特表 2024-534424 ボツリヌス神経毒素代替新規素材およびその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-20

(54)【発明の名称】ボツリヌス神経毒素代替新規素材およびその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/49 20060101AFI20240912BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 27/16 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 17/02 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 25/06 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 25/24 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 25/04 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 5/14 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 1/18 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240912BHJP

   A61K 31/352 20060101ALI20240912BHJP

【ＦＩ】

A61K8/49

A61P43/00 111

A61P17/00

A61P27/02

A61P27/16

A61P1/02

A61P17/02

A61P29/00

A61P25/06

A61P25/24

A61P25/00

A61P25/04

A61P5/14

A61P9/00

A61P21/00

A61P1/18

A61P1/04

A61P25/28

A61K31/352

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024516818

(86)(22)【出願日】2022-08-24

(85)【翻訳文提出日】2024-03-14

(86)【国際出願番号】 KR2022012651

(87)【国際公開番号】W WO2023043076

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】10-2021-0124504

(32)【優先日】2021-09-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】508369571

【氏名又は名称】イントロン バイオテクノロジー，インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100130111

【弁理士】

【氏名又は名称】新保 斉

(72)【発明者】

【氏名】ユン、ソン ジュン

(72)【発明者】

【氏名】クォン、アン ソン

(72)【発明者】

【氏名】ジョン、ス ヨン

(72)【発明者】

【氏名】パク、ジ ソン

(72)【発明者】

【氏名】パク、ソン ホ

(72)【発明者】

【氏名】カン、サン ヒョン

【テーマコード（参考）】

4C083

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C083AA082

4C083AA122

4C083AC012

4C083AC022

4C083AC072

4C083AC102

4C083AC122

4C083AC212

4C083AC442

4C083AC482

4C083AC542

4C083AC841

4C083AC842

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4C083CC04

4C083CC05

4C083DD16

4C083EE01

4C083EE11

4C083EE12

4C083EE13

4C083FF01

4C083FF04

4C086AA01

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4C086MA01

4C086MA04

4C086MA13

4C086MA17

4C086MA22

4C086MA23

4C086MA35

4C086MA37

4C086MA41

4C086MA43

4C086MA52

4C086MA55

4C086MA56

4C086MA59

4C086MA63

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA01

4C086ZA08

4C086ZA12

4C086ZA15

4C086ZA33

4C086ZA34

4C086ZA36

4C086ZA66

4C086ZA67

4C086ZA68

4C086ZA89

4C086ZA94

4C086ZC02

4C086ZC06

4C086ZC51

(57)【要約】

ボツリヌス神経毒素代替新規素材およびその製造方法に関し、具体的には、体内安定性を含む物質の安定性が画期的に改善された、ＳＮＡＲＥ複合体の形成を阻害して結果的にアセチルコリン分泌を阻害することができる能力を有するミリセチンアセチル誘導体、およびその製造方法を提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記［化学式１］：

【化1】

で表されるミリセチン誘導体である３－アセチル－ミリセチン（３－Ａｃｅｔｙｌ－Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）を有効成分として含む
ことを特徴とするアセチルコリン（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）分泌阻害効果を提供する組成物。

【請求項2】

前記組成物は、美容目的の化粧料組成物またはアセチルコリン過多分泌に起因した疾患治療目的の薬学的組成物である
請求項１に記載のアセチルコリン（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）分泌阻害効果を提供する組成物。

【請求項3】

前記美容目的は、シワ改善（Ｔｒｅａｔｉｎｇ ｗｒｉｎｋｌｅｓ）、毛穴縮小（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）および皮膚弾力増進（Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｋｉｎ ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を含む群から選択されたいずれかである
請求項２に記載のアセチルコリン（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）分泌阻害効果を提供する組成物。

【請求項4】

前記アセチルコリン過分泌に起因した疾患は、斜視（Ｃｒｏｓｓｅｄ ｅｙｅｓ）、内耳障害（Ｉｎｎｅｒ ｅａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、歯ぎしり（Ｔｅｅｔｈ ｇｒｉｎｄｉｎｇ）、ケロイド性瘢痕（Ｋｅｌｏｉｄ ｓｃａｒｒｉｎｇ）、多汗症（Ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ｓｗｅａｔｉｎｇ）、背中の痛み（Ｂａｃｋ ｐａｉｎ）、ふるえ（Ｔｒｅｍｏｒｓ）、裂肛（Ａｎａｌ ｆｉｓｓｕｒｅ）、臀部奇形（Ｂｕｔｔｏｃｋ ｄｅｆｏｒｍｉｔｙ）、筋損傷（Ｍｕｓｃｌｅ ｉｎｊｕｒｉｅｓ、ｔｗｉｔｃｈｉｎｇ）、慢性片頭痛（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｉｇｒａｉｎｅ）、うつ病（Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、顔面神経障害（Ｆａｃｉａｌ ｎｅｒｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、頸部疼痛（Ｎｅｃｋ ｐａｉｎ、ｓｐａｓｍｓ）、甲状腺障害（Ｔｈｙｒｏｉｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、心筋障害（Ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、上肢硬直（Ｕｐｐｅｒ ｌｉｍｂ ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ）、膵臓障害（Ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、過敏性腸症候群（Ｉｒｒｉｔａｂｌｅ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、肉割れ（Ｓｔｒｅｔｃｈ ｍａｒｋｓ）、および小児脳性麻痺（Ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｐａｌｓｙ）を含む群から選択されたいずれかである
請求項２に記載のアセチルコリン（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）分泌阻害効果を提供する組成物。

【請求項5】

下記［化学式１］：

【化2】

で表されるミリセチン誘導体３－アセチル－ミリセチン（３－Ａｃｅｔｙｌ－Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）の製造方法であって、
（Ａ）外部の空気と水分が添加されないようにした窒素雰囲気中で無水ピリジン（Ｐｙｒｉｄｉｎｅ ａｎｈｙｄｒｏｕｓ）に溶けたミリセチンに無水酢酸（Ａｃｅｔｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）を添加して反応させるステップと、
（Ｂ）エチルアセテート（Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ；ＥＡ）で抽出するステップと、
（Ｃ）エチルアセテート（Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ；ＥＡ）抽出物を減圧乾燥するステップと、
（Ｄ）減圧乾燥した試料にジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ）を添加し、次いでリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ；ｐＨ７．０）を添加して希釈するステップと、
（Ｅ）希釈した試料を反応（Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させて副産物を分解するステップと、
（Ｆ）凍結乾燥するステップと、を含む
ことを特徴とする方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ボツリヌス神経毒素（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）代替新規素材およびその製造方法に関し、より詳細には、体内安定性（ｉｎ ｖｉｖｏ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を含む物質の安定性が画期的に改善された、アセチルコリン（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）分泌を阻害することができる能力を有するミリセチン（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）アセチル誘導体（Ａｃｅｔｙｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、およびその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ボツリヌス神経毒素（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ）は、神経細胞においてシナプス前膜（Ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）とシナプス小胞（Ｓｙｎａｐｔｉｃ ｖｅｓｉｃｌｅ）の結合（Ｄｏｃｋｉｎｇ）に関与するＳＮＡＲＥ（Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｎ－ｅｔｈｙｌｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆａｃｔｏｒ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質（Ｐｒｏｔｅｉｎ）を加水分解して結果的にアセチルコリン（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）分泌を阻害し、究極的には神経伝達を遮断することにより、シワ改善（Ｔｒｅａｔｉｎｇ ｗｒｉｎｋｌｅｓ）などの美容的施術だけでなく、斜視（Ｃｒｏｓｓｅｄ ｅｙｅｓ）、多汗症（Ｅｘｃｅｓｓｉｖｅ ｓｗｅａｔｉｎｇ）などのアセチルコリン過多分泌が原因である１００余種の疾病治療に活用できる物質である。

【0003】

ボツリヌス神経毒素は、それ自体が毒素であるため、誤って処置された際に死亡に至らせるおそれがあるだけでなく、アレルギー反応を誘発し、言葉が不自然になったり表情がぎこちなくなったり瞼が閉じられなくなったりするなどの副作用を持っていることが知られている。一般的に、使用量の調節失敗、および望まない筋肉にボツリヌス神経毒素が広がる現象などが原因となり、これらの副作用は、ボツリヌス神経毒素が体内で分解されるか或いは新しい神経が形成されて正常な機能を回復すれば解消できるが、これは数ヶ月の期間がかかったりもする。このような理由から、ボツリヌス神経毒素は、美容目的または医学的目的で使用する上で相当な水準の注意が要求される。ボツリヌス神経毒素は、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）という嫌気性微生物の培養によって生産するが、この菌は非常に致命的であるため、培養過程から分離精製、廃棄および殺菌に至るまでの全過程が厳しく管理されなければならない。

【0004】

このような理由から、ボツリヌス神経毒素を代替することができる多様な素材の開発が試みられている。その例としては（特許文献１－８）、タンパク質またはポリペプチド（Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）を使用しようとする場合（韓国特許公開第１０－２０１２－０００１９６４号；韓国特許公開第１０－２０１２－０１２２９９９号）、天然のポリフェノール（Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ）を利用しようとする場合（韓国特許公開第１０－２００８－００８３４３８号；韓国特許公開第１０－２００８－００９１７３５号；韓国特許公開第１０－２０１１－００１７５９９号；韓国特許公開第１０－２０１６－００５８７３９号）、ミリセチン（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）誘導体（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）を利用しようとする場合（韓国特許公開第１０－２０１７－００１５８４５号；韓国特許公開第１０－２０１７－００９１５５４号）などがあった。その中で、海外では、ペプチドを活用した疑似ボツリヌス神経毒素素材が開発されて商品化されている。Ｌｉｐｏｔｅｃ社で開発したアルジルリン（Ａｒｇｉｒｅｌｉｎｅ）がその例である。しかし、ボツリヌス神経毒素代替剤の商業的成功は、様々な欠点により未だ微々たる水準である。

【0005】

これにより、既存のボツリヌス神経毒素代替素材の欠点を克服することができながらもボツリヌス神経毒素の副作用および問題点までも解決することができる新規素材の開発が求められている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】大韓民国特許公開第１０－２０１２－０００１９６４号

【特許文献2】大韓民国特許公開第１０－２０１２－０１２２９９９号

【特許文献3】大韓民国特許公開第１０－２００８－００８３４３８号

【特許文献4】大韓民国特許公開第１０－２００８－００９１７３５号

【特許文献5】大韓民国特許公開第１０－２０１１－００１７５９９号

【特許文献6】大韓民国特許公開第１０－２０１６－００５８７３９号

【特許文献7】大韓民国特許公開第１０－２０１７－００１５８４５号

【特許文献8】大韓民国特許公開第１０－２０１７－００９１５５４号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

そこで、本発明者らは、既存のボツリヌス神経毒素代替素材のうち、ミリセチン誘導体が、体内安定性を含む物質の安定性が減少するという点と、これを解決すればより価値のあるボツリヌス神経毒素代替素材を開発することができるという点に着目し、既存のミリセチン誘導体の安定性問題を解決するために鋭意努力した結果、既存の公開されたミリセチン誘導体と比較して安定性が画期的に改善された物質およびその製造方法を開発することにより、本発明を完成した。

【0008】

そこで、本発明の目的は、ボツリヌス神経毒素代替素材として活用できる、安定性が画期的に改善された、ＳＮＡＲＥ複合体の形成を阻害して結果的にアセチルコリン分泌を阻害することができる能力を有する［化学式１］のミリセチンアセチル誘導体（３－アセチル－ミリセチン；３－Ａｃｅｔｙｌ－Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ）を提供することにある。

【0009】

【化1】

【0010】

本発明の他の目的は、［化学式１］で表されるミリセチンアセチル誘導体の製造方法を提供することにある。

【0011】

本発明の別の目的は、前記［化学式１］で表されるミリセチンアセチル誘導体を有効成分として含むボツリヌス神経毒素代替美容目的の化粧料組成物を提供することにある。

【0012】

本発明のさらに別の目的は、前記［化学式１］で表されるミリセチンアセチル誘導体を有効成分として含む、アセチルコリン過分泌により発生する疾患の治療用薬学的組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0013】

したがって、本発明の一態様によれば、本発明は、ＳＮＡＲＥ複合体の形成を阻害して結果的にアセチルコリン分泌を阻害することができる能力を有する［化学式１］で表されるミリセチンアセチル誘導体を提供する。

【0014】

もちろん、前記［化学式１］を基本骨格としながら追加の誘導体化（Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）を適用しても、本発明の効果を得ることができるのは、本発明内で自明である。

【0015】

本発明の他の一態様によれば、本発明は、［化学式１］で表されるミリセチンアセチル誘導体を有効成分として含む、美容目的の化粧料組成物を提供する。

【0016】

前記美容目的には、シワ改善、毛穴縮小（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｐｏｒｅ ｓｉｚｅ）、皮膚弾力増進（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｋｉｎ ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ）などを提示することができるが、これに限定されないのは当然である。前記シワの例として、眉の垂れ（Ｂｒｏｗ ｄｒｏｏｐ）、目じりの小皺（Ｃｒｏｗ’ｓ－ｆｅｅｔ）、鼻唇襞（Ｎａｓｏｌａｂｉａｌ ｆｏｌｄｓ）、口唇の縦じわ（Ｍｏｕｔｈ ｆｒｏｗｎ）、首のシワ（Ｎｅｃｋ ｗｒｉｎｋｌｅｓ）、額のシワ（Ｆｏｒｅｈｅａｄ ｌｉｎｅｓ）、眉間のシワ（Ｆｒｏｗｎ ｌｉｎｅｓ）、目の下のクマ（Ｔｅａｒ ｔｒｏｕｇｈｓ）、顎の垂れ肉（Ｊｏｗｌｓ）などを提示することができるが、これに限定されないのは当然である。

【0017】

本発明の一側面において、「化粧料組成物」は、人体の外観を美しくする全ての組成物を含む概念であって、本開示の美容目的の化粧料組成物は、生体リズムに伴う生理的な現象によって皮膚での悪影響を抑制して人体の外観を美しくする組成物を指す概念であるが、これに限定されるものではない。

【0018】

本発明の一側面において、化粧料組成物は、基本的に皮膚に塗布されるものであるので、当業分野の化粧料組成物を参照して通常製造される如何なる剤形にも製造できる。一例として、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーションおよびスプレーなどに剤形化できるが、これに限定されるものではない。より詳細には、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、スプレーまたはパウダーの剤形などに製造できる。

【0019】

本発明の一側面において、本発明の剤形がペースト、クリームまたはゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛などが含まれ得る。

【0020】

本発明の一側面において、本発明の剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、ポリアミドパウダーなどが含まれることができ、特にスプレーである場合には、さらにクロロフルオロヒドロカーボン、プロパン／ブタン、ジメチルエーテルなどの推進体が含まれることができる。

【0021】

本発明の一側面において、本発明の剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤、乳濁化剤などが含まれることができ、具体的には、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾアート、プロピレングリコール、１，３－ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステルなどが含まれることができる。

【0022】

本発明の一側面において、本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノール、プロピレングリコールなどの液状希釈剤；エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル、ポリオキシエチレンソルビタンエステルなどの懸濁剤；微結性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天、トラガカントなどが含まれることができる。

【0023】

本発明の一側面において、本発明の剤形が界面活性剤含有クリンジングである場合には、担体成分として脂肪族アルコールサルフェート、脂肪族アルコールエーテルサルフェート、スルホコハク酸モノエステル、イセチオネート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウレート、サルコシネート、脂肪酸アミドエーテルサルフェート、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物性油、ラノリン誘導体またはエトキシル化グリセロール脂肪酸エステルなどが用いられることができる。

【0024】

本発明の他の一態様によれば、本発明は、［化学式１］で表されるミリセチンアセチル誘導体を有効成分として含むアセチルコリン過分泌に起因する疾患治療目的の薬学的組成物を提供する。

【0025】

前記アセチルコリン過分泌に起因した疾患には、斜視、内耳障害（Ｉｎｎｅｒ ｅａｒ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、歯ぎしり（Ｔｅｅｔｈ ｇｒｉｎｄｉｎｇ）、ケロイド性瘢痕（Ｋｅｌｏｉｄ ｓｃａｒｒｉｎｇ）、多汗症、背中の痛み（Ｂａｃｋ ｐａｉｎ）、ふるえ（Ｔｒｅｍｏｒｓ）、裂肛（Ａｎａｌ ｆｉｓｓｕｒｅ）、臀部奇形（Ｂｕｔｔｏｃｋ ｄｅｆｏｒｍｉｔｙ）、筋損傷（Ｍｕｓｃｌｅ ｉｎｊｕｒｉｅｓ、ｔｗｉｔｃｈｉｎｇ）、慢性片頭痛（Ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｉｇｒａｉｎｅ）、うつ病（Ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、顔面神経障害（Ｆａｃｉａｌ ｎｅｒｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、頸部疼痛（Ｎｅｃｋ ｐａｉｎ、ｓｐａｓｍｓ）、甲状腺障害（Ｔｈｙｒｏｉｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、心筋障害（Ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、上肢硬直（Ｕｐｐｅｒ ｌｉｍｂ ｓｐａｓｔｉｃｉｔｙ）、膵臓障害（Ｐａｎｃｒｅａｓ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、過敏性腸症候群（Ｉｒｒｉｔａｂｌｅ ｂｏｗｅｌ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、肉割れ（Ｓｔｒｅｔｃｈ ｍａｒｋｓ）、小児脳性麻痺（Ｊｕｖｅｎｉｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｐａｌｓｙ）などがあり、これに限定されないのは当たり前である。

【0026】

本発明の薬学的組成物に含まれる、薬学的に許容される担体は、製剤の際に通常用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物は、上記の成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含むことができる。

【0027】

本発明の［化学式１］で表されるミリセチンアセチル誘導体を有効成分として含む薬学的組成物は、経口投与または非経口投与によって投与することができ、非経口投与の場合には、静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与、鼻腔内投与または局部投与を用いて投与することができるが、これに限定されるものではない。

【0028】

本発明の［化学式１］で表されるミリセチンアセチル誘導体を有効成分として含む薬学的組成物は、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施し得る方法によって、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を用いて製剤化されることにより、単位用量形態で製造されるか、或いは多用量容器内に内入させて製造されてもよい。この時、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液または乳化液形態であるか、或いはエキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含んでもよい。

【0029】

また、前記薬学的組成物の好適な塗布、噴霧および投与量は、製剤化方法、投与方式、年齢、体重、性、疾病症状の程度、食餌、投与時間、投与経路、排泄速度および反応感応性などの要因によって多様であり、普通に熟練した医師は、所望する治療に効果的な投与量を容易に決定および処方することができる。

【0030】

本発明の他の一態様によれば、本発明は、［化学式１］で表されるミリセチンアセチル誘導体の製造方法を提供する。

【0031】

具体的には、（Ａ）外部の空気と水分が添加されないようにした窒素雰囲気中で無水ピリジン（Ｐｙｒｉｄｉｎｅ ａｎｈｙｄｒｏｕｓ）に溶けたミリセチンに無水酢酸（Ａｃｅｔｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）を添加して反応させるステップと、（Ｂ）エチルアセテート（Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ；ＥＡ）で抽出するステップと、（Ｃ）エチルアセテート（Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ；ＥＡ）抽出物を減圧乾燥するステップと、（Ｄ）減圧乾燥した試料にジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ）を添加し、次いでリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ；ｐＨ７．０）を添加して希釈するステップと、（Ｅ）希釈した試料を反応（Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させて副産物を分解するステップと、（Ｆ）凍結乾燥するステップと、を含むことを特徴とする、［化学式１］で表されるミリセチンアセチル誘導体の製造方法を提供する。

【発明の効果】

【0032】

本発明による［化学式１］で表されるミリセチンアセチル誘導体は、改善された物質安定性を提供することができるので、これを有効成分として含む組成物は、保管および取り扱いがより容易であり、さらに重要には、投与後の高い体内安定性も提供することができるため、より改善された持続的な効能を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】本発明の［化学式１］で表される３－アセチル－ミリセチンの合成過程を示す概略図である。

【図2】本発明の［化学式１］で表される３－アセチル－ミリセチン製造過程において、凍結乾燥試料に対する逆相高性能液体クロマトグラフィー（Ｒｅｖｅｒｓｅｄ ｐｈａｓｅ－ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＲＰ－ＨＰＬＣ）分析結果である。

【図3】最終精製された［化学式１］で表される３－アセチル－ミリセチンのＲＰ－ＨＰＬＣ分析結果である。

【図4】最終精製された［化学式１］で表される３－アセチル－ミリセチンの液体クロマトグラフィー質量分析法（Ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＬＣ／ＭＳ）分析結果である。

【図5】最終精製された［化学式１］で表される３－アセチル－ミリセチンの核磁気共鳴分析法（Ｎｕｃｌｅａｒ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ；ＮＭＲ）の分析結果である。

【図6】本発明による［化学式１］で表される３－アセチル－ミリセチンのアセチルコリン分泌抑制程度を測定した結果である。１は対照群の結果であり、２は０．５μＭ試料の適用結果であり、３は２μＭ試料の適用結果であり、４は１０μＭ試料の適用結果であり、５は２０μＭ試料の適用結果である。

【図7】本発明による［化学式１］で表される３－アセチル－ミリセチン、ミリセチン、およびミリセチン－Ｃ４（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ－Ｃ４）の安定性比較実験結果である。

【図8】効能比較実験結果である。１は対照群（ＰＢＳ処理群；無処理群）であり、２は３－アセチル－ミリセチン処理群、３はミリセチン処理群、４はラリシトリン（Ｌａｒｉｃｉｔｒｉｎ）処理群、５はコンブレトール（Ｃｏｍｂｒｅｔｏｌ）処理群、６はシリンゲチン（Ｓｙｒｉｎｇｅｔｉｎ）処理群、７はミリセチン－Ｃ４（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ－Ｃ４）処理群、８はミリセチン－Ｃ８（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ－Ｃ８）処理群、９はミリセチン－Ｃ１２（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ－Ｃ１２）処理群、１０はミリセチン－Ｃ１６（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ－Ｃ１６）処理群、１１はミリセチン－Ｃ２０（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ－Ｃ２０）処理群、１２はデリバティブ Ｅ４－２（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｅ４－２）処理群、１３はデリバティブ Ｅ４－４（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｅ４－４）処理群、１４はデリバティブ Ｅ４－８（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｅ４－８）処理群、１５はデリバティブ Ｅ４－１２（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｅ４－１２）処理群、１６はデリバティブ Ｅ４－１６（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｅ４－１６）処理群、１７はデリバティブ Ｅ４－１８（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｅ４－１８）処理群、１８はデリバティブ Ｅ４－２０（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｅ４－２０）処理群である。効能比較実験は、対照群（無処理群）の汗面積（Ｓｗｅａｔｉｎｇ ａｒｅａ）を１００％にして相対値を結果として提示した。

【発明を実施するための形態】

【0034】

以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の例示に過ぎず、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

【0035】

実施例１：対照物質およびミリセチンアセチル誘導体の製造
本実施例では、後続の比較実験に使用される対照物質を準備した。対照物質としては、ミリセチン、韓国特許公開第１０－２０１７－００１５８４５号および韓国特許公開第１０－２０１７－００９１５５４号にミリセチン誘導体として実施例に提示された、［化学式２］のラリシトリン、［化学式３］のコンブレトール、［化学式４］のシリンゲチン、リパーゼ触媒下の酪酸ビニル（Ｖｉｎｙｌ ｂｕｔｙｒａｔｅ）を用いたアシル化によって製造されたミリセチン誘導体（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ－Ｃ４）、リパーゼ触媒下のオクタノン酸ビニル（Ｖｉｎｙｌ ｏｃｔａｎｏａｔｅ）を用いたアシル化によって製造されたミリセチン誘導体（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ－Ｃ８）、リパーゼ触媒下のラウリン酸ビニル（Ｖｉｎｙｌ ｌａｕｒａｔｅ）を用いたアシル化によって製造されたミリセチン誘導体（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ－Ｃ１２）、リパーゼ触媒下のパルミチン酸ビニル（Ｖｉｎｙｌ ｐａｌｍｉｔａｔｅ）を用いたアシル化によって製造されたミリセチン誘導体（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ－Ｃ１６）、リパーゼ触媒下のエイコサン酸ビニル（Ｖｉｎｙｌ ｅｉｃｏｓａｎｏａｔｅ）を用いたアシル化によって製造されたミリセチン誘導体（Ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ－Ｃ２０）、塩基および塩化オキサリルを使用した酢酸（Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を用いたアシル化によって製造されたミリセチン誘導体（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｅ４－２）、塩基および塩化オキサリルを使用した酪酸（Ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）を用いたアシル化によって製造されたミリセチン誘導体（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｅ４－４）、塩基および塩化オキサリルを使用したオクタン酸（Ｏｃｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）を用いたアシル化によって製造されたミリセチン誘導体（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｅ４－８）、塩基および塩化オキサリルを使用したラウリン酸（Ｌａｕｒｉｃ ａｃｉｄ）を用いたアシル化によって製造されたミリセチン誘導体（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｅ４－１２）、塩基および塩化オキサリルを使用したパルミチン酸（Ｐａｌｍｉｔｉｃ ａｃｉｄ）を用いたアシル化によって製造されたミリセチン誘導体（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｅ４－１６）、塩基および塩化オキサリルを使用しステアリン酸（Ｓｔｅａｒｉｃ ａｃｉｄ）を用いたアシル化によって製造されたミリセチン誘導体（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｅ４－１８）、塩基および塩化オキサリルを使用したアラキジン酸（Ａｒａｃｈｉｄｉｃ ａｃｉｄ）を用いたアシル化によって製造されたミリセチン誘導体（Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ Ｅ４－２０）を選定した。

【0036】

【化2】

【0037】

【化3】

【0038】

【化4】

【0039】

ミリセチン、ラリシトリン、コンブレトール、シリンゲチンは、商業的に販売されるものを購入して使用した。残りの対照物質として用いられる誘導体は、韓国特許公開第１０－２０１７－００１５８４５号および韓国特許公開第１０－２０１７－００９１５５４号の実施例に提示された方法によって製造して準備した。本発明者らによって開発された［化学式１］のミリセチンアセチル誘導体（３－アセチル－ミリセチン）は、次の方法によって製造した。丸底フラスコ（Ｒｏｕｎｄ ｂｏｔｔｏｍ ｆｌａｓｋ；ＲＢＦ）に攪拌棒（Ｓｔｉｒｒｉｎｇ ｂａｒ）とミリセチン（１当量）を入れて窒素に置換した後、外部の空気と水分が添加されないようにゴム栓で塞いだ後、ＲＢＦに無水ピリジン（Ｐｙｒｉｄｉｎｅ ａｄｖａｎｈｙｄｒｏｕｓ；０．５当量）を添加した後、氷槽（Ｉｃｅ ｂａｔｈ）でミリセチンを全て溶解させる。溶解したミリセチンに注射器を用いて１滴ずつ無水酢酸（Ａｃｅｔｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）を添加する。氷槽で一晩攪拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ）を行う。一晩反応させた溶液に冷たい蒸留水を添加して反応を終結する。反応済みの反応物を分液漏斗（Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ｆｕｎｎｅｌ）に全て入れた後、エチルアセテート（Ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ；ＥＡ）を添加する。反応物がＲＢＦに残っていないようにＥＡをＲＢＦに添加した後、分液漏斗に移す。合成された３－アセチル－ミリセチンがＥＡによく溶けるように分液漏斗を多数回振とうした後、水とＥＡ層が分けられるようにスタンドに静置させる。水とＥＡ層が分けられると、水層のみを除去する（ＥＡの密度が水より低い０．９であるので、水層が下方に位置する）。分液漏斗に飽和塩水（Ｂｒｉｎｅ）を添加した後、合成された３－アセチル－ミリセチンがＥＡによく溶けるように分液漏斗を多数回振とうした後、水とＥＡ層が分けられるようにスタンドに静置させる。水とＥＡ層が分けられると、水層のみを除去する。分液漏斗に蒸留水を添加した後、合成された３－アセチル－ミリセチンがＥＡによく溶けるように分液漏斗を多数回振とうした後、水とＥＡ層が分けられるようにスタンドに静置させる過程と、水とＥＡ層が分けられた後に水層のみを除去する過程を３回繰り返し行う。ＥＡ層を新しいＲＢＦに移した後、減圧乾燥を行う。この過程によって減圧乾燥した試料にＤＭＳＯを入れて１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させる。１０ｍｇ／ｍｌの合成混合物にＰＢＳ（ｐＨ７．０）を添加して１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈する。このように準備した試料を３７℃で２００ｒｐｍにて撹拌しながら一晩反応（Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させる。続いて、一晩反応させた試料を凍結乾燥させる。凍結乾燥した試料は、ＤＭＳＯを用いて溶かす。このように準備した試料に対して表１の条件でＲＰ－ＨＰＬＣを実施して１６分帯のピークフラクション（Ｐｅａｋ ｆｒａｃｔｉｏｎ）のみを取る。

【0040】

【表1】

【0041】

［化学式１］で表される３－アセチル－ミリセチンの合成過程は、図１に要約的に提示されており、ＲＰ－ＨＰＬＣ結果は、図２に提示されており、最終精製された［化学式１］で表される３－アセチル－ミリセチン（純度９９％以上）に対するＲＰ－ＨＰＬＣ分析結果は、図３に提示されている。そして、構造確認のために、通常の方法によってＬＣ／ＭＳ分析と^１Ｈ－ＮＭＲ分析を行ったが、［ＮＭＲ分析の際にはミリセチンのＮＭＲ分析論文（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０１４；１９：１３６４３）を参照した］、その結果が図４と図５に提示されている。

【0042】

実施例２：神経伝達抑制効能の調査
本実施例では、実施例１で製造した［化学式１］で表される３－アセチル－ミリセチンが期待したとおりに神経伝達抑制効能を提供することができるかを調査した。調査は、次の通りに神経伝達物質であるアセチルコリンの分泌を抑制することができるかを、通常の細胞基盤（ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ）有効性評価法であるアセチルコリン分泌分析法（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ）で実施した。アセチルコリン分泌分析法は、アセチルコリン性神経細胞（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ）から分泌するアセチルコリンを細胞水準で定量分析する試験法であって、骨格筋の収縮・弛緩運動信号を伝達するメッセンジャーであるアセチルコリンを定量分析することにより、神経伝達物質の分泌有無を確認することができる試験法である。

【0043】

具体的には、まず、Ｔ７５フラスコ（Ｆｌａｓｋ）を用いて３日に一回ずつ完全血清培地［Ｆｕｌｌ ｓｅｒｕｍ ｍｅｄｉａ：８４％ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉａ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１０％ Ｈｏｒｓｅ ｓｅｒｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）、５％ Ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）］を用いてＰＣ１２細胞の継代培養を行った。継代しない間は、毎日新しい完全血清培地を用いて培地交換を行った。これと同時に、実験の１日目には、コラーゲン－コーティングプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｃｏａｔｅｄ ｐｌａｔｅ）を製作した。コラーゲン－コーティングプレートの製作は、次の方法で行った。０．２μｍのフィルター（Ｆｉｌｔｅｒ）で濾過した滅菌水を用いて２０ｍＭの酢酸（Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）溶液を製造した。これを用いて５０μｇ／ｍｌの濃度のコラーゲン溶液５０ｍｌを製造した。このように製造したコラーゲン溶液をウェル（Ｗｅｌｌ）当たり１ｍｌずつ添加した後、常温で３時間静置（Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させた。静置後に丁寧に各ウェルのコラーゲン溶液を除去した。その次に、１ｍｌのＰＢＳで丁寧に洗浄を行った。その後、無菌ベンチ（Ｃｌｅａｎ ｂｅｎｃｈ）内で自然乾燥（Ａｉｒ ｄｒｙｉｎｇ）させてコラーゲン－コーティングプレートの製造を完了した。実験の２日目には、製造したコラーゲン－コーティングプレートに細胞を接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。細胞接種は、次の方法で行った。Ｔ７５フラスコで培養中のＰＣ１２細胞の培地を除去した後、２ｍｌの無血清培地［Ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ：９９％ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉａ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）］を添加した後、軽くピペッティング（Ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）して細胞を分離し、しかる後に、１５ｍｌのコニカルチューブに移して遠心分離（２，５００ｒｐｍ、３分）を行った。遠心分離の後、上澄み液を除去し、無血清培地１ｍｌを用いて細胞を再浮遊（Ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）させた後、細胞数計数（ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）を行った。その後、無血清培地を用いて２×１０^５ｃｅｌｌ／ｍｌのＰＣ１２細胞浮遊液を準備した後、これを準備しておいたコラーゲン－コーティングプレートにウェル当たり１ｍｌずつ分注した後、プレートを２４時間培養（ＣＯ_２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ、３７℃）する方式で細胞接種を行った。実験開始３日目には、培養しているプレートから培地を除去した後、ＮＧＦ培地［９８．６％ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉａ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．４％（２５μｇ／ｍｌ）ＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｒ－２．５Ｓ ｆｒｏｍ ｍｕｒｉｎｅ ｓｕｂｍａｘｉｌｌａｒｙ ｇｌａｎｄ；Ｓｉｇｍａ）］で交換する方式でＮＧＦ処理を行った。ＮＧＦ処理の後、プレートを５日間追加培養した（ＣＯ_２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ、３７℃）。実験８日目に次の方法で試料処理および分析を行った。５日間培養したＰＣ１２細胞のプレートから培地を除去し、無血清培地９９５μｌずつを添加した後、ＤＭＳＯを用いて準備した０．５μＭ、２μＭ、１０μＭ、２０μＭの３－アセチル－ミリセチン試料を各ウェルに５μｌずつ添加した後、１８時間培養（ＣＯ_２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ、３７℃）した。対照群にはＤＭＳＯを５μｌ添加した。１８時間培養の後、アセチルコリン分泌分析キット（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ ｋｉｔ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて製品の説明に従って定量分析を行った。その結果が図６に提示されている。

【0044】

この結果から、本発明の［化学式１］で表されるミリセチン誘導体（３－アセチル－ミリセチン）も、ＳＮＡＲＥ複合体の形成を阻害して結果的にアセチルコリン分泌を阻害することができることを確認することができた。これは、本発明の［化学式１］で表されるミリセチン誘導体（３－アセチル－ミリセチン）が神経伝達遮断効果を提供することができることを示す。

【0045】

実施例３：物質安定性の比較
本実施例では、安定性比較実験を行った。極端な条件比較のために一日放置条件で行った。ちなみに、既存のミリセチンまたはミリセチン誘導体は、約２時間程度だけ放置しても大部分が分解されてなくなる。安定性実験は、次のとおりに行った。１０ｍｇ／ｍｌの濃度となるようにＤＭＳＯを用いて準備した試料にＰＢＳ（ｐＨ７．０）を添加して１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈させる（１／１０希釈）。このように準備した試料を２００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で１日間放置（Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）させた。放置した試料を凍結乾燥した後、これをＤＭＳＯに溶かして、前に提示した条件と同一の条件でＲＰ－ＨＰＬＣ分析を行って安定性を比較した。その結果が表２に提示されている。

【0046】

【表2】

【0047】

理解を助けるために、代表的な実験結果（ミリセチン、ミリセチン－Ｃ４、および３－アセチル－ミリセチン）を図７に提示した。

【0048】

以上の結果から、本発明の［化学式１］で表されるミリセチン誘導体（３－アセチル－ミリセチン）が、既存に報告されたミリセチン誘導体が提供することができない程度の改善された安定性を提供することができることを確認することができた。このような改善された安定性は、［化学式１］で表されるミリセチン誘導体（３－アセチル－ミリセチン）が適用されて製造された最終製品の保管および流通において大きい利点として作用することができる。また、本実施例の実験条件が体内の条件とも類似するので、これから、本発明の［化学式１］で表されるミリセチン誘導体（３－アセチル－ミリセチン）が改善された体内安定性も提供することができ、その結果としてより増進した効能を提供することも推定することができる。

【0049】

実施例４：組成物の製造
本実施例では、ミリセチンを含む様々なミリセチン誘導体が捕集されたナノ粒子（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）を製造した。実施例５の効能比較実験を韓国特許公開第１０－２０１７－００９１５５４号の実施例で提示している方法で実施しようとするため、経皮伝達（Ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）に使用できるナノ粒子を製造した。具体的には、（１）脂質層（Ｌｉｐｉｄ ｐｈａｓｅ）の製造、（２）水溶液層（Ｗａｔｅｒ ｐｈａｓｅ）の製造、および（３）脂質－ナノ粒子の製造（Ｌｉｐｉｄ－ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の順に行った。詳細な製造法は、次の通りである。

【0050】

４．１ 脂質層の製造
まず、脂質層を次の方法で製造した。トリステアリン（Ｔｒｉｓｔｅａｒｉｎ）７０ｍｇとトリカプリリン（Ｔｒｉｃａｐｒｙｌｉｎ）３０ｍｇを定量してガラス反応容器（Ｇｌａｓｓ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｖｉａｌ）に入れて混合した後、８５℃の恒温槽（Ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で次のステップの実施前まで保管する。２ｍｇのミリセチンまたはミリセチン誘導体をアセトン１ｍｌに溶かして準備した後、これを前で準備して保管していた脂質混合液（Ｌｉｐｉｄ ｍｉｘｔｕｒｅ）と混ぜて８５℃を維持しながら３０分間撹拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ）する。３０分撹拌が終わった後、混合されているアセトンを除去するために減圧乾燥（Ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）を行い、このように準備された脂質層は、８５℃の恒温槽に保管する。

【0051】

４．２ 水溶液層の製造
水溶液層の製造は、ガラス反応容器にブリッジ（Ｂｒｉｊ（登録商標） Ｓ１００、０．９７３５ｇ）とプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｐ－１２３、０．９７３５ｇ）をそれぞれ定量して添加し、１０ｍｌの水（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ）を添加した後、８５℃を維持しながら１２時間攪拌する方式で行った。

【0052】

４．３ 脂質－ナノ粒子の製造
脂質層（体積比で０．５）と水溶液層（体積比で９．５）を５０ｍｌのコニカルチューブ（Ｃｏｎｉｃａｌ ｔｕｂｅ）に入れて混ぜる。このとき、脂質層と水溶液層は８５℃に維持され続けるようにしなければならない。このように準備した混合液を８５℃に維持しながら、高速混合器（Ｈｉｇｈ ｓｐｅｅｄ ｂｌｅｎｄｅｒ）を用いて８，０００ｒｐｍで１分間均質化（Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｉｎｇ）した後、１０，０００ｒｐｍで１分間さらに均質化（Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｉｎｇ）した。次いで、チップ型超音波器（Ｔｉｐ－ｔｙｐｅ ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて８５℃に維持しながら１秒作動し、１秒停止する方式で４分間６０％の強さ（Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ）で超音波混合（Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）を行う。このように準備した試料入りのコニカルチューブを、２５℃の水が満たされたビーカーに浸して撹拌しながら４５℃まで冷やした後、チップ型超音波器を用いて１秒作動し、１秒停止する方式で４分間６０％の強さで超音波混合を行う。製造された試料は、冷蔵（４℃）保管する

【0053】

実施例５：効能比較実験１
実施例４で製造した組成物を用いて効能比較実験を行った。効能比較実験は、韓国特許公開第１０－２０１７－００９１５５４号の実施例に提示された方法によって多汗症に対する効果を測定する方式で行った。具体的には、実施例４で準備した組成物を市販の日焼け止めクリーム１ｍｌに１ｍｇの濃度で混ぜて試験試料を準備した。対照群（無処理群）は、組成物を含まない日焼け止めクリームのみを処理し、処理群は、それぞれの組成物を含む日焼け止めクリームを処理した。両手に試験試料を処理した後、被実験者に重量を測定した化粧コットンパフを５分間両手に握っているようにした後、回収して再び化粧コットンパフの重量を測定して増加重量を計算した。処理群当たり１０人の平均値を結果として表３に提示した。対照群（無処理群）の平均汗重量を１００％にして、その比例値を結果として提示した。

【0054】

【表3】

【0055】

以上の結果から、本発明の［化学式１］で表されるミリセチン誘導体（３－アセチル－ミリセチン）が、既存に報告されたミリセチン誘導体が提供することができない程度の改善された効果を提供することができることが分かる。これは、改善された体内安定性によるものと解釈することができる。

【0056】

実施例６：効能比較実験２
マウスを用いた追加効能比較実験を行った。また、実施例４で製造した組成物を用いた。具体的な実験方法を提示すると、次の通りである。６週齢の雄ＩＣＲマウス（体重：２５～３５ｇ）１８０匹を無作為に１８個のグループに分けた後（グループ当たり１０匹のマウス）、皮膚塗布の方法で処置した。具体的には、８０ｍｇ／ｋｇのアルファキサン（Ａｌｆａｘａｎ）と１０ｍｇ／ｋｇのランパン（Ｒｏｍｐｕｎ）とが混合された溶液を腹腔内注射してマウスを１時間以上麻酔させた。その後、麻酔したマウスの右側後足の足裏に試料を塗布した。陰性対照群は、０．８ｍｌ／ｋｇの用量でＰＢＳ（ｐＨ７．４）を塗布し、処置群は、実施例４で製造した各組成物（ＰＢＳに浮遊して製造）を０．８ｍｇ／ｋｇの用量で塗布した。塗布した試料が十分に吸収されるように試料を塗布したマウスを３０分間そのまま維持させた。その後、足裏の試料を拭き取った後、エタノールに溶けている３．５％のヨウ素溶液（ｗ／ｖ）を再び塗布した。１分間乾燥させた後、ひまし油（Ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）に溶けている１０％澱粉溶液（ｗ／ｖ）をさらに塗布した。澱粉溶液を塗布した直後に１２００万画素のデジタルカメラを用いて同一の条件（距離、倍率および露出）ですべてのマウスの足裏を写真撮影した。そして、撮影した写真に対してイメージ分析によって汗面積（Ｓｗｅａｔｉｎｇ ａｒｅａ）を分析した。その結果が図８に提示されている。

【0057】

この結果からも、本発明の［化学式１］で表されるミリセチン誘導体（３－アセチル－ミリセチン）が、既存に報告されたミリセチン誘導体が提供することができない程度の改善された効果を提供することができることを確認することができた。これも、改善された体内安定性のためと解釈することができる。

【0058】

実施例７：効能比較実験３
皮膚シワの改善に対する効能比較実験を行った。３０～５０歳の女性７２人を４人ずつ１つの群に区分して実験を行った。実験が始まる前に目下のレプリカ（Ｒｅｐｌｉｃａ）を通常の方法で採取し、レプリカの採取後１時間経過時点に、実施例４で準備した組成物をＰＢＳを用いて１ｍｇ／ｍｌの濃度となるように準備した試験試料（５ｍｌ）を各実験群別に区分して顔面部に塗布するようにした。対照群は、ＰＢＳを塗布した。塗布後６時間経過時点に、目下の同一部位からレプリカを再び採取した。採取したレプリカに対する画像分析によって皮膚シワの２次元的分析を実施する方式で皮膚シワの密度（Ｄｅｒｍａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｓｋｉｎ ｗｒｉｎｋｌｅ）を比較測定した。画像分析による皮膚シワ密度の測定結果は、試験試料塗布前の皮膚シワ密度に対する塗布後の皮膚シワ密度の比を平均してその結果を下記表４に示した。

【0059】

【表4】

【0060】

この結果からも、本発明の［化学式１］で表されるミリセチン誘導体（３－アセチル－ミリセチン）が、既存に報告されたミリセチン誘導体が提供することができない程度の改善された効果を提供することができることを確認することができた。

【0061】

以下に、本発明の化粧料組成物のための剤形例および製剤例を例示する。但し、下記剤形例および製剤例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容は、下記剤形例および製剤例によって限定されるものではない。

【0062】

剤形例１：柔軟化粧水（スキン）の製造
［化学式１］で表されるミリセチン誘導体（３－アセチル－ミリセチン）捕集ナノ粒子０．１重量％、１，３－ブチレングリコール５．２重量％、オレイルアルコール１．５重量％、エタノール３．２重量％、３．２重量％のポリソルベート２０、２．０重量％のベンゾフェノン－９、カルボキシルビニルポリマー１．０重量％、グリセリン３．５重量％、微量の香り、微量の防腐剤、および残量の精製水を混合して通常の方法で柔軟化粧水を製造する。

【0063】

剤形例２：ミルクローションの製造
［化学式１］で表されるミリセチン誘導体（３－アセチル－ミリセチン）捕集ナノ粒子０．１重量％、グリセリン５．１重量％、プロピレングリコール４．２重量％、トコフェリルアセテート３．０重量％、流動パラフィン４．６重量％、トリエタノールアミン１．０重量％、スクワラン３．１重量％、マカダミアナッツオイル２．５重量％、１．６重量％のポリソルベート６０、ソルビタンセスキオレアート１．６重量％、プロピルパラベン０．６重量％、カルボキシルビニルポリマー１．５重量％、微量の香り、微量の防腐剤、および残量の精製水を混合して通常の方法でミルクローションを製造する。

【0064】

剤形例３：栄養クリームの製造
［化学式１］で表されるミリセチン誘導体（３－アセチル－ミリセチン）捕集ナノ粒子０．５重量％、グリセリン４．０重量％、ワセリン３．５重量％、トリエタノールアミン２．１重量％、流動パラフィン５．３重量％、スクワラン３．０重量％、蜜蝋２．６重量％、トコフェリルアセテート５．４重量％、３．２重量％のポリソルベート６０、カルボキシルビニルポリマー１．０重量％、ソルビタンセスキオレート３．１重量％、微量の香り、微量の防腐剤および残量の精製水を混合して通常の方法で栄養クリームを製造する。

【0065】

以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当該分野における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好適な実施形態に過ぎず、これに本発明の範囲が限定されるものではないことは明白である。よって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とその等価物によって定義される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【国際調査報告】