特表 2024-534521 フロースルーオリゴヌクレオチド合成のプロセス及びシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-20

(54)【発明の名称】フロースルーオリゴヌクレオチド合成のプロセス及びシステム

(51)【国際特許分類】

   C07H 21/02 20060101AFI20240912BHJP

   C07H 1/00 20060101ALI20240912BHJP

   C07H 21/04 20060101ALI20240912BHJP

   C12M 1/00 20060101ALN20240912BHJP

【ＦＩ】

C07H21/02

C07H1/00

C07H21/04 Z

C07H21/04 A

C12M1/00 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024517489

(86)(22)【出願日】2022-09-15

(85)【翻訳文提出日】2024-05-10

(86)【国際出願番号】 SE2022050812

(87)【国際公開番号】W WO2023043359

(87)【国際公開日】2023-03-23

(31)【優先権主張番号】2151135-7

(32)【優先日】2021-09-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522368031

【氏名又は名称】ペプティシステムズ エービー

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】ホルムバーグ，ラース－オーケ

(72)【発明者】

【氏名】テデバーク，ウルフ

(72)【発明者】

【氏名】シラード，ランナー

【テーマコード（参考）】

4B029

4C057

【Ｆターム（参考）】

4B029AA27

4B029BB20

4C057AA30

4C057BB02

4C057DD03

4C057MM01

4C057MM02

4C057MM04

4C057MM08

(57)【要約】

本発明は、フロースルー固相オリゴヌクレオチド合成のためのプロセス及びシステムに関する。本プロセスは、脱トリチル化、カップリング、酸化、及びキャッピングのステップを含む。本プロセスは、脱トリチル化ステップの後に行われる合成樹脂を再圧密化する少なくとも１つのステップを含む。合成樹脂を再圧密化するステップは、最初の流動化ステップと、それに続く再充填ステップを含む。流動化ステップでは溶媒はカラムの底部から頂部へ流れ、再充填ステップでは溶媒はカラムの頂部から底部へ流れる。
【選択図】図１Ａ、図１Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

化学結合を介して合成樹脂に結合された第１のヒドロキシル保護配列単位がカラム内に提供される、固相オリゴヌクレオチド合成のためのフロースループロセスであって、サイクルとして少なくとも１回繰り返される以下のステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）：
ｉ． 脱トリチル化により、合成樹脂に結合した第１の配列単位の前記ヒドロキシル基を脱保護するステップ：
ｉｉ． 少なくとも１つの第２の配列単位を含む液体反応溶液を提供するステップ；
ｉｉｉ． 少なくとも１つの第１の配列単位が結合した前記合成樹脂上に反応溶液を通過させ、それによって少なくとも１つの第２の配列単位が前記樹脂に結合した前記第１の配列単位に結合し、前記反応溶液が、ステップ（ｉ）で提供されるカラムにおいて、前記樹脂をより密な状態に圧密化するステップ、
を含み、
そのプロセス内で、合成樹脂に結合した前記第１の配列単位から保護基を除去する前記ステップが酸性溶液中で行われ、
前記プロセスは、前記樹脂を再圧密化する少なくとも１つのステップを含む、
前記プロセス。

【請求項2】

前記第１の配列単位及び前記第２の配列単位がヌクレオチドまたはヌクレオシドに基づく、請求項１に記載のプロセス。

【請求項3】

前記合成樹脂を再圧密化するステップがカップリングステップの前に行われる、請求項１または２に記載のプロセス。

【請求項4】

前記再圧密化のステップが、前記樹脂を流動化することを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項5】

脱トリチル化ステップで使用される前記酸性溶液のｐＫａが０．２～３である、先行請求項のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項6】

前記配列単位が、別個に画定された混合チャンバ内で活性化される、先行請求項のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項7】

前記第２の配列単位が、前記システムの前記チューブ内で活性化される、先行請求項のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項8】

前記反応溶液が、前記反応溶液中の少なくとも１つの第２配列単位が前記固定化された配列単位（複数可）のうちの少なくとも９９％と接触することを可能にする流速及び体積で前記樹脂上を通過する、先行請求項のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項9】

前記合成樹脂上を通過する前に、前記液体反応溶液中に含まれる少なくとも１つの第２の配列単位に加熱が適用される、先行請求項のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項10】

前記少なくとも１つの第２の配列単位が、前記合成樹脂上を通過する前に少なくとも１℃加熱される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記プロセスの少なくとも１つのステップの進行が、少なくとも２つの検出器によってモニターされる、先行請求項のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項12】

前記プロセスの進行が連続的にモニターされる、先行請求項のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項13】

前記プロセスの進行が、分光法、好ましくは近赤外（ＮＩＲ）分光法によってモニターされる、請求項１１または１２に記載のプロセス。

【請求項14】

前記プロセスが直線的に拡張可能である、先行請求項のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項15】

前記プロセスが、重要品質特性（ＣＱＡ）に影響を及ぼす重要工程パラメータ（ＣＰＰ）を測定するためにプロセス解析工学（ＰＡＴ）の使用を可能にするソフトウェア制御のリアルタイム条件付きモニタリングを使用する、先行請求項のいずれか１項に記載のプロセス。

【請求項16】

フロースルー固相オリゴヌクレオチド合成のためのシステム（１００）であって、前記システム（１００）が、合成樹脂で充填されるように配置された少なくとも１つのカラム（１０１）と；少なくとも第１のポンプ（１０２ａ）と；モノマー及び試薬のための少なくとも第１のリザーバ（１０４ａ）と；少なくとも１つの検出器（１０６）と、少なくとも１つのプロセッサ（１１４）と、を含み、チューブ（１０８）が前記第１のリザーバ（１０４ａ）を前記カラム（１０１）に接続し、前記第１のポンプ（１０２ａ）及びバルブ（１０９ａ～ｄ）が、前記システム（１００）内の流れを導くように配置され、前記プロセッサ（１１４）が、少なくとも前記第１のポンプ（１０２ａ）、前記バルブ（１０９ａ～ｄ）、及び前記検出器（１１４）と通信接続し、前記システム（１００）が、溶媒が前記カラムの底部（１０１’）から頂部（１０１’’）に前記カラム（１０１）を通過するように、溶媒の流れを前記第１のリザーバ（１０４ａ）から前記カラムの底部（１０１’）に導くように配置された流動化流路（２００）を提供するように配置され、前記システム（１００）が、溶媒が前記カラムの頂部（１０１’’）から底部（１０１’）に前記カラム（１０１）を通過するように、溶媒の流れを前記第１のリザーバ（１０４ａ）から前記カラムの頂部（１０１’’）に導くように配置された再充填経路（２１０）を提供するように配置され、前記システム（１００）が、１回の合成サイクルにおいて、最初に前記流動化流路（２００）に溶媒を流し、続いて前記再充填流路（２１０）に溶媒を流すように配置される、前記システム（１００）。

【請求項17】

溶媒が前記カラムの底部（１０１’）から前記頂部（１０１’’）に通過するとき、前記第３のバルブ（１０９ｃ）が廃液出口を提供するように配置され、溶媒が前記カラムの頂部（１０１’’）から前記底部（１０１’）に通過するとき、前記第４のバルブ（１０９ｄ）が廃液出口を提供するように配置される、請求項１６に記載のシステム（１００）。

【請求項18】

前記流動化流路（２００）及び前記再充填流路（２１０）が前記チューブ（１０８）によって実現される、請求項１６または１７に記載のシステム（１００）。

【請求項19】

前記システム（１００）が、再循環流路（２２０）を提供するようにさらに配置され、前記再循環流路（２２０）は、前記カラム（１０１）上を溶媒、試薬などを再循環させるように配置される、請求項１６～１８のいずれか１項に記載のシステム（１００）。

【請求項20】

前記システム（１００）が、前記カラム（１０１）の上流及び前記少なくとも第１のリザーバ（１０４ａ）の下流に配置された温度調節装置（１０３）と、前記カラム（１０１）の上流及び前記温度調節装置（１０３）の下流に配置された第１の温度センサー（１０５ａ）と、前記カラム（１０１）の下流に配置された第２の温度センサー（１０５ｂ）と、を含む、請求項１６～１９のいずれか１項に記載のシステム（１００）。

【請求項21】

前記システム（１００）が、前記少なくとも第１のリザーバ（１０４ａ）と流体連通して配置された別個に画定された混合チャンバ（１１３）と、前記別個に画定された混合チャンバ（１１３）の上流に配置される気泡検出器（１０７）とをさらに備える、請求項１６～２０のいずれか１項に記載のシステム（１００）。

【請求項22】

フロースルー固相オリゴヌクレオチド合成のためのシステム（１００）を使用してフロースルー固相オリゴヌクレオチド合成を行うための方法（３００）であって、前記システム（１００）が、合成樹脂で充填されるように配置された少なくとも１つのカラム（１０１）と；少なくとも第１のポンプ（１０２ａ）と；モノマー及び試薬のための少なくとも第１のリザーバ（１０４ａ）と；少なくとも１つの検出器（１０６）と、少なくとも１つのプロセッサ（１１４）とを含み、チューブ（１０８）が前記第１のリザーバ（１０４ａ）を前記カラム（１０１）に接続し、前記第１のポンプ（１０２ａ）及びバルブ（１０９ａ～ｄ）が、前記システム（１００）内の流れを導くように配置され、前記プロセッサ（１１４）が、少なくとも前記第１のポンプ（１０２ａ）、前記バルブ（１０９ａ～ｄ）、及び前記検出器（１０６）と通信接続し、合成樹脂が前記カラム（１０１）内に配置され、第１の配列単位が化学結合を介して前記合成樹脂に結合され、前記方法（３００）が、前記システム（１００）が、流動化ステップ（３０３’）において前記流動化流路（２００）を介して前記カラムの底部（１０１’）から前記頂部（１０１’’）に溶媒を流すことによって、前記カラム（１０１）内に配置された前記合成樹脂を最初に流動化するように構成され、前記流動化ステップ（３０３’）に続いて、前記システム（１００）が前記再充填流路（２１０）を用いて前記カラムの頂部（１０１’’）から前記底部（１０１’）に溶媒を流して、前記カラム（１０１）内に配置された前記合成樹脂を再充填する再充填ステップ（３０３’’）が行われる、少なくとも１つの再圧密化ステップ（３０３）を含む、前記方法（３００）。

【請求項23】

前記方法（３００）が、以下のステップを含む、請求項２２に記載の方法（３００）：
脱トリチル化ステップ（３０１）：前記システム１００が、少なくとも第１のバルブ（１０９ａ）、第２のバルブ（１０９ｂ）、及び第３のバルブ（１０９ｃ）を開くことによって、脱トリチル化剤を含む酸性溶液を前記チューブ（１０８）を通して前記第１のリザーバ（１０４ａ）から前記カラム（１０１）に流すように配置される；
第１の洗浄ステップ（３０２）：前記システム（１００）が、少なくとも前記第１のバルブ（１０９ａ）、前記第２のバルブ（１０９ｂ）、及び前記第３のバルブ（１０９ｃ）を開くことによって、溶媒を前記チューブ（１０８）を通して前記第１のリザーバ（１０４ａ）から前記カラム（１０１）に流すように配置される；
第１の再圧密化ステップ（３０３）：前記システム（１００）が、流動化ステップ（３０３’）において前記流動化流路（２００）を介して前記カラムの底部（１０１’）から前記頂部（１０１’’）に溶媒を流すことによって、前記カラム（１０１）内に配置された前記合成樹脂を最初に流動化するように構成され、前記流動化ステップ（３０３’）に続いて、前記システム（１００）が前記再充填流路（２１０）を用いて前記カラムの頂部（１０１’’）から前記底部（１０１’）に溶媒を流して、前記カラム（１０１）内に配置された前記合成樹脂を再充填する再充填ステップ（３０３’’）を行う；
反応ステップ（３２０）：前記システム（１００）が、少なくとも前記第１のバルブ（１０９ａ）、前記第２のバルブ（１０９ｂ）、及び前記第３のバルブ（１０９ｃ）を開くことによって、少なくとも１つの配列単位を前記チューブ（１０８）を通して前記第１のリザーバ（１０４ａ）から前記カラム（１０１）に流すように配置され、その後、第２の洗浄ステップ（３０５）があり、前記システム（１００）が、少なくとも前記第１のバルブ（１０９ａ）、前記第２のバルブ（１０９ｂ）、及び前記第３のバルブ（１０９ｃ）を開くことによって、溶媒を前記チューブ（１０８）を通して前記第１のリザーバ（１０４ａ）から前記カラム（１０１）に流すように配置され；
酸化／チオール化ステップ（３３０）：前記システム（１００）が、少なくとも前記第１のバルブ（１０９ａ）、前記第２のバルブ（１０９ｂ）、及び前記第３のバルブ（１０９ｃ）を開くことによって、酸化剤またはチオール化剤を前記チューブ（１０８）を通して前記第１のリザーバ（１０４ａ）から前記カラム（１０１）に流すように配置され、その後、第３の洗浄ステップ（３０７）があり、前記システム（１００）が、少なくとも前記第１のバルブ（１０９ａ）、前記第２のバルブ（１０９ｂ）、及び前記第３のバルブ（１０９ｃ）を開くことによって、溶媒を前記チューブ（１０８）を通して前記第１のリザーバ（１０４ａ）から前記カラム（１０１）に流すように配置され；
キャッピングステップ（３０９）：前記システム（１００）が、少なくとも前記第１のバルブ（１０９ａ）、前記第２のバルブ（１０９ｂ）、及び前記第３のバルブ（１０９ｃ）を開くことによって、キャッピング剤を前記チューブ（１０８）を通して前記第１のリザーバ（１０４ａ）から前記カラム（１０１）に流すように配置され、その後、第４の洗浄ステップ（３０７）があり、前記システム（１００）が、少なくとも前記第１のバルブ（１０９ａ）、前記第２のバルブ（１０９ｂ）、及び前記第３のバルブ（１０９ｃ）を開くことによって、溶媒を前記チューブ（１０８）を通して前記第１のリザーバ（１０４ａ）から前記カラム（１０１）に流すように配置される。

【請求項24】

前記方法（３００）に従って行われる合成の進行が、前記カラム（１０１）の下流に配置された少なくとも１つの検出器（１０６）によってモニターされる、請求項２２または２３に記載の方法（３００）。

【請求項25】

前記流動化ステップ（３０３’）中の流速が２５～７５ｃｍ／ｈであり、前記流動化ステップ（３０３’）が０．２５～１カラム体積の間継続され、前記再充填ステップ（３０３’’）中の流速が１００～２００ｃｍ／ｈであり、前記再充填ステップ（３０３’’）が０．２５～１カラム体積の間継続される、請求項２２～２４のいずれか１項に記載の方法（３００）。

【請求項26】

前記方法（３００）が、前記反応ステップ（３２０）の前に活性化のステップを含み、前記活性化のステップ中に、前記システム（１００）が前記少なくとも１つの配列単位に活性化剤を提供することによって、前記少なくとも１つの配列単位を活性化するように構成されている、請求項２２～２５のいずれか１項に記載の方法（３００）。

【請求項27】

前記システム（１００）が、前記活性化剤と前記少なくとも１つの配列単位を前記システム（１００）の前記チューブ（１０８）を通して同時に流すことによって、前記システム（１００）の前記チューブ（１０８）内の前記少なくとも１つの配列単位を活性化するように構成される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記少なくとも１つの配列単位が、別個に画定された混合チャンバ（１１３）内で活性化される、請求項２６に記載の方法（３００）。

【請求項29】

前記別個に画定された混合チャンバ（１１３）を出る前記活性化された少なくとも１つの配列単位が気泡検出器（１０７）によってモニターされる、請求項２８に記載の方法（３００）。

【請求項30】

前記方法（３００）が、前記反応ステップ（３２０）の前に追加のステップを含み、少なくとも１つの第２の配列単位を含む前記溶液が、前記カラム（１０１）に入る前に加熱され、前記加熱ステップは、前記システム（１００）が、前記カラム（１０１）の上流に配置された温度調節装置（１０３）を通して、前記少なくとも１つの第２の配列単位を含む前記溶液を通過させるように構成される、請求項２２～２９のいずれか１項に記載の方法（３００）。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、固相オリゴヌクレオチド合成のためのプロセス、方法、及びシステムに関する。

【背景技術】

【0002】

自然界のオリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。それらは、創薬、治療法、分子診断などでの使用により大きな関心を集めている。現在までに１０を超えるＦＤＡ承認のオリゴヌクレオチド薬物があり、それらのほとんどは２０１６年以降に承認されている。オリゴヌクレオチドは、溶液中で、または合成樹脂がカラムに提供されるフロースループロセスで合成することができる。保護されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、リンカーを介して樹脂に結合される。反応の第１のステップでは、保護されたヌクレオシドまたはヌクレオチドが脱保護剤によって脱保護される。溶媒に溶解した第２のヌクレオチドをカラムに加えて、第２のヌクレオチドを第１のヌクレオチドまたはヌクレオシドに結合させる。これらのステップを繰り返して、オリゴヌクレオチド鎖または配列を生成することができる。所望のオリゴヌクレオチド配列が合成された後、オリゴヌクレオチドは樹脂から分離される。

【0003】

合成樹脂は、樹脂の種類、成長するオリゴヌクレオチドの量に対する樹脂の量の比率、及びプロセスで使用される溶媒に応じて、プロセス中に収縮及び膨張する可能性がある。樹脂の膨張及び収縮は、オリゴヌクレオチド合成中に樹脂の相不均一性を増加させる可能性がある。相不均一性は、樹脂を通る非最適な流れをもたらす可能性がある。すなわち、例えば、前部がカラム壁に対して水平または垂直ではなく、したがって流れが樹脂全体で均一ではない可能性がある。これは、結果として、合成及び合成されたオリゴマーの品質に悪影響を及ぼす。

【0004】

ＵＳ５，６４１，４５９は、多数の異なる単量体のそれぞれ及び合成プロセスで使用される他の流体に接続するための個々のモジュラスを有するオリゴヌクレオチドを合成するための機械を開示している。

【0005】

ＵＳ６，４６９，１５７Ｂ１は、ポリヌクレオチド合成のために官能化された固定化固体支持体を含むカラムを含む反応器内の固体支持体上でポリヌクレオチドを調製するための装置を開示している。

【0006】

ＥＰ３６５０４５５Ａ１は、固相核酸合成方法における脱保護ステップにおいてトルエンの代替として使用できる新規溶媒、及び保護されたヌクレオシドホスホラミダイトからの保護基の除去をｐＫａ０．２～０．８の酸とアセトニトリルを含む溶液中で行う方法を開示している。

【0007】

先行技術では、先行技術の問題を克服する、オリゴヌクレオチド合成のための改善されたプロセス及びシステムが必要とされている。また、樹脂の相不均一性の悪影響を防止または最小限に抑えるオリゴヌクレオチド合成のプロセス及びシステムも必要とされている。

【発明の概要】

【0008】

本発明の目的は、先行技術のシステム及びプロセスの欠点を克服するオリゴヌクレオチド合成のためのプロセス及びシステムを提供することである。これは、請求項１に定義されたプロセス、請求項１６に定義されたシステム、及び請求項２２に定義された方法によって達成される。

【0009】

本発明の一態様によれば、化学結合を介して合成樹脂に結合した第１のヒドロキシル保護配列単位がカラムに提供される、固相オリゴヌクレオチド合成のためのフロースループロセスが存在する。本プロセスは、サイクルとして少なくとも１回繰り返される以下のステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）：
ｉ． 脱トリチル化により、合成樹脂に結合した第１の配列単位のヒドロキシル基を脱保護するステップ：
ｉｉ． 少なくとも１つの第２の配列単位を含む液体反応溶液を提供するステップ；
ｉｉｉ． 少なくとも１つの第１の配列単位が結合した合成樹脂上に反応溶液を通過させ、それによって少なくとも１つの第２の配列単位が樹脂に結合した第１の配列単位に結合し、反応溶液が、ステップ（ｉ）で提供されるカラムにおいて、樹脂をより密な状態に圧密化するステップ、
を含み、
そのプロセス内で、合成樹脂に結合した第１の配列単位から保護基を除去するステップが酸性溶液中で行われ、そのプロセスは、樹脂を再圧密化する少なくとも１つのステップを含む。

【0010】

本発明の一態様では、フロースルー固相オリゴヌクレオチド合成のためのシステムが存在する。本システムは、合成樹脂を充填するように配置された少なくとも１つのカラムと；少なくとも第１のポンプと；単量体及び試薬のための少なくとも第１のリザーバと；少なくとも１つの検出器と、少なくとも１つのプロセッサと、を含む。チューブは第１のリザーバをカラムに接続し、第１のポンプとバルブはシステム内の流れを導くように配置されている。プロセッサは、少なくとも第１のポンプ、バルブ、及び検出器と通信接続している。システムは、溶媒の流れを第１のリザーバからカラムの底部に導くように構成された流動化流路を提供するように配置され、溶媒がカラムの底部から頂部にカラムを通過するようにする。システムは、溶媒の流れを第１のリザーバからカラムの頂部に導くように構成された再充填流路を提供するように配置され、溶媒がカラムの頂部からカラムを通過するようにする。システムは、１回の合成サイクルにおいて、最初に流動化流路に溶媒を流し、続いて再充填流路に溶媒を流すように配置される。

【0011】

本発明の一態様では、フロースルー固相オリゴヌクレオチド合成のためのシステムを使用してフロースルー固相オリゴヌクレオチド合成を実施するための方法が存在する。本システムは、合成樹脂を充填するように配置された少なくとも１つのカラムと；少なくとも第１のポンプと；単量体及び試薬のための少なくとも第１のリザーバと；少なくとも１つの検出器と、少なくとも１つのプロセッサと、を含む。チューブは、第１のリザーバをカラムに接続する。第１のポンプとバルブは、システム内の流れを導くように配置されている。プロセッサは、少なくとも第１のポンプ、バルブ、及び検出器と通信接続している。合成樹脂がカラム内に配置され、第１の配列単位が化学結合を介して合成樹脂に結合される。本方法は、再圧密化の少なくとも１つのステップを含み、その間、システムは、流動化ステップにおいて流動化流路を介してカラムの底部から頂部に溶媒を流すことによって、カラム内に配置された合成樹脂を最初に流動化するように構成される。流動化ステップに続いて、システムが再充填流路を用いてカラムの頂部から底部に溶媒を流して、カラム内に配置された合成樹脂を再充填する再充填ステップを行う。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1A】本発明によるプロセスのフローチャートである。

【図1B】本発明によるプロセスのフローチャートである。

【図2A】本発明によるシステムの概略図である。

【図2B】本発明によるシステムの概略図である。

【図3】本発明によるシステムの概略図である。

【図4】本発明によるシステムの概略図である。

【図5】本発明によるブロック方式である。

【図6A】本発明による実施例からのＨＰＬＣクロマトグラムである。

【図6B】比較例からのＨＰＬＣクロマトグラムである。

【0013】

定義
本明細書で使用される用語は、別段の指定がない限り、当該技術分野における通常の意味を有する。

【0014】

「フロースルー」という用語は、試薬、及び／または溶媒、及び／または添加剤などを含む溶液がカラム上を／カラムを通って通過するプロセスを記述するために使用され、この用語には、シングルパス（すなわち、溶液（複数可）がカラム上を１回通過する）と再循環（すなわち、溶液（複数可）がシステムを通って再循環され、少なくとももう一回カラムを通過する）との両方が含まれる。

【0015】

「配列単位」という用語は、配列中の単位として使用される化合物を指す。配列単位は、情報を格納／運ぶことができる。配列単位の例としては、ヌクレオシド（複数可）、ヌクレオチド、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）、二環式／三環式ヌクレオシド、及びＬＮＡ、ｃＥｔ、ＥＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、ＦＮＡなどのヌクレオチド類似体が挙げられる。配列の例としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＭＯＥ、ＯＭｅ、Ｆなどの２’修飾の類似体が挙げられる。配列単位はまた、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの類似体と一緒の配列中の任意の非ヌクレオチド、非ヌクレオシドベースの化合物であってもよい。第１の配列単位もユニバーサルサポートの一部であり得る。

【0016】

「ヌクレオチド」という用語は、核酸サブユニットを指し、ヌクレオチドは、糖基、塩基、及びリン酸基、またはホスホロチオエートが最も一般的なものの１つである任意の他のリン酸類似体を含む。

【0017】

「ヌクレオシド」という用語は、糖及び塩基を含む化合物を指す。

【0018】

「塩基」という用語は、窒素含有塩基を指す。使用できるさまざまな塩基が多数存在する。ＤＮＡ及びＲＮＡに最も一般的な５つは、アデニン、シトシン、グアニン、及びチミン／ウラシル（Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ／Ｕと略される）である。他の例は、メチルウラシル（ＭｅＵ）及びメチルシトシン（ＭｅＣ）、または基本構造に結合または置換／含まれる任意の他の官能基（複数可）である。

【0019】

「核酸」という用語は、ＤＮＡとＲＮＡの両方、及びＤＮＡとＲＮＡの類似体を含む。類似体は、ＤＮＡやＲＮＡとは骨格の構造が異なる。

【0020】

「合成樹脂」という用語は、有機化合物またはカラム内で充填床を形成できる固相を含み、合成樹脂は、例えば、ポリスチレンまたはジビニルベンゼンに基づくポリマー材料だけでなく、任意の程度の架橋または細孔構造を有する他の固相または固相の組み合わせも含む。

【0021】

「試薬」という用語は、フロースルーシステムにおいて成長するヌクレオチド配列の生成に使用される任意の化合物、配列単位、試薬、溶媒を指す。

【0022】

本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±１０％、または±５％、または±１％の変動を包含すると理解されるべきである。

【0023】

「流動化」という用語は、合成樹脂の底面の約１％超がカラムの底部と接触しなくなったときを指す。この段階は、例えばカラムを底部または頂部からの流れを適用することによって得ることができる。

【0024】

本明細書を通して、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴマー」という用語は交換可能に使用され、直鎖状または分枝鎖状の配列単位の鎖または配列、すなわち配列、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡまたはその類似体などの核酸を指す。

【0025】

本明細書において、特に断りのない限り、「ヌクレオシド（複数可）」、「ヌクレオチド（複数可）」、「オリゴヌクレオチド（複数可）」、及び「ポリヌクレオチド（複数可）」などの「配列単位」は、適切な場合、活性化基及び／または保護基を有するものを指す。

【0026】

「脱トリチル化すること」または「脱トリチル化」という用語は、追加の配列単位の付加を可能にする保護基（複数可）の除去を指す。脱トリチル化には、ジメトキシトリチルまたはモノメトキシトリチルまたは任意の他の保護基を除去して、追加の配列単位の付加及びカップリングを可能にすることが含まれる。

【0027】

「直線的に拡張可能」という用語は、より小さなスケールまたはより大きなスケールの合成条件が、類似または同一の合成結果をもたらす代替サイズのスケールに移すことができる合成プロセスという意味を有する。

【0028】

「条件付き閾値」という用語は、前のステップ（複数可）を終了させ、次のステップを開始させるために、制御ソフトウェアに設定された少なくとも１つのパラメータの事前定義された値という意味で使用される。

【0029】

「ＡＣＮ」は、アセトニトリルの略語であり、当該技術分野ではその標準的な意味で使用される。

【0030】

「ＤＣＡ」及び「ＴＣＡ」は、それぞれジクロロ酢酸及びトリクロロ酢酸の略語であり、当該技術分野においてその標準的な意味で使用される。

【0031】

「ＰＡＴ」は、プロセス解析工学（Ｐｒｏｃｅｓｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の略語であり、当該技術分野においてその標準的な意味で使用される。

【0032】

「ＣＰＰ」は、重要工程パラメータ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）の略語であり、当該技術分野においてその標準的な意味で使用される。

【0033】

「ＣＱＡ」は、重要品質特性（Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｑｕａｌｉｔｙ Ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ）の略語であり、当該技術分野においてその標準的な意味で使用される。

【0034】

「ＮＩＲ」は近赤外線（Ｎｅａｒ Ｉｎｆｒａｒｅｄ）の略語であり、当該技術分野ではその標準的な意味で使用される。

【0035】

「ＵＶ／Ｖｉｓ」は、紫外／可視（Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ／Ｖｉｓｉｂｌｅ）の略語であり、当該技術分野ではその標準的な意味で使用される。

【発明を実施するための形態】

【0036】

「頂部」、「底部」、「上部」、「下部」などの用語は、図面に示される本発明の実施形態の幾何学的形状を参照するためにのみ使用され、いかなる形でも本発明を限定することを意図するものではない。

【0037】

オリゴヌクレオチドを合成するための方法及びプロセスとしては、ホスホラミダイト、ホスホトリエステル、及びＨ－ホスホネート法、ならびに他の同様の方法が挙げられ、これらはすべて当該技術分野で一般的に知られている。本明細書に記載のシステム及びプロセスは、ホスホラミダイト法に関連して記載されているが、プロセス及びシステムは他の合成方法を使用しても利用できることを理解されたい。

【0038】

背景技術で論じたように、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、成長するオリゴヌクレオチドがカラムに配置された樹脂上に固定化されるフロースループロセスで合成することができる。フロースルーシステムは、チューブを使用して互いに流体連通するカラム（複数可）、バルブ（複数可）、及びポンプ（複数可）をすべて含む。ポンプ（複数可）は、システムを介してカラム上に液体を圧送するように配置されている。合成を開始する前に、共有結合を介して直接的に、またはユニバーサル支持体とも呼ばれるリンカーユニットを介して、最初のヌクレオチドまたはヌクレオシドが結合している樹脂をカラムに充填する。リンカー単位は、切断後に樹脂に残る配列単位であってもよく、したがって、切断後の最終配列単位の一部ではない。

【0039】

本発明の第１の態様では、化学結合を介して合成樹脂に結合した第１のヒドロキシル保護配列単位がカラムに提供される、固相オリゴヌクレオチド合成のためのフロースループロセスが存在する。本プロセスは、サイクルとして少なくとも１回繰り返される以下のステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）：
ｉ． 脱トリチル化により、合成樹脂に結合した第１の配列単位のヒドロキシル基を脱保護するステップ：
ｉｉ． 少なくとも１つの第２の配列単位を含む液体反応溶液を提供するステップ；
ｉｉｉ． 少なくとも１つの第１の配列単位が結合した合成樹脂上に反応溶液を通過させ、それによって少なくとも１つの第２の配列単位が樹脂に結合した第１の配列単位に結合し、反応溶液が、ステップ（ｉ）で提供されるカラムにおいて、樹脂をより密な状態に圧密化するステップ、
を含む。

【0040】

第２の配列単位は、合成樹脂に結合した第１の配列単位に結合される。合成樹脂に結合した第１配列単位から保護基を除去するステップ、すなわち脱トリチル化ステップは、酸性溶液中で実施される。本プロセスは、合成樹脂を再圧密化する少なくとも１つのステップを含む。

【0041】

当業者が理解するように、循環プロセスの場合、「第１の配列単位」という用語は、最後に追加された配列単位を指す。

【0042】

「反応溶液」という用語は、成長する配列に必要な任意の試薬、複数の試薬、配列単位（複数可）、溶媒、添加剤などを包含する。

【0043】

合成樹脂を再圧密化するステップは、溶媒をカラムの底部から上方または向流方向に流すことによって合成樹脂を流動化させ、合成樹脂を再充填するステップを含む。樹脂を再充填するステップは、合成樹脂を流動化するステップの後に続く。合成樹脂の再充填ステップでは、溶媒をカラムの頂部から流下、すなわち流れ方向に流す。

【0044】

換言すると、本発明の第１の態様では、第１のヒドロキシル保護配列単位が化学結合を介して樹脂に結合される、固相オリゴヌクレオチド合成のためのフロースループロセスが存在する。本プロセスは、サイクルとして少なくとも１回繰り返される以下のステップ（ｉ）～（ｉｉｉ）：
ｉ． 脱トリチル化により、合成樹脂に結合した第１の配列単位のヒドロキシル基を脱保護するステップ：
ｉｉ． 少なくとも１つの第２の配列単位を含む液体反応溶液を提供するステップ；
ｉｉｉ． 少なくとも１つの第１の配列単位が結合した合成樹脂上に反応溶液を通過させ、それによって少なくとも１つの第２の配列単位が樹脂に結合した第１の配列単位に結合し、反応溶液が、ステップ（ｉ）で提供されるカラムにおいて、樹脂をより密な状態に圧密化するステップ、
を含む。

【0045】

第２の配列単位は、合成樹脂に結合した第１の配列単位に結合される。合成樹脂に結合した第１配列単位から保護基を除去するステップ、すなわち脱トリチル化ステップは、酸性溶液中で実施される。本プロセスは、溶媒をカラムの底部から上方または向流方向に流すことによって樹脂を流動化させ、その後樹脂を再充填する少なくとも１つのステップを含む。樹脂の再充填ステップでは、溶媒をカラムの頂部から流下、すなわち流れ方向に流す。

【0046】

本発明の一実施形態では、再圧密化のステップは、樹脂を流動化することを含む。

【0047】

本発明の一実施形態では、配列単位はヌクレオチド（複数可）またはヌクレオシド（複数可）である。

【0048】

第１の態様による方法は、オリゴヌクレオチド、オリゴマー、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ／ＲＮＡの類似体、または配列単位、例えば核酸の配列もしくは鎖を含む任意の他の巨大分子を合成するために使用され得る。本明細書に記載のすべての実施形態、態様、及び変形は、上記のすべてのタイプの巨大分子に関連し得る。

【0049】

オリゴヌクレオチド合成を開始する前に、合成樹脂がカラムに提供される。上記のように、第１の配列単位、または核酸、またはモノマーは、直接またはリンカーユニットを介して合成樹脂に結合される。合成樹脂は、異なる程度の細孔構造が発達した粒子状の外観を有し、典型的には、７０％以下、または５０％以下、または３０％以下、または１０％以下などの、ある程度の架橋を有するポリマーまたはポリマー材料である。合成樹脂は、当該技術分野で使用される任意のタイプの合成樹脂、例えば、ポリスチレン（ＰＳ）、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）、またはＰＳ－ＤＶＢなどの混合物であってよい。合成樹脂は、板状、粒子状、繊維状などの任意の形状または形態を有してもよい。一実施形態では、樹脂は架橋ポリスチレン、例えば、ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅまたはＰｒｉｍｅｒ Ｓｕｐｐｏｒｔ ５Ｇまたは同様のものである。合成樹脂は、オリゴヌクレオチドの合成またはプロセスなどのさまざまな溶媒と接触すると、膨張及び／または収縮し得る。カラム内に配置された合成樹脂の膨張及び収縮は、カラム内の不均一な樹脂領域の形成、または樹脂内の不均一性の形成をもたらす可能性がある。樹脂の不均一性は、他の方法でも発生する可能性がある。また、他のタイプの樹脂、例えばポリマーと別の材料の混合物は、オリゴヌクレオチド合成プロセスにおいて不均一性を経験する可能性がある。

【0050】

本発明による一般的なオリゴヌクレオチドプロセスまたは合成のフローチャートを図１ａに示す。第１のステップにおいて、第１の配列単位は、脱トリチル化３０１によって脱保護される。脱トリチル化ステップ３０１では、５’－ジメトキシトリチル保護基が第１の配列単位から除去される。その結果、水酸基がカップリングに利用できるようになる。第１の配列単位が２つ以上の配列単位である場合（すなわち、鎖または配列が樹脂に結合している場合）、例えば配列中の最後の配列単位のヒドロキシル基がカップリングに利用可能になる。場合によっては、ヒドロキシル、アミンなどのさらなる官能化の準備ができている官能基は、最後の配列単位以外の任意の位置で利用可能であり得、例えば、分岐オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド誘導体、他の配列、他の配列単位、他の高分子を可能にすることができる。

【0051】

脱トリチル化に続いて、第１の洗浄ステップ３０２があり、その間に溶媒がカラムを通過する。必要な洗浄量は、カラムの長さ及び直径、床高、拡散などの物理的パラメータに依存し、当業者によって決定され得る。必要な洗浄量は、当業者によって決定される条件付き閾値を満たすことによって決定することもできる。

【0052】

脱トリチル化ステップ３０１の後、カラム中の合成樹脂は、上記のように、収縮する及び／または不均一になる及び／または不均一性を含む可能性がある。したがって、第１の洗浄ステップ３０２に続いて、第１の再圧密化ステップ３０３がある。第１の再圧密化３０３ステップは、樹脂を流動化する第１のステップ３０３’とそれに続く樹脂を再充填するステップ３０３’’の２つのステップを含む。流動化ステップ３０３’では、例えばＡＣＮなどの溶媒を最初に向流または逆流方向で、すなわちカラムの底部から上に向かってカラムに通す。溶媒は、合成樹脂または樹脂床が流動化するまでカラムを向流方向に通過させる。したがって、カラム内に流動床が形成されるまでである。流動床が形成されると、再充填ステップ３０３’’が続く。再充填ステップ３０３’’では、溶媒は反対方向、すなわち流れの方向、またはカラムの頂部から底部にカラムを通過する。

【0053】

オリゴヌクレオチドのプロセスまたは合成は、図１ｂに示されるように、任意選択の再圧密化ステップ３０３’’’をさらに含んでもよい。そのような任意選択の再圧密化ステップ３０３’’’は、脱トリチル化ステップ３０１の前に実施される。任意選択の再圧密化ステップ３０３’’’は、流動化ステップ３０３’とそれに続く再充填ステップ３０３’’、すなわち上記の再圧密化ステップ３０３を含む。

【0054】

一実施形態では、合成樹脂を再圧密化する第１のステップ３０３は、脱トリチル化３０１の後に実施される。上記のように、第１の再圧密化ステップ３０３は、樹脂を流動化する第１のステップ３０３’を含み、ここで溶媒はカラムの底部から頂部へと通過し、その後、樹脂を再充填するステップ３０３’’が続き、その間に溶媒がカラムの頂部から底部へ通過する。第２の再圧密化ステップは、以下で論じる第４の洗浄ステップ３０９の後に実施してもよい。合成における洗浄ステップ３０２；３０５；３０７；３０９のいずれかの後に、追加の再圧密化ステップを実施することができる（すべての洗浄ステップは、さらに下で論じる）。

【0055】

第１の再圧密化ステップ３０３に続いて、反応ステップ３２０がある。反応ステップ３２０は、カップリングステップ３０４とそれに続く第２の洗浄ステップ３０５を含む。カップリングステップ３０４では、少なくとも１つの第２の配列単位が樹脂上を通過する（カラムを通過する）。第２の洗浄ステップ３０５の間、溶媒、例えばアセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピオニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、続いてＡＣＮ、または試薬、副生成物、過剰な配列単位、添加物などの除去を促進するのに適した任意の他の溶媒または溶媒の組み合わせ（複数可）などをカラムに通す。少なくとも１つの第２のヌクレオチドまたはヌクレオシドを樹脂上で再循環させることができるように、カップリングステップ３０４を１回または数回繰り返すことができる。カップリング３０４の前に、少なくとも１つの第２のヌクレオチドまたはヌクレオシドは、活性化剤、例えば、ＢＴＴ、ＥＴＴ、活性化剤４２によって活性化され得る。カップリングステップ３０４において、第２の配列単位中のリンは、樹脂結合の第１の配列単位中のヒドロキシル基と共有結合を形成する。カップリングステップ３０４の間、無水反応条件を有することは有利である。無水条件は、形成されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーのより高い収率及び／またはより高い純度をもたらし得る。

【0056】

酸化／チオール化３３０は、反応ステップ３２０に続く。酸化／チオール化ステップ３３０は、酸化ステップ３０６及び第３の洗浄ステップ３０７を含む。酸化ステップ３０６では、酸化剤／チオール化剤／硫化剤がカラム３０４に添加される。酸化剤／チオール化剤／硫化剤は、新たに形成された三価リンを五価リン（例えば、ホスホロチオエート、ホスホジエステル）に変換する。第２に、残りの酸化剤／チオール化剤／硫化剤は、第３の洗浄ステップ３０７で洗い流される。第３の洗浄ステップ３０７では、溶媒がカラムを通過する。

【0057】

酸化剤／チオール化剤／硫化剤が洗い流された後、フルキャッピングステップ３４０が続く。フルキャッピングステップ３４０は、キャッピングステップ３０８及び第４の洗浄ステップ３０９を含む。キャッピングステップ３０８では、キャッピング剤がカラムに添加される。キャッピング剤は、未反応のヒドロキシル基をブロックし、次のステップでの反応を防ぐ。キャッピング剤の導入に続いて、第４の洗浄ステップ３０９が行われる。第４の洗浄ステップ３０９では、溶媒がカラムを通過する。キャッピングステップは任意選択であってよい。キャッピングステップはまた、酸化／チオール化ステップに含まれてもよい。

【0058】

所望の核酸配列を含むオリゴマーまたはオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが合成されるまで、脱トリチル化３０１、再圧密化３０３、反応３２０、酸化／チオール化３３０、及びフルキャッピング３４０のステップが繰り返される。所望の配列が合成された後、新たに形成された配列（例えば、新たに形成されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド）は、切断ステップ３１０において樹脂から除去される。所望の配列は、利用可能な任意の標準的な技術によって樹脂から除去することができる。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、最大２５個、または最大４０～５０個、または上の７０～８０個、または最大１００個以上の配列単位、またはヌクレオチドもしくはヌクレオシドを含み得る。

【0059】

例示的なオリゴヌクレオチド合成サイクルは、上記のステップ、すなわち、脱トリチル化３０１、第１の洗浄ステップ３０２、第１の再圧密化３０３、反応３２０、酸化３３０、及びキャッピング３４０の繰り返しを含む。所望の配列が合成された後、それは切断ステップ３１０で樹脂から除去される。樹脂からの除去前、除去中、または除去直後に、オリゴマーまたはオリゴヌクレオチドから任意の保護基または複数の保護基を切断することもできる。

【0060】

ガラス（または任意の他の適切な透明材料）カラムを使用することにより、第１の再圧密化ステップをモニターし、カラムに配置された樹脂を視覚的にモニターすることが可能である。第１の再圧密化ステップ３０３が成功した後、樹脂はカラム内でより均一または均一に見える。一実施形態では、第１の再圧密化ステップ３０３は、流動化ステップ中の流速が２５～７５ｃｍ／ｈとなるように実施され、流動化ステップは、０．２５～０．７５、または０．２５～１のカラム体積の間継続され、再充填ステップの間の流速は、１００～２００ｃｍ／ｈで、再充填は０．２５～０．７５、または０．２５～１またはそれ以上のカラム体積の間継続される。

【0061】

２回以上の合成サイクルと、フルキャッピング３４０の後（または第４の洗浄ステップ３０９の後）に実施される第２の再圧密化ステップを含む本明細書に記載のプロセスでは、次の／後に続く脱トリチル化ステップ３０１で形成される赤色前線を追跡することによって、第２の再圧密化ステップをモニターすることが可能である。適切な第２の再圧密化ステップの場合、脱トリチル化ステップ３０１の間に形成される赤色前線または線は、塔壁に対して垂直なほぼ直線として現れる。これは、第２の再圧密化ステップ３０３が実施されなかった場合とは対照的であり、その場合、線は直線でないか、または垂直でないか、または前線が線を形成しない。

【0062】

上記のように、ヌクレオシド（複数可）またはヌクレオチド（複数可）は、反応ステップ３２０の前に活性化される。一実施形態では、配列単位（複数可）（例えば、ヌクレオシド（複数可）またはヌクレオチド（複数可））は、別個に画定された混合チャンバ内で活性化される。一実施形態では、配列単位（複数可）（例えば、ヌクレオシド（複数可）またはヌクレオチド（複数可））は、システムのチューブ内で活性化される。システムのチューブ内のヌクレオシド（複数可）またはヌクレオチド（複数可）の活性化は、インライン活性化と呼ばれることがある。インライン活性化は、カラムに到達する前またはカラム内で発生し得る。

【0063】

本明細書に記載のプロセスでは、任意の適切な溶媒または複数の溶媒を使用することができる。一般に、アセトニトリル（ＡＣＮ）は洗浄ステップ３０２；３０５；３０７；３０９で溶媒として使用され、酸性溶液は脱トリチル化ステップ３０１で使用され、保護基は樹脂に結合した第１のヌクレオシド（複数可）またはヌクレオチド（複数可）から除去される。一実施形態では、脱トリチル化ステップで使用される酸性溶液のｐＫａは、保護基を放出できるような値であり、例えば、ジメトキシトリチルに対するＤＣＡまたはＴＣＡのｐＫａ値は、例えば、ＤＣＡについて１．３５、ＴＣＡについて０．６６である。一実施形態では、脱トリチル化ステップで使用される酸性溶液のｐＫａは、０．２～３、または０．２～２、または０．２～１．５、または０．２～０．８である。

【0064】

一実施形態では、反応溶液は、反応溶液中の第２の配列単位が固定化された配列単位のうちの少なくとも９９％、または９８％、または９７％、または９６％、または９５％、または９０％と接触することを可能にする流速及び体積で樹脂上を通過する。

【0065】

本明細書に記載のオリゴマーまたはオリゴヌクレオチドの固相合成のためのフロースルー法では、第２の配列単位を含む溶液は、少なくとも１つの固定化された第１の配列単位を含むカラムに通過する。溶液は、１回カラムを通過してもよいし、再循環して複数回、例えば２回、または３回、またはそれ以上カラムを通過してもよい。再循環の場合、再循環される溶液に異なる試薬及び／または添加剤を添加することができる。当業者は、合成されるオリゴヌクレオチドのタイプ、所望の結果、試薬のタイプなどに応じて、適切なサイクル数を決定することができる。

【0066】

一実施形態では、合成樹脂の上を通過する前に、少なくとも１つの第２の配列単位に加熱が加えられる。少なくとも１つの第２の配列単位は、合成樹脂上を通過する前に少なくとも１℃加熱することができる。

【0067】

この文脈において、加熱は、１℃、または３℃、または５℃以上の加熱を指し得る。当業者は、反応、配列単位（複数可）のタイプ（複数可）、または核酸（複数可）／ヌクレオチド（複数可）／ヌクレオシド（複数可）、試薬のタイプ（複数可）などに応じて加熱レベルを決定することができる。配列単位（複数可）またはヌクレオシド（複数可）またはヌクレオチド（複数可）、及びキャッピング剤（複数可）、酸化剤（複数可）などの可能な他の試薬を加熱すると、反応速度を高める可能性があるという点で利点がある。オリゴヌクレオチド合成のプロセスで加熱を使用して、１つまたは複数の反応ステップの反応速度を高めることができる。

【0068】

本明細書に記載のプロセスの異なるステップは、１つ、２つ、またはいくつかの検出器を使用してモニターすることができる。一実施形態では、プロセスの少なくとも１つのステップの進行は、少なくとも２つの検出器によってモニターされる。一実施形態では、プロセスの進行は継続的にモニターされる。一実施形態では、プロセスの進行は、分光法、好ましくは近赤外（ＮＩＲ）分光法によってモニターされる。

【0069】

上記のように、本明細書に記載のプロセスの１つ、いくつか、またはすべての部分／ステップは、連続的または非連続的な方法でモニターすることができる。したがって、脱トリチル化３０１、第１の再圧密化３０３、反応ステップ３２０、酸化／チオール化ステップ３３０、フルキャッピングステップ３４０、及び／または異なる洗浄ステップ３０２；３０５；３０７；３０９をモニターすることができる。検出器は、ＮＩＲ及び／またはＵＶ／Ｖｉｓ検出器であり得る。継続的なモニタリングは、脱トリチル化３０１、再圧密化３０３、カップリング３０４、酸化３０６、キャッピング３０８、異なる洗浄ステップ３０２；３０５；３０７；３０９などのさまざまなステップの進行に関する情報を提供できる。そのような情報は、例えば、現在進行中のステップが終了し、次のステップが開始されるとき、すなわち条件付き閾値に到達するときなどである。モニタリングからの情報は、連続モニタリングからの出力に応じて合成プロトコールを変更するためにも使用できる。プロセスは、インライン、オンライン、またはその両方など、さまざまな方法でモニターできる。プロセスは、継続的なモニターを可能にする方法でモニターすることができる。

【0070】

上記のように、配列単位（複数可）またはヌクレオシド（複数可）またはヌクレオチド（複数可）の活性化は、別個に画定された混合チャンバ内で実施され得る。そのような場合、溶媒による希釈を使用してサイクル間で混合チャンバを空にして洗浄することができ、洗浄の進行をＵＶ／Ｖｉｓ検出器またはＮＩＲ検出器などの検出器、または当業者によって適切であると決定されるような任意の他のタイプの検出器を使用してモニターすることができる。混合チャンバを空にして洗浄することは、カラム内の樹脂を洗浄している間に、２つのプロセスを独立して同時に実施するか、または洗浄溶媒を最初にこれらのユニットの１つに通し、次に他のユニットに通す（すなわち、最初に混合チャンバ、次いでカラム上を通す、またはその逆）ことによって行うことができる。

【0071】

混合チャンバの洗浄は、例えばＡＣＮなどの洗浄溶媒を、最初に混合チャンバに、その後カラムに順次通すことにより、カラムの洗浄と組み合わせることができる。

【0072】

別の実施形態では、混合チャンバの流出は、気泡検出器を使用してモニターすることができる。

【0073】

異なる洗浄ステップ３０２；３０５；３０７；３０９は、置換技術を使用して実施することができる。カラムの洗浄は、インライン及びリアルタイムでモニターでき、条件付き閾値に達するまで継続できる。そのような閾値は、当業者によって決定される。モニターは、ＵＶ／ＶｉｓまたはＮＩＲモニター／検出器、または任意の他の適切な種類の検出器であり得る。

【0074】

一実施形態では、本プロセスは、ソフトウェア制御のリアルタイム条件付きモニタリングを使用し、重要品質特性（ＣＱＡ）に影響を及ぼす重要工程パラメータ（ＣＰＰ）を測定するためにプロセス解析工学（ＰＡＴ）の使用を可能にする。

【0075】

プロセス解析工学（ＰＡＴ）は、バイオテクノロジー及び医薬品製造業界における品質保証のための重要なツールである。ＰＡＴは、例えば米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などのさまざまな規制機関の要件を満たすために重要であるため、プロセスがＰＡＴを有効にすることは利点である。ＵＶ／Ｖｉｓ及び／またはＮＩＲ分光法を使用して、反応のさまざまなステップをモニターすると、ＰＡＴの使用が可能になり得る。

【0076】

ＰＡＴの使用により、ユーザーは、時間、特定の波長での光の吸光度、温度、特定の中間体、副産物などの存在または非存在またはその両方などのパラメータを選択でき、これはプロセスを制御する。定義されたパラメータは、２１ ＣＦＲ ｐａｒｔ １１準拠に従って、文書化され、制御ソフトウェアに記録され得る。

【0077】

一実施形態では、プロセスは直線的に拡張可能である。本明細書に記載のプロセスは、直線的に拡張可能であり、すなわち、カラム内の液体流速（ｃｍ／ｈ）は、カラムのサイズ／比率に関係なく同じであり、したがって、例えば、μｍｏｌ、ｍｍｏｌ、ｍｏｌなどの、すべてのスケールで同じ直線流速を使用することができる。これは、本明細書に記載のプロセスが、同じ相対的過剰の配列単位（複数可）またはヌクレオシド（複数可）またはヌクレオチド（複数可）を、さまざまなステップで同じ線形液体流量を使用するため、より大きいスケール（例えば、ｍｍｏｌ）と同様により小さいスケール（例えば、μｍｏｌ）で使用してスケールアップ（またはスケールダウン）、またはその逆（すなわち、より大きなスケールからより小さなスケールへの条件の移行）にできることを意味する。したがって、スケールアップまたはスケールダウンする前にプロセスを小規模に最適化することができ、時間、試薬、溶媒のすべてを節約し、無駄を減らすことができる。本プロセスは、パラメータが最適化されたスケールと同様に、スケーリングされたバージョンでも、類似または同一の結果、例えば収率及び純度をもたらし得る。プロセスが直線的に拡張可能であると当業者によって理解されるように、すべてのプロセスパラメータ（例えば、圧力、温度など）及びすべての合成成分（例えば、添加剤、溶媒など）が、異なる合成スケール間で線形関係を有さなければならないわけではない。

【0078】

本発明の第２の態様では、フロースルー固相オリゴヌクレオチド合成のためのシステム１００が存在する。システム１００は、合成樹脂を充填するように配置された少なくとも１つのカラム１０１、少なくとも第１のポンプ１０２ａ、溶媒及び試薬用の少なくとも第１のリザーバ１０４ａ、少なくとも１つの検出器１０６、及び少なくとも１つのプロセッサ１１４を含む。チューブ１０８は、第１のリザーバ１０４ａをカラム１０１に接続する。第１のポンプ１０２ａとバルブ１０９ａ～ｄは、システム１００内の流れを導くように配置されている。プロセッサ１１４は、少なくとも第１のポンプ１０２ａ、バルブ１０９ａ～ｄ、及び検出器１０６と通信接続している。システム１００は、溶媒の流れを第１のリザーバ１０４ａからカラムの底部１０１’に導き、溶媒がカラムの底部１０１’から頂部１０１’’へとカラム１０１を通過するように配置された流動化流路２００を提供するように配置され、溶媒の流れを第１のリザーバ１０４ａからカラムの頂部１０１’’に導き、溶媒が頂部１０１’’から底部１０１’へとカラム１０１を通過するように配置された再充填流路２１０を提供するように配置される。システム１００は、１回の合成サイクルにおいて、最初に流動化流路２００に溶媒を流し、続いて再充填流路２１０に溶媒を流すように配置される。このようなシステムは、図２ａに概略的に示されている。

【0079】

一実施形態では、溶媒がカラムの底部１０１’から頂部１０１’’へと通過するとき、第３のバルブ１０９ｃが配置され、廃液出口を提供する、すなわちシステム１００から廃液を排出するように配置される。同様に、溶媒がカラムの頂部１０１’’から底部１０１’へと通過するとき、第４のバルブ１０９ｄが配置され、廃液出口を提供する、すなわちシステム１００から廃液を排出するように配置される。

【0080】

一実施形態では、図２ａに示すように、第２のバルブ１０９ｂは、第１のリザーバ１０４ａの下流でカラム１０１の上流に配置される。第２のバルブ１０９ｂは、流れがカラム１０１に頂部１０１’または底部１０１’’のいずれかから入るように導くように配置されてもよい。このようにして、第２のバルブ１０９ｂは、流れを方向付けることによって、流動化流路２００及び再充填流路２１０を促進することができる。

【0081】

一実施形態では、図２ａに示されるように、第１のバルブ１０９ａは、第１のリザーバ１０４ａの下流で第１のポンプ１０２ａの上流に配置される。そのような構成では、特に第１のリザーバ１０４ａが複数のリザーバによって実現される場合、第１のバルブ１０９ａは、第１のリザーバ１０４ａからシステム１００及び第１のポンプ１０２ａに入る液体のタイプを選択するように配置されてもよい。他の実施形態では、液体のタイプを選択する機能は、第１のポンプ１０９ａが第１のリザーバ１０４ａによって実現されるかまたは組み込まれるように、第１のリザーバ１０４ａによって実現される。

【0082】

一実施形態では、システム１００は、再循環流路２２０を提供するように配置される。再循環流路２２０は、カラム１０１上で、システム１００を通して溶媒（複数可）、試薬などを再循環させるように配置される。このようなシステム１００は、図２ｂに概略的に示されている。他の実施形態では、再循環流路２２０は、チューブ１０８及び／または流動化流路２００と、再充填流路２１０とによって実現され得る。第２のポンプ１０２ｂは、図２ｂに示すように、再循環流路２２０と流体連通するように配置することができる。そのような構成では、第２のポンプ１０２ｂは、再循環流路２２０内の流れを調節するように配置され得る。

【0083】

本発明によるシステム１００で使用される構成要素は、当該技術分野で使用される標準的な構成要素であり、したがって当業者によく知られている。

【0084】

カラム１０１は、ガラスカラム、ステンレス鋼から製造されたカラムなど、任意のタイプのカラムであってもよい。カラム１０１は、システム１００内で重力方向に実質的に真っ直ぐに配置され、それによりカラム上部１０１’’が実質的に上向き（空に向かって）に面して配置され、カラム底部１０１’が実質的に下向き（地球に向かって）に面して配置される。このようにして、カラム１０１’’の上部から底部１０１’への液体の流れは重力方向に流れる。カラム１０１には合成樹脂が充填されるように配置されている。

【0085】

システム１００は、図２～４に示されるように、２つのリザーバ（第１の１０４ａ及び第２の１０４ｂ）など、２つ以上のリザーバ１０４ａを備えることができる。そのような場合、第１のリザーバ１０４ａは、溶媒（複数可）、脱トリチル化剤（複数可）、及びキャッピング剤（複数可）を含むことができ、第２のリザーバ１０４ｂは、溶媒（複数可）、配列単位または核酸（複数可）、及びキャッピング剤（複数可）を含むことができるか、またはその逆で、または任意の他の組み合わせで含むことができる。

【0086】

システム１００は、図２～４に示されるように、第１のポンプ１０２ａ及び第２のポンプ１０２ｂの２つ、またはそれ以上のポンプなど、２つ以上のポンプ１０２ａを備えることができる。それぞれのポンプ１０２ａ、１０２ｂは、図２～４に示すように、システム１００内のリザーバ１０４（複数可）のうちの少なくとも１つと流体連通することができ、第１のポンプ１０２ａが下流に配置され、第１のリザーバ１０４ａと流体連通し、第２のポンプ１０２ｂは下流に配置され、第２のリザーバ１０４ｂと流体連通する。ポンプ（複数可）１０２は、システム１００内の液体の流れを駆動するために使用できる任意のデバイス、例えば、油圧ポンプ（複数可）、空気圧ポンプ（複数可）などであってもよい。

【0087】

一実施形態では、流動化流路２００及び再充填流路２１０はチューブ１０８によって実現されるため、余分なチューブは必要ない。代替的に、システム１００は、チューブ１０８を使用して、最初にカラムの底部１０１’からカラムの頂部１０１’’へ、または逆流方向で液体を流し、続いてカラムの頂部１０１’から底部１０１’’へ液体を流すように配置される。さらに、再循環流路２２０もチューブ１０８によって実現することができる。このようなシステムは、図３に概略的に示されている。

【0088】

システム１００は、チューブ１０８及びカラム１０１と流体連通して配置されたカラムバイパス１１２をさらに含んでもよい。カラムバイパス１１２は、図４のシステム１００に概略的に示されている。溶媒入口及び廃液出口は、カラム１０１及び流体バイパス１１２と流体連通して配置され得る。溶媒入口はカラム１０１の上流に配置することができ、廃液出口はカラム１０１の下流に配置することができ、逆もまた同様である。カラムバイパス１１２は、例えば活性化、洗浄などの間、カラム１０１を通過することなくシステム１００内の液体（複数可）を再循環させるように配置され得る。

【0089】

図２～４のいずれかに示されるシステム１００は、下流に配置され、リザーバ（複数可）１０４ａ；１０４ｂと流体連通する圧力センサ（複数可）１１１ａ；１１１ｂをさらに備えることができる。システム１００は、第１のポンプ１０２ａ及び第２のポンプ１０２ｂと流体連通する流れ方向転換バルブ１２０ａ；１２０ｂをさらに備えることができる。流れ方向転換バルブ１２０ａ；１２０ｂは、流れをそれぞれのポンプ１０２ａ；１０２ｂに出し入れするように導くように配置することができる。流れ方向転換バルブ１２０ａ；１２０ｂは、ロータリーバルブ、またはソレノイドバルブ、または別の適切なタイプのバルブであり得る。

【0090】

圧力は、例えば、異なる流速、樹脂の膨張、特定の溶媒の使用、チューブなどの機器構成要素のサイズなどにより、合成プロセス中に変化する可能性がある。液体の流速は、システム１００の使用中にプロセッサ１１４と通信接続するポンプ１０２ａ；１０２ｂによって調整及び調節されるように配置されている。システム１００内の圧力が所定の制限内に保たれるように、調節は（他の調節パラメータに加えて）圧力に基づくことができる。そのような所定の制限は、プロセス及びシステム１００の構成要素に依存し、当業者によって決定されるべきである。

【0091】

システム１００は、例えば入口フィルタ（複数可）１２１及びインラインフィルタ（複数可）１２２の形態のフィルタをさらに備えてもよい。入口１２１及びインライン１２２のフィルタは、図４に概略的に示すように配置することができるが、他の配置も可能である。望ましくない粒子などがシステム１００に入るのを防ぐために、システム１００への入口（複数可）の先端（複数可）に入口フィルタ１２１を配置することができる。インラインフィルタ（複数可）１２２は、プロセス中に形成された沈殿物などの望ましくない成分を濾去するように配置されてもよい。インラインフィルタ１２２は、例えば、ポンプ（複数可）１０２ａ；１０２ｂの上流または下流に、またはカラムバイパス１１２に、またはシステム１００の任意の他の適切な位置に配置することができる。

【0092】

バルブ１０９ａ～ｆは、当業者がフロースルーオリゴヌクレオチド合成システムに適していると考える任意のタイプのバルブであり得、例えば、ロータリーバルブ、またはソレノイドバルブ、または別の適切なタイプのバルブであり得る。

【0093】

システム１００内のバルブ１０９ａ～ｆ及び／または流れ方向転換バルブ１２０ａ～ｂは、システム１００内の流れを方向付けるように配置され、チューブ１０８及びリザーバ（複数可）１０４ａ；１０４ｂと流体連通している。バルブ１０９ａ～ｆ及び／または流れ方向転換バルブ１２０ａ～ｂは、プロセッサ１１４によって制御され、プロセッサ１１４と通信可能に通信する。システム１００内のバルブ１０９ａ～ｆ及び／または流れ方向転換バルブ１２０ａ～ｂはそれぞれ、プロセッサ１１４によって自動化及び制御されるように配置される。モニターからのシステム１００へのフィードバックに応じて、バルブ１０９ａ～ｆ及び／または流れ方向転換バルブ１２０ａ～ｂを調節することができる。そのような調節は、例えばシステム１００と通信接続しているコンピュータ内のプロセッサ１１４によって提供される。

【0094】

検出器１０６は、ＵＶ／Ｖｉｓ検出器、蛍光検出器、ＮＩＲ検出器などの任意のタイプの検出器であってもよい。一実施形態では、検出器１０６は分光検出器、好ましくはＮＩＲ検出器である。検出器１０６は、カラム１０１の下流に配置される。検出器１０６は、プロセッサ１１４と通信可能に通信する。システム１００は、２つ以上の検出器１０６を含み得る。

【0095】

システム１００は、２つ以上のカラム１０１、例えば並列に接続できる少なくとも２つのカラム１０１を含むことができる。２つ以上のカラム１０１の使用は、他の配列の自動化連続合成、異なるスケールでの合成、プロセス開発のためのパラメータの最適化などを促進する。

【0096】

２つのリザーバ（複数可）１０４ａ；１０４ｂが図２～４に示されているが、例えばそれぞれが異なるタイプの溶媒、配列単位、モノマー、核酸（複数可）、異なる薬剤、試薬などを含む複数のリザーバが代わりに使用できることが理解されるべきである。検出器１０６、気泡検出器１０７、ポンプ１０２ａ；１０２ｂ、温度装置１０３などのシステム１００の異なる構成要素は、システム１００の異なる位置に配置され得ることがさらに理解されるべきである。図２～４は、システム１００内の構成要素の可能な構成のいくつかの例を単に示していることに留意されたい。

【0097】

本発明の一実施形態では、システム１００はさらに、
－ カラム１０１の上流及び少なくとも第１のリザーバ１０４ａの下流に配置された温度調節装置１０３と；
－ 第１の温度センサー１０５ａと；
－ 第２の温度センサー１０５ｂと、
を含む。

【0098】

図２～４に示すように、第１の温度センサー１０５ａはカラム１０１の上流で温度調節装置１０３の下流に配置され、第２の温度センサー１０５ｂはカラム１０１の下流に配置される。

【0099】

温度調節装置１０３は、システム１００内の液体、液体混合物または合成液体混合物などを加熱または冷却するか、またはその両方を行うように配置することができる。液体は、溶媒（複数可）、及び／または試薬、及び／または核酸（複数可）、及び／またはキャッピング剤などを含んでもよい。温度調節デバイス１０３は、カラム１０１の上流及びリザーバ１０４ａ；１０４ｂの下流に配置され、液体がカラム１０１に到達する前に加熱できるようにする。

【0100】

システム１００は、システム１００を通ってカラム１０１上に異なる温度を有する液体を流すように配置されたチューブによって実現される１つ以上の流路（図示せず）をさらに含んでもよい。そのような流路は、少なくとも温度調節装置１０３、カラム１０１、及びリザーバ（複数可）１０４ａ～ｂと流体連通している。

【0101】

本発明の一実施形態では、システム１００は、図４に概略的に示すように、温度調節装置バイパス１２３をさらに備える。温度調節装置バイパス１２３は、温度調節装置１０３と流体連通して配置される。温度調節装置バイパス１２３は、合成液が温度調節装置１０３を通過しないように、温度調節装置１０３から合成液をバイパスするように配置されてもよい。

【0102】

本発明の一実施形態では、システム１００は、図２～図４に示すように、少なくとも第１のリザーバ１０４ａと流体連通して配置された別個に画定された混合チャンバ１１３と、別個に画定された混合チャンバ１１３の上流に配置された気泡検出器１０７とをさらに備える。

【0103】

別個に画定された混合チャンバ１１３は、システム１００内のヌクレオシド（複数可）またはヌクレオチド（複数可）を活性化するために使用され得る。それは、システム１００がヌクレオシド（複数可）またはヌクレオチド（複数可）及び少なくとも１つの活性化剤（複数可）を少なくとも第１のリザーバ１０４ａから少なくとも第１のバルブ１０９ａ及び第５のバルブ１０９ｅを開くことによって、別個に画定された混合チャンバ１１３へと流すように配置され得るように少なくとも第１のリザーバ１０４ａと流体連通して配置される。

【0104】

気泡検出器１０７は、別個に画定された混合チャンバ１１３の上流に配置され得る。気泡検出器１０７は、プロセッサ１１４と通信可能に通信する。気泡検出器１０７は、混合チャンバが空に近づいているかまたは空になっていることを示すものとして、気泡の存在を検出するように配置され得る。気泡検出器１０７は、別個に画定された混合チャンバ１１３の上流、及びシステム１００の残りの部分と流体連通する第２の第５のバルブ１０９ｅ’の下流に配置され得る。

【0105】

本発明の一実施形態では、検出器１０６は、例えばＵＶ／Ｖｉｓ光検出器、蛍光検出器、及びＮＩＲ検出器から選択される。システム１００は、システム１００の使用中に、オリゴヌクレオチド合成プロセスの進行を継続的にモニターするか、または特定の時点などで特定の反応ステップをモニターするように配置され得る。

【0106】

第３の態様では、フロースルー固相オリゴヌクレオチド合成のためのシステム１００を使用してフロースルー固相オリゴヌクレオチド合成３００を実施するための方法が存在する。システム１００は、合成樹脂を充填するように配置された少なくとも１つのカラム１０１、少なくとも第１のポンプ１０２ａ、モノマー及び試薬用の少なくとも第１のリザーバ１０４ａ、少なくとも１つの検出器１０６、及び少なくとも１つのプロセッサ１１４を含み、チューブ１０８が第１のリザーバ１０４ａをカラム１０１に接続する。第１のポンプ１０２ａとバルブ１０９ａ～ｄは、システム１００内の流れを導くように配置されている。プロセッサ１１４は、少なくとも第１のポンプ１０２ａ、バルブ１０９ａ～ｄ、及び検出器１１４と通信接続している。合成樹脂がカラム１０１内に配置され、第１の配列単位が化学結合を介して合成樹脂に結合される。本方法３００は、再圧密化３０３の少なくとも１つのステップを含み、その間、システム１００は、流動化ステップ３０３’において流動化流路２００を介してカラムの底部１０１’から頂部１０１’’に溶媒を流すことによって、カラム１０１内に配置された合成樹脂を最初に流動化するように構成される。流動化ステップ３０３’に続いて、システム１００が再充填流路２１０を用いてカラムの頂部１０１’’から底部１０１’に溶媒を流して、カラム１０１内に配置された合成樹脂を再充填する再充填ステップ３０３’’を行う。

【0107】

本発明の一実施形態では、フロースルーオリゴヌクレオチド合成のためのシステム１００を使用してフロースルー固相オリゴヌクレオチド合成を実施するための方法３００が存在する。方法３００は、以下のステップを含む：
－ 脱トリチル化ステップ３０１：システム１００が、少なくとも第１のバルブ１０９ａ、第２のバルブ１０９ｂ、及び第３のバルブ１０９ｃを開くことによって、脱トリチル化剤を含む酸性溶液をチューブ１０８を通して第１のリザーバ１０４ａからカラム１０１に流すように配置される；
－ 第１の洗浄ステップ３０２：システム１００が、少なくとも第１のバルブ１０９ａ、第２のバルブ１０９ｂ、及び第３のバルブ１０９ｃを開くことによって、溶媒をチューブ１０８を通して第１のリザーバ１０４ａからカラム１０１に流すように配置される；
－ 第１の再圧密化ステップ３０３： システム１００が、流動化ステップ３０３’において流動化流路２００を介してカラムの底部１０１’から頂部１０１’’に溶媒を流すことによって、カラム１０１内に配置された合成樹脂を最初に流動化するように構成される。流動化ステップ３０３’に続いて、システム１００が再充填流路２１０を用いてカラムの頂部１０１’’から底部１０１’に溶媒を流して、カラム１０１内に配置された合成樹脂を再充填する再充填ステップ３０３’’を行う；
－ 反応ステップ３２０：システム１００が、少なくとも第１のバルブ１０９ａ、第２のバルブ１０９ｂ、及び第３のバルブ１０９ｃを開くことによって、少なくとも１つの配列単位をチューブ１０８を通して第１のリザーバ１０４ａからカラム１０１に流すように配置される。反応ステップ３２０の第２の部分は第２の洗浄ステップ３０５であり、システム１００が、少なくとも第１のバルブ１０９ａ、第２のバルブ１０９ｂ、及び第３のバルブ１０９ｃを開くことによって、溶媒をチューブ１０８を通して第１のリザーバ１０４ａからカラム１０１に流すように配置される；
－ 酸化／チオール化ステップ３３０：システム１００が、少なくとも第１のバルブ１０９ａ、第２のバルブ１０９ｂ、及び第３のバルブ１０９ｃを開くことによって、酸化剤またはチオール化剤をチューブ１０８を通して第１のリザーバ１０４ａからカラム１０１に流すように配置される。酸化／チオール化の第１の部分に第３の洗浄ステップ３０７が続き、システム１００が、少なくとも第１のバルブ１０９ａ、第２のバルブ１０９ｂ、及び第３のバルブ１０９ｃを開くことによって、溶媒をチューブ１０８を通して第１のリザーバ１０４ａからカラム１０１に流すように配置され；
－ フルキャッピングステップ３０９：システム１００が、少なくとも第１のバルブ１０９ａ、第２のバルブ１０９ｂ、及び第３のバルブ１０９ｃを開くことによって、キャッピング剤をチューブ１０８を通して第１のリザーバ１０４ａからカラム１０１に流すように配置される。キャッピングステップ３０９の第１の部分に第４の洗浄ステップ３０７が続き、システム１００が、少なくとも第１のバルブ１０９ａ、第２のバルブ１０９ｂ、及び第３のバルブ１０９ｃを開くことによって、溶媒をチューブ１０８を通して第１のリザーバ１０４ａからカラム１０１に流すように配置される。

【0108】

上記のように、システム１００は、図２～４に示されるように、２つのリザーバ１０４ａ；１０４ｂなど、２つ以上のリザーバ１０４ａを有することができる。そのような場合、本明細書に記載の方法３００のすべてのステップにおいて、第１のリザーバ１０４ａを第２のリザーバ１０４ｂと交換する（またはその逆）ことができる。

【0109】

一実施形態では、キャッピング３４０の後（または第４の洗浄ステップ３０９の後）に、第２の再圧密化ステップが行われる。本発明による方法３００では、例えば、洗浄ステップ３０２；３０５；３０７；３０９のいずれかの後に、追加の再圧密化ステップをいつでも実施することができる。

【0110】

本発明の一実施形態では、流動化ステップ３０３’中の流速は２５～７５ｃｍ／ｈであり、流動化ステップ３０３’は０．２５～０．７５、または０．２５～１、またはそれ以上のカラム体積の間継続される。本発明の一実施形態では、再充填ステップ３０３’’中の流速は１００～２００ｃｍ／ｈであり、再充填ステップ３０３’’は０．２５～０．７５、または０．２５～１、またはそれ以上のカラム体積の間継続される。

【0111】

再圧密化ステップ３０３の流速及び時間は、反応のタイプ、及び／または所望の結果、及び／またはカラム１０１のサイズ（長さ及び直径）または体積及びタイプなどに依存する。本発明による方法３００では、システム１００は、上記のパラメータに基づいて決定されたプロセッサ１１４によって提供される所定の流量を使用して、所定の期間再圧密化ステップ３０３を実行するように構成される。

【0112】

本発明の一実施形態では、方法３００の進行は、カラム１０１の下流に配置された少なくとも１つの検出器１０６によってモニターされる。

【0113】

本発明の一実施形態では、方法３００は、反応ステップ３２０の前の活性化ステップを含む。活性化ステップにおいて、システム１００は、活性化剤を少なくとも１つの配列単位に提供することによって、少なくとも１つのヌクレオチドまたはヌクレオシドを活性化するように構成される。活性化は、システム１００のチューブ１０８内で、または別個に画定された混合チャンバ１１３内で実施することができる。別個に画定された混合チャンバ１１３は、第１のリザーバ１０４ａと流体連通して配置される。一実施形態では、システム１００は、別個に画定された混合チャンバ１１３の上流に配置された気泡検出器１０７を使用して、活性化された少なくとも１つの配列単位が別個に画定された混合チャンバ１１３から離れることをモニターするように構成される。

【0114】

本発明の一実施形態では、方法３００は、反応ステップ３２０の前に追加のステップを含み、ここで、少なくとも１つの第２の配列単位、またはヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む溶液は、カラム１０１に入る前に加熱される。加熱ステップにおいて、システム１００は、温度調節装置１０３を通して、少なくとも１つの第２の配列単位、またはヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む溶液を流すように配置される。温度調節装置１０３はカラム１０１の上流及び第１のリザーバ１０４ａの下流に配置される。

【0115】

本発明によるシステム１００を使用する典型的なフロースルーオリゴヌクレオチド合成は、図５のブロックスキーム及び図１ａのフローチャートに示されている。前述のように、合成は次のステップに分けることができる：
－ 脱トリチル化３０１ 合成は、少なくとも第１のバルブ１０９ａ及び第１のポンプ１０２ａを使用して、少なくとも１つの脱トリチル化剤を第１のリザーバ１０４ａからカラム１０１に提供するようにシステム１００を配置することによって開始される。例えば、検出器１０６によって検出された条件付き閾値によって決定されるように、脱トリチル化ステップ３０１が終了した後、脱トリチル化ステップ３０１からのすべての残留物を洗い流すために、溶媒がシステム１００を通過する。システム１００は、少なくとも第１のバルブ１０９ａ及び第１のポンプ１０２ａを使用することによって、第１のリザーバ１０４ａ（または第２のリザーバ１０４ｂ）から溶媒を提供するように構成される。例えば検出器１０６によって検出された条件付き閾値によって決定されるように、第１の洗浄ステップ３０２が終了した後、再圧密化ステップ３０３が続く。

【0116】

－ 再圧密化３０３ 再圧密化ステップ３０３において、溶媒は最初にカラム１０１を向流方向に、すなわちカラムの底部１０１’’から頂部１０１’に通過する。合成樹脂または樹脂床が少なくとも部分的に流動化するまで、例えば９０％、または９５％、または９９％流動化するか、または樹脂の少なくとも１％がカラム１０１’’の底部と接触しなくなるまで、溶媒がカラム１０１を向流方向に、すなわちカラムの頂部１０１’から底部１０１’’に通過する。樹脂がカラムの底部１０１’’と接触していない場合、合成樹脂は流動化され、したがって、合成樹脂とカラムの底部１０１’’との間に樹脂で充填されていない空間（例えば１％を超えるギャップ）がある場合、樹脂は流動化されている。したがって、カラム１０１内に流動床が配置されるまでである。換言すれば、再圧密化ステップ３０３において、システム１００は、最初に流動化流路２００を使用し、続いて再充填流路２１０を使用して、第１のリザーバ１０４ａからカラム１０１に溶媒を提供するように配置される。再圧密化ステップ３０３が終了した後、樹脂はカラム１０１に均一に充填される。システム１００で透明カラム１０１が使用される場合、これは視覚的に観察することができる。

【0117】

－ 反応ステップ３２０ 反応ステップは、カップリングステップ３０４とそれに続く第２の洗浄ステップ３０５を含む。カップリングステップ３０４において、システム１００は、少なくとも第７のバルブ１０９ｇ及び第２のポンプ１０２ｂを使用することによって、少なくとも１つの配列単位、またはヌクレオシドもしくはヌクレオチドを第２のリザーバ１０４ｂからカラム１０１にカラム１０１を通過させるように配置される。例えば検出器１０６によって検出された条件付き閾値によって決定されるように、カップリングステップ３０４が終了した後、第２の洗浄ステップ３０５が続く。第２の洗浄ステップ３０５の間、カップリング３０４からすべての残留物を洗い流すために、溶媒がシステム１００を通過する。システム１００は、少なくとも第７のバルブ１０９ｇ（または第１のバルブ１０９ａ）及び第２のポンプ１０２ｂ（または第１のポンプ１０２ａ）を使用することによって、第２のリザーバ１０４ａ（または第１のリザーバ１０４ａ）から溶媒を提供するように構成される。例えば検出器１０６によって検出された条件付き閾値によって決定されるように、第２の洗浄ステップ３０５が終了した後、酸化ステップ３３０が続く。カップリングステップ３０４は、少なくとも１つの配列単位、またはヌクレオチドまたはヌクレオシドがカラム１０１を通して再循環され得るように、１回または数回繰り返され得る。

【0118】

－ 酸化／チオール化ステップ３３０ 酸化またはチオール化ステップ３３０は、カップリングステップ３２０に続く。システム１００は、少なくとも第１のバルブ１０９ａ及び第１のポンプ１０２ａを使用することによって、酸化剤／チオール化剤を第１のリザーバ１０４ａからカラム１０１に提供するように構成される。例えば、検出器１０６によって検出された条件付き閾値によって決定されるように、酸化ステップ３０６が終了した後、第３の洗浄ステップ３０７において酸化からのすべての残留物を洗い流すために、溶媒がシステム１００を通過する。システム１００は、少なくとも第１のバルブ１０９ａ（または第７のバルブ１０９ｇ）及び第１のポンプ１０２ａ（または第２のポンプ１０２ｂ）を使用することによって、第１のリザーバ１０４ａ（または第２のリザーバ１０４ｂ）から溶媒を提供するように構成される。例えば検出器１０６によって検出された条件付き閾値によって決定されるように、第３の洗浄ステップ３０７が終了した後、キャッピングステップ３４０が続く。

【0119】

－ キャッピング３４０ キャッピングステップ３４０において、システム１００は、少なくとも第７のバルブ１０９ｇ及び第２のポンプ１０２ｂを使用することによって、第２のリザーバ１０４ｂからカラム１０１にキャッピング剤を提供するように構成される。例えば、検出器１０６によって検出された条件付き閾値によって決定されるように、キャッピングステップ３０８が終了した後、キャッピングステップ３０８からのすべての残留物を洗い流すために、第４の洗浄ステップ３０９において溶媒がシステム１００を通過する。システム１００は、少なくとも第１のバルブ１０９ａ（または第７のバルブ１０９ｇ）及び第１のポンプ１０２ａ（または第２のポンプ１０２ｂ）を使用することによって、第１のリザーバ１０４ａ（または第２のリザーバ１０４ｂ）から溶媒を提供するように構成される。

【0120】

本発明の一実施形態では、反応ステップ３２０の前に活性化ステップがある。活性化ステップ中、システム１００は、活性化剤を提供することによって少なくとも１つのヌクレオシドまたはヌクレオチドを活性化するように構成される。一実施形態では、システム１００は、システム１００のチューブ１０８内の少なくとも１つの配列ユニット、またはヌクレオシドもしくはヌクレオチドを、活性化剤と少なくとも１つの配列ユニット、またはヌクレオシドまたはヌクレオチドとをシステム１００のチューブ１０８を通して同時に流すことによって活性化するように構成される。一実施形態では、システム１００は、別個に画定された混合チャンバ１１３内の少なくとも１つの配列単位、またはヌクレオシドもしくはヌクレオチドを活性化するように構成され、そのような活性化は検出器によってモニターされ得る。すでに活性化された配列単位、またはヌクレオシド（複数可）またはヌクレオシド（複数可）もまた、本発明による方法３００で使用することができ、そのような場合、活性化ステップは必要ない。

【0121】

本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。さまざまな代替、修正、及び均等物を使用することができる。したがって、上記の実施形態は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。さらに、すべての実施形態、態様、及び実施例は、特に明記しない限り、互いに組み合わせることができる。

【実施例】

【0122】

ＨＰＬＣ分析方法及び条件。カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ａｅｒｉｓ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＸＢ－Ｃ１８、２．６μｍ、１００Å、１５０×２．１ｍｍ。移動相緩衝液Ａ：１００ｍＭの酢酸ヘキシルアンモニウム、ｐＨ７、緩衝液Ｂ：Ａ中５０％アセトニトリル。勾配：０％Ｂで４分間、２分間で０～３０％Ｂ、３０分間で３０～８０％Ｂ、２分間で８０～１００％Ｂ、１００％Ｂで２分間。流速０．２５ｍｌ／ｍｉｎ。カラム温度：５０℃。ＵＶ吸光度は２６０ｎｍで記録した。

【0123】

実施例１：カップリングステップの前の再圧密化を実施
オリゴヌクレオチド合成は、Ｔで事前に誘導体化されている市販のポリスチレン／ＤＶＢ架橋樹脂を用いて、Ｔｅｓｔ－１３オリゴヌクレオチド配列のホスホラミダイト標準合成条件（Ｓ．Ｌ． Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｍ．Ｈ． Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ， Ｖｏｌ ２２， Ｉｓｓｕｅ ２０， ｐｐ １８５９－１８６２， １９８１）を用いて実施した。カップリングステップの前に、再圧密化（流動化及び再充填）ステップを行った。

【0124】

特定の条件：
－ 「アミダイト」の１．２５当量
－ カップリング時間２分間
結果：
－ 重量増加に基づく総収率（十分な乾燥後）、８４％。
－ 総収率（樹脂からの部分切断及び脱保護、Ａ２６０単位に基づく）、７７％。
－ ＨＰＬＣによる純度、８４％。
－ 得られた配列のＨＰＬＣクロマトグラムを図６ａに示す。

【0125】

実施例２：再圧密なしで実施（比較例）
オリゴヌクレオチド合成は、Ｔで事前に誘導体化されている市販のポリスチレン／ＤＶＢ架橋樹脂を用いて、Ｔｅｓｔ－１３オリゴヌクレオチド配列のホスホラミダイト標準合成条件（Ｓ．Ｌ． Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｍ．Ｈ． Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ， Ｖｏｌ ２２， Ｉｓｓｕｅ ２０， ｐｐ １８５９－１８６２， １９８１）を用いて実施した。カップリングステップの前に、再圧密化ステップを行っていない。

【0126】

特定の条件：
－ 「アミダイト」の１．２５当量
－ カップリング時間２分間
結果：
－ 重量増加に基づく総収率（十分な乾燥後）、６６％。
－ ＨＰＬＣによる純度、８４％。
－ 得られた配列のＨＰＬＣクロマトグラムを図６ｂに示す。

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【国際調査報告】