特表 2024-534364 （１ｒ，４ｒ）－４－置換シクロヘキサン－１－アミンを生成する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-20

(54)【発明の名称】（１ｒ，４ｒ）－４－置換シクロヘキサン－１－アミンを生成する方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 13/00 20060101AFI20240912BHJP

   C07B 57/00 20060101ALI20240912BHJP

   C07C 229/46 20060101ALI20240912BHJP

   C07C 227/30 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20240912BHJP

【ＦＩ】

C12P13/00 ZNA

C07B57/00 360

C07C229/46

C07C227/30

C12N9/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024515866

(86)(22)【出願日】2022-09-14

(85)【翻訳文提出日】2024-05-10

(86)【国際出願番号】 IB2022058641

(87)【国際公開番号】W WO2023042081

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】P2100325

(32)【優先日】2021-09-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】HU

(31)【優先権主張番号】P2200363

(32)【優先日】2022-09-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】HU

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】310008859

【氏名又は名称】リヒター ゲデオン ニュイルヴァーノシャン ミューコェデー レースヴェーニュタールシャシャーグ

【氏名又は名称原語表記】Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｇｅｄｅｏｎ Ｎｙｒｔ．

(71)【出願人】

【識別番号】504111451

【氏名又は名称】ブダペスティ ミーサキ エーシュ ガズダサーグトウドマーニ エジェテム

(74)【代理人】

【識別番号】100094640

【弁理士】

【氏名又は名称】紺野 昭男

(74)【代理人】

【識別番号】100103447

【弁理士】

【氏名又は名称】井波 実

(74)【代理人】

【識別番号】100111730

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 武泰

(74)【代理人】

【識別番号】100180873

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 慶政

(72)【発明者】

【氏名】ファルカシュ、エメシェ

(72)【発明者】

【氏名】ポッペ、ラースロー

(72)【発明者】

【氏名】ホルニャーンスキー、ガーボル

(72)【発明者】

【氏名】インツゼ、ダーニエル ヤーノシュ

(72)【発明者】

【氏名】エーレシュ、ヤーノシュ

(72)【発明者】

【氏名】サーンタ－ベル、エベリン

(72)【発明者】

【氏名】モルナール、ジョーフィア クラーラ

(72)【発明者】

【氏名】セメシュ、ヨージェフ

(72)【発明者】

【氏名】シュネイデル、アンナ

(72)【発明者】

【氏名】チュカ、パール

【テーマコード（参考）】

4B064

4H006

【Ｆターム（参考）】

4B064AE01

4B064BH02

4B064BH08

4B064BH20

4B064BJ11

4B064CA21

4B064CA31

4B064CB30

4B064CC24

4B064CC30

4B064CD05

4B064DA01

4B064DA20

4H006AA02

4H006AC81

4H006BA49

4H006BJ20

4H006BN10

4H006BU42

(57)【要約】

本発明は、４－置換シクロヘキサン－１－アミンまたはそれらの任意の塩のジアステレオマー混合物（式（Ｃ）＋式（Ｔ））：

から出発して、等モル量未満から等モル量までの量で使用されるアミンアクセプターの存在下、全細胞形態、可溶性形態または固定化形態の単一のトランスアミナーゼ生体触媒を使用することによって、式（Ｔ）の（１ｒ，４ｒ）－４－置換シクロヘキサン－１－アミン［トランス－４－置換シクロヘキサン－１－アミンとも称される］をバッチ方式または連続フロー方式で生成する方法に関する。本発明の第１の態様において、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル、より好ましくは、Ｃ_１－６アルキルエステル、特に、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステルが生成され得る。本発明の第２の態様において、ヒドロキシル保護されたまたは保護基を含まない、トランス－４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミン、特に、トランス－４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミンが生成され得る。本発明の第３の態様において、保護された２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）アセトアルデヒド、特に、トランス－４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミンが生成され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

４－置換シクロヘキサン－１－アミンまたはそれらの任意の塩のジアステレオマー混合物（式（Ｃ）＋式（Ｔ））：

【化1】

［ここで、式（Ｔ）および式（Ｃ）において、Ｇは、
－ 水素原子；
－ Ｃ_１－６アルキル基；
－ エステル部分（－ＣＯＯＲ）（式中、Ｒは、好適なアルキル基、アラルキル基またはアリール基、好ましくは、Ｃ_１－６アルキル基、より好ましくは、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから選択される置換基を表す）；
－ ＣＨ_２－ＯＲ’基（式中、Ｒ’は、水素原子、またはヒドロキシル保護基を表す）；
－ 式

【化2】

（式中、ｎは、１～２の整数である）の保護されたアルデヒド基；
－ 置換もしくは無置換のアリール基、好ましくは、フェニル基；または
－ アラルキル基、好ましくは、ベンジル基
から選択される置換基を表す］
から出発して、式（Ｔ）の（１ｒ，４ｒ）－４－置換シクロヘキサン－１－アミン［＝トランス－４－置換シクロヘキサン－１－アミン］を生成する方法であって、
前記ジアステレオマー混合物を、等モル量未満から等モル量までの量で使用されるアミンアクセプターの存在下、全細胞形態、可溶性形態または固定化形態の単一のトランスアミナーゼ生体触媒と反応させることを特徴とする、方法。

【請求項2】

前記反応が、バッチ方式または連続フロー方式で行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

４－置換シクロヘキサン－１－アミンのジアステレオマー混合物（式（Ｃ）＋式（Ｔ））が、遊離塩基形態であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

４－置換シクロヘキサン－１－アミンのジアステレオマー混合物（式（Ｃ）＋式（Ｔ））が、塩形態、好ましくは、塩酸塩形態（式（Ｃ・ＨＣｌ）＋式（Ｔ・ＨＣｌ））：

【化3】

であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。

【請求項5】

４－置換シクロヘキサン－１－アミンのジアステレオマー混合物（式（Ｃ）＋式（Ｔ））またはその塩形態が、約２：９８～約９９：１の比のシス／トランス異性体として提供されることを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

少なくとも約１００残基の領域にわたって、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）トランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ：配列番号１）またはビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）トランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ：配列番号２）に対して少なくとも約３７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼを使用することを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

少なくとも約１００残基の領域にわたって、クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ：配列番号１）またはビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ：配列番号２）に対して少なくとも約４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼを使用することを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

少なくとも約１００残基の領域にわたって、クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ：配列番号１）またはビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ：配列番号２）に対して少なくとも約５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼを使用することを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

少なくとも約１００残基の領域にわたって、クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ：配列番号１）またはビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ：配列番号２）に対して少なくとも約６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼを使用することを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

少なくとも約１００残基の領域にわたって、クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ：配列番号１）またはビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ：配列番号２）に対して少なくとも約７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼを使用することを特徴とする、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

少なくとも約１００残基の領域にわたって、クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ：配列番号１）またはビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ：配列番号２）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼを使用することを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

等モル量未満のアミンアクセプター化合物として、好適なケトンまたはアルデヒドを使用することを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

アミンアクセプターケトンとして、式Ｋの４－置換シクロヘキサノン：

【化4】

（式中、Ｇは、前記式（Ｃ）および式（Ｔ）におけるＧとして請求項１に記載した通りである）を使用することを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記ジアステレオマー混合物が、遊離塩基形態または塩形態の式（Ｉ）および式（ＩＩ）の２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル：

【化5】

（式中、Ｒは、好適なアルキル基、アラルキル基またはアリール基、好ましくは、Ｃ_１－６アルキル基、より好ましくは、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから選択される置換基を表す）からなることを特徴とする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

等モル量未満のアミンアクセプターケトンとして、ピルビン酸ナトリウムを使用することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

アミンアクセプターケトンとして、式（ＩＩＩ）の４－置換シクロヘキサノン：

【化6】

（式中、Ｒは、好適なアルキル基、アラルキル基またはアリール基、好ましくは、Ｃ_１－６アルキル基、より好ましくは、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから選択される置換基を表す）を使用することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

アミンアクセプターケトンとして、式（ＩＩＩｂ）のエチル２－（４－オキソシクロヘキシル）アセテート：

【化7】

を使用することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

アミンアクセプターケトンとして、式（ＩＩＩｄ）のイソプロピル２－（４－オキソシクロヘキシル）アセテート：

【化8】

を使用することを特徴とする、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

トランスアミナーゼとして、前記クロモバクテリウム・ビオラセウム変異体（Ｗ６０Ｃ）酵素（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ、配列番号１によって特徴付けられる）を、バッチ方式で、使用することを特徴とする、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記クロモバクテリウム・ビオラセウム変異体（Ｗ６０Ｃ）トランスアミナーゼ（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ、配列番号１によって特徴付けられる）を、全細胞形態、または固定化全細胞形態、または可溶性無細胞形態、または固定化無細胞形態で使用することを特徴とする、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

トランスアミナーゼとして、前記ビブリオ・フルビアリス酵素（ＶｆＳ－ＴＡ、配列番号２によって特徴付けられる）を、バッチ方式で、使用することを特徴とする、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記ビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ、配列番号２によって特徴付けられる）を、全細胞形態、または固定化全細胞形態、または可溶性無細胞形態、または固定化無細胞形態で使用することを特徴とする、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

シス選択的クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ）を、連続フロー方式で使用することを特徴とする、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

多孔質ポリマー支持体上に共有結合的に固定化された状態のシス選択的クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ）を使用することを特徴とする、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル塩酸塩のジアステレオマー混合物（式Ｉｂ・ＨＣｌ＋式ＩＩｂ・ＨＣｌ）から出発して、純粋な２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル（式Ｉｂ）を生成することを特徴とする、

【化9】

請求項１４～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸イソプロピルエステル塩酸塩のジアステレオマー混合物（式Ｉｄ・ＨＣｌ＋式ＩＩｄ・ＨＣｌ）から出発して、純粋な２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸イソプロピルエステル（式Ｉｄ）を生成することを特徴とする、

【化10】

請求項１４～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記ジアステレオマー混合物が、遊離塩基形態または塩形態の式（ＩＶ）および式（Ｖ）の２－（４－アミノシクロヘキシル）エタン－１－オール誘導体：

【化11】

（式中、Ｒ’は、水素原子、または好適なヒドロキシル保護基、好ましくは、ベンジル基を表す）からなることを特徴とする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

等モル量未満のアミンアクセプターケトンとして、ピルビン酸ナトリウムを使用することを特徴とする、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

アミンアクセプターケトンとして、式（ＶＩ）の４－置換シクロヘキサノン：

【化12】

（式中、Ｒ’は、水素原子、または好適なヒドロキシル保護基、好ましくは、ベンジル基を表す）を使用することを特徴とする、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

アミンアクセプターケトンとして、式（ＶＩａ）の２－（４－オキソシクロヘキシル）エタン－１－オール：

【化13】

を使用することを特徴とする、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

トランスアミナーゼとして、前記クロモバクテリウム・ビオラセウム変異体（Ｗ６０Ｃ）酵素（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ、配列番号１によって特徴付けられる）を、バッチ方式で、使用することを特徴とする、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記クロモバクテリウム・ビオラセウム変異体（Ｗ６０Ｃ）トランスアミナーゼ（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ、配列番号１によって特徴付けられる）を、全細胞形態、または固定化全細胞形態、または可溶性無細胞形態、または固定化無細胞形態で使用することを特徴とする、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

トランスアミナーゼとして、前記ビブリオ・フルビアリス酵素（ＶｆＳ－ＴＡ、配列番号２によって特徴付けられる）を、バッチ方式で、使用することを特徴とする、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記ビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ、配列番号２によって特徴付けられる）を、全細胞形態、または固定化全細胞形態、または可溶性無細胞形態、または固定化無細胞形態で使用することを特徴とする、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

シス選択的クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ）を、連続フロー方式で使用することを特徴とする、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

多孔質ポリマー支持体上に共有結合的に固定化された状態のシス選択的クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ）を使用することを特徴とする、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

２－（４－アミノシクロヘキシル）エタン－１－オール塩酸塩のジアステレオマー混合物（式ＩＶａ・ＨＣｌ＋式Ｖａ・ＨＣｌ）から出発して、純粋な２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）エタン－１－オール（式ＩＶａ）を生成することを特徴とする、

【化14】

請求項２７～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記ジアステレオマー混合物が、式（ＶＩＩ）および式（ＶＩＩＩ）の２－（４－アミノシクロヘキシル）アセトアルデヒド誘導体：

【化15】

（式中、ｎは、１～２の整数である）からなることを特徴とする、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

等モル量未満のアミンアクセプターケトンとして、ピルビン酸ナトリウムを使用することを特徴とする、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

アミンアクセプターケトンとして、式（ＩＸ）の４－置換シクロヘキサノン：

【化16】

（式中、ｎは、１～２の整数である）を使用することを特徴とする、請求項３８に記載の方法。

【請求項41】

トランスアミナーゼとして、前記クロモバクテリウム・ビオラセウム変異体（Ｗ６０Ｃ）酵素（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ、配列番号１によって特徴付けられる）を、バッチ方式で、使用することを特徴とする、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記クロモバクテリウム・ビオラセウム変異体（Ｗ６０Ｃ）トランスアミナーゼ（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ、配列番号１によって特徴付けられる）を、全細胞形態、または固定化全細胞形態、または可溶性無細胞形態、または固定化無細胞形態で使用することを特徴とする、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

トランスアミナーゼとして、前記ビブリオ・フルビアリス酵素（ＶｆＳ－ＴＡ、配列番号２によって特徴付けられる）を、バッチ方式で、使用することを特徴とする、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記ビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ、配列番号２によって特徴付けられる）を、全細胞形態、または固定化全細胞形態、または可溶性無細胞形態、または固定化無細胞形態で使用することを特徴とする、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

シス選択的クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ）を、連続フロー方式で使用することを特徴とする、請求項３８～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

多孔質ポリマー支持体上に共有結合的に固定化された状態のシス選択的クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ）を使用することを特徴とする、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミンのジアステレオマー混合物（式ＶＩＩａ＋式ＶＩＩＩａ）から出発して、純粋なトランス－４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミン（式ＶＩＩａ）を生成することを特徴とする、

【化17】

請求項３８～４６のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、等モル量未満から等モル量までの量で使用されるアミンアクセプターの存在下、全細胞形態、可溶性形態または固定化形態の単一のトランスアミナーゼ生体触媒を使用することによって、４－置換シクロヘキサン－１－アミンまたはそれらの任意の塩のジアステレオマー混合物（式（Ｃ）＋式（Ｔ））

【化1】

から出発して、式（Ｔ）の（１ｒ，４ｒ）－４－置換シクロヘキサン－１－アミン［トランス－４－置換シクロヘキサン－１－アミンとさらに称される］を、バッチ方式または連続フロー方式で、生成する新規方法に関する。本発明の第１の態様において、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル、より好ましくは、Ｃ_１－６アルキルエステル、特に、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステルが生成され得る。本発明の第２の態様において、ヒドロキシル保護されたまたは保護基を含まない、トランス－４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミン、特に、トランス－４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミンが生成され得る。本発明の第３の態様において、保護された２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）アセトアルデヒド、特に、トランス－４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミンが生成され得る。

【背景技術】

【0002】

２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル、好ましくは、Ｃ_１－６アルキルエステル、特に、トランス－４－アミノ－シクロヘキシル酢酸エチルエステルは、一般にカリプラジンとして公知の３－（（１ｒ，４ｒ）－４－（２－（４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル）エチル）シクロヘキシル）－１，１－ジメチルウレア［トランス－Ｎ－｛４－［２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）－ピペラジン－１－イル］エチル］シクロヘキシル｝－Ｎ’，Ｎ’－ジメチルウレアと称される］を含む、薬理活性物質の合成のための優れた出発材料であり、この合成は、国際特許出願ＷＯ２００５／０１２２６６Ａ１に最初に開示された。

【0003】

欧州においてＲｅａｇｉｌａ（登録商標）および米国においてＶｒａｙｌａｒ（登録商標）として上市されたカリプラジンは、統合失調症および双極性マニア／混合エピソードの治療（Ｌ．Ｃｉｔｒｏｍｅ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．９，１９３－２０６（２０１３），ＤＯＩ：１０．１５１７／１７４２５２５５．２０１３．７５９２１１）のための非定型抗精神病薬である（Ｅ．Ａｇａｉ－Ｃｓｏｎｇｏｒら Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２２，３４３７－３４４０（２０１２），ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｂｍｃｌ．２０１２．０３．１０４）。これは、中枢神経系において、Ｄ３受容体（Ｄ３アンタゴニスト）に対する高い選択性を有するドーパミン受容体パーシャルアゴニスト（Ｄ３およびＤ２）である。

【化2】

【0004】

トランス－４－置換シクロヘキサンアミン単位（トランス配置を提供する、擬似不斉の２つの中心である１ｒおよび４ｒを含有する）は、薬理活性物質カリプラジンの化学構造の重要な要素である。したがって、カリプラジンの合成のために、中間体化合物のジアステレオマー的に純粋なトランス－異性体形態（Ｉ）のみが利用可能であり、ジアステレオマーのシス－異性体形態（ＩＩ）の存在は所望されない。

【化3】

【0005】

式（Ｉ）のアミノエステル内の立体化学は、実際にトランスであるが（１－および４－置換基が、「折り畳まれていない」シクロヘキサン環の２つの逆側にあることを意味する）が、基本的な立体要素に分解される場合に、これは、実際には、シクロヘキサン環における疑似不斉の２つの中心（１ｒ，４ｒ）の存在によって引き起こされる（擬似不斉の中心は、ＣＩＰシステムにおいてｒ／ｓとマークされる；より詳細については、Ｌ．Ｐｏｐｐｅら Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＫＧａＡ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（２０１６），５２－５４頁を参照されたい）。このシステムの固有の特徴は、擬似不斉の一方の中心が排除される（１ｒ中心が脱アミノ化の際にケトン（ＩＩＩ）に破壊される）と、他方の中心（この場合、４ｒ）も、中心原子に直接付着した４つの共有結合のどれも変更することなく、完全に取り除かれることである。この点において、擬似不斉の２つの中心の存在によって引き起こされるシステムは、むしろ単一の立体単位として挙動、したがって、１つの立体記述子（シスまたはトランス）による説明がより適切である。

【0006】

式（Ｉｂ・ＨＣｌ）により特徴付けられる（１ｒ，４ｒ）－４－（２－エトキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物［２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル塩酸塩とさらに称される］出発材料は、ＷＯ２０１０／０７０３６８に記載される製造プロセスに従って、高品質で、単純反応工程を介した工業スケールで提供される。

【化4】

【0007】

このプロセスにおいて、安価で容易に利用可能な大スケールの工業的化学原料である２－（４－ニトロフェニル）酢酸は、Ｐｄ／Ｃ触媒を使用して、水性媒体中で水素化される。第１工程において、ニトロ基、および次いで芳香環が飽和され、次いで、２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸のジアステレオマー混合物が、酸触媒反応において、エタノール媒体中でエステル化され、得られた２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル異性体混合物（Ｉｂ＋ＩＩｂ）から純粋な２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル塩酸塩（Ｉｂ・ＨＣｌ）最終生成物が、選択的結晶化によって得られる。

【0008】

この手順を使用することによって、シクロヘキシル酢酸エステル（Ｉ＋ＩＩ）、例えば、エチルエステル（Ｉｂ＋ＩＩｂ）およびプロピルエステル（Ｉｃ＋ＩＩｃ）誘導体は、約１：１の比のトランス／シス－異性体の混合物で調製され、これは、トランス－ジアステレオマー（Ｉ）の比較的良好な収率で、トランス－およびシス－生成物（それぞれ、化合物ＩおよびＩＩ）に分離され得る。

【0009】

ＷＯ２０１０／０７０３６８の記載によれば、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル塩酸塩（Ｉｂ・ＨＣｌ）は、アセトニトリル処理後に、極めて高いジアステレオマー純度で、４０％の収率で単離され得る。通常、トランス／シス混合物（Ｉｂ＋ＩＩｂ）は、結晶化によって分離される。

【0010】

Ｘ．－Ｗ．Ｃｈｅｎらの刊行物（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ４８（１８），３１２０－３１２６（２０１６），ＤＯＩ：１０．１０５５／ｓ－００３５－１５６１８６５；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１２３，３３２－３５３（２０１６），ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｅｊｍｅｃｈ．２０１６．０７．０３８）によれば、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル塩酸塩（Ｉｂ・ＨＣｌ）のＮ－アシル化（Ｎ－アセチル、Ｎ－Ｂｏｃ、Ｎ－（Ｎ’－ジメチルアミノ）カルボニル）誘導体は、中程度の単離収率（それぞれ、Ｎ－アセチルおよびＮ－（Ｎ’－ジメチルアミノ）カルボニル誘導体について、６４％および６２％）および優れたジアステレオマー純度（トランス：シス約１００：０）で、シス／トランス異性体混合物から、エタノール中での直接再結晶によって単離され得る。

【0011】

ＣＮ２０１５／１０６４９８２２の記載によれば、アミノ部分の保護なしの４－アミノシクロヘキサノンが原料として採用されている。この化合物から、ウィッティヒ反応を（ジメトキシホスフィニル）酢酸メチルエステルまたは（ジエトキシホスフィニル）酢酸エチルエステルを用いて実施し、次いで、得られた粗アルキル２－（トランス／シス－４－アミノシクロヘキシリデン）アセテート（Ｉａ＋ＩＩａ、またはＩｂ＋ＩＩｂ）の接触水素化を経由して、塩形成結晶化に付して、より純粋なトランス生成物（化合物ＩａまたはＩｂ、９５～９９．９：５～０．１のトランス：シス比を有する）を得ている。

【0012】

通常、接触還元後、対応する２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステルのトランスおよびシス混合物（Ｉ＋ＩＩ）は、結晶化によって分離され、シス副生成物（ＩＩ）は廃棄される。シス副生成物（ＩＩ）のシス－およびトランス－異性体の混合物への異性化はまた、Ｒ．Ｓ．Ｍｕｒｏｍｏｖａら（Ｚｈｕｒｎａｌ Ｖｓｅｓｏｙｕｚｎｏｇｏ Ｋｈｉｍｉｃｈｅｓｋｏｇｏ Ｏｂｓｈｃｈｅｓｔｖａ ｉｍ．Ｄ．Ｉ．Ｍｅｎｄｅｌｅｅｖａ，１０（６），７１１－７１２（１９６５）：Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．６４，５１６６２（１９６６）；ＵＳＳＲ，ＳＵ１７７４２２ １９６５－１２－１８：Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．６４，１０３６３４（１９６６））のプロセスによれば実現可能である。このプロセスにおいて、エチル２－（４－ニトロフェニル）アセテートは、ＥｔＯＨ中、６０℃および１００ａｔｍで、Ｒｈ－Ｐｔ上で９８％の２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステルの混合シス／トランス異性体（化合物Ｉｂ＋ＩＩｂ）に水素化され、これらは、遊離酸の混合異性体に加水分解された。いずれかの異性体（化合物Ｉｂまたは化合物ＩＩｂ）または２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステルの異性体混合物（化合物Ｉｂ＋ＩＩｂ）をタングステン酸の存在下で、水性ＮａＯＨ中、２９％Ｈ_２Ｏ_２で処理することにより、８０％のエチル４－オキソシクロヘキシルアセテートオキシムを得て、水性ＮａＯＨ中、１００℃、１２時間で、遊離酸オキシムの対応する異性体組成物を得た。ＥｔＯＨ－１０％Ｈ_２ＳＯ_４中、１０～１２℃および３Ａｄｍ^－２での遊離酸オキシムの電解還元により、５０％のトランス－異性体を含有する混合２－（シス／トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸を得た。

【0013】

ＣＮ２０１８／１０６４９８２２（Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．１７２，２５２７５６（２０１９））の記載によれば、カリプラジンは、トランス－４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（ＩＶａ・ＨＣｌ）からも調製され得る。

【化5】

【0014】

しかしながら、この化合物は、高価なルテニウム触媒により高圧下でのオートクレーブ中の水素化によって２－（４－ニトロフェニル）エタン－１－オールから調製され、４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミンのシス／トランス－ジアステレオマー混合物（化合物ＩＶａ＋化合物Ｖａ）を提供し、それに続いて結晶化が支援する異性体分離が行われ得る。これらのジアステレオマー（化合物ＩＶａ＋化合物Ｖａ）の場合、擬似不斉の１つの中心を除くことによっても（例えば、１ｒ中心がケトン（ＶＩａ）に存在しない）、他の中心（４ｒ）が完全に取り除かれる。

【0015】

ＷＯ２００２００６２２９（Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．１３６，１３４６７５（２００２））の記載によれば、カリプラジンの構造に類似するβ－３アドレナリン受容体アゴニストである複素環式アミノアルコールは、トランス－４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（ＶＩＩａ・ＨＣｌ）から調製され得る。

【化6】

【0016】

このプロセスは、トランス－アミン（化合物ＶＩＩａ）の遊離塩基形態のアミン部分のＮ’，Ｎ’－ジメチルウレア誘導体への最初の変換、それに続くアルデヒド部分の遊離および適当な第二級アミン試薬とのカップリングを含む。

【0017】

本発明者らの目的は、シス－異性体（式ＩＩ）が、これまで廃棄物として処理されていた現在最も一般的な製造プロセスを改善すること、および温和な条件下での単一工程で、圧倒的大部分のシス副生成物（式ＩＩ）の所望のトランス－異性体（式Ｉ）への変換を可能にすることであった。

【0018】

最初に、本発明者らは、２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステルのシス－およびトランス異性体（化合物Ｉ＋ＩＩ）の分離を、これまでの伝統的な製造方法の部分であった分離プロセスの場合よりも、生体触媒プロセスによってはるかにより効率的に行うことができると仮定した。驚くべきことに、我々は、単一の酵素が、シス－ジアステレオマー（化合物ＩＩ）の分離だけでなく、２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステルのシス－ジアステレオマー（化合物ＩＩ）の所望のトランス－中間体化合物（Ｉ）への動的異性化プロセスも触媒し得ることを見出した。

【0019】

バイオインフォマティクスの爆発的な発展により、生体触媒プロセスの酵素学的および分子生物学な実用的な適用は、より良く設計することができ、最近では、競合するプロセスになっている。

【0020】

類似する関連化合物について、ケトレダクターゼ（それぞれ、４－プロピルシクロヘキサノンおよび４－エチルシクロヘキサノンの対応するシス－およびトランス－アルコールへの還元）およびトランスアミナーゼ［メチル２－（３－オキソシクロヘキシル）アセテート誘導体および２－メチルシクロヘキサノンの対応するアミンへの］触媒の検討は、文献において利用可能であるが、生体触媒プロセスは、これまで、２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステルのジアステレオマー（ＩまたはＩＩ）のいずれかの立体選択的調製のために開発されていなかった。

【0021】

アルキル２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）アセテート（化合物Ｉ）のための、特に、化学構造（Ｉｂ・ＨＣｌ）によって表されるエチル２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）－アセテート塩酸塩のためのトランスアミナーゼ（ＴＡ）触媒プロセスは、この目標の達成に有効であり得ると仮説を立てた。

【0022】

加えて、このプロセスを、バッチ方式だけでなく、連続フロー方式で行うことが可能であると考えた。酵素の安定性、活性および効率を増強し、グリーンな強化プロセスにおけるそれらの回収ならびにそれらの使用を可能にし得る、トランスアミナーゼの固定化および連続フロー適用の多くの例が文献に見出され得る。酵素は、単離（精製）形態で、トランスアミナーゼを産生する宿主細胞（野生型または組換えのいずれか）の抽出物で、またはさらに全細胞に組み込まれて、生体触媒として使用され得る。

【0023】

トランスアミナーゼ（ＴＡ）は、アミノドナーからカルボニル化合物への酸化還元的に中性のアミノ基の移動を触媒する。ＴＡの働きは、電子および窒素シャトルとしての機能を果たすピリドキサール－５’－リン酸（ＰＬＰ）補因子に依存する。最も頻繁に用いられるＴＡの適用は、キラルアミンの単一エナンチオマーを標的にする立体選択的プロセスである。単一のＴＡによって触媒される反応および目的とするキラルアミン調製は、２つの異なる種類のやり方に分けることができる：（ｉ）不斉合成（ＡＳ）において、プロキラルケトンから出発して、好適なアミンドナーからのアミン移動が、キラルアミンを生成する（Ｓ．Ｍａｔｈｅｗら ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．８（１２），９９３－１００１（２０１２），ＤＯＩ：１０．１０２１／ｃｓ３００１１６ｎ；Ｄ．Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉら Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（６），３２４－３３２（２０１０），ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｔｅｃｈ．２０１０．０３．００３）、一方で（ｉｉ）速度論的分割（ＫＲ）において、ラセミアミンの一方の好ましいエナンチオマーが、単純なアミンアクセプターに対してアミンドナーとして作用し、それによって、ラセミアミンの残りのエナンチオマーおよび反応するエナンチオマーに対応するケトンの混合物をもたらす（Ｄ Ｐｒｅｓｓｎｉｔｚら ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．３（４），５５５－５５９（２０１３），ＤＯＩ：１０．１０２１／ｃｓ４００００２ｄ）。

【0024】

これらのアプローチの適用は、ケトンまたはラセミアミンのいずれかの出発材料のアクセス性に依存する。実用的観点（１００％の変換を達成可能）から、不斉合成は、むしろ好ましい種類の反応であるが、不斉反応の方向のしばしば好ましくない熱力学的平衡に起因して、速度論的分割がより好都合である。その支配を妨害し得る基質および生成物阻害現象である一部の熱力学的問題にもかかわらず、キラルアミン生成のための上記のプロセスは、ＴＡの工業的適用がより広範になっていることを示す。

【0025】

Ｃ．Ｋ．Ｓａｖｉｌｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２９（５９８９），３０５－３０９（２０１０），ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１８８９３４）によって開示される調製方法は、工業的製造を行うためのＴＡの適用可能性を示す。ＣｏｄｅＥｖｏｌｖｅｒ（登録商標）タンパク質操作技術を使用するＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．およびＣｏｄｅｘｉｓによるプロセスは、糖尿病の治療において使用される薬物の（Ｒ）－シタグリプチン（Ｊａｎｕｖｉａと示される）に関連して開発されている。合成の目標を達成するために、初期ＴＡの新たなバリアントは、最初のラウンドにおける基質のウォーキング、モデリングおよび突然変異アプローチ、それに続く元のロジウム触媒不斉エナミン水素化（２５０ｐｓｉで）が置き換えられ、合成全体が短縮されることによる突然変異型ＴＡ形態への指向進化により開発された。要約すれば、２７の突然変異を、親（Ｒ）－選択的ＡＴＡ１１７（アルスロバクター属種（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．））トランスアミナーゼにおいて行って、嵩高い種類の基質に対する結合ポケットの拡大を伴い、初期ＡＴＡ１１７に対する４桁改善された活性、ならびにｉＰｒＮＨ_２（０．５～１Ｍ）、有機溶媒（５～５０％のＤＭＳＯ）、熱（４５℃）およびケトン濃度（１００ｇ／Ｌ、２５０ｍＭ）の耐性の増加を有する、最終生体触媒を得た。金属触媒プロセスと比較して、このＴＡ触媒プロセス（６ｇ／Ｌのトランスアミナーゼが２００ｇ／Ｌのプロシタグリプチンケトンを変換し得る）は、＞９９．９％の鏡像体過剰率、１０～１３％の全収率の増加、５３％の生産性の増加、および１９％の総廃棄物の低減を伴って、（Ｒ）－シタグリプチンを提供した。

【0026】

逆のエナンチオマー優先度の２つのＴＡの支援により、ラセミアミンの変換は、いわゆる脱ラセミ化によって、エナンチオマーのいずれかに対して実現可能である（Ｎ．Ｊ．Ｔｕｒｎｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１４（２），１１５－１２１（２０１０），ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｂｐａ．２００９．１１．０２７）。２つの立体相補的ＴＡを用いる脱ラセミ化は、一方のＴＡを用いる速度論的分割工程、それに続く立体相補的ＴＡによるケトンを形成する不斉合成を含む。ラセミ化としての対応するケトンによる一方のアミンエナンチオマーの逆のエナンチオマーへの相互変換を考慮して、脱ラセミ化プロセスは、動的速度論的分割（ＤＫＲ）とも称され得る。

【0027】

Ｄ．Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉらの刊行物（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１４），２２８９－２２９２（２００９），ＤＯＩ：１０．１００２／ｅｊｏｃ．２００８０１２６５）において、α－キラル第一級アミンの脱ラセミ化は、２つの立体相補的ＴＡからなる、２工程のワンポットカスケードプロセスによって行われる。速度論的分割（第１）工程が行われたら、ＴＡは、熱ショックによって破壊され、逆の立体優先度を有する第２のＴＡは、組み合わされた反応系において、乳酸デヒドロゲナーゼとともに添加されて、反応平衡を所望のアミン側にシフトさせる。ラセミアミンのいずれかのエナンチオマー形態は、２つの異なる立体選択的ＴＡの適用順序を切り替えることによって合成することができる。

【0028】

Ｇ．Ｓｈｉｎらの刊行物（Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．７７（４９），８６２９－８６３１（２０１３），ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ３ｃｃ４３３４８ｊ）は、２つの逆のエナンチオ選択的ＴＡからの第１のＴＡによってのみ許容されるアミノアクセプターを適用することによって、上記に言及したプロセスの欠点（ＫＲにおける第１のＴＡの熱失活）に対する解決手段を提供する。この方法において、ワンポットの１工程の脱ラセミ化が開発されるが、依然として少なくとも２つの酵素を必要としている。

【0029】

Ｃ．Ｓ．Ｆｕｃｈｓらの刊行物（Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．３６０（４），７６８－７７８（２０１８），ＤＯＩ：１０．１００２／ａｄｓｃ．２０１７０１４４９）およびＷＯ２０１６／０７５０８２によれば、プレガバリンおよびブリバラセタムの調製は、ｉＰｒＮＨ_２による基質のシッフ塩基のイミン－エナミン互変異性化に起因する化学的ラセミ化と組み合わされた、適当なエナンチオ優先度のＴＡを用いるＴＡ触媒エナンチオマー選択的アミノ化による、対応するラセミβ－キラルアルデヒドからβ－キラル第一級アミンをもたらすエナンチオ相補的な動的速度論的分割プロセスによって可能である。

【0030】

エナンチオマーの相互変換にも関連して、アミノ基シャトルとしての機能を果たす対称ケトン／アミン共基質の存在下で立体相補的ＴＡの対によって触媒される、α－キラル第一級アミンについての酵素的ラセミ化戦略は、Ｄ．Ｋｏｓｚｅｌｅｗｓｋｉらの刊行物（Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．１７（１），３７８－３８３（２０１１），ＤＯＩ：１０．１００２／ｃｈｅｍ．２０１００１６０２）に記載されている。この刊行物に開示されている別のアプローチは、アミノ基シャトルとして追加の外部対称ケトンおよび外部アミンドナーの非存在下での２つの立体相補的ＴＡ［ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）（ＶｆＳ－ＴＡ）、ＡＴＡ－１１７またはＡＴＡ－１１３由来］を適用することによるケトン中間体を介した２つの異なるエナンチオ相補的α－キラル第一級アミンの生体触媒的交差ラセミ化である。

【0031】

Ｆ．Ｒｕｇｇｉｅｒｉらの刊行物（ＣｈｅｍＣａｔＣｈｅｍ １０（２１），５０１２－５０１８（２０１８），ＤＯＩ：１０．１００２／ｃｃｔｃ．２０１８０１０４９）によれば、（Ｒ）－または（Ｓ）－１－メチル－３－フェニルプロピルアミンのラセミ化は、２つのエナンチオ相補的ＴＡ［クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）（ＣｖＳ－ＴＡ）由来およびアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）（ＡｏＲ－ＴＡ）由来］および共基質として最低量のピルビン酸塩／アラニンを用いることによって行うことができる。

【0032】

エナンチオピュアなキラルアミンの調製を目的とするエナンチオトープ選択性（エナンチオトピックな側を有するプロキラルケトンの不斉アミノ化における）およびエナンチオマー選択性（ラセミα－キラル第一級アミンの脱アミノ化による速度論的分割における）に加えて、ＴＡのいくらか類似するジアステレオトープ選択性（ジアステレオトピックな側を有するケトンの不斉アミノ化における）またはジアステレオマー選択性（α－キラル／プロキラル第一級アミンのジアステレオマー混合物の脱アミノ化による速度論的分割における）も、さまざまな合成目標を行うためにいくつかの事例において使用されている（これらの種類の立体選択性の定義について、Ｌ．Ｐｏｐｐｅら Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＫＧａＡ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ（２０１６），１２７－１２９頁を参照されたい）。

【0033】

立体化学的により複雑な場合は、ラセミケトンのＴＡ触媒転換であり、ここで、エナンチオマー選択性（ラセミケトンの２つのエナンチオマー間）は、ジアストロープ選択性（ケトンのＣ原子のプロキラル中心のＲｅ及びＳｉ側の間）と並行して現れ得る。どの種類の選択性が現れるかおよびどの化合物が化学的または酵素的に平衡であり得るかに依存して、動的速度論的分割と称されるＴＡ触媒プロトコールが開発され、例えば、Ａ．Ｍｏｕｒｅｌｌｅ－Ｉｎｓｕａらの刊行物（Ｃａｔａｌ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．９（１５），４０８３－４０９０（２０１９），ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ９ＣＹ０１００４Ａ）によるα－アルキルβ－アミノアミドの合成では、出発のα－アルキルβ－ケト－アミドは、高い鏡像体過剰率（高いジアステレオトープ選択性に起因する）および中程度～高いジアステレオマー比（さまざまな度合いの化学的ラセミ化による中程度～良好なエナンチオマー選択性に起因する）で、α－アルキルβ－アミノアミドに変換される。

【0034】

それらの研究において、Ｊ．Ｌｉｍａｎｔｏら（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１６，２２７１６－２２７１９（２０１４），ＤＯＩ：１０．１０２１／ｏｌ５０１００２ａ）は、ＴＡ触媒を使用して、ラセミケトンを、薬物のベルナカラントの中間体に選択的に転換する。ここでも、２つの選択性［エナンチオマー選択性（ラセミケトンのエナンチオマーを識別する）およびジアステレオトープ選択性（カルボニル基側の）］が並行して起こり得る。ベルナカラントのエナンチオマー的に純粋な調製は、両方の選択性に加えて、ケトンエナンチオマーのラセミ化（すなわち、動的異性化）もｐＨが約１０の条件下で起こることを必要とする。高いエナンチオマー選択性およびジアステレトープ選択性の両方を示す対応するＴＡバリアントは、指向進化によって生成されて、高い選択性および８０％を上回る単離収率でトランス－異性体を形成する（トランス：シス＞９５：１、＞９９．５％ｅｅ）。

【0035】

ＴＡ触媒ＤＫＲ様プロセスについての別の例は、Ｚ．Ｐｅｎｇら（Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．１６，８６０－８６３（２０１４），ＤＯＩ：１０．１０２１／ｏｌ４０３６３０ｇ）によって開示されている。ラセミ２－置換４－ピペリドン誘導体から出発して、対応するトランス－アミンが、ＡＴＡ－０３６トランスアミナーゼの使用から調製される（９９％ｅｅで、１０：１のジアステレオマー比）。このプロセスは、ケトンに対してエナンチオマー選択的（分割）およびジアステレオトープ選択的（アミノ化）である。基質の環－鎖互変異性化による残りのケトンのラセミ化は、ＤＫＲプロセスを可能にし、ラセミケトンの所望の（２Ｒ，４Ｒ）－アミンへの８５％の変換をもたらす。

【0036】

擬似不斉の２つの中心（１ｒ，４ｒ）の存在に起因するトランス－配置を有するカリプラジン以外に、さらなる薬物、例えば、セルトラリン、ダソトラリンは、それらの構造中にシス－またはトランス－配置を有する４－置換シクロヘキサンアミン単位を含有する。

【化7】

【0037】

しかしながら、４－置換シクロヘキサンアミン／シクロヘキサノン系の平面対称性を破壊する二環式系における縮合芳香環に起因して、４つの可能な立体異性体をもたらす不斉の２つの実際の中心の存在がこれらの薬物中に存在する。４つの可能な立体異性体を識別するために、環上の適切な立体中心を選択的に形成すること、またはエナンチオマー／ジアステレオマー分離を有することが可能であることが重要である。

【0038】

Ｄ．Ｐ．Ｇａｖｉｎら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．９，２０２８５（２０１９），ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５９８－０１９－５６６１２－７）の研究は、追加の別個の立体中心を有するラセミアミンのＴＡ触媒脱アミノ化が、可能性のあるエナンチオマー選択性およびジアステレオトープ選択性の両方が高いが、別個の立体中心が安定である場合に、ＫＲプロセスを単純化することを示した。新たに単離されたシュードビブリオ属種（Ｐｓｅｕｄｏｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）トランスアミナーゼ（ＰｓＳ－ＴＡ）および以前に公知のＣｖＳ－ＴＡは両方とも、脱メチル化セルトラリンジアステレオマー（スキーム１におけるシス－およびトランス－ノルセルトラリン）を生成するために探索された。

【化8】

【0039】

ラセミシス－異性体からの脱アミノ化によるＫＲは、両方のＴＡを用いて優れた変換をもたらし（高い度合いのエナンチオマー選択性に起因する）、得られる（Ｓ）－ケトンと一緒に高い純度（ｅｅ＞９９％）の（１Ｒ，４Ｒ）－異性体のままにした（高い度合いのジアステレオトープ選択性に起因する）。ラセミトランス－異性体の場合、ＣｖＴＡのみが、著しい活性を示し、ここで、約５０％の変換後、（Ｒ）－ケトンは、（１Ｓ，４Ｒ）－異性体（約８０％のｅｅを有する）から形成されたが、残りの（１Ｒ，４Ｓ）－アミンは、約９５％の鏡像体過剰率で得られた。このプロセスは、両方の（Ｓ）選択的ＴＡが、より遠い立体中心の配置に対してもよりも、アミン結合立体要素の配置に対してはるかに感受性［（Ｓ）－選択的］であることを示す。

【0040】

ダソトラリンが、９９％超の鏡像体過剰率で予想される（１Ｒ，４Ｓ）－ダソトラリンをもたらす（Ｒ）－選択的トランスアミナーゼを使用する還元的アミノ化によって（この場合、ジアステレオトープ選択性のみが可能である）、対応する（Ｓ）－ケトンから調製され得ることがＵＳ２０１９／０３９０２３５に開示されている。

【0041】

ＴＡによる４－置換シクロヘキサノンに対するジアステレオトープ選択性または４－置換シクロヘキシルアミンに対するジアステレオマー選択性の単独の出現は、それぞれ、しばしば適用されるエナンチオトープ選択性（プロキラルケトンの還元的アミノ化における）またはエナンチオマー選択性（α－キラル第一級アミンの酸化的脱アミノ化における）によく類似しているが、上記の例が示すように、我々は、他の種類の選択性とのみ組み合わされるジアステレオトープ選択性またはジアステレオマー選択性を利用する、さまざまな置換シクロヘキシルアミンのためのＴＡを用いる調製方法を見出した。

【0042】

単一のＴＡを使用して２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル（Ｉ）、特に重要には、エチルエステル（Ｉｂ）を得るためのＴＡ触媒調製方法の開発において、当初、本発明者らは、ＴＡの可能性があるジアステレオトープ選択性（スキーム２Ａ）またはジアステレオマー選択性（スキーム２Ｂ）の純粋な出現を利用するスキーム２に表される２つの選択肢を考慮した。

【化9】

【0043】

トランス－選択性のＴＡ（スキーム２Ａ）は、（４－アルコキシカルボニル－メチル）シクロヘキサノン（ＩＩＩ）の直接的な所望の２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル（Ｉ）への変換を可能にし得るが、シス－選択性のＴＡ（スキーム２Ｂ）は、ジアステレオマー分割のために利用することができ、所望の２－（トランス－４－アミノ－シクロヘキシル）酢酸エステル（Ｉ）およびシス－異性体（ＩＩ）から形成される対応する（４－アルコキシカルボニルメチル）シクロヘキサノン（ＩＩＩ）の分離が容易な混合物をもたらす。

【0044】

アミンドナーとしてα－メチルベンジルアミンの対応するエナンチオマーを使用する、（４－エトキシカルボニルメチル）シクロヘキサノン（化合物ＩＩＩｂ）のジアステレオトープ選択的アミノ化のための３つの（Ｓ）－選択的ＴＡおよび３つの（Ｒ）－選択的ＴＡを用いる選択肢Ａ）を標的にする本発明者らのスクリーニングは、所望の２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル（化合物Ｉｂ）への直接調製に好適なトランス－選択性のＴＡがないことを明らかにした。トランス－エステル（化合物Ｉ）の形成のために必要な選択性を有するＴＡは見出されていないが、良好なシス－選択性を有するＴＡは、良好なジアステレオマー過剰率のあまり容易に利用可能ではないシス－エステル（化合物ＩＩ）の調製に好適である。

【0045】

シス－ジアステレオマー優先度は、アミンのトランス／シス－異性体混合物（化合物Ｉ＋ＩＩ）のジアステレオマー分離によるトランス－異性体（化合物Ｉ）の調製を可能にする、選択肢Ｂ）のための要件である。幸いにも、（４－エトキシカルボニルメチル）シクロヘキサノン（化合物ＩＩＩｂ）からのアミノ化における高い度合いのシス－選択性は、良好なジアステレオマー過剰率（＞９０％ｄｅ_ｃｉｓ）で、それぞれ、低い～中程度の変換をもたらすＶｆＳ－ＴＡおよびＣｖＳ－ＴＡバリアントを見出した。トランス／シス－アミン（化合物Ｉ＋ＩＩ）のジアステレオマー混合物は、対応するケトン（化合物ＩＩＩ）よりも容易に利用可能であるので、ジアステレオマー混合物（化合物Ｉ＋ＩＩ）の異性体分離は、実行可能なプロセスであると考える。

【0046】

エナンチオピュアなキラルアミン調製を目的とし、ラセミ化合物から出発する類似のエナンチオマー選択的プロセスにおいて、立体相補的ＴＡまたは基質における化学的感受性単位に起因する非酵素的ラセミ化のいずれかの適用は、反応するエナンチオマー内容物（content）に対する速度論的分割の変換限界を上回ることが必要であり、このようにして、動的速度論的分解または脱ラセミ化をもたらしたので、そのような効果は、単一のＴＡによるジアステレオマー混合物の異性体分離において予想されなかった。

【0047】

異性体２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル（化合物Ｉｂ＋ＩＩｂ）のシス－ジアステレオマー内容物の脱アミノ化のためのアミンアクセプターとしてピルビン酸塩を利用するシス選択的ＴＡ（ＣｖＳ－ＴＡバリアントおよびＶｆＳ－ＴＡ）を用いる本発明者らのジアステレオマー分離実験は、予想外の驚くべき結果をもたらした。ある特定の反応時間で、ＴＡ生体触媒の特質ならびにアミンドナーの種類および量に応じて、消費されるシス－異性体（化合物ＩＩｂ）よりも低い量のケトン（化合物ＩＩＩｂ）、および元のトランス－異性体（化合物Ｉｂ）内容物よりも高い量のジアステレオマー的に濃縮されたトランス－異性体（化合物Ｉｂ、最高で＞９８％のｄｅ_{ｔｒａｎｓ}）から形成される混合物が得られた（Ｉｂのモル分率、ｘ_{ｔｒａｎｓ}は最高で＞８５％まで上昇）。これらの結果は、単一のＴＡによるシス－異性体内容物（化合物ＩＩｂのモル分率：ｘ_ｃｉｓ）のトランス－ジアステレオマー（化合物Ｉｂ）への予想外の動的異性化が、ジアステレオトープ選択的ケトンアミノ化の方向において、高いシス－選択性を示すことを示した。

【0048】

そのため、本発明は、バッチ方式または連続フロー方式のいずれかで行われ得る、トランス－４－置換シクロヘキサン－１－アミン（Ｔ）の合成のための、４－置換シクロヘキサン１－アミンのトランス／シス－ジアステレオマー混合物（Ｃ＋Ｔ）の、単一のトランスアミナーゼが触媒する動的異性化に関する。

【発明の概要】

【0049】

本発明による方法は、４－置換シクロヘキサン－１－アミンまたはそれらの任意の塩のジアステレオマー混合物（式Ｃ＋式Ｔ）：

【化10】

［ここで、式（Ｔ）および式（Ｃ）において、Ｇは、
－ 水素原子；
－ Ｃ_１－６アルキル基；
－ エステル部分（－ＣＯＯＲ）（式中、Ｒは、好適なアルキル基、アラルキル基またはアリール基、好ましくは、Ｃ_１－６アルキル基、より好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基およびイソプロピル基から選択される置換基を表す）；
－ ＣＨ_２－ＯＲ’基（式中、Ｒ’は、水素原子、またはヒドロキシル保護基を表す）；
－ 式

【化11】

（式中、ｎは、１～２の整数である）の保護されたアルデヒド基；
－ 置換もしくは無置換のアリール基、好ましくは、フェニル基；または
－ アラルキル基、好ましくは、ベンジル基
から選択される置換基を表す］
から出発する、式（Ｔ）の（１ｒ，４ｒ）－４－置換シクロヘキサン－１－アミン［＝トランス－４－置換シクロヘキサン－１－アミン］の生成であって、
ジアステレオマー混合物を、等モル量未満から等モル量までの量で使用されるアミンアクセプターの存在下、全細胞形態、可溶性形態または固定化形態の単一のトランスアミナーゼ生体触媒と反応させる、
生成に関する。

【0050】

第１の態様において、本発明は、等モル量未満から等モル量までの量で使用されるアミンアクセプターの存在下、全細胞形態、可溶性形態または固定化形態の単一のトランスアミナーゼ生体触媒を使用する、２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステルまたはそれらの任意の塩のジアステレオマー混合物（式（Ｉ）＋式（ＩＩ））から出発する、式（Ｉ）の２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステルの生成に関する。

【化12】

【0051】

第２の態様において、本発明は、等モル量未満から等モル量までの量で使用されるアミンアクセプターの存在下、単一のトランスアミナーゼ生体触媒を使用する、対応するトランス／シス－ジアステレオマーまたはそれらの任意の塩の混合物（化合物ＩＶ＋Ｖ）から出発する、式（ＩＶ）のヒドロキシル保護されたまたは保護基を含まないトランス－４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミンの生成に関する。

【化13】

【0052】

第３の態様において、本発明は、等モル量未満から等モル量までの量で使用されるアミンアクセプターの存在下、単一のトランスアミナーゼ生体触媒を使用する、対応するトランス／シス－ジアステレオマー混合物（化合物ＶＩＩ＋ＶＩＩＩ）からの保護された２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）アセトアルデヒド（ＶＩＩ）の生成に関する。

【化14】

【0053】

本発明による方法は、バッチ操作および連続操作の両方において実現可能である。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1】ＣｖＳＷ６０Ｃ－ＴＡのアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。

【図2】ＶｆＳ－ＴＡのアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。

【図3】ＣｖＳＷ６０Ｃ－ＴＡおよびＶｆＳ－ＴＡについてのペアワイズ配列アライメントを示す図である。

【図4】ＡＴＡ－２１７と名付けられたＶｆＳ－ＴＡのバリアントにおける１７の変異を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0055】

本発明による技術的解決手段は、一般的に言えば、上記で述べたように、４－置換シクロヘキサン－１－アミンのジアステレオマー混合物（式Ｃ＋式Ｔ）から出発して、式（Ｔ）の（１ｒ，４ｒ）－４－置換シクロヘキサン－１－アミン［＝トランス－４－置換シクロヘキサン－１－アミン］を生成するために好適である。しかしながら、本発明は、特定の価値を有するいくつかの態様および実施形態を含む。
主に、本発明は、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル（Ｉ）の合成のための２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステルのトランス／シス－ジアステレオマー混合物（Ｉ＋ＩＩ）の単一のトランスアミナーゼが触媒する動的異性化を含む方法を提供する。しかし、同時に、動的異性化プロセスは、等モル量未満の量で使用されるアミンアクセプターの存在下、単一のトランスアミナーゼ生体触媒を用いる、それぞれ、４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミン（式（ＩＶａ）＋式（Ｖａ））または４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミン（式（ＶＩＩａ）＋式（ＶＩＩＩａ））の対応するシス／トランス－ジアステレオマー混合物からの式（ＩＶａ）のトランス－４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミンまたは式（ＶＩＩａ）のトランス－４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミンの調製のためにも適用可能であり得る。

【0056】

２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル（Ｉ）は、薬理活性物質の合成において使用される。具体的には、２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸Ｃ_１－６アルキルエステルのジアステレオマー的に純粋なトランス－異性体形態が適用される薬理活性物質の合成のためである。特に、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル生成物（Ｉｂ）は、カリプラジンとして一般に公知のトランス－Ｎ－｛４－［２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）－ピペラジン－１－イル］－エチル］シクロヘキシル｝－Ｎ’，Ｎ’－ジメチルウレアの合成において使用される。トランス－４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミン（ＩＶａ）またはトランス－４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミン（ＶＩＩａ）はまた、カリプラジンに至る代替合成プロセスにおいて適用され得る。

【0057】

好ましく使用されるエステルにおいて、式ＩにおけるＲ基は、直鎖または分枝鎖を有する１～６個の炭素原子を含有するＣ_１－６アルキル部分を表す。

【0058】

原薬であるカリプラジンの化学構造は、４－置換シクロヘキサンアミン単位を含有する。そのため、環上の置換基の適切な空間配置［すなわち（１ｒ，４ｒ）］を有する２つの疑似不斉中心を選択的に形成することが重要である。実際には、これは、エチル２－（４－アミノシクロヘキシル）アセテートＨＣｌ（Ｉｂ・ＨＣｌ）のジアステレオマー的に純粋なトランス－異性体形態のみが適用可能であること、およびこのジアステレオマー（Ｉｂ）の選択的形成または中間体化合物（Ｉｂ＋ＩＩｂ）の２つのジアステレオマーの分離のいずれかが必須であることを特異的に意味する。

【0059】

上で言及したように、工業スケールの２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル塩酸塩（Ｉｂ・ＨＣｌ）出発材料は、ＷＯ２０１０／０７０３６８に記載の製造プロセスによって、単純な反応工程を介して、高品質で提供される。この手順を使用することによって、２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル誘導体、例えば、メチル、エチルまたはプロピルエステル誘導体は、約１：１の比のシス／トランス異性体の混合物（それぞれ、化合物Ｉａ＋ＩＩａ、Ｉｂ＋ＩＩｂ、またはＩｃ＋ＩＩｃ）として調製され得る。この混合物（Ｉ＋ＩＩ）は、結晶化によって所望のトランス－生成物（Ｉ）およびシス－副生成物（ＩＩ）に分離される。通常、シス－副生成物は、廃棄物として処理されるか、またはシス－およびトランス－化合物（Ｉ＋ＩＩ）の混合物への異性化によって、分離工程に再利用され得る。

【0060】

本発明者らは、バッチまたは連続フロープロセスの方法のいずれかを使用して、ジアステレオマー分離の競合的な技術的解決手段であるトランスアミナーゼ系生体触媒プロセスの実際の適用を行おうとした。

【0061】

驚くべきことに、この新たに設計された方法が、元のトランス－異性体（化合物Ｉ）内容物に限定された伝統的な分離に基づくプロセスの比較的良好な生成物収率を上回り、それによって、それが、はるかに効率的な方法でトランス－異性体（化合物Ｉ）を生成するのを可能にしたことを見出した。

【0062】

本発明者らは、ジアステレオマーのシス／トランス－混合物（化合物Ｉ＋ＩＩ）のシス－異性体（化合物ＩＩ）内容物のほとんどが、単一のＴＡおよび等モル量未満の量の適当なアミンアクセプターを用いて異性化され得、良好な収率および高いジアステレオマー過剰率のトランス－異性体（化合物Ｉ）およびより低い量の対応する４－置換シクロヘキサノン（化合物ＩＩＩ）の混合物をもたらす、生体触媒プロセスを開発した。本発明者らは、これまで伝統的な製造プロセスの一部分であった分離プロセスよりもはるかに効率的である方法の開発に成功した。

【0063】

本発明者らは、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル（式Ｉ）、特に、Ｃ_１－６アルキルエステル、好ましくは、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル（化合物Ｉｂ）および２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸イソプロピルエステル（化合物Ｉｄ）、最も好ましくは、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル（化合物Ｉｂ）の生成のための生体触媒経路を初めて開発した。

【0064】

本発明によるこの解決手段は、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステルＨＣｌ（化合物Ｉｂ・ＨＣｌ）が、カリプラジンの重要中間体であるので、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステルＨＣｌ（化合物Ｉｂ・ＨＣｌ）の調製のための、したがって、カリプラジンの生成を改善するのに著しく寄与する、新たな工業的に適用可能な代替アプローチを意味する。

【0065】

対応する２－（４－オキソシクロヘキシル）酢酸エチルエステル（ＩＩＩｂ）のＴＡ触媒還元的アミノ化は、トランス－生成物（化合物Ｉｂ）を直接的に得る目的で、ジアステレオトープ選択的な方法として探索され、探索されたＴＡは、シス－形態（化合物ＩＩｂ）を含有する生成物を優先的に生じた。

【0066】

２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸の一部のＣ_１－６アルキルエステル、好ましくは、エチルエステルおよびイソプロピルエステルのシス／トランス－異性体混合物（それぞれ、化合物Ｉｂ＋ＩＩｂ、およびＩｄ＋ＩＩｄ）のジアステレオマー選択的分離についての本発明者らの当初の研究仮説は、シス選択的ＴＡの支援により、約１：１の比のシス／トランス異性体の得られた混合物（化合物Ｉ＋ＩＩ）が、等モル量未満の量のケトン型アミンアクセプターの存在下の生体触媒的方法によって分離できるということであった

【0067】

本発明者らは、驚くべきことに、等モル量未満の量のアミンアクセプター化合物としてピルビン酸塩の存在下でＴＡを使用する生体触媒プロセスの適用による異性体エステル（化合物Ｉ＋ＩＩ）の目的とする分離が、＞９８％のジアステレオマー過剰率で最高で＞８５％のトランス－異性体（化合物Ｉ）、および＜１５％のケトン（化合物ＩＩＩ）を生じる優れた結果で成し遂げることができたこと、ならびにバッチ方式または連続フロー方式のいずれかで行われ得るプロセスが、シス－異性体（化合物ＩＩ）のケトン（化合物ＩＩＩ）への脱アミノ化以外のさまざまな度合いのシスからトランスへの異性化（化合物ＩＩの化合物Ｉへの変換）を含んでいたことも見出した

【0068】

シス／トランス－２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル（化合物Ｉ＋ＩＩ）、好ましくは、エチルエステル異性体混合物（化合物Ｉｂ＋ＩＩｂ）から出発する単一のＴＡ触媒生体触媒的なシスからトランスへの異性化プロセスのために、等モル量未満の量のアミンアクセプター化合物として、２－（４－オキシシクロヘキシル）酢酸エステル（ＩＩＩ）、好ましくは、２－（４－オキシシクロヘキシル）酢酸エチルエステル（化合物ＩＩＩｂ）が適用され得、増強されたジアステレオマー過剰率（ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}約７５～８０％）を有するトランス－異性体（化合物Ｉｂ）、および初期量に近い追加の２－（４－オキシシクロヘキシル）酢酸エステル（化合物ＩＩＩｂ）の混合物をもたらした。再結晶によるこの混合物からのトランス－異性体（化合物Ｉｂ）の分離後、シス－異性体（化合物ＩＩｂ）およびアミンアクセプターケトン（化合物ＩＩＩｂ）を含有する再結晶の母液からの混合物は、アミンアクセプター／出発ジアステレオマー混合物として次の異性化工程に直接的に再利用することができる。

【0069】

一般に、さまざまな官能基、例えば、芳香族基、脂肪族基およびカルボキシレート基を有するケトンの非立体選択的な還元的アミノ化は、Ｐ．Ｆａｌｕｓらの刊行物（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，５２，１３１０－１３１２（２０１１），ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｔｅｔｌｅｔ．２０１１．０１．０６２）に記載される方法に従って、バッチ方式または連続フロー方式のいずれかで成し遂げることができる。

【0070】

本発明者らの開発研究の間に、２－（４－オキシシクロヘキシル）酢酸エステル（Ｉ）、好ましくは、２－（４－オキシシクロヘキシル）酢酸エチルエステル（ＩＩＩｂ）または２－（４－オキシシクロヘキシル）酢酸イソプロピルエステル（ＩＩＩｄ）、最も好ましくは、２－（４－オキシシクロヘキシル）酢酸エチルエステル（化合物ＩＩＩｂ）を、生体触媒的なシスからトランスへの異性化（化合物ＩＩから化合物Ｉ）プロセスのためのアミンアクセプターとして試みた。

【0071】

Ｚ．Ｍｏｌｎａｒら（Ｃａｔａｌｙｓｔｓ，９，４３８（２０１９），ＤＯＩ：１０．３３９０／ｃａｔａｌ９０５０４３８）によって開示された固定化全細胞形態におけるラセミアミンの速度論的分割のために成功裏に既に適用されている、異なるエナンチオマー優先度を有する６つのトランスアミナーゼ酵素を、立体選択的プロセスのために考慮した。選択されたＴＡは、それぞれ、３つの（Ｒ）－選択的ＴＡおよび３つの（Ｓ）－選択的ＴＡの、アルスロバクター属種（ＡｒＲ－ＴＡ）、その変異型バリアント（ＡｒＲ_ｍｕｔ－ＴＡ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）（ＡｔＲ－ＴＡ）由来の（Ｒ）－選択的ＴＡ；およびアルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）（ＡｒＳ－ＴＡ）、クロモバクテリウム・ビオラセウムの変異型バリアント（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ）、ビブリオ・フルビアリス（ＶｆＳ－ＴＡ）由来の（Ｓ）－選択的ＴＡを含んでいた。

【0072】

４位においてアルコキシカルボニルメチル基で置換されたシクロヘキサノン（式ＩＩＩ）は、バッチで、６つの（Ｒ）－または（Ｓ）－選択的トランスアミナーゼを用いて、対応するアルキル２－（４－アミノシクロヘキシル）アセテートのジアステレオマー（式Ｉまたは式ＩＩ）に転換された。エチル２－（４－オキシシクロヘキシル）アセテート（化合物ＩＩＩｂ）から出発する試みは、クロモバクテリウム・ビオラセウム（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ）［Ｋ．Ｅ．Ｃａｓｓｉｍｊｅら（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１０，５４６６－５４７０（２０１２），ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ２ＯＢ２５８９３Ｅ）］およびビブリオ・フルビアリス（ＶｆＳ－ＴＡ）［Ｆ．Ｇ．Ｍｕｔｔｉら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１００３－１００７（２０１２），ＤＯＩ：１０．１００２／ｅｊｏｃ．２０１１０１４７６］由来のＴＡによって、シス－ジアステレオマー（化合物ＩＩｂ、ｄｅ_ｃｉｓ＞９０％）の形成に好ましい最も高いジアステレオトープ選択性を明らかにした。そのため、シス選択的ＴＡとしては、限定されるものではないが、それらのアミノ酸配列によって特徴付けられる、クロモバクテリウム・ビオラセウムＴＡ変異体Ｗ６０Ｃ（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ）、およびビブリオ・フルビアリスＴＡ（ＶｆＳ－ＴＡ）が挙げられる。ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡのアミノ酸配列（配列番号１）は、図１によって示され、ＶｆＳ－ＴＡのアミノ酸配列（配列番号２）は、図２によって示される。ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡおよびＶｆＳ－ＴＡについてのペアワイズ配列アライメントは、図３によって示される。図１および図２によって示される例示的な配列中の下線付きのアミノ酸は、親和性タグをコードし、したがって、それらは、配列比較に関与しない。

【0073】

シス－選択性を有する例示的なＴＡの２つのアミノ酸配列（それぞれ、図１および２に表されるＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡについての配列番号１およびＶｆＳ－ＴＡについての配列番号２）は、３７．１％の配列同一性を共有するので（図３を参照されたい）、配列番号１または配列番号２のいずれかに対して４０％よりも高い配列同一性を有する任意のＴＡは、類似の触媒特性を有すると予想される。

【0074】

本発明は、少なくとも約１００残基の領域にわたって、本発明の例示的な配列（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡについての配列番号１またはＶｆＳ－ＴＡについての配列番号２）のいずれかに対して少なくとも約３７％、４０％、５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単一のトランスアミナーゼによって、シス－４－置換シクロヘキサン－１－アミン（式Ｃによって特徴付けられる）を対応するトランス－４－置換シクロヘキサン－１－アミン（式Ｔによって特徴付けられる）に変換するための動的異性化方法であって、配列同一性が、本発明のアミノ酸配列との配列比較アルゴリズムによる解析によってまたは目視検査によって決定される、方法を提供する。

【0075】

本発明者らの実験結果によれば、等モル量未満の量のケトン型アミンアクセプターの存在下、単一のシス選択的ＴＡの支援による、２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸の一部のＣ_１－６アルキルエステル（Ｉ＋ＩＩ）、好ましくは、エチルエステルおよびイソプロピルエステルのシス／トランス－異性体混合物（それぞれ、Ｉｂ＋ＩＩｂおよびＩｄ＋ＩＩｄ）からのジアステレオマー選択的速度論的分離を目的とするＴＡ触媒反応は、高いジアステレオマー純度（ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}）、および元のシス／トランス－異性体混合物（化合物Ｉ＋ＩＩ）のトランス－異性体（化合物Ｉ）含有量（ｘ_{ｔｒａｎｓ}）よりも著しく高い収率で、トランス－異性体生成物（化合物Ｉ）を得るのを成し遂げることができる。したがって、本発明者らの発明した方法は、シス／トランス－異性体混合物（化合物Ｉ＋ＩＩ）の単純なジアステレオマー選択的速度論的分離ではなく、かなりの割合のシス－異性体副生成物（化合物ＩＩ）を所望のトランス－異性体生成物（化合物Ｉ）に変換する動的異性化方法である。

【0076】

本発明に関連する任意の科学的背景理論に固執することなく、進行中の化学的プロセスについての説明は、等モル量未満の量のアミンアクセプターの存在下、シス－異性体（化合物ＩＩ）⇔ケトン（化合物ＩＩＩ）転換は、速度論的により好ましいが（両方の方向に比較的速く、したがって可逆的）、ケトン（化合物ＩＩＩ）⇔トランス－異性体（化合物Ｉ）転換は、非常に遅く、その平衡は、熱力学的に好ましいトランス－異性体（化合物Ｉ）の方向にシフトする可能性がある。

【0077】

本発明の第１の態様を考慮して、本発明者らは、バッチ方法を使用して、ジアステレオマー分離の技術的解決手段であるトランスアミナーゼ系生体触媒プロセスの実際の適用を行おうとした。

【0078】

トランス／シス－アミン（ほぼ１：１の比の化合物Ｉｂ＋ＩＩｂ、２５ｍＭ）から出発する動的異性化プロセスのための等モル量未満の量のアミンアクセプターとしてピルビン酸ナトリウムを使用すると、トランス－異性体生成物の高いジアステレオマー過剰率（化合物Ｉｂ：ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９５％）は、ＴＡ生体触媒処方および量に応じて、異なる反応時間で、クロモバクテリウム・ビオラセウムおよびビブリオ・フルビアリスＴＡ（それぞれ、ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡおよびＶｆＳ－ＴＡ）の両方を用いて、達成することができる（表１）。

【0079】

【表1】

【0080】

表１における実施例４は、トランス－異性体（化合物Ｉｂ、ｘ_{ｔｒａｎｓ}＝５６％）およびシス－異性体（化合物ＩＩｂ、ｘ_ｃｉｓ＝４４％）の混合物から出発して、バッチ方式で、２時間の反応時間後に、ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９９％でトランス－異性体（化合物Ｉｂ：ｘ_{ｔｒａｎｓ}＝８６％）への良好な収率およびより少ない量のケトン（化合物ＩＩＩｂ：ｘ_{ｋｅｔｏｎｅ}＝１４％）を生じる、精製された可溶性ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡを用いる最良の設定を示す。この結果は、最高で６８％の元のシス－異性体（化合物ＩＩｂ）内容物が、所望のトランス－異性体（化合物Ｉｂ）に変換され得ることを実証している。

【0081】

表および図１に示された実施例は、著しい度合いのシスからトランスへの異性化［３４～６８％の元のシス－内容物（化合物ＩＩｂ）の所望のトランス－異性体（化合物Ｉｂ）への変換］が、ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡのさまざまな形態（実施例１および４）またはＶｆＳ－ＴＡの異なる調製物（実施例２、３、５および６）のいずれかを用いて達成することができたことを示した。

【0082】

表１に列挙された実施例は、シス選択的ＴＡが、それらの精製された可溶性形態（実施例４および５）またはそれらの固定化形態の生体触媒、例えば、ゾル－ゲル封入によって固定化されたＴＡ－発現全細胞（Ｚ．Ｍｏｌｎａｒら，Ｃａｔａｌｙｓｔｓ，９，４３８（２０１９），ＤＯＩ：１０．３３９０／ｃａｔａｌ９０５０４３８の方法による）（実施例１、２および３）、または多孔質ポリマー樹脂に共有結合的に付着した精製されたタンパク質（Ｅ．Ａｂａｈａｚｉら Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．１３２，２７０－２７８（２０１８），ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｂｅｊ．２０１８．０１．０２２の方法による）（実施例６）として適用することができることも示している。

【0083】

トランス／シス－アミン（ほぼ１：１の比の化合物Ｉｂ＋ＩＩｂ、２５ｍＭ）から出発し、アミンアクセプターとして４－置換シクロヘキサノン（化合物ＩＩＩｂ）またはシクロヘキサノンを使用する場合、熱力学的平衡（ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}約７５～８０％）は、ＴＡ生体触媒の形態および量に応じて、異なる反応時間後に達成することができる（表２）。

【0084】

【表2】

【0085】

表２における実施例７は、ＶｆＳ－ＴＡの固定化全細胞形態を用い、アミンアクセプターとして対応する４－置換シクロヘキサノン（化合物ＩＩＩｂ：ｘ_{ｋｅｔｏｎｅ}＝１１％）を使用して、トランス／シス－ジアステレオマー混合物（５１．５：３９．２の比の化合物Ｉｂおよび化合物ＩＩｂ）から出発する動的異性化プロセスにより、バッチ方式で、４８時間の反応時間後に、ほぼ元の量のケトン（化合物ＩＩＩｂ：ｘ_{ｋｅｔｏｎｅ}＝１３．０％）以外に、著しく増加した量のトランス－異性体（化合物Ｉｂ：ｘ_{ｔｒａｎｓ}＝７４．６％でｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＝７１．５％）を得られることを示している。このデータは、固定化ＶｆＳ－ＴＡ生体触媒を用いて、約５３％の元のシス－異性体（化合物ＩＩｂ）内容物を、所望のトランス－異性体（化合物Ｉｂ）に変換することができたことを意味する。ＷＯ２０１０／０７０３６８に開示される方法と類似する方法によるトランス／シス－分離は、ほぼ同一量のシス－異性体（化合物ＩＩｂ）およびケトン（化合物ＩＩＩｂ）を含有する母液から混合物をもたらし得、これは、次の動的異性化サイクルにおいて、アミンアクセプター／シス－異性体混合物として再利用され得る。

【0086】

表２における実施例８は、精製された可溶性ＶｆＳ－ＴＡを用い、アミンアクセプターとして対応する４－置換シクロヘキサノン（化合物ＩＩＩｂ：ｘ_{ｋｅｔｏｎｅ}＝１１％）を使用して、トランス－異性体（化合物Ｉｂ、ｘ_{ｔｒａｎｓ}＝４４．４％）およびシス－異性体（化合物ＩＩｂ、ｘ_ｃｉｓ＝４６．６％）の混合物から出発する動的異性化プロセスが、バッチ方式で、４８時間の反応時間後に、元の量のケトン（化合物ＩＩＩ：ｘ_{ｋｅｔｏｎｅ}＝１０．７％）と一緒に、ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＝７５．７％を意味する、トランス－異性体（化合物Ｉｂ：ｘ_{ｔｒａｎｓ}＝７８．４％）の量の著しい増加と少量の残りのシス－異性体（化合物ＩＩｂ：ｘ_ｃｉｓ＝１０．８％）をもたらし得ることを示している。このデータは、約５３％の元のシス－異性体（化合物ＩＩｂ）内容物を、所望のトランス－異性体（化合物Ｉｂ）に変換することができたことを意味する。

【0087】

表２における実施例９は、精製された可溶性ＶｆＳ－ＴＡおよびアミンアクセプターとしてシクロヘキサノン（０．２当量の量）を用いて、トランス－異性体（化合物Ｉｂ、ｘ_{ｔｒａｎｓ}＝４９％）およびシス－異性体（化合物ＩＩｂ、ｘ_ｃｉｓ＝５１％）の混合物から出発する動的異性化プロセスが、バッチ方式で、４８時間の反応時間後に、ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＝８０．４％を意味する、トランス－異性体（化合物Ｉｂ：ｘ_{ｔｒａｎｓ}＝８５．９％）の量の最も高い増加と少量の残りのシス－異性体（化合物ＩＩｂ：ｘ_ｃｉｓ＝９．３％）をもたらし得ることを示している。このｄｅ_{ｔｒａｎｓ}値は、おそらく、最も高い達成可能な熱力学的平衡比に近い。

【0088】

本発明の第２の態様を考慮して、本発明者らは、連続フロー方式を使用して、ジアステレオマー分離の技術的解決手段であるトランスアミナーゼ系生体触媒プロセスの実際の適用を行おうとした。

【0089】

フローケミストリーの使用は、合成方法論の右肩上がりの増加を目の当たりにしている（Ｍ．Ｇｉｕｄｉら Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４９，８９１０－８９３２（２０２０），ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ９ｃｓ００８３２ｂ）。適用における幅広い多用途性は、アプローチのモジュール式の特質の結果であり、単一工程プロセスおよび複数工程プロセスの両方のために、新たな条件、機器、分析、自動化、および試薬の種類の容易な統合を可能にする。正確な制御は、優れた再現性および安全性をもたらし、医薬品工業のための合成においても、フローケミストリーをある範囲の領域に適用可能にする（Ｍ．Ｂａｕｍａｎｎら Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．２４，１８０２－１８１３（２０２０），ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｏｐｒｄ．９ｂ００５２４；Ｄ．Ｌ．Ｈｕｇｈｅｓ，Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．２４，１８５０－１８６０（２０２０），ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｏｐｒｄ．０ｃ００１５６）。

【0090】

連続フローシステムにおける合成化学の利益は、よりグリーンで、より温和で、より低い温度で、かつ水性の条件下での反応を含む、生体触媒の利益と組み合わせることができる（Ｊ．Ｂｒｉｔｔｏｎら，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４７，５８９１－５９１８（２０１８），ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ７ｃｓ００９０６ｂ；Ｐ．Ｄｅ Ｓａｎｔｉｓら，Ｒｅａｃｔ Ｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．５，２１５５－２１８４（２０２０），ＤＯＩ：１０．１０３９／ｄ０ｒｅ００３３５ｂ）。反応条件の微調整に加えて、連続フローシステムの使用は、酵素触媒の問題、例えば、基質および生成物阻害を軽減することができる。細胞および酵素を使用する反応は、連続システムにおける著しく改善された混合、物質移動、温度調節、圧力反応の実現可能性、自動化およびプロセス変動の低減、ならびに連続フローによって容易になる生成物分析および精製の利点を得ることができる。そのため、連続フローおよび生体触媒の組み合わせは、さまざまな合成目標を達成するための非常に効率的なアプローチとして浮上している。

【0091】

３つの理想的な反応器の種類の選択基準、すなわち、生体触媒のためのバッチ式撹拌漕反応器（ＢＳＴＲ）は、Ｊ．Ｍ．Ｗｏｏｄｌｅｙ（Ｗｏｏｄｌｅｙ，Ｊ．Ｍ．「Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」における３．９．章、Ｋ．Ｆａｂｅｒ，Ｗ．Ｄ．Ｆｅｓｓｎｅｒ，Ｎ．Ｊ．Ｔｕｒｎｅｒ編；Ｔｈｉｅｍｅ：Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ（２０１５），３巻，５１５－５４６頁，ＤＯＩ：ＤＯＩ：１０．１０５５／ｓｏｓ－ＳＤ－２１６－００３３１）およびＲ．Ｌｉｎｄｅｑｕｅら（Ｃａｔａｌｙｓｔｓ ９，２６２（２０１９）；ＤＯＩ：１０．３３９０／ｃａｔａｌ９０３０２６２）によって分析されている。

【0092】

ＢＳＴＲは、一般に、それらの単純性および柔軟性に起因して、生体触媒反応のために使用されている。ＢＳＴＲにおいて、最初に、基質および酵素は、機械的撹拌漕に入れられて、反応を開始し、その後、材料は、反応が停止されるまで、除去されない。ＢＳＴＲにおいて、濃度は、反応器内の場所にかかわらず、同じである。初めは、基質は、最初に迅速に消費されるが、反応の後半では、反応速度は遅くなる。しかしながら、ＢＳＴＲにおける十分な時間を考えると、平衡が好ましいという条件で、完全な変換を達成することができる。

【0093】

連続式撹拌槽型反応器（ＣＳＴＲ）の設計は、材料が連続的に添加され、そこから除去され、したがって、作業体積が一定のままであることを除いて、ＢＳＴＲの設計と類似している。ＣＳＴＲにおいて、生体触媒は、排出物における触媒の損失のバランスを取るように反応器に連続的に供給されるか、または固定化および／もしくは部分透過性膜によって反応器内に保持される。ＣＳＴＲは、十分に混合されるので、反応器の内容物および排出物は、均一である。しかしながら、ＣＳＴＲにおいて、排出物は、常に一部の基質を含有し、そのため、完全な基質変換は不可能である。反応速度と変換との間のこのトレードオフは、ＣＳＴＲの重要な特徴である。

【0094】

連続式プラグフロー反応器（ＣＰＦＲ）において、反応物は、長い管状反応器にポンプで送られ、そこでは、撹拌漕とは異なって、そこを流れる材料は、その前またはその後ろを流れる任意の材料と混合しない。これは、ＢＳＴＲにおける経時的な濃度勾配と同一の、反応器の長さにわたる濃度勾配をもたらす。したがって、反応器が十分に長い場合、基質は、完全に変換され得る。この理由のために、材料がＣＰＦＲ中で費やす時間は、単に、反応器の長さおよび体積流量の関数である。可溶性触媒を用いてＣＰＦＲを操作することが可能であるが、生体触媒は、典型的には、反応器の壁に、または次に管に充填されて、連続式充填床反応器（ＣＰＢＲ）を形成する担体材料の粒子上に、固定化される。

【0095】

本発明者らは、連続フロー方式でトランス－異性体（式Ｉ）を生成することを意図して、ＣＰＦＲにおいて、ＴＡによって触媒されるトランス／シス－異性体混合物（式Ｉ＋式ＩＩ）から２－（トランス－４－アミノ－シクロヘキシル）酢酸エステル（式Ｉ）を生じる動的異性化を目的とする実験を行った。連続フロープロセスのための充填床反応器におけるＴＡ調製物の適用性は、固定化ＴＡの物理化学的特性、例えば、酵素密度、ならびに担体の表面、形状、細孔 多孔性および粒子サイズにおける利用可能性に依存する。ＴＡのさまざまな固定化方法を、ＴＡ触媒の連続フロー速度論的分割プロセスのために使用することができる。ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡおよびＶｆＳ－ＴＡは、Ｚ．Ｍｏｌｎａｒら（Ｃａｔａｌｙｓｔｓ，９，４３８（２０１９），ＤＯＩ：１０．３３９０／ｃａｔａｌ９０５０４３８）の方法に従って、固定化全細胞生体触媒として適用することができ、またはマクロ多孔質ポリマー樹脂上に共有結合的に固定化されたＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡも、Ｅ．Ａｂａｈａｚｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．１３２，２７０－２７８（２０１８），ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｂｅｊ．２０１８．０１．０２２）によって記載されているようにして適用可能であった。

【0096】

本発明の好ましい実施形態によれば、２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸のエチルまたはイソプロピルエステルのジアステレオマー混合物（それぞれ、Ｉｂ＋ＩＩｂまたはＩｄ＋ＩＩｄ）は、適切なシス選択的トランスアミナーゼ（例えば、クロモバクテリウム・ビオラセウムＴＡまたはビブリオ・フルビアリスＴＡ）の存在下、ケトン（化合物ＩＩＩ）中間体の形成を介して、アミンアクセプターとして等モル量未満のピルビン酸塩の存在下、非常にジアステレオピュアなトランス－アミン（Ｉ、ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９９％）およびケトン（化合物ＩＩＩ）の混合物に異性化された。

【0097】

動的異性化についての本発明者らの実験結果によれば、特に、シス選択的ＴＡの固定化形態は、有利であり、より特に、ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡおよびＶｆＳ－ＴＡは、有利であり、最も特に、マクロ多孔質ポリマー樹脂上に共有結合的に固定化されたＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ_ＣＢ）の使用は、有利であった。直列的に連結されたＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ_ＣＢ（約２２０ｍｇ）で満たされた充填床カラムにおいて、１０μＬ分^－１の流速で、トランス／シス－アミン（ほぼ１：１の比の化合物Ｉｂ＋ＩＩｂまたはｄ＋ＩＩｄ、２０ｍＭ）およびアミンアクセプターとしてピルビン酸ナトリウム（０．９５当量）の溶液から出発する動的異性化プロセスは、トランス－生成物（化合物ＩｂまたはＩｄ：ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９９％）の優れたジアステレオマー過剰率をもたらした（表３）。

【0098】

【表3】

【0099】

表３における実施例１０は、マクロ多孔質ポリマー樹脂上に共有結合的に固定化されたＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡを用いて、アミンアクセプターとしてピルビン酸ナトリウム（０．９５当量を使用して、ＨＣｌ塩形態のエチルエステルのトランス／シス－ジアステレオマー混合物（３０．３：６９．７の比の化合物Ｉｂ・ＨＣｌ＋ＩＩｂ・ＨＣｌ）から出発する動的異性化プロセスを、連続フロー方式で行うことができることを示している。最適化されていないプロセスにより、４８時間の連続操作後に、中間体ケトン（化合物ＩＩＩｂ：ｘ_{ｋｅｔｏｎｅ}＝６１．２％）以外に、増加した量のトランス－異性体（化合物Ｉｂ：ｘ_{ｔｒａｎｓ}＝３８．８％でｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９９）を得た。このデータは、固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ生体触媒を用いて、元の３０．３％のトランス－異性体（化合物Ｉｂ）含有量が、８．５％～３８．８％増加し、ＨＣｌ塩として所望のトランス－異性体（化合物Ｉｂ・ＨＣｌ）について３０．７％の単離収率が可能であることを意味する。

【0100】

表３における実施例１１は、アミンアクセプターとしてのピルビン酸ナトリウム（０．９５当量）の存在下、共有結合的固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ生体触媒が、連続フロー方式で、それらのＨＣｌ塩形態のイソプロピルエステルのトランス／シス－ジアステレオマー混合物（４８．３：５１．７の比の化合物Ｉｄ・ＨＣｌ＋ＩＩｄ・ＨＣｌ）の動的異性化に適用可能であり得ることを実証している。最適化されていないプロセスは、４８時間の連続操作後に、中間体ケトン（化合物ＩＩＩｄ：ｘ_{ｋｅｔｏｎｅ}＝４６．０％）に加えて、上昇した量のトランス－異性体（化合物Ｉｄ：ｘ_{ｔｒａｎｓ}＝５４．０％でｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９９）を生成した。これらの結果は、固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ生体触媒を用いて、初期の４８．３％のトランス－異性体（化合物Ｉｄ）の量が、５．７％～５４．０％増加し、ＨＣｌ塩として必要なトランス－異性体（化合物Ｉｄ・ＨＣｌ）について４６．５％の単離収率を可能にすることを示している。

【0101】

表４に要約された本発明者らの実験結果によれば、シス選択的ＴＡの固定化形態を用いる部分的動的異性化は、連続フロー方式で、４－置換シクロヘキシルアミンのシス／トランス－ジアステレオマー混合物（化合物Ｃ＋化合物Ｔ）のさらなる選択を行うことができた。１０μＬ分^－１の流速で、直列的に連結されたＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ_ＣＢ（約２２０ｍｇ）で満たされた充填床カラムにおいて４０℃でのトランス／シス－アミン（化合物Ｃ＋Ｔ）およびアミンアクセプターとしてのピルビン酸ナトリウム（０．９５当量）の溶液から出発する動的異性化プロセスは、トランス－生成物（化合物ＩｂまたはＩｄ：ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９９％）の優れたジアステレオマー過剰率をもたらした（表４）。

【0102】

【表4】

【0103】

表４における実施例１２は、４－メチルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物のシス／トランス－ジアステレオマー混合物（４２：５８の比の化合物Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｈ））から出発して、動的異性化プロセスを、連続フロー方式で、アミンアクセプターとしてのピルビン酸ナトリウム（０．９５当量）の存在下、固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ生体触媒を用いて行うことができることを示している。最適化されていないプロセスにより、２４時間の連続操作後に、中間体ケトン（化合物Ｋ（Ｇ＝Ｈ）：ｘ_{ｋｅｔｏｎｅ}＝１９．８％）以外に、増加した量のトランス－異性体（化合物Ｔ（Ｇ＝Ｈ）：ｘ_{ｔｒａｎｓ}＝８０．２％でｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９９）を得た。このデータは、元の５８．０％のトランス－異性体（化合物Ｔ（Ｇ＝Ｈ））含有量が、２２．２％～８０．２％増加することを示している。その揮発性に起因して、生成物（化合物Ｔ（Ｇ＝Ｈ））は単離されなかった。

【0104】

表４における実施例１３は、アミンアクセプターとしてのピルビン酸ナトリウム（０．９５当量）の存在下、共有結合的固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ生体触媒が、連続フロー方式で、４－エチルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物のシス／トランス－ジアステレオマー混合物（６５．４：３４．６の比の化合物Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｍｅ））の動的異性化に適用可能であり得ることを実証している。最適化されていないプロセスは、２４時間の連続操作後に、中間体ケトン（化合物Ｃ＋Ｔ（Ｇ＝Ｍｅ）：ｘ_{ｋｅｔｏｎｅ}＝５３．８％）に加えて、増加した量のトランス－異性体（化合物Ｔ（化合物Ｔ（Ｇ＝Ｍｅ）：ｘ_{ｔｒａｎｓ}＝４６．２％でｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９９）を生成した。これらの結果は、初期の３４．６％のトランス－異性体（化合物Ｔ（Ｇ＝Ｍｅ））の量が、１１．６％～４６．２％増加し、ＨＣｌ塩として必要なトランス－異性体（化合物Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｍｅ））について３０．４％の単離収率を可能にすることを示している。

【0105】

表４における実施例１４は、樹脂固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ生体触媒およびアミンアクセプターとしてピルビン酸ナトリウム（０．９５当量の量）を用いて、４－フェニルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物のシス／トランス－ジアステレオマー混合物（２６．２：７３．８の比の化合物Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｐｈ））から出発する最適化されていない動的異性化プロセスが、連続フロー方式で、２４時間の反応時間後に、最も高い量のトランス－異性体（化合物Ｔ（Ｇ＝Ｐｈ）：ｘ_{ｔｒａｎｓ}＝８３．２％）をもたらすことができ、ＨＣｌ塩として必要なトランス－異性体（化合物Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｐｈ））について７７．７％の単離収率が可能であることを示している。

【0106】

表４における実施例１５は、アミンアクセプターとしてピルビン酸ナトリウム（０．９５当量）の存在下、固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ生体触媒を用いて、４－ベンジルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物のシス／トランス－ジアステレオマー混合物（５０．７：４９．３の比の化合物Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ））から出発する動的異性化プロセスが、連続フロー方式で、達成することができることを検証している。最適化されていないプロセスは、２４時間の連続操作後に、中間体ケトン（化合物Ｋ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ）：ｘ_{ｋｅｔｏｎｅ}＝４０．２％）以外に、増加した量のトランス－異性体（化合物Ｔ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ）：ｘ_{ｔｒａｎｓ}＝５９．８％でｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９９）をもたらした。このデータは、元の５８．０％のトランス－異性体（化合物Ｔ（Ｇ＝Ｈ））含有量が、１０．５％～５９．８％増加し、ＨＣｌ塩として必要なトランス－異性体（化合物Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ））について５４．１％の単離収率を可能にすることを示している。

【0107】

要約すると、表１～４におけるすべての本発明者らの実験は、４－置換シクロヘキサン－１－アミン（化合物Ｃ＋Ｔ）またはその塩（化合物Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ）のシス／トランス－ジアステレオマー混合物のトランス－ジアステレオマー（化合物Ｔ）への動的異性化が、バッチ方式または連続フロー方式で、アミンアクセプターとしての役割を果たす等モル量未満の量のケトンの存在下、さまざまな形態のシス選択的ＴＡを用いて成し遂げることができることを示している。すべてのケースにおいて、生成物混合物中のトランス－異性体（Ｔ）の量は、元のシス／トランス－ジアステレオマー混合物（Ｃ＋Ｔ）におけるよりも著しく高く、これは、異性化なしのジアステレオマー分離に基づく任意の従来のプロセスと比較して、トランス－異性体（Ｔ）の調製収率を改善するための動的異性化方法の可能性を示している。

【0108】

表１～４に要約された本発明者らの実験結果に基づいて、シス選択的ＴＡを用いる部分的動的異性化が４－置換シクロヘキシルアミン、例えば、４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミン（式（ＩＶａ）＋式（Ｖａ））および４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミン（式（ＶＩＩａ）＋式（ＶＩＩＩａ））のシス／トランス－ジアステレオマー混合物のさらなる選択を好都合に行い得ることが予測可能である。

【0109】

そのため、等モル量未満の量のピルビン酸ナトリウムの存在下、精製された可溶性ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡを用いて、トランス／シス－４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミンのジアステレオマー混合物（化合物ＩＶａ＋化合物Ｖａ）から出発して、トランス－異性体（化合物ＩＶａ）を、バッチ方式で、数時間の反応時間後、中程度～少量のケトン（化合物ＶＩａ）以外に、良好な収率（元のトランス－異性体（ＩＶａ）の量を超える）と高いジアステレオマー純度（ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９０％）で得ることができることが予想される。固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡおよび等モル量未満の量のアミンアクセプターケトンを用いて、トランス－異性体（化合物ＩＶａ）を、同様に連続フロー方式によって、中程度の量のケトン（化合物ＶＩａ）以外に、４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミンのトランス／シス－ジアステレオマー混合物（化合物ＩＶａ＋化合物Ｖａ）から、高いジアステレオマー過剰率（ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９５％）で得ることができることも想定される。多量の元のシス－異性体（化合物Ｖａ）内容物を、これらの動的異性化プロセスにおいて、所望のトランス－異性体（化合物ＩＶａ）に変換することができることが予想される。

【0110】

４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミンのトランス／シス－ジアステレオマー混合物（化合物ＶＩＩａ＋化合物ＶＩＩＩａ）からの動的異性化が、数時間の反応時間で、精製された可溶性ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡを用いて、バッチ方式で、有意義に増強された量のトランス－異性体（化合物ＶＩＩａ）を高いジアステレオマー過剰率（ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９０％）で、中程度の量のケトン（化合物ＩＸａ）と一緒にもたらすことができることも予想される。固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡおよび等モル量未満の量のアミンアクセプターケトンを用いて、トランス－異性体（化合物ＶＩＩａ）を、同様に連続フロー方式のプロセスによって、中程度の量のケトン（化合物ＶＩａ）以外に、４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミンのトランス／シス－ジアステレオマー混合物（化合物ＶＩＩａ＋化合物ＶＩＩＩａ）から、高いジアステレオマー過剰率（ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９５％）で得ることができることも予見される。著しい量の元のシス－異性体（化合物ＶＩＩＩａ）内容物を、これらの動的異性化プロセスにおいて、所望のトランス－異性体（化合物ＶＩＩａ）に変換することができることが予測される。

【0111】

そのため、本発明者らは、カリプラジン合成の重要中間体として、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸アルキルエステル［（式Ｉａ－ｄ）、特に、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル（式Ｉｂ）または２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸イソプロピルエステル（式Ｉｄ）、最も好ましくは、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル（式Ｉｂ）］をもたらす動的異性化のための生体触媒経路を初めて開発した。これは、再結晶の代わりに、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステルＨＣｌ（式ＩＩｂ・ＨＣｌ）の調製のための、代替のおよび工業的にも適用可能なアプローチを意味する。

【0112】

類似の方法において、式（ＩＶａ）のトランス－４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミンは、バッチ方式で、等モル量未満から等モル量までの量で使用されるアミンアクセプターの存在下、全細胞形態、可溶性形態または固定化形態の単一のトランスアミナーゼ生体触媒を用いて、４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミンのシス／トランス－ジアステレオマー混合物（式（ＩＶａ）＋式（Ｖａ））から調製することもできる。

【化15】

【0113】

最後に、単一のトランスアミナーゼが触媒する動的異性化は、バッチ方式で、等モル量未満から等モル量までの量のアミンアクセプターの存在下、全細胞形態、可溶性形態または固定化形態のトランスアミナーゼ生体触媒を使用して、４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミンのシス／トランス－ジアステレオマー混合物（式（ＶＩＩａ）＋式（ＶＩＩＩａ））の式（ＶＩＩａ）のトランス－４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミンへの変換を可能にする。

【化16】

【0114】

要約すると、本発明によるプロセスは、いくつかの利点および利益を有する。

【0115】

発明されたプロセスは、
－ シス副生成物（式Ｃ、特に、式ＩＩ、Ｖ、またはＶＩＩＩ）の大部分を優先的に変換することを可能にする、
－ 伝統的な製造プロセスの一部分であった分離プロセスよりもはるかに効率的である、
－ バッチ方式だけでなく、連続フロー方式でも行うことができる、
－ 実験室スケール（＜グラム）において開発されたプロセスは、工業的にも実現可能であり、開発された手順は、スケールアップすることができる、
－ 天然酵素を用いて行うこともできる、
－ エナンチオマーの動的分離／転換についての文献はほとんどが２つのＴＡを使用するが、単一のトランスアミナーゼのみを必要とする、
－ 中間体ケトン（式Ｋ、特に、式ＩＩＩ、ＶＩ、またはＩＸ）に加えて、他の基質を導入する必要がないので、シス／トランス－アミン混合物（式Ｃ＋Ｔ））を用いて行われるプロセスにおいて、アミンアクセプターとして４－置換シクロヘキサノン（式Ｋ）を使用する場合に、効率の観点で著しい利益を示す、
－ カリプラジンの一般的な生成の期間の間に新たな可能性を開くこともできる、
－ 単一のトランスアミナーゼ触媒動的異性化を用いて、カリプラジンの調製のための代替中間体としての役割を果たし得る、さらなるトランス－４－置換シクロヘキシルアミン、例えば、式（ＩＶａ）のトランス－４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキサン－１－アミンまたは式（ＶＩＩａ）のトランス－４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミンの合成に適用可能である。

【0116】

上記に記載した詳細および知見に基づいて、一般に、本発明は、４－置換シクロヘキサン－１－アミンのジアステレオマーまたはそれらの任意の塩の混合物（式（Ｃ）＋式（Ｔ））：

【化17】

［ここで、式（Ｔ）および式（Ｃ）において、Ｇは、
－水素原子；
－Ｃ_１－６アルキル基；
－エステル部分（－ＣＯＯＲ）（式中、Ｒは、好適なアルキル基、アラルキル基またはアリール基、好ましくは、Ｃ_１－６アルキル基、より好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基およびイソプロピル基から選択される置換基を表す）；
－ＣＨ_２－ＯＲ’基（式中、Ｒ’は、水素原子、またはヒドロキシル保護基を表す）；
－式

【化18】

（式中、ｎは、１～２の整数である）の保護されたアルデヒド基；
－置換もしくは無置換のアリール基、好ましくは、フェニル基；または
－アラルキル基、好ましくは、ベンジル基
から選択される置換基を表す］
から出発して、式（Ｔ）の（１ｒ，４ｒ）－４－置換シクロヘキサン－１－アミン［＝トランス－４－置換シクロヘキサン－１－アミン］を生成する方法であって、
ジアステレオマー混合物を、等モル量未満から等モル量までの量で使用されるアミンアクセプターの存在下、全細胞形態、可溶性形態または固定化形態の単一のトランスアミナーゼ生体触媒と反応させる、
方法に関する。

【0117】

本発明の特定の実施形態によれば、この一般的な生成方法は、バッチ方式または連続フロー方式で行うことができる。

【0118】

本発明の好ましい実施形態によれば、この一般的な生成方法は、遊離塩基形態である４－置換シクロヘキサン－１－アミンのジアステレオマー混合物（式（Ｃ）＋式（Ｔ））から出発して、行うことができる。

【0119】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、この一般的な生成方法は、塩形態、好ましくは、塩酸塩形態（式（Ｃ・ＨＣｌ）＋式（Ｔ・ＨＣｌ））である４－置換シクロヘキサン－１－アミンのジアステレオマー混合物（式（Ｃ）＋式（Ｔ））から出発して、行うことができる。

【化19】

【0120】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、この一般的な生成方法は、約２：９８～約９９：１の比のシス／トランス異性体として提供される４－置換シクロヘキサン－１－アミンのジアステレオマー混合物（式（Ｃ）＋式（Ｔ））またはその塩形態から出発して、行うことができる。

【0121】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、この一般的な生成方法において、少なくとも約１００残基の領域にわたって、クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ：配列番号１）またはビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ：配列番号２）に対して少なくとも約３７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼが使用される。

【0122】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、この一般的な生成方法において、少なくとも約１００残基の領域にわたって、クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ：配列番号１）またはビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ：配列番号２）に対して少なくとも約４０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼが使用される。

【0123】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、この一般的な生成方法において、少なくとも約１００残基の領域にわたって、クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ：配列番号１）またはビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ：配列番号２）に対して少なくとも約５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼが使用される。

【0124】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、この一般的な生成方法において、少なくとも約１００残基の領域にわたって、クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ：配列番号１）またはビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ：配列番号２）に対して少なくとも約６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼが使用される。

【0125】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、この一般的な生成方法において、少なくとも約１００残基の領域にわたって、クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ：配列番号１）またはビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ：配列番号２）に対して少なくとも約７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼが使用される。

【0126】

本発明の別の好ましい実施形態によれば、この一般的な生成方法において、少なくとも約１００残基の領域にわたって、クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ：配列番号１）またはビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ：配列番号２）に対して少なくとも約９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むトランスアミナーゼが使用される。

【0127】

本発明の特定の実施形態によれば、この一般的な生成方法において、好適なケトンまたはアルデヒドは、等モル量未満の量でアミンアクセプター化合物として使用される。

【0128】

本発明の好ましい実施形態によれば、この一般的な生成方法において、式Ｋの４－置換シクロヘキサノン：

【化20】

（式中、Ｇは、式（Ｃ）および式（Ｔ）におけるＧとして請求項１に記載した通りである）は、アミンアクセプターケトンとして使用される。

【0129】

その第１の態様に関して、本発明は、出発ジアステレオマー混合物が、遊離塩基形態または塩形態の式（Ｉ）および式（ＩＩ）の２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル：

【化21】

（式中、Ｒは、好適なアルキル基、アラルキル基またはアリール基、好ましくは、Ｃ_１－６アルキル基、より好ましくは、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから選択される置換基を表す）からなる方法に関する。

【0130】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、ピルビン酸ナトリウムは、等モル量未満の量でアミンアクセプターケトンとして使用される。

【0131】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、式（ＩＩＩ）の４－置換シクロヘキサノン：

【化22】

（式中、Ｒは、式（Ｉ）および（ＩＩ）について定義される通り、同じ好適なアルキル基、アラルキル基またはアリール基、好ましくは、同じＣ_１－６アルキル基、より好ましくは、メチル、エチル、プロピルおよびイソプロピルから選択される置換基を表す）は、アミンアクセプターケトンとして使用される。

【0132】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、式（ＩＩＩｂ）のエチル２－（４－オキソシクロヘキシル）アセテート：

【化23】

は、アミンアクセプターケトンとして使用される。

【0133】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、式（ＩＩＩｄ）のイソプロピル２－（４－オキソシクロヘキシル）アセテート：

【化24】

は、アミンアクセプターケトンとして使用される。

【0134】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、クロモバクテリウム・ビオラセウム変異体（Ｗ６０Ｃ）酵素／ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ、配列番号１によって特徴付けられる／は、バッチ方式で、トランスアミナーゼとして使用される。

【0135】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、クロモバクテリウム・ビオラセウム変異体（Ｗ６０Ｃ）トランスアミナーゼ／ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ、配列番号１によって特徴付けられる／は、全細胞形態、または固定化全細胞形態、または可溶性無細胞形態、または固定化無細胞形態で使用される。

【0136】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、ビブリオ・フルビアリス酵素／ＶｆＳ－ＴＡ、配列番号２によって特徴付けられる／は、バッチ方式で、トランスアミナーゼとして使用される。

【0137】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、ビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ／ＶｆＳ－ＴＡ、配列番号２によって特徴付けられる／は、全細胞形態、または固定化全細胞形態、または可溶性無細胞形態、または固定化無細胞形態で使用される。

【0138】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、シス選択的クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）／ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ／は、連続フロー方式で使用される。

【0139】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、多孔質ポリマー支持体上に共有結合的に固定化された状態のシス選択的クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）／ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ／が使用される。

【0140】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル塩酸塩のジアステレオマー混合物（式Ｉｂ・ＨＣｌ＋式ＩＩｂ・ＨＣｌ）から出発して、純粋な２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル（式Ｉｂ）が生成される。

【0141】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸イソプロピルエステル塩酸塩のジアステレオマー混合物（式Ｉｄ・ＨＣｌ＋式ＩＩｄ・ＨＣｌ）から出発して、純粋な２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸イソプロピルエステル（式Ｉｄ）が生成される。

【0142】

本発明の好ましい実施形態によれば、アミンの遊離塩基形態または塩酸塩形態から遊離したアミン形態のいずれかの２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル（Ｉ＋ＩＩ）、好ましくは、Ｃ_１－６アルキルエステルのシス／トランス－ジアステレオマー混合物から出発する、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル（Ｉ）、好ましくは、Ｃ_１－６アルキルエステルの生成方法は、等モル量未満の量で使用されるアミンアクセプターの存在下、バッチ方式で、シス選択的トランスアミナーゼ（好ましくは、クロモバクテリウム・ビオラセウム由来のＴＡのＷ６０Ｃ変異体／ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ／またはビブリオ・フルビアリス由来のＴＡ／ＶｆＳ－ＴＡ／）の全細胞形態、部分的もしくは完全に精製された可溶性形態、または固定化形態を用いて、あるいは連続フロー方式で、同じシス選択的トランスアミナーゼ（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡまたはＶｆＳ－ＴＡ）の固定化形態を用いて、行うことができる。

【0143】

本発明の最も好ましい実施形態によれば、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル生成物（式Ｉｂ）は、カリプラジンとして一般に公知のトランス－Ｎ－｛４－［２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル］シクロヘキシル｝－Ｎ’，Ｎ’－ジメチルウレアの製造において使用される。

【0144】

本発明の第１の態様の好ましい実施形態によれば、アミンの遊離塩基形態または塩酸塩形態から遊離したアミン形態のいずれかの２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステルのシス／トランス－ジアステレオマー混合物（Ｉ＋ＩＩ）から出発する、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル（Ｉ）の生成方法は、等モル量未満の量で使用されるアミンアクセプターの存在下、バッチ方式で、シス選択的トランスアミナーゼの全細胞形態、部分的もしくは完全に精製された可溶性形態、または固定化形態を用いて行うことができる。

【0145】

本発明の第１の態様の特定の実施形態によれば、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル（Ｉ）の生成方法は、アミンの遊離塩基形態の２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステルのシス／トランス－ジアステレオマー混合物（Ｉ＋ＩＩ）から出発して行うことができる。

【0146】

本発明の第１の態様の別の特定の実施形態によれば、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル（Ｉ）の生成方法は、塩形態、特に、塩酸塩形態から遊離したアミン形態の２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステルのシス／トランス－ジアステレオマー混合物（Ｉ＋ＩＩ）から出発して行うことができる。

【0147】

本発明の第１の態様の別の特定の実施形態によれば、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル（Ｉ）の生成方法は、クロモバクテリウム・ビオラセウム由来のＴＡのＷ６０Ｃ変異体／ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ／の全細胞形態、部分的もしくは完全に精製された可溶性形態、または固定化形態を使用することによって行うことができる。

【0148】

本発明の第１の態様の別の特定の実施形態によれば、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エステル（Ｉ）の生成方法は、ビブリオ・フルビアリス由来のＴＡ／ＶｆＳ－ＴＡ／の全細胞形態、部分的もしくは完全に精製された可溶性形態、または固定化形態を使用することによって行うことができる。

【0149】

本発明の第１の態様のより好ましい実施形態によれば、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸Ｃ_１－６アルキルエステルの生成方法は、アミンの遊離塩基形態または塩酸塩形態から遊離したアミン形態のいずれかの２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸Ｃ_１－６アルキルエステルのシス／トランス－ジアステレオマー混合物から出発して行うことができる。

【0150】

本発明の第１の態様の別のより好ましい実施形態によれば、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸Ｃ_１－６アルキルエステルの生成方法は、シス／トランス異性体の混合物が約２：９８～約９９：１の比で提供される、アミンの遊離塩基形態または塩酸塩形態から遊離したアミン形態のいずれかの２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸Ｃ_１－６アルキルエステルのシス／トランス－ジアステレオマー混合物から出発して行うことができる。

【0151】

本発明の第１の態様の別のより好ましい実施形態によれば、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸Ｃ_１－６アルキルエステルの生成方法は、等モル量未満の量で使用されるアミンアクセプターとしての好適なケトンまたはアルデヒドの存在下で行うことができる。

【0152】

本発明の第１の態様の別のより好ましい実施形態によれば、２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸Ｃ_１－６アルキルエステルの生成方法は、アミンアクセプターとしてのピルビン酸ナトリウムの存在下で行うことができる。

【0153】

本発明の第１の態様の最も好ましい実施形態によれば、カリプラジンとして一般に公知のトランス－Ｎ－｛４－［２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル］シクロヘキシル｝－Ｎ’，Ｎ’－ジメチルウレアの生成方法は、シス選択的トランスアミナーゼの全細胞形態、部分的にもしくは完全に精製された可溶性形態、または固定化形態を用いて、等モル量未満の量で使用されるアミンアクセプターとしての２－（４－オキソシクロヘキシル）酢酸エステル（式ＩＩＩ）、最も好ましくは、エチル２－（４－オキソシクロヘキシル）アセテート（式ＩＩＩｂ）の存在下、シス／トランスエステル異性体の混合物が約２：９８～約９９：１の比で提供される、アミンの遊離塩基形態または塩酸塩形態から遊離したアミン形態のいずれかの２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル（式Ｉｂ）のシス／トランス－ジアステレオマー混合物から出発して行うことができる。

【0154】

本発明の第１の態様の別の最も好ましい実施形態によれば、カリプラジンとして一般に公知のトランス－Ｎ－｛４－［２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル］シクロヘキシル｝－Ｎ’，Ｎ’－ジメチルウレアの生成方法は、段階的な方式で、バッチ反応器において、２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル（式Ｉｂ）のシス／トランス－ジアステレオマー混合物から出発して実施することができ、ここで、
ａ．２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステルのトランス／シス－ジアステレオマー混合物（式（Ｉｂ）＋式（ＩＩｂ））の混合物は、約２：９８～約９９：１の比で、バッチ方式で操作される反応器に入れられ、
ｂ．全細胞形態、または固定化全細胞形態、または可溶性無細胞形態、または固定化無細胞形態の、クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）／ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ：配列番号１／またはビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ／ＶｆＳ－ＴＡ：配列番号２／に対して４０％よりも高いタンパク質配列同一性を有するトランスアミナーゼは、１：１００００～１：１のタンパク質：［基質（式（Ｉｂ）＋式（ＩＩｂ））］の重量比で反応器に添加され、
ｃ．アミンアクセプター化合物として使用される好適なケトンの溶液は、等モル量未満の量で混合物に添加され、
ｄ．酸性抽出精製工程は、生成物（式（ＩＩＩｂ））によるケトンの形成を除去するために適用され、
ｅ．所望の２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステルは、遊離アミン（式（Ｉｂ））としてまたはその塩（式（Ｉｂ・ＨＡ））として、出発混合物中のトランス－異性体（式（Ｉｂ））の割合を超える収量で、抽出／分離／単離される。

【0155】

その第２の態様に関して、本発明は、出発ジアステレオマー混合物が、遊離塩基形態または塩形態の式（ＩＶ）および式（Ｖ）の２－（４－アミノシクロヘキシル）エタン－１－オール誘導体

【化25】

（式中、Ｒ’は、水素原子、または好適なヒドロキシル保護基、好ましくは、ベンジル基を表す）からなる方法に関する。

【0156】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、ピルビン酸ナトリウムは、等モル量未満の量でアミンアクセプターケトンとして使用される。

【0157】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、式（ＶＩ）の４－置換シクロヘキサノン：

【化26】

（式中、Ｒ’は、式（ＩＶ）および（Ｖ）について定義される通り、同じ水素原子、または好適なヒドロキシル保護基、好ましくは、ベンジル基を表す）は、アミンアクセプターケトンとして使用される。

【0158】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、式（ＶＩａ）の２－（４－オキソシクロヘキシル）エタン－１－オール：

【化27】

は、アミンアクセプターケトンとして使用される。

【0159】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、クロモバクテリウム・ビオラセウム変異体（Ｗ６０Ｃ）酵素／ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ、配列番号１によって特徴付けられる／は、バッチ方式で、トランスアミナーゼとして使用される。

【0160】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、クロモバクテリウム・ビオラセウム変異体（Ｗ６０Ｃ）トランスアミナーゼ／ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ、配列番号１によって特徴付けられる／は、全細胞形態、または固定化全細胞形態、または可溶性無細胞形態、または固定化無細胞形態で使用される。

【0161】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、ビブリオ・フルビアリス酵素／ＶｆＳ－ＴＡ、配列番号２によって特徴付けられる／は、バッチ方式で、トランスアミナーゼとして使用される。

【0162】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、ビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ／ＶｆＳ－ＴＡ、配列番号２によって特徴付けられる／は、全細胞形態、または固定化全細胞形態、または可溶性無細胞形態、または固定化無細胞形態で使用される。

【0163】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、シス選択的クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）／ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ／は、連続フロー方式で使用される。

【0164】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、多孔質ポリマー支持体上に共有結合的に固定化された状態のシス選択的クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）／ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ／が使用される。

【0165】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、２－（４－アミノシクロヘキシル）エタン－１－オール塩酸塩のジアステレオマー混合物（式ＩＶａ・ＨＣｌ＋式Ｖａ・ＨＣｌ）から出発して、純粋な２－（トランス－４－アミノシクロヘキシル）エタン－１－オール（式ＩＶａ）が生成される。

【0166】

その第３の態様に関して、本発明は、出発ジアステレオマー混合物が、式（ＶＩＩ）および式（ＶＩＩＩ）の２－（４－アミノシクロヘキシル）アセトアルデヒド誘導体：

【化28】

（式中、ｎは、１～２の整数である）からなる方法に関する。

【0167】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、ピルビン酸ナトリウムは、等モル量未満の量でアミンアクセプターケトンとして使用される。

【0168】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、式（ＩＸ）の４－置換シクロヘキサノン：

【化29】

（式中、ｎは、式（ＶＩＩ）および（ＶＩＩＩ）について定義される通り、同じ整数を表す）は、アミンアクセプターケトンとして使用される。

【0169】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、クロモバクテリウム・ビオラセウム変異体（Ｗ６０Ｃ）酵素／ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ、配列番号１によって特徴付けられる／は、バッチ方式で、トランスアミナーゼとして使用される。

【0170】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、クロモバクテリウム・ビオラセウム変異体（Ｗ６０Ｃ）トランスアミナーゼ／ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ、配列番号１によって特徴付けられる／は、全細胞形態、または固定化全細胞形態、または可溶性無細胞形態、または固定化無細胞形態で使用される。

【0171】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、ビブリオ・フルビアリス酵素／ＶｆＳ－ＴＡ、配列番号２によって特徴付けられる／は、バッチ方式で、トランスアミナーゼとして使用される。

【0172】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、ビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ／ＶｆＳ－ＴＡ、配列番号２によって特徴付けられる／は、全細胞形態、または固定化全細胞形態、または可溶性無細胞形態、または固定化無細胞形態で使用される。

【0173】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、シス選択的クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）／ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ／は、連続フロー方式で使用される。

【0174】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、多孔質ポリマー支持体上に共結合性固定化を有するシス選択的クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼ変異体（Ｗ６０Ｃ）／ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ／が使用される。

【0175】

本発明のこの好ましい実施形態によれば、４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミンのジアステレオマー混合物（式ＶＩＩａ＋式ＶＩＩＩａ）から出発して、純粋なトランス－４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミン（式ＶＩＩａ）が生成される。

【0176】

本発明を以下の非限定的な実施例によって説明する。

【実施例】

【0177】

材料
他に別段の記載がない限り、すべての溶媒および化学物質は、以下の商業的供給業者：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ Ｅｕｒｏｐｅ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）、Ｍｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）、Ｆｌｕｋａ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ、米国）から購入し、さらなる精製なしで使用した。ＭＡＴ５４０（ＭＡＴＳＰＨＥＲＥ（商標）ＳＥＲＩＥＳ ５４０ － １０μｍの平均粒子径を有するアミノアルキルおよびビニル官能基でエッチングされた中空シリカミクロスフェア）は、Ｍａｔｅｒｉｕｍ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ（Ｇｒａｎｂｙ、ＱＣ、カナダ）から入手した。エチレンアミン官能化メタクリレートポリマー樹脂（ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＡ４０３／Ｓ；ポリメチルメタクリレート支持体、粒子径１５０～３００μｍ、細孔サイズ４００～６００Å）およびエポキシド官能化メタクリレートポリマー樹脂（ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＰ４０３／Ｓ；ポリメチルメタクリレート支持体、粒子径１５０～３００μｍ、細孔サイズ４００～６００Å）は、Ｒｅｓｉｎｄｉｏｎ Ｓ．ｒ．Ｌ．（Ｂｉｎａｓｃｏ、イタリア）から購入した。

【0178】

シス／トランスジアステレオマー混合物としての２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸塩酸塩［Ｔ・ＨＣｌ＋Ｃ・ＨＣｌ（Ｇ＝ＣＯＯＨ）］、および２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル塩酸塩のシス－ジアステレオマー（約９０．２％のｄｅを有するＩＩｂ・ＨＣｌ）の試料は、ＷＯ２０１０／０７０３６８による工業スケールの生成プロセスから入手した。ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキシル］カルバメートは、Ｗｕ Ｙ．－Ｊ．ら（ＷＯ２０１８０８１３８４Ａ１（２０１８））によって開示されるようにして調製することができる。

【0179】

分析方法
薄層クロマトグラフィー
ＴＬＣは、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ）シートを使用して行った。スポットは、ＵＶ光（Ｖｉｌｂｅｒ Ｌｏｕｒｍａｔ ＶＬ－６．ＬＣ、２５４ｎｍ）下、または５％のエタノール性リンモリブデン酸溶液もしくは３％のイソプロパノールニンヒドリン溶液による処理および所望のプレートの加熱後、視覚化された。

【0180】

赤外分光法
赤外スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＬＰＨＡ ＦＴ－ＩＲ分光計において記録し、バンドの波長は、ｃｍ^－１で列挙する。

【0181】

ガスクロマトグラフィー
ケトン（一般式Ｋ、ＩＩＩ、ＶＩ、およびＩＸ）のＴＡ触媒還元的アミノ化または４－置換シクロヘキサン－１－アミンのジアステレオマー混合物（一般式Ｃ＋Ｔ、Ｉ＋ＩＩ、ＩＶ＋Ｖ、およびＶＩＩ＋ＶＩＩＩ）の動的異性化の反応混合物は、酢酸エチル溶液中の過剰の無水酢酸の処理によるアミンの対応するアセトアミドへの誘導体化後に、非極性ＨＰ－５カラム［Ａｇｉｌｅｎｔ Ｊ＆Ｗ；３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍの（５％－フェニル）メチルポリシロキサンのフィルム厚さ］を使用する、フレームイオン化検出器（ＦＩＤ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ５８９０ ＧＣ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、米国）、またはキラルＨｙｄｒｏｄｅｘ β－６ ＴＢＤＭカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ；２５ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍのヘプタキス－（２，３－ジ－Ｏ－メチル－６－Ｏ－ｔ－ブチル－ジメチルシリル）－β－シクロデキストリンのフィルム厚さ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ ４８９０ ＧＣにおいて、Ｈ_２キャリアガス（注入器：２５０℃、検出器：２５０℃、ヘッド圧：１２ｐｓｉ、スプリット比：５０：１）を使用して分析した。

【0182】

温度プログラム：ＴＰ１：５℃／分で１８０から２１０℃、２１０℃で４分間；ＴＰ２：１℃／分で１１０から１３０℃、２０℃／分で１３０から１８０℃、１８０℃で３分間。

【0183】

保持時間：
１．４５分（化合物ＩＩＩａ）、２．９１分（化合物ＩＩａのアセトアミド）、３．１１分（化合物Ｉａのアセトアミド）［ＴＰ１を用いるＨＰ－５カラムにおいて、モル応答係数：（Ｉａ＋ＩＩａのアセトアミド／ＩＩＩａのシグナル）＝１．０６］；

【0184】

１．９５分（化合物ＩＩＩｂ）、３．９３分（化合物ＩＩｂのアセトアミド）、４．１１分（化合物Ｉｂのアセトアミド）［ＴＰ１を用いるＨＰ－５カラムにおいて、モル応答係数：（Ｉｂ＋ＩＩｂのアセトアミド／ＩＩＩｂのシグナル）＝１．０３］；

【0185】

１．５８分（化合物ＩＩＩｄ）、４．２０分（化合物ＩＩｄのアセトアミド）、４．４０分（化合物Ｉｄのアセトアミド）［ＴＰ１を用いるＨＰ－５カラムにおいて、モル応答係数：（Ｉｄ＋ＩＩｄのアセトアミド／ＩＩＩｄのシグナル）＝０．９６］；

【0186】

１．６９分（化合物ＶＩａ）、３．８２分（化合物ＩＶａのアセトアミド）、３．９６分（化合物Ｖａのアセトアミド）［ＴＰ１を用いるＨＰ－５カラムにおいて、モル応答係数：（ＩＶａ＋Ｖａのアセトアミド／ＶＩａのシグナル＝１．０５］；

【0187】

１．７１分［化合物ＶＩ（Ｒ＝Ａｃ）］、３．８１分［化合物ＩＶ（Ｒ＝Ａｃ）のアセトアミド］、３．９４分［化合物Ｖ（Ｒ＝Ａｃ）のアセトアミド］［ＴＰ１を用いるＨＰ－５カラムにおいて、モル応答係数（ＩＶ＋Ｖ（Ｒ＝Ａｃ）のアセトアミド／ＶＩ（Ｒ＝Ａｃ）のシグナル＝１．０３］；

【0188】

１．９１分（化合物ＩＸａ）、４．４５分（化合物ＶＩＩａのアセトアミド）、４．６０分（化合物ＶＩＩＩａのアセトアミド）［ＴＰ１を用いるＨＰ－５カラムにおいて、モル応答係数（ＶＩＩａ＋ＶＩＩＩａのアセトアミド／ＩＸａのシグナル）＝１．０５］；

【0189】

２．２８分［化合物ＩＸ（ｎ＝２）］、５．４９分［化合物ＶＩＩ（ｎ＝２）のアセトアミド］、５．６５分［化合物ＶＩＩＩ（ｎ＝２）のアセトアミド］［ＴＰ１を用いるＨＰ－５カラムにおいて、モル応答係数（ＶＩＩ＋ＶＩＩＩ（ｎ＝２）のアセトアミド／ＩＸ（ｎ＝２）のシグナル＝１．０３］；

【0190】

３．４５分（化合物Ｋ（Ｇ＝Ｈ））、１９．７２分（化合物Ｔ（Ｇ＝Ｈ）のアセトアミド）、２０．２９分（化合物Ｃ（Ｇ＝Ｈ）のアセトアミド）［ＴＰ２を用いるＨｙｄｒｏｄｅｘカラムにおいて、モル応答係数（（Ｃ＋Ｔ（Ｇ＝Ｈ））のアセトアミド／（Ｋ（Ｇ＝Ｈ））＝１．９０］；

【0191】

５．９９分（化合物Ｋ（Ｇ＝Ｍｅ））、２２．６４分（化合物Ｃ（Ｇ＝Ｍｅ）のアセトアミド）、２２．８５分（化合物Ｔ（Ｇ＝Ｍｅ）のアセトアミド）［ＴＰ２を用いるＨｙｄｒｏｄｅｘカラムにおいて、モル応答係数（（Ｃ＋Ｔ（Ｇ＝Ｍｅ））のアセトアミド／（Ｋ（Ｇ＝Ｍｅ））＝１．１６］；

【0192】

２．３２分（化合物Ｋ（Ｇ＝Ｐｈ））、５．１７分（化合物Ｃ（Ｇ＝Ｐｈ）のアセトアミド）、５．５１分（化合物Ｔ（Ｇ＝Ｐｈ）のアセトアミド）［ＴＰ１を用いるＨＰ－５カラムにおいて、モル応答係数（（Ｃ＋Ｔ（Ｇ＝Ｐｈ））のアセトアミド／（Ｋ（Ｇ＝Ｐｈ））＝１．０６］；

【0193】

２．７４分（化合物Ｋ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ））、６．２４分（化合物Ｃ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ）のアセトアミド）、６．５６分（化合物Ｔ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ）のアセトアミド）［ＴＰ１を用いるＨＰ－５カラムにおいて、モル応答係数（（Ｃ＋Ｔ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ））のアセトアミド／（Ｋ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ））＝０．８９］；

【0194】

質量分析
ＨＲＭＳおよびＭＳ－ＭＳ分析を、Ｔｈｅｒｍｏ Ｖｅｌｏｓ Ｐｒｏ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）システムにおいて行った。イオン化方法は、陽イオンモードで作動するＥＳＩであった。プロトン化分子イオンピークは、３５％の正規化された衝突エネルギーで、ＣＩＤによってフラグメント化した。ＣＩＤ実験のために、ヘリウムを、衝突ガスとして使用した。試料は、メタノールに溶解した。データ取得および分析は、Ｘｃａｌｉｂｕソフトウェアバージョン２．０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて成し遂げた。

【0195】

核磁気共鳴分光法
すべてのＮＭＲ試料は、ＤＭＳＯ－ｄ_６溶媒に溶解し、スペクトルは、標準的な５ｍｍの管において、２５℃で、以下のＢｒｕｋｅｒ ＢｉｏＳｐｉｎ ＧｍｂＨ、Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ、ドイツ製のＡｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＨＤＸ分光計（プロトン周波数を得られる）：４００ＭＨｚ（１Ｈ－１９Ｆ／１５Ｎ－３１Ｐ Ｐｒｏｄｉｇｙ ＣｒｙｏＰｒｏｂｅおよびＳａｍｐｌｅＣａｓｅサンプルチェンジャーを有する）、５００ＭＨｚ（５００ Ｓ２ １Ｈ／１３Ｃ／１５Ｎ ＴＣＩ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ＣｒｙｏＰｒｏｂｅ）または８００ＭＨｚ（８００ ＳＡ １Ｈ＆１９Ｆ／１３Ｃ／１５Ｎ ＴＣＩ ＣｒｙｏＰｒｏｂｅ）のいずれかにおいて取得した。

【0196】

（４－アルコキシカルボニルメチル）シクロヘキサノン（ＩＩＩ）の合成のための一般手順
乾燥テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の事前にヘキサンで洗浄した水素化ナトリウム（１．７当量）の溶液を、（－５）～０℃に冷却した。温度を０～５℃に保って、乾燥テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の対応するホスホネート（１．２当量のエチル２－（ジエトキシホスホリル）アセテートまたはイソプロピル２－（ジイソプロポキシホスホリル）アセテート）の溶液を添加し、得られた混合物を０℃で０．５時間および室温で１時間撹拌した。再び（－５）～０℃に冷却した後、乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の１，４－シクロヘキサンジオンモノエチレンケタール（１当量：約８０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下添加し、得られた混合物を、０℃で１時間、次いで室温で終夜撹拌した。ＴＨＦを反応混合物から蒸発させ、残渣をブライン（６０ｍＬ）で希釈し、水相を酢酸エチル（３×８０ｍＬ）で抽出した。まとめた有機相を、飽和ブライン（８０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、真空中で濃縮して、粗アルキル２－（１，４－ジオキサスピロ［４，５］デカン－８－イリデン）アセテートを得た。

【0197】

さらなる精製なしで、不飽和粗アルキル２－（１，４－ジオキサスピロ［４，５］デカン－８－イリデン）アセテートを水素化した。対応するアルコール（５０～２００ｍＬ）に溶解した後、溶液を、水素化が完了するまで（ＴＬＣ、溶離液：ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝２：１によって追跡）、１ｂａｒの水素下、１０％のＰｄ／Ｃ（１０ｗ／ｗ％）で処理した。反応の完了後、混合物を、セライト（登録商標）を通して濾過し、溶媒を真空ロータリーエバポレーションによって除去して、飽和アルキル２－（１，４－ジオキサスピロ［４，５］デカン－８－イル）アセテートを得た。

【0198】

ケトン保護基を除去するために、アルキル２－（１，４－ジオキサスピロ［４，５］デカン－８－イル）アセテート（１当量）を、対応するアルコール（１００～１５０ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。１ＮのＨＣｌ（３当量）溶液を滴下添加し、０℃で１時間、次いでＲＴで終夜撹拌した。反応が完了した後、それを０℃に冷却し、ｐＨを、１ＮのＮａＯＨによって、ｐＨ７に調整した。混合物を酢酸エチル（３×８０ｍＬ）で抽出し、まとめた有機相を、飽和ブライン（８０ｍＬ）で抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、真空中で濃縮した。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ヘキサン－ＥｔＯＡｃ＝４：１）によって精製して、（４－アルコキシカルボニルメチル）シクロヘキサノン（式ＩＩＩで特徴付けられる）を得た。

【0199】

エチル２－（４－オキソシクロヘキシル）アセテート（ＩＩＩｂ）

【化30】

一般記載に従って、乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）中のエチル２－（ジエトキシホスホリル）アセテート（１８．３ｍｌ、２０．７ｇ、９２．２ｍｍｏｌ）の溶液および乾燥ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のヘキサンで洗浄したＮａＨ（３．６９ｇ、１５４ｍｍｏｌ）と、乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の１，４－シクロヘキサンジオンモノエチレンケタール（１２．０ｇ、７６．８ｍｍｏｌ）の反応により、無色液体としてエチル２－（１，４－ジオキサスピロ［４，５］デカン－８－イリデン）アセテート（１６．８ｇ、粗収率９７％）を得た。

【0200】

非加圧水素雰囲気下でのエタノール（７０ｍＬ）中のエチル２－（１，４－ジオキサスピロ［４，５］デカン－８－イリデン）アセテート（１６．７ｇ、７１．０ｍｍｏｌ）および１０％のＰｄ／Ｃ（１．６７ｇ）の反応により、無色液体としてエチル２－（１，４－ジオキサスピロ［４，５］デカン－８－イル）アセテート（１６．５ｇ、粗収率９８％）を得た。

【0201】

エタノール（１５０ｍＬ）中のエチル２－（１，４－ジオキサスピロ［４，５］デカン－８－イル）アセテート（１５．０ｇ、６５．７ｍｍｏｌ）と１ＮのＨＣｌ（１５０ｍＬ）の反応により、無色油状物としてエチル－２－（４－オキソシクロヘキシル）アセテート（式ＩＩＩｂ、５．３２ｇ、精製収率４２％）を得た。

【0202】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：４．０７（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、ＯＣＨ_２－ＣＨ_３）、２．３９（２Ｈ、ｔｄ、Ｊ＝１３．７Ｈｚ、Ｊ＝５．９Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）、２．３１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、ＣＨ_２－ＣＯＯＥｔ）、２．２１－２．１５（２Ｈ＋１Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ＋ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）、１．９８－１．９２（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．４０（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２．１Ｈｚ、Ｊ＝４．３Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）、１．１９（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、ＣＨ_３－ＣＨ_２）；

【0203】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：２１０．４（ＣＯ）、１７１．９（ＣＨ_２－ＣＯＯＥｔ）、５９．７（ＯＣＨ_２－ＣＨ_３）、３９．８（ＣＨ_２）、３９．３（ＣＨ_２）、３２．３（ＣＨ－ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）、３１．５（ＣＨ_２）、１４．０（ＣＨ_３）；

【0204】

ＥＳＩ－ＨＲＭＳ：Ｍ＋Ｈ＝１８５．１１７２７（デルタ＝０．３ｐｐｍ；Ｃ_１０Ｈ_１７Ｏ_３）。ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ（ＣＩＤ＝３５％；相対強度％）：１６７（６０）および１３９（１００）。

【0205】

ＩＲ（ニート） υ_ｍａｘ：２９３３、１７１０、１４４９、１３６８、１３４５、１２７８、１２０１、１１５０、１０９４、１０２９、９６８、７５４、５０３ｃｍ^－１。

【0206】

ＧＣ（ＨＰ ５カラム）：ｔ_Ｒ＝１．９５分。

【0207】

イソプロピル－２－（４－オキソシクロヘキシル）アセテート（ＩＩＩｄ）

【化31】

一般記載に従って、イソプロピル２－（ジイソプロポキシホスホリル）アセテート（２５．００ｇ、９３．３ｍｍｏｌ）と乾燥ＴＨＦ（１００ｍＬ）中のヘキサンで洗浄したＮａＨ（３．７５ｇ、１５６．４ｍｍｏｌ）と乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の１，４－シクロヘキサンジオンモノエチレンケタール（１２．２ｇ、７８．２ｍｍｏｌ）の反応により、無色液体としてイソプロピル２－（１，４－ジオキサスピロ［４，５］デカン－８－イリデン）アセテート（１７．１ｇ、粗収率９１％）を得た。

【0208】

非加圧水素雰囲気下でのイソプロパノール（２２０ｍＬ）中のイソプロピル２－（１，４－ジオキサスピロ［４，５］デカン－８－イリデン）アセテート（１５．００ｇ、６２．４６ｍｍｏｌ）および１０％のＰｄ／Ｃ（１．５ｇ）の反応により、無色油状物としてイソプロピル－２－（１，４－ジオキサスピロ［４，５］デカン－８－イル）アセテート（１４．６ｇ、粗収率９７％）を得た。

【0209】

イソプロパノール（１７０ｍＬ）中のイソプロピル２－（１，４－ジオキサスピロ［４，５］デカン－８－イル）アセテート（１４．００ｇ、５７．８５ｍｍｏｌ）および１ＮのＨＣｌ（１７０ｍＬ）の反応により、無色油状物としてエチル－２－（４－オキソシクロヘキシル）アセテート（式ＩＩＩｄ、８．４７ｇ、精製収率７４％）を得た。

【0210】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：４．９１（１Ｈ、ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、ＣＨ－（ＣＨ_３）_２）、２．３９（２Ｈ、ｔｄ、Ｊ＝１３．８Ｈｚ、Ｊ＝６．０Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）、２．２８－２．２７（２Ｈ、ｍ、ＣＨ_２）、２．１９－２．１４（１Ｈ＋２Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２ＣＯＯ^ｉＰｒ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．９６－１．９２（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．４０（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、Ｊ＝４．１Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）、１．１９（６Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、２×ＣＨ_３）；

【0211】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：２１０．４（ＣＯ）、１７１．４（ＣＯＯ^ｉＰｒ）、６６．９（ＣＨ－（ＣＨ_３）_２）、３９．６（ＣＨ_２－ＣＯＯ^ｉＰｒ）、３２．３（ＣＨ－ＣＨ_２ＣＯＯ^ｉＰｒ）＋ＣＨ_２）、３１．４（ＣＨ_２）、２１．５（ＣＨ_３）；

【0212】

ＨＲＭＳ：Ｍ＋Ｈ＝１９９．１３２７６（デルタ＝－０．６ｐｐｍ；Ｃ_１１Ｈ_１９Ｏ_３）。ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ（ＣＩＤ＝３５％；相対強度％）：１８１（５）；１７１（１１）；１６７（１００）；１５７（６２）；１５３（９１）および１３９（６４）；

【0213】

ＩＲ（ニート） υ_ｍａｘ：２９７９、１７１１、１４４９、１３７４、１２７８、１２０３、１１６１、１１０７、９６７ｃｍ^－１。

【0214】

ＧＣ（ＨＰ ５カラム）：ｔ_Ｒ＝１．５８分。
２４

【0215】

４－置換シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物のシス／トランス－ジアステレオマー混合物（化合物Ｉ・ＨＣｌ＋ＩＩ・ＨＣｌまたは化合物Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ）
４－（２－メトキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（化合物Ｉａ・ＨＣｌ＋ＩＩａ・ＨＣｌ）

【化32】

メタノール（６０ｍＬ）中の２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸［シス／トランスジアステレオマー混合物、Ｔ・ＨＣｌ＋Ｃ・ＨＣｌ（Ｇ＝ＣＯＯＨ）］（１ｇ、６．３７ｍｍｏｌ）の溶液に、５Ｍの塩酸溶液（９．５６ｍｍｏｌ、１．９１１ｍＬ、１．５当量）を添加した。反応混合物を、室温で３０分間撹拌し（この時間の間に、最初乳白色の溶液は透明になった）、ＴＬＣ分析（溶離液：ｎ－ブタノール：酢酸：水＝３：１：１；イソプロパノール中の３％のニンヒドリンによって視覚化；Ｒｆ_ａｃｉｄ＝０．６２、Ｒｆ_{Ｍｅ ｅｓｔｅｒ}＝０．６８）は変換の完了を明らかにした。次に、溶媒を、ロータリー真空エバポレーターを使用して除去し、残渣を真空乾燥チャンバー中で乾燥して、白色固体として所望のメチルエステル塩酸塩のジアステレオマー混合物（化合物Ｉａ・ＨＣｌ＋ＩＩａ・ＨＣｌ、１．２８ｇ、収率９７％）を得た。

【0216】

ＩＲ（ＡＴＲ） υ_ｍａｘ：２９３４、２８９５、２８６３、１７３２、１６１０、１５０７、１４５８、１４３７、１３６５、１２９５、１２２６、１１６８、１１３２、１０１８ｃｍ^－１。

【0217】

（１ｓ，４ｓ）－４－（２－メトキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（シス－化合物ＩＩａ・ＨＣｌ）
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．１２（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、３．５８（３Ｈ、ｓ、ＯＣＨ_３）、３．２９（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ｅｋｖ－ＮＨ_３ ^＋）、２．３３（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、ＣＨ_２ＣＯＯＭｅ）、１．９５（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ｅｑ－ＣＨ_２ＣＯＯＭｅ）、１．８１－１．７４（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ）、１．７０－１．５８（４Ｈ、ｍ、４×ＣＨ）、１．４６－１．３５（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ）。

【0218】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：１７６．３９（ＣＯＯ）、５２．１４（ＯＣＨ_３）、４８．５３（ＮＣＨ）、３８．１５（ＣＨ_２）、３０．６５（ＣＨ）、２６．２３（２×ＣＨ_２）、２６．０６（２×ＣＨ_２）。

【0219】

（１ｒ，４ｒ）－４－（２－メトキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（トランス－化合物Ｉａ・ＨＣｌ）
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．１２（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、３．５９（３Ｈ、ｓ、ＯＣＨ_３）、３．０４（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＮＨ_３ ^＋）、２．２１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、ＣＨ_２ＣＯＯＭｅ）、１．９８－１．８６（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．７５（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２ＣＯＯＭｅ）、１．７２（２Ｈ、ｂｒ ｄ、Ｊ＝１４．０Ｈｚ、ＣＨ_ｅｑＣＨＮＨ_３ ^＋）、１．４６－１．３５（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ）、１．０２（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２Ｈｚ、Ｊ＝４Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）

【0220】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：１７６．４３（ＣＯＯ）、５２．０９（ＯＣＨ_３）、４８．８７（ＮＣＨ）、４０．４８（ＣＨ_２）、３３．０１（ＣＨ）、２９．８９（２×ＣＨ_２）、２９．８５（２×ＣＨ_２）

【0221】

４－（２－エトキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（化合物Ｉｂ・ＨＣｌ＋ＩＩｂ・ＨＣｌ）

【化33】

エタノール（４０ｍＬ）中のエチル２－（４－オキソシクロヘキシル）アセテート（ＩＩＩｂ、１．５０ｇ、８．１４ｍｍｏｌ）および１０％のＰｄ／Ｃ（０．１５ｇ）とギ酸アンモニウム（３．０８ｇ、４８．８ｍｍｏｌ）の反応により、無色油状物として４－（２－エトキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミンのジアステレオマー混合物（化合物Ｉｂ＋ＩＩｂ、１．２４ｇ、収率８３％、シス／トランス＝２．３０：１．００（^１Ｈ－ＮＭＲ））を得た。最後に、ＨＣｌガスを導入した後、４－（２－エトキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（化合物Ｉｂ・ＨＣｌ＋ＩＩｂ・ＨＣｌ、１．３０ｇ、収率７２％）が、白色固体として形成された。

【0222】

（１ｓ，４ｓ）－４－（２－エトキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（シス－化合物ＩＩｂ・ＨＣｌ）
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．１４（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、４．０９－４．０２（２Ｈ、ｍ、ＯＣＨ_２）、３．１８－３．０９（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＮＨ_３ ^＋）、２．２７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）、１．９８－１．８６（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ｅｑ－ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）、１．６９－１．６２（４Ｈ、ｍ、４×ＣＨ）、１．５３－１．４３（４Ｈ、ｍ、４×ＣＨ）、１．１８（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、ＣＨ_３）、

【0223】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：１７１．９６（ＣＯ）、５９．６２（ＯＣＨ_２）、４７．２（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、３７．９２（ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）、３０．５８（ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）、２５．９６（ＣＨ_２）、２５．８９（ＣＨ_２）、１４．０４（ＣＨ_３）；

【0224】

（１ｒ，４ｒ）－４－（２－エトキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（トランス－化合物Ｉｂ・ＨＣｌ）
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．１４（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、４．０９－４．０２（２Ｈ、ｍ、ＯＣＨ_２）、２．９４－２．８２（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＮＨ_３ ^＋）、２．１８（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．６Ｈｚ、ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）、１．９８－１．８６（２×Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．７２（２Ｈ、ｂｒ ｄ、Ｊ＝１４．０Ｈｚ、ＣＨ_ｅｑＣＨＮＨ_３ ^＋），１．６４－１．５５（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）、１．３４（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２．４Ｈｚ、Ｊ＝３．１Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）、１．１８（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、ＣＨ_３）、１．０３（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２．７Ｈｚ、Ｊ＝３．５Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）

【0225】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：１７１．８（ＣＯ）、５９．６（ＯＣＨ_２）、４８．９（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、４０．３（ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）、３３．１（ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）、２９．８（ＣＨ_２）、２９．７５（ＣＨ_２）、１４．０（ＣＨ_３）；

【0226】

ＨＲＭＳ：Ｍ＋Ｈ＝１８６．１４８５３（デルタ＝－１．８ｐｐｍ；Ｃ_１０Ｈ_２０Ｏ_２Ｎ）。ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ（ＣＩＤ＝３５％；相対強度％）：１６９（１００）；１４１（２）；１４０（２）；１２３（９）；９５（１５）および８１（６）；

【0227】

ＩＲ（ニート） υ_ｍａｘ：２９３３、２５５２、２０３７、１７３１、１６０４、１５０９、１４５１、１３７０、１２９１、１１７７、１０３３ｃｍ^－１。

【0228】

４－（２－イソプロポキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（化合物Ｉｄ・ＨＣｌ＋ＩＩｄ・ＨＣｌ）

【化34】

イソプロパノール（４０ｍＬ）中のイソプロピル２－（４－オキソシクロヘキシル）アセテート（ＩＩＩｄ、２．００ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）および１０％のＰｄ／Ｃ（０．２０ｇ）とギ酸アンモニウム（３．８２ｇ、６０．５ｍｍｏｌ）の反応により、無色油状物として４－（２－イソプロポキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミンのジアステレオマー混合物（化合物Ｉｄ＋ＩＩｄ、１．７１ｇ、収率８５％、シス／トランス＝１．０７：１．００（^１Ｈ－ＮＭＲ））を得た。最後に、ＨＣｌガスを導入した後、４－（２－イソプロポキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（化合物Ｉｄ・ＨＣｌ＋ＩＩｄ・ＨＣｌ、１．７５ｇ、収率７３％）が、白色固体として形成された。

【0229】

（１ｓ，４ｓ）－４－（２－イソプロポキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（シス－化合物Ｉｄ・ＨＣｌ）
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．１０（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、４．８９（１Ｈ、ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝６．２５Ｈｚ、ＣＨ－（ＣＨ_３）_２）、３．１３（１Ｈ、ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝５．６Ｈｚ、ＣＨ_ｅｑ－ＮＨ_３ ^＋）、２．２１（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．５５Ｈｚ、ＣＨ_２－ＣＯＯ^ｉＰｒ）、１．９５－１．８９（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２ＣＯＯ^ｉＰｒ）、１．６７－１．６４（４Ｈ、ｍ、４×ＣＨ）、１．５３－１．４３（４Ｈ、ｍ、４×ＣＨ）、１．１８（６Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．７１Ｈｚ、２×ＣＨ_３）、

【0230】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：１７１。５（ＣＯ）；６６．９（ＣＨ－（ＣＨ_３）_２）；４７．３（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、３８．２（ＣＨ_２－ＣＯＯ^ｉＰｒ）、３０．６（ＣＨ－ＣＨ_２ＣＯＯ^ｉＰｒ）、２６．０（ＣＨ_２），２５．９（ＣＨ_２）、２１．５（ＣＨ_３）。

【0231】

（１ｒ，４ｒ）－４－（２－イソプロポキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（トランス－化合物Ｉｄ・ＨＣｌ）
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．１０（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、４．８８（１Ｈ、ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝６．２５Ｈｚ、ＣＨ－（ＣＨ_３）_２）、２．８８（１Ｈ、ｔｔ、Ｊ＝１１．８Ｈｚ、Ｊ＝３．９Ｈｚ、ＣＨ_ａｘ－ＮＨ_３ ^＋）、２．１４（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９６Ｈｚ、ＣＨ_２－ＣＯＯ^ｉＰｒ）、１．９５－１．８９（２Ｈ、ｍ ２×ＣＨ_ｅｑ）、１．７３－１．７０（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ）、１．６２－１．５５（１Ｈ、ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２ＣＯＯ^ｉＰｒ）、１．３３（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２．７Ｈｚ、Ｊ＝３．２Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）、１．１７（６Ｈ、ｄ、Ｊ＝１．７５Ｈｚ、２×ＣＨ_３）、１．０２（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２．８Ｈｚ、Ｊ＝３．２Ｈｚ、２×ＣＨ）；

【0232】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：１７１．３（ＣＯ）；６６．９（ＣＨ－（ＣＨ_３）_２）；４８．９（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、４０．６（ＣＨ_２－ＣＯＯ^ｉＰｒ）、３３．２（ＣＨ－ＣＨ_２ＣＯＯ^ｉＰｒ）、２９．８（ＣＨ_２）、２９．７（ＣＨ_２）、２１．５（ＣＨ_３）；

【0233】

ＨＲＭＳ：Ｍ＋Ｈ＝２００．１６４２３（デルタ＝－１．４ｐｐｍ；Ｃ_１１Ｈ_２２Ｏ_２Ｎ）。ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ（ＣＩＤ＝３５％；相対強度％）：１８３（５）；１５８（５）；１４１（１００）；１４０（４）；１２３（６）および８１（８）。

【0234】

ＩＲ（ニート） υ_ｍａｘ：２９４４、２６２７、２５５３、２０５６、１７２９、１６０７、１５１０、１４５８、１３９１、１２９７、１１８２、１１０７ｃｍ^－１。

【0235】

２－（４－アミノシクロヘキシル）エタン－１－オール（化合物ＩＶａ＋Ｖａ）

【化35】

丸底フラスコに、ＮａＢＨ_４（１７３ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１５ｍＬ）およびシス／トランス－２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸塩酸塩［Ｔ・ＨＣｌ＋Ｃ・ＨＣｌ（Ｇ＝ＣＯＯＨ）］（３００ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物に、ヨウ素（４８３ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ）およびＴＨＦ（４．５ｍＬ）から調製された溶液を０℃で滴下添加し（ガスの発生を伴う発熱反応が生じる）、形成された混合物を還流下で２４時間撹拌した。０℃に冷却した後、メタノール（８ｍＬ）を滴下添加した（熱およびガスの発生を生じ、形成された白色懸濁液は溶解する）。真空下での溶媒の蒸発後、残った粗生成物を、分取的薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、溶離液としてジクロロメタン：メタノール＝２０：１）によって精製して、白色粉末状固体としてアルコールのジアステレオマー混合物ＩＶａ＋Ｖａ（１７３．２ｍｇ ６３．６％、シス／トランス約４６：５４）を得た。

【0236】

融点：９２℃

【0237】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：３．５４（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝５．４Ｈｚ、ＯＣＨ_２）、２．６７および２．４１（１Ｈ、ｍ、ＣＨ－Ｎ）、２．００（１Ｈ、ｍ）；１．７１（１Ｈ、ｍ）；１．６０－１．２５（６Ｈ、ｍ）；１．２５－１．１５（１Ｈ、ｍ）；１．０８（１Ｈ、ｑ）；０．８９（１Ｈ、ｑ）。

【0238】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：６２．３１および６２．１９（ＯＣＨ_２）、５８．６７および５６．４６（ＣＨＮ）、４０．６９（ＣＨＣＨ_２）、３５．３７（ＣＨ）、３３．５５および３３．４０（２×ＣＨ_２）、２９．４９および２９．１０（２×ＣＨ_２）。

【0239】

ＩＲ（ＡＴＲ） υ_ｍａｘ：３４８３、３４５５、３２５９、３２２７、３１４１、２９２５、２８８８、２８７７、２８５６、１５９８、１４５４、１４４５、１３５６、１３２７、１１６４、１０５０、８７４ｃｍ^－１。

【0240】

４－（２－アセトキシエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物［化合物ＩＶ（Ｒ＝Ａｃ）＋Ｖ（Ｒ＝Ａｃ）］

【化36】

ｔｅｒｔ－ブチルＮ－［４－（２－アセトキシエチル）シクロヘキシル］カルバメート
ジクロロメタン（１５ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－［４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキシル］カルバメート［Ｗｕ Ｙ．－Ｊ．ら（ＷＯ２０１８０８１３８４Ａ１（２０１８）］（０．４ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．４ｍＬ）および４－ジメチルアミノピリジン（２４ｍｇ）の溶液に、塩化アセチル（０．１７５ｍＬ、２．４６ｍｍｏｌ）を０℃で滴下添加し、次いで、得られた混合物を室温で４時間撹拌した。真空中での揮発物の蒸発後、残渣を、２０：１のジクロロメタン：メタノール溶離液を使用してシリカゲルカラムにおいて精製して、冷蔵庫で結晶化する物質として表題生成物［化合物ＩＶ（Ｒ＝Ａｃ）＋Ｖ（Ｒ＝Ａｃ）］（０．３９ｇ、８３％）を得た。

【0241】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ_Ｈ：４．５７および４．３（１Ｈ、ｂｒ、ＮＨ）、４．０（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、ＯＣＨ_２）、３．６４および３．２８（１Ｈ、ｂｒ ＣＨＮ）、１．９７（３Ｈ、ｓ、ＣＯＣＨ_３）、１．９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ）、１．７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．６－１．４（５Ｈ、ｍ）、１．３８（９Ｈ、ｓ、３×ＣＨ_３）、１．３－１．１（２Ｈ、ｍ）、１．０５－０．９（２Ｈ、ｍ）。

【0242】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ_Ｃ：１７１．２５（ＣＯＣＨ_３）、１５５．２７（ＣＯＮＨ）、７９．１２（Ｃ）、６２．６６（ＯＣＨ_２）、４９．８７および４６．５２（ＣＨＮＨ）、３５．３８および３３．８（ＣＨ_２）、３３．３（ＣＨ_２）、３４．０９および３２．５７（ＣＨ）、３１．６９（ＣＨ_２）、２９．５９（ＣＨ_２）、２８．４４（３×ＣＨ_３）、２７．７１（ＣＨ_２）、２１．０２（ＣＯＣＨ_３）。

【0243】

４－（２－アセトキシエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物［化合物ＩＶ（Ｒ＝Ａｃ）・ＨＣｌ＋Ｖ（Ｒ＝Ａｃ）・ＨＣｌ］
酢酸エチル（３．５ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチルＮ－［４－（２－アセトキシエチル）シクロヘキシル］カルバメート（０．３９ｇ）の溶液に、酢酸エチル（２．４ｍＬ）中の２０％の塩酸の溶液を添加し、得られた混合物を室温で２．５時間撹拌した。真空下での溶媒の蒸発により、表題化合物（０．３０ｇ、１００％）が得られた。

【0244】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ_Ｈ：８．３３および４．６０－４．１０（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、４．１（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、ＯＣＨ_２）、３．４７および３．１２（１Ｈ、ｂｒ、ＣＨＮ）、２．２０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１１．５Ｈｚ）、２．０６および２．０５（３Ｈ、ｓ、ＣＯＣＨ_３）、２．００－１．９３（１Ｈ、ｍ）、１．８８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１３Ｈｚ）、１．８５－１．７５（１Ｈ、ｍ）、１．７２－１．５（５Ｈ、ｍ）、１．５－１．２（１Ｈ、ｍ）、１．０３（１Ｈ、ｑ、Ｊ＝１３Ｈｚ）。

【0245】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ_Ｃ：１７１．２２（ＣＯＣＨ_３）、６２．４０および６２．２１（ＯＣＨ_２）、５０．９５および４８．７３（ＨＮＨ）、３５．０６（ＣＨ_２）、３２．９１（ＣＨ_２）、３３．２６および３１．５０（ＣＨ）、３０．７１（ＣＨ_２）、３０．６８（ＣＨ_２）、２７．４５（ＣＨ_２）、２６．４２（ＣＨ_２）、２１．０１（ＣＯＣＨ_３）。

【0246】

４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミン（化合物ＶＩＩａ＋ＶＩＩＩａ）

【化37】

ｔｅｒｔ－ブチル（４－（２－オキソエチル）シクロヘキシル）カルバメート
乾燥ジクロロメタン（７ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル［４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキシル］カルバメート（０．２ｇ、０．８２３ｍｍｏｌ）の溶液に、クロロクロム酸ピリジニウム（ＰＣＣ、１．３ｇ）を分割して添加し、得られた混合物を室温で１時間撹拌した。溶媒を真空下で混合物から蒸発させ、残渣をジクロロメタンを用いるシリカゲルカラムにおけるクロマトグラフィーによって精製して、冷蔵庫で結晶化する粘性油状物として表題化合物（１．１２ｇ、５８％）を得た。

【0247】

^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ_Ｈ：９．７６（１Ｈ、ｓ、ＣＨＯ）、４．６４および４．４（１Ｈ、ｂｒ、ＮＨ）、３．７２および３．３６（１Ｈ、ｂｒ ＣＨＮ）、２．４３－２．３（２Ｈ、ｄｄ、ＣＨ_２）、２．１－１．７（２Ｈ、ｍ）、１．７１－１．５５（３Ｈ、ｍ）；１．４５（９Ｈ、ｓ、３×ＣＨ_３）、１．０－１．３５（４Ｈ、ｍ）。

【0248】

^１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ_Ｃ：２０２．２（ＣＨＯ）、１５５．４（ＣＯＮＨ）、７９．２（Ｃ－Ｏ）、５０．７および４９．６（ＣＨＮＨ）、３９．７および３８．４（ＣＨ_２）、３３．２（ＣＨ_２）、３１．７（ＣＨ_２）、３０．５（ＣＨ）、２９．５（ＣＨ_２）、２８．４５（３×ＣＨ_３）、２７．８（ＣＨ_２）。

【0249】

ｔｅｒｔ－ブチル（４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキシル）カルバメート［Ｂｕｓｈ－Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｊ．らのＷＯ２００６０５０２９２Ａ２（２００６）による］
アセトニトリル（１１．５ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル（４－（２－オキソエチル）シクロヘキシル）カルバメート（０．６１ｇ、２．７１ｍｍｏｌ）の溶液に、シュウ酸・２Ｈ_２Ｏ（３３ｍｇ）、ＭｇＳＯ_４（０．５ｇ）およびエチレングリコール（０．６１ｍＬ）を添加し、混合物を室温で１８時間撹拌した。反応混合物を濾過した後、濾液を、酢酸エチル（４０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（８ｍＬ）、水（８ｍＬ）およびブライン（８ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥した後、溶媒を真空中で蒸発させて、冷蔵庫で結晶化する重質油状物として表題化合物（０．５９ｇ、７４％）が残った（試料は、不純物として約１０％のｔｅｒｔ－ブチル［４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキシル］カルバメートを含有していた）。

【0250】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ_Ｈ：４．９（１Ｈ、ｔ、Ｏ－ＣＨ－Ｏ）、４．６４および４．３６（１Ｈ、ｂｒ、ＮＨ）、４．０－３．８（４Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_２）、３．７０および３．３６（１Ｈ、ｂｒ ＣＨＮ）、２．１－１．８（２Ｈ、ｍ）、１．７１－１．５（５Ｈ、ｍ）、１．４５（９Ｈ、ｓ、３×ＣＨ_３）、１．３５－１．２（２Ｈ、ｍ）、１．０－１．２（２Ｈ、ｍ）、

【0251】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ_Ｃ：１５５．４（Ｏ＝ＣＮＨ）、１０３．６および１０３．４（Ｏ－ＣＨ－Ｏ）、７９．１（Ｃ－Ｏ）、６４．８（２×ＯＣＨ_２）、４９．８および４６．５（ＣＨＮＨ）、４０．７および３３．３（ＣＨ_２）、３３．４（ＣＨ_２）、３２．１（ＣＨ_２）、３９．５および３２．０（ＣＨ）、２９．７（ＣＨ_２）、２８．４６（３×ＣＨ_３）、２８．２（ＣＨ_２）。

【0252】

４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミン（化合物ＶＩＩａ＋ＶＩＩＩａ）［Ｂｕｓｈ－Ｐｅｔｅｒｓｅｎ Ｊ．らのＷＯ２００６０５０２９２Ａ２（２００６）による］
酢酸エチル（５ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル（４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキシル）カルバメート（０．５７ｇ、２．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、酢酸エチル（３．５ｍＬ）中の２０％の塩酸の溶液を添加し、得られた混合物を室温で２時間撹拌した。真空下で溶媒を蒸発させた後、残った固体を、真空チャンバー中で乾燥して、固体粉末として得た（０．４５ｇ、１００％）（この試料は、２８％の遊離アルデヒドを含有していた）。

【0253】

この固体をエチレングリコール（０．５２ｍＬ）に溶解し、混合物を、減圧下（５Ｈｇｍｍ）、４０℃で８時間撹拌した。酢酸エチル（４０ｍＬ）で希釈した後、固体Ｎａ_２ＣＯ_３（０．４５ｇ）を添加し、得られた混合物を数分間撹拌した。濾過後、有機相を水（２×１０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥した後、溶媒を真空中で蒸発させて、粘性油状物として表題化合物（０．１６ｇ、３８％）が残った（試料は、不純物として、約７％の２－（４－アミノシクロヘキシル）エタノールおよび約９％の２－（４－アミノシクロヘキシル）エタン－１－オールを含有していた）。

【0254】

まとめた水相をジクロロメタン（３×２０ｍＬ）で抽出し、得られた有機相を、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、真空中で濃縮して、粘性油状物として表題化合物（２３ｍｇ、６％）を得た（試料は、不純物として、約１．５％の２－（４－アミノシクロヘキシル）エタノールおよび約５．５％の２－（４－アミノシクロヘキシル）エタン－１－オールを含有していた）。

【0255】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ_Ｈ：４．９１（１Ｈ、ｍ、ＯＣＨＯ）、３．９７（２Ｈ、ｍ、２×ＯＣＨ）、３．８４（２Ｈ、ｍ、２×ＯＣＨ）、２．９８および２．６３（１Ｈ、ｂｒ、ＣＨＮ）、２．１９（２Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_２）、１．９１－１．７９（２Ｈ、ｍ）、１．７２－１．４１（５Ｈ、ｍ）、１．３５－１．２１（２Ｈ、ｍ）、１．０１－１．２０（２Ｈ、ｍ）。

【0256】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ_Ｃ：１０３．７１および１０３．４７（ＯＣＨＯ）、６４．６９（２×ＯＣＨ_２）、５０．５６（ＣＨＮＨ）、４０．８２（ＣＨ_２）、３３．２３（２×ＣＨ_２）、３２．２（２×ＣＨ_２）、３１．９９（ＣＨ）。

【0257】

４－（（１，３－ジオキサン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミン［化合物ＶＩＩ（ｎ＝２）＋ＶＩＩＩ（ｎ＝２）］

【化38】

ｔｅｒｔ－ブチル（４－（（１，３－ジオキサン－２－イル）メチル）シクロヘキシル）カルバメート
アセトニトリル（１５．５ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル（４－（２－オキソエチル）シクロヘキシル）カルバメート（０．８２ｇ、３．４ｍｍｏｌ）の溶液に、シュウ酸（４４．４ｍｇ）、ＭｇＳＯ_４（０．６ｇ）およびプロピレングリコール（１．１ｍＬ）を添加し、混合物を室温で１８時間撹拌した。濾過後、濾液を、酢酸エチル（５４ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３溶液（１１ｍＬ）、水（１１ｍＬ）およびブライン（２２ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で洗浄した後、溶媒を真空中で蒸発させた。残渣を、２０：１のジクロロメタン：メタノールの溶離液を使用するシリカゲルカラムにおいて精製して、冷蔵庫で結晶化する重質油状物として表題化合物（０．９３ｇ、９９％）が残った（試料は、不純物として、約１０％のｔｅｒｔ－ブチル［４－（２－ヒドロキシエチル）シクロヘキシル］カルバメートを含有していた）。

【0258】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ_Ｈ：４．６４および４．３７（１Ｈ、ｂｒ、ＮＨ）、４．５８（１Ｈ、ｔ、ＯＣＨＯ）、４．２１－４．０１（２Ｈ、ｄｄ、Ｊ＝４．５Ｈｚおよび１１．５Ｈｚ、ＣＨ_２）、３．７６（２Ｈ、ｔ、Ｊ＝１２．５Ｈｚ）、３．７１および３．３６（１Ｈ、ｂｒ、ＣＨＮ）、２．１４－１．９０（２Ｈ、ｍ）、１．７９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１１Ｈｚ）、１．７１－１．５１（５Ｈ、ｍ）、１．５１－１．４６（１Ｈ、ｍ）、１．４５（９Ｈ、ｓ、３×ＣＨ_３）、１．３５（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝１３．５Ｈｚ）、１．２９－１．１５（１Ｈ、ｍ）、１．１５－１．０１（２Ｈ、ｍ）。

【0259】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ_Ｃ：１５５．２８（ＣＯＮＨ）、１０１．０５および１００．９２（ＯＣＨＯ）、７９．０４（Ｃ）、６６．９２（２×ＯＣＨ_２）、５３．４２および５１．４３（ＣＨＮＨ）、４２．０４および３２．３７（ＣＨ_２）、３３．３４（ＣＨ_２）、３３．１３および３１．６０（ＣＨ）、３２．００（ＣＨ_２）、２９．６１（ＣＨ_２）、２８．４５（３×ＣＨ_３）、２８．１３（ＣＨ_２）、２５．８３（ＣＨ_２）。

【0260】

４－（（１，３－ジオキサン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミン（化合物ＶＩＩ＋ＶＩＩＩ（ｎ＝２））
酢酸エチル（５．５ｍＬ）中のｔｅｒｔ－ブチル（４－（（１，３－ジオキサン－２－イル）メチル）シクロヘキシル）カルバメート（０．６５ｇ、２．１８ｍｍｏｌ）の溶液に、酢酸エチル（４ｍＬ）中の２０％の塩酸の溶液を添加し、得られた混合物を室温で１時間撹拌した。真空下で溶媒を蒸発させた後、残った固体を、真空チャンバー中で乾燥して、固体粉末として得た（０，５３ｇ、１００％）（試料は、１０％の遊離アルデヒドを含有していた）。

【0261】

この固体をプロピレングリコール（０．６ｍＬ）に溶解し、混合物を、減圧下（５Ｈｇｍｍ）、４０℃で８時間撹拌した。酢酸エチル（４０ｍＬ）で希釈された混合物に、Ｎａ_２ＣＯ_３（０．３８ｇ）を添加し、懸濁液を数分間撹拌した。濾過後、有機相を水（２×１０ｍＬ）およびブライン（１０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥した後、溶媒を真空中で蒸発させて、粘性油状物として表題化合物（０．２８ｇ、６０％）が残った（試料は、不純物として、約１２．５％の２－（４－アミノシクロヘキシル）エタン－１－オールを含有していた）。

【0262】

まとめた水相をジクロロメタン（３×２０ｍＬ）で抽出し、得られた有機相を、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、真空中で濃縮して、粘性油状物として表題化合物（０．１８ｇ、４０％）を得た（試料は、不純物として、約７％の２－（４－アミノシクロヘキシル）エタン－１－オールを含有していた）。

【0263】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ_Ｈ：４．７７（１Ｈ、ｍ、ＯＣＨＯ）、４．１０（２Ｈ、ｍ、２×ＯＣＨ）、３．８２（２Ｈ、ｍ、２×ＯＣＨ）、２．９８および２．６３（１Ｈ、ｂｒ、ＣＨＮ）、２．４２（２Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_２）、１．９１－１．８０（２Ｈ、ｍ）、１．７２－１．４１（７Ｈ、ｍ）、１．４０－１．３１（２Ｈ、ｍ）、１．２０－１．０７（（１Ｈ、ｍ）、１．０５－０．９５（１Ｈ、ｍ）。

【0264】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３） δ_Ｃ：１０１．２１および１０１．０１（ＯＣＨＯ）、６６．８９（２×ＯＣＨ_２）、５０．６１（ＣＨＮＨ）、４２．１６（ＣＨ_２）、３４．１１（２×ＣＨ_２）、３２．０６（２×ＣＨ_２）、３１．７１（ＣＨ）、２５．８２および２５．６８（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）。

【0265】

４－メチルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（化合物Ｔ・ＨＣｌ＋Ｃ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｈ））

【化39】

メタノール（１００ｍｌ）中の４－メチルシクロヘキサン－１－オン（Ｋ（Ｇ＝Ｈ））（５．５ｍｌ、５．００ｇ、４４．６ｍｍｏｌ）および１０％のＰｄ／Ｃ（０．５０ｇ）とギ酸アンモニウム（１６．８６ｇ、２６７．５ｍｍｏｌ）の反応により、無色液体として４－メチルシクロヘキサン－１－アミン（化合物Ｔ＋Ｃ（Ｇ＝Ｈ））（３．７８ｇ、収率７５％）を得た。最後に、ＨＣｌガスを導入した後、４－メチルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（化合物Ｔ・ＨＣｌ＋Ｃ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｈ））（２．８３ｇ、収率４３％、シス：トランス＝１．００：１．２３（^１Ｈ－ＮＭＲ））が、白色固体として形成された。

【0266】

（１ｓ，４ｓ）－４－メチルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（シス－化合物Ｃ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｈ））
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．１２（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、３．１１（１Ｈ、ｔｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、Ｊ＝３．９Ｈｚ、ＣＨ_ａｘ－ＮＨ_３ ^＋）、１．６９－１．６５（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ）、１．６４－１．６１（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ）、１．６１－１．５９（Ｈ、ｍ、ＣＨ－ＣＨ_３）、１．４９－１．４４（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ）、１．４２－１．３５（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ－ＣＨ_３）、０．９０（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．８Ｈｚ、ＣＨ_３）；

【0267】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：４７．４（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、２８．２（ＣＨ－ＣＨ_３）、２８．１（ＣＨ_２－ＣＨＣＨ_３）、２６．１（ＣＨ_２）、１９．５（ＣＨ_３）；

【0268】

（１ｒ，４ｒ）－４－メチルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（トランス－化合物Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｈ））
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．１２（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、２．８６（１Ｈ、ｔｔ、Ｊ＝１１．８Ｈｚ、Ｊ＝４．０Ｈｚ、ＣＨ_ａｘ－ＮＨ_３ ^＋）、１．９３－１．９１（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．６９－１．６５（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．３２（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２．７Ｈｚ、Ｊ＝３．３Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）、１．２６－１．２２（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_３）、０．９４（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１３．１Ｈｚ、Ｊ＝３．１Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）、０．８５（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ、ＣＨ_３）；

【0269】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：４９．１（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、３２．３（ＣＨ_２－ＣＨＣＨ_３）、３０．９（ＣＨ－ＣＨ_３）、３０．１（ＣＨ_２）、２１．８（ＣＨ_３）；

【0270】

ＩＲ（液体膜） υ_ｍａｘ：２９２７、２５６３、２０４９、１６１、１５１２、１４５５、１３９２、１１２７、１０２９ｃｍ^－１。

【0271】

ＨＲＭＳ：Ｍ＋Ｈ＝１１４．１２７４４（デルタ＝－２．５ｐｐｍ；Ｃ_７Ｈ_１６Ｎ）。ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ（ＣＩＤ＝３５％；相対強度％）：９７（１００）。

【0272】

４－エチルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（化合物Ｔ・ＨＣｌ＋Ｃ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｍｅ））

【化40】

メタノール（１００ｍｌ）中の４－エチルシクロヘキサン－１－オン（Ｋ（Ｇ＝Ｍｅ））（５．６ｍｌ、５．００ｇ、３９．６ｍｍｏｌ）および１０％のＰｄ／Ｃ（０．５００ｇ）とギ酸アンモニウム（１５．００ｇ、２３７．７ｍｍｏｌ）の反応により、無色液体として４－エチルシクロヘキサン－１－アミン（化合物Ｔ＋Ｃ（Ｇ＝Ｅｔ））（４．２６ｇ、収率８５％、シス：トランス＝１．９３：１．００（^１Ｈ－ＮＭＲ））を得た。最後に、ＨＣｌガスを導入した後、４－エチルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（化合物Ｔ・ＨＣｌ＋Ｃ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｍｅ））が、白色固体として形成された。

【0273】

（１ｓ，４ｓ）－４－エチルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（シス－化合物Ｃ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｍｅ））
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．１５（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、３．１２（１Ｈ、ｂｒ ｍ ＣＨ_ｅｑ－ＮＨ_３ ^＋）、１．６８－１．６５（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ）、１．６４－１．６０（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ）、１．４９－１．４５（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ）、１．４４－１．４１（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ）、１．２９（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２ＣＨ_３）、１．２７（２Ｈ、ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、ＣＨ_２ＣＨ_３）、０．８５（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、ＣＨ_２ＣＨ_３）；

【0274】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：４７．６（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、３５．３（ＣＨ－ＣＨ_２ＣＨ_３）、２６．２（ＣＨ_２）、２５．９（ＣＨ_２）、２５．８（ＣＨ_２ＣＨ_３）、１１．３（ＣＨ_２ＣＨ_３）。

【0275】

（１ｒ，４ｒ）－４－エチルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（トランス－化合物Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｍｅ））
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：７．９９（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、２．８７（１Ｈ、ｂｒ ｍ ＣＨ_ａｘ－ＮＨ_３ ^＋）、１．９６－１．９５（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．７５－１．７４（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．３１（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２．８Ｈｚ、Ｊ＝３．４Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）、１．１８（２Ｈ、ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝１５Ｈｚ ＣＨ_２ＣＨ_３）、１．０７－１．０３（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２ＣＨ_３）、０．９１（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２．９Ｈｚ、Ｊ＝３．３Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）、０．８５（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、ＣＨ_２ＣＨ_３）；

【0276】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：４９．４（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、３７．５（ＣＨ－ＣＨ_２ＣＨ_３）、３０．１（ＣＨ_２）、２９．９（ＣＨ_２－ＣＨＣＨ_２ＣＨ_３）、２８．７（ＣＨ_２ＣＨ_３）、１１．６（ＣＨ_２ＣＨ_３）；

【0277】

ＩＲ（液体膜） υ_ｍａｘ：２９３３、２５７５、２０４７、１５８３、１５０５、１４５３、１３８８、１２３６、１１２１、１０３６ｃｍ^－１。

【0278】

ＨＲＭＳ：Ｍ＋Ｈ＝１２８．１４３０３（デルタ＝－２．７ｐｐｍ；Ｃ_８Ｈ_１８Ｎ）。ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ（ＣＩＤ＝３５％；相対強度％）：１１１（１００）および６９（９）。

【0279】

４－フェニルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（化合物Ｔ・ＨＣｌ＋Ｃ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｐｈ））

【化41】

メタノール（８０ｍｌ）中の４－フェニルシクロヘキサン－１－オン（Ｋ（Ｇ＝Ｐｈ））（４．００ｇ、２２．９ｍｍｏｌ）および１０％のＰｄ／Ｃ（０．４０ｇ）とギ酸アンモニウム（８．６６ｇ、１３７．４ｍｍｏｌ）の反応により、液体として４－フェニルシクロヘキサン－１－アミン（化合物Ｔ＋Ｃ（Ｇ＝Ｐｈ））（２．９３ｇ、収率７３％、シス／トランス＝１．００：３．７０）を得た。最後に、ＨＣｌを導入した後、４－フェニルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（化合物Ｔ・ＨＣｌ＋Ｃ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｐｈ））（２．２ｇ、収率４５％）が、白色固体として形成された。

【0280】

（１ｓ，４ｓ）－４－フェニルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（シス－化合物Ｃ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｐｈ））
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．０３（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、７．３４－７．３２（Ｈ、ｍ、ＡｒＨ_ｏｒｔｏ）、７．３１－７．２７（Ｈ、ｍ、ＡｒＨ_ｍｅｔａ）、７．１９－７．１７（Ｈ、ｍ、ＡｒＨ_ｐａｒａ）、３．４２－３．４１（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ｅｑ－ＮＨ_３ ^＋）、２．５７（１Ｈ、ｔｔ、Ｊ＝１１．４Ｈｚ、Ｊ＝３．４Ｈｚ、ＣＨ_ａｘ－Ｐｈ）、

【0281】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：１４６．２（ＡｒＣ）、１２８．２（ＡｒＣＨ_ｍｅｔａ）、１２６．９（ＡｒＣＨ_ｏｒｔｏ）、１２５．９（ＡｒＣＨ_ｐａｒａ）、４５．８（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、４１．７（ＣＨ－Ｐｈ）、２７．８（ＣＨ_２）；２６．６（ＣＨ_２）；

【0282】

（１ｒ，４ｒ）－４－フェニルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（トランス－化合物Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｐｈ））
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．０３（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、７．３１－７．２７（Ｈ、ｍ、ＡｒＨ_ｍｅｔａ）、７．２４－７．２３（Ｈ、ｍ、ＡｒＨ_ｏｒｔｏ）、７．１９－７．１７（Ｈ、ｍ、ＡｒＨ_ｐａｒａ）、３．０６（１Ｈ、ｔｔ、Ｊ＝１１．６Ｈｚ、Ｊ＝３．９Ｈｚ、ＣＨ_ａｘ－ＮＨ_３ ^＋）、２．４７（１Ｈ、ｔｔ、Ｊ＝１２．０Ｈｚ、Ｊ＝３．４Ｈｚ、ＣＨ_ａｘ－Ｐｈ）、

【0283】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：１４６．０（ＡｒＣ）、１２８．２（ＡｒＣＨ_ｍｅｔａ）、１２６．６（ＡｒＣＨ_ｏｒｔｏ）、１２６．０（ＡｒＣＨ_ｐａｒａ）、４８．９（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、４２．２（ＣＨ－Ｐｈ）、３１．４（ＣＨ_２）；３０．４（ＣＨ_２）；

【0284】

ＨＲＭＳ：Ｍ＋Ｈ＝１７６．１４３０２（デルタ＝－２．０ｐｐｍ；Ｃ_１２Ｈ_１８Ｎ）。ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ（ＣＩＤ＝３５％；相対強度％）：１５９（１００）；９１（３）および８１（３）；

【0285】

ＩＲ（液体膜） υ_ｍａｘ：２９３９、２５４４、２０３８、１６１０、１５０４、１４５１、１３９０、１１８２、１０７３、１０２０、７５８、７００ｃｍ^－１。

【0286】

４－ベンジルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（化合物Ｔ・ＨＣｌ＋Ｃ・ＨＣｌ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ））

【化42】

メタノール（６０ｍｌ）中の４－ベンジルシクロヘキシル－１－オン（Ｋ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ））（１．５０ｇ、７．９７ｍｍｏｌ）および１０％のＰｄ／Ｃ（０．４５ｇ）とギ酸アンモニウム（３．０１ｇ、４７．８ｍｍｏｌ）の反応により、液体として４－ベンジルシクロヘキサン－１－アミン（化合物Ｔ＋Ｃ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ））（０．２９ｇ、収率１９％、シス／トランス＝１．００：１．０８（^１Ｈ－ＮＭＲ））を得た。最後に、ＨＣｌガスを導入した後、４－ベンジルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（化合物Ｔ・ＨＣｌ＋Ｃ・ＨＣｌ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ））（０．２２ｇ、収率１２％）が、白色固体として形成された。

【0287】

（１ｓ，４ｓ）－４－ベンジルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（シス－化合物Ｃ・ＨＣｌ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ））
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．１４（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、７．２９－７．２５（２Ｈ、ｍ、ＡｒＨ_ｍｅｔａ）、７．１９－７．１３（３Ｈ、ｍ、ＡｒＨ_ｐａｒａ、ＡｒＨ_ｏｒｔｏ）、３．１４－３．１３（１Ｈ、ｍ、ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、２．５５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．６４Ｈｚ、ＣＨ_２－Ｐｈ）、１．７８－１．７１（３Ｈ、ｍ、２×ＣＨ、ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２Ｐｈ）、１．６６－１．５９（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ）、１．４４－１．４１（４Ｈ、ｍ、４×ＣＨ）；

【0288】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：１４０．６（ＡｒＣ）、１２８．７（ＡｒＣ_ｏｒｔｏ）、１２８．１（ＡｒＣ_ｍｅｔａ）、１２５．７（ＡｒＣ、パラ）、４７．６（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、３９．３（ＣＨ_２－Ｐｈ）、３５．４（ＣＨ－ＣＨ_２－Ｐｈ）、２６．０（ＣＨ_２）、２５．９（ＣＨ_２）；

【0289】

（１ｒ，４ｒ）－４－ベンジルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（トランス－化合物Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ））
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．１４（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、７．２９－７．２５（２Ｈ、ｍ、ＡｒＨ_ｍｅｔａ）、７．１９－７．１３（３Ｈ、ｍ、ＡｒＨ_ｏｒｔｏ、ＡｒＨ_ｐａｒａ）、２．８８（１Ｈ、ｔｔ、Ｊ＝１１．８Ｈｚ、Ｊ＝３．２Ｈｚ、ＣＨ_ａｘ－ＮＨ_３ ^＋）、２．４５（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、ＣＨ_２－Ｐｈ）、１．９３－１．９１（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．６６－１．５９（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．４４－１．４１（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２Ｐｈ）、１．２８（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２．６１Ｈｚ、Ｊ＝３．２Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）、１．００（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１３．５８Ｈｚ、Ｊ＝２．９Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）；

【0290】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：１４０．３（ＡｒＣ）、１２８．８（ＡｒＣ_ｏｒｔｏ）、１２８．０（ＡｒＣ_ｍｅｔａ）、１２５．７（ＡｒＣ_ｐａｒａ）、４９．３（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、４２．３（ＣＨ_２－Ｐｈ）、３７．９（ＣＨ－ＣＨ_２Ｐｈ）、３０．０（ＣＨ_２）、２９．９（ＣＨ_２）、

【0291】

ＨＲＭＳ：Ｍ＋Ｈ＝１９０．１５８５０（デルタ＝－２．８ｐｐｍ；Ｃ_１３Ｈ_２０Ｎ）。ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ（ＣＩＤ＝３５％；相対強度％）：１７３（１００）；１１７（２）；１０５（３１）；９５（９）；９１（５）および８１（２）。

【0292】

ＩＲ（液体膜） υ_ｍａｘ：３０７３、２６１０、２０３５、１６１０、１５１１、１４９４、１４５３、１３９２、１３４７、１２０３、１０６２、７４４、７０１ｃｍ^－１。

【0293】

２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル塩酸塩のシス－ジアステレオマー（化合物ＩＩｂ・ＨＣｌ）
（１ｓ，４ｓ）－４－（２－エトキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（化合物ＩＩｂ・ＨＣｌ）

【化43】

２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル塩酸塩のシス－ジアステレオマー（約９０．２％のｄｅを有するＩＩｂ・ＨＣｌ）は、ＷＯ２０１０／０７０３６８による工業スケールの生成プロセスで、２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル塩酸塩のジアステレオマー混合物（約１：１の比のＩｂ・ＨＣｌ ＩＩｂ・ＨＣｌ）の再結晶の母液から入手した。

【0294】

（１ｓ，４ｓ）－４－（２－エトキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（シス－化合物ＩＩｂ・ＨＣｌ）
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．１４（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、４．０９－４．０２（２Ｈ、ｍ、ＯＣＨ_２）、３．１８－３．０９（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＮＨ_３ ^＋）、２．２７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）、１．９８－１．８６（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ｅｑ－ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）、１．６９－１．６２（４Ｈ、ｍ、４×ＣＨ）、１．５３－１．４３（４Ｈ、ｍ、４×ＣＨ）、１．１８（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、ＣＨ_３）。

【0295】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：１７１．９６（ＣＯ）、５９．６２（ＯＣＨ_２）、４７．２（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、３７．９２（ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）、３０．５８（ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）、２５．９６（ＣＨ_２）、２５．８９（ＣＨ_２）、１４．０４（ＣＨ_３）。

【0296】

ＩＲ（ニート） υ_ｍａｘ：２９２７、１７２７、１６０１、１５２０、１５１１、１４４７、１３７５、１２２６、１１６５、１０３１ｃｍ^－１。

【0297】

生体触媒としての異なる微生物株のトランスアミナーゼ
プラスミドの作成およびクロモバクテリウム・ビオラセウム由来の（Ｓ）－選択的トランスアミナーゼ（ＣｖＳ－ＴＡ）の発現は、Ｋ．Ｅ．Ｃａｓｓｉｍｊｅら（ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．１（９），１０５１－１０５５（２０１１），ＤＯＩ：１０．１０２１／ｃｓ２００３１５ｈ）によって開示された。増強された触媒の性質を示すＨｉｓタグ化ＣｖＳ－ＴＡ Ｗ６０Ｃ変異体（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ）の組換え発現は、Ｋ．Ｅ．Ｃａｓｓｉｍｊｅら（Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１０，５４６６－５４７０（２０１２），ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ２ＯＢ２５８９３Ｅ）によって公開された。Ｈｉｓタグ化ＶｆＳ－ＴＡの組換え発現は、Ｆ．Ｇ Ｍｕｔｔｉら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１００３－１００７（２０１２），ＤＯＩ：１０．１００２／ｅｊｏｃ．２０１１０１４７６）によって公開された。固定化全細胞形態で、ラセミアミンの速度論的分割のために適用される、それぞれ、３つの（Ｒ）－選択的ＴＡおよび３つの（Ｓ）－選択的ＴＡの、アルスロバクター属種（ＡｒＲ－ＴＡ）、その変異型バリアント（ＡｒＲ_ｍｕｔ－ＴＡ）、アスペルギルス・テレウス（ＡｔＲ－ＴＡ）由来の（Ｒ）－選択的ＴＡ；およびアルスロバクター・シトレウス（ＡｒＳ－ＴＡ）、クロモバクテリウム・ビオラセウムの変異型バリアント（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ）、ビブリオ・フルビアリス（ＶｆＳ－ＴＡ）由来の（Ｓ）－選択的ＴＡの生成および全細胞固定化は、Ｍｏｌｎａｒら（Ｃａｔａｌｙｓｔｓ，９，４３８（２０１９），ＤＯＩ：１０．３３９０／ｃａｔａｌ９０５０４３８）によって公開された。２つの異なる親系統：ビブリオ・フルビアリスＪＳ１７ ＡＴＡ（ＶｆＳ－ＴＡ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６５，２０６－２１１（１９９９），ＤＯＩ：１０．１００２／（ＳＩＣＩ）１０９７－０２９０（１９９９１０２０）６５：２＜２０６：：ＡＩＤ－ＢＩＴ１１＞３．０．ＣＯ；２－９）およびアルスロバクター属種ＡＴＡ（ＡｒＲ－ＴＡ：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６９，４９９－５０５（２００６），ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００２５３－００５－０００２－１）由来の２４の変異体アミントランスアミナーゼ（ＡＴＡ）を含有するトランスアミナーゼスクリーニングキット（Ｃｏｄｅｘｉｓ、Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ、米国）もアッセイした。ＡＴＡ－２１７と名付けられたＶｆＳ－ＴＡのバリアントにおける１７の変異（配列番号３において太字でマーク；図４を参照されたい）は、Ｎｏｖｉｃｋ Ｓ．Ｊ．ら（ＡＣＳ Ｃａｔａｌ．１１，３７６２－３７７０（２０２１），ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｃａｔａｌ．０ｃ０５４５０）によって開示された。

【0298】

トランスアミナーゼの発現
ＡｒＳ－ＴＡおよびＶｆＳ－ＴＡの生成は、所与のＴＡの遺伝子を有する組換えｐＡＳＫ－ＩＢＡ３５＋プラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）において達成した。ＬＢ－Ｃａｒ培地（５ｍＬ；カルベニシリン、５０ｍｇＬ^－１を含有するＬＢ培地）に、終夜ＬＢ－Ｃａｒ寒天プレートからの１つの新鮮なコロニーを接種し、細胞を、振とうフラスコ（３７℃、２００ｒｐｍ）中、終夜成長させた。２Ｌのフラスコ中のＬＢ培地（０．５Ｌ）に、シード培養物（２ｍＬ）を接種し、細胞を、ＯＤ_６４０が０．８に達するまで（およそ４時間）、３７℃、２００ｒｐｍで成長させた。誘導のために、テトラサイクリン溶液（２０μＬ、エタノール中５ｍｇｍｌ^－１のテトラサイクリン）を添加し、培養物を、さらに１６時間、２５℃、２００ｒｐｍで振とうした。次いで、細胞を遠心分離（１５，０００ｇ、４℃、２０分）によって回収した。

【0299】

ＡｔＲ－ＴＡ、ＡｒＲ－ＴＡ、ＡｒＲ_ｍｕｔ－ＴＡおよびＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡの生成は、所与のＴＡの遺伝子を有する組換えｐＥＴ２１ａプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）において達成した。ＬＢ－Ｃａｒ培地（５ｍＬ；カルベニシリン、５０ｍｇＬ^－１を含有するＬＢ培地）に、終夜ＬＢ－Ｃａｒ寒天プレートからの１つの新鮮なコロニーを接種し、細胞を、振とうフラスコ（３７℃、２００ｒｐｍ）中、終夜成長させた。２Ｌのフラスコ中の自己誘導培地（０．５Ｌ：Ｎａ_２ＨＰＯ_４、６ｇＬ^－１；ＫＨ_２ＰＯ_４、３ｇＬ^－１；トリプトン、２０ｇＬ^－１；酵母エキス、５ｇＬ^－１；ＮａＣｌ、５ｇＬ^－１；グリセロール、７．５６ｇＬ^－１；グルコース、０．５ｇＬ^－１；ラクトース、２ｇＬ^{－１ Ｓ}）に、シード培養物（２ｍＬ）を接種し、１６時間、２５℃、２００ｒｐｍで振とうした。次いで、細胞を遠心分離（１５，０００ｇ、４℃、２０分）によって回収した。

【0300】

トランスアミナーゼ発現全細胞の固定化
シリカゾルを、以下の通り調製した：ＴＥＯＳ（１４．４ｍＬ）を、０．１ＭのＨＮＯ_３（１．３ｍＬ）および蒸留水（５ｍＬ）を含有する溶液に添加し、得られた混合物を、室温で５分間超音波処理し（Ｅｍａｇ Ｅｍｍｉ ２０ＨＣ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｂａｔｈ、４５ ｋＨｚ）、４℃で２４時間保った。次いで、ＭＡＴ５４０支持体（３ｇ）を、細胞ペースト懸濁液（６ｍＬ；１ｇの遠心分離した細胞ペーストから取得し、６ｍｌの０．１Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７．５に再懸濁した）と混合し、得られた懸濁液を均一になるまで激しく振とうした（Ｔｅｃｈｎｏｋａｒｔｅｌｌ Ｔｅｓｔ Ｔｕｂｅ Ｓｈａｋｅｒ Ｍｏｄｅｌ Ｔ３ＳＫ、４０Ｈｚ、室温、５分）。最後に、均一化された支持された細胞懸濁液をシリカゾルと混合し、得られた混合物を激しく振とうした（Ｔｅｃｈｎｏｋａｒｔｅｌｌ Ｔｅｓｔ Ｔｕｂｅ Ｓｈａｋｅｒ Ｍｏｄｅｌ Ｔ３ＳＫ、４０Ｈｚ、室温、５分）。ゲル化は、室温で３０分以内に起こり、それに続いて、オープンディッシュ中、４℃で４８時間、ゲルを熟成させた。粗固定化ＴＡ生体触媒を、蒸留水（２×１５ｍＬ、１００ｍＭ、ｐＨ７．５）で洗浄し、室温で（２４時間）乾燥し、４℃で貯蔵した。

【0301】

クロモバクテリウム・ビオラセウム由来のトランスアミナーゼのＷ６０Ｃ変異体（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ）の精製
ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡを含有する大腸菌細胞の発酵後、細胞を、フレンチプレスによって破壊し、遠心分離し、粗細胞抽出物を、Ｆ．Ｇ．Ｍｕｔｔｉら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１００３－１００７（２０１２），ＤＯＩ：１０．１００２／ｅｊｏｃ．２０１１０１４７６）によって以前に記載されたようにして、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂によって精製した。補因子ＰＬＰをＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡのストック溶液に添加し、これを、さらなる使用まで２０％のグリセロール溶液中、－２０℃で保った。

【0302】

ビブリオ・フルビアリス由来のトランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ）の精製
ＶｆＳ－ＴＡを含有する大腸菌細胞の発酵後、細胞を、フレンチプレスによって破壊し、遠心分離し、粗細胞抽出物を、ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡの精製について上記に記載されたようにして、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂によって精製した。補因子ＰＬＰをＶｆＳ－ＴＡのストック溶液に添加し、これを、さらなる使用まで２０％のグリセロール溶液中、－２０℃で保った。

【0303】

グリセロールジグリシジルエーテル（ＧＤＥ）によるアミノエチルポリメタクリレート樹脂の表面活性化
Ｅ．Ａｂａｈａｚｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．１３２，２７０－２７８（２０１８），ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｂｅｊ．２０１８．０１．０２２）の方法に従って、エチレンアミン官能化メタクリレートポリマー樹脂ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＡ４０３／Ｓ（１．０ｇ、粒子径１５０～３００μｍ、細孔サイズ４００～６００Å）を、エタノール（１５ｍＬ）中のグリセロールジグリシジルエーテル溶液（１０ｍｍｏｌ）に添加した。ビスエポキシド溶液中のポリマー支持体の懸濁液を、４５０ｒｐｍで、２５℃で２４時間振とうした。活性化された支持体を、ガラスフィルター（Ｇ３）で濾別し、Ｐａｔｏｓｏｌｖ（登録商標）（３×１０ｍＬ）で洗浄し、室温で（４時間）乾燥し、アルゴン雰囲気下、４℃で貯蔵した。

【0304】

ＧＤＥ活性化アミノエチル樹脂におけるＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡの固定化
Ｅ．Ａｂａｈａｚｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．１３２，２７０－２７８（２０１８），ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｂｅｊ．２０１８．０１．０２２）の方法に従って、エッペンドルフ管（１．５ｍＬ）中、精製されたＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ（２１０μＬ、４．８ｍｇｍＬ^－１）をＨＥＰＥＳ緩衝液（７９０μＬ、５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で希釈し、次いで、ＧＤＥ活性化アミノエチル樹脂（１０．０ｍｇ、酵素：支持体比＝１：１０をもたらす）を溶液に添加した。得られた懸濁液を、９００ｒｐｍで、２５℃で２４時間振とうした。固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡを、遠心分離し、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２×１．０ｍＬ）で洗浄した。固定化前のＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ溶液および上清におけるタンパク質濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計によって決定した。固定化収率（ＩＹ）を、式ＩＹ（％）＝（Ｐ_０－Ｐ）／Ｐ_０×１００（式中、Ｐ_０［ｍｇｍＬ^－１］は、固定化前の初期タンパク質濃度であり、Ｐ［ｍｇｍＬ^－１］は、固定化後の上清中のタンパク質濃度である）に従って計算した。ＧＤＥ活性化アミノエチル樹脂（ＥＡ－Ｇ）上への精製された天然ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡの固定化後、ごく少量のタンパク質濃度が検出できたので（Ｐ 約０ｍｇｍＬ^－１）、酵素：支持体比＝１：１０での固定化収率は約１００％であった。固定化後、得られた共有結合的固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ生体触媒を、動的異性化反応において直ぐに使用した。

【0305】

固定化プロセスは、同一の結果を伴って、４ｍＬのバイアルにおいて１０倍スケールアップすることができた。

【0306】

ＧＤＥ活性化アミノエチル樹脂におけるＶｆＳ－ＴＡの固定化
Ｅ．Ａｂａｈａｚｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．１３２，２７０－２７８（２０１８），ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｂｅｊ．２０１８．０１．０２２）の方法に従って、エッペンドルフ管（１．５ｍＬ）中、精製されたＶｆＳ－ＴＡ（２５０μＬ、４．５ｍｇｍＬ^－１）をＨＥＰＥＳ緩衝液（７９０μＬ、５０ｍＭ、ｐＨ７．０）で希釈し、次いで、ＧＤＥ活性化アミノエチル樹脂（１０．０ｍｇ、酵素：支持体比＝１：１０をもたらす）を溶液に添加した。得られた懸濁液を、９００ｒｐｍで、２５℃で２４時間振とうした。ＶｆＳ－ＴＡを、遠心分離し、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２×１．０ｍＬ）で洗浄した。固定化前のＶｆＳ－ＴＡ溶液および上清におけるタンパク質濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００分光光度計によって決定した。酵素：支持体比＝１：１０で約１００％の固定化収率が観察された。固定化後、得られた共有結合的固定化ＶｆＳ－ＴＡ生体触媒を、動的異性化反応において直ぐに使用した。

【0307】

ＧＤＥ活性化アミノエチル樹脂におけるＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡの連続フロー固定化
Ｅ．Ａｂａｈａｚｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ｊ．１３２，２７０－２７８（２０１８），ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｂｅｊ．２０１８．０１．０２２）の方法に従って、ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡのフロースルー固定化を、正確な温度制御で、インハウスで作製されたアルミニウム金属ブロックカラムホルダー中のＥＡ－Ｇ支持体で満たされたＣａｔＣａｒｔ（商標）カラムが取り付けられたＫｎａｕｅｒ Ａｚｕｒａ Ｐ４．１ＳアイソクラチックＨＰＬＣポンプから構築された実験室スケールのフロー反応器において行った。ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ溶液（２ｍｇｍＬ^－１、１：１０の酵素：支持体比に対応する体積中）を、０．５ｍＬ分^－１の流速で、ＥＡ－Ｇ支持体で満たされたステンレス鋼のＣａｔＣａｒｔ（商標）カラム（ステンレス鋼、内径：４ｍｍ；全長：７０ｍｍ；充填長さ：６５ｍｍ；内部体積：０．８１６ｍＬ；支持体重量：２１１．４±１６．１ｍｇ）において再循環させた。固定化前のＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ溶液および固定化の間のいくつかの時点のタンパク質濃度を、Ｎａｎｏ－Ｄｒｏｐ ２０００分光光度計によって決定した。

【0308】

バッチ方式におけるトランスアミナーゼを用いる２－（４－アミノシクロヘキシル）－酢酸エチルエステルのトランス／シス－ジアステレオマー混合物（化合物Ｉｂ＋ＩＩｂ）の動的異性化（ＤＩ）
実施例１
バッチ方式におけるピルビン酸塩存在の下で固定化全細胞ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡを用いるトランス／シス－エチルエステル（Ｉｂ＋ＩＩｂ）のＤＩ
固定化全細胞クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼＷ６０Ｃ変異体生体触媒（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ、５０ｍｇ）を、４ｍｌのバイアル中、リン酸緩衝液（１．６ｍＬ、１００ｍＭ、ｐＨ７．５）に懸濁させた。２－（４－アミノシクロヘキシル）酢酸エチルエステル塩酸塩のシス／トランスジアステレオマー混合物［４４：５６比の化合物ＩＩｂ・ＨＣｌ＋Ｉｂ・ＨＣｌ；１１．１ｍｇ、５０μｍｏｌ、リン酸緩衝液（２００μＬ、１００ｍＭ、ｐＨ７．５）中］およびアミンアクセプターとしてピルビン酸ナトリウム［０．５当量、０．２３ｍｇ、２５μｍｏｌ、リン酸緩衝液（２００μＬ、１００ｍＭ、ｐＨ７．５）中］を、生体触媒懸濁液に添加し、２５ｍＭのシス／トランスジアステレオマー混合物（ＩＩｂ・ＨＣｌ／Ｉｂ・ＨＣｌ）を有する２ｍＬの最終反応体積を提供した。反応混合物を、オービタルシェーカー（５００ｒｐｍ）において、３０℃で２４時間振とうした。反応混合物（１５０μＬ）から取得された試料に、水酸化ナトリウム（１００μＬ、１Ｍ）を添加し、それに続いて、酢酸エチル（８００μＬ）で抽出した。アミンの誘導体化を無水酢酸（２０μＬ、６０℃、１時間）の添加によって行い、次いで、有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥した。試料をガスクロマトグラフィーによって分析した。

【0309】

ケトン（ＩＩＩｂ）ならびに対応するＩｂおよびＩＩｂのアセトアミドについてのピーク面積の積分により、生成物Ｉｂ、ＩＩｂ、およびＩＩＩｂのモル分率は、混合物中で、それぞれ、７６．３％、０．６％および２３．０％であった。

【0310】

反応混合物を遠心分離して、生体触媒を除去した。水性懸濁液を、濃ＨＣｌ水の添加によってｐＨ１に酸性化し、それをジクロロメタン（３×３ｍＬ）で抽出した。まとめた有機相を、飽和ブライン（３ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、真空中で濃縮して、ケトン（化合物ＩＩＩｂ：２．０ｍｇ、１１μｍｏｌ、収率９５％）を得た。酸性化された水相のｐＨを、２５％の水酸化アンモニウム水の添加によってｐＨ１０に調整し、塩基性溶液をジクロロメタン（３×３ｍＬ）で抽出した。まとめた有機相を、飽和ブライン（３ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、真空中で濃縮して、トランス－アミン（化合物Ｉｂ：４．８ｍｇ、２６μｍｏｌ、収率６８％でＧＣによるｄｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＝９８．３％）を得た。

【0311】

実施例２
バッチ方式におけるピルビン酸の塩存在下で固定化全細胞ＶｆＳ－ＴＡを用いるトランス／シス－エチルエステル（Ｉｂ＋ＩＩｂ）のＤＩ
手順を、固定化全細胞ビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ、５０ｍｇ）生体触媒を使用した方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0312】

２４時間の反応時間後、ケトン（ＩＩＩｂ）ならびに対応するＩｂおよびＩＩｂのアセトアミドについてのピーク面積の積分により、生成物Ｉｂ、ＩＩｂ、およびＩＩＩｂのモル分率は、混合物中で、それぞれ、７０．６％、１．５％、２７．９であった。

【0313】

実施例３
バッチ方式におけるピルビン酸の塩存在下で二倍量の固定化全細胞ＶｆＳ－ＴＡを用いるトランス／シス－エチルエステル（Ｉｂ＋ＩＩｂ）のＤＩ
手順を、固定化全細胞ビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ、１００ｍｇ）生体触媒を使用した方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0314】

６時間の反応時間後、ケトン（ＩＩＩｂ）ならびに対応するＩｂおよびＩＩｂのアセトアミドについてのピーク面積の積分により、生成物Ｉｂ、ＩＩｂ、およびＩＩＩｂのモル分率は、混合物中で、それぞれ、７４．５％、１．０％および２４．５％であった。

【0315】

実施例４
バッチ方式におけるピルビン酸の塩存在下で精製された可溶性ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡを用いるトランス／シス－エチルエステル（Ｉｂ＋ＩＩｂ）のＤＩ
手順を、２５ｍＭのシス／トランスジアステレオマー混合物（ＩＩｂ・ＨＣｌ／Ｉｂ・ＨＣｌ＝４４：５６）から出発する反応において、溶液中のＮｉ－ＮＴＡ精製クロモバクテリウム・ビオラセウムトランスアミナーゼＷ６０Ｃ変異体（ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ）生体触媒を使用した（最終反応混合物中で０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、０．２ｍＭのピリドキサール－５－リン酸（ＰＬＰ）で補充）方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0316】

２時間の反応時間後、ケトン（ＩＩＩｂ）ならびに対応するＩｂおよびＩＩｂのアセトアミドについてのピーク面積の積分により、生成物Ｉｂ、ＩＩｂ、およびＩＩＩｂのモル分率は、混合物中で、それぞれ、８６．０％、０％および１４．０％であった。

【0317】

実施例１に示される抽出後処理により、ケトン（化合物ＩＩＩｂ：１．３ｍｇ、７μｍｏｌ、収率約９８％）、トランス－アミン（化合物Ｉｂ：４．９ｍｇ、２７μｍｏｌ、収率６２％でＧＣによるｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９９％）を得た。

【0318】

実施例５
バッチ方式におけるピルビン酸の塩存在下で精製された可溶性ＶｆＳ－ＴＡを用いるトランス／シス－エチルエステル（Ｉｂ＋ＩＩｂ）のＤＩ
手順を、２５ｍＭのシス／トランスジアステレオマー混合物（ＩＩｂ・ＨＣｌ／Ｉｂ・ＨＣｌ＝５１：４９）から出発する反応において、Ｎｉ－ＮＴＡ精製ビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ）生体触媒を使用した（最終反応混合物中で０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、０．２ｍＭのピリドキサール－５－リン酸（ＰＬＰ）で補充）方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0319】

３時間の反応時間後、ケトン（ＩＩＩｂ）ならびに対応するＩｂおよびＩＩｂのアセトアミドについてのピーク面積の積分により、混合物中の生成物Ｉｂ、ＩＩｂ、およびＩＩＩｂのモル分率は、それぞれ、７９．０％、０．５％および２０．５％であった。

【0320】

実施例１に示される抽出後処理により、ケトン（化合物ＩＩＩｂ：１．７ｍｇ、約９μｍｏｌ、収率約９２％）、トランス－アミン（化合物Ｉｂ：４．８ｍｇ、２６μｍｏｌ、収率６５％でＧＣによるｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＝９８．７％）を得た。

【0321】

実施例６
バッチ方式におけるピルビン酸の塩存在下で多孔質樹脂上に共有結合的に固定化されたＶｆＳ－ＴＡを用いるトランス／シス－エチルエステル（Ｉｂ＋ＩＩｂ）のＤＩ
手順を、生体触媒としてポリマー樹脂上の共有結合的固定化ビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ、１０ｍｇ）を使用した方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0322】

６時間の反応時間後、ケトン（ＩＩＩｂ）ならびに対応するＩｂおよびＩＩｂのアセトアミドについてのピーク面積の積分により、混合物中の生成物Ｉｂ、ＩＩｂ、およびＩＩＩｂのモル分率は、それぞれ、７４．９％、１．６％および２３．６％であった。

【0323】

実施例７
バッチ方式におけるケトン（ＩＩＩｂ）の存在下で固定化全細胞ＶｆＳ－ＴＡを用いるトランス／シス－エチルエステル（Ｉｂ＋ＩＩｂ）のＤＩ
手順を、反応において、生体触媒として固定化全細胞ビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ、１００ｍｇ）およびアミンアクセプターとしてエチル２－（４－オキソシクロヘキシル）アセテート（化合物ＩＩＩｂ、２．５ｍＭ）を使用した方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0324】

４８時間の反応時間後、ケトン（ＩＩＩｂ）ならびに対応するＩｂおよびＩＩｂのアセトアミドについてのピーク面積の積分により、生成物Ｉｂ、ＩＩｂ、およびＩＩＩｂのモル分率は、混合物中で、それぞれ、７４．６％、１２．４％および１３．０％であった。

【0325】

実施例８
バッチ方式におけるケトン（ＩＩＩｂ）の存在下で精製された可溶性ＶｆＳ－ＴＡを用いるトランス／シス－エチルエステル（Ｉｂ＋ＩＩｂ）のＤＩ
手順を、２５ｍＭのシス／トランスジアステレオマー混合物（ＩＩｂ・ＨＣｌ／Ｉｂ・ＨＣｌ＝５１：４９）から出発する反応において、アミンアクセプターとしてエチル２－（４－オキソシクロヘキシル）アセテート（化合物ＩＩＩｂ、２．５ｍＭ）およびＮｉ－ＮＴＡ精製ビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ）生体触媒（最終反応混合物中で０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、０．２ｍＭのピリドキサール－５－リン酸（ＰＬＰ）で補充）を使用した方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0326】

４８時間の反応時間後、ケトン（ＩＩＩｂ）ならびに対応するＩｂおよびＩＩｂのアセトアミドについてのピーク面積の積分により、生成物Ｉｂ、ＩＩｂ、およびＩＩＩｂのモル分率は、混合物中で、それぞれ、７８．４％、１０．８％および１０．７％であった。

【0327】

実施例１に示される抽出後処理により、ケトン（化合物ＩＩＩｂ：１．０ｍｇ、約５．４μｍｏｌ、収率約９７％）および粗トランス－アミン（化合物Ｉｂと少量のＩＩｂ）：６．２ｍｇ、３３μｍｏｌ、収率６５％でＧＣによるｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＝７５．７％）を得た。

【0328】

ＷＯ２０１０／０７０３６８に開示された方法による粗トランス－アミン（化合物Ｉｂと少量のＩＩｂ）の再結晶により、トランス－アミン塩酸塩（化合物Ｉｂ・ＨＣｌ：５．７ｍｇ、２６μｍｏｌ、ＧＣによるｄｅ_{ｔｒａｎｓ＞}９９％）を得た。

【0329】

実施例９
バッチ方式におけるシクロヘキサノンの存在下で精製された可溶性ＶｆＳ－ＴＡを用いるトランス／シス－エチルエステル（Ｉｂ＋ＩＩｂ）のＤＩ
手順を、２５ｍＭのシス／トランスジアステレオマー混合物（ＩＩｂ・ＨＣｌ／Ｉｂ・ＨＣｌ＝５１：４９）から出発する反応において、アミンアクセプターとしてシクロヘキサノン（５ｍＭ）およびＮｉ－ＮＴＡ精製ビブリオ・フルビアリストランスアミナーゼ（ＶｆＳ－ＴＡ）生体触媒（最終反応混合物中で０．５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度、０．２ｍＭのピリドキサール－５－リン酸（ＰＬＰ）で補充）を使用した方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0330】

４８時間の反応時間後、ケトン（ＩＩＩｂ）ならびに対応するＩｂおよびＩＩｂのアセトアミドについてのピーク面積の積分により、生成物Ｉｂ、ＩＩｂ、およびＩＩＩｂのモル分率は、混合物中で、それぞれ、８５．９％、９．３％および４．８％であった。

【0331】

実施例１に示される抽出後処理により、粗ケトン（化合物ＩＩＩｂと少量のシクロヘキサノン：０．４ｍｇ）および粗トランス－アミン（化合物Ｉｂと少量のＩＩｂ）：６．１ｍｇ、３２μｍｏｌ、収率６４％でＧＣによるｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＝８０．４％）を得た。

【0332】

連続フロー方式におけるクロモバクター・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）由来のトランスアミナーゼの共有結合的固定化Ｗ６０Ｃ変異体を用いる４－置換シクロヘキサン－１－アミンのトランス／シス－ジアステレオマー混合物（化合物Ｃ＋Ｔ）の動的異性化
実施例１０
連続フロー方式におけるピルビン酸の塩存在下で多孔質樹脂上に共有結合的に固定化されたＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡを用いるトランス／シス－エチルエステル（Ｉｂ・ＨＣｌ＋ＩＩｂ・ＨＣｌ）のＤＩ
４－（２－エトキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物のシス／トランス－ジアステレオマー混合物（化合物Ｉｂ・ＨＣｌ＋ＩＩｂ・ＨＣｌ）の動的異性化は、ＳｙｎＢｉｏＣａｒｔカラム（ＳｙｎＢｉｏｃａｔ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ、ハンガリー；ステンレス鋼の外側およびＰＴＦＥの内側管、内径：４ｍｍ；全長：７０ｍｍ；充填長さ：６５ｍｍ；内部体積：０．８１６ｍＬ）に取り付けられたシリンジポンプ（Ａｓｉａ（登録商標）シリンジポンプシステム、Ｓｙｒｒｉｓ Ｌｔｄ．、Ｒｏｙｓｔｏｎ、英国）から構成される実験室スケールのフロー反応器において成し遂げられた。カラムを、ＰＴＦＥ製のフィルター膜［Ｗｈａｔｍａｎ（登録商標）Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＷＨＡ１０４１１３１１、細孔サイズ０．４５μｍ］によってシールした。シーリング要素はＰＴＦＥ製であった。ＰＴＦＥチューブ（１／１６インチの外径および０．８ｍｍの内径、ＶＩＣＩ ＡＧ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｃｈｅｎｋｏｎ、スイス）およびＰＥＥＫ手締め（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、カラム（商業的供給業者から購入）に接続した。グリセロール－１，３－ジグリシジルエーテル改変メタクリレートポリマー樹脂（ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＡ４０３／Ｓ；ポリメチルメタクリレート支持体、粒子径１５０～３００μｍ、細孔サイズ４００～６００Å）上に固定化された共有結合的固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ生体触媒（充填重量：３７５±１２ｍｇ／カラム）で満たされた、３つの直列的に接続されたＳｙｎＢｉｏＣａｒｔカラムを、インハウス製のステンレス鋼金属ブロックにおいて、正確な温度制御で４０℃に温度調節した。ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ生体触媒で満たされたカラムを、ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．０）によって１時間、事前洗浄した。次いで、４－（２－エトキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物のシス／トランス－ジアステレオマー混合物［化合物Ｉｂ・ＨＣｌ＋ＩＩｂ・ＨＣｌ、シス：トランス＝６９．７：３０．３、２０ｍＭ、共溶媒としてＤＭＳＯ（１０％ｖ／ｖ）、ピルビン酸ナトリウム（０．９５当量）およびＰＬＰ（１％ｎ／ｎ）を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．０）に溶解］の溶液を、１０μＬ分^－１の流速で、カラムを通してポンプで送った。安定した操作が確立された後（約６時間）、試料を取り、安定操作期間の間毎時間ＧＣによって分析し、流出した反応生成物を４８時間収集した。

【0333】

収集溶液（２５ｍＬ）を、濃ＨＣｌ水によってｐＨ１に酸性化し、形成されたケトン（化合物ＩＩＩｂ）を、ジクロロメタン（３×５０ｍＬ）による抽出によって除去した。ケトンの除去後、水相を、水酸化アンモニウム（２５％）の添加によってｐＨ１２に塩基性化し、残ったアミンをジクロロメタン（３×５０ｍＬ）で抽出した。まとめた有機相を、飽和ブライン（３０ｍＬ）で抽出し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、真空中で濃縮して、生成物アミン（化合物Ｉｂ）を得、これを、ジエチルエーテルに溶解し、ＨＣｌガスで処理した。次いで、沈殿を、濾過によって単離し、乾燥して、白色固体としてトランス－アミン塩酸塩生成物（化合物Ｉｂ・ＨＣｌ、１１．６ｍｇ、単離収率２７％、ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９９％）を得た。

【0334】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．０９（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、４．０４（２Ｈ、ｑ、Ｊ＝７．２２Ｈｚ、ＯＣＨ_２）、２．９４－２．８３（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＮＨ_３ ^＋）、２．１７（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝７．０Ｈｚ、ＣＨ_２－ＣＯＯＥｔ）、１．９３（２Ｈ、ｂｒ ｄ、Ｊ＝１３．５Ｈｚ、２×ＣＨ_ｅｑＣＨＮＨ_３ ^＋）、１．７２（２Ｈ、ｂｒ ｄ、Ｊ＝１３．０Ｈｚ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．６４－１．５６（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２ＣＯＯＥｔ）、１．３２（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２．４Ｈｚ、Ｊ＝２．９Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ－ＣＨＮＨ_３ ^＋）、１．１７（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．２Ｈｚ、ＣＨ_３）、１．０２（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２．８Ｈｚ、Ｊ＝２．７Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）；

【0335】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：１７１．８（ＣＯ）、５９．６（ＯＣＨ_２）、４８．９（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、４０．４（ＣＨ_２－ＣＯＯＥｔ）、３３．１（ＣＨ_２）、２９．８（２×ＣＨ_２）、１４．０（ＣＨ_３）；

【0336】

ＨＲＭＳ：Ｍ^＋＝２００．１６４４３（デルタ＝－０．４ｐｐｍ；Ｃ_１１Ｈ_２２Ｏ_２Ｎ）。ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ（ＣＩＤ＝３５％；相対強度％）：１８３（４１）および１４１（１００）。

【0337】

実施例１１
連続フロー方式におけるピルビン酸の塩存在下で多孔質樹脂上に共有結合的に固定化されたＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡを用いるトランス／シス－イソプロピルエステル（Ｉｄ・ＨＣｌ＋ＩＩｄ・ＨＣｌ）のＤＩ
手順を、共有結合的固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ生体触媒で満たされた４つの直列的に接続されたＳｙｎＢｉｏＣａｒｔカラムが、４－（２－イソプロポキシ－２－オキソエチル）シクロヘキサン－１－アミニウム塩化物のシス／トランス－ジアステレオマー混合物（化合物Ｉｄ・ＨＣｌ＋ＩＩｄ・ＨＣｌ、２０ｍＭ、シス：トランス＝５１．７：４８．３）の動的異性化のために適用された方法で改変して、実施例１０に示される通りに行った。４８時間の安定的な反応の操作により、白色固体としてトランス－アミン塩酸塩生成物（化合物Ｉｄ・ＨＣｌ、１８．７ｍｇ、単離収率３０％、ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９９％）を得た。

【0338】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．０５（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、４．８８（１Ｈ、ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝６．３Ｈｚ、ＣＨ－（ＣＨ_３）_２）、２．８９－２．８７（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＮＨ_３ ^＋）、２．１４（２Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．９６Ｈｚ、ＣＨ_２－ＣＯＯ^ｉＰｒ）、１．９４－１．９１（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．７２－１．７０（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．６３－１．５５（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２ＣＯＯ^ｉＰｒ）、１．３２（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２．７Ｈｚ、Ｊ＝３．０Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）、１．１７（６Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．２５Ｈｚ、２×ＣＨ_３）、１．０２（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２．９Ｈｚ、Ｊ＝３．１Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ

【0339】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：１７１．３（ＣＯ）、６６．９（ＣＨ－（ＣＨ_３）_２）、４８．９（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、４０．６（ＣＨ－ＣＨ_２－ＣＯＯ^ｉＰｒ）、３３．２（ＣＨ－ＣＨ_２ＣＯＯ^ｉＰｒ）、２９．８（ＣＨ_２）、２９．７（ＣＨ_２）、２１．５（ＣＨ_３）；

【0340】

ＨＲＭＳ：Ｍ^＋＝１８６．１４８６６（デルタ＝－１．１ｐｐｍ；Ｃ_１０Ｈ_２０Ｏ_２Ｎ）。ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ（ＣＩＤ＝３５％；相対強度％）：１６９（１００）。

【0341】

実施例１２
連続フロー方式におけるピルビン酸の塩存在下で多孔質樹脂上に共有結合的に固定化されたＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡを用いるトランス／シス－４－メチルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｈ））のＤＩ
手順を、共有結合的固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ生体触媒で満たされた４つの直列的に接続されたＳｙｎＢｉｏＣａｒｔカラムが、４－メチルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物のシス／トランス－ジアステレオマー混合物（化合物Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｈ）、２０ｍＭ、シス：トランス＝４２：５８）の動的異性化のために適用された方法で改変して、実施例１０に示される通りに行った。２４時間の安定的な反応の操作により、トランス－アミン（化合物Ｔ（Ｇ＝Ｈ））をｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９９％（ＧＣによる）を得て、これは、生成物の揮発性に起因して単離されなかった。

【0342】

実施例１３
連続フロー方式におけるピルビン酸の塩存在下で多孔質樹脂上に共有結合的に固定化されたＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡを用いるトランス／シス－４－エチルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｍｅ））のＤＩ
手順を、共有結合的固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ生体触媒で満たされた２つの直列的に接続されたＳｙｎＢｉｏＣａｒｔカラムが、４－エチルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物のシス／トランス－ジアステレオマー混合物（化合物Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｍｅ）、２０ｍＭ、シス：トランス＝６５．４：３４．６）の動的異性化のために適用された方法で改変して、実施例１０に示される通りに行った。２４時間（６～２４時間）の安定的な反応の操作により、白色固体としてトランス－アミン塩酸塩生成物（化合物Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｍｅ）、１０．７ｍｇ、単離収率３０．４％、ｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＞９９％）を得た。

【0343】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：７．９９（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、２．９１－２．８６（１Ｈ、ｍ ＣＨ_ａｘ－ＮＨ_３ ^＋）、１．９３－１．９２（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．７５－１．７４（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．３１－１．２３（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２．６Ｈｚ、Ｊ＝３．２５Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）、１．２１－１．１６（２Ｈ、ｑｕｉｎｔ、Ｊ＝１５Ｈｚ ＣＨ_２ＣＨ_３）、１．０７－１．０３（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＣＨ_２ＣＨ_３）、０．９４－０．８８（２Ｈ、ｑｄ、Ｊ＝１２．９Ｈｚ、Ｊ＝３．３Ｈｚ、２×ＣＨ_ａｘ）、０．８６－０．８３（３Ｈ、ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、ＣＨ_２ＣＨ_３）；

【0344】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：４９．４２（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、３７．４９（ＣＨ－ＣＨ_２ＣＨ_３）、３０．０７（ＣＨ_２）、２９．９２（ＣＨ_２－ＣＨＣＨ_２ＣＨ_３）、２８．６９（ＣＨ_２ＣＨ_３）、１１．２７（ＣＨ_２ＣＨ_３）；

【0345】

ＨＲＭＳ：Ｍ^＋＝１２８．１４３０７（デルタ＝－２．４ｐｐｍ；Ｃ_８Ｈ_１８Ｎ）。ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ（ＣＩＤ＝３５％；相対強度％）：１１１（１００）および６９（１０）。

【0346】

実施例１４
連続フロー方式におけるピルビン酸の塩存在下で多孔質樹脂上に共有結合的に固定化されたＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡを用いるトランス／シス－４－フェニルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｐｈ））のＤＩ
手順を、共有結合的固定化ＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡ生体触媒で満たされた２つの直列的に接続されたＳｙｎＢｉｏＣａｒｔカラムが、４－フェニルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物のシス／トランス－ジアステレオマー混合物（化合物Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｐｈ）、１５ｍＭ、シス：トランス＝２６．２：７３．８）の動的異性化のために適用された方法で改変して、実施例１０に示される通りに行った。２４時間（６～２４時間）の安定的な反応の操作により、黄色がかった白色固体としてトランス－アミン塩酸塩生成物（化合物Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝Ｐｈ）、（２６．７ｍｇ、単離収率７０．７％）を得た。

【0347】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．１７（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、７．２９－７．２６（２Ｈ、ｍ、ＡｒＨ_ｍｅｔａ）、７．２４－７．２２（２Ｈ、ｍ、ＡｒＨ_ｏｒｔｏ）、７．１８（１Ｈ、ｔｔ、Ｊ＝７．１１Ｈｚ、Ｊ＝１．４３Ｈｚ、ＡｒＨ_ｐａｒａ）、３．０５－３．０３（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＮＨ_３ ^＋）、２．４６－２．４０（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－Ｐｈ）、２．０６－２．０４（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．８３－１．８２（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）；１．５７－１．４４（４Ｈ、ｍ、４×ＣＨ_ａｘ）

【0348】

^１３Ｃ ＮＭＲ（１２６ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｃ：１４６．０（ＡｒＣ）、１２８．２（ＡｒＣＨ_ｍｅｔａ）、１２６．６（ＡｒＣＨ_ｏｒｔｏ）、１２６．０（ＡｒＣＨ_ｐａｒａ）、４８．８（ＣＨ－ＮＨ_３ ^＋）、４２．２（ＣＨ－Ｐｈ）、３１．４（ＣＨ_２）、３０．４（ＣＨ_２）；

【0349】

ＨＲＭＳ：Ｍ^＋＝１７６．１４３１２（デルタ＝－１．５ｐｐｍ；Ｃ_１２Ｈ_１８Ｎ）。ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ－ＭＳ（ＣＩＤ＝３５％；相対強度％）：１５９（１００）；９１（３）および８１（３）。

【0350】

実施例１５
連続フロー方式におけるピルビン酸の塩存在下で多孔質樹脂上に共有結合的に固定化されたＣｖＳ_Ｗ６０Ｃ－ＴＡを用いるトランス／シス－４－ベンジルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物（Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ））のＤＩ
手順を、共有結合的固定化ＣｖＳＷ６０Ｃ－ＴＡ生体触媒で満たされた１つのみのＳｙｎＢｉｏＣａｒｔカラムが、４－ベンジルシクロヘキサン－１－アミニウム塩化物のシス／トランス－ジアステレオマー混合物（化合物Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ）、１５ｍＭ、シス：トランス＝５０．７：４９．３）の動的異性化のために適用された方法で改変して、実施例１０に示される通りに行った。２４時間（６～２４時間）の安定的な反応の操作により、黄色がかった白色固体としてトランス－アミン塩酸塩生成物（化合物Ｃ・ＨＣｌ＋Ｔ・ＨＣｌ（Ｇ＝ＣＨ_２Ｐｈ）、（１９．８ｍｇ、単離収率５４．１％）を得た。

【0351】

^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ－ｄ_６） δ_Ｈ：８．１７（３Ｈ、ｂｒ、ＮＨ_３ ^＋）、７．２９－７．２６（２Ｈ、ｍ、ＡｒＨ_ｍｅｔａ）、７．２４－７．２２（２Ｈ、ｍ、ＡｒＨ_ｏｒｔｏ）、７．１８（１Ｈ、ｔｔ、Ｊ＝７．１１Ｈｚ、Ｊ＝１．４３Ｈｚ、ＡｒＨ_ｐａｒａ）、３．０５－３．０３（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－ＮＨ_３ ^＋）、２．４６－２．４０（１Ｈ、ｍ、ＣＨ_ａｘ－Ｐｈ）、２．０６－２．０４（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）、１．８３－１．８２（２Ｈ、ｍ、２×ＣＨ_ｅｑ）；１．５７－１．４４（４Ｈ、ｍ、４×ＣＨ_ａｘ）

【0352】

バッチ方式におけるＡＴＡ－２１７（操作されたＶｆＳ－ＴＡ）を用いる４－置換シクロヘキサン－１－アミンのシス／トランス－ジアステレオマー混合物の動的異性化
実施例１６
バッチ方式におけるピルビン酸の塩存在下で凍結乾燥ＡＴＡ－２１７を用いるトランス／シス－メチルエステル（Ｉａ＋ＩＩａ）のＤＩ
手順を、ＡＴＡ－２１７生体触媒を、２５ｍＭのシス／トランスジアステレオマー混合物（ＩＩｂ・ＨＣｌ／Ｉｂ・ＨＣｌ＝４８：５２）から出発する反応において、最終反応混合物（２ｍｌ）で、ピリドキサール－５－リン酸（ＰＬＰ、０．１ｍＭ）が補充されたリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）およびアミンアクセプターとしてピルビン酸ナトリウム（０．０４当量、１ｍＭ）中で使用した（１．０ｍｇ／ｍｌの濃度）方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0353】

２４時間の反応時間後、ケトン（ＩＩＩａ）ならびに対応するＩａおよびＩＩａのアセトアミドについてのピーク面積の積分により、混合物中の生成物Ｉａ、ＩＩａ、およびＩＩＩａのモル分率は、それぞれ、７６．９％、１９．２％および３．９％であり、２４．７％のシスからトランスへの変換およびＧＣによるｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＝６０．１％を示した。

【0354】

実施例１７
バッチ方式におけるピルビン酸の塩存在下で凍結乾燥ＡＴＡ－２１７を用いるトランス／シス－エチルエステル（Ｉｂ＋ＩＩｂ）のＤＩ
手順を、ＡＴＡ－２１７生体触媒を、２５ｍＭのシス／トランスジアステレオマー混合物（ＩＩｂ・ＨＣｌ／Ｉｂ・ＨＣｌ＝４９：５１）から出発する反応において、最終反応混合物（２ｍｌ）で、ピリドキサール－５－リン酸（ＰＬＰ、０．１ｍＭ）が補充されたリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）およびアミンアクセプターとしてピルビン酸ナトリウム（０．０４当量、１ｍＭ）中で使用した（１．０ｍｇ／ｍｌの濃度）方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0355】

２４時間の反応時間後、ケトン（ＩＩＩｂ）ならびに対応するＩｂおよびＩＩｂのアセトアミドについてのピーク面積の積分により、混合物中の生成物Ｉｂ、ＩＩｂ、およびＩＩＩｂのモル分率は、それぞれ、８４．６％、１１．３％および４．０％であり、３４．０％のシスからトランスへの変換およびＧＣによるｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＝７６．４％を示した。

【0356】

実施例１８
バッチ方式におけるピルビン酸の塩存在下で凍結乾燥ＡＴＡ－２１７を用いるシス－エチルエステル（ＩＩｂ）のＤＩ
手順を、ＡＴＡ－２１７生体触媒を、２５ｍＭのシスジアステレオマー（ＩＩｂ・ＨＣｌ、ｄｅ_ｃｉｓ＝９０．２％）から出発する反応において、最終反応混合物（２ｍｌ）で、ピリドキサール－５－リン酸（ＰＬＰ、０．１ｍＭ）が補充されたリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）およびアミンアクセプターとしてピルビン酸ナトリウム（０．０４当量、１ｍＭ）中で使用した（１．０ｍｇ／ｍｌの濃度）方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0357】

２４時間の反応時間後、ケトン（ＩＩＩｂ）ならびに対応するＩｂおよびＩＩｂのアセトアミドについてのピーク面積の積分により、混合物中の生成物Ｉｂ、ＩＩｂ、およびＩＩＩｂのモル分率は、それぞれ、８４．２％、１１．４％および４．４％であり、７９．３％のシスからトランスへの変換およびＧＣによるｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＝７６．０％を示した。

【0358】

実施例１９
バッチ方式におけるピルビン酸の塩存在下で凍結乾燥ＡＴＡ－２１７を用いるトランス／シス－イソプロピルエステル（Ｉｄ＋ＩＩｄ）のＤＩ
手順を、ＡＴＡ－２１７生体触媒を、２５ｍＭのシス／トランスジアステレオマー混合物（ＩＩｄ・ＨＣｌ／Ｉｄ・ＨＣｌ＝６９：３１）から出発する反応において、最終反応混合物（２ｍｌ）で、ピリドキサール－５－リン酸（ＰＬＰ、０．１ｍＭ）が補充されたリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）およびアミンアクセプターとしてピルビン酸ナトリウム（０．０４当量、１ｍＭ）中で使用した（１．０ｍｇ／ｍｌの濃度）方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0359】

２４時間の反応時間後、ケトン（ＩＩＩｄ）ならびに対応するＩｄおよびＩＩｄのアセトアミドについてのピーク面積の積分により、混合物中の生成物Ｉｄ、ＩＩｄ、およびＩＩＩｄのモル分率は、それぞれ、８４．４％、１０．９％および４．７％であり、５３．４％のシスからトランスへの変換およびＧＣによるｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＝７７．２％を示した。

【0360】

実施例２０
バッチ方式におけるピルビン酸塩の存在下で凍結乾燥ＡＴＡ－２１７を用いるトランス／シス－２－（４－アミノシクロヘキシル）エタン－１－オール（ＩＶａ＋Ｖａ）の異性化の試み
手順を、ＡＴＡ－２１７生体触媒を、２５ｍＭのシス／トランスジアステレオマー混合物（Ｖａ／ＩＶａ＝４８．３：５１．７）から出発する反応において、最終反応混合物（２ｍｌ）で、ピリドキサール－５－リン酸（ＰＬＰ、０．１ｍＭ）が補充されたリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）およびアミンアクセプターとしてピルビン酸ナトリウム（０．０４当量、１ｍＭ）中で使用した（１．０ｍｇ／ｍｌの濃度）方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0361】

２４時間の反応時間後、ケトン（ＶＩａ）ならびに対応するＩＶａおよびＶａのアセトアミドについてのピーク面積の積分により、混合物中の生成物ＩＶａ、Ｖａ、およびＶＩａのモル分率は、それぞれ、４９．８％、３１．０％および１９．２％であり、シスからトランスへの変換がほとんどないが、ＧＣによるｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＝２３．２％を示した。

【0362】

実施例２１
バッチ方式におけるピルビン酸塩の存在下で凍結乾燥ＡＴＡ－２１７を用いるトランス／シス－４－（２－アセトキシエチル）シクロヘキサン－１－アミン［化合物ＩＶ（Ｒ＝Ａｃ）＋Ｖ（Ｒ＝Ａｃ）］のＤＩ
手順を、ＡＴＡ－２１７生体触媒を、２５ｍＭのＯ－アセテートのシス／トランスジアステレオマー混合物（Ｖ（Ｒ＝Ａｃ）・ＨＣｌ／ＩＶ（Ｒ＝Ａｃ）・ＨＣｌ＝５２．９：４７．１）から出発する反応において、最終反応混合物（２ｍｌ）で、ピリドキサール－５－リン酸（ＰＬＰ、０．１ｍＭ）が補充されたリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）およびアミンアクセプターとしてピルビン酸ナトリウム（０．０４当量、１ｍＭ）中で使用した（１．０ｍｇ／ｍｌの濃度）方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0363】

２４時間の反応時間後、ケトン［ＶＩ（Ｒ＝Ａｃ）］ならびに対応するＩＶ（Ｒ＝Ａｃ）およびＶ（Ｒ＝Ａｃ）のアセトアミドについてのピーク面積の積分により、混合物中の生成物ＩＶ（Ｒ＝Ａｃ）、Ｖ（Ｒ＝Ａｃ）、およびＶＩ（Ｒ＝Ａｃ）のモル分率が、それぞれ、５９．４％、３３．２％および７．４％であり、１２．３％のシスからトランスへの変換およびＧＣによるｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＝２８．３％を示した。

【0364】

実施例２２
バッチ方式におけるピルビン酸塩の存在下で凍結乾燥ＡＴＡ－２１７を用いるトランス／シス－４－（（１，３－ジオキソラン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミン（化合物ＶＩＩａ＋ＶＩＩＩａ）のＤＩ
手順を、ＡＴＡ－２１７生体触媒を、２５ｍＭのＯ－アセテートのシス／トランスジアステレオマー混合物（ＶＩＩａ／ＶＩＩＩａ＝５２．０：４８．０）から出発する反応において、最終反応混合物（２ｍｌ）で、ピリドキサール－５－リン酸（ＰＬＰ、０．１ｍＭ）が補充されたリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）およびアミンアクセプターとしてピルビン酸ナトリウム（０．０４当量、１ｍＭ）中で使用した（１．０ｍｇ／ｍｌの濃度）方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0365】

２４時間の反応時間後、ケトン（ＩＸａ）ならびに対応するＶＩＩａおよびＶＩＩＩａのアセトアミドについてのピーク面積の積分により、混合物中の生成物ＶＩＩａ、ＶＩＩＩａ、およびＩＸａのモル分率は、それぞれ、７４．９％、１１．７％および１３．４％であり、２２．９％のシスからトランスへの変換およびＧＣによるｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＝７３．０％を示した。

【0366】

実施例２３
バッチ方式におけるピルビン酸塩の存在下で凍結乾燥ＡＴＡ－２１７を用いるトランス／シス－４－（（１，３－ジオキサン－２－イル）メチル）シクロヘキサン－１－アミン［化合物ＶＩＩ（ｎ＝２）＋ＶＩＩＩａ（ｎ＝２）］のＤＩ
手順を、ＡＴＡ－２１７生体触媒を、２５ｍＭのＯ－アセテートのシス／トランスジアステレオマー混合物（ＶＩＩ（ｎ＝２）／ＶＩＩＩ（ｎ＝２）＝５１．０：４９．０）から出発する反応において、最終反応混合物（２ｍｌ）で、ピリドキサール－５－リン酸（ＰＬＰ、０．１ｍＭ）が補充されたリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．５）およびアミンアクセプターとしてピルビン酸ナトリウム（０．０４当量、１ｍＭ）中で使用した（１．０ｍｇ／ｍｌの濃度）方法で改変して、実施例１に示される通りに行った。

【0367】

２４時間の反応時間後、ケトン［ＩＸａ（ｎ＝２）］ならびに対応するＶＩＩ（ｎ＝２）およびＶＩＩＩ（ｎ＝２）のアセトアミドについてのピーク面積の積分により、混合物中の生成物ＶＩＩ（ｎ＝２）、ＶＩＩＩ（ｎ＝２）、およびＩＸ（ｎ＝２）のモル分率は、それぞれ、６０．９％、２７．３％および１１．７％であり、９．９％のシスからトランスへの変換およびＧＣによるｄｅ_{ｔｒａｎｓ}＝３８．０％を示した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

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【国際調査報告】