特表 2024-534410 新規転写因子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-20

(54)【発明の名称】新規転写因子

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/47 20060101AFI20240912BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/55 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240912BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240912BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240912BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20240912BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240912BHJP

【ＦＩ】

C07K14/47 ZNA

C07K19/00

C12N9/22

C12N15/12

C12N15/55

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N15/63 P

C12N15/85 Z

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K35/76

A61K35/761

A61K35/763

A61K48/00

A61P25/00

A61P43/00 105

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024516730

(86)(22)【出願日】2022-09-15

(85)【翻訳文提出日】2024-05-13

(86)【国際出願番号】 IB2022058691

(87)【国際公開番号】W WO2023042104

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】63/245,084

(32)【優先日】2021-09-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】504389991

【氏名又は名称】ノバルティス アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(72)【発明者】

【氏名】ファーガソン，ケイス エヴァレット

(72)【発明者】

【氏名】フロマートカ，ステファニー ヴィアニ

(72)【発明者】

【氏名】タオ，シュ イー．

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA91

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZA012

4C084ZB212

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZA01

4C087ZB21

4H045AA10

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA11

4H045CA40

4H045DA89

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、目的の遺伝子を標的とするＤＮＡ結合ドメインに融合することにより、目的の遺伝子の発現を調節するための新規転写因子に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＮＡ結合ドメイン及び少なくとも３つの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含む転写因子であって、前記ＴＡＤは、同じであるか又は異なり得る、転写因子。

【請求項2】

前記ＴＡＤは、ｉ）少なくとも１つの酸性ＴＡＤ及び少なくとも１つのＱに富むＴＡＤ、又はｉｉ）少なくとも１つの酸性ＴＡＤ及び少なくとも１つのＰに富むＴＡＤを含む、請求項１に記載の転写因子。

【請求項3】

前記酸性ＴＡＤは、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ７、ＡＴＦ６、ＴＦＥ３、ＡＴＦ６－１１又はそれらのフラグメントから選択されるＴＡＤの１つ以上のコピーを含む、請求項２に記載の転写因子。

【請求項4】

前記Ｑに富むＴＡＤは、Ｏｃｔ２－Ｑ、ＳＰ１－Ｑ１又はそれらのフラグメントから選択されるＴＡＤの１つ以上のコピーを含む、請求項２に記載の転写因子。

【請求項5】

前記Ｐに富むＴＡＤは、ＴＦＡＰ２－Ｐ、Ｏｃｔ２－Ｐ又はそれらのフラグメントから選択されるＴＡＤの１つ以上のコピーを含む、請求項２に記載の転写因子。

【請求項6】

前記ＴＡＤは、全長ＶＰ６４、ＶＰ１６の１つ又は複数のリピート、全長又は部分ｐ６５、全長ＲＴＡ、全長ＶＰ７、全長又は部分ＴＥＦ３、全長又は部分ＡＴＦ６－１１、全長又は部分ＡＴＦ６酸性、全長又は部分ＳＰ１富Ｑ、全長又は部分Ｏｃｔ２富Ｑ、全長又は部分Ｏｃｔ２富Ｐ、全長又は部分ＴＦＡＰ２富Ｐ、ＶＰ６４の活性フラグメント、ｐ６５の転写活性フラグメント、ＲＴＡの転写活性フラグメント、ＶＰ７の活性フラグメント、ＴＥＦ３の活性フラグメント、ＡＴＦ６－１１の活性フラグメント、ＡＴＦ６酸性の活性フラグメント、ＳＰ１富Ｑの活性フラグメント、Ｏｃｔ２富Ｑの活性フラグメント、Ｏｃｔ２富Ｐの活性フラグメント、ＴＦＡＰ２富Ｐの活性フラグメント及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の転写因子。

【請求項7】

前記ＴＡＤの合計長は、２０００ａａ未満、１５００ａａ未満、１０００ａａ未満、７５０ａａ未満、５００ａａ未満、３００ａａ未満、２５０ａａ未満、２００ａａ未満又は１５０ａａ未満の長さである、請求項１～６のいずれか一項に記載の転写因子。

【請求項8】

配列番号１～２８のいずれかに対して少なくとも９５％の配列同一性を有する配列又は配列番号１～２８と少なくとも８０％、８５％、９０％、好ましくは９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の転写因子。

【請求項9】

配列番号１～１８のいずれか１つを有する配列又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の転写因子。

【請求項10】

前記転写因子をコードする核酸配列は、配列番号３０～４７の配列又はそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の転写因子。

【請求項11】

前記ＤＮＡ結合ドメインは、リンカーを用いて又は用いることなく、請求項１～１０のいずれか一項に記載の転写因子に連結される、請求項１に記載の転写因子。

【請求項12】

前記ＤＮＡ結合ドメインは、前記転写因子のＮ末端に直接又はリンカーを介して連結される、請求項１１に記載の転写因子。

【請求項13】

前記ＤＮＡ結合ドメインは、前記転写因子のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結される、請求項１１に記載の転写因子。

【請求項14】

前記ＤＮＡ結合ドメインは、目的の遺伝子のゲノム領域に結合する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の転写因子。

【請求項15】

前記ＤＮＡ結合ドメインは、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体、転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクター又はジンクフィンガータンパク質である、請求項１４に記載の転写因子。

【請求項16】

前記ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｅ）Ｃａｓ９、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９又はデルタプロテオバクテリア綱（Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）（Ｄｐｂ）ＣａｓＸであるか又はそれに由来するＣａｓ分子を含む、請求項１５に記載の転写因子。

【請求項17】

前記Ｃａｓ分子は、１つ以上の活性を欠如し、任意選択により、前記１つ以上の活性は、切断活性である、請求項１６に記載の転写因子。

【請求項18】

前記Ｃａｓ分子は、４，０００ヌクレオチド未満を含む核酸分子によってコードされ、任意選択により、前記Ｃａｓ分子は、３，５００ヌクレオチド未満又は２，５００ヌクレオチド未満を含む核酸分子によってコードされる、請求項１６又は１７に記載の転写因子。

【請求項19】

前記Ｃａｓ分子は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９であるか又はそれに由来する、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の転写因子。

【請求項20】

前記Ｃａｓ分子は、野生型Ｃａｓ分子配列と比較して１つ以上のアミノ酸の欠失を含む、請求項１９に記載の転写因子。

【請求項21】

前記ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質である、請求項１５に記載の転写因子。

【請求項22】

前記ＤＮＡ結合ドメインは、前記目的の遺伝子のプロモーター領域に結合する、請求項２１に記載の転写因子。

【請求項23】

前記ＤＮＡ結合ドメインは、前記目的の遺伝子の前記プロモーター領域の６、９、１２、１５、１８、２１又は２４ｂｐ配列に結合するジンクフィンガータンパク質である、請求項２２に記載の転写因子。

【請求項24】

請求項１～２３のいずれか一項に記載の転写因子の１つ以上の成分、任意選択により前記成分の全てをコードする核酸分子。

【請求項25】

請求項２４に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項26】

前記ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターを含む、請求項２５に記載のベクター。

【請求項27】

ヒト細胞で転写を駆動するプロモーターを含む、請求項２６に記載のベクター。

【請求項28】

前記第１のプロモーターは、ニューロンで作動可能である、請求項２６又は２７に記載のベクター。

【請求項29】

前記ニューロンは、ＧＡＢＡ作動性ニューロン若しくは抑制性ニューロン又は抑制性介在ニューロンである、請求項２８に記載のベクター。

【請求項30】

前記ニューロンは、パルブアルブミン陽性ＧＡＢＡ作動性ニューロン、又はソマトスタチン陽性ＧＡＢＡ作動性ニューロン、又は血管作動性腸管ペプチド陽性ＧＡＢＡ作動性ニューロンである、請求項２９に記載のベクター。

【請求項31】

ａ．ポリＡ配列；
ｂ．イントロン配列；又は
ｃ．エンハンサー配列
の１つ以上をさらに含む、請求項２５～３０のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項32】

前記転写因子の産生及び／又は分解を制御する調節エレメントをさらに含む、請求項２５～３１のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項33】

前記調節エレメントは、前記転写因子に連結されたミニ遺伝子であり、前記ミニ遺伝子は、スプライス調節剤結合配列を含み、スプライス調節剤の存在下において、前記ミニ遺伝子は、前記転写因子の増加又は減少した発現をもたらすスプライシングを受ける、請求項３２に記載のベクター。

【請求項34】

前記調節エレメントは、脱安定化ドメインであり、前記脱安定化ドメインに特異的に結合する小分子の存在下において、前記転写因子の発現は、減少する、請求項３２に記載のベクター。

【請求項35】

アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター若しくはレンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクター若しくは単純ヘルペスウイルスベクターである、請求項２５～３４のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項36】

ＡＡＶベクターである、請求項３５に記載のベクター。

【請求項37】

ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶ．ｒｈ１０ベクターである、請求項３６に記載のベクター。

【請求項38】

請求項２５～３７のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。

【請求項39】

対象における導入遺伝子の選択的発現の方法であって、前記対象に、請求項２５～３７のいずれか一項に記載のウイルスベクターを投与することを含む方法。

【請求項40】

目的の遺伝子の変異に関連する疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項２５～３８のいずれか一項に記載のウイルスベクターを投与することを含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、目的の遺伝子を標的とするＤＮＡ結合ドメインに融合することにより、目的の遺伝子の発現を調節するための新規転写因子に関する。

【背景技術】

【0002】

１つ以上の遺伝子又は遺伝子産物の転写又は活性の低減をもたらすゲノム変更は、多様な哺乳動物疾患の原因因子である。そのようなゲノム変更の１つは、ハプロ不全である。ハプロ不全では、遺伝子の１つの機能性コピーのみが存在するにすぎず、その単一コピーは、野生型表現型を産生するのに十分な遺伝子産物を産生しない。別の疾患型は、遺伝子産物が、活性の排除ではなく、活性の低減を呈するように遺伝子産物を変更する遺伝子の一方又は両方のコピーのゲノム変化によって引き起こされる。さらに別の疾患型では、ゲノム変更は、野生型表現型を産生する遺伝子産物の存在量が不十分となるように遺伝子の一方若しくは両方のコピーの転写を低減するか又は転写物の安定性を低減する。

【0003】

転写又は活性が低減される１つ以上の遺伝子の量又は活性を増加させることにより、そのような疾患を処置する多くのアプローチが試みられている。そのようなアプローチの１つは、機能性タンパク質を産生するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターによる患者への標的遺伝子の野生型コピーの送達である。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト及びいくつかの他の霊長動物種に感染する小さい複製欠損非エンベロープウイルスである。ＡＡＶがヒト疾患の原因になるか又は軽度免疫応答を誘発するかは、知られておらず、ＡＡＶベクターは、宿主細胞ゲノム中に組み込むことなく分裂及び休眠細胞の両方に感染可能であるなど、ＡＡＶのいくつかの特性により、このウイルスは、遺伝子療法による治療用タンパク質の送達のための魅力的媒体になっている。しかしながら、ＡＡＶ遺伝子療法ベクターは、実際にはいくつかの欠点を有する。特に、ＡＡＶベクターのクローニング能力は、ウイルスＤＮＡのパッケージング能力の結果として限定される。野生型ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムは、およそ４．７キロベース（ｋｂ）である。実用上、約５．０ｋｂまでのＡＡＶゲノムは、完全に、すなわち全長がＡＡＶウイルス粒子中にパージングされると見られている。ＡＡＶベクター中の核酸ゲノムは、およそ１４５塩基の２つのＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）を有しなければならないという要件により、ＡＡＶベクターのＤＮＡパッケージング能力は、タンパク質コーディング配列が最大でおよそ４．４ｋｂであるようなものである。

【0004】

このサイズ制限に起因して、大きい治療用遺伝子、例えば約４．４ｋｂの長さを超えるものは、ＡＡＶベクターでの使用に一般に好適ではない。ＡＡＶのサイズ制限を克服するための一アプローチは、標的遺伝子自体を送達する代わりに標的遺伝子のプロモーター領域を標的とする転写因子を送達することにより遺伝子の標的遺伝子転写を増加させることである。したがって、ＡＡＶベクターにより送達するのに適切な且つ疾患又は障害の影響を逆転させる助けとなるようにいずれかの内因性遺伝子の発現を調節可能である、特にサイズが小さい且つ活性が強い改善された転写因子、特に免疫原性の低減、オフターゲットの影響の低減、標的遺伝子に対する特異性の増加及び／又は治療効能の増加をもたらす療法の必要性が存在する。

【発明の概要】

【0005】

一態様では、ＤＮＡ結合ドメイン及び少なくとも３つの転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含む転写因子であって、ＴＡＤは、同じであるか又は異なり得る、転写因子が本明細書で提供される。

【0006】

いくつかの実施形態では、ＴＡＤは、ｉ）少なくとも１つの酸性ＴＡＤ及び少なくとも１つのＱに富むＴＡＤ、又はｉｉ）少なくとも１つの酸性ＴＡＤ及び少なくとも１つのＰに富むＴＡＤを含む。いくつかの実施形態では、酸性ＴＡＤは、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ７、ＡＴＦ６、ＴＦＥ３、ＡＴＦ６－１１又はそれらのフラグメントから選択されるＴＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、Ｑに富むＴＡＤは、Ｏｃｔ２－Ｑ、ＳＰ１－Ｑ１又はそれらのフラグメントから選択されるＴＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、Ｐに富むＴＡＤは、ＴＦＡＰ２－Ｐ、Ｏｃｔ２－Ｐ又はそれらのフラグメントから選択されるＴＡＤの１つ以上のコピーを含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、ＴＡＤは、全長ＶＰ６４、ＶＰ１６の１つ又は複数のリピート、全長又は部分ｐ６５、全長ＲＴＡ、全長ＶＰ７、全長又は部分ＴＥＦ３、全長又は部分ＡＴＦ６－１１、全長又は部分ＡＴＦ６酸性、全長又は部分ＳＰ１富Ｑ、全長又は部分Ｏｃｔ２富Ｑ、全長又は部分Ｏｃｔ２富Ｐ、全長又は部分ＴＦＡＰ２富Ｐ、ＶＰ６４の活性フラグメント、ｐ６５の転写活性フラグメント、ＲＴＡの転写活性フラグメント、ＶＰ７の活性フラグメント、ＴＥＦ３の活性フラグメント、ＡＴＦ６－１１の活性フラグメント、ＡＴＦ６酸性の活性フラグメント、ＳＰ１富Ｑの活性フラグメント、Ｏｃｔ２富Ｑの活性フラグメント、Ｏｃｔ２富Ｐの活性フラグメント、ＴＦＡＰ２富Ｐの活性フラグメント及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

【0008】

いくつかの実施形態では、ＴＡＤの合計長は、２０００ａａ未満、１５００ａａ未満、１０００ａａ未満、７５０ａａ未満、５００ａａ未満、３００ａａ未満、２５０ａａ未満、２００ａａ未満又は１５０ａａ未満の長さである。

【0009】

いくつかの実施形態では、転写因子は、配列番号１～２８の配列又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、転写因子は、配列番号１～１８のいずれか１つを有する配列又はそれに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、転写因子をコードする核酸配列は、配列番号３０～４７の配列又はそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、リンカーを用いて又は用いることなく、転写因子のいずれか１つの転写因子に連結される。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写因子のＮ末端に直接又はリンカーを介して連結される。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写因子のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結される。特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号５９）又はＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号６０）を含むか又はそれからなる。

【0012】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、目的の遺伝子のゲノム領域に結合する。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体、転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクター又はジンクフィンガータンパク質である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体中のＣａｓ分子は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｅ）Ｃａｓ９、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９又はデルタプロテオバクテリア綱（Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）（Ｄｐｂ）ＣａｓＸであるか又はそれらに由来する。

【0013】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ分子は、１つ以上の活性を欠如し、任意選択により、その１つ以上の活性は、切断活性である。

【0014】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ分子は、４，０００ヌクレオチド未満を含む核酸分子によってコードされ、任意選択により、Ｃａｓ分子は、３，５００ヌクレオチド未満又は２，５００ヌクレオチド未満を含む核酸分子によってコードされる。特定の実施形態では、Ｃａｓ分子は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９であるか又はそれに由来する。

【0015】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ分子は、野生型Ｃａｓ分子配列と比較して１つ以上のアミノ酸の欠失を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質である。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は、６～９つのジンクフィンガードメインを含む。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は、目的の遺伝子のプロモーター領域に結合する。特定の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は、目的の遺伝子のプロモーター領域の６、９、１２、１５、１８、２１、２４又は２７ｂｐ配列に結合する。

【0017】

いくつかの実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は、配列番号６１、配列番号７０、配列番号７１又は配列番号７３に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。

【0018】

別の態様では、本出願は、上記の実施形態のいずれか１つに記載の転写因子の１つ以上の成分、任意選択により成分の全てをコードする核酸分子を提供する。

【0019】

別の態様では、本出願は、核酸分子を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結された第１のプロモーターを含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ヒト細胞で転写を駆動するプロモーターを含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、第１のプロモーターは、ニューロンで作動可能である。特定の実施形態では、ニューロンは、ＧＡＢＡ作動性ニューロン若しくは抑制性ニューロン又は抑制性介在ニューロンである。特定の実施形態では、ニューロンは、パルブアルブミン陽性ＧＡＢＡ作動性ニューロン、又はソマトスタチン陽性ＧＡＢＡ作動性ニューロン、又は血管作動性腸管ペプチド陽性ＧＡＢＡ作動性ニューロンである。

【0022】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ａ．ポリＡ配列；ｂ．イントロン配列；又はｃ．エンハンサー配列の１つ以上をさらに含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、ベクターは、転写因子の産生及び／又は分解を制御する調節エレメントをさらに含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、調節エレメントは、転写因子に連結されたミニ遺伝子であり、ミニ遺伝子は、スプライス調節剤結合配列を含み、スプライス調節剤の存在下において、前記ミニ遺伝子は、転写因子の増加又は減少した発現をもたらすスプライシングを受ける。

【0025】

いくつかの実施形態では、調節エレメントは、脱安定化ドメインであり、脱安定化ドメインに特異的に結合する小分子の存在下において、転写因子の発現は、減少する。

【0026】

いくつかの実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター若しくはレンチウイルスベクター又はアデノウイルスベクター若しくは単純ヘルペスウイルスベクターである。

【0027】

特定の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶベクターである。特定の実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９又はＡＡＶ．ｒｈ１０ベクターである。

【0028】

別の態様では、本出願は、上記の実施形態のいずれか１つに記載のベクターを含む細胞を提供する。

【0029】

別の態様では、本出願は、対象における導入遺伝子の選択的発現の方法であって、対象に、上記の実施形態のいずれかに記載のウイルスベクターを投与することを含む方法を提供する。

【0030】

別の態様では、本出願は、目的の遺伝子の変異に関連する疾患を処置する方法であって、それを必要とする対象に、上記の実施形態のいずれかに記載のウイルスベクターを投与することを含む方法を提供する。

【0031】

参照による組み込み
本明細書で言及される刊行物、特許及び特許出願の全ては、あたかも個々の刊行物、特許又は特許出願が、参照により組み込まれることを具体的且つ個別に明示されたのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】ＴＲＥプロモーターの活性化に関して、ＶＰＲ３と比較したＴＡＤ１、ＴＡＤ２＋（３つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列を有するＴＡＤ２）、ＴＡＤ２－（２つのＮＬＳ配列を有するＴＡＤ２）及びＴＡＤ３の活性を示す。ＴＡＤは、ミニＳａ－Ｃａｓ９に連結された場合、ＴＲＥ含有プロモーターを活性化する。ＴＲＥ配列を標的とするｓｇＲＮＡを担持したプラスミド、ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター、ＴＲＥプロモーター－ルシフェラーゼ及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。コントロールガイドＲＮＡサンプルからの変化倍率を計算することにより、Ｓａ－ｄＣａｓ９－アクチベーターによりトリガーされた相対プロモーター活性を決定した。１×ＴＲＥプロモーターは、１つのＴＲＥ部位を含有し；３×ＴＲＥプロモーターは、ＴＲＥ部位の３リピートを担持する。ＶＰＲ３（Ｍａ ｅｔ ａｌ．２０１８）も同様にミニＳａ－Ｃａｓ９に連結し、陽性転写活性化因子コントロールとして使用した。ＴＲＥを標的とするｓｇＲＮＡの配列は、配列番号６４に列挙される。

【図2】マウスＳＣＮ１Ａプロモーターの活性化に関して、ＶＰＲ３と比較したＴＡＤ１～ＴＡＤ７の活性を示す。ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター（ＴＡＤ１～ＴＡＤ７）、マウスｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ、マウスｓｃｎ１ａプロモーターを標的とするｇＲＮＡ及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。各ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーターを２０、６．７及び２．２ｎｇ／ウェルでトランスフェクトしたところ、結果は、用量依存性効果を示した。ｓｇＲＮＡ３の配列は、配列番号６５に対応する。

【図3】マウスＳＣＮ１Ａプロモーターの活性化に関して、ＶＰＲ３と比較したＴＡＤ７～ＴＡＤ１０の活性を示す。ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター（ＴＡＤ７～ＴＡＤ１０）、マウスｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ、マウスｓｃｎ１ａプロモーターを標的とするｇＲＮＡ及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。各ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーターを２０、６．７及び２．２ｎｇ／ウェルでトランスフェクトしたところ、活性ガイドＲＮＡのｓｇＲＮＡ３と共にコトランスフェクトしたとき、結果は、用量依存性活性化を示した。ミニＳａ－ｄＣａｓ９を非活性ガイドＲＮＡのｓｇＲＮＡ１１と共にコトランスフェクトしたとき、プロモーターは、活性化されなかった。ｓｇＲＮＡ３及びｓｇＲＮＡ１１の配列は、それぞれ配列番号６５、配列番号６６に対応する。

【図4】ｓｇＲＮＡと対合した場合について、ＴＲＥプロモーター及びＳＣＮ１ａプロモーターの活性化に関してＶＰＲと比較したＴＡＤ２及びＴＡＤ９の活性を示す。ユビキチンＣプロモーターにより駆動されるミニＳａ－ｄＣａｓ９－ＴＡＤは、活性ｓｇＲＮＡと対合したとき、マウスｓｃｎ１ａプロモーター及びＴＲＥ含有プロモーターを活性化する。様々な量のミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター（ＴＡＤ２、ＴＡＤ９及びＶＰＲ）、マウスｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ又はＴＲＥ含有プロモーター、それぞれＴＲＥ含有プロモーターのためのＴＲＥ ｓｇＲＮＡ；ｍＳＣＮ１ＡプロモーターのためのｓｇＲＮＡ３及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。

【図5】マウスＳＣＮ１Ａ及びヒトＳＣＮ１Ａプロモーターの活性化に関して、ＶＰ６４及びフルＶＰＲと比較したＴＡＤ９、ＴＡＤ１１、ＴＡＤ１４、ＴＡＤ１６の活性を示す。ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター、マウスｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ又はヒトｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ、ｓｃｎ１ａプロモーターを標的とするｇＲＮＡ及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。新たに作成された転写活性化ドメイン（ＴＡＤ９、ＴＡＤ１１、ＴＡＤ１４及びＴＡＤ１６）は、ＶＰＲ（Ｃｈａｖｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１５）と同等以上の活性及びＶＰ６４よりも強い活性を有する。

【図6】ＴＲＥ及びヒトＳＣＮ１Ａプロモーターの活性化に関して、ＶＰ６４及びフルＶＰＲと比較したＴＡＤ９、ＴＡＤ１１、ＴＡＤ１２、ＴＡＤ１３、ＴＡＤ１４、ＴＡＤ１５の活性を示す。ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター、ＴＲＥ含有プロモーター又はヒトｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ、ｓｃｎ１ａプロモーターを標的とするｇＲＮＡ及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。新たに作成された転写活性化ドメインは、ＶＰＲ（Ｃｈａｖｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１５）と同等以上の活性を有すると共に、ＶＰ６４よりも強い活性を有する。

【図7】異なる活性ｓｇＲＮＡを用いたマウスＳＣＮ１Ａプロモーターの活性化において、ＶＰ６４及びフルＶＰＲと比較したＴＡＤ９、ＴＡＤ１１、ＴＡＤ１２、ＴＡＤ１３、ＴＡＤ１４、ＴＡＤ１５の活性を示す。ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター、マウスｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ、マウスｓｃｎ１ａプロモーターを標的とするｓｇＲＮＡ及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。ｓｇＲＮＡ４２の配列は、配列番号６７に対応する。

【図8】Ｕ２ＯＳ細胞株でのＴＲＥレポーター遺伝子の活性化に関して、ＶＰ６４と比較したＴＡＤ８ａ、ＴＡＤ９及びＴＡＤ１５の活性を示す。ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター、ＴＲＥ含有プロモーター又はヒトｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ、ＴＲＥを標的とするｇＲＮＡ配列及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドをＵ２ＯＳ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。ＴＡＤ８ａ、ＴＡＤ９及びＴＡＤ１５は、ＶＰ６４よりも高い活性を示すと共に、ＴＡＤ１５は、全ての中で最も高い活性を示す。

【図9】遺伝子転写を増強するためにジンクフィンガータンパク質に連結されたＴＡＤ１５の活性を示す。６ＣＡＧリピートを標的とするジンクフィンガータンパク質ＺＦＰ－Ｃ（配列番号７０、「６ＣＡＧリピート」は、配列番号９３として開示される）及びヒトｅｒｂ２遺伝子プロモーターを標的とするジンクフィンガータンパク質Ｅ２Ｃ（配列番号７１）をＴＡＤ１５に連結した。２つのＥ２Ｃエレメント（Ｅ２Ｃ ２×）を担持するレポーター又は８ＣＡＧリピート（ＣＡＧ２４）（配列番号９４）を担持するレポーターと共に各転写アクチベーターをコトランスフェクトすると共に、ＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。転写因子は、プロモーターを特異的に活性化した。すなわち、Ｅ２Ｃ－ＴＡＤ１５は、Ｅ２Ｃエレメント含有プロモーターのみを活性化し；ＺＦＰ－Ｃ－ＴＡＤ１５は、ＣＡＧリピート含有プロモーターのみを活性化した。

【図10】内因性遺伝子プロモーターの活性化に関してＴＡＤ１５の活性を示す。ジンクフィンガータンパク質Ｅ２Ｃ（配列番号７１）は、ヒトｅｒｂ２遺伝子プロモーター中のエレメントを認識する（Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ １９９８）。Ｅｒｂ２は、レセプタータンパク質Ｈｅｒ２をコードする。Ｅ２Ｃ－ＴＡＤ１５をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。Ｅ２Ｃ－ＴＡＤ１５上にタグ付けされたヘマグルチニン（ＨＡ）の染色により、トランスフェクト細胞を同定した。細胞表面上のＨｅｒ２の免疫染色により、Ｈｅｒ２発現レベルを定量した。Ｅ２Ｃ－ＴＡＤ１５（ＨＡ陽性）を有する細胞は、非トランスフェクト細胞（ＨＡ陰性）と比較して３倍超のＨｅｒ２レベルを示した。

【図11】マウスＧＡＢＡ作動性ニューロン中の内因性ニューロン遺伝子の活性化におけるＴＡＤ１５の活性を示す。ＴＡＤ１３、ＴＡＤ１４及びＴＡＤ１５に、それぞれＳＣＮ１Ａプロモーターを標的とするジンクフィンガータンパク質Ｎａｖ－ＺＦ２（配列番号６１）を連結した。それらをレンチウイルス中にパージングして培養ニューロンに感染させるために使用し、７０～９０％形質導入率を達成した。４日後、細胞を溶解してＲＮＡを採取した。ｑＲＴ－ＰＣＲにより、ＳＣＮ１Ａ及びＭＡＰ２転写物を分析した。転写アクチベーターによるＳＣＮ１Ａ転写物の増加は、ウイルスなしの細胞での規格化ＳＣＮ１Ａ ｍＲＮＡレベルに対する規格化ＳＣＮ１Ａ ｍＲＮＡレベルの倍率により測定される。

【図12】原寸通りではないが、各ＴＡＤ分子中の活性化ドメインの配置を示す概略図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0033】

定義
本発明がより容易に理解され得るように、特定の用語は、詳細な説明全体を通して定義される。特に定義がない限り、本明細書で用いられる科学技術用語は、全て本発明が関連する技術分野の当業者が通常理解するものと同一の意味を有する。

【0034】

特に明記されない限り、本明細書で用いられる以下の用語及び語句は、以下の意味を有することが意図される。

【0035】

本明細書で使用される場合、「哺乳動物」は、ヒト、飼育動物、農場動物、伴侶動物などを含めて、哺乳動物として分類されるいずれの動物も含むが、これらに限定されない。

【0036】

本明細書で使用される場合、「対象」又は「患者」という用語は、霊長動物、ウサギ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ及びウシを含めて、ヒト及び非ヒト哺乳動物を指すが、これらに限定されない。好ましくは、対象又は患者はヒトである。

【0037】

「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」又は「その」という用語は、冠詞の文法上の目的語の１つ又は２つ以上を指す。この用語は、「１つ」、「１つ以上」、「少なくとも１つ」又は「１つ又は２つ以上」を指し得る。例として、「要素」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。「又は」という用語は、特に明記されない限り、「及び／又は」を指す。「含む」又は「含有する」という用語は、限定ではない。

【0038】

測定可能値、例えば量、時間的持続などが参照されたときの「約」という用語は、具体的に示された値から±２０％、又はいくつかの事例では±１０％、又はいくつかの事例では±５％、又はいくつかの事例で±１％、又はいくつかの事例では±０．１％の変動を包含することを意味するが、そのような変動は本開示の方法を実施するのに適切であるものとする。

【0039】

「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列を含有するＣａｓ９分子の結合特性に有意な影響又は変更を与えないアミノ酸改変を指す。そのような保存的改変は、アミノ酸置換、付加及び欠失を含む。改変は、部位指向変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などの当技術分野で公知の標準的技術により、本明細書に記載のＣａｓ９分子又はフラグメントに導入可能である。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ－分岐状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。そのため、Ｃａｓ９分子内の１つ以上のアミノ酸残基は、同一側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置換え可能であると共に、変更されたＣａｓ９分子は、本明細書に記載の機能性アッセイを用いて試験可能である。同様に、「保存的配列改変」は、本明細書に記載の転写因子の結合特性に有意な影響又は変更を与えないアミノ酸改変を指す。

【0040】

「コードする」という用語は、ヌクレオチド（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）の定義配列又はアミノ酸の定義配列のいずれか及びそれから生じる生物学的性質を有する他のポリマー及びマクロ分子の生物学的プロセスでの合成のためのテンプレートとしての役割を果たす、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異的配列の固有の性質を指す。そのため、遺伝子、ｃＤＮＡ又はＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又は他の生物学的系でタンパク質を産生するならば、タンパク質をコードする。遺伝子又はｃＤＮＡの転写のためのテンプレートとして使用される、ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であると共に配列表で通常提供されるコーディング鎖及び非コーディング鎖は、両方ともその遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードすると呼ばれ得る。

【0041】

特に明記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重バージョンである且つ同一アミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンでイントロンを含有し得る範囲内でイントロンも含み得る。

【0042】

「有効量」又は「治療有効量」という用語は、本明細書では互換可能に使用され、特定の生物学的結果を達成するのに有効な、本明細書に記載の化合物、製剤、材料又は組成物の量を指す。

【0043】

「内因性」という用語は、生物、細胞、組織又は系の内に由来する又はそれらの内で産生されるいずれかの物質を指す。

【0044】

「外因性」という用語は、生物、細胞、組織又は系の外から導入される又はそれらの外で産生されるいずれかの物質を指す。

【0045】

「発現」という用語は、核酸配列又はポリヌクレオチドがＤＮＡテンプレートから（例えば、ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス及び／又は転写されたｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に後続的に翻訳されるプロセスを指す。転写物及びコードポリペプチドは、総称して「遺伝子産物」と呼ばれ得る。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞でのｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

【0046】

「トランスファーベクター」という用語は、単離された核酸を含む及び単離された核酸を細胞内に送達するために使用可能である物質の組成物を指す。限定されるものではないが、線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に会合したポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスをはじめとする多くのベクターが当技術分野で公知である。そのため、「トランスファーベクター」という用語は、自律複製プラスミド又はウイルスを含む。この用語は、細胞中への核酸の移入を促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物、例えばポリリシン化合物、リポソームなどをさらに含むものとも解釈されるべきである。ウイルストランスファーベクターの例には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0047】

「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に作動的に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性エレメントを含み；発現のための他のエレメントは、宿主細胞により又はインビトロ発現系中に供給可能である。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドが組み込まれたコスミド、プラスミド（例えば、ネイキッドであるか又はリポソーム中に含有される）及びウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）を含めて、当技術分野で公知の全てのものを含む。

【0048】

「相同」、「相同性」又は「同一性」という用語は、２つのポリマー分子間、例えば２つのＤＮＡ分子若しくは２つのＲＮＡ分子などの２つの核酸分子間又は２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列同一性を指す。２つの分子の両方のサブユニット位置が同一モノマーサブユニットにより占領されているとき；例えば、２つのＤＮＡ分子の各々の位置がアデニンにより占領されている場合、それらはその位置で相同又は同一である。２つの配列間の相同性は、適合又は相同位置の数の直接関数であり；例えば、２つの配列中の位置の半分（例えば、１０サブユニット長のポリマー中の５つの位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、位置の９０％（例えば、１０のうちの９つ）が適合又は相同である場合、２つの配列は９０％相同である。

【0049】

「単離された」という用語は、天然状態から変更又は除去されたことを意味する。例えば、生存動物中に天然に存在する核酸又はペプチドは「単離された」ものではないが、その天然状態の共存物質から部分的又は完全に分離された同一の核酸又はペプチドは「単離された」ものである。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在可能であるか、又は非ネイティブ環境、例えば宿主細胞中に存在可能である。

【0050】

「作動可能に連結された」又は「転写制御」という用語は、調節配列と異種核酸配列との機能的連結が後者の発現をもたらすことを指す。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係に配置されたとき、第１の核酸配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結されている。例として、プロモーターがコーディング配列の転写又は発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コーディング配列に作動可能に連結されている。プロモーター又は調節配列は、シス作用性エレメント又はトランス作用性エレメントであり得る。作動可能に連結されたＤＮＡ配列は、互いに連続であり得ると共に、例えば２つのタンパク質コーディング領域を接合する必要がある場合、同一リーディングフレームである。

【0051】

「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖の形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合を有する及び天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの既知のアナログを含有する核酸を包含する。特に指示がない限り、特定核酸配列は、その保存的改変変異体（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ及び相補的配列並びに明示的に示された配列も黙示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が混合塩基残基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を発生させることにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１－９８（１９９４））。

【0052】

「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、互換可能に使用されると共に、ペプチド結合により共有結合で連結されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質又はペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数には限定が課されない。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに連結された２つ以上のアミノ酸を含むいずれかのペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、この用語は、例えば、ペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも当技術分野で通常呼ばれる短鎖と、タンパク質と当技術分野で一般に呼ばれ、多くのタイプが存在するより長い鎖と、の両方を指す。「ポリペプチド」は、とりわけ、例えば生物学的活性フラグメント、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、改変ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド又はそれらの組み合わせを含む。

【0053】

本明細書で使用される場合、「プロモーター」又は「プロモーター配列」という用語は、例えばＲＮＡポリメラーゼの結合を介した、例えば下流（３’方向）のコーディング又は非コーディング配列の、作動可能に連結されたコーディング又は非コーディング配列の転写を促進することができる（例えば、検出可能なレベルの転写を引き起こすことができ、且つ／又はプロモーターの非存在下で提供されるレベルを超えて検出可能なレベルの転写を増加させることができる）ＤＮＡ調節配列である。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合され、上流（５’方向）に伸びて、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するための最小数の塩基又はエレメントを含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、転写開始部位並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインを含み得る。転写を開始するのに十分な配列に加えて、プロモーターは、転写の調節に関与する他の調節エレメントの配列（例えば、エンハンサー、コザック配列及びイントロン）も含み得る。誘導性プロモーター及び構成的プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示されるベクターを駆動し得る。いくつかの実施形態、例えば本明細書に開示されるウイルスベクターにおいて使用され得る当技術分野で公知のプロモーターの例には、ＣＭＶプロモーター、ＣＢＡプロモーター、ｓｍＣＢＡプロモーター及び免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０又は他の組織特異的遺伝子に由来するプロモーター（例えば、ＲＬＢＰ１、ＲＰＥ、ＶＭＤ２）が含まれる。さらに、既知の調節エレメントを混合及び適合させることによって機能的プロモーターを作製するための標準的な技術が当技術分野で公知である。プロモーターのフラグメント、例えばバックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するために少なくとも最小数の塩基又はエレメントを保持するものも使用され得る。

【0054】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的に活性なプロモーター（すなわち任意の細胞型において且つ／又は任意の条件下で構成的に発現を駆動するプロモーター）であり得る。他の実施形態では、プロモーターは、特定の組織に関連して、例えばニューロン、心臓細胞などにおいて構成的に活性なプロモーターであり得る。他の実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーター（すなわちその活性が外部刺激、例えば特定の温度、化合物又はタンパク質の存在によって制御されるプロモーター）であり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、プロモーターが見出される物理的状況に応じて、活性を駆動する又はしないことができる、空間的に制限されたプロモーターであり得る。空間的に制限されたプロモーターの非限定的な例には、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなどが含まれる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、プロモーターが見出される時間的状況に応じて発現を駆動する、時間的に制限されたプロモーターであり得る。例えば、時間的に制限されたプロモーターは、胚発生の特定の段階又は生物学的プロセスの特定の段階でのみ発現を駆動し得る。時間的に制限されたプロモーターの非限定的な例には、マウスの毛包サイクルプロモーターが含まれる。

【0055】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、多細胞生物において、プロモーターが特定の細胞のサブセットにおいてのみ発現を駆動するように、組織特異的である。例えば、組織特異的プロモーターには、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、平滑筋特異的プロモーター、光受容体特異的プロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。ニューロン特異的プロモーターは、例えば、末梢で、中枢神経系（ＣＮＳ）に直接投与される場合又はインビトロ、エクスビボ若しくはインビボを含み神経細胞に送達される場合、非神経細胞での発現と比較して、ニューロンにおいて作動可能に連結された異種核酸、例えば目的のタンパク質又はペプチド又はｓｈＲＮＡをコードするものの発現を優先的に駆動又は調節するプロモーターを指す。本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」及び「処置すること」という用語は、発作障害の進行、重症度及び／若しくは持続期間の部分的若しくは完全な低減若しくは回復又は１つ以上の療法の施行の結果として生じる発作障害の１つ以上の症状（好ましくは１つ以上の見分け可能な症状）の回復を指す。

【0056】

本明細書で互換可能に使用される「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」及び「調節エレメント」という用語は、非コード配列（例えば、短いヘアピンＲＮＡ）又はコード配列（例えば、ＰＧＲＮ）の転写を提供及び／又は調節し、且つ／又はコードされたポリペプチドの翻訳を調節する、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写及び翻訳制御配列を指す。

【0057】

具体的な実施形態では、「処置する」、「処置」及び「処置すること」という用語は、発作障害の少なくとも１つの測定可能な物理的パラメーター及び患者により必ずしも見分け可能とは限らないパラメーターの回復を指す。他の実施形態では、「処置する」、「処置」及び「処置すること」という用語は、発作障害の進行の阻害、例えば生理学的に、物理的パラメーターの安定化などにより又は両方により見分け可能な症状の安定化を指す。

【0058】

本明細書で用いられる「治療」は、処置を意味する。治療効果は、疾患状態又は症状の部分的又は完全な低減、抑制、寛解又は根絶により得られる。

【0059】

「トランスフェクト」又は「形質転換」又は「形質導入」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入又は導入されるプロセスを指す。「トランスフェクト」又は「形質転換」又は「形質導入」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換又は形質導入されたものである。細胞は、初代対象細胞及びその子孫を含む。

【0060】

「特異的に結合する」という用語は、サンプル中に存在する他の分子よりも優先的に結合パートナー（例えば、タンパク質又は核酸）を認識してそれに結合する分子を指す。

【0061】

範囲：本開示全体を通して、様々な態様は、範囲フォーマットで提示可能である。範囲フォーマットでの記載は、単に便宜上及び簡潔さを期したものにすぎないことが理解されるべきであり、本開示の範囲に対するインフレキシブルな限定として解釈されるべきではない。そのため、範囲の記載は、その範囲内の可能なサブ範囲及び個別数値を全て具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などのサブ範囲並びにその範囲内の個別数、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３及び６を具体的に開示したものとみなされるべきである。別の例として、９５～９９％の同一性などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するものを含むと共に、９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～９８％及び９８～９９％の同一性などのサブ範囲を含む。このことは、範囲の幅にかかわらず当てはまる。全ての具体的に示された範囲は、特に明記されない限り、端点も含む。

【0062】

「遺伝子編集系」又は「ゲノム編集系」という用語は、少なくともヌクレアーゼ（又はヌクレアーゼドメイン）並びにヌクレアーゼ（又はヌクレアーゼドメイン）により標的配列で核酸の改変（例えば、一本鎖切断又は二本鎖切断）を指令及び実施するのに必要且つ十分なプログラマブルヌクレオチド結合ドメインを含む１つ以上の分子の系を指す。実施形態では、遺伝子編集系はＣＲＩＳＰＲ系である。実施形態では、遺伝子編集系はジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系である。実施形態では、遺伝子編集系はＴＡＬＥＮ系である。実施形態では、遺伝子編集系はメガヌクレアーゼ系である。実施形態では、遺伝子編集系は、第１の標的、すなわちＳＣＮ１Ａの発現を改変する。実施形態では、遺伝子編集系は、本明細書に記載のテンプレート核酸をさらに含む。実施形態では、遺伝子編集系の１つ以上の成分は、前記１つ又は複数の成分をコードする核酸として細胞に導入され得る。理論に拘束されるものではないが、前記１つ又は複数の成分が発現されると、例えば細胞に遺伝子編集系が構成される。

【0063】

「配列特異的転写調節系」という用語は、少なくともＤＮＡ配列に特異的に結合する成分及び転写を調節する、例えば増加又は減少させる能力のある成分を含む１つ以上の分子の系を指す。例示的な系では、配列特異的転写調節系はゲノム編集系に由来し、例えばゲノム編集系の１つ以上の活性、例えば１つ以上のヌクレアーゼ活性は変更（例えば、消失）される。例示的な配列特異的転写調節系では、ＤＮＡ配列に特異的に結合する成分はジンクフィンガー分子である。例示的な配列特異的転写調節系では、ＤＮＡ配列に特異的に結合する成分はＴＡＬＥＮ分子である。例示的な配列特異的転写調節系では、ＤＮＡ配列に特異的に結合する成分はメガヌクレアーゼである。しかしながら、配列特異的分子の標的配列に結合するように操作可能ないずれの分子も、ＤＮＡ配列に特異的に結合する成分として有用であることは、わかるであろう。

【0064】

「ＣＲＩＳＰＲ系」、「Ｃａｓ系」又は「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」という用語は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子（又はそのような分子に由来する分子）及びガイドＲＮＡ分子を含み、一緒になってＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子による標的配列での核酸の改変を指令及び実施するのに必要且つ十分である分子セットを指す。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ガイドＲＮＡ分子及びＣａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質を含む。Ｃａｓ９又は改変Ｃａｓ９分子を含むそのような系は、本明細書では「Ｃａｓ９系」又は「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系」と呼ばれる。一例では、ガイドＲＮＡ分子及びＣａｓ分子は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するように複合体化され得る。いくつかの例では、エフェクター分子は、野生型分子の１つ以上の活性、例えば１つ以上のヌクレアーゼ活性などを変更するように改変され得る。

【0065】

「ガイドＲＮＡ」、「ガイドＲＮＡ分子」、「ｇＲＮＡ分子」又は「ｇＲＮＡ」という用語は、互換可能に使用され、標的配列へのＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子の特異的方向付けを（典型的にはｇＲＮＡ分子との複合体で）促進する核酸分子セットを指す。以下でより十分に説明されるように、ｇＲＮＡ分子はいくつかのドメインを有し得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、標的化ドメインを含むと共に、Ｃａｓ９などのＣａｓ分子又はＣｐｆ１などの別のＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼと相互作用する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡドメイン（標的化ドメインを含む）及びｔｒａｃｒ、例えばＣａｓ９などのＣａｓ分子と相互作用するためのものを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ結合の指令は、ＤＮＡへのｇＲＮＡの一部分のハイブリダイゼーションを介して（例えば、ｇＲＮＡ標的化ドメインを介して）及びＲＮＡ誘導ヌクレアーゼ又は他のエフェクター分子へのｇＲＮＡの一部分の結合により（例えば、少なくともｇＲＮＡ ｔｒａｃｒを介して）達成される。実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒは、本明細書では「シングルガイドＲＮＡ」、「ｓｇＲＮＡ」又は「単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」などと呼ばれる単一連続ポリヌクレオチド分子上に提供される。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒは、通常はハイブリダイゼーションを介してそれ自体で会合する能力のある、本明細書では「デュアルガイドＲＮＡ」、「ｄｇＲＮＡ」、「ダブル分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」などと呼ばれる別々のポリヌクレオチド分子上に提供される。ｄｇＲＮＡのいくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒは、非ヌクレオチド化学リンカーにより連結される。

【0066】

ｇＲＮＡと関連して本明細書で用いられる「標的化ドメイン」という用語は、標的配列、例えば細胞の核酸内の標的配列を認識する、例えばそれに相補的であるｇＲＮＡ分子の部分である。

【0067】

ｇＲＮＡ分子と関連して本明細書で用いられる「ｃｒＲＮＡ」という用語は、標的化ドメインを含むｇＲＮＡの一部分である。実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒと相互作用してフラグポール領域を形成する領域を含む。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡなしでＣａｓタンパク質（例えば、Ｃｐｆ１）などのＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼと直接相互作用可能である。

【0068】

「標的配列」という用語は、ｇＲＮＡ標的化ドメインに相補的な、例えば完全に相補的な核酸配列を指し、且つ配列特異的転写調節系のＤＮＡ結合成分により認識（例えば、結合）される核酸配列、例えばジンクフィンガーモチーフにより認識される配列又はＴＡＬＥＮ若しくはホーミングエンドヌクレアーゼにより認識される配列も指す。実施形態では、標的配列はゲノムＤＮＡ上に配設される。一実施形態では、特にＲＮＡ誘導エンドヌクレアーゼ系を含む実施形態では、標的配列は、ヌクレアーゼ活性又は他のエフェクター活性を有するタンパク質により認識されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（ＤＮＡの同一鎖上又は相補鎖上のいずれか）、例えばＣａｓ９により認識されるＰＡＭ配列に隣接する。ＰＡＭの配列及び長さは、使用されるＣａｓ９タンパク質に依存し得る。ＰＡＭ配列の非限定的な例には、５’－ＮＧＧ－３、５’－ＮＧＧＮＧ－３’、５’－ＮＧ－３’、５’－ＮＡＡＡＡＮ－３’、５’－ＮＮＡＡＡＡＷ－３’、５’－ＮＮＮＮＡＣＡ－３’、５’－ＧＮＮＮＣＮＮＡ－３’、５’－ＮＮＧＲＲＴ－３’、５’－ＮＮＧＲＲＮ－３’及び５’－ＮＮＮＮＧＡＴＴ－３’（式中、Ｎはいずれかのヌクレオチドを表し、ＲはＡ又はＧを表し、且つＷはＡ又はＴを表す）が含まれる。

【0069】

実施形態では、標的配列は、ＳＣＮ１Ａのエクソン配列内にある。他の実施形態では、標的配列は、ＳＣＮ１Ａのイントロン配列内にある。さらに他の実施形態では、標的配列は、ＳＣＮ１Ａ遺伝子に隣接する核酸領域にある。そのほかのさらなる実施形態では、標的配列は、ＳＣＮ１Ａのイントロン配列、ＳＣＮ１Ａのエクソン配列及びＳＣＮ１Ａに隣接する核酸領域の１つ以上にオーバーラップする。

【0070】

ｇＲＮＡ分子と関連して本明細書で用いられる「フラグポール」という用語は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒが互いに結合又はハイブリダイズするｇＲＮＡの部分を指す。

【0071】

ｇＲＮＡ分子と関連して本明細書で用いられる「ｔｒａｃｒ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ」という用語は、ヌクレアーゼ分子又は他のエフェクター分子に結合するｇＲＮＡの部分を指す。実施形態では、ｔｒａｃｒは、Ｃａｓ９に特異的に結合する核酸配列を含む。実施形態では、ｔｒａｃｒは、フラグポールの一部を形成する核酸配列を含む。

【0072】

「Ｃａｓ」という用語は、ガイドＲＮＡ分子と一緒になって標的配列での核酸の改変を指令及び実施するのに必要且つ十分なＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを指す。非限定的な一例は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からのＣａｓ分子、例えばＣａｓ９分子である。他の非限定的な一例は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系からのＣａｓ分子、例えばＣｐｆ１分子である。

【0073】

「Ｃａｓ９」及び「Ｃａｓ９分子」という用語は、ＤＮＡ切断に関与する細菌ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からの酵素を指す。実施形態では、Ｃａｓ９は、野生型タンパク質、変異体タンパク質（非触媒タンパク質を含む）及びそれらの機能的フラグメントも含む。Ｃａｓ９配列の非限定的な例は、当技術分野で公知であり、本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、いずれかのＣａｓ９配列、例えば当技術分野で公知の若しくは本明細書に開示される野生型、変異体、非触媒若しくは機能的フラグメントに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の相同性を含むか；いずれかのＣａｓ９配列と比較したときにアミノ酸残基の１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％若しくは４０％以下が異なるか；いずれかのＣａｓ９配列に対して少なくとも１、２、５、１０若しくは２０アミノ酸が異なるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０若しくは３０アミノ酸を超えないか；又はいずれかのＣａｓ９配列と同一である、Ｃａｓ９配列を指す。好ましい一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）から得られる。別の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、検出可能なヌクレアーゼ活性を有しない変異体タンパク質である。さらに別の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、転写アクチベーターに融合された変異体タンパク質である。

【0074】

「Ｃｐｆ１」及び「Ｃｐｆ１分子」という用語は、ＤＮＡ切断に関与する細菌Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からの酵素を指す。実施形態では、Ｃｐｆ１は、野生型タンパク質、変異体タンパク質（非触媒タンパク質を含む）及びそれらの機能的フラグメントも含む。Ｃｐｆ１配列の非限定的な例は、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、Ｃｐｆ１は、いずれかのＣｐｆ１配列、例えば当技術分野で公知の野生型、変異体、非触媒若しくはそれらの機能的フラグメントに対して少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の相同性を含むか；いずれかのＣｐｆ１と比較したときにアミノ酸残基の１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％若しくは４０％以下が異なるか；いずれかのＣｐｆ１に対して少なくとも１、２、５、１０若しくは２０アミノ酸が異なるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０若しくは３０アミノ酸を超えないか；又はいずれかのＣｐｆ１配列と同一である、Ｃｐｆ１配列を指す。他のＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）と異なり、Ｃｐｆ１は、活性に関してｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせず、ｃｒＲＮＡポリヌクレオチドのみでゲノム標的配列に結合してそれを切断することが可能である。したがって、標的配列を編集するためにＣｐｆ１を利用するいくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ部分を欠如し得る。核酸と関連して使用される「相補的」という用語は、塩基の対合、ＡとＴ又はＵ及びＧとＣを指す。相補的という用語は完全に相補的である、すなわち全参照配列にわたりＡ：Ｔ又はＵ対及びＧ：Ｃ対を形成する核酸分子並びに少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％相補的な分子も指し得る。

【0075】

「遺伝子」又は「遺伝子配列」という用語は、遺伝的配列、例えば核酸配列を指すものとみなされる。「遺伝子」という用語は、完全遺伝子配列又は部分遺伝子配列を包含することが意図される。「遺伝子」という用語は、タンパク質若しくはポリペプチドコードする配列又はタンパク質若しくはポリペプチドをコードしない配列、例えば調節配列、リーダー配列、シグナル配列、イントロン又は他の非タンパク質コーディング配列を指す。

【0076】

「イントロン」という用語は、前記遺伝子から発現されるタンパク質に対して非コーディングの遺伝子内核酸配列を指す。イントロン配列は、ＤＮＡからＲＮＡに転写され得るが、タンパク質が発現される前に除去され得る。

【0077】

「エクソン」という用語は、前記遺伝子から発現されるタンパク質をコードする遺伝子内核酸配列を指す。

【0078】

遺伝子編集系又は配列特異的転写調節系又はｇＲＮＡ分子と関連して使用されるときの「イントロン－エクソン接合部」という用語は、エクソンのヌクレオチド及びイントロンのヌクレオチドを含む配列を指す。例示的な実施形態では、イントロン－エクソン接合部はｇＲＮＡの標的配列であり、イントロン－エクソン接合部標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系により認識されたとき、前記ＣＲＩＳＰＲ系は、イントロンの２つのヌクレオチド間の標的配列又はその近くを改変する。他の例示的実施形態では、イントロン－エクソン接合部はｇＲＮＡの標的配列であり、イントロン－エクソン接合部標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系により認識されたとき、前記ＣＲＩＳＰＲ系は、エクソンの２つのヌクレオチド間の標的配列又はその近くを改変する。他の例示的実施形態では、イントロン－エクソン接合部はｇＲＮＡの標的配列であり、イントロン－エクソン接合部標的配列に相補的な標的化ドメインを含むｇＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ系により認識されたとき、前記ＣＲＩＳＰＲ系は、エクソンのヌクレオチド及びイントロンのヌクレオチド間の標的配列又はその近くを改変する。

【0079】

「ＡＡＶ」という用語は、アデノ随伴ウイルスに対する略号であり、ウイルス自体又はその誘導体を意味するように使用され得る。この用語は、全ての血清型、サブタイプ、天然に存在する形態及び組換え形態の両方を包含するが、他に要求される場合を除く。「ｒＡＡＶ」という略号は、組換えＡＡＶベクター（又は「ｒＡＡＶベクター」）とも呼ばれる組換えアデノ随伴ウイルスを指す。「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈｌＯ及びそれらのハイブリッド、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長動物ＡＡＶ、非霊長動物ＡＡＶ並びにヒツジＡＡＶを含む。ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列並びにネイティブ末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質及びキャプシドサブユニットの配列は、当技術分野で公知である。そのような配列は、文献又はＧｅｎＢａｎｋなどのパブリックデータベースに見出され得る。本明細書で用いられる「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源でないポリヌクレオチド配列（すなわちＡＡＶに対して異種のポリヌクレオチド）、典型的には細胞の遺伝的形質転換の目的の配列を含むＡＡＶベクターを指す。一般的には、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つ、一般に２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）により隣接される。ｒＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）又は自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。「ＡＡＶウイルス」又は「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質及びキャプシド被包ポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターで構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは、典型的には、「ｒＡＡＶベクター粒子」又は単に「ｒＡＡＶ粒子」と呼ばれる。そのため、そのようなベクターがｒＡＡＶ粒子内に含有されるため、ｒＡＡＶ粒子の産生は、必然的にｒＡＡＶベクターの産生を含む。

【0080】

本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」、「療法」などという用語は、疾患若しくは障害の進行の緩和、遅延若しくは緩徐化、疾患若しくは障害の予防、減衰、疾患若しくは障害の影響若しくは症状の低減、疾患若しくは障害の発症の防止、疾患若しくは障害の阻害又は疾患若しくは障害の発症の回復を指す。本開示の方法は、いずれかの哺乳動物で使用され得る。例示的な哺乳動物には、ラット、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ及びより好ましくはヒトが含まれるが、これらに限定されない。治療利益には、処置される基礎障害の根絶又は回復が含まれる。治療利益は、基礎障害に関連する生理学的症状の１つ以上の根絶又は回復の結果として、対象が依然として基礎障害を患っているおそれがあっても対象で改善が観測されることによっても達成される。いくつかの場合、疾患の診断が行われていないおそれがあっても、予防利益のために、治療剤は、特定の疾患を発症するリスクのある対象又は疾患の生理学的症状の１つ以上を報告する対象に投与され得る。本開示の方法は、いずれかの哺乳動物で使用され得る。いくつかの場合、処置は、症状の減少又は停止（例えば、発作の頻度、持続期間及び／又は重症度の低減）をもたらし得る。予防効果には、疾患若しくは病態の出現の遅延若しくは排除、疾患若しくは病態の症状の発症の遅延若しくは排除、疾患若しくは病態の進行の緩徐化、停止若しくは逆転又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。

【0081】

ヌクレオチド配列又はペプチド配列の「フラグメント」は、参照配列又は「全長」配列よりも短い配列を意味する。

【0082】

分子の「変異体」は、そのような配列のアレル変異、すなわち全分子又はそのフラグメントのいずれかに対して構造及び生物学的活性が実質的に類似した配列を指す。

【0083】

ＤＮＡ又はタンパク質配列の「機能的フラグメント」は、全長ＤＮＡ又はタンパク質配列の生物学的活性に実質的に類似した生物学的活性（機能又は構造のいずれか）を保持するフラグメントを指す。ＤＮＡ配列の生物学的活性は、全長配列に帰属される既知の方式で発現に影響を及ぼすその能力であり得る。

【0084】

「インビボ」という用語は、対象の身体内で起こるイベントを指す。

【0085】

「インビトロ」という用語は、対象の身体外で起こるイベントを指す。例えば、インビトロアッセイは、対象外で行われるいずれかのアッセイを包含する。インビトロアッセイは、生細胞又は死細胞が採用される細胞ベースアッセイを包含する。インビトロアッセイは、インタクト細胞が採用されない細胞フリーアッセイを包含する。

【0086】

一般的には、互換可能に使用可能な「配列同一性」又は「配列相同性」は、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列のそれぞれの厳密ヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸対応を指す。典型的には、配列同一性を決定するための技術は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列を比較してそれらのパーセント同一性決定することを含む。同一性を評価する目的などでの配列比較は、限定されるものではないが、ニードルマン・ブンシュアルゴリズム（例えば、任意選択によりデフォルト設定を用いてｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／で利用可能なＥＭＢＯＳＳ Ｎｅｅｄｌｅアライナーを参照されたい）、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（例えば、任意選択によりデフォルト設定を用いてｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで利用可能なＢＬＡＳＴアライメントツールを参照されたい）及びスミス・ウォーターマンアルゴリズム（例えば、任意選択によりデフォルト設定を用いてｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｗａｔｅｒ／で利用可能なＥＭＢＯＳＳ Ｗａｔｅｒアライナーを参照されたい）をはじめとする任意の適切なアライメントアルゴリズムにより実施され得る。最適アライメントは、デフォルトパラメーターを含めて、選ばれたアルゴリズムの任意の適切なパラメーターを用いて評価され得る。２つの配列間の「パーセント相同性」とも呼ばれる「パーセント同一性」は、２つの最適にアラインされた配列間の厳密適合の数を参照配列の長さで除算し１００を乗算して計算され得る。パーセント同一性は、例えば、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から入手可能なバージョン２．２．９を含む最新ＢＬＡＳＴコンピュータープログラムを用いて配列情報を比較することによっても決定され得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８（１９９０）のアライメント方法に基づき、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）；Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７（１９９３）；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）で考察される通りである。簡潔に述べると、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一アライン記号（すなわちヌクレオチド又はアミノ酸）の数を２つの配列の短い方の記号の合計数で除算して同一性を定義する。プログラムは、比較される配列の全長にわたりパーセント同一性を決定するために使用され得る。デフォルトパラメーターは、例えばｂｌａｓｔｐプログラムを用いて、ショートクエリー配列での検索を最適化するために提供される。プログラムは、Ｗｏｏｔｔｏｎ ａｎｄ Ｆｅｄｅｒｈｅｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１４９－１６３（１９９３）のＳＥＧプログラムにより決定されるクエリー配列のセグメントをマスキングして除外するためにＳＥＧフィルターの使用も許容する。高い配列同一性は、一般におよそ８０％～１００％の配列同一性の範囲及びそれらの間に整数値を含む。［０１０３］本明細書で使用される場合、タンパク質に関連する「操作」は、限定されるものではないが、天然に存在するタンパク質に由来するタンパク質又は特定の性質を有するように天然に存在するタンパク質が改変若しくは再プログラムされたものを含めて天然に存在しないタンパク質を意味する。

【0087】

本明細書で使用される場合、「合成」及び」人工」は、天然に存在するヒトタンパク質に対して低い配列同一性（例えば、５０％未満の配列同一性）を有するタンパク質又はそのドメインを意味するように互換可能に使用される。

【0088】

本明細書で使用される場合、「転写因子」又は「ＴＦ」は、特異的標的結合部位に結合するように及び／又は改変若しくは置換え転写エフェクタードメインを含むように改変又は再プログラムされたＤＮＡ結合タンパク質又は天然に存在しない転写調節剤と呼ばれる。

【0089】

本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ結合ドメイン」は、ＤＮＡ結合タンパク質の一部として個別に又は総称して、Ｃａｓ分子、転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクター、ジンクフィンガータンパク質、塩基性ヘリックス－ループ－ヘリックス（ｂＨＬＨ）モチーフなどの１つ以上のＤＮＡ結合モチーフを指すために使用可能である。

【0090】

「転写活性化ドメイン」、「転写性活性化ドメイン」、「トランス活性化ドメイン」、「トランス活性化性ドメイン」及び「ＴＡＤ」という用語は、本明細書では互換可能に使用され、ＤＮＡ結合ドメインと連携して、直接又はコアクチベーターとして知られる他のタンパク質を介してのいずれかで転写性機構（例えば、一般的転写因子及び／又はＲＮＡポリメラーゼ）に接触させることによりプロモーターからの転写を活性化可能なタンパク質のドメインを指す。「Ｑに富むＴＡＤ」は、富グルタミントランス活性化ドメインを意味する。「Ｐに富むＴＡＤ」は、富プロリントランス活性化ドメインを意味する。「酸性ＴＡＤ」は、酸性アミノ酸に富んだトランス活性化ドメインを意味する。

【0091】

転写因子
転写因子（ＴＦ）は、ゲノムの特異的配列に結合して遺伝子の発現を制御するタンパク質である。本開示は、ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）及び少なくとも３つの転写性活性化ドメイン（ＴＡＤ）を含む新規操作転写因子を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＡＤは同一であり得る。いくつかの実施形態では、ＴＡＤは異なり得る。

【0092】

様々なタンパク質内に見出される転写性活性化ドメインは、類似の構造上の特徴に基づいてカテゴリーに分類されてきた。本出願で使用可能な転写活性化ドメインのタイプには、酸性転写活性化ドメイン、富プロリン（富Ｐ）転写活性化ドメイン及び富グルタミン（富Ｑ）転写活性化ドメイン並びに／又はそれらのフラグメントが含まれる。酸性転写性活性化ドメインの例には、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ７、ＡＴＦ６、ＴＦＥ３、ＡＴＦ６－１１又はそれらのフラグメントが含まれる。富プロリン活性化ドメインの例には、ＴＦＡＰ２－Ｐ、Ｏｃｔ２－Ｐ又はそれらのフラグメントが含まれる。富グルタミン活性化ドメインの例には、アミノ酸残基Ｏｃｔ２－Ｑ、ＳＰ１－Ｑ１又はそれらのフラグメントが含まれる。以上に記載の領域の各々のアミノ酸配列は、本出願の表１に開示される。

【0093】

特定の実施形態では、ＴＡＤは、ｉ）少なくとも１つの酸性ＴＡＤ及び少なくとも１つのＱに富むＴＡＤ、又はｉｉ）少なくとも１つの酸性ＴＡＤ及び少なくとも１つのＰに富むＴＡＤを含む。

【0094】

いくつかの実施形態では、酸性ＴＡＤは、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ７、ＡＴＦ６、ＴＦＥ３、ＡＴＦ６－１１又はそれらのフラグメントから選択されるＴＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、Ｑに富むＴＡＤは、Ｏｃｔ２－Ｑ、ＳＰ１－Ｑ１又はそれらのフラグメントから選択されるＴＡＤの１つ以上のコピーを含む。いくつかの実施形態では、Ｐに富むＴＡＤは、ＴＦＡＰ２－Ｐ、Ｏｃｔ２－Ｐ又はそれらのフラグメントから選択されるＴＡＤの１つ以上のコピーを含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、ＴＡＤは、全長ＶＰ６４、ＶＰ１６の１つ又は複数のリピート、全長又は部分ｐ６５、全長ＲＴＡ、全長ＶＰ７、全長又は部分ＴＥＦ３、全長又は部分ＡＴＦ６－１１、全長又は部分ＡＴＦ６酸性、全長又は部分ＳＰ１富Ｑ、全長又は部分Ｏｃｔ２富Ｑ、全長又は部分Ｏｃｔ２富Ｐ、全長又は部分ＴＦＡＰ２富Ｐ、ＶＰ６４の活性フラグメント、ｐ６５の転写活性フラグメント、ＲＴＡの転写活性フラグメント、ＶＰ７の活性フラグメント、ＴＥＦ３の活性フラグメント、ＡＴＦ６－１１の活性フラグメント、ＡＴＦ６酸性の活性フラグメント、ＳＰ１富Ｑの活性フラグメント、Ｏｃｔ２富Ｑの活性フラグメント、Ｏｃｔ２富Ｐの活性フラグメント、ＴＦＡＰ２富Ｐの活性フラグメント及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。

【0096】

いくつかの実施形態では、少なくとも３つのＴＡＤの合計長は、２０００ａａ未満、１５００ａａ未満、１０００ａａ未満、７５０ａａ未満、５００ａａ未満、３００ａａ未満、２５０ａａ未満、２００ａａ未満又は１５０ａａ未満である。

【0097】

いくつかの実施形態では、転写因子は、配列番号１～２８の配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。特定の実施形態では、転写因子は、配列番号１～１８のいずれか１つを有する配列を含む。

【0098】

いくつかの実施形態では、転写因子をコードする核酸配列は、配列番号３０～４７の配列又はそれに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％若しくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。

【0099】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、リンカーを用いて又は用いることなく、転写因子のいずれか１つの転写因子に連結される。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写因子のＮ末端に直接又はリンカーを介して連結される。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、転写因子のＣ末端に直接又はリンカーを介して連結される。

【0100】

いくつかの実施形態では、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、７５、８０、９０若しくは１００アミノ酸又は１～５、１～１０、１～２０、１～３０、１～４０、１～５０、１～７５、１～１００、５～１０、５～２０、５～３０、５～４０、５～５０、５～７５、５～１００、１０－２０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～７５、１０～１００、２０～３０、２０～４０、２０～５０、２０～７５若しくは２０～１００アミノ酸を有する。

【0101】

適切なリンカーは、フレキシブル、切断、非切断、親水性及び／又は疎水性であり得る。特定の実施形態では、リンカーは、複数のグリシン及び／又はセリン残基を含む。グリシン／セリンペプチドリンカーの例としては、［ＧＳ］ｎ、［ＧＧＧＳ］ｎ（配列番号７４）、［ＧＧＧＧＳ］ｎ（配列番号７５）、［ＧＧＳＧ］ｎ（配列番号７６）（式中、ｎは、１以上の整数である）が挙げられる。特定の実施形態では、リンカーは、ＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号５９）又はＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号６０）を含むか又はそれからなる。

【0102】

以下の表１は、転写活性化ドメインの配列を提供する。

【0103】

【表1】

【0104】

【表2】

【0105】

【表3】

【0106】

【表4】

【0107】

【表5】

【0108】

【表6】

【0109】

【表7】

【0110】

【表8】

【0111】

【表9】

【0112】

【表10】

【0113】

【表11】

【0114】

【表12】

【0115】

【表13】

【0116】

【表14】

【0117】

【表15】

【0118】

【表16】

【0119】

【表17】

【0120】

【表18】

【0121】

【表19】

【0122】

ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）
本明細書に提供される転写因子は、目的の標的部位（例えば、本明細書に提供される転写因子が結合したときに標的遺伝子のアップレギュレーションをもたらす標的部位）に結合する任意の適切なＤＢＤを含む。

【0123】

ＴＡＬＥＮ
いくつかの実施形態では、ＤＢＤはＴＡＬＥＮであり得る。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメインに融合させることにより人工的に産生される。転写アクチベーター様効果（ＴＡＬＥ）は、いずれかの所望のＤＮＡ配列に結合するように操作可能である。次いで、これらを細胞に導入可能であり、そこでそれらをゲノム編集に使用可能である。Ｂｏｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１３５－６（２０１１）；及びＢｏｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：１５０９－１２（２００９）；Ｍｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６：３５０１（２００９）。

【0124】

ＴＡＬＥは、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）細菌により分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、繰返し高度保存３３～３４アミノ酸配列を含有するが、１２番目及び１３番目のアミノ酸は例外である。これらの２つの位置は高度に可変であり、特異的ヌクレオチド認識との強い相関を示す。そのため、それらは所望のＤＮＡ配列に結合するように操作可能である。

【0125】

本明細書に記載の配列に特異的なＴＡＬＥは、モジュラー成分を用いた様々なスキームを含めて、当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて構築可能である。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２９：１４９－５３（２０１１）；Ｇｅｉｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６：ｅ１９５０９（２０１１）；米国特許第８，４２０，７８２号明細書；米国特許第８，４７０，９７３号明細書（それらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）。

【0126】

ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集系
いくつかの実施形態では、ＤＢＤはｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体であり得る。

【0127】

以下でより十分に記載されるように、ｇＲＮＡ分子はいくつかのドメインを有し得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、標的化ドメインを含むと共にＣａｓ９などのＣａｓ分子と相互作用する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡドメイン（標的化ドメインを含む）及びｔｒａｃｒを含む。実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒは、単一連続ポリヌクレオチド分子上に提供される。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒは、非共有結合ハイブリダイゼーションなどを介してそれ自体で会合する能力のある別々のポリヌクレオチド分子上に提供される。ＣＲＩＳＰＲ系の成分として使用されるｇＲＮＡ分子は、標的部位又はその近くのＤＮＡを改変する（例えば、配列を改変する）のに有用である。そのような改変は、例えば、標的部位を含む遺伝子の機能性産物の発現の低減又は排除をもたらす挿入及び又は欠失を含む。そのような改変は、例えば、Ｃａｓ９分子がヌクレアーゼ活性を欠如するが１つ以上の転写因子に融合された場合、標的部位を含む遺伝子の機能性産物の発現のアップレギュレーションも含み得る。いくつかの実施形態では、標的部位を含む遺伝子の機能性産物の発現をアップレギュレーションするために、別々のｇＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲ系が使用される。これらの使用などは、以下でより十分に記載される。

【0128】

一実施形態では、単分子状又はｓｇＲＮＡは、好ましくは５’→３’方向に：ｃｒＲＮＡ（標的配列に相補的な標的化ドメイン及びフラグポールの一部を形成する領域（すなわちｃｒＲＮＡフラグポール領域）を含む）；任意選択によりループ；及びｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡフラグポール領域に相補的なドメイン及びヌクレアーゼ分子又は他のエフェクター分子、例えばＣａｓ９分子などのＣａｓ分子に追加的に結合するドメインを含む）を含み、以下のフォーマット（５’→３’方向に）：
［標的化ドメイン］－［ｃｒＲＮＡフラグポール領域］－［任意の第１のフラグポール延長］－［任意のループ］－［任意の第１のｔｒａｃｒ延長］－［ｔｒａｃｒフラグポール領域］－［ｔｒａｃｒヌクレアーゼ結合ドメイン］
をとり得る。実施形態では、ｔｒａｃｒヌクレアーゼ結合ドメインは、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質に結合する。

【0129】

一実施形態では、二分子状又はｄｇＲＮＡは、２つのポリヌクレオチド；第１に好ましくは５’→３’方向に：ｃｒＲＮＡ（標的配列に相補的な標的化ドメイン及びフラグポールの一部を形成する領域を含有する）；及び第２に好ましくは５’→３’方向に：ｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡフラグポール領域に相補的なドメイン及びヌクレアーゼ分子又は他のエフェクター分子、例えばＣａｓ９分子などのＣａｓ分子に追加的に結合するドメインを含有する）を含み、以下のフォーマット（５’→３’方向に）：
ポリヌクレオチド１（ｃｒＲＮＡ）：［標的化ドメイン］－［ｃｒＲＮＡフラグポール領域］－［任意の第１のフラグポール延長］－［任意の第２のフラグポール延長］
ポリヌクレオチド２（ｔｒａｃｒ）：［任意の第１のｔｒａｃｒ延長］－［ｔｒａｃｒフラグポール領域］－［ｔｒａｃｒヌクレアーゼ結合ドメイン］
をとり得る。

【0130】

実施形態では、ｄｇＲＮＡは、例えば、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １７：１８０９－１８１２（２０１６）に記載のように、非ヌクレオチドリンカーにより共有結合で連結された２つのポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、化学反応は、例えば、銅（Ｉ）触媒アルキン－アジド環化付加（ＣｕＡＡＣ）反応を用いて（Ｈｅ ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ １７：１８０９－１８１２（２０１６）を参照されたい）又は歪み促進アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）を介して（米国特許出願公開第２０１６／０２１５２７５Ａ１号明細書を参照されたい）（いずれもその全体が参照により本明細書に組み込まれる）、２つのポリヌクレオチドを連結するために使用される。別の実施形態では、２つのポリヌクレオチドは、例えば、チオール及びマレイミド官能基間の反応により又は他の官能基間の反応により（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２１５２７５Ａ１号明細書を参照されたい）発生可能なチオ－エーテルリンカーを介して共有結合で連結される。さらに他の実施形態では、非ヌクレオチドリンカーは、カルバメート、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドロゾン、ジスルフィド、チオエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、スルホンアミド、スルホネート、スルホン、スルホキシド、ウレア、チオウレア、ヒドラジド、オキシム、光不安定性連結或いはＣ－Ｃ結合形成基、例えばディールズ・アルダー環化付加対及び／若しくは閉環メタセシス対並びに／又はマイケル反応対（国際公開第２０１６／１８７４５Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）を含むことが可能である。

【0131】

いくつかの態様では、フラグポール、例えばｃｒＲＮＡフラグポール領域は、５’→３’方向に：ＡＧＵＡＣＵＣＵＧを含む。

【0132】

いくつかの態様では、ループは、５’→３’方向に：ＧＡＡＡを含む。

【0133】

いくつかの態様では、ｔｒａｃｒは、５’→３’方向に：ＡＧＵＡＣＵＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＵＣＵＡＣＵＣＵＡＡＣＡＡＧＧＣＡＡＡＡＵＧＣＣＧＵＧＵＵＵＡＵＣＵＣＧＵＣＡＡＣＵＵＧＵＵＧＧＣＧＡＧＡＵＵＵＵＵ（配列番号７９）を含む。

【0134】

いくつかの態様では、ｇＲＮＡは、３’末端に追加のＵ核酸も含み得る。例えば、ｇＲＮＡは、３’末端に追加の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０Ｕ核酸を含み得る。一実施形態では、ｇＲＮＡは、３’末端に追加の４～５Ｕ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチドの１つ以上（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）は、３’末端に追加のＵ核酸を含み得る。例えば、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチドの１つ以上（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）は、３’末端に追加の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０Ｕ核酸を含み得る。一実施形態では、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチドの１つ以上（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）は、３’末端に追加の４～５Ｕ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの一実施形態では、ｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドのみが追加のＵ核酸、例えば４～５Ｕ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの一実施形態では、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドのみが追加のＵ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの一実施形態では、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドは、両方とも追加のＵ核酸、例えば４～５Ｕ核酸を含む。

【0135】

いくつかの態様では、ｇＲＮＡは、３’末端に追加のＡ核酸も含み得る。例えば、ｇＲＮＡは、３’末端に追加の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０Ａ核酸を含み得る。一実施形態では、ｇＲＮＡは、３’末端に追加の４Ａ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチドの１つ以上（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）は、３’末端に追加のＡ核酸を含み得る。例えば、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチドの１つ以上（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）は、３’末端に追加の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０Ａ核酸を含み得る。一実施形態では、ｄｇＲＮＡの場合、ｄｇＲＮＡのポリヌクレオチドの１つ以上（例えば、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチド）は、３’末端に追加の４Ａ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの一実施形態では、ｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドのみが追加のＡ核酸、例えば４Ａ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの一実施形態では、標的化ドメインを含むポリヌクレオチドのみが追加のＡ核酸を含む。ｄｇＲＮＡの一実施形態では、標的化ドメインを含むポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒを含むポリヌクレオチドは、両方とも追加のＵ核酸、例えば４Ａ核酸を含む。

【0136】

実施形態では、ｇＲＮＡ分子のポリヌクレオチドの１つ以上は、５’末端にキャップを含み得る。

【0137】

一実施形態では、単分子状又はｓｇＲＮＡは、好ましくは５’→３’方向に：ｃｒＲＮＡ（標的配列に相補的な標的化ドメイン；ｃｒＲＮＡフラグポール領域；第１のフラグポール延長）；ループ；第１のｔｒａｃｒ延長（第１のフラグポール延長の少なくとも一部分に相補的なドメインを含有する）；及びｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡフラグポール領域に相補的なドメイン及びＣａｓ９分子に追加的に結合するドメインを含有する）を含む。いくつかの態様では、標的化ドメインは、本明細書に記載の標的化ドメイン配列を含むか、又は標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０（好ましくは２０）連続ヌクレオチド、例えば標的化ドメイン配列の３’側の１７、１８、１９若しくは２０（好ましくは２０）連続ヌクレオチドを含む若しくはそれからなる標的化ドメインを含む。実施形態では、標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０（好ましくは２０）連続ヌクレオチドは、標的化ドメイン配列の３’側の１７、１８、１９、２０（好ましくは２０）連続ヌクレオチドである。実施形態では、標的化ドメイン配列の１７、１８、１９、２０（好ましくは２０）連続ヌクレオチドは、標的化ドメイン配列の５’側の１７、１８、１９、２０（好ましくは２０）連続ヌクレオチドである。

【0138】

第１のフラグポール延長及び／又は第１のｔｒａｃｒ延長を含む態様では、フラグポール、ループ及びｔｒａｃｒ配列は、以上に記載の通りであり得る。一般的には、いずれの第１のフラグポール延長及び第１のｔｒａｃｒ延長も、それらが相補的である限り、採用され得る。実施形態では、第１のフラグポール延長及び第１のｔｒａｃｒ延長は、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれを超える相補的ヌクレオチドからなる。

【0139】

いくつかの態様では、第１のフラグポール延長は、５’→３’方向に：ＵＧＣＵＧを含む。いくつかの態様では、第１のフラグポール延長は、配列番号８０からなる。

【0140】

いくつかの態様では、第１のｔｒａｃｒ延長は、５’→３’方向に：ＣＡＧＣＡを含む。いくつかの態様では、第１のｔｒａｃｒ延長は、配列番号８１からなる。

【0141】

一実施形態では、ｄｇＲＮＡは２つの核酸分子を含む。いくつかの態様では、ｄｇＲＮＡは、好ましくは５’→３’方向に：標的配列に相補的な標的化ドメイン；ｃｒＲＮＡフラグポール領域；任意選択により第１のフラグポール延長；及び任意選択により第２のフラグポール延長を含有する第１の核酸；並びに好ましくは５’→３’方向に：任意選択により第１のｔｒａｃｒ延長；及びｔｒａｃｒ（ｃｒＲＮＡフラグポール領域に相補的なドメイン及びＣａｓ９などのＣａｓ分子に追加的に結合するドメインを含有する）を含む第２の核酸（本明細書ではｔｒａｃｒとも呼ばれ得ると共に、少なくともＣａｓ９分子などのＣａｓ分子に結合するドメインを含む）を含む。第２の核酸は、３’末端（例えば、ｔｒａｃｒの３’側）に追加のＵ核酸を追加的に含み得る。例えば、ｔｒａｃｒは、３’末端（例えば、ｔｒａｃｒの３’側）に追加の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０Ｕ核酸を含み得る。第２の核酸は、追加的又は代替的に３’末端（例えば、ｔｒａｃｒの３’側）に追加のＡ核酸を含み得る。例えば、ｔｒａｃｒは、３’末端（例えば、ｔｒａｃｒの３’側）に追加の１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０Ａ核酸を含み得る。

【0142】

ｄｇＲＮＡが関与する態様では、ｃｒＲＮＡフラグポール領域、任意の第１のフラグポール延長、任意の第１のｔｒａｃｒ延長及びｔｒａｃｒ配列は、以上に記載の通りであり得る。

【0143】

いくつかの態様では、任意の第２のフラグポール延長は、５’→３’方向に：ＵＵＵＵＧを含む。実施形態では、ｇＲＮＡ分子の３’側の１、２、３、４若しくは５ヌクレオチド、５’側の１、２、３、４若しくは５ヌクレオチド又は３’側及び５’側の両方の１、２、３、４若しくは５ヌクレオチド（及びｄｇＲＮＡ分子の場合、標的化ドメインを構成するポリヌクレオチド及び／又はｔｒａｃｒを構成するポリヌクレオチド）は、以下でより十分に記載されるように改変核酸である。

【0144】

ドメインについては以下で簡潔に考察される。

【0145】

標的化ドメインの選択に関するガイダンスは、例えば、Ｆｕ Ｙ ｅｌ ａｌ．ＮＡＴ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ （ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８０８）（２０１４）ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ＳＨ ｅｌ ａｌ．ＮＡＴＵＲＥ（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅｌ３０１１）（２０１４）に見出され得る。

【0146】

標的化ドメインは、標的核酸上の標的配列に対して相補的な、例えば少なくとも８０、８５、９０、９５若しくは９９％相補的であるか又は例えば完全に相補的なヌクレオチド配列を含む。標的化ドメインは、ＲＮＡ分子の一部であり、したがって塩基ウラシル（Ｕ）を含むであろうが、ｇＲＮＡ分子をコードするいずれかのＤＮＡは、塩基チミン（Ｔ）を含むであろう。理論に拘束されることを望むものではないが、標的配列との標的化ドメインの相補性は、標的核酸とのｇＲＮＡ分子／Ｃａｓ９分子複合体の相互作用の特異性に寄与すると考えられる。標的化ドメイン及び標的配列対では、標的化ドメイン中のウラシル塩基は、標的配列中のアデニン塩基に対合するものと理解される。

【0147】

一実施形態では、標的化ドメインは、５～５０、例えば１０～４０、例えば１０～３０、例えば１５～３０、例えば１５～２５ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは１６ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは１７ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは１８ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは１９ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは２０ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは２１ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは２２ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは２３ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは２４ヌクレオチド長である。一実施形態では、標的化ドメインは２５ヌクレオチド長である。実施形態では、前述の１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドは、表２に記載の標的化ドメインからの５’側の１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドを含む。実施形態では、前述の１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドは、標的化ドメインからの３’側の１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドを含む。実施形態では、前述の１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドは、標的化ドメインからの３’側の１６、１７、１８、１９又は２０ヌクレオチドからなる。

【0148】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ複合体中のＣａｓ分子は、クラス１Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ分子は、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼである。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２－３６（２０１５）；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照されたい。クラス２Ｃａｓ分子は、単一タンパク質のエンドヌクレアーゼであり得る。いくつかの実施形態では、クラス２Ｃａｓ分子は、ＩＩ、Ｖ又はＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系からのものであり、単一タンパク質エンドヌクレアーゼであり得る。クラス２Ｃａｓ分子の非限定的な例としては、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２及びＣ２ｃ３タンパク質が挙げられる。例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，１６７（７）：１８１４－２８（２０１６）；Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５）を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ分子は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である。

【0149】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ分子は、Ｃａｓ９分子又はそのフラグメント又は変異体、例えば非触媒変異体である。本明細書に記載の方法及び組成物では、様々な種のＣａｓ９分子を使用可能である。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子は、本明細書の開示の多くの主題であるが、本明細書に列挙される他の種のＣａｓ９タンパク質に由来する又はそれに基づくＣａｓ９分子も同様に使用可能である。言い換えると、本明細書に記載の系、方法及び組成物では、他のＣａｓ９分子、例えばＳ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、スタフィロコッカス・ピロゲネス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）及び／又はナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）Ｃａｓ９分子が使用され得る。

【0150】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９分子は、非特異的ＤＮＡ接触を低減するように設計された変更を保持する高忠実度変異体である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５２９（７５８７）：４９０－９５（２０１６）；Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５１（６２６８）：８４－８８（２０１６）；Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：５６９－５７７（２０１４）を参照されたい。いくつかの実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓ９に匹敵するオンターゲット活性を保持する。いくつかの実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９は、例えば、ゲノムワイド切断キャプチャー及び標的化配列決定法により測定したとき、野生型Ｃａｓ９と比較してオフターゲット活性を少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％低減する。いくつかの実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９は、ゲノムワイド切断キャプチャー及び標的化配列決定法により測定したとき、オフターゲット活性を検出不能にする。いくつかの実施形態では、高忠実度Ｃａｓ９は、ストレプトコッカス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９である。

【0151】

追加のＣａｓ９種には、アシドボラックス・アベネ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アクチノバチルス・スクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ）、アクチノマイセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）種、アリシクリフィルス・デニトリフィカンス（ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚ’ｏｂｉｕｍ）種、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｍｓｐｏｒｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｄ）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコチイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｌｉｉｂａｅ）、ユウバクテリウム・ドリクム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア綱（ｇａｍｍａ ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトラム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｒｕｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シネディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｌｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンガエ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌、メチロシスチス科（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）種、メチロシナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベッセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）種及びパルビバクラム・ラバメンチボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラークトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム属（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ）種、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）種、スポロラクトバチルス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、サブドリグラヌルム属（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ）種、チストレラ・モビリス（Ｔｉｓｌｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）種又はベルミネフロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）が含まれる。

【0152】

Ｃａｓ９分子は、その用語が本明細書で使用される場合、ｇＲＮＡ分子（例えば、ｔｒａｃｒのドメインの配列）と相互作用可能であると共に、ｇＲＮＡ分子と協奏的に、標的配列及びＰＡＭ配列を含む部位に局在化する（例えば、それを標的とする又はそれにホーミングする）分子を意味する。

【0153】

一実施形態では、標的核酸と相互作用する活性Ｃａｓ９分子の能力は、ＰＡＭ配列依存性である。ＰＡＭ配列は、標的核酸中の配列である。異なる細菌種からの活性Ｃａｓ９分子は、異なる配列モチーフ（例えば、ＰＡＭ配列）を認識可能である。一実施形態では、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子は、配列モチーフＮＧＲＲ（Ｒ＝Ａ又はＧ）を認識すると共に、その配列から上流に１～１０、例えば３～５塩基対の標的核酸配列の切断を指令する。例えば、Ｒａｎ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ５２０：１８６－１９１（２０１５）を参照されたい。ＰＡＭ配列を認識するＣａｓ９分子の能力は、例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ，ＳＣＩＥＮＣＥ ３３７：８１６（２０１２）に記載の形質転換アッセイを用いて決定可能である。いくつかのＣａｓ９分子は、ｇＲＮＡ分子と相互作用すると共にｇＲＮＡ分子と連携してコア標的ドメインにホーミングする（例えば、それを標的とする又はそれに局在化する）能力を有するが、標的核酸を切断する能力がないか又は効率的速度で切断する能力がない。切断活性を有しないか又は実質的に有しないＣａｓ９分子は、本明細書では、非活性Ｃａｓ９（酵素的非活性Ｃａｓ９）、デッドＣａｓ９又はｄＣａｓ９分子と呼ばれることがある。例えば、非活性Ｃａｓ９分子は、切断活性を欠如し得るか、又は本明細書に記載のアッセイにより測定したとき、参照Ｃａｓ９分子よりも実質的に低い、例えばその２０、１０、５１若しくは０．１％未満の切断活性を有し得る。

【0154】

本明細書に提供される方法で使用され得る例示的な天然に存在するＣａｓ９分子は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０（５）：７２７－７３７（２０１３）に記載されている。そのようなＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌科、クラスター２細菌科、クラスター３細菌科、クラスター４細菌科、クラスター５細菌科、クラスター６細菌科、クラスター７細菌科、クラスター８細菌科、クラスター９細菌科、クラスター１０細菌科、クラスター１１細菌科、クラスター１２細菌科、クラスター１３細菌科、クラスター１４細菌科、クラスター１細菌科、クラスター１６細菌科、クラスター１７細菌科、クラスター１８細菌科、クラスター１９細菌科、クラスター２０細菌科、クラスター２１細菌科、クラスター２２細菌科、クラスター２３細菌科、クラスター２４細菌科、クラスター２５細菌科、クラスター２６細菌科、クラスター２７細菌科、クラスター２８細菌科、クラスター２９細菌科、クラスター３０細菌科、クラスター３１細菌科、クラスター３２細菌科、クラスター３３細菌科、クラスター３４細菌科、クラスター３５細菌科、クラスター３６細菌科、クラスター３７細菌科、クラスター３８細菌科、クラスター３９細菌科、クラスター４０細菌科、クラスター４１細菌科、クラスター４２細菌科、クラスター４３細菌科、クラスター４４細菌科、クラスター４５細菌科、クラスター４６細菌科、クラスター４７細菌科、クラスター４８細菌科、クラスター４９細菌科、クラスター５０細菌科、クラスター５１細菌科、クラスター５２細菌科、クラスター５３細菌科、クラスター５４細菌科、クラスター５５細菌科、クラスター５６細菌科、クラスター５７細菌科、クラスター５８細菌科、クラスター５９細菌科、クラスター６０細菌科、クラスター６１細菌科、クラスター６２細菌科、クラスター６３細菌科、クラスター６４細菌科、クラスター６５細菌科、クラスター６６細菌科、クラスター６７細菌科、クラスター６８細菌科、クラスター６９細菌科、クラスター７０細菌科、クラスター７１細菌科、クラスター７２細菌科、クラスター７３細菌科、クラスター７４細菌科、クラスター７５細菌科、クラスター７６細菌科、クラスター７７細菌科又はクラスター７８細菌科のＣａｓ９分子が挙げられる。

【0155】

例示的な天然に存在するＣａｓ９分子としては、クラスター１細菌科のＣａｓ９分子が挙げられる。例としては、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（例えば、株ＳＦ３７０、ＭＧＡＳ１０２７０、ＭＧＡＳ１０７５０、ＭＧＡＳ２０９６、ＭＧＡＳ３１５、ＭＧＡＳ５００５、ＭＧＡＳ６１８０、ＭＧＡＳ９４２９、ＮＺ１３１及びＳＳＩ－１）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（例えば、株ＬＭＤ－９）、Ｓ．シュードポルシナス（Ｓ．ｐｓｅｕｄｏｐｏｒｃｉｎｕｓ）（例えば、株ＳＰＩＮ２００２６）、Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）（例えば、株ＵＡ１５９、ＮＮ２０２５）、Ｓ．マカケ（Ｓ．ｍａｃａｃａｅ）（例えば、株ＮＣＴＣ１１５５８）、Ｓ．ガロリリカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｌｉｃｕｓ）（例えば、株ＵＣＮ３４、ＡＴＣＣ ＢＡＡ－２０６９）、Ｓ．エキネス（Ｓ．ｅｑｕｉｎｅｓ）（例えば、株ＡＴＣＣ９８１２、ＭＧＣＳ１２４）、Ｓ．ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｄａｌａｃｔｉａｅ）（例えば、株ＧＧＳ１２４）、Ｓ．ボビス（Ｓ．ｂｏｖｉｓ）（例えば、株ＡＴＣＣ７００３３８）、Ｓ．アンギノサス（ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（例えば、株Ｆ０２１１）、Ｓ．アガラクティア（ａｇａｌａｃｔｉａ）（例えば、株ＮＥＭ３１６、Ａ９０９）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（例えば、株Ｆ６８５４）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）（例えば、株Ｃｌｉｐ１１２６２）、エンテロコッカス・イタリカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｉｔａｌｉｃｕｓ）（例えば、株ＤＳＭ１５９５２）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）（例えば、株１，２３１、４０８）、Ｃ．ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｅ）又はデルタプロテオバクテリア綱（Ｄｅｌｔａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）（Ｄｂｐ）のＣａｓ９分子が挙げられる。追加の例示的なＣａｓ９分子は、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子（Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ Ｅａｒｌｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ １－６（２０１３））及びＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９分子である。

【0156】

一実施形態では、Ｃａｓ９分子、例えば非活性Ｃａｓ９分子は、本明細書に記載のいずれかのＣａｓ９分子配列又は天然に存在するＣａｓ９分子配列、例えば本明細書に列挙されるか又はＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：５（２０１３）若しくはＨｏｕ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ Ｅａｒｌｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ １－６（２０１３）に記載される種からのＣａｓ９分子に対して６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有するか；前記Ｃａｓ９配列と比較したときにアミノ酸残基の１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％又は４０％以下が異なるか；前記Ｃａｓ９配列に対して少なくとも１、２、５、１０又は２０アミノ酸が異なるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０又は３０アミノ酸を超えないか；或いは前記Ｃａｓ９配列と同一である、アミノ酸配列を含む。

【0157】

一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９に対して６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の相同性を有するか；Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９配列と比較したときにアミノ酸残基の１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％若しくは４０％以下が異なるか；Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９配列に対して少なくとも１、２、５、１０若しくは２０アミノ酸が異なるが、１００、８０、７０、６０、５０、４０若しくは３０アミノ酸を超えないか；又はＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９と同一である、アミノ酸配列を含む。

【0158】

様々なタイプのＣａｓ分子を本明細書で使用可能である。いくつかの実施形態では、ＩＩ型Ｃａｓ系のＣａｓ分子が使用される。他の実施形態では、他のＣａｓ系のＣａｓ分子が使用される。例えば、Ｉ型又はＩＩＩ型Ｃａｓ分子を使用し得る。例示的なＣａｓ分子（及びＣａｓ系）は、例えば、Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ ＢＩＯＬＯＧＹ １（６）：ｅ６０（２００５）及びＭａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩＥＷ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ９：４６７－４７７（２０１１）（両方の参照文献の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。

【0159】

変更Ｃａｓ９分子
天然に存在するＣａｓ９分子は、ニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼ及び／又はエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；ｇＲＮＡ分子に機能的に会合する能力；及び核酸上の部位を標的とする（又はそれに局在化する）能力（例えば、ＰＡＭ認識及び特異性）をはじめとするいくつかの性質を有し得る。一実施形態では、本明細書に開示される方法で使用されるＣａｓ９分子は、これらの性質の全て又はサブセットを含み得る。典型的実施形態では、Ｃａｓ９分子は、ｇＲＮＡ分子と相互作用してｇＲＮＡ分子と協奏的に核酸中の部位に局在化する能力を有する。他の活性、例えばＰＡＭ特異性、切断活性又はヘリカーゼ活性は、Ｃａｓ９分子によってより広範に変動可能である。

【0160】

所望の性質を有するＣａｓ９分子は、いくつかの方法において、例えば天然に存在するＣａｓ９分子などの親Ｃａｓ９の変更により、所望の性質を有する変更Ｃａｓ９分子を提供するように作製可能である。例えば、親Ｃａｓ９分子に１つ以上の変異又は差異を導入可能である。そのような変異及び差異は、置換（例えば、保存的置換又は非必須アミノ酸の置換）；挿入；又は欠失を含み得る。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、参照Ｃａｓ９分子の１つ以上の活性を保持又は増強しつつ、参照Ｃａｓ９分子と比べて１つ以上の変異又は差異、例えば少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、３００、４０又は５０変異を含み得るが、２００、１００又は８０変異を超えない。例えば、一実施形態では、Ｃａｓ分子は、野生型Ｃａｓ分子配列と比較して１つ以上のアミノ酸の欠失を含む。

【0161】

一実施形態では、１つ又は複数の変異は、核酸の片側を標的とする（又はそれに局在化する）Ｃａｓ９活性（例えば、ＰＡＭ認識及び特異性）に実質的な影響を及ぼさない。一実施形態では、１つ又は複数の変異は、Ｃａｓ９活性、例えばニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性及びヘリカーゼ活性のＣａｓ９活性に実質的な影響を及ぼす。

【0162】

特定配列か否かにかかわらず、例えば、置換は、１つ以上の活性、例えば標的化活性、切断活性などに影響を及ぼし得ると共に、例えば変異が保存的であるかを評価することにより又は以上に記載の方法により評価又は予測可能である。一実施形態では、Ｃａｓ９分子と関連して使用される「非必須」アミノ酸残基は、Ｃａｓ９活性（例えば、標的化能力）を消失させることなく又はより好ましくは実質的に変更することなく、Ｃａｓ９分子、例えば天然に存在するＣａｓ９分子、例えば活性Ｃａｓ９分子の野生型配列から変更可能な残基であるが、一方、「必須」アミノ酸残基を変化させると、活性（例えば、標的化能力）の実質的損失をもたらす。

【0163】

ＰＡＭ認識が変更されたＣａｓ９分子
天然に存在するＣａｓ９分子は、特異的ＰＡＭ配列、例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．ミュータンス（ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＮ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）に対して以上に記載したＰＡＭ認識配列を認識し得る。

【0164】

一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、天然に存在するＣａｓ９分子と同一のＰＡＭ特異性を有する。他の実施形態では、Ｃａｓ９分子は、天然に存在するＣａｓ９分子に関連しないＰＡＭ特異性又は最も近い配列相同性を有する天然に存在するＣａｓ９分子に関連しないＰＡＭ特異性を有する。例えば、天然に存在するＣａｓ９分子は、例えば、ＰＡＭ認識を変更するように、例えばＣａｓ９分子が認識するＰＡＭ配列を変更することによりオフターゲット部位を減少させるように及び／又は特異性を改善するように；又はＰＡＭ認識要件を排除するように、変更可能である。一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、例えば、ＰＡＭ認識配列の長さを増加させることにより及び／又は高い同一性レベルにＣａｓ９特異性を改善することによりオフターゲット部位を減少させて特異性を増加させるように、変更可能である。一実施形態では、ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０又は１５アミノ酸長である。異なるＰＡＭ配列を認識する及び／又はオフターゲット活性を低減させたＣａｓ９分子は、指向進化を用いて発生可能である。Ｃａｓ９分子の指向進化に使用可能な例示的な方法及び系は、例えば、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｌ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ４７２（７３４４）：４９９－５０３（２０１１）に記載されている。候補Ｃａｓ９分子は、例えば、本明細書に記載の方法により評価可能である。

【0165】

非切断Ｃａｓ９分子
一実施形態では、Ｃａｓ９分子は、天然に存在するＣａｓ９分子と異なる、例えば最も近い相同性を有する天然に存在するＣａｓ９分子と異なる切断を含む。例えば、Ｃａｓ９分子は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子などの天然に存在するＣａｓ９分子と次の点で異なり得る。すなわち、例えば、天然に存在するＣａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子）と比較して二本鎖の破断切断（エンドヌクレアーゼ及び／若しくはエキソヌクレアーゼ活性）を調節する能力、例えば減少させること；例えば、天然に存在するＣａｓ９分子（例えば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣａｓ９分子）と比較して核酸の一本鎖、例えば核酸分子の非相補的鎖若しくは核酸分子の相補的鎖の切断（ニッカーゼ活性）を調節する能力、例えば減少させること；又は核酸分子、例えば二本鎖若しくは一本鎖核酸分子を切断する能力を排除可能であること。

【0166】

非切断非活性Ｃａｓ９分子
一実施形態では、変更Ｃａｓ９分子は、核酸分子（二本鎖又は一本鎖核酸分子のいずれか）を切断しないか、又は有意により低い効率、例えば本明細書に記載のアッセイにより測定したとき、参照Ｃａｓ９分子の切断活性の２０、１０、５、１又は０．１％未満で核酸分子を切断する、非活性Ｃａｓ９分子である。参照Ｃａｓ９分子は、天然に存在する非改変Ｃａｓ９分子、例えばＳ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）又はＮ．メニンギティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＣａｓ９分子などの天然に存在するＣａｓ９分子であり得る。一実施形態では、参照Ｃａｓ９分子は、最も近い配列同一性又は相同性を有する天然に存在するＣａｓ９分子である。一実施形態では、非活性Ｃａｓ９分子は、Ｎ末端ＲｕｖＣ様ドメインに関連する実質的切断活性及びＨＮＨ様ドメインに関連する切断活性を欠如する。一実施形態では、Ｃａｓ９分子はｄＣａｓ９である。例えば、Ｔｓａｉ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２：５６９－５７７（２０１４）を参照されたい。

【0167】

触媒的非活性Ｃａｓ９分子は、転写アクチベーターに融合され得る。非活性Ｃａｓ９融合タンパク質は、ｇＲＮＡと複合体化してｇＲＮＡの標的化ドメインにより具体的に示されるＤＮＡ配列に局在化するが、活性Ｃａｓ９と異なり、それは、標的ＤＮＡを切断しようとしない。非活性Ｃａｓ９への転写性活性化ドメインなどのエフェクタードメインの融合は、ｇＲＮＡにより具体的に示されるいずれかのＤＮＡ部位へのエフェクターのリクルートメントを可能にする。遺伝子のプロモーター領域へのＣａｓ９融合タンパク質の部位特異的標的化は、プロモーター領域へのポリメラーゼ結合を誘発し得るか又はそれに影響を及ぼし得る。例えば、転写因子（例えば、転写アクチベーター）及び／又は転写エンハンサーとのＣａｓ９融合は、核酸への結合で転写活性化を増加させる。本発明の一実施形態では、転写性アクチベーター又はそのドメインは、１，６５０ヌクレオチド未満を含む核酸分子によってコードされる。本発明の別の実施形態では、転写リプレッサー又はそのドメインは、１，６５０ヌクレオチド未満を含む核酸分子によってコードされる。

【0168】

以下の表２は、ＳＣＮ１Ａに対するｇＲＮＡの配列を提供する。

【0169】

【表20】

【0170】

ジンクフィンガータンパク質
いくつかの実施形態では、ＤＢＤはジンクフィンガータンパク質である。ジンクフィンガータンパク質は、「ジンクフィンガードメイン」及び「ジンクフィンガーモチーフ」と互換可能に使用可能である。ジンクフィンガーは、フォールドを安定化させるための１つ以上の亜鉛イオン（Ｚｎ^２＋）の配位により特徴付けられる小タンパク質構造モチーフである。ジンクフィンガー（Ｚｎｆ）ドメインは、ＤＮＡ標的部位にタンデム接触する複数の指状突出を含有する相対的に小さいタンパク質モチーフである。ジンクフィンガーモチーフのモジュラー性は、高度の親和性及び特異性で結合されるＤＮＡ配列の多数の組み合わせを可能にするため、特異的ＤＮＡ配列を標的としてそれに結合可能なタンパク質を操作するのに理想的に適している。多くの操作ジンクフィンガーアレイは、マウス転写因子Ｚｉｆ２６８のジンクフィンガードメインに基づく。Ｚｉｆ２６８は、高親和性で９ｂｐ配列に集団で結合する３つの個別ジンクフィンガーモチーフを有する。多様なジンクフィンガータンパク質が同定されており、本明細書にさらに記載される構造に基づいて様々なタイプに特徴付けられる。いずれのそのようなジンクフィンガータンパク質も本明細書に記載のＤＢＤと関連して有用である。

【0171】

ジンクフィンガータンパク質を設計するための様々な方法を利用可能である。例えば、対象標的ＤＮＡ配列に結合するようにジンクフィンガータンパク質を設計するための方法は記載されており、例えばＬｉｕ Ｑ，ｅｔ ａｈ，Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｐｏｌｙｄａｃｔｙｌ ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ ｕｎｉｑｕｅ ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ ｗｉｔｈｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅｓ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９４（１１）：５５２５－３０（１９９７）；Ｗｒｉｇｈｔ ＤＡ ｅｔ ａｈ，Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄ ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｒ ａｓｓｅｍｂｌｙ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００６；１（３）：１６３７－５２；及びＣＡ Ｇｅｒｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｔ Ｇａｊ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｚｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｔｈｅ Ａｄｖｅｎｔ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ４７：２３０９－２３１８（２０１４）を参照されたい。さらに、目的のＤＮＡ標的配列に結合するようにジンクフィンガータンパク質を設計するための様々なウェブベースツールが一般公開されており、例えばワールドワイドウェブ上のｏｍｉｃｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ／ｚｆｎｓ－ｃａｔｅｇｏｒｙで利用可能なＯｍｉｃＸからのＺｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｄｅｓｉｇｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓウェブサイト；及びワールドワイドウェブ上のｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｂａｒｂａｓ／ｚｆｄｅｓｉｇｎ／ｚｆｄｅｓｉｇｎｈｏｍｅ．ｐｈｐで利用可能なＳｃｒｉｐｐｓからのＺｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｔｏｏｌｓ設計ウェブサイトを参照されたい。さらに、目的のＤＮＡ標的配列に結合するようにジンクフィンガータンパク質を設計するための様々な市販サービスが利用可能であり、例えばＣｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓにより提供される市販サービス又はキット（ｃｒｅａｔｉｖｅ－ｂｉｏｌａｂｓ．ｃｏｍ／Ｄｅｓｉｇｎ－ａｎｄ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ－ｏｆ－Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ－Ｚｉｎｃ－Ｆｉｎｇｅｒ－Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブ）、Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能なＺｉｎｃ Ｆｉｎｇｅｒ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ Ｍｏｄｕｌａｒ Ａｓｓｅｍｂｌｙ Ｋｉｔ（ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂ ａｔ ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｋｉｔｓ／ｚｆｃ－ｍｏｄｕｌａｒ－ａｓｓｅｍｂｌｙ／）又はＳｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈからのＣｏｍｐｏＺｒ Ｃｕｓｔｏｍ ＺＦＮ Ｓｅｒｖｉｃｅ（ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅ／ｚｉｎｃ－ｆｍｇｅｒ－ｎｕｃｌｅａｓｅ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｃｕｓｔｏｍ－ｚｆｎ．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブ）を参照されたい。

【0172】

特定の実施形態では、本明細書に提供される転写因子は、１つ以上のジンクフィンガーを含むＤＢＤを含むか又はジンクフィンガータンパク質のＤＢＤに由来する。いくつかの場合、ＤＢＤは、複数のジンクフィンガーを含み、各ジンクフィンガーは、そのＮ末端若しくはＣ末端のいずれかで又は両方でアミノ酸リンカーを介して別のジンクフィンガー又は別のドメインに連結される。いくつかの場合、本明細書に提供されるＤＢＤは、複数のジンクフィンガー構造若しくはモチーフ又は表３に記載の配列番号７０～７３及び６１の１つ以上を有する複数のジンクフィンガー或いはそれらの任意の組み合わせを含む。

【0173】

特定の実施形態では、ＤＢＤは、Ｘ－［ＺＦ－Ｘ］ｎ及び／又は［Ｘ－ＺＦ］ｎ－Ｘ（式中、ＺＦは、ジンクフィンガードメインであり、Ｘは、１～５０アミノ酸を含むアミノ酸リンカーであり、且つｎは、１～１５、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４若しくは１５の整数であり、各ＺＦは、独立して、同一配列又はＤＢＤ中の他のＺＦ配列と異なる配列を有することが可能であり、且つ各リンカーＸは、独立して、同一配列又はＤＢＤ中の他のＸの配列と異なる配列を有することが可能である）を含む。各ジンクフィンガーは、別の配列、ジンクフィンガー又はそのＣ末端、Ｎ末端若しくは両末端のドメインに連結可能である。ＤＢＤでは、各リンカーＸは、配列、長さ及び／若しくは性質（例えば、フレキシビリティー若しくは電荷）が同一であり得るか、又は配列、長さ及び／若しくは性質が異なり得る。いくつかの場合、２つ以上のリンカーは、同等であり得るが、他のリンカーは、異なる。例示的な実施形態では、リンカーは、１つ以上の天然に存在するジンクフィンガータンパク質に見出されるジンクフィンガーを接続する配列に由来し得るか又はそれから得られ得る。他の実施形態では、適切なリンカー配列は、例えば、５アミノ酸長以上のリンカーを含む。６アミノ酸長以上の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；同第６，９０３，１８５号明細書；及び同第７，１５３，９４９号明細書（その各々はその全体が本明細書に組み込まれる）も参照されたい。本明細書に提供されるＤＢＤタンパク質は、タンパク質の個別ジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。本明細書に記載されるＤＢＤタンパク質は、タンパク質の個別ジンクフィンガー間に適切なリンカーの任意の組み合わせを含み得る。

【0174】

特定の実施形態では、本明細書に提供される転写因子は、１つ以上の古典的ジンクフィンガーを含むＤＢＤを含む。古典的Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガーは、亜鉛イオンにより配位されて一方の鎖に２つのシステイン及び他方の鎖に２つのヒスチジン残基を有する。古典的ジンクフィンガードメインは、２つのβシート及び１つのαヘリックスを有し、αヘリックスは、ＤＮＡ分子と相互作用すると共に、標的部位に結合するＤＢＤの基礎を形成し、「認識ヘリックス」といわれ得る。例示的な実施形態では、ジンクフィンガーの認識ヘリックスは、位置１、２、３又は６に少なくとも１つのアミノ酸置換を含むことによりジンクフィンガードメインの結合特異性を変化させる。他の実施形態では、本明細書に提供されるＤＢＤは、１つ以上の非古典的ジンクフィンガー、例えばＣ２－Ｈ２、Ｃ２－ＣＨ及びＣ２－Ｃ２を含む。

【0175】

別の実施形態では、本明細書に提供される転写因子は、次の構造：ＬＥＰＧＥＫＰ－［ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＸＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰ］ｎ－ＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳＸＨＱＲＴＨ－ＴＧＫＫＴＳ（式中、「ＬＥＰＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ」は、配列番号９１として開示され、「ＨＱＲＴＨＴＧＥＫＰＹＫＣＰＥＣＧＫＳＦＳ」は、配列番号９２として開示され、「ＨＱＲＴＨＴＧＫＫＴＳ」は、配列番号８３として開示され、且つｎは、１～１５、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５の整数であり、各Ｘは、独立して、標的配列の３ｂｐに結合する能力のある認識配列（例えば、認識ヘリックス）である）を有するジンクフィンガーモチーフを含むＤＢＤを含む。例示的な実施形態では、ｎは、３、６又は９である。特に好ましい実施形態では、ｎは６である。様々な実施形態では、各Ｘは、独立して、同一アミノ酸配列又はＤＢＤ中の他のＸの配列と比較して異なるアミノ酸配列を有し得る。例示的な実施形態では、各Ｘは、ワールドワイドウェブ上のｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｂａｒｂａｓ／ｚｆｄｅｓｉｇｎ／ｚｆｄｅｓｉｇｎｈｏｍｅ．ｐｈｐに位置するＳｃｒｉｐｐｓからのＺｉｎｇｅｒ Ｆｉｎｇｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌを用いて目的の標的結合部位の３ｂｐと相互作用するように設計された７アミノ酸を含む配列である。

【0176】

ＤＢＤ内の各ジンクフィンガーは３ｂｐを認識するため、ＤＢＤに含まれるジンクフィンガーの数は、ＤＢＤにより認識される結合部位の長さを知らせ、例えば、１ジンクフィンガーを有するＤＢＤは、３ｂｐを有する標的結合部位を認識し、２ジンクフィンガーを有するＤＢＤは、６ｂｐを有する標的結合部位を認識し、３ジンクフィンガーを有するＤＢＤは、９ｂｐを有する標的結合部位を認識し、４ジンクフィンガーを有するＤＢＤは、１２ｂｐを有する標的結合部位を認識し、５ジンクフィンガーを有するＤＢＤは、１５ｂｐを有する標的結合部位を認識し、６ジンクフィンガーを有するＤＢＤは、１８ｂｐを有する標的結合部位を認識し、９ジンクフィンガーを有するＤＢＤは、２７ｂｐを有する標的結合部位を認識するなどである。一般的には、より長い標的結合部位を認識するＤＢＤは、より大きい結合特異性（例えば、より少ないオフターゲット又は非特異的結合）を呈するであろう。

【0177】

他の実施形態では、本明細書に提供される転写因子は、ＤＢＤの結合特異性を変化させるように（例えば、ＤＢＤにより認識される標的部位を変化させるように）ジンクフィンガードメインの認識ヘリックスの１つ以上で１つ以上のアミノ酸置換を行うことにより天然に存在するジンクフィンガータンパク質に由来するＤＢＤを含む。本明細書に提供されるＤＢＤは、いずれかの天然に存在するジンクフィンガータンパク質に由来し得る。

【0178】

様々な実施形態では、そのようなＤＢＤは、いずれかの種、例えばマウス、ラット、ヒトなどのジンクフィンガータンパク質に由来し得る。例示的な実施形態では、本明細書に提供されるＤＢＤは、ヒトジンクフィンガータンパク質に由来する。特定の実施形態では、本明細書に提供されるＤＢＤは、表９に列挙される天然に存在するタンパク質に由来する。例示的な実施形態では、本明細書に提供されるＤＢＤタンパク質は、ヒトＥＧＲジンクフィンガータンパク質、例えばＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３又はＥＧＲ４に由来する。

【0179】

特定の実施形態では、ＳＣＮ１Ａをアップレギュレーションする本明細書に提供される転写因子は、天然に存在するタンパク質のＤＢＤ内の１つ以上のジンクフィンガーを反復することによりＤＢＤタンパク質中のジンクフィンガードメインの数を増加させるようにＤＢＤを改変することにより天然に存在するタンパク質に由来するＤＢＤを含む。特定の実施形態では、そのような改変は、天然に存在するタンパク質のＤＢＤ内のジンクフィンガーのデュプリケーション、トリプリケーション、クアドラプリケーション又はさらなるマルチプリケーションを含む。いくつかの場合、ヒトタンパク質のＤＢＤからの１つのジンクフィンガーが多重化され、例えば同一ジンクフィンガーモチーフの２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又はそれを超えるコピーが転写因子中のＤＢＤで反復される。いくつかの場合、天然に存在するタンパク質のＤＢＤからのジンクフィンガーのセットが多重化される。例えば、天然に存在するタンパク質のＤＢＤからの３ジンクフィンガーのセットがデュプリケートされて６ジンクフィンガーのＤＢＤを有する転写因子を生成し、トリプリケートされて９ジンクフィンガーの転写因子のＤＢＤを生成するか、又はクアドラプリケートされて１２ジンクフィンガーの転写因子のＤＢＤを生成するなどである。いくつかの場合、天然に存在するタンパク質のＤＢＤからのジンクフィンガーのセットが、部分複製されてより多数のジンクフィンガーを有する転写因子のＤＢＤを形成する。例えば、ジンクフィンガーが天然に存在するタンパク質からの第１のジンクフィンガーの１コピー、第２のジンクフィンガーの１コピー及び第３のジンクフィンガーの２コピー、合計で４ジンクフィンガーを転写因子のＤＢＤ中に提示する場合、転写因子のＤＢＤは４ジンクフィンガーを含む。次いで、そのようなＤＢＤは、ＤＢＤの結合特異性を変化させるように（例えば、ＤＢＤにより認識される標的部位を変化させるように）ジンクフィンガードメインの認識ヘリックスの１つ以上で１つ以上のアミノ酸置換を行うことによりさらに改変される。例示的な実施形態では、ＤＢＤは、天然に存在するヒトタンパク質、例えばヒトＥＧＲジンクフィンガータンパク質、例えばＥＧＲ１、ＥＧＲ２、ＥＧＲ３又はＥＧＲ４に由来する。

【0180】

ヒトＥＧＲ１及びＥＧＲ３は、３フィンガーのＣ２Ｈ２ジンクフィンガーＤＢＤにより特徴付けられる。ジンクフィンガーに対する一般的結合規則は、３フィンガー全てが、標的結合部位配列の特異性又は認識を決定するために各ジンクフィンガーのアルファヘリックス中の同一アミノ酸を用いて、類似ジオメトリーでその同族のＤＮＡ配列と相互作用すると規定している。そのような結合規則は、ＥＧＲ１又はＥＧＲ３のＤＢＤを改変して所望の標的結合部位を認識するＤＢＤを操作することを許容する。いくつかの場合、ＥＧＲ１又はＥＧＲ３のジンクフィンガーモチーフ中の７アミノ酸ＤＮＡ認識ヘリックスは、公開されたジンクフィンガー設計規則に従って改変される。特定の実施形態では、ＥＧＲ１又はＥＧＲ３の３フィンガーＤＢＤの各ジンクフィンガーは、例えば、１つ以上の認識ヘリックスの配列を変更することにより及び／又はＤＢＤのジンクフィンガーの数を増加させることにより、改変される。特定の実施形態では、ＥＧＲ１又はＥＧＲ３は、所望の標的部位の少なくとも９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０、３３、３６又はそれを超える塩基対の標的結合部位を認識するように再プログラムされる。特定の実施形態では、ＥＲＧ１又はＥＧＲ３に由来するそのようなＤＢＤは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２又はそれを超えるジンクフィンガーを含む。例示的な実施形態では、ＤＢＤ中のジンクフィンガーの１つ以上は、認識ヘリックスの位置１、２、３又は６に少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。

【0181】

以下の表３は、実施例で使用される例示的ジンクフィンガータンパク質のアミノ酸配列を提供する。

【0182】

【表21】

【0183】

以下の表４は、転写因子で使用される他の配列を提供する。

【0184】

【表22】

【0185】

【表23】

【0186】

【表24】

【0187】

【表25】

【0188】

【表26】

【0189】

【表27】

【0190】

目的の遺伝子のアップレギュレーション
本明細書に提供される転写因子は、目的の遺伝子のアップレギュレーションをもたらすいずれかの標的部位（例えば、目的の遺伝子のプロモーター領域）を認識するように設計可能である。例示的な実施形態では、ＤＢＤは、転写因子が結合したときに目的の内因性遺伝子のゲノム位置を認識してその発現をアップレギュレーションするように設計される。本明細書に提供される転写因子が結合したときに目的の内因性遺伝子の発現を調節する能力のある結合部位は、目的の遺伝子の遺伝子発現のモジュレーションをもたらすゲノム中のいずれかの位置に位置し得る。様々な実施形態では、結合部位は、目的の遺伝子と異なる染色体上、目的の遺伝子と同一の染色体上、目的の遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）の上流、目的の遺伝子のＴＳＳの下流、目的の遺伝子のＴＳＳの近位、目的の遺伝子の遠位、目的の遺伝子のコーディング領域内、目的の遺伝子のイントロン内、目的の遺伝子のポリＡテールの下流、目的の遺伝子を調節するプロモーター配列内又は目的の遺伝子を調節するエンハンサー配列内に位置し得る。

【0191】

ＤＢＤは、例えば、オフターゲット結合を最小限に抑えるか又は生じさせることなく、ＤＢＤによる標的結合部位配列の特異的認識を提供する限りいずれの長さの標的結合部位にも結合するように設計され得る。特定の実施形態では、標的結合部位は、トランス作用因子が結合したとき、全ての他の遺伝子と比較して少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍又はそれを超えるレベルで目的の遺伝子の発現を調節し得る。特定の実施形態では、標的結合部位は、トランス作用因子が結合したとき、４０最近接遺伝子（例えば、染色体上の目的の遺伝子のコーディング配列の上流又は下流のいずれかの最も近くに位置する４０遺伝子）と比較して少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、５００倍又はそれを超えるレベルで目的の遺伝子の発現を調節し得る。特定の実施形態では、標的結合部位は、少なくとも５ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、３５ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ若しくは５０ｂｐ又はそれを超え得る。結合部位の特異的長さは、転写因子中のＤＢＤのタイプにより特徴付けられるであろう。一般的には、結合部位の長さが長くなるほど、結合の特異性及び遺伝子発現のモジュレーションは大きくなる（例えば、結合部位の長さが長くなるほど、オフターゲットの影響は少なくなる）。特定の実施形態では、より長い標的結合部位を認識するＤＢＤを有する転写因子は、より短い標的部位に結合するＤＢＤを有する転写因子で観測されるオフターゲットの影響と比べて、非特異的結合に関連するオフターゲットの影響はより少なくなる（例えば、オフターゲット遺伝子又は目的の遺伝子以外の遺伝子の発現のモジュレーションなど）。いくつかの場合、オフターゲット結合の低減は、より短い標的結合部位を認識するＤＢＤを有する同等の転写因子と比較して少なくとも１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０倍になる。

【0192】

特定の実施形態では、本明細書に提供されるＤＢＤは、結合親和性を増加させてより長期間にわたり標的結合部位に結合するように改変可能であり、その結果、ＤＢＤにコンジュゲートされたＴＡＤは、目的の内因性遺伝子の発現レベルにより大きい影響を発揮するように、より多くの転写因子をリクルートでき、且つ／又はそのような転写因子をより長期間にわたりリクルートできる。特定の実施形態では、ＤＢＤは、所望の標的部位へのその特異的結合（又はオンターゲット結合）を増加させるように改変され得、且つ／又はその非特異的若しくはオフターゲット結合を減少させるように改変され得る。

【0193】

様々な実施形態では、ＤＢＤ又は転写因子と標的結合部位との結合は、様々な方法を用いて決定され得る。特定の実施形態では、ＤＢＤ又は転写因子と標的結合部位との特異的結合は、移動度シフトアッセイ、ＤＮａｓｅ保護アッセイ又はタンパク質－ＤＮＡ結合のアッセイのための当技術分野で公知のいずれかの他のインビトロ法を用いて決定され得る。他の実施形態では、転写因子と標的結合部位との特異的結合は、機能性アッセイを用いて、例えば標的結合部位に転写因子が結合したとき、目的の遺伝子の発現（ＲＮＡ又はタンパク質）を測定することにより決定され得る。例えば、標的結合部位は、細胞に含有されたベクター上のレポーター遺伝子（例えば、ｅＧＦＰなど）若しくは目的の遺伝子の上流に位置し得るか、又は細胞が転写因子を発現する場合、細胞のゲノムに組み込まれ得る。代替的に、転写因子を発現するベクターは、目的の遺伝子を天然で含有する細胞型に導入され得る。コントロール（例えば、転写因子なし又は異なる標的部位を認識する転写因子）と比較して転写因子の存在下でレポーター遺伝子（又は目的の遺伝子）の発現レベルが大きくなることは、転写因子のＤＢＤが標的部位に結合することを示唆する。同様に、適切なインビトロ（例えば、非細胞ベース）転写及び翻訳系も使用され得る。特定の実施形態では、標的部位に結合する転写因子は、コントロール（例えば、転写因子なし又は異なる標的部位を認識する転写因子）と比較してレポーター遺伝子又は目的の遺伝子の発現を少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍又はそれを超えるものにし得る。

【0194】

特定の実施形態では、目的の遺伝子をアップレギュレーションする本明細書に開示される転写因子は、少なくとも９ｂｐ、１２ｂｐ、１５ｂｐ、１８ｂｐ、２１ｂｐ、２４ｂｐ、２７ｂｐ、３０ｂｐ、３３ｂｐ若しくは３６ｂｐのサイズ；９ｂｐ、１２ｂｐ、１５ｂｐ、１８ｂｐ、２１ｂｐ、２４ｂｐ、２７ｂｐ若しくは３０ｂｐ超；又は９～３３ｂｐ、９～３０ｂｐ、９～２７ｂｐ、９～２４ｂｐ、９～２１ｂｐ、９～１８ｂｐ、９～１５ｂｐ、９～１２ｂｐ、１２～３３ｂｐ、１２～３０ｂｐ、１２～２７ｂｐ、１２～２４ｂｐ、１２～２１ｂｐ、１２～１８ｂｐ、１２～１５ｂｐ、１５～３３ｂｐ、１５～３０ｂｐ、１５～２７ｂｐ、１５～２４ｂｐ、１５～２１ｂｐ、１５～１８ｂｐ、１８～３３ｂｐ、１８～３０ｂｐ、１８～２７ｂｐ、１８～２４ｂｐ、１８～２１ｂｐ、２１～３３ｂｐ、２１～３０ｂｐ、２１～２７ｂｐ、２１～２４ｂｐ、２４～３３ｂｐ、２４～３０ｂｐ、２４～２７ｂｐ、２７～３３ｂｐ、２７～３０ｂｐ若しくは３０～３３ｂｐである標的結合部位を認識する。例示的な実施形態では、目的の遺伝子をアップレギュレーションする本明細書に開示される転写因子は、１８～２７ｂｐ、１８ｂｐ又は２７ｂｐである標的結合部位を認識する。

【0195】

特定の実施形態では、目的の遺伝子をアップレギュレーションする本明細書に開示される転写因子は、２番染色体上に位置する標的結合部位を認識する。特定の実施形態では、目的の遺伝子をアップレギュレーションする本明細書に開示される転写因子は、染色体上の目的の遺伝子ＡのＴＳＳの上流又は下流１１０ｋｂ、１００ｋｂ、９０ｋｂ、８０ｋｂ、７０ｋｂ、６０ｋｂ、５０ｋｂ、４０ｋｂ、３０ｋｂ、２０ｋｂ、１０ｋｂ、５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ又は１ｋｂ内に位置する標的結合部位を認識する。

【0196】

目的の遺伝子は、ゲノム交替が１つ以上の遺伝子の転写若しくは活性の低減をもたらす又は遺伝子産物が哺乳動物疾患の原因因子であるいずれかの遺伝子であり得る。例えば、ゲノム変更は、遺伝子の１つの機能性コピーのみが存在し、その単一コピーが野生型表現型を産生するのに十分な遺伝子産物を産生しないハプロ不全であり得る。他の疾患は、活性の低減を呈するが排除を呈しないように遺伝子産物を変更する遺伝子の一方又は両方のコピーのゲノム変更によって引き起こされる。そのほか他の疾患では、ゲノム変更は、野生型表現型を産生するのに不十分な遺伝子産物が存在するように遺伝子の一方若しくは両方の転写を低減するか又は転写物安定性を低減する。

【0197】

いくつかの実施形態では、目的の遺伝子の発現の増加は、導入遺伝子配列のＲＮＡ転写物の数の増加により測定される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列の発現の増加は、ＰＣＲにより測定される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列の発現の増加は、ＲＴ－ＰＣＲにより測定される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列の発現の増加は、ｑＰＣＲにより測定される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列の発現の増加は、ｑＲＴ－ＰＣＲにより測定される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列の発現の増加は、配列決定により測定される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列の発現の増加は、ノーザンブロット分析により測定される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列の発現の増加は、単一分子蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により測定される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列の発現の増加は、導入遺伝子によってコードされるタンパク質の産生量の増加により測定される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列の発現の増加は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により測定される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列の発現の増加はウエスタンブロット分析により測定される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列の発現の増加は、免疫染色により測定される。いくつかの実施形態では、導入遺伝子配列の発現の増加は、以上に列挙された方法の２つ以上により測定される。

【0198】

プロモーター
動物又はヒトの体の全ての細胞は、同じＤＮＡを含有するが、異なる組織の異なる細胞は、一方では共通の遺伝子のセットを発現し、他方では組織のタイプ及び発達の段階に応じて変化する遺伝子のセットを発現する。理論に拘束されるものではないが、イントロンを含まない任意のプロモーターを、本明細書に記載の様々な態様及び実施形態（例えば、核酸分子）で使用することができる。本明細書に記載の様々な態様及び実施形態で使用可能な例示的なプロモーターには、限定されるものではないが、ＧＡＢＡ作動性ニューロンで作動可能なプロモーター、抑制性ニューロンで作動可能なプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＪｅＴプロモーター、ＰＧＫプロモーター及びニワトリベータ－アクチンプロモーター（ＣＢＡ）プロモーターが含まれる。実施形態では、プロモーターは、複数の細胞型において活性である。他の実施形態では、プロモーターは、１つの細胞型（例えば、細胞特異的）又は例えば中枢神経組織（例えば、脳組織）などの１つの組織の細胞型（例えば、組織特異的）において活性である。実施形態では、プロモーターはニューロン特異的である。本明細書に記載の様々な態様及び実施形態で使用できるニューロン特異的プロモーターの例には、作動可能に連結されたミニ遺伝子及び導入遺伝子の発現を駆動するためにベクター及び他の核酸で使用される単離又は合成ニューロン特異的プロモーター及びその機能的フラグメント、例えばニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）に由来するプロモーター（例えば、ＥＭＢＬ ＨＳＥＮＯ２、Ｘ５１９５６を参照されたい）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター；ニューロフィラメントプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７を参照されたい）；シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１を参照されたい）；ｔｈｙ－１プロモーター（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ，５１：７－１９；Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１６（１０）：１１６１－１１６６を参照されたい）；セロトニン受容体プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｓ６２２８３を参照されたい）；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（ＴＨ）（例えば、Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１６：４３７；Ｓａｓａｏｋａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．，１６：２７４；Ｂｏｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１８：９９８９；及びＫａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｎｅｕｒｏｎ，６：５８３－５９４を参照されたい）；ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Ｒａｄｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：３４０２－３４０６を参照されたい）；Ｌ７プロモーター（例えば、Ｏｂｅｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：２２３－２２６を参照されたい）；ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Ｂａｒｔｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：３６４８－３６５２を参照されたい）；エンケファリンプロモーター（例えば、Ｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．，１７：３７９３－３８０５を参照されたい）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター；Ｃａ２＋－カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ－アルファ（ＣａｍＫＩＭ）プロモーター（例えば、Ｍａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１３２５０；及びＣａｓａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓｉｓ，３１：３７を参照されたい）；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来成長因子－ｐプロモーター（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１１：５２－６０を参照されたい）；などが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、最小ヒトシナプシン１プロモーター（ＳＹＮ）の一部又は全部が使用される。Ｋｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０（４）：３３７－４７；Ｔｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ，（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８（８）３４３１－５；Ｃａｓｔｌｅ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３８２：１３３－４９；ＭｃＬｅａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，５７６：７３－７８；Ｋｕｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３１１（１）：８９－９５。

【0199】

いくつかの実施形態では、組織又は細胞特異的プロモーターは、非神経細胞におけるものと比較して、神経細胞又は組織において、作動可能に連結されたミニ遺伝子及び／又は導入遺伝子のより高い発現を提供するように構成される。いくつかの実施形態では、神経特異的プロモーターは、非神経細胞におけるものと比較して、神経において、作動可能に連結されたミニ遺伝子及び／又は導入遺伝子のより高い発現を提供するように構成される。神経細胞又は組織の例には、ニューロン及びシュワン細胞、グリア細胞、星状細胞などを含むものが含まれる。非神経細胞の例には、肝細胞、心筋細胞、赤血球、上皮細胞などが含まれるが、これらに限定されない。作動可能に連結されたミニ遺伝子及び／又は導入遺伝子のより高いレベルの発現は、ミニ遺伝子及び／又は導入遺伝子の転写から産生されるＲＮＡ転写物の数の増加を含み得る。いくつかの実施形態では、産生されたＲＮＡ転写物の数は、ＰＣＲによって測定され得る。いくつかの他の実施形態では、産生されたＲＮＡ転写物の数は、ＲＴ－ＰＣＲ、例えばｑＰＣＲによって測定され得る。いくつかの実施形態では、産生されたＲＮＡ転写物の数は、配列決定によって測定され得る。いくつかの実施形態では、産生されたＲＮＡ転写物の数は、単一分子蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）によって測定され得る。いくつかの実施形態では、産生されたＲＮＡ転写物の数は、ノーザンブロット分析によって測定され得る。ミニ遺伝子及び／又は導入遺伝子が目的のタンパク質をコードする場合、作動可能に連結されたミニ遺伝子及び／又は導入遺伝子のより高いレベルの発現は、代替的又は追加的に、産生されるタンパク質の量の増加を含み得る。いくつかの実施形態では、産生されたタンパク質の量は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定され得る。いくつかの実施形態では、産生されたタンパク質の量は、ウエスタンブロット分析によって測定され得る。いくつかの実施形態では、産生されたタンパク質の量は、免疫染色によって測定され得る。いくつかの実施形態では、産生されたタンパク質の量は、時間分解フェルスター共鳴エネルギー転移（ＴＲ－ＦＲＥＴ）によって測定され得る。いくつかの実施形態では、産生されるタンパク質の量は、免疫組織化学（ＩＨＣ）によって測定され得る。いくつかの実施形態では、発現のレベルは、これらの又は他の方法のうちの複数によって測定される。

【0200】

ポリＡシグナル配列
様々な実施形態では、本明細書に開示される核酸、ベクター及び他の組成物は、１つ以上のポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列を含み得る。ポリアデニル化シグナル配列は、補助配列エレメントが隣接する中央配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含み得る。理論よって拘束されるものではないが、配列は、転写物の末端をシグナルし、ポリアデニレートポリメラーゼによってホモポリマーＡ配列が３’末端に付加される部位として機能し得る。

【0201】

ＳＶ４０ポリＡ、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）ポリＡ、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡ、ベータグロビンポリＡ、アルファグロビンポリＡ、オボアルブミンポリＡ、カッパ軽鎖ポリＡ及び合成ポリＡを含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知のポリアデニル化シグナル配列が企図される。ポリＡシグナル配列は、本明細書に開示される核酸及び他の組成物において使用され得る。

【0202】

転写後調節エレメント
様々な実施形態では、本明細書に開示される核酸、導入遺伝子及び他の組成物は、１つ以上の転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、例えば導入遺伝子の発現を増強又は他の方法で改善することができるものを含み得る。理論に拘束されるものではないが、ＰＲＥはｍＲＮＡの安定性及び３’末端形成を可能にすることによって発現を増強し得、且つ／又はスプライシングされていないｍＲＮＡの核細胞質への輸送を促進し得る。ＰＲＥは、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）又はマイクロＲＮＡの結合部位も含み得る。

【0203】

例示的なＰＲＥには、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）、コウモリウイルス（ＢＰＲＥ）、ジリスウイルス（ＧＳＰＲＥ）、ホッキョクリスウイルス（ＡＳＰＲＥ）、アヒルウイルス（ＤＰＲＥ）、チンパンジーウイルス（ＣＰＲＥ）、ウーリーモンキーウイルス（ＷＭＰＲＥ）又はウッドチャックウイルス（ＷＰＲＥ）からのＰＲＥが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、核酸又は導入遺伝子は、ＰＲＥを含む。特定の実施形態では、ＰＲＥは、ＨＰＲＥを含む。いくつかの実施形態では、合成ＰＲＥが使用される。

【0204】

ウイルスベクター
本明細書で論じられる核酸（例えば、ミニ遺伝子、導入遺伝子、プロモーター、ＰＲＥ及びポリＡなどの他の核酸成分並びにそれらの組み合わせ）を含むベクターも本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ベクターは、導入遺伝子を標的細胞に送達するために、且つ／又は標的細胞におけるその導入遺伝子の発現を増加させるために役立ち得る。様々な実施形態では、ベクターは、スプライス調節剤と組み合わせた使用により、タンパク質、抗体又は機能的結合フラグメント、酵素など、及び／又は核酸、例えばＣＲＩＳＰＲなどで使用するためのｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｇＲＮＡなどの発現を調節するために使用され得る。

【0205】

例として、ベクターは、目的の遺伝子の発現を増加させる本明細書に記載の転写因子を含み得る。ベクターは、遺伝情報を別の細胞に転送するのに役立ち得る。ベクターは、例えば、クローニングベクター又はプラスミドとして、クローニングに使用され得る。ベクターは、例えば、ヒト神経細胞における、細胞感染などの他の目的のために、発現、例えば治療用タンパク質及び／又はＲＮＡ発現を駆動するようにも特異的に設計され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸を含むベクターが企図される。ベクターは、ＤＮＡベクター、環状ベクター又はプラスミドであり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは二本鎖である。他の実施形態では、ベクターは一本鎖である。

【0206】

いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ベクターは、導入遺伝子配列を神経細胞又は組織に送達するために使用されるウイルスベクターである。ベクターに使用されるウイルスの例には、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス及び他のハイブリッドウイルスが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、キメラＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター又はそれらの任意の変異体若しくは誘導体である。

【0207】

理論に拘束されるものではないが、本明細書に開示されるウイルスベクターは、それらが感染する宿主細胞にそれらのゲノムを挿入して、その核酸配列を宿主に送達し得る。挿入されたウイルスゲノムは、エピソームであるか、又はランダムであるか又は標的化され得る部位で宿主細胞の染色体に組み込まれ得る。一実施形態では、ベクターは、導入遺伝子配列を細胞に送達するために使用されるウイルスベクターである。ベクターに使用されるウイルスの例には、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス及び他のハイブリッドウイルスが含まれるが、これらに限定されない。Ｗａｒｎｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，７３７：１－２５。レンチウイルスは、有意な量のウイルスＤＮＡを宿主細胞に組み込むことができるレトロウイルスの属であり、遺伝子送達の効率的な方法となる。一方、アデノウイルスは、宿主細胞の染色体に組み込まれていない遺伝物質を導入するため、宿主細胞を破壊するリスクが減少する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、キメラＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＤＮＡウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター又はそれらの任意の変異体若しくは誘導体である。

【0208】

いくつかの実施形態では、導入遺伝子を含むベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であるか又はそれに由来する。いくつかの実施形態では、ベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）である。ｒＡＡＶゲノムは、転写因子をコードする配列に隣接する１つ以上のＡＡＶ ＩＴＲを含み得る。実施形態では、ベクターは、本明細書に開示されるものなどの他の転写制御エレメント、例えば導入遺伝子配列の発現を駆動するために標的細胞において機能的であるプロモーター、エンハンサー、ＰＲＥ及び／又はポリＡ配列をさらに含む。導入遺伝子配列は、哺乳動物細胞で発現される場合にＲＮＡ転写物のプロセシングを容易にするイントロン配列も含み得る。

【0209】

様々な実施形態では、ＡＡＶベクター、例えばｒＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）である。本明細書で使用される場合、「自己相補的」とは、コード領域が、例えば、１つ以上の末端逆位反復（ＩＴＲ）において、分子内二本鎖テンプレートを形成するように設計されていることを意味する。理論に拘束されるものではないが、典型的なＡＡＶゲノムは一本鎖ＤＮＡテンプレートであるため、ＡＡＶゲノムの律速段階には第２鎖合成が関与することが多い。Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７０（５）：３２２７－３４；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７０（１）：５２０－３２。しかし、ｓｃＡＡＶゲノムの場合、感染すると、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、第２の鎖の細胞媒介性合成を待つのではなく複製及び転写の準備ができている１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、ｓｃＡＡＶベクターであり、より速い且つ／又は増加した発現を提供する。

【0210】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、１つ以上（例えば、全て）のＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を欠如している。ＡＡＶベクターは、任意の適切なＡＡＶ血清型からの核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を（例えば、そのＩＴＲに）含み得る。適切なＡＡＶ血清型には、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ－ＤＪ及びＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶｒｈ３７、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ及びＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＡＡＶベクター、例えばｓｃＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２からの核酸配列、例えばＡＡＶ２からのＩＴＲ配列を含み得る。ＡＡＶベクター、例えばｓｃＡＡＶベクターは、複数の血清型からの核酸も含み得る。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。例えば、ＡＡＶ１の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７で提供され；ＡＡＶ２の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）で提供され；ＡＡＶ３の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９で提供され；ＡＡＶ４の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９で提供され；ＡＡＶ５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６で提供され；ＡＡＶ－６の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２で提供され；ＡＡＶ７及びＡＡＶ８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９で提供され；ＡＡＶ９ゲノムはＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）で提供され；ＡＡＶ１０ゲノムはＷｉｌｌｉａｍｓ，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６で提供され；ＡＡＶ１１ゲノムはＭｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３で提供される。

【0211】

いくつかの実施形態では、機能的末端逆位反復（ＩＴＲ）配列は、例えば、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製及びパッケージングをサポートするために使用され得る。したがって、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、シスでウイルスの複製及びパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）を提供する配列を含み得る。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列であり得るが、そうである必要はなく、配列が機能的レスキュー、複製及びパッケージングを提供する限り、例えばヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって変更され得る。ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０及びＡＡＶ－１１を含むが、これらに限定されない、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型からのものであり得る。ＡＡＶ血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当技術分野で公知である。例えば、ＡＡＶ－１の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７で提供され；ＡＡＶ－２の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）で提供され；ＡＡＶ－３の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９で提供され；ＡＡＶ－４の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９で提供され；ＡＡＶ－５ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６で提供され；ＡＡＶ－６の全ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２で提供され；ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９で提供され；ＡＡＶ－９ゲノムは、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８で提供され；ＡＡＶ－１０ゲノムは、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６で提供され；ＡＡＶ－１１ゲノムは、Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３で提供される。一実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ－２由来のＩＴＲを有するＡＡＶ－９ベクターである。

【0212】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶベクターは、１つ以上のＩＴＲ、例えば２つのＩＴＲを含み、１つは導入遺伝子（例えば、ｈＰＧＲＮをコードする）及び／又は上で論じた他の核酸エレメントの上流にあり、もう１つは下流にある。いくつかの実施形態では、例えばｓｃＡＡＶベクターにおいて、本明細書に開示される核酸は、プロモーター、ミニ遺伝子、導入遺伝子、転写後調節エレメント及び／又はポリＡに対して５’に配置された第１のＩＴＲ及び３’に配置された第２のＩＴＲを含み、例えば、ＩＴＲは、独立して、もう１つのエレメントの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０ヌクレオチド５’及び／又は３’側にある。ＩＴＲ配列は、野生型であり得るか、又は例えばそれが野生型ＩＴＲの１つ以上の機能を保持する限り、１つ以上の変異を含み得る。いくつかの実施形態では、野生型ＩＴＲは、末端分解部位の欠失を含むように改変され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｓｃＡＡＶは、２つのＩＴＲ配列を含み得、ここで、両方は、野生型、変異体又は改変されたＡＡＶ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＩＴＲ配列は、野生型、変異体又は改変されたＡＡＶ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態では、２つのＩＴＲ配列の両方は、野生型、変異体又は改変されたＡＡＶ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態では、「左」又は５’－ＩＴＲは、自己相補的ゲノムの産生を可能にする改変されたＡＡＶ ＩＴＲ配列であり、「右」又は３’－ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態では、「右」又は３’－ＩＴＲは、自己相補的ゲノムの産生を可能にする改変されたＡＡＶ ＩＴＲ配列であり、「左」又は５’－ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、野生型、変異体又は改変されたＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＩＴＲ配列は、野生型、変異体又は改変されたＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態では、２つのＩＴＲ配列の両方は、野生型、変異体又は改変されたＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態では、「左」又は５’－ＩＴＲは、自己相補的ゲノムの産生を可能にする改変されたＡＡＶ２ ＩＴＲ配列であり、「右」又は３’－ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。いくつかの実施形態では、「右」又は３’－ＩＴＲは、自己相補的ゲノムの産生を可能にする改変されたＡＡＶ２ ＩＴＲ配列であり、「左」又は５’－ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ配列である。１つ以上のＩＴＲに使用され得る例示的な配列を本明細書に記載する。国際公開第２０１９／０９４２５３号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５８７４４号明細書）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に提供されるＡＡＶ ＩＴＲの実施形態も、本明細書に開示されるいずれかのＡＡＶ ＩＴＲに使用され得る。

【0213】

いくつかの実施形態では、ベクターはｒＡＡＶである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、１つ以上の（例えば、全ての）ＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を欠如している。ＡＡＶベクターは、任意の適切なＡＡＶ血清型からの核酸配列（例えば、ＤＮＡ）を（例えば、そのＩＴＲに）含み得る。適切なＡＡＶ血清型には、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０及びＡＡＶ－１１が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＡＡＶベクター、例えばｓｃＡＡＶベクターは、ＡＡＶ－２からの核酸配列、例えばＡＡＶ－２からのＩＴＲ配列を含み得る。ＡＡＶベクター、例えばｓｃＡＡＶベクターは、複数の血清型からの核酸も含み得る。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６；及びＭｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３。

【0214】

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターにおける機能的末端逆位反復（ＩＴＲ）配列は、例えば、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製及びパッケージングをサポートするために使用され得る。したがって、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、シスでウイルスの複製及びパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）を提供する配列を含み得る。ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列である必要はなく、配列が機能的レスキュー、複製及びパッケージングを提供する限り、例えばヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によって変更され得る。ＩＴＲは、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０及びＡＡＶ－１１を含むが、これらに限定されない、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型からのものであり得る。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２；それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６；及びＭｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３。一実施形態では、ベクターは、ＡＡＶ－２由来のＩＴＲを有するＡＡＶ－９ベクターである。

【0215】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるベクター又は核酸配列は、クローニングベクター又は発現ベクターを形成する。そのような実施形態では、ベクターは、ベクターの複製又は維持を容易にする他の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、クローン選択のための選択マーカーをさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクター中の選択マーカーは、原核生物又は真核生物の抗生物質耐性遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクター中の選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクター中の選択マーカーは、アンピシリン耐性遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ピューロマイシン耐性遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態では、ベクター中の選択マーカーは、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む。

【0216】

組換えウイルス
様々な実施形態では、本明細書で論じられる核酸及びベクターは、組換えウイルス粒子などの１つ以上のウイルス粒子中に存在し得る。組換えウイルスは、組換え手段によって生成されたウイルスである。様々な異なるウイルスタイプ、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ＡＡＶ、マウス白血病ウイルスなどが使用され得る。理論に拘束されるものではないが、レンチウイルスなどのレトロウイルスから送達されるベクターは、それらが導入遺伝子の長期の安定した組み込み及び娘細胞への伝播を可能にするため、長期遺伝子導入を提供し得、また低い免疫原性を提供し得る。他の適切なレトロウイルスには、ガンマレトロウイルスが含まれる。例示的なガンマレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、脾限局巣形成ウイルス（ＳＦＦＶ）及び骨髄増殖性肉腫ウイルス（ＭＰＳＶ）並びにそれら由来のベクターを含む。他のガンマレトロウイルスベクターは、例えば、Ｔｏｂｉａｓ Ｍａｅｔｚｉｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”Ｖｉｒｕｓｅｓ．２０１１ Ｊｕｎ；３（６）：６７７－７１３に記載される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、本明細書に開示される核酸又はベクターを含む組換えアデノウイルスである。いくつかの実施形態では、ウイルスは、本明細書に開示される核酸又はベクターを含む組換えＡＡＶである。

【0217】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸又はベクターは、組換えウイルスの製造における使用のためのものである。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸又はベクターは、ｒＡＡＶの製造における使用のためのものである。したがって、様々な実施形態では、ウイルス組成物（ビリオンとも呼ばれる）、例えば上記で開示されるウイルスベクター又は核酸を含むｒＡＡＶウイルス組成物も本明細書で開示される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はその任意の変異体若しくは誘導体である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、キメラＡＡＶ又はその任意の変異体若しくは誘導体である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、アデノウイルス又はその任意の変異体若しくは誘導体である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、レトロウイルス又はその任意の変異体若しくは誘導体である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、レンチウイルス又はその任意の変異体若しくは誘導体である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、ＤＮＡウイルス又はその任意の変異体若しくは誘導体である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、単純ヘルペスウイルス又はその任意の変異体若しくは誘導体である。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、バキュロウイルス又はその任意の変異体若しくは誘導体である。

【0218】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶは、１つ以上のＡＡＶキャプシドタンパク質を含み得る。ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ血清型ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｆｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ及びＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓを含むが、これらに限定されない、組換えウイルスが誘導され得る任意のＡＡＶ血清型からのものであり得る。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ中の１つ以上のキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ－９からのものである。理論に拘束されるものではないが、典型的にはＡＡＶにおいて、３つのキャプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３が多量体化してキャプシドを形成する。キャプシドタンパク質のポリペプチド配列は当技術分野で公知であり、またＡＡＶのゲノムに由来し得る。これらは、本明細書に開示されるＡＡＶウイルス組成物における例示的なキャプシドとして使用することができる。例えば、ＡＡＶ－１の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２０７７で提供され；ＡＡＶ－２の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００１４０１及びＳｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，４５：５５５－５６４｛１９８３）で提供され；ＡＡＶ－３の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿１８２９で提供され；ＡＡＶ－４の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８２９で提供され；ＡＡＶ－５ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０８５７１６で提供され；ＡＡＶ－６の全ゲノムはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００１８６２で提供され；ＡＡＶ－７及びＡＡＶ－８ゲノムの少なくとも一部は、それぞれＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＸ７５３２４６及びＡＸ７５３２４９で提供され；ＡＡＶ－９ゲノムはＧａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：６３８１－６３８８（２００４）で提供され；ＡＡＶ－１０ゲノムはＷｉｌｌｉａｍｓ，（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３（１）：６７－７６で提供され；ＡＡＶ－１１ゲノムはＭｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３３０（２）：３７５－３８３で提供される。キャプシドタンパク質ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ又はＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓは、Ｄｅｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３４：２０４－２０９及びＣｈａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０：１１７２－１１７９に提供される。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、１つ以上のＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ－ＤＪ／８、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶ－ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ－ＰＨＰ．ｅＢ若しくはＡＡＶ－ＰＨＰ．Ｓキャプシド血清型又はその機能的変異体を含むＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、複数のＡＡＶ血清型からのキャプシドの組み合わせを含むＡＡＶである。

【0219】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶ組成物は、ウイルスＤＮＡ複製（ｒｅｐ）、キャプシド形成／パッケージング及び宿主細胞染色体組み込みを指示する１つ以上のシス作用性配列を含み、ＩＴＲ内に含まれる。いくつかの実施形態では、これらの配列の１つ以上は、シスではなくトランスで、例えば宿主細胞でのウイルス製造プロセス中に別個のプラスミド上にも存在し得る。典型的には、３つのＡＡＶプロモーター（その相対的マップ位置でｐ５、ｐ１９及びｐ４０と名付けられている）は、野生型ウイルスのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をコードする２つのＡＡＶ内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。いくつかの実施形態では、これらのプロモーター及び／又はオープンリーディングフレームの１つ以上は、本明細書に開示されるＡＡＶベクター及び／又はＡＡＶビリオンにおいてシスで存在するか、又はＡＡＶウイルス製造プロセス中、例えばウイルスを産生する宿主細胞において、別個のプラスミド上に存在する。２つのｒｅｐプロモーター（ｐ５及びｐ１９）は、単一のＡＡＶイントロン（ヌクレオチド２１０７及び２２２７）の特異的スプライシングと相まって、ｒｅｐ遺伝子から４つのｒｅｐタンパク質（ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２及びｒｅｐ４０）の産生を生じ得る。ｒｅｐタンパク質は、ウイルスゲノムの複製に最終的に関与する複数の酵素特性を有する。ｃａｐ遺伝子は、典型的には、ｐ４０プロモーターから発現され、３つのキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする。選択的スプライシング及び非コンセンサス翻訳開始部位は、３つの関連するキャプシドタンパク質の産生に関与している。単一のコンセンサスポリアデニル化部位は、ＡＡＶゲノムのマップ位置９５に存在する。ＡＡＶのライフサイクル及び遺伝学は、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍ．，１５８：９７－１２９で概説されている。

【0220】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶで使用されるＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３は、以下の配列によってコードされるか又はそれを含む。
ＶＰ１核酸（配列番号８４）：

【化1】

ＶＰ２核酸（配列番号８５）：

【化2】

ＶＰ３核酸（配列番号８６）：

【化3】

ＶＰ１タンパク質（配列番号８７）：

【化4】

ＶＰ２タンパク質（配列番号８８）：

【化5】

ＶＰ３タンパク質（配列番号８９）：

【化6】

【0221】

一実施形態では、組換えウイルスは、ＡＡＶ９キャプシド血清型又はその任意の変異体若しくは誘導体を含むＡＡＶである。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３を含む。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、ｓｃＡＡＶである。

【0222】

様々な実施形態では、本開示の標的細胞は、任意の哺乳動物細胞型であり得る。本開示のいくつかの態様では、核酸及びベクターは、神経組織又は体液又は細胞における発現を調節する。いくつかの実施形態では、神経組織は脳である。いくつかの実施形態では、神経組織は脳の前頭葉である。いくつかの実施形態では、神経組織は脳の側頭葉である。いくつかの実施形態では、神経組織は中枢神経系である。いくつかの実施形態では、神経組織は脊髄である。いくつかの実施形態では、神経細胞はヒト神経細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞はニューロンである。いくつかの実施形態では、神経細胞は星状細胞である。いくつかの実施形態では、神経液は脳脊髄液である。いくつかの実施形態では、非神経組織は肝臓である。いくつかの実施形態では、非神経体液は血漿である。いくつかの実施形態では、非神経細胞は肝細胞である。いくつかの実施形態では、非神経細胞は星状脂肪蓄積細胞である。いくつかの実施形態では、非神経細胞はクッパー細胞である。いくつかの実施形態では、非神経細胞は、肝臓内皮細胞である。いくつかの実施形態では、非神経体液は血漿である。いくつかの実施形態では、非神経体液は血清である。いくつかの実施形態では、非神経体液は血液である。

【0223】

組換えウイルスの産生方法
様々な実施形態では、ニューロン特異的プロモーターを含む組換えウイルスを産生する方法も本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、核酸配列、例えばＡＡＶ又は他のウイルスゲノムをコードするプラスミドは、組換えウイルスを産生するために使用される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及び／又はＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む核酸配列、例えばプラスミドもＡＡＶ又は他のウイルスを調製する際に使用される。アデノウイルスヘルパー機能遺伝子を含む核酸配列、例えばプラスミドも本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐ、ＡＡＶ ｃａｐ及び／又はアデノウイルスヘルパー遺伝子をコードする核酸は、同じ構造、例えば単一のプラスミドに存在し得るか、又はそれらは、別個の構造に存在し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のプラスミドは、ＡＡＶベクターをコードする核酸と共にコンピテント細胞にコトランスフェクトされ、細胞は、組換えウイルスを産生するために培養される。場合により、ＡＡＶウイルスゲノム並びにＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子をコードするプラスミドは、ＡＡＶのヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス、Ｅ１欠失アデノウイルス又はヘルペスウイルス）による感染が許容される細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、トランスフェクション後、細胞内でＡＡＶキャプシドタンパク質を有する感染性ウイルス粒子へと構築される。パッケージングされるＡＡＶゲノム、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される、ｒＡＡＶ粒子を産生するための技術は、当技術分野で公知であり、例えばエレクトロポレーションを含み得る。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶの産生は、単一の細胞（本明細書ではパッケージング細胞として示される）内に存在する以下の成分を含む：ｒＡＡＶベクター、ｒＡＡＶベクターとは別の（すなわちその中にない）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子並びにヘルパーウイルス機能。疑似型化されたｒＡＡＶの生成は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第０１／８３６９２号パンフレットに開示されている。様々な実施形態では、ＡＡＶキャプシドタンパク質は、組換えベクターの送達を増強するように改変され得る。キャプシドタンパク質の改変は、当技術分野で一般的に知られている。例えば、米国特許出願公開第２００５／００５３９２２号明細書及び米国特許出願公開第２００９／０２０２４９０号明細書（これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0224】

様々な実施形態では、ウイルスベクター産生の一般原理を利用して、本明細書に開示されるベクター及びウイルス、例えばｒＡＡＶを産生し得る。Ｃａｒｔｅｒ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１５３３－５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９。様々なアプローチがＲａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：２０７２；Ｈｅｎｎｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３２５１；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９；Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８；米国特許第５，１７３，４１４号明細書；国際公開第９５／１３３６５号パンフレット及び対応する米国特許第５，６５８，７７６号明細書；国際公開第９５／１３３９２号パンフレット；国際公開第９６／１７９４７号パンフレット；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００号明細書；国際公開第９７／０９４４１号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３号明細書）；国際公開第９７／０８２９８号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２号明細書）；国際公開第９７／２１８２５号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７号明細書）；国際公開第９７／０６２４３号パンフレット（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４号明細書）；国際公開第９９／１１７６４号パンフレット；Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ，１３：１２４４－１２５０；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，４：６０９－６１５；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，３：１１２４－１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号明細書；米国特許第５，８７１，９８２号明細書；及び米国特許第６，２５８，５９５号明細書に開示される。前述の文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、特に、ｒＡＡＶ産生に関連する文献のセクションが重視される。

【0225】

パッケージング細胞を産生する例示的な方法は、ＡＡＶ粒子の産生に必要な全ての成分を安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠如するｒＡＡＶベクターをコードするプラスミド（又は複数のプラスミド）、ｒＡＡＶベクターとは別個のＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーが、細胞のゲノムに組み込まれる。ＡＡＶゲノムは、ＧＣテーリング（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１）、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの追加（Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｇｅｎｅ，２３：６５－７３）又は直接の平滑末端ライゲーションによるもの（Ｓｅｎａｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：４６６１－４６６６）などの手順によって細菌プラスミドに導入されている。次に、パッケージング細胞株を、アデノウイルスなどのヘルパーウイルス及び／又はヘルパーウイルスをコードするプラスミドに感染させる。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模産生に適していることである。適切な方法の他の例は、プラスミドではなくアデノウイルス又はバキュロウイルスを使用して、ｒＡＡＶベクター及び／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入する。

【0226】

いくつかの実施形態では、組換えウイルスを産生する方法は、パッケージ化される核酸を提供することを含む。いくつかの実施形態では、核酸はプラスミドである。他の実施形態では、核酸は、第１のＡＡＶ末端反復と第２のＡＡＶ末端反復との間に挿入された導入遺伝子配列を含む。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、ヒトプログラニュリン（ｈＰＧＲＮ）をコードする。いくつかの実施形態では、組換えウイルスを産生する方法は、１つ以上の追加の核酸を提供することを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなる核酸は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及び／又はＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の核酸は、ＡＡＶ血清型１、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型３、ＡＡＶ血清型４、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型６、ＡＡＶ血清型７、ＡＡＶ血清型８又はＡＡＶ血清型９に由来するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の核酸は、ＡＡＶ血清型１、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型３、ＡＡＶ血清型４、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型６、ＡＡＶ血清型７、ＡＡＶ血清型８又はＡＡＶ血清型９に由来するＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の核酸は、１つ以上のアデノウイルスヘルパー機能遺伝子を含む。

【0227】

いくつかの実施形態では、核酸は、コンピテント細胞又はパッケージング細胞にコトランスフェクトされる。コトランスフェクションの方法は当技術分野で公知であり、リポフェクタミン、エレクトロポレーション及びポリエチレンイミンによるトランスフェクションが含まれるが、これらに限定されない。コンピテント細胞又はパッケージング細胞は、浮遊細胞又は付着細胞で培養された非付着細胞であり得る。一実施形態では、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞及びＰｅｒＣ．６細胞（同族の２９３株）などの任意の適切なパッケージング細胞株が使用され得る。一実施形態では、パッケージング細胞はヒト細胞である。一実施形態では、パッケージング細胞はＨＥＫ２９３細胞である。一実施形態では、パッケージング細胞は昆虫細胞である。一実施形態では、パッケージング細胞はＳｆ９細胞である。いくつかの実施形態では、方法は、トランスフェクトされた細胞を培養して組換えウイルスを産生することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、組換えウイルスを回収することを含む。組換えウイルスを回収する方法には、例えば、米国特許第６，１４３，５４８号明細書及び米国特許第９，４０８，９０４号明細書に開示される方法が含まれる。いくつかの実施形態では、組換えウイルスは、細胞培養培地に分泌され、培地から精製される。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞は溶解され、内容物は組換えウイルスを回収するために精製される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ろ過又は遠心分離によってパッケージング細胞から回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、クロマトグラフィーによってパッケージング細胞から回収される。

【0228】

様々な実施形態では、本明細書に開示される核酸を含む細胞、本明細書に開示されるベクターを含む細胞又は本明細書に開示されるウイルスを含む細胞が本明細書に開示される。本明細書に開示される核酸を含む細胞、本明細書に開示されるベクターを含む細胞又は本明細書に開示されるウイルスを含む細胞は、ヒト細胞であり得る。本明細書に開示される核酸を含む細胞、本明細書に開示されるベクターを含む細胞又は本明細書に開示されるウイルスを含む細胞は、昆虫細胞でもあり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸を含む細胞、本明細書に開示されるベクターを含む細胞又は本明細書に開示されるウイルスを含む細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。いくつかの他の実施形態では、本明細書に開示される核酸を含む細胞、本明細書に開示されるベクターを含む細胞又は本明細書に開示されるウイルスを含む細胞は、Ｓｆ９細胞である。

【0229】

いくつかの実施形態では、組換えウイルスを産生する方法は、昆虫細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に開示されるような核酸を含むバキュロウイルスで昆虫細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、第１のＡＡＶ末端反復と第２のＡＡＶ末端反復との間に挿入された導入遺伝子配列を含む核酸を含むバキュロウイルスで昆虫細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上のさらなる核酸を含むバキュロウイルスで昆虫細胞をトランスフェクトすることを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなる核酸は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及び／又はＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の核酸は、ＡＡＶ血清型１、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型３、ＡＡＶ血清型４、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型６、ＡＡＶ血清型７、ＡＡＶ血清型８又はＡＡＶ血清型９に由来するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の核酸は、ＡＡＶ血清型１、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型３、ＡＡＶ血清型４、ＡＡＶ血清型５、ＡＡＶ血清型６、ＡＡＶ血清型７、ＡＡＶ血清型８又はＡＡＶ血清型９．ｃに由来するＡＡＶ ｃａｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の核酸は、１つ以上のアデノウイルスヘルパー機能遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、組換えウイルスを産生するのに適した条件下で培養される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、昆虫細胞から回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ろ過又は遠心分離によって昆虫細胞から回収される。いくつかの実施形態では、ウイルスは、クロマトグラフィーによって昆虫細胞から回収される。

【0230】

医薬組成物
様々な実施形態では、医薬組成物が開示される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、本明細書に開示される１つ以上の核酸、ベクター及び／又はウイルスを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。

【0231】

本開示による核酸、ベクター及び／又は組換えウイルス（例えば、ウイルス粒子）は、薬学的に有用な組成物を調製するために製剤化することができる。例示的な製剤には、例えば、参照によりその全体が組み込まれる米国特許第９，０５１，５４２号明細書及び米国特許第６，７０３，２３７号明細書に開示されているものが含まれる。本開示の組成物は、哺乳動物対象、例えばヒトへの投与のために製剤化することができる。いくつかの実施形態では、送達系は、筋肉内、皮内、粘膜、皮下、静脈内、髄腔内、注射可能なデポ型デバイス又は局所投与のために製剤化され得る。

【0232】

いくつかの実施形態では、送達系が溶液又は懸濁液として製剤化される場合、送達系は、許容される担体、例えば水性担体中にある。様々な水性担体、例えば水、緩衝水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などが使用され得る。これらの組成物は、滅菌及び／又は滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するためにパッケージ化され得るか又は凍結乾燥され得る。いくつかの実施形態では、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と組み合わされる。

【0233】

いくつかの実施形態では、組成物、例えば医薬組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張性調整剤、湿潤剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン等など、生理的条件に近似させるための薬学的に許容される補助物質を含み得る。いくつかの実施形態では、医薬組成物は保存剤を含む。他のいくつかの実施形態では、医薬組成物は保存剤を含まない。

【0234】

使用方法及び処置
理論に拘束されるものではないが、本明細書に記載の核酸及び他の実施形態は、分子（例えば、目的の遺伝子）を条件付きで発現する方法で使用され、前記方法は、発現系、例えば本明細書に記載の核酸分子、本明細書に記載のベクターを含む細胞を、それを必要とする対象に投与することを含み、ａ）前記目的の遺伝子の発現は、そのような処置を受けない対象における前記目的の遺伝子の発現レベルと比べて例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０又は１００倍に増加する。

【0235】

一実施形態では、「処置する」という用語は、本明細書に開示される核酸、ベクター、組換えウイルス又は医薬組成物を含む組成物の有効用量又は有効複数用量を、それを必要とする動物（ヒトを含む）に投与するステップを含む。障害／疾患の発症前に用量が投与される場合、投与は予防的である。障害／疾患の発症後に用量が投与される場合、投与は治療的である。実施形態では、有効用量は、処置中の障害／疾患状態に関連する少なくとも１つの症状を検出可能に緩和（排除又は軽減）し、障害／疾患状態への進行を遅延させるか又は予防し、障害／疾患状態の進行を遅延させるか又は予防し、疾患の程度を軽減し、疾患の寛解（部分又は完全）をもたらし、且つ／又は生存期間を延長する用量である。この用語は、完全な処置（すなわち治癒）及び／又は予防を包含するが、それらを必要としない。いくつかの実施形態では、有効用量は、本明細書に開示されるウイルス１ミリリットル当たり１×１０^１０～１×１０^１５のベクターゲノム（ｖｇ／ｍｌ）を含む。いくつかの実施形態では、有効用量は、本明細書に開示されるウイルス１ミリリットル当たり１×１０^６～１×１０^１０のプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍｌ）を含む。いくつかの実施形態では、有効用量は、本明細書に開示されるウイルス１ミリリットル当たり１×１０^６～１×１０^９の形質導入単位（ＴＵ／ｍｌ）を含む。処置のために企図される病状の例は、本明細書に記載されている。

【0236】

いくつかの実施形態では、処置される疾患は目的の遺伝子の変異によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子の変異は欠失変異である。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子の変異はヌル変異である。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子の変異はインデルである。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子の変異は機能喪失変異である。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子の変異はノックアウト変異である。いくつかの実施形態では、目的の遺伝子の変異はタンパク質の発現及び／又は機能の損失をもたらす。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸、ベクター及び／又はウイルスによる処置を必要とする患者は、投与前に変異についてスクリーニングすることによって同定される。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、対象から細胞又は組織のサンプルを取得し、サンプル中の１つ以上の遺伝子座を配列決定又は遺伝子型決定して、変異の存在を確認することを含む。いくつかの実施形態では、スクリーニングは、唾液、血液及び／又は皮膚細胞などの（ただし、これらに限定されない）サンプルからの遺伝物質に対して実施される。

【0237】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸、ベクター、組換えウイルス又は医薬組成物は、それを必要とする対象を処置するための薬剤の製造において使用される。実施形態では、対象は、目的の遺伝子の１つ以上の変異によって引き起こされる障害に罹患している。

【0238】

様々な実施形態では、本明細書に開示される核酸、ベクター、組換えウイルス又は医薬組成物は、それを必要とする対象に、静脈内投与、直接脳投与（例えば、髄腔内、脳内及び／又は脳室内投与）、鼻腔内投与、耳内投与若しくは眼内経路投与又はそれらの任意の組み合わせによって送達され得る。いくつかの実施形態では、核酸、ベクター、組換えウイルス又は医薬組成物は、髄腔内投与によって送達される。いくつかの実施形態では、核酸、ベクター、組換えウイルス又は医薬組成物は、脳内又は脳室内投与経路によって送達される。いくつかの実施形態では、投与された核酸、ベクター、組換えウイルス又は医薬組成物は、最終的に、直接又は別の組織若しくは体液（例えば、血液）への投与後の移動により、脳、脊髄、末梢神経系及び／又はＣＮＳに送達される。

【0239】

理論に拘束されるものではないが、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、ポリペプチドをコードする遺伝子に、非機能性ポリペプチドを生じる変異を保有する細胞をレスキューし得る。いくつかの実施形態では、分子、例えばタンパク質又はリボ核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）を発現する方法は、本明細書に開示される核酸、ウイルスベクター、ウイルス又は医薬組成物を細胞に送達することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は神経細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、神経細胞はニューロンである。いくつかの実施形態では、送達はインビトロで行われる。いくつかの実施形態では、送達はエクスビボで行われる。いくつかの実施形態では、送達は、全身投与による。いくつかの実施形態では、送達は局所的である。いくつかの実施形態では、送達は、標的組織への直接適用によるものである。いくつかの実施形態では、標的組織は脳である。いくつかの実施形態では、送達は、脳への注射による。いくつかの実施形態では、送達は、髄腔内投与による。理論に拘束されるものではないが、本明細書に開示される方法は、リポフスチン沈着、星状細胞及びミクログリアの活性化及び／又は目的の遺伝子に変異を有するヒト又はマウスの脳における炎症を低減し、したがってそれを必要とする対象に潜在的な利益を提供し得る。

【0240】

様々な実施形態では、本明細書に開示される核酸、ベクター、ウイルス及び医薬組成物は、障害を処置するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸、ベクター、ウイルス及び／又は医薬組成物は、障害を処置するための医薬剤の製造で使用され得る。いくつかの実施形態では、障害は、目的の遺伝子の１つ以上の変異によって引き起こされる。

【0241】

本明細書には、本明細書に記載の核酸分子、本明細書に記載のベクター、本明細書に記載の組換えウイルス、本明細書に記載の細胞又は本明細書に記載の医薬組成物を含むキットも提供される。

【0242】

本開示の１つ以上の実施形態の詳細は、付随する上記の説明に示されている。本明細書に記載のものと類似の又は均等な方法及び材料のいずれも本開示の実施又は試験に使用可能であるが、好ましい方法及び材料を次に記載する。本開示の他の特徴、目的及び利点は、説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形は、特に文脈上明確な規定がない限り、複数形の参照を含む。特に、定義がない限り、本明細書で用いられる科学技術用語は、全て本開示が属する技術分野の当業者により通常理解されるものと同一の意味を有する。本明細書に引用された特許及び刊行物の全ては、特に指示がない限り、適用可能な場合には参照により組み込まれる。以下の実施例は、本開示の好ましい実施形態をより詳細に例示するために提示される。これらの実施例は、添付の特許請求の範囲により規定される開示された主題の範囲を決して限定するものと解釈すべきではない。

【実施例】

【0243】

実施例１：ＴＲＥレポーター
ＴＲＥレポーター構築物の全ては、ｈＰＧＫプロモーター及びＴｅｔ－Ｏｎ ３Ｇコーディング領域を除去し、ＴＲＥ３Ｇｓプロモーターの下流のマルチクローニング部位にホタルルシフェラーゼコーディング配列を挿入し、次いで、複数のテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）を欠失させ、リピートを７から３、２及び１に低減し、それぞれ３×ＴＲＥ、２×ＴＲＥ及び１×ＴＲＥレポーターを発生させることにより、ｐＬＶＸ－ＴｅｔＯｎｅ－Ｐｕｒｏ（ＴａＫａＲａ）から改変された。

【0244】

実施例２：ヒト及びマウスＳＣＮ１Ａレポーター
ヒトＳＣＮ１Ａプロモーターレポーターでは、ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８ｃｈｒ２：１６６１２７８０６－１６６１３０７２０（－鎖）に相関するヒトｓｃｎ１ａ遺伝子の２６７３塩基対（ｂｐ）プロモーター＋２４２ｂｐエクソン配列のフラグメントをヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流にクローニングした。マウスＳＣＮ１Ａプロモーターレポーターでは、マウスｓｃｎ１ａ遺伝子の３０６４ｂｐのプロモーター及び２５６ｂｐエクソン配列を含む配列をＣ５７ＢＬ／６マウス系統のゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。配列は、マウスゲノム参照配列ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０ｃｈｒ２：６６４０９８６２－６６４１３１８１（－鎖）に相関し、ベクター中のホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の直接上流にクローニングされた。

【0245】

実施例３：規格化用レポーター構築物
別々の構築物中のｈＧＰＫプロモーターの下流にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を直接クローニングした。全ての一過性トランスフェクションレポーターアッセイでホタルルシフェラーゼ活性を規格化するためにウミシイタケルシフェラーゼを使用した。

【0246】

実施例４：Ｃａｓ９アクチベーター構築物
ミニヌクレアーゼデッドスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９（ミニＳａ－ｄＣａｓ９）（Ｍａ ｅｔ ａｌ．２０１８）を合成し、哺乳動物発現ベクター中の伸長因子１αプロモーター（ＥＦ１ａ）プロモーターの直接下流にクローニングした。いくつかの場合、それをベクター中にクローニングし、哺乳動物ユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーターにより駆動した。ＶＰ６４、ｐ６５及びＲｔａ（ＶＰＲ）並びにＶＰＲ３を含む転写活性化ドメイン（ＴＡＤ）（Ｃｈａｖｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１５，Ｍａ ｅｔ ａｌ．２０１８）コーディング配列をＣａｓ９遺伝子の３’末端に連結した。ヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ配列をＴＡＤ配列にインフレームで連結した。３つの核局在化配列（ＮＬＳ）をＳａ－ｄＣａｓ９のＮ末端、Ｃａｓ９及びＴＡＤ間並びにＴＡＤ及びＨＡタグ間に配置した。

【0247】

実施例５：ｓｇＲＮＡ構築物
ｓｇＲＮＡの設計では、転写開始部位後の配列を含めて、ＴＲＥプロモーター内のＳａ－Ｃａｓ９プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位ＮＮＧＲＲＴ（ＲはＧ又はＡのいずれかであり得る）、ヒト又はマウスｓｃｎ１ａ近位プロモーター領域を決定することにより、潜在的Ｓａ－Ｃａｓ９結合部位をｉｎ ｓｉｌｉｃｏで同定した。ＳａＣａｓ９トランス活性化性ｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含有するベクター中に各ＰＡＭの５’側２０ヌクレオチドをクローニングした。（Ｍａ ｅｔ ａｌ．２０１８）全てのｇＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡをＵ６プロモーターにより駆動した。

【0248】

実施例６：ジンクフィンガータンパク質アクチベーター構築物
Ｓａ－ｄＣａｓ９－ＴＡＤ１５中のＳａ－ｄＣａｓ９コーディング配列をジンクフィンガータンパク質コーディング配列に置き換えた。Ｅ２Ｃ－ＴＡＤ１５では、ｅｒｂ２／Ｈｅｒ２プロモーター領域のＥ２Ｃ部位に結合するジンクフィンガータンパク質のヒト化コーディング配列を刊行物（Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １９９８）に従って合成し、ＴＡＤ１５配列の５’末端に連結した。ＺＦＰ－Ｃ－ＴＡＤ１５では、ＺＦＰ－Ｃ（Ｚｅｉｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１９）のヒト化コーディング配列を合成し、ＴＡＤ１５配列の５’末端に連結した。（Ｂｅｅｒｌｉ，ＰＮＡＳ １９９８，Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １９９９）に従って、ＳＣＮ１Ａ遺伝子を標的とする配列５’－ＧＧＣ－ＧＡＧ－ＧＡＴ－ＧＡＡ－ＧＣＣ－ＧＡＧ－３’（配列番号９０）のジンクフィンガータンパク質Ｎａｖ－ＺＦ２をＳｐ１Ｃジンクフィンガーフレームワークに構築し、ＴＡＤ１３、ＴＡＤ１４及びＴＡＤ１５配列の５’末端にそれぞれ連結した。１つの核局在化配列（ＮＬＳ）をジンクフィンガータンパク質のＮ末端に、他の１つをＴＡＤ及びＨＡタグ間に配置した。

【0249】

実施例７：細胞及び細胞トランスフェクション
１０％熱不活化ウシ胎仔血清、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，３５０５００６１）及び１×ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１０３７８０１６）が補充された１００μｌのＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１９６５０９２）中２５，０００細胞／ウェルでポリ－Ｄ－リシン被覆９６ウェル黒色透明底プレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３７℃、５％ＣＯ２でプリンティングした。翌日、製造元の説明書に従ってリポフェクタミン３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌ３０００１５）を用いて培養物をトランスフェクトした。１トランスフェクションサンプル当たりの各プラスミドの量は次の通りあった。すなわち、２０ｎｇのミニＳａｄ－Ｃａｓ９－ＶＰＲ、６０ｎｇのｓｇＲＮＡプラスミド、２５ｎｇのＳＣＮ１Ａプロモーターレポータープラスミド及び０．６ｎｇのｈＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド。２日後、ルシフェラーゼ活性を測定した。

【0250】

実施例８：ルシフェラーゼ活性の記録
トランスフェクションの２日後、培養培地を除去し、５０ｕｌフレッシュＤＭＥＭ完全培地を各ウェルに添加した。ＤｕａｌＧｌｏルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｅ２９２０）を用いて製造元の説明書に従ってルシフェラーゼ活性を測定した。簡潔に述べると、５０ｕｌのホタルルシフェラーゼ基質を各ウェルに添加し、サンプルを混合した。室温で１０分後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてホタルルシフェラーゼ活性を記録した。続いて、５０ｕｌのウミシイタケルシフェラーゼ基質を各ウェルに添加し、混合した。室温で１０分後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）でウミシイタケルシフェラーゼ活性を記録した。

【0251】

実施例９：レンチウイルスジンクフィンガータンパク質アクチベーターのパッケージング
１０ｍｌ培養培地を用いて４，０００，０００細胞／ディッシュで２９３Ｔ細胞をポリ－Ｄ－リシン被覆１０ｃｍディッシュにプレーティングした。１日後、リポフェクタミン３０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌ３０００１５）を用いて、ジンクフィンガータンパク質トランスアクチベーターを担持したレンチウイルスベクター及びヘルパープラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ、ｐｓＰＡＸ２）を培養物にトランスフェクトした。４６時間後、培地を採取し、１０，０００×ｇで５分間の遠心分離により培地から細胞デブリを除去した。４９，０００×ｇで９０分間の超遠心分離により上清中のウイルスを濃縮した。ペレットをＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｐｌｕｓ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａ３５８２９０１）中に再懸濁し、アリコートにし、使用まで－８０℃でフリーズした。

【0252】

実施例１０：マウスＧＡＢＡ作動性ニューロン培養及びニューロン遺伝子活性化
胎生１３日目のマウスの内側神経節隆起（ＭＧＥ）からＧＡＢＡ作動性ニューロンを解剖した。製造元のプロトコルに従ってパパイン解離系（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてＭＧＥを単一細胞懸濁液中に解離させ、ポリ－Ｄ－リシンで被覆された９６ウェルプレート上のグリアサポート層にＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ｐｌｕｓ培地中１５，０００ニューロン／ウェルで細胞をプレーティングした。インビトロで２又は３日目（ＤＩＶ）、４時間にわたりニューロン培養物にレンチウイルスを感染させた。７０～９０％感染効率を達成するように各ウイルス用量を選んだ。感染後、プレーンＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で培養物を３回洗浄し、次いで、馴化培地／フレッシュ培地（５０／５０）をプレートに戻し、記載のように培養物を維持した。ＤＩＶ７で、細胞を溶解し、ＲＮＡを採取した。ｑＲＴ－ＰＣＲにより、ＳＣＮ１Ａ及びＭＡＰ２転写物を分析した。各サンプル中のＳＣＮ１Ａレベルを同一サンプルのＭＡＰ２レベルに対して規格化した。転写アクチベーターによるＳＣＮ１Ａ転写物の増加は、ウイルスなしの細胞での規格化ＳＣＮ１Ａ ｍＲＮＡレベルに対する規格化ＳＣＮ１Ａ ｍＲＮＡレベルの倍率により測定される。

【0253】

実施例１１．ＴＲＥプロモーターの活性化のための転写因子
ＴＡＤ１、ＴＡＤ２＋（３つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）配列を有するＴＡＤ２）、ＴＡＤ２－（２つのＮＬＳ配列を有するＴＡＤ２）及びＴＡＤ３は、ミニＳａ－Ｃａｓ９に連結された場合、ＴＲＥ含有プロモーターを活性化する。ＴＲＥ配列を標的とするｓｇＲＮＡを担持したプラスミド、ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター、ＴＲＥプロモーター－ルシフェラーゼ及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。コントロールガイドＲＮＡサンプルからの変化倍率を計算することにより、Ｓａ－ｄＣａｓ９アクチベーターによりトリガーされた相対プロモーター活性を決定した。１×ＴＲＥプロモーターは１つのＴＲＥ部位を含有し；３×ＴＲＥプロモーターはＴＲＥ部位の３リピートを担持する。ＶＰＲ３（Ｍａ ｅｔ ａｌ．２０１８）も同様にミニＳａ－Ｃａｓ９に連結し、陽性転写活性化因子コントロールとして使用した。ＴＲＥを標的とするｓｇＲＮＡの配列は、配列番号６４に列挙される。

【0254】

図１に示されるように、ＴＡＤ１、ＴＡＤ２＋、ＴＡＤ２－は、ＴＲＥプロモーターを活性化する際、ＶＰＲ３と比較して高い活性を示す。

【0255】

実施例１２．ＳＣＮ１Ａプロモーターの活性化のための転写因子
ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター（ＴＡＤ１～ＴＡＤ７）、マウスｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ、マウスｓｃｎ１ａプロモーターを標的とするｇＲＮＡ及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。各ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーターを２０、６．７及び２．２ｎｇ／ウェルでトランスフェクトしたところ、結果は、用量依存性効果を示した。ｓｇＲＮＡ３の配列は、配列番号６５に対応する。結果は図２に示される。

【0256】

ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター（ＴＡＤ７～ＴＡＤ１０）、マウスｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ、マウスｓｃｎ１ａプロモーターを標的とするｇＲＮＡ及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。各ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーターを２０、６．７及び２．２ｎｇ／ウェルでトランスフェクトしたところ、活性ガイドＲＮＡのｓｇＲＮＡ３と共にコトランスフェクトしたとき、結果は、用量依存性活性化を示した。ミニＳａ－ｄＣａｓ９を非活性ガイドＲＮＡのｓｇＲＮＡ１１と共にコトランスフェクトしたとき、プロモーターは、活性化されなかった。ｓｇＲＮＡ３及びｓｇＲＮＡ１１の配列は、それぞれ配列番号６５、配列番号６６に対応する。結果は図３に示される。

【0257】

実施例１３．ｓｇＲＮＡと対合したときのＳＣＮ１Ａプロモーターの活性化のための転写因子
ユビキチンＣプロモーターにより駆動されるミニＳａ－ｄＣａｓ９－ＴＡＤは、活性ｓｇＲＮＡと対合したとき、マウスｓｃｎ１ａプロモーター及びＴＲＥ含有プロモーターを活性化する。様々な量のミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター（ＴＡＤ２、ＴＡＤ９及びＶＰＲ）、マウスｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ又はＴＲＥ含有プロモーター、それぞれＴＲＥ含有プロモーターのためのＴＲＥ ｓｇＲＮＡ；ｍＳＣＮ１ＡプロモーターのためのｓｇＲＮＡ３及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。

【0258】

ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター、マウスｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ又はヒトｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ、ｓｃｎ１ａプロモーターを標的とするｇＲＮＡ及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。新たに作成された転写活性化ドメイン（ＴＡＤ９、ＴＡＤ１１、ＴＡＤ１４及びＴＡＤ１６）は、ＶＰＲ（Ｃｈａｖｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１５）と同等以上の活性及びＶＰ６４よりも強い活性を有する。結果は図５により示される。

【0259】

ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター、ＴＲＥ含有プロモーター又はヒトｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ、ｓｃｎ１ａプロモーターを標的とするｇＲＮＡ及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。新たに作成された転写活性化ドメインは、ＶＰＲ（Ｃｈａｖｅｚ ｅｔ ａｌ．２０１５）と同等以上の活性を有すると共に、ＶＰ６４よりも強い活性を有する。図６は、ＴＲＥ及びヒトＳＣＮ１Ａプロモーターの活性化に関して、ＶＰ６４及びフルＶＰＲと比較したＴＡＤ９、ＴＡＤ１１、ＴＡＤ１２、ＴＡＤ１３、ＴＡＤ１４、ＴＡＤ１５の活性を示す。

【0260】

ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター、マウスｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ、マウスｓｃｎ１ａプロモーターを標的とするｓｇＲＮＡ及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。ｓｇＲＮＡ４２の配列は、配列番号６７に対応する。図７は、異なる活性ｓｇＲＮＡを用いたマウスＳＣＮ１Ａプロモーターの活性化において、ＶＰ６４及びフルＶＰＲと比較したＴＡＤ９、ＴＡＤ１１、ＴＡＤ１２、ＴＡＤ１３、ＴＡＤ１４、ＴＡＤ１５の活性を示す。

【0261】

実施例１４．Ｕ２ＯＳ細胞株でのＴＲＥレポーター遺伝子の活性化のための転写因子
ミニＳａ－ｄＣａｓ９－アクチベーター、ＴＲＥ含有プロモーター又はヒトｓｃｎ１ａプロモーター－ルシフェラーゼ、ＴＲＥを標的とするｇＲＮＡ配列及びＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼのプラスミドをＵ２ＯＳ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。図８に示されるように、ＴＡＤ８ａ、ＴＡＤ９及びＴＡＤ１５は、ＶＰ６４よりも高い活性を示すと共に、ＴＡＤ１５は、全ての中で最も高い活性を示す。

【0262】

実施例１５．ジンクフィンガータンパク質を含有する転写因子の活性
６ＣＡＧリピートを標的とするジンクフィンガータンパク質ＺＦＰ－Ｃ（配列番号７０、「６ＣＡＧリピート」は、配列番号９３として開示される）及びヒトｅｒｂ２遺伝子プロモーターを標的とするジンクフィンガータンパク質Ｅ２Ｃ（配列番号７１）をＴＡＤ１５に連結した。２つのＥ２Ｃエレメント（Ｅ２Ｃ ２×）を担持するレポーター又は８ＣＡＧリピート（ＣＡＧ２４）（配列番号９４）を担持するレポーターと共に各転写アクチベーターをコトランスフェクトすると共に、ＧＰＫ－ウミシイタケルシフェラーゼをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。２日後、ルシフェラーゼ活性を読み取った。ウミシイタケルシフェラーゼ活性でホタルルシフェラーゼ活性を規格化することにより、プロモーター活性を計算した。転写因子は、プロモーターを特異的に活性化した。すなわち、Ｅ２Ｃ－ＴＡＤ１５は、Ｅ２Ｃエレメント含有プロモーターのみを活性化し；ＺＦＰ－Ｃ－ＴＡＤ１５は、ＣＡＧリピート含有プロモーターのみを活性化した。図９は、遺伝子転写を増強するためにジンクフィンガータンパク質に連結されたＴＡＤ１５の活性を示す。

【0263】

ジンクフィンガータンパク質Ｅ２Ｃ（配列番号７１）は、ヒトｅｒｂ２遺伝子プロモーター中のエレメントを認識する（Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ １９９８）。Ｅｒｂ２は、レセプタータンパク質Ｈｅｒ２をコードする。Ｅ２Ｃ－ＴＡＤ１５をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。Ｅ２Ｃ－ＴＡＤ１５上にタグ付けされたヘマグルチニン（ＨＡ）の染色により、トランスフェクト細胞を同定した。細胞表面上のＨｅｒ２の免疫染色により、Ｈｅｒ２発現レベルを定量した。Ｅ２Ｃ－ＴＡＤ１５（ＨＡ陽性）を有する細胞は、非トランスフェクト細胞（ＨＡ陰性）と比較して３倍超のＨｅｒ２レベルを示した。結果は、図１０に示される。

【0264】

ＴＡＤ１３、ＴＡＤ１４及びＴＡＤ１５に、それぞれＳＣＮ１Ａプロモーターを標的とするジンクフィンガータンパク質Ｎａｖ－ＺＦ２（配列番号６１）を連結した。それらをレンチウイルス中にパージングして培養ニューロンに感染させるために使用し、７０～９０％形質導入率を達成した。４日後、細胞を溶解してＲＮＡを採取した。ｑＲＴ－ＰＣＲにより、ＳＣＮ１Ａ及びＭＡＰ２転写物を分析した。転写アクチベーターによるＳＣＮ１Ａ転写物の増加は、ウイルスなしの細胞での規格化ＳＣＮ１Ａ ｍＲＮＡレベルに対する規格化ＳＣＮ１Ａ ｍＲＮＡレベルの倍率により測定される。マウスＧＡＢＡ作動性ニューロンにおける内因性ニューロン遺伝子の活性化でのＴＡＤ１５の活性は、図１１に示される。

【0265】

本明細書に記載の実施例及び態様は、単に例示を目的としたものにすぎず、それらに照らして様々な修正形態又は変更形態が当業者に示唆され、本出願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲に含まれるものと理解される。

【0266】

さらに、本発明の特徴又は態様がマーカッシュグループにより記載される場合、本発明がマーカッシュグループのいずれかの個別のメンバー又はメンバーのサブグループによっても記載されることは、当業者であればわかるであろう。

【0267】

本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献は、各々が参照により個別に組み込まれたのと同程度にその全体が参照により明示的に組み込まれる（又は文脈から決定される通りである）。矛盾を生じた場合、定義を含む本明細書が優先されるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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【国際調査報告】