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特表2024-534509ｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡの標的ＮＧＳシーケンシングのための組成物および方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-20
(54)【発明の名称】ｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡの標的ＮＧＳシーケンシングのための組成物および方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20240912BHJP
C12Q 1/6827 20180101ALI20240912BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20240912BHJP
C12Q 1/6855 20180101ALI20240912BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20240912BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20240912BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z
C12Q1/6827 Z
C12Q1/6876 Z
C12Q1/6855 Z
C12Q1/6851 Z
C40B40/06
【審査請求】有
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2024517452
(86)(22)【出願日】2021-09-23
(85)【翻訳文提出日】2024-04-24
(86)【国際出願番号】 US2021051683
(87)【国際公開番号】W WO2023048713
(87)【国際公開日】2023-03-30
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524103988
【氏名又は名称】ジノミク テスティング コーポレーティブ，エルシーエー
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】アルビタール，マーヘル
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ03
4B063QQ41
4B063QR55
4B063QS24
4B063QS28
4B063QS32
4B063QX02
(57)【要約】
無細胞核酸試験を、同じ試料から得られたｃｆＴＮＡ画分およびｃｆＲＮＡ画分の同時分析を使用して行う。好ましい実施形態では、ｃｆＴＮＡ単離は、ｃｆＤＮＡおよびｃｆＲＮＡの小さな断片さえも単離することを含み、両方の画分中のｃｆＲＮＡの逆転写後、そのようにして得られたｃＤＮＡライブラリは、タイリングされた濃縮オリゴヌクレオチドを使用して標的濃縮に供される。最も注目すべきことに、両方のｃＤＮＡライブラリからのデータセットを使用する配列分析は、これまでに実現されていない感度および特異性を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
無細胞液から核酸を操作する方法であって、生体液から無細胞全核酸（ｃｆＴＮＡ）を得る工程；
前記ｃｆＴＮＡの第１の部分をＤＮＡｓｅ消化に供して、前記ｃｆＴＮＡのｃｆＲＮＡ画分を生成する工程；
前記ｃｆＴＮＡの前記ｃｆＲＮＡ画分と前記ｃｆＴＮＡの第２の部分との両方を逆転写、アダプターライゲーション、および増幅に供して、それによって、第１および第２それぞれのｃＤＮＡライブラリを作製する工程；
前記第１および第２のｃＤＮＡライブラリの各々を、複数の標的ｃＤＮＡを濃縮する標的濃縮に供して、それによって、第１および第２それぞれの標的濃縮ｃＤＮＡライブラリを作製する工程；
を含む方法。
【請求項2】
前記ｃｆＴＮＡが、１７～２００塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片および５０～３００塩基の間のサイズを有するｃｆＤＮＡ断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ｃｆＴＮＡが、３０～２５０塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片および７５～４００塩基の間のサイズを有するｃｆＤＮＡ断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ｃｆＲＮＡ断片および前記ｃｆＤＮＡ断片が、すべてのｃｆＴＮＡの少なくとも３０％を一緒に構成する、請求項２または請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ｃｆＲＮＡ断片および前記ｃｆＤＮＡ断片が、すべてのｃｆＴＮＡの少なくとも４０％を一緒に構成する、請求項２または請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ｃｆＴＮＡ中の突然変異を、増強された感度で検出する方法であって、生体液の試料からｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡを得る工程；
前記ｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡから第１および第２それぞれのｃＤＮＡライブラリを作製する工程；前記第１および第２のｃＤＮＡライブラリの各々を、複数の標的ｃＤＮＡを濃縮する標的濃縮に供し、それによって第１および第２それぞれの標的濃縮ｃＤＮＡライブラリを作製する工程；ならびに
前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし、前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリからのシーケンシング結果を使用して、それによって、同じ試料からのシーケンシングｃｆＲＮＡまたはｃｆＤＮＡ単独と比較して増強された感度で突然変異を検出する工程；
を含む方法。
【請求項7】
前記生体液から前記ｃｆＴＮＡを得る前記工程が、ｃｆＲＮＡおよびｃｆＤＮＡの同時単離を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ｃｆＴＮＡが、１７～２００塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片および５０～３００塩基の間のサイズを有するｃｆＤＮＡ断片を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記ｃｆＴＮＡが、３０～２５０塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片および７５～４００塩基の間のサイズを有するｃｆＤＮＡ断片を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項10】
前記ｃｆＲＮＡ断片および前記ｃｆＤＮＡ断片が、すべてのｃｆＴＮＡの少なくとも３０％を一緒に構成する、請求項８または請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ｃｆＲＮＡ断片および前記ｃｆＤＮＡ断片が、すべてのｃｆＴＮＡの少なくとも４０％を一緒に構成する、請求項８または請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
配列分析用試薬キットであって、生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ枯渇ｃｆＲＮＡ画分を含む第１の試薬；および
同じ生体液のｃｆＴＮＡを含む第２の試薬；
を含む試薬キット。
【請求項13】
前記生体液がヒトの血漿または血清である、請求項１２に記載の試薬キット。
【請求項14】
前記第１の試薬が、主に１７～２００塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片および主に５０～３００塩基の間のサイズを有するｃｆＤＮＡ断片を含む、請求項１２～１３のいずれか一項に記載の試薬キット。
【請求項15】
前記第２の試薬が、主に１７～２００塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片を含む、請求項１４に記載の試薬キット。
【請求項16】
前記ｃｆＲＮＡ断片および前記ｃｆＤＮＡ断片が、すべてのｃｆＴＮＡの少なくとも３０％を一緒に構成する、請求項１２～１３のいずれか一項に記載の試薬キット。
【請求項17】
前記第１の試薬が、前記第２の試薬から調製される、請求項１２～１３のいずれか一項に記載の試薬キット。
【請求項18】
配列分析用試薬キットであって、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリを含み；前記第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含まず；ならびに
前記第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが同じ生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含む、
試薬キット。
【請求項19】
前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが、同じ標的ｃＤＮＡを使用して標的濃縮される、請求項１８に記載の試薬キット。
【請求項20】
前記標的ｃＤＮＡが、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子または受容体関連遺伝子をコードする、請求項１８または１９に記載の試薬キット。
【請求項21】
配列分析用試薬キットであって、５０塩基以下のサイズを有するＲＮＡの結合を可能にし、１００塩基以下のサイズを有するＤＮＡの結合を可能にする表面およびサイズを有する複数のナノ粒子；および
標的遺伝子に対する配列相補性を有する複数の標的濃縮オリゴヌクレオチドを含み、
前記標的濃縮オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、同じ標的遺伝子の異なる部分にハイブリダイズする、
試薬キット。
【請求項22】
前記複数のナノ粒子が、３０塩基以下のサイズを有するＲＮＡの結合を可能にし、８０塩基以下のサイズを有するＤＮＡの結合を可能にする表面およびサイズを有する、請求項２１に記載の試薬キット。
【請求項23】
前記複数のナノ粒子が、２０塩基以下のサイズを有するＲＮＡの結合を可能にし、６０塩基以下のサイズを有するＤＮＡの結合を可能にする表面およびサイズを有する、請求項２１に記載の試薬キット。
【請求項24】
前記複数のナノ粒子が常磁性ナノ粒子である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の試薬キット。
【請求項25】
対象の核酸データを分析する方法であって、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし、それによって第１および第２それぞれの配列データセットを得る工程（前記第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは前記対象の生体液のｃｆＴＮＡから調製され、ｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含まず、
前記第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは同じ生体液のｃｆＴＮＡから調製され、ｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含む）；
前記第１および第２の配列データセット中の各遺伝子について１つ以上の突然変異を同定する工程、ならびに少なくとも前記第１の配列データセットにおける発現を定量する工程、を含む方法。
【請求項26】
前記シーケンシングの工程がペアエンドシーケンシングであり、ならびに／または第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが、前記第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリ単独の突然変異の検出と比較して、突然変異の検出の感度が増強される、請求項２５記載の方法。
【請求項27】
前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子または受容体関連遺伝子をコードする標的ｃＤＮＡが濃縮されており、任意選択的に、前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが、臨床経過、治療に対する応答または疾患の再発の診断または決定のために、特定の前記疾患に特異的な標的ｃＤＮＡが濃縮されている、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
対象のがんを分類する方法であって、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし、それによって第１および第２それぞれの配列データセットを得る工程（前記第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは前記対象の生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含まず、
前記第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは同じ生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含む）；
前記第１および第２の配列データセット中の各遺伝子について１つ以上の突然変異を同定する工程、および各遺伝子について少なくとも前記第１の配列データセットにおける発現レベルを定量する工程；ならびに
前記同定された突然変異および定量された発現レベルをモデルに使用して、それによって前記対象の前記がんを同定する工程、
を含む方法。
【請求項29】
前記シーケンシングの工程がペアエンドシーケンシングである、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子または受容体関連遺伝子をコードする標的ｃＤＮＡについて濃縮されている、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項31】
対象を治療する方法であって、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし、それによって第１および第２それぞれの配列データセットを得る工程（前記第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは前記対象の生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含まず；
前記第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは同じ生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含む）；
前記第１および第２の配列データセット中の各遺伝子について１つ以上の突然変異を同定する工程、および各遺伝子について少なくとも前記第１の配列データセットにおける発現レベルを定量する工程；ならびに
前記同定された突然変異および定量された発現レベルに基づいて治療を投与する工程、
を含む方法。
【請求項32】
前記シーケンシングの工程がペアエンドシーケンシングである、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子または受容体関連遺伝子をコードする標的ｃＤＮＡについて濃縮されている、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項34】
生体液から得られたｃＤＮＡの配列分析用試薬キットであって、それぞれのｃＤＮＡにハイブリダイズする４０～７０ヌクレオチドの間の長さを有する複数の標的濃縮プローブを含み、
前記複数の標的濃縮プローブが、ヌクレオチドあたり２～５９プローブの間のタイリング密度および１～６０ヌクレオチドの間のステップ長を有するタイリング様式で前記それぞれのｃＤＮＡに結合し；
前記それぞれのｃＤＮＡが、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子、および／または受容体関連遺伝子をコードする、
試薬キット。
【請求項35】
前記標的濃縮プローブのそれぞれが、固相捕捉のための配列部分、固相捕捉のための化学修飾、または磁気ビーズをさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項36】
前記標的ｃＤＮＡが、前記生体液のｃｆＴＮＡおよびｃｆＲＮＡから調製される、請求項３４に記載のキット。
【請求項37】
対象のための治療を予測する方法であって、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし、それによって第１および第２それぞれの配列データセットを得る工程（前記第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは前記対象の生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含まず；
前記第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは同じ生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含む）；
前記第１および第２の配列データセット中の各遺伝子について１つ以上の突然変異を同定する工程、および各遺伝子について少なくとも前記第１の配列データセットにおける発現レベルを定量する工程；ならびに
前記同定された突然変異および定量された発現レベルに基づいて前記治療を予測する工程、を含む方法。
【請求項38】
前記シーケンシングの工程がペアエンドシーケンシングである、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子または受容体関連遺伝子をコードする標的ｃＤＮＡについて濃縮されている、請求項３７または３８に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明の分野は、様々な生体液由来の無細胞核酸の分析のための組成物および方法であり、特に血漿および血清由来の無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）および無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）に関する。
【背景技術】
【0002】
背景技術の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書で提供される情報のいずれかが先行技術であるか、または現在特許請求されている発明に関連すること、または具体的または暗黙的に参照される任意の刊行物が先行技術であることを認めるものではない。
【0003】
本明細書におけるすべての刊行物および特許出願は、あたかも各個々の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照により組み込まれる。組み込まれた参考文献における用語の定義または使用が、本明細書で提供されるその用語の定義と矛盾しているかまたは逆である場合、本明細書で提供されるその用語の定義が適用され、参考文献におけるその用語の定義は適用されない。
【0004】
無細胞核酸（ｃｆＮＡ）、特に血液および他の生体液中に存在する無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）および無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）は、がん細胞または腫瘍などの対象中の疾患細胞および組織を検出するための潜在的なマーカーとして最近提案された。その目的のために、循環核酸を生体液から単離する必要があり、そのような単離を達成するための様々なキットおよび方法が当技術分野で公知である。例えば、ｃｆＤＮＡおよび／またはｃｆＲＮＡは、固相（典型的にはシリカ系）吸着およびその後のクリーンアップを使用して非核酸成分を除去するか（例えば、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ ｏｒ Ａｐｏｓｔｌｅ ＭｉｎｉＭａｘ Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｆＤＮＡ＿ＲＮＡ（ｃｆＮＡｓ）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）、または国際公開第２０２１／０３７０７５号パンフレットに記載されているような水性二相システムを使用して単離することができる。代替的には、循環するｃｆＤＮＡまたはｃｆＲＮＡは、マイクロ流体デバイスを使用して単離することもできる（例えば、ＮＰＪ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０２０）４：３を参照されたい）。またさらなる例では、米国特許出願公開第２０１４／０３５６８７７号明細書は、電気化学的分離を使用した血液からの核酸単離を教示し、米国特許出願公開第２０１５／００３１０３５号明細書は、核酸の環状化およびその後のローリングサークル増幅を教示している。調製方法にかかわらず、そのようにして得られた核酸調製物は次いで、さらなる分析に供される。
【0005】
例えば、米国特許出願公開第２００６／０２２８７２７号明細書は、健康な対照と比較して、遺伝子増幅および／または遺伝子過剰発現の全体的な反映として、がん患者の血漿／血清中の特定の遺伝子のＤＮＡおよびＲＮＡの量を一緒に分析することを教示している。概念的には比較的単純であるが、そのような方法は突然変異特異的情報を提供せず、細胞のＤＮＡセグメント中の突然変異が転写されるか否かも識別しない。配列分析の別の例（例えば、米国特許出願公開第２０２０／０１９９６７１号明細書を参照されたい）では、ｃｆＲＮＡおよび細胞内ＲＮＡをシーケンシングし、細胞内ＲＮＡ配列情報を使用してｃｆＲＮＡ配列情報をフィルタリングする。このようなアプローチは、有利には、ｃｆＲＮＡ試料中の細胞内ＲＮＡ汚染を排除することができ、分析はＲＮＡ情報のみに限定される。国際公開第２０１８／２０８８９２号パンフレットは、循環腫瘍ＲＮＡを使用したＲＮＡ発現プロファイリングを教示しており、もう一度ＲＮＡの分析を限定している。同様に、米国特許出願公開第２０２０／０２３２０１０号明細書は、試料の偏りを減少させるためのサイズ分布および断片化に基づくｃｆＤＮＡ分析の方法を教示している。しかしながら、そのような方法は、試料中のｃｆＤＮＡのみを分析する。
【0006】
ＤＮＡとＲＮＡの両方を分析する努力では、米国特許出願公開第２０１９／０３９０２５３号明細書が、同じ遺伝子をコードする異なる形態について配列情報を得ることができるように、形態特異的配列タグを使用した試料中の核酸の複数の形態（ここでは：ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ）および／または修飾の分析を記載している。さらに、そのような方法は、形態特異的増幅および濃縮も可能にする。そのような分析は、ＤＮＡおよびＲＮＡの同時分析を有利に可能にするが、そのようなアッセイの感度は、特にＤＮＡおよび／またはＲＮＡが低いコピー数／転写産物で存在する場合、比較的低いと予想される。さらに、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡが血漿または血清から単離される場合、感度はさらにより問題である。少なくともいくつかの事例では、無細胞核酸からのシーケンシングライブラリは、米国特許出願公開第２０１８／０３２７８３１号明細書に記載されているような、小型捕捉プローブの使用によって改善することができる。しかしながら、そのようなアプローチは、典型的には、既に単離された核酸の集団に限定され、そのため、特に目的の遺伝子または転写産物が低コピー数または翻訳を受け、突然変異体遺伝子および突然変異体転写産物の場合によくあるように高い不安定性を有する場合、感度を増加させない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】米国特許出願公開第２０１４／０３５６８７７号明細書
【特許文献2】米国特許出願公開第２０１５／００３１０３５号明細書
【特許文献3】米国特許出願公開第２００６／０２２８７２７号明細書
【特許文献4】米国特許出願公開第２０２０／０１９９６７１号明細書
【特許文献5】国際公開第２０１８／２０８８９２号パンフレット
【特許文献6】米国特許出願公開第２０２０／０２３２０１０号明細書
【特許文献7】米国特許出願公開第２０１９／０３９０２５３号明細書
【特許文献8】米国特許出願公開第２０１８／０３２７８３１号明細書
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】ＮＰＪ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（２０２０）４：３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
したがって、循環核酸の単離および分析の様々なシステムおよび方法が当技術分野で公知であるにもかかわらず、それらのすべてまたはほとんどすべてがいくつかの欠点を抱えている。したがって、特に循環核酸が血液から単離され、安定性が低い場合、循環核酸の単離および分析のための組成物および方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明の主題は、生体液中、特に対象の血液中の循環無細胞核酸の改善された単離および分析のための様々な組成物および方法に関する。
【0011】
特に好ましい組成物および方法は、同じ試料液由来のｃｆＴＮＡ画分およびｃｆＲＮＡ画分の両方を使用し、それらの画分は、分解された核酸（例えば、１００以下のヌクレオチドの断片サイズを有する）の単離を可能にする工程で得られる。さらに、両方の画分の逆転写後、好ましい方法により、そのように調製されたｃＤＮＡライブラリは、ハイブリダイゼーションプローブがタイリング様式で同じ標的ｃＤＮＡに結合するように、各標的ｃＤＮＡの増幅のために複数のハイブリダイゼーションプローブを使用して、標的特異的方法でさらに濃縮される。
【0012】
注目すべきことに、ｃｆＴＮＡ画分およびｃｆＲＮＡ画分からこのようにして調製された標的濃縮ｃＤＮＡライブラリの配列分析は、目的の複数の遺伝子に関して前例のない感度および特異性を提供した。実際、本発明者は、様々ながんの存在が血液試料において検出され得るだけでなく、そのような方法ががん分類（例えば、がんのタイプまたはステージ）も可能にすることを実証した。
【0013】
本発明の主題の一態様では、本発明者は、無細胞液から核酸を操作する方法であって、生体液から無細胞全核酸（ｃｆＴＮＡ）を得る工程、および該ｃｆＴＮＡの第１の部分をＤＮＡｓｅ消化に供して、ｃｆＴＮＡのｃｆＲＮＡ画分を生成するさらなる工程を含む方法を企図する。さらに別の工程では、ｃｆＴＮＡのｃｆＲＮＡ画分とｃｆＴＮＡの第２の部分との両方を逆転写、アダプターライゲーション、および増幅に供して、それによって、それぞれ第１および第２のｃＤＮＡライブラリを作製し、次いで、第１および第２のｃＤＮＡライブラリのそれぞれを、複数の標的ｃＤＮＡを濃縮する標的濃縮に供して、それによって、それぞれ第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリを作製する。
【0014】
いくつかの実施形態では、ｃｆＴＮＡは、１７～２００塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片、および５０～３００塩基の間のサイズを有するｃｆＤＮＡ断片を含み、および／またはｃｆＴＮＡは、３０～２５０塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片、および７５～４００塩基の間のサイズを有するｃｆＤＮＡ断片を含む。さらに企図される実施形態では、ｃｆＲＮＡ断片およびｃｆＤＮＡ断片は、すべてのｃｆＴＮＡの少なくとも３０％または少なくとも４０％を一緒に構成し得る。
【0015】
本発明の主題に限定されるものではないが、生体液からｃｆＴＮＡを得るステップは、ｃｆＲＮＡおよびｃｆＤＮＡの同時単離によって実施され得る。追加的または代替的に、逆転写の工程は、第１鎖合成のためのランダムプライミングの工程、および／またはｄＵＴＰを第２鎖合成に組み込む工程を含むことが企図される。最も典型的には、必須ではないが、アダプターライゲーションは、３’－ｄＴＭＰオーバーハングを有するアダプターをライゲーションする工程を含み得る。アダプターライゲーションが、ｐ５配列部分、ｐ７配列部分、第１インデックス配列部分、第２インデックス配列部分、第１シーケンシングプライマー結合部位配列部分および／または第２シーケンシングプライマー結合部位配列部分を含むアダプターを使用することが、（特にＮＧＳシーケンシングが使用される場合）さらに好ましい）。最も典型的には、増幅は６～１５の間の増幅サイクルにわたって行われる。
【0016】
なおさらなる実施形態では、標的濃縮は、各標的ｃＤＮＡに対して、それぞれ異なる位置で標的ｃＤＮＡに結合する複数のハイブリダイゼーションプローブを使用する。したがって、いくつかの態様では、複数のハイブリダイゼーションプローブは、標的ｃＤＮＡにタイリング様式で（例えば、少なくとも×２のタイリング密度で）結合する。異なる観点から見ると、複数のハイブリダイゼーションプローブは、ステップ長ｎ（ｎは１～１０の整数である）を有するタイリング様式で標的ｃＤＮＡに結合することができる。特定のタイリングにかかわらず、複数のハイブリダイゼーションプローブの各々が１００～１５０塩基の長さを有することが一般に好ましい。容易に理解されるように、第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは、シーケンシング、記録保持などのためにさらに増幅され得る。
【0017】
したがって、企図される方法はまた、第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリまたは増幅された第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし、それによってそれぞれ第１および第２の配列データセットを生成する工程を含む。同様に容易に認識されるように、第１および第２のデータセットは、典型的には、配列情報を含み、ならびに定量的情報（例えば、ＴＰＭデータまたはコピー数データ）を提供する。
【0018】
本発明の主題の別の態様では、本発明者は、生体液の試料からｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡを得る工程、ならびにｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡから第１および第２それぞれのｃＤＮＡライブラリを作製するさらなる工程を含む、ｃｆＴＮＡ中の突然変異を増強された感度で検出する方法を企図する。さらに別の工程では、第１および第２のｃＤＮＡライブラリの各々を、複数の標的ｃＤＮＡを濃縮する標的濃縮に供し、それによって第１および第２それぞれの標的濃縮ｃＤＮＡライブラリを作製し、さらに別の工程では、第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングする（例えば、ＮＧＳシーケンシングを使用する）。次いで、第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリからのシーケンシング結果を使用して、それによって、同じ試料からのシーケンシングｃｆＲＮＡまたはｃｆＤＮＡ単独と比較して高い感度で突然変異を検出する。
【0019】
必ずしもそうとは限らないが、最も典型的には、生体液からｃｆＴＮＡを得る工程は、ｃｆＲＮＡとｃｆＤＮＡの同時単離を使用する。そのような方法および他の方法では、ｃｆＴＮＡが、１７塩基～２００塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片、および５０塩基～３００塩基の間のサイズを有するｃｆＤＮＡ断片を含むか、またはｃｆＴＮＡが、３０塩基～２５０塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片、および７５塩基～４００塩基の間のサイズを有するｃｆＤＮＡ断片を含むことが一般に好ましい。異なる観点から見ると、ｃｆＲＮＡ断片およびｃｆＤＮＡ断片は、すべてのｃｆＴＮＡの少なくとも３０％または少なくとも４０％を一緒に構成することが企図される。
【0020】
標的濃縮は、各標的ｃＤＮＡに対して、それぞれ異なる位置で標的ｃＤＮＡに結合する複数のハイブリダイゼーションプローブを使用することがさらに企図される。例えば、複数のハイブリダイゼーションプローブは、標的ｃＤＮＡにタイリング様式で、好ましくは少なくとも×２のタイリング密度で結合する。したがって、複数のハイブリダイゼーションプローブは、ステップ長ｎ（ｎは１～１０の間の整数である）のタイリング様式で標的ｃＤＮＡに結合することができる。他の選択肢としては、複数のハイブリダイゼーションプローブの各々が１００～１５０塩基の長さを有することが一般に好ましい。
【0021】
さらに、シーケンシングの工程は、ペアエンドシーケンシングを含むこと、および／またはシーケンシングが少なくとも２０倍の読み取り深度まで実行されることが企図される。企図される方法において、突然変異を検出する工程は、単一ヌクレオチド変化、１つ以上のヌクレオチドの挿入、１つ以上のヌクレオチドの欠失、逆位、転座およびコピー数変異のうちの少なくとも１つを検出する。さらに、企図される方法はまた、変異対立遺伝子画分の決定を可能にする。有利には、固有の突然変異の検出および／または変異対立遺伝子断片検出の感度は、ｃｆＤＮＡ単独と比較して増強される。
【0022】
本発明の主題のさらなる態様では、本発明者はまた、生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ枯渇ｃｆＲＮＡ画分を含む第１の試薬および同じ生体液のｃｆＴＮＡを含む第２の試薬を含み得る配列分析用試薬キットを企図する。最も典型的には、生体液はヒトの血漿または血清である。例えば、第１の試薬は、主に１７塩基～２００塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片および主に５０塩基～３００塩基の間のサイズを有するｃｆＤＮＡ断片を含み得、および／または第２の試薬は、主に１７塩基～２００塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片を含む。最も典型的には、ｃｆＲＮＡ断片およびｃｆＤＮＡ断片は、すべてのｃｆＴＮＡの少なくとも３０％または少なくとも４０％を一緒に構成する。いくつかの実施形態では、第１の試薬は第２の試薬から調製され得る。
【0023】
本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者は、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリを含み得る配列分析用試薬キットであって、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含まず、第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが同じ生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含む試薬キットを企図する。
【0024】
所望であれば、第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは、同じ標的ｃＤＮＡを使用して標的濃縮され、および／または標的ｃＤＮＡは、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子、または受容体関連遺伝子をコードする。第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリのそれぞれのｃＤＮＡは、ｐ５配列部分、ｐ７配列部分、第１のインデックス配列部分、第２のインデックス配列部分、第１のシーケンシングプライマー結合部位配列部分、および第２のシーケンシングプライマー結合部位配列部分のうちの少なくとも１つを含み得ることがさらに企図される。有利には、第１および／または第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリのｃＤＮＡは、標的ｃＤＮＡに対応する、生体液中に存在する全核酸の少なくとも９０％に相当する。
【0025】
したがって、本発明の主題のさらに別の態様では、本発明者は、５０塩基以下のサイズを有するＲＮＡの結合を可能にし、１００塩基以下のサイズを有するＤＮＡの結合を可能にする表面およびサイズを有する複数のナノ粒子を含む配列分析用試薬キットを企図する。そのようなキットは、標的遺伝子に対する配列相補性を有する複数の標的濃縮オリゴヌクレオチドをさらに含み、標的濃縮オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、同じ標的遺伝子の異なる部分にハイブリダイズする。
【0026】
少なくともいくつかの実施形態では、複数のナノ粒子は、３０塩基以下のサイズを有するＲＮＡの結合を可能にし、８０塩基以下のサイズを有するＤＮＡの結合を可能にする表面およびサイズを有し得るか、または２０塩基以下のサイズを有するＲＮＡの結合を可能にし、６０塩基以下のサイズを有するＤＮＡの結合を可能にする表面およびサイズを有し得る。最も典型的には、必須ではないが、複数のナノ粒子は常磁性ナノ粒子である。標的濃縮オリゴヌクレオチドに関して、複数の標的濃縮オリゴヌクレオチドは、各標的ｃＤＮＡに対して、それぞれ異なる位置で標的ｃＤＮＡに結合する複数のハイブリダイゼーションプローブを含むことが典型的に好ましい。例えば、複数のハイブリダイゼーションプローブは、タイリング様式で標的ｃＤＮＡに結合することができ、複数のハイブリダイゼーションプローブは、少なくとも×２のタイリング密度を提供する。したがって、適切なハイブリダイゼーションプローブは、ステップ長ｎ（ｎは１～１０の間の整数である）のタイリング様式で標的ｃＤＮＡに結合することができる。さらなる例では、複数のハイブリダイゼーションプローブの各々は、１００～１５０塩基の長さを有し得る。さらに、企図されるキットはまた、逆転写酵素、リガーゼ、およびペアエンドシーケンシングに適した複数の異なるアダプターのうちの少なくとも１つを含み得る。
【0027】
したがって、本発明者はまた、本発明の主題のさらに別の態様において、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし、それによって第１および第２それぞれの配列データセットを得る工程を含む、対象の核酸データを分析する方法を企図する。最も典型的には、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは対象の生体液のｃｆＴＮＡから調製され、ｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含まず、第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは同じ生体液のｃｆＴＮＡから調製され、ｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含む。そのような方法のさらなる工程では、第１および第２の配列データセット中の各遺伝子について１つ以上の突然変異が同定され、少なくとも第１の配列データセット中の少なくとも１つの遺伝子について発現レベルが決定される。いくつかの態様では、シーケンシングの工程はペアエンドシーケンシングである。
【0028】
第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリの使用は、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリ単独の突然変異の検出と比較して、突然変異の検出の感度が増強することに留意すべきである。好ましくは、必須ではないが、第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子または受容体関連遺伝子をコードする標的ｃＤＮＡが濃縮されており、任意選択的に、第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは、臨床経過、治療に対する応答または疾患の再発の診断または決定のために、特定の疾患に特異的な標的ｃＤＮＡが濃縮されている。
【0029】
さらに、そのような方法はまた、機械学習アルゴリズムにおいて第１および第２の配列データセットを使用して、疾患パラメータに関連する１つ以上の遺伝子を同定する工程を含み得ることが企図される。例えば、適切な疾患パラメータは、がんの存在、がんのタイプ、がんの再発、および／または残存がんである。追加的または代替的に、そのような方法は、機械学習アルゴリズムにおいて第１および第２の配列データセットを使用して、細胞遺伝学的パラメータ（例えば、染色体の少なくとも一部の転座および／または欠損または重複）に関連する１つ以上の遺伝子を同定する工程を含み得ることが企図される。同様に、そのような方法は、機械学習アルゴリズムにおいて第１および第２の配列データセットを使用して、免疫組織化学的パラメータ（例えば、細胞表面受容体の存在もしくは量および／または細胞表面酵素の存在もしくは量）に関連する１つ以上の遺伝子を同定する工程を含み得ること、ならびに／あるいはそのような方法は、モデルにおいて第１および第２の配列データセットを使用して、それによって、疾患パラメータ、細胞遺伝学的パラメータ、および／または免疫組織化学的パラメータを同定する工程を含み得ることが企図される。容易に理解されるように、そのような方法は、１つ以上の突然変異および／または定量された発現に基づいて治療を投与する工程をさらに含み得る。
【0030】
結果として、本発明者らはまた、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし（ペアエンドシーケンシング配列決定を使用して）、それによって第１および第２それぞれの配列データセットを得る工程を含む、対象のがんを分類する方法を企図する。好ましくは、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは対象の生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含まず、一方第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは同じ生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含む。そのような方法のさらなる工程では、第１および第２の配列データセット中の各遺伝子について１つ以上の突然変異が同定され、少なくとも第１の配列データセット中の１つ以上の遺伝子について発現レベルが定量される。そのようにして同定された突然変異および定量された発現レベルは、次いで、トレーニング済みモデルに使用され、それによって対象のがんを分類することができる。
【0031】
いくつかの態様では、第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子または受容体関連遺伝子をコードする標的ｃＤＮＡが濃縮されている。例えば、トレーニング済みモデルは、がんが存在する、再発している、もしくは残存しているとしてがんを分類することができ、またはトレーニング済みモデルは、がんを固形がん、肉腫、またはリンパ腫として分類することができる。最も典型的には、トレーニング済みモデルは、ベイズ分類器による機械学習を使用して構築される。容易に明らかであるように、企図される方法はまた、がんの分類に基づいて治療を投与する工程を含み得る。
【0032】
したがって、異なる観点から見ると、本発明者は、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし（ペアエンドシーケンシングを使用して）、それによって第１および第２それぞれの配列データセットを得る工程を含む、対象を治療する方法を企図する。好ましくは、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは対象の生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含まず、一方第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは同じ生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含む。そのような方法のさらなる工程は、第１および第２の配列データセット中の各遺伝子について１つ以上の突然変異を同定する工程、および少なくとも第１の配列データセット中の各遺伝子について発現レベルを定量する工程を含む。次いで、同定された突然変異および定量された発現レベルに基づいて治療が投与される。
【0033】
前述のように、第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子または受容体関連遺伝子をコードする標的ｃＤＮＡが濃縮されていることが企図される。したがって、治療は、化学療法剤、免疫刺激剤、チェックポイント阻害剤、および／またはがんワクチンを投与する工程を含み得る。治療は、好ましくは、同定された突然変異および定量された発現レベルを使用するモデル（例えば、ベイズ分類器トレーニング済みモデル）に基づくことも理解されたい。
【0034】
最後に、本発明者は、それぞれの標的ｃＤＮＡにハイブリダイズする複数の標的濃縮プローブを含む、生体液から得られたｃＤＮＡの配列分析用試薬キットであって、標的ｃＤＮＡががん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子および／または受容体関連遺伝子をコードする試薬キットを企図する。所望であれば、標的濃縮プローブの各々は、固相捕捉のための配列部分、固相捕捉のための化学修飾、または磁気ビーズをさらに含み得る。最も典型的には、標的ｃＤＮＡは、生体液のｃｆＴＮＡおよびｃｆＲＮＡから調製される。いくつかの実施形態では、標的ｃＤＮＡは、以下の表１の遺伝子をコードする。
【0035】
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、好ましい実施形態の以下の詳細な説明と併せて、同様の符号が同様の構成要素を表す添付の図面からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【発明を実施するための形態】
【0037】
本発明者は、血液などの生体液から単離された無細胞核酸の分析に関連する多くの困難が、ｃｆＴＮＡおよびｃｆＲＮＡならびにそれらの断片を同じ試料から単離し、そのようにして得られた試料を逆転写に供してそれぞれのｃＤＮＡライブラリを作製するシステムおよび方法を使用して克服され得ることを今回発見した。分析をさらに改善するために、次いで、ｃＤＮＡライブラリを、（ハイパー）タイリングハイブリダイゼーションプローブを使用する標的濃縮に供して、その後増幅、ＮＧＳシーケンシングおよびインシリコ分析する。
【0038】
特に、本明細書に提示されるシステムおよび方法は、現在知られている方法と比較して核酸の損失を回避するだけでなく、顕著な感度および特異性で突然変異の優れた検出も提供する。実際、目的の遺伝子をコードする循環核酸の圧倒的多数（実質的にすべてではないにしても）は、それらの物理的完全性、コピー数、および発現の強度にかかわらず、本明細書に提示されるシステムおよび方法を使用して調査することができることを理解されたい。その結果、本明細書に提示される方法によって得られたシーケンシングデータは、循環核酸の非常に正確で包括的な提示を提供するだけでなく、機械学習が、がん、がんのタイプ、微小残存疾患などを識別するために、高い信頼性（例えば、ＡＵＣ≧０．７、より典型的にはＡＵＣ≧０．８）で使用できるトレーニング済みモデルの生成を可能にする。同様に、本明細書に提示されるシステムおよび方法はまた、高い信頼性でがんサブタイプを識別可能にする。
【0039】
例えば、１つの典型的な方法では、生体液は、ＥＤＴＡ含有採血管に採取された末梢血であり、血漿画分は、当技術分野で周知の遠心分離を介して血液から調製される。次いで、全核酸（ｃｆＴＮＡ）は、少なくとも５０塩基対のサイズを有するＤＮＡおよび少なくとも１７ヌクレオチドのサイズを有するＲＮＡの回収に適したシリカ系ビーズを使用して血漿試料から抽出される。これに関連して、そのように回収された核酸は、全長遺伝子および転写産物ならびにそれらのすべての断片を、そのような断片が非常に小さい場合（例えば、＜１５０ｂｐ／ｎｔ、または＜１００ｂｐ／ｎｔ、または＜７５塩基ｂｐ／ｎｔ、さらにより小さい）であっても含むことに留意されたい。次いで、そのように単離されたｃｆＴＮＡの少なくともいくつかを２つの部分に分割し、２つの部分のうちの１つをＤＮＡｓｅ処理に供して、対応するｃｆＲＮＡを得る。有利には、この工程は、ＤＮＡに対してＲＮＡについて試料を濃縮し、独立しているが対応する試料として機能し得る（未処理ｃｆＴＮＡ試料中のＤＮＡ／ＲＮＡ量は、典型的には８０％／２０％～９５％／５％である）。したがって、２つの異なる試料（ｃｆＴＮＡおよびｃｆＲＮＡ）が同じ生体液から生成されることを認識すべきである。
【0040】
次いで、２つの異なる試料のそれぞれを、第１鎖合成（典型的には小さいランダムプライマーを用いる）、第２鎖合成（鎖特異性のためにｄＵＴＰを用いて実施し得る）およびＡテーリングによる任意選択のｒＲＮＡ枯渇後に逆転写に供する。次いで、そのようにして得られた第１および第２のｃＤＮＡライブラリを３’－ｄＴＭＰアダプターにライゲーションする。この時点で、ｃｆＴＮＡから調製されるｃＤＮＡライブラリは、アダプターもライゲーションされたｃｆＤＮＡも含むことに留意すべきである。第１および第２のｃＤＮＡライブラリの両方をＰＣＲを用いて増幅し、各増幅反応物をさらなる処理のためにクリーンアップする。容易に理解されるように、適切なアダプターが以下でより詳細に説明するように使用された場合、多重化のために複数のサンプルを組み合わせることができる。
【0041】
次いで、そのように増幅された第１および第２のｃＤＮＡライブラリを、各標的遺伝子に対する複数のタイリングハイブリダイゼーションプローブを使用して標的遺伝子濃縮に供する。最も典型的には、標的遺伝子または転写産物全体が、ステップ長１～１０の間を有するハイブリダイゼーションプローブによって標的化される（すなわち、第１および第２のハイブリダイゼーションプローブは、１～１０ｎｔの間の直線距離で標的配列に結合する）。ハイブリダイゼーションプローブが１００～１５０ｎｔの長さを有することがさらに好ましい。本実施例では、標的遺伝子は、１つ以上のがん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子、および／または受容体関連遺伝子をコードする遺伝子であり、１４５８個の標的遺伝子の例示的な集合を以下の表１に示す。ハイブリダイゼーションを液相で少なくとも８時間にわたって行い、捕捉されたｃＤＮＡを磁気ビーズを用いて取り外すことになる。
【0042】
標的核酸の単離により、第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが得られ、次いで、それらをさらなる増幅（典型的には６～１５増幅サイクルの間）に供し、次いで、そのように増幅された標的濃縮ｃＤＮＡライブラリを、ＮＧＳシーケンシング（典型的にはペアエンドシーケンシング）を使用してシーケンシングする。シーケンシングの終了時に、第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリのデータを、逆畳み込み、突然変異体および融合呼び出し、発現レベル決定、ＣＮＶ／ＳＮＰ変異体の同定、ならびに対立遺伝子画分およびゲノム再編成の決定のために処理する。さらに、また、以下により詳細に示されるように、第１および／または第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリのデータの一部または全部を、トレーニング済みモデルの作製に使用することができ、および／またはがんの存在を同定するために、がんを分類またはさらにサブタイプに分類するために、残存疾患を検出するために、および細胞遺伝学的変化（例えば、転座、コピー数の変化など）を検出するために、１つ以上のトレーニング済みモデルで使用することができる。
【0043】
適切な生体液に関して、全血、血漿、および血清以外の多数の生体液も本明細書での使用に適切であると見なされ、適切な液は、無細胞核酸を含有することができる、または含有することが疑われるすべての液を含むことを理解されたい。また、容易に理解されるように、生体液は、任意の適切な供給源から、特にヒトまたは非ヒト哺乳動物（家畜、コンパニオンアニマルなど）から得ることができる。さらに、ヒトまたは他の哺乳動物は、健康であっても、または状態もしくは疾患を有すると診断されているか、もしくは有することが疑われていてもよく、特にそのような疾患が１つ以上の遺伝子の突然変異および／または（過剰または過小）発現パターンに関連し得るかまたはそれに起因し得ることに留意すべきである。したがって、対象は、ｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡが対象から得られるときに、治療未経験であっても、または治療を受けていてもよい。異なる観点から見ると、ｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡの使用は、疾患の検出、疾患の進行の監視、疾患を治療するために行われる治療の治療効果の監視、ならびに残存または再発性疾患の検出に特に有益である。
【0044】
したがって、企図される液には、唾液、尿、滑液、脳脊髄液、嚢胞液（例えば、膵臓嚢胞）および腹水が含まれる。結果として、生体液のタイプに応じて、固体担体（例えば、シリカまたはアミン修飾担体）への吸着による単離、多塩基性材料への非共有結合（特にタンパク質）、電気泳動または他の電気化学的分離、マイクロ流体分離などを含む、ｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡの多数の公知の単離方法が企図されることに留意されたい。しかしながら、ｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡの特に好ましい単離方法には、固相吸着を使用するものが含まれる。
【0045】
さらに、本明細書に提示される方法およびシステムのための試料は、必ずしも液に限定される必要はないが、そのようなシステムおよび方法は、核酸の含有量が低い任意の試料と組み合わせて使用することができ、そのような核酸が少なくともある程度の分解を受けている可能性があることも認識されるべきである。したがって、さらに企図される試料には、生検標本（例えば、未加工または加工されていてもよい、針芯、塗抹標本、ブラシなど）、組織スライド（ＦＦＰＥ固定または非固定）、微小または残存法医学組織試料、古い組織からの試料（例えば、１００歳超）などが含まれる。
【0046】
単離方法にかかわらず、単離されたｃｆＲＮＡおよびｃｆＤＮＡは、（特定の標的遺伝子または転写産物に関して）完全長核酸を表すだけでなく、様々な程度の長さを有するその断片も表すことを理解されたい。実際、ｃｆＴＮＡおよびｃｆＲＮＡの特定の供給源材料に起因して、単離された材料は、主に（例えば、少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％の）複数の標的遺伝子およびその転写産物の断片を含むことが予想される。したがって、複数の標的遺伝子および転写産物の大部分は、１，０００ｂｐ／ｎｔ未満に等しい、または９００ｂｐ／ｎｔ未満に等しい、または８００ｂｐ／ｎｔ未満に等しい、または７００ｂｐ／ｎｔ未満に等しい、または６００ｂｐ／ｎｔ未満に等しい、または５００ｂｐ／ｎｔ未満に等しい、または４００ｂｐ／ｎｔ未満に等しい、または３００ｂｐ／ｎｔ未満に等しい、さらにはそれ未満の長さを有することが企図される。
【0047】
異なる観点から見ると、本明細書で企図される手順を使用して単離されたｃｆＲＮＡの少なくとも一部は、１５～５０ｎｔの間、または２０～７５ｎｔの間、または１７～１００ｎｔの間、または２０～１５０ｎｔの間、または２０～２００ｎｔの間、または５０～３００ｎｔの間の長さ範囲を有し得る。同様に、本明細書で企図される手順を用いて単離されたｃｆＴＮＡ中に存在するｃｆＤＮＡの少なくとも一部は、５０～１００ｂｐの間、または７５～１５０ｂｐの間、または７５～２００ｂｐの間、または１００～３００ｂｐの間、または５０～３５０ｂｐの間の長さ範囲を有し得る。したがって、ｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡの全体的なサイズ分布は、１００～２００ｂｐ／ｎｔの間、または１５０～２５０ｂｐ／ｎｔの間、または２００～３００ｂｐ／ｎｔの間の長さ、典型的には５０～４００ｂｐ／ｎｔの間または７５～５００ｂｐ／ｎｔの間の長さ分布幅（すべての単離された核酸の９０％を被覆する）でピークを有し得る。
【0048】
さらに企図される態様では、ｃｆＲＮＡ画分がｃｆＴＮＡ単離の親体積から調製されることが一般に好ましいが、ｃｆＲＮＡ画分はまた、ｃｆＲＮＡのみを選択的に単離するように設計された方法および材料を使用して、または試料の第２の異なる体積からのいずれかで、同じ試料由来のｃｆＴＮＡから別個に調製され得ることを理解されたい。代替的には、ｃｆＲＮＡおよびｃｆＤＮＡを同じ生体液から別々に単離してもよく、様々な割合の単離されたｃｆＲＮＡおよびｃｆＤＮＡ（例えば、約５～１５％のｃｆＲＮＡと８５～９５％のｃｆＤＮＡ、または約１５～２５％のｃｆＲＮＡと７５～８５％のｃｆＤＮＡ、または約３０～５０％のｃｆＲＮＡと５０～７０％のｃｆＤＮＡ）からｃｆＴＮＡ画分を再構成してもよい。
【0049】
容易に理解されるように、ｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡ試料中の単離されたｃｆＲＮＡ分子の逆転写は、当技術分野で公知のすべての標準的なプロトコルに従うことができる。さらに、ｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡ試料は、リボソームＲＮＡを除去するために前処理され得ることを理解されたい。さらに、望ましい場合、ｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡ試料はまた、マグネシウムの存在下での熱処理、または剪断、および／または超音波処理を使用してサイズ断片化に供され、例えば２００～４００塩基対／ヌクレオチドの間の平均サイズを有する断片化分子の集団を生成し得る。最も典型的には、逆転写は、特に第１鎖合成のためにユニバーサルプライマーを利用する。第２鎖合成も確立された手順に従うことができ、オリゴＴプライマー、ランダムプライマー、および／または標的化第２鎖プライマー（例えば、標的濃縮リストからの配列を使用すること）の使用を含み得る。同様に、第２鎖合成は、ｄＵＴＰ取り込みを使用して鎖特異的であり得ることが企図される。ｃＤＮＡ作製の方法にかかわらず、そのようにして作製されたｃＤＮＡライブラリは、ｃＤＮＡライブラリメンバーへのアダプターライゲーションを容易にするＡテーリング（単一アデノシンの付加）に供されることが好ましい（典型的には、３’－ｄＴＭＰオーバーハングを有するｄｓＤＮＡアダプターを使用して、Ａテーリングされたライブラリメンバーへのライゲーションを可能にする）。
【0050】
同様に、アダプターの選択は、本明細書に提示された本発明の主題を限定するものではなく、アダプターの選択は、典型的には下流処理の特定の方法によって駆動されることを認識されたい。例えば、下流処理がＩｌｌｕｍｉｎａ型次世代シーケンシングを使用する場合、アダプターは、典型的には、クラスター形成を可能にするためにフローセルまたはレーン上の相補配列に特異的に結合する配列部分を含む。他のそのような配列部分の中でも、ｐ５およびｐ７配列部分は、本明細書での使用に特に適していると考えられる。さらに、特に試料が多重化される場合、企図されるアダプターはまた、シーケンシング後の逆畳み込みを可能にする固有の第１および／または第２のインデックス部分を含み得る。同様に容易に認識されるように、アダプターは、通常、ペアエンドシーケンシングを可能にするための適切なシーケンシングプライマー結合部位配列部分を含む。しかし、特にシーケンシングがペアエンドシーケンシングではない場合（例えば、ナノポアシーケンシング、一分子リアルタイムシーケンシング、イオントレントシーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシングなど）、様々な代替アダプターを使用することができ、またはさらにはアダプターを使用しなくてもよい態様がさらに企図される。次いで、そのようにして得られた第１および第２のｃＤＮＡライブラリを、所望の標的遺伝子セットについて増幅および／または濃縮することができる。この時点で、第１および第２のｃＤＮＡライブラリは同じ生体液から（最も典型的には同じｃｆＴＮＡ単離物から）調製されたので、これらの２つのｃＤＮＡライブラリは、同じ試料の２つの異なるが相補的な図を表す：１つは（ＤＮＡに対して）ＲＮＡが濃縮されており、もう１つは（ＲＮＡに対して）ＤＮＡが豊富である。
【0051】
標的濃縮に関して、第１および第２のｃＤＮＡライブラリを（好ましくはアダプターライゲーション後）標的濃縮に供して、目的の遺伝子を選択してライブラリを濃縮することが企図される。最も典型的には、目的の遺伝子は疾患または状態に関連するが、一般的な健康状態または年齢または他の非健康関連状態に基づいて選択することもできる。例えば、目的の疾患関連遺伝子は、典型的には、特定の疾患に関連するかまたは特定の疾患の原因となる１つ以上の遺伝子を含む。とりわけ、疾患ががんである場合、がん関連遺伝子は、がんの存在、がんのタイプ、がんの再発、および／または治療後の残存がんを示し得る。したがって、特に企図される標的遺伝子には、細胞シグナル伝達関連遺伝子（例えば、細胞表面受容体の存在または量を同定するため）、チェックポイント阻害関連遺伝子（例えば、がんの免疫状態を同定するため）、細胞表面酵素をコードする遺伝子、免疫表現型関連遺伝子（例えば、細胞表面受容体の存在もしくは量および／または細胞表面酵素の存在もしくは量を同定するため）、および／または１つ以上の細胞表面受容体をコードする遺伝子が含まれる。さらに、がん特異的遺伝子には、公知の遺伝子の特定の突然変異体型（例えば、キナーゼの融合産物、切断型の細胞表面受容体またはシグナル伝達成分）、ならびに新生物および患者に特異的な突然変異体型（すなわち、腫瘍特異的ネオ抗原および患者特異的ネオ抗原）をコードするものも含まれ得る。したがって、濃縮のために選択された遺伝子を使用して、がんの存在を同定し、特定のがんを分類し、治療に対する臨床経過もしくは応答を決定し、または疾患の再発を同定できることを理解されたい。
【0052】
さらに、本明細書に提示される方法は、がん（または他の疾患細胞）の遺伝子における突然変異を同定するのに有用であるだけでなく、突然変異した遺伝子および突然変異していない遺伝子の発現レベルを決定することができ、疾患の同定および治療に適した臨床情報のさらなる次元を追加することを理解されたい。例えば、そのような追加の情報は、変異遺伝子の単独の同定が、その変異遺伝子が弱くしか発現されないかまたは全く発現されない医薬標的として臨床的に無関係であり得る場合に特に有益である。
【0053】
さらに、本明細書に提示される企図されるシステムおよび方法は、循環核酸分解産物および比較的小さいサイズ（例えば、１７～５０の間のＲＮＡヌクレオチドおよび／または５０～３００の間のＤＮＡ塩基対）を有する断片を利用するだけでなく、タイリングまたはさらにはハイパータイリング標的濃縮を使用してこれらの断片を特異的に濃縮し、それによって無細胞生体液中に存在するすべての変異体の捕捉を最大化することを認識されたい。例えば、いくつかの実施形態では、各標的遺伝子は、ステップ長ｎ（ｎは１～５の間の整数である）（すなわち、標的遺伝子に結合し、塩基で発現された場合の第１および第２のハイブリダイゼーションプローブの３’末端の直線距離）でタイリング様式（部分的に重複）に標的ｃＤＮＡに結合する複数のハイブリダイゼーションプローブによって標的化される。他の実施形態では、ｎは５～１０の間、または１０～１５の間、または１５～２０の間、または２０～３０の間、または３０～５０の間、または５０～７０の間、または７０～１００の間である。したがって、異なる観点から見ると、複数のハイブリダイゼーションプローブは、より長いハイブリダイゼーションプローブが使用される場合、少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、または少なくとも８、または少なくとも９、または少なくとも１０、または１０～２０の間、または２０～４０の間、または４０～６０の間、およびさらにそれ以上の高いタイリング密度を提供する。結果として、本明細書での使用に適したハイブリダイゼーションプローブの線長は、２０～４０塩基の間、または４０～７０塩基の間、または７０～１００塩基の間、または１００～１５０塩基の間、およびさらにそれ以上の長さであってよいことが認識されるべきである。したがって、ハイブリダイゼーションプローブは、多数の位置で各標的遺伝子の全長を被覆する。当然のことながら、ハイブリダイゼーションプローブは、典型的には、ハイブリダイゼーションプローブと結合した標的との物理的分離を可能にして標的濃縮を容易にする部分を含み、適切な部分には、磁気ビーズ、色分けされたビーズ、親和性剤（例えば、ビオチン、アビジン、ｈｉｓタグ、セルロース結合タンパク質など）が含まれることに留意すべきである。
【0054】
最も好ましくは、ハイブリダイゼーションプローブは、配列特異的アニーリングを可能にするのに十分な時間、液相中でｃＤＮＡライブラリと組み合わされる。容易に理解されるように、ハイブリダイゼーションプローブが長いほど、特異的かつ完全にアニールするのにより長い時間を必要とする。その結果、ハイブリダイゼーションプローブによる標的捕捉は、２～４時間の間、または４～８時間の間、または８～１２時間の間の範囲であり得、場合によってはさらに長くなり得る。捕捉されたｃＤＮＡのタイプにかかわらず、ハイブリダイゼーションプローブと捕捉されたｃＤＮＡとの間に形成されたハイブリッドは、未結合ｃＤＮＡライブラリメンバーの残りから除去される。これに関連して、そのように濃縮された標的核酸は、（ｃｆＲＮＡの逆転写からの）ｃｆＤＮＡ分子およびｃＤＮＡ分子を含むことが認識されるべきである。さらに、そのように単離され濃縮された標的核酸は、ｃｆＴＮＡ画分およびｃｆＲＮＡ画分の全長ＲＮＡ分子だけでなく、生体液中に元々存在するすべての断片および分解産物も表すことを理解されたい。したがって、循環核酸の捕捉は、疾患細胞から放出される無細胞核酸の有意に改善された提示を提供する。実際、第１および／または第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは、標的ｃＤＮＡに対応する、生体液中に存在する全核酸の少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９２％、または少なくとも９４％、または少なくとも９６％、または少なくとも９８％を表すことが推定される。
【0055】
シーケンシングを容易にするために、第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリを標的特異的増幅に供する。容易に理解されるように、そのような増幅は、アダプターのアンカリング、シーケンシング、および／またはインデックス配列部分を有利に使用することができる（標的特異的配列に起因する増幅バイアスを有益に低減する）。最も典型的には、第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリの増幅は、シーケンシング、保管および反復分析のための十分な材料を提供するために６～１５増幅サイクルにわたって行われる。既に先に述べたように、特定のシーケンシング方法は本発明の主題を限定するものではないことを理解されたい。しかしながら、シーケンシングは、次世代（例えば、ペアエンド）シーケンシングまたは他のハイスループット法を用いて行われることが一般に好ましい。第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリのシーケンシングは、好ましくは、少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍、または少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍、さらに必要に応じてそれ以上の深度まで行われる。
【0056】
シーケンシングの方法にかかわらず、２つのデータセットが、増幅され標的濃縮された第１および第２のｃＤＮＡライブラリから得られ、これもまた以下でより詳細に考察されるように、異なるが相補的な情報を提供することを理解されたい。有利には、本発明者は、本明細書に提示されるシステムおよび方法の使用により、遺伝子における多種多様な突然変異体、代替転写産物、および発現が不十分または非発現の突然変異の同定および定量、ならびに以下により詳細に示されるようにＲＮＡ転写産物に高い不安定性をもたらす突然変異の検出が可能になることを発見した。さらに、本明細書に提示されるシステムおよび方法はまた、ｃｆＲＮＡ画分を使用して（突然変異した）標的遺伝子の発現レベルの定量を可能にし、これは、ｃｆＴＮＡ画分から得られたコピー数変異情報からさらに解釈可能となる。同様に、企図されるシステムおよび方法は、ｃｆＴＮＡ画分およびｃｆＲＮＡ画分の両方が分析される場合、対立遺伝子画分の改善された分析を可能にする。
【0057】
したがって、第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリの使用は、突然変異体（例えば、ＳＮＶ、インデル、転座）検出の感度を有意に増強させる。とりわけ、各細胞から生成されたｃＤＮＡに変換されたＲＮＡは、各細胞から生成されたＤＮＡよりも豊富である。したがって、以下により詳細に示されるように、ＴＮＡシーケンシングにおけるＤＮＡの同時シーケンシングは、例えば突然変異によるその安定性の変化に起因して、ＲＮＡが分解される場合の突然変異の検出を補償する。実際、ｃｆＴＮＡ画分およびｃｆＲＮＡ画分から得られたデータは、以下により詳細に示されるように、高い信頼性で疾患、病態および疾患状態の同定およびさらには予測を可能にする機械学習トレーニング済みモデルを介して生成するのに十分であることが認識されるべきである。さらに、ｃｆＴＮＡ画分およびｃｆＲＮＡ画分に基づいてそのようにして得られた情報を使用して、免疫表現型および／または免疫組織化学的プロファイルを予測することもできる。以下でさらに詳細に考察するように、ｃｆＴＮＡ画分およびｃｆＲＮＡ画分に基づいてそのようにして得られた情報もまた、仮想細胞遺伝学的分析を実施するために使用することができる。
【実施例】
【0058】
核酸抽出（一般プロトコル）：特に明記しない限り、すべての核酸抽出は、ＥＤＴＡバキュテーナーチューブに採取した全末梢血からのものであった。細胞成分から血漿を分離した後、１ｍｌの血漿を使用した。
【0059】
小さな断片化ＲＮＡおよびＴＮＡを捕捉するために、本発明者は、元々は循環中のマイクロＲＮＡを捕捉するために設計された方法を適合させた。以下の実施例では、本発明者は市販のキット（Ａｐｏｓｔｌｅ ＭｉｎｉＭａｘ Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｆＲＮＡ／ｃｆＤＮＡ 単離キット）を使用し、製造業者のプロトコルに従った。ｃｆＲＮＡ／ｃｆＤＮＡの単離後、ｃｆＴＮＡ試料の半分をＤＮａｓｅで処理してｃｆＲＮＡ試料を得たが、他方の半分は不変に維持した。次いで、各対象のｃｆＴＮＡおよびｃｆＲＮＡ試料を並行して処理して、各対象のそれぞれのｃＤＮＡライブラリを作製した。逆転写およびアダプターライゲーションを、市販のキット（ＫＡＰＡ ＲＮＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐキット）を製造者の説明書に従って使用して行った。逆転写およびアダプターライゲーションは、以下の工程を含んでいた：ランダムヘキサマープライマーを使用した第１鎖合成、続いてＫＡＰＡ ＲＮＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ Ｋｉｔプライマーを使用した第２鎖合成、およびＡテーリング。Ａ－テーリングが完了したら、インデックス配列部分を有するＩｌｌｕｍｉｎａ ＮＧＳアダプターをｃｆＤＮＡおよびｃＤＮＡにライゲーションし、ＫＡＰＡ ＲＮＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ Ｋｉｔプライマーを用いて第１および第２のライブラリを１４サイクル増幅した。これに関連して、第２鎖合成は、以下でより詳細に論じるように、下流の標的濃縮に使用されている同じオリゴヌクレオチドを好ましくは使用し、それによって感度および特異性を大幅に増強させることを理解されたい。
【0060】
次いで、増幅反応をＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒＦｌｅｘクリーンアップシステムを用いてクリーンアップし、増幅された第１および第２のライブラリを定量した。標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ（「標的濃縮プローブ」）とのハイブリダイゼーションのために、Ｊａｎｕｓによって対象のライブラリから８プレックスＤＮＡ試料ライブラリプールを調製した。プローブは、一晩（少なくとも８時間）のハイブリダイゼーションのために合計１４５８個の遺伝子（表１に列挙）をカバーするＧＴＣ設計ＫＡＰＡ標的濃縮プローブであった。表１の標的遺伝子の各遺伝子に対する標的濃縮プローブは、６０ヌクレオチドの長さを有し（したがって、１～６０の間のステップ長が提供される。特定のステップ長がプライマー設計ソフトウェアによって決定されるであろう）、２～５９の間のタイリング密度をもたらした。標的ハイブリダイゼーション後、ＫＡＰＡビーズを使用して多重化ＤＮＡライブラリを捕捉し、各ライブラリを増幅して第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリを得た。次いで、第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをクリーンアップし、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ分析装置を用いて確認した。次いで、各ライブラリを正規化し、プールし、変性させ、ペアエンド１００×２サイクルを用いてシーケンシングのためにＮｏｖａｓｅｑ ６０００シーケンサーにロードした。
【表1】
【0061】
シーケンシング実行が終了した後、データをｂｃｌ２ｆａｓｔｑ２ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ．２．２０．０で実行してデマルチプレックス（ｄｅ－ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）した。その後の配列分析には、融合呼び出しのためのＤｒａｇｅｎ ３．８ ＲＮＡ ｓｅｑパイプライン、発現レベル（ＴＰＭで測定）の決定のためのＳａｌｍｏｎ ｖ１．４．０、ＣＮＶ呼び出しの決定のためのｃｎｖｋｉｔ、および突然変異呼び出しを得るためのＶＣＦ用ＲＮＡ－Ｓｅｑ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｖ．２．０．２－ＢａｓｅＳｐａｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｕｂ Ａｐｐが含まれた。
【0062】
患者試料：１６０人の個体の末梢血試料をＥＤＴＡチューブに採取した。以下の表２に示すように、これらの個体のうち、３１人は健常対照であり、１２９人は骨髄系腫瘍（２２）、リンパ系腫瘍（７３）または固形腫瘍（３４）の病歴を有する患者であった。これらの試料の血漿１ｍｌから全核酸を抽出し、表１の遺伝子を使用して上記のように逆転写および標的濃縮を行った。
【表2】
【0063】
各患者の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリの配列分析（各患者のｃｆＴＮＡおよびｃｆＲＮＡ画分に基づく）により、有意に多数の突然変異がｃｆＲＮＡ画分から検出され得ることが明らかになった。図１から明らかに分かるように、同じ遺伝子濃縮パネルを使用したｃｆＴＮＡと比較して、ｃｆＲＮＡのみを使用して有意により多くの突然変異が検出された。特に、２７５個の遺伝子を有する公知のＤＮＡパネルに基づく日常的な試験で検出された突然変異の数は、同定された突然変異体が実質的に少なかった。ｃｆＲＮＡ試験で検出された突然変異の数が、ｃｆＴＮＡまたはｃｆＤＮＡを使用した場合よりも有意に高かったことは注目に値する。ｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡの試験に使用される遺伝子の数もまた、ＤＮＡで使用される遺伝子（２７５遺伝子）よりも有意に多かった（１４８５遺伝子）。しかしながら、２７５個の遺伝子パネルは臨床的に関連する発がん性遺伝子のほとんどを含んでいたので、２７５個の遺伝子に含まれていなかった遺伝子におけるＲＮＡ試験では４５個の突然変異しか検出されなかった。実際、これらの４５個の突然変異は２７個の遺伝子に集中していた。これらの知見を考慮すると、ｃｆＲＮＡ分析はより感度が高く、有益であることが明確に分かる。しかしながら、ｃｆＲＮＡは、以下により詳細に示されるように、低発現または未発現の突然変異の検出、またはＲＮＡが単離限界を超えて急速に分解される場合には不利である。
【0064】
さらなる一連の分析において、本発明者は、変異対立遺伝子頻度（ＶＡＦ）／感度に対するｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡの影響を調査した。より具体的には、本発明者は、両方の方法で突然変異が検出された場合、ｃｆＴＮＡとｃｆＤＮＡとの間でＶＡＦを比較した。図２に見られるように、ＶＡＦのレベルにおいて２つの方法の間に有意差がある（符号検定［帰無仮説検定］Ｐ＝０．０４）。この比較は、ｃｆＴＮＡが使用される場合、検出された突然変異において実質的に感度がより高いことを明らかに実証する。特定の理論または仮説に限定されるものではないが、本発明者は、そのような差がｃｆＴＮＡ中のｃｆＲＮＡ画分に起因し得ることを企図する。
【0065】
次いで、本発明者は、ｃｆＴＮＡおよびｃｆＲＮＡの両方を使用した場合の突然変異の包括的検出の潜在的な利益を決定することに着手した。既に上で示したように、ｃｆＲＮＡを使用した場合、ｃｆＴＮＡまたはｃｆＤＮＡと比較して、より多くの数の突然変異が検出された。しかしながら、本発明者は、特定の変異がｃｆＴＮＡでは検出され得るが、ｃｆＲＮＡでは検出されないことを発見した。このような違いは、突然変異による翻訳の早期終了が突然変異体ＲＮＡの分解の増加をもたらし得るという現象に起因する可能性が最も高い。そのような観察に加えて、（不適切な）スプライシング変異はまた、ＲＮＡの早期分解をもたらし得る。全体として、図３から分かるように、突然変異が両方の分析で検出された場合、ｃｆＲＮＡとｃｆＴＮＡとの間でＶＡＦに差はなかった。しかし、図４から明らかなように、いくつかの突然変異はｃｆＴＮＡと比較してより高いレベルで明確に検出され、逆もまた同様であった。以下の例は、ｃｆＤＮＡでは検出されたが、ｃｆＲＮＡでは検出されなかった多数の突然変異があることを示している。表３は、ｃｆＴＮＡで検出されたが、ｃｆＲＮＡでは検出されなかった突然変異の例を示している。終結につながる突然変異の割合が高いことに留意されたい。残りの突然変異は、高度に不安定化する可能性が高い。
【表3】
【0066】
有意に改善された突然変異体の検出およびＶＡＦ決定に加えて、本発明者はまた、本明細書に提示されるシステムおよび方法が、免疫表現型、免疫組織化学プロファイルの正確な予測、ならびにｃｆＲＮＡ発現の定量的分析によるバイオマーカーの診断および測定に適していることを実証した。より具体的には、本発明者は、ｃｆＲＮＡ画分および／またはｃｆＴＮＡ画分からの標的化ＲＮＡシーケンシングにより、典型的には免疫表現型同定および免疫組織化学（ＩＨＣ）プロファイリングに使用されるタンパク質の発現レベルを測定することが可能になり、ＲＮＡレベルは典型的にはタンパク質レベルを反映し、したがって実際のタンパク質発現の測定の代理として有用であり得るので、選択されたタンパク質の発現レベルを様々な疾患およびがんの診断、予後予測、およびモニタリングにおけるバイオマーカーとして使用可能になることを発見した。
【0067】
例えば、ＣＣＮＤ１の（特にＣＤ２２に対する）発現レベルは、マントル細胞リンパ腫の診断マーカーとして使用することができる。試験した患者集団の試料を使用して、図５は、発現レベル（および特に一般的なＢ細胞マーカーＣＤ２２に対する相対的発現レベル）が、個体＃３および＃６についてマントル細胞リンパ腫の存在を正確に診断できることを実証する。対照的に、図６から容易に得ることができるように、いずれの慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）試料も同様の高いＣＣＮＤ１：ＣＤ２２比を示さなかった。したがって、ｃｆＲＮＡ分析からの発現レベルデータは、異なるリンパがんタイプを正確に識別できることを理解されたい。
【0068】
固形腫瘍についても同様に、ｃｆＲＮＡ試料中のＣＡ１５－３（ＭＵＣ１）の発現レベルを使用して、図７の患者＃２および＃７から分かるように、活動性乳がんを有する試料を他の状態と区別することができる。また、乳がんおよび高ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２）を有するこれらの患者は、図８に明確に示すように、末梢血ｃｆＲＮＡ中のＥＲＢＢ２ ｍＲＮＡを評価することによって区別することができた。
【0069】
またさらなる一連の実験において、本発明者は、様々なタイプのがんの診断および早期検出のために、機械学習によるｃｆＲＮＡ発現プロファイリングを使用した。一例では、本発明者は、がんの有無を予測するための機械学習アルゴリズムを用いたＴＰＭ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ Ｍｉｌｌｉｏｎ）プロファイリングによって決定されるｃｆＲＮＡ発現レベルを使用した。このようなシステムでは、特定のがんの存在を予測するために、ならびにこの予測に必要な遺伝子を決定するために開発された機械学習システムを使用して、ＮＧＳ標的遺伝子の発現レベルを分析した。がんに関連する遺伝子のサブセットを、ｋ分割（ｋ－ｆｏｌｄ）交差検証手順（ｋ＝１０）に基づいて、分類システムのために自動的に選択した。個々の遺伝子について、ｋ－１サブセットのトレーニングでナイーブベイズ分類器を構築し、他の試験サブセットで試験した。次いで、トレーニングおよび試験サブセットを回転させ、分類誤差の平均を使用して遺伝子の関連性を測定した。分類システムを、最も関連性の高い遺伝子の選択されたサブセットでトレーニングし、幾何平均ナイーブベイズ（ＧＭＮＢ）を、特定のがんを予測するための分類器として用いた。ＧＭＮＢは、尤度積（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）に幾何平均を適用することによる一般化されたナイーブベイズ分類器であり、これにより、高次元性を有する標準的なナイーブベイズ分類器に一般的に関連するアンダーフロー問題が排除される。遺伝子選択およびがん分類のプロセスを反復的に適用して、最適な分類システムおよび目的の特定のがんに関連する遺伝子のサブセットを得た。
【0070】
任意のがんの存在の予測：上記の機械学習アプローチを用いて測定された発現レベルを使用して、上記の１６０人の患者の分析は、図９に示すように、表１の１４５０個の遺伝子を使用して０．７８６の曲線下面積（ＡＵＣ）でがんを有する患者を実際に区別できることを示した。この予測は、このシステムに突然変異プロファイリングを追加することによって改善されると予想される。
【0071】
特定のがんの存在の予測：ｃｆＲＮＡ発現プロファイリングを開発された機械学習モデルと併せると、特定のがんを予測することができる。例えば、本発明者は、図１０に示されるように、６５０個の遺伝子を使用して０．８４８のＡＵＣでリンパ系新生物（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病）を有する患者を区別した。同様に、本発明者は、図１１に示されるように、１４５０個の遺伝子を使用して０．８１２のＡＵＣで骨髄性がん（急性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性新生物など）を有する患者を区別した。同様に、本発明者は、図１２に示されるよう、９５０個の遺伝子を使用して０．７９９のＡＵＣで固形腫瘍（乳房、肺、卵巣など）を有する患者を区別した。
【0072】
容易に理解されるように、突然変異プロファイルがｃｆＲＮＡ発現プロファイルに追加される場合、これらの分析のすべてを改善することができる。さらに、予測はまた、特定のがんの存在の予測に使用される変数に、任意のゲノムＣＮＶ（コピー数変異）を包含するＴＰＭによって測定されるｃｆＴＮＡのレベルを加えることによって改善することができる。例えば、固形腫瘍予測ＡＵＣは、図１３から分かるように、ｃｆＴＮＡがアルゴリズムに追加された場合、０．７９９から０．８７４に有意に改善された。同じように、骨髄がん予測は、図１４に示されるように、改善されたＡＵＣ（０．８１２から０．８５４）から明らかなように、ｃｆＴＮＡデータを追加することによって有意に改善された。したがって、ｃｆＲＮＡおよびｃｆＤＮＡの使用は臨床分析を有意に改善し、ひいては個体における治療および予防を改善することをもう一度認識すべきである。
【0073】
またさらなる例では、本発明者はまた、細胞遺伝学的変化の検出においてｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡを使用した。典型的には、細胞遺伝学的異常は、染色体転座または構造的な増加および／または消失である。企図されるシステムおよび方法を使用して、ｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡの両方の分析は、完全な細胞遺伝学的分析を可能にする。
【0074】
例えば、染色体転座は、染色体転座から生じるＲＮＡ融合から検出することができ、本発明者は、ＲＮＡ融合産物がこれらの染色体転座の検出において有意により信頼性が高いことを発見した。さらに、ＲＮＡシーケンシングを使用すると、パートナー遺伝子に関係なく転座を検出することができる。本発明者は、ｃｆＲＮＡシーケンシングによって、様々な融合ｍＲＮＡを検出することができた。例えば、本発明者は、図１５に見られるように、急性リンパ芽球性白血病を有する小児患者におけるｔ（１２；２１）（ｐ１３；ｑ２２）ＲＵＮＸ１－ＥＴＶ６を検出することができる。別の例において、図１６から得ることができるように、ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）ＲＵＮＸ１－ＲＵＮＸ１Ｔ１が、急性骨髄性白血病を有する患者において検出された。
【0075】
さらに、企図されるシステムおよび方法はまた、様々な染色体構造異常の検出を可能にする。例えば、ｃｆＴＮＡシーケンシングを使用することにより、ＣＮＶｋｉｔアプローチなどの標準的なアプローチを使用して染色体構造異常の分析が可能になる。図１７および図１８は、急性リンパ芽球性白血病を有する小児患者におけるｃｆＴＮＡデータを示し、ｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡ分析により、染色体転座および／または構造的な増加もしくは消失のための完全な細胞遺伝学的分析を行うことができることが確認される。
【0076】
最後に、本発明者はまた、ｃｆＲＮＡおよび／またはｃｆＴＮＡの発現プロファイルを使用することが、微小残存疾患の検出のために使用され得ることを発見した。より具体的には、ｃｆＲＮＡまたはｃｆＴＮＡの発現プロファイルを機械学習アプローチと併せて使用することにより、末梢血循環において突然変異を示す活動性がんを有する患者の予測が可能になった。ｃｆＲＮＡを使用して、本発明者は、図１９に示されるように、循環中の突然変異の存在を０．７１８のＡＵＣで予測することができ、一方ｃｆＴＮＡを使用して、本発明者は、図２０に示されるように、循環中の突然変異の存在を０．７３５のＡＵＣで予測することができた。
【0077】
したがって、上記を考慮して、試料中のＲＮＡおよびＤＮＡ（特にｃｆＴＮＡ／ｃｆＲＮＡ）の両方を定量し、生物学的事象（診断、治療に対する応答、予後．．．）を予測するためのバイオマーカーを開発するために両方を使用することは、分子医学にとっても新規かつ高感度である。実際、ＲＮＡと同じ様式でＤＮＡを定量することの１つの重要な利点は、ゲノムの増加および消失を評価することである。これをＲＮＡ情報に加えると、新しいバイオマーカーの発見が大幅に改善される。さらに、本明細書に提示されるシステムおよび方法はＲＮＡを保持し、ハイブリッド捕捉を使用して試料中のＤＮＡからｃＤＮＡ／ＲＮＡおよびエクソンを引き出すことを理解されたい。
【0078】
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明および特許請求するために使用される成分の量、濃度などの特性、反応条件などを表す数は、場合によっては「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、明細書および添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に入る各別個の値を個別に参照する簡略方法として役立つことを意図している。本明細書に別段の指示がない限り、各個々の値は、本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。
【0079】
本明細書で使用される場合、医薬組成物または薬物を「投与する」という用語は、医薬組成物または薬物の直接および間接投与の両方を指し、医薬組成物または薬物の直接投与は、典型的には医療専門家（例えば、医師、看護師など）によって行われ、間接投与は、直接投与（例えば、注射、注入、経口送達、局所送達などを介して）のために医薬組成物または薬物を医療専門家に提供または利用可能にする工程を含む。状態、疾患の発症についての感受性、または意図される治療に対する応答を「予後判定する」または「予測する」という用語は、対象における状態の進行速度、改善、および／または持続期間を含む、状態、感受性および／または応答を予測する行為または予測（しかし、その治療または診断ではない）を包含することを意味することにさらに留意すべきである。
【0080】
本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書の特定の実施形態に関して提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく明らかにすることを意図しており、特許請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な、特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【0081】
コンピュータを対象とする任意の言語は、サーバ、インターフェース、システム、データベース、エージェント、ピア、エンジン、モジュール、コントローラ、または個別にまたは集合的に動作する他の種類のコンピューティングデバイスを含むコンピューティングデバイスの任意の適切な組み合わせを含むように読まれるべきであることに留意されたい。コンピューティングデバイスは、有形の非一時的コンピュータ可読記憶媒体（例えば、ハードドライブ、ソリッドステートドライブ、ＲＡＭ、フラッシュ、ＲＯＭなどである）に記憶されたソフトウェア命令を実行するように構成されたプロセッサを備えることを理解されたい。ソフトウェア命令は、好ましくは、開示された装置に関して以下に説明するような役割、責任、または他の機能を提供するようにコンピューティングデバイスを構成する。特に好ましい実施形態では、様々なサーバ、システム、データベース、またはインターフェースは、場合によりＨＴＴＰ、ＨＴＴＰＳ、ＡＥＳ、公開秘密鍵交換、ウェブサービスＡＰＩ、または他の電子情報交換方法に基づく標準化されたプロトコルまたはアルゴリズムを使用してデータを交換する。データ交換は、好ましくは、パケット交換ネットワーク、インターネット、ＬＡＮ、ＷＡＮ、ＶＰＮ、または他のタイプのパケット交換ネットワークを介して行われる。
【0082】
本明細書の説明および以下の特許請求の範囲を通して使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、複数の言及を含む。また、本明細書の説明で使用される場合、「ｉｎ」の意味は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、「ｉｎ」および「ｏｎ」を含む。また、本明細書で使用される場合、文脈がそうでないことを指示しない限り、「～に結合される」という用語は、直接結合（互いに結合された２つの要素が互いに接触する）および間接結合（少なくとも１つの追加の要素が２つの要素の間に配置される）の両方を含むことを意図している。したがって、「～に結合される」および「～と結合される」という用語は同義的に使用される。
【0083】
既に説明されたもの以外のより多くの修正が、本明細書の本発明の概念から逸脱することなく可能であることは当業者には明らかである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の範囲を除いて制限されるべきではない。さらに、明細書および特許請求の範囲の両方を解釈する際に、すべての用語は、文脈と一致する可能な限り最も広い方法で解釈されるべきである。特に、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「備えている（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、要素、構成要素、または工程を非排他的な方法で言及するものとして解釈されるべきであり、参照される要素、構成要素、または工程が存在するか、または利用されるか、または明示的に参照されていない他の要素、構成要素、またはステップと組み合わされ得ることを示す。明細書の特許請求の範囲がＡ、Ｂ、Ｃ．．．．およびＮからなる群から選択されるもののうちの少なくとも１つを指す場合、テキストは、ＡプラスＮまたはＢプラスＮなどではなく、群からの１つの要素のみを必要とすると解釈されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-14
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
無細胞液から核酸を操作する方法であって、生体液から無細胞全核酸（ｃｆＴＮＡ）を得る工程；
前記ｃｆＴＮＡの第１の部分をＤＮＡｓｅ消化に供して、前記ｃｆＴＮＡのｃｆＲＮＡ画分を生成する工程；
前記ｃｆＴＮＡの前記ｃｆＲＮＡ画分と前記ｃｆＴＮＡの第２の部分との両方を逆転写、アダプターライゲーション、および増幅に供して、それによって、第１および第２それぞれのｃＤＮＡライブラリを作製する工程；
前記第１および第２のｃＤＮＡライブラリの各々を、複数の標的ｃＤＮＡを濃縮する標的濃縮に供して、それによって、第１および第２それぞれの標的濃縮ｃＤＮＡライブラリを作製する工程；
を含む方法。
【請求項2】
前記ｃｆＴＮＡが、１７～２００塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片および５０～３００塩基の間のサイズを有するｃｆＤＮＡ断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ｃｆＴＮＡが、３０～２５０塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片および７５～４００塩基の間のサイズを有するｃｆＤＮＡ断片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ｃｆＲＮＡ断片および前記ｃｆＤＮＡ断片が、すべてのｃｆＴＮＡの少なくとも３０％を一緒に構成する、請求項２または請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ｃｆＲＮＡ断片および前記ｃｆＤＮＡ断片が、すべてのｃｆＴＮＡの少なくとも４０％を一緒に構成する、請求項２または請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ｃｆＴＮＡ中の突然変異を、増強された感度で検出する方法であって、生体液の試料からｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡを得る工程；
前記ｃｆＲＮＡおよびｃｆＴＮＡから第１および第２それぞれのｃＤＮＡライブラリを作製する工程；前記第１および第２のｃＤＮＡライブラリの各々を、複数の標的ｃＤＮＡを濃縮する標的濃縮に供し、それによって第１および第２それぞれの標的濃縮ｃＤＮＡライブラリを作製する工程；ならびに
前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし、前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリからのシーケンシング結果を使用して、それによって、同じ試料からのシーケンシングｃｆＲＮＡまたはｃｆＤＮＡ単独と比較して増強された感度で突然変異を検出する工程；
を含む方法。
【請求項7】
前記生体液から前記ｃｆＴＮＡを得る前記工程が、ｃｆＲＮＡおよびｃｆＤＮＡの同時単離を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記ｃｆＴＮＡが、１７～２００塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片および５０～３００塩基の間のサイズを有するｃｆＤＮＡ断片を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記ｃｆＴＮＡが、３０～２５０塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片および７５～４００塩基の間のサイズを有するｃｆＤＮＡ断片を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項10】
前記ｃｆＲＮＡ断片および前記ｃｆＤＮＡ断片が、すべてのｃｆＴＮＡの少なくとも３０％を一緒に構成する、請求項８または請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ｃｆＲＮＡ断片および前記ｃｆＤＮＡ断片が、すべてのｃｆＴＮＡの少なくとも４０％を一緒に構成する、請求項８または請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
配列分析用試薬キットであって、生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ枯渇ｃｆＲＮＡ画分を含む第１の試薬；および
同じ生体液のｃｆＴＮＡを含む第２の試薬；
を含む試薬キット。
【請求項13】
前記生体液がヒトの血漿または血清である、請求項１２に記載の試薬キット。
【請求項14】
前記第１の試薬が、主に１７～２００塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片および主に５０～３００塩基の間のサイズを有するｃｆＤＮＡ断片を含む、請求項１２～１３のいずれか一項に記載の試薬キット。
【請求項15】
前記第２の試薬が、主に１７～２００塩基の間のサイズを有するｃｆＲＮＡ断片を含む、請求項１４に記載の試薬キット。
【請求項16】
前記ｃｆＲＮＡ断片および前記ｃｆＤＮＡ断片が、すべてのｃｆＴＮＡの少なくとも３０％を一緒に構成する、請求項１２～１３のいずれか一項に記載の試薬キット。
【請求項17】
前記第１の試薬が、前記第２の試薬から調製される、請求項１２～１３のいずれか一項に記載の試薬キット。
【請求項18】
配列分析用試薬キットであって、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリを含み；前記第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含まず；ならびに
前記第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが同じ生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含む、
試薬キット。
【請求項19】
前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが、同じ標的ｃＤＮＡを使用して標的濃縮される、請求項１８に記載の試薬キット。
【請求項20】
前記標的ｃＤＮＡが、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子または受容体関連遺伝子をコードする、請求項１８または１９に記載の試薬キット。
【請求項21】
配列分析用試薬キットであって、５０塩基以下のサイズを有するＲＮＡの結合を可能にし、１００塩基以下のサイズを有するＤＮＡの結合を可能にする表面およびサイズを有する複数のナノ粒子；および
標的遺伝子に対する配列相補性を有する複数の標的濃縮オリゴヌクレオチドを含み、
前記標的濃縮オリゴヌクレオチドの少なくとも一部が、同じ標的遺伝子の異なる部分にハイブリダイズする、
試薬キット。
【請求項22】
前記複数のナノ粒子が、３０塩基以下のサイズを有するＲＮＡの結合を可能にし、８０塩基以下のサイズを有するＤＮＡの結合を可能にする表面およびサイズを有する、請求項２１に記載の試薬キット。
【請求項23】
前記複数のナノ粒子が、２０塩基以下のサイズを有するＲＮＡの結合を可能にし、６０塩基以下のサイズを有するＤＮＡの結合を可能にする表面およびサイズを有する、請求項２１に記載の試薬キット。
【請求項24】
前記複数のナノ粒子が常磁性ナノ粒子である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の試薬キット。
【請求項25】
対象の核酸データを分析する方法であって、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし、それによって第１および第２それぞれの配列データセットを得る工程（前記第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは前記対象の生体液のｃｆＴＮＡから調製され、ｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含まず、
前記第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは同じ生体液のｃｆＴＮＡから調製され、ｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含む）；
前記第１および第２の配列データセット中の各遺伝子について１つ以上の突然変異を同定する工程、ならびに少なくとも前記第１の配列データセットにおける発現を定量する工程、を含む方法。
【請求項26】
前記シーケンシングの工程がペアエンドシーケンシングであり、ならびに／または第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが、前記第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリ単独の突然変異の検出と比較して、突然変異の検出の感度が増強される、請求項２５記載の方法。
【請求項27】
前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子または受容体関連遺伝子をコードする標的ｃＤＮＡが濃縮されており、任意選択的に、前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが、臨床経過、治療に対する応答または疾患の再発の診断または決定のために、特定の前記疾患に特異的な標的ｃＤＮＡが濃縮されている、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
対象のがんを分類する方法であって、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし、それによって第１および第２それぞれの配列データセットを得る工程（前記第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは前記対象の生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含まず、
前記第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは同じ生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含む）；
前記第１および第２の配列データセット中の各遺伝子について１つ以上の突然変異を同定する工程、および各遺伝子について少なくとも前記第１の配列データセットにおける発現レベルを定量する工程；ならびに
前記同定された突然変異および定量された発現レベルをモデルに使用して、それによって前記対象の前記がんを同定する工程、
を含む方法。
【請求項29】
前記シーケンシングの工程がペアエンドシーケンシングである、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子または受容体関連遺伝子をコードする標的ｃＤＮＡについて濃縮されている、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項31】
同定された突然変異および定量された発現レベルに基づいて治療を投与する方法において使用するための、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリであって、前記方法が、
前記第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび前記第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし、それによって第１および第２それぞれの配列データセットを得る工程（前記第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは前記対象の生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含まず；
前記第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは同じ生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含む）；
前記第１および第２の配列データセット中の各遺伝子について１つ以上の突然変異を同定する工程、および各遺伝子について少なくとも前記第１の配列データセットにおける発現レベルを定量する工程；ならびに
前記同定された突然変異および定量された発現レベルに基づいて治療を投与する工程、
を含む、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリ。
【請求項32】
前記シーケンシングの工程がペアエンドシーケンシングである、請求項３１に記載の第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリ。
【請求項33】
前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子または受容体関連遺伝子をコードする標的ｃＤＮＡについて濃縮されている、請求項３１または３２に記載の第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリ。
【請求項34】
生体液から得られたｃＤＮＡの配列分析用試薬キットであって、それぞれのｃＤＮＡにハイブリダイズする４０～７０ヌクレオチドの間の長さを有する複数の標的濃縮プローブを含み、
前記複数の標的濃縮プローブが、ヌクレオチドあたり２～５９プローブの間のタイリング密度および１～６０ヌクレオチドの間のステップ長を有するタイリング様式で前記それぞれのｃＤＮＡに結合し；
前記それぞれのｃＤＮＡが、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子、および／または受容体関連遺伝子をコードする、
試薬キット。
【請求項35】
前記標的濃縮プローブのそれぞれが、固相捕捉のための配列部分、固相捕捉のための化学修飾、または磁気ビーズをさらに含む、請求項３４に記載のキット。
【請求項36】
前記標的ｃＤＮＡが、前記生体液のｃｆＴＮＡおよびｃｆＲＮＡから調製される、請求項３４に記載のキット。
【請求項37】
対象のための治療を予測する方法であって、第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリおよび第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリをシーケンシングし、それによって第１および第２それぞれの配列データセットを得る工程（前記第１の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは前記対象の生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含まず；
前記第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリは同じ生体液のｃｆＴＮＡのｃｆＤＮＡ画分を含む）；
前記第１および第２の配列データセット中の各遺伝子について１つ以上の突然変異を同定する工程、および各遺伝子について少なくとも前記第１の配列データセットにおける発現レベルを定量する工程；ならびに
前記同定された突然変異および定量された発現レベルに基づいて前記治療を予測する工程、を含む方法。
【請求項38】
前記シーケンシングの工程がペアエンドシーケンシングである、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記第１および第２の標的濃縮ｃＤＮＡライブラリが、がん関連遺伝子、細胞シグナル伝達関連遺伝子、免疫表現型関連遺伝子または受容体関連遺伝子をコードする標的ｃＤＮＡについて濃縮されている、請求項３７または３８に記載の方法。【国際調査報告】