【0123】

「免疫する」という用語は、本明細書では、免疫レパートリーが、天然の遺伝子的に未改変の生物に存在するか、または人工ヒト免疫レパートリーを提示するように改変されたトランスジェニック生物に存在するかに関わらず、そのレパートリーに抗原を提示するプロセスを指す。同様に、「免疫原性調製物」は、抗原の免疫原性を増強することになるアジュバントまたは他の添加剤を含む抗原の配合物である。その例は、精製されたペプチドまたはペプチド免疫原を完全フロイントアジュバンと共にマウスに同時注射することであると考えられ、一部の実施形態では、アジュバントはペプチドに共有結合で連結されている。本明細書で定義される「超免疫化」は、強力な免疫応答を発現させることを目的として、免疫原性調製物中の抗原を宿主動物へと連続して複数回提示する行為である。

【0124】

また、本主題の発明は、上記に記載の完全長抗体だけでなく、それらの部分または断片、例えばそれらのＦａｂ部分も含むことが留意されるべきである。加えて、本主題の発明は、例えば、結合特異性、構造などの点で本発明の抗体と同じ特性を有するあらゆる抗体を包含する。

【0125】

「抗体」は、同じ構造的特質を有する糖タンパク質を指す。抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示す。本明細書では、「抗原」は、対応する抗体に結合し、ｉｎ ｖｉｖｏで抗原－抗体反応を誘導する能力を有するタンパク質を指す。

【0126】

アミロイドの主成分であるＡタンパク質は、４０～４２個アミノ酸からなるペプチドであり、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）と呼ばれる前駆体タンパク質からプロテアーゼの作用により産生されることが知られている。超遠心分離された沈降物画分に収集されたアミロイド原線維の他に、ＡＰＰから産生されるアミロイド分子は、可溶性単量体に加えて多量体非線維性アセンブリを含む。「Ａβ多量体」は、非線維性アセンブリを指し、これには、例えば、Ａβ４０（Ａβ１～４０）多量体およびＡβ４２（Ａβ１～４２）多量体またはそれらの組合せを挙げることができる。例えば、本明細書に記載の「Ａβ４２多量体」は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは４５～１６０ｋＤａ、Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥでは２２．５～１，０３５ｋＤａの分子量を示す分子である。モレキュラーシーブを使用すると、こうした分子は、主に＞１００ｋＤａ保持溶液に収集される。原子間力顕微鏡で観察すると、こうした分子は、高さ１．５～３．１ｎｍの粒状、ビーズ状、およびリング状の分子が混在した形態学的特徴を示す。ゲル濾過法では、６８０ｋＤａまたはそれよりも高い分子量を有する分子を空隙容積画分８に、１７～４４ｋＤａの分子量を有する分子を画分１５に溶出させることができる。

【0127】

Ａβ多量体に結合するがＡβ単量体には結合しない限り、本明細書に記載の抗体の起源および形態には制限はない。

【0128】

モノクローナル抗体は、公知の技法を使用して産生することができる。例えば、モノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Nature 256: 495-7, 1975）により最初に記載されたハイブリドーマ法により、または組換えＤＮＡ法（Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-7, 1984）により産生することができるが、方法はこれらに限定されない。例えば、ハイブリドーマ法を使用する場合、Ａβ多量体（例えば実施例に記載のＡβ四量体）を感作抗原として使用し、従来の免疫化方法に従って免疫を実施する。得られた免疫細胞を、従来の細胞融合法により既知親細胞と融合させ、従来のスクリーニング方法を使用してモノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングおよび単離することができる。

【0129】

モノクローナル抗体は、以下のよう産生することができる。Ｂａｌｂ－ｃマウスを、任意選択で完全フロイントアジュバントを使用して乳化した本明細書に記載のペプチド免疫原で、抗原を足蹠に注射することにより免疫する。その後、追加免疫を、例えば６回実施する。次いで、例えばポリエチレングリコール１５００を使用してＳｐ２／Ｏ－Ａｇ１４細胞と融合させることにより、鼠径リンパ節からハイブリドーマを産生させる。

【0130】

感作抗原で免疫する動物には特に制限はないが、好ましくは、細胞融合に使用される親細胞との適合性を考慮して選択される。一般に、げっ歯動物、ウサギ目、または霊長類が使用される。げっ歯動物としては、例えば、マウス、ラット、およびハムスターが挙げられる。ウサギ目としては、例えばウサギが挙げられる。霊長類としては、例えば、カニクイザル（Macaca fascicularis）、アカゲザル（Macaca mulatta）、マントヒメザル、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（旧世界）サルが挙げられる。

【0131】

動物を、公知の方法に従って感作抗原で免疫する。例えば、標準的な方法としては、免疫は、感作抗原を哺乳動物に腹腔内または皮下注射することにより実施される。

【0132】

上述の免疫細胞と融合させる親細胞の例は、実施例で後述することになるＳｐ２／Ｏ－Ａｇ１４細胞である。しかしながら、種々の他の公知細胞株を使用することができる。

【0133】

上述の免疫細胞と骨髄腫細胞との細胞融合は、基本的には、例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ法（Kohler and Milstein C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46）を含む、公知の方法に従って実施することができる。

【0134】

このようにして得られたハイブリドーマを、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む、ＨＡＴ培養培地などの従来の選択培地で培養することにより選択する。上記で言及されているＨＡＴ培養培地での培養は、一般に、所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）を死滅させるのに十分な時間にわたって数日～数週間継続する。次に、従来の限界希釈法を実施して、所望の抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングおよびシングルクローニングする。

【0135】

その後、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔へと移植し、所望のモノクローナル抗体を含む腹水を抽出する。例えば、抗体は、親和性クロマトグラフィーを含むがそれに限定されないカラムクロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩沈殿、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、および等電点電気泳動の選択された組合せなどの従来のタンパク質分離および／または精製方法により、腹水から精製することができる（Antibodies: A Laboratory manual, Harlow and David, Lane (edit.), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。

【0136】

親和性カラムには、プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムを使用することができる。使用されるプロテインＡカラムの例としては、Ｈｙｐｅｒ Ｄ、ＰＯＲＯＳ、およびＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．(Ｐｈａｒｍａｃｉａ)が挙げられる。

【0137】

クロマトグラフィー（親和性クロマトグラフィーを除く）としては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーが挙げられる（“Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual”, Daniel R Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996）。クロマトグラフィーを実施する場合、ＨＰＬＣおよびＦＰＬＣなどの液相クロマトグラフィー法を使用することができる。

【0138】

このようにして調製されたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、従来の培養培地で継代培養してもよく、液体窒素中で長期保管してもよい。

【0139】

抗体産生のために、免疫原を使用してあらゆる哺乳動物を免疫することができる。しかしながら、ハイブリドーマを産生することによりモノクローナル抗体を調製する場合、好ましくは、ハイブリドーマ産生のために細胞融合で使用した親細胞との適合性が考慮される。

【0140】

一般に、げっ歯動物、ウサギ目、または霊長類が免疫化に使用される。げっ歯動物としては、例えば、マウス、ラット、およびハムスターが挙げられる。ウサギ目としては、例えばウサギが挙げられる。霊長類としては、例えば、カニクイザル（Macaca fascicularis）、アカゲザル（Macaca mulatta）、マントヒメザル、およびチンパンジーなどの狭鼻下目（旧世界）サルが挙げられる。

【0141】

ヒト抗体遺伝子レパートリーを有するトランスジェニック動物の使用は、当技術分野で公知である（Ishida et al., Cloning and Stem Cells 4: 91-102, 2002）。他の動物と同様に、ヒトモノクローナル抗体を得るには、トランスジェニック動物を免疫し、次いで動物から抗体産生細胞を収集し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを産生させ、こうしたハイブリドーマから抗タンパク質ヒト抗体を調製することができる（国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、第９４／０２６０２号パンフレット、第９４／２５５８５号パンフレット、第９６／３３７３５号パンフレット、および第９６／３４０９６号パンフレットを参照）。

【0142】

代替的に、がん遺伝子で不死化されたリンパ球を、モノクローナル抗体産生に使用することができる。例えば、ＥＢウイルスなどに感染させたヒトリンパ球などを、免疫原でｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫する。次に、免疫したリンパ球を、無制限に分裂可能なヒト由来骨髄腫細胞（Ｕ２６６など）と融合させ、したがって所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマが得られる（特開昭６３－１７６８８号公報（未審査の日本特許出願公開））。

【0143】

上述の方法のいずれかによりモノクローナル抗体を得たら、遺伝子工学法を使用して抗体を調製することもできる（例えば、Borrebaeck C A K and Larrick J W, Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publishers, UK, 1990を参照）。例えば、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化リンパ球など、抗原産生細胞から所望の抗体をコードするＤＮＡをクローニングし、次いでクローニングしたＤＮＡを適切なベクターに挿入し、ベクターを好適な宿主細胞に移植すること（ｔｒａｎｓｅｃｔｉｎｇ）により、組換え抗体を調製することができる。そのような組換え抗体も本発明に含まれる。

【0144】

診断のための方法、組成物、およびキット
可溶性ｏＡβが初期ＡＤ病態形成において中心的な役割を果たすという証拠が増えているにも関わらず、例えばヒト血漿においてｏＡβを非侵襲的に検出および定量化するための高感度で特異的な方法に対する大きな満たされていないニーズが存在する。合成Ａβ１－４０環状ペプチドを免疫原として使用することにより生成されたモノクローナル抗体１Ｇ５および７１Ａ１は、広範に特徴付けられており、本明細書に記載の多量体特異的イムノアッセイの開発に使用される。本明細書に示されているように、１）１Ｇ５および７１Ａ１は、Ａβ単量体に対する反応性を示さずに、ヒト脳、ＣＳＦ、および血漿から可溶性ｏＡβを認識し、２）７１Ａ１は、電気生理学的アッセイにおいて、ｏＡβを多く含むＡＤ脳抽出物のシナプス毒性を中和し、３）検出器としての３Ｄ６と対にして捕捉体としての７１Ａ１を使用する超高感度イムノアッセイは、０．６ｐｇ／ｍＬというより低いＬＬｏＱを達成し、ヒト脳、ＣＳＦ、および血漿中のｏＡβを低い変動係数（ＣＶ）で信頼性高く定量化する。血液中の内因性ヒトｏＡβを定量化する高感度で特異的なイムノアッセイが利用可能になれば、脳および生物流体におけるＡβの多量体化および解体の動的プロセスに関する将来の研究が可能になり、ｏＡβと、血液中のＡβ単量体［３２～３４］、タウ断片［３５、３６］、およびｐＴａｕ［３７～４３］を含む他の公知のＡＤバイオマーカーとの相関性が確立されるはずである。さらに、こうした知見は、７１Ａ１免疫反応性ｏＡβを中和することの潜在的な療法利益を裏付けている。まとめると、こうした進歩により、ＡＤにおけるｏＡβの病理学的役割に関する理解が深まり、アルツハイマー病および加齢性βアミロイドーシスにおける、アミロイドｂタンパク質のこの重要な病原性形態をモニターするための道が開かれることになる。

【0145】

合成および天然Ａβ多量体の検出が、約２０年前にアミロイド仮説を修正して以来［１、２］、ｏＡβを視覚化して、それらの構造がより小型の多量体種と部分的に重複する可能性のあるＡβ単量体および原線維と区別するためのより良好なツールを生成するための継続的な努力がなされてきた。脳内の不溶性Ａβ斑に比べてシナプス毒性がより強いＡβの形態であると考えられている可溶性ｏＡβを認識し、さらに中和するための試みとして、モノクローナル抗体が開発されている［３、４、１４］。それらの中で、モノクローナル抗体１Ｃ２２［２６］は、脳およびＣＳＦの両方のｏＡβに対して高度に特異的であることが示されている［３０、５３］。本発明者らは、以前に、Ｒｏｃｈｅ社の抗Ａβ抗体クレネズマブのＡＢＢＹおよびＢＬＡＺＥ第２相治験に参加したＡＤ対象１０４人のＣＳＦ中の１Ｃ２２陽性多量体を定量化し、１Ｃ２２／３Ｄ６アッセイで測定された多量体Ａβレベルは、高い割合のクレネズマブ治療患者において有意に減少したが、プラセボ群では体系的な変化は起こらなかったことが見出された［３１］。本発明者らは、こうしたデータに促されて、潜在的により高い結合力および特異性を有する、ｏＡβに対する新規抗体の試験にさらに取り組んだ。二量体立体構造を模倣する可能性のある環化Ａβペプチド免疫原を設計することにより、陽性クローン１Ｇ５および７１Ａ１は、免疫原および合成Ａβ多量体に対して高い結合能力および特異性を示した。この研究では、本発明者らは、こうした２つの新規抗体を、ａ）ｏＡβを特異的に認識する能力、ｂ）ヒト脳抽出物、ＣＳＦ、および血漿中のｏＡβを定量化する能力、およびｃ）ＡＤ大脳皮質に由来する拡散性Ａβ多量体のシナプス毒性を中和する能力に関して検証した。

【0146】

本発明者らは、まず、ＡＤ脳浸漬抽出物中のＡβアセンブリに結合する１Ｇ５および７１Ａ１の能力を調査した。こうした抽出物には、高度に拡散性およびシナプス毒性であるｏＡβ種が含まれていることが確認されている［１１］。本発明者らは、中間領域特異的抗体およびＮ末端（Ａｓｐ－１）特異的抗体の両方でプローブしたＩＰ免疫ブロットにより、およびＡβｘ－４０およびｘ－４２を検出するＥＬＩＳＡを使用したＩＰ－ＥＬＩＳＡにより調査したところ、１Ｇ５および７１Ａ１は両方ともＡβのプルダウンに成功したことを見出した。興味深いことに、多量体特異的ベンチマーク抗体１Ｃ２２［３０］と比較して、１Ｇ５および７１Ａ１は両方とも、ヒト脳浸漬抽出物中の可溶性Ａβ種に対して非常により低い結合能力を示した。同様に、本発明者らが、免疫組織化学によりこうした３つの抗体を比較したところ、１Ｇ５および７１Ａ１は、標準Ａβ抗体Ｄ５４Ｄ２による二重標識により確認して未固定クリオスタット切片において斑を認識した。３つの多量体優先抗体はすべて、未変性凍結切片のＡβ堆積を良好に染色したが、染色強度は、４％ＰＦＡにより切片を固定すると実質的に減退した。これは、こうした抗体が固定架橋に感受性の立体構造エピトープを認識することを示唆している。７１Ａ１および１Ｇ５は、１Ｃ２２よりも、脳内のＡβ堆積のより少ない部分を認識した。それにも関わらず、７１Ａ１は、ＡＤ脳浸漬抽出物により誘導される海馬ＬＴＰの阻害から保護する一貫した能力を示し、わずか３０分間で皮質片からの単純な拡散により得られた脳Ａβのごく一部（約１２％）が、回復可能なシナプス毒性の多くを付与するという以前の知見を補強した［１１］。さらに、ＡＤ浸漬抽出物から７１Ａ１で親和性精製したｏＡβは、強力なシナプス毒性を付与し、７１Ａ１は、ひいては、ＡＤ脳由来の可溶性ｏＡβの毒性を中和することができ、それはこの新しい抗体の魅力的な潜在的療法特性を示す。

【0147】

脳由来の可溶性Ａβに関するこうしたデータとは対照的に（図１Ｃ）、本発明者らのＩＰ－ＥＬＩＳＡは、以下のように、ＣＳＦにおけるＡβ結合能力の順位序列が逆転したことを示した：７１Ａ１＞１Ｇ５＞＞１Ｃ２２（図３Ａ）。脳浸漬抽出物とＣＳＦとの間のこの違いは顕著であり、脳とＣＳＦとの間で可溶性ｏＡβアセンブリに差異があることを示唆すると解釈することができる。さらに、こうしたｏＡβ優先抗体の３つすべては、Ａβ４０およびＡβ４２を等しく免疫沈降させた。これは、ＣＳＦ中のｏＡβは多様なＡβ単量体バリアントを含むことを示唆する。血漿などの生物流体から低レベルのｏＡβを免疫沈降よりも正確に定量化するために、本発明者らは、Ｅｒｅｎｎａ ＳＭＣｘＰＲＯプラットフォーム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）での超高感度サンドイッチイムノアッセイを開発し、捕捉抗体としての７１Ａ１および検出器抗体としての３Ｄ６（Ａβ Ａｓｐ－１ Ｎ末端に対する）を使用して、０．６ｐｇ／ｍＬのＬＬｏＱ、および低いアッセイ内ＣＶ％（＜１０％）により示される高い再現性、および優れた（約１００％）回収率を達成した（図４Ｄ）。ｏＡβに対する７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイの特異性は、７１Ａ１が、それらの単量体成分よりも合成ＡＤＤＬ［１］およびＳ２６Ｃ Ａβ１－４０二量体［４５］を強力に優先することにより示された（図４）。

【0148】

合成Ａβペプチドから調製したｏＡβに対する７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイの安定性および相対的多量体特異性をこのように検証した後、本発明者らは、ＡＤ脳浸漬抽出物の未変性ＳＥＣ画分に対してアッセイを実施し、アッセイが、以前に報告された多量体特異的１Ｃ２２／３Ｄ６アッセイと同様に［５３］、高ＭＷのＡβ多量体を認識し、Ａβ単量体を認識しないことを観察した（図５Ｃ、５Ｄ）。７１Ａ１／３Ｄ６アッセイの多量体特異性を確認した後、本発明者らは、ヒトＣＳＦおよび血漿中のｏＡβレベルの定量化へと進んだ。重要なことには、本発明者らは、ＣＳＦ中の７１Ａ１免疫反応性ｏＡβレベル（ｎ＝２９）が、ＣＬＩＡ承認のＡＤｍａｒｋアッセイで測定して、同じ試料中の総タウおよびｐＴ１８１タウと有意に相関していたことを見出した。しかしながら、本発明者らは、７１Ａ１／３Ｄ６シグナルとＡβ１－４２単量体レベルとの間の相関性を観察しなかった。

【0149】

次いで、本発明者らは、この研究の主な目標である、ヒト血漿に対する７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイの特徴付けに進んだ。血漿マトリックス干渉の効果を受けない血漿中ｏＡβの定量化の妥当性を示すために、本発明者らは、１）希釈回収率、２）３つの異なる天然Ａβ源（ヒト脳可溶性ホモジネート、ヒト脳浸漬抽出物、およびＣＳＦ）でのスパイク回収率、３）７１Ａ１、１Ｃ２２、および陰性対照抗体４－６４（ＨＩＶ糖タンパク質１２０に対して生じた）による免疫枯渇、および４）ＧｎＣｌ（ｏＡβを単量体へと迅速に解体する強力なカオトロピック塩）で処理した脳ホモジネート、ＣＳＦ、および血漿を調査した。７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイはこうした試験にすべてに合格し、１）血漿希釈およびスパイクイン実験の両方で最適な回収率を示し、２）７１Ａ１による免疫枯渇性シグナルを示したが、１Ｃ２２または対照抗体では示されず、３）３つすべての試料タイプのＧｎＣｌ処理後、７１Ａ１シグナルが顕著に減少または消失した。最後に、本発明者らは、認知的に正常なヒト対象７３名（人口統計データは表１）の血漿コホートに対して７１Ａ１／３Ｄ６アッセイを実施し、血漿中の７１Ａ１陽性多量体の平均（＋／－ＳＤ）濃度４３．３４±２９．０９ｐｇ／ｍＬを得た。

【0150】

本発明者らの研究は、幾つかの突出した知見を提供する。第一に、本発明者らは、天然ヒト多量体Ａβの立体構造エピトープを認識する新しい抗体の設計および詳細な特徴付けについて報告する。第二に、本発明者らは、１Ｇ５および７１Ａ１が、参照多量体優先抗体１Ｃ２よりも生物流体中のｏＡβに対して高い結合能力を有することを示す。第三に、７１Ａ１は、ＡＤ脳浸漬抽出物中の高拡散性多量体のシナプス毒性を中和する。第四に、新規７１Ａ１／３Ｄ６サンドイッチＥＬＩＳＡは、ヒト血漿中のｏＡβを高感度に再現性よく定量化する。本発明者らの知る限り、これは、多量体選択的立体構造抗体を使用してヒト血漿中のｏＡβを定量化した最初の報告である。今や、このアッセイは、内因性ｏＡβの構造特性、ヒト血漿およびＣＳＦにおける動力学、および機能的細胞毒性を含む、内因性ｏＡβの生物学的特徴を調べるための固有のツールとなるだろう。本発明者らは、ｏＡβ血漿イムノアッセイに関する３件の報告を見出した［５５～５７］。これらはいずれも、同一の捕捉抗体および検出器抗体を使用することを含み、したがって定量化には表面上に少なくとも２つの同一の露出エピトープが必要である。８２Ｅ１を捕捉抗体および検出器抗体の両方として使用する１つのそのようなアッセイは、Ｉｍｍｕｎｏ－Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＩＢＬ）から市販されている。こうしたアッセイは、Ｎ末端エピトープが利用可能であり露出している限り、二量体からプロトフィブリル、さらには原線維に至るまでの幅広い範囲のＡβを認識することになる。また、報告されているすべてのアッセイには、アッセイ特異性を試験するための希釈直線性、スパイクイン回収率、および免疫枯渇などの詳細な特徴付けが欠如している。本明細書に記載の例示的な７１Ａ１／３Ｄ６アッセイは、単量体を検出しない新規多量体特異的抗体を捕捉体として使用することによる特異性の向上、およびＳＭＣｘＰＲＯシステムによる感度の向上を呈する。

【0151】

今や、この新しいアッセイは確立され、技術的に検証され、本発明者らおよび他の研究者は、この新しいアッセイを使用して、大規模で明確に画定された横断的および縦断的なヒトコホートを系統的に調査し、血漿ｏＡβレベルを、Ａβ３７からＡβ４３までの６つのＣ末端バリアントすべてを検出するＡβ単量体アッセイ［３２］、複数のＡＤ表現型と相関するＮ末端タウ断片を検出するＮＴ－１タウアッセイ［３５、３６］、およびＴｈｒ１８１、Ｔｈｒ２１７、およびＴｈｒ２３１でリン酸化されたタウを検出する非常に有望な最近のアッセイ（「緒言」を参照）などの他の確立された新興のＡＤバイオマーカーと相関付けることができる。複数のコホートでのそのような詳細な相関性分析は、ＣＳＦおよび血漿における振興の抗アミロイド治療の効果をモニターすることを含み、ＡＤの初期病態形成および経過におけるｏＡβ動力学の関与に関するさらなる洞察を明らかにするはずである。ヒト血漿中の内因性ｏＡβに対するこの高感度で特異的なアッセイの作出、分析的検証、および初期応用は、多くの研究室からの広範な証拠により、ＡＤにおけるＡβの重要な生物活性形態であり、したがって疾患修飾療法の主要な標的であることが示唆されている種を検出および追跡するための長年求められてきた方法を提供する。

【0152】

したがって、本明細書では、例えば、本明細書に記載の、例えばヒト対象、または動物モデル、例えばヒト化ＡＰＰマウス、または獣医学的対象、例えばネコもしくはイヌからの、１つまたは複数の生物学的流体を含む試料中に存在するｏＡβをアッセイするための方法が提供される。こうした方法は、試料中のｏＡβを定量的にアッセイするために使用することができる。こうした方法は、ヒト患者に由来する流体試料、例えば、血液または血漿を含む試料に対して使用することができる。試料は、当技術分野で公知の方法を使用して得ることができる。試料としては、例えば、組織、全血、血漿、血清、尿、唾液、呼気、エキソソームまたはエキソソーム様微小胞、リンパ、脳脊髄液、または痰を挙げることができる。

【0153】

一部の実施形態では、表面（例えば、プレートまたはビーズの表面などの表面）に結合した捕捉抗体および標識された検出抗体を使用するサンドイッチイムノアッセイが使用される。こうした方法は、試料中のｏＡβを認識して結合する第１の作用剤またはプローブ（捕捉抗体）を用いて、試料中に存在するｏＡβを捕捉するステップを含んでいてもよい。好ましくは、捕捉抗体は、本明細書に記載の７１Ａ１抗体もしくは１Ｇ５抗体またはそれらの抗原結合性断片である。捕捉抗体は、好ましくは、表面、例えば、マルチウェルプレートなどのプレートの表面、ビーズ、例えば、ビーズ、粒子、ミクロスフェア、ナノチューブ、ポリマー、プレート、ディスク、またはディップスティックの表面に付着している。ビーズとしては、磁気ビーズ、プラスチックビーズ、セラミックビーズ、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、メチルスチレンビーズ、アクリルポリマービーズ、カーボングラファイトビーズ、二酸化チタンビーズ、ラテックスまたは架橋デキストラン、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥビーズ、セルロースビーズ、ナイロンビーズ、架橋ミセル、またはＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ビーズを挙げることができる。一部の実施形態では、捕捉抗体はビオチン部分にコンジュゲートされており、表面はストレプトアビジンでコーティングされており、抗体はビオチン－ストレプトアビジン結合を介して表面に付着している。

【0154】

試料を、ｏＡβ－捕捉抗体複合体に結合する第２の検出抗体と接触させる。例えば、検出抗体は、ｏＡβに結合することができるが、前記標的分析物の異なるエピトープを認識し、ｏＡβに対する結合について捕捉（例えば、７１Ａ１または１Ｇ５）抗体と競合しない。ｏＡβに結合する例示的な検出抗体としては、３Ｄ６（例えば、Feinberg et al. Alzheimers Res Ther. 2014;6:31）または８２Ｅ１が挙げられ、７１Ａ１または１Ｇ５はサンドイッチアッセイでの検出器としても使用することもできる。代替的に、捕捉抗体は親和性タグを含んでいてもよく、検出抗体は親和性タグに結合してもよい。親和性タグの例としては、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＨＩＳタグ、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号３８）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｓタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＶＳＶＧ、Ｖ５、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ｃ－ｍｙｃ、およびそれらの組合せが挙げられる（例えば、Kimple et al., Curr Protoc Protein Sci. 2013; 73: Unit-9.9を参照）。タグに結合する検出抗体は公知であり、例えば、ＢｉｏＲａｄ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、および他の業者から市販されている。好ましくは、検出抗体は、例えば、放射性同位体、化学発光物質、蛍光物質、金属錯体、ルシフェラーゼなどの生物発光物質、または核酸で標識されている。

【0155】

こうした方法は、例えば、検出抗体が放射性同位体で標識されている場合は、ラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）を使用して、検出抗体が化学発光物質で標識されている場合は、化学発光イムノアッセイ法（ＣＩＡ）を使用して、検出抗体が蛍光物質で標識されている場合は、蛍光イムノアッセイ法（ＦＩＡ）を使用して、検出抗体が金属錯体で標識されている場合は、電気化学発光イムノアッセイ法（ＥＣＬＩＡ）を使用して、検出抗体がルシフェラーゼなどの生物発光物質で標識されている場合は、生物発光イムノアッセイ法（ＢＬＩＡ）を使用して、検出抗体が核酸で標識されている場合は、抗体を標識した核酸をＰＣＲにより増幅することおよびその核酸を検出することを含む免疫ＰＣＲ法を使用して、免疫複合体の形成により生じる濁度を検出する比濁イムノアッセイ法（ＴＡＩ）を使用して、免疫複合体の形成により凝集したラテックスを検出するラテックス凝集比濁法（ＬＡ）を使用して、またはセルロース膜での反応を使用するイムノクロマトグラフィーアッセイを使用して、試料中のｏＡβの濃度を検出し、任意選択で定量化するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、ＳＭＣｘＰＲＯまたはＥｒｅｎｎａ（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）などの蛍光ベースＥＬＩＳＡプラットフォームである。

【0156】

検出は、抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体を検出可能な物質にカップリングすることにより容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々の陽電子放射断層撮影法で使用される陽電子放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。診断薬として使用するために抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについては、例えば、米国特許第４，７４１，９００号明細書を参照されたい。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが挙げられる。発光物質の例としては、ルミノールが挙げられる。生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられる。好適な放射性物質の例としては、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１１１Ｉｎ、または^９９Ｔｃが挙げられる。一部の実施形態では、蛍光標識は、理想的には５９４ｎｍまたは６３３ｎｍレーザー線に好適な励起を示す明色近赤外蛍光色素である。一部の実施形態では、標識は、蛍光タンパク質であるかまたはそれを含む。多くのレポータータンパク質が当技術分野で公知であり、以下のものが挙げられる：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、緑色蛍光タンパク質のバリアント（ＧＦＰ１０）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＧＦＰＳ６５Ｔ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧＥｍｅｒａｌｄ ＧＦＰ、スーパーフォールダーＧＦＰ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＣｌｏｖｅｒ３、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ＮｏｗＧＦＰ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、光活性化型ＧＦＰ（ＰＡ－ＧＦＰ）、Ｋａｅｄｅ、Ｋｉｋｕｍｅ、ｍＫｉｋＧＲ、ｔｄＥｏｓ、Ｄｅｎｄｒａ２、ｍＥｏｓＦＰ２、Ｄｒｏｎｐａ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ｅＢＦＰ２、アジュライトＢＦＰ、ｍＴａｇＢＦＰ、ｍＫａｌａｍａｌ、ｍＴａｇＢＦＰ２、ｓｈＢＦＰ、青緑色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｉａｎ ＣＦＰ、ＳＣＦＰ３Ａ、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、ＣｙＰｅｔ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ｍＴＦＰＩ、光スイッチ可能なＣＦＰ２（ＰＳ－ＣＦＰ２）、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ｍＭｉｄｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ、アクアマリン、ｍＫｅｉｍａ、ｍＢｅＲＦＰ、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅ２、ＬＳＳ－ｍＫａｔｅｌ、ＬＳＳｍＯｒａｎｇｅ、ＣｙＯＦＰ１、Ｓａｎｄｅｒｃｙａｎｉｎ、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ｅＲＦＰ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＣａｒｄｉｎａｌ、ｍＳｔａｂｌｅ、ｍＭａｒｏｏｎｌ、ｍＧａｒｎｅｔ２、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＴａｇＲＦＰ６７５、ｍＫａｔｅ２、ＨｃＲｅｄ、ｔ－ＨｃＲｅｄ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ、Ｋｉｎｄｌｉｎｇ、近赤外蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ｅＹＦＰ、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ＴａｇＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＰＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｙｐｅｔ、ＩＡＮＲＦＰ－ＡＳ８３、ｍＰａｐａｙａｌ、ｍＣｙＲＦＰ１、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＫｕｓａｂｉｒａ Ｏｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＫＯＫ、ｍＫＯ２、ｍＧｒａｐｅｌ、ｍＧｒａｐｅ２、ｚｓＹｅｌｌｏｗ、ｅｑＦＰ６１１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｎｄｅｒｃｙａｎｉｎ、ｓｈＢＦＰ－Ｎ１５８Ｓ／Ｌ１７３Ｉ、近赤外タンパク質、ｉＦＰ１．４、ｉＲＦＰ７１３、ｉＲＦＰ６７０、ｉＲＦＰ６８２、ｉＲＦＰ７０２、ｉＲＦＰ７２０、ｉＦＰ２．０、ｍＩＦＰ、ＴＤｓｍＵＲＦＰ、ｍｉＲＦＰ６７０、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ（ＢＶ）４２１、ＢＶ６０５、ＢＶ５１０、ＢＶ７１１、ＢＶ７８６、ＰｅｒＣＰ、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ポシロポリン（pocilloporin）、ウミシイタケＧＦＰ、ＭｏｎｓｔｅｒＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、もしくはフィコビリタンパク質（Phycobiliprotein）、またはそれらのいずれか１つの生物学的に活性なバリアントもしくは断片。ルシフェラーゼなどの他のタンパク質も使用することができる。

【0157】

抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体は、それを化学発光化合物にカップリングすることにより検出可能に標識することもできる。次いで、化学発光タグ付き抗体の存在は、化学反応の過程中に生じる発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマティックアクリジニウムエステル（theromatic acridinium ester）、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルである。

【0158】

抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体を検出可能に標識することができる方法の１つは、それを酵素に連結し、連結された産物を酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）に使用することによる（Voller, A., “The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)” Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2 (1978), 1-7）；Voller et al., J. Clin. Pathol. 31 (1978), 507-520；Butler, Meth. Enzymol. 73 (1981), 482-523；Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla., (1980)；Ishikawa, E. et al., (eds.), Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo (1981)。抗体に結合している酵素は、例えば、分光光度法、蛍光分析法、または視覚的手段により検出することができる化学部分が生成されるように、適切な基質、好ましくは発色基質と反応することになる。抗体を検出可能に標識するために使用することができる酵素としては、これらに限定されないが、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ－５－ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ－グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。加えて、酵素の発色基質を使用する比色法により検出を達成することができる。検出は、基質の酵素反応の程度を、同様に調製された標準物質と比較して視覚的に比較することによっても達成することができる。

【0159】

検出は、様々な他のイムノアッセイのいずれかを使用して達成することもできる。例えば、抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体を放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用して抗体を検出することが可能である（例えば、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986)）を参照。この文献は参照により本明細書に組み込まれる）。放射性同位体は、これらに限定されないが、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーを含む手段により検出することができる。

【0160】

抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体は、１５２Ｅｕまたはランタニド系列の他のものなどの蛍光発光金属を使用して検出可能に標識することもできる。こうした金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を使用して抗体に付着させることができる。

【0161】

種々の部分を、抗体、またはその抗原結合性断片、バリアント、もしくは誘導体にコンジュゲートさせるための技法は周知である。例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985)；Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Marcel Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987)；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)；“Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985)、およびThorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. 62 (1982), 119-158を参照されたい。

【0162】

本明細書には、アミロイドーシス、例えばＣＡＡまたはアルツハイマー病（ＡＤ）を有すると対象を診断するための方法が含まれる。こうした方法は、対象から試料を得るステップ、ならびに試料中のｏＡβの存在および／またはレベルを評価するステップ、ならびにその存在および／またはレベルを、１つまたは複数の参照、例えば正常レベルの、例えば未罹患対象のレベルのｏＡβを表す対照参照と、および／またはアミロイドーシス（例えば、ＣＡＡまたはＡＤ）に関連付けられるタンパク質のレベル、例えばＡＤまたはアミロイドーシスを有する対象におけるレベルを表す疾患参照と比較するステップを含む。一部の実施形態では、こうした方法は、対象が、アミロイドーシス、例えばＡＤまたはＣＡＡを有すると特定された場合、対象に、治療、例えば、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の治療を施すステップをさらに含んでいてもよい。治療としては、コリンエステラーゼ阻害剤、例えば、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン；ＮＭＤＡアンタゴニスト、例えばメマンチン；またはモノクローナル抗体、例えばアデュカヌマブ、または本明細書に記載の抗体が挙げられる。代替的にまたは加えて、こうした方法は、対象に対してさらなる診断検査、例えば精神状態および神経心理学的検査、または例えば磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）もしくはコンピューター断層撮影法（ＣＴ）もしくは陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）スキャン、例えば、フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ）ＰＥＴイメージング、アミロイドＰＥＴイメージング、もしくはタウＰＥＴイメージングを使用したイメージングを推奨または実施するステップをさらに含んでいてもよい。

【0163】

本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、本発明の方法を使用して生物学的マーカーの存在について試験しようとする物質を指す場合、特に、組織、全血、血漿、血清、尿、唾液、呼気、エキソソームもしくはエキソソーム様微小胞（米国特許第８．９０１．２８４号明細書）、リンパ、脳脊髄液、または痰を含む。使用される試料のタイプは、検査しようとする生物学的マーカーの同一性および方法が使用される臨床状況に応じて様々であってもよい。

【0164】

ｏＡβの存在および／またはレベルは、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、ウエスタンブロットを含むがこれに限定されない、タンパク質の定量的イムノアッセイ法；酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡ；ビオチン／アビジンタイプのアッセイ；タンパク質アレイ検出；ラジオイムノアッセイ；免疫組織化学（ＩＨＣ）；免疫沈降アッセイ；ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）；質量分析法（Kim (2010) Am J Clin Pathol 134:157-162；Yasun (2012) Anal Chem 84(14):6008-6015；Brody (2010) Expert Rev Mol Diagn 10(8):1013-1022；Philips (2014) PLOS One 9(3):e90226；Pfaffe (2011) Clin Chem 57(5): 675-687）を使用して評価することができる。こうした方法は、典型的には、直接的または間接的のいずれかでシグナルをもたらす蛍光分子、化学発光分子、放射性分子、および酵素分子または色素分子などの標識を明らかにするステップを含む。本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、放射性作用剤またはフルオロフォア（例えば、フィコエリトリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５）などの検出可能な物質と、抗体またはプローブとのカップリング（つまり、物理的連結）、ならびに検出可能な物質との反応性によるプローブまたは抗体（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＨＲＰ）の間接的標識化を指す。

【0165】

一部の実施形態では、表面、例えばビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルが、それに対してタンパク質を試験しようとする捕捉抗体でコーティングされているＥＬＩＳＡ法を使用することができる。次いで、生物学的マーカーを含むかまたは含むと疑われる試料をウェルに適用する。抗体－抗原複合体が形成されることになるのに十分な時間が経過した後、プレートを洗浄してあらゆる未結合部分を除去し、検出可能に標識された分子を添加する。十分なインキュベーション期間の後、プレートを再度洗浄してあらゆる過剰な未結合分子を除去し、当技術分野で公知の方法を使用して標識分子の存在を決定する。競合ＥＬＩＳＡまたは競合アッセイ、およびサンドイッチＥＬＩＳＡなどのＥＬＩＳＡ法の変法も使用することができる。そうした変法は当業者に周知である。

【0166】

一部の実施形態では、ｏＡβの存在および／またはレベルは、疾患参照におけるタンパク質の存在および／またはレベルと同等であり、対象は、アミロイドーシス、例えば、ＡＤまたはＣＡＡに関連付けられる１つまたは複数の症状を有している。その場合、対象はアミロイドーシス、例えばＡＤまたはＣＡＡを有しているか、または有していると診断することができる。一部の実施形態では、対象は、アミロイドーシス、例えばＡＤまたはＣＡＡの明白な兆候または症状を有していないが、評価したタンパク質の１つまたは複数の存在および／またはレベルが、疾患参照におけるそうしたタンパク質の存在および／またはレベルと同等である。その場合、対象は、アミロイドーシス、例えばＡＤまたはＣＡＡを発症するリスクの増加（一般集団のリスクレベルを上回る）を有する。一部の実施形態では、個人が、アミロイドーシス、例えばＡＤもしくはＣＡＡを有するか、またはアミロイドーシス、例えばＡＤもしくはＣＡＡを発症するリスクの増加を有すると決定されたら、次いで、例えば当技術分野で公知であるかまたは本明細書に記載の治療を施してもよい。

【0167】

好適な参照値は、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、標準的な臨床治験方法論および統計分析を使用して決定することができる。参照値は、任意の関連形態を有していてもよい。一部の場合では、参照は、ｏＡβの意義のあるレベルについての所定の値、例えば、正常なｏＡβレベル、例えば、未罹患の対象もしくは本明細書に記載の疾患を発症するリスクのない対象におけるレベルを表す対照参照レベル、および／またはアミロイドーシス、例えばＡＤもしくはＣＡＡに関連付けられる状態に関連付けられるタンパク質のレベル、例えばアミロイドーシス、例えばＡＤもしくはＣＡＡを有する対象におけるレベルを表す疾患参照を含む。

【0168】

所定のレベルは、中央値または平均などの単一のカットオフ（閾値）値であってもよく、または他のセグメントとは統計的に異なると決定される、臨床治験集団の上位四分位もしくは下位四分位、三分位、または他のセグメントの境界を画定するレベルであってもよい。所定のレベルは、信頼区間などのカットオフ値（または閾値）の範囲であってもよい。所定のレベルは、１つの画定された群における疾患の発症リスクまたは疾患の存在との関連性が、別の画定された群における疾患のリスクまたは存在よりも１倍高いかまたは低いかなど（例えば、およそ２倍、４倍、８倍、１６倍、またはそれよりも大きく）、比較グループに基づいて確立することができる。所定のレベルは、例えば、対象の集団（例えば、対照対象）が、低リスク群、中リスク群、および高リスク群などの群へと、または最小四分位が最も低いリスクを有する対象であり、最大四分位が最も高いリスクを有する対象である四分位へと、またはｎ分位の最小分位が最も低いリスクを有する対象であり、ｎ分位の最大分位が最も高いリスクを有する対象であるｎ分位（つまり、ｎ個の等しく離間された間隔）へと均等に（または不均等に）分割される範囲であってもよい。

【0169】

一部の実施形態では、所定のレベルは、同じ対象における、例えば異なる時点、例えばより早期の時点でのレベルまたは出現である。

【0170】

所定の値に関連付けられる対象は、典型的には、参照対象と呼ばれる。例えば、一部の実施形態では、対照参照対象は、本明細書に記載の障害（例えば、アミロイドーシス、例えばＡＤまたはＣＡＡ）を有していない。

【0171】

疾患参照対象は、アミロイドーシス、例えばＡＤまたはＣＡＡの１つまたは複数を有する（または発症のリスクの増加を有する）対象である。リスクの増加は、一般集団における対象のリスクを上回るリスクであると定義される。

【0172】

したがって、一部の場合では、対象におけるｏＡβのレベルが、ｏＡβの参照レベル未満であるかまたは等しいことは、臨床状態を示す（例えば、本明細書に記載の障害、例えばアミロイドーシス、例えばＡＤまたはＣＡＡの不在を示す）。他の場合では、対象におけるｏＡβのレベルが参照レベルよりも大きいかまたは等しいことは、アミロイドーシス、例えばＡＤもしくはＣＡＡの存在、または疾患のリスクの増加を示す。一部の実施形態では、対象におけるレベルが参照レベル未満である量は、対象を対照対象から区別するのに十分であり、任意選択で、対照対象におけるレベルよりも統計的に有意に低い。対象におけるｏＡβのレベルがｏＡβの参照レベルに等しい場合、「等しい」とは、ほぼ等しい（例えば、統計的に異なっていない）ことを指す。

【0173】

所定の値は、選択された特定の集団の対象（例えば、ヒト対象）に依存してもよい。例えば、一見健康な集団は、本明細書に記載の障害を有する、有する可能性が高い、または有するリスクがより高い対象の集団が有することになるレベルとは異なるαＡβのレベルの「正常」範囲を有するだろう。したがって、選択される所定の値は、対象（例えば、ヒト対象）が属するカテゴリー（例えば、性別、年齢、健康状態、リスク、他の疾患の存在）を考慮してもよい。適切な範囲およびカテゴリーは、当業者による単なる日常的な実験で選択することができる。

【0174】

可能性またはリスクの特徴付けにおいて、多数の所定の値を確立することができる。

【0175】

また、本明細書では、試料中のｏＡβの量を定量化するためのキットが提供される。キットは、本明細書に記載の捕捉抗体および検出器抗体、任意選択で陽性対照、および任意選択で試料中のｏＡβを定量化するための前記試薬の使用説明書を含む。

【0176】

治療のための方法および組成物
アミロイドーシスは、様々な組織における病原性アミロイドの細胞外および／または細胞内堆積により引き起こされる臨床障害である。アミロイドーシスの兆候および症状としては、以下のものが挙げられる：重度の疲労および脱力感；息切れ；手や足のしびれ、うずき、もしくは痛み；足首および脚のむくみ；おそらくは出血を伴う下痢もしくは便秘；舌の縁が波打って見えることがある舌肥大；肥厚もしくはあざのできやすさなどの皮膚の変化；および目の周りの紫斑。大脳皮質および血管の両方における斑の形態のアミロイドβペプチド（Ａβ）の脳内蓄積は、脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）およびアルツハイマー病（ＡＤ）と関連付けられる。

【0177】

アミロイドベータタンパク質の可溶性多量体（ｏＡβ）がアルツハイマー病（ＡＤ）の病原性カスケードの開始を支援するという強力な証拠があり、単量体でもなく原線維状ＡβでもなくｏＡβを標的とする療法戦略が示唆される。本明細書に記載の抗体７１Ａ１は、合成単量体よりもｏＡβに対して約１００倍感度が高い。７１Ａ１が、ＡＤ可溶性脳抽出物から特異的に免疫沈降させる物質は、完全な抽出物と同様にシナプス機能を損なう。本明細書に示されているように、脳抽出物を７１Ａ１と共にプレインキュベートすることにより、そのシナプス毒性が中和される。疾患関連ｏＡβに対する７１Ａ１は、その固有の活性により、アミロイドーシス、例えばＡＤまたはＣＡＡの治療に療法的に有用となる。

【0178】

したがって、本明細書では、対象におけるｏＡβの蓄積に関連付けられる障害、例えばアミロイドーシス、例えばＡＤまたはＣＡＡを治療するための方法が提供される。こうした方法は、治療有効量の７１Ａ１抗体またはその抗原結合性断片を、対象に、例えば対象の脳に投与するステップを含む。この状況で使用される場合、「治療する」は、アミロイドーシス、例えばＡＤまたはＣＡＡの少なくとも１つの症状を改善することを意味する。多くの場合、アミロイドーシスは、影響を受けた臓器の機能障害をもたらす。したがって、治療は、ｏＡβを低減させ、正常機能に戻すかまたは近づけることができる。例えば、ＡＤおよびＣＡＡは、進行性認知機能低下に関連付けられる。ＡＤまたはＣＡＡを治療するための本明細書に記載の治療有効量の化合物の投与は、認知障害の減少、進行性認知機能低下の速度の低下、または進行性認知機能低下の停止をもたらすことになる。

【0179】

医薬組成物および投与方法
本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の抗体、例えばｍＡｂ ７１Ａ１もしくは１Ｇ５またはそれらの抗原結合性断片を活性成分として含むかまたはからなる医薬組成物の使用を含む。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、非ヒト動物抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ミニボディ、二重特異性抗体、アミノ酸配列修飾抗体、他の分子（例えば、ポリエチレングリコールなどのポリマー）にコンジュゲートされた修飾抗体、あるいはｍＡｂ ７１Ａ１もしくは１Ｇ５のＨＣ ＣＤＲおよびＬＣ ＣＤＲ、またはｍＡｂ ７１Ａ１もしくは１Ｇ５のＨＣおよびＬＣ全体を含む糖鎖修飾抗体である。

【0180】

医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という文言には、薬学的投与に適合する食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、ならびに等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。

【0181】

医薬組成物は、典型的には、その意図された投与経路に適合するように製剤化されている。投与経路の例としては、非経口、例えば静脈内送達；脳室内、脳内、もしくはくも膜下腔内注射；またはＣＳＦへの注射が挙げられる。

【0182】

好適な医薬組成物を製剤化するための方法は当技術分野で公知である。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st ed., 2005; and the books in the series Drugs and the Pharmaceutical Sciences: a Series of Textbooks and Monographs (Dekker, NY)を参照されたい。例えば、非経口、皮内、または皮下投与に使用される溶液または懸濁物としては、以下の成分を挙げることができる：注射用水、食塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための作用剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または複数用量バイアルに封入することができる。

【0183】

注射使用に好適な医薬組成物としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物、および滅菌注射溶液または分散物を即時調製するための滅菌粉末を挙げることができる。静脈内投与の場合、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、パーシッパニー、ニュージャージー州）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合でも、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性であるべきである。組成物は、製造および保管の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散物の場合には必要な粒子サイズの維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなどにより達成することができる。多くの場合、組成物中には、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムが含まれていることが好ましいだろう。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによりもたらすことができる。

【0184】

滅菌注射溶液は、必要な量の活性化合物を、上記に列挙されている成分の１つまたは組合せを有する適切な溶媒に組み込み、必要に応じて続いて濾過滅菌することにより調製することができる。一般に、分散物は、基本分散媒、および上記に列挙されているものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことにより調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、それにより、事前に滅菌濾過したその溶液から、活性成分＋任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。

【0185】

一部の実施形態では、療法用化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤など、療法用化合物を身体から急速に排除されることから保護することになる担体を用いて調製される。化合物は、例えばポンプ、例えば外科的に埋め込まれたリザーバポンプを使用して送達することもできる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性で生体適合性のポリマーを使用することができる。そのような製剤は、標準的な技法を使用して調製してもよく、または、例えばＡｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に得ることができる。ナノ粒子（例えば、リポソーム、ポリマー性ナノ粒子、デンドリマー、クラスリンナノ粒子、または金属ナノ粒子）、操作された二重特異性抗体（例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体（ＩＲ）、または低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質－１（ＬＲＰ－１）にも結合するもの。例えば、Faresjo et al., Fluids Barriers CNS. 2021;18:26；Bajracharya et al., Pharmaceutics. 2021 Dec; 13(12): 2014を参照）、集束超音波とマイクロバブルとの組合せ、血液脳関門（ＢＢＢ）通過特性を有する細胞外小胞を使用して、ＢＢＢを通過する送達を強化することができる。例えば、Bajracharya et al., Pharmaceutics. 2021 Dec; 13(12): 2014を参照されたい。リポソームを含むナノ粒子も、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載のような、当業者に公知の方法に従って調製することができる。代替的に、例えば、本明細書に記載の療法用抗体をコードする核酸（好ましくは、ヒトでの使用のためにコドン最適化されている）を含む、抗体をコードするウイルスベクター（ＡＡＶなど）を送達することができる。

【0186】

医薬組成物は、投与の説明書と共に、容器、パック、またはディスペンサーに含まれていてもよい。

【0187】

投薬量
「有効量」は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。例えば、療法量は、所望の療法効果を達成する量である。この量は、疾患または疾患症状の発症を予防するために必要な量である予防有効量と同じであってもよくまたは異なっていてもよい。有効量は、１回または複数回の投与、適用、または投薬量で投与することができる。療法用化合物の治療有効量（つまり、有効投薬量）は、選択された療法用化合物に依存する。組成物は、１日１回または複数回から１日おきを含む１週間に１回または複数回まで投与することができる。当業者であれば、これらに限定されないが、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の一般的健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患を含むある特定の要因は、対象を効果的に治療するために必要な投薬量およびタイミングに影響を及ぼす可能性があることを理解するだろう。さらに、本明細書に記載の治療有効量の療法用化合物による対象の治療としては、単一の治療または一連の治療を挙げることができる。

【0188】

療法用化合物の投薬量、毒性、および療法効果は、細胞培養物または実験動物にて、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な量）およびＥＤ５０（集団の５０％に対して療法的に有効な用量）を決定するための標準的な薬学的手順により決定することができる。毒性効果と療法効果との間の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を呈する化合物を使用してもよいが、未感染細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それにより副作用を低減させるために、そのような化合物を患部組織部位へと標的化する送達系を設計するように注意する必要がある。

【0189】

細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータは、ヒトに使用するための投薬量範囲を処方する際に使用することができる。そのような化合物の投薬量は、毒性をほとんどまたは全く示さない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投薬量は、使用される剤形および使用される投与経路に応じて、その範囲内で変化させることができる。本発明の方法で使用される任意の化合物の場合、治療有効用量は、初期には、細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、動物モデルでは、細胞培養で決定されるＩＣ５０（つまり、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように処方してもよい。そのような情報を使用して、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーで測定することができる。

【実施例】

【0190】

本発明を以下の例でさらに説明するが、それらは、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定するものではない。

【0191】

[実施例１]
ペプチド免疫原
ヒトアミロイドｂタンパク質４２（Ａβ４２）アミノ酸配列および免疫原性ペプチドの生成に使用される配列内の領域（ａａ９～１８）は以下の通りである。

【0192】

【化9】

【0193】

この配列を選択したのは、複雑な側鎖を含むアミノ酸のクラスターがあるためであった。こうしたアミノ酸は、二量体、三量体、さらにはより複雑な構造にアラインすると、Ａβ凝集の初期に形成され得るものと同様の特徴的な三次元構造を作出する固有の配向性に再会合する可能性があると考えた。こうした構造は、未凝集単量体配列には存在しない、抗体結合のための「ネオエピトープ」である可能性がある。免疫原設計の主な目的は、Ａβが初期に凝集した際に作出され、その後より大型の凝集体が形成されると失われる立体構造ネオ抗体エピトープに対して、免疫応答の焦点を可能な限り限定することになる理想的には安定二量体であるが、安定三量体またはさらに安定４個ペプチド構造であってもよい分子を作出することであった。

【0194】

この領域の合成ペプチド型は、配列ＣＧＫＣＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＰＮＶＬＫＱＨＨＶＥＹＧＣＫ（配列番号２）を有し、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける免疫原として使用するために作製した。

【0195】

環化ペプチドの概略図を図１に示す。Ｍａｂ ７１Ａ１および１Ｇ５は両方とも、独占所有のＴ細胞エピトープペプチドにコンジュゲートされたこの免疫原を使用して単離した。

【0196】

この免疫原は、本明細書ではＮＥＴＬ－１とも呼ばれ、上記に図示したＡβ配列内の１０個アミノ酸のストレッチに由来した。この領域は、Ａβプロトフィブリル凝集の形成に必要なβシート変換と同様の、アルファヘリックス立体構造からβシート立体構造への最初の変換に関与する可能性があると考えられる配列に由来するものであった。樹脂から切断する前にペプチドの環化を可能にするとキンクが形成されるため、プロリンおよびアスパラギンを追加した後、１０個アミノ酸のストレッチを逆方向に繰り返した。Ｎ末端システインを使用して、完全に合成され樹脂から切断されたペプチドを、スルフヒドリル反応性ＥＬＩＳＡプレートおよびマレイミド活性化ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）などの担体タンパク質に、またはＴｅｐｉ２と称される独占所有のマレイミド－ペプチド担体にコンジュゲートした。マレイミドは、スルフヒドリル反応性であり、システインは、他のスルフヒドリル基またはマレイミドとのコンジュゲーションに利用可能な遊離スルフヒドリル基を有する。水溶性を増加させるために、ペプチドのＮ末端に追加のリジンを追加した。スクリーニング用の対照ペプチドは、Ｃ末端システインを有する完全長Ａβ４０（ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ、配列番号４０）ならびにＮＥＴＬ１で使用されるものと同じＡβ１０アミノ酸ペプチド配列であるが、逆方向の反復を有しておらず、追加のＮ末端リジンおよびシステインを有するＮＥＴＬ－２ペプチドの両方を含んでいた。

【0197】

Ｔｅｐｉ２は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のクラスＩＩ ＭＨＣ抗原の背景で提示されると、ヘルパーＴ細胞を活性化して、Ａベータ配列構造に対する抗体応答を開始させる配列である。例示的なＴｅｐｉ２は以下の通りである。

【0198】

【化10】

【0199】

これは、Ｐａｍ３Ｃｙｓ（Ｎ－α－パルミトイル－Ｓ－２，３－ビス（パルミトイルオキシ）－（２ＲＳ）－プロピル－Ｌ－システインを有し、パルミトイル－Ｃｙｓ（（ＲＳ）－２，３）が２番目のリジン（Ｋ４）に付着しているペプチド配列（配列番号４）である。Ｐａｍ３Ｃｙｓは、自然免疫応答を刺激することが公知であるリポペプチドアジュバントである。自然免疫応答は、多くの微生物または寄生虫に見出される、Ｐａｍ３Ｃｙｓに類似した成分に結合する生殖系列コードパターン認識受容体（ＰＲＲ）を使用する応答である。自然免疫系の誘導は、多くの炎症性サイトカインの産生をもたらし、直ちに宿主防御応答を引き起こして、特異的抗体産生の誘導などの抗原特異的適応免疫応答を初回刺激することができる。（Janeway CA Jr, Medzhitov R. Innate immune recognition. Annu Rev Immunol (2002) 20:197-216）。

【0200】

大型のタンパク質担体を用いて続けるのではなく、Ｔｅｐｉ２をペプチド免疫原に結合させる目的は２つある。第一に、大型タンパク質担体自体が抗体応答を誘導し、活性化されたＢ細胞の多くは、こうしたタンパク質上に見出される不要で無関連のエピトープに応答する。したがって、Ｔｅｐｉ－２担体をその後の追加免疫物質に付着させることにより、所望のＡベータペプチド免疫原に特異的な初回刺激Ｂ細胞の継続的な活性化が制限された。第二に、Ｔｅｐｉ２の追加のアミノ酸組成に対する抗体応答は、Ｔｅｐｉ２でコーティングされたプレートを用いたＥＬＩＳＡでは、本発明者らの手ではまったく測定することができなかった。

【0201】

[実施例２]
生化学および免疫学
ＮＥＴＬ－１は、ペプチドの生成に使用される樹脂（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｉｎｃ）から切断する前のコンジュゲーションおよび合成後修飾に利用可能なスルフヒドリルを有する３つのシステインを含んでいた。ペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３２Ａなどの自動ペプチド合成機でＦＭＯＣ化学を使用して合成した。ペプチドは、合成プロセスを通して、アミノ酸の完全性を保証するために必要な側鎖保護基（Ｔｒｔ－ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニルまたはＢｏｃ）を有している。こうした基は、ペプチドの合成に使用される樹脂から最終産物を切断する際に除去しなければならない。ＮＥＴＬ－１には、ペプチドの両ｃ末端に２つのシステイン（Ｃ４およびＣ２７）が挿入されている。こうしたシステインを使用して、樹脂からの最終切断の前に樹脂上でペプチドを環化した。この課題を達成するために、システインを、アセトアミドメチル（ＡＣＭ）基で保護した。タリウムＩＩＩ手順を使用してＡＣＭ基を除去すると、こうしたシステインは、樹脂からペプチドを切断するために使用される異なる条件下で除去されるＢｏｃ保護基に影響を及ぼすことなく、優先的に切断された。ＡＣＭ保護基の除去は、遊離スルフヒドリルを生成し、それらが互いに優先的に反応して樹脂上でループを形成すると考えられる。ある程度のペプチド間二量体も形成されることになる可能性がある。無論、潜在的なβシート構造を作出するこうした合成アクロバットを使用して安定二量体構造を作り出すスキームは、いずれの結合優先性も排除しない。最初のＡベータ９－１８配列のＣ末端バリンの後、または免疫原のＮ末端もしくはＣ末端のいずれかにアミノ酸を追加しても、凝集の初期に形成される安定小型Ａベータ構造を形成するという同じ目標を達成することができる。次いで、天然の連続した「直線状」配列ではなく三次構造に応答する単離された７１Ａ１および１Ｇ５抗体を、多くの異なる構成に対する応答性レパートリーから取り出した。樹脂から最終的に切断した後、コンジュゲーションのためにペプチドのＮ末端に利用可能な遊離スルフヒドリルを有する安定会合二量体がもたらされる可能性が高い。

【0202】

安定二量体化を作出するために使用することができる追加のアミノ酸保護基がペプチド配列内に存在する。例えば、モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）保護基は、ＡＣＭ保護基よりも強力な酸、塩基、求核剤に対してより感受性であるため、除去がより容易な多用途アミノ保護基である。ＮＥＴＬ－１で使用される１０個アミノ酸のストレッチは、下記に図示されているように、プロリンおよびアスパラギンで区切ってタンデムに繰り返すこともできる。
Ｃ Ｇ Ｋ Ｃ Ｇ Ｙ Ｅ Ｖ Ｈ Ｈ Ｑ Ｋ Ｌ Ｖ Ｐ Ｎ Ｇ Ｙ Ｅ Ｖ Ｈ Ｈ Ｑ Ｋ Ｌ Ｖ Ｃ Ｋ（配列番号３）

【0203】

最初のシステイン（Ｃ１）は、ペプチド合成中および樹脂からの切断中、すべてのアミノ酸に使用されているＴＲＴ基により保護することができる。例えば、二番目のシステイン（Ｃ４）はＡＣＴ基で、三番目のシステイン（Ｃ２７）はＭＭＴ基で保護することができる。ＭＭＴ基を最初に除去して、Ｃ４ジスルフィド架橋による隣接ペプチド間のジスルフィド結合を可能にし、その後ＡＣＴ基を除去して、同じ隣接ペプチド間に追加のＣ２７ジスルフィド架橋を可能にすることになる。ペプチドを樹脂から切断すると、隣接する繰返し二量体を有する安定ペプチド構造を生成させることができる。

【0204】

【化11】

【0205】

単量体Ａβ４０またはＡβ４２ペプチドでは利用可能ではない固有の三次元構造を有する安定二量体、三量体、または４個ペプチドの凝集体を作出することを念頭に置いて、他の保護基および戦略を、このプロセスおよびＮＥＴＬ－１ペプチド合成プロセスにて同じ目標のために使用することができる。

【0206】

正常な免疫応答は、リンパ球のＢ細胞サブセットおよびＴ細胞サブセットの両方の活性化を含む。複雑なタンパク質に対して開始される応答には、そのタンパク質に由来するペプチド断片の取込みおよび消化、続いて細胞表面提示が必要である。こうした断片は、Ｂ細胞上のＭＨＣ分子と呼ばれる細胞表面発現分子およびＡＰＣまたは抗原提示細胞と呼ばれる特殊細胞に会合した状態で細胞内環境に提示される。Ｔ細胞は、ＭＨＣに会合するこうしたペプチド断片を認識する特殊な受容体を有する。この認識は、Ｔ細胞内部で細胞間事象を開始させ、それによりサイトカインの産生および合成がもたらされる。こうしたサイトカインは、Ｂ細胞成熟を刺激し、最終的には抗体分泌Ｂ細胞を発生させる。

【0207】

Ｔ細胞活性化のプロセスおよび機序を理解および解明しようとする多くの研究が存在する。Ｔ細胞の活性化に関与するタンパク質内の配列は、Ｔ細胞エピトープと呼ばれ、そうした配列の特定およびそうした配列間の特質は免疫学者の関心分野である。通常、小型ペプチドに対する抗体応答が求められる場合、ペプチドは、ＫＬＨまたはＢＳＡなどの大型担体分子にコンジュゲートされる。このコンジュゲーションプロセスは、Ｂ細胞およびＡＰＣが、大型担体タンパク質に由来するＴ細胞エピトープペプチドを内部移行、プロセシング、および提示することを可能にする。しかしながら、こうした担体に関する問題は、担体も多数のＢ細胞エピトープを有しており、大半の場合、こうした領域に対する抗体応答が、担体にコンジュゲートされたペプチドに対する応答を圧倒してしまうことである。その結果、時間の経過と共に、対象のペプチドに対する比力価が減少する。この現象は、Ｔ細胞エピトープを使用した場合には生じない。その理由は、認識に利用可能なＢ細胞エピトープは、担体にコンジュゲートされたペプチドまたは分子に由来するものだけであるからである。

【0208】

Ｍａｂ ７１Ａ１および１Ｇ５を刺激するために使用されるＴ細胞エピトープは、特に小型分子およびペプチドに対するマウス抗体応答を開始するために本発明者らが使用した配列である。例えば、それら自体が目的のタンパク質に由来する小型ペプチド免疫原にコンジュゲートされたこうした配列は、マウスにおいて目的のペプチドに対する抗体応答を生成することになる。Ｔ細胞エピトープに対する抗体応答は観察されない。加えて、本発明者らは、こうした配列のみがＴ細胞増殖に結び付くことになることを示す研究を過去に行っていた。この意味で、こうしたＴ細胞エピトープは、Ｂ細胞およびＡＰＣ上のＭＨＣと会合した状態で、Ｔ細胞により認識される複合体を提示する可能性が高くなるだろう。この認識により、こうしたＴ細胞エピトープにコンジュゲートされた分子に対する抗体応答に結び付くことになる開始要件が完了する。

【0209】

ＮＥＴＬ－１ペプチド間のあらゆるジスルフィド結合を低減させるために、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．５中にて、ＮＥＴＬ－１ペプチドを１：１のモル比でＴ細胞エピトープペプチドにコンジュゲートした。対照Ａβ４２－システインおよびＮＥＴＬ－２を両方とも同様に処理した。

【0210】

完全な環化および切断プロトコールは以下の通りである。まず、環化させることになるペプチド樹脂の質量を決定し、環化に必要なタリウムＩＩＩの質量を決定する：（ＸｍＭ ＮＥＴＬ１２×２）×５４３．２ｍｇ／ｍＭ＝ＹｍｇタリウムＩＩＩ。ＤＭＦを使用してガラスバイアル内で樹脂を膨潤させる。必要とされる容積のタリウムＩＩＩ（ペプチド樹脂を膨潤させるために添加した量と同じ量）をペプチド樹脂に移す。０℃で２時間撹拌しながら反応を可能にする。反応混合物を、濾過のために適切なサイズのガラス焼結フィルターフラスコに移す。ペプチド－樹脂混合物をＤＭＦで３回洗浄し、次いでペプチド－樹脂混合物をＤＣＭで３回洗浄する。

【0211】

焼結フラスコを覆い、混合物を一晩乾燥させる。乾燥したペプチド－樹脂をカバー付きのガラスバイアルに移し、収量を決定する。

【0212】

翌日、環化ペプチド－樹脂を秤量し、磁気フレア（magnetic flea）または撹拌子を含む適切なサイズのガラスバイアルに入れる。

【0213】

チオアニソール、脱イオン水、エタンジチオール、およびトリフルオロ酢酸を含む切断カクテルを調製し、氷上で冷却する。冷却したカクテルの全容積をペプチド－樹脂を含むバイアルにゆっくりと添加し、氷上で１５分間、その後室温で１６５分間撹拌する。

【0214】

切断反応中に、ＭＴＢＥを氷上で冷却する。１００～１５０ｍｇペプチド－樹脂毎に、およそ３５ｍｌの冷却ＭＴＢＥを使用する。ペプチド－樹脂－カクテル混合物をＱｕｉｋ－Ｓｅｐカラムにかけて冷却ＭＴＢＥへと流す。ＴＦＡで洗浄する。遠心分離して切断されたペプチドをペレットにし、次いで冷却ＭＴＢＥでペプチドペレットを洗浄／再懸濁する。遠心分離および洗浄を３回繰り返す。

【0215】

前回の遠心分離と同様に遠心分離してペプチドをペレットにし、手短に乾燥させる。ペレットを最小容積の氷酢酸に溶解する。凍結および凍結乾燥を１または２回繰り返す。

【0216】

[実施例３]
免疫化および抗体スクリーニング
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、ＫＬＨコンジュゲートＮＥＴＬ－１ペプチドによる一次免疫および二次免疫を行った。その後の追加免疫は、Ｔ細胞エピトープコンジュゲートペプチドを用いて３週間間隔で実施した。この手法は、ＫＬＨが、ペプチドに対する強力な免疫応答を初期に確立することを可能にした。ＫＬＨに対する抗体応答がペプチドに対する応答を圧倒し始める前に、Ｔ細胞エピトープは、ＫＬＨ内に含まれるＢ細胞エピトープに起因する無関連抗体応答をさらに誘導することなく、目的の構造に対するさらなる追加免疫を可能にする。Ｔ細胞エピトープは、Ｂ細胞応答を最小限に誘導するかまたはまったく誘導しないが、Ｂ細胞誘導および成熟に重要である強力なＴ細胞増殖応答を誘導する。

【0217】

ＮＥＴＬ－１免疫原の背後にある理論的根拠は、環化ペプチドにより形成されるより焦点を絞ったエピトープが、完全長Ａβ４０内に見出される単量体１０ａａペプチド配列に対する応答の誘導が最小限であるかまたはまったくないように、応答を、選択された１０ａａ配列に由来する二量体構造に制限することができるということだった。両応答が観察された。本発明者らは、ペプチド構造がいかに小さくとも、単量体配列と交差反応する認識に利用可能な最小限のエピトープが常に存在する可能性があるという事実により、これを部分的に説明することができる。ＮＥＴＬ－１およびＮＥＴＬ－２の両方に特異的な幾つかのモノクローナル抗体を単離した。ＮＥＴＬ－１に結合したが、ＮＥＴＬ－２にもＡβ４０にも結合しなかった２つの分離物７ａおよび１ｇが明らかになった。こうした分離物を、さらなる特徴付けのためにサブクローニングした。２つの単離されたサブクローンであるＭａｂ ７１Ａ１および１Ｇ５を選択し、組織培養で増殖させ、特異性の確認および将来の研究のために精製した。７１Ａ１および１Ｇ５モノクローナル抗体は両方とも、環化ペプチドＮＥＴＬ－１に結合し、対照ウェルにも、Ａβ４０単量体ペプチドにも、対照ペプチドＮＥＴＬ－２にも結合しなかった（図２）。図２は、マレイミド活性化（ＳＨ反応性）マイクロタイタープレートにコンジュゲートされたＡβ４０、ＮＥＴＬ１、またはＮＥＴＬ２ペプチドに対する結合についてアッセイした、精製されたモノクローナル抗体による標準的な間接酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）である。１時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体１００μｌを添加し、プレートをさらに１時間インキュベートしてから、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）基質を添加した。分光光度計で６５０ｎｍの吸光度を測定した。

【0218】

[実施例４]
ヒト血漿中の可溶性Ａβ多量体を検出および定量化するための超高感度イムノアッセイ
この例では、高齢対象およびＡＤ対象の大規模コホートを分析して、この重要な病原性種の動力学および療法に対する応答を評価するためにヒト血漿中のシナプス毒性ｏＡβを定量化するための高感度でハイスループットの安価な方法が記載される。

【0219】

方法
実施例４では以下の方法を使用した。

【0220】

Ａβ多量体特異的抗体７１Ａ１および１Ｇ５の生成
モノクローナル抗体７１Ａ１（親クローン７Ａ１ａのサブクローン）および１Ｇ５は、単量体Ａβの二量体化の際に形成される三次元構造を潜在的に模倣するように設計された合成立体構造ペプチド免疫原に対して生じたものだった。Ａβ_１－４０のアミノ酸残基９～１８を含むペプチド免疫原を合成し、環化して、安定二量体形成物へのフォールディングを可能にするように合成後修飾した（特許出願中）。Ａβペプチドの残基９～１８を選択した背後にある理論的根拠は、この領域のアミノ酸が、Ａβの凝集形態にのみ存在する固有の三次元構造へと再会合する可能性が高いと考えられるということだった。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、脾臓摘出術手順の前に、一次および二次免疫にはマレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体複合体を使用し、その後の追加免疫には独占所有のヘルパー２Ｔ細胞エピトープを使用して、この立体構造ペプチド免疫原で免疫した。免疫化マウス脾細胞および融合パートナーとしてのマウス骨髄腫Ｆ０細胞を使用して融合を実施した。免疫原による一次スクリーニングおよびサブクローニングの後、特に２つのモノクローナル候補７１Ａ１および１Ｇ５は、環化ペプチドに対して高い特異性を示したが、直線状ペプチドに対しては特異性を示さなかった。こうした抗体の初期特徴付けは、Ａβの合成および内因性多量体形態に対して高い特異性を有し、単量体Ａβには結合しないことを示していた［４４］。

【0221】

試薬
合成β－アミロイドペプチド１－４０および１－４２は、Ａｎａｓｐｅｃから購入した。セリン２６がシステインで置換されたＡβ１－４０（Ａβ Ｓ２６Ｃ）は、Ｋｅｃｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ（エール大学、ニューヘブン、コネチカット州）から購入した。アミロイドβ由来拡散性リガンド（ＡＤＤＬ）［１］およびＳ２６Ｃ二量体を、以前の報告［４５］に従って調製した。

【0222】

マウス
雄および雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを両方とも使用した。マウスを含むすべての手順は、ハーバード大学医学部およびブリガムアンドウィメンズ病院の動物福祉ガイドラインに準拠していた。

【0223】

可溶性脳「浸漬」抽出物の調製
「浸漬」法を使用した、可溶性タンパク質の死後脳組織からの抽出を、以前に記載のように実施した［１１］。簡単に説明すると、新たに解凍した冠状スライスから皮質灰白質を切り出し、次いでＭｃＩｌｗａｉｎ組織チョッパーで幅０．５ｍｍ間隔に切り刻んだ。切り刻んだ組織片を秤量し、１：５重量：容積で、抽出緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５μｇ／ｍｌロイペプチン、５μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌペプスタチン、１２０μｇ／ｍｌ Ｐｅｆａｂｌｏｃ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＮａＦ、ｐＨ７．２）に添加した。組織小片を、５０ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆタンパク質ＬｏＢｉｎｄチューブ内で３０分間４℃にて旋回させることにより浸漬した。Ｓｏｒｖａｌｌ Ｌｙｎｘ ６０００卓上遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でＦｉｂｅｒｌｉｔｅ Ｆ１４－１４×５０ｃｙローターを用いて２，０００ｇで１０分間４℃にて遠心分離することにより組織小片を除去した。上清の上部約９０％を除去し、次いでＯｐｔｉｍａ Ｌ９０Ｋ超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）でＳＷ４１Ｔｉローターを用いて４０，０００ｒｐｍで１１０分間４℃にて遠心分離した。上清の上部約９０％を、さらなる研究のために「浸漬抽出物」として保持した。脳ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）浸漬抽出物を１．５ｍｌ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆタンパク質ＬｏＢｉｎｄチューブにアリコートし、－８０℃で保管した。

【0224】

ヒト生物流体および脳組織
２つの臨床コホート：１つはＢＷＨ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙからのもの、もう１つはＭａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇからのものから、ヒトＣＳＦおよび血漿を得た。表１には、両コホートの人口統計上の特質およびさらなる詳細が示されている。腰椎穿刺診断のために紹介されたＢＷＨ患者は、血漿試料および追加のＣＳＦの提供、ならびにＢＷＨ ＩＲＢの承認下での医療記録へのアクセスに同意した。血液をＥＤＴＡチューブに収集し、１５００ｇで１５分間遠心分離し、血漿をアリコートして－８０℃で凍結した。すべては収集後３時間以内だった。ＣＳＦをポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）へと直接吸引した。ＣＳＦの一部を、ＡＤｍａｒｋパネル（Ａβ_１－４２、Ｔ－タウ、およびＰ－タウからなる）のためにＡｔｈｅｎａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓに送付し、残りはドライアイスで直ちに凍結し、次いで解凍して後日アリコートした。臨床診断情報は、ＡＤｍａｒｋまたは研究ＥＬＩＳＡ結果が判明する前に、有資格行動神経科医によるカルテレビューから得た。

【0225】

Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ａｇｉｎｇ（ＭＣＳＡ）は、ミネソタ州オルムステッド郡に住む住民を対象とした集団ベースの前向き研究である。研究設計および参加者募集の詳細は公開されている［４６、４７］。２００４年に、ロチェスター疫学プロジェクト（ＲＥＰ）医療記録リンクシステムを使用して７０歳～８９歳のオルムステッド郡住民を記載のように一覧にした［４８］。２０１２年には、ＭＣＳＡは５０歳以上の住民を含むように拡大された。本分析には、本発明者らが、本明細書に記載のように血漿Ａβ多量体を測定した７３人のＭａｙｏ参加者が含まれていた。対象の登録、試料の収集、施設間での試料の共有は、メイヨークリニックおよびオルムステッドメディカルセンターが承認した。研究プロトコールは、メイヨークリニックおよびオルムステッドメディカルセンターの施設内治験審査委員会による承認を受け、すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントを得た。

【0226】

ＢＷＨまたはＭＧＨにおいて、診断解剖を受けたＡＤの可能性が高い死亡ドナーからヒト脳組織を得た。一方の半球を診断のために固定し、他方の半球を冠状にスライスし、－８０℃で凍結した。すべてのヒト対象研究は、マサチューセッツ州ジェネラルブリガム施設内治験審査委員会による事前承認を受け、すべてのヒト対象についてインフォームドコンセントを得た。

【0227】

【表2】

【0228】

電気生理学的細胞外フィールド記録
実験は、以前に記載のように実施した［１３］。簡単に説明すると、マウス（１～３月齢）をハロタンで深く麻酔し、断頭した。横断鋭利海馬スライス（３５０μｍ）を、２０６ｍＭスクロース、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１．２５ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１０ｍＭ Ｄ－グルコース、ｐＨ７．４を含む氷冷した酸素化スクロース増強人工脳脊髄液（oxygenated sucrose-enhanced artificial cerebrospinal fluid）（ａＣＳＦ）中で切断した。解剖後、９５％Ｏ_２および５％ＣＯ_２で飽和させた、以下のもの（単位はｍＭ）：１２４ ＮａＣｌ、２ ＫＣｌ、２ ＭｇＳＯ_４、１．２５ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２．５ ＣａＣｌ_２、２６ ＮａＨＣＯ_３、１０ Ｄ－グルコース（ｐＨ７．４）を含むａＣＳＦ中でスライスをインキュベートし、記録前に少なくとも９０分間回復を可能にした。記録は、ａＣＳＦに沈水させたチャンバー内で室温の同じ溶液中で実施した。海馬のＣＡ１領域のフィールドＥＰＳＰ（ｆＥＰＳＰ）を記録するために、標準的手順を使用した。最大値の４０～５０％だったｆＥＰＳＰ振幅を誘発した刺激強度の低周波数（０．０５Ｈｚ）で試験刺激を適用し、応答の安定性を確保するために実験を開始する前に試験応答を１０分間記録した。安定した試験応答が得られたら、実験処理のために、０．５ｍＬのＡＤ脳ＴＢＳ浸漬抽出物を、９．５ｍＬのａＣＳＦ灌流液に添加し、ベースラインをさらに３０分間記録した。抗Ａβ抗体実験では、７１Ａ１抗体をＡＤ脳抽出物のアリコートに添加し、混合しながら３０分間インキュベートし、次いで混合物を脳スライス灌流緩衝液に添加した。ＬＴＰを誘導するために、１００Ｈｚの刺激を２０秒間隔で２回連続（１秒間）してスライスに適用した。ｐＣｌａｍｐ１１によりトレースを得、Ｃｌａｍｐｆｉｔ１１を使用して分析した。データ分析は以下の通りである。初期ｆＥＰＳＰ傾きを使用してｆＥＰＳＰ振幅を測定し、３つの連続する傾き（１分間）を平均し、前処置刺激の１０分前に記録した平均値に対して正規化した。データは平均値±ＳＥＭとして表示されている。有意差は、事後テューキー検定による一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して決定した。

【0229】

電気泳動およびＷＢ
ＭＥＳ－ＳＤＳランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して試料を４－１２％または１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（ＳｕｒｅＰＡＧＥ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）に負荷し、ニトロセルロース膜に転写し、標準的ＷＢを使用して種々のタンパク質をプローブした。得られたブロットをＥＣＬで検出し、シグナルをフィルムで捕捉した。

【0230】

免疫沈降
８００μＬのヒト脳ＴＢＳ浸漬抽出物またはＣＳＦ試料を、１０μｇの抗体と共に４℃で１時間インキュベートした。免疫沈降物（ＩＰ）をプロテインＧ磁気ビーズ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）と共に４℃で一晩インキュベートし、次いでＴＢＳで３回洗浄した。ＩＰ後溶液も分析のために保存した。次いで、免疫沈降タンパク質を、８Ｍ塩酸グアニジン（ＧｎＣＬ）（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）で溶出した。

【0231】

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
脳ＴＢＳ浸漬抽出物またはＣＳＦ（総容積３５０μＬ）を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅに注入し、ＴＢＳ、ｐＨ７．４で高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）装置（ＡＫＴＡ；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に流した。下流の実験のために５００μＬの画分を収集した。カラムを、１，３５０～６７０，０００Ｄａの範囲のゲル濾過標準物質（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で較正した。

【0232】

７１Ａ１を使用した親和性精製
脳ＴＢＳ浸漬抽出物（２ｍＬ）を、５０ｕｇのビオチン化７１Ａ１で予めコンジュゲートした高容量ストレプトアビジンアガロース樹脂（Ｐｉｅｒｃｅ）と、室温（ＲＴ）で２時間旋回させながら混合した。ビーズを１０カラム容量のＳＭＣｘＰＲＯ洗浄緩衝液でよく洗浄し、０．２Ｍグリシン（ｐＨ３）で溶出し、続いて１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で中和した。親和性精製した物質を、ＰＤ ＭｉｄｉＴｒａｐ Ｇ－２５を使用してＰＢＳ（ｐＨ７．４）で脱塩してから、海馬スライスに適用した。

【0233】

ＭＳＤ ＥＬＩＳＡ
ヒト脳抽出物、ＣＳＦ、免疫沈降試料、およびＳＥＣ画分を各々、洗浄緩衝液（０．０５％ Ｔｗｅｅｎで補完したＴＢＳ）中１％ＢＳＡで希釈した。本発明者らの自家製Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙアッセイ（ＭＳＤ）電気化学発光プラットフォームでは、未コーティング９６ウェルマルチアレイプレート（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｌ１５ＸＡ－３）の各ウェルを、捕捉抗体を含む３０μＬのＰＢＳ溶液でコーティングし（すべてのヒトＡβ ＥＬＩＳＡについて、３μｇ／ｍＬ ２６６、Ａβの中間領域を認識するモノクローナル抗体［ソラネズマブのマウスアナログ］）、室温で一晩インキュベートし、続いて洗浄緩衝液中５％ＢＳＡで１時間、室温にて＞３００ｒｐｍで振盪しながらブロッキングした。検出抗体溶液は、ビオチン化検出抗体、１００ｎｇ／ｍＬのストレプトアビジンスルホＴＡＧ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、＃Ｒ３２ＡＤ－５）、および洗浄緩衝液で希釈した１％ＢＳＡを用いて調製した。ブロッキングステップに続いて、５０μＬ／ウェルの試料、続いて２５μＬ／ウェルの検出抗体溶液を、＞３００ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間インキュベートし、インキュベーション間に１５０μＬの洗浄緩衝液でウェルを洗浄した。製造業者のプロトコールに従ってプレートを読み取り、分析した。特異的抗原の検出に使用した抗体は、ｈＡβ（１－４０特異的）の場合は１３９－５（ウサギ組換え体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）であり、ｈＡβ（１－４２特異的）の場合はＤ３Ｅ１０（ウサギ組換え体、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）だった。

【0234】

ＳＭＣｘＰＲＯイムノアッセイ
ＳＭＣｘＰＲＯプラットフォーム（Ｓｉｇｍａ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、単一分子計数技術に基づいており、典型的には、従来の検出系と比較して２０～１００倍の感度増加が可能である。Ｓｉｇｍａ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅのキットを使用して、ビオチン化捕捉ｍＡｂ（１Ｃ２２、１Ｇ５、および７１Ａ１）をストレプトアビジン磁性粒子（ＭＰ）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、ＭＰ１ミリグラム当たり１２．５μｇのビオチン化抗体の比率でコンジュゲートした。捕捉ｍＡｂが結合したＭＰを、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．０００５％（重量／容積）ｄ－デス－チオ－ビオチン、および０．１％ウシ血清アルブミン）を有するＡβ多量体アッセイ緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝液；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）で５０μｇ／ｍＬに希釈した。５０μＬのこの懸濁物を１５０μＬの試料、標準物質、またはブランクに添加し、２５℃の振盪インキュベーターで６００ｒｐｍにて２時間インキュベートした。磁石を使用してＭＰを単離し、ＨｙｄｒｏＦｌｅｘプレート洗浄機（Ｔｅｃａｎ Ｇｒｏｕｐ ＡＧ、メンネドルフ、スイス）を使用して１×ＳＭＣ洗浄緩衝液で洗浄することにより、未結合物質を除去した。蛍光標識（Ａｌｅｘａ－６４７色素）検出抗体３Ｄ６（２０μＬ、２００ｎｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。次いで、抗体－多量体Ａβサンドイッチを有するＭＰを、Ｊｉｔｔｅｒｂｕｇ振盪機（Ｂｏｅｋｅｌ、フェスタービル、ペンシルベニア州、米国）を使用して撹拌しながら２５℃で１時間インキュベートした。洗浄緩衝液で４回洗浄することにより未結合検出試薬を除去した。洗浄緩衝液を吸引により除去し、溶出緩衝液Ｂ（１１．５μＬ／ウェル）で１０分間２５℃にて振盪することにより蛍光標識３Ｄ６検出抗体を放出させた。次いで、１１μＬの溶出物を、中和緩衝液Ｄ（１１μＬ／ウェル）を含む清浄９６ウェルプレートのウェルに移した。次いで、中和した試料（２０μＬ／ウェル）を、黒色３８４ウェル読取りプレート（Ａｕｒｏｒａ）に移し、ＳＭＣｘＰＲＯ機器で読み取った。蛍光標識抗体を６４２ｎｍレーザーで励起させ、検査空間を通過させると、蛍光標識抗体は共焦点顕微鏡レンズおよび光子検出器を使用して測定される光を放射する。検出器からの出力はパルス列であり、各パルスは、検出された１つの光子を表す。信頼定量化の下限（ＬＬｏＱ）は、バックグラウンドの２倍のシグナルを提供し、算出された回収パーセンテージが８０％～１００％であり、分散係数（ＣＶ）が≦２０％である、最小逆補間標準物質であると規定した。

【0235】

免疫組織化学
新鮮なまたは解凍した（冷凍ストックから）ヒト脳ブロックを、Ｔｉｓｓｕｅ－Ｔｅｋ（登録商標）Ｏ．Ｃ．Ｔ．に包埋した。化合物を－８０℃で一晩凍結させた。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ）を使用して２０～３０μｍ厚に切片化する前に、凍結ブロックを２時間－２０℃に変更して、切片化のために組織を柔らかくした。次いで凍結切片を、ＭＡＳ－ＧＰ（商標）Ａｄｈｅｓｉｏｎ顕微鏡スライド（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ）に直接マウントし、染色まで４℃で保管した。３，３０－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色には、凍結切片を、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳで３０分間平衡化し、続いて内因性ペルオキシダーゼ活性および抗体非特異的結合をそれぞれ１時間ブロッキングした。一次抗体をＰＢＳＴで希釈し、切片とともに４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳＴで３回洗浄した後、切片を、ビオチン化二次抗体と共に１時間インキュベートした。免疫反応産物を、１）増強試薬として硫酸ニッケルアンモニウムを含むＤＡＢ、または２）Ｖｉｎａ Ｇｒｅｅｎ ｃｈｒｏｍｅ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）と共にインキュベートすることにより視覚化した。染色切片を、Ａｘｉｏｓｋｏｐ２（Ｚｅｉｓｓ）を使用して観察した。

【0236】

定量化および統計分析
統計分析はすべて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェアを使用して実施した。実験の統計詳細は、本文および／または図凡例に記載されている。

【0237】

[実施例４．１]
７１Ａ１および１Ｇ５の免疫原設計およびモノクローナル抗体生成
モノクローナル抗体７１Ａ１（親クローン７Ａ１ａのサブクローン）および１Ｇ５は、単量体アミロイドβタンパク質（Ａβ）の二量体化の際に形成される潜在的な三次元構造を模倣するように設計された合成立体構造ペプチド免疫原に対して生じたものだった。Aβ_１－４０のアミノ酸残基９～１８を含むペプチド免疫原を合成し、環化して、安定二量体様形成物へのフォールディングを可能にするように合成後修飾した（特許出願中）。Ａβペプチドの残基９～１８を選択した背後にある理論的根拠は、この領域のアミノ酸が、Ａβの凝集形態にのみ存在する固有の三次元構造へと再会合する可能性が高いと考えられるということだった。

【0238】

Ｂａｌｂ／ｃマウスを、脾臓摘出術の前に、一次および二次免疫にはマレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体複合体を使用し、その後の追加免疫には独占所有のヘルパー２Ｔ細胞エピトープを使用して、この環化立体構造ペプチドで免疫した。免疫化マウス脾細胞および融合パートナーとしてのマウス骨髄腫Ｆ０細胞を使用して融合を実施した。免疫原による一次スクリーニングおよびサブクローニングの後、特に２つのモノクローナル抗体候補（７１Ａ１および１Ｇ５）は、環化ペプチドに対して高い特異性を示したが、直線状ペプチドに対しては特異性を示さなかった。こうした抗体の初期特徴付けは、Ａβの合成および内因性多量体形態に対して高い特異性を有し、単量体Ａβには結合しないことを示していた［４４］。

【0239】

[実施例４．２]
７１Ａ１および１Ｇ５は、ヒト脳のＡβを生化学的および組織学的に認識する
本発明者らは、こうした２つの新規抗体１Ｇ５および７１Ａ１を、ヒトＡβの天然源に対して試験した。まず、本発明者らは、「浸漬抽出」と呼ばれる最近開発された方法［１１］を使用して、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）中でわずか３０分間インキュベートした神経病理学的に典型的なＡＤ皮質の細かく刻んだ脳小片からホモジナイズせずに高拡散性Ａβ種を得た。こうした拡散性水性抽出物は、ＡＤ皮質試料のシナプス毒性活性のほとんどを保持することが示されている。浸漬後の脳小片をその後ホモジナイズすることにより、より多くのＡβが得られるが、これにはシナプス毒性活性はほとんどない［１１］。浸漬手順を図３Ａに図示する。本発明者らは、陽性対照抗体４Ｇ８（主として抗単量体）および１Ｃ２２（抗多量体）ならびに陰性対照正常マウスＩｇＧと共に、１Ｇ５および７１Ａ１を使用して、ＡＤ脳浸漬抽出物からの免疫親和性プルダウンを実施した。１Ｇ５および７１Ａ１は両方とも、異なるＡβエピトープに対して生じた２つのウサギモノクローナル組換え抗体（ｍＡｂ）でプローブしたイムノブロットから判断して、ＡＤ脳浸漬抽出物からプルダウンしたＡβは、４Ｇ８および１Ｃ２２と比較して非常により少なかったが、ＡβをプルダウンしなかったマウスＩｇＧよりも一貫して多くをプルダウンした（図３Ｂ）。変性ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、可溶性ｏＡβが単量体へとおよびある程度共有結合で結合した二量体へと解体されるため［４９］、本発明者らは、約６～７ｋＤａ付近およびそれを下回る箇所にイムノブロットシグナルを観察した（図３Ｂ、下段パネル（長時間曝露））。次いで、この知見を確認するために、本発明者らは、本発明者らの高度に特異的な自家製Ａβｘ－４０およびｘ－４２単量体イムノアッセイを使用して［５０、５１］、１Ｇ５、７１Ａ１、１Ｃ２２（陽性対照）、およびマウスＩｇＧ（陰性対照）により３つの個々のＡＤ脳からプルダウンされたＡβ含有量を定量化した。図３Ｃ（プロテインＧビーズでプルダウンしたＡβを、次いで塩酸グアニジン（ＧｎＣｌ）で変性させた）および図３Ｄ（ＩＰ後上清に残ったＡβを、次いでＧｎＣｌで変性させた）に示されているように、１Ｇ５および７１Ａ１は両方とも、常に陰性対照マウスＩｇＧよりも多いが、１Ｃ２２よりは非常により少ない、少量だが一貫した量のＡβをＡＤ脳浸漬抽出物からプルダウンした。この結果は免疫ブロットデータと一致した（図３Ｂ）。また、４つの抗体によるプルダウンおよび免疫枯渇が一貫していることを示すために、本発明者らは、４つの抗体によるＩＰでおよびＩＰ後に得られた、３つのＡＤ脳からのＡβ質量（単位はｎｇ、ＡＤＤＬ標準物質に対して測定）を計算した。

【0240】

このようにして１Ｇ５および７１Ａ１が高度に可溶性のヒト脳抽出物に由来するＡβに結合することができることを確立した後、本発明者らは、免疫組織化学を使用して、１Ｇ５および７１Ａ１がヒト脳内のＡβ斑を標識することができるか否かを調べた。本発明者らは、免疫組織化学での使用についてまず１Ｃ２２を試験した際、１Ｃ２２は、典型的なＰＦＡ固定ＡＤ脳切片を染色することはできなかったが、未固定の凍結切片を容易に染色することができたことを見出した（図４Ａ）。さらに、後者の切片を４％ＰＦＡで２０分間処理すると、１Ｃ２２免疫反応性のほとんどが減少した（図４Ａ）。この現象は、立体構造エピトープを認識する抗体によく見られるものである。１Ｇ５および７１Ａ１について、本発明者らは、１）両抗体が、未固定凍結切片中の細胞外アミロイド斑（つまり、堆積したＡβ）を同様のパターンで標識し、２）２０分間の４％ＰＦＡ処理により、標識が実質的に減少したことを見出した（図４Ａ）。

【0241】

こうした抗体が実質部Ａβを標識したことをさらに確立するために、本発明者らは二重免疫染色を使用した。凍結切片をＤ５４Ｄ２で連続的に標識し（Ａβ Ｎ末端領域に対して。ＤＡＢにより視覚化された総Ａβを表す）、次いで１Ｃ２２または７１Ａ１（Ｖｉｎａ Ｇｒｅｅｎにより視覚化）のいずれかで標識した。図４Ｂでは、左側パネルは、Ｄ５４Ｄ２のみがアミロイド斑を標識したことを示し、中央パネルは、総Ａβ（ＤＡＢ）についてのＤ５４Ｄ２および１Ｃ２２または７１Ａ１（ｖｉｎａ Ｇｒｅｅｎ）により二重標識されたアミロイド斑を示し、右側パネルは二重標識斑を高倍率で示す。こうした知見は、７１Ａ１および１Ｇ５が、Ａβ脳堆積をｉｎ ｓｉｔｕで認識することを裏付けている。また、本発明者らは、Ａβに対する特異性を示すために、１Ｃ２２、１Ｇ５、および７１Ａ１を、斑のない対照脳で試験した。３つの抗体はすべていかなるシグナルも検出することができなかった（データは示さず）。

【0242】

１Ｇ５および７１Ａ１の免疫反応性は、以前に示されている多量体優先性１Ｃ２２［５２、５３］と類似していたため、本発明者らは、次に、２つの新しい抗体が、可溶性ＡＤ脳抽出物のＡβ誘導性シナプス毒性に対する防御を示すことができるか否かを調べた。本発明者らは、野生型（ｗｔ）マウス脳海馬スライスの電気生理学を使用して［５４］、スライス灌流液に２．１２μｇ／ｍＬで添加した７１Ａ１は、ＡＤ浸漬抽出物による海馬ＬＴＰの阻害を完全に防止するが、それ自体はＬＴＰに対して効果を示さないことを見出した（図４Ｃ）。具体的には、人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）ビヒクル単独でのｆＥＰＳＰ傾きは、１５２．６±５．３％（Ｎ＝６）；ａＣＳＦ＋ＡＤ抽出物では：１１５．７±４．９％（Ｎ＝５）；ａＣＳＦ＋７１Ａ１単独では：１４９±８．３％（Ｎ＝４）；および７１Ａ１と事前混合したａＣＳＦ＋ＡＤ抽出物では：１５４．９±９．８％（Ｎ＝４）だった。この効果は、本発明者らが以前に報告したｍＡｂ ３Ｄ６および８２Ｅ１のｏＡβ中和利益とよく似ていた［１３］。さらに、本発明者らは、７１Ａ１を使用して、同じＡＤ脳浸漬抽出物からｏＡβを親和性精製し、精製されたｏＡβのシナプス毒性をｗｔマウス脳海馬スライスに対して試験した。親和性精製されたｏＡβも、海馬ＬＴＰを有意に抑制した（図４Ｄ）。１）ＡＤ脳抽出物単独と７１Ａ１と事前混合したＡＤ脳抽出物との間の差異の統計分析は、７１Ａ１が抽出物により引き起こされるＬＴＰ欠損を有意にレスキューしたことを裏付け（図４Ｅ）、および２）７１Ａ１で精製したｏＡβとａＣＳＦ対照との間の差異の統計分析は、７１Ａ１で精製したｏＡβが、入力浸漬抽出物と同様に、ＬＴＰを有意に阻害したことを示した（図４Ｆ）。まとめると、こうしたデータは、７１Ａ１反応性Ａβ種が、プロテインＧによる免疫沈降により示されるようにＡＤ脳におけるｏＡβが少数集団であるにも関わらず（図３Ｂ～３Ｄ）、７１Ａ１により中和することができるシナプス毒性を付与することを示している。

【0243】

[実施例４．３]
７１Ａ１および１Ｇ５は、１Ｃ２２の逆で、脳よりもＣＳＦにおいて優先的にＡβ種に結合する
次に、本発明者らは、１Ｇ５および７１Ａ１が、別の天然源であるヒトＣＳＦからＡβをどの程度認識することができるかを調べた。脳浸漬抽出物からの親和性プルダウンで使用したものと同様の実験セットアップを用いて（図３Ｃ、３Ｄ）、本発明者らは、１Ｇ５、７１Ａ１、１Ｃ２２、およびマウス正常ＩｇＧ（対照）を使用して、ブリガムアンドウィメンズ病院の記憶障害クリニックで収集されたＡＤ患者に由来する３つの個々のＣＳＦ試料からのプルダウンを行った。１Ｇ５および７１Ａ１は各々、ＧｎＣＬ変性後のＡβｘ－４０およびｘ－４２単量体イムノアッセイにより測定して、驚くほど多量のＡβを免疫沈降させ（図５Ａ、上段パネル）、それに対応してＩＰ後上清ではＡβの量は減少した（図５Ａ、下段パネル）。さらに、上記で研究した可溶性ＡＤ脳抽出物とは対照的に、１Ｇ５および７１Ａ１は両方とも、１Ｃ２２よりも高い相対量のＡβｘ－４２をＣＳＦからプルダウンした。これは、ヒト脳とＣＳＦとの間には天然Ａβ集団に差異がある可能性があることを示唆する。また、本発明者らは、３つのＣＳＦ試料すべてにおいて、７１Ａ１が１Ｇ５よりも高いＡβプルダウン効率を示したことを見出した（図５Ａ）。したがって、本発明者らは、７１Ａ１を使用して、同じＢＷＨクリニックからの１９個の異なるＣＳＦに対してＩＰ－ＥＬＩＳＡを実施することにした（患者人口統計および診断については表１を参照）。７１Ａ１は、ＣＳＦ試料のすべてからＡβを免疫沈降した（図５Ｂ）。次に、本発明者らは、このＩＰ－ＥＬＩＳＡデータが、本発明者らのクリニックにより同じＣＳＦから得られた市販のＡＤｍａｒｋ Ａβ１－４２レベルと相関するか否かを調べた。本発明者らの７１Ａ１免疫沈降物（ＩＰ）からのＡβｘ－４２シグナル（ＧｎＣｌ変性後）は、本発明者らの１９個のＣＳＦ全体にわたってＡＤｍａｒｋ ＣＳＦ Ａβ１－４２レベルと有意に相関し（Ｒ^２＝０．４３、ｐ＝０．００４６）（図５Ｃ）、本発明者らの７１Ａ１親和性精製の特異性および信頼性が裏付けられた。ここで、本発明者らは、図５Ａの３つのＣＳＦからの、４つの抗体によるＩＰおよびＩＰ後のＡβ質量（ｎｇ）も計算した。本発明者らは、脳浸漬抽出物の場合とは異なり、４つの異なる抗体のＩＰ＋ＩＰ後が、３つの個々のＣＳＦ試料にわたって同じ傾向を共有していたものの、完全には一致しなかったことを見出した。この知見は、本発明者らが、ＩＰ－ＥＬＩＳＡをさらに使用して、ｏＡβを生物流体試料から正確に定量化することを妨げた。

【0244】

上記の結果は、数多くの脳、ＣＳＦ、および潜在的には血漿試料中の７１Ａ１反応性Ａβ種の相対レベルを定量化するためのこうしたＡβ ＩＰ－ＥＬＩＳＡ手法の技術的限界を浮き彫りにしている。したがって、本発明者らは、生物流体中の見かけのＡβ多量体をより正確に定量化するためのサンドイッチイムノアッセイの開発を進めた。この状況において、本発明者らは、ヒトＣＳＦ中の１Ｃ２２反応性Ａβ多量体を以前に定量化したが、１Ｃ２２は、高感度Ｅｒｅｎｎａイムノアッセイ系（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた場合でも、少量のＣＳＦ Ａβ多量体をプルダウンしたため（図５Ａ）、すべての試料から十分なレベルを得るために希釈せずに（ニートで）ＣＳＦを使用することを余儀なくされた（図５Ａ）。本発明者らは、脳抽出物よりもＣＳＦ中のＡβ多量体に対して高い結合能力を有する（１Ｃ２２とはまったく対照的に）７１Ａ１の固有の特性（上記）を活用して、ＣＳＦおよび最終的には血漿などの生物流体中のｏＡβレベルをより良好に定量化するための、７１Ａ１を捕捉体として使用するサンドイッチイムノアッセイを設計した。

【0245】

[実施例４．４]
７１Ａ１／３Ｄ６アッセイは、Ａβ多量体を高感度で特異的に定量化する
本発明者らは、ヒトＣＳＦおよび血漿中で検出を行うための、１Ｇ５および７１Ａ１反応性Ａβ種の定量化高感度イムノアッセイを開発した。Ｅｒｅｎｎａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）プラットフォームで確立した本発明者らの１Ｃ２２／３Ｄ６ ｏＡβサンドイッチＥＬＩＳＡと同様に［３０、３１］、本発明者らは、磁気ストレプトアビジンコーティングビーズにコンジュゲートされた捕捉抗体としてのビオチン化１Ｇ５または７１Ａ１、および検出器抗体としての３Ｄ６（Ａｌｅｘａ－６４７色素で標識）を、ビーズベースのイムノアッセイプラットフォームＳＭＣｘＰＲＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＥｒｅｎｎａのアップグレードバージョン）で使用した（図６Ａ）。図６Ｂ～６Ｄに示されているように、本発明者らが合成ＡＤＤＬの従来の較正物質を使用した場合［１］、７１Ａ１／３Ｄ６アッセイおよび１Ｇ５／３Ｄ６アッセイは両方とも、１）本発明者らが以前に開発した１Ｃ２２／３Ｄ６多量体アッセイ［３０］と同じ０．６ｐｇ／ｍＬのＬＬｏＱ；２）８０～１２０％であると計算された回収率；３）ＣＳＦおよび血漿で使用される適切な希釈率で検出可能な分析物濃度の範囲全体を容易にカバーする（下記を参照）０．６～８０ｐｇ／ｍＬのＡＤＤＬ濃度範囲にわたって２０％を大幅に下回るアッセイ内ＣＶを示した。プルダウン有効性および一貫性の観点で７１Ａ１が１Ｇ５を凌駕した本発明者らのＩＰ－ＥＬＩＳＡアッセイで観察されているように（図５Ａ）、本発明者らは、ヒト生物流体に見出される多量体Ａβに対する７１Ａ１／３Ｄ６アッセイの特異性を検証することに焦点を当てた。

【0246】

７１Ａ１が単量体ＡβよりもｏＡβを優先的に認識するか否かを評価するために、本発明者らは、ジスルフィド結合を介して共有結合で連結された合成Ｓ２６Ｃ Ａβ４０二量体［４５］を使用した。この二量体は、ＤＴＴなどの還元剤により単量体形態へと戻すことができる。本発明者らは、このＡβ４０二量体に対する新しい７１Ａ１／３Ｄ６アッセイおよび以前の１Ｃ２２／３Ｄ６アッセイを比較する前に、まず、２つのアッセイが、ＡＤＤＬに対して同じ感度を有することを示した（図６Ｅ）。１Ｃ２２／３Ｄ６ ｏＡβアッセイおよび７１Ａ１／３Ｄ６アッセイは両方とも、還元単量体対応物よりも非還元Ｓ２６Ｃ Ａβ４０二量体（図６ＦのＳＤＳ－ＰＡＧＥにより確認）に対して強力で有意な結合優先性を示した（図６Ｇ～６Ｈ）。この結果は、１Ｃ２２抗体および７１Ａ１抗体は両方とも、高次構造を有するＡβに優先的に結合する一方で、単量体Ａβとの結合は１００分の１よりも少ないことを示唆している。さらに、７１Ａ１／３Ｄ６アッセイは、１Ｃ２２／３Ｄ６アッセイよりもＳ２６Ｃ Ａβ４０二量体に対して非常により高い感度を示した。７１Ａ１／３Ｄ６アッセイでは８ｐｇ／ｍＬのＳ２６Ｃ Ａβ４０二量体が、１Ｃ２２／３Ｄ６アッセイでの１．５ｎｇ／ｍＬのＳ２６Ｃ Ａβ４０二量体と同様のシグナルを示した（図６Ｇ対６Ｈ；横軸の単位が違うことに留意されたい）。これは、ＡＤ脳由来ｏＡβ対ＣＳＦ中のｏＡβに対するそれぞれの結合優先性の点で、７１Ａ１と１Ｃ２２との間で観察された違いを説明するのに役立つ可能性がある（図３Ｃおよび５Ａを比較）。

【0247】

合成多量体Ａβ対単量体Ａβに対する７１Ａ１／３Ｄ６アッセイの感度および特異性を評価した上で、本発明者らは、７１Ａ１／３Ｄ６アッセイが、ヒト脳浸漬抽出物などの天然源からｏＡβを容易におよび正確に測定することができるか否かの試験に進んだ。本発明者らは、ヒト脳浸漬抽出物（組織：浸漬緩衝液＝１：５重量／容積）を、１０００倍、２０００倍、４０００倍、および２０，０００倍に系列希釈し、希釈した試料を７１Ａ１／３Ｄ６アッセイで測定した（図６Ｉ）。本発明者らは、希釈した脳浸漬抽出物試料からのシグナルが、完全に希釈可能であり、２０，０００倍での平均回収％は９３．３％であることを見出した（図６Ｉ、下段パネル）。７１Ａ１／３Ｄ６アッセイのこの希釈直線性試験は、幅広い濃度範囲にわたって天然の生物学的物質からｏＡβを測定する能力を示した。

【0248】

[実施例４．５]
７１Ａ１／３Ｄ６アッセイは、脳内の高分子量Ａβ多量体を認識する
次に、本発明者らは、どの種類の天然ｏＡβ種が７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイにより検出されるのかを調査した。本発明者らは、非変性サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、分子量（ＭＷ）標準物質で較正されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ高分解能カラムでヒトＡＤ脳浸漬抽出物を分画した（図７Ａ）。本発明者らは、カラムの空隙容量から開始して３０個のＳＥＣ画分に対して７１Ａ１／３Ｄ６アッセイを実施した（図７ＢにおけるＵＶ２８０クロマトグラムの画分）。７１Ａ１／３Ｄ６シグナル（ｐｇ／ｍＬ単位のＡＤＤＬ較正物質で測定）は、空隙容量範囲内の画分番号３～６でピークに達した。これは、推定分析物サイズが少なくとも６７０ｋＤａであることを示す（図７Ｃ）。画分番号３～６のこの７１Ａ１／３Ｄ６シグナルが実際にＡβを表していることを確認するために、本発明者らは、８Ｍ ＧｎＣｌを使用して３０個の画分を変性させ、次いで十分に確立された単量体Ａβ４２イムノアッセイ（捕捉：ｍ２６６、検出器：Ｄ３Ｅ１０、ＭＳＤプラットフォーム）［１１、５０］でそれらを測定した。本発明者らは、ＧｎＣｌ放出単量体Ａβ種が、７１Ａ１／３Ｄ６アッセイと同じ画分番号３～６でピークに達したことを見出した（図７Ｃを図７Ｄ［ＧｎＣｌ（＋）＝明灰色バー、各対のバーの右側］と比較されたい）。本発明者らは、同じＡβ単量体アッセイにより、天然で単量体である種（図７Ｄ：ＧｎＣｌ（－）＝濃灰色バー、各対の左側）が、主に画分番号１９～２６に溶出することを見出した。まとめると、こうしたデータは、ＡＤ脳浸漬抽出物の画分番号３～６で観察された豊富な７１Ａ１／３Ｄ６シグナルが、ＧｎＣｌによりＡβ単量体へと変性させることができる高次高ＭＷ可溶性Ａβ多量体を表しており、このアッセイでは、１Ｃ２２／３Ｄ６ ｏＡβアッセイで以前に検出されたパターンと同様に［３０、５３］、単量体の検出が非常に不良であることを示唆している。

【0249】

[実施例４．５]
７１Ａ１／３Ｄ６アッセイは、ヒトＣＳＦ中の低分子量Ａβ多量体を定量化する
７１Ａ１／３Ｄ６アッセイをヒトＣＳＦに対して検証するために、本発明者らは、脳浸漬抽出物で使用したステップと同様の希釈直線性試験を実施した（図８Ａ）。本発明者らは、１：２および１：４希釈では９８．９４％の平均回収率を観察し、その範囲では測定は正確で安定していたが、１：８希釈（図８Ａ）では希釈回収率が最適未満だった。その理由は不明である。本発明者らは、７１Ａ１／３Ｄ６アッセイを使用して、記憶障害クリニック（ブリガムアンドウィメンズ病院）で集められた、様々な神経学的診断を受けた３６人の対象のコホート（表１：患者人口統計および診断情報）に由来するＣＳＦを測定することに進んだ。３６個の試料すべてが、７１Ａ１／３Ｄ６アッセイにより定量化され、平均レベルは５．４７ｎｇ／ｍＬであり、範囲は１．７５～２０．３８ｎｇ／ｍＬだった（図８Ｂ～８Ｄ）。本発明者らは、こうしたＣＳＦ ７１Ａ１／３Ｄ６レベルが、広く使用されている市販のＡＤｍａｒｋ臨床アッセイ（Ａｔｈｅｎａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）により測定した、ＣＳＦ中のＡＤ病理の他のバイオマーカーと相関するか否かを調べた。ＡＤｍａｒｋデータは、３６試料中２９試料で利用可能であったため、こうした２９試料に対して相関性を実施した。こうしたＣＳＦでは７１Ａ１／３Ｄ６ ｏＡβシグナルとＡＤｍａｒｋ Ａβ１－４２単量体レベルとの間に統計的に有意な相関性はなかったが（図８Ｂ）、７１Ａ１／３Ｄ６シグナルとＡＤｍａｒｋ総タウ（Ｒ^２＝０．４１、ｐ＝０．０００２）およびホスホ－タウ（phosho-tau）（ｐＴ１８１）（Ｒ^２＝０．４２、ｐ＝０．０００１；ピアソン相関係数）との間には強力に有意な相関性があった（図８Ｃ～８Ｄ）。脳浸漬抽出物ＳＥＣ画分の本発明者らの分析と同様に（図７Ａ～７Ｄ）、本発明者らは、カラムの空隙容量から開始してヒトＣＳＦの３０個のＳＥＣ画分に対して７１Ａ１／３Ｄ６アッセイを実施した（ＵＶ２８０クロマトグラムは図８Ｅに示されている）。７１Ａ１／３Ｄ６シグナル（ｐｇ／ｍＬ単位のＡＤＤＬ較正物質で測定）は、２つのピークを示した：より小さなピークは番号３～６、より大きなピークは番号２４～２８だった（図８Ｆ）。これは、脳浸漬抽出物（図７Ｃ）とは異なる分布だった。こうしたデータをまとめると、７１Ａ１／３Ｄ６アッセイは、脳浸漬抽出物に見出される高分子量多量体に加えて、ヒトＣＳＦに見出される低分子量Ａβ多量体を定量化することができることが示される。

【0250】

[実施例４．６]
７１Ａ１／３Ｄ６アッセイはヒト血漿中のＡβ多量体を定量化する
ＣＳＦは、その採取が多くの人々にとっては侵襲的すぎると考えられており、扱いが比較的複雑であり高価であるため、バイオマーカー開発にとってまったく魅力的ではない。さらに、連続的な腰椎穿刺測定が行われることは非常にまれである。対照的に、採血は日常的に実施され、侵襲性が最小限であり、安価である。したがって、本発明者らは、イムノアッセイによる正確な定量化に技術的課題をもたらす非常に複雑なマトリックスである血漿における、７１Ａ１／３Ｄ６アッセイの正確性を確立しようとした。本発明者らは、１）血漿希釈および回収、２）分析物スパイク回収、および３）免疫枯渇により、血漿中のマトリックス干渉の度合いを試験した。４倍希釈と比べて、７１Ａ１／３Ｄ６アッセイは、６つの個々の血漿（メイヨークリニックアルツハイマー病研究センターから）の各々の最大１６倍希釈でほぼ１００％の希釈回収率（平均９６．６％）を示した（図９Ａ）。また、本発明者らは、このアッセイでは、ニート血漿（希釈なし）を使用した場合にのみ、血漿のマトリックス効果を観察した（図９Ｆ～９Ｇ）。したがって、本発明者らは、以下の実験では１：８希釈を使用することを選択した。本発明者らは、ＡＤ対象に由来する天然ｏＡβの３つの異なる供給源である、脳ホモジネート、脳浸漬抽出物、およびＣＳＦを使用して、８倍希釈血漿試料に対して分析物スパイク回収実験を実施した。それにより、それぞれ９７．５％、９２．９％、および９９．７％の優れた平均回収率値が得られた（図９Ｂ）。次いで、本発明者らは、ビオチン化抗体およびストレプトアビジンコーティングプレートを使用して、８倍希釈した個々の血漿に対して免疫除去実験を試みた。７１Ａ１は、７１Ａ１／３Ｄ６シグナルの平均で６１．５％を免疫枯渇させたが、１Ｃ２２は、７１Ａ１／３Ｄ６シグナルの１５．６％を免疫枯渇させたに過ぎなかった（図９Ｃ）。これは、７１Ａ１／３Ｄ６アッセイが血漿中のｏＡβ検出に対して特異的であることを示している。さらに、本発明者らは、脳ホモジネート、ＣＳＦ、および血漿中のＡβ多量体対単量体に対する７１Ａ１／３Ｄ６アッセイの特異性を調査した。本発明者らは、８ＭのＧｎＣｌによる多量体変性処理を施したかまたは施さなかったこうした試料を測定し、ＧｎＣｌが、脳ホモジネートからの７１Ａ１／３Ｄ６シグナルを＞７０％、血漿からの７１Ａ１／３Ｄ６シグナルを＞８４％減少させ、ＣＳＦからのシグナルを消失させた（＞９９％）ことを見出した（図９Ｄ）。イムノアッセイに対するＧｎＣｌの否定的な効果を排除するために、アッセイ前にすべての試料を大幅に希釈した（ＧｎＣｌの最終濃度は＜０．２５Ｍ）。

【0251】

要約すると、ＡＤ対象に由来する３つの異なる天然ｏＡβ源を用いた血漿希釈回収実験およびスパイク回収実験のデータはすべて、血漿７１Ａ１／３Ｄ６アッセイにおいて有意なマトリックス干渉を示さなかった。さらに、免疫枯渇実験は、個々のヒト血漿中のその標的に結合する７１Ａ１の能力を浮き彫りにする。したがって、本発明者らは、認知的に正常な７３人のコホート（メイヨークリニックアルツハイマー病研究センター）の８倍希釈血漿試料に対して７１Ａ１／３Ｄ６イムノアッセイを実施した。合成ｏＡβ（ＡＤＤＬ）標準曲線に基づく平均希釈調整濃度は、４３．３４±２９．０９ｐｇ／ｍＬだった（図９Ｅ、左側）。こうした四重重複血漿試料のＣＶは、５人の対象を除いて≦２０％であり（図９Ｅ、右側）、血漿アッセイの一貫性が示された。

【0252】

[実施例５]
多量体指向性Ａβ抗体は、脳内のシナプス毒性多量体Ａβを減少させ、ヒト化ＡＰＰノックインマウスの行動異常を改善する
アミロイドベータタンパク質の可溶性多量体（ｏＡβ）がアルツハイマー病（ＡＤ）の病原性カスケードの開始を支援するという強力な証拠が存在し、単量体または原線維状ＡβではなくｏＡβを標的とする療法戦略が示唆される。新しい抗体７１Ａ１は、合成単量体よりもｏＡβに対して約１００倍感受性である。７１Ａ１がＡＤ可溶性脳抽出物から特異的に免疫沈降させる物質は、完全抽出物と同様にシナプス機能を損なう。それと一致して、脳抽出物を７１Ａ１と共にプレインキュベートすることにより、そのシナプス毒性が中和される。７１Ａ１は、疾患関連ｏＡβに対して潜在的に固有の活性を有しており、そのためＡＤ治療の新規候補となる。

【0253】

方法
１５ｍｇ／ｋｇの７１Ａ１または抗ＫＬＨ（陰性対照）を、４５匹のヒト化ＡＰＰノックインマウス（ＡＰＰ ＮＬＧＦ／ＮＬＧＦ）に、８週齢から２０週齢まで毎週ｉ．ｐ．投与した。自発的交替行動（spontaneous alternation）（Ｙ字迷路）により認知を評価した。生化学的、電気生理学的、および免疫組織化学的分析のために、２１週齢で脳を採取した。自家製の超高感度アッセイを使用して単量体Ａβおよび多量体Ａβを測定するために、脳の拡散性（「浸漬」）抽出物を調製した。同じ浸漬抽出物のアリコートを使用して野生型マウス海馬スライスを処理し、長期増強（ＬＴＰ）を測定して、処理後のＡＰＰ^{ＮＬＧＦ／ＮＬＧＦ}脳におけるシナプス毒性を評価した。

【0254】

結果
６月齢のＡＰＰ^{ＮＬＧＦ／ＮＬＧＦ}の脳に由来するｏＡβは、野生型マウスのＬＴＰを損なったが、これは７１Ａ１での処置によりレスキューされる（図１０Ａ～１０Ｃを参照）。図１１Ａに示されているように、７１Ａ１処置は、対照抗体処置と比較して、雄マウスのＹ迷路成績を有意に向上させたが、雌マウスでは向上させなかった。その時点で、７１Ａ１処置は、雄マウスの脳におけるｏＡβ量を減少させた（統計的有意性のない傾向、図１１Ｂ）。加えて、７１Ａ１処置は、ＡＰＰ ＮＬＧＦ雄マウス脳のシナプス毒性を低減させ、それは、野生型マウス海馬のＬＴＰを阻害しなかったことにより反映される（図１２Ａ～１２Ｂを参照）。

【0255】

こうした結果は、７１Ａ１が、ＡＤの療法候補としての多量体優先性モノクローナル抗体であり、脳ｏＡβおよびｏＡβ誘導性シナプス毒性を減少させることを示している。これは、ｏＡβ優先性であると注意深く特徴付けられた抗体を使用した最初の概念実証マウス試験を提供するものであると本発明者らは考える。本発明者らは、１）ｏＡβ濃度とそのシナプス毒性との間の相関性があったこと、および２）７１Ａ１は、ｏＡβを標的とすることによりＡＰＰＮＬＧＦ／ＮＬＧＦマウスの認知障害の側面を改善したことを観察した。

【0256】

[実施例６]
７１Ａ１可変領域に結合するペプチド模倣体の特定
Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）Ｐｈ．Ｄ．－１２（商標）ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（説明書添付）を使用して、固定化されたＭａｂ ７１Ａ１に結合したアミノ酸残基ペプチドリガンド（本明細書ではペプチド模倣体と呼ぶ）を単離した。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｐｈ．Ｄ．－１２（商標）ファージディスプレイペプチドライブラリーキットは、Ｍ１３バクテリオファージのマイナーコートタンパク質（ｐＩＩＩ）に融合されたランダムな１２個アミノ酸のペプチド（１２量体）のコンビナトリアルライブラリーである。このペプチドを、バクテリオファージの表面上に融合タンパク質の提示をもたらすコートタンパク質との融合物として発現させた。ライブラリーは２．７×１０９個のエレクトロポレーション配列からなり、１０μｌの供給ファージ中に各配列のおよそ５５コピーが得られるように１回増幅した。

【0257】

固定化された７１Ａ１抗体を使用して、可変領域に結合した、図１３に示されている１２個アミノ酸のペプチドを単離した。Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＡｍｉｎｏＬｉｎｋ Ｐｌｕｓカップリング樹脂を使用して、Ｍａｂ ７１Ａ１を固定化した。陰性対照粒子は、無関連ペプチド配列に対して特異性を有するモノクローナル抗体３Ｃ７を使用して製作した。ＮＥＢライブラリーでパニングした７１Ａ１粒子の産生に使用したＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）ＡｍｉｎｏＬｉｎｋ Ｐｌｕｓカップリング樹脂プロトコールは提供されている。簡単に説明すると、２ｍＬのａｍｉｎｏｌｉｎｋ粒子スラリーを、１５ｍＬコニカルチューブで２０００×ｇで１０分間遠心分離することにより、１０ｍＬの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ１０で２回洗浄した。次いで、この結合緩衝液中の１０ｍｇの７１Ａ１抗体を、２ｍＬのｅｐｐｅｎｄｏｒｐｈチューブに移した粒子に添加し、室温で２時間回転させた。次いで、スラリーをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ遠心分離フィルターユニットに添加し、樹脂を、２ｍＬの０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２の結合緩衝液で３回洗浄した。次いで、遠心分離した粒子を、２ｍＬのｐＨ７．２緩衝液および４０μｌの５０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液と混合し、４時間回転させた。ａｍｉｎｏＬｉｎｋゲルは、抗体の第一級アミンと自発的に反応するアルデヒド官能基を含む。次いで、形成されたシッフ塩基結合を、穏やかな還元剤であるシアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で安定第二級アミン結合へと還元する。次いで、粒子を２ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣＬ、ｐＨ７．４で２回洗浄し、２ｍＬのこの同じ緩衝液および４０μｌのシアノ水素化ホウ素ナトリウムに再懸濁して、粒子上の未結合部位をブロッキングし、３０分間回転させた。１Ｍ塩化ナトリウムで５回洗浄した粒子を、１ｍＬのＰＢＳに懸濁した。

【0258】

まず、ライブラリー（１０μｌ）を、アイソタイプ一致で可変領域無関連の固定化された３Ｃ７抗体粒子（２００μｌをＭｉｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ遠心分離フィルターユニットに添加）と混合して、非特異的に結合したバクテリオファージを除去した。２０００×ｇの回転数で遠心分離することによりこうした対照粒子からライブラリーを除去し、次いで、新しいＭｉｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ－ＭＣ遠心分離フィルターユニット中で、固定化された７１Ａ１抗体（２００μｌ）と混合し、その後未結合ファージを２０００×ｇで遠心分離することにより洗い流した。その後、粒子を１ｍＬのＰＢＳで洗浄し、この手順を数回繰り返した。特異的に結合したファージを、１００μｌの０．１Ｍグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．０を使用して、固定化された抗体から溶出させた。バクテリオファージを、キットに付属し、ここに含まれているプロトコールに記載のように、液体培養大腸菌（E coli）細菌の感染および増殖により増幅した。次いで、単離および増幅したバクテリオファージを、ＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％（重量／容積）ポリエチレングリコール－８０００、２．５Ｍ ＮａＣｌ）沈殿を使用して細菌上清から単離した。単離されたファージを増幅し、追加の結合／増幅サイクルにより、抗体可変領域に対する結合配列について、ファージのプールを濃縮した。３～４ラウンド後、個々のクローンを、ＤＮＡ配列決定（ＡＩＢｉｏＴｅｃｈ－Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、リッチモンド、バージニア州）および単離されたＤＮＡ配列から作成したその後のアミノ酸予測（図１３）により特徴付けた。

【0259】

精製されたモノクローナル抗体７１Ａ１を用いた標準的な間接酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ１０中１０μｇ／ｍＬでマレイミド活性化マイクロタイタープレートにコンジュゲートさせ、ＰＢＳおよび２％ＢＳＡでブロッキングしたペプチド模倣体１～１３（図１３の配列）に対する結合をアッセイした。１時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）コンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体１００ｕｌを添加し、プレートをさらに１時間インキュベートしてから、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）基質を添加した。分光光度計で６５０ｎｍの吸光度を測定した。図１４Ａ～１４Ｂに示されている結果は、ファージディスプレイにより単離されたペプチド模倣体のすべてではないがほとんどが、モノクローナル抗体７１Ａ１に結合することを示している。このアッセイでは、ペプチド１、３、５、７、８、１１、および１３が最も多くの結合を示し、ペプチド５、８、および７が最も良好だった。
参考文献

【0260】

【表3-1】

【0261】

【表3-2】

【0262】

【表3-3】

【0263】

【表3-4】

【0264】

【表3-5】

【0265】

【表3-6】

【0266】

【表3-7】

【0267】

【表3-8】

【0268】

【表3-9】

【0269】

【表3-10】

【0270】

【表3-11】

【0271】

【表3-12】

【0272】

【表3-13】

【0273】

【表3-14】

【0274】

【表3-15】

【0275】

他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載したが、上述の記載は例示を目的とするものであり、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図4-5】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図6-5】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8-1】

【図8-2】

【図8-3】

【図8-4】

【図8-5】

【図9-1】

【図9-2】

【図9-3】

【図9-4】

【図9-5】

【図9-6】

【図9-7】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図12-1】

【図12-2】

【図13】

【図14-1】

【図14-2】

【配列表】

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【国際調査報告】