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特表2024-534501細胞内送達のための小分子生物製剤のデンドリマーコンジュゲート
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-20
(54)【発明の名称】細胞内送達のための小分子生物製剤のデンドリマーコンジュゲート
(51)【国際特許分類】
A61K 47/59 20170101AFI20240912BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240912BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240912BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240912BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240912BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240912BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240912BHJP
【ＦＩ】
A61K47/59
A61K31/7088
A61K31/7105
A61P27/02
A61P35/00
A61P43/00 105
C12N15/113 Z ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024517429
(86)(22)【出願日】2022-09-21
(85)【翻訳文提出日】2024-05-17
(86)【国際出願番号】 US2022076775
(87)【国際公開番号】W WO2023049743
(87)【国際公開日】2023-03-30
(31)【優先権主張番号】63/246,705
(32)【優先日】2021-09-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】398076227
【氏名又は名称】ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ランガラマヌジャム， カナン
(72)【発明者】
【氏名】リヤナゲ， ワスサラ
(72)【発明者】
【氏名】ウー， トニー
(72)【発明者】
【氏名】カナン， スジャータ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076BB01
4C076BB11
4C076CC50
4C076EE59
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086MA55
4C086MA66
4C086NA13
4C086ZA02
4C086ZA33
4C086ZB21
4C086ZB26
(57)【要約】
それを必要とする対象における１つまたは複数の疾患または障害を予防、処置または診断するための、機能性核酸と共有結合によりコンジュゲートしているヒドロキシル末端デンドリマー（Ｄ－ＦＮＡ）の組成物、およびそれを使用する方法を開発した。ＦＮＡのデンドリマーへの共有結合によるコンジュゲーションは、血清中半減期およびバイオアベイラビリティを大幅に強化し、ペイロードをタンパク質吸着および酵素分解から保護する。好ましくは、機能性核酸は、腫瘍関連ミクログリア（ＴＡＭ）を含む活性化マクロファージ内でＦＮＡを細胞内放出するための機能的に放出可能なカップリングエレメントによってデンドリマーに共有結合によりコンジュゲートしている。例示的な機能的に放出可能なカップリングエレメントはグルタチオン感受性カップリングエレメントである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
必要に応じて１つまたは複数のスペーサーを介して１つまたは複数の機能性核酸に共有結合によりコンジュゲートしているデンドリマーを含む組成物であって、前記機能性核酸が、コンジュゲーション前の前記デンドリマーの表面上の全末端基の５０％未満にコンジュゲートしている、組成物。
【請求項2】
前記１つまたは複数の機能性核酸が、標的遺伝子の転写、翻訳、または機能を阻害する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記１つまたは複数の機能性核酸が、アンチセンス分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、および外部ガイド配列からなる群より選択される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
前記１つまたは複数の機能性核酸がｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項5】
前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ－１２６である、請求項４に記載の組成物。
【請求項6】
前記デンドリマーが、第２世代、第３世代、第４世代、第５世代、第６世代、第７世代、または第８世代のデンドリマーである、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項7】
前記デンドリマーが、ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーまたはグルコースデンドリマーであり、表面基の４０％超から１００％の間がヒドロキシル化されているかまたはグルコース単糖にコンジュゲートしている、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項8】
前記デンドリマーがヒドロキシル末端ＰＡＭＡＭデンドリマーである、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
前記デンドリマーがグルコースおよびエチレングリコール構成ブロックから作製されたグルコースデンドリマーであり、１０個を超える表面グルコース部分を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
前記デンドリマーが、１つまたは複数のスペーサーを介して前記１つまたは複数の機能性核酸に共有結合によりコンジュゲートしている、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
１つまたは複数のスペーサーが、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオネート（ＳＰＤＰ）、グルタチオン、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項12】
前記デンドリマーが、ジスルフィド結合を介して前記１つまたは複数の機能性核酸に共有結合によりコンジュゲートしている、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
前記デンドリマーが、１つまたは複数の追加の治療剤、予防剤、および／または診断剤にさらにコンジュゲートしている、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項14】
以下の構造：【化3】
式中、Ｄで示される円はヒドロキシル末端デンドリマーであり、ＦＮＡで示される楕円は機能性核酸である、
組成物。
【請求項15】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物、および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項16】
非経口投与または経口投与用に製剤化されている、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
ヒドロゲル、ナノ粒子またはマイクロ粒子、懸濁物、粉末、錠剤、カプセル剤、および溶液からなる群より選択される形態で製剤化されている、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
【請求項18】
がん、感染性疾患、増殖性疾患、または炎症のうちの１つまたは複数の症状の処置を必要とする対象においてがん、感染性疾患、増殖性疾患、または炎症のうちの１つまたは複数の症状を処置するための方法であって、前記がん、感染性疾患、増殖性疾患、または炎症のうちの１つまたは複数の症状を緩和するために有効量の請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項19】
前記炎症が、眼、脳、および／または神経系（ＣＮＳ）の１つまたは複数の疾患、状態、および／または損傷と関連する、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記眼、前記脳および／または前記ＣＮＳの前記１つまたは複数の疾患、状態、および／または損傷が、前記脳および前記眼における、活性化されたミクログリアおよびアストロサイト、または損傷した、罹患した、および／もしくは過活動性のニューロン、神経節細胞および他のニューロン細胞と関連する疾患、状態、および損傷である、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記眼の前記１つまたは複数の疾患、状態、および／または損傷が脈絡膜血管新生であり、前記機能性核酸が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的なｍｉＲＮＡである、請求項１９に記載の方法。
【請求項22】
前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ－１２６である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記眼の前記１つまたは複数の疾患、状態、および／または損傷が黄斑変性症である、請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記組成物が前記眼に直接投与される、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記組成物が硝子体内注射によって投与される、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記がんが、乳がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮がん、膵臓がん、皮膚がん、多発性骨髄腫、前立腺がん、精巣胚細胞腫瘍、脳がん、口腔がん、食道がん、肺がん、肝臓がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、十二指腸がん、胃がん、および結腸がんからなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項27】
前記有効量が、腫瘍サイズを減少させるかまたは腫瘍成長を阻害するのに有効なものである、請求項１８または２６に記載の方法。
【請求項28】
前記組成物が経口または非経口で投与される、請求項１８から２３、２６、および２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記組成物が静脈内投与される、請求項１８から２３および２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記組成物が、毎日１回、１日おきに１回、３日に１回、１週間に１回、１０日に１回、２週間に１回、３週間に１回および１カ月に１回からなる群より選択される時点で投与される、請求項１８から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記組成物が、２週間に１回、またはそれ未満の頻度で投与される、請求項１８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記疾患または障害を処置するのに有効な前記機能性核酸の量が、前記デンドリマーの非存在下で前記疾患または障害を処置するのに必要とされる同じ機能性核酸の量の５０％またはそれ未満である、請求項１８から３１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月２１日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６３／２４６，７０５の利益および優先権を主張しており、その全体が参照により本明細書に援用される。
本出願は、２０２１年９月２１日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６３／２４６，７０５の利益および優先権を主張しており、その全体が参照により本明細書に援用される。
【0002】
配列表の参照
２０２２年９月２１日に作成され、１０，６６４バイトのサイズを有する「ＪＨＵ＿Ｃ＿１７０４８＿ＰＣＴ．ｘｍｌ」という名称のｘｍｌファイルとして提出された配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８３４（ｃ）（１）に従い、これにより参照により本明細書に組み込まれるものとする。
２０２２年９月２１日に作成され、１０，６６４バイトのサイズを有する「ＪＨＵ＿Ｃ＿１７０４８＿ＰＣＴ．ｘｍｌ」という名称のｘｍｌファイルとして提出された配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８３４（ｃ）（１）に従い、これにより参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【0003】
発明の分野
本発明は一般的に核酸送達の分野、特に、それを必要とする部位または領域で選択的に取り込まれる小分子、例えばデンドリマーに共有結合しているＲＮＡ分子を送達するための方法である。
本発明は一般的に核酸送達の分野、特に、それを必要とする部位または領域で選択的に取り込まれる小分子、例えばデンドリマーに共有結合しているＲＮＡ分子を送達するための方法である。
【背景技術】
【0004】
発明の背景
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子発現をサイレンシングするために最も広く使用されている２つの戦略である。治療剤としてのアンチセンスおよびｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの潜在的な使用は、はるかに大きな関心を引き起こしている。しかし、オリゴヌクレオチドベースの治療法に関する主要な問題には、活性分子を有効に細胞内送達することが伴う。生物全体にオリゴヌクレオチドを送達することは、多くのバリアを通過することを必要とする。血清ヌクレアーゼによる分解、腎臓によるクリアランス、または不適切な生体内分布は、オリゴヌクレオチドがその標的臓器に到達することを阻止し得る。オリゴヌクレオチドは、血管壁を通過し、間質空間と細胞外マトリックス中を進まなければならない。最後に、オリゴヌクレオチドが適切な細胞膜に到達することに成功した場合、通常はエンドソーム中に取り込まれることになり、オリゴヌクレオチドは、活性になるにはエンドソームから逃避する必要がある。
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、遺伝子発現をサイレンシングするために最も広く使用されている２つの戦略である。治療剤としてのアンチセンスおよびｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの潜在的な使用は、はるかに大きな関心を引き起こしている。しかし、オリゴヌクレオチドベースの治療法に関する主要な問題には、活性分子を有効に細胞内送達することが伴う。生物全体にオリゴヌクレオチドを送達することは、多くのバリアを通過することを必要とする。血清ヌクレアーゼによる分解、腎臓によるクリアランス、または不適切な生体内分布は、オリゴヌクレオチドがその標的臓器に到達することを阻止し得る。オリゴヌクレオチドは、血管壁を通過し、間質空間と細胞外マトリックス中を進まなければならない。最後に、オリゴヌクレオチドが適切な細胞膜に到達することに成功した場合、通常はエンドソーム中に取り込まれることになり、オリゴヌクレオチドは、活性になるにはエンドソームから逃避する必要がある。
【0005】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、神経学的疾患の進行に不可欠な特定の遺伝子を阻害するその能力に起因して、中枢神経系（ＣＮＳ）障害のための新規で強力な治療薬である。しかし、ｓｉＲＮＡを脳実質にうまく送達することによって、障害、例えば血液脳関門や細胞取り込みの不良に直面する。さらに、ｓｉＲＮＡは生理学的条件において非常に不安定であり、タンパク質結合および酵素分解に対して感受性であり、有効なままにするには高用量が必要とされる。効率的なウイルス性および非ウイルス性担体を開発する努力は、免疫原性、ビヒクル毒性、および凝集という課題に直面している。さらに、非共有結合相互作用に依存する送達システムにおいて、一貫した核酸負荷を達成するのは困難である。
【0006】
したがって、機能性核酸、特に、細胞において遺伝子発現および／または他の生化学的活性をモジュレートすることができるＲＮＡ分子を送達するための組成物を提供することが本発明の目的である。
【0007】
脳および中枢神経系の疾患、障害、および損傷、特に活性化されたミクログリアおよび／またはアストロサイトと関連するものを処置するための薬物送達製剤を提供することも本発明の目的である。
【0008】
局在的または全身的毒性をほぼまたは全く伴わず、機能性核酸、特にＲＮＡ分子の中枢神経系への標的化または選択的送達を行うための、生体適合性で安価なナノ材料を提供することが本発明のさらなる目的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0009】
発明の要旨
ヒドロキシル末端デンドリマーは、高い有効性および低い毒性で、損傷および疾患の部位において、共有結合によりコンジュゲートしている小分子生物製剤、例えば機能性核酸を活性化マクロファージおよびミクログリアおよびニューロンに選択的に送達することができることは確立されている。デンドリマーは、ｉｎ ｖｉｖｏで機能性核酸を遮蔽し安定化させ、疾患および障害を処置および予防するための標的化された遺伝子の発現の効率的な遺伝子サイレンシングおよび／または調節を可能にする。
ヒドロキシル末端デンドリマーは、高い有効性および低い毒性で、損傷および疾患の部位において、共有結合によりコンジュゲートしている小分子生物製剤、例えば機能性核酸を活性化マクロファージおよびミクログリアおよびニューロンに選択的に送達することができることは確立されている。デンドリマーは、ｉｎ ｖｉｖｏで機能性核酸を遮蔽し安定化させ、疾患および障害を処置および予防するための標的化された遺伝子の発現の効率的な遺伝子サイレンシングおよび／または調節を可能にする。
【0010】
必要に応じて１つまたは複数のスペーサーを介して１つまたは複数の機能性核酸に共有結合によりコンジュゲートしているヒドロキシル末端デンドリマーの組成物が提供される。典型的には、機能性核酸は、デンドリマー表面上の末端ＯＨ基の５０％未満にコンジュゲートしている。典型的には、１つまたは複数の機能性核酸は、標的遺伝子の転写、翻訳、または機能を阻害する。一部の実施形態では、１つまたは複数の機能性核酸は、アンチセンス分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、または外部ガイド配列である。好ましい機能性核酸はｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ－１２６である。
【0011】
ヒドロキシル末端デンドリマーは一般的に、第２世代（Ｇ２）、第３世代（Ｇ３）、第４世代（Ｇ４）、第５世代（Ｇ５）、第６世代（Ｇ６）、第７世代（Ｇ７）、または第８世代（Ｇ８）のデンドリマーである。好ましい実施形態において、デンドリマーはポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーである。一部の実施形態では、デンドリマーは、１つまたは複数のスペーサーを介して１つまたは複数の機能性核酸に共有結合によりコンジュゲートしている。好適なスペーサーとしては、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオネート（ＳＰＤＰ）、グルタチオン、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のうちの１つが挙げられる。好ましい実施形態では、デンドリマーはジスルフィド結合を介して１つまたは複数の機能性核酸に共有結合によりコンジュゲートしている。一部の実施形態では、デンドリマーは、１つまたは複数の追加の治療剤、予防剤、および／または診断剤にさらにコンジュゲートしている。
機能性核酸とコンジュゲートしているデンドリマーの組成物としては、以下の構造のうちの１つが挙げられる：
および
（式中、Ｄで示される円はヒドロキシル末端デンドリマーであり、ＦＮＡで示される楕円は機能性核酸である）。
機能性核酸とコンジュゲートしているデンドリマーの組成物としては、以下の構造のうちの１つが挙げられる：
【化1】
【化2】
【0012】
必要に応じて１つまたは複数のスペーサーを介して１つまたは複数の機能性核酸に共有結合によりコンジュゲートしているヒドロキシル末端デンドリマーと、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物も提供される。医薬組成物は一般的に、ある形態で、例えば、ヒドロゲル、ナノ粒子またはマイクロ粒子、懸濁物、粉末、錠剤、カプセル剤、および溶液で、非経口または経口投与用に製剤化される。
【0013】
それを必要とする対象における疾患または障害の１つまたは複数の症状を処置するための方法であって、疾患または障害の１つまたは複数の症状を緩和するのに有効な、必要に応じて１つまたは複数のスペーサーを介して１つまたは複数の機能性核酸に共有結合によりコンジュゲートしているヒドロキシル末端デンドリマーと、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む方法。典型的には、方法は、対象における炎症、増殖性疾患、例えばがん、または神経学的疾患を処置または予防する。一部の実施形態では、方法は、眼、脳、および／または神経系（ＣＮＳ）の１つまたは複数の疾患、状態、および／または損傷と関連する炎症を処置するためのものである。方法によって処置してもよい眼の例示的な疾患、状態、および／または損傷は、脈絡膜血管新生と関連するものである。一部の実施形態では、機能性核酸は血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的なｍｉＲＮＡである。ＶＥＧＦに特異的な例示的なｍｉＲＮＡはｍｉＲ－１２６である。好ましい実施形態では、ｍｉＲ－１２６と共有結合によりコンジュゲートしているデンドリマーは、対象における黄斑変性症の１つまたは複数の症状を処置または予防するために眼に選択的に送達される。
【0014】
一部の実施形態では、方法は、対象におけるがんを処置または予防するために、デンドリマーにコンジュゲートしている１つまたは複数の機能性核酸を送達する。処置することができる例示的ながんとしては、乳がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮がん、膵臓がん、皮膚がん、多発性骨髄腫、前立腺がん、精巣胚細胞腫瘍、脳がん、口腔がん、食道がん、肺がん、肝臓がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、十二指腸がん、胃がん、および結腸がんがある。したがって一部の実施形態では、方法は、腫瘍サイズを減少させるかまたは腫瘍成長を阻害するための有効量の機能性核酸を送達する。一部の実施形態では、方法は、デンドリマー－機能性核酸組成物を眼に直接投与する。眼に投与するための例示的な方法は硝子体内注射によるものである。他の実施形態において、組成物は経口または非経口で投与される。例えば、特定の実施形態において、組成物は静脈内で投与される。
【0015】
方法は典型的には、デンドリマー－機能性核酸組成物を、毎日１回、１日おきに１回、３日に１回、１週間に１回、１０日に１回、２週間に１回、３週間に１回および１カ月に１回から選択される時点で投与する。例えば一部の実施形態では、組成物は２週間に１回、またはそれ未満の頻度で投与される。典型的には、記載する方法に従って疾患または障害を処置するのに有効な機能性核酸の量は、デンドリマー非存在下で疾患または障害を処置するのに必要とされる同じ機能性核酸の量の５０％またはそれ未満である。
【0016】
デンドリマー－機能性核酸組成物を含み、必要に応じて組成物を対象に投与するための試薬、緩衝液および装置、ならびに／または使用についての指示を含むキットも記載する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】図１は、機能化Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＴＣＯを生成するための段階的合成経路における分子構造を示す概略図である。第６世代ヒドロキシルＰＡＭＡＭデンドリマー（ＰＡＭＡＭ－Ｇ６－ＯＨ）を４－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）酪酸（Ｂｏｃ－保護ＧＡＢＡ）リンカー（２）で処置し、得られた生成物（３）をジクロロメタン（ＤＣＭ）／トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（４：１）を使用して脱保護した。生成物（４）をＣｙ５Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを使用してＣｙ５フルオロフォアで標識し、得られた中間体（５）をトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）リンカー、ＰＥＧ４－ＴＣＯとコンジュゲートして、機能化Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＴＣＯ（６）を得た。式における下付き数字は、デンドリマーごとに結合したＧＡＢＡ ＢＯＣ、ＰＥＧ４－ＴＣＯ、またはフルオロフォアの数を示す。
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【図7】図７Ａ～７Ｃは、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の有意なＧＦＰノックダウンをもたらす送達方法を示す棒グラフである。相対蛍光は、ＧＦＰチャネルにおけるバックグラウンド補正強度を使用して得、０時間の内部対照に対して正規化した。図７Ａは、２４または４８時間のそれぞれに関して、対照、ｓｉＧＦＰ、ＲＮＡ／Ｍａｘ ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００、およびＤ－ｓｉＧＦＰ試料のそれぞれに関する、ＯＨに対して－５０から１００％のノックダウンを示すビヒクル依存性ＧＦＰノックダウンの棒グラフである。データは２連の平均±ＳＥＭとして示した。図７Ｂは、対照、ｓｉＧＦＰ、ＲＮＡ／Ｍａｘ ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００、およびＤ－ｓｉＧＦＰそれぞれの、ＧＦＰタンパク質発現（０～２．５）の棒グラフである。ＧＦＰの相対的発現は、シクロフィリンＢ発現に対してＧＦＰ発現を正規化することによって得られた。図７Ｃは、対照、Ｄ－ｓｉＧＦＰ、Ｌｉｐｏ２０００、Ｌｉｐｏ３０００、ＲＮＡｉ Ｍａｘ、およびｓｉＧＦＰそれぞれに関する、経時的な（０～４８時間の）コンフルエンシー（０～１．５）の棒グラフである。コンフルエンシーを介した細胞生存度によって、細胞傷害性効果は示唆されなかった。
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【図13-1】図１３Ａ～１３Ｄは、未処置対照におけるまたは０．１μｇ／μＬおよび１μｇ／μＬの濃度のＤ－ｍｉｒＲ１２６、またはｍｉＲ－１２６で処置された実験群における、ＥＬＩＳＡで測定された相対ＶＥＧＦ－Αタンパク質発現レベル（図１３Ａ）；およびＰＢＳで処置されたマウス（対照群）におけるおよびＤ－ｍｉＲ１２６またはｍｉＲ－１２６で処置された実験群における、ＶＥＧＦ－Αの相対ｍＲＮＡ発現レベル（図１３Ｂ）；およびＰＢＳで処置されたマウス（対照群）におけるおよびＤ－ｍｉＲ１２６またはｍｉＲ－１２６で処置された実験群における、ＴＮＦα（図１３Ｃ）およびＩＬ－１β（図１３Ｄ）の相対ｍＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフである。
【図13-2】図１３Ａ～１３Ｄは、未処置対照におけるまたは０．１μｇ／μＬおよび１μｇ／μＬの濃度のＤ－ｍｉｒＲ１２６、またはｍｉＲ－１２６で処置された実験群における、ＥＬＩＳＡで測定された相対ＶＥＧＦ－Αタンパク質発現レベル（図１３Ａ）；およびＰＢＳで処置されたマウス（対照群）におけるおよびＤ－ｍｉＲ１２６またはｍｉＲ－１２６で処置された実験群における、ＶＥＧＦ－Αの相対ｍＲＮＡ発現レベル（図１３Ｂ）；およびＰＢＳで処置されたマウス（対照群）におけるおよびＤ－ｍｉＲ１２６またはｍｉＲ－１２６で処置された実験群における、ＴＮＦα（図１３Ｃ）およびＩＬ－１β（図１３Ｄ）の相対ｍＲＮＡ発現レベルを示す棒グラフである。
【0030】
【0031】
【0032】
【0033】
【0034】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【図23】図２３は、Ｇｌｕ－Ｇ２デンドリマーの合成を示す概略図である。Ｇ２－グルコースの段階的な合成；Ｇ１－グルコースデンドリマー、４を水素化ナトリウム（鉱油中の６０％分散物）で、０℃で１５分間処置し、次いで臭化プロパルギル（トルエン中の８０％ｗ／ｗ溶液）で処置した。反応物を室温で８時間撹拌して化合物５を形成した。次に化合物５を、ＤＭＦ：Ｈ２Ｏ（１：１）中の古典的クリック試薬（ＣｕＡＡＣクリック反応）、触媒量の硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ）およびアスコルビン酸ナトリウム下、ＡＢ４構成ブロック（β－グルコース－ＰＥＧ４－アジド）、２で処置して、Ｇ２－グルコース－９６－ＯＡｃ、６を生成した。次いで化合物６を典型的なＺｅｍｐｌｅｎ条件下で反応させて、所望の生成物７（Ｇ２－グルコース）を得た。
【0040】
【0041】
【発明を実施するための形態】
【0042】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
「活性薬剤」または「生物学的薬剤」という用語は、予防的、治療的または診断的であってもよい所望の薬理学的および／または生理学的効果を誘発する化学的または生物学的化合物を指すために互換的に使用される治療、予防または診断剤である。これらは、核酸、核酸アナログ、２ｋＤ未満、より典型的には１ｋＤ未満の分子量を有する小分子、ペプチド模倣体、タンパク質もしくはペプチド、炭水化物もしくは糖、脂質、またはこれらの組合せであってもよい。これらの用語はまた、これらに限定されないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、およびアナログを含む薬剤の薬学的に許容され薬理学的に活性な誘導体を包含する。
Ｉ．定義
「活性薬剤」または「生物学的薬剤」という用語は、予防的、治療的または診断的であってもよい所望の薬理学的および／または生理学的効果を誘発する化学的または生物学的化合物を指すために互換的に使用される治療、予防または診断剤である。これらは、核酸、核酸アナログ、２ｋＤ未満、より典型的には１ｋＤ未満の分子量を有する小分子、ペプチド模倣体、タンパク質もしくはペプチド、炭水化物もしくは糖、脂質、またはこれらの組合せであってもよい。これらの用語はまた、これらに限定されないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、およびアナログを含む薬剤の薬学的に許容され薬理学的に活性な誘導体を包含する。
【0043】
「ヌクレオチド」という用語は、塩基部分、糖部分、およびホスフェート部分を含む分子を指す。ヌクレオチドは、そのホスフェート部分および糖部分を介して一緒に連結し、ヌクレオシド間連結を生成することができる。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン－９－イル（Ａ）、シトシン－１－イル（Ｃ）、グアニン－９－イル（Ｇ）、ウラシル－１－イル（Ｕ）、およびチミン－１－イル（Ｔ）とすることができる。ヌクレオチドの糖部分はリボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのホスフェート部分は５価のホスフェートである。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’－ＡＭＰ（３’－アデノシンモノホスフェート）または５’－ＧＭＰ（５’－グアノシンモノホスフェート）である。当技術分野において利用可能であり、本明細書において利用可能なこれらのタイプの分子の多くの変形が存在する。
【0044】
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」という用語は、複数のヌクレオチドサブユニットを含む合成または単離された核酸ポリマーである。
【0045】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は交換可能であり、直鎖状または環状立体構造の単鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的で、これらの用語はポリマーの長さに関する限定と解釈されるべきではない。その用語は、公知の天然ヌクレオチドのアナログ、ならびに塩基、糖および／またはホスフェート部分が修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格、ロックド核酸）を包含していてもよい。一般的に特に指定がない限り、特定のヌクレオチドのアナログは同じ塩基対合特異性を有し、すなわち、ＡのアナログはＴと塩基対合する。
【0046】
「薬学的に許容される塩」という用語は当技術分野において認識されており、化合物の比較的非毒性の無機および有機酸付加塩を含む。薬学的に許容される塩の例としては、無機酸、例えば、塩酸および硫酸由来のもの、ならびに有機酸、例えば、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、およびｐ－トルエンスルホン酸由来のものが挙げられる。塩を形成するのに好適な無機塩基の例としては、アンモニア、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム、および亜鉛の水酸化物、炭酸塩、および重炭酸塩がある。塩はまた、非毒性であり、このような塩を形成するのに十分強力なものを含む好適な有機塩基と形成してもよい。例示の目的で、このような有機塩基のクラスとしては、モノ－、ジ－、およびトリアルキルアミン、例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、およびトリエチルアミン；モノ－、ジ－またはトリヒドロキシアルキルアミン、例えば、モノ－、ジ－、およびトリエタノールアミン；アミノ酸、例えば、アルギニンおよびリシン；グアニジン；Ｎ－メチルグルコサミン；Ｎ－メチルグルカミン；Ｌ－グルタミン；Ｎ－メチルピペラジン；モルホリン；エチレンジアミン；Ｎ－ベンジルフェネチルアミンがあり得る。
【0047】
「治療剤」という用語は、疾患または障害の１つまたは複数の症状を処置するために投与することができる薬剤を指す。
【0048】
「診断用薬剤」という用語は、病理学的プロセスの局在を示し、特定し、明らかにするために投与することができる薬剤を一般的に指す。診断用薬剤は、標的細胞を標識することができ、これらの標識された標的細胞のその後の検出またはイメージングを可能にすることができる。一部の実施形態では、診断用薬剤は、デンドリマーまたは好適な送達ビヒクルを介して中枢神経系（ＣＮＳ）中の活性化ミクログリアを標的とする／それと結合することができる。
【0049】
「予防用薬剤」という用語は、疾患を予防するためにまたはある特定の状態を予防するために投与することができる薬剤、例えばワクチンを一般的に指す。
【0050】
「薬学的に許容される」または「生体適合性」という句は、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織との接触において使用するのに好適であり、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、妥当な利益／リスク比率に見合った組成物、ポリマー、および他の材料ならびに／または投薬形態を指す。「薬学的に許容される担体」という句は、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクル、例えば、任意の対象組成物を、１つの臓器または身体の一部から別の臓器または身体の一部へ運ぶまたは輸送することに関与する液体または固体フィラー、希釈剤、溶媒、またはカプセル化材料を指す。各担体は、対象組成物の他の成分と適合性であり、患者に対して有害ではないという意味で「許容され」なければならない。
【0051】
「治療有効量」という用語は、デンドリマー中および／またはその上に組み込まれた場合、任意の医療処置に適用可能な妥当な利益／リスク比率で何らかの所望の効果をもたらす治療剤の量を指す。有効量は、処置される疾患もしくは状態、投与される特定の構築物、対象のサイズ、または疾患もしくは状態の重症度のような因子によって変わる場合がある。当業者であれば、過度の実験を必要とすることなく特定の化合物の有効量を経験的に決定してもよい。一部の実施形態では、「有効量」という用語は、１つまたは複数の疾患または障害の症状を減少させるかまたは低減するための、例えば、アルツハイマー病などに罹患した個体における学習および／または記憶の欠如を減少させるか、予防するか、または逆転させるための治療剤または予防剤の量を指す。１つまたは複数の神経学的または神経変性疾患において、有効量の薬物は、新規のニューロンの生成を引き起こす神経の有糸分裂の刺激または誘導の効果を有していてもよく、すなわち、神経原性効果を示し；神経損失の速度における低下を含む神経損失の予防または遅延、すなわち、神経保護効果を示す。有効量は１回または複数回投与で投与してもよい。
【0052】
阻害の文脈における「阻害する」または「低下させる」という用語は、活性および量における低下または減少を意味する。これは、活性または量における完全な阻害または低下、または部分的な阻害または低下であってもよい。阻害または低下は、対照または標準レベルと比較してもよい。阻害は、５、１０、２５、５０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、または１００％であってもよい。例えば、１つまたは複数の阻害剤を含むデンドリマー組成物は、デンドリマー組成物を与えられなかったかまたはそれで処置されなかった対象の同等の組織における同じ細胞の活性および／または量から、ｎＳＭａｓｅ２と関連する活性化ミクログリアの活性および／または量を約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、または９９％阻害するかまたは減少させることができる。一部の実施形態では、阻害および低下は、ｍＲＮＡ、タンパク質、細胞、組織および臓器レベルで比較される。例えば、未処置の対照対象と比較した場合の、眼の脈絡膜血管新生における阻害および低下である。
【0053】
「処置すること」または「予防すること」という用語、疾患、障害および／または状態に罹りやすいことがあるが、それを有するとはまだ診断されていない動物において生じる疾患、障害または状態、疾患、障害または状態の進行を阻害すること、ならびに疾患、障害、または状態を軽減すること、例えば、疾患、障害および／または状態の退行をもたらすことを意味する。疾患または状態を処置することには、たとえ基本的な病態生理に影響がなかったとしても、特定の疾患または状態の少なくとも１つの症状を回復させること、例えば鎮痛剤を投与することによってそのような薬剤が疼痛の原因を処置しなかったとしても、対象の疼痛を処置することが含まれる。処置の望ましい効果としては、疾患の進行速度を低下させること、疾患の状況を回復または緩和すること、および寛解することかまたは予後を改善することがある。例えば、これらに限定されるものではないが、腫瘍成長速度の低下、疾患に起因する症状の減少、疾患に罹患したもののクオリティーオブライフの向上、疾患の処置に必要とされる他の医薬の用量の減少、疾患の進行の遅延、および／または個体の生存の延長を含む、脳腫瘍と関連する１つまたは複数の症状が軽減または除去された場合、個体は成功裏に「処置される」。
【0054】
「生分解性」という用語は、生理学的状態下で、対象により代謝、除去、または排泄することができるより小さな単位または化学種に分解または浸食されるであろう材料を一般的に指す。分解時間は、組成および形態の関数である。
【0055】
「デンドリマー」という用語は、これらに限定されるものではないが、内部コアと、この開始のコアに規則的に結合している内層または繰返し単位の「世代」と、最外部の世代に結合している末端基の外表面とを伴う分子構造を含む。
【0056】
「官能化」という用語は、官能基または部位の結合をもたらす様式で、化合物または分子を修飾することを意味する。例えば、分子を強力な求核試薬または強力な求電子剤にする分子を導入することによって、分子を官能化してもよい。
【0057】
「標的化部分」という用語は、具体的な場所に局在するかまたはそこから離れて局在する部分を指す。その部分は、例えば、タンパク質、核酸、核酸アナログ、炭水化物、または小分子であってもよい。実体は、例えば治療化合物、例えば、小分子または診断用の実体、例えば検出可能な標識であってもよい。位置は、組織、特定の細胞タイプ、または細胞内コンパートメントであってもよい。一実施形態では、標的化部分は、薬剤を局在させる。好ましい実施形態では、デンドリマー組成物は、追加の標的化部分の非存在下で活性化ミクログリアを選択的に標的とすることができる。
【0058】
「延長された滞留時間」という用語は、薬剤が患者の身体、またはその患者の臓器もしくは組織から消失するために必要とされる時間における増加を指す。ある特定の実施形態では、「延長された滞留時間」は、比較標準、例えば、デンドリマーなどの送達ビヒクルにコンジュゲートしていない比較薬剤よりも１０％、２０％、５０％または７５％長い半減期で消失する薬剤を指す。ある特定の実施形態では、「延長された滞留時間」は、比較標準、例えば、特定の細胞タイプを特異的に標的とするデンドリマーを含まない比較薬剤よりも２、５、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、または１００００倍長い半減期で消失する薬剤を指す。
【0059】
「組み込まれた」および「カプセル化された」という用語は、所望の適用において薬剤を放出、例えば持続放出するのを可能にする組成物中におよび／または組成物上に、このような薬剤を組み込むこと、製剤化すること、他の方法で含むことを指す。薬剤または他の材料を、デンドリマーの１つまたは複数の表面官能基に結合させることによって（共有結合、イオン結合、または他の結合相互作用によって）、物理的な混合によって、樹状構造内に薬剤を包むことによって、および／または樹状構造の内部に薬剤をカプセル化することによって、このようなデンドリマー中に組み込んでもよい。
【0060】
ＩＩ．組成物
１つまたは複数の疾患または状態を予防、処置、または診断するための、１つまたは複数の小分子生物製剤、特に１つまたは複数の機能性核酸を送達するのに好適なデンドリマー複合体を開発した。
１つまたは複数の疾患または状態を予防、処置、または診断するための、１つまたは複数の小分子生物製剤、特に１つまたは複数の機能性核酸を送達するのに好適なデンドリマー複合体を開発した。
【0061】
デンドリマー複合体の組成物は、デンドリマーと共有結合によりコンジュゲートしている、１つまたは複数の疾患または障害を処置または予防するための１つまたは複数の予防剤または治療剤を含む。一般的に、１つまたは複数の活性剤は、全デンドリマー／活性剤複合体の約０．０１重量％から約５０重量％、好ましくは約１重量％から約３０重量％、さらに好ましくは約５重量％から約２０重量％の濃度でデンドリマー複合体にコンジュゲートされている。好ましくは、１つまたは複数の薬剤は、１つまたは複数の連結、例えば、ジスルフィド、エステル、エーテル、チオエステル、カルバメート、カルボネート、ヒドラジン、およびアミド連結を介して、必要に応じて、１つまたは複数のスペーサーを介してデンドリマーに共有結合によりコンジュゲートされている。例示的な薬剤としては、小分子生物製剤、例えば機能性核酸分子が挙げられる。
【0062】
追加の薬剤の存在は、粒子のゼータ電位または表面電荷に影響を与える場合がある。一実施形態では、デンドリマーのゼータ電位は、両端を含む、約－１００ｍＶから約１００ｍＶの間、約－５０ｍＶから約５０ｍＶの間、約－２５ｍＶから約２５ｍＶの間、約－２０ｍＶから約２０ｍＶの間、約－１０ｍＶから約１０ｍＶの間、約－１０ｍＶから約５ｍＶの間、約－５ｍＶから約５ｍＶの間、約－２ｍＶから約２ｍＶの間、または約－１ｍＶから約１ｍＶの間である。好ましい実施形態では、表面電荷は中性または中性付近である。上記範囲は、－１００ｍＶから１００ｍＶまでの全ての値を包含する。
【0063】
Ａ．デンドリマー
デンドリマーは、高密度の表面末端基を含む３次元ハイパー分岐単分散球状多価高分子である（Ｔｏｍａｌｉａ， Ｄ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ， ３５， ６１ （２００７）；およびＳｈａｒｍａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， ＡＣＳ Ｍａｃｒｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３， １０７９ （２０１４））。その特有の構造的かつ物理的特徴のために、デンドリマーは、標的を絞った薬物／遺伝子送達、イメージングおよび診断を含むさまざまな生物医学的用途のためのナノ担体として有用である（Ｓｈａｒｍａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， ＲＳＣ Ａｄｖａｎｃｅｓ， ４， １９２４２ （２０１４）、Ｃａｍｉｎａｄｅ， Ａ．－Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ， ２， ４０５５ （２０１４）、Ｅｓｆａｎｄ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ， ６， ４２７ （２００１）、およびＫａｎｎａｎ， Ｒ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２７６， ５７９ （２０１４））。
デンドリマーは、高密度の表面末端基を含む３次元ハイパー分岐単分散球状多価高分子である（Ｔｏｍａｌｉａ， Ｄ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ， ３５， ６１ （２００７）；およびＳｈａｒｍａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， ＡＣＳ Ｍａｃｒｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３， １０７９ （２０１４））。その特有の構造的かつ物理的特徴のために、デンドリマーは、標的を絞った薬物／遺伝子送達、イメージングおよび診断を含むさまざまな生物医学的用途のためのナノ担体として有用である（Ｓｈａｒｍａ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， ＲＳＣ Ａｄｖａｎｃｅｓ， ４， １９２４２ （２０１４）、Ｃａｍｉｎａｄｅ， Ａ．－Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｂ， ２， ４０５５ （２０１４）、Ｅｓｆａｎｄ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ， ６， ４２７ （２００１）、およびＫａｎｎａｎ， Ｒ． Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ２７６， ５７９ （２０１４））。
【0064】
最近の研究では、デンドリマー表面基が、その生体内分布に顕著に影響を与えることが示されている（Ｎａｎｃｅ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ， １０１， ９６ （２０１６））。任意の標的化リガンドを含まない、ヒドロキシル末端第４世代ＰＡＭＡＭデンドリマー（約４ｎｍサイズ）が、脳性麻痺（ＣＰ）のウサギモデルにおいて全身投与した場合、健常対照と比較して、障害を受けたＢＢＢを顕著に多く（２０倍を超えて）通過し、活性化ミクログリアおよびアストロサイトを選択的に標的とする（Ｌｅｓｎｉａｋ， Ｗ． Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ， １０ （２０１３））。
【0065】
「デンドリマー」という用語は、これらに限定されるものではないが、内部コアと、この内部コアに付加され、そこから広がる反復単位の層または「世代」とを有する分子構成であって、各層が１つまたは複数の分岐点を有し、末端基の外部表面が最も外側の世代に付加されている、分子構成を含む。一部の実施形態では、デンドリマーは、標準デンドリマーまたは「星型バースト（ｓｔａｒｂｕｒｓｔ）」分子構造を有する。
【0066】
一般的に、デンドリマーは、約１ｎｍから約５０ｎｍの間、さらに好ましくは約１ｎｍから約２０ｎｍの間、約１ｎｍから約１０ｎｍの間、または約１ｎｍから約５ｎｍの間の直径を有する。一部の実施形態では、直径は約１ｎｍから約２ｎｍの間である。コンジュゲートは、一般的に同じサイズ範囲内に入るが、大きなタンパク質、例えば抗体は、５～１５ｎｍサイズが大きくなる場合がある。一般的に、薬剤は、薬剤のデンドリマーに対する平均比率が０．１：１から４：１の間（両端を含む）でコンジュゲートされている。好ましい実施形態では、デンドリマーは、脳組織を通過し、標的細胞に長時間保持されるのに有効な直径を有する。
【0067】
一部の実施形態では、デンドリマーは、約５００ダルトンから約１００，０００ダルトンの間、好ましくは約５００ダルトンから約５０，０００ダルトンの間、最も好ましくは約１，０００ダルトンから約２０，０００ダルトンの間の分子量を有する。
【0068】
使用してもよい好適なデンドリマー足場としては、ＰＡＭＡＭとしても知られるポリ（アミドアミン）、またはＳＴＡＲＢＵＲＳＴ（商標）デンドリマー、ポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）、ポリエチレンイミン、ポリリシン、ポリエステル、イプチセン、脂肪族ポリ（エーテル）、および／または芳香族ポリエーテルデンドリマーが挙げられる。デンドリマーは、カルボキシル、アミン、および／またはヒドロキシル末端を有していてもよい。好ましい実施形態では、デンドリマーはヒドロキシル末端を有する。デンドリマー複合体の各デンドリマーは、同じであっても、他のデンドリマーと類似のまたは異なる化学的性質のものであってもよい（例えば、第１のデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーを含んでいてもよく、一方で第２のデンドリマーは、ＰＯＰＡＭデンドリマーであってもよい）。
【0069】
「ＰＡＭＡＭデンドリマー」という用語は、異なるコアを含有していてもよく、アミドアミン構築ブロックを有し、これらに限定されないが、第１世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第２世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第３世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第４世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第５世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第６世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第７世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第８世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第９世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、または第１０世代ＰＡＭＡＭデンドリマーを含む任意の世代の、カルボキシル、アミン、およびヒドロキシル末端を有していてもよいポリ（アミドアミン）デンドリマーを意味する。好ましい実施形態では、デンドリマーは製剤中に溶解性であり、第４、５または６世代（「Ｇ」）デンドリマーである。デンドリマーは、その官能表面基に結合したヒドロキシル基を有していてもよい。
【0070】
デンドリマーを作製するための方法は当業者に公知であり、中心開始コア（例えば、エチレンジアミンコア）の周囲に樹状β－アラニン単位の同心性のシェル（世代）を生成する２ステップ反復反応順序を一般的に伴う。その後の各成長ステップは、前の世代より大きな分子直径、２倍の数の反応表面部位、およびおよそ２倍の分子量を有するポリマーの新規の「世代」を表す。使用に好適であるデンドリマー足場は、さまざまな世代として市販されている。好ましくは、デンドリマー組成物は、第０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０世代デンドリマー足場に基づいている。このような足場は、それぞれ、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、１０２４、２０４８、および４０９６個の反応部位を有する。したがって、これらの足場に基づいたデンドリマー化合物は、合わせられた標的化部分および存在する場合の薬剤の対応する数を最大として有してもよい。
【0071】
１．ヒドロキシル末端デンドリマー
一部の実施形態では、デンドリマーは、複数のヒドロキシル基を含む。一部の例示的な高密度ヒドロキシル基含有デンドリマーとしては、市販されているポリエステル樹状ポリマー、例えばハイパー分岐２，２－ビス（ヒドロキシル－メチル）プロピオン酸ポリエステルポリマー（例えば、ハイパー分岐ビス－ＭＰＡポリエステル－６４－ヒドロキシル、第４世代）、樹状ポリグリセロールが挙げられる。
一部の実施形態では、デンドリマーは、複数のヒドロキシル基を含む。一部の例示的な高密度ヒドロキシル基含有デンドリマーとしては、市販されているポリエステル樹状ポリマー、例えばハイパー分岐２，２－ビス（ヒドロキシル－メチル）プロピオン酸ポリエステルポリマー（例えば、ハイパー分岐ビス－ＭＰＡポリエステル－６４－ヒドロキシル、第４世代）、樹状ポリグリセロールが挙げられる。
【0072】
一部の実施形態では、高密度ヒドロキシル基含有デンドリマーは、オリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）様デンドリマーである。例えば、第２世代ＯＥＧデンドリマー（「Ｄ２－ＯＨ－６０」）は、非常に効率的で、頑強で、原子経済的な化学反応、例えばＣｕ（Ｉ）触媒アルキン－アジドクリックおよび光触媒チオール－エンクリックケミストリーを使用して合成することができる。直交性ハイパーモノマー（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｈｙｐｅｒｍｏｎｏｍｅｒ）およびハイパーコア戦略を使用することによって、非常に低世代の高密度ポリオールデンドリマーを最小限の反応ステップで達成することができ、例えば、国際特許公開ＷＯ２０１９／０９４９５２に記載される。一部の実施形態では、デンドリマー骨格は、非切断性ポリエーテル結合を構造全体にわたって有し、デンドリマーのｉｎ ｖｉｖｏでの崩壊を回避し、そのようなデンドリマーが単一の実体として身体から消失することを可能にする（非生分解性）。
【0073】
一部の実施形態では、デンドリマーは、特定の組織領域および／または細胞タイプ、好ましくは、ＣＮＳ中の活性化ミクログリアなどの活性化マクロファージを特異的に標的とする。好ましい実施形態では、デンドリマーは、標的化部分を有さない特定の組織領域および／または細胞タイプを特異的に標的とする。例えば、ヒドロキシル（－ＯＨ）末端デンドリマーは血液－脳関門（ＢＢＢ）を横切り、脳組織中／脳組織全体にわたって浸透して脳における炎症領域内の活性化されたミクログリア内に選択的に内在化することができることは確立されている。
【0074】
したがって、好ましい実施形態では、デンドリマーは、デンドリマーの周辺に複数のヒドロキシル（－ＯＨ）基を有する。好ましいヒドロキシル（－ＯＨ）基表面密度は、少なくとも１ＯＨ基／ｎｍ２（ヒドロキシル表面基の数／表面積ｎｍ２）である。例えば、一部の実施形態では、ヒドロキシル基表面密度は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０を超え；好ましくは少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０であるかまたは５０を超える。さらなる実施形態では、ヒドロキシル（－ＯＨ）基表面密度は、約１から約５０の間、好ましくは５～２０ＯＨ基／ｎｍ２（ヒドロキシル表面基の数／表面積ｎｍ２）であり、同時に約５００Ｄａから約１０ｋＤａの間の分子量を有する。
【0075】
一部の実施形態では、デンドリマーは、外表面上に露出しているヒドロキシル基のフラクションを、デンドリマーの内部コアにあるもう一方のフラクションとともに有していてもよい。好ましい実施形態では、デンドリマーは、少なくとも１ＯＨ基／ｎｍ３（ヒドロキシル基の数／体積ｎｍ３）のヒドロキシル（－ＯＨ）基体積密度を有する。例えば、一部の実施形態では、ヒドロキシル基体積密度は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０であるか、または１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、および５０を超える。一部の実施形態では、ヒドロキシル基体積密度は、約４～約５０基／ｎｍ３、好ましくは約５～約３０基／ｎｍ３、より好ましくは約１０～約２０基／ｎｍ３である。
【0076】
一部の実施形態では、デンドリマーは、身体に投与後、特定の組織領域および／または細胞タイプを特異的に標的とする。好ましい実施形態において、デンドリマーは、標的化部分なしに、特定の組織領域および／または細胞タイプを特異的に標的とする。
【0077】
２．グルコースベースのデンドリマー
一部の実施形態では、デンドリマーは、ハイパーコア（ｈｙｐｅｒｃｏｒｅ）（例えば、ジペンタエリスリトール）および１つまたは複数の単糖分岐単位を有している。一部の実施形態では、単糖分岐単位は、リンカー、例えばポリエチレングリコール鎖を介してコアまたはモノマーの前層（ｐｒｉｏｒ ｌａｙｅｒ）にコンジュゲートしている。好ましい実施形態において、ハイパーコアは、ジペンタエリスリトールであり、単糖分岐単位はグルコースベースの分岐単位である。
一部の実施形態では、デンドリマーは、ハイパーコア（ｈｙｐｅｒｃｏｒｅ）（例えば、ジペンタエリスリトール）および１つまたは複数の単糖分岐単位を有している。一部の実施形態では、単糖分岐単位は、リンカー、例えばポリエチレングリコール鎖を介してコアまたはモノマーの前層（ｐｒｉｏｒ ｌａｙｅｒ）にコンジュゲートしている。好ましい実施形態において、ハイパーコアは、ジペンタエリスリトールであり、単糖分岐単位はグルコースベースの分岐単位である。
【0078】
さらなる実施形態では、スペーサー分子はまたアルキル（ＣＨ２）ｎ－炭化水素様単位であってもよい。分岐単位は、異なる世代のデンドリマー間のＰＥＧまたはアルキル鎖リンカーであり、例えば、グルコース層は、ＰＥＧリンカーおよびトリアゾール環を介して結合している。
【0079】
グルコース構成ブロックを使用して合成されたデンドリマーは、大部分がグルコース部分で作製された表面を伴い、脳および眼における損傷したニューロン、神経節細胞および他のニューロン細胞を含む選択された細胞への標的化された送達を可能にする。
【0080】
一実施形態では、グルコースベースのデンドリマーは、ニューロン、特にニューロン核を選択的に標的とするかまたはそれらの内部で富化される。好ましい実施形態では、グルコースベースのデンドリマーは、損傷したニューロン、罹患したニューロン、および／または過活動性のニューロンを選択的に標的とするかまたはそれらの内部で富化される。
【0081】
好ましい実施形態において、デンドリマーは、ＣＮＳまたは眼の１つもしくは複数のニューロンを標的とするための有効な数の末端グルコースおよび／またはヒドロキシル基を含む。デンドリマー表面上のヒドロキシル基はグルコース分子の一部である。表面上のグルコース分子以外に余分なヒドロキシルは存在しない。表面上の糖分子の数は世代数によって決定される。全ての世代がニューロンを標的とすることが期待される。
【0082】
一部の実施形態では、デンドリマーは、グルコースおよびオリゴエチレングリコール構成ブロックから作製される。例示的なグルコースデンドリマーは実施例に示しており、例えば、第１世代のデンドリマーは図２２で示し、第２世代のデンドリマーは図２３で示す。一部の例示的なグルコースデンドリマーとしては、２４個のヒドロキシル（－ＯＨ）末端基を有する第１世代グルコースデンドリマー、９６個のヒドロキシル（－ＯＨ）末端基を有する第２世代グルコースデンドリマー、３９６個のヒドロキシル（－ＯＨ）末端基を有する第３世代グルコースデンドリマー、および１５８４個のヒドロキシル（－ＯＨ）末端基を有する第４世代グルコースデンドリマーが挙げられる。好ましい実施形態では、グルコースデンドリマーは、周辺に２４個のグルコース分子と、ＰＥＧセグメントによって保持されている骨格において埋め込まれた６個のグルコース分子とを有する第２世代グルコースベースのデンドリマーである。
【0083】
一部の実施形態では、グルコースデンドリマーは、例えば、図２４で示すようにＳＰＤＰおよび１つまたは複数のＰＥＧセグメントを介して追加の部分にコンジュゲートするように機能化されている。一部の実施形態では、グルコースデンドリマーは、図２５で示すようにｓｉＲＮＡにコンジュゲートしている。
【0084】
したがって一部の実施形態では、１つまたは複数の機能性核酸は、損傷したニューロン、罹患したニューロン、および／または過活動性のニューロンを選択的に標的とするかまたはそれらの内部で富化されるためにグルコースデンドリマーにコンジュゲートしている。例示的な機能性核酸は、アンチセンス分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、または外部ガイド配列である。好ましい機能性核酸はｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡである。特定の実施形態において、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ－１２６である。
【0085】
Ｂ．カップリング剤およびスペーサー
デンドリマー複合体は、１つまたは複数のスペーサー／リンカーを介してデンドリマー、樹状ポリマーまたはハイパーブランチポリマーにコンジュゲートしている小分子生物製剤から形成される。典型的には、活性剤は、１つまたは複数の連結、例えば、ジスルフィド、エステル、カルボネート、カルバメート、チオエステル、ヒドラジン、ヒドラジド、およびアミド連結を介してデンドリマーと連結している。好ましい実施形態では、デンドリマーと薬剤との間の１つまたは複数のスペーサー／リンカーは、デンドリマー－活性複合体のｉｎ ｖｉｖｏで放出可能なまたは放出不可能な形態を提供するように設計される。一部の実施形態では、結合は、薬剤とデンドリマーとの間にエステル結合を提供する適切なスペーサーを介して生じる。一部の実施形態では、結合は、薬剤とデンドリマーとの間にアミド結合を提供する適切なスペーサーを介して生じる。好ましい実施形態では、デンドリマーと薬剤との間の１つまたは複数のスペーサー／リンカーは、所望のおよび有効な放出動態をｉｎ ｖｉｖｏで達成するように添加される。
デンドリマー複合体は、１つまたは複数のスペーサー／リンカーを介してデンドリマー、樹状ポリマーまたはハイパーブランチポリマーにコンジュゲートしている小分子生物製剤から形成される。典型的には、活性剤は、１つまたは複数の連結、例えば、ジスルフィド、エステル、カルボネート、カルバメート、チオエステル、ヒドラジン、ヒドラジド、およびアミド連結を介してデンドリマーと連結している。好ましい実施形態では、デンドリマーと薬剤との間の１つまたは複数のスペーサー／リンカーは、デンドリマー－活性複合体のｉｎ ｖｉｖｏで放出可能なまたは放出不可能な形態を提供するように設計される。一部の実施形態では、結合は、薬剤とデンドリマーとの間にエステル結合を提供する適切なスペーサーを介して生じる。一部の実施形態では、結合は、薬剤とデンドリマーとの間にアミド結合を提供する適切なスペーサーを介して生じる。好ましい実施形態では、デンドリマーと薬剤との間の１つまたは複数のスペーサー／リンカーは、所望のおよび有効な放出動態をｉｎ ｖｉｖｏで達成するように添加される。
【0086】
「スペーサー」という用語は、活性剤（例えば、機能性核酸）をデンドリマーに連結するために使用する組成物を含む。スペーサーは、ポリマーと治療剤または造影剤とを架橋するために一緒に連結されている、単一の化学的実体または２つもしくはそれを超える化学的実体のいずれかとすることができる。スペーサーとしては、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、およびカルボネート末端を有する任意の小さな化学的実体、ペプチドまたはポリマーを挙げることができる。スペーサーは、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンおよびカルボネート基が末端である化合物のクラスから選択され得る。
【0087】
好ましい実施形態において、スペーサーとしては、チオピリジン末端化合物、例えば、ジチオジピリジン、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド）ヘキサノエートＬＣ－ＳＰＤＰまたはスルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰがある。
【0088】
一部の実施形態では、スペーサーとしては、スルフヒドリル基、例えばグルタチオン、ホモシステイン、システインおよびその誘導体を実質的に有する直鎖状または環状のペプチド、ａｒｇ－ｇｌｙ－ａｓｐ－ｃｙｓ（ＲＧＤＣ）、シクロ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－ｄ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ）（ｃ（ＲＧＤｆＣ））、シクロ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ）、シクロ（Ａｒｇ－Ａｌａ－Ａｓｐ－ｄ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ）を挙げることもできる。スペーサーは、メルカプト酸誘導体、例えば３メルカプトプロピオン酸、メルカプト酢酸、４メルカプト酪酸、チオラン－２－オン、６メルカプトヘキサン酸、５メルカプト吉草酸ならびに他のメルカプト誘導体、例えば２メルカプトエタノールおよび２メルカプトエチルアミンとすることができる。スペーサーは、チオサリチル酸およびその誘導体、（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－メチル－アルファ－２－ピリジルチオ）トルエン、（３－［２－ピリジチオ］プロピオニルヒドラジドとすることができる。スペーサーは、マレイミド末端を有していてもよく、スペーサーとしては、ポリマーまたは小さな化学的実体、例えばビス－マレイミドジエチレングリコールおよびビス－マレイミドトリエチレングリコール、ビス－マレイミドエタン、ビスマレイミドヘキサンが挙げられる。スペーサーとしては、ビニルスルホン、例えば１，６－ヘキサン－ビス－ビニルスルホンを挙げることができる。スペーサーとしては、チオグリコシド、例えばチオグルコースを挙げることができる。スペーサーは、還元タンパク質、例えばウシ血清アルブミンおよびヒト血清アルブミン、ジスルフィド結合を形成することができる任意のチオール末端化合物とすることができる。スペーサーとしては、スルフヒドリル、チオピリジン、マレイミド、スクシンイミジルおよびチオール末端を有するポリエチレングリコールを挙げることができる。
【0089】
活性剤は、共有結合していても、分子内分散していても、カプセル化されていてもよい。好ましい実施形態において、活性剤はデンドリマーに共有結合している。デンドリマーは好ましくは最大第１０世代のＰＡＭＡＭデンドリマーであり、カルボキシル、ヒドロキシル、またはアミン末端を有している。好ましい実施形態において、デンドリマーは、ジスルフィド結合で終わるスペーサーを介して活性剤に連結されたヒドロキシル末端ＰＡＭＡＭデンドリマーである。
【0090】
１．ｉｎ ｖｉｖｏで放出可能なリンカー
好ましい実施形態において、１つまたは複数の小分子活性剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで放出可能なリンカーを介してデンドリマーに共有結合によりコンジュゲートしている。典型的には、デンドリマーへの共有結合によって活性剤が安定化され、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬剤の血清中半減期が延長され、酵素分解が予防され、同時に非機能的形態で活性剤が維持される。一部の実施形態では、リンカーは、所定の時間またはｉｎ ｖｉｖｏの位置で、例えば細胞内環境内で、活性剤がデンドリマーとの共有結合から放出されるように設計され選択されている。したがって、一部の形態では、小分子生物製剤、例えば機能性核酸は、血清において安定して保護されているが機能的に不活性な形態で維持されおり、しかし細胞中に内在化された際に放出されて機能するようになる。したがって一部の実施形態では、デンドリマー／小分子生物製剤には、例えば、デンドリマーと薬剤との間のジスルフィド結合を分割することによってデンドリマーから活性剤を放出する、ｉｎ ｖｉｖｏで放出可能なリンカーが含まれる。一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏで放出可能なリンカーは、プロテアーゼ活性、ｐＨ、およびグルタチオン濃度のうちの１つまたは複数に対して感受性である。グルタチオン濃度放出戦略では、血漿よりも高い細胞内グルタチオン濃度を利用する。したがって、ジスルフィド含有リンカーは、グルタチオンによる還元後に細胞毒素を放出する。例示的なグルタチオン感受性リンカーは、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオネート（ＳＰＤＰ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、およびガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）である。例示的なプロテアーゼ感受性戦略では、カテプシンＢによる細胞内切断機序としてリンカー、例えば、バリン－シトルリン（ＶＣ）ジペプチドにおける特異的ペプチド配列を認識し切断するために、腫瘍細胞のリソソームにおいて認められる優勢なプロテアーゼを利用する。酸感受性戦略は、細胞質（ｐＨ＝７．４）と比較してｐＨが低いエンドソーム（ｐＨ＝５～６）およびリソソーム（ｐＨ＝４．８）コンパートメントを使用して、リンカー、例えばヒドラゾン内の酸に不安定な基の加水分解を誘発するためのものである。
好ましい実施形態において、１つまたは複数の小分子活性剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで放出可能なリンカーを介してデンドリマーに共有結合によりコンジュゲートしている。典型的には、デンドリマーへの共有結合によって活性剤が安定化され、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬剤の血清中半減期が延長され、酵素分解が予防され、同時に非機能的形態で活性剤が維持される。一部の実施形態では、リンカーは、所定の時間またはｉｎ ｖｉｖｏの位置で、例えば細胞内環境内で、活性剤がデンドリマーとの共有結合から放出されるように設計され選択されている。したがって、一部の形態では、小分子生物製剤、例えば機能性核酸は、血清において安定して保護されているが機能的に不活性な形態で維持されおり、しかし細胞中に内在化された際に放出されて機能するようになる。したがって一部の実施形態では、デンドリマー／小分子生物製剤には、例えば、デンドリマーと薬剤との間のジスルフィド結合を分割することによってデンドリマーから活性剤を放出する、ｉｎ ｖｉｖｏで放出可能なリンカーが含まれる。一部の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏで放出可能なリンカーは、プロテアーゼ活性、ｐＨ、およびグルタチオン濃度のうちの１つまたは複数に対して感受性である。グルタチオン濃度放出戦略では、血漿よりも高い細胞内グルタチオン濃度を利用する。したがって、ジスルフィド含有リンカーは、グルタチオンによる還元後に細胞毒素を放出する。例示的なグルタチオン感受性リンカーは、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオネート（ＳＰＤＰ）、グルタチオン（ＧＳＨ）、およびガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）である。例示的なプロテアーゼ感受性戦略では、カテプシンＢによる細胞内切断機序としてリンカー、例えば、バリン－シトルリン（ＶＣ）ジペプチドにおける特異的ペプチド配列を認識し切断するために、腫瘍細胞のリソソームにおいて認められる優勢なプロテアーゼを利用する。酸感受性戦略は、細胞質（ｐＨ＝７．４）と比較してｐＨが低いエンドソーム（ｐＨ＝５～６）およびリソソーム（ｐＨ＝４．８）コンパートメントを使用して、リンカー、例えばヒドラゾン内の酸に不安定な基の加水分解を誘発するためのものである。
【0091】
好ましい実施形態では、リンカーは、細胞内環境内のデンドリマーから小分子生物製剤を放出し、その結果、小分子の活性は標的細胞内部に制限される。例示的な実施形態では、デンドリマー複合体は、グルタチオン放出可能リンカー、例えばＳＰＤＰリンカーを介して１つまたは複数の小分子生物製剤、例えば機能性核酸に共有結合しているＯＨ末端ＰＡＭＡＭデンドリマーを含む。
【0092】
Ｃ．小分子生物製剤
デンドリマーは１つまたは複数の小分子生物製剤に共有結合している。生物製剤という用語は、生物起源の多様な選択物の化合物、例えば、ペプチド、核酸ベースの化合物、サイトカイン、代替酵素、さまざまな組換えタンパク質、およびモノクローナル抗体を網羅する。好ましい実施形態において、小分子生物製剤としては、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡおよび治療的タンパク質がある。小分子生物製剤の分子量は、５０，０００ａｍｕ未満、好ましくは２０，０００ａｍｕ未満、より好ましくは５，０００～１５，０００ダルトンである。一部の実施形態では、デンドリマーと会合しているかまたはそれにコンジュゲートしている小分子生物製剤としては１つまたは複数の機能性核酸がある。
デンドリマーは１つまたは複数の小分子生物製剤に共有結合している。生物製剤という用語は、生物起源の多様な選択物の化合物、例えば、ペプチド、核酸ベースの化合物、サイトカイン、代替酵素、さまざまな組換えタンパク質、およびモノクローナル抗体を網羅する。好ましい実施形態において、小分子生物製剤としては、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡおよび治療的タンパク質がある。小分子生物製剤の分子量は、５０，０００ａｍｕ未満、好ましくは２０，０００ａｍｕ未満、より好ましくは５，０００～１５，０００ダルトンである。一部の実施形態では、デンドリマーと会合しているかまたはそれにコンジュゲートしている小分子生物製剤としては１つまたは複数の機能性核酸がある。
【0093】
１．機能性核酸
標的遺伝子の転写、翻訳、または機能を阻害する機能性核酸を記載する。機能性核酸は、特異的機能、例えば標的分子との結合または特定の反応の触媒作用を有する核酸分子である。以下でより詳細に考察するように、機能性核酸分子は次のカテゴリー：アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、ＲＮＡｉ、および外部ガイド配列に分けることができる。機能性核酸分子は、標的分子が有する特異的な活性のエフェクター、阻害剤、モジュレーター、または刺激物質として作用することができるか、または任意の他の分子とは無関係なデノボ活性を有する場合がある。
標的遺伝子の転写、翻訳、または機能を阻害する機能性核酸を記載する。機能性核酸は、特異的機能、例えば標的分子との結合または特定の反応の触媒作用を有する核酸分子である。以下でより詳細に考察するように、機能性核酸分子は次のカテゴリー：アンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、ＲＮＡｉ、および外部ガイド配列に分けることができる。機能性核酸分子は、標的分子が有する特異的な活性のエフェクター、阻害剤、モジュレーター、または刺激物質として作用することができるか、または任意の他の分子とは無関係なデノボ活性を有する場合がある。
【0094】
機能性核酸分子は、任意の高分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、または炭水化物鎖と相互作用することができる。したがって、機能性核酸は、標的ポリペプチドのｍＲＮＡもしくはゲノムＤＮＡと相互作用することができるか、または標的ポリペプチド自体と相互作用することができる。機能性核酸は、標的分子と機能性核酸分子との間の配列相同性に基づいて他の核酸と相互作用するように設計されていることが多い。他の状況では、機能性核酸分子と標的分子との間の特異的認識は、機能性核酸分子と標的分子との間の配列相同性に基づいておらず、むしろ特異的認識を可能にする第三級構造の形成に基づいている。したがって、組成物は、標的タンパク質の発現または機能を減少させるように設計された１つまたは複数の機能性核酸を含んでいてもよい。
【0095】
記載する機能性核酸、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＥＧＳ、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、リボザイム、およびアプタマーをｉｎ ｖｉｖｏで発現させるためのベクターを作製および使用する方法は当技術分野において公知である。デンドリマー－機能性核酸複合体として機能性核酸を対象に投与すると、典型的には、単独で投与された機能性核酸の血清中半減期と比較して、機能性核酸の血清中半減期が増強される。一部の実施形態では、デンドリマーとのコンジュゲーションによって、機能性核酸が酵素分解またはタンパク質分解から遮蔽され、機能性核酸の非特異的細胞取り込みおよび／または活性が阻止される。
【0096】
典型的には、デンドリマーとのコンジュゲーションは、デンドリマー複合体によって標的とされる１つまたは複数の部位への機能性核酸のｉｎ ｖｉｖｏ分布を誘導する。例えば、ＯＨ末端デンドリマーとのコンジュゲーションは、全身投与後、１つまたは複数の炎症部位への機能性核酸のｉｎ ｖｉｖｏ分布を誘導する。特定の実施形態では、ＯＨ末端デンドリマーとのコンジュゲーションは、全身投与後、脳および／またはＣＮＳ内の神経炎症または神経学的損傷の１つまたは複数の部位への機能性核酸のｉｎ ｖｉｖｏ分布を誘導する。
【0097】
ａ．アンチセンスオリゴヌクレオチド
一部の実施形態では、機能性核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは標準的塩基対形成または非標準的塩基対形成のいずれかによって標的核酸分子と相互作用するように設計されている。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ介在性ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド分解によって標的分子の破壊を促進するように設計されている。あるいは、アンチセンス分子は、標的分子上で通常生じるであろうプロセシング機能、例えば転写または複製を妨害するように設計されている。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計してもよい。標的分子の最もアクセス可能な領域を見出すことによってアンチセンス効率を最適化するための多くの方法が存在する。例示的な方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの選択実験、ならびにＤＭＳおよびＤＥＰＣを使用したＤＮＡ修飾研究がある。アンチセンス分子は、標的分子と１０－６、１０－８、１０－１０、または１０－１２未満またはそれらに等しい解離定数（Ｋｄ）で結合することが好ましい。
一部の実施形態では、機能性核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは標準的塩基対形成または非標準的塩基対形成のいずれかによって標的核酸分子と相互作用するように設計されている。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮａｓｅ Ｈ介在性ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッド分解によって標的分子の破壊を促進するように設計されている。あるいは、アンチセンス分子は、標的分子上で通常生じるであろうプロセシング機能、例えば転写または複製を妨害するように設計されている。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計してもよい。標的分子の最もアクセス可能な領域を見出すことによってアンチセンス効率を最適化するための多くの方法が存在する。例示的な方法としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの選択実験、ならびにＤＭＳおよびＤＥＰＣを使用したＤＮＡ修飾研究がある。アンチセンス分子は、標的分子と１０－６、１０－８、１０－１０、または１０－１２未満またはそれらに等しい解離定数（Ｋｄ）で結合することが好ましい。
【0098】
ｂ．サイレンシングＲＮＡ（ＲＮＡ干渉）
一部の実施形態では、機能性核酸は、ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）によって遺伝子サイレンシングを誘導する。標的遺伝子の発現は、ＲＮＡ干渉によって高度に特異的な様式で有効にサイレンシングすることができる。
一部の実施形態では、機能性核酸は、ＲＮＡ干渉（ｓｉＲＮＡ）によって遺伝子サイレンシングを誘導する。標的遺伝子の発現は、ＲＮＡ干渉によって高度に特異的な様式で有効にサイレンシングすることができる。
【0099】
所与の遺伝子の干渉活性を伴うＲＮＡポリヌクレオチドは、対応する相補的配列を伴う特定のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の分解をもたらし、タンパク質産生を予防することによって遺伝子を下方調節することになる（Ｓｌｅｄｚ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｂｌｏｏｄ， １０６（３）：７８７－７９４ （２００５）を参照のこと）。ＲＮＡ分子がｍＲＮＡと相補的ワトソンクリック塩基対を形成した場合、アクセサリータンパク質によるｍＲＮＡ切断が誘発される。ＲＮＡの供給源は、ウイルス感染であっても、転写であっても、外因性供給源からの導入であってもよい。
【0100】
遺伝子サイレンシングは、もともとは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の添加によって観察された（Ｆｉｒｅ， ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ， ３９１：８０６－１１；Ｎａｐｏｌｉ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９－８９；Ｈａｎｎｏｎ， （２００２） Ｎａｔｕｒｅ， ４１８：２４４－５１）。ｄｓＲＮＡが細胞に侵入すると、ダイサーと呼ばれるＲＮａｓｅ ＩＩＩ様酵素によって切断され、３’末端上で２ヌクレオチドオーバーハングを含む２１～２３ヌクレオチド長の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）となる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．， １５：１８８－２００ （２００１）；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４０９：３６３－６ （２００１）；Ｈａｍｍｏｎｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４０４：２９３－６ （２０００）；Ｎｙｋａｎｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １０７：３０９－２１ （２００１）；Ｍａｒｔｉｎｅｚ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １１０：５６３－７４ （２００２））。ｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡまたはそれらの使用の効果はいずれのタイプの機序にも限定されない。
【0101】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと標的ＲＮＡとの両方の間の配列同一性の領域内で相同ＲＮＡ分子、例えばｍＲＮＡの特異的分解を引き起こす。配列特異的遺伝子サイレンシングは、ダイサー酵素によって産生されるｓｉＲＮＡを模倣した短い二本鎖合成ＲＮＡを使用して哺乳動物細胞において達成することができる（Ｅｌｂａｓｈｉｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ４１１：４９４－４９８ （２００１））（Ｕｉ－Ｔｅｉ， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ， ４７９：７９－８２ （２０００））。ｓｉＲＮＡは化学的にまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで合成しても、細胞内部でｓｉＲＮＡにプロセシングされる短い二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の結果であってもよい。例えば、ＷＯ０２／４４３２１では、３’オーバーハング末端と塩基対を形成した場合、ｓｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡを配列特異的に分解することができることが記載されており、その出願は、それらのｓｉＲＮＡを作成する方法に関して参照により本明細書に特に組み込まれるものとする。合成ｓｉＲＮＡは、アルゴリズムおよび従来のＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を使用して一般的に設計される。供給会社としては、Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ａｓｈｌａｎｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）、ＭＷＢ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｓｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｐｒｏｌｉｇｏ（Ｂｏｕｌｄｅｒ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、およびＱｉａｇｅｎ（Ｖｅｎｔｏ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）がある。ｓｉＲＮＡはまた、キット、例えばＡｍｂｉｏｎのＳＩＬＥＮＣＥＲ（登録商標）ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎキットを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで合成してもよい。
【0102】
したがって一部の実施形態では、デンドリマーは、１つもしくは複数のｓｉＲＮＡ、またはｓｉＲＮＡを発現する１つまたは複数のベクターを含む。ベクターからのｓｉＲＮＡ産生は、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の転写によって行うのがより一般的である。ｓｈＲＮＡを含むベクターを産生するためのキットは入手可能であり、例えば、ＩｍｇｅｎｅｘのＧＥＮＥＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ（商標）ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎキットおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＢＬＯＣＫ－ＩＴ（商標）誘発型ＲＮＡｉプラスミドおよびレンチウイルスベクターである。一部の実施形態では、機能性核酸はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡである。
【0103】
ｉ．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）
一部の実施形態では、サイレンシングＲＮＡはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現の調節において重要な役割を果たすある種の非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは標的配列に結合し、標的遺伝子の発現を減少させる。ｍｉＲＮＡはＤＮＡに直接結合し転写を阻止するか、または転写されたｍＲＮＡに直接結合し翻訳を阻止し、ｍＲＮＡを分解に向かわせる。
一部の実施形態では、サイレンシングＲＮＡはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、遺伝子発現の調節において重要な役割を果たすある種の非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは標的配列に結合し、標的遺伝子の発現を減少させる。ｍｉＲＮＡはＤＮＡに直接結合し転写を阻止するか、または転写されたｍＲＮＡに直接結合し翻訳を阻止し、ｍＲＮＡを分解に向かわせる。
【0104】
ｍｉＲＮＡは、平均２２ヌクレオチド長の小さな非コードＲＮＡである。大部分のｍｉＲＮＡはＤＮＡ配列から一次ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）に転写され、前駆体ｍｉＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）および成熟ｍｉＲＮＡにプロセシングされる。大部分の場合では、ｍｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と相互作用して、ｍＲＮＡの分解および翻訳抑制を誘発する。しかし、ｍｉＲＮＡと５’ＵＴＲ、コード配列、および遺伝子プロモーターを含む他の領域との相互作用も報告されている。ある特定の条件下では、ｍｉＲＮＡは翻訳を活性化するかまたは転写を調節する場合もある。ｍｉＲＮＡとその標的遺伝子との相互作用は動的であり、多くの因子、例えば、ｍｉＲＮＡの細胞内位置、ｍｉＲＮＡおよび標的ｍＲＮＡの豊富さ、ならびにｍｉＲＮＡ－ｍＲＮＡ相互作用の親和性に依存する。ｍｉＲＮＡは細胞外液に分泌され、小胞、例えばエクソソームによってまたはアルゴノートを含むタンパク質に結合することによって、標的細胞に輸送される場合がある。細胞外ｍｉＲＮＡは細胞－細胞コミュニケーションを媒介するための化学メッセンジャーとして機能する（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｆｒｏｎｔ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， ９， ｐｐ．４０２ （２０１８））。
【0105】
大部分の場合で、ｍｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲと相互作用して発現を抑制するか、または５’ＵＴＲ、コード配列、および遺伝子プロモーターを含む他の領域と相互作用する。ｍｉＲＮＡは異なる細胞内コンパートメント間を往復し、翻訳、さらには転写の速度を制御もする。
【0106】
１つまたは複数の放出可能なリンカーを介してｍｉＲＮＡに共有結合しているデンドリマーを記載する。好ましい実施形態では、デンドリマーは、ｍｉＲＮＡを標的細胞内、例えば、活性化マクロファージまたはミクログリア細胞内に細胞内放出するために、放出可能なリンカーを介して１つまたは複数のｍｉＲＮＡに共有結合しているＧ２～Ｇ１０世代ＯＨ末端ＰＡＭＡＭデンドリマーである。
【0107】
（１）ｍｉＲ－１２６
一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）はｍｉＲ－１２６ｍｉＲＮＡである。ｍｉＲ－１２６は、毛細血管から太い血管にわたる内皮細胞においてのみ発現するヒトマイクロＲＮＡであり、さまざまな転写物に作用して血管新生を制御する。ｍｉＲ－１２６はヒト第９染色体上に存在するＥＧＦＬ７遺伝子の第７イントロン内に位置する（Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ． １０： ２０９０－１００． ｄｏｉ：１０．１１００／ｔｓｗ．２０１０．１９８ （２０１０））。
一部の実施形態では、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）はｍｉＲ－１２６ｍｉＲＮＡである。ｍｉＲ－１２６は、毛細血管から太い血管にわたる内皮細胞においてのみ発現するヒトマイクロＲＮＡであり、さまざまな転写物に作用して血管新生を制御する。ｍｉＲ－１２６はヒト第９染色体上に存在するＥＧＦＬ７遺伝子の第７イントロン内に位置する（Ｍｅｉｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ． １０： ２０９０－１００． ｄｏｉ：１０．１１００／ｔｓｗ．２０１０．１９８ （２０１０））。
【0108】
ｍｉＲ－１２６は２つの転写因子：ＥＴＳ１およびＥＴＳ２の結合によって調節され、これらが結合するとｍｉＲ－１２６プレｍｉＲＮＡの転写が誘発され、ヘアピンｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの形成をもたらす。ヘアピンｍｉＲＮＡはダイサーに標的とされて切断され、成熟ｍｉＲ－１２６およびｍｉＲ－１２６＊転写物が産生される。メチル化および遺伝子サイレンシングヌクレオソームの蓄積による宿主遺伝子のエピジェネティックな調節によってイントロンｍｉＲＮＡの発現が減少する。これはＥＧＦＬ７とｍｉＲ－１２６の両方のサイレンシングからの恩恵を受け両方とも発現しなくなるがんにおいて観察されている。
【0109】
ｍｉＲ－１２６の主な標的のうちの１つは宿主遺伝子ＥＧＦＬ７である。成熟ｍｉＲ－１２６は、ＥＧＦＬ７内の相補的配列に結合し、ｍＲＮＡの翻訳を阻止し、ＥＧＦＬ７タンパク質レベルを減少させる。ＥＧＦＬ７は、細胞遊走および血管形成に関与していることは公知であり、ＥＧＦＬ７およびｍｉＲ－１２６は、腫瘍に栄養を供給するための血管の継続的形成および組織浸潤を媒介するための細胞遊走経路を必要とする疾患、例えばがんに対する標的として好都合である。ｍｉＲ－１２６の標的としては、ＣＲＫ（細胞接着、増殖、遊走および浸潤の調節に関与する細胞内シグナル経路に関与するタンパク質）；ＴＯＭ１（ＩＬ－１ベータおよびＴＮＦ－アルファシグナル伝達経路の負のレギュレーター）；ＣＸＣＬ１２（ｍｉＲ－１２６によって調節されるケモカイン）；ＰＯＵ３Ｆ１（転写因子ＰＵ．１の活性化に必要とされる因子）；ＶＥＧＦ－Α（ｍｉＲ－１２６がＶＥＧＦ－ΑｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合するとき、タンパク質産生は減少する）；ＩＲＳ－１（細胞周期のＧ０／Ｇ１からＳ期への進行を阻害する）；およびＨＯＸＡ９（ｍｉＲ－１２６は造血細胞におけるＨＯＸＡ９発現をモジュレートする）がある。
【0110】
ｍｉＲ－１２６ ｍｉＲＮＡに関する核酸配列は：
５’ＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＵＵＵＧＧＵＡＣＧＣＧ－３’（配列番号１）
である。
５’ＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＵＵＵＧＧＵＡＣＧＣＧ－３’（配列番号１）
である。
【0111】
ｃ．アプタマー
一部の実施形態では、機能性核酸はアプタマーである。アプタマーは、好ましくは特異的な方法で標的分子と相互作用する分子である。典型的には、アプタマーは、規定された二次および三次構造、例えばステムループまたはＧ－四重鎖（Ｇ－ｑｕａｒｔｅｔ）に折りたたまれている１５～５０塩基長の範囲の小さな核酸である。アプタマーは小さな分子、例えばＡＴＰおよびテオフィリン、ならびに大きな分子、例えば逆転写酵素およびトロンビンと結合することができる。アプタマーは、標的分子からのＫｄ値が１０－１２Ｍ未満で非常に強力に結合することができる。アプタマーは標的分子と１０－６、１０－８、１０－１０、または１０－１２未満のＫｄで結合することが好ましい。アプタマーは標的分子と非常に高度な特異性で結合することができる。例えば、標的分子と分子上で１つの位置のみが異なる別の分子との間の結合親和性において１０，０００倍を超える差を有するアプタマーが単離されている。アプタマーは、標的分子とのＫｄがバックグラウンド結合分子のＫｄの多くとも１／１０、１／１００、１／１０００、１／１０，０００、または１／１００，０００であることが好ましい。ポリペプチドなどの分子について比較を行う場合、バックグラウンド分子は、異なるポリペプチドであることが好ましい。
一部の実施形態では、機能性核酸はアプタマーである。アプタマーは、好ましくは特異的な方法で標的分子と相互作用する分子である。典型的には、アプタマーは、規定された二次および三次構造、例えばステムループまたはＧ－四重鎖（Ｇ－ｑｕａｒｔｅｔ）に折りたたまれている１５～５０塩基長の範囲の小さな核酸である。アプタマーは小さな分子、例えばＡＴＰおよびテオフィリン、ならびに大きな分子、例えば逆転写酵素およびトロンビンと結合することができる。アプタマーは、標的分子からのＫｄ値が１０－１２Ｍ未満で非常に強力に結合することができる。アプタマーは標的分子と１０－６、１０－８、１０－１０、または１０－１２未満のＫｄで結合することが好ましい。アプタマーは標的分子と非常に高度な特異性で結合することができる。例えば、標的分子と分子上で１つの位置のみが異なる別の分子との間の結合親和性において１０，０００倍を超える差を有するアプタマーが単離されている。アプタマーは、標的分子とのＫｄがバックグラウンド結合分子のＫｄの多くとも１／１０、１／１００、１／１０００、１／１０，０００、または１／１００，０００であることが好ましい。ポリペプチドなどの分子について比較を行う場合、バックグラウンド分子は、異なるポリペプチドであることが好ましい。
【0112】
ｄ．リボザイム
機能性核酸はリボザイムであってもよい。リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで化学反応を触媒することができる核酸分子である。リボザイムは分子間反応を触媒することが好ましい。天然の系において認められるリボザイム、例えばハンマーヘッドリボザイムに基づくヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼタイプの反応を触媒する異なるタイプのリボザイムを記載する。天然の系において認められないがデノボでの特異的な反応を触媒するように操作されているリボザイムも記載する。好ましいリボザイムはＲＮＡまたはＤＮＡ基質を切断し、より好ましくはＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは典型的には、標的基質を認識し結合し、その後切断することによって核酸基質を切断する。この認識は、標準的なまたは非標準的な塩基対相互作用に大部分は基づいていることが多い。標的基質の認識は標的基質の配列に基づいているため、この特性によって、リボザイムは核酸の特異的切断を標的とするための特に良好な候補となる。
機能性核酸はリボザイムであってもよい。リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで化学反応を触媒することができる核酸分子である。リボザイムは分子間反応を触媒することが好ましい。天然の系において認められるリボザイム、例えばハンマーヘッドリボザイムに基づくヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼタイプの反応を触媒する異なるタイプのリボザイムを記載する。天然の系において認められないがデノボでの特異的な反応を触媒するように操作されているリボザイムも記載する。好ましいリボザイムはＲＮＡまたはＤＮＡ基質を切断し、より好ましくはＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは典型的には、標的基質を認識し結合し、その後切断することによって核酸基質を切断する。この認識は、標準的なまたは非標準的な塩基対相互作用に大部分は基づいていることが多い。標的基質の認識は標的基質の配列に基づいているため、この特性によって、リボザイムは核酸の特異的切断を標的とするための特に良好な候補となる。
【0113】
ｅ．三重鎖形成オリゴヌクレオチド
機能性核酸は三重鎖形成オリゴヌクレオチド分子であってもよい。三重鎖形成機能性核酸分子は、二本鎖核酸または一本鎖核酸のいずれかと相互作用することができる分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用した場合、ワトソンクリック塩基対形成とフーグスティーン塩基対形成の両方に依存する複合体を形成するＤＮＡの３つのストランドが存在する三重鎖と呼ばれる構造が形成される。三重鎖分子は、高い親和性および特異性で標的領域と結合することができるため好ましい。三重鎖形成分子は標的分子に１０－６、１０－８、１０－１０、または１０－１２未満のＫｄで結合することが好ましい。
機能性核酸は三重鎖形成オリゴヌクレオチド分子であってもよい。三重鎖形成機能性核酸分子は、二本鎖核酸または一本鎖核酸のいずれかと相互作用することができる分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用した場合、ワトソンクリック塩基対形成とフーグスティーン塩基対形成の両方に依存する複合体を形成するＤＮＡの３つのストランドが存在する三重鎖と呼ばれる構造が形成される。三重鎖分子は、高い親和性および特異性で標的領域と結合することができるため好ましい。三重鎖形成分子は標的分子に１０－６、１０－８、１０－１０、または１０－１２未満のＫｄで結合することが好ましい。
【0114】
ｆ．外部ガイド配列
機能性核酸は外部ガイド配列であってもよい。外部ガイド配列（ＥＧＳ）は標的核酸分子に結合し複合体を形成する分子であり、それがＲＮａｓｅ Ｐによって認識され、次いで標的分子が切断される。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的に標的とするように設計されていてもよい。ＲＮａｓｅ Ｐは細胞内の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを助ける。細菌性ＲＮａｓｅ Ｐは、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然ｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを使用することによって、いずれのＲＮＡ配列も事実上切断するように動員することができる。同様に、真核生物ＥＧＳ／ＲＮａｓｅ Ｐ指向性ＲＮＡ切断を、真核細胞内の所望の標的を切断するために利用してもよい。さまざまな異なる標的分子の切断を促進するためにＥＧＳ分子を作製し使用する方法の代表的な例は当技術分野において公知である。
機能性核酸は外部ガイド配列であってもよい。外部ガイド配列（ＥＧＳ）は標的核酸分子に結合し複合体を形成する分子であり、それがＲＮａｓｅ Ｐによって認識され、次いで標的分子が切断される。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的に標的とするように設計されていてもよい。ＲＮａｓｅ Ｐは細胞内の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセシングを助ける。細菌性ＲＮａｓｅ Ｐは、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然ｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを使用することによって、いずれのＲＮＡ配列も事実上切断するように動員することができる。同様に、真核生物ＥＧＳ／ＲＮａｓｅ Ｐ指向性ＲＮＡ切断を、真核細胞内の所望の標的を切断するために利用してもよい。さまざまな異なる標的分子の切断を促進するためにＥＧＳ分子を作製し使用する方法の代表的な例は当技術分野において公知である。
【0115】
Ｄ．送達されることになる追加の薬剤
デンドリマー－小型生物製剤複合体は、１つまたは複数の追加の活性剤、特に、標的疾患または障害の１つまたは複数の症状を予防または処置するための１つまたは複数の活性剤を送達するために使用することができる。好適な治療剤、診断剤、および／または予防剤は、生体分子、例えば、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドであってもよい。薬剤は、デンドリマー内にカプセル化されていても、デンドリマー内に分散されていても、および／またはデンドリマー表面と共有結合的にまたは非共有結合的に会合していてもよい。
デンドリマー－小型生物製剤複合体は、１つまたは複数の追加の活性剤、特に、標的疾患または障害の１つまたは複数の症状を予防または処置するための１つまたは複数の活性剤を送達するために使用することができる。好適な治療剤、診断剤、および／または予防剤は、生体分子、例えば、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドであってもよい。薬剤は、デンドリマー内にカプセル化されていても、デンドリマー内に分散されていても、および／またはデンドリマー表面と共有結合的にまたは非共有結合的に会合していてもよい。
【0116】
デンドリマーは、複数の治療用、予防用、および／または診断用薬剤を同じデンドリマーを用いて送達することができるという利点を有する。１つまたは複数のタイプの薬剤は、デンドリマーにカプセル化、複合体化、またはコンジュゲートしてもよい。一実施形態では、デンドリマーは、２つまたはそれを超える異なるクラスの薬剤と複合体化されるかまたはそれらにコンジュゲートされ、標的部位における異なるまたは独立した放出動態を伴う同時送達を提供する。別の実施形態では、デンドリマーは、少なくとも１つの検出可能な部分および少なくとも１つのクラスの薬剤に共有結合により連結される。さらなる実施形態では、異なるクラスの薬剤をそれぞれ運ぶデンドリマー複合体は、組合せ処置のために同時に投与される。
【0117】
１．治療用および予防用薬剤
一部の実施形態では、デンドリマー－小型生物製剤複合体は、１つまたは複数の追加の治療用または予防用薬剤を含む。例示的な追加の治療用または予防用薬剤の例としては、抗炎症剤、化学療法剤、および抗感染症剤がある。
一部の実施形態では、デンドリマー－小型生物製剤複合体は、１つまたは複数の追加の治療用または予防用薬剤を含む。例示的な追加の治療用または予防用薬剤の例としては、抗炎症剤、化学療法剤、および抗感染症剤がある。
【0118】
ａ．抗炎症剤
一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗炎症剤を含む。抗炎症剤は炎症を減少させ、抗炎症剤としては、ステロイド薬および非ステロイド薬がある。
一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗炎症剤を含む。抗炎症剤は炎症を減少させ、抗炎症剤としては、ステロイド薬および非ステロイド薬がある。
【0119】
好ましい抗炎症薬は、Ｎ－アセチルシステインを含む抗酸化薬である。好ましい非ステロイド性抗炎症薬（「ＮＳＡＩＤＳ」）としては、メフェナム酸、アスピリン、ジフルニサル、サルサレート、イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、ディークケトプロフェン（Ｄｅａｃｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、エレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブ、フィロコキシブ、スルホンアニリド、ニメスリド、ニフルム酸、およびリコフェロンがある。
【0120】
代表的な小分子としては、メチルプレドニゾン、デキサメタゾンなどのステロイド、ＣＯＸ－２阻害剤を含む非ステロイド性抗炎症剤、コルチコステロイド性抗炎症剤、金化合物抗炎症剤、免疫抑制剤、抗炎症剤および抗血管新生剤、バルプロ酸、Ｄ－アミノホスホノバレレート（Ｄ－ａｍｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｏｖａｌｅｒａｔｅ）、Ｄ－アミノホスホノヘプタノエート（Ｄ－ａｍｉｎｏｐｈｏｓｐｈｏｎｏｈｅｐｔａｎｏａｔｅ）などの抗興奮毒性剤、バクロフェンなどのグルタメート形成／放出阻害剤、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、サリチレート抗炎症剤、ラニビズマブ、アフリベルセプトを含む抗ＶＥＧＦ剤、ならびにラパマイシンが挙げられる。他の抗炎症薬としては、非ステロイド薬、例えばインドメタシン、アスピリン、アセトアミノフェン、ジクロフェナクナトリウムおよびイブプロフェンが挙げられる。コルチコステロイドは、フルオシノロンアセトニドおよびメチルプレドニゾロンであってもよい。
【0121】
例示的な免疫モジュレート薬としては、シクロスポリン、タクロリムスおよびラパマイシンが挙げられる。一部の実施形態では、抗炎症剤は、Ｔ細胞などの１つまたは複数の免疫細胞型の作用をブロックするか、または腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－アルファ）、インターロイキン１７－Ａ、インターロイキン１２および２３などの免疫系におけるタンパク質をブロックする生物学的薬物である。
【0122】
一部の実施形態では、抗炎症薬は、合成または天然の抗炎症性低分子量タンパク質である。選択する免疫構成成分に対して特異的な抗体を、免疫抑制療法に加えることができる。一部の実施形態では、抗炎症薬は、抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリンまたは抗リンパ球グロブリン）、抗ＩＬ－２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブまたはダクリズマブ）、または抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）の断片である。
【0123】
多くの炎症性疾患は、リポ多糖（ＬＰＳ）に対する受容体であるトル様受容体４（ＴＬＲ４）を介し病理学的に上昇したシグナル伝達に連結している場合がある。したがって、潜在的な抗炎症剤としてのＴＬＲ４阻害剤の発見に大きな関心が寄せられている。近年では、阻害剤Ｅ５５６４に結合するＴＬＲ４の構造が解明され、Ｅ５５６４－結合ドメインを標的とする新規のＴＬＲ４阻害剤の設計および合成が可能になった。このことは、米国特許第８，８８９，１０１号に記載されている。Ｎｅａｌ， ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１３； ８（６）： ｅ６５７７９ｅによって報告されているように、小分子ライブラリの限定されたスクリーニングアプローチと組み合わせて使用する類似性探索アルゴリズムによって、Ｅ５５６４部位に結合し、ＴＬＲ４を阻害する化合物が同定されている。リード化合物のＣ３４、は、式Ｃ１７Ｈ２７ＮＯ９を有する２－アセトアミドピラノシド（ＭＷ３８９）であり、腸細胞およびマクロファージにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏでＴＬＲ４を阻害し、内毒素血症および壊死性腸炎のマウスモデルにおける全身性炎症を減少させる。したがって、一部の実施形態では、活性剤は、１つまたは複数のＴＬＲ４阻害剤である。好ましい実施形態では、活性剤は、Ｃ３４、およびこれらの誘導体、アナログである。
【0124】
好ましい実施形態において、１つまたは複数の抗炎症薬物は、哺乳動物対象に投与後、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、好ましくは少なくとも１週、２週、または３週、より好ましくは少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月間にわたりデンドリマーナノ粒子から炎症を阻害するのに有効な量で放出される。
【0125】
ｂ．化学療法剤
化学療法剤は一般的に、がん細胞におけるＤＮＡ合成または機能を干渉することによって作用する薬学的または治療的活性化合物を含む。細胞レベルでのその化学作用に基づいて、化学療法剤は、細胞周期特異的薬剤（細胞周期のある特定の期の間で有効）および細胞周期非特異的薬剤（細胞周期の全ての期で有効）に分類することができる。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、血管新生阻害剤、アロマターゼ阻害剤、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、抗腫瘍抗生物質、プラチナ薬物、トポイソメラーゼ阻害剤、放射性同位体、放射線増感剤、チェックポイント阻害剤、ＰＤ１阻害剤、植物アルカロイド、解糖阻害剤およびそれらのプロドラッグがある。
化学療法剤は一般的に、がん細胞におけるＤＮＡ合成または機能を干渉することによって作用する薬学的または治療的活性化合物を含む。細胞レベルでのその化学作用に基づいて、化学療法剤は、細胞周期特異的薬剤（細胞周期のある特定の期の間で有効）および細胞周期非特異的薬剤（細胞周期の全ての期で有効）に分類することができる。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、血管新生阻害剤、アロマターゼ阻害剤、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、抗腫瘍抗生物質、プラチナ薬物、トポイソメラーゼ阻害剤、放射性同位体、放射線増感剤、チェックポイント阻害剤、ＰＤ１阻害剤、植物アルカロイド、解糖阻害剤およびそれらのプロドラッグがある。
【0126】
ＰＤ－１阻害剤の例としては、例えば、ヒトＰＤ－１に特異的な遺伝子操作された完全ヒト免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）モノクローナル抗体であるＭＤＸ－１１０６、および米国ＦＤＡによって近年承認されたペンブロリズマブがある。断片は、デンドリマーにコンジュゲートしていてもよい。
【0127】
代表的な化学療法剤としては、これらに限定されるものではないが、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピポドフィロトキシン、エピルビシン、エトポシド、リン酸エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン（ｉｎｎｏｔｅｃａｎ）、ロイコボリン、リポソーム型ドキソルビシン、リポソーム型ダウノルビシン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テニポシド、テガフール－ウラシル、テモゾロマイド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソールおよびその誘導体、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、セツキシマブ、およびリツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）またはＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ならびにこれらの組合せが挙げられる。代表的なアポトーシス促進剤（ｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ａｇｅｎｔ）としては、これらに限定されるものではないが、フルダラビンタウロスポリン、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、ラクトシルセラミド、１５ｄ－ＰＧＪ（２）５、およびこれらの組合せがある。
【0128】
１つまたは複数の化学療法剤を含むデンドリマー複合体は、チェックポイントタンパク質、例えばＰＤ－１またはＣＴＬＡ－４を阻害する免疫療法、養子Ｔ細胞療法、および／またはがんワクチンより前に、またはそれらとともに使用してもよい。適応性Ｔ細胞がん療法に関するｉｎ ｖｉｔｒｏでＴ細胞をプライミングおよび活性化する方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｗａｎｇ， ｅｔ ａｌ， Ｂｌｏｏｄ， １０９（１１）：４８６５－４８７２ （２００７）およびＨｅｒｖａｓ－Ｓｔｕｂｂｓ， ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １８９（７）：３２９９－３１０ （２０１２）を参照のこと。がんワクチンの例としては、例えば、前立腺がんを処置するための樹状細胞ベースのワクチンであるＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標）（シプロイセル－Ｔ）が挙げられる（Ｌｅｄｆｏｒｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ５１９， １７－１８ （０５ Ｍａｒｃｈ ２０１５））。このようなワクチンならびに免疫療法のための他の組成物および方法は、Ｐａｌｕｃｋａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ， １２， ２６５－２７７ （Ａｐｒｉｌ ２０１２）で総説されている。
【0129】
一部の実施形態では、デンドリマー複合体は、例えばレット症候群を含む神経発達障害における脳のミクログリアの炎症を処置、イメージング、および／または予防するのに有効である。好ましい実施形態では、デンドリマー複合体は、抗炎症剤（Ｄ－ＮＡＣ）および抗興奮毒性剤およびＤ－抗グルタメート剤を送達するために使用されることになる。好ましい候補はＭＫ８０１、メマンチン、ケタミン、１－ＭＴである。
【0130】
ｃ．神経活性剤
いくつかの薬物が、ニューロンの損傷に向かうグルタメート興奮毒性カスケードを妨害するか、影響を与えるか、または一時的に停止させるための試みにおいて開発され使用されてきた。１つの戦略は、グルタメート放出を減少させるための「上流」の試みである。薬物のこのカテゴリーとしては、ナトリウムチャネルブロッカーであるリルゾール、ラモトリジン、およびリファリジン（ｌｉｆａｒｉｚｉｎｅ）がある。通常使用されるニモジピンは電位依存性チャネル（Ｌ型）ブロッカーである。共役型グルタメート受容体自体のさまざまな部位に影響を与える試みも行われてきた。これらの薬物の一部としては、フェルバメート、イフェンプロジル、マグネシウム、メマンチン、およびニトログリセリンがある。これらの「下流」薬物は、細胞内事象、例えば、フリーラジカル形成、一酸化窒素形成、タンパク質分解、エンドヌクレアーゼ活性、およびＩＣＥ様プロテアーゼ形成（プログラムされた細胞死またはアポトーシスを引き起こすプロセスにおける重要な構成成分）に影響を与えようと試みるものである。
いくつかの薬物が、ニューロンの損傷に向かうグルタメート興奮毒性カスケードを妨害するか、影響を与えるか、または一時的に停止させるための試みにおいて開発され使用されてきた。１つの戦略は、グルタメート放出を減少させるための「上流」の試みである。薬物のこのカテゴリーとしては、ナトリウムチャネルブロッカーであるリルゾール、ラモトリジン、およびリファリジン（ｌｉｆａｒｉｚｉｎｅ）がある。通常使用されるニモジピンは電位依存性チャネル（Ｌ型）ブロッカーである。共役型グルタメート受容体自体のさまざまな部位に影響を与える試みも行われてきた。これらの薬物の一部としては、フェルバメート、イフェンプロジル、マグネシウム、メマンチン、およびニトログリセリンがある。これらの「下流」薬物は、細胞内事象、例えば、フリーラジカル形成、一酸化窒素形成、タンパク質分解、エンドヌクレアーゼ活性、およびＩＣＥ様プロテアーゼ形成（プログラムされた細胞死またはアポトーシスを引き起こすプロセスにおける重要な構成成分）に影響を与えようと試みるものである。
【0131】
神経変性疾患を処置するための活性剤は当技術分野において周知であり、処置される症状および疾患に基づいて変更してもよい。例えば、パーキンソン病に関する従来の処置としては、レボドパ（通常ドパ脱炭酸酵素阻害剤またはＣＯＭＴ阻害剤と併用する）、ドーパミンアゴニスト、またはＭＡＯ－Ｂ阻害剤があり得る。
【0132】
ハンチントン病のための処置としては、異常な挙動および運動の減少を助けるためのドーパミンブロッカー、または運動を制御するための薬物、例えばアマンタジンおよびテトラベナジンなどがあり得る。舞踏病の減少を助ける他の薬物としては、神経弛緩薬およびベンゾジアゼピンがある。化合物、例えばアマンタジンまたはレマセミドは予備的な陽性結果を示している。運動機能低下および硬直は、特に若年性の場合、抗パーキンソン病薬物で処置される場合があり、ミオクロニー性運動亢進症はバルプロ酸で処置される場合がある。精神医学的な症状は、一般的な集団において使用されるものと類似している医薬で処置してもよい。選択的セロトニン再取り込み阻害剤およびミルタザピンは、抑うつのために推奨され、同時に非定型抗精神病薬物は精神病および行動障害に推奨されている。
【0133】
抗興奮毒のリルゾール（ＲＩＬＵＴＥＫ（登録商標））（２－アミノ－６－（トリフルオロメトキシ）ベンゾチアゾール）は、ＡＬＳを呈する対象における生存期間を改善させた。他の医薬は大部分は適用外使用であり、介入することによってＡＬＳに起因する症状を減少させることができる。一部の処置は生活の質を改善し、いくつかは寿命を延ばすと思われる。一般的なＡＬＳ関連療法は、Ｇｏｒｄｏｎ， Ａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， ４（５）：２９５－３１０ （２０１３）において概説されており、例えばその中の表１を参照されたい。いくつかの他の薬剤が１つまたは複数の臨床治験で試験を行われており、有効性は非有効なものから有望なものまでに及ぶ。例示的な薬剤は、Ｃａｒｌｅｓｉ， ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈｉｖｅｓ Ｉｔａｌｉｅｎｎｅｓ ｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ， １４９：１５１－１６７ （２０１１）において概説されている。例えば、治療法としては、興奮毒性を減少させる薬剤、例えばタランパネル（ｔａｌａｍｐａｎｅｌ）（８－メチル－７Ｈ－１，３－ジオキソロ（２，３）ベンゾジアゼピン）、セファロスポリン、例えばセフトリアキソン、またはメマンチン；酸化ストレスを減少させる薬剤、例えば補酵素Ｑ１０、マンガンポルフィリン（ｍａｎｇａｎｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、ＫＮＳ－７６０７０４［（６Ｒ）－４，５，６，７－テトラヒドロ－Ｎ６－プロピル－２，６－ベンゾチアゾール－ジアミン二塩酸塩、ＲＰＰＸ］、またはエダラボン（３－メチル－１－フェニル－２－ピラゾリン－５－オン、ＭＣＩ－１８６）；アポトーシスを減少させる薬剤、例えば、バルプロ酸を含むヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＴＣＨ３４６（ジベンゾ（ｂ，ｆ）オキセピン－１０－イルメチル－メチルプロパ－２－イニルアミン）、ミノサイクリン、またはタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）；神経炎症を減少させる薬剤、例えばサリドマイドおよびセラストール；向神経性薬剤、例えばインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）；ヒートショックタンパク質誘発物質、例えばアリモクロモール；またはオートファジー誘発物質、例えばラパマイシンまたはリチウムがあり得る。
【0134】
アルツハイマー病のための処置としては、例えば、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、例えば、タクリン、リバスチグミン、ガランタミンまたはドネペジル；ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、例えばメマンチン；または抗精神病薬物があり得る。
【0135】
レビー小体型認知症の処置として、例えば、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、例えば、タクリン、リバスチグミン、ガランタミンもしくはドネペジル；Ｎ－メチルｄ－アスパルテート受容体アンタゴニストメマンチン；ドーパミン系治療薬、例えば、レボドパもしくはセレギリン；抗精神病薬、例えば、オランザピンもしくはクロザピン；ＲＥＭ障害治療薬、例えば、クロナゼパム、メラトニン、もしくはクエチアピン；抗抑うつおよび抗不安治療薬、例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害剤（シタロプラム、エスシタロプラム、セルトラリン、パロキセチンなど）、またはセロトニンおよびノルアドレナリン再取り込み阻害剤（ベンラファクシン、ミルタザピン、およびブプロピオン）を挙げることができる（例えば、Ｍａｃｉｊａｕｓｋｉｅｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｄｉｃｉｎａ （Ｋａｕｎａｓ）， ４８（１）：１－８ （２０１２）を参照のこと）。
【0136】
例示的な神経保護剤も当技術分野において公知であり、例えば、グルタメートアンタゴニスト、抗酸化剤、およびＮＭＤＡ受容体刺激薬を含む。他の神経保護剤および処置としては、カスパーゼ阻害剤、栄養因子、抗タンパク質凝集剤、治療的低体温法、およびエリスロポエチンが挙げられる。
【0137】
神経機能不全を処置するための他の一般的な活性剤としては、運動症状を処置するためのアマンタジンおよび抗コリン作動薬、精神病を処置するためのクロザピン、認知症を処置するためのコリンエステラーゼ阻害剤、ならびに日中の眠気を処置するためのモダフィニルがある。
【0138】
ｄ．抗感染症剤
抗生物質としては、ベータラクタム、例えばペニシリンおよびアンピシリン、セファロスポリン、例えば、セフロキシム、セファクロル、セファレキシン、セファドロキシル（ｃｅｐｈｙｄｒｏｘｉｌ）、セフポドキシム（ｃｅｐｆｏｄｏｘｉｍｅ）およびプロキセチル、テトラサイクリン抗生物質、例えば、ドキシサイクリンおよびミノサイクリン、マクロライド抗生物質、例えば、アジスロマイシン、エリスロマイシン、ラパマイシンおよびクラリスロマイシン、フルオロキノロン、例えば、シプロフロキサシン、エンロフロキサシン、オフロキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシンおよびノルフロキサシン、トブラマイシン、コリスチン、またはアズトレオナム、ならびに抗炎症活性を有することが公知の抗生物質、例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシン、またはクラリスロマイシンがある。
抗生物質としては、ベータラクタム、例えばペニシリンおよびアンピシリン、セファロスポリン、例えば、セフロキシム、セファクロル、セファレキシン、セファドロキシル（ｃｅｐｈｙｄｒｏｘｉｌ）、セフポドキシム（ｃｅｐｆｏｄｏｘｉｍｅ）およびプロキセチル、テトラサイクリン抗生物質、例えば、ドキシサイクリンおよびミノサイクリン、マクロライド抗生物質、例えば、アジスロマイシン、エリスロマイシン、ラパマイシンおよびクラリスロマイシン、フルオロキノロン、例えば、シプロフロキサシン、エンロフロキサシン、オフロキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシンおよびノルフロキサシン、トブラマイシン、コリスチン、またはアズトレオナム、ならびに抗炎症活性を有することが公知の抗生物質、例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシン、またはクラリスロマイシンがある。
【0139】
２．診断剤
デンドリマーナノ粒子は投与された粒子の位置を決定するに有用な診断剤を含んでいてもよい。これらの薬剤は予防的にも使用することができる。例示的な診断材料としては、常磁性分子、蛍光性化合物、磁性分子、および放射性核種がある。好適な診断剤としては、これらに限定されるものではないが、Ｘ線画像化剤および造影剤がある。放射性核種は画像化剤としても使用してもよい。例示的な放射性標識としては、１４Ｃ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｌｎ、１５２Ｅｕ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、３２Ｐ、１８６Ｒｅ、３５Ｓ、７５Ｓｅ、１７５Ｙｂがある。他の好適な造影剤の例としては、放射線不透過性のガスまたはガス放出化合物がある。一部の実施形態では、デンドリマーナノ粒子中に取り込まれることになる画像化剤は、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、元素粒子（例えば、金粒子）である。
デンドリマーナノ粒子は投与された粒子の位置を決定するに有用な診断剤を含んでいてもよい。これらの薬剤は予防的にも使用することができる。例示的な診断材料としては、常磁性分子、蛍光性化合物、磁性分子、および放射性核種がある。好適な診断剤としては、これらに限定されるものではないが、Ｘ線画像化剤および造影剤がある。放射性核種は画像化剤としても使用してもよい。例示的な放射性標識としては、１４Ｃ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｌｎ、１５２Ｅｕ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、３２Ｐ、１８６Ｒｅ、３５Ｓ、７５Ｓｅ、１７５Ｙｂがある。他の好適な造影剤の例としては、放射線不透過性のガスまたはガス放出化合物がある。一部の実施形態では、デンドリマーナノ粒子中に取り込まれることになる画像化剤は、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、元素粒子（例えば、金粒子）である。
【0140】
さらなる実施形態では、単一のデンドリマー複合体組成物は、身体における１つまたは複数の位置で疾患または状態を同時に処置および／または診断することができる。
【0141】
ＩＩＩ．医薬製剤
１つまたは複数の低分子生物剤に共有結合でコンジュゲートされたデンドリマーを含む医薬組成物は、薬学的に使用することができる調製物への活性化合物の処理を促進する、賦形剤および助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して従来の様式で製剤化してもよい。
１つまたは複数の低分子生物剤に共有結合でコンジュゲートされたデンドリマーを含む医薬組成物は、薬学的に使用することができる調製物への活性化合物の処理を促進する、賦形剤および助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して従来の様式で製剤化してもよい。
【0142】
適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。好ましい実施形態では、組成物は非経口送達用に製剤化される。一部の実施形態では、組成物は、静脈内注射用に製剤化される。典型的には、組成物は、処置されることになる組織または細胞への注射用の無菌生理食塩水または緩衝溶液中で製剤化されることになる。組成物は、使用直前に再水和するための使い捨てバイアル中で凍結乾燥保存してもよい。再水和し、投与するための他の手段は当業者に公知である。
【0143】
医薬製剤は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、１つまたは複数の低分子生物剤に共有結合でコンジュゲートされた１つまたは複数のデンドリマーを含有する。代表的な賦形剤としては、溶媒、希釈剤、ｐＨ改変剤、保存剤、抗酸化剤、懸濁化剤、湿潤剤、粘度改変剤、等張化剤、安定化剤、およびこれらの組合せが挙げられる。好適な薬学的に許容される賦形剤は、好ましくは、安全であると一般的に認められている（ＧＲＡＳ）材料から選択され、不所望の生物学的副作用または望ましくない相互作用をもたらすことなく個体に投与することができる。
【0144】
一般的に、薬学的に許容される塩は、水中または有機溶媒中またはこの２つの混合物中で、薬剤の遊離酸または遊離塩基の形態と化学量論量の適切な塩基または酸との反応によって調製してもよく；一般的に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。薬学的に許容される塩としては、無機酸、有機酸由来の薬剤の塩、アルカリ金属塩、およびアルカリ土類金属塩、ならびに薬物と好適な有機リガンドとの反応によって形成された塩（例えば、第四級アンモニウム塩）が挙げられる。好適な塩のリストは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ２０ｔｈ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ， ２０００， ｐ． ７０４で見出される。薬学的に許容される塩の形態でときとして投与される眼科用薬物の例としては、マレイン酸チモロール、酒石酸ブリモニジン、およびジクロフェナクナトリウムが挙げられる。
【0145】
１つまたは複数の小型生物製剤に共有結合でコンジュゲートされたデンドリマーの組成物は、好ましくは、投与を容易にし、投薬量を均一にするための投薬単位形態に製剤化される。「投薬単位形態」という句は、処置されることになる患者に適切なコンジュゲートの物理的に個別の単位を指す。しかし、組成物の総単回投与は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることになることは理解されるであろう。治療有効用量は、細胞培養アッセイにおいてまたは動物モデル、通常はマウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタにおいて最初に推測してもよい。動物モデルを使用して、投与の望ましい濃度範囲および経路を達成してもよい。次に、このような情報は、ヒトにおける有用な用量および投与経路を決定するのに有用であるはずである。コンジュゲートの治療的有効性および毒性、例えば、ＥＤ５０（用量は、５０％の集団において治療的に有効である）およびＬＤ５０（用量は、５０％の集団に対して致死的である）は、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的手順によって決定してもよい。毒性の治療効果に対する用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として示され得る。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトに使用するためのさまざまな投薬量の製剤化において使用することができる。
【0146】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の小型生物製剤に共有結合でコンジュゲートされたデンドリマーの組成物は、例えば、処置されることになる部位に直接注射することによって局所的に投与される。一部の実施形態では、１つまたは複数の小型生物製剤に共有結合でコンジュゲートされたデンドリマーの組成物は、損傷、外科手術、または移植の部位のまたはその付近の血管組織上の血管系に注射されるか、局所的に適用されるか、または他の方法で直接投与される。例えば、実施形態において、１つまたは複数の小型生物製剤に共有結合でコンジュゲートされたデンドリマーの組成物は、外科手術中に露出された血管組織に局所的に適用される。典型的には、局所投与は、組成物の局所的な濃度の増加をもたらし、これは全身投与によって達成することができるものよりも高い。
【0147】
非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）および経腸投与経路用に製剤化された医薬組成物を記載する。
【0148】
Ａ．非経口投与
一部の実施形態では、１つまたは複数の小分子生物製剤と共有結合によりコンジュゲートしているデンドリマー組成物は非経口で投与される。
一部の実施形態では、１つまたは複数の小分子生物製剤と共有結合によりコンジュゲートしているデンドリマー組成物は非経口で投与される。
【0149】
「非経口投与」および「非経口的に投与される」という句は、当技術分野において認識されている用語であり、注射などの経腸および局所投与以外の投与様式を含み、これらに限定されないが、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、胸膜内、血管内、心膜内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内（ｉｎｔｒａｄｅｎｎａｌ）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、経気管、皮下（ｓ．ｃ．）、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内および胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）注射および注入が挙げられる。デンドリマーは、硬膜下、静脈内、髄腔内、脳室内、動脈内、羊膜内、腹腔内、または皮下経路によって非経口で投与することができる。
【0150】
液体製剤に関しては、薬学的に許容される担体は、例えば、水性もしくは非水性溶液、懸濁液、エマルションまたは油であってもよい。非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内注射用）としては、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲルおよび固定油がある。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、例えば、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、シクロデキストリン、エマルションまたは懸濁液が挙げられる。デンドリマーは、エマルション、例えば油中水型としても投与することができる。油の例は、石油、動物、植物、または合成起源、例えば、落花生油、ダイズ油、鉱物油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ、ペトロラタム、および鉱物のものである。非経口製剤として使用するのに好適な脂肪酸としては、例えば、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、好適な脂肪酸エステルの例である。
【0151】
非経口投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、ならびに目的のレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含んでいてもよい水性および非水性滅菌懸濁液を含んでいてもよい。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補給液、電解質補給液、例えばリンゲルデキストロースベースのものを含んでいてもよい。一般的に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、ならびにグリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールは、特に注射用溶液に好ましい液体担体である。
【0152】
注射可能な組成物のための注射可能な医薬品担体は、当業者であれば周知である（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｊ．Ｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ， Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ， ｅｄｓ．， ｐａｇｅｓ ２３８－２５０ （１９８２）、およびＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ， Ｔｒｉｓｓｅｌ， １５ｔｈ ｅｄ．， ｐａｇｅｓ ６２２－６３０ （２００９）を参照のこと）。
【0153】
Ｂ．経腸投与
一部の実施形態では、１つまたは複数の小型生物製剤に共有結合でコンジュゲートされたデンドリマーの組成物は、経腸で投与される。担体または希釈剤は、固体製剤用のカプセル剤または錠剤などの固体担体もしくは希釈剤、液体製剤用の液体担体もしくは希釈剤、またはこれらの混合物であってもよい。
一部の実施形態では、１つまたは複数の小型生物製剤に共有結合でコンジュゲートされたデンドリマーの組成物は、経腸で投与される。担体または希釈剤は、固体製剤用のカプセル剤または錠剤などの固体担体もしくは希釈剤、液体製剤用の液体担体もしくは希釈剤、またはこれらの混合物であってもよい。
【0154】
液体製剤に関しては、薬学的に許容される担体は、例えば、水性もしくは非水性溶液、懸濁液、エマルションまたは油であってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、例えば、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、シクロデキストリン、エマルションまたは懸濁液がある。
【0155】
油の例は、石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、落花生油、ダイズ油、鉱物油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ、ペトロラタム、および鉱物である。非経口製剤として使用するのに好適な脂肪酸としては、例えば、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、好適な脂肪酸エステルの例である。
【0156】
ビヒクルとしては、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲルおよび固定油が挙げられる。製剤は、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および目的のレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有していてもよい水性および非水性等張滅菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含んでいてもよい水性および非水性滅菌懸濁液を含む。ビヒクルは、例えば、液体栄養補給液、電解質補給液、例えばリンゲルデキストロースベースのものを含んでいてもよい。一般的に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液は、好ましい液体担体である。これらはまた、タンパク質、脂質、糖および人工栄養乳の他の構成成分とともに製剤化される場合もある。
【0157】
好ましい実施形態では、１つまたは複数の小型生物製剤に共有結合でコンジュゲートされたデンドリマーの組成物は、経口投与用に製剤化される。経口製剤は、チューインガム、ゲルストリップ（ｇｅｌ ｓｔｒｉｐｓ）、錠剤、カプセル剤またはトローチ剤、および粒子の形態であってもよい。腸溶性コーティング経口製剤を調製するためのカプセル化物質としては、酢酸フタル酸セルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびメタクリル酸エステルコポリマーが挙げられる。固体経口製剤、例えばカプセル剤または錠剤が好ましい。エリキシル剤およびシロップ剤も周知の経口製剤である。
【0158】
ＩＶ．デンドリマーおよびその核酸コンジュゲートを作製する方法
Ａ．デンドリマーを作製する方法
デンドリマーは、さまざまな化学反応ステップを介して調製してもよい。デンドリマーは、構築の全ての段階においてその構造を制御することを可能にする方法に従って通常合成される。樹状構造は、発散的なまたは収束的な２つの主要な異なるアプローチによって大部分が合成される。
Ａ．デンドリマーを作製する方法
デンドリマーは、さまざまな化学反応ステップを介して調製してもよい。デンドリマーは、構築の全ての段階においてその構造を制御することを可能にする方法に従って通常合成される。樹状構造は、発散的なまたは収束的な２つの主要な異なるアプローチによって大部分が合成される。
【0159】
一部の実施形態では、デンドリマーは発散的な方法を使用して調製され、そこではデンドリマーが多官能性コアから組み立てられ、それが一連の反応、通常はマイケル反応によって外側へ延長される。戦略は、反応性基および保護基を有するモノマー分子と多官能性コア部分とのカップリングを伴い、これがコア周囲への世代の段階的な付加につながり、続いて保護基が除去される。例えば、ＰＡＭＡＭ－ＮＨ２デンドリマーは、Ｎ－（２－アミノエチル）アクリルアミドモノマーをアンモニアコアへカップリングさせることによって最初に合成される。
【0160】
他の実施形態では、デンドリマーは、収束的な方法を使用して調製され、そこではデンドリマーが、最終的に球の表面に位置する小分子から構築され、反応は内側に進行し、内側に構築し、最終的にはコアに結合させる。
【0161】
デンドリマーを調製するための多くの他の合成経路、例えば、直交性アプローチ、加速アプローチ、２段階の収束的な方法もしくはハイパーコアアプローチ、ハイパーモノマー方法もしくは分岐モノマーアプローチ、二重指数法；直交性カップリング法または２ステップアプローチ、２モノマーアプローチ、ＡＢ２－ＣＤ２アプローチが存在する。
【0162】
一部の実施形態では、デンドリマーのコア、１つもしくは複数の分岐単位、１つもしくは複数のリンカー／スペーサー、および／または１つもしくは複数の表面基は、１つまたは複数の銅アシスト（Ｃｏｐｐｅｒ－Ａｓｓｉｓｔｅｄ）アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）、ディールスアルダー反応、チオール－エンおよびチオール－イン反応、ならびにアジド－アルキン反応を用いたクリックケミストリーを介してさらなる官能基（分岐単位、リンカー／スペーサー、表面基など）、モノマー、および／または薬剤にコンジュゲートするのを可能にするために修飾してもよい（Ａｒｓｅｎｅａｕｌｔ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． ２０１５ Ｍａｙ ２０；２０（５）：９２６３－９４）。一部の実施形態では、既製のデンドロンを高密度ヒドロキシルポリマーにクリックする。「クリックケミストリー」は、例えば、第１の部分の表面のアルキン部分（またはそれと同等のもの）と、第２の部分上のアジド部分（例えば、トリアジン組成物もしくはそれと同等のもの上に存在する、または任意の活性末端基、例えば、第一級アミン末端基、ヒドロキシル末端基、カルボン酸末端基、チオール末端基など）との間の１，３－双極環化付加反応を介した２つの異なる部分（例えば、コア基および分岐単位；または分岐単位および表面基）のカップリングを伴う。
【0163】
一部の実施形態では、デンドリマー合成は、１つまたは複数の反応、例えばチオール－エンクリック反応、チオール－インクリック反応、ＣｕＡＡＣ、ディールス－アルダークリック反応、アジド－アルキンクリック反応、マイケル付加、エポキシ開環、エステル化、シラン化学、およびこれらの組合せに対して応答する。
【0164】
任意の現存する樹状プラットフォームは、高ヒドロキシル含有部分、例えば、１－チオ－グリセロールまたはペンタエリスリトールをコンジュゲートさせることによって、所望の官能性の、すなわち、高密度の表面ヒドロキシル基を有するデンドリマーを作製するために使用してもよい。例示的な樹状プラットフォーム、例えば、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）、ポリ－Ｌ－リシン、メラミン、ポリ（エーテルヒドロキシルアミン）（ＰＥＨＡＭ）、ポリ（エステルアミン）（ＰＥＡ）およびポリグリセロールを合成し、研究してもよい。
【0165】
デンドリマーはまた、２つまたはそれを超えるデンドロンを組み合わせることによって調製してもよい。デンドロンは、反応性焦点官能基を有する、デンドリマーのくさび形セクションである。多くのデンドロン足場は市販されている。それらは、２、４、８、１６、３２、および６４個の反応性基をそれぞれ有する、第１、２、３、４、５、および６世代として販売されている。ある特定の実施形態では、１つのタイプの薬剤が１つのタイプのデンドロンに連結され、異なるタイプの薬剤が別のタイプのデンドロンに連結される。次いで、２つのデンドロンが接続されてデンドリマーが形成される。２つのデンドロンは、クリックケミストリー、すなわち、一方のデンドロン上のアジド部分ともう一方のデンドロン上のアルキン部分との間の１，３－双極環化付加反応を介して連結させて、トリアゾールリンカーを形成してもよい。
【0166】
デンドリマーを作製する例示的な方法は、国際特許出願ＷＯ２００９／０４６４４６、ＷＯ２０１５１６８３４７、ＷＯ２０１６０２５７４５、ＷＯ２０１６０２５７４１、ＷＯ２０１９０９４９５２、および米国特許第８，８８９，１０１号に詳述されている。
【0167】
Ｂ．デンドリマー複合体
デンドリマー複合体は、デンドリマー、樹状ポリマーまたはハイパーブランチポリマーにコンジュゲートしている治療的、予防的または診断的小分子生物製剤、例えば機能性核酸から形成されていてもよい。デンドリマーへの１つまたは複数の薬剤のコンジュゲーションは、当技術分野において公知であり、米国特許出願公開ＵＳ２０１１／００３４４２２号、ＵＳ２０１２／０００３１５５号、およびＵＳ２０１３／０１３６６９７号に詳細に記載されている。
デンドリマー複合体は、デンドリマー、樹状ポリマーまたはハイパーブランチポリマーにコンジュゲートしている治療的、予防的または診断的小分子生物製剤、例えば機能性核酸から形成されていてもよい。デンドリマーへの１つまたは複数の薬剤のコンジュゲーションは、当技術分野において公知であり、米国特許出願公開ＵＳ２０１１／００３４４２２号、ＵＳ２０１２／０００３１５５号、およびＵＳ２０１３／０１３６６９７号に詳細に記載されている。
【0168】
一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、デンドリマーに共有結合されている。一部の実施形態では、薬剤は、ｉｎ ｖｉｖｏで切断するように設計された連結部分を介してデンドリマーに結合される。連結部分は、加水分解的に、酵素的に、またはこれらの組合せで切断するように設計してもよく、その結果、薬剤のｉｎ ｖｉｖｏでの持続放出が提供される。連結部分の組成と薬剤へのその結合点の両方は、連結部分の切断が活性剤またはその好適なプロドラッグのいずれかを放出するように選択される。連結部分の組成はまた、薬剤の所望の放出速度を考慮して選択してもよい。
【0169】
一部の実施形態では、結合は、ジスルフィド、エステル、エーテル、チオエステル、カルバメート、カルボネート、ヒドラジン、またはアミド結合のうちの１つまたは複数を介して生じる。好ましい実施形態では、結合は、薬剤の所望の放出動態に応じて、薬剤とデンドリマーとの間にエステル結合またはアミド結合を提供する適切なスペーサーを介して生じる。一部の場合では、エステル結合は、薬物の放出可能な形態のために導入される。他の場合では、アミド結合は、薬剤の放出不能な形態のために導入される。
【0170】
連結部分は、一般的に１つまたは複数の有機官能基を含む。好適な有機官能基の例としては、第二級アミド（－ＣＯＮＨ－）、第三級アミド（－ＣＯＮＲ－）、スルホンアミド（－Ｓ（Ｏ）２－ＮＲ－）、第二級カルバメート（－ＯＣＯＮＨ－；－ＮＨＣＯＯ－）、第三級カルバメート（－ＯＣＯＮＲ－；－ＮＲＣＯＯ－）、カルボネート（－Ｏ－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－）、尿素（－ＮＨＣＯＮＨ－；－ＮＲＣＯＮＨ－；－ＮＨＣＯＮＲ－、－ＮＲＣＯＮＲ－）、カルビノール（－ＣＨＯＨ－、－ＣＲＯＨ－）、ジスルフィド基、ヒドラゾン、ヒドラジド、エーテル（－Ｏ－）、およびエステル（－ＣＯＯ－、－ＣＨ２Ｏ２Ｃ－、ＣＨＲＯ２Ｃ－）が挙げられ、ここで、Ｒは、アルキル基、アリール基、または複素環式基である。一般的に、連結部分内の１つまたは複数の有機官能基のアイデンティティーは、薬剤の所望の放出速度を考慮して選択される。さらに、１つまたは複数の有機官能基は、薬剤のデンドリマーへの共有結合を促進するように選択してもよい。
【0171】
ある特定の実施形態では、連結部分は、スペーサー基と組み合わせて、上述の有機官能基のうちの１つまたは複数を含む。スペーサー基は、オリゴマーおよびポリマー鎖を含む原子の任意のアセンブリーから構成されていてもよいが、スペーサー基における原子の合計数は、好ましくは３から２００原子の間、より好ましくは３から１５０原子の間、より好ましくは３から１００原子の間、最も好ましくは３から５０原子の間である。好適なスペーサー基の例としては、アルキル基、ヘテロアルキル基、アルキルアリール基、オリゴ－およびポリエチレングリコール鎖、ならびにオリゴ－およびポリ（アミノ酸）鎖が挙げられる。スペーサー基の変形形態によって、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬剤の放出はさらに制御される。連結部分がスペーサー基を含む実施形態では、１つまたは複数の有機官能基は、スペーサー基を核酸とデンドリマーの両方に接続するために一般的に使用することになる。
【0172】
好ましい実施形態では、結合は、薬剤とデンドリマーとの間にジスルフィド架橋を提供する適切なスペーサーを介して生じる場合がある。デンドリマー複合体は、身体において認められる還元条件下、チオール交換反応によってｉｎ ｖｉｖｏで薬剤の迅速な放出が可能である。例えば、スペーサーは、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンおよびカルボネート基が末端である化合物のクラスから選択され得る。スペーサーとしては、チオピリジン末端化合物、例えばジチオジピリジン、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド）ヘキサノエート ＬＣ－ＳＰＤＰまたはスルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰがあり得る。
【0173】
一部の実施形態では、センスストランドまたはパッセンジャーストランドの５’および３’末端ならびにアンチセンスストランドの３’末端は、修飾を用いるコンジュゲーションのための潜在的な部位である。センスストランドまたはパッセンジャーストランドの好ましい実施形態において、５’および／または３’末端はデンドリマーへのコンジュゲーションのために機能化されている。一部の実施形態では、デンドリマーのヒドロキシル表面基はＳＰＤＰで機能化されており、必要に応じて核酸のコンジュゲーションのためにＰＥＧリンカーで機能化されている。
【0174】
一部の実施形態では、ジスルフィドチオール改変剤は、図２で示すようなセンス５’チオール（－ＳＨ）連結を導入するために使用される。さらなる実施形態では、ジチオール修飾核酸をジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処置してジスルフィド結合を定量的に還元し、デンドリマーとのさらなるコンジュゲーションのためのスルフヒドリル基をもたらす。他の実施形態では、次いでセンス５’末端（例えば、ｓｉＧＦＰ）におけるスルフヒドリル基をＳＰＤＰで機能化されたデンドリマーと反応させて、必要に応じてＰＥＧリンカー（例えば、デンドリマー－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ）と反応させて、スルフヒドリル交換反応を介してデンドリマーとアンチセンス分子とのコンジュゲートを形成している。
【0175】
薬剤をデンドリマーに共有結合により付加するのに有用である反応および戦略は、当技術分野において公知である。例えば、Ｍａｒｃｈ， “Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，” ５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１， Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）およびＨｅｒｍａｎｓｏｎ， “Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，” １９９６， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｕ．Ｓ．Ａを参照されたい。所与の薬剤の共有結合的な付加に適切な方法は、所望の連結部分ならびに薬剤およびデンドリマーの構造を考慮して選択してもよく、総じて官能基の適合性、保護基の戦略、および不安定な結合の存在に関連する。
【0176】
一部の実施形態では、機能性核酸のデンドリマーへの共有結合はクリック化学を介して生じる。好ましい実施形態において、機能性核酸のデンドリマーへの共有結合は、１，２，４，５－テトラジン（Ｔｚ）とトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）との間の逆電子要求性ディールスアルダー（ＩＥＤＤＡ）反応開始ライゲーションを介している。一実施形態では、アンチセンス分子は末端テトラジン（Ｔｚ）で機能化されており、同時にヒドロキシル末端デンドリマーは、例えば、図１および２で示すようにクリック反応のためにトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）で機能化されている。
【0177】
最適な薬物担持は、薬物の選択、デンドリマーの構造およびサイズ、ならびに処置されることになる組織を含む多くの因子に必然的に依存することになる。一部の実施形態では、１つまたは複数の薬剤は、約０．０１重量％から約４５重量％、好ましくは約０．１重量％から約３０重量％、約０．１重量％から約２０重量％、約０．１重量％から約１０重量％、約１重量％から約１０重量％、約１重量％から約５重量％、約３重量％から約２０重量％、および約３重量％から約１０重量％の濃度で、デンドリマーにカプセル化、会合、および／またはコンジュゲートされている。しかし、任意の所与の薬物、デンドリマー、および標的部位に最適な薬物担持は、記載済みのものなどの常用の方法によって同定することができる。
【0178】
一部の実施形態では、薬剤および／またはリンカーのコンジュゲートは、１つまたは複数の表面および／または内部基を介して生じる。したがって、一部の実施形態では、薬剤／リンカーのコンジュゲートは、コンジュゲート前のデンドリマーの利用可能な全ての表面官能基、好ましくは、ヒドロキシル基の約１％、２％、３％、４％、または５％を介して生じる。他の実施形態では、薬剤／リンカーのコンジュゲートは、コンジュゲートの前のデンドリマーの利用可能な全ての表面官能基の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満で生じる。好ましい実施形態では、デンドリマー複合体は、具体的な細胞の種類を標的とするための有効量の表面官能基を保持し、同時に疾患または障害を処置、予防および／またはイメージングするのに有効量の薬剤にコンジュゲートする。
【0179】
Ｖ．使用法
デンドリマー複合体組成物を使用する方法も記載する。好ましい実施形態において、デンドリマー複合体は障害または損傷を受けたＢＢＢを通過し、活性化されたミクログリアおよびアストロサイトを標的とする。
デンドリマー複合体組成物を使用する方法も記載する。好ましい実施形態において、デンドリマー複合体は障害または損傷を受けたＢＢＢを通過し、活性化されたミクログリアおよびアストロサイトを標的とする。
【0180】
Ａ．処置法
１つまたは複数の小分子生物製剤と共有結合によりコンジュゲートしているデンドリマーの組成物およびその製剤は、感染症、炎症、またはがん、神経系、特にＣＮＳにまで及ぶ全身性炎症を有する特定のものと関連する障害を処置するために投与してもよい。組成物は、胃腸障害、増殖性疾患を含む他の疾患、障害および損傷を処置するため、ならびに神経が疾患または障害において役割を果たす他の組織を処置するためにも使用してもよい。組成物および方法は、予防的使用にも好適である。
１つまたは複数の小分子生物製剤と共有結合によりコンジュゲートしているデンドリマーの組成物およびその製剤は、感染症、炎症、またはがん、神経系、特にＣＮＳにまで及ぶ全身性炎症を有する特定のものと関連する障害を処置するために投与してもよい。組成物は、胃腸障害、増殖性疾患を含む他の疾患、障害および損傷を処置するため、ならびに神経が疾患または障害において役割を果たす他の組織を処置するためにも使用してもよい。組成物および方法は、予防的使用にも好適である。
【0181】
方法は、それを必要とする対象におけるそれを必要とする部位で、炎症性サイトカインおよび／または増殖因子を減弱させるのに有効な量で１つまたは複数のデンドリマー－機能性核酸複合体を全身投与する。典型的には、必要に応じて１つまたは複数の追加の治療的、予防的、および／または診断的活性剤を含む、１つまたは複数の小分子生物製剤と共有結合によりコンジュゲートしているデンドリマーのデンドリマー複合体の有効量がそれを必要とする個体に投与される。デンドリマーは標的化剤も含んでいてもよいが、実施例によって実証されているように、これらは脊髄および脳における損傷した組織の部位に存在するものを含む活性化マクロファージへの送達に必要であるわけではない。
【0182】
好ましい実施形態では、デンドリマー複合体は、ｉｎ ｖｉｖｏで認められる還元条件下で、薬物を細胞内に優先的に放出することができるデンドリマーに付加またはコンジュゲートされている薬剤を含む。薬剤は、共有結合により結合されている。対象に投与する１つまたは複数の小型生物製剤に共有結合でコンジュゲートされたデンドリマーの量は、対照、例えばデンドリマーを有さない活性剤で処置された対象と比較して、処置されることになる疾患または障害の１つまたは複数の臨床的または分子的症状を減少、予防、そうでなければ緩和するような有効量を送達するように選択する。
【0183】
Ｂ．処置される状態
１つまたは複数の小分子生物製剤と共有結合によりコンジュゲートしているデンドリマーの組成物は、眼、脳、および神経系における１つまたは複数の疾患、状態、および損傷（特に、ミクログリアおよびアストロサイトの病理学的活性化と関連するもの）を処置するのに好適である。組成物はまた、消化管障害、がんを含む他の疾患、障害および損傷を処置するために、ならびに疾患または障害において神経が役割を果たしている他の組織を処置するために使用してもよい。組成物および方法はまた予防的使用に好適である。
１つまたは複数の小分子生物製剤と共有結合によりコンジュゲートしているデンドリマーの組成物は、眼、脳、および神経系における１つまたは複数の疾患、状態、および損傷（特に、ミクログリアおよびアストロサイトの病理学的活性化と関連するもの）を処置するのに好適である。組成物はまた、消化管障害、がんを含む他の疾患、障害および損傷を処置するために、ならびに疾患または障害において神経が役割を果たしている他の組織を処置するために使用してもよい。組成物および方法はまた予防的使用に好適である。
【0184】
デンドリマー複合体組成物は、好ましくは直径が１５ｎｍを下回っており、ヒドロキシル基の表面密度が少なくとも３ＯＨ基／ｎｍ２であり、好ましくは直径が１０ｎｍを下回っており、ヒドロキシル基の表面密度が少なくとも４ＯＨ基／ｎｍ２であり、より好ましくは直径が５ｎｍを下回っており、ヒドロキシル基の表面密度が少なくとも５ＯＨ基／ｎｍ２であり、最も好ましくは直径が１～２ｎｍの間であり、ヒドロキシル基の表面密度が少なくとも４ＯＨ基／ｎｍ２であり、神経発達疾患、神経変性疾患、壊死性腸炎、および脳がんを含む多くの障害および状態の病因において重要な役割を果たすミクログリアおよびアストロサイトを選択的に標的とする治療剤、予防剤、または診断剤を送達する。したがって、デンドリマー複合体は、ミクログリアおよびアストロサイトの病理学的状態と関連する状態を処置または緩和するのに有効な投薬量単位量で投与される。一般的に、これらの細胞を標的とすることによって、デンドリマーは神経炎症を処置するための薬剤を特異的に送達する。
【0185】
ミクログリア
ミクログリアは、脳および脊髄全体にわたって存在するある種の神経膠細胞（グリア細胞）である。ミクログリアは、脳内に認められる全細胞の１０～１５％を占めている。常在マクロファージ細胞として、これらは中枢神経系（ＣＮＳ）における活性免疫防御の第１の主要な形態として作用する。ミクログリアは、ＣＮＳ損傷後に重要な役割を果たし、傷害のタイミングおよびタイプに基づいて防御効果と有害効果の両方を有する場合がある（Ｋｒｅｕｔｚｂｅｒｇ， Ｇ． Ｗ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９， ３１２ （１９９６）；Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２８９， ５３ （２０００）；Ｐｏｌａｚｚｉ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｉａ， ３６， ２７１ （２００１）；Ｍａｌｌａｒｄ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ７５， ２３４ （２０１４）；Ｆａｕｓｔｉｎｏ， Ｊ． Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ： Ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， ３１， １２９９２ （２０１１）；Ｔａｂａｓ， Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３９， １６６ （２０１３）；およびＡｇｕｚｚｉ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３９， １５６ （２０１３））。ミクログリアの機能における変化は、正常なニューロン発達およびシナプス刈込みにも影響を与える（Ｌａｗｓｏｎ， Ｌ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， ３９， １５１ （１９９０）；Ｇｉｕｌｉａｎ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ： Ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， １３， ２９ （１９９３）；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ｔ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ： Ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， １８， ７０４７ （１９９８）；Ｚｉｅｔｌｏｗ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， １１， １６５７ （１９９９）；およびＰａｏｌｉｃｅｌｌｉ， Ｒ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３３， １４５６ （２０１１））。ミクログリアは、枝状構造からアメーバ状構造へ形態が顕著に変化し、損傷後に増殖する。結果として生じた神経炎症が損傷部位で血液脳関門を破壊し、急性および慢性のニューロン細胞死および希突起膠細胞死をもたらす。したがって、炎症促進性のミクログリアを標的とすることは、強力で有効な治療戦略のはずである。神経炎症性疾患において損傷したＢＢＢは、薬物担持ナノ粒子を脳に輸送するために利用することができる。
ミクログリアは、脳および脊髄全体にわたって存在するある種の神経膠細胞（グリア細胞）である。ミクログリアは、脳内に認められる全細胞の１０～１５％を占めている。常在マクロファージ細胞として、これらは中枢神経系（ＣＮＳ）における活性免疫防御の第１の主要な形態として作用する。ミクログリアは、ＣＮＳ損傷後に重要な役割を果たし、傷害のタイミングおよびタイプに基づいて防御効果と有害効果の両方を有する場合がある（Ｋｒｅｕｔｚｂｅｒｇ， Ｇ． Ｗ． Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９， ３１２ （１９９６）；Ｗａｔａｎａｂｅ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２８９， ５３ （２０００）；Ｐｏｌａｚｚｉ， Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， Ｇｌｉａ， ３６， ２７１ （２００１）；Ｍａｌｌａｒｄ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ７５， ２３４ （２０１４）；Ｆａｕｓｔｉｎｏ， Ｊ． Ｖ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ： Ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， ３１， １２９９２ （２０１１）；Ｔａｂａｓ， Ｉ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３９， １６６ （２０１３）；およびＡｇｕｚｚｉ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３９， １５６ （２０１３））。ミクログリアの機能における変化は、正常なニューロン発達およびシナプス刈込みにも影響を与える（Ｌａｗｓｏｎ， Ｌ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， ３９， １５１ （１９９０）；Ｇｉｕｌｉａｎ， Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ： Ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， １３， ２９ （１９９３）；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ， Ｔ． Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ： Ｔｈｅ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， １８， ７０４７ （１９９８）；Ｚｉｅｔｌｏｗ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， １１， １６５７ （１９９９）；およびＰａｏｌｉｃｅｌｌｉ， Ｒ． Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３３， １４５６ （２０１１））。ミクログリアは、枝状構造からアメーバ状構造へ形態が顕著に変化し、損傷後に増殖する。結果として生じた神経炎症が損傷部位で血液脳関門を破壊し、急性および慢性のニューロン細胞死および希突起膠細胞死をもたらす。したがって、炎症促進性のミクログリアを標的とすることは、強力で有効な治療戦略のはずである。神経炎症性疾患において損傷したＢＢＢは、薬物担持ナノ粒子を脳に輸送するために利用することができる。
【0186】
好ましい実施形態では、デンドリマーは、関連する毒性を一切伴わずに、ミクログリア介在性病理を処置することを必要とする対象におけるミクログリア介在性病理を処置するために有効な量で投与される。
【0187】
一部の実施形態では、処置されることになる対象はヒトである。一部の実施形態では、処置されることになる対象は小児または乳児である。全ての方法は、処置を必要とする対象、または記載される組成物の投与から利益を得るであろう対象を識別し、選択するステップを含んでいてもよい。
【0188】
１．眼疾患および障害
組成物および方法は、眼と関連する疾患および障害の処置に好適である。
組成物および方法は、眼と関連する疾患および障害の処置に好適である。
【0189】
処置することができる眼障害の例としては、アメーバ性角膜炎、真菌性角膜炎、細菌性角膜炎、ウイルス性角膜炎、オンコルセルカ角膜炎、細菌性角結膜炎、ウイルス性角結膜炎、角膜ジストロフィー疾患、フックス角膜内皮ジストロフィー、マイボーム腺機能不全、前方および後方眼瞼炎、結膜充血、結膜壊死、瘢痕性瘢痕および線維症、点状上皮角膜症、糸状角膜炎、角膜びらん、菲薄化、潰瘍化および穿孔、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、自己免疫性ドライアイ疾患、環境性ドライアイ疾患、角膜の血管新生疾患、角膜移植後の拒絶反応の予防および処置、自己免疫ブドウ膜炎、感染性ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎（トキソプラズマ症を含む）、汎ブドウ膜炎、硝子体または網膜の炎症性疾患、眼内炎の予防および処置、黄斑浮腫、黄斑変性症、加齢黄斑変性症、増殖性および非増殖性糖尿病性網膜症、高血圧性網膜症、網膜の自己免疫疾患、原発性および転移性眼内黒色腫、他の眼内転移性腫瘍、開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、色素性緑内障ならびにそれらの組合せがある。他の障害としては、角膜の損傷、熱傷、または擦過傷、白内障、およびそれらに関連する眼または視力の加齢変性がある。
【0190】
好ましい実施形態において、処置される眼障害は脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）と関連する。ＣＮＶと関連する例示的な眼障害としては黄斑変性症がある。したがって一部の実施形態では、方法は、対象における黄斑変性症を処置または予防するためにデンドリマーにコンジュゲートされた機能性核酸を送達する。一部の実施形態では、方法は加齢関連（ＡＭＤ）を処置または予防する。
【0191】
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は黄斑の神経変性神経炎症性疾患であり、これは中心視力損失の原因である。加齢黄斑変性症の病因は、脈絡膜（網膜の下の血管層）、網膜の色素上皮（ＲＰＥ）、神経感覚網膜（ｎｅｕｒｏｓｅｎｓｏｒｙ ｒｅｔｉｎａ）下の細胞層、ブルッフ膜および神経感覚網膜自体における慢性神経炎症に関与する。
【0192】
一部の実施形態では、方法は、血管新生および血管完全性の抑制に特異的な機能性核酸に共有結合によりコンジュゲートしているＯＨ末端デンドリマーを投与して、それを必要とする対象におけるＣＮＶを処置または予防する。典型的には、方法は、炎症部位においてＣＮＶを選択的に約１０％～９０％、例えば、１０％から３０％の間抑制する。典型的には、方法は、それを必要とする対象におけるそれを必要とする部位においてＶＥＧＦ産生を減弱させるのに有効な量で１つまたは複数のデンドリマー－機能性核酸複合体を全身投与する。例えば一部の実施形態では、方法は、それを必要とする部位においてＶＥＧＦ産生を約１０％から約９０％の間、例えば、１５％から５０％の間、２０％から３０％の間、または２５％減少させる。特定の実施形態では、方法は、眼におけるＣＮＶと関連する黄斑変性症を有するかまたは有するリスクのある対象の眼内で、ＶＥＧＦレベルを約２５％減少させる。
【0193】
２．がん
一部の実施形態では、デンドリマー組成物ならびにその製剤は、それを必要とする対象におけるがんを処置するための方法において使用される。がんを処置することを必要とする対象におけるがんを処置するための方法であって、治療有効量のデンドリマー組成物を対象に投与することを含む方法。
一部の実施形態では、デンドリマー組成物ならびにその製剤は、それを必要とする対象におけるがんを処置するための方法において使用される。がんを処置することを必要とする対象におけるがんを処置するための方法であって、治療有効量のデンドリマー組成物を対象に投与することを含む方法。
【0194】
患者におけるがんとは、がんをもたらす細胞の典型的な特性、例えば、制御されない増殖、特化した機能の損失、不死性、顕著な転移能、抗アポトーシス活性における顕著な増加、急速な成長および増殖速度、ならびにある特定の特徴的な形態および細胞マーカーを有する細胞の存在を指す。一部の環境では、がん細胞は腫瘍の形態であることになり；このような細胞は、動物体内に局所的に存在する場合もあり、独立した細胞、例えば白血病細胞として血流内を循環する場合もある。腫瘍とは、悪性か良性かにかかわらず、全ての新生物細胞の成長および増殖、ならびに全ての前がん性およびがん性の細胞および組織を指す。固形腫瘍は一般的に、嚢胞または液体領域を含有しない組織の異常な塊である。固形腫瘍は、非限定的な例として、脳、結腸、乳房、前立腺、肝臓、腎臓、肺、食道、頭頸部、卵巣、子宮頚部、胃、結腸、直腸、膀胱、子宮、精巣、および膵臓に存在する場合がある。一部の実施形態では、固形腫瘍がここで開示される方法で処置された後、固形腫瘍は退縮するかまたはその成長が遅くなるかもしくは静止する。他の実施形態では、固形腫瘍は悪性である。一部の実施形態では、がんはステージ０のがんを含む。一部の実施形態では、がんはステージＩのがんを含む。一部の実施形態では、がんはステージＩＩのがんを含む。一部の実施形態では、がんはステージＩＩＩのがんを含む。一部の実施形態では、がんはステージＩＶのがんを含む。一部の実施形態では、がんは、難治性および／または転移性である。例えば、がんは、照射療法、化学療法を用いた処置または免疫療法を用いた単独療法に対して抵抗性であってもよい。がんとしては、限定するものではないが、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、進行性軟部組織肉腫、脳がん、転移性または侵襲性乳がん、乳癌、気管支原性癌、絨毛癌、慢性骨髄性白血病、結腸癌、結腸直腸癌、ユーイング肉腫、消化管癌、神経膠腫、多形神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、肝細胞癌、ホジキン病、頭蓋内上衣芽腫、大腸がん、白血病、肝臓がん、肺癌、ルイス肺癌、リンパ腫、悪性線維性組織球腫、乳腺腫瘍、黒色腫、中皮腫、神経芽腫、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、橋腫瘍、閉経前乳がん、前立腺がん、横紋筋肉腫、細網細胞肉腫、肉腫、小細胞肺がん、固形腫瘍、胃がん、精巣がん、および子宮癌を含む新たに診断されたかまたは再発性のがんがある。一部の実施形態では、がんは急性白血病である。一部の実施形態では、がんは急性リンパ芽球性白血病である。一部の実施形態では、がんは急性骨髄性白血病である。一部の実施形態では、がんは進行性軟部組織肉腫である。一部の実施形態では、がんは脳がんである。一部の実施形態では、がんは乳がん（例えば、転移性または侵襲性乳がん）である。一部の実施形態では、がんは乳癌である。一部の実施形態では、がんは気管支原性癌である。一部の実施形態では、がんは絨毛癌である。一部の実施形態では、がんは慢性骨髄性白血病である。一部の実施形態では、がんは結腸癌（例えば、腺癌）である。一部の実施形態では、がんは結腸直腸がん（例えば、結腸直腸癌）である。一部の実施形態では、がんはユーイング肉腫である。一部の実施形態では、がんは消化管癌である。一部の実施形態では、がんは神経膠腫である。一部の実施形態では、がんは多形神経膠芽腫である。一部の実施形態では、がんは頭頸部扁平上皮細胞癌である。一部の実施形態では、がんは肝細胞癌である。一部の実施形態では、がんはホジキン病である。一部の実施形態では、がんは頭蓋内上衣芽腫である。一部の実施形態では、がんは大腸がんである。一部の実施形態では、がんは白血病である。一部の実施形態では、がんは肝臓がんである。一部の実施形態では、がんは肺がん（例えば、肺癌）である。一部の実施形態では、がんはルイス肺癌である。一部の実施形態では、がんはリンパ腫である。一部の実施形態では、がんは悪性線維性組織球腫である。一部の実施形態では、がんとしては乳腺腫瘍が挙げられる。一部の実施形態では、がんは黒色腫である。一部の実施形態では、がんは中皮腫である。一部の実施形態では、がんは神経芽腫である。一部の実施形態では、がんは骨肉腫である。一部の実施形態では、がんは卵巣がんである。一部の実施形態では、がんは膵臓がんである。一部の実施形態では、がんとしては橋腫瘍が挙げられる。一部の実施形態では、がんは閉経前乳がんである。一部の実施形態では、がんは前立腺がんである。一部の実施形態では、がんは横紋筋肉腫である。一部の実施形態では、がんは細網細胞肉腫である。一部の実施形態では、がんは肉腫である。一部の実施形態では、がんは小細胞肺がんである。一部の実施形態では、がんとしては固形腫瘍が挙げられる。一部の実施形態では、がんは胃がんである。一部の実施形態では、がんは精巣がんである。一部の実施形態では、がんは子宮癌である。
【0195】
ａ．脳腫瘍
開示されるデンドリマーの有効な血液－脳腫瘍関門（ＢＢＴＢ）浸透および均一な固形腫瘍分布は、脳腫瘍への治療的送達を著しく強化することができる。高密度ヒドロキシル表面基はそのサイズが小さく、表面電荷がほぼ中性であり、炎症、特に神経炎症と関連する細胞において選択的に局在する。
開示されるデンドリマーの有効な血液－脳腫瘍関門（ＢＢＴＢ）浸透および均一な固形腫瘍分布は、脳腫瘍への治療的送達を著しく強化することができる。高密度ヒドロキシル表面基はそのサイズが小さく、表面電荷がほぼ中性であり、炎症、特に神経炎症と関連する細胞において選択的に局在する。
【0196】
組成物および方法は、対象における腫瘍成長を遅延させるかもしくは阻害すること、腫瘍の成長もしくはサイズを減少させること、腫瘍転移を阻害するかもしくは減少させること、および／または腫瘍の発生もしくは成長と関連する症状を阻害するかもしくは減少させることによって、良性または悪性腫瘍を有する対象を処置することに有用である。
【0197】
組成物および方法で処置してもよいタイプのがんとしては、これらに限定されるものではないが、神経膠腫、神経膠芽腫、神経膠肉腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、乏突起神経膠腫、非グリア腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫、神経節腫、神経鞘腫、脊索腫および下垂体腫瘍を含む脳腫瘍がある。
【0198】
デンドリマー複合体は、脳腫瘍またはそれに関連する症状を処置できるのが公知である１つまたは複数の追加の治療的活性剤と組み合わせて投与してもよい。
【0199】
例えば、デンドリマーは、静脈内投与を介してまたは腫瘍の全てもしくは一部を除去するための外科手術中に脳に投与してもよい。デンドリマーは、化学療法剤、補助療法、例えば放射線療法を受けている対象のものを強化する薬剤を送達するために使用してもよく、ヒドロキシル末端デンドリマーは、脳の増殖性疾患におけるＤＤＸ３活性を抑制または阻害するのに有効な量で少なくとも１つの放射線感作剤に共有結合している。
【0200】
当業者であれば、化学療法に加えて、外科的介入および放射線療法も神経系のがんの処置において使用されることは理解するであろう。放射線療法とは、対象のがんの位置に近接して対象に電離放射線を投与することを意味する。一部の実施形態では、放射線感作剤は２回またはそれを超える用量で投与され、その後、電離放射線が対象のがんの位置に近接して対象に投与される。さらなる実施形態では、放射線感作剤、それに続く電離放射線の投与は２サイクルまたはそれを超えるサイクルで繰り返してもよい。
【0201】
典型的には、電離放射線の線量は腫瘍のサイズおよび位置で異なるが、線量は０．１Ｇｙから約３０Ｇｙの範囲、好ましくは５Ｇｙから約２５Ｇｙの範囲である。
【0202】
一部の実施形態では、電離放射線は、定位アブレーション放射線療法（ＳＡＢＲ）または定位体放射線療法（ｓｔｅｒｏｔａｃｔｉｃ ｂｏｄｙ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｔｈｅｒａｐｙ）（ＳＢＲＴ）の形態である。
【0203】
３．神経学的および神経変性疾患
デンドリマー組成物およびその製剤は、１つまたは複数の神経学的および神経変性疾患を診断および／または処置するために使用することができる。組成物および方法は、スフィンゴミエリンを含むスフィンゴ脂質の欠損した代謝および機能と関連する１つまたは複数の神経学的または神経変性疾患の処置に特に適している。一部の実施形態では、疾患または障害は、これらに限定されないが、一部の精神（例えば、抑うつ、統合失調症（ＳＺ）、アルコール使用障害、およびモルヒネ抗侵害受容性の耐性）および神経学的（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ））障害から選択される。一実施形態では、デンドリマー複合体は、アルツハイマー病（ＡＤ）または認知症を処置するために使用される。
デンドリマー組成物およびその製剤は、１つまたは複数の神経学的および神経変性疾患を診断および／または処置するために使用することができる。組成物および方法は、スフィンゴミエリンを含むスフィンゴ脂質の欠損した代謝および機能と関連する１つまたは複数の神経学的または神経変性疾患の処置に特に適している。一部の実施形態では、疾患または障害は、これらに限定されないが、一部の精神（例えば、抑うつ、統合失調症（ＳＺ）、アルコール使用障害、およびモルヒネ抗侵害受容性の耐性）および神経学的（例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ））障害から選択される。一実施形態では、デンドリマー複合体は、アルツハイマー病（ＡＤ）または認知症を処置するために使用される。
【0204】
神経変性疾患は、神経および行動的機能に影響を与える神経系の慢性進行性障害であり、異なった組織病理学的および臨床的な症候群をもたらす生化学的変化を伴う（Ｈａｒｄｙ Ｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ． １９９８；２８２：１０７５－９）。細胞分解機序に対して耐性がある異常なタンパク質が細胞内に蓄積する。神経損失のパターンは、１つのグループが影響を受けているのに対し、他方のグループは無傷なままという意味で、選択的である。疾患に関する明らかな誘発事象は存在しないことが多い。神経変性として古典的に記載される疾患は、アルツハイマー病、ハンチントン病、およびパーキンソン病である。
【0205】
活性化ミクログリアおよびアストロサイトによって介在される神経炎症は、さまざまな神経障害の主要な特質であり、潜在的な治療標的となる（Ｈａｇｂｅｒｇ， Ｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１２， ７１， ４４４；Ｖａｒｇａｓ， ＤＬ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２００５， ５７， ６７；およびＰａｒｄｏ， ＣＡ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ２００５， １７， ４８５）。複数の科学報告書では、これらの細胞を標的とすることによって初期段階で神経炎症を緩和すると、疾患の発症を遅延させることができ、ひいては処置に関して、より長期の治療域を提供できることが示唆されている（Ｄｏｍｍｅｒｇｕｅｓ， ＭＡ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００３， １２１， ６１９；Ｐｅｒｒｙ， ＶＨ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｌ ２０１０， ６， １９３；Ｋａｎｎａｎ， Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ． ２０１２， ４， １３０ｒａ４６；およびＢｌｏｃｋ， ＭＬ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００７， ８， ５７）。血液脳関門を通過して治療薬を送達することは困難な課題である。神経炎症は、血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊をもたらす。神経炎症性障害において損傷したＢＢＢは、薬物担持ナノ粒子を脳全体にわたって輸送するために利用することができる（Ｓｔｏｌｐ， ＨＢ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１１， ２０１１， １０；およびＡｈｉｓｈａｌｉ， Ｂ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００５， １１５， １５１）。
【0206】
組成物および方法は、神経疾患もしくは障害または神経変性疾患もしくは障害、または中枢神経系障害を処置する活性剤を送達するためにも使用してもよい。好ましい実施形態では、組成物および方法は、神経疾患もしくは障害または神経変性疾患もしくは障害、または中枢神経系障害と関連する神経炎症の処置および／または緩和において有効である。方法は、典型的には、認知を高めるかまたは認知の低下を減少させる、認知機能を高めるかまたは認知機能低下を減少させる、記憶を高めるかまたは記憶の低下を減少させる、学習能力もしくは容量（ｃａｐａｃｉｔｙ）を高めるかまたは学習能力もしくは容量の低下を減少させる、あるいはこれらの組合せのために、有効量の組成物を対象に投与することを含む。
【0207】
神経変性とは、ニューロン死を含む、ニューロンの構造または機能の進行性の損失を指す。例えば、組成物および方法は、疾患または障害、例えば、パーキンソン病（ＰＤ）およびＰＤ関連疾患、ハンチントン病（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）および他の認知症、プリオン疾患、例えばクロイツフェルトヤコブ疾患、大脳皮質基底核変性症、前頭側頭型認知症、ＨＩＶ関連認知機能障害、軽度認知機能障害、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、脊髄小脳失調（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、フリードライヒ運動失調症、レビー小体疾患、アルパーズ病、バッテン病、脳－眼－顔面－骨格症候群、大脳皮質基底核変性症、ゲルストマン－シュトロイスラー－シャインカー疾患、クールー、リー病、単肢性筋萎縮症（Ｍｏｎｏｍｅｌｉｃ Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｙ）、多系統萎縮症、起立性低血圧を伴う多系統萎縮症（シャイドレーガー症候群）、多発性硬化症（ＭＳ）、脳鉄蓄積を伴う神経変性症、眼球クローヌスミオクローヌス、後部皮質萎縮症（Ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ Ｃｏｒｔｉｃａｌ Ａｔｒｏｐｈｙ）、原発性進行型失語症、進行性核上性麻痺、血管性認知症、進行性多病巣性白質脳症、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、ラクナ症候群（Ｌａｃｕｎａｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、水頭症、ウェルニッケコルサコフ症候群、脳炎後認知症、がんおよび化学療法関連認知機能障害および認知症、ならびに抑うつ誘発性認知症および仮性認知症を有する対象を処置するために使用してもよい。
【0208】
さらなる実施形態では、疾患または障害は、これらに限定されないが、注射局限性アミロイドーシス、脳アミロイド血管症、ミオパチー、ニューロパチー、脳外傷、前頭側頭型認知症、ピック病、多発性硬化症、プリオン障害、２型糖尿病、致死性家族性不眠症、心不整脈、孤立性心房アミロイドーシス（ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｔｒｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、家族性アミロイド多発性ニューロパチー、遺伝性非ニューロパチー性全身性アミロイドーシス、フィンランド型アミロイドーシス（Ｆｉｎｎｉｓｈ ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ）、格子状角膜ジストロフィー、全身性ＡＬアミロイドーシス、およびダウン症候群から選択される。好ましい実施形態では、疾患または障害は、アルツハイマー病または認知症である。
【0209】
特定の神経学的因子における改善をアセスメントするための基準は、認知的技能、運動技能、記憶容量などを評価する方法、ならびに中枢神経系の選択された領域における物理的変化をアセスメントするための方法、例えば、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）およびコンピューター断層撮影スキャン（ＣＴ）または他のイメージング法を含む。このような評価法は、医学、神経学、心理学などの分野において周知されており、特定の神経機能障害の状態を診断するために適切に選択することができる。アルツハイマー病における変化または関連する神経学的変化をアセスメントするために、選択されたアセスメントまたは評価試験、または試験群は、デンドリマー組成物の投与を開始するより前に行われる。この最初のアセスメント後、デンドリマー組成物を投与するための処置法が開始され、さまざまな時間間隔にわたって継続される。神経学的欠陥機能障害の最初のアセスメントに続く選択された時間間隔で、選択された神経学的基準における変化または改善を再アセスメントするために、同じアセスメントまたは評価試験が再び使用される。
【0210】
Ｃ．投薬量および有効量
投薬量および投薬レジメンは、障害もしくは損傷の重症度および位置、ならびに／または投与方法に依存し、当業者に公知である。神経学的または神経変性疾患の処置において使用される治療有効量のデンドリマー組成物は、典型的には、神経学的または神経変性疾患の１つまたは複数の症状を減少させるかまたは緩和するのに十分である。
投薬量および投薬レジメンは、障害もしくは損傷の重症度および位置、ならびに／または投与方法に依存し、当業者に公知である。神経学的または神経変性疾患の処置において使用される治療有効量のデンドリマー組成物は、典型的には、神経学的または神経変性疾患の１つまたは複数の症状を減少させるかまたは緩和するのに十分である。
【0211】
好ましくは、活性剤は、罹患した組織または標的組織内に存在しないかもしくはそれらと関連していない健常細胞の活性もしくは量を標的としないかもしくはモジュレートしないか、またはＣＮＳにおける活性化ミクログリア細胞を含む標的細胞と比較して低いレベルで標的とするかもしくはモジュレートする。このようにして、組成物と関連する副生成物および他の副作用は減少される。
【0212】
組成物の投与は、神経疾患、神経損傷、または加齢関連のニューロンの低下または機能障害を有する個体における神経機能の改善または増強をもたらす。一部のｉｎ ｖｉｖｏでのアプローチでは、デンドリマー複合体は、新規のニューロンの生成につながる神経有糸分裂を刺激または誘発し、神経原性効果を提供するための治療有効量で対象に投与される。個体のニューロン、神経突起および神経ネットワークの悪化、機能障害、または死滅を予防し、減少させ、または終息させ、神経保護効果を提供するための有効量の組成物も提供される。
【0213】
デンドリマー複合体の実際の有効量は、投与される特定の薬剤、製剤化される特定の組成物、投与様式、および処置される対象の年齢、体重、状態、ならびに投与経路、および疾患または障害を含む因子に従って変更してもよい。組成物の用量は、約０．０１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ～約５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。一般的に、静脈内注射または注入に関しては、投薬量は経口投与用のものより低くてもよい。
【0214】
一般的に、投与のタイミングおよび頻度は、所与の処置または診断スケジュールの有効性と所与の送達システムの副作用とのバランスをとるように調整されることになる。例示的な投薬頻度は、連続注入、単回および複数回投与、例えば１時間ごと、毎日、毎週、毎月または毎年の投薬を含む。
【0215】
組成物は、治療剤の血液レベルの治療上有効な増加を提供するような量で、毎日、週２回、週１回、２週間毎またはそれ未満の頻度で投与され得る。投与が経口経路以外によるものである場合、組成物は、２４時間以内に治療有効用量を生成するように、１時間を超えて、例えば３～１０時間にわたって送達してもよい。あるいは、組成物は、制御放出のために製剤化してもよく、組成物は、週１回、またはそれ未満の頻度のレジメンで繰り返される単回用量として投与される。
【0216】
投薬量は変更してもよく、１日または数日間、単回または複数回用量投与で毎日投与してもよい。ガイダンスは、所与のクラスの医薬品に関する適切な投薬量に関する文献で見出すことができる。最適な投薬スケジュールは、対象または患者の身体における薬物蓄積の測定値から計算することができる。当業者であれば、最適な投薬量、投薬方法論、および反復率（ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ）を容易に決定することができる。最適な投薬量は、個々の医薬組成物の相対的な効力に応じて変化する場合があり、一般的に、動物モデルにおいてｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで有効であることが認められたＥＣ５０に基づいて推測することができる。
【0217】
一部の実施形態では、方法は、対象における１つまたは複数の疾患または障害を減少させるかまたは予防するのに有効な量で対象に機能性核酸を投与する。デンドリマー－機能性核酸複合体として対象に機能性核酸を投与すると、典型的には、単独で投与された機能性核酸の血清半減期と比較して、機能性核酸の血清半減期が強化される。一部の実施形態では、デンドリマーとのコンジュゲーションによって、酵素分解またはタンパク質分解から機能性核酸が遮蔽され、機能性核酸の非特異的細胞取り込みおよび／または活性が予防される。例えば一部の実施形態では、機能性核酸は、デンドリマーとのコンジュゲーションが非存在下での同じ機能性核酸の血清半減期よりも１０％から１０，０００％長い血清半減期を有し、例えば、デンドリマーとのコンジュゲーションが非存在下での同じ機能性核酸の血清半減期よりも５０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％、７００％、１，０００％、５，０００％または１０，０００％、または１０，０００％を超える長い血清半減期を有する。実施例で示すように、ｉｎ ｖｉｖｏで３０分の血清半減期を有するｍｉＲＮＡ分子は、デンドリマーコンジュゲートとして投与後最大１４日機能した。したがって一部の実施形態では、機能性核酸は一般的に、ｉｎ ｖｉｖｏで投与後３０分を超える、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで投与後、最大１時間（１ｈｒ）、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０、時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、４週、１カ月または１カ月を超える期間にわたって治療有効性を提供する。
【0218】
一部の実施形態では、レジメンは、治療ラウンド、続いて休薬（例えば、薬物なし）の１つまたは複数のサイクルを含む。休薬は、１、２、３、４、５、６、もしくは７日、または１、２、３、４週、または１、２、３、４、５、もしくは６カ月であってもよい。
【0219】
Ｄ．対照
デンドリマー複合体組成物の効果は対照と比較してもよい。好適な対照は当技術分野において公知であり、例えば、未処置の細胞または未処置の対象を含む。一部の実施形態では、対照は、処置された対象からの未処置の組織であるか、または未処置の対象からの未処置の組織である。好ましくは対照の細胞または組織は、処置された細胞または組織と同じ組織由来のものである。一部の実施形態では、未処置の対照対象は、処置された対象と同じ疾患または状態を患っているかまたはそのリスクがあるものである。
デンドリマー複合体組成物の効果は対照と比較してもよい。好適な対照は当技術分野において公知であり、例えば、未処置の細胞または未処置の対象を含む。一部の実施形態では、対照は、処置された対象からの未処置の組織であるか、または未処置の対象からの未処置の組織である。好ましくは対照の細胞または組織は、処置された細胞または組織と同じ組織由来のものである。一部の実施形態では、未処置の対照対象は、処置された対象と同じ疾患または状態を患っているかまたはそのリスクがあるものである。
【0220】
ＶＩ．キット
組成物は、キットとして包装してもよい。キットは、デンドリマー中にカプセル化された、それと会合された、またはそれとコンジュゲートされた１つまたは複数の機能性核酸を含む組成物の単回用量または複数回用量と、組成物を投与するための取扱説明書とを含んでいてもよい。特に、取扱説明書は、有効量の組成物が、表示された特定の疾患または障害を伴う個体に投与することを指示している。組成物は、特定の処置方法を参照しながら上述のように製剤化してもよく、任意の好都合な様式で包装してもよい。
組成物は、キットとして包装してもよい。キットは、デンドリマー中にカプセル化された、それと会合された、またはそれとコンジュゲートされた１つまたは複数の機能性核酸を含む組成物の単回用量または複数回用量と、組成物を投与するための取扱説明書とを含んでいてもよい。特に、取扱説明書は、有効量の組成物が、表示された特定の疾患または障害を伴う個体に投与することを指示している。組成物は、特定の処置方法を参照しながら上述のように製剤化してもよく、任意の好都合な様式で包装してもよい。
【0221】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによってさらに理解されるであろう。
【実施例】
【0222】
（実施例１）
Ｃｙ－５を含むデンドリマー－アンチセンス－ＲＮＡコンジュゲートの合成および特徴付け
材料および方法
特に記載がない限り、全ての反応は、乾燥溶媒を使用して窒素陽圧下火炎乾燥させたガラス容器中で行った。各反応ステップ後、生成物は、ＤＭＦ中で透析を介して２４時間精製して小分子不純物を除去し、続いて水透析を行ってＤＭＦを除去した。（１）～（９）の化学構造の全ての列挙は図１および２において（１）～（９）で表される化学構造に対応する。
Ｃｙ－５を含むデンドリマー－アンチセンス－ＲＮＡコンジュゲートの合成および特徴付け
材料および方法
特に記載がない限り、全ての反応は、乾燥溶媒を使用して窒素陽圧下火炎乾燥させたガラス容器中で行った。各反応ステップ後、生成物は、ＤＭＦ中で透析を介して２４時間精製して小分子不純物を除去し、続いて水透析を行ってＤＭＦを除去した。（１）～（９）の化学構造の全ての列挙は図１および２において（１）～（９）で表される化学構造に対応する。
【0223】
１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６中）で中間体と最終的なコンジュゲートとを上から下に比較し、ピークの出現および消失による生成物の形成を確認し、保持時間におけるシフトがそれぞれ示された。全ての中間体および最終構成要素の分子量は、ＰＡＭＡＭ－Ｇ６－ＯＨ、Ｃｙ５－Ｄ、およびＣｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＴＣＯの分析ＨＰＬＣトレース、ならびにＰＡＭＡＭ－Ｇ６－ＯＨ、Ｃｙ５－Ｄ、およびＣｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＴＣＯのマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）スペクトルによって決定した。合成の各ステップにおけるコンジュゲーションの程度は、１Ｈ－ＮＭＲとＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳによって測定した分子量の変化とに基づいて計算した。
【0224】
生体分子、化学物質、および試薬
市販グレードの試薬および無水溶媒は、化学物質の供給会社から購入し、さらに精製することなく使用した。１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ．ＨＣｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、４－（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、γ－（Ｂｏｃ－アミノ）酪酸（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨ）、無水ジクロロメタン（ＤＣＭ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。シアニン５（Ｃｙ５）－モノ－ＮＨＳエステルはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ－ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）はＡＡＴ ｂｉｏｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．から購入した。テトラジン（Ｔｚ）前駆体はＢｒｏａｄＰｈａｒｍから購入した。重水素化溶媒ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ６）、水（Ｄ２Ｏ）、およびクロロホルム（ＣＤＣｌ３）はＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）から購入した。エチレンジアミンコアポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、第６．０世代、ヒドロキシ表面（Ｇ６－ＯＨ；診断グレード；２５６個のヒドロキシル末端基からなる）、メタノール溶液（１３．７５％ｗ／ｗ）は、Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ、ＵＳＡ）から購入した。透析膜はＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。
市販グレードの試薬および無水溶媒は、化学物質の供給会社から購入し、さらに精製することなく使用した。１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ．ＨＣｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、４－（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、γ－（Ｂｏｃ－アミノ）酪酸（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨ）、無水ジクロロメタン（ＤＣＭ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。シアニン５（Ｃｙ５）－モノ－ＮＨＳエステルはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ－ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）はＡＡＴ ｂｉｏｑｕｅｓｔ，Ｉｎｃ．から購入した。テトラジン（Ｔｚ）前駆体はＢｒｏａｄＰｈａｒｍから購入した。重水素化溶媒ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ６）、水（Ｄ２Ｏ）、およびクロロホルム（ＣＤＣｌ３）はＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）から購入した。エチレンジアミンコアポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、第６．０世代、ヒドロキシ表面（Ｇ６－ＯＨ；診断グレード；２５６個のヒドロキシル末端基からなる）、メタノール溶液（１３．７５％ｗ／ｗ）は、Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ、ＵＳＡ）から購入した。透析膜はＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。
【0225】
中間体および生成物の特徴付けのための機器の使用
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルは、周囲温度でＢｒｕｋｅｒ ５００ＭＨｚ分光計で記録し、ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａソフトウェアを使用して分析した。１Ｈ ＮＭＲ化学シフトは、内部標準として残留溶媒（ＤＭＳＯ－ｄ６、２．５０）および（Ｄ２Ｏ、４．７９ｐｐｍ）を使用したδとして報告されている。
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルは、周囲温度でＢｒｕｋｅｒ ５００ＭＨｚ分光計で記録し、ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａソフトウェアを使用して分析した。１Ｈ ＮＭＲ化学シフトは、内部標準として残留溶媒（ＤＭＳＯ－ｄ６、２．５０）および（Ｄ２Ｏ、４．７９ｐｐｍ）を使用したδとして報告されている。
【0226】
Ｄ－ＧＡＢＡＢｏｃ（３）の合成
ＤＭＦ（１２ｍＬ）中のＰＡＭＡＭ Ｇ６－ＯＨ１（１．００ｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）の溶液をＢｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨ（０．０６９ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０７８２ｇ、０．４０８ｍｍｏｌ）で処置し、室温で５分間撹拌した。次いでＥＤＣ．ＨＣＩ（０．０４６ｇ、０．３７４ｍｍｏｌ）を反応混合物に５分かけて分けて加えた。反応混合物を室温で３６時間撹拌した。粗製生成物を３ｋＤ ＭＷカットオフセルロース透析チューブに移し、ＤＭＦに対して１２時間、続いて水に対して２４時間透析した。水性層を凍結し、凍結乾燥して、吸湿性の白色固形物として所望の生成物３を得た（０．９７３ｇ、９５％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） ８．１０－７．７０ （ｍ， 内部アミドＨ）， ６．６０ （ｓ， ＧＡＢＡアミド Ｈ， １０Ｈ）， ４．７４ （ｓ， 表面ＯＨ， ２１３Ｈ）， ３．９９ （ｓ， エステル連結Ｈ， ２２Ｈ） ３．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．４０－３．３５ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， ３．１１ （ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．８９ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， ２．７３－２．６５（ｍ， デンドリマーＣＨ２）， ２．４５（ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．２１（ｍ， デンドリマーＣＨ２）， １．６４－１．５９ （ｍ， ＧＡＢＡリンカー－ＣＨ２， ２５Ｈ）， １．３６ （ｓ， Ｂｏｃ基， ８５Ｈ）．ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間１９分。
ＤＭＦ（１２ｍＬ）中のＰＡＭＡＭ Ｇ６－ＯＨ１（１．００ｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）の溶液をＢｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨ（０．０６９ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０７８２ｇ、０．４０８ｍｍｏｌ）で処置し、室温で５分間撹拌した。次いでＥＤＣ．ＨＣＩ（０．０４６ｇ、０．３７４ｍｍｏｌ）を反応混合物に５分かけて分けて加えた。反応混合物を室温で３６時間撹拌した。粗製生成物を３ｋＤ ＭＷカットオフセルロース透析チューブに移し、ＤＭＦに対して１２時間、続いて水に対して２４時間透析した。水性層を凍結し、凍結乾燥して、吸湿性の白色固形物として所望の生成物３を得た（０．９７３ｇ、９５％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） ８．１０－７．７０ （ｍ， 内部アミドＨ）， ６．６０ （ｓ， ＧＡＢＡアミド Ｈ， １０Ｈ）， ４．７４ （ｓ， 表面ＯＨ， ２１３Ｈ）， ３．９９ （ｓ， エステル連結Ｈ， ２２Ｈ） ３．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．４０－３．３５ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， ３．１１ （ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．８９ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， ２．７３－２．６５（ｍ， デンドリマーＣＨ２）， ２．４５（ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．２１（ｍ， デンドリマーＣＨ２）， １．６４－１．５９ （ｍ， ＧＡＢＡリンカー－ＣＨ２， ２５Ｈ）， １．３６ （ｓ， Ｂｏｃ基， ８５Ｈ）．ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間１９分。
【0227】
Ｄ－ＧＡＢＡ－ＮＨ２（４）の合成
ＰＡＭＡＭ Ｇ６－ＯＨ３（２５０ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）を含むＢｏｃ保護ＧＡＢＡリンカーをＴＦＡ／ＤＣＭ（３：４）溶媒混合物で処置した。反応物を室温で１２時間撹拌し、次いでメタノールで希釈し、真空中で濃縮した（このステップは、過剰なＴＦＡを除去し、ＧＡＢＡリンカーを加水分解切断するために必要である）。粗製生成物を使用して、さらなる精製を一切行わずに次のステップを行った。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．５０－７．７５ （ｍ， 内部アミドＨ）， ５．５０－４．５０ （ブロードなｓ， 表面－ＯＨ）， ４．００ （ｓ， エステル連結Ｈ）， ３．５０－２．２５（ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， １．９３－１．５９ （ｍ， ＧＡＢＡリンカー－ＣＨ２）．
ＰＡＭＡＭ Ｇ６－ＯＨ３（２５０ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）を含むＢｏｃ保護ＧＡＢＡリンカーをＴＦＡ／ＤＣＭ（３：４）溶媒混合物で処置した。反応物を室温で１２時間撹拌し、次いでメタノールで希釈し、真空中で濃縮した（このステップは、過剰なＴＦＡを除去し、ＧＡＢＡリンカーを加水分解切断するために必要である）。粗製生成物を使用して、さらなる精製を一切行わずに次のステップを行った。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．５０－７．７５ （ｍ， 内部アミドＨ）， ５．５０－４．５０ （ブロードなｓ， 表面－ＯＨ）， ４．００ （ｓ， エステル連結Ｈ）， ３．５０－２．２５（ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， １．９３－１．５９ （ｍ， ＧＡＢＡリンカー－ＣＨ２）．
【0228】
Ｃｙ５－Ｄ（５）の合成
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物４（２８７ｍｇ、０．００４８ｍｍｏｌ）の溶液をＤＩＰＥＡで処置して、反応混合物のｐＨを調整した（約７．０～７．５）。次いで反応物をＣｙ５－ＮＨＳエステル（８．７ｍｇ、０．０１１５ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）で処置し、室温で１２時間撹拌した。次いでそれをＤＭＦに対して１２時間、続いて水に対して２４時間透析した。水性層を凍結し、凍結乾燥して、所望の生成物５を青色固形物として得た（収率８５％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．２５－７．７５ （ｍ， 内部アミドＨ）， ７．３０ （ｓ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．１０ （ｓ Ｃｙ５ Ｈ）， ６．７０ （ｓ， ＧＡＢＡアミド Ｈ）， ６．５０ （ｍ Ｃｙ５ Ｈ）， ６．２５ （ｍ Ｃｙ５ Ｈ）， ４．７５ （ｓ， 表面ＯＨ， ２２６Ｈ）， ４．００ （ｍ， エステルＣＨ２）， ３．５０－２．００ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， １．６４－１．５９ （ｓ， ３１Ｈ）， １．２５ （ｓ， ６６Ｈ）， ０．８ （ｓ， ２１Ｈ）．ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間（０．１％ＴＦＡを含む水中のアセトニトリル、直線勾配、４０分）。ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間：１７．５分。
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物４（２８７ｍｇ、０．００４８ｍｍｏｌ）の溶液をＤＩＰＥＡで処置して、反応混合物のｐＨを調整した（約７．０～７．５）。次いで反応物をＣｙ５－ＮＨＳエステル（８．７ｍｇ、０．０１１５ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）で処置し、室温で１２時間撹拌した。次いでそれをＤＭＦに対して１２時間、続いて水に対して２４時間透析した。水性層を凍結し、凍結乾燥して、所望の生成物５を青色固形物として得た（収率８５％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．２５－７．７５ （ｍ， 内部アミドＨ）， ７．３０ （ｓ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．１０ （ｓ Ｃｙ５ Ｈ）， ６．７０ （ｓ， ＧＡＢＡアミド Ｈ）， ６．５０ （ｍ Ｃｙ５ Ｈ）， ６．２５ （ｍ Ｃｙ５ Ｈ）， ４．７５ （ｓ， 表面ＯＨ， ２２６Ｈ）， ４．００ （ｍ， エステルＣＨ２）， ３．５０－２．００ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， １．６４－１．５９ （ｓ， ３１Ｈ）， １．２５ （ｓ， ６６Ｈ）， ０．８ （ｓ， ２１Ｈ）．ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間（０．１％ＴＦＡを含む水中のアセトニトリル、直線勾配、４０分）。ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間：１７．５分。
【0229】
Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＴＣＯ（６）の合成
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物５（４８ｍｇ、０．０００８ｍｍｏｌ）の溶液をＤＩＰＥＡで処置して、反応混合物のｐＨを調整した（約７．０～７．５）。反応物をＴＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル（４ｍｇ、０．００８０ｍｍｏｌ）で処置し、反応混合物を室温で１２時間撹拌した。次いでそれをＤＭＦに対して１２時間、続いて水に対して２４時間透析した。水性層を凍結し、凍結乾燥して、所望の生成物を青色固形物として得た（収率５５％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．１４－７．７３ （ｍ， 内部アミドＨ）， ７．３５ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．２５ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．０５ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ６．６ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ６．３ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ６．８３ （ｓ， ＧＡＢＡアミド Ｈ）， ５．６５－５．５０ （ｍ， ＴＣＯ Ｈ）， ５．４５－５．３５ （ｍ， ＴＣＯ Ｈ）， （４．７４ （ｓ， 表面ＯＨ， Ｈ）， ４．０１－３．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， エステル－ＣＨ２）， ３．５０－２．００ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， １．９ （ｓ， ２４Ｈ）， １．６ （ｓ， ８０Ｈ）， １．２ （ｓ， １２６Ｈ）， ０．８ （ｓ， ８０Ｈ）．ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間：１９．５分。
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物５（４８ｍｇ、０．０００８ｍｍｏｌ）の溶液をＤＩＰＥＡで処置して、反応混合物のｐＨを調整した（約７．０～７．５）。反応物をＴＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル（４ｍｇ、０．００８０ｍｍｏｌ）で処置し、反応混合物を室温で１２時間撹拌した。次いでそれをＤＭＦに対して１２時間、続いて水に対して２４時間透析した。水性層を凍結し、凍結乾燥して、所望の生成物を青色固形物として得た（収率５５％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．１４－７．７３ （ｍ， 内部アミドＨ）， ７．３５ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．２５ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．０５ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ６．６ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ６．３ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ６．８３ （ｓ， ＧＡＢＡアミド Ｈ）， ５．６５－５．５０ （ｍ， ＴＣＯ Ｈ）， ５．４５－５．３５ （ｍ， ＴＣＯ Ｈ）， （４．７４ （ｓ， 表面ＯＨ， Ｈ）， ４．０１－３．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， エステル－ＣＨ２）， ３．５０－２．００ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， １．９ （ｓ， ２４Ｈ）， １．６ （ｓ， ８０Ｈ）， １．２ （ｓ， １２６Ｈ）， ０．８ （ｓ， ８０Ｈ）．ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間：１９．５分。
【0230】
限外ろ過およびＳＥＣクロマトグラフィー
合成の各ステップ後、過剰な小分子試薬および副生成物および緩衝液の交換を、１０ｋＤａおよび３０ｋＤａ ＭＷＣＯユニット（２ｍｇ以上の試料）１５ｍＬ、または１０ｋＤａおよび３０ｋＤａ ＭＷＣＯユニット（２ｍｇ以下の試料）０．５ｍＬを使用してＡｍｉｃｏｎ限外ろ過によって行った。
合成の各ステップ後、過剰な小分子試薬および副生成物および緩衝液の交換を、１０ｋＤａおよび３０ｋＤａ ＭＷＣＯユニット（２ｍｇ以上の試料）１５ｍＬ、または１０ｋＤａおよび３０ｋＤａ ＭＷＣＯユニット（２ｍｇ以下の試料）０．５ｍＬを使用してＡｍｉｃｏｎ限外ろ過によって行った。
【0231】
ＰＡＭＡＭデンドリマーコンジュゲートのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ
ＭＡＬＤＩマトリックス２’，４’，６’－トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（ＴＨＡＰ）（１０ｍｇ）を、０．１％トリフルオロ酢酸を含む、水中のアセトニトリル（１：１）１ｍＬ中に溶解した。次いでＰＡＭＡＭデンドリマー２μＬをＭＡＬＤＩ試料プレート上に沈着させた。マトリックス（１０ｍｇ／ｍＬ、２μＬ）を空気乾燥済み試料上に沈着させ、１０～２０分間空気乾燥させた。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析を反射ポジティブモードで行った。
ＭＡＬＤＩマトリックス２’，４’，６’－トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（ＴＨＡＰ）（１０ｍｇ）を、０．１％トリフルオロ酢酸を含む、水中のアセトニトリル（１：１）１ｍＬ中に溶解した。次いでＰＡＭＡＭデンドリマー２μＬをＭＡＬＤＩ試料プレート上に沈着させた。マトリックス（１０ｍｇ／ｍＬ、２μＬ）を空気乾燥済み試料上に沈着させ、１０～２０分間空気乾燥させた。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析を反射ポジティブモードで行った。
【0232】
結果
Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＴＣＯの合成および特徴付け
Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＴＣＯコンジュゲートを、さらなるコンジュゲーションのために表面上で利用可能な２５６個の遊離ヒドロキシル基（Ｄ６－ＯＨ）を含むＰＡＭＡＭ－Ｇ６－ＯＨ（Ｄ６－ＯＨ）デンドリマーを使用して合成した。メタノール中のＤ６－ＯＨ（１３．７５％ｗ／ｗ）を減圧下で乾燥させ、続いて水中に溶解し、さらなるコンジュゲーションのために凍結乾燥した。凍結乾燥された単機能化Ｄ６－ＯＨを、ＤＭＦ中のＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）および４－（ジメチルアミノ）ピリジン（４－ＤＭＡＰ）下、室温で３６時間、４－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）酪酸（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨ）で処置することによってＢｏｃ保護アミンで機能化して、Ｂｏｃ保護二機能性デンドリマー生成物を得た。粗製デンドリマーを、３．５ｋＤａ膜によって超純水に対して２４時間透析し、続いて凍結乾燥した。デンドリマー（３）の１Ｈ ＮＭＲによって、シングレットとしてδ１．３ｐｐｍにおいてＢｏｃ基のｔｅｒｔ－ブチルプロトンおよびδ１．６ｐｐｍにおいてＧＡＢＡメチレンプロトンの出現が示された。δ３．９ｐｐｍにおけるピークは、一度エステルに変換されたヒドロキシル基の隣のデンドリマーのメチレンプロトンに関するものであり、ＧＡＢＡリンカーからのアミドプロトンもδ６．８ｐｐｍにおいて出現した。次いで、Ｂｏｃ基を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１：４）を使用して弱酸性条件下で脱保護して二機能化デンドリマーを得た。過剰なＴＦＡをメタノールとの共蒸発によって除去し、得られた粗製生成物を使用してさらに精製することなく次のステップを行った。Ｂｏｃプロトンの完全な消失を１Ｈ ＮＭＲによって確認し、同時にエステル加水分解はこの条件下では観察されなかった（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６、５００ＭＨｚ）。デンドリマーコンジュゲート、Ｄ－ＧＡＢＡ－Ｂｏｃ、Ｄ－ＧＡＢＡ－ＮＨ２、Ｃｙ５－Ｄ、Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＴＣＯ（ＤＭＳＯ－ｄ６およびＤ２Ｏ中）の特徴付けでは、特徴的なシグナルの出現または消失が示された。アミン基の総数は約１０で維持された。次いで二機能性デンドリマーを蛍光染料Ｃｙ５で処置して、デンドリマー表面において約１～２個のＣｙ５結合が成功したデンドリマー（４）を得た。１Ｈ ＮＭＲによって、芳香族領域におけるＣｙ５シグナルの出現が示され、ＨＰＬＣ保持時間は１９．０から１７．５分にシフトし、生成物の形成が確認された。Ｃｙ５結合後、アミン基の残りを、トランス－シクロオクテンを含むヘテロ二機能性（ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ＴＣＯ）リンカーと反応させた。このヘテロ二機能性リンカーを使用してデンドリマーとアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）との間に化学結合を形成した。
Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＴＣＯの合成および特徴付け
Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＴＣＯコンジュゲートを、さらなるコンジュゲーションのために表面上で利用可能な２５６個の遊離ヒドロキシル基（Ｄ６－ＯＨ）を含むＰＡＭＡＭ－Ｇ６－ＯＨ（Ｄ６－ＯＨ）デンドリマーを使用して合成した。メタノール中のＤ６－ＯＨ（１３．７５％ｗ／ｗ）を減圧下で乾燥させ、続いて水中に溶解し、さらなるコンジュゲーションのために凍結乾燥した。凍結乾燥された単機能化Ｄ６－ＯＨを、ＤＭＦ中のＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）および４－（ジメチルアミノ）ピリジン（４－ＤＭＡＰ）下、室温で３６時間、４－ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）酪酸（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨ）で処置することによってＢｏｃ保護アミンで機能化して、Ｂｏｃ保護二機能性デンドリマー生成物を得た。粗製デンドリマーを、３．５ｋＤａ膜によって超純水に対して２４時間透析し、続いて凍結乾燥した。デンドリマー（３）の１Ｈ ＮＭＲによって、シングレットとしてδ１．３ｐｐｍにおいてＢｏｃ基のｔｅｒｔ－ブチルプロトンおよびδ１．６ｐｐｍにおいてＧＡＢＡメチレンプロトンの出現が示された。δ３．９ｐｐｍにおけるピークは、一度エステルに変換されたヒドロキシル基の隣のデンドリマーのメチレンプロトンに関するものであり、ＧＡＢＡリンカーからのアミドプロトンもδ６．８ｐｐｍにおいて出現した。次いで、Ｂｏｃ基を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１：４）を使用して弱酸性条件下で脱保護して二機能化デンドリマーを得た。過剰なＴＦＡをメタノールとの共蒸発によって除去し、得られた粗製生成物を使用してさらに精製することなく次のステップを行った。Ｂｏｃプロトンの完全な消失を１Ｈ ＮＭＲによって確認し、同時にエステル加水分解はこの条件下では観察されなかった（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６、５００ＭＨｚ）。デンドリマーコンジュゲート、Ｄ－ＧＡＢＡ－Ｂｏｃ、Ｄ－ＧＡＢＡ－ＮＨ２、Ｃｙ５－Ｄ、Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＴＣＯ（ＤＭＳＯ－ｄ６およびＤ２Ｏ中）の特徴付けでは、特徴的なシグナルの出現または消失が示された。アミン基の総数は約１０で維持された。次いで二機能性デンドリマーを蛍光染料Ｃｙ５で処置して、デンドリマー表面において約１～２個のＣｙ５結合が成功したデンドリマー（４）を得た。１Ｈ ＮＭＲによって、芳香族領域におけるＣｙ５シグナルの出現が示され、ＨＰＬＣ保持時間は１９．０から１７．５分にシフトし、生成物の形成が確認された。Ｃｙ５結合後、アミン基の残りを、トランス－シクロオクテンを含むヘテロ二機能性（ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ＴＣＯ）リンカーと反応させた。このヘテロ二機能性リンカーを使用してデンドリマーとアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）との間に化学結合を形成した。
【0233】
デンドリマー－ＡＳＯコンジュゲートの合成および特徴付け
ＡＳＯを末端テトラジン（Ｔｚ）で機能化し、同時にＤ６－ＯＨを、クリック反応のためにトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）で機能化した（図１～２）。ＡＳＯ（２ｍｇ、ＰＢＳ５００μＬ中）をメチルテトラジン－ＰＥＧ４－Ｓ－Ｓ－ＮＨＳエステル（５ｍｏｌ当量、無水ＤＭＳＯ１０～２０μＬ中）で処置し、１時間インキュベートした。過剰なＭｅ－Ｔｚ－ＰＥＧ４－Ｓ－Ｓ－ＮＨＳおよび副生成物を限外ろ過によって除去した。ＴＣＯ－ＰＥＧ４結合デンドリマー６（１７ｍｇ、ＰＢＳ５００μＬ中）を、トランス－シクロオクテン－テトラジン（ＴＣＯ－Ｔｚ）を介して８と反応させて、粗製生成物９を得た。得られた粗製生成物を限外ろ過で精製し、生成物をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－２５カラムでさらに精製し、限外ろ過によって濃縮した。分子量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって決定した（Ｃｙ５－Ｄ－ＡＳＯのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦスペクトルによってＤ－ＡＳＯに関する６６００９Ｄａの質量におけるピークが示され；ゲル遅延アッセイを行ってＤ－ＡＳＯコンジュゲートの形成を確認し、それによってＲＮＡラダー（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、遊離ｓｉＲＮＡ、およびＤ－ｓｉＧＦＰを、２μｇの核酸ローディングのためのＧＥＬＲＥＤ（登録商標）染色剤、グリセロール１μＬ、および超純水と混合した；ゲル電気泳動を、ＴＢＥ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を含む３％ＴＢＥ－尿素ゲル中、１２０Ｖで２０分間行い、その後ゲルをＣＨＥＭＩＤＯＣ（登録商標）イメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）においてイメージングした）。さらに、Ｄ－ｓｉＧＦＰの合成の成功をゲル電気泳動で確認した。本明細書において使用するＴＣＯ－Ｔｚクリック反応は高速で定量的であり、毒性を有する副生成物を放出することはない。低い生体分子濃度（５μＭ未満）において、ＴＣＯ－Ｔｚは、歪み促進アルキン－アジド環化付加ＳＰＡＡＣおよびＣｕ（Ｉ）触媒アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡｃｃ）と比較して良好に作用する。ＴＣＯ－Ｔｚ「クリック」反応はＴＣＯとＴｚとの間の逆電子要求性ディールスアルダー反応（ＩＥＤＤＡ）を介して進行し、続いて逆ディールスアルダー反応によってＮ２が除去されてジヒドロピリダジン結合が形成される。通常のディールスアルダー反応とは対照的に、電子ジエンが電子不足の求ジエン体と反応する場合は逆電子要求ディールスアルダー反応において、電子が豊富な求ジエン体は電子不足のジエンと反応する。前駆体としてのＴＣＯはシス－シクロオクテンおよび他の環式アルケンと比較して極めて大きな速度差を与えた。高い反応性は、シス型の「半チェア型」立体配座よりもエネルギーが低い、ＴＣＯによって適応されたクラウン型立体配座と関連する。化学選択的ＴＣＯ－Ｔｚライゲーションは、いずれの他のバイオ直交性ライゲーションペアにも匹敵しない超高速速度論（＞８００Ｍ－１ｓ－１）を有する。クリックライゲーションは中性ｐＨ付近、水性条件、室温で行った。超高速速度論、選択性、および長期水性安定性によって、ＴＣＯ－Ｔｚは低濃度デンドリマー－ＡＳＯカップリング反応における理想的なペアとなる。
ＡＳＯを末端テトラジン（Ｔｚ）で機能化し、同時にＤ６－ＯＨを、クリック反応のためにトランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）で機能化した（図１～２）。ＡＳＯ（２ｍｇ、ＰＢＳ５００μＬ中）をメチルテトラジン－ＰＥＧ４－Ｓ－Ｓ－ＮＨＳエステル（５ｍｏｌ当量、無水ＤＭＳＯ１０～２０μＬ中）で処置し、１時間インキュベートした。過剰なＭｅ－Ｔｚ－ＰＥＧ４－Ｓ－Ｓ－ＮＨＳおよび副生成物を限外ろ過によって除去した。ＴＣＯ－ＰＥＧ４結合デンドリマー６（１７ｍｇ、ＰＢＳ５００μＬ中）を、トランス－シクロオクテン－テトラジン（ＴＣＯ－Ｔｚ）を介して８と反応させて、粗製生成物９を得た。得られた粗製生成物を限外ろ過で精製し、生成物をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－２５カラムでさらに精製し、限外ろ過によって濃縮した。分子量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって決定した（Ｃｙ５－Ｄ－ＡＳＯのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦスペクトルによってＤ－ＡＳＯに関する６６００９Ｄａの質量におけるピークが示され；ゲル遅延アッセイを行ってＤ－ＡＳＯコンジュゲートの形成を確認し、それによってＲＮＡラダー（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、遊離ｓｉＲＮＡ、およびＤ－ｓｉＧＦＰを、２μｇの核酸ローディングのためのＧＥＬＲＥＤ（登録商標）染色剤、グリセロール１μＬ、および超純水と混合した；ゲル電気泳動を、ＴＢＥ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を含む３％ＴＢＥ－尿素ゲル中、１２０Ｖで２０分間行い、その後ゲルをＣＨＥＭＩＤＯＣ（登録商標）イメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）においてイメージングした）。さらに、Ｄ－ｓｉＧＦＰの合成の成功をゲル電気泳動で確認した。本明細書において使用するＴＣＯ－Ｔｚクリック反応は高速で定量的であり、毒性を有する副生成物を放出することはない。低い生体分子濃度（５μＭ未満）において、ＴＣＯ－Ｔｚは、歪み促進アルキン－アジド環化付加ＳＰＡＡＣおよびＣｕ（Ｉ）触媒アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡｃｃ）と比較して良好に作用する。ＴＣＯ－Ｔｚ「クリック」反応はＴＣＯとＴｚとの間の逆電子要求性ディールスアルダー反応（ＩＥＤＤＡ）を介して進行し、続いて逆ディールスアルダー反応によってＮ２が除去されてジヒドロピリダジン結合が形成される。通常のディールスアルダー反応とは対照的に、電子ジエンが電子不足の求ジエン体と反応する場合は逆電子要求ディールスアルダー反応において、電子が豊富な求ジエン体は電子不足のジエンと反応する。前駆体としてのＴＣＯはシス－シクロオクテンおよび他の環式アルケンと比較して極めて大きな速度差を与えた。高い反応性は、シス型の「半チェア型」立体配座よりもエネルギーが低い、ＴＣＯによって適応されたクラウン型立体配座と関連する。化学選択的ＴＣＯ－Ｔｚライゲーションは、いずれの他のバイオ直交性ライゲーションペアにも匹敵しない超高速速度論（＞８００Ｍ－１ｓ－１）を有する。クリックライゲーションは中性ｐＨ付近、水性条件、室温で行った。超高速速度論、選択性、および長期水性安定性によって、ＴＣＯ－Ｔｚは低濃度デンドリマー－ＡＳＯカップリング反応における理想的なペアとなる。
【0234】
（実施例２）
ＣＮＳ障害のための標的化された治療薬としてのヒドロキシルＰＡＭＡＭデンドリマー－およびｓｉＲＮＡベースのナノコンジュゲートの開発
材料および方法
生体分子、化学物質、および試薬
特に記載がない限り、反応は、乾燥溶媒を使用して窒素陽圧下火炎乾燥させたガラス容器中で行った。（１）～（９）の化学構造の全ての列挙は図３および４において（１）～（９）で表される化学構造に対応する。
ＣＮＳ障害のための標的化された治療薬としてのヒドロキシルＰＡＭＡＭデンドリマー－およびｓｉＲＮＡベースのナノコンジュゲートの開発
材料および方法
生体分子、化学物質、および試薬
特に記載がない限り、反応は、乾燥溶媒を使用して窒素陽圧下火炎乾燥させたガラス容器中で行った。（１）～（９）の化学構造の全ての列挙は図３および４において（１）～（９）で表される化学構造に対応する。
【0235】
市販グレードの試薬および無水溶媒は、化学物質の供給会社から購入し、さらに精製することなく使用した。１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ．ＨＣｌ）、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、４－（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、γ－（Ｂｏｃ－アミノ）酪酸（Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨ）、無水ジクロロメタン（ＤＣＭ）、Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。シアニン５（Ｃｙ５）－モノ－ＮＨＳエステルはＡｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ－ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。重水素化溶媒ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ－ｄ６）、水（Ｄ２Ｏ）、およびクロロホルム（ＣＤＣｌ３）はＣａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ａｎｄｏｖｅｒ、ＭＡ）から購入した。エチレンジアミンコアポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー、第６．０世代、ヒドロキシ表面（Ｇ６－ＯＨ；診断グレード；２５６個のヒドロキシル末端基からなる）、メタノール溶液（１３．７５％ｗ／ｗ）は、Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈ Ｉｎｃ．（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ、ＵＳＡ）から購入した。透析膜はＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。ＧＦＰ ｓｉＲＮＡ標的化配列５’－Ｓ－Ｓ－ＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣ－３’（配列番号２）、ＧＦＰ ｓｉＲＮＡＣｙ３５’－Ｓ－Ｓ－ＧＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＴＣ－Ｃｙ３－３’（配列番号３）、およびスクランブルＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ）はＤｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）から購入した。ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌ－グルタミンを含む低グルコース）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００、およびストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）はＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。全てのプライマーはＩＤＴから購入した。ＲＮａｓｅ ＩＩＩはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）から購入した。塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）および１，４－ジチオスレイトール（ＤＴＴ）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。
【0236】
機器
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルは、周囲温度でＢｒｕｋｅｒ ５００ＭＨｚ分光計で記録し、ソフトウェアを使用して分析した。１Ｈ ＮＭＲ化学シフトは、内部標準として残留溶媒（ＤＭＳＯ－ｄ６、２．５０）および（Ｄ２Ｏ、４．７９ｐｐｍ）を使用したδとして報告されている。分析用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、可変波長吸光度検出器およびＣ１８逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ、ＢＥＨ３００ ５μｍ、１９×２５０ｍｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－ＡＤ ＨＰＬＣシステムを使用して行った。溶離液は、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器を使用して２１０ｎｍでモニターし、および蛍光標識コンジュゲートは、蛍光およびＰＤＩ検出器を使用して６５０ｎｍと２１０ｎｍの両方でそれぞれモニターした。ＨＰＬＣ溶出は、水（０．１％ＴＦＡを含む）中の０％～９０％ＨＰＬＣグレードアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）の４０分の直線勾配で行い、流量１．０ｍＬ／分を維持した。
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルは、周囲温度でＢｒｕｋｅｒ ５００ＭＨｚ分光計で記録し、ソフトウェアを使用して分析した。１Ｈ ＮＭＲ化学シフトは、内部標準として残留溶媒（ＤＭＳＯ－ｄ６、２．５０）および（Ｄ２Ｏ、４．７９ｐｐｍ）を使用したδとして報告されている。分析用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、可変波長吸光度検出器およびＣ１８逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ、ＢＥＨ３００ ５μｍ、１９×２５０ｍｍ）を備えたＳｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－ＡＤ ＨＰＬＣシステムを使用して行った。溶離液は、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器を使用して２１０ｎｍでモニターし、および蛍光標識コンジュゲートは、蛍光およびＰＤＩ検出器を使用して６５０ｎｍと２１０ｎｍの両方でそれぞれモニターした。ＨＰＬＣ溶出は、水（０．１％ＴＦＡを含む）中の０％～９０％ＨＰＬＣグレードアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）の４０分の直線勾配で行い、流量１．０ｍＬ／分を維持した。
【0237】
Ｄ－ＧＡＢＡＢｏｃ（３）の合成
ＤＭＦ（１２ｍＬ）中のＰＡＭＡＭ Ｇ６－ＯＨ１（１．００ｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）の溶液をＢｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨ（０．０６９ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０７８２ｇ、０．４０８ｍｍｏｌ）で処置し、室温で５分間撹拌した。次いでＥＤＣ．ＨＣＩ（０．０４６ｇ、０．３７４ｍｍｏｌ）を反応混合物に５分かけて分けて加えた。反応混合物を室温で３６時間撹拌した。粗製生成物を３ｋＤ ＭＷカットオフセルロース透析チューブに移し、ＤＭＦに対して１２時間、続いて水に対して２４時間透析した。水性層を凍結し、凍結乾燥して、吸湿性の白色固形物として所望の生成物３を得た（０．９７３ｇ、９５％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） ８．１０－７．７０ （ｍ， 内部アミドＨ）， ６．６０ （ｓ， ＧＡＢＡアミド Ｈ， １０Ｈ）， ４．７４ （ｓ， 表面ＯＨ， ２１３Ｈ）， ３．９９ （ｓ， エステル連結Ｈ， ２２Ｈ） ３．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．４０－３．３５ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， ３．１１ （ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．８９ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， ２．７３－２．６５（ｍ， デンドリマーＣＨ２）， ２．４５（ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．２１（ｍ， デンドリマーＣＨ２）， １．６４－１．５９ （ｍ， ＧＡＢＡリンカー－ＣＨ２， ２５Ｈ）， １．３６ （ｓ， Ｂｏｃ基， ８５Ｈ）．ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間１９分。
ＤＭＦ（１２ｍＬ）中のＰＡＭＡＭ Ｇ６－ＯＨ１（１．００ｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）の溶液をＢｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨ（０．０６９ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０７８２ｇ、０．４０８ｍｍｏｌ）で処置し、室温で５分間撹拌した。次いでＥＤＣ．ＨＣＩ（０．０４６ｇ、０．３７４ｍｍｏｌ）を反応混合物に５分かけて分けて加えた。反応混合物を室温で３６時間撹拌した。粗製生成物を３ｋＤ ＭＷカットオフセルロース透析チューブに移し、ＤＭＦに対して１２時間、続いて水に対して２４時間透析した。水性層を凍結し、凍結乾燥して、吸湿性の白色固形物として所望の生成物３を得た（０．９７３ｇ、９５％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） ８．１０－７．７０ （ｍ， 内部アミドＨ）， ６．６０ （ｓ， ＧＡＢＡアミド Ｈ， １０Ｈ）， ４．７４ （ｓ， 表面ＯＨ， ２１３Ｈ）， ３．９９ （ｓ， エステル連結Ｈ， ２２Ｈ） ３．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．４０－３．３５ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， ３．１１ （ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．８９ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， ２．７３－２．６５（ｍ， デンドリマーＣＨ２）， ２．４５（ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．２１（ｍ， デンドリマーＣＨ２）， １．６４－１．５９ （ｍ， ＧＡＢＡリンカー－ＣＨ２， ２５Ｈ）， １．３６ （ｓ， Ｂｏｃ基， ８５Ｈ）．ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間１９分。
【0238】
Ｄ－ＧＡＢＡ－ＮＨ２（４）の合成
ＰＡＭＡＭ Ｇ６－ＯＨ３（２５０ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）を含むＢｏｃ保護ＧＡＢＡリンカーをＴＦＡ／ＤＣＭ（３：４）溶媒混合物で処置した。反応物を室温で１２時間撹拌し、次いでメタノールで希釈し、真空中で濃縮した（このステップは、過剰なＴＦＡを除去し、ＧＡＢＡリンカーを加水分解切断するために必要である）。粗製生成物を使用して、さらなる精製を一切行わずに次のステップを行った。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．５０－７．７５ （ｍ， 内部アミドＨ）， ５．５０－４．５０ （ブロードなｓ， 表面－ＯＨ）， ４．００ （ｓ， エステル連結Ｈ）， ３．５０－２．２５（ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， １．９３－１．５９ （ｍ， ＧＡＢＡリンカー－ＣＨ２）．
ＰＡＭＡＭ Ｇ６－ＯＨ３（２５０ｍｇ、０．００４ｍｍｏｌ）を含むＢｏｃ保護ＧＡＢＡリンカーをＴＦＡ／ＤＣＭ（３：４）溶媒混合物で処置した。反応物を室温で１２時間撹拌し、次いでメタノールで希釈し、真空中で濃縮した（このステップは、過剰なＴＦＡを除去し、ＧＡＢＡリンカーを加水分解切断するために必要である）。粗製生成物を使用して、さらなる精製を一切行わずに次のステップを行った。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．５０－７．７５ （ｍ， 内部アミドＨ）， ５．５０－４．５０ （ブロードなｓ， 表面－ＯＨ）， ４．００ （ｓ， エステル連結Ｈ）， ３．５０－２．２５（ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， １．９３－１．５９ （ｍ， ＧＡＢＡリンカー－ＣＨ２）．
【0239】
Ｃｙ５－Ｄ（５）の合成
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物４（２８７ｍｇ、０．００４８ｍｍｏｌ）の溶液をＤＩＰＥＡで処置して、反応混合物のｐＨを調整した（約７．０～７．５）。次いで反応物をＣｙ５－ＮＨＳエステル（８．７ｍｇ、０．０１１５ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）で処置し、室温で１２時間撹拌した。次いでそれをＤＭＦに対して１２時間、続いて水に対して２４時間透析した。水性層を凍結し、凍結乾燥して、所望の生成物５を青色固形物として得た（収率８５％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．２５－７．７５ （ｍ， 内部アミドＨ）， ７．３０ （ｓ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．１０ （ｓ Ｃｙ５ Ｈ）， ６．７０ （ｓ， ＧＡＢＡアミド Ｈ）， ６．５０ （ｍ Ｃｙ５ Ｈ）， ６．２５ （ｍ Ｃｙ５ Ｈ）， ４．７５ （ｓ， 表面ＯＨ， ２２６Ｈ）， ４．００ （ｍ， エステルＣＨ２）， ３．５０－２．００ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， １．６４－１．５９ （ｓ， ３１Ｈ）， １．２５ （ｓ， ６６Ｈ）， ０．８ （ｓ， ２１Ｈ）．ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間（０．１％ＴＦＡを含む水中のアセトニトリル、直線勾配、４０分）。ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間：１７．５分。
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物４（２８７ｍｇ、０．００４８ｍｍｏｌ）の溶液をＤＩＰＥＡで処置して、反応混合物のｐＨを調整した（約７．０～７．５）。次いで反応物をＣｙ５－ＮＨＳエステル（８．７ｍｇ、０．０１１５ｍｍｏｌ、１．２ｅｑ）で処置し、室温で１２時間撹拌した。次いでそれをＤＭＦに対して１２時間、続いて水に対して２４時間透析した。水性層を凍結し、凍結乾燥して、所望の生成物５を青色固形物として得た（収率８５％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．２５－７．７５ （ｍ， 内部アミドＨ）， ７．３０ （ｓ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．１０ （ｓ Ｃｙ５ Ｈ）， ６．７０ （ｓ， ＧＡＢＡアミド Ｈ）， ６．５０ （ｍ Ｃｙ５ Ｈ）， ６．２５ （ｍ Ｃｙ５ Ｈ）， ４．７５ （ｓ， 表面ＯＨ， ２２６Ｈ）， ４．００ （ｍ， エステルＣＨ２）， ３．５０－２．００ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， １．６４－１．５９ （ｓ， ３１Ｈ）， １．２５ （ｓ， ６６Ｈ）， ０．８ （ｓ， ２１Ｈ）．ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間（０．１％ＴＦＡを含む水中のアセトニトリル、直線勾配、４０分）。ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間：１７．５分。
【0240】
Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ（６）の合成
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物５（２５０ｍｇ、０．００４１ｍｍｏｌ）の溶液をＤＩＰＥＡで処置して、反応混合物のｐＨを調整した（約７．０～７．５）。反応物をＳＰＤＰ－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル（１１ｍｇ、０．００２０ｍｍｏｌ）で処置し、反応混合物を室温で１２時間撹拌した。次いでそれをＤＭＦに対して１２時間、続いて水に対して２４時間透析した。水性層を凍結し、凍結乾燥して、所望の生成物を青色固形物として得た（収率８０％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．２５－７．７５ （ｍ， 内部アミドＨ）， ７．３５ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．２５ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．０５ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ６．６ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ６．３ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ６．８３ （ｓ， ＧＡＢＡアミド Ｈ）， ４．７４ （ｓ， 表面ＯＨ， Ｈ）， ４．０１－３．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， エステル－ＣＨ２）， ３．５０－２．００ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， １．９ （ｓ， ２４Ｈ）， １．６ （ｓ， ８０Ｈ）， １．２ （ｓ， １２６Ｈ）， ０．８ （ｓ， ８０Ｈ）．ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間：１９．５分。
ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物５（２５０ｍｇ、０．００４１ｍｍｏｌ）の溶液をＤＩＰＥＡで処置して、反応混合物のｐＨを調整した（約７．０～７．５）。反応物をＳＰＤＰ－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル（１１ｍｇ、０．００２０ｍｍｏｌ）で処置し、反応混合物を室温で１２時間撹拌した。次いでそれをＤＭＦに対して１２時間、続いて水に対して２４時間透析した。水性層を凍結し、凍結乾燥して、所望の生成物を青色固形物として得た（収率８０％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．２５－７．７５ （ｍ， 内部アミドＨ）， ７．３５ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．２５ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．０５ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ６．６ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ６．３ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ６．８３ （ｓ， ＧＡＢＡアミド Ｈ）， ４．７４ （ｓ， 表面ＯＨ， Ｈ）， ４．０１－３．３９ （ｔ， Ｊ ＝ ５．０ Ｈｚ， エステル－ＣＨ２）， ３．５０－２．００ （ｍ， デンドリマーＣＨ２）， １．９ （ｓ， ２４Ｈ）， １．６ （ｓ， ８０Ｈ）， １．２ （ｓ， １２６Ｈ）， ０．８ （ｓ， ８０Ｈ）．ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間：１９．５分。
【0241】
チオール修飾ｓｉＲＮＡの還元
１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．３～８．５中のＤＴＴの１００ｍＭ溶液を、緩衝液５ｍＬ中にＤＴＴ７７．１３ｍｇを溶解することによって調製した。チオール修飾ｓｉＲＮＡ７をＤＴＴ溶液１２５μＬ中に溶解し、室温で１時間インキュベートした。副産物の除去は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＮＡＰ－１０カラムＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－２５ ＤＮＡグレード（ＣＡＳ番号２６８２－２０－４）を使用して行った。ＮＡＰ－１０カラムは、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、約１５ｍＬを用いて平衡化した。チオール修飾ｓｉＲＮＡは、リン酸ナトリウム緩衝液０．５ｍＬを使用してＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、ＵＬＴＲＡＣＥＬ（登録商標）１０Ｋフィルター（ＵＦＣ５０１０２４）に溶出した。
１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．３～８．５中のＤＴＴの１００ｍＭ溶液を、緩衝液５ｍＬ中にＤＴＴ７７．１３ｍｇを溶解することによって調製した。チオール修飾ｓｉＲＮＡ７をＤＴＴ溶液１２５μＬ中に溶解し、室温で１時間インキュベートした。副産物の除去は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＮＡＰ－１０カラムＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－２５ ＤＮＡグレード（ＣＡＳ番号２６８２－２０－４）を使用して行った。ＮＡＰ－１０カラムは、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、約１５ｍＬを用いて平衡化した。チオール修飾ｓｉＲＮＡは、リン酸ナトリウム緩衝液０．５ｍＬを使用してＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、ＵＬＴＲＡＣＥＬ（登録商標）１０Ｋフィルター（ＵＦＣ５０１０２４）に溶出した。
【0242】
Ｄ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの合成
２００μＬ中の化合物６（２．４ｍｇ、３７．５ｎｍｏｌ、０．５ｅｑ）の溶液を、２００μＬ中のｓｉＧＦＰ－ＳＨ ８（７５ｎｍｏｌ、１．０ｅｑ）で処置し、反応混合物を室温で撹拌した。１２時間後、混合物をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－２５カラムに通し、Ｄ－ｓｉＧＦＰ ９生成物を収集した。生成物を濃縮し、容量０．５ｍＬの３０ＫＤａ ＭＷＣＯフィルターユニットを使用した遠心限外ろ過によってＰＢＳに対して緩衝液交換を行った。ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間１８．５分。
２００μＬ中の化合物６（２．４ｍｇ、３７．５ｎｍｏｌ、０．５ｅｑ）の溶液を、２００μＬ中のｓｉＧＦＰ－ＳＨ ８（７５ｎｍｏｌ、１．０ｅｑ）で処置し、反応混合物を室温で撹拌した。１２時間後、混合物をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－２５カラムに通し、Ｄ－ｓｉＧＦＰ ９生成物を収集した。生成物を濃縮し、容量０．５ｍＬの３０ＫＤａ ＭＷＣＯフィルターユニットを使用した遠心限外ろ過によってＰＢＳに対して緩衝液交換を行った。ＨＰＬＣ Ｃ１８保持時間１８．５分。
【0243】
限外ろ過およびＳＥＣクロマトグラフィー
合成および緩衝液交換の各ステップ後の過剰な試薬および副生成物の除去を、ＭＷＣＯ ３０ｋＤａまたは１００ｋＤａを備えた０．５ｍＬ ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）ろ過ユニットを使用した超遠心ろ過によって行った。生成物および中間体を、移動相としてＰＢＳを使用したサイズ排除カラム（ＳＥＣ）クロマトグラフィーによってさらに精製した。
合成および緩衝液交換の各ステップ後の過剰な試薬および副生成物の除去を、ＭＷＣＯ ３０ｋＤａまたは１００ｋＤａを備えた０．５ｍＬ ＡＭＩＣＯＮ（登録商標）ろ過ユニットを使用した超遠心ろ過によって行った。生成物および中間体を、移動相としてＰＢＳを使用したサイズ排除カラム（ＳＥＣ）クロマトグラフィーによってさらに精製した。
【0244】
ＰＡＭＡＭデンドリマーコンジュゲート
ＭＡＬＤＩマトリックス２’，４’，６’－トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（ＴＨＡＰ）（１０ｍｇ）を、０．１％トリフルオロ酢酸を含む、水中のアセトニトリル（１：１）１ｍＬ中に溶解した。次いでＰＡＭＡＭデンドリマー２μＬをＭＡＬＤＩ試料プレート上に沈着させた。マトリックス（１０ｍｇ／ｍＬ、２μＬ）を空気乾燥済み試料上に沈着させ、１０～２０分間空気乾燥させた。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析を反射ポジティブモードで行った。
ＭＡＬＤＩマトリックス２’，４’，６’－トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（ＴＨＡＰ）（１０ｍｇ）を、０．１％トリフルオロ酢酸を含む、水中のアセトニトリル（１：１）１ｍＬ中に溶解した。次いでＰＡＭＡＭデンドリマー２μＬをＭＡＬＤＩ試料プレート上に沈着させた。マトリックス（１０ｍｇ／ｍＬ、２μＬ）を空気乾燥済み試料上に沈着させ、１０～２０分間空気乾燥させた。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析を反射ポジティブモードで行った。
【0245】
オリゴヌクレオチドコンジュゲート
３－ヒドロキシピコリン酸（３－ＨＰＡ）およびクエン酸水素二アンモニウム（ＤＡＨＣ）を含むマトリックスを使用してオリゴヌクレオチド分析を行った。３－ＨＰＡの溶液（５０ｍｇ／ｍＬ、５０％アセトニトリル／水中）をＤＡＨＣ溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）と９：１の比率（３－ＨＰＡ２２５μＬ：ＤＡＨＣ２５μＬ）で混合して、１０ｍｇ／ｍＬの最終ＤＡＨＣ濃度を得た。ｓｉＲＮＡ溶液を脱塩してからマトリックスと混合し、ｓｉＲＮＡ２μＬをプレート上に沈着させ、１０～２０分間空気乾燥させた。次いでＨＰＡ／ＤＡＨＣマトリックスを空気乾燥済みのオリゴヌクレオチド上に沈着させ、空気乾燥させた。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析を線形陽イオンモードで動作するＢｒｕｋｅｒ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ－ＳＴＲ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｃｏｒｅ、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）で行った。
３－ヒドロキシピコリン酸（３－ＨＰＡ）およびクエン酸水素二アンモニウム（ＤＡＨＣ）を含むマトリックスを使用してオリゴヌクレオチド分析を行った。３－ＨＰＡの溶液（５０ｍｇ／ｍＬ、５０％アセトニトリル／水中）をＤＡＨＣ溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）と９：１の比率（３－ＨＰＡ２２５μＬ：ＤＡＨＣ２５μＬ）で混合して、１０ｍｇ／ｍＬの最終ＤＡＨＣ濃度を得た。ｓｉＲＮＡ溶液を脱塩してからマトリックスと混合し、ｓｉＲＮＡ２μＬをプレート上に沈着させ、１０～２０分間空気乾燥させた。次いでＨＰＡ／ＤＡＨＣマトリックスを空気乾燥済みのオリゴヌクレオチド上に沈着させ、空気乾燥させた。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ分析を線形陽イオンモードで動作するＢｒｕｋｅｒ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ－ＳＴＲ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｃｏｒｅ、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）で行った。
【0246】
ゲル電気泳動
ゲル遅延アッセイを行って、Ｄ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの形成を確認した。ＲＮＡラダー（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、遊離ｓｉＲＮＡ、およびＤ－ｓｉＧＦＰを、２μｇの核酸ローディングのためのＧｅｌＲｅｄ染色剤、グリセロール１μＬ、および超純水と混合した。ゲル電気泳動を、ＴＢＥ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を含む１０％ＴＢＥ－尿素ゲル中、１２０Ｖで２０分間行い、その後ゲルを、ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）においてイメージングした。デンドリマーを可視化するための別個の遅延アッセイを、４～１５％ＴＧＸ染色剤不含ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で行った。
ゲル遅延アッセイを行って、Ｄ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの形成を確認した。ＲＮＡラダー（ＮＥＢ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、遊離ｓｉＲＮＡ、およびＤ－ｓｉＧＦＰを、２μｇの核酸ローディングのためのＧｅｌＲｅｄ染色剤、グリセロール１μＬ、および超純水と混合した。ゲル電気泳動を、ＴＢＥ緩衝液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を含む１０％ＴＢＥ－尿素ゲル中、１２０Ｖで２０分間行い、その後ゲルを、ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）においてイメージングした。デンドリマーを可視化するための別個の遅延アッセイを、４～１５％ＴＧＸ染色剤不含ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で行った。
【0247】
デンドリマー－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの血清安定性
ＲＮａｓｅ ＩＩＩを製造業者のプロトコールに従って使用して、還元条件下で安定性研究を行った。非還元条件を用いた研究は、溶媒交換によって得られたＲＮａｓｅ ＩＩＩを用いて行った。ＲＮａｓｅ ＩＩＩ １００単位を、ＤＴＴを含んでいない等体積の反応緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で希釈し、１０ｋＤａの遠心フィルターで抽出した。プロセスを３回繰り返して残留ＤＴＴの除去が完了するのを確実にした。
ＲＮａｓｅ ＩＩＩを製造業者のプロトコールに従って使用して、還元条件下で安定性研究を行った。非還元条件を用いた研究は、溶媒交換によって得られたＲＮａｓｅ ＩＩＩを用いて行った。ＲＮａｓｅ ＩＩＩ １００単位を、ＤＴＴを含んでいない等体積の反応緩衝液（５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で希釈し、１０ｋＤａの遠心フィルターで抽出した。プロセスを３回繰り返して残留ＤＴＴの除去が完了するのを確実にした。
【0248】
還元および非還元安定性研究において、遊離ｓｉＧＦＰおよびＤ－ｓｉＧＦＰ１０μｇをＲＮａｓｅ ＩＩＩ ２０単位で処置し、３７℃で保存した。試料を設定した時点で採取し、ただちに凍結し、さらなる分析まで－２０℃で保存した。ゲル遅延アッセイを１０％ＴＢＥ－尿素ゲルにおいて行って、ＲＮＡ安定性を決定した。
【0249】
細胞系
ＧＦＰｄ２発現ヒト胚性腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞系はＧｒｅｅｎ Ｌａｂ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ＮａｎｏＢｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、およびＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって寛大にも提供された。細胞は、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）が添加されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中で培養した。細胞培地をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で置き換えてトランスフェクト研究を行った。細胞は加湿雰囲気下、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
ＧＦＰｄ２発現ヒト胚性腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞系はＧｒｅｅｎ Ｌａｂ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ ＮａｎｏＢｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、およびＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）によって寛大にも提供された。細胞は、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）が添加されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中で培養した。細胞培地をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で置き換えてトランスフェクト研究を行った。細胞は加湿雰囲気下、３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
【0250】
ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍接種のために使用したＧＬ２６１ネズミ神経膠腫細胞系を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、および１％Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）が添加されたＲＰＭＩ １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中で培養した。
【0251】
送達戦略のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
時間依存的取り込みの研究
ＧＦＰ発現ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞をガラス底培養皿中に播種し、２４～４８時間成長させて７０～８０％のコンフルエンシーとした。細胞を、１％Ｐ／Ｓ（血清不含培地）が添加されたＤＭＥＭ中、Ｃｙ５蛍光標識デンドリマー（Ｃｙ５－Ｄ）およびｓｉＧＦＰコンジュゲートＣｙ５標識デンドリマー（Ｃｙ５－Ｄ－ｓｉＧＦＰ、９）で処置した。次いで、細胞をＰＢＳ（×３）で洗浄し、５％ホルマリン溶液中で固定した。細胞をインキュベートし、共焦点顕微鏡イメージをＬＳＭ ５１０－Ｍｅｔａ共焦点モジュールを備えたＺＥＩＳＳ ＡＸＩＯＶＥＲＴ（登録商標）２００システムによって撮影した。イメージ取得パラメーターは、イメージング中は一定を維持した。イメージはＺｅｎ ２０１１ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）によって処理した。
時間依存的取り込みの研究
ＧＦＰ発現ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞をガラス底培養皿中に播種し、２４～４８時間成長させて７０～８０％のコンフルエンシーとした。細胞を、１％Ｐ／Ｓ（血清不含培地）が添加されたＤＭＥＭ中、Ｃｙ５蛍光標識デンドリマー（Ｃｙ５－Ｄ）およびｓｉＧＦＰコンジュゲートＣｙ５標識デンドリマー（Ｃｙ５－Ｄ－ｓｉＧＦＰ、９）で処置した。次いで、細胞をＰＢＳ（×３）で洗浄し、５％ホルマリン溶液中で固定した。細胞をインキュベートし、共焦点顕微鏡イメージをＬＳＭ ５１０－Ｍｅｔａ共焦点モジュールを備えたＺＥＩＳＳ ＡＸＩＯＶＥＲＴ（登録商標）２００システムによって撮影した。イメージ取得パラメーターは、イメージング中は一定を維持した。イメージはＺｅｎ ２０１１ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）によって処理した。
【0252】
イメージ分析
生存細胞イメージを、ＺＥＩＳＳ ＡＸＩＯＶＥＲＴ（登録商標）２００位相差顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で設定した時点において撮影した。イメージに関する閾値は、ＩｍａｇｅＪにおいて組み込まれたＴｒｉａｎｇｌｅ法で自動化し、閾値オブジェクトを使用して平均蛍光およびバックグラウンドを計算した。自動細胞計数は、閾値マスクに対する「Ａｎａｌｙｚｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」機能を使用して行い、細胞コンフルエンシーはＰＨＡＮＴＡＳＴ－ＦＩＪＩ（登録商標）プラグインで推測した。
生存細胞イメージを、ＺＥＩＳＳ ＡＸＩＯＶＥＲＴ（登録商標）２００位相差顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で設定した時点において撮影した。イメージに関する閾値は、ＩｍａｇｅＪにおいて組み込まれたＴｒｉａｎｇｌｅ法で自動化し、閾値オブジェクトを使用して平均蛍光およびバックグラウンドを計算した。自動細胞計数は、閾値マスクに対する「Ａｎａｌｙｚｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」機能を使用して行い、細胞コンフルエンシーはＰＨＡＮＴＡＳＴ－ＦＩＪＩ（登録商標）プラグインで推測した。
【0253】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞トランスフェクション
細胞を、１ウェルあたり５×１０４細胞の密度で２４ウェル組織培養プレート中に播種し、２４時間成長させた。異なるＲＮＡ送達プラットフォーム（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００、ＲＮＡｉ Ｍａｘ）を製造業者のプロトコールに従って調製した。処置の前に、細胞培養培地をＯｐｔｉ－ＭＥＭ低血清培地で置き換えた。各送達ビヒクルに関する条件を最適化するために、ｓｉＧＦＰペイロード濃度（０．６～３０ｐＭｏｌ）とＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）またはＲＮＡｉ Ｍａｘ濃度（０．５～１．５μＬ）との組合せで試験を行った。最も高いノックダウンを伴うセットを、デンドリマープラットフォームとの比較のために使用した。
細胞を、１ウェルあたり５×１０４細胞の密度で２４ウェル組織培養プレート中に播種し、２４時間成長させた。異なるＲＮＡ送達プラットフォーム（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００、ＲＮＡｉ Ｍａｘ）を製造業者のプロトコールに従って調製した。処置の前に、細胞培養培地をＯｐｔｉ－ＭＥＭ低血清培地で置き換えた。各送達ビヒクルに関する条件を最適化するために、ｓｉＧＦＰペイロード濃度（０．６～３０ｐＭｏｌ）とＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）またはＲＮＡｉ Ｍａｘ濃度（０．５～１．５μＬ）との組合せで試験を行った。最も高いノックダウンを伴うセットを、デンドリマープラットフォームとの比較のために使用した。
【0254】
用量依存的研究に関しては、細胞を異なる濃度のＤ－ｓｉＧＦＰで４８時間にわたって処置した。ＧＦＰｄ２蛍光のノックダウンを、処置してから０時間、２４時間、および４８時間後に撮影した生存細胞イメージによって評価した。細胞タンパク質も４８時間目で抽出し、ウエスタンブロットのために－８０℃で保存した。
【0255】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウエスタンブロットアッセイ
細胞タンパク質の濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて決定し、等量のタンパク質を、標準的なウエスタンブロットプロトコールに従って、２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で変性させた。タンパク質を４～１５％ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で分離し、ニトロセルロース膜に転写した。膜を３％ＢＳＡで１時間ブロックし、シクロフィリンＢおよびＧＦＰに関して４℃で一晩プローブした。膜を３回洗浄してからＨＲＰコンジュゲート二次抗体とともに１．５時間インキュベートした。タンパク質バンドを、染色した膜を化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中に浸漬することによって可視化し、ＣｈｅｍｉＤｏｃシステムを使用してイメージングした。
細胞タンパク質の濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて決定し、等量のタンパク質を、標準的なウエスタンブロットプロトコールに従って、２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で変性させた。タンパク質を４～１５％ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で分離し、ニトロセルロース膜に転写した。膜を３％ＢＳＡで１時間ブロックし、シクロフィリンＢおよびＧＦＰに関して４℃で一晩プローブした。膜を３回洗浄してからＨＲＰコンジュゲート二次抗体とともに１．５時間インキュベートした。タンパク質バンドを、染色した膜を化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）中に浸漬することによって可視化し、ＣｈｅｍｉＤｏｃシステムを使用してイメージングした。
【0256】
送達戦略のｉｎ ｖｉｖｏ評価
同所性ＧＬ２６１神経膠芽腫マウスモデル
全ての動物手順をＪｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたとおりに行った。ＣＸ３ＣＲ－１ＧＦＰマウスを一定の温度および湿度（２０±１℃、湿度５０±５％）で飼育した。全ての手順に関して、生理食塩水中の２．５％キシラジン（ＶｅｔＯｎｅ、Ｂｏｉｓｅ、ＭＯ）、２５％ケタミン（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）、および１４．２％エタノール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のカクテルを含む腹腔内注射によって動物に麻酔をかけた。ＧＬ２６１細胞を５０，０００細胞／μＬの濃度で収集してからただちに接種し、外科手術中は氷上で維持した。頭皮を切開し、マイクロドリル（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、ＭＡ）を使用してブレグマに対して１ｍｍ後方および中心線に対して１．５ｍｍ外側の頭蓋骨に穴を開けた。ＧＬ２６１細胞を、動物１匹あたり細胞懸濁物２μＬに関して０．２μＬ／分の速度で２μＬのシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）を使用して開口部を通して接種した。切開部を縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）で閉じ、抗生物質軟膏を適用した。
同所性ＧＬ２６１神経膠芽腫マウスモデル
全ての動物手順をＪｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたとおりに行った。ＣＸ３ＣＲ－１ＧＦＰマウスを一定の温度および湿度（２０±１℃、湿度５０±５％）で飼育した。全ての手順に関して、生理食塩水中の２．５％キシラジン（ＶｅｔＯｎｅ、Ｂｏｉｓｅ、ＭＯ）、２５％ケタミン（Ｈｅｎｒｙ Ｓｃｈｅｉｎ、Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）、および１４．２％エタノール（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）のカクテルを含む腹腔内注射によって動物に麻酔をかけた。ＧＬ２６１細胞を５０，０００細胞／μＬの濃度で収集してからただちに接種し、外科手術中は氷上で維持した。頭皮を切開し、マイクロドリル（Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ、ＭＡ）を使用してブレグマに対して１ｍｍ後方および中心線に対して１．５ｍｍ外側の頭蓋骨に穴を開けた。ＧＬ２６１細胞を、動物１匹あたり細胞懸濁物２μＬに関して０．２μＬ／分の速度で２μＬのシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ、ＮＶ）を使用して開口部を通して接種した。切開部を縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）で閉じ、抗生物質軟膏を適用した。
【0257】
Ｄ－ｓｃＲＮＡおよびＤ－ｓｉＧＦＰコンジュゲートの投与
接種してから２週間後、切開部を再度開き、動物に、核酸ベースで２μｇのＤ－ｓｃＲＮＡ、Ｄ－ｓｉＧＦＰまたは遊離ｓｉＧＦＰの腫瘍内注射を行った。取り込みおよび有効性を決定するために、動物に、２４時間および４８時間の時点においてイソフルランで麻酔をかけ、ＰＢＳの心臓灌流で安楽死させた。
接種してから２週間後、切開部を再度開き、動物に、核酸ベースで２μｇのＤ－ｓｃＲＮＡ、Ｄ－ｓｉＧＦＰまたは遊離ｓｉＧＦＰの腫瘍内注射を行った。取り込みおよび有効性を決定するために、動物に、２４時間および４８時間の時点においてイソフルランで麻酔をかけ、ＰＢＳの心臓灌流で安楽死させた。
【0258】
免疫組織化学および光学イメージング
摘出した脳をただちに４％パラホルムアルデヒド中で固定し、４℃で一晩保存し、スクロース勾配を行ってから凍結切開を行った。臓器をＬｅｉｃａ ＣＭ １９０５クライオスタットで処理して３０ｍｍの厚さの軸方向切片を得た。各スライドをＤＡＰＩ（核）で染色し、共焦点ＬＳＭ ７１０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ；Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ）でイメージングした。未染色および未処置の対照脳を較正において使用してバックグラウンド蛍光を回避し、設定は研究全体にわたって変更することなく使用した。腫瘍と対応する対側脳半球の両方をイメージングして分析を行い、対側脳半球は内部対照としての役割を果たした。
摘出した脳をただちに４％パラホルムアルデヒド中で固定し、４℃で一晩保存し、スクロース勾配を行ってから凍結切開を行った。臓器をＬｅｉｃａ ＣＭ １９０５クライオスタットで処理して３０ｍｍの厚さの軸方向切片を得た。各スライドをＤＡＰＩ（核）で染色し、共焦点ＬＳＭ ７１０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ；Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ）でイメージングした。未染色および未処置の対照脳を較正において使用してバックグラウンド蛍光を回避し、設定は研究全体にわたって変更することなく使用した。腫瘍と対応する対側脳半球の両方をイメージングして分析を行い、対側脳半球は内部対照としての役割を果たした。
【0259】
統計分析
データは平均±ＳＥＭとして表され、分析はＥｘｃｅｌ ２０１３およびＧｒａｐｈＰａｄプリズム（バージョン６：Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）で行った。処置群は、時点または用量にわたって、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定によって分析した。単一群間の有意差は、スチューデントのｔ検定で決定した：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
データは平均±ＳＥＭとして表され、分析はＥｘｃｅｌ ２０１３およびＧｒａｐｈＰａｄプリズム（バージョン６：Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）で行った。処置群は、時点または用量にわたって、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定によって分析した。単一群間の有意差は、スチューデントのｔ検定で決定した：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【0260】
結果
Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰの合成および特徴付け：Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰコンジュゲートは、２５６個の末端ヒドロキシル基から構成されるＰＡＭＡＭ－Ｇ６－ＯＨ（Ｄ６－ＯＨ）デンドリマーを使用して合成した（図３）。各合成ステップ後、生成物は、ＤＭＦ中で透析を介して２４時間精製して小分子不純物が除去され、続いて水透析を行ってＤＭＦが除去された。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６中）で中間体と最終的なコンジュゲートとを上から下に比較し、分析ＨＰＬＣトレースによってピークの出現および消失による生成物の形成を確認し、保持時間におけるシフトがそれぞれで示された。全ての中間体および最終構成要素の分子量は、ＰＡＭＡＭ－Ｇ６－ＯＨ、Ｃｙ５－Ｄ、およびＣｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰのＭＡＬＤＩ－スペクトルによって決定し；合成の各ステップにおけるコンジュゲーションの程度は１Ｈ－ＮＭＲに基づいて計算し、分子量の変化はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって測定した。化合物１の合成は、メタノール中の市販されているＤ６－ＯＨ（１３．７５％ｗ／ｗ）から出発し、減圧下で乾燥させ、続いて水中に溶解し、凍結乾燥して行った。デンドリマー中の微量のメタノールおよび水はカップリングステップに干渉するため、完全に除去した。凍結乾燥された単機能性Ｄ６－ＯＨは、最初にＤＭＦ中のＥＤＣ．ＨＣｌおよび４－ＤＭＡＰの下、室温で３６時間Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨで処置することによってＢｏｃ保護アミンで機能化して、生成物であるＢｏｃ保護二機能性デンドリマーを得た。反応の完了は、ＨＰＬＣでモニターし、残渣を超純水に対して３．５ｋＤａ膜により２４時間透析して、半透性の透析膜を通過する選択的拡散を介して低分子量不純物を除去した。デンドリマー（３）の１Ｈ ＮＭＲによって、シングレットとしてδ１．３ｐｐｍにおいてＢｏｃ基のｔｅｒｔ－ブチルプロトンおよびδ１．６ｐｐｍにおいてＧＡＢＡメチレンプロトンの出現が示された。δ３．９ｐｐｍにおけるピークは、一度エステルに変換されたヒドロキシル基の隣のデンドリマーのメチレンプロトンに関するものであり、ＧＡＢＡリンカーからのアミドプロトンもδ６．８ｐｐｍにおいて出現した。次いで、Ｂｏｃ基を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１：４）を使用して弱酸性条件下で脱保護して二機能性デンドリマー（４）を得た。過剰なＴＦＡをメタノールとの共蒸発によって除去し、得られた粗製生成物を使用してさらに精製することなく次のステップを行った。Ｂｏｃプロトンの完全な消失を１Ｈ ＮＭＲによって確認し、同時にエステル加水分解はこの条件下では観察されなかった。アミン基の総数は約１０で維持された。次いで二機能性デンドリマーを蛍光染料Ｃｙ５で処置して、デンドリマー表面において約１～２個のＣｙ５結合が成功したデンドリマー４を得た。１Ｈ ＮＭＲによって芳香族領域におけるＣｙ５シグナルの出現が示され（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６、５００ＭＨｚ）により、デンドリマーコンジュゲート、Ｄ－ＧＡＢＡ－Ｂｏｃ、Ｄ－ＧＡＢＡ－ＮＨ２、Ｃｙ５－Ｄ、Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ（ＤＭＳＯ－ｄ６およびＤ２Ｏ中）が特徴付けられて、特徴的なシグナルの出現または消失が示される）、ＨＰＬＣ保持時間は１９．０から１７．５分にシフトし、生成物の形成が確認された。Ｃｙ５結合後、アミン基の残りはヘテロ二機能性３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル（ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ）リンカーと反応させた。このヘテロ二機能性リンカーを使用して、ｓｉＲＮＡ－ＳＨによる古典的チオール－ジスルフィド交換を介してデンドリマーとｓｉＲＮＡとの間のジスルフィド還元感受性リンカーを形成した。この結合は血清中で比較的安定であり、還元的な細胞質環境において切断可能である。分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行って生成物の純度を測定した。構成要素のサイズを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用した動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。水中のＤ－ＯＨとＤ－ｓｉＲＮＡの両方の平均流体力学的直径は約６ｎｍであり、修飾後に有意な変化は示さなかった。
Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰの合成および特徴付け：Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰコンジュゲートは、２５６個の末端ヒドロキシル基から構成されるＰＡＭＡＭ－Ｇ６－ＯＨ（Ｄ６－ＯＨ）デンドリマーを使用して合成した（図３）。各合成ステップ後、生成物は、ＤＭＦ中で透析を介して２４時間精製して小分子不純物が除去され、続いて水透析を行ってＤＭＦが除去された。１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６中）で中間体と最終的なコンジュゲートとを上から下に比較し、分析ＨＰＬＣトレースによってピークの出現および消失による生成物の形成を確認し、保持時間におけるシフトがそれぞれで示された。全ての中間体および最終構成要素の分子量は、ＰＡＭＡＭ－Ｇ６－ＯＨ、Ｃｙ５－Ｄ、およびＣｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰのＭＡＬＤＩ－スペクトルによって決定し；合成の各ステップにおけるコンジュゲーションの程度は１Ｈ－ＮＭＲに基づいて計算し、分子量の変化はＭＡＬＤＩ－ＴＯＦによって測定した。化合物１の合成は、メタノール中の市販されているＤ６－ＯＨ（１３．７５％ｗ／ｗ）から出発し、減圧下で乾燥させ、続いて水中に溶解し、凍結乾燥して行った。デンドリマー中の微量のメタノールおよび水はカップリングステップに干渉するため、完全に除去した。凍結乾燥された単機能性Ｄ６－ＯＨは、最初にＤＭＦ中のＥＤＣ．ＨＣｌおよび４－ＤＭＡＰの下、室温で３６時間Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨで処置することによってＢｏｃ保護アミンで機能化して、生成物であるＢｏｃ保護二機能性デンドリマーを得た。反応の完了は、ＨＰＬＣでモニターし、残渣を超純水に対して３．５ｋＤａ膜により２４時間透析して、半透性の透析膜を通過する選択的拡散を介して低分子量不純物を除去した。デンドリマー（３）の１Ｈ ＮＭＲによって、シングレットとしてδ１．３ｐｐｍにおいてＢｏｃ基のｔｅｒｔ－ブチルプロトンおよびδ１．６ｐｐｍにおいてＧＡＢＡメチレンプロトンの出現が示された。δ３．９ｐｐｍにおけるピークは、一度エステルに変換されたヒドロキシル基の隣のデンドリマーのメチレンプロトンに関するものであり、ＧＡＢＡリンカーからのアミドプロトンもδ６．８ｐｐｍにおいて出現した。次いで、Ｂｏｃ基を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１：４）を使用して弱酸性条件下で脱保護して二機能性デンドリマー（４）を得た。過剰なＴＦＡをメタノールとの共蒸発によって除去し、得られた粗製生成物を使用してさらに精製することなく次のステップを行った。Ｂｏｃプロトンの完全な消失を１Ｈ ＮＭＲによって確認し、同時にエステル加水分解はこの条件下では観察されなかった。アミン基の総数は約１０で維持された。次いで二機能性デンドリマーを蛍光染料Ｃｙ５で処置して、デンドリマー表面において約１～２個のＣｙ５結合が成功したデンドリマー４を得た。１Ｈ ＮＭＲによって芳香族領域におけるＣｙ５シグナルの出現が示され（１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ－ｄ６、５００ＭＨｚ）により、デンドリマーコンジュゲート、Ｄ－ＧＡＢＡ－Ｂｏｃ、Ｄ－ＧＡＢＡ－ＮＨ２、Ｃｙ５－Ｄ、Ｃｙ５－Ｄ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ（ＤＭＳＯ－ｄ６およびＤ２Ｏ中）が特徴付けられて、特徴的なシグナルの出現または消失が示される）、ＨＰＬＣ保持時間は１９．０から１７．５分にシフトし、生成物の形成が確認された。Ｃｙ５結合後、アミン基の残りはヘテロ二機能性３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル（ＮＨＳ－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ）リンカーと反応させた。このヘテロ二機能性リンカーを使用して、ｓｉＲＮＡ－ＳＨによる古典的チオール－ジスルフィド交換を介してデンドリマーとｓｉＲＮＡとの間のジスルフィド還元感受性リンカーを形成した。この結合は血清中で比較的安定であり、還元的な細胞質環境において切断可能である。分析用逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行って生成物の純度を測定した。構成要素のサイズを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用した動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定した。水中のＤ－ＯＨとＤ－ｓｉＲＮＡの両方の平均流体力学的直径は約６ｎｍであり、修飾後に有意な変化は示さなかった。
【0261】
デンドリマー－ｓｉＲＮＡコンジュゲート１の合成および特徴付け
デンドリマー－ｓｉＧＦＰ（Ｄ－ｓｉＧＦＰ）の合成を図４に示す。ｓｉＲＮＡバイオコンジュゲートの送達効率は、コンジュゲーションの部位、リンカーの切断可能性、スペーサーアームの長さ、およびコンジュゲートされる分子の生物物理学的性質に依存する。ｓｉＲＮＡは、２つの相補的ストランドであるセンスおよびアンチセンスからなる二重鎖であり、化学コンジュゲーションに使用することができる末端ホスフェート基を有する。コンジュゲーション部位として使用することができる４つの末端終末が存在する。細胞取り込みの際、標的ｍＲＮＡに対して相補的配列を有するアンチセンスストランドはＲＩＳＣ中に取り込まれる。アンチセンスストランドの５’は、ＲＮＡｉ機序の開始において特に重要である。したがって、センスストランドまたはパッセンジャーストランドの５’および３’末端ならびにアンチセンスストランドの３’末端は、コンジュゲーションのための潜在的な部位であり、センスストランドに対する修飾はサイレンシング効力における変化を最小限にするのにより好ましい。結果的に、センス５’チオール（－ＳＨ）連結を導入するためのジスルフィドチオール改変剤をこの研究に使用した。ＳＨ修飾ｓｉＧＦＰは、可逆的ジスルフィド結合、配位子－Ｓ－Ｓ－ｓｉＧＦＰ、またはさまざまな活性化受容基との不可逆的結合を形成するために使用することができる。本明細書において使用される保護された形態のチオール修飾ｓｉＧＦＰは、ダイマーの形成を阻止する。使用前に、チオール修飾（Ｓ－Ｓ）ｓｉＧＦＰは、さらなるコンジュゲーションのためにスルフヒドリル（－ＳＨ）に還元された。ジチオール修飾ｓｉＧＦＰを１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処置してジスルフィド結合を定量的に還元し、デンドリマーとのさらなるコンジュゲーションのためのスルフヒドリル基をもたらした。ＨＰＬＣ分析によって、ジチオール基がほぼ定量的に還元され、次の反応ステップ前に過剰なＤＴＴが除去されたことが示された。次いで、ｓｉＧＦＰのセンス５’末端において得られたスルフヒドリル基はデンドリマー－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ（５）と反応させて、スルフヒドリル交換反応を介して所望のＤ－ｓｉＧＦＰ（１）コンジュゲートを形成した。２－ピリジルチオ基は、中性ｐＨ下、電子安定化２－ピリジル基をチオール化合物で置き換えることによってスルフヒドリルと反応する。このチオール交換反応は通常、ＳＰＤＰがスルフヒドリル基との交換反応を容易に行って単一のジスルフィド生成物を得る、多くの架橋およびコンジュゲーション反応において使用される。デンドリマーとｓｉＲＮＡとの間に新たに形成されたジスルフィド結合は、酸性条件下での還元に対して感受性を有する。得られたＤ－ｓｉＧＦＰはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－２５カラムに通し、限外ろ過によって濃縮した。分子量は、Ｃｙ５－Ｄ－ｓｉＧＦＰのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＴＯＦスペクトルによって決定され、７２９０８Ｄａの質量におけるピークおよびＨＰＬＣトレースを示した。生成物の純度は、２１０、２６０、および６５０ｎｍにおけるＣｙ５－Ｄ－ｓｉＧＦＰのＨＰＬＣによって確認した。さらに、Ｄ－ｓｉＧＦＰの合成の成功はゲル遅延によって確認された。Ｄ－ｓｉＧＦＰからの明らかな単一のバンドは、１０％ＴＢＥ－尿素ゲル上の１５０ｂｐマーカーに対応する距離において保持された。ネイキッドｓｉＧＦＰとＤ－ｓｉＧＦＰとのゲル遅延によって決定されたサイズは９０ｋＤａと推測された。
デンドリマー－ｓｉＧＦＰ（Ｄ－ｓｉＧＦＰ）の合成を図４に示す。ｓｉＲＮＡバイオコンジュゲートの送達効率は、コンジュゲーションの部位、リンカーの切断可能性、スペーサーアームの長さ、およびコンジュゲートされる分子の生物物理学的性質に依存する。ｓｉＲＮＡは、２つの相補的ストランドであるセンスおよびアンチセンスからなる二重鎖であり、化学コンジュゲーションに使用することができる末端ホスフェート基を有する。コンジュゲーション部位として使用することができる４つの末端終末が存在する。細胞取り込みの際、標的ｍＲＮＡに対して相補的配列を有するアンチセンスストランドはＲＩＳＣ中に取り込まれる。アンチセンスストランドの５’は、ＲＮＡｉ機序の開始において特に重要である。したがって、センスストランドまたはパッセンジャーストランドの５’および３’末端ならびにアンチセンスストランドの３’末端は、コンジュゲーションのための潜在的な部位であり、センスストランドに対する修飾はサイレンシング効力における変化を最小限にするのにより好ましい。結果的に、センス５’チオール（－ＳＨ）連結を導入するためのジスルフィドチオール改変剤をこの研究に使用した。ＳＨ修飾ｓｉＧＦＰは、可逆的ジスルフィド結合、配位子－Ｓ－Ｓ－ｓｉＧＦＰ、またはさまざまな活性化受容基との不可逆的結合を形成するために使用することができる。本明細書において使用される保護された形態のチオール修飾ｓｉＧＦＰは、ダイマーの形成を阻止する。使用前に、チオール修飾（Ｓ－Ｓ）ｓｉＧＦＰは、さらなるコンジュゲーションのためにスルフヒドリル（－ＳＨ）に還元された。ジチオール修飾ｓｉＧＦＰを１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）で処置してジスルフィド結合を定量的に還元し、デンドリマーとのさらなるコンジュゲーションのためのスルフヒドリル基をもたらした。ＨＰＬＣ分析によって、ジチオール基がほぼ定量的に還元され、次の反応ステップ前に過剰なＤＴＴが除去されたことが示された。次いで、ｓｉＧＦＰのセンス５’末端において得られたスルフヒドリル基はデンドリマー－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ（５）と反応させて、スルフヒドリル交換反応を介して所望のＤ－ｓｉＧＦＰ（１）コンジュゲートを形成した。２－ピリジルチオ基は、中性ｐＨ下、電子安定化２－ピリジル基をチオール化合物で置き換えることによってスルフヒドリルと反応する。このチオール交換反応は通常、ＳＰＤＰがスルフヒドリル基との交換反応を容易に行って単一のジスルフィド生成物を得る、多くの架橋およびコンジュゲーション反応において使用される。デンドリマーとｓｉＲＮＡとの間に新たに形成されたジスルフィド結合は、酸性条件下での還元に対して感受性を有する。得られたＤ－ｓｉＧＦＰはＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ－２５カラムに通し、限外ろ過によって濃縮した。分子量は、Ｃｙ５－Ｄ－ｓｉＧＦＰのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＴＯＦスペクトルによって決定され、７２９０８Ｄａの質量におけるピークおよびＨＰＬＣトレースを示した。生成物の純度は、２１０、２６０、および６５０ｎｍにおけるＣｙ５－Ｄ－ｓｉＧＦＰのＨＰＬＣによって確認した。さらに、Ｄ－ｓｉＧＦＰの合成の成功はゲル遅延によって確認された。Ｄ－ｓｉＧＦＰからの明らかな単一のバンドは、１０％ＴＢＥ－尿素ゲル上の１５０ｂｐマーカーに対応する距離において保持された。ネイキッドｓｉＧＦＰとＤ－ｓｉＧＦＰとのゲル遅延によって決定されたサイズは９０ｋＤａと推測された。
【0262】
化学的コンジュゲートＤ－ｓｉＲＮＡの血清安定性
ヌクレアーゼに対する核酸ペイロードの保護はＲＮＡｉ療法を成功させるために極めて重要である。したがって、インタクトなペイロードを送達するためのＤ－ｓｉＧＦＰの能力を、還元（１ｍＭ ＤＴＴ）および非還元（０ｍＭ ＤＴＴ）条件下、エンドヌクレアーゼであるＲＮａｓｅ ＩＩＩに対して検証された。非還元条件下では、ネイキッドｓｉＧＦＰはＲＮａｓｅ ＩＩＩによって２時間未満で分解され、一方Ｄ－ｓｉＧＦＰは依然として最大４８時間安定なままであり；Ｄ－ｓｉＧＦＰおよびｓｉＧＦＰを、非還元および還元条件下、ＲＮａｓｅ ＩＩＩヌクレアーゼとともにインキュベートした。非還元条件下、ネイキッドｓｉＧＦＰは３０分で分解され、同時にＤ－ｓｉＧＦＰは最大４８時間保持した。還元条件下では、ｓｉＧＦＰとＤ－ｓｉＧＦＰの両方の核酸ペイロードはデンドリマープラットフォームから急速に放出され、ネイキッドｓｉＧＦＰとＤ－ｓｉＧＦＰの両方が１５分で急速に分解された。さらに、ｓｉＧＦＰおよびＤ－ｓｉＧＦＰはヒト血漿中でインキュベートしてｉｎ ｖｉｖｏでの血清安定性を模倣した。Ｄ－ｓｉＧＦＰに関するバンドは依然として１５０ｂｐのままであり、血漿タンパク質結合がないことを示し、同時にｓｉＧＦＰバンドは１時間ほどで２０ｂｐから１５０ｂｐに劇的にシフトし、有意なタンパク質結合を伴っていた。遊離ｓｉＧＦＰに対する著しい血漿タンパク質結合は、ヒト血漿中、３７℃で早ければ１時間で生じ、タンパク質への結合量はインキュベーション後４８時間で増加した。有意なタンパク質吸着はＤ－ｓｉＧＦＰにおいて観察されなかった。
ヌクレアーゼに対する核酸ペイロードの保護はＲＮＡｉ療法を成功させるために極めて重要である。したがって、インタクトなペイロードを送達するためのＤ－ｓｉＧＦＰの能力を、還元（１ｍＭ ＤＴＴ）および非還元（０ｍＭ ＤＴＴ）条件下、エンドヌクレアーゼであるＲＮａｓｅ ＩＩＩに対して検証された。非還元条件下では、ネイキッドｓｉＧＦＰはＲＮａｓｅ ＩＩＩによって２時間未満で分解され、一方Ｄ－ｓｉＧＦＰは依然として最大４８時間安定なままであり；Ｄ－ｓｉＧＦＰおよびｓｉＧＦＰを、非還元および還元条件下、ＲＮａｓｅ ＩＩＩヌクレアーゼとともにインキュベートした。非還元条件下、ネイキッドｓｉＧＦＰは３０分で分解され、同時にＤ－ｓｉＧＦＰは最大４８時間保持した。還元条件下では、ｓｉＧＦＰとＤ－ｓｉＧＦＰの両方の核酸ペイロードはデンドリマープラットフォームから急速に放出され、ネイキッドｓｉＧＦＰとＤ－ｓｉＧＦＰの両方が１５分で急速に分解された。さらに、ｓｉＧＦＰおよびＤ－ｓｉＧＦＰはヒト血漿中でインキュベートしてｉｎ ｖｉｖｏでの血清安定性を模倣した。Ｄ－ｓｉＧＦＰに関するバンドは依然として１５０ｂｐのままであり、血漿タンパク質結合がないことを示し、同時にｓｉＧＦＰバンドは１時間ほどで２０ｂｐから１５０ｂｐに劇的にシフトし、有意なタンパク質結合を伴っていた。遊離ｓｉＧＦＰに対する著しい血漿タンパク質結合は、ヒト血漿中、３７℃で早ければ１時間で生じ、タンパク質への結合量はインキュベーション後４８時間で増加した。有意なタンパク質吸着はＤ－ｓｉＧＦＰにおいて観察されなかった。
【0263】
ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＦＰノックダウン
化学的にコンジュゲートされたデンドリマーベースのプラットフォームを使用したｓｉＲＮＡの細胞への送達は、ＧＦＰ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＧＦＰ（ＧＦＰｄ２）の不安定化された形態を発現しており、その半減期は約２時間であり、これはｉｎ ｖｉｖｏ環境における多くのタンパク質に匹敵する。時間依存的取り込み研究に関しては、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＣｙ５－Ｄ－ｓｉＧＦＰ－Ｃｙ３で処置し、細胞を４８時間インキュベートした。細胞を洗浄してから各時点においてイメージングし、各イメージングセッション後に処置培地を再適用した。早ければ６時間でＤ－ｓｉＧＦＰは細胞内蓄積を示し；Ｃｙ５－Ｄ－ｓｉＧＦＰの細胞取り込みおよび用量依存的遺伝子ノックダウンは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＣｙ５－Ｄ－ｓｉＧＦＰ－Ｃｙ３細胞取り込みの共焦点顕微鏡画像によって観察された。処置後２４時間で、拡散Ｃｙ３－ｓｉＲＮＡシグナルは検出され、同時にＣｙ５－デンドリマーシグナルは点状であり；Ｃｙ５－デンドリマーシグナルおよびＣｙ３－ｓｉＲＮＡシグナルは共局在している。
化学的にコンジュゲートされたデンドリマーベースのプラットフォームを使用したｓｉＲＮＡの細胞への送達は、ＧＦＰ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞系を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＧＦＰ（ＧＦＰｄ２）の不安定化された形態を発現しており、その半減期は約２時間であり、これはｉｎ ｖｉｖｏ環境における多くのタンパク質に匹敵する。時間依存的取り込み研究に関しては、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＣｙ５－Ｄ－ｓｉＧＦＰ－Ｃｙ３で処置し、細胞を４８時間インキュベートした。細胞を洗浄してから各時点においてイメージングし、各イメージングセッション後に処置培地を再適用した。早ければ６時間でＤ－ｓｉＧＦＰは細胞内蓄積を示し；Ｃｙ５－Ｄ－ｓｉＧＦＰの細胞取り込みおよび用量依存的遺伝子ノックダウンは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＣｙ５－Ｄ－ｓｉＧＦＰ－Ｃｙ３細胞取り込みの共焦点顕微鏡画像によって観察された。処置後２４時間で、拡散Ｃｙ３－ｓｉＲＮＡシグナルは検出され、同時にＣｙ５－デンドリマーシグナルは点状であり；Ｃｙ５－デンドリマーシグナルおよびＣｙ３－ｓｉＲＮＡシグナルは共局在している。
【0264】
ネイキッドｓｉＧＦＰはＨＥＫ２９３Ｔ細胞にいかなる明白な程度にも蓄積されなかった。共焦点顕微鏡イメージによって、デンドリマーＣｙ５はＨＥＫ２９３Ｔの細胞質に分布し、同時にデンドリマーＣｙ５シグナルは処置してから２４時間後にｓｉＲＮＡＣｙ３シグナルと共局在していたことが示された。Ｃｙ５およびＣｙ３シグナルの共局在は、チャネルを統合した際に統合された（ピンク色）シグナルによって確認された。
【0265】
ＧＦＰノックダウンを評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、処置の２４時間前に播種し、培養培地をＯＰＴＩＭＥＭ（登録商標）で置き換えてからただちに処置を行った。細胞は、１０、５０、１００、２００、５００ｎＭを含む５つの異なる濃度のＤ－ｓｉＧＦＰで処置した。ＧＦＰｄ２発現はＧＦＰチャネルにおけるバックグラウンド補正強度を使用した相対蛍光強度によって推測し、０時間の時点の内部対照に対して正規化した。最適なノックダウンはトランスフェクションから２４時間後に報告された。生存細胞イメージによれば、ＧＦＰタンパク質の著しい時間依存的ノックダウンが５０ｎＭを超える濃度で報告され、ピークは２４時間で約４０％のノックダウンであった。ＧＦＰ濃度は７２時間にわたって正常に戻った。４８時間後、細胞を収集し、溶解してウエスタンブロットを行った。ＩＣ５０値はトランスフェクションから２４時間後のＤ－ｓｉＧＦＰの用量応答曲線を使用して推測した（図５および６）。
【0266】
市販のトランスフェクション試薬を使用したｓｉＲＮＡの送達
市販のトランスフェクション試薬、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００およびＲＮＡｉ Ｍａｘの効果を比較対照として評価した。ＧＦＰ蛍光のイメージ分析において、全ての市販のプラットフォームで、ＧＦＰｄ２発現のある程度のノックダウンが得られ（図７Ａ～７Ｃ）、条件および核酸負荷を各ビヒクルに対して最適化した。生存細胞画像も細胞毒性の間接的な尺度としてコンフルエンシーに関して分析し；有意な毒性は全てのシステムにわたって観察されなかった。ウエスタンブロットによる相対的ＧＦＰ発現の直接的な尺度は、送達システム間に統計的有意差を一切もたらさなかったが、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）システムおよびネイキッドｓｉＧＦＰは、ＧＦＰ産生に対してより一貫性のない効果をもたらすという傾向を観察することができた。イメージ分析から検出されたＧＦＰ蛍光と実際のＧＦＰタンパク質産生との間の不一致は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）システムが、バースト放出でそのペイロードを放出し、イメージ分析において観察されたノックダウンとその後のｓｉＧＦＰが分解を受けた場合のＧＦＰタンパク質における増加とを達成する場合があることを示唆する。一方、ＲＮＡｉ ＭａｘおよびＤ－ｓｉＧＦＰは遅い放出プロファイルを示し、ＧＦＰ産生の長期ノックダウンをもたらす場合がある。
市販のトランスフェクション試薬、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００およびＲＮＡｉ Ｍａｘの効果を比較対照として評価した。ＧＦＰ蛍光のイメージ分析において、全ての市販のプラットフォームで、ＧＦＰｄ２発現のある程度のノックダウンが得られ（図７Ａ～７Ｃ）、条件および核酸負荷を各ビヒクルに対して最適化した。生存細胞画像も細胞毒性の間接的な尺度としてコンフルエンシーに関して分析し；有意な毒性は全てのシステムにわたって観察されなかった。ウエスタンブロットによる相対的ＧＦＰ発現の直接的な尺度は、送達システム間に統計的有意差を一切もたらさなかったが、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）システムおよびネイキッドｓｉＧＦＰは、ＧＦＰ産生に対してより一貫性のない効果をもたらすという傾向を観察することができた。イメージ分析から検出されたＧＦＰ蛍光と実際のＧＦＰタンパク質産生との間の不一致は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）システムが、バースト放出でそのペイロードを放出し、イメージ分析において観察されたノックダウンとその後のｓｉＧＦＰが分解を受けた場合のＧＦＰタンパク質における増加とを達成する場合があることを示唆する。一方、ＲＮＡｉ ＭａｘおよびＤ－ｓｉＧＦＰは遅い放出プロファイルを示し、ＧＦＰ産生の長期ノックダウンをもたらす場合がある。
【0267】
ＧＬ２６１神経膠腫におけるＣｙ５－Ｄ－ｓｉＧＦＰのｉｎ ｖｉｖｏ研究
有効なｓｉＲＮＡトランスフェクション剤としてのＤ－ｓｉＧＦＰコンジュゲートを検証するために、Ｄ－ｓｉＧＦＰを同所性神経膠芽腫マウスモデルに腫瘍内注射した。腫瘍内注射は、それが遺伝子療法の適用において普及しており、無駄なくＤ－ｓｉＧＦＰの有効性および取り込みを実証することに起因して選択した。ＣＸ３ＣＲ－１ＧＦＰマウスに、デンドリマーコンジュゲートを腫瘍内注射する２週間前に、２×１０５ＧＬ２６１細胞を最初に接種し、腫瘍を十分なサイズまで成長させた。
有効なｓｉＲＮＡトランスフェクション剤としてのＤ－ｓｉＧＦＰコンジュゲートを検証するために、Ｄ－ｓｉＧＦＰを同所性神経膠芽腫マウスモデルに腫瘍内注射した。腫瘍内注射は、それが遺伝子療法の適用において普及しており、無駄なくＤ－ｓｉＧＦＰの有効性および取り込みを実証することに起因して選択した。ＣＸ３ＣＲ－１ＧＦＰマウスに、デンドリマーコンジュゲートを腫瘍内注射する２週間前に、２×１０５ＧＬ２６１細胞を最初に接種し、腫瘍を十分なサイズまで成長させた。
【0268】
取り込み研究に関しては、二重標識コンジュゲートであるＣｙ５－Ｄ－ｓｉＧＦＰ－Ｃｙ３を腫瘍内投与し、注射してから２４時間後に臓器を抽出した。腫瘍、腫瘍境界、および対側の共焦点イメージを得、Ｚｅｎ ２０１１ソフトウェアによって分析した。二重標識Ｄ－ｓｉＲＮＡは腫瘍内に散在的に分布しており、腫瘍実質内のみで観察され、対側脳半球には存在しなかった。Ｃｙ５－Ｄ－ｓｉＲＮＡ－Ｃｙ３はＴＡＭを選択的に標的とし、ＧＦＰトランスジェニックＧＬ２６１マウスモデルにおける遺伝子をノックダウンし；Ｄ－ｓｉＧＦＰは腫瘍内投与後に腫瘍中に保持され、Ｄ－ｓｉＧＦＰの取り込みは腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）周囲に集中する。一部のＣｙ５（デンドリマー）およびＣｙ３（ｓｉＧＦＰ）シグナルは互いに共局在し、インタクトなＤ－ｓｉＧＦＰコンジュゲートの送達を示唆している。さらに、Ｃｙ３シグナルも存在し、ＴＡＭによって発現されたＧＦＰシグナルと共局在しており、ｓｉＧＦＰの取り込みを示していた。興味深いことに、Ｃｙ３シグナルのうちの一部のみがＧＦＰとＣｙ５の両方に共局在しており、Ｄ－ｓｉＧＦＰコンジュゲートのわずかな部分のみが細胞取り込み後も依然としてインタクトなままであることを示す。Ｃｙ３およびＣｙ５シグナルの大部分は互いに解離し、ｓｉＧＦＰ配列は細胞取り込み後にデンドリマービヒクルから放出されることを示す。
【0269】
次に、ＧＦＰ発現のノックダウンを調査した。腫瘍担持動物にＤ－ｓｉＧＦＰ、Ｄ－ｓｃＲＮＡまたは遊離ｓｉＧＦＰを注射し、注射してから２４時間および４８時間後に臓器を収集した。対側脳半球を内部対照として使用し、Ｄ－ｓｃＲＮＡをビヒクル対照として使用した。内部対照としての対側脳半球と比較して、ＧＦＰ蛍光Ｄ－ｓｉＲＮＡが投与された腫瘍では５０％のノックダウンが存在した（図８）。未処置の動物では、ＧＦＰ蛍光は腫瘍接種で２０％減少した。
【0270】
要約
ｓｉＲＮＡは、特異的ｍＲＮＡ配列と対を形成し、ＲＩＳＣ複合体を介してそれらを分解することによって、遺伝子サイレンシングプロセスにおける重要な機能的役割を果たし、特定のタンパク質発現のノックダウンをもたらす。したがって、インタクトなｓｉＲＮＡ配列の標的細胞への送達は、ＲＮＡｉ療法を成功させるために極めて重要である。簡便なデンドリマー－ｓｉＲＮＡコンジュゲーション戦略は、正確な核酸負荷および炎症領域への固有の標的化を伴う環境応答性ナノ粒子コンジュゲートを生成する生体適合性ヒドロキシル末端ＰＡＭＡＭデンドリマーに基づいて開発した。
ｓｉＲＮＡは、特異的ｍＲＮＡ配列と対を形成し、ＲＩＳＣ複合体を介してそれらを分解することによって、遺伝子サイレンシングプロセスにおける重要な機能的役割を果たし、特定のタンパク質発現のノックダウンをもたらす。したがって、インタクトなｓｉＲＮＡ配列の標的細胞への送達は、ＲＮＡｉ療法を成功させるために極めて重要である。簡便なデンドリマー－ｓｉＲＮＡコンジュゲーション戦略は、正確な核酸負荷および炎症領域への固有の標的化を伴う環境応答性ナノ粒子コンジュゲートを生成する生体適合性ヒドロキシル末端ＰＡＭＡＭデンドリマーに基づいて開発した。
【0271】
合成は、手頃な合成材料および単純な精製技術を使用した調節可能な合成経路によって穏和な反応条件下で行った。本明細書において使用する刺激応答性リンカー化学は、ペイロードの細胞内環境への特異的な放出において重要な役割を果たし、同時にデンドリマーコンジュゲーションはヌクレアーゼ抵抗性および送達効率を改善する。血清におけるネイキッドｓｉＲＮＡの報告された半減期は数分から１時間の範囲であり、同時に結果によって、化学的にコンジュゲートされたＤ－ｓｉＲＮＡは、血清分解を３０分から４８時間まで遅延させることによってノックダウン効率を損なうことなく安定性を改善することが示唆される。
【0272】
これは、ＲＮＡ干渉のｉｎ ｖｉｖｏ効力における画期的な進歩である。さらに、Ｄ－ｓｉＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ還元剤でただちにジスルフィド結合の還元を受けており、細胞質ゾル環境がｓｉＲＮＡの放出を引き起こすことができることが示唆される。本明細書における研究は、ｓｉＲＮＡのデンドリマーへの化学コンジュゲーションは遺伝子ノックダウン活性を損なうことはないことも強調する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境では、共有結合によりコンジュゲートしているＤ－ｓｉＲＮＡは、核酸ペイロードの放出を遅延させることによって持続性のノックダウンを生成することができることが示された。
【0273】
ｉｎ ｖｉｖｏでの原理証明の結果によって、共有結合によりコンジュゲートしているＤ－ｓｉＧＦＰは標的化された遺伝子ノックダウン効果を生成できることが示された。比較的中程度のノックダウンがｉｎ ｖｉｔｒｏＨＥＫ２９３Ｔ細胞とｉｎ ｖｉｖｏ脳腫瘍モデルの両方で報告された（約５０％）。共焦点分析によれば、Ｄ－ｓｉＧＦＰは腫瘍関連マクロファージ内に局在し、細胞内にペイロードを放出し、同時に他の細胞集団または対側脳半球における取り込みは事実上認められなかった。化学的にコンジュゲートされたｓｉＲＮＡは、整形外科的ＧＬ２６１マウスモデルにおいて高い腫瘍特異性を達成する上でのＰＡＭＡＭデンドリマーの固有の性質に影響を与えず、遊離ｓｉＧＦＰと比較して高い遺伝子ノックダウンを生成することが可能である。
【0274】
ｓｉＲＮＡのデンドリマーへの共有結合性コンジュゲーションによって、血清半減期およびバイオアベイラビリティが大きく強化され、ペイロードはタンパク質吸着および酵素分解から保護された。Ｄ－ｓｉＲＮＡコンジュゲートは、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方でｓｉＲＮＡを細胞に有効に送達し、同時に標的化された遺伝子を効率的にノックダウンした。ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究では、Ｄ－ｓｉＧＦＰはＲＮＡｉ ＭａｘおよびＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）システムと同程度のノックダウンを達成した。ｉｎ ｖｉｖｏ研究では、Ｄ－ｓｉＧＦＰは腫瘍実質内に優先的に局在し、そのペイロードを細胞内に放出し、ＧＦＰ発現腫瘍関連マクロファージにおける遺伝子サイレンシング効果を達成した。これらの結果は、簡便なデンドリマーベースの共有結合性コンジュゲーション戦略が、ｓｉＲＮＡ治療薬の臨床移行に効率的で安全なアプローチを提供することを実証する。
【0275】
（実施例３）
脈絡膜血管新生の標的化された抑制のためのデンドリマー－ｍｉＲ１２６コンジュゲート
材料および方法
化学物質および試薬
メタノール溶液中のヒドロキシル末端エチレンジアミンコアＰＡＭＡＭデンドリマー（第６世代、医薬品グレード）はＤｅｎｄｒｉｔｅｃｈ（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ、ＵＳＡ）から購入した。使用前に、デンドリマー溶液をロータリーエバポレーターで蒸発させた。透析膜（ＭＷＣＯ １ｋＤａ）はＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）から購入した。チオール修飾ｍｉＲ－１２６：
センス：５’－ＵＣＧＵＡＣＣＧＵＧＡＧＵＡＡＵＡＡＵＧＣＧ－３’（配列番号４）；
アンチセンス：５’－ＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡ－［チオールＣ６Ｓ－Ｓ］－３’（配列番号５）、およびＣｙ３標識された同等のものはＢｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ、ＵＳＡ）から購入した。Ｂｉｏ－Ｓｐｉｎ Ｐ－３０ゲルカラムおよび１５％ＴＢＥ－尿素プレキャストゲルはＢｉｏ－Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター（ＭＷＣＯ １０ｋＤａ）、ＧｅｌＲｅｄ核酸染料、および無水Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。重水素化溶媒（ＤＭＳＯ－ｄ６）、メタノール（ＣＤ３ＯＤ）、および水（Ｄ２Ｏ）もＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ｄｓＲＮＡラダーはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌ－グルタミンを含む低グルコース）はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。ヒト微小血管内皮細胞および必要な培地キットはＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。フェノールレッド不含マトリゲルはＣｏｒｎｉｎｇ（Ｔｅｗｋｓｂｅｒｒｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。
脈絡膜血管新生の標的化された抑制のためのデンドリマー－ｍｉＲ１２６コンジュゲート
材料および方法
化学物質および試薬
メタノール溶液中のヒドロキシル末端エチレンジアミンコアＰＡＭＡＭデンドリマー（第６世代、医薬品グレード）はＤｅｎｄｒｉｔｅｃｈ（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ、ＵＳＡ）から購入した。使用前に、デンドリマー溶液をロータリーエバポレーターで蒸発させた。透析膜（ＭＷＣＯ １ｋＤａ）はＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）から購入した。チオール修飾ｍｉＲ－１２６：
センス：５’－ＵＣＧＵＡＣＣＧＵＧＡＧＵＡＡＵＡＡＵＧＣＧ－３’（配列番号４）；
アンチセンス：５’－ＣＧＣＡＵＵＡＵＵＡＣＵＣＡＣＧＧＵＡＣＧＡ－［チオールＣ６Ｓ－Ｓ］－３’（配列番号５）、およびＣｙ３標識された同等のものはＢｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ、ＵＳＡ）から購入した。Ｂｉｏ－Ｓｐｉｎ Ｐ－３０ゲルカラムおよび１５％ＴＢＥ－尿素プレキャストゲルはＢｉｏ－Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。Ａｍｉｃｏｎ超遠心フィルター（ＭＷＣＯ １０ｋＤａ）、ＧｅｌＲｅｄ核酸染料、および無水Ｎ，Ｎ’－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。重水素化溶媒（ＤＭＳＯ－ｄ６）、メタノール（ＣＤ３ＯＤ）、および水（Ｄ２Ｏ）もＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ｄｓＲＮＡラダーはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌ－グルタミンを含む低グルコース）はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。ヒト微小血管内皮細胞および必要な培地キットはＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。フェノールレッド不含マトリゲルはＣｏｒｎｉｎｇ（Ｔｅｗｋｓｂｅｒｒｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。
【0276】
機器の使用
中間体の構造は、Ｂｒｕｋｅｒ ５００ＭＨｚ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用したプロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）分光法を使用して周囲温度で分析した。化学シフトは、テトラメチルシランの内部標準に対するものであり、ｐｐｍで報告している。残留プロトン性溶媒Ｄ２Ｏ（１Ｈ、δ４．７９ｐｐｍ）およびＤＭＳＯ－ｄ６（１Ｈ、δ２．５０ｐｐｍ）の化学シフトは化学シフト較正のために使用した。
中間体の構造は、Ｂｒｕｋｅｒ ５００ＭＨｚ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用したプロトン核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）分光法を使用して周囲温度で分析した。化学シフトは、テトラメチルシランの内部標準に対するものであり、ｐｐｍで報告している。残留プロトン性溶媒Ｄ２Ｏ（１Ｈ、δ４．７９ｐｐｍ）およびＤＭＳＯ－ｄ６（１Ｈ、δ２．５０ｐｐｍ）の化学シフトは化学シフト較正のために使用した。
【0277】
中間体およびデンドリマー－ｍｉＲ１２６コンジュゲートの純度は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して分析した。ＨＰＬＣ機器（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）は、１５２５バイナリポンプおよびインラインデガッサーＡＦを備えていた。機器は７１７ｐｌｕｓオートサンプラーを備えており、２つの検出器：２９９８フォトダイオードアレイ検出器および２４７５マルチλ蛍光検出器を有していた。機器はＷａｔｅｒｓ Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェアとインターフェースで連結されていた。ＨＰＬＣ試料は、Ｗａｔｅｒｓ製のＣ１８シンメトリー３００、５μｍ、４．６×２５０ｍｍカラムで実行した。クロマトグラムは２１０ｎｍ（デンドリマー吸収）および２６０ｎｍ（核酸吸収）で記録した。勾配フローＨＰＬＣ法を使用し、９０：１０（溶媒Ａ：水中の０．１％ＴＦＡおよび５％ＡＣＮ；溶媒Ｂ：ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ）で出発し、３０分で５０：５０（Ａ：Ｂ）に徐々に増加させ、４０分で最終的に９０：１０（Ａ：Ｂ）に戻し、１ｍＬ／分の一定流量で行った。
【0278】
デンドリマーコンジュゲートの合成
デンドリマー－ＰＤＰ、１の合成
スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ、１４ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ中のＤ－ＯＨ（２００ｍｇ、０．００３４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液へ添加した。反応を室温で２４時間継続させた。混合物をＤＭＦで希釈し、ＤＭＦに対して１ｋＤａカットオフ透析膜を使用して透析した。ＤＭＦを４時間ごとに１２時間交換し、続いて水に対して１２時間透析し、水を頻繁に交換した。得られた水溶液を凍結乾燥して、Ｄ－ＰＤＰをオフホワイト色粉末として得た（８０％収率）。
デンドリマー－ＰＤＰ、１の合成
スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ、１４ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ中のＤ－ＯＨ（２００ｍｇ、０．００３４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液へ添加した。反応を室温で２４時間継続させた。混合物をＤＭＦで希釈し、ＤＭＦに対して１ｋＤａカットオフ透析膜を使用して透析した。ＤＭＦを４時間ごとに１２時間交換し、続いて水に対して１２時間透析し、水を頻繁に交換した。得られた水溶液を凍結乾燥して、Ｄ－ＰＤＰをオフホワイト色粉末として得た（８０％収率）。
【0279】
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ８．３０ （ｄ， 芳香族４Ｈ）， ８．０６－７．７９ （ｍ， 内部アミド５１０Ｈ）， ７．０１ （ｍ， 芳香族５Ｈ）， ４．７３ （ｓ， 表面ＯＨ， ２３５Ｈ）， ４．０６ （ｓ， エステル連結， １２Ｈ）， ３．４０ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．３３ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．１８－３．１１ （ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．６４ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．４３ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．２０ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）．保持時間：１８．００分。
【0280】
Ｂｏｃ－ＧＡＢＡ－デンドリマー－ＰＤＰ、２の合成
化合物１（１００ｍｇ、０．００１６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ３ｍＬ中に溶解し、続いてＢｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨ（１ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で１０分間撹拌してからＥＤＣ．ＨＣＬ（２ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一定の撹拌下、室温で２４時間放置してから粗製生成物を３ｋＤカットオフセルロース透析チューブに移し、ＤＭＦに対して１２時間透析した。次いで生成物を水に対してさらに２４時間透析した。得られた水性溶液を凍結し、凍結乾燥して、生成物２を吸湿性の白色固形物として得た（９５ｍｇ、９４％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） ８．１２－７．７８ （ｍ， 内部アミドＨ）， ７．０１ （ｍ， 芳香族５Ｈ）， ６．５９ （ｓ， ＧＡＢＡアミド Ｈ， １０Ｈ）， ４．７３ （ｓ， 表面ＯＨ， ２３３Ｈ）， ４．０６ （ｓ， エステル連結， １６Ｈ）， ３．４０ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．３３ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．１８－３．１１ （ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．６４ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， １．６４－１．５９ （ｍ， ＧＡＢＡリンカー －ＣＨ２， ６Ｈ）， １．３６ （ｓ， Ｂｏｃ基， ２０Ｈ）．
化合物１（１００ｍｇ、０．００１６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ３ｍＬ中に溶解し、続いてＢｏｃ－ＧＡＢＡ－ＯＨ（１ｍｇ、０．００５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で１０分間撹拌してからＥＤＣ．ＨＣＬ（２ｍｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一定の撹拌下、室温で２４時間放置してから粗製生成物を３ｋＤカットオフセルロース透析チューブに移し、ＤＭＦに対して１２時間透析した。次いで生成物を水に対してさらに２４時間透析した。得られた水性溶液を凍結し、凍結乾燥して、生成物２を吸湿性の白色固形物として得た（９５ｍｇ、９４％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） ８．１２－７．７８ （ｍ， 内部アミドＨ）， ７．０１ （ｍ， 芳香族５Ｈ）， ６．５９ （ｓ， ＧＡＢＡアミド Ｈ， １０Ｈ）， ４．７３ （ｓ， 表面ＯＨ， ２３３Ｈ）， ４．０６ （ｓ， エステル連結， １６Ｈ）， ３．４０ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．３３ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．１８－３．１１ （ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．６４ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， １．６４－１．５９ （ｍ， ＧＡＢＡリンカー －ＣＨ２， ６Ｈ）， １．３６ （ｓ， Ｂｏｃ基， ２０Ｈ）．
【0281】
ＮＨ２－ＧＡＢＡ－Ｄ－ＰＤＰ、３の合成
脱保護を、化合物２（９５ｍｇ、０．００１５ｍｍｏｌ）をＴＦＡ／ＤＣＭの混合物（３：４）に添加し、１２時間激しく撹拌することによって行った。懸濁物をメタノールで希釈し、真空中で濃縮し、プロセスを３回繰り返して過剰なＴＦＡを除去した。粗製生成物をさらに精製することなく使用した。
脱保護を、化合物２（９５ｍｇ、０．００１５ｍｍｏｌ）をＴＦＡ／ＤＣＭの混合物（３：４）に添加し、１２時間激しく撹拌することによって行った。懸濁物をメタノールで希釈し、真空中で濃縮し、プロセスを３回繰り返して過剰なＴＦＡを除去した。粗製生成物をさらに精製することなく使用した。
【0282】
Ｃｙ５－Ｄ－ＰＤＰ、４の合成
化合物３（１０８ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中に溶解し、ＤＩＰＥＡで処置し、混合物のｐＨを調整した（ｐＨ約７．０～７．５）。Ｃｙ５－ＮＨＳエステル（２．８ｍｇ、０．００２７ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を添加し、室温で１２時間撹拌した。粗製混合物をＤＭＦに対して１２時間透析し、水に対して２４時間透析した。水溶液を凍結し、凍結乾燥して、生成物４を青色粉末として得た（収率８６％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） ８．１２－７．７８ （ｍ， 内部アミドＨ）， ７．３０ （ｓ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．０１ （ｍ， 芳香族５Ｈ）， ４．７３ （ｓ， 表面ＯＨ， １６８Ｈ）， ４．０６ （ｓ， エステル連結， １６Ｈ）， ３．４０ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．３３ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．１８－３．１１ （ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．６４ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， １．６４－１．５９ （ｍ， ＧＡＢＡリンカー －ＣＨ２）．保持時間：１８．０７分。
化合物３（１０８ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中に溶解し、ＤＩＰＥＡで処置し、混合物のｐＨを調整した（ｐＨ約７．０～７．５）。Ｃｙ５－ＮＨＳエステル（２．８ｍｇ、０．００２７ｍｍｏｌ、１．５ｅｑ．）を添加し、室温で１２時間撹拌した。粗製混合物をＤＭＦに対して１２時間透析し、水に対して２４時間透析した。水溶液を凍結し、凍結乾燥して、生成物４を青色粉末として得た（収率８６％）。１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） ８．１２－７．７８ （ｍ， 内部アミドＨ）， ７．３０ （ｓ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．０１ （ｍ， 芳香族５Ｈ）， ４．７３ （ｓ， 表面ＯＨ， １６８Ｈ）， ４．０６ （ｓ， エステル連結， １６Ｈ）， ３．４０ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．３３ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．１８－３．１１ （ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．６４ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， １．６４－１．５９ （ｍ， ＧＡＢＡリンカー －ＣＨ２）．保持時間：１８．０７分。
【0283】
デンドリマー－ｍｉＲ１２６、５の合成
チオール修飾ｍｉＲ－１２６およびそのＣｙ３標識された同等のものを製造業者のプロトコールに従って脱保護した。簡単に述べると、凍結乾燥されたｍｉＲ－１２６を、トリエチルアミン（ＴＥＡ、２％）およびジチオスレイトール（ＤＴＴ、５０ｍＭ）の水溶液中に再懸濁した。溶液を室温で１０分間維持し、酢酸エチルで４回抽出してＤＴＴを除去した。
チオール修飾ｍｉＲ－１２６およびそのＣｙ３標識された同等のものを製造業者のプロトコールに従って脱保護した。簡単に述べると、凍結乾燥されたｍｉＲ－１２６を、トリエチルアミン（ＴＥＡ、２％）およびジチオスレイトール（ＤＴＴ、５０ｍＭ）の水溶液中に再懸濁した。溶液を室温で１０分間維持し、酢酸エチルで４回抽出してＤＴＴを除去した。
【0284】
ジエチルピロカルボネート処置（ＤＥＰＣ処置）水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）中の１（１ｍｇ、０．０００１７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、脱保護されたｍｉＲ－１２６（０．５ｍｇ、０．０００３４ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を４８時間撹拌し、３ｋＤａカットオフＡＭＩＣＯＮ（登録商標）遠心フィルターに移した。溶液を洗浄し、ＤＥＰＣ処置水とともに遠心分離によって３回濃縮した。濃縮した溶液をＰ－３０ゲルカラムに通して未反応のｍｉＲ－１２６を除去した。保持時間：１７．３３分。
【0285】
Ｃｙ５－Ｄ－ｍｉＲ１２６－Ｃｙ３、６の合成
Ｃｙ３標識されたチオール修飾ｍｉＲ－１２６を上記のステップに従って脱保護し、次いで４の水溶液に添加した。溶液を４８時間撹拌し、３ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターに移した。溶液を洗浄し、３回濃縮し、次いでＰ－３０ゲルカラムに通過させて未反応の核酸を除去した。
Ｃｙ３標識されたチオール修飾ｍｉＲ－１２６を上記のステップに従って脱保護し、次いで４の水溶液に添加した。溶液を４８時間撹拌し、３ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎ遠心フィルターに移した。溶液を洗浄し、３回濃縮し、次いでＰ－３０ゲルカラムに通過させて未反応の核酸を除去した。
【0286】
ゲル電気泳動
精製したＤ－ｍｉＲ１２６、チオール修飾ｍｉＲ－１２６、およびｄｓＲＮＡラダーをＧＥＬＲＥＤ（登録商標）核酸染色剤およびグリセロール（１０％ｖ／ｖ）と混合し、１５％ＴＢＥ－尿素ゲルにロードした。ゲルに定電圧（１２０Ｖ）をかけ、ＣＨＥＭＩＤＯＣ（登録商標）イメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で可視化した。
精製したＤ－ｍｉＲ１２６、チオール修飾ｍｉＲ－１２６、およびｄｓＲＮＡラダーをＧＥＬＲＥＤ（登録商標）核酸染色剤およびグリセロール（１０％ｖ／ｖ）と混合し、１５％ＴＢＥ－尿素ゲルにロードした。ゲルに定電圧（１２０Ｖ）をかけ、ＣＨＥＭＩＤＯＣ（登録商標）イメージングシステム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で可視化した。
【0287】
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析
マトリックス２’－４’６’－トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（ＴＨＡＰ）を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル：水混合物（１：１）中に溶解した。Ｄ－ｍｉＲ１２６ ５μＬをＭＡＬＤＩ試料プレート上に１μｇ／μＬの濃度で沈着させ、続いてマトリックス混合物２μＬを沈着させた。Ｄ－ＰＤＰ ２μＬを試料プレート上に１μｇ／μＬの濃度で沈着させ、続いてマトリックス混合物２μＬを沈着させた。試料を一晩空気乾燥させ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳの反射ポジティブモードによって分析した。
マトリックス２’－４’６’－トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（ＴＨＡＰ）を、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で０．１％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル：水混合物（１：１）中に溶解した。Ｄ－ｍｉＲ１２６ ５μＬをＭＡＬＤＩ試料プレート上に１μｇ／μＬの濃度で沈着させ、続いてマトリックス混合物２μＬを沈着させた。Ｄ－ＰＤＰ ２μＬを試料プレート上に１μｇ／μＬの濃度で沈着させ、続いてマトリックス混合物２μＬを沈着させた。試料を一晩空気乾燥させ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳの反射ポジティブモードによって分析した。
【0288】
細胞系
ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）は、Ｌｏｎｚａから得、ＥＧＭＴＭ－２内皮細胞成長培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。ＢＶ－２ネズミマクロファージはＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙから提供され、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で培養した。全ての細胞系は加湿雰囲気下、３７℃および５％ＣＯ２で維持した。
ヒト微小血管内皮細胞（ＨＭＥＣ）は、Ｌｏｎｚａから得、ＥＧＭＴＭ－２内皮細胞成長培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。ＢＶ－２ネズミマクロファージはＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｍｉｃｈｉｇａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙから提供され、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で培養した。全ての細胞系は加湿雰囲気下、３７℃および５％ＣＯ２で維持した。
【0289】
Ｄ－ｍｉＲ１２６有効性のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価
ＨＭＥＣ血管形成アッセイ
ＨＭＥＣを、１×１０５細胞／ｍＬの密度で１２ウェルプレートに播種し、コンフルエンシーまで成長させた。次いで細胞をＤ－ｍｉＲ１２６およびｍｉＲ－１２６および完全血清培地と２４時間同時にインキュベートした。処置してから２４時間後、細胞をトリプシンでそれらを剥離することによって収集し、得られた細胞懸濁物を収集し、３００ｇで５分間遠心分離した。管形成アッセイをＬｏｎｚａによって提供されたプロトコールに従って行った。
ＨＭＥＣ血管形成アッセイ
ＨＭＥＣを、１×１０５細胞／ｍＬの密度で１２ウェルプレートに播種し、コンフルエンシーまで成長させた。次いで細胞をＤ－ｍｉＲ１２６およびｍｉＲ－１２６および完全血清培地と２４時間同時にインキュベートした。処置してから２４時間後、細胞をトリプシンでそれらを剥離することによって収集し、得られた細胞懸濁物を収集し、３００ｇで５分間遠心分離した。管形成アッセイをＬｏｎｚａによって提供されたプロトコールに従って行った。
【0290】
簡単に述べると、アッセイ当日、９６ウェルプレートにフェノール不含マトリゲル（登録商標）７５μＬをコーティングし、３７℃で２０分間重合させた。細胞ペレットを培地３００μＬで再懸濁し、溶液（４００，０００細胞／ｍＬ）７５μＬを、マトリゲル（登録商標）をコーティングした各ウェルに播種した。７時間後、得られた細胞ネットワークをＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００位相差顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でイメージングし、Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ－ＩｍａｇｅＪプラグインによって分析した（Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． １０， １１５６８ （２０２０））。
【0291】
炎症促進性および血管新生促進性ｍＲＮＡ発現のＰＣＲ分析
ＨＭＥＣを、完全血清条件でＤ－ｍｉＲ１２６またはｍｉＲ－１２６とともに２４時間インキュベートしてから試料を収集した。炎症促進性表現型を誘導するために、ＢＶ２ネズミマクロファージを、無血清培地中、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で３時間最初に刺激し、次いでＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＤ－ｍｉＲ１２６またはｍｉＲ－１２６で２４時間同時に処置した。
ＨＭＥＣを、完全血清条件でＤ－ｍｉＲ１２６またはｍｉＲ－１２６とともに２４時間インキュベートしてから試料を収集した。炎症促進性表現型を誘導するために、ＢＶ２ネズミマクロファージを、無血清培地中、ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で３時間最初に刺激し、次いでＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＤ－ｍｉＲ１２６またはｍｉＲ－１２６で２４時間同時に処置した。
【0292】
次いでＨＭＥＣおよびＢＶ２試料を、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）分析のためにＴＲＩｚｏｌを用いて収集した。簡単に述べると、試料に、ＴＲＩｚｏｌとともに凍結－解凍サイクルを行い、続いてクロロホルム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）２００μＬを添加した。試料を振とうし、氷中に１５分間入れた。水性層と有機層との分離を助けるため、試料を１５，０００ｇで１５分間遠心分離した。水溶液を収集し、イソプロパノールを各試料に添加した（５００μＬ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。試料を再び１５，０００ｇで１５分間遠心分離し、次いでＤＥＰＣ処置水中の７５％エタノールで洗浄した。
【0293】
ＲＮＡ含有量をＮａｎｏｄｒｏｐによって決定し、各試料からの同等の量のＲＮＡを相補的ＤＮＡに変換した（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。ＰＣＲ分析を、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ 試薬を用い、ＳＴＥＰ ＯＮＥ ＰＬＵＳ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。ＶＥＧＦ－Α、ＧＡＰＤＨ、およびＩＬ－１βのためのＰＣＲプライマーはＢｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から得た。プライマーはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入した。
【0294】
ＴＮＦαのためのプライマーは：
正方向：ＣＣＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＣＴＧＴＣＴＴ（配列番号６）；および
逆方向：ＡＡＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡ（配列番号７）
であった。
正方向：ＣＣＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＣＴＧＴＣＴＴ（配列番号６）；および
逆方向：ＡＡＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡ（配列番号７）
であった。
【0295】
レーザー誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）マウスモデルにおけるＤ－ｍｉＲ１２６のｉｎ ｖｉｖｏ評価
レーザー誘発ＣＮＶマウスモデル
全ての動物手順はＪｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）を通じて５～７週齢で得、一定温度および湿度（２０±１℃、５０±５％湿度）で飼育した。ＣＮＶのレーザー誘導より前に、ケタミン／キシラジン／アセプロマジンのカクテル（１００ｍｇ／ｋｇのケタミン、２０ｍｇ／ｋｇのキシラジン、および３ｍｇ／ｋｇのアセプロマジン）を腹腔内注射して動物に麻酔を行った。次いで動物に１滴の局所２．５％フェニレフリン（Ｐｈｙｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ）塩酸塩眼用溶液、続いて０．５％テトラカイン塩酸塩眼用溶液で処置して、瞳孔を散大させた。Ｍｉｃｒｏｎ ＩＩＩ ＳＬＯ（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を使用して眼底をイメージングし、付属のレーザーシステム（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）で焦点を合わせた。ブルッフ膜の４つの等距離の場所に、２４０ｍＷのレーザー出力設定、７０ｍ秒の持続時間でレーザー熱傷を生成した。
レーザー誘発ＣＮＶマウスモデル
全ての動物手順はＪｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）を通じて５～７週齢で得、一定温度および湿度（２０±１℃、５０±５％湿度）で飼育した。ＣＮＶのレーザー誘導より前に、ケタミン／キシラジン／アセプロマジンのカクテル（１００ｍｇ／ｋｇのケタミン、２０ｍｇ／ｋｇのキシラジン、および３ｍｇ／ｋｇのアセプロマジン）を腹腔内注射して動物に麻酔を行った。次いで動物に１滴の局所２．５％フェニレフリン（Ｐｈｙｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ）塩酸塩眼用溶液、続いて０．５％テトラカイン塩酸塩眼用溶液で処置して、瞳孔を散大させた。Ｍｉｃｒｏｎ ＩＩＩ ＳＬＯ（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）を使用して眼底をイメージングし、付属のレーザーシステム（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）で焦点を合わせた。ブルッフ膜の４つの等距離の場所に、２４０ｍＷのレーザー出力設定、７０ｍ秒の持続時間でレーザー熱傷を生成した。
【0296】
Ｄ－ｍｉＲ１２６およびｍｉＲ－１２６の投与
ＣＮＶ誘導後ただちに、Ｄ－ｍｉＲ１２６、ｍｉＲ－１２６、または生理食塩水シャム（ｓｈａｍ）を動物に投与した。簡単に述べると、３０Ｇインスリンシリンジを使用して強膜に注射開口部を生成した。次いで１０μＬのハミルトンシリンジを使用して硝子体腔内に直接処置を投与した。処置後、動物に局所眼用抗生物質（ゲンタマイシンおよび酢酸プレドニゾロン眼科用軟膏）を与えて感染症を予防した。次いで動物を処置後の設定した時点（７および１４日目）において屠殺してイメージングおよび生化学的分析を行った。
ＣＮＶ誘導後ただちに、Ｄ－ｍｉＲ１２６、ｍｉＲ－１２６、または生理食塩水シャム（ｓｈａｍ）を動物に投与した。簡単に述べると、３０Ｇインスリンシリンジを使用して強膜に注射開口部を生成した。次いで１０μＬのハミルトンシリンジを使用して硝子体腔内に直接処置を投与した。処置後、動物に局所眼用抗生物質（ゲンタマイシンおよび酢酸プレドニゾロン眼科用軟膏）を与えて感染症を予防した。次いで動物を処置後の設定した時点（７および１４日目）において屠殺してイメージングおよび生化学的分析を行った。
【0297】
生体内分布研究に関しては、核酸ベースで（１μｇ／μＬの濃度の）Ｃｙ５－Ｄ－ｍｉＲ１２６－Ｃｙ３またはｍｉＲ－１２６－Ｃｙ３ １μｇを上記のステップに従って動物に投与した。組織を設定した時点において抽出した（処置してから１、３、５、７、１４日後）。
【0298】
免疫組織化学およびイメージング
設定した時点において、動物を屠殺し、眼球摘出した眼を４％パラホルムアルデヒド中で１時間固定した。次いで脈絡膜および網膜を解剖して取り出した。組織をブロックし、一定の撹拌のもと室温で５％正常ヤギ血清、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、および１％ウシ血清アルブミンの溶液とともに２時間インキュベートすることによって透過処理した。マクロファージを可視化するために、組織を抗Ｉｂａ１抗体（１：１００；ＦＵＪＩＦＩＬＭ（登録商標）Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）で染色し、続いてＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５標識ヤギ抗ウサギ二次抗体（１：２００；Ａｂｃａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で染色した。血管をＦＩＴＣ標識イソレクチン（ＧＳＩＢ４）（１：１００；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）で染色した。
設定した時点において、動物を屠殺し、眼球摘出した眼を４％パラホルムアルデヒド中で１時間固定した。次いで脈絡膜および網膜を解剖して取り出した。組織をブロックし、一定の撹拌のもと室温で５％正常ヤギ血清、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、および１％ウシ血清アルブミンの溶液とともに２時間インキュベートすることによって透過処理した。マクロファージを可視化するために、組織を抗Ｉｂａ１抗体（１：１００；ＦＵＪＩＦＩＬＭ（登録商標）Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）で染色し、続いてＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）４０５標識ヤギ抗ウサギ二次抗体（１：２００；Ａｂｃａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で染色した。血管をＦＩＴＣ標識イソレクチン（ＧＳＩＢ４）（１：１００；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）で染色した。
【0299】
フラットマウントを、組織に４つの放射状の切開部を作製し、弛緩した組織をカバースリップにマウントすることによって生成した。ＣＮＶ形成は、生体内分布に関しては共焦点７１０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でイメージングし、領域計算に関してはＡｘｉｏｖｅｒｔ位相差顕微鏡でイメージングした。
【0300】
ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡアッセイ
眼を摘出後ただちに切開し、固定は行わなかった。脈絡膜を収集し、－８０℃で保存してから分析を行った。ＥＬＩＳＡ分析に関しては、脈絡膜をＴ－ＰＥＲタンパク質抽出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に浸し、Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ Ｓｔｏｒｍ組織ホモジナイザー（Ｎｅｘｔ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｉｎｃ．、Ａｖｅｒｉｌｌ Ｐａｒｋ、ＮＹ）で０．９～２．０ｍｍステンレス鋼ビーズを用いてホモジネートした。上清を遠心分離して水溶液を収集した。試料を－８０℃で保存し、さらなる処理を行うことなく使用してＶＥＧＦ－ΑレベルのＥＬＩＳＡ検出を行った。
眼を摘出後ただちに切開し、固定は行わなかった。脈絡膜を収集し、－８０℃で保存してから分析を行った。ＥＬＩＳＡ分析に関しては、脈絡膜をＴ－ＰＥＲタンパク質抽出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に浸し、Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｌｅｎｄｅｒ Ｓｔｏｒｍ組織ホモジナイザー（Ｎｅｘｔ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｉｎｃ．、Ａｖｅｒｉｌｌ Ｐａｒｋ、ＮＹ）で０．９～２．０ｍｍステンレス鋼ビーズを用いてホモジネートした。上清を遠心分離して水溶液を収集した。試料を－８０℃で保存し、さらなる処理を行うことなく使用してＶＥＧＦ－ΑレベルのＥＬＩＳＡ検出を行った。
【0301】
ＰＣＲに関しては、脈絡膜をＴＲＩｚｏｌ中に浸し、鋼ビーズを用いてホモジネートし、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＣＯＳＴＡＲ ＳＰＩＮ－Ｘ（登録商標）遠心管フィルター（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によってろ過して組織固形物を除去した。ＲＮＡを前述のプロトコールに従って単離し、ＲＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐによって決定した。同等の量のＲＮＡを相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換し、ＳＴＥＰ ＯＮＥ ＰＣＲ（登録商標）システムによってＦａｓｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ試薬を用い分析した。
【0302】
統計分析
データは、平均±ＳＥＭとして表され、分析はＧｒａｐｈＰａｄプリズム（バージョン９；Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）で行った。処置群は、時点または用量にわたって、分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定によって分析した。単一群間の有意差は、スチューデントのｔ検定で決定した：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
データは、平均±ＳＥＭとして表され、分析はＧｒａｐｈＰａｄプリズム（バージョン９；Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）で行った。処置群は、時点または用量にわたって、分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定によって分析した。単一群間の有意差は、スチューデントのｔ検定で決定した：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【0303】
結果
Ｄ－ｍｉＲ１２６中間体およびコンジュゲートの合成および特徴付け
再現性のある環境感受性コンジュゲーション戦略は、その有効性を低下させることなくｍｉＲＮＡを細胞内環境に有効に送達するのに必須である。このコンジュゲーション戦略は、ｍｉＲＮＡをデンドリマーナノ粒子に結合させるために実証されたグルタチオン感受性リンカーを利用した。デンドリマー表面は、スルフヒドリル基との還元可能なジスルフィド結合を容易に形成する反応性リンカーであるスクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネートで最初に修飾した。修飾の成功は、７．０１ｐｐｍに５つの芳香族プロトンおよび４．０６ｐｐｍに１２個のエステル連結されたプロトンの存在を示す１ＨＮＭＲスペクトルによって確認した。脱保護されチオール化されたｍｉＲ－１２６は修飾デンドリマーと反応させ、反応はゲル電気泳動によってモニターした。デンドリマー－ｍｉＲ１２６コンジュゲートの形成は、２７ｂｐにおける遊離ｍｉＲ－１２６と比較した場合の１５０ｂｐでのＴＢＥ－尿素ゲルにおける増加した保持時間で確認した。Ｄ－ｍｉＲ１２６のゲル電気泳動によって、１５０～３００ＲＮＡ ｂｐ（約９０～１８０ｋＤａ）に対応する長期の保持時間が示された。Ｄ－ｍｉＲ１２６における単一バンドの存在によって、遊離核酸が存在しないことが示唆された。対照的に、ｍｉＲ１２６と関連するバンドはさらに移動し、より小さなｂｐサイズを示した。Ｄ－ｍｉＲ１２６のＨＰＬＣクロマトグラフは１４．９７２分の保持時間を伴う単一ピークからなり、純粋な生成物を示した。
Ｄ－ｍｉＲ１２６中間体およびコンジュゲートの合成および特徴付け
再現性のある環境感受性コンジュゲーション戦略は、その有効性を低下させることなくｍｉＲＮＡを細胞内環境に有効に送達するのに必須である。このコンジュゲーション戦略は、ｍｉＲＮＡをデンドリマーナノ粒子に結合させるために実証されたグルタチオン感受性リンカーを利用した。デンドリマー表面は、スルフヒドリル基との還元可能なジスルフィド結合を容易に形成する反応性リンカーであるスクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネートで最初に修飾した。修飾の成功は、７．０１ｐｐｍに５つの芳香族プロトンおよび４．０６ｐｐｍに１２個のエステル連結されたプロトンの存在を示す１ＨＮＭＲスペクトルによって確認した。脱保護されチオール化されたｍｉＲ－１２６は修飾デンドリマーと反応させ、反応はゲル電気泳動によってモニターした。デンドリマー－ｍｉＲ１２６コンジュゲートの形成は、２７ｂｐにおける遊離ｍｉＲ－１２６と比較した場合の１５０ｂｐでのＴＢＥ－尿素ゲルにおける増加した保持時間で確認した。Ｄ－ｍｉＲ１２６のゲル電気泳動によって、１５０～３００ＲＮＡ ｂｐ（約９０～１８０ｋＤａ）に対応する長期の保持時間が示された。Ｄ－ｍｉＲ１２６における単一バンドの存在によって、遊離核酸が存在しないことが示唆された。対照的に、ｍｉＲ１２６と関連するバンドはさらに移動し、より小さなｂｐサイズを示した。Ｄ－ｍｉＲ１２６のＨＰＬＣクロマトグラフは１４．９７２分の保持時間を伴う単一ピークからなり、純粋な生成物を示した。
【0304】
精製したＤ－ｍｉＲ１２６にはまた、ＨＰＬＣ分析を行い、得られたクロマトグラフは１４．９７２分の保持時間を伴う１つの単一ピークからなり、分析物は純粋であったことが示唆された。さらに、分析物のＵＶプロファイルはデンドリマーおよび核酸の吸収波長にそれぞれ対応する２００ｎｍおよび２６０ｎｍにおいて２つの吸収ピークを示し、核酸のデンドリマープラットフォームへの取り込みが成功したことが示唆された。
【0305】
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分析を使用してコンジュゲート形成をさらに確認し、核酸負荷を決定した。Ｄ－ＰＤＰ前駆体およびＤ－ｍｉＲ１２６コンジュゲートの質量はそれぞれ、６０ｋＤａおよび６６ｋＤａであることが決定された。全ての他の中間体および生成物は、１Ｈ ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、またはゲル電気泳動を使用して特徴付けた。二重標識コンジュゲートに蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が可能かどうかを決定するために、試料を５４０ｎｍで励起し、得られた蛍光強度を、ＰＡＮＯＲＡＭＡ（登録商標）３ソフトウェア（Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）を実行したＲＦ５３０１ＰＣ蛍光分光光度計を用いて５５０～７２０ｎｍの範囲にわたって測定した。Ｃｙ３発光は５６５～５７５ｎｍからの強度として決定され、Ｃｙ５発光は６６５～６７５ｎｍからの強度として決定された。得られたスペクトルにおいてＣｙ５フルオロフォアの励起は観察されておらず、ＦＲＥＴに起因する蛍光はその後のイメージング実験において見込みがないことが示唆された。
【0306】
ＨＭＥＣおよびＢＶ２細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤ－ｍｉＲ１２６活性
ＢＶ２ネズミマクロファージおよびヒト微小血管内皮細胞系を選択して、Ｄ－ｍｉＲ１２６の炎症促進性および血管新生促進性のマーカーを減少させる有効性をそれぞれ試験した。ＬＰＳ刺激マクロファージは、未処置対照と比較して高レベルのＴＮＦαおよびＩＬ－１βを産生し、これらの炎症促進性サイトカインの産生は、Ｄ－ｍｉＲ１２６およびｍｉＲ－１２６で同時に処置した場合に減少した。２つの処置によってＴＮＦαの類似の（約５０％）ノックダウンが生じたが（図１０Ａ）、Ｄ－ｍｉＲ１２６で処置された細胞に関してはＩＬ－１βの用量依存的ノックダウンがあり、ｍｉＲ－１２６で処置された細胞に関しては逆用量応答があるようであった（図１０Ｂ）。ＴＮＦα応答は用量非依存的であるように思われる。
ＢＶ２ネズミマクロファージおよびヒト微小血管内皮細胞系を選択して、Ｄ－ｍｉＲ１２６の炎症促進性および血管新生促進性のマーカーを減少させる有効性をそれぞれ試験した。ＬＰＳ刺激マクロファージは、未処置対照と比較して高レベルのＴＮＦαおよびＩＬ－１βを産生し、これらの炎症促進性サイトカインの産生は、Ｄ－ｍｉＲ１２６およびｍｉＲ－１２６で同時に処置した場合に減少した。２つの処置によってＴＮＦαの類似の（約５０％）ノックダウンが生じたが（図１０Ａ）、Ｄ－ｍｉＲ１２６で処置された細胞に関してはＩＬ－１βの用量依存的ノックダウンがあり、ｍｉＲ－１２６で処置された細胞に関しては逆用量応答があるようであった（図１０Ｂ）。ＴＮＦα応答は用量非依存的であるように思われる。
【0307】
ＨＭＥＣにおける抗血管新生効果は２つの補完的方法で試験した。最初に、重要な血管新生サイトカインであるＶＥＧＦ－ΑのｍＲＮＡレベルを、ｍｉＲ－１２６およびＤ－ｍｉＲ１２６で処置された細胞ならびに未処置対照によって評価した。対照と比較して、Ｄ－ｍｉＲ１２６または遊離ｍｉＲ－１２６のいずれかで処置されたＨＭＥＣは、ＶＥＧＦ－Αのより低い産生をもたらし（約２０％ノックダウン）、血管新生活性を阻害することが示唆された（図１０Ｃ）。ＨＭＥＣにおけるＶＥＧＦ－Α抑制は極めて高い用量または低い用量のＤ－ｍｉＲ１２６で減少し、最適な投薬量は５～１０ｎＭであった。高用量のｍｉＲ－１２６（１０～１００ｎＭ）はより低い用量のＤ－ｍｉＲ１２６と同じレベルでＶＥＧＦ－Α発現を抑制した。
【0308】
次に、ＨＭＥＣの血管新生活性を管形成アッセイによって評価した。処置および未処置の細胞をマトリゲル（登録商標）マトリックス上で血管新生の条件に曝し、細胞ネットワークを自然に形成させた。次いでネットワークをＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｎａｌｙｚｅｒ、Ｉｍａｇｅ Ｊ用プラグインによって分析した。全ての尺度において、Ｄ－ｍｉＲ１２６またはｍｉＲ－１２６によって処置された細胞は、ネットワーク形成の撹乱、例えば、孤立した断片の増加、血管によって囲まれた領域の減少、およびネットワークの長さの減少を示した（図１１Ａ～１１Ｄ）。より低い用量のＤ－ｍｉＲ１２６での前処置は、マトリゲルマトリックス上でネットワークを形成するＨＭＥＣの能力を抑制した。対照的に、より高い用量の遊離ｍｉＲ－１２６は、ネットワーク形成を抑制するために必要とされた。
【0309】
Ｄ－ｍｉＲ１２６のｉｎ ｖｉｖｏでの抗血管新生活性
レーザー誘発ＣＮＶマウスモデルを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＮＶ形成を減少させることにおけるＤ－ｍｉＲ１２６コンジュゲートの有効性を評価した。モデルによって、７日目におよそ１２，０００μｍ２および１４日目に約９，０００μｍ２の領域で一貫したＣＮＶ形成が生成された。ＣＮＶ誘導日にＤ－ｍｉＲ１２６またはｍｉＲ－１２６の単回用量で処置されたマウスはより小さなＣＮＶ領域を生成した。７日目では、Ｄ－ｍｉＲ１２６処置動物のＣＮＶ領域は約７，０００μｍ２であり、同時にｍｉＲ－１２６処置動物の領域は約８，０００μｍ２であった。１４日目では、Ｄ－ｍｉＲ１２６処置ではＣＮＶ領域が対照と比較して約３０％（約６，０００μｍ２）減少し、同時にｍｉＲ－１２６処置ではＣＮＶ領域が約１０％（約８，０００μｍ２）しか減少しなかった（図１２Ａ～１２Ｂ）。したがって、単回用量のＤ－ｍｉＲ１２６処置は投与してから最大１４日後にＣＮＶ形成を抑制する。
レーザー誘発ＣＮＶマウスモデルを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＮＶ形成を減少させることにおけるＤ－ｍｉＲ１２６コンジュゲートの有効性を評価した。モデルによって、７日目におよそ１２，０００μｍ２および１４日目に約９，０００μｍ２の領域で一貫したＣＮＶ形成が生成された。ＣＮＶ誘導日にＤ－ｍｉＲ１２６またはｍｉＲ－１２６の単回用量で処置されたマウスはより小さなＣＮＶ領域を生成した。７日目では、Ｄ－ｍｉＲ１２６処置動物のＣＮＶ領域は約７，０００μｍ２であり、同時にｍｉＲ－１２６処置動物の領域は約８，０００μｍ２であった。１４日目では、Ｄ－ｍｉＲ１２６処置ではＣＮＶ領域が対照と比較して約３０％（約６，０００μｍ２）減少し、同時にｍｉＲ－１２６処置ではＣＮＶ領域が約１０％（約８，０００μｍ２）しか減少しなかった（図１２Ａ～１２Ｂ）。したがって、単回用量のＤ－ｍｉＲ１２６処置は投与してから最大１４日後にＣＮＶ形成を抑制する。
【0310】
Ｄ－ｍｉＲ１２６の抗血管新生機序を決定するために、ＶＥＧＦ－ΑレベルをＰＣＲおよびＥＬＩＳＡアッセイによって測定し、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦαおよびＩＬ－１β）をＰＣＲで測定した。ｍｉＲ－１２６およびＤ－ｍｉＲ１２６で処置されたマウスは、ＥＬＩＳＡによって測定されたように７日目にＶＥＧＦ－Αタンパク質において有意な減少が得られた。さらに、Ｄ－ｍｉＲ１２６では、ｍｉＲ－１２６処置と比較してＶＥＧＦ－Αタンパク質レベルが有意に減少した。しかし１４日目まで、処置および未処置動物でのＶＥＧＦレベルにおける差はなかった（図１３Ａ）。７日目のＶＥＧＦの減少傾向は、ＰＣＲによって測定されたｍＲＮＡレベルによって実証されたが、その傾向は、大きな分散に起因して有意ではなかった。興味深いことに、ＶＥＧＦタンパク質レベルは１４日目に同様であるように見えたが、ＶＥＧＦ－Α ｍＲＮＡレベルはＤ－ｍｉＲ１２６およびｍｉＲ－１２６処置動物において未だに減少したままであった（図１３Ｂ）。Ｄ－ｍｉＲ１２６は、ＶＥＧＦ－Α ｍＲＮＡを減少させることにおいてより有効であるように思われた。
【0311】
Ｄ－ｍｉＲ１２６およびｍｉＲ－１２６で処置された動物は炎症性ｍＲＮＡの減弱をもたらした。７日目に、Ｄ－ｍｉＲ１２６で処置された動物は、より低いレベルのＩＬ－１βをもたらしたが、減少は１４日目では持続されなかった（図１３Ｄ）。逆に、Ｄ－ｍｉＲ１２６およびｍｉＲ－１２６処置は、１４日目に測定されたようにより遅い時点でのみＴＮＦα産生に対してその効果を発揮するように思われた（図１３Ｃ）。ＴＮＦα ｍＲＮＡは、Ｄ－ｍｉＲ１２６処置またはｍｉＲ－１２６処置のいずれでも早い時点（７日）で上昇したが、統計的に有意ではなかった。その後、両処置は１４日にＴＮＦαを抑制した。
【0312】
ｉｎ ｖｉｖｏ分布
取り込みおよび分布を評価するために、Ｃｙ３標識ｍｉＲ－１２６および二重標識Ｃｙ５－Ｄ－ｍｉＲ１２６－Ｃｙ３をレーザーＣＮＶマウスモデルに注射し、脈絡膜を注射してから１、３、５、７、１４日後に収集した。Ｉｂａ１染色は、マクロファージの細胞内環境を可視化するために使用し、イソレクチンＧＳ－ＩＢ４は、血管とマクロファージの両方を染色するために使用した。硝子体内注射されたＤ－ｍｉＲ１２６は注射の１日以内にＣＮＶ領域に局在し、これは、Ｃｙ３（ｍｉＲ－１２６）、Ｃｙ５（デンドリマー）、イソレクチン（ＣＮＶ血管）およびＩｂａ１（マクロファージ）の共局在によって認められた。共局在のパターンは最大１４日間維持された。ｍｉＲ－１２６はまた、最大７日間ＣＮＶ標的領域に局在するように思われたが、取り込みパターンはより断続的であり、マクロファージ染色とより相関するように思われ、一方Ｄ－ｍｉＲ１２６の広範な取り込みが存在した。さらに、Ｄ－ｍｉＲ１２６は、共焦点顕微鏡によって検出されたように最大１４日間標的領域中に滞在し、一方、ｍｉＲ－１２６の大部分は７日までに除去された。
取り込みおよび分布を評価するために、Ｃｙ３標識ｍｉＲ－１２６および二重標識Ｃｙ５－Ｄ－ｍｉＲ１２６－Ｃｙ３をレーザーＣＮＶマウスモデルに注射し、脈絡膜を注射してから１、３、５、７、１４日後に収集した。Ｉｂａ１染色は、マクロファージの細胞内環境を可視化するために使用し、イソレクチンＧＳ－ＩＢ４は、血管とマクロファージの両方を染色するために使用した。硝子体内注射されたＤ－ｍｉＲ１２６は注射の１日以内にＣＮＶ領域に局在し、これは、Ｃｙ３（ｍｉＲ－１２６）、Ｃｙ５（デンドリマー）、イソレクチン（ＣＮＶ血管）およびＩｂａ１（マクロファージ）の共局在によって認められた。共局在のパターンは最大１４日間維持された。ｍｉＲ－１２６はまた、最大７日間ＣＮＶ標的領域に局在するように思われたが、取り込みパターンはより断続的であり、マクロファージ染色とより相関するように思われ、一方Ｄ－ｍｉＲ１２６の広範な取り込みが存在した。さらに、Ｄ－ｍｉＲ１２６は、共焦点顕微鏡によって検出されたように最大１４日間標的領域中に滞在し、一方、ｍｉＲ－１２６の大部分は７日までに除去された。
【0313】
Ｄ－ｍｉＲ１２６の取り込みは２４時間でＣＮＶ領域およびその周辺に限定され、遊離ｍｉＲ－１２６の分布と類似していた。しかし、Ｄ－ｍｉＲ１２６コンジュゲートは最大１４日間標的領域で保持された。その後の時点では、Ｄ－ｍｉＲ１２６は、マクロファージ中に優先的に局在するようであり、大部分のデンドリマーＣｙ５シグナルおよびｍｉＲ－１２６Ｃｙ３シグナルはＩｂａ１抗体と共局在した。ｍｉＲ－１２６の取り込みは硝子体内注射から２４時間後にＣＮＶ領域およびそのすぐ周辺に単離された。蛍光顕微鏡によってイメージングされたように、大部分の遊離ｍｉＲＮＡは７日までに除去された。１４日目では、ｍｉＲＮＡは標的領域にほとんど残っていなかった。Ｃｙ５蛍光の不在は、遊離ｍｉＲＮＡ処置群におけるデンドリマーの欠如に対応する。
【0314】
２つの染色された細胞集団内で共局在しているシグナルの割合も分析した（図１４）。遊離ｍｉＲ－１２６は、５日間にわたってマクロファージおよび内皮細胞によって徐々に取り込まれた。注射してから２４時間後に、Ｉｂａ１シグナルと共局在した割合によって示されたように、およそ２％のｍｉＲ－１２６がマクロファージ内で検出され、マクロファージおよび内皮細胞組合せ集団（イソレクチンＧＳ－ＩＢ４で染色した）においておよそ３％のｍｉＲ－１２６が検出された。シグナルは５日でビークに達し、約１０％のシグナルがマクロファージ内で共局在しており、約１５％がマクロファージ／内皮細胞組合せ集団内で共局在していた。
【0315】
対照的に、Ｄ－ｍｉＲ１２６はＣＮＶ領域内の常在マクロファージによって急速に取り込まれ、およそ約８％のシグナルがマクロファージ染色とともに共局在していた。興味深いことに、２％のシグナルのみが、マクロファージ／内皮細胞組合せ集団において観察された。しかし、３日目には、Ｃｙ３標識ｍｉＲ－１２６からのシグナル分布は、異なる細胞集団間でさらに均一に分布するように移動したと思われる。およそ約６％のシグナルはＩｂａ－１と局在し、類似のパーセンテージがイソレクチンＧＳ－ＩＢ４と局在した。Ｉｂａ－１陽性細胞内およびイソレクチン染色した細胞内のシグナルの比率は、残りの時点に関して依然として類似したままであった。さらに、２つの細胞集団内に共局在したｍｉＲ－１２６のレベルは、７日目の低下を除いて、時間的経過とともに依然として比較的に安定（約１０％）のままである。デンドリマー（Ｃｙ５）とｍｉＲ－１２６（Ｃｙ３）との間の共局在シグナルもｉｎ ｖｉｖｏでのペイロード放出の尺度として調査した。注射後２４時間で、約５０％のｍｉＲ－１２６がデンドリマープラットフォームから放出され、ｍｉＲ－１２６の総放出は１４日目までに約８０％に増加した。
【0316】
考察
マイクロＲＮＡは、特定の疾患の進行に関与する複数の標的と結合し分解するその能力に起因して強力な処置選択肢である。しかしこれは、ｍｉＲＮＡの適正細胞への送達がオフターゲット効果を回避し、その有効性を最適化するために極めて重要であることも意味する。デンドリマープラットフォームは、炎症および血管新生の領域を選択的に標的とし、脈絡膜血管新生を処置するためにｍｉＲＮＡを有効に送達することが実証されている。
マイクロＲＮＡは、特定の疾患の進行に関与する複数の標的と結合し分解するその能力に起因して強力な処置選択肢である。しかしこれは、ｍｉＲＮＡの適正細胞への送達がオフターゲット効果を回避し、その有効性を最適化するために極めて重要であることも意味する。デンドリマープラットフォームは、炎症および血管新生の領域を選択的に標的とし、脈絡膜血管新生を処置するためにｍｉＲＮＡを有効に送達することが実証されている。
【0317】
このプラットフォームは、生体適合性であり、長い循環時間を有することが示されている第６世代ＰＡＭＡＭデンドリマーを利用している。表面は、環境感受性のジスルフィドリンカーで修飾されており、そのリンカーは核酸に結合し、細胞内コンパートメントにおいてペイロードを選択的に放出するように使用することができる。表面に結合したＰＤＰリンカー部分の数は、立体障害の検討事項に起因して、最終化合物においてデンドリマー対ｍｉＲＮＡの１：１の化学量論比よりも多かった。デンドリマー－ｍｉＲＮＡコンジュゲーション化学は２つの大きな生体分子を伴うため、コンジュゲーション効率が低いことが予想され、したがって、コンジュゲート形成を増加させるために多くの結合部位が含まれていた。さらに、デンドリマープラットフォームへの結合を促進するためにｍｉＲ－１２６を過剰に添加した。精製後、ゲル電気泳動およびＨＰＬＣによって、コンジュゲートの形成および未反応の核酸の除去が確認された。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦとゲル電気泳動との組合せによって、１：１（デンドリマー：ｍｉＲＮＡ）での核酸負荷が推定された。
【0318】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでのシンク条件では、複雑なタンパク質相互作用、競合する細胞集団、および消失機序なしに、細胞が化合物を自由に取り込むことができるため、Ｄ－ｍｉＲ１２６およびｍｉＲ－１２６において類似の性能が期待された。ＨＭＥＣでは、ＶＥＧＦ－Α産生の減少において、Ｄ－ｍｉＲ１２６およびｍｉＲ－１２６の性能に有意差は観察されなかった。同様に、このような予想と一致して、ＴＮＦα ｍＲＮＡレベルにおける減少は、Ｄ－ｍｉＲ１２６およびｍｉＲ－１２６処置ＢＶ２細胞に関しては類似していた。しかし興味深いことに、ＩＬ－１βレベルはプラットフォームに依存して異なる用量応答を示すと思われる。Ｄ－ｍｉＲ１２６処置細胞に関しては、強力な用量応答が観察され、より高いノックダウン効果が１００ｎＭで認められた。対照的に、ｍｉＲ－１２６処置細胞は逆応答を示し、高いノックダウン効果は、最も有効なＤ－ｍｉＲ１２６濃度よりも低い１０ｎＭで認められた。
【0319】
この効果は、ｍｉＲＮＡの複雑な用量－依存的効果とＤ－ｍｉＲ１２６の遅い放出の両方に起因し得る。最初に、理論的モデルによって、ｍｉＲＮＡとその標的のプールおよびシグナル伝達経路との複雑な相互作用の解読が試みられた。特に、ｍｉＲＮＡは、その濃度、他の標的に対する親和性、およびシグナル伝達経路からのフィードバックに依存して異なる標的に優先的に影響を与える場合がある。結果的に、所望の標的に依存して、異なる用量のｍｉＲＮＡがその有効性を最適化するために必要とされる場合がある。これによって、ＢＶ２細胞におけるＩＬ－１βｍＲＮＡ産生で観察された逆の関係を部分的に説明することができる。
【0320】
さらに、デンドリマー－コンジュゲートは、遅い放出プロファイルを示し、ＲＩＳＣが結合したｍｉＲＮＡにアクセスするのを制限することが示されている。Ｄ－ｍｉＲ１２６の場合、ｍｉＲＮＡペイロードの放出が十分遅い場合があり、ｍｉＲＮＡの一部のみがアッセイ期間にわたってその効果を示すことができる。結果的に、Ｄ－ｍｉＲ１２６の処置濃度を増加させると、細胞質ゾルにおいて放出されたｍｉＲ－１２６の量が部分的にしか増加せず、最適な治療濃度範囲が維持された。細胞質ゾルｍｉＲ－１２６の利用可能濃度が最適濃度の範囲内であったため、有効性は逆応答ではなく用量－依存的応答を示した。
【0321】
管形成アッセイでは、Ｄ－ｍｉＲ１２６およびｍｉＲ－１２６で処置されたＨＭＥＣは、低用量のＤ－ｍｉＲ１２６で細胞ネットワーク撹乱を示し、ネットワーク形成抑制において高い有効性を示した。遊離ｍｉＲ－１２６と比較してＤ－ｍｉＲ１２６の有効性における増加は、ＨＭＥＣが、ｍｉＲ－１２６処置なしでマトリゲル（登録商標）によって刺激された場合、ｍｉＲ－１２６のより安定な細胞内濃度を維持することができる遅い放出機序に起因する場合がある。
【0322】
ｍｉＲＮＡ濃度と標的選択性との間の複雑な相互作用のため、化合物はレーザー誘発ＣＮＶマウスモデルにおいて評価した。最初に、Ｄ－ｍｉＲ１２６およびｍｉＲ－１２６の分布を共焦点顕微鏡によって決定し、Ｄ－ｍｉＲ１２６は、標的ＣＮＶ領域内に長く滞在するだけではなく、血管新生に重要な２つの細胞サブ集団であるマクロファージと内皮細胞の両方に分布するように見えたことが認められた。これは、Ｄ－ｍｉＲ１２６が、ＣＮＶ形成の血管新生応答と炎症性応答の両方に影響を与える場合があり、より長い期間にわたって与えることができ、追加の用量の必要性を低下させることを示す。
【0323】
ＣＮＶ減弱の有効性を評価するために、処置および未処置マウスの脈絡膜を７日目および１４日目に調査した。Ｄ－ｍｉＲ１２６処置マウスの領域は１４日目にＣＮＶ減少を有意に低下させ、同時にｍｉＲ－１２６処置マウスは領域において有意ではない減少をもたらした。領域の減少は、ＰＣＲまたはＥＬＩＳＡアッセイのいずれかによって測定されたように、ＶＥＧＦ－Α、ＴＮＦα、およびＩＬ－１βレベルにおける減少と十分に相関している。さらに、蛍光標識ｍｉＲ－１２６およびデンドリマー、ならびに染色したマクロファージおよび内皮細胞の共局在測定によって、遊離ｍｉＲ－１２６とＤ－ｍｉＲ１２６との間の取り込み速度論および分布特性における差が明らかになった。Ｄ－ｍｉＲ１２６は、遊離ｍｉＲ－１２６と比較して早い時点でより高い細胞内濃度を達成し、ペイロードは経時的に徐々に放出されるように思われた。取り込みにおけるこの差は、早期の段階でｍｉＲ－１２６の治療的効力を強化し、その後の時点でその有効性を延長する場合がある。
【0324】
結論
複数のタンパク質および経路を標的とするためのｍｉＲＮＡの柔軟性は、これまで処置できなかった疾患の処置における強力なツールとすることができる。しかし、その効力の利用は有効な送達および投薬に依存する。ｍｉＲＮＡを選択した細胞集団に標的化された送達をするためのデンドリマープラットフォームが確立された。さらに、ｍｉＲＮＡ投薬に関するデンドリマーの効果が特徴付けられ、臨床的に関連するモデルの処置におけるデンドリマー－ｍｉＲＮＡコンジュゲートの有効性も検証した。本研究によって、臨床的に移行可能なｍｉＲＮＡ療法の開発に向けた大きなステップとなる。
複数のタンパク質および経路を標的とするためのｍｉＲＮＡの柔軟性は、これまで処置できなかった疾患の処置における強力なツールとすることができる。しかし、その効力の利用は有効な送達および投薬に依存する。ｍｉＲＮＡを選択した細胞集団に標的化された送達をするためのデンドリマープラットフォームが確立された。さらに、ｍｉＲＮＡ投薬に関するデンドリマーの効果が特徴付けられ、臨床的に関連するモデルの処置におけるデンドリマー－ｍｉＲＮＡコンジュゲートの有効性も検証した。本研究によって、臨床的に移行可能なｍｉＲＮＡ療法の開発に向けた大きなステップとなる。
【0325】
（実施例４）
黄斑変性症を処置するためのデンドリマーコンジュゲート
先進国では、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）に起因して何百万もの高齢患者が視力損失のリスクに直面しており、これらの患者のおよそ１０％が湿性ＡＭＤを発症することになる。湿性ＡＭＤは複雑なプロセスであり、脈絡膜血管新生が、ブルッフ膜を通して脈絡膜から血管を押し出して網膜色素上皮（ＲＰＥ）を移動させるかまたは破壊する。湿性ＡＭＤの疾患進行における主な因子は、新規の血管の成長を促進する眼における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現の上昇である。結果的に湿性ＡＭＤに関する現行の標準ケアの大半は、抗ＶＥＧＦ抗体、例えばアフリベルセプトの硝子体内注射によってＶＥＧＦを直接標的とすることである。しかし、患者のかなりの部分（約１／３）はこれらの治療法に応答せず、処置レジメンへの患者の最適な遵守にもかかわらず視力がさらに低下する場合がある（Ｄ． Ｖｏｇｔ， Ｖ． Ｄｅｉｔｅｒｓ， Ｔ． Ｒ． Ｈｅｒｏｌｄ， Ｓ． Ｒ． Ｇｕｅｎｔｈｅｒ， Ｋ． Ｕ． Ｋｏｒｔｕｅｍ， Ｓ． Ｇ． Ｐｒｉｇｌｉｎｇｅｒ， Ａ． Ｗｏｌｆ， ａｎｄ Ｒ． Ｇ． Ｓｃｈｕｍａｎｎ， Ｃｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ， ２０２２， １－８）。
黄斑変性症を処置するためのデンドリマーコンジュゲート
先進国では、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）に起因して何百万もの高齢患者が視力損失のリスクに直面しており、これらの患者のおよそ１０％が湿性ＡＭＤを発症することになる。湿性ＡＭＤは複雑なプロセスであり、脈絡膜血管新生が、ブルッフ膜を通して脈絡膜から血管を押し出して網膜色素上皮（ＲＰＥ）を移動させるかまたは破壊する。湿性ＡＭＤの疾患進行における主な因子は、新規の血管の成長を促進する眼における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現の上昇である。結果的に湿性ＡＭＤに関する現行の標準ケアの大半は、抗ＶＥＧＦ抗体、例えばアフリベルセプトの硝子体内注射によってＶＥＧＦを直接標的とすることである。しかし、患者のかなりの部分（約１／３）はこれらの治療法に応答せず、処置レジメンへの患者の最適な遵守にもかかわらず視力がさらに低下する場合がある（Ｄ． Ｖｏｇｔ， Ｖ． Ｄｅｉｔｅｒｓ， Ｔ． Ｒ． Ｈｅｒｏｌｄ， Ｓ． Ｒ． Ｇｕｅｎｔｈｅｒ， Ｋ． Ｕ． Ｋｏｒｔｕｅｍ， Ｓ． Ｇ． Ｐｒｉｇｌｉｎｇｅｒ， Ａ． Ｗｏｌｆ， ａｎｄ Ｒ． Ｇ． Ｓｃｈｕｍａｎｎ， Ｃｕｒｒ Ｅｙｅ Ｒｅｓ， ２０２２， １－８）。
【0326】
他の治療モダリティ、例えばインテグリン結合ペプチドは患者における湿性ＡＭＤの進行を停止させるために開発されている。これらのペプチド拮抗薬は細胞表面インテグリン、例えばαＶβ３、α５β１、およびα５β３に強く結合し、これらのインテグリンの下流シグナル伝達を阻害する。特に、これらのインテグリン拮抗薬はＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化を減少させ、次にさまざまな炎症促進性および血管新生促進性のサイトカイン、例えばＶＥＧＦ－Α、ＴＮＦ－α、およびＩＬ１βの発現を減弱させる。Ｌｕｍｉｎａｔｅ（またはＡＬＧ－１００１）はこのようなインテグリン結合ペプチドの１つであり、血管新生の停止において成功していることが実証されており、現在のところＡＭＤおよび糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）における適用に関して臨床治験が行われている。しかし、ペプチドベースの拮抗薬は、急速な酵素分解および腎臓クリアランスを含む広範な送達課題に悩まされている。したがって、これらの治療法は、現在のところ硝子体内注射に限定されており、後進国における患者への利用可能性が限定されるだけではなく、眼内炎、眼圧上昇（ＩＯＰ）、および刺激のリスクも有する。
【0327】
材料および方法：
化学物質および試薬
メタノール溶液中のヒドロキシル末端エチレンジアミンコアＰＡＭＡＭデンドリマー（第６世代、医薬品グレード）はＤｅｎｄｒｉｔｅｃｈ（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ、ＵＳＡ）から購入した。使用前に、デンドリマー溶液はロータリーエバポレーターで蒸発させた。透析膜（ＭＷＣＯ １ｋＤａ）はＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，、ＮＪ、ＵＳＡ）から購入した。ＡＬＧ－１００１およびアジドリンカーで修飾されたＡＬＧ－１００１はＢｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ、ＵＳＡ）から購入した。重水素化溶媒（ＤＭＳＯ－ｄ６）、メタノール（ＣＤ３ＯＤ）、および水（Ｄ２Ｏ）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。プロテイナーゼＫストック溶液およびダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌ－グルタミンを含む低グルコース）はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。ヒト臍帯静脈内皮細胞および必要な培地キットはＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。フェノールレッド不含マトリゲルはＣｏｒｎｉｎｇ（Ｔｅｗｋｓｂｅｒｒｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。
化学物質および試薬
メタノール溶液中のヒドロキシル末端エチレンジアミンコアＰＡＭＡＭデンドリマー（第６世代、医薬品グレード）はＤｅｎｄｒｉｔｅｃｈ（Ｍｉｄｌａｎｄ、ＭＩ、ＵＳＡ）から購入した。使用前に、デンドリマー溶液はロータリーエバポレーターで蒸発させた。透析膜（ＭＷＣＯ １ｋＤａ）はＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，、ＮＪ、ＵＳＡ）から購入した。ＡＬＧ－１００１およびアジドリンカーで修飾されたＡＬＧ－１００１はＢｉｏ－Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ、ＵＳＡ）から購入した。重水素化溶媒（ＤＭＳＯ－ｄ６）、メタノール（ＣＤ３ＯＤ）、および水（Ｄ２Ｏ）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。プロテイナーゼＫストック溶液およびダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌ－グルタミンを含む低グルコース）はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。ヒト臍帯静脈内皮細胞および必要な培地キットはＬｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。フェノールレッド不含マトリゲルはＣｏｒｎｉｎｇ（Ｔｅｗｋｓｂｅｒｒｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。
【0328】
機器の使用
核磁気共鳴
Ｂｒｕｋｅｒ ５００－ＭＨｚ分光計を使用して周囲温度で１Ｈ ＮＭＲスペクトルを得た。化学シフトは、内部標準として使用したテトラメチルシランに対する１００万分の１で報告しており、残留プロトン性溶媒ピークを使用して化学シフトを較正した。ＤＭＳＯ－ｄ６（δ＝２．５０ｐｐｍ）。スペクトルにおける共鳴多重度は「ｓ」（シングレット）、「ｄ」（ダブレット）、「ｔ」（トリプレット）、および「ｍ」（マルチプレット）として示す。ブロードな共鳴は「ｂ」で示す。
核磁気共鳴
Ｂｒｕｋｅｒ ５００－ＭＨｚ分光計を使用して周囲温度で１Ｈ ＮＭＲスペクトルを得た。化学シフトは、内部標準として使用したテトラメチルシランに対する１００万分の１で報告しており、残留プロトン性溶媒ピークを使用して化学シフトを較正した。ＤＭＳＯ－ｄ６（δ＝２．５０ｐｐｍ）。スペクトルにおける共鳴多重度は「ｓ」（シングレット）、「ｄ」（ダブレット）、「ｔ」（トリプレット）、および「ｍ」（マルチプレット）として示す。ブロードな共鳴は「ｂ」で示す。
【0329】
高速液体クロマトグラフィー
１５２５バイナリポンプを備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）、およびインラインデガッサーＡＦ、７１７プラスオートサンプラー、およびＷａｔｅｒｓ Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェアとインターフェースで連結した２９９８フォトダイオードアレイ検出器を使用して化合物の純度を決定した。カラムは粒子サイズ５μｍ、長さ２５ｃｍ、および内部直径４．６．ｍｍのＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８逆相カラムであった。クロマトグラムは、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器を使用して２１０、６５０、および５３０ｎｍでモニターした。分析は９５：５（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）で出発し、３０分で５０：５０（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）に増加させ、１０分で９５：５（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）に戻る勾配フローで流量１ｍｌ／分で行った。
１５２５バイナリポンプを備えたＷａｔｅｒｓ ＨＰＬＣ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）、およびインラインデガッサーＡＦ、７１７プラスオートサンプラー、およびＷａｔｅｒｓ Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェアとインターフェースで連結した２９９８フォトダイオードアレイ検出器を使用して化合物の純度を決定した。カラムは粒子サイズ５μｍ、長さ２５ｃｍ、および内部直径４．６．ｍｍのＷａｔｅｒｓ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８逆相カラムであった。クロマトグラムは、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器を使用して２１０、６５０、および５３０ｎｍでモニターした。分析は９５：５（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）で出発し、３０分で５０：５０（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）に増加させ、１０分で９５：５（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）に戻る勾配フローで流量１ｍｌ／分で行った。
【0330】
デンドリマーコンジュゲートの合成
デンドリマー－ヘキシンの合成
５－ヘキシン酸およびＤＭＡＰを無水ＤＭＦ中のＤ－ＯＨの溶液に添加し、室温で１５分間撹拌した。ＥＤＣ・ＨＣｌを、得られた透明溶液に３等分して添加し、溶液を室温で一晩撹拌した。反応混合物を、８時間間隔で溶媒を交換しながら、ＤＭＦに対して２ｋＤａ ＭＷカットオフセルロース透析膜による透析で精製した。２４時間後、混合物を、１２時間間隔で溶媒を交換しながら水に対して２４時間透析した。最終水溶液を凍結乾燥して生成物を白色固形物として得た。
デンドリマー－ヘキシンの合成
５－ヘキシン酸およびＤＭＡＰを無水ＤＭＦ中のＤ－ＯＨの溶液に添加し、室温で１５分間撹拌した。ＥＤＣ・ＨＣｌを、得られた透明溶液に３等分して添加し、溶液を室温で一晩撹拌した。反応混合物を、８時間間隔で溶媒を交換しながら、ＤＭＦに対して２ｋＤａ ＭＷカットオフセルロース透析膜による透析で精製した。２４時間後、混合物を、１２時間間隔で溶媒を交換しながら水に対して２４時間透析した。最終水溶液を凍結乾燥して生成物を白色固形物として得た。
【0331】
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ） δ ８．０６－７．７９ （ｍ， 内部アミド５１０Ｈ）， ４．７３ （ｓ， 表面ＯＨ， ２３２Ｈ）， ４．０６ （ｓ， エステル連結， ２２Ｈ）， ３．４０ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．３３ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．１８－３．１１ （ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．６４ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．４３ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．２０ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， １．６８ （ｔ， アセチレン， ３０Ｈ）．保持時間：１９．５８分。
【0332】
ＢＯＣ－ＧＡＢＡ－Ｄ－ヘキシンの合成
Ｄ－ヘキシンを無水ＤＭＦ中に溶解し、ＢＯＣ－ＧＡＢＡ－ＯＨおよびＤＭＡＰを添加した。溶液を１５分間撹拌してからＥＤＣ・ＨＣｌを３等分に分けて添加した。溶液を一晩撹拌し、透析で精製し、凍結乾燥して生成物を白色固形物として得た。
Ｄ－ヘキシンを無水ＤＭＦ中に溶解し、ＢＯＣ－ＧＡＢＡ－ＯＨおよびＤＭＡＰを添加した。溶液を１５分間撹拌してからＥＤＣ・ＨＣｌを３等分に分けて添加した。溶液を一晩撹拌し、透析で精製し、凍結乾燥して生成物を白色固形物として得た。
【0333】
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．０６－７．７９ （ｍ， 内部アミド５１０Ｈ）， ４．７３ （ｓ， 表面ＯＨ， １９９Ｈ）， ４．０６ （ｓ， エステル連結， ４０Ｈ）， ３．４０ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．３３ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．１８－３．１１ （ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．６４ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．４３ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．２０ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， １．６８ （ｔ， アセチレン， ２７Ｈ）， １．３６ （ｓ， ＢＯＣ， ６８Ｈ）．
【0334】
ＧＡＢＡ－Ｄ－ヘキシンの合成
ＢＯＣ－ＧＡＢＡ－Ｄ－ヘキシンの脱保護を無水条件下で行った。化合物を丸底フラスコに入れ、無水ＤＣＭを窒素雰囲気下で添加した。溶液を絶えず撹拌し、超音波処理して白濁した粘着性の懸濁物を形成した。次いでＴＦＡを懸濁物に４：１の比率（ＤＣＭ：ＴＦＡ）で添加し、溶液を一晩撹拌した。次いでＤＣＭを、ロータリーエバポレーターを使用して蒸発させた。ＴＦＡを、反応混合物をメタノールで繰り返し希釈し、得られた溶液を蒸発させることによって除去した。次いで生成物を高真空下に３時間置き、さらに精製することなく使用した。
ＢＯＣ－ＧＡＢＡ－Ｄ－ヘキシンの脱保護を無水条件下で行った。化合物を丸底フラスコに入れ、無水ＤＣＭを窒素雰囲気下で添加した。溶液を絶えず撹拌し、超音波処理して白濁した粘着性の懸濁物を形成した。次いでＴＦＡを懸濁物に４：１の比率（ＤＣＭ：ＴＦＡ）で添加し、溶液を一晩撹拌した。次いでＤＣＭを、ロータリーエバポレーターを使用して蒸発させた。ＴＦＡを、反応混合物をメタノールで繰り返し希釈し、得られた溶液を蒸発させることによって除去した。次いで生成物を高真空下に３時間置き、さらに精製することなく使用した。
【0335】
Ｃｙ５－Ｄ－ヘキシンの合成
ＧＡＢＡ－Ｄ－ヘキシンを無水ＤＭＦ、続いてＤＩＰＥＡ中に溶解し、最終的にＣｙ５ ＮＨＳエステルを添加した。反応物を一晩撹拌し、反応混合物を、２ｋＤａ膜によってＤＭＦに対して２４時間透析した。次いで混合物を水に対してさらに２４時間透析し、凍結乾燥して固形の青色生成物を得た。
ＧＡＢＡ－Ｄ－ヘキシンを無水ＤＭＦ、続いてＤＩＰＥＡ中に溶解し、最終的にＣｙ５ ＮＨＳエステルを添加した。反応物を一晩撹拌し、反応混合物を、２ｋＤａ膜によってＤＭＦに対して２４時間透析した。次いで混合物を水に対してさらに２４時間透析し、凍結乾燥して固形の青色生成物を得た。
【0336】
１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６） δ ８．０６－７．７９ （ｍ， 内部アミド５１０Ｈ）， ７．３５ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．２５ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ７．０５ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ６．６ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ６．３ （ｍ， Ｃｙ５ Ｈ）， ４．７３ （ｓ， 表面ＯＨ， １９９Ｈ）， ４．０６ （ｓ， エステル連結， ４０Ｈ）， ３．４０ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．３３ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．１８－３．１１ （ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．６４ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．４３ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．２０ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， １．６８ （ｔ， アセチレン， ２７Ｈ）．保持時間：１８．０１分。
【0337】
Ｄ－ＡＬＧ１００１およびＣｙ５－Ｄ－ＡＬＧ１００１の合成
ＡＬＧ－１００１を超純水中に溶解し、非標識のコンジュゲートのためにＤ－ヘキシンの水溶液に添加した。ＡＬＧ－１００１－Ｃｙ３を超純水中に溶解し、二重標識コンジュゲートのためにＣｙ５－Ｄ－ヘキシンの水溶液に添加した。硫酸銅溶液を添加し、溶液を室温で１０分間撹拌してからアスコルビン酸ナトリウムを添加した。精製に関しては、両反応物を室温で一晩放置し、次いで水に対して２４時間透析した。各溶液を凍結乾燥して粉末生成物を得た。
ＡＬＧ－１００１を超純水中に溶解し、非標識のコンジュゲートのためにＤ－ヘキシンの水溶液に添加した。ＡＬＧ－１００１－Ｃｙ３を超純水中に溶解し、二重標識コンジュゲートのためにＣｙ５－Ｄ－ヘキシンの水溶液に添加した。硫酸銅溶液を添加し、溶液を室温で１０分間撹拌してからアスコルビン酸ナトリウムを添加した。精製に関しては、両反応物を室温で一晩放置し、次いで水に対して２４時間透析した。各溶液を凍結乾燥して粉末生成物を得た。
【0338】
Ｄ－ＡＬＧの１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： ８．１２－７．７８ （ｍ， 内部アミドＨ）， ４．４５－４．０６ （ｍ， ペプチドα炭素）， ４．００ （ｓ， エステル連結， ３７Ｈ）， ３．７８ （ｍ， ポリエチレングリコールＨ） ， ３．４０ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．３３ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．１８－３．１１ （ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．６４ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， １．６４－１．５９ （ｍ， ＧＡＢＡリンカー －ＣＨ２およびペプチド側鎖）．保持時間：１６．６０分。
【0339】
Ｃｙ５－Ｄ－ＡＬＧ－Ｃｙ３の１Ｈ ＮＭＲ （５００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ－ｄ６）： ８．１２－７．７８ （ｍ， 内部アミドＨ）， ７．０１ （ｍ， 芳香族５Ｈ）， ６．５９ （ｓ， ＧＡＢＡアミド Ｈ， １０Ｈ）， ４．７３ （ｓ， 表面ＯＨ， ２３３Ｈ）， ４．０６ （ｓ， エステル連結， １６Ｈ）， ３．４０ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．３３ （ｄ， デンドリマー－ＣＨ２）， ３．１８－３．１１ （ｍ， デンドリマー－ＣＨ２）， ２．６４ （ｓ， デンドリマー－ＣＨ２）， １．６４－１．５９ （ｍ， ＧＡＢＡリンカー －ＣＨ２， ６Ｈ）， １．３６ （ｓ， Ｂｏｃ基， ２０Ｈ）．保持時間：１７．９９分。
【0340】
酵素分解下でのｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性
プロテイナーゼＫストック溶液はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入し、そのまま使用した。ＡＬＧ－１００１およびＤ－ＡＬＧ溶液は２ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、プロテイナーゼＫは、プロテイナーゼＫの最終濃度が２ｍｇ／ｍＬになるように各溶液に添加した。混合物は３７℃でインキュベートし、設定した時点において混合物１００μＬを取り出し、ＨＰＬＣで分析した。化合物の分解を決定するために、ＡＬＧ－１００１およびＤ－ＡＬＧと関連する溶出時間でのピークの積分を使用し、０時間の時点で注入された分析物のピークに対して正規化した。
プロテイナーゼＫストック溶液はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入し、そのまま使用した。ＡＬＧ－１００１およびＤ－ＡＬＧ溶液は２ｍｇ／ｍＬの濃度に調製し、プロテイナーゼＫは、プロテイナーゼＫの最終濃度が２ｍｇ／ｍＬになるように各溶液に添加した。混合物は３７℃でインキュベートし、設定した時点において混合物１００μＬを取り出し、ＨＰＬＣで分析した。化合物の分解を決定するために、ＡＬＧ－１００１およびＤ－ＡＬＧと関連する溶出時間でのピークの積分を使用し、０時間の時点で注入された分析物のピークに対して正規化した。
【0341】
細胞培養
ＨＵＶＥＣ細胞はＬｏｎｚａから得、ＥＧＭ－２内皮細胞成長培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。継代５から継代９の間のネズミマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が添加されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で培養した。全ての細胞は加湿インキュベーターを用い３７℃および５％ＣＯ２で維持した。
ＨＵＶＥＣ細胞はＬｏｎｚａから得、ＥＧＭ－２内皮細胞成長培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。継代５から継代９の間のネズミマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）を、１０％ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が添加されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で培養した。全ての細胞は加湿インキュベーターを用い３７℃および５％ＣＯ２で維持した。
【0342】
Ｄ－ＡＬＧ有効性のｉｎ ｖｉｔｒｏでの評価
血管形成アッセイ
９６ウェルプレートを７５μＬのマトリゲル（登録商標）でコーティングし、室温で１５分間放置してから３７℃のインキュベーター中にさらに３０分間置いた。Ｄ－ＡＬＧ１００１を所望の濃度の２倍に溶解し、薬物溶液５０μＬをウェルに添加した。次いでＨＵＶＥＣ細胞を各ウェルに７０，０００細胞／ｃｍ２の密度で添加した。生存細胞イメージを１２時間で撮影して分析を行った。
血管形成アッセイ
９６ウェルプレートを７５μＬのマトリゲル（登録商標）でコーティングし、室温で１５分間放置してから３７℃のインキュベーター中にさらに３０分間置いた。Ｄ－ＡＬＧ１００１を所望の濃度の２倍に溶解し、薬物溶液５０μＬをウェルに添加した。次いでＨＵＶＥＣ細胞を各ウェルに７０，０００細胞／ｃｍ２の密度で添加した。生存細胞イメージを１２時間で撮影して分析を行った。
【0343】
創傷治癒アッセイ
ＨＵＶＥＣ細胞を、２４ウェルプレート中、１ウェルあたり５×１０４細胞の密度で播種し、少なくとも７２時間放置して細胞の均一な単層を形成した。細胞をＤ－ＡＬＧ１００１およびＡＬＧ－１００１で２４時間処置した。１センチメートルの長さのひっかき傷を、２００μＬのピペットチップの先端を用いて細胞単層につけた。イメージをＮｉｋｏｎで撮影した。
ＨＵＶＥＣ細胞を、２４ウェルプレート中、１ウェルあたり５×１０４細胞の密度で播種し、少なくとも７２時間放置して細胞の均一な単層を形成した。細胞をＤ－ＡＬＧ１００１およびＡＬＧ－１００１で２４時間処置した。１センチメートルの長さのひっかき傷を、２００μＬのピペットチップの先端を用いて細胞単層につけた。イメージをＮｉｋｏｎで撮影した。
【0344】
ウエスタンブロットおよびＰＣＲのためのＶＥＧＦ活性化
ＨＵＶＥＣ細胞を２４ウェルプレート中１ウェルあたり５×１０４細胞の密度で２４時間播種してから処置を行った。細胞を、Ｄ－ＡＬＧ１００１およびＡＬＧ－１００１で２４時間処置してからＶＥＧＦで５分間活性化させた。細胞を収集し、溶解して、ＰＨＯＳＳＴＯＰ（登録商標）およびプロテイナーゼ阻害剤のカクテルが添加されたＴ－Ｐｅｒ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してウエスタンブロットを行った。細胞をＴＲＩＺＯＬ（登録商標）で溶解し、前述のように処理してｑＰＣＲ分析を行った。
ＨＵＶＥＣ細胞を２４ウェルプレート中１ウェルあたり５×１０４細胞の密度で２４時間播種してから処置を行った。細胞を、Ｄ－ＡＬＧ１００１およびＡＬＧ－１００１で２４時間処置してからＶＥＧＦで５分間活性化させた。細胞を収集し、溶解して、ＰＨＯＳＳＴＯＰ（登録商標）およびプロテイナーゼ阻害剤のカクテルが添加されたＴ－Ｐｅｒ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用してウエスタンブロットを行った。細胞をＴＲＩＺＯＬ（登録商標）で溶解し、前述のように処理してｑＰＣＲ分析を行った。
【0345】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ炎症モデル
ＲＡＷ２６４．７細胞を１２ウェルプレート中、１ウェルあたり１×１０５細胞の密度で４８時間播種してから処置を行った。細胞をＤ－ＡＬＧ１００１およびＡＬＧ－１００１とともに２４時間インキュベートし、処置培地を吸引し、次いで１０，０００エンドトキシン単位／ｍＬの濃度のＬＰＳを添加して炎症性応答を刺激した。ＬＰＳ刺激を行ってから３時間後、試料を収集してからｑＰＣＲ分析を行った。
ＲＡＷ２６４．７細胞を１２ウェルプレート中、１ウェルあたり１×１０５細胞の密度で４８時間播種してから処置を行った。細胞をＤ－ＡＬＧ１００１およびＡＬＧ－１００１とともに２４時間インキュベートし、処置培地を吸引し、次いで１０，０００エンドトキシン単位／ｍＬの濃度のＬＰＳを添加して炎症性応答を刺激した。ＬＰＳ刺激を行ってから３時間後、試料を収集してからｑＰＣＲ分析を行った。
【0346】
脈絡膜血管新生を減弱させることにおけるＤ－ＡＬＧのｉｎ ｖｉｖｏ評価
ｉｎ ｖｉｖｏレーザーＣＮＶラットモデル
全ての動物手順はＪｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。８週齢から１２週齢の間のＢｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットを得、一定の温度および湿度（２０±１℃、５０±５％湿度）で飼育した。動物に、ケタミン／キシラジンカクテル（ケタミン５０ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔をかけた。瞳孔を局所用２．５％フェニレフリン塩酸塩溶液、続いて０．５％テトラカイン塩酸塩溶液を用いて散大させた。ＣＮＶ形成を誘導するために、４つの等間隔の病変を、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＩＩ ＳＬＯの組み込まれたレーザーシステムでブルッフ膜において生成することになる。レーザー出力を２４０～２５０Ｗ、持続時間を７０ｍ秒に設定した。Ｇｏｎｉｏ眼用溶液を術後に適用して眼の乾燥および白内障形成を予防した。
ｉｎ ｖｉｖｏレーザーＣＮＶラットモデル
全ての動物手順はＪｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。８週齢から１２週齢の間のＢｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットを得、一定の温度および湿度（２０±１℃、５０±５％湿度）で飼育した。動物に、ケタミン／キシラジンカクテル（ケタミン５０ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって麻酔をかけた。瞳孔を局所用２．５％フェニレフリン塩酸塩溶液、続いて０．５％テトラカイン塩酸塩溶液を用いて散大させた。ＣＮＶ形成を誘導するために、４つの等間隔の病変を、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＩＩ ＳＬＯの組み込まれたレーザーシステムでブルッフ膜において生成することになる。レーザー出力を２４０～２５０Ｗ、持続時間を７０ｍ秒に設定した。Ｇｏｎｉｏ眼用溶液を術後に適用して眼の乾燥および白内障形成を予防した。
【0347】
ＣＮＶ誘導日（０日目）に、Ｄ－ＡＬＧ１００１およびＡＬＧ１００１を、ペプチドベースで１５０μｇの用量で腹腔内投与した。その後の用量は４日ごとに投与した。７日目および１４日目に、マウスを屠殺し、眼球を摘出した。ＣＮＶイメージのために使用される眼は１０％ホルマリン中で１時間固定した。ｑＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、およびウエスタンブロットのために使用される眼は使用するまで－８０℃でただちに保存した。
【0348】
ウエスタンおよびｑＰＣＲのための組織の調製
簡単に述べると、ＰＨＯＳＳＴＯＰ（登録商標）およびプロテイナーゼ阻害剤カクテルが添加されたＴ－Ｐｅｒ ５００μＬを切開した脈絡膜を含む管に添加した。１．６ｍｍの鋼ホモジネーションビーズ１杯を各試料に添加し、次いでＴＩＳＳＵＥＬＹＳＥＲ（登録商標）ＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ）に５０／秒の振動数で１５分間入れた。ｑＰＣＲに関しては、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）２００μＬを、脈絡膜を含む管に添加し、１．６ｍｍの鋼ホモジネーションビーズ１杯を添加した。試料をＴＩＳＳＵＥＬＹＳＥＲ（登録商標）ＬＴに５０／秒の振動数で１５分間入れた。
簡単に述べると、ＰＨＯＳＳＴＯＰ（登録商標）およびプロテイナーゼ阻害剤カクテルが添加されたＴ－Ｐｅｒ ５００μＬを切開した脈絡膜を含む管に添加した。１．６ｍｍの鋼ホモジネーションビーズ１杯を各試料に添加し、次いでＴＩＳＳＵＥＬＹＳＥＲ（登録商標）ＬＴ（Ｑｉａｇｅｎ）に５０／秒の振動数で１５分間入れた。ｑＰＣＲに関しては、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）２００μＬを、脈絡膜を含む管に添加し、１．６ｍｍの鋼ホモジネーションビーズ１杯を添加した。試料をＴＩＳＳＵＥＬＹＳＥＲ（登録商標）ＬＴに５０／秒の振動数で１５分間入れた。
【0349】
ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡを用いた経路活性化分析
タンパク質の濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて決定した。等量のタンパク質を変性させ、４～１５％ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で分離した。ゲルをニトロセルロース膜に転写し、３％ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）を用いて室温で１時間ブロックし、ＧＡＰＤＨ、ＦＡＫ、ｐＦＡＫ、ＭＡＰＫ、およびｐＭＡＰＫに関して４℃で一晩プローブした。膜を３回洗浄してからＨＲＰコンジュゲート二次抗体とともにインキュベートし、続いて化学発光基質とともにインキュベートして可視化した。
タンパク質の濃度をＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて決定した。等量のタンパク質を変性させ、４～１５％ＴＧＸゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上で分離した。ゲルをニトロセルロース膜に転写し、３％ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）を用いて室温で１時間ブロックし、ＧＡＰＤＨ、ＦＡＫ、ｐＦＡＫ、ＭＡＰＫ、およびｐＭＡＰＫに関して４℃で一晩プローブした。膜を３回洗浄してからＨＲＰコンジュゲート二次抗体とともにインキュベートし、続いて化学発光基質とともにインキュベートして可視化した。
【0350】
組織から抽出したタンパク質に関しては、総ＦＡＫおよびＦＡＫ（ホスホ）［ｐＹ３９７］ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してタンパク質の発現レベルを定量化し、測定したタンパク質発現をＢＣＡアッセイから決定された各試料の総タンパク質量に対して正規化した。
【0351】
ｑＰＣＲ分析
クロロホルム１００μＬをＴｒｉｚｏｌ懸濁物に添加し、水性相を、１０Ｋ ＲＰＭ、４℃で１５分間、遠心分離で分離した。２－プロパノール４００μＬを水溶液に添加し、再び回転させてＲＮＡをペレット化した。ＲＮＡを７０％エタノール溶液で洗浄し、再びペレット化し、ＤＥＰＣ（酵素を不活性化させるために処置された超純粋）水中に再懸濁した。
クロロホルム１００μＬをＴｒｉｚｏｌ懸濁物に添加し、水性相を、１０Ｋ ＲＰＭ、４℃で１５分間、遠心分離で分離した。２－プロパノール４００μＬを水溶液に添加し、再び回転させてＲＮＡをペレット化した。ＲＮＡを７０％エタノール溶液で洗浄し、再びペレット化し、ＤＥＰＣ（酵素を不活性化させるために処置された超純粋）水中に再懸濁した。
【0352】
ＲＮＡを相補的ＤＮＡに変換するため、ＲＮＡ２μｇを高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して変換した。試料は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いたＳＴＥＰＯＮＥ ＰＬＵＳ（登録商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析した。相対的発現は、対照に対して正規化したΔΔＣｔ計算を用いて定量化した。ＧＡＰＤＨのためのプライマーは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から得た。プライマーはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入した。ＴＮＦαのためのプライマーは：
正方向：ＣＣＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＣＴＧＴＣＴＴ（配列番号６）；および
逆方向：ＡＡＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡ（配列番号７）
であった。
ＩＬ１βのためのプライマーは：
正方向：ＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＣＴＣＧＡＡＧＣＡＧ（配列番号８）；および
逆方向：ＴＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣ（配列番号９）
であった。
正方向：ＣＣＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＧＣＴＧＴＣＴＴ（配列番号６）；および
逆方向：ＡＡＧＣＡＡＡＡＧＡＧＧＡＧＧＣＡＡＣＡ（配列番号７）
であった。
ＩＬ１βのためのプライマーは：
正方向：ＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＣＴＣＧＡＡＧＣＡＧ（配列番号８）；および
逆方向：ＴＧＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣ（配列番号９）
であった。
【0353】
生体内分布
生体内分布研究に関しては、Ｃｙ５－Ｄ－ＡＬＧ１００１－Ｃｙ３およびＡＬＧ－１００１－Ｃｙ３を、ＣＮＶ誘導日（０日目）に１５０μｇ／１００μＬの用量で各動物に腹腔内投与した。動物を１、２、３、および４日の時点で屠殺し、眼球摘出した。
生体内分布研究に関しては、Ｃｙ５－Ｄ－ＡＬＧ１００１－Ｃｙ３およびＡＬＧ－１００１－Ｃｙ３を、ＣＮＶ誘導日（０日目）に１５０μｇ／１００μＬの用量で各動物に腹腔内投与した。動物を１、２、３、および４日の時点で屠殺し、眼球摘出した。
【0354】
イメージング
固定後、後眼部を解剖して取り出し、網膜を脈絡膜から分離した。血管および単球に関しては、組織をＦＩＴＣ標識イソレクチン（ＧＳ ＩＢ４）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で染色した。眼を４つの放射状緩和切開を導入することによってマウントした。生体内分布のための試料を共焦点７１０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）下でイメージングした。ＣＮＶ定量化のための試料をＡｘｉｏｖｅｒｔ位相差顕微鏡でイメージングした。全てのイメージをＩｍａｇｅＪで処理した。
固定後、後眼部を解剖して取り出し、網膜を脈絡膜から分離した。血管および単球に関しては、組織をＦＩＴＣ標識イソレクチン（ＧＳ ＩＢ４）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で染色した。眼を４つの放射状緩和切開を導入することによってマウントした。生体内分布のための試料を共焦点７１０顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）下でイメージングした。ＣＮＶ定量化のための試料をＡｘｉｏｖｅｒｔ位相差顕微鏡でイメージングした。全てのイメージをＩｍａｇｅＪで処理した。
【0355】
統計分析
データは、平均±ＳＥＭとして表され、ＧｒａｐｈＰａｄプリズム（バージョン９；Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）で分析を行った。処置群は、時点または用量にわたって、分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定によって分析した。単一群間の有意差は、スチューデントのｔ検定で決定した：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
データは、平均±ＳＥＭとして表され、ＧｒａｐｈＰａｄプリズム（バージョン９；Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）で分析を行った。処置群は、時点または用量にわたって、分散分析（ＡＮＯＶＡ）検定によって分析した。単一群間の有意差は、スチューデントのｔ検定で決定した：＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１および＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【0356】
結果
Ｄ－ＡＬＧ１００１中間体およびコンジュゲートの合成および特徴付け
高収率クリック反応を使用してＡＬＧ－１００１ペプチドをデンドリマープラットフォームに、ペプチドの完全性および活性を保存するのに適した穏やかな条件下で効率的に結合させた（図１５）。最初にデンドリマー表面をヘキシン酸リンカーで修飾し、１ＨＮＭＲで修飾を確認しており、４．０ｐｐｍおよび１．７ｐｐｍで２０個のプロトンが存在した。デンドリマー表面は最小限に修飾して、その中性に近い電荷と組織を浸透するその固有の能力とを保存した。
Ｄ－ＡＬＧ１００１中間体およびコンジュゲートの合成および特徴付け
高収率クリック反応を使用してＡＬＧ－１００１ペプチドをデンドリマープラットフォームに、ペプチドの完全性および活性を保存するのに適した穏やかな条件下で効率的に結合させた（図１５）。最初にデンドリマー表面をヘキシン酸リンカーで修飾し、１ＨＮＭＲで修飾を確認しており、４．０ｐｐｍおよび１．７ｐｐｍで２０個のプロトンが存在した。デンドリマー表面は最小限に修飾して、その中性に近い電荷と組織を浸透するその固有の能力とを保存した。
【0357】
生体内分布研究に関しては、デンドリマー表面をＧＡＢＡ－Ｂｏｃリンカーでさらに修飾した。４．０ｐｐｍ、１．７ｐｐｍ、および１．２ｐｐｍでの追加のプロトンの存在によって修飾が裏付けられる。得られた中間体を脱保護し、遊離アミンを使用して、Ｃｙ５エステルとカップリングさせて蛍光標識デンドリマーを得た。
【0358】
ＡＬＧ－１００１ペプチドは、短いポリエチレングリコール（ＰＥＧ）アジドリンカーがＣ末端に結合した状態で購入し、さらに調製することなく使用した。生体内分布研究に関しては、ペプチドのＮ末端も、追跡のためにＣｙ３フルオロフォアで修飾した。銅（Ｉ）触媒アルキン－アジドクリック（ＣｕＡＡＣ）反応を使用してＡＬＧ－１００１をデンドリマーに結合させ、１ＨＮＭＲスペクトルによってペプチドプロトンの存在が示されたことによりＡＬＧ－１００１の結合が確認された。
【0359】
酵素分解下でのｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性
ＡＬＧ－１００１と広範に作用するプロテアーゼであるプロテイナーゼＫとを同時にインキュベートすることによって、ＡＬＧ－１００１の急速な分解をもたらし、ここでは約５０％が３０分で分解され、９０％が９０分で分解された。プロテイナーゼＫと同時にインキュベートした後のＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１のＨＰＬＣクロマトグラフは、遊離ＡＬＧ－１００１ペプチドと関連するピークのＡＵＣの減少を示す。Ｄ－ＡＬＧのトレースは、ＡＵＣにおけるごくわずかな減少を示す。分解した量をプロットした曲線は、設定した時点において得られた分析物のピークを、０分で得られた開始ピークに対して正規化することによって示される。約９０％のＡＬＧ－１００１が９０分までに分解され、一方、Ｄ－ＡＬＧではわずか１０％しか分解されなかった。一方、ＡＬＧ－１００１ペプチドのデンドリマーコンジュゲーションは、場合によりデンドリマー担体からの立体障害に起因して、酵素分解に対する抵抗性をもたらした。およそ１０％のＤ－ＡＬＧのみが９０分で分解された。この酵素分解に対する抵抗性は、並外れて高い酵素濃度においてさえ、デンドリマーコンジュゲーションが分解経路から逃避するのを助けることによってインタクトなペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの循環時間を増加させることができることを示唆する。
ＡＬＧ－１００１と広範に作用するプロテアーゼであるプロテイナーゼＫとを同時にインキュベートすることによって、ＡＬＧ－１００１の急速な分解をもたらし、ここでは約５０％が３０分で分解され、９０％が９０分で分解された。プロテイナーゼＫと同時にインキュベートした後のＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１のＨＰＬＣクロマトグラフは、遊離ＡＬＧ－１００１ペプチドと関連するピークのＡＵＣの減少を示す。Ｄ－ＡＬＧのトレースは、ＡＵＣにおけるごくわずかな減少を示す。分解した量をプロットした曲線は、設定した時点において得られた分析物のピークを、０分で得られた開始ピークに対して正規化することによって示される。約９０％のＡＬＧ－１００１が９０分までに分解され、一方、Ｄ－ＡＬＧではわずか１０％しか分解されなかった。一方、ＡＬＧ－１００１ペプチドのデンドリマーコンジュゲーションは、場合によりデンドリマー担体からの立体障害に起因して、酵素分解に対する抵抗性をもたらした。およそ１０％のＤ－ＡＬＧのみが９０分で分解された。この酵素分解に対する抵抗性は、並外れて高い酵素濃度においてさえ、デンドリマーコンジュゲーションが分解経路から逃避するのを助けることによってインタクトなペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの循環時間を増加させることができることを示唆する。
【0360】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの血管形成アッセイ
生理学的に適切なモデルにおける有効な用量を見出すために、血管形成のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを利用した。ＨＵＶＥＣ細胞を、３つの異なる大きさの用量の勾配濃度のＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１で２４時間処置した。次いで細胞をマトリゲル（登録商標）上に播種し、その後、細胞は自然に移動して血管様細管構造を形成した。イメージは、ＩｍａｇｅＪのＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｎａｌｙｚｅｒプラグインで分析して、管ネットワークの結合性および完全性を測定する適切な測定基準を抽出した（図１６）。
生理学的に適切なモデルにおける有効な用量を見出すために、血管形成のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルを利用した。ＨＵＶＥＣ細胞を、３つの異なる大きさの用量の勾配濃度のＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１で２４時間処置した。次いで細胞をマトリゲル（登録商標）上に播種し、その後、細胞は自然に移動して血管様細管構造を形成した。イメージは、ＩｍａｇｅＪのＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｎａｌｙｚｅｒプラグインで分析して、管ネットワークの結合性および完全性を測定する適切な測定基準を抽出した（図１６）。
【0361】
１ｍＭのＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１で処置された細胞は、管形成において撹乱が増加し、孤立したセグメントが増加し、管によって囲まれた領域またはメッシュが減少したことを示す。データによって、デンドリマーコンジュゲーションがネットワーク形成を撹乱させることにおけるＡＬＧ－１００１の有効性を高めることが示される。１ｍＭのＤ－ＡＬＧで処置されたＨＵＶＥＣは、１ｍＭのＡＬＧ－１００１で処置されたものと比較して、血管間の交差点（ジャンクション）が減少し、結合セグメントが減少し、孤立したセグメントが増加した。
【0362】
創傷治癒アッセイ
管形成アッセイによって測定された細胞形態および運動性変化に加えて、Ｄ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１で処置されたＨＵＶＥＣの増殖性活性を創傷治癒アッセイにおいて評価した。ＨＵＶＥＣの単層をＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１で前処置し、続いて単層をピペットの先端でひっかいた。イメージを創傷時および損傷から２４時間後に撮影した。未処置の細胞は、２４時間後に最初の損傷から最大８０％治癒し、同時にＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１で処置された細胞は最初の創傷領域の最大５０％が治癒した。さらに、１ｍＭの高用量のＤ－ＡＬＧで処置された細胞は最初の損傷の２０％しか回復せず、ＨＵＶＥＣの再生能力の低下が示唆された。傾向によって、Ｄ－ＡＬＧでの処置は、遊離ペプチドよりも有効であることが示される。
管形成アッセイによって測定された細胞形態および運動性変化に加えて、Ｄ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１で処置されたＨＵＶＥＣの増殖性活性を創傷治癒アッセイにおいて評価した。ＨＵＶＥＣの単層をＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１で前処置し、続いて単層をピペットの先端でひっかいた。イメージを創傷時および損傷から２４時間後に撮影した。未処置の細胞は、２４時間後に最初の損傷から最大８０％治癒し、同時にＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１で処置された細胞は最初の創傷領域の最大５０％が治癒した。さらに、１ｍＭの高用量のＤ－ＡＬＧで処置された細胞は最初の損傷の２０％しか回復せず、ＨＵＶＥＣの再生能力の低下が示唆された。傾向によって、Ｄ－ＡＬＧでの処置は、遊離ペプチドよりも有効であることが示される。
【0363】
内皮細胞活性化についてのウエスタンブロット
Ｄ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１が血管新生の機能に影響を与える機序を解明するために、細胞をＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１で２４時間前処置した。次いで、細胞を高用量の外因性ＶＥＧＦで５分間刺激し、その後試料を収集してウエスタンブロットを行った。試料は、総ＦＡＫ、ホスホ－ＦＡＫ（Ｙ３９７）、ＥＲＫ１／２、ホスホ－ＥＲＫ１／２、およびシクロフィリンＢ（ＣｙｃＢ）の発現に関してプローブし、ＣｙｃＢは内部対照として作用した。
Ｄ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１が血管新生の機能に影響を与える機序を解明するために、細胞をＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１で２４時間前処置した。次いで、細胞を高用量の外因性ＶＥＧＦで５分間刺激し、その後試料を収集してウエスタンブロットを行った。試料は、総ＦＡＫ、ホスホ－ＦＡＫ（Ｙ３９７）、ＥＲＫ１／２、ホスホ－ＥＲＫ１／２、およびシクロフィリンＢ（ＣｙｃＢ）の発現に関してプローブし、ＣｙｃＢは内部対照として作用した。
【0364】
未処置のＶＥＧＦ刺激対照と比較して、結果は、Ｄ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１で処置された細胞が、より低いレベルの総ＦＡＫおよびホスホ－ＦＡＫを発現したことを示す。ペプチドベースで１ｍＭの高用量では、ＶＥＧＦ刺激対照と比較して、Ｄ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１によってホスホ－ＥＲＫ１／２のリン酸化が約６０％減少し、ホスホ－ＦＡＫが２０％減少した。ＥＲＫ１／２経路とＦＡＫ経路の両方が血管新生において重要な役割を果たし、その活性化は内皮細胞増殖および遊走を促進する（図１７）。リン酸化タンパク質における減少傾向によって、ＶＥＧＦに応答したこれらのネットワークの活性化における減弱が示唆される。
【0365】
経路活性化の調査に加えて、内皮細胞によるＶＥＧＦ－Α発現に対するＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１の効果も研究した。ＶＥＧＦ－Αで処置された細胞は、未刺激対照と比較してＶＥＧＦ－Αの産生が有意に増加した。ＶＥＧＦ－ΑおよびＡＬＧ－１００１またはＤ－ＡＬＧのいずれかと同時にインキュベートされた細胞は、対照と比較してＶＥＧＦ産生において統計的に有意な増加を有さず、ＶＥＧＦに応答した内皮活性化におけるわずかな減弱が示唆された。
【0366】
ネズミミクログリアにおける炎症性応答の減弱
血管新生における別の重要な因子はマクロファージおよびミクログリアであり、これらは血管新生プロセス中に炎症促進性および血管新生促進性のサイトカインを産生する。マクロファージ活性化に対するＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１の効果を解明するために、ＲＡＷ２６４．７細胞を、ＬＰＳ刺激の２４時間前に高用量および低用量のＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１で前処置した。処置培地を最初に吸引してｉｎ ｖｉｖｏ送達の一時的な性質をシミュレーションし、細胞をＬＰＳで３時間活性化させた。
血管新生における別の重要な因子はマクロファージおよびミクログリアであり、これらは血管新生プロセス中に炎症促進性および血管新生促進性のサイトカインを産生する。マクロファージ活性化に対するＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１の効果を解明するために、ＲＡＷ２６４．７細胞を、ＬＰＳ刺激の２４時間前に高用量および低用量のＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１で前処置した。処置培地を最初に吸引してｉｎ ｖｉｖｏ送達の一時的な性質をシミュレーションし、細胞をＬＰＳで３時間活性化させた。
【0367】
ＬＰＳで活性化された細胞は、未刺激対照と比較すると、ｑＰＣＲによって検出されたように炎症促進性サイトカインＩＬ１βおよびＴＮＦαの発現において堅固な増加を示した（図１８Ａ～１８Ｂ）。Ｄ－ＡＬＧ処置に伴って、低用量（１００μｍ）と高用量（１ｍＭ）の両方において、ＩＬ１βの発現は約９０％減少し、ＴＮＦαの発現は８０％減少した。驚くべきことに、Ｄ－ＡＬＧで処置すると、ＴＮＦαのレベルは未処置対象と統計的に差がないレベルになる。比較において、ＡＬＧ－１００１はＴＮＦαの発現を最も高い用量でわずか２０％しか減少させず、ＡＬＧ－１００１単独処置ではＩＬ１β産生に対する影響は観察されなかった。この差は、（１）デンドリマープラットフォームは、遊離薬物と比較して、治療薬を活性化マクロファージに送達する際にはるかにより効率的であることが実証される；（２）デンドリマー表面上に複数のリガンドを結合させると多価効果が可能になり、ペプチドと表面インテグリンとの相互作用が増加するという２つの潜在的な差に起因する場合がある。
【0368】
全身投与されたＡＬＧ－１００１およびＤ－ＡＬＧの生体内分布
蛍光標識Ｃｙ３－ＡＬＧ－１００１ペプチドおよび二重標識Ｃｙ５－デンドリマー－ＡＬＧ－Ｃｙ３を０日目（ＣＮＶ誘導と同じ日）に全身注射し、脈絡膜組織を設定した時点において収集した。共焦点顕微鏡を使用してＡＬＧ－１００１ペプチド（Ｃｙ３）、デンドリマー担体（Ｃｙ５）、ＣＮＶ形成（イソレクチン）、およびマクロファージ（Ｉｂａ１）の存在をモニターした。全身投与から最初の２４時間以内に、遊離ＡＬＧ－１００１ペプチドはＣＮＶ領域に到達し、検出されたＣｙ３シグナルから認められるように最大２日間残存した。比較において、Ｄ－ＡＬＧは、全身性注射後２４時間以内にＣＮＶ領域に到達できるだけではなく、Ｃｙ５シグナルとＣｙ３シグナルの両方が共局在して存在していることから、標的領域において投与後最大４日残存することができた。長期の滞留時間によって、デンドリマーコンジュゲーションが標的領域自体に薬物デポーとしての役割を与え、ペプチド治療薬の有効性を延長させることが示される。
蛍光標識Ｃｙ３－ＡＬＧ－１００１ペプチドおよび二重標識Ｃｙ５－デンドリマー－ＡＬＧ－Ｃｙ３を０日目（ＣＮＶ誘導と同じ日）に全身注射し、脈絡膜組織を設定した時点において収集した。共焦点顕微鏡を使用してＡＬＧ－１００１ペプチド（Ｃｙ３）、デンドリマー担体（Ｃｙ５）、ＣＮＶ形成（イソレクチン）、およびマクロファージ（Ｉｂａ１）の存在をモニターした。全身投与から最初の２４時間以内に、遊離ＡＬＧ－１００１ペプチドはＣＮＶ領域に到達し、検出されたＣｙ３シグナルから認められるように最大２日間残存した。比較において、Ｄ－ＡＬＧは、全身性注射後２４時間以内にＣＮＶ領域に到達できるだけではなく、Ｃｙ５シグナルとＣｙ３シグナルの両方が共局在して存在していることから、標的領域において投与後最大４日残存することができた。長期の滞留時間によって、デンドリマーコンジュゲーションが標的領域自体に薬物デポーとしての役割を与え、ペプチド治療薬の有効性を延長させることが示される。
【0369】
ＣＮＶ形成のｉｎ ｖｉｖｏでの減弱
Ｍｉｃｒｏｎ ＩＩＩ ＳＬＯスコープおよびレーザーアタッチメントを使用して、マウスにおいてＣＮＶ形成を誘導した。レーザーＣＮＶモデルは、ＣＮＶ生成とＣＮＶプロセスの進行とにおけるその一貫性に起因して選択した。デンドリマーコンジュゲーションによってペプチドがＣＮＶを減弱することを妨害されるかどうかを、ＣＮＶ誘導後、まずＡＬＧ－１００１およびＤ－ＡＬＧを硝子体内注射することによって評価した。次いで眼を７日目に収集し、ＣＮＶ領域を定量化した。Ｄ－ＡＬＧとＡＬＧ－１００１の両方が、硝子体内に投与された場合にＣＮＶの形成を有意に阻害した。
Ｍｉｃｒｏｎ ＩＩＩ ＳＬＯスコープおよびレーザーアタッチメントを使用して、マウスにおいてＣＮＶ形成を誘導した。レーザーＣＮＶモデルは、ＣＮＶ生成とＣＮＶプロセスの進行とにおけるその一貫性に起因して選択した。デンドリマーコンジュゲーションによってペプチドがＣＮＶを減弱することを妨害されるかどうかを、ＣＮＶ誘導後、まずＡＬＧ－１００１およびＤ－ＡＬＧを硝子体内注射することによって評価した。次いで眼を７日目に収集し、ＣＮＶ領域を定量化した。Ｄ－ＡＬＧとＡＬＧ－１００１の両方が、硝子体内に投与された場合にＣＮＶの形成を有意に阻害した。
【0370】
Ｄ－ＡＬＧの保護および標的化によって、侵襲性の低い投与経路が可能になった。０日目にレーザーを使用してＣＮＶを誘導し、第１の用量（ペプチドベースで１５０μｇ）のＡＬＧ－１００１およびＤ－ＡＬＧを腹腔内で投与した。動物にペプチドベースで１５０μｇを４日に１回投薬した。７日目および１４日目に眼脈絡膜のフラットマウントをイメージングし、ＣＮＶ領域はＩｍａｇｅＪを使用して計算した。
【0371】
未処置対照動物において、ＣＮＶ誘導後、ＣＮＶ領域は７日までに約１３，０００μｍ２のサイズに到達し、１４日目には約１４，０００μｍ２に到達した（図１９Ａ～１９Ｂ）。ＡＬＧ－１００１の全身注射によって７日目にＣＮＶ形成が堅固に減弱（約６０％減少）したが、１４日目にＣＮＶ領域は回復した。比較すると、Ｄ－ＡＬＧの全身投与はＣＮＶの形成を７日目および１４日目に約５０％抑制し、１４日目に統計的有意性に到達した。ＣＮＶ減少におけるこの改善およびその持続効果はペプチドペイロードを保護し、標的ＣＮＶ領域での滞留時間を長くするＤ－ＡＬＧの能力におそらく起因する。
【0372】
全身投与されたＤ－ＡＬＧはＦＡＫおよびＥＲＫ活性化を減弱させる
ＦＡＫおよびＥＲＫ経路の活性化を評価するために、設定した時点において眼を眼球摘出し、脈絡膜組織を解剖して取り出した。組織を、Ｔ－ｐｅｒ、プロテイナーゼ阻害剤、およびＰｈｏｓＳｔｏｐの混合物にステンレス鋼ホモジネーションビーズとともに漬け、ホモジネートしてタンパク質抽出物を生成した。総ＦＡＫ、総ＥＲＫ、ｐ－ＦＡＫ（Ｙ３９７）、およびｐ－４４／４２ＥＲＫ ＥＬＩＳＡキットを使用してＦＡＫおよびＥＲＫ経路における総タンパク質およびリン酸化タンパク質の量を定量化した。Ｄ－ＡＬＧで処置された動物では、総ＦＡＫおよびｐ－ＦＡＫタンパク質の減少傾向が、未処置対象と比較して７日と１４日の両方において観察され、ＦＡＫ経路の長期の減弱が示唆された（図２０Ａ～２０Ｂ）。ＡＬＧ－１００１の処置も両方の時点にわたってｐ－ＦＡＫの減少をもたらした。しかし、ＡＬＧ－１００１処置動物における総ＦＡＫタンパク質のレベルは１４日目に上昇した。Ｄ－ＡＬＧ処置動物とＡＬＧ－１００１処置動物の両方がｐ４４／４２ＥＲＫ産生の減少において類似の傾向をもたらし、同時に総ＥＲＫは処置群全体にわたって７日目に依然として比較的一定のままであった（図２０Ｃ～２０Ｄ）。１４日目に、未処置動物と比較してＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１処置動物における総ＥＲＫにわずかな減少が認められた。
ＦＡＫおよびＥＲＫ経路の活性化を評価するために、設定した時点において眼を眼球摘出し、脈絡膜組織を解剖して取り出した。組織を、Ｔ－ｐｅｒ、プロテイナーゼ阻害剤、およびＰｈｏｓＳｔｏｐの混合物にステンレス鋼ホモジネーションビーズとともに漬け、ホモジネートしてタンパク質抽出物を生成した。総ＦＡＫ、総ＥＲＫ、ｐ－ＦＡＫ（Ｙ３９７）、およびｐ－４４／４２ＥＲＫ ＥＬＩＳＡキットを使用してＦＡＫおよびＥＲＫ経路における総タンパク質およびリン酸化タンパク質の量を定量化した。Ｄ－ＡＬＧで処置された動物では、総ＦＡＫおよびｐ－ＦＡＫタンパク質の減少傾向が、未処置対象と比較して７日と１４日の両方において観察され、ＦＡＫ経路の長期の減弱が示唆された（図２０Ａ～２０Ｂ）。ＡＬＧ－１００１の処置も両方の時点にわたってｐ－ＦＡＫの減少をもたらした。しかし、ＡＬＧ－１００１処置動物における総ＦＡＫタンパク質のレベルは１４日目に上昇した。Ｄ－ＡＬＧ処置動物とＡＬＧ－１００１処置動物の両方がｐ４４／４２ＥＲＫ産生の減少において類似の傾向をもたらし、同時に総ＥＲＫは処置群全体にわたって７日目に依然として比較的一定のままであった（図２０Ｃ～２０Ｄ）。１４日目に、未処置動物と比較してＤ－ＡＬＧおよびＡＬＧ－１００１処置動物における総ＥＲＫにわずかな減少が認められた。
【0373】
炎症促進性および血管新生促進性のサイトカインの発現を比較するために、ＲＮＡを抽出し、ｑＰＣＲを行って、ＶＥＧＦ－Α、ＴＮＦα、およびＩＬ１βの相対的発現を決定した（図２１Ａ～２１Ｃ）。Ｄ－ＡＬＧ処置動物において、ＶＥＧＦ－Α産生は７日と１４日の両方にわたって減少し、一方、ＡＬＧ－１００１処置動物は１４日のみにＶＥＧＦ－Α産生の低下を示した。炎症性サイトカインにおける傾向を比較すると、Ｄ－ＡＬＧは、７日のみにより低いＴＮＦαレベルを有し、同時にＡＬＧ－１００１処置動物は両方の時点にわたってより低いＴＮＦαレベルを有した。ＩＬ１β発現の傾向は、ＡＬＧ－１００１およびＤ－ＡＬＧ処置動物に関しては１４日目のみ減少した。
【0374】
考察
ＡＬＧ－１００１ペプチドのデンドリマーコンジュゲーションは、穏やかな条件下で高効率的な銅アシストクリック反応によって達成され、ＨＰＬＣおよびＮＭＲによって特徴付けられた。ＮＭＲピークの積分によって、６～７個のペプチドがデンドリマー担体１つごとに結合していることが計算された。酵素分解に対する抵抗性の増加は、広範に作用するプロテイナーゼとともにインキュベートした後、デンドリマーコンジュゲーションでｉｎ ｖｉｔｒｏで観察された。
ＡＬＧ－１００１ペプチドのデンドリマーコンジュゲーションは、穏やかな条件下で高効率的な銅アシストクリック反応によって達成され、ＨＰＬＣおよびＮＭＲによって特徴付けられた。ＮＭＲピークの積分によって、６～７個のペプチドがデンドリマー担体１つごとに結合していることが計算された。酵素分解に対する抵抗性の増加は、広範に作用するプロテイナーゼとともにインキュベートした後、デンドリマーコンジュゲーションでｉｎ ｖｉｔｒｏで観察された。
【0375】
同等の高用量で、Ｄ－ＡＬＧコンジュゲートは遊離ペプチドよりも１桁良好に血管形成を阻害した。さらに、Ｄ－ＡＬＧ１００１は、内皮細胞におけるＦＡＫ経路の活性化だけではなく、ＬＰＳ刺激ネズミマクロファージにおける炎症促進性サイトカインの発現も減弱させた。単一のデンドリマーに複数のペプチド部分を結合させることによって、インテグリンクラスターがより有効に係合し、この多価効果によってＡＬＧ－１００１の抗血管新生活性および抗炎症活性が促進される場合があることが仮定された。
【0376】
ｉｎ ｖｉｖｏで全身投与された場合、Ｄ－ＡＬＧおよび遊離ＡＬＧ－１００１ペプチドの分布およびバイオアベイラビリティにおける差をより解明することができる。蛍光標識Ｄ－ＡＬＧは、腹腔内注射後最大４日ＣＮＶ領域において検出可能であり；一方、ＡＬＧ－１００１シグナルは２日目以降検出することができなかった。標的領域での滞留時間の増加によって、Ｄ－ＡＬＧに関してはより頻繁ではない注射を可能にした。４日ごとのＤ－ＡＬＧの１５０μｇ（ペプチドベース）の腹腔内注射は、ＣＮＶ領域において５０％の減少をもたらした一方、遊離ＡＬＧ－１００１ペプチドは７日目にＣＮＶ形成を４０％減少させ、後の時点で効力を失った（１４日目に２０％のＣＮＶ減少）。比較すると、小分子α５β１アンタゴニストであるＪＳＭ６４２７の埋込型ポンプを使用した連続的な全身性送達によって、４０％のＣＮＶ領域減少をもたらした（Ｎ． Ｕｍｅｄａ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ２００６， ６９， １８２０－１８２８）。同様に、Å６ペプチドおよびＣＧＲＰペプチドをそれぞれ調査したＤａｓらおよびＴｏｒｉｙａｍａらによる別個の研究において、毎日の注射は、ＣＮＶ領域を３０％減少させるために必要であった（Ｈ． Ｊ． Ｋｏｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ．， ２００４， ４５， ６３５－６４０； Ｙ． Ｔｏｒｉｙａｍａ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， ２０１５， １８５， １７８３－１７９４）。
【0377】
データによって、デンドリマーコンジュゲーションは、全身投与後、標的領域にインタクトな生物製剤を送達することができるだけではなく、その滞留時間および有効性を増加させることができることが実証された。結果的に、それほど厳格な投薬スケジュールはＣＮＶ形成を有効に制御するのに必要とされない。反応性マクロファージおよびミクログリアによって選択的に取り込まれるデンドリマーの固有の能力によって、より高い局所濃度を達成し、同時に血液からのデンドリマーコンジュゲートの急速なクリアランスが、標的としていない細胞および組織において不必要な曝露を減少させることが可能になる。ＡＬＧ－１００１ペプチドへのデンドリマーコンジュゲーションによって、ペプチドの活性が保存され、その安定性が増加し、標的組織におけるその滞留時間が延長され、硝子体内注射の代替の経路として全身投与が提供され、したがって治療法の利用能が世界的に拡大される。
【0378】
（実施例５）
グルタミンデンドリマーコンジュゲートの合成
図２２はＧ１－グルコースの合成を示す。Ｇ１－グルコースの段階的な合成；ヘキサプロパギル化（ｈｅｘａｐｒｏｐａｇｙｌａｔｅｄ）コア１を、ＤＭＦ：Ｈ２Ｏ（１：１）中の古典的クリック試薬（ＣｕＡＡＣクリック反応）、触媒量の硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ）およびアスコルビン酸ナトリウムの下、ＡＢ４構成ブロック（β－グルコース－ＰＥＧ４－アジド）、２で処置して、Ｇ１－グルコース－２４－ＯＡｃ、３を生成した。次いで化合物３を典型的なＺｅｍｐｌｅｎ条件下で処置して（アセテート基を除去するために）所望の生成物４（Ｇ１－グルコース）を得た。
グルタミンデンドリマーコンジュゲートの合成
図２２はＧ１－グルコースの合成を示す。Ｇ１－グルコースの段階的な合成；ヘキサプロパギル化（ｈｅｘａｐｒｏｐａｇｙｌａｔｅｄ）コア１を、ＤＭＦ：Ｈ２Ｏ（１：１）中の古典的クリック試薬（ＣｕＡＡＣクリック反応）、触媒量の硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ）およびアスコルビン酸ナトリウムの下、ＡＢ４構成ブロック（β－グルコース－ＰＥＧ４－アジド）、２で処置して、Ｇ１－グルコース－２４－ＯＡｃ、３を生成した。次いで化合物３を典型的なＺｅｍｐｌｅｎ条件下で処置して（アセテート基を除去するために）所望の生成物４（Ｇ１－グルコース）を得た。
【0379】
図２３は、Ｇｌｕ－Ｇ２デンドリマーの合成を示す。Ｇ２－グルコースの段階的な合成；Ｇ１－グルコースデンドリマー、４を水素化ナトリウム（鉱油中の６０％分散物）で、０℃で１５分間処置し、次いで臭化プロパルギル（トルエン中の８０％ｗ／ｗ溶液）で処置した。反応物を室温で８時間撹拌して化合物５を形成した。次に化合物５を、ＤＭＦ：Ｈ２Ｏ（１：１）中の古典的クリック試薬（ＣｕＡＡＣクリック反応）、触媒量の硫酸銅五水和物（ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏ）およびアスコルビン酸ナトリウム下、ＡＢ４構成ブロック（β－グルコース－ＰＥＧ４－アジド）、２で処置して、Ｇ２－グルコース－９６－ＯＡｃ、６を生成した。次いで化合物６を典型的なＺｅｍｐｌｅｎ条件下で反応させて、所望の生成物７（Ｇ２－グルコース）を得た。
【0380】
図２４は、Ｃｙ５－Ｇｌｕ－Ｇ２－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰの合成を示す。Ｇｌｕ－Ｇ２デンドリマーをＮａＨおよび臭化プロパルギルで処置し、得られた生成物２をＮ３－ＰＥＧ３－アミン、３とＣＵＡＡＣクリック条件を使用してさらに反応させて、化合物４を形成した。生成物４はＣｙ５フルオロフォアで標識し、得られた中間体５をＳＰＤＰとコンジュゲートして機能化Ｃｙ５－Ｇｌｕ－Ｇ２－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ、６を得た。式における下付き数字はデンドリマーごとのアタッチメントの数を示す。
【0381】
図２５は、Ｃｙ５－Ｇｌｕ－Ｇ２－ｓｉＲＮＡコンジュゲートの合成を示す。ｓｉＲＮＡ、７を、ＤＴＴを使用してジチオール基を還元することによって活性化させ、得られた生成物８を活性化Ｃｙ５－Ｇｌｕ－Ｇ２－ＰＥＧ４－ＳＰＤＰ、６と反応させて最終生成物、Ｃｙ５－Ｇｌｕ－Ｇ２－ｓｉＲＮＡ、９を得た。
【0382】
Ｃｙ５－Ｇｌｕ－Ｇ２－ｓｉＧＦＰのニューロン細胞への取り込みは、Ｃｙ５－Ｇｌｕ－Ｇ２－ｓｉＧＦＰ細胞のニューロン細胞への取り込みの共焦点顕微鏡イメージによって確認した。処置後２４時間で、Ｃｙ５－Ｇｌｕ－Ｇ２－ｓｉＲＮＡデンドリマーは細胞内に共局在する。
【0383】
別段の定義がない限り、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、開示される発明が属する当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において引用される刊行物およびそこで引用される材料は、参照により具体的に組み込まれるものとする。
【0384】
当業者であれば、日常的な実験だけを使用して、本明細書において記載される本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識または確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20-1】
【図20-2】
【図21-1】
【図21-2】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【配列表】
【国際調査報告】