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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-20
(54)【発明の名称】抗ＫＬＢ抗体及び使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240912BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240912BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240912BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240912BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240912BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240912BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240912BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240912BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240912BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240912BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240912BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240912BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20240912BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240912BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61P1/16
A61P3/10
A61P3/04
A61P3/06
A61P9/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024517530
(86)(22)【出願日】2022-09-23
(85)【翻訳文提出日】2024-03-19
(86)【国際出願番号】 CN2022120887
(87)【国際公開番号】W WO2023046071
(87)【国際公開日】2023-03-30
(31)【優先権主張番号】202111110895.0
(32)【優先日】2021-09-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519352757
【氏名又は名称】江▲蘇▼恒瑞医▲薬▼股▲フン▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＳＵ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】ＮＯ．７ ＫＵＮＬＵＮＳＨＡＮ ＲＯＡＤ， ＥＣＯＮＯＭＩＣ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＺＯＮＥ， ＬＩＡＮＹＵＮＧＡＮＧ， ＪＩＡＮＧＳＵ ２２２０４７， ＣＨＩＮＡ
(71)【出願人】
【識別番号】516174208
【氏名又は名称】上海恒瑞医薬有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＨＥＮＧＲＵＩ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ
【住所又は居所原語表記】ＮＯ． ２７９ ＷＥＮＪＩＮＧ ＲＯＡＤ， ＭＩＮＨＡＮＧ ＤＩＳＴＲＩＣＴ， ＳＨＡＮＧＨＡＩ ２００２４５， ＣＨＩＮＡ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ 玲
(72)【発明者】
【氏名】▲應▼ ▲華▼
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ 明喜
(72)【発明者】
【氏名】金 薪盛
(72)【発明者】
【氏名】陶 ▲維▼康
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA14
4C085BB11
4C085CC02
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA23
4H045EA27
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
抗ＫＬＢ抗体及び使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗ＫＬＢ抗体であって、ｉ）前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４０～４８中の何れか１つの配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３４中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、又は前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、或いは
ｉｉ）前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４９中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５６～６８中の何れか１つの配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、又は前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、或いは
ｉｉｉ）前記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１８中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１９中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む、
抗ＫＬＢ抗体。
【請求項2】
ｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３７、３８、３９若しくは７のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号８のアミノ酸配列を含み、及び前記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、或いはｉｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、及び前記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号６９、１５、７０、７１、７２、７３若しくは７４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号７５若しくは１６のアミノ酸配列を含み、及びＬＣＤＲ３が配列番号１７のアミノ酸配列を含み、或いは
ｉｉｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号２４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号２５のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含み、及び前記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号２７のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２８のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号２９のアミノ酸配列を含み、
好ましくは、
ｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３７のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号８のアミノ酸配列を含み、及び前記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、或いは
ｉｉ）前記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、及び前記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号６９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号７５のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号１７のアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の抗ＫＬＢ抗体。
【請求項3】
マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である、請求項１又は２に記載の抗ＫＬＢ抗体。
【請求項4】
ｉ）前記重鎖可変領域は配列番号４０、３０、３１、３２、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７若しくは４８、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３４、３３、３５若しくは３６、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いはｉｉ）前記重鎖可変領域は配列番号４９、５０若しくは５１、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号５７、５２、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７若しくは６８、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
ｉｉｉ）前記重鎖可変領域は配列番号１８、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号１９、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
ｉｖ）前記重鎖可変領域は配列番号２、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
ｖ）前記重鎖可変領域は配列番号４、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号５、又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１～３の何れか一項に記載の抗ＫＬＢ抗体。
【請求項5】
ｉ）前記重鎖可変領域は配列番号４０又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号３４又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記重鎖可変領域はそのフレームワーク領域に１Ｅ、２４Ｔ、４４Ｇ、７１Ｓ及び９１Ｆ（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸復帰変異が含まれ、且つ前記軽鎖可変領域はそのフレームワーク領域に２Ｖ、４Ｉ、３６Ｆ、３８Ｅ、４３Ｔ、４４Ｎ及び５８Ｉ（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸復帰変異が含まれ、ｉｉ）前記重鎖可変領域は配列番号４９又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号５７又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記重鎖可変領域はそのフレームワーク領域に１Ｅ、２４Ｇ、４８Ｉ、６７Ａ、６９Ｖ、７１Ｖ及び７３Ｋ（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸変異が含まれ、及び／又は前記軽鎖可変領域はそのフレームワーク領域に２Ｎ、４５Ｋ、４７Ｗ、４９Ｙ、５８Ｖ及び７１Ｙ（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸復帰変異が含まれ、或いは
ｉｉｉ）前記重鎖可変領域は配列番号１８又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域は配列番号１９又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１～４の何れか一項に記載の抗ＫＬＢ抗体。
【請求項6】
重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含み、好ましくは、前記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１重鎖定常領域であり、前記軽鎖定常領域はヒトκ軽鎖定常領域であり、
より好ましくは、前記重鎖定常領域は配列番号２２のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖定常領域は配列番号２３のアミノ酸配列を含む、
請求項１～５の何れか一項に記載の抗ＫＬＢ抗体。
【請求項7】
重鎖及び軽鎖を含み、そのうち、ｉ）前記重鎖は配列番号７８に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号７９に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
ｉｉ）前記重鎖は配列番号８０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号８１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
ｉｉｉ）前記重鎖は配列番号２０に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号２１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項６に記載の抗ＫＬＢ抗体。
【請求項8】
重鎖及び軽鎖を含み、そのうち、ｉ）前記重鎖は配列番号７８のアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号７９のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）前記重鎖は配列番号８０のアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号８１のアミノ酸配列を含み、或いは
ｉｉｉ）前記重鎖は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖は配列番号２１のアミノ酸配列を含む、
請求項６に記載の抗ＫＬＢ抗体。
【請求項9】
ヒトＫＬＢ又はサルＫＬＢに対して請求項１～８の何れか一項に記載の抗ＫＬＢ抗体と競合的に結合する、単離した抗ＫＬＢ抗体。
【請求項10】
Ａ．前記抗ＫＬＢ抗体はｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現する細胞に活性化活性を有し、好ましくは、前記抗ＫＬＢ抗体のＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃへの活性化倍数は１０を超え、及び／又は前記抗ＫＬＢ抗体のＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞への活性化倍数は２を超えること、Ｂ．前記抗ＫＬＢ抗体はｈＦＧＦＲ１ｃを発現する組換え細胞への活性化活性が弱く、好ましくは、前記抗ＫＬＢ抗体のＨＥＫ２９３－ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞への活性化倍数は１未満であること、
Ｃ．前記抗ＫＬＢ抗体はｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及び／又はｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４を発現する細胞への活性化活性が弱く、好ましくは、前記抗ＫＬＢ抗体のＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４への活性化倍数は２未満であること、
Ｄ．前記抗ＫＬＢ抗体はヒトＫＬＢにもサルＫＬＢにも結合することができ、好ましくは、前記抗ＫＬＢ抗体は、２．０ Ｅ－９ Ｍ以下のＥＣ５０値でヒトＫＬＢ及びサルＫＬＢに結合することができ、前記ＥＣ５０値はフローサイトメトリー法により検出されること、及び
Ｅ．前記抗ＫＬＢ抗体はヒトＫＬＢに結合することができ、好ましくは、前記抗体は、３．０ Ｅ－９ Ｍ未満のＫＤ値でヒトＫＬＢに結合することができ、前記ＫＤ値はＢｉａｃｏｒｅ法によって検出されること、
という特徴の１つ以上を有する、請求項１～９の何れか一項に記載の抗ＫＬＢ抗体。
【請求項11】
医薬組成物であって、治療有効量の請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＫＬＢ抗体と、１種以上の薬学的に許容されるベクター、希釈剤、緩衝剤又は賦形剤とを含み、
好ましくは、少なくとも１種の第２の治療剤をさらに含む、
医薬組成物。
【請求項12】
請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＫＬＢ抗体をコードする、単離した核酸。
【請求項13】
請求項１２に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項14】
疾患を治療する方法であって、必要とする対象に治療有効量の請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＫＬＢ抗体又は請求項１１に記載の医薬組成物を投与するステップを含み、好ましくは、前記疾患はＦＧＦ２１及び／又はＦＧＦ１９に関連する疾患であり、
より好ましくは、前記疾患は、ＮＡＳＨ、２型糖尿病、肥満症、脂質異常症、心臓血管疾患及びメタボリック症候群から選ばれる、
方法。
【請求項15】
ＦＧＦ２１及び／又はＦＧＦ１９シグナル伝達を誘導する方法であって、ＫＬＢとＦＧＦＲを発現する細胞を請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＫＬＢ抗体と接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示はバイオテクノロジー分野に属し、より具体的に、本開示は抗ＫＬＢ抗体及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ここでの記載は、単に本開示に関連する背景情報を提供し、必ずしも従来技術を構成するものではない。
【0003】
ＫＬＢ（Ｋｌｏｔｈｏ－ｂｅｔａ、β－Ｋｌｏｔｈｏ）は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインからなるＫｌｏｔｈｏタンパク質ファミリーのメンバーの１つである。ＫＬＢは、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ１－４及びその可変切断体、例えば、ＦＧＦＲ１ｃ、ＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃを含むＦＧＦＲ）と一緒に、線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ、略称ＦＧＦ、例えば、ＦＧＦ１９及びＦＧＦ２１）の共通受容体として複合物を形成する。ＫＬＢは、ＦＧＦ２１／ＦＧＦ１９に対する細胞応答の決定基として、肝臓、脂肪細胞及び膵臓において高発現される（Ｋｕｒｏｓｕ，Ｈ． ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ『生化学雑誌』２８２，２６６８７－９５）。線維芽細胞増殖因子受容体は、細胞内チロシンキナーゼドメインを含み、当該ドメインは、リガンドに結合すると活性化されて、ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）、ＲＡＦ１、ＡＫＴ１及びＳＴＡＴなどを産生し、下流シグナル伝達経路を活性化する（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ，Ａ． ｅｔ ａｌ．（２００８）ＢｉｏＤｒｕｇｓ『生物薬剤』２２：３７－４４）。
【0004】
線維芽細胞増殖因子２１（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２１、ＦＧＦ２１）は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーの１つであり、肝臓及び膵臓において高発現される（Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄ Ｇｅｎｅｔ． ２０：５６３－６９）。ＦＧＦ２１は、Ｃ末端を介してＫＬＢに結合され、Ｎ末端がＦＧＦＲに結合して受容体－リガンド複合物を形成することで、ＦＧＦＲの下流のシグナル伝達経路を活性化する。様々な代謝関連標的器官（例えば、肝臓、脂肪組織、膵臓、ＣＮＳにおける副腎など）で研究した結果、ＦＧＦ２１は、ＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ、ＫＬＢ＆ＦＧＦＲ２ｃ及びＫＬＢ＆ＦＧＦＲ３ｃと複合物を形成することで、糖代謝、脂質代謝及びエネルギー消費を調節する役割を果たすことが示された。ＦＧＦ２１を過剰発現するトランスジェニックマウスは、低インスリン、低コレステロール及び低トリグリセリドを示し、インスリン感受性が向上して、高脂質食物による体重増加を抑制する（Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ１１５：１６２７－３５）。ＦＧＦ２１類似体（例えばＡＫＲ００１で、ＷＯ２０１０１２９５０３Ａ１中の配列番号４７を参照）は、肝臓脂肪を顕著に低減し、ＮＡＳＨ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎを向上させ、線維症を改善することなどができることが臨床実験において十分に確認された。
【発明の概要】
【0005】
本開示は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む抗ＫＬＢ抗体を構築し、そのうち、
（ｉ）上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４０～４８中の何れか１つの配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、又は上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉ）上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４９中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５６～６８中の何れか１つの配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、又は上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉｉ）上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１８中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１９中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
（ｉ）上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４０～４８中の何れか１つの配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３４のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、又は上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号２中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉ）上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４９中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５６～６８中の何れか１つの配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、又は上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉｉ）上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１８中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１９中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
【0006】
幾つかの実施形態において、ｉ）上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４０中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３４中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、又はｉｉ）上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４９中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号５７中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、又はｉｉｉ）上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１８中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号１９中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態において、上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３はそれぞれ配列番号４０中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はそれぞれ配列番号３４中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列を含む。
【0007】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３及び軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ及びＣｏｎｔａｃｔから選ばれる同じ番号付け規則によって定義される。幾つかの実施形態において、上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はＫａｂａｔ番号付け規則によって定義され、幾つかの実施形態において、上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はＩＭＧＴ番号付け規則によって定義され、幾つかの実施形態において、上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はＣｈｏｔｈｉａ番号付け規則によって定義され、幾つかの実施形態において、上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はＡｂＭ番号付け規則によって定義され、幾つかの実施形態において、上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、及び軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３はＣｏｎｔａｃｔ番号付け規則によって定義される。
【0008】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、そのうち、
ｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３７、３８、３９若しくは７のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号８のアミノ酸配列を含み、及び上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、或いは
ｉｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、及び上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号１５、６９、７０、７１、７２、７３若しくは７４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１６若しくは７５のアミノ酸配列を含み、及びＬＣＤＲ３が配列番号１７のアミノ酸配列を含み、或いは
ｉｉｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号２４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号２５のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含み、及び上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号２７のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２８のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
ｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３７、３８、３９若しくは７のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号８のアミノ酸配列を含み、及び上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、或いは
ｉｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、及び上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号１５、６９、７０、７１、７２、７３若しくは７４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１６若しくは７５のアミノ酸配列を含み、及びＬＣＤＲ３が配列番号１７のアミノ酸配列を含み、或いは
ｉｉｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号２４のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号２５のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号２６のアミノ酸配列を含み、及び上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号２７のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号２８のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号２９のアミノ酸配列を含む。
【0009】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、そのうち、
ｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３７のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号８のアミノ酸配列を含み、及び上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、或いは
ｉｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、及び上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号６９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号７５のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
ｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３７のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号８のアミノ酸配列を含み、及び上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、或いは
ｉｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、及び上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号６９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号７５のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
【0010】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３及び軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって定義される。
【0011】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、上記抗ＫＬＢ抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体である。幾つかの実施形態において、上記抗体はヒト抗体である。幾つかの実施形態において、上記抗体は完全ヒト抗体である。
【0012】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、そのうち、（ｉ）上記重鎖可変領域は配列番号４０、３０、３１、３２、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７若しくは４８、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は配列番号３４、３３、３５若しくは３６、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉ）上記重鎖可変領域は配列番号４９、５０若しくは５１、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は配列番号５７、５２、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７若しくは６８、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉｉ）上記重鎖可変領域は配列番号１８、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は配列番号１９、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｖ）上記重鎖可変領域は配列番号２、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は配列番号３、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｖ）上記重鎖可変領域は配列番号４、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は配列番号５、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
（ｉｉ）上記重鎖可変領域は配列番号４９、５０若しくは５１、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は配列番号５７、５２、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７若しくは６８、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉｉ）上記重鎖可変領域は配列番号１８、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は配列番号１９、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｖ）上記重鎖可変領域は配列番号２、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は配列番号３、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｖ）上記重鎖可変領域は配列番号４、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は配列番号５、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0013】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、上記抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域には、１、２４、４４、７１及び９１番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸復帰変異が含まれ、軽鎖可変領域のフレームワーク領域には、２、４、３６、３８、４３、４４及び５８番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸復帰変異が含まれる。幾つかの実施形態において、上記の抗ＫＬＢ抗体であって、そのうち、上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３７、３８、３９若しくは７のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号８のアミノ酸配列を含み、及び上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、上記抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域には、１Ｅ、２４Ｔ、４４Ｇ、７１Ｓ及び９１Ｆ（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸復帰変異が含まれ、及び／又は上記軽鎖可変領域のフレームワーク領域には、２Ｖ、４Ｉ、３６Ｆ、３８Ｅ、４３Ｔ、４４Ｎ及び５８Ｉ（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸復帰変異が含まれる。
【0014】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、上記抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域には、１、２４、４８、６７、６９、７１及び７３番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸変異が含まれ、軽鎖可変領域のフレームワーク領域には、２、４５、４７、４９、５８及び７１番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸復帰変異が含まれる。幾つかの実施形態において、上記の抗ＫＬＢ抗体であって、そのうち、上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、及び上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号１５、６９、７０、７１、７２、７３若しくは７４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１６若しくは７５のアミノ酸配列を含み、及びＬＣＤＲ３が配列番号１７のアミノ酸配列を含み、上記抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域には、１Ｅ、２４Ｇ、４８Ｉ、６７Ａ、６９Ｖ、７１Ｖ及び７３Ｋ（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸変異が含まれ、及び／又は上記軽鎖可変領域のフレームワーク領域には、２Ｎ、４５Ｋ、４７Ｗ、４９Ｙ、５８Ｖ及び７１Ｙ（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸復帰変異が含まれる。上記変異位点は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって番号付けされ、例えば、「２Ｎ」は２番目（Ｋａｂａｔ番号付け規則に応じて番号付けされる）の残基が「Ｎ」であることを示す。
【0015】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、そのうち、
（ｉ）上記重鎖可変領域は、配列番号４０、３０、３１、３２、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７若しくは４８の何れか１つの配列、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号３４、３３、３５若しくは３６の何れか１つの配列、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉ）上記重鎖可変領域は、配列番号４９、５０若しくは５１の何れか１つの配列、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号５７、５２、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７若しくは６８の何れか１つの配列、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉｉ）上記重鎖可変領域は、配列番号１８、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号１９、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｖ）上記重鎖可変領域は、配列番号２、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号３、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｖ）上記重鎖可変領域は、配列番号４、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号５、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
（ｉ）上記重鎖可変領域は、配列番号４０、３０、３１、３２、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７若しくは４８の何れか１つの配列、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号３４、３３、３５若しくは３６の何れか１つの配列、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉ）上記重鎖可変領域は、配列番号４９、５０若しくは５１の何れか１つの配列、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号５７、５２、５３、５４、５５、５６、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７若しくは６８の何れか１つの配列、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉｉ）上記重鎖可変領域は、配列番号１８、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号１９、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｖ）上記重鎖可変領域は、配列番号２、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号３、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｖ）上記重鎖可変領域は、配列番号４、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号５、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0016】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、そのうち、
（ｉ）上記重鎖可変領域は、配列番号４０、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号３４、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｉｉ）上記重鎖可変領域は、配列番号４９、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号５７、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉｉ）上記重鎖可変領域は、配列番号１８、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号１９、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
（ｉ）上記重鎖可変領域は、配列番号４０、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号３４、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
（ｉｉ）上記重鎖可変領域は、配列番号４９、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号５７、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉｉ）上記重鎖可変領域は、配列番号１８、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号１９、又はそれに対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0017】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、そのうち、上記重鎖可変領域は、配列番号４０のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖可変領域は、配列番号３４のアミノ酸配列を含む。
【0018】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、それは重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を含み、幾つかの実施形態において、上記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ重鎖定常領域であり、幾つかの実施形態において、上記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４重鎖定常領域であり、幾つかの実施形態において、上記軽鎖定常領域はヒトλ、κ軽鎖定常領域であり、幾つかの実施形態において、上記重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１重鎖定常領域であり、上記軽鎖定常領域はヒトκ軽鎖定常領域であり、幾つかの実施形態において、上記重鎖定常領域のＦｃ領域は、Ｆｃ領域とＦｃ受容体の結合を低下させることができる１つ以上のアミノ酸置換を有する。幾つかの実施形態において、上記Ｆｃ領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異、Ｓ２２８Ｐ変異及び／又はＹＴＥ変異（Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６Ｅ）を有し、上記変異は、ＥＵインデックスによって番号付けされる。幾つかの実施形態において、上記重鎖定常領域は配列番号２２のアミノ酸配列を含み、上記軽鎖定常領域は配列番号２３のアミノ酸配列を含む。
【0019】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、上記抗ＫＬＢ抗体は重鎖及び軽鎖を含み、そのうち、
（ｉ）上記重鎖は、配列番号７８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖は、配列番号７９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉ）上記重鎖は、配列番号８０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖は、配列番号８１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉｉ）上記重鎖は、配列番号２０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖は、配列番号２１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
（ｉ）上記重鎖は、配列番号７８に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖は、配列番号７９に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉ）上記重鎖は、配列番号８０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖は、配列番号８１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、或いは
（ｉｉｉ）上記重鎖は、配列番号２０に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖は、配列番号２１に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0020】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、上記抗ＫＬＢ抗体は重鎖及び軽鎖を含み、そのうち、（ｉ）上記重鎖は配列番号７８のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖は配列番号７９のアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）上記重鎖は配列番号８０のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖は配列番号８１のアミノ酸配列を含み、又は（ｉｉｉ）上記重鎖は配列番号２０のアミノ酸配列を含み、且つ上記軽鎖は配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【0021】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、上記抗ＫＬＢ抗体は抗原結合断片であり、幾つかの実施形態において、上記抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ及び二重抗体から選ばれる。
【0022】
幾つかの実施形態において、本開示は、ヒト及び／又はサルＫＬＢに対して上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体と競合的に結合する、単離した抗ＫＬＢ抗体を提供し、幾つかの実施形態において、本開示は、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体と同じ抗原エピトープに結合する、単離した抗ＫＬＢ抗体を提供する。
【0023】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、上記抗ＫＬＢ抗体は、
Ａ．上記抗ＫＬＢ抗体はｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現する細胞に活性化活性を有し、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体はｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現する細胞に高い活性化活性を有し、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現するＣＨＯＫ１細胞への活性化倍数が１０を超え、及び／又は上記抗ＫＬＢ抗体は、ＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞への活性化倍数が２を超え、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数はブランク対照に対する抗体の活性化倍数であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数は、本開示の試験例４、５の方法により検出されること、
Ｂ．上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＦＧＦＲ１ｃを発現する組換え細胞（ｈＦＧＦＲ１ｃのみで、ｈＫＬＢを発現しない）への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、ＨＥＫ２９３－ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞への活性化倍数が１未満であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数はブランク対照に対する抗体の活性化倍数であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数は本開示の試験例６の方法により検出されること、
Ｃ．上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及びｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４を発現する細胞への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が２未満であり、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が２未満であり、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃとＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が２未満であり、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ細胞への活性化倍数が５未満であり、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ細胞への活性化倍数が１．４未満であり、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が１．６未満であり、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ細胞への活性化倍数が５未満であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数はブランク対照に対する抗体の活性化倍数であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数は本開示の試験例７の方法により検出されること、
Ｄ．上記抗ＫＬＢ抗体はヒトＫＬＢにもサルＫＬＢにも結合することができ、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は２．０ Ｅ－９ Ｍ未満のＥＣ５０値でヒト及び／又はサルＫＬＢに結合することができ、上記ＥＣ５０値はフローサイトメトリー法により検出されること、及び
Ｅ．上記抗ＫＬＢ抗体は高親和性でヒトＫＬＢに結合することができ、幾つかの実施形態において、上記抗体は３．０ Ｅ－９ Ｍ未満のＫＤ値でヒトＫＬＢに結合することができ、上記ＫＤ値はＢｉａｃｏｒｅ方法により検出されること、
という特徴の１つ以上を有する。
Ａ．上記抗ＫＬＢ抗体はｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現する細胞に活性化活性を有し、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体はｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現する細胞に高い活性化活性を有し、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現するＣＨＯＫ１細胞への活性化倍数が１０を超え、及び／又は上記抗ＫＬＢ抗体は、ＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞への活性化倍数が２を超え、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数はブランク対照に対する抗体の活性化倍数であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数は、本開示の試験例４、５の方法により検出されること、
Ｂ．上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＦＧＦＲ１ｃを発現する組換え細胞（ｈＦＧＦＲ１ｃのみで、ｈＫＬＢを発現しない）への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、ＨＥＫ２９３－ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞への活性化倍数が１未満であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数はブランク対照に対する抗体の活性化倍数であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数は本開示の試験例６の方法により検出されること、
Ｃ．上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及びｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４を発現する細胞への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が２未満であり、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が２未満であり、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃとＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が２未満であり、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ細胞への活性化倍数が５未満であり、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ細胞への活性化倍数が１．４未満であり、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が１．６未満であり、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ細胞への活性化倍数が５未満であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数はブランク対照に対する抗体の活性化倍数であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数は本開示の試験例７の方法により検出されること、
Ｄ．上記抗ＫＬＢ抗体はヒトＫＬＢにもサルＫＬＢにも結合することができ、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は２．０ Ｅ－９ Ｍ未満のＥＣ５０値でヒト及び／又はサルＫＬＢに結合することができ、上記ＥＣ５０値はフローサイトメトリー法により検出されること、及び
Ｅ．上記抗ＫＬＢ抗体は高親和性でヒトＫＬＢに結合することができ、幾つかの実施形態において、上記抗体は３．０ Ｅ－９ Ｍ未満のＫＤ値でヒトＫＬＢに結合することができ、上記ＫＤ値はＢｉａｃｏｒｅ方法により検出されること、
という特徴の１つ以上を有する。
【0024】
幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現する細胞に高い活性化活性を有し、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及びｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４を発現する細胞に弱い活性化活性を有し、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現するＣＨＯＫ１細胞への活性化倍数が１０を超え、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が２未満であり、上記活性化倍数はブランク対照に対する抗体の活性化倍数である。
【0025】
別の態様において、本開示は、治療有効量の上記の抗ＫＬＢ抗体と、１種以上の薬学的に許容されるベクター、希釈剤、緩衝剤又は賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0026】
別の態様において、本開示は、上記の抗ＫＬＢ抗体をコードする、単離した核酸を提供する。
【0027】
別の態様において、本開示は、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。
【0028】
別の態様において、本開示は、上記の核酸を含む宿主細胞を提供する。
【0029】
別の態様において、本開示は、疾患を治療する方法を提供し、上記方法は、対象に上記の抗ＫＬＢ抗体又は医薬組成物を投与するステップを含む。
【0030】
別の態様において、本開示は、疾患を治療する薬剤の調製における上記の抗ＫＬＢ抗体又は医薬組成物の使用をさらに提供する。
【0031】
別の態様において、本開示は、薬剤として用いられる上記の抗ＫＬＢ抗体又は医薬組成物をさらに提供し、幾つかの実施形態において、上記薬剤は疾患の治療に用いられる。
【0032】
幾つかの実施形態において、本開示は、ヒトＦＧＦ２１及び／又はヒトＦＧＦ１９に関連する疾患、病状又は病態を治療する方法を提供し、上記方法は、対象（例えば、患者）に治療有効量の上記の抗ＫＬＢ抗体又は医薬組成物を与えることを含む。
【0033】
幾つかの実施形態において、上記の疾患は、ＦＧＦ２１及び／又はＦＧＦ１９に関連する病状である。幾つかの実施形態において、上記病状は、代謝性病状、内分泌病状及び心臓血管病状から選ばれる。幾つかの実施形態において、上記病状は、肥満、糖尿病（１型糖尿病、２型糖尿病）、膵臓炎、脂質異常症、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、インスリン抵抗性、高インスリン血症、耐糖能異常、高血糖、メタボリック症候群、急性心筋梗塞、高血圧、アテローム性動脈硬化、末梢動脈疾患、脳卒中、心不全、冠動脈性心疾患、腎臓疾患、糖尿病合併症、神経系の疾患及び胃不全麻痺から選ばれる。幾つかの実施形態において、上記疾患は、２型糖尿病、肥満症、脂質異常症、ＮＡＳＨ、心臓血管疾患及びメタボリック症候群からなる群から選ばれる。幾つかの実施形態において、上記疾患は、非アルコール性脂肪性肝炎である。
【0034】
別の態様において、本開示は、ＦＧＦ２１及び／又はＦＧＦ１９シグナル伝達を誘導する方法をさらに提供し、上記方法は、ＫＬＢとＦＧＦＲを発現する細胞を上記の抗ＫＬＢ抗体と接触させることを含む。
【発明を実施するための形態】
【0035】
用語
本開示がさらに容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を説明する。本明細書で特に明確な定義のない限り、本明細書に使用される技術・科学用語の全ては、当業者に一般的に理解された意味と同じ意味を持っている。
本開示がさらに容易に理解されるように、以下、幾つかの技術・科学用語を説明する。本明細書で特に明確な定義のない限り、本明細書に使用される技術・科学用語の全ては、当業者に一般的に理解された意味と同じ意味を持っている。
【0036】
明細書及び特許請求の範囲に用いられる単数形である「１つ」、「１種」及び「上記」は、文脈でそうではないと明記しない限り、複数の指示対象を含む。
【0037】
文脈で特に明記のない限り、特許の明細書と特許請求の範囲において、「含有する」、「有する」、「含む」という言葉などは、排他的又は網羅的な意味ではなく、「含むが、これらに限定されない」という意味として理解すべきである。
【0038】
「及び／又は」という用語は、「及び」と「又は」という２つの意味を含むことを指す。例えば、「Ａ、Ｂ及び／又はＣ」という語句は、Ａ、ＢとＣ、Ａ、Ｂ又はＣ、Ａ又はＣ、Ａ又はＢ、Ｂ又はＣ、ＡとＣ、ＡとＢ、ＢとＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）、及びＣ（単独）のうちの何れか１つをカバーすることを意図する。
【0039】
本開示に用いられるアミノ酸の３文字コード及び１文字コードは、Ｊ．ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ，２４３，ｐ３５５８（１９６８）に記載された通りである。
【0040】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸と合成したアミノ酸、及び天然に存在するアミノ酸と同じように作用するアミノ酸類似体とアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コドンによってコードされるアミノ酸、及び後に修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタミン酸とＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（即ち、水素、カルボキシ基、アミノ基及びＲ基に結合したα炭素）を有する化合物を指し、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じように作用する化学化合物を指す。
【0041】
「アミノ酸変異」という用語は、アミノ酸置換（アミノ酸置き換えともいう）、欠失、挿入と修飾を含む。最終構築体がＦｃ受容体への結合を低減するなどの所望の特性を有すれば、置換、欠失、挿入と修飾の任意の組み合わせを行うことにより、最終構築体を実現することができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入は、ポリペプチド鎖のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端での欠失と挿入を含む。具体的なアミノ酸変異は、アミノ酸置換であってもよい。一実施形態において、アミノ酸変異は、非保存的アミノ酸置換であり、即ち、１つのアミノ酸を異なる構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸で置き換える。アミノ酸置換は、天然に存在しないアミノ酸又は２０種の天然アミノ酸の誘導体（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）による置き換えを含む。アミノ酸変異は、この分野で公知の遺伝学的又は化学的方法により生成することができる。遺伝学的方法は、部位特異的変異導入、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含んでもよい。遺伝子工学以外のアミノ酸側鎖基を改変する方法、例えば、化学修飾も利用可能であろうと予測される。本明細書では、様々な名称で同一のアミノ酸変異を示すことができる。本明細書では、位置＋アミノ酸残基という方式で特定の部位でのアミノ酸残基を示すことができ、例えば、３６６Ｗは、３６６部位でのアミノ酸残基がＷであることを示す。Ｔ３６６Ｗは、３６６番目の部位でのアミノ酸残基が元のＴからＷへ変異したことを示す。
【0042】
「抗体」という用語は、所望の抗原結合活性を示せば、最も広い意味で使用され、且つ種々の抗体構造をカバーしており、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、全長抗体と抗体断片（又は抗原結合断片、又は抗原結合部分）を含むが、これらに限定されない。「天然抗体」とは、天然に存在する免疫グロブリン分子である。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合で結合した２本の同じ軽鎖と２本の同じ重鎖から構成される。Ｎ末端からＣ末端へ、それぞれの重鎖には、可変重鎖ドメイン、重鎖可変領域とも呼ばれる可変領域（ＶＨ）が１つあり、その次は重鎖定常領域（ＣＨ）であり、天然ＩｇＧ重鎖定常領域は、一般的に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含む。同様に、Ｎ末端からＣ末端へ、それぞれの軽鎖には、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）が１つあり、その次は１つの定常軽鎖ドメイン（軽鎖定常領域、ＣＬ）である。「全長抗体」、「完全抗体」と「全抗体」という用語は、本明細書で入れ替えて使用されてもよく、天然抗体の構造とほぼ類似の構造を有し、又は本明細書に限定されるようなＦｃ領域の重鎖を有する抗体を指す。天然完全抗体の軽鎖は、軽鎖可変領域ＶＬ及び定常領域ＣＬを含み、ＶＬは軽鎖のアミノ末端にあり、軽鎖定常領域はκ鎖及びλ鎖を含み、重鎖は可変領域ＶＨ及び定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を含み、ＶＨは重鎖のアミノ末端（Ｎ末端ともいう）にあり、定常領域はカルボキシ末端（Ｃ末端ともいう）にあり、そのうち、ＣＨ３はポリペプチドのカルボキシ末端に最も近く、重鎖は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブタイプを含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１とＩｇＡ２サブタイプを含む）、ＩｇＭ及びＩｇＥを含む任意のアイソタイプに属してもよい。
【0043】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体における抗原に結合するドメインを指す。本明細書において、重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬは、４つの保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）をそれぞれ含む。「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、可変ドメインにおける抗原との結合を主に促進する領域を指し、「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、ＣＤＲ残基を除く可変ドメイン残基を指す。ＶＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３という３つのＣＤＲ領域を含み、ＶＬは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３という３つのＣＤＲ領域を含む。それぞれのＶＨ及びＶＬは、アミノ末端（Ｎ末端ともいう）からカルボキシ末端（Ｃ末端ともいう）へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４という順に配列された３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなる。それぞれのＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４という順に配列された３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなる。抗体によっては、単一のＶＨ又はＶＬは、抗原結合特異性を十分に付与することが可能である。
【0044】
ＣＤＲのアミノ酸配列の境界は、様々な公知の方案、例えば、「Ｋａｂａｔ」番号付け規則（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、５ｔｈ ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤを参照）、「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付け規則、「ＡＢＭ」番号付け規則、「ｃｏｎｔａｃｔ」番号付け規則（Ｍａｒｔｉｎ、ＡＣＲ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓ［Ｊ］．２００１を参照）及びＩｍＭｕｎｏＧｅｎＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）番号付け規則（Ｌｅｆｒａｎｃ、Ｍ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖ． Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７、５５－７７（２００３）、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１８ Ｏｃｔ １６、９：２２７８）などによって決定することができ、様々な番号付けシステム間の対応関係は当業者によく知られているものであり、例示的に、下記の表１に示す通りである。
【0045】
【表1】
【0046】
「抗体断片」又は「抗原結合断片」という用語は、完全抗体とは異なる分子を指し、完全抗体の結合する抗原に結合する、完全抗体の一部を含む。抗体断片の実例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、二重抗体、線形抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、及び抗体断片からなる多重特異性抗体を含むが、これらに限定されない。
【0047】
「Ｆｃ領域」又は「断片結晶化可能領域」という用語は、抗体重鎖のＣ末端領域を定義するためであり、天然Ｆｃ領域及び改変されたＦｃ領域を含む。幾つかの実施形態において、Ｆｃ領域は、同一又は異なる２つのサブユニットを含む。幾つかの実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６位置でのアミノ酸残基から、又はＰｒｏ２３０からそのカルボキシ末端へ延びると定義される。本明細書に記載される抗体に用いられる好適なＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３とＩｇＧ４のＦｃ領域を含む。幾つかの実施形態において、Ｆｃ領域の境界は変えてもよく、例えば、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）の欠失、又はＦｃ領域のＣ末端グリシンとリジン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４６と４４７）の欠失である。特に説明のない限り、Ｆｃ領域の番号付け規則はＥＵ番号付けシステムであり、ＥＵインデックスとも呼ばれる。
【0048】
「キメラ」抗体という用語は、抗体における重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種から誘導されるが、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が他の異なる供給源又は種から誘導される抗体を指す。
【0049】
「ヒト化」抗体という用語は、非ヒト抗体の反応性を保持するとともに、ヒトにおいて比較的低い免疫原性を有する抗体である。例えば、非ヒトＣＤＲ領域を保持し、そのヒト対応物（即ち、定常領域及び可変領域のフレームワーク領域部分）で抗体の残りの部分を置き換えることにより達成してもよい。
【0050】
「ヒト抗体」、「ヒト化抗体」、「全ヒト抗体」、「完全ヒト抗体」という用語は入れ替えて使用されてもよく、可変領域及び定常領域がヒト配列である抗体を指す。当該用語は、ヒト遺伝子に由来するが、例えば、可能性のある免疫原性の低減、親和性の増加、望ましくないフォールディングを引き起こし得るシステイン又はグリコシル化部位の除去などを有する、配列が変化した抗体をカバーしている。当該用語は、非ヒト細胞（ヒト細胞の特徴を有しないグリコシル化を付与し得る）において組換えて産生されるような抗体をカバーしている。当該用語は、幾つか又は全てのヒト免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖遺伝子座を含むトランスジェニックマウスで既に飼育された抗体もカバーしている。ヒト抗体の定義には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が明確に除外されている。
【0051】
「親和性」という用語は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合リガンド（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の全強度を指す。特に明記のない限り、本明細書に使用されるように、結合「親和性」は、内部結合親和性を指し、結合ペア（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する。分子ＸによるそのリガンドＹへの親和性は、一般的に、解離定数（ＫＤ）で示すことができる。親和性は、当該分野で既知の通常の方法（本明細書に記載されるような方法を含む）により測定することができる。
【0052】
本明細書に使用されるように、「ｋａｓｓｏｃ」又は「ｋａ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指し、「ｋｄｉｓ」又は「ｋｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指す。「ＫＤ」という用語は解離定数を指し、ｋｄとｋａの比率（即ち、ｋｄ／ｋａ）から得られ、且つモル濃度（Ｍ）で示される。この分野で公知の方法により抗体のＫＤ値を測定することができる。例えば、表面プラズモン共鳴をシステムなどのバイオセンシングシステムによって測定し、又は溶液平衡滴定法（ＳＥＴ）によって溶液中の親和性を測定する。幾つかの実施形態において、ＫＤ値は、Ｂｉａｃｏｒｅにより検出される。
【0053】
「エフェクター機能」という用語は、抗体Ｆｃ領域（天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列が変異したＦｃ領域）によるものとすることができるとともに、抗体のアイソタイプによって変えられる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合と補体依存性細胞傷害性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、貪食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、及びＢ細胞の活性化を含むが、これらに限定されない。
【0054】
「抗体依存性細胞の細胞傷害性」、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」又は「ＡＤＣＣ」という用語は、細胞死を誘導するメカニズムであり、当該メカニズムは、抗体で被覆した標的細胞と溶解活性を有するエフェクター細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、単球、マクロファージ細胞及び好中球）との、エフェクター細胞に発現されたＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）により発生された相互作用に依存する。例えば、ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩａを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩａを発現する。本明細書により提供される抗体のＡＤＣＣ活性は、インビトロ測定により、抗原を発現した細胞を標的細胞として、ＮＫ細胞をエフェクター細胞として利用して評価することができる。溶解した細胞から放出された標識（例えば、放射性基質、蛍光染料又は天然細胞内タンパク質）によって細胞溶解を検出する。
【0055】
「抗体依存性細胞貪食作用」（「ＡＤＣＰ」）という用語は、貪食細胞（例えば、マクロファージ細胞又は樹状細胞）のエンドサイトーシスによって、抗体で被覆した標的細胞を除去するメカニズムを指す。
【0056】
「補体依存性細胞傷害性」又は「ＣＤＣ」という用語は、細胞死を誘導するメカニズムを指し、ここで、標的結合抗体のＦｃエフェクタードメインが補体成分Ｃ１ｑに結合して活性化し、Ｃ１ｑがさらに補体カスケードを活性化することにより、標的細胞の死亡を引き起こす。補体の活性化により、補体成分の標的細胞表面における堆積を引き起こすこともでき、これらの補体成分は、白血球における補体受容体（例えば、ＣＲ３）に結合することによりＣＤＣを促進する。
【0057】
「モノクローナル抗体」という用語は、基本的に均質な抗体の群を指し、即ち、当該群に含まれる抗体分子のアミノ酸配列は、少量に存在可能な天然変異を除き、同じである。それに対して、ポリクローナル抗体製剤は通常、その可変ドメインにおいて、一般的に異なるエピトープに特異的である異なるアミノ酸配列を有する複数の異なる抗体を含む。「モノクローナル」は、基本的に均質な抗体群から得られる抗体の特徴を表し、任意の特定の方法により抗体を産生しなければならないと解釈すべきではない。幾つかの実施形態において、本開示により提供される抗体は、モノクローナル抗体である。
【0058】
「抗原」という用語は、例えば抗原結合タンパク質（例えば、抗体を含む）などの選択的結合剤によって結合することができ、さらに、当該抗原に結合可能な抗体が産生されるように動物に使用することができる分子又は分子部分を指す。抗原は、異なる抗原結合タンパク質（例えば、抗体）と相互作用することができる１つ又は複数のエピトープを有してもよい。
【0059】
「エピトープ」という用語は、抗体又はその抗原結合断片と特異的に結合可能な抗原上の領域（ａｒｅａ又はｒｅｇｉｏｎ）を指す。エピトープは、連続的なアミノ酸列（線状エピトープ）によって形成され、又は、例えば抗原のフォールディング（即ち、タンパク質の性質による抗原の三次フォールディング）により空間的に近接した非連続的なアミノ酸（配座エピトープ）を含んでもよい。配座エピトープと線状エピトープは、変性溶媒の存在で、抗体の配座エピトープへの結合が失われるという点で異なっている。エピトープは、独特な空間配座にある少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、又は８～１０個のアミノ酸を含む。特定のエピトープに結合する抗体（即ち、同じエピトープに結合するようなもの）のスクリーニングは、この分野における通常の方法により行うことができ、例えば、アラニンスキャンニング、ペプチドブロット、ペプチド切断解析、エピトープ切除、エピトープ抽出、抗原の化学修飾（Ｐｒｏｔ． Ｓｃｉ． ９（２０００）４８７－４９６を参照）及び交差阻害が挙げられるが、これらに限定されない。
【0060】
「特異的に結合可能」、「特異的に結合」又は「結合」という用語は、他の抗原又はエピトープに比べて、抗体（例えば、抗ＫＬＢ抗体）がより高い親和性で、ある抗原又は当該抗原内のエピトープに結合することができることを指す。一般的に、抗体は、約１×１０－７ Ｍ以下（例えば、約１×１０－８ Ｍ以下）の平衡解離定数（ＫＤ）で抗原又は抗原内のエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、抗体の抗原に結合するＫＤは、当該抗体の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）に結合するＫＤの１０％以下（例えば、１％）である。ＫＤは、既知の方法により測定することができ、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴測定法により測定される。しかし、抗原又は抗原内のエピトープに特異的に結合する抗体は、他の関連する抗原に交差反応性を有する可能性があり、例えば、他の種（ホモ）（例えば、ヒト、又はカニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ、ｃｙｎｏ）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）（ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ、ｃｈｉｍｐ）などのサル）又はマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）（ｃｏｍｍｏｎｍａｒｍｏｓｅｔ、ｍａｒｍｏｓｅｔ）由来の対応する抗原に対して交差反応性を有する。
【0061】
「核酸」という用語は、本明細書において「ポリヌクレオチド」という用語と入れ替えて使用されてもよく、且つ単鎖若しくは二本鎖の形態を呈するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそのポリマーを指す。上記用語は、既知のヌクレオシド類似体又は修飾した骨格残基若しくはリンカーを含む核酸をカバーし、上記核酸は合成した、天然に存在する、及び天然に存在しないものであり、参照核酸と類似の結合特性を有するとともに、参照ヌクレオシドと類似する方式で代謝される。このような類似体の実例は、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスフェート、キラル－メチルホスフェート、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）を含むが、これらに限定されない。「単離した」核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離した核酸は、下記の細胞に含まれる核酸分子を含み、上記細胞は一般的に当該核酸分子を含むが、当該核酸分子は染色体外に存在し、又はその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。抗ＫＬＢ抗体をコードする単離した核酸は、抗ＫＬＢ抗体をコードする１つ以上の核酸分子を指し、単一のベクター又は別個のベクターにある１つ以上の核酸分子と、宿主細胞における１つ以上の位置に存在する１つ以上の核酸分子とを含む。特に説明のない限り、特定の核酸配列は、その保存的に修飾された変異体（例えば、縮重コドン置換）と相補配列、及び明記した配列も暗黙的にカバーしている。具体的に、以下詳述するように、縮重コドン置換は、１つ又は複数の選ばれた（又は全ての）コドンの３番目が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を産生することにより得ることができる。
【0062】
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書で入れ替えて使用されてもよく、アミノ酸残基のポリマーを指す。当該用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマー、及び天然に存在するアミノ酸ポリマーと天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用可能である。特に説明のない限り、特定のポリペプチド配列は、その保存的に修飾された変異体をさらに暗黙的にカバーしている。
【0063】
配列「同一性」という用語は、２つの配列に対して最適アラインメントを行う場合、最大の配列同一性の百分率が得られるように、必要に応じてギャップを導入し、且つ何れの保存的置換も配列同一性の一部とは見なさず、２つの配列のアミノ酸／核酸が等価位置で同じ程度（百分率）であることを指す。配列同一性の百分率を測定するために、アラインメントは、この分野の技術で知られている技術、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ－２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に取得可能なコンピュータソフトウェアにより、実現することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、測定アラインメントに適用されるパラメータを決定することができる。
【0064】
「融合」又は「連結」という用語は、要素（例えば、Ｆｖ中のＶＨとＶＬ）が直接的に、或いは１つ又は複数のリンカーを介して共有結合で連結されることを指す。
【0065】
「ベクター」という用語は、それに連結された別のポリヌクレオチドを輸送可能なポリヌクレオチド分子を指す。１種類のベクターは「プラスミド」であり、付加されたＤＮＡセグメントに連結可能な環状二本鎖ＤＮＡ環を指す。もう１種類のベクターはウィルスベクターであり、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ又はＡＡＶ２）であり、その中で、別のＤＮＡセグメントがウィルスゲノムに連結可能である。あるベクターは、それらが導入された宿主細胞において自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーマル哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入された後、宿主細胞のゲノムに整合されることで、宿主ゲノムとともに複製することができる。「発現ベクター」又は「発現構築体」という用語は、宿主細胞を形質転換することができ、且つ（宿主細胞とともに）それと操作可能に連結された１つ又は複数のヘテロコード領域の発現を指導及び／又は制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現構築物は、転写、翻訳を影響又は制御し、且つイントロンの存在下でそれに操作可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングを影響する配列を含んでもよいが、これらに限定されない。
【0066】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」と「宿主細胞培養物」という用語は、入れ替えて使用されてもよく、且つ外因性核酸が導入された細胞を指し、このような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代数を考慮せず、初代の形質転換された細胞及びそれより誘導された子孫を含む。子孫は、核酸内容物において親細胞と全く同じではなくてもよいが、変異を含んでもよい。本明細書において、初期形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体の子孫を含む。宿主細胞は、原核及び真核宿主細胞を含み、そのうち、真核宿主細胞は、哺乳動物細胞、昆虫細胞株の植物細胞及び真菌細胞を含むが、これらに限定されない。哺乳動物宿主細胞は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマとハムスター細胞を含み、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞がん細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞とＨＥＫ－２９３細胞を含むが、これらに限定されない。真菌細胞は、酵母と糸状菌細胞を含み、例えば、ピチアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピチア・フィンランディカ（Ｐｉｃｈｉａ ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ）、ピチア・トレハロフィラ（Ｐｉｃｈｉａ ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ）、ピチア・コクラメ（Ｐｉｃｈｉａ ｋｏｃｌａｍａｅ）、ピチア・メンブラネファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）、ピチア・ミヌタ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｉｎｕｔａ）（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、ピチアオプンチエ（Ｐｉｃｈｉａｏｐｕｎｔｉａｅ）、ピチア・サーモトレランス（Ｐｉｃｈｉａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、ピチア・サリクタリア（Ｐｉｃｈｉａ ｓａｌｉｃｔａｒｉａ）、Ｐｉｃｈｉａ ｇｕｅｒｃｕｕｍ、ピチア・ピエペリ（Ｐｉｃｈｉａ ｐｉｊｐｅｒｉ）、ピチア・スティプティス（Ｐｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｔｉｓ）、ピチア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピチア属、サッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス属、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クライベロミセス属、クライベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ルックノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）、フザリウム・グラミネウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ ｐａｔｅｎｓ）及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）、ピキア属、任意のサッカロミセス属、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、任意のクライベロミセス属、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、任意のアスペルギルス属、トリコデルマ・レーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、クリソスポリウム・ラクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、任意のフザリウム属、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）及びアカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）を含む。
【0067】
本願に使用されるように、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という表現は、入れ替えて使用されてもよく、且つこのような名称の全ては子孫を含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」という用語は、継代数にかかわらず、初代対象細胞及びそれに由来する培養物を含む。さらに、意図的又は非意図的な変異のために、何れの子孫も完全に同じＤＮＡ内容物を有するわけではないと理解すべきである。それをスクリーニングした初期形質転換細胞と同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫を含む。
【0068】
「任意選択的」又は「任意選択的に」は、その後に説明される事象又は状況が生じてもよいが、必ずしも生じなくてもよいことを意味し、この説明は、当該事象又は状況が生じる場合と生じない場合を含む。
【0069】
「医薬組成物」という用語は、１種又は複数種の本明細書に記載の抗ＫＬＢ抗体と他の化学成分とを含む混合物を示し、上記他の成分は、例えば、生理学的／薬学的に許容されるベクター及び賦形剤である。
【0070】
「薬学的に許容されるベクター」という用語は、薬学的配合剤において活性成分とは異なり、対象に無毒な成分を指す。薬学的に許容されるベクターは、緩衝剤、賦形剤、安定剤又は防腐剤を含むが、これらに限定されない。
【0071】
「対象」又は「個体」という用語は、ヒト及び非ヒト動物を含む。非ヒト動物は、全ての脊椎動物（例えば、哺乳動物及び非哺乳動物）、例えば、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類及び爬虫類動物を含む。指摘のない限り、「患者」又は「対象」という上記用語は、本明細書において入れ替えて使用されてもよい。本明細書に使用するように、「カニクイザル（ｃｙｎｏ）」又は「カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）」という用語は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を指す。ある実施形態において、個体又は対象はヒトである。
【0072】
「投与」又は「与える」は、動物、ヒト、実験の対象、細胞、組織、臓器や生体流体に適用される場合に、外因性薬物、治療剤、診断薬又は組成物と動物、ヒト、対象、細胞、組織、臓器や生体流体との接触を指す。
【0073】
「試料」という用語は、対象から単離された流体、細胞又は組織と類似する採取物、及び対象の体内に存在する流体、細胞又は組織を指す。例示的な試料は生体流体であり、例えば、血液、血清と漿膜液、血漿、リンパ液、尿液、唾液、嚢胞液、涙液、排せつ物、痰、分泌組織と臓器の粘膜分泌物、膣分泌物、腹水、胸膜、心膜、腹膜、腹腔と他の体腔の流体、気管支洗浄液から収集された流体、滑液、対象若しくは生体源に接触した液体溶液、例えば、細胞と臓器培地（細胞又は臓器馴化培地を含む）、洗浄液など、組織生検試料、細針吸引組織、手術で切除した組織、臓器培養物又は細胞培養物である。
【0074】
「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ又はｔｒｅａｔ）」及び「処理」（及びその文法的変形）は、治療される個体の自然過程の変更を図る臨床的介入を指し、且つ予防のために、又は臨床病理学的プロセスにおいて実施することができる。治療の所望の効果は、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の軽減／減少、転移の予防、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善又は軽減、及び予後の退縮又は改善を含むが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、本開示の抗体を使用することで、疾患の形成を遅延させるか、又は疾患の進行を遅延させる。幾つかの実施形態において、本開示の抗ＫＬＢ抗体（ヒト及び／又はカニクイザルＫＬＢに結合する抗体を含む）は、ＦＧＦ２１及び／又はＦＧＦ１９のインビボでの作用を模倣し、ＦＧＦ２１様シグナル伝達及び／又はＦＧＦ１９様シグナル伝達を誘導するユニークな特性を有し、幾つかの実施形態において、上記抗体は、ＦＧＦ２１の天然生物学的機能に一致する活性を示す。このような特性により、抗ＫＬＢ抗体は、ＦＧＦ２１及び／又はＦＧＦ１９に関連する代謝疾患、例えば、２型糖尿病、肥満症、脂質異常症、ＮＡＳＨ、心臓血管疾患、メタボリック症候群の治療への適用、並びにＦＧＦ１９及び／又はＦＧＦ２１のインビボでの作用を模倣又は増強する必要のある任意の疾患、病状又は病態の治療への適用が可能になる。
【0075】
「有効量」は、一般的に、症状の重症度及び／又は頻度の低減、これらの症状及び／又は潜在的な原因の排除、症状及び／又はその潜在的な原因の出現の予防、及び／又は疾患状態によるか若しくはそれに関連する損傷（例えば、肺疾患）の改良若しくは改善に十分な量である。幾つかの実施例において、有効量は、治療有効量又は予防有効量である。「治療有効量」は、疾患の状態若しくは症状、特に当該疾患の状態に関連する状態若しくは症状の治療、又は他の方式による当該疾患の状態若しくは当該疾患に関連する任意の他の望ましくない症状の進行の予防、阻害、遅延若しくは逆転に十分な量である。「予防有効量」は、対象に与えると、当該疾患状態の発症（又は再発）の予防若しくは遅延、又は当該疾患状態若しくは関連症状の発症（又は再発）可能性の低減などの所定の予防効果が付与される量である。完全治療又は予防効果は必ずしも１つの用量が与えられると生じるわけではなく、一連の用量が与えられた後に生じる可能性がある。従って、治療又は予防有効量は、１回又は複数回与える方式で投与することができる。「治療有効量」及び「予防有効量」は、例えば、個体の疾患状態、年齢、性別と体重、及び治療剤又は治療剤の組み合わせが個体において所望の応答を引き起こす能力のような様々な要因によって変化することができる。有効治療剤又は治療剤の組み合わせの例示的な指標は、例えば、患者の改善された健康状態を含む。
本開示の抗ＫＬＢ抗体
本開示の抗ＫＬＢ抗体
【0076】
一態様において、本開示は、大量の実験によってＫＬＢに特異的に結合する抗体を得た。幾つかの実施形態において、本開示の抗ＫＬＢ抗体は、多くの有利な特性、例えば、高親和性で抗原に結合すること、ヒトとサルの交差反応活性、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞に強い活性化活性を有するが、ｈＦＧＦＲ１ｃ組換え細胞に弱い活性化活性を有すること、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ、及びｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞に対して選択性を有すること、薬物動態特性及び／又は創薬可能性などを有する。
【0077】
幾つかの実施形態において、本開示は、ＫＬＢに特異的に結合する抗体を提供し、幾つかの実施形態において、上記抗体は、全長抗体又はその抗原結合断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）、二重抗体、線形抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ））であり、幾つかの実施形態において、それは、
Ａ．上記抗ＫＬＢ抗体はｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現する細胞に活性化活性を有し、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体はｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現する細胞に高い活性化活性を有し、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現するＣＨＯＫ１細胞への活性化倍数が１０を超え、及び／又は上記抗ＫＬＢ抗体は、ＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞への活性化倍数が２を超え、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数はブランク対照に対する抗体の活性化倍数であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数は、本開示の試験例４、５の方法により検出されること、
Ｂ．上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＦＧＦＲ１ｃを発現する組換え細胞（ｈＦＧＦＲ１ｃのみで、ｈＫＬＢを発現しない）への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、ＨＥＫ２９３－ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞への活性化倍数が１未満であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数はブランク対照に対する抗体の活性化倍数であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数は本開示の試験例６の方法により検出されること、
Ｃ．上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及びｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４を発現する細胞への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が２未満であり、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が２未満であり、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃとＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が２未満であり、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ細胞への活性化倍数が５未満であり、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ細胞への活性化倍数が１．４未満であり、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が１．６未満であり、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ細胞への活性化倍数が５未満であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数はブランク対照に対する抗体の活性化倍数であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数は本開示の試験例７の方法により検出されること、
Ｄ．上記抗ＫＬＢ抗体はヒトＫＬＢにもサルＫＬＢにも結合することができ、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は２．０ Ｅ－９ Ｍ未満のＥＣ５０値でヒト及び／又はサルＫＬＢに結合することができ、上記ＥＣ５０値はフローサイトメトリー法により検出されること、及び
Ｅ．上記抗ＫＬＢ抗体は高親和性でヒトＫＬＢに結合することができ、幾つかの実施形態において、上記抗体は３．０ Ｅ－９ Ｍ未満のＫＤ値でヒトＫＬＢに結合することができ、上記ＫＤ値はＢｉａｃｏｒｅ方法により検出されること、
という特徴の１つ以上を有する。
Ａ．上記抗ＫＬＢ抗体はｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現する細胞に活性化活性を有し、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体はｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現する細胞に高い活性化活性を有し、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現するＣＨＯＫ１細胞への活性化倍数が１０を超え、及び／又は上記抗ＫＬＢ抗体は、ＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞への活性化倍数が２を超え、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数はブランク対照に対する抗体の活性化倍数であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数は、本開示の試験例４、５の方法により検出されること、
Ｂ．上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＦＧＦＲ１ｃを発現する組換え細胞（ｈＦＧＦＲ１ｃのみで、ｈＫＬＢを発現しない）への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、ＨＥＫ２９３－ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞への活性化倍数が１未満であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数はブランク対照に対する抗体の活性化倍数であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数は本開示の試験例６の方法により検出されること、
Ｃ．上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及びｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４を発現する細胞への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が２未満であり、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化活性が弱く、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が２未満であり、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃとＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が２未満であり、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ細胞への活性化倍数が５未満であり、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ細胞への活性化倍数が１．４未満であり、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が１．６未満であり、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ細胞への活性化倍数が５未満であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数はブランク対照に対する抗体の活性化倍数であり、幾つかの実施形態において、上記活性化倍数は本開示の試験例７の方法により検出されること、
Ｄ．上記抗ＫＬＢ抗体はヒトＫＬＢにもサルＫＬＢにも結合することができ、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は２．０ Ｅ－９ Ｍ未満のＥＣ５０値でヒト及び／又はサルＫＬＢに結合することができ、上記ＥＣ５０値はフローサイトメトリー法により検出されること、及び
Ｅ．上記抗ＫＬＢ抗体は高親和性でヒトＫＬＢに結合することができ、幾つかの実施形態において、上記抗体は３．０ Ｅ－９ Ｍ未満のＫＤ値でヒトＫＬＢに結合することができ、上記ＫＤ値はＢｉａｃｏｒｅ方法により検出されること、
という特徴の１つ以上を有する。
【0078】
幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現する細胞に高い活性化活性を有し、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及びｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４を発現する細胞に弱い活性化活性を有し、幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体は、ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃを発現するＣＨＯＫ１細胞への活性化倍数が１０を超え、上記抗ＫＬＢ抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ及び／又はＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化倍数が２未満であり、上記活性化倍数はブランク対照に対する抗体の活性化倍数である。
【0079】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、それは重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、そのうち、ｉ）上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号４０～４８中の何れか１つの配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の配列と同じであり、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号３４中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであり、又は上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号２中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであり、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号３中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであり、或いは
ｉｉ）上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号４９中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであり、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号５６～６８中の何れか１つの配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであり、又は上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号４中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであり、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号５中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであり、或いは
ｉｉｉ）上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号１８中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであり、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号１９中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じである。
ｉｉ）上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号４９中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであり、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号５６～６８中の何れか１つの配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであり、又は上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号４中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであり、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号５中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであり、或いは
ｉｉｉ）上記重鎖可変領域のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号１８中のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じであり、且つ上記軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３の配列はそれぞれ配列番号１９中のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列と同じである。
【0080】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、上記ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ及びＣｏｎｔａｃｔから選ばれる番号付け規則によって定義される。幾つかの実施形態において、
ｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号６で示され、ＨＣＤＲ２が配列番号３７、３８、３９又は７で示され、且つＨＣＤＲ３が配列番号８で示され、及び
上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号９で示され、ＬＣＤＲ２が配列番号１０で示され、且つＬＣＤＲ３が配列番号１１で示され、又は
ｉｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号１２で示され、ＨＣＤＲ２が配列番号１３で示され、且つＨＣＤＲ３が配列番号１４で示され、及び
上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号１５、６９、７０、７１、７２、７３若しくは７４で示され、ＬＣＤＲ２が配列番号１６若しくは７５で示され、且つＬＣＤＲ３が配列番号１７で示され、又は
ｉｉｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号２４で示され、ＨＣＤＲ２が配列番号２５で示され、且つＨＣＤＲ３が配列番号２６で示され、及び
上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号２７で示され、ＬＣＤＲ２が配列番号２８で示され、且つＬＣＤＲ３が配列番号２９で示される。
ｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号６で示され、ＨＣＤＲ２が配列番号３７、３８、３９又は７で示され、且つＨＣＤＲ３が配列番号８で示され、及び
上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号９で示され、ＬＣＤＲ２が配列番号１０で示され、且つＬＣＤＲ３が配列番号１１で示され、又は
ｉｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号１２で示され、ＨＣＤＲ２が配列番号１３で示され、且つＨＣＤＲ３が配列番号１４で示され、及び
上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号１５、６９、７０、７１、７２、７３若しくは７４で示され、ＬＣＤＲ２が配列番号１６若しくは７５で示され、且つＬＣＤＲ３が配列番号１７で示され、又は
ｉｉｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号２４で示され、ＨＣＤＲ２が配列番号２５で示され、且つＨＣＤＲ３が配列番号２６で示され、及び
上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号２７で示され、ＬＣＤＲ２が配列番号２８で示され、且つＬＣＤＲ３が配列番号２９で示される。
【0081】
好ましくは、
ｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号６で示され、ＨＣＤＲ２が配列番号３７で示され、且つＨＣＤＲ３が配列番号８で示され、及び
上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号９で示され、ＬＣＤＲ２が配列番号１０で示され、且つＬＣＤＲ３が配列番号１１で示され、又は
ｉｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号１２で示され、ＨＣＤＲ２が配列番号１３で示され、且つＨＣＤＲ３が配列番号１４で示され、及び
上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号６９で示され、ＬＣＤＲ２が配列番号７５で示され、且つＬＣＤＲ３が配列番号１７で示される。
ｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号６で示され、ＨＣＤＲ２が配列番号３７で示され、且つＨＣＤＲ３が配列番号８で示され、及び
上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号９で示され、ＬＣＤＲ２が配列番号１０で示され、且つＬＣＤＲ３が配列番号１１で示され、又は
ｉｉ）上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号１２で示され、ＨＣＤＲ２が配列番号１３で示され、且つＨＣＤＲ３が配列番号１４で示され、及び
上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号６９で示され、ＬＣＤＲ２が配列番号７５で示され、且つＬＣＤＲ３が配列番号１７で示される。
【0082】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、上記抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域は、ＩＧＨＶ１－３＊０１／ＩＧＨＪ６＊０１重鎖フレームワーク領域に１、２４、４４、７１及び９１番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸復帰変異が含まれ、軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、ＩＧＫＶ１－３９＊０１／ＩＧＫＪ４＊０１軽鎖フレームワーク領域に２、４、３６、３８、４３、４４及び５８番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸復帰変異が含まれる。幾つかの実施形態において、上記抗ＫＬＢ抗体であって、そのうち、上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号３７、３８、３９若しくは７のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号８のアミノ酸配列を含み、及び上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号９のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１０のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号１１のアミノ酸配列を含み、上記抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域は、ＩＧＨＶ１－３＊０１／ＩＧＨＪ６＊０１重鎖フレームワーク領域に１Ｅ、２４Ｔ、４４Ｇ、７１Ｓ及び９１Ｆ（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸復帰変異がさらに含まれ、及び／又は上記軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、ＩＧＫＶ１－３９＊０１／ＩＧＫＪ４＊０１軽鎖フレームワーク領域に２Ｖ、４Ｉ、３６Ｆ、３８Ｅ、４３Ｔ、４４Ｎ及び５８Ｉ（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸復帰変異が含まれる。
【0083】
幾つかの実施形態において、上記何れか１つに記載の抗ＫＬＢ抗体であって、上記抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域は、ＩＧＨＶ１－３＊０１／ＩＧＨＪ６＊０１重鎖フレームワーク領域に１、２４、４８、６７、６９、７１及び７３番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸変異が含まれ、軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、ＩＧＫＶ６－２１＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１又はＩＧＫＶ３－２０＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１軽鎖フレームワーク領域に２、４５、４７、４９、５８及び７１番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸復帰変異が含まれる。幾つかの実施形態において、上記の抗ＫＬＢ抗体であって、そのうち、上記重鎖可変領域は、ＨＣＤＲ１が配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２が配列番号１３のアミノ酸配列を含み、且つＨＣＤＲ３が配列番号１４のアミノ酸配列を含み、及び上記軽鎖可変領域は、ＬＣＤＲ１が配列番号１５、６９、７０、７１、７２、７３若しくは７４のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２が配列番号１６若しくは７５のアミノ酸配列を含み、且つＬＣＤＲ３が配列番号１７のアミノ酸配列を含み、上記抗体の重鎖可変領域のフレームワーク領域は、ＩＧＨＶ１－３＊０１／ＩＧＨＪ６＊０１重鎖フレームワーク領域に１Ｅ、２４Ｇ、４８Ｉ、６７Ａ、６９Ｖ、７１Ｖ及び７３Ｋ（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸変異が含まれ、及び／又は上記軽鎖可変領域のフレームワーク領域は、ＩＧＫＶ６－２１＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１又はＩＧＫＶ３－２０＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１軽鎖フレームワーク領域に２Ｎ、４５Ｋ、４７Ｗ、４９Ｙ、５８Ｖ及び７１Ｙ（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）から選ばれる１つ以上のアミノ酸復帰変異が含まれる。上記変異位点は、Ｋａｂａｔ番号付け規則によって番号付けされ、例えば、「２Ｎ」は２番目（Ｋａｂａｔ番号付け規則に応じて番号付けされる）の残基が「Ｎ」であることを示す。
抗ＫＬＢ抗体変異体
抗ＫＬＢ抗体変異体
【0084】
ある実施形態において、本明細書により提供される抗ＫＬＢ抗体のアミノ酸配列変異体をカーバーする。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改善することが望まれる。抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により、抗体のアミノ酸配列変異体を調製することができる。このような修飾は、例えば、抗ＫＬＢ抗体のアミノ酸配列における残基の削除、及び／又は挿入、及び／又は置換を含む。最終的な構築体が抗原結合特性などの所望の特性を有すれば、最終的な構築体は、削除、挿入及び置換の任意の組み合わせを行うことで得られる。
変異体の置換、挿入及び削除
変異体の置換、挿入及び削除
【0085】
ある実施形態において、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗ＫＬＢ抗体変異体を提供する。置換変異誘発の関心部位は、ＣＤＲ及びＦＲを含む。保存的置換は表２において、「好ましい置換」という見出しの下に示されている。より実質的な変化は表２において、「例示的な置換」という見出しの下に提供され、且つ以下アミノ酸側鎖分類を参照してさらに記載される通りである。アミノ酸置換を関心抗体に導入し、生成物について、例えば、保持／改善された抗原結合、低下した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣなどの所望の活性をスクリーニングすることができる。
【0086】
【表2】
【0087】
一般的な側鎖の特性によって、アミノ酸は、以下のように群分けすることができる：
（１）疎水性のもの：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性、親水性のもの：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性のもの：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性のもの：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族のもの：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
（１）疎水性のもの：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性、親水性のもの：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性のもの：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性のもの：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族のもの：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【0088】
非保存的置換には、これらの分類の１つにおけるメンバーで別の分類におけるメンバーを置き換える必要がある。
【0089】
１種類の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の１つ又は複数のＣＤＲ残基の置換に関わる。一般的に、さらなる研究のために選択して得られた変異体は、親抗体に対してある生物学的特性（例えば、向上した親和性、低下した免疫原性）に変化（例えば、改善）を有し、及び／又は親抗体のある生物学的特性を基本的に保持する。１つの例示的な置換変異体は親和性成熟抗体であり、例えば、ファージディスプレイに基づく親和性成熟技術（例えば、本明細書に記載されるような技術）により、上記抗体を容易に産生することができる。要するに、１つ又は複数のＣＤＲ残基を変異させ、変異抗体をファージ上にディスプレイし、それについて特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）をスクリーニングする。例えば抗体親和性を向上させるために、ＣＤＲに変化（例えば、置換）を加えることができる。ＣＤＲ「ホットスポット」、即ち、体細胞成熟過程中に高頻度で変異されたコドンによってコードされた残基、及び／又は抗原に接触する残基に対して、このような変化を行うとともに、得られた変異体ＶＨ又はＶＬに対して結合親和性を試験することができる。親和性成熟の幾つかの実施形態において、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド特異的変異誘発）の何れかにより、多様性を成熟のために選択された可変遺伝子に導入する。次に、二次ライブラリーを作成する。さらに、所望の親和性を有する任意の抗体変異体を同定するために、ライブラリーをスクリーニングする。多様性を導入する別の方法は、数個のＣＤＲ残基（例えば、１回に４～６個の残基）をランダム化する、ＣＤＲを標的とする方法に関する。例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングにより、抗原結合に関わるＣＤＲ残基を同定することができる。特に、ＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ３がよく標的とされる。
【0090】
ある実施形態において、このような変化が抗原に結合する抗体の能力を実質的に低下させない限り、置換、挿入又は欠失は、１つ又は複数のＣＤＲにおいて行われてもよい。例えば、ＣＤＲに対して、結合親和性を実質的に低下させない保存的変化（例えば、本明細書に提供されたような保存的置換）を行うことができる。このような変化は、例えば、ＣＤＲにおける抗原接触残基の外部にあってもよい。
【0091】
抗体における変異誘発の標的部位となり得る残基又は領域を同定するために使用できる方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、１つの残基又は標的残基群（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕのような電荷を持つ残基）を同定し、且つ中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、Ａｌａ又はポリアラニン）で置換することで、当該抗体と抗原との相互作用が影響を受けたか否かを確認する。初期置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に、さらなる置換を導入することができる。また、抗原－抗体複合物の結晶構造を調べることにより、抗体と抗原との接触点を同定することができる。これらの接触残基及び隣接残基は、置換候補として標的化又は除去されてもよい。所望の特性が含まれるか否かを確認するために変異体をスクリーニングしてもよい。
【0092】
アミノ酸配列挿入は、長さの範囲が１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドのアミノ基及び／又はカルボキシ末端融合と、単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入とを含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のＮ又はＣ末端と、酵素又は抗体の血清半減期を延長するポリペプチドとの融合体を含む。
Ｆｃ領域の改変
Ｆｃ領域の改変
【0093】
一態様において、本開示の抗ＫＬＢ抗体のＦｃ領域は１つ又は複数のアミノ酸置換を含み、上記１つ又は複数のアミノ酸置換は、そのＦｃ受容体への結合、例えば、そのＦｃγ受容体への結合を低減し、且つエフェクター機能を低減又は除去する。天然のＩｇＧ Ｆｃ領域は、具体的にＩｇＧ１ Ｆｃ領域又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域であり、本開示に係る抗ＫＬＢ抗体が、抗原を発現した細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現した細胞を標的とするようにする可能性がある。本開示に係る改変したＦｃ領域は、Ｆｃ受容体への低減された結合親和性及び／又は低減されたエフェクター機能を示す。幾つかの実施形態において、改変したＦｃ領域は天然Ｆｃ領域に比べて、Ｆｃ受容体への結合親和性が５０％、８０％、９０％又は９５％以上低減される。幾つかの実施形態において、上記Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。幾つかの実施形態において、上記Ｆｃ受容体はヒトＦｃγ受容体、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩａである。幾つかの実施形態において、改変したＦｃ領域は天然Ｆｃ領域に比べて、Ｃ１ｑなどの補体への結合親和性も低減される。幾つかの実施形態において、改変したＦｃ領域は天然Ｆｃ領域に比べて、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合親和性が低減されていない。幾つかの実施例において、改変したＦｃ領域は、低減されたエフェクター機能を有し、上記低減されたエフェクター機能は、低減された補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、低減された抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、低減された抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、減少されたサイトカインの分泌、減少された免疫複合体媒介性の抗原提示細胞の抗原摂取、減少されたＮＫ細胞との結合、減少されたマクロファージ細胞との結合、減少された単球との結合、減少された多形核細胞との結合、減少された直接シグナル伝達誘導性の細胞アポトーシス、低減された樹状細胞の成熟又は減少されたＴ細胞による誘発のうちの１つ又は複数を含んでもよいが、これらに限定されない。ＩｇＧ１ Ｆｃ領域について、２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９などの位置でのアミノ酸残基置換により、エフェクター機能を低減することができる。幾つかの実施形態において、上記Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域であり、且つ２３４と２３５位置でのアミノ酸残基はＡであり、番号がＥＵインデックスに従って付けられる。ＩｇＧ４ Ｆｃ領域について、２２８などの位置でのアミノ酸残基置換により、エフェクター機能を低減することができる。
【0094】
抗ＫＬＢ抗体は、ジスルフィド結合改変、例えば、第１のサブユニットの３５４Ｃ及び第２のサブユニットの３４９Ｃをさらに含んでもよい。
【0095】
抗ＫＬＢ抗体は、Ｆｃ領域の２つのサブユニットに融合する異なる抗原結合モジュールを含めるので、望ましくないホモ二量化を引き起こす可能性がある。収率と純度を向上させるために、本開示に係る抗ＫＬＢ抗体のＦｃ領域にヘテロ二量化を促進する修飾を導入することは有利である。幾つかの実施形態において、本開示のＦｃ領域は、ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ、ＫＩＨ）技術による改変を含み、当該方法は、一方のサブユニットの界面にノブ構造（ｋｎｏｂ）を導入し、且つ他方のサブユニットの界面にホール構造（ｈｏｌｅ）を導入することに関する。これにより、上記ノブ構造をホール構造に位置決めし、ヘテロ二量体の形成を促進してホモ二量体の産生を阻害することができる。ノブ構造は、比較的大きい側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で一方のサブユニットの界面からの小さいアミノ酸側鎖を置換することにより構築される。一方、ホール構造は、比較的小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）で大きいアミノ酸側鎖を置換することにより他方のサブユニットの界面において構築される。ノブ構造及びホール構造は、ポリペプチドをコードする核酸を変更することにより調製され、選択可能なアミノ酸置換は、下記の表３に示す通りである。
【0096】
【表3】
【0097】
ノブ・イン・ホール技術を除き、ヘテロ二量化が実現されるように多重特異性抗体の重鎖のＣＨ３ドメインを修飾するための他の技術も、この分野で知られているものであり、例えば、ＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２／０５８７６８、ＷＯ２０１３／１５７９５４及びＷＯ０１３／０９６２９１である。
【0098】
Ｆｃ領域のＣ末端は、アミノ酸残基ＰＧＫで終わる完全なＣ末端であってもよく、短縮されたＣ末端であってもよく、例えば、上記短縮されたＣ末端には、１つ又は２つのＣ末端アミノ酸残基が既に除去されている。一好ましい態様において、重鎖のＣ末端は、ＰＧで終わる短縮されたＣ末端である。従って、幾つかの実施形態において、完全抗体の組成物は、あらゆるＫ４４７残基及び／又はＧ４４６＋Ｋ４４７残基を除去した抗体群を含んでもよい。幾つかの実施形態において、完全抗体の組成物は、Ｋ４４７残基及び／又はＧ４４６＋Ｋ４４７残基を除去していない抗体群を含んでもよい。幾つかの実施形態において、完全抗体の組成物は、Ｋ４４７残基及び／又はＧ４４６＋Ｋ４４７残基を持つ、及び持たない抗体混合物の抗体群を有する。
組換え法
組換え法
【0099】
抗ＫＬＢ抗体（例えば、抗体）は、組換え法により産生することができる。これらの方法に対して、抗ＫＬＢ抗体をコードする１つ以上の単離した核酸を提供する。
【0100】
一実施形態において、本開示は、上記のような抗ＫＬＢ抗体をコードする単離した核酸を提供する。このような核酸は、それぞれ独立的に上記何れか１つのポリペプチド鎖をコードすることができる。別の態様において、本開示は、このような核酸を含む１種又は複数種のベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。別の態様において、本開示は、このような核酸を含む宿主細胞を提供する。一実施形態において、抗ＫＬＢ抗体を調製する方法を提供し、そのうち、上記方法は、上記に提供されるように、発現に適する条件で、上記抗ＫＬＢ抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、任意選択的に宿主細胞（又は宿主細胞培地）から上記抗ＫＬＢ抗体を回収することとを含む。
【0101】
組換えて抗ＫＬＢ抗体を産生するために、タンパク質をコードする核酸を単離して１つ以上のベクターに挿入し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／又は発現に用いる。このような核酸は、通常の手順で容易に単離とシークエンシングすることができ、或いは組換え法により産生され、又は化学合成により得られる。
【0102】
抗ＫＬＢ抗体をコードするベクターをクローニング又は発現するための適切な宿主細胞は、本明細書に記載される原核又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が不要な場合に、細菌において産生することができる。発現した後、可溶性画分において細菌細胞のペースト状物から単離することができ、且つさらに精製することができる。
【0103】
原核生物の他に、糸状菌や酵母などの真核微生物も、抗ＫＬＢ抗体をコードするためのベクターに好適なクローン又は発現宿主であり、真菌と酵母菌株を含む。抗ＫＬＢ抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物体（無脊椎動物及び脊椎動物）に由来してもよく、無脊椎動物細胞の例は、植物及び昆虫細胞を含む。多くのバキュロウイルス株が既に同定されており、それらは、昆虫細胞と併用され、特にツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションに用いられてもよく、また、例えばＵＳ５９５９１７７、ＵＳ６０４０４９８、ＵＳ６４２０５４８、ＵＳ７１２５９７８及びＵＳ６４１７４２９のように、植物細胞培養物を宿主として利用してもよく、脊椎動物細胞、例えば、懸濁液における成長に適する哺乳動物細胞株を宿主として利用してもよい。好適な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０で形質転換されたサル腎臓ＣＶｌ株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓株（２９３又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ（ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞（ＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット（ｂｕｆｆａｌｏ ｒａｔ）肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞及びＦＳ４細胞である。他の好適な哺乳動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及びＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。抗体の産生に適する幾つかの哺乳動物宿主細胞株についての概説は、例えば、Ｙａｚａｋｉ，Ｐ．及びＷｕ，Ａ．Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８，Ｌｏ，Ｂ．Ｋ．Ｃ．（編集），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（２００４），２５５～２６８ページを参照する。
検出及び診断
検出及び診断
【0104】
本明細書に提供される抗ＫＬＢ抗体は、この分野で既知の種々の測定法により、その物理的／化学的特徴及び／又は生物学的活性を同定、スクリーニング又は特徴付けることができる。一態様において、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティングなどの既知の方法により、本開示に係る抗ＫＬＢ抗体の活性を試験する。
【0105】
ある実施形態において、本開示により提供される抗ＫＬＢ抗体は、生物学的試料におけるＫＬＢの存在を検出するために使用可能である。本明細書に使用する場合、「検出」という用語は、定量的又は定性的検出をカバーする。ある実施形態において、生物学的試料は、細胞又は腫瘍組織などの組織を含む。
【0106】
一実施形態において、診断又は検出方法に使用される抗ＫＬＢ抗体を提供する。一態様において、生物学的試料におけるＫＬＢの存在を検出する方法を提供する。ある実施形態において、当該方法は、適切な条件で生物学的試料を抗ＫＬＢ抗体と接触させ、且つ検出試薬と抗原との間で複合物が形成されたか否かを検出することを含む。このような方法は、インビトロ方法又はインビボ方法であってもよい。一実施形態において、抗ＫＬＢ抗体を使用して治療に適する対象を選択し、例えば、ＫＬＢは、対象を選択するためのバイオマーカーである。
【0107】
本開示の抗ＫＬＢ抗体により診断可能な例示的な疾患は、例えば、糖尿病、心臓血管疾患、インスリン抵抗性、高血圧、血栓塞栓性疾患又は脂質異常症であり、特に非アルコール性脂肪性肝炎、糖尿病である。
【0108】
ある実施形態において、標識された抗ＫＬＢ抗体を提供する。標識は、直接的に検出された標識又はモジュール（例えば、蛍光、発色、高電子密度、化学発光と放射性標識）、及び間接的に検出されたモジュール（例えば、酵素反応又は分子相互作用により間接的に検出されたモジュール、例えば、酵素又はリガンド）を含むが、これらに限定されない。
治療方法及び投与経路
治療方法及び投与経路
【0109】
本明細書に提供される任意の抗ＫＬＢ抗体（例えば、抗体）も、治療方法に使用することができる。別の態様において、本開示は、薬剤の製造又は調製における抗ＫＬＢ抗体の使用を提供する。幾つかの実施形態において、上記疾患は、ＫＬＢに関連する疾患又は病状である。幾つかの実施形態において、上記疾患は、糖尿病、心臓血管疾患、インスリン抵抗性、高血圧、血栓塞栓性疾患又は脂質異常症から選ばれ、特に非アルコール性脂肪性肝炎、糖尿病である。このような実施形態の１つにおいて、上記使用は、対象に有効量の少なくとも１種の別の治療剤（例えば、１種、２種、３種、４種、５種又は６種の別の治療剤）を投与することをさらに含む。任意の上記実施形態による「対象」は、ヒトであってもよい。幾つかの実施形態において、本開示の抗ＫＬＢ抗体（ヒト及び／又はカニクイザルＫＬＢに結合する抗体を含む）は、ＦＧＦ２１及び／又はＦＧＦ１９のインビボでの作用を模倣し、ＦＧＦ２１様シグナル伝達及び／又はＦＧＦ１９様シグナル伝達を誘導するユニークな特性を有し、幾つかの実施形態において、上記抗体は、ＦＧＦ２１の天然生物学的機能に一致する活性を示す。このような特性により、本開示の抗ＫＬＢ抗体は、ＦＧＦ２１及び／又はＦＧＦ１９に関連する代謝疾患、例えば、２型糖尿病、肥満症、脂質異常症、ＮＡＳＨ、心臓血管疾患、メタボリック症候群の治療、並びにＦＧＦ１９及び／又はＦＧＦ２１のインビボでの作用を模倣又は増強する必要のある任意の疾患、病状又は病態の治療への適用が可能になる。
【0110】
さらなる態様において、例えば、上記任意の製薬的使用又は治療方法に使用される、上記抗ＫＬＢ抗体の医薬組成物を提供する。一実施形態において、医薬組成物は、本明細書に提供される任意の抗ＫＬＢ抗体と、薬学的に許容されるベクターとを含む。別の実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１種の別の治療剤をさらに含む。
【0111】
本開示の抗ＫＬＢ抗体は、治療のために、単独で使用したり、他の試薬と併用したりすることができる。例えば、本開示に係る抗体は、少なくとも１種の別の治療剤とともに投与することができる。
【0112】
本開示に係る抗ＫＬＢ抗体（及び任意の別の治療剤）は、非経口投与、肺内投与及び鼻内投与を含む任意の適切な手段により投与されてもよく、且つ局所治療が必要な場合、病巣内に投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内又は皮下投与を含む。投与は、任意の適切な経路により、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができ、これは部分的に、投与が短期間か長期間かによって決められる。本明細書では、様々な投与スケジュールが考慮されており、単回投与又は複数の時点での複数回投与、ボーラス投与及びパルス注入を含むが、これらに限定されない。
【0113】
本開示の抗ＫＬＢ抗体は、良好な医療行為に適合するように調製、投薬及び投与される。この背景で考えられる要因は、治療される具体的な病状、治療される具体的な哺乳動物、個体患者の臨床状況、病状の起因、試薬の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医療従事者に知られている他の要因を含む。抗ＫＬＢ抗体は、現在上記病状の予防又は治療に用いられる１種又は複数種の試薬とともに調製したりしなかったりすることができる。このような他の試薬の有効量は、医薬組成物に存在する量、病状又は治療の種類及び他の要因によって決められる。これらは、一般的に、本明細書の記載と同じ用量及び投与経路で使用され、又は本明細書に記載される用量の約１％～９９％で使用され、又は別の用量で使用され、且つ経験的／臨床的に適切と決定された任意の経路で使用される。
【0114】
疾患を予防又は治療するために、本開示に係る抗ＫＬＢ抗体（単独で使用されるか又は１種若しくは複数種の別の治療剤と併用される場合）の好適な用量は、治療すべき疾患の種類、治療分子の種類、疾患の重症度及び疾患の経過、投与が予防のためか治療のためか、過去の治療、患者の臨床病歴及び治療分子に対する応答、及び主治医の判断によって決められる。治療分子は、適当に１回又は一連の治療で患者に投与される。例えば、毎日の用量は、約１ μｇ／ｋｇ～１００ ｍｇ／ｋｇであり得るが、これは具体的に、上述した要因によって決定される。
製品
製品
【0115】
本開示の別の態様において、上記病状の治療、予防及び／又は診断に適用可能な材料を含む製品を提供する。当該製品は、容器と、容器上若しくは容器と組み合わせたラベル又は添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）とを含む。好適な容器は、例えば、瓶、バイアル、注射器、ＩＶ溶液バッグなどを含む。容器は、例えば、ガラスやプラスチックのような種々の材料から形成されてもよい。容器には、単独で又は別の組成物と組み合わせて疾患を効果的に治療、予防及び／又は診断する組成物が入っているとともに、滅菌した出入り口があってもよい（例えば、容器は、皮下注射針が刺し通せるプラグを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物の中の少なくとも１種の活性試薬は、本開示の抗ＫＬＢ抗体である。ラベル又は添付文書は、当該組成物が、選択された病態を治療するために使用されることを示す。また、製品は、（ａ）本開示に係る抗ＫＬＢ抗体を含む組成物が収容された第１の容器と、（ｂ）別の細胞傷害剤又はその他の治療剤を含む組成物が収容された第２の容器とを含んでもよい。本開示の当該実施形態における製品は、添付文書をさらに含んでもよく、上記添付文書は、上記組成物が特定の病態の治療に適用可能なことを示す。選択的に、又はさらに、製品は、薬学的に許容される緩衝液を含む第２（又は第３）の容器をさらに含んでもよい。ビジネス及びユーザーの観点から、それは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、注射針及び注射器を含む必要な他の材料をさらに含んでもよい。
実施例及び試験例
実施例及び試験例
【0116】
以下、実施例及び試験例に合わせて本開示をさらに説明するが、これらの実施例及び試験例は、本開示の範囲を限定するものではない。本開示の実施例及び試験例において具体的な条件が明記されていない実験方法は、一般的に、例えば冷泉港の抗体技術実験マニュアル、分子クローニングマニュアルなどの通常の条件、又は原料や商品のメーカーにより推薦された条件に従う。具体的な供給源が明示されていない試薬は、市販される通常の試薬である。
実施例１． 組換え細胞株の構築
実施例１． 組換え細胞株の構築
【0117】
ヒトＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃを発現する複合物（ヒトＫＬＢの配列はＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｑ８６Ｚ１４を参照し、ヒトＦＧＦＲ１ｃの配列はＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ１１３６２を参照する）、カニクイザルＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ複合物（カニクイザルＫＬＢの配列はＧｅｎｅｂａｎｋ ＩＤ：ＥＨＨ５３６２０．１を参照し、カニクイザルＦＧＦＲ１ｃの配列は配列番号１を参照する）、マウスＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ複合物（マウスＫＬＢの配列はＵｎｉｐｒｏｔ Ｑ９９Ｎ３２を参照し、マウスＦＧＦＲ１ｃの配列はＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ１６０９２を参照する）、及びヒトＦＧＦＲ１ｃを単独で発現する細胞株を構築した。
【0118】
方法：ヒトＫＬＢ、サルＫＬＢ、マウスＫＬＢ、ヒトＦＧＦＲ１ｃ、サルＦＧＦＲ１ｃ及びマウスＦＧＦＲ１ｃの全長遺伝子をそれぞれレンチウィルス発現ベクターｐＣＤＨ（Ｓｙｓｔｅｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、０１． ＳＢＩ． ＣＤ５１４Ｂ－１）にクローニングし、ここで、ＫＬＢのウィルス発現ベクターとＦＧＦＲ１ｃのウィルス発現ベクターは異なる耐性遺伝子を有し、それぞれ異なる種属のＫＬＢとＦＧＦＲ１ｃウィルスをパッケージングし、ｐＶＳＶ－Ｇ、ｐＣＭＶ－ｄＲ８．９１、ｐＣＤＨ－ＫＬＢ又はｐＣＤＨ－ＦＧＦＲ１ｃという３つのプラスミドをともに用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１１２６８）にコトランスフェクションしてウィルスをパッケージングした。複合物過剰発現細胞株の構築のために、ＫＬＢ及びＦＧＦＲ１ｃ遺伝子を含むパッケージング済みのウイルスを一定の割合でＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）又はＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１５７３）株に感染した。ヒトＦＧＦＲ１ｃ過剰発現細胞株の構築のために、ＦＧＦＲ１ｃ遺伝子を含むウイルスのみをＣＨＯＫ１又はＨＥＫ２９３細胞株に感染した。４８時間感染後にウイルスを含む培養上清を除去し、対応する抗生物質を加えて５日間加圧スクリーニングした後、流動選別によりＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ複合物又はＦＧＦＲ１ｃを高発現するＣＨＯＫ１又はＨＥＫ２９３モノクローナル細胞を得た。最後に、ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ、ＣＨＯＫ１－ｍＫＬＢ＆ｍＦＧＦＲ１ｃ、ＣＨＯＫ１－ｈＦＧＦＲ１ｃ、ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ、ＨＥＫ２９３－ｈＫＬＢ、ＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃなどの組換え細胞を得た。
【0119】
カニクイザルＦＧＦＲ１ｃのアミノ酸配列：
ＭＷＳＷＫＣＬＬＦＷＡＶＬＶＴＡＴＬＣＴＡＲＰＳＰＴＬＰＥＱＤＡＬＰＳＳＥＤＤＤＤＤＤＤＳＳＳＥＥＫＥＴＤＮＴＫＰＮＲＭＰＶＡＰＹＷＴＳＰＥＫＭＥＫＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰＳＳＧＴＰＮＰＴＬＲＷＬＫＮＧＫＥＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹＡＴＷＳＩＩＭＤＳＶＶＰＳＤＫＧＮＹＴＣＩＶＥＮＥＹＧＳＩＮＨＴＹＱＬＤＶＶＥＲＳＰＨＲＰＩＬＱＡＧＬＰＡＮＫＴＶＡＬＧＳＮＶＥＦＭＣＫＶＹＳＤＰＱＰＨＩＱＷＬＫＨＩＥＶＮＧＳＫＩＧＰＤＮＬＰＹＶＱＩＬＫＴＡＧＶＮＴＴＤＫＥＭＥＶＬＨＬＲＮＶＳＦＥＤＡＧＥＹＴＣＬＡＧＮＳＩＧＬＳＨＨＳＡＷＬＴＶＬＥＡＬＥＥＲＰＡＶＭＴＳＰＬＹＬＥＩＩＩＹＣＴＧＡＦＬＩＳＣＭＶＧＳＶＩＶＹＫＭＫＳＧＴＫＫＳＤＦＨＳＱＭＡＶＨＫＬＡＫＳＩＰＬＲＲＱＶＴＶＳＡＤＳＳＡＳＭＮＳＧＶＬＬＶＲＰＳＲＬＳＳＳＧＴＰＭＬＡＧＶＳＥＹＥＬＰＥＤＰＲＷＥＬＰＲＤＲＬＶＬＧＫＰＬＧＥＧＣＦＧＱＶＶＬＡＥＡＩＧＬＤＫＤＫＰＮＲＶＴＫＶＡＶＫＭＬＫＳＤＡＴＥＫＤＬＳＤＬＩＳＥＭＥＭＭＫＭＩＧＫＨＫＮＩＩＮＬＬＧＡＣＴＱＤＧＰＬＹＶＩＶＥＹＡＳＫＧＮＬＲＥＹＬＱＡＲＲＰＰＧＬＥＹＣＹＮＰＳＨＮＰＥＥＱＬＳＳＫＤＬＶＳＣＡＹＱＶＡＲＧＭＥＹＬＡＳＫＫＣＩＨＲＤＬＡＡＲＮＶＬＶＴＥＤＮＶＭＫＩＡＤＦＧＬＡＲＤＩＨＨＩＤＹＹＫＫＴＴＮＧＲＬＰＶＫＷＭＡＰＥＡＬＦＤＲＩＹＴＨＱＳＤＶＷＳＦＧＶＬＬＷＥＩＦＴＬＧＧＳＰＹＰＧＶＰＶＥＥＬＦＫＬＬＫＥＧＨＲＭＤＫＰＳＮＣＴＮＥＬＹＭＭＭＲＤＣＷＨＡＶＰＳＱＲＰＴＦＫＱＬＶＥＤＬＤＲＩＶＡＬＴＳＮＱＥＹＬＤＬＳＭＰＬＤＱＹＳＰＳＦＰＤＴＲＳＳＴＣＳＳＧＥＤＳＶＦＳＨＥＰＬＰＥＥＰＣＬＰＲＨＰＡＱＬＡＮＧＧＬＫＲＲ
配列番号１
注記：上記配列においては、順にシグナルペプチド（一重下線部分）＋細胞外領域部分（下線なし部分）＋膜貫通領域部分（二重下線部分）＋細胞質領域部分（点線部分）である
ヒトＦＧＦ２１のアミノ酸配列：
ＨＨＨＨＨＨＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＰＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ
配列番号７６
ヒトＦＧＦ１９のアミノ酸配列：
ＨＨＨＨＨＨＬＡＦＳＤＡＧＰＨＶＨＹＧＷＧＤＰＩＲＬＲＨＬＹＴＳＧＰＨＧＬＳＳＣＦＬＲＩＲＡＤＧＶＶＤＣＡＲＧＱＳＡＨＳＬＬＥＩＫＡＶＡＬＲＴＶＡＩＫＧＶＨＳＶＲＹＬＣＭＧＡＤＧＫＭＱＧＬＬＱＹＳＥＥＤＣＡＦＥＥＥＩＲＰＤＧＹＮＶＹＲＳＥＫＨＲＬＰＶＳＬＳＳＡＫＱＲＱＬＹＫＮＲＧＦＬＰＬＳＨＦＬＰＭＬＰＭＶＰＥＥＰＥＤＬＲＧＨＬＥＳＤＭＦＳＳＰＬＥＴＤＳＭＤＰＦＧＬＶＴＧＬＥＡＶＲＳＰＳＦＥＫ
配列番号７７
実施例２． 抗ヒトβ－ｋｌｏｔｈｏ（ＫＬＢ）ハイブリドーマモノクローナル抗体の調製
ＭＷＳＷＫＣＬＬＦＷＡＶＬＶＴＡＴＬＣＴＡＲＰＳＰＴＬＰＥＱＤＡＬＰＳＳＥＤＤＤＤＤＤＤＳＳＳＥＥＫＥＴＤＮＴＫＰＮＲＭＰＶＡＰＹＷＴＳＰＥＫＭＥＫＫＬＨＡＶＰＡＡＫＴＶＫＦＫＣＰＳＳＧＴＰＮＰＴＬＲＷＬＫＮＧＫＥＦＫＰＤＨＲＩＧＧＹＫＶＲＹＡＴＷＳＩＩＭＤＳＶＶＰＳＤＫＧＮＹＴＣＩＶＥＮＥＹＧＳＩＮＨＴＹＱＬＤＶＶＥＲＳＰＨＲＰＩＬＱＡＧＬＰＡＮＫＴＶＡＬＧＳＮＶＥＦＭＣＫＶＹＳＤＰＱＰＨＩＱＷＬＫＨＩＥＶＮＧＳＫＩＧＰＤＮＬＰＹＶＱＩＬＫＴＡＧＶＮＴＴＤＫＥＭＥＶＬＨＬＲＮＶＳＦＥＤＡＧＥＹＴＣＬＡＧＮＳＩＧＬＳＨＨＳＡＷＬＴＶＬＥＡＬＥＥＲＰＡＶＭＴＳＰＬＹＬＥＩＩＩＹＣＴＧＡＦＬＩＳＣＭＶＧＳＶＩＶＹＫＭＫＳＧＴＫＫＳＤＦＨＳＱＭＡＶＨＫＬＡＫＳＩＰＬＲＲＱＶＴＶＳＡＤＳＳＡＳＭＮＳＧＶＬＬＶＲＰＳＲＬＳＳＳＧＴＰＭＬＡＧＶＳＥＹＥＬＰＥＤＰＲＷＥＬＰＲＤＲＬＶＬＧＫＰＬＧＥＧＣＦＧＱＶＶＬＡＥＡＩＧＬＤＫＤＫＰＮＲＶＴＫＶＡＶＫＭＬＫＳＤＡＴＥＫＤＬＳＤＬＩＳＥＭＥＭＭＫＭＩＧＫＨＫＮＩＩＮＬＬＧＡＣＴＱＤＧＰＬＹＶＩＶＥＹＡＳＫＧＮＬＲＥＹＬＱＡＲＲＰＰＧＬＥＹＣＹＮＰＳＨＮＰＥＥＱＬＳＳＫＤＬＶＳＣＡＹＱＶＡＲＧＭＥＹＬＡＳＫＫＣＩＨＲＤＬＡＡＲＮＶＬＶＴＥＤＮＶＭＫＩＡＤＦＧＬＡＲＤＩＨＨＩＤＹＹＫＫＴＴＮＧＲＬＰＶＫＷＭＡＰＥＡＬＦＤＲＩＹＴＨＱＳＤＶＷＳＦＧＶＬＬＷＥＩＦＴＬＧＧＳＰＹＰＧＶＰＶＥＥＬＦＫＬＬＫＥＧＨＲＭＤＫＰＳＮＣＴＮＥＬＹＭＭＭＲＤＣＷＨＡＶＰＳＱＲＰＴＦＫＱＬＶＥＤＬＤＲＩＶＡＬＴＳＮＱＥＹＬＤＬＳＭＰＬＤＱＹＳＰＳＦＰＤＴＲＳＳＴＣＳＳＧＥＤＳＶＦＳＨＥＰＬＰＥＥＰＣＬＰＲＨＰＡＱＬＡＮＧＧＬＫＲＲ
配列番号１
注記：上記配列においては、順にシグナルペプチド（一重下線部分）＋細胞外領域部分（下線なし部分）＋膜貫通領域部分（二重下線部分）＋細胞質領域部分（点線部分）である
ヒトＦＧＦ２１のアミノ酸配列：
ＨＨＨＨＨＨＨＰＩＰＤＳＳＰＬＬＱＦＧＧＱＶＲＱＲＹＬＹＴＤＤＡＱＱＴＥＡＨＬＥＩＲＥＤＧＴＶＧＧＡＡＤＱＳＰＥＳＬＬＱＬＫＡＬＫＰＧＶＩＱＩＬＧＶＫＴＳＲＦＬＣＱＲＰＤＧＡＬＹＧＳＬＨＦＤＰＥＡＣＳＦＲＥＬＬＬＥＤＧＹＮＶＹＱＳＥＡＨＧＬＰＬＨＬＰＧＮＫＳＰＨＲＤＰＡＰＲＧＰＡＲＦＬＰＬＰＧＬＰＰＡＬＰＥＰＰＧＩＬＡＰＱＰＰＤＶＧＳＳＤＰＬＳＭＶＧＰＳＱＧＲＳＰＳＹＡＳ
配列番号７６
ヒトＦＧＦ１９のアミノ酸配列：
ＨＨＨＨＨＨＬＡＦＳＤＡＧＰＨＶＨＹＧＷＧＤＰＩＲＬＲＨＬＹＴＳＧＰＨＧＬＳＳＣＦＬＲＩＲＡＤＧＶＶＤＣＡＲＧＱＳＡＨＳＬＬＥＩＫＡＶＡＬＲＴＶＡＩＫＧＶＨＳＶＲＹＬＣＭＧＡＤＧＫＭＱＧＬＬＱＹＳＥＥＤＣＡＦＥＥＥＩＲＰＤＧＹＮＶＹＲＳＥＫＨＲＬＰＶＳＬＳＳＡＫＱＲＱＬＹＫＮＲＧＦＬＰＬＳＨＦＬＰＭＬＰＭＶＰＥＥＰＥＤＬＲＧＨＬＥＳＤＭＦＳＳＰＬＥＴＤＳＭＤＰＦＧＬＶＴＧＬＥＡＶＲＳＰＳＦＥＫ
配列番号７７
実施例２． 抗ヒトβ－ｋｌｏｔｈｏ（ＫＬＢ）ハイブリドーマモノクローナル抗体の調製
【0120】
１． マウスの免疫及びハイブリドーマの融合
本開示の実施例１で構築されたヒトＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ複合物を発現した組換え細胞株ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ及びマウスＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ複合物を過剰発現した組換え細胞株ＣＨＯＫ１－ｍＫＬＢ＆ｍＦＧＦＲ１ｃをＳＪＬ又はＢａｌｂ／Ｃマウスに混合又は交差免疫し、腹腔内注射により、力価が所望の値に達するまで複数回連続的に免疫した後、血清中抗体価の高いマウスを脾細胞融合のために選択し、ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ組換え細胞株に特異的に結合するが、ヒトＦＧＦＲ１ｃ組換え細胞株ＣＨＯＫ１－ｈＦＧＦＲ１ｃに結合しないクローンをスクリーニングした。活性の良いハイブリドーマ細胞株であるｍＡｂ－９９及びｍＡｂ－１８をスクリーニングにより得て、それらの配列を増幅し、対数増殖期のハイブリドーマ細胞を収集し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ Ｎｏ． １５５９６－０１８）を用いて試薬キットの取扱説明書での手順に従ってＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写試薬キット（Ｔａｋａｒａ、Ｃａｔ Ｎｏ． ２６８０Ａ）を用いて逆転写した。逆転写して得たｃＤＮＡをマウスＩｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＴＢ３２６ Ｒｅｖ．Ｂ ０５０３）によりＰＣＲ増幅した後、シークエンシング会社に送ってシークエンシングしてもらったところ、ハイブリドーマクローンマウス抗体ｍＡｂ－９９、ｍＡｂ－１８の可変領域の配列は、以下の通りである：
＞ｍＡｂ－９９重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＫＱＲＰＲＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＩＧＮＧＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＩＹＦＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＴＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号２
＞ｍＡｂ－９９軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＤＶＱＩＴＱＳＰＳＹＬＡＡＳＰＧＥＴＩＴＩＮＣＲＡＳＫＳＩＳＫＦＬＡＷＦＱＥＫＰＧＫＴＮＫＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＧＬＥＰＥＤＦＡＭＹＹＣＱＱＨＮＥＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３
＞ｍＡｂ－１８重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＲＰＧＶＳＶＫＩＳＣＫＧＳＧＹＴＦＴＤＹＡＭＨＷＶＫＱＴＨＡＫＳＬＥＷＩＧＶＩＳＴＹＳＧＴＴＮＹＮＱＮＦＫＧＫＡＴＶＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＡＲＬＴＳＥＤＳＡＩＹＹＣＡＲＳＧＰＬＤＹＷＧＱＧＴＳＬＴＶＳＳ
配列番号４
＞ｍＡｂ－１８軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＳＧＡＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＥＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５
マウス抗体ｍＡｂ－９９及びｍＡｂ－１８のＣＤＲ配列は、表４に示されている：
本開示の実施例１で構築されたヒトＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ複合物を発現した組換え細胞株ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ及びマウスＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ複合物を過剰発現した組換え細胞株ＣＨＯＫ１－ｍＫＬＢ＆ｍＦＧＦＲ１ｃをＳＪＬ又はＢａｌｂ／Ｃマウスに混合又は交差免疫し、腹腔内注射により、力価が所望の値に達するまで複数回連続的に免疫した後、血清中抗体価の高いマウスを脾細胞融合のために選択し、ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ組換え細胞株に特異的に結合するが、ヒトＦＧＦＲ１ｃ組換え細胞株ＣＨＯＫ１－ｈＦＧＦＲ１ｃに結合しないクローンをスクリーニングした。活性の良いハイブリドーマ細胞株であるｍＡｂ－９９及びｍＡｂ－１８をスクリーニングにより得て、それらの配列を増幅し、対数増殖期のハイブリドーマ細胞を収集し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ Ｎｏ． １５５９６－０１８）を用いて試薬キットの取扱説明書での手順に従ってＲＮＡを抽出し、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写試薬キット（Ｔａｋａｒａ、Ｃａｔ Ｎｏ． ２６８０Ａ）を用いて逆転写した。逆転写して得たｃＤＮＡをマウスＩｇ－Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＴＢ３２６ Ｒｅｖ．Ｂ ０５０３）によりＰＣＲ増幅した後、シークエンシング会社に送ってシークエンシングしてもらったところ、ハイブリドーマクローンマウス抗体ｍＡｂ－９９、ｍＡｂ－１８の可変領域の配列は、以下の通りである：
＞ｍＡｂ－９９重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＲＰＧＳＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＫＱＲＰＲＱＧＬＥＷＩＧＹＩＹＩＧＮＧＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＫＡＴＬＴＳＤＴＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＩＹＦＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＴＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号２
＞ｍＡｂ－９９軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＤＶＱＩＴＱＳＰＳＹＬＡＡＳＰＧＥＴＩＴＩＮＣＲＡＳＫＳＩＳＫＦＬＡＷＦＱＥＫＰＧＫＴＮＫＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＧＬＥＰＥＤＦＡＭＹＹＣＱＱＨＮＥＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号３
＞ｍＡｂ－１８重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＲＰＧＶＳＶＫＩＳＣＫＧＳＧＹＴＦＴＤＹＡＭＨＷＶＫＱＴＨＡＫＳＬＥＷＩＧＶＩＳＴＹＳＧＴＴＮＹＮＱＮＦＫＧＫＡＴＶＴＶＤＫＳＳＳＴＡＹＭＥＬＡＲＬＴＳＥＤＳＡＩＹＹＣＡＲＳＧＰＬＤＹＷＧＱＧＴＳＬＴＶＳＳ
配列番号４
＞ｍＡｂ－１８軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＳＧＡＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＥＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＶＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５
マウス抗体ｍＡｂ－９９及びｍＡｂ－１８のＣＤＲ配列は、表４に示されている：
【0121】
【表4】
【0122】
備考：表中、ＣＤＲのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって決定されて注釈されている。
【0123】
２． ヒト天然ファージライブラリースクリーニング
ヒトＰＢＭＣ、脾臓、リンパ節組織を利用してＢ細胞を単離し、ＲＮＡを抽出して、天然単鎖ファージ抗体ライブラリーを構築した。構築した天然単鎖ファージ抗体ライブラリーをパッケージングしてファージ粒子を形成した後、ヒトＫＬＢを過剰発現した組換え細胞株によりパニングし、ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ（実施例１参照）とＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＫＬＢ（実施例１参照）の組換え細胞を用いてクロスパニングした。パニングを３回行うことで、モノクローナルコロニーを選択してファージの単鎖抗体になるようにパッケージングし、ＥＬＩＳＡでファージのヒトＫＬＢタンパク質に対する結合活性を試験した。陽性クローンを選択し、その軽重鎖可変領域をそれぞれ抗体の重／軽鎖定常領域（重鎖定常領域は配列番号２２で示され、軽鎖定常領域は配列番号２３で示される）と融合して、ＩｇＧ形態の抗体を構築した。抗体のＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ、ＣＨＯＫ１－ｃｙｎｏＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ及びＣＨＯＫ１－ｈＦＧＦＲ１ｃに対する結合活性を検出し、最後にスクリーニングして良好な生物学的活性を有する完全ヒト抗体ｈＡｂ－２３を得て、具体的な配列は以下の通りである：
＞ｈＡｂ－２３重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＬＶＳＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号１８
＞ｈＡｂ－２３軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１９
＞ｈＡｂ－２３重鎖のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＬＶＳＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２０
＞ｈＡｂ－２３軽鎖のアミノ酸配列
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２１
＞ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異を含む）のアミノ酸配列
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２２
＞ヒトκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２３
ヒト抗体ｈＡｂ－２３のＣＤＲは、表５に示されている：
ヒトＰＢＭＣ、脾臓、リンパ節組織を利用してＢ細胞を単離し、ＲＮＡを抽出して、天然単鎖ファージ抗体ライブラリーを構築した。構築した天然単鎖ファージ抗体ライブラリーをパッケージングしてファージ粒子を形成した後、ヒトＫＬＢを過剰発現した組換え細胞株によりパニングし、ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ（実施例１参照）とＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＫＬＢ（実施例１参照）の組換え細胞を用いてクロスパニングした。パニングを３回行うことで、モノクローナルコロニーを選択してファージの単鎖抗体になるようにパッケージングし、ＥＬＩＳＡでファージのヒトＫＬＢタンパク質に対する結合活性を試験した。陽性クローンを選択し、その軽重鎖可変領域をそれぞれ抗体の重／軽鎖定常領域（重鎖定常領域は配列番号２２で示され、軽鎖定常領域は配列番号２３で示される）と融合して、ＩｇＧ形態の抗体を構築した。抗体のＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ、ＣＨＯＫ１－ｃｙｎｏＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ及びＣＨＯＫ１－ｈＦＧＦＲ１ｃに対する結合活性を検出し、最後にスクリーニングして良好な生物学的活性を有する完全ヒト抗体ｈＡｂ－２３を得て、具体的な配列は以下の通りである：
＞ｈＡｂ－２３重鎖可変領域のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＬＶＳＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳ
配列番号１８
＞ｈＡｂ－２３軽鎖可変領域のアミノ酸配列
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号１９
＞ｈＡｂ－２３重鎖のアミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＳＹＡＩＳＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＧＩＩＰＩＦＧＴＡＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＩＴＡＤＥＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＬＶＳＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２０
＞ｈＡｂ－２３軽鎖のアミノ酸配列
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＬＥＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２１
＞ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異を含む）のアミノ酸配列
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号２２
＞ヒトκ軽鎖定常領域のアミノ酸配列
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号２３
ヒト抗体ｈＡｂ－２３のＣＤＲは、表５に示されている：
【0124】
【表5】
【0125】
備考：表中、抗体ＣＤＲのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって決定されて注釈されている。
実施例３． 抗ヒトＫＬＢマウス抗体のヒト化
実施例３． 抗ヒトＫＬＢマウス抗体のヒト化
【0126】
ヒト抗体重軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子データベースとのアラインメント及びＭＯＥソフトウェアにより、相同性の高い重軽鎖可変領域生殖細胞系遺伝子をそれぞれテンプレートとして選択し、マウス抗体のＣＤＲを対応するヒトテンプレートにそれぞれグラフト（ｇｒａｆｔ）して、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４という順の可変領域配列を形成し、そして可変領域配列をヒト定常領域配列と融合し、ヒト化抗体を得た。以下、ｍＡｂ－９９及びｍＡｂ－１８マウス抗体のヒト化を例示的に記載する：
１． ｍＡｂ－９９のヒト化
ｍＡｂ－９９抗体のヒト化重鎖のテンプレートとしては、ＩＧＨＶ１－３＊０１／ＩＧＨＪ６＊０１を選択し、即ち、ヒト生殖細胞系重鎖ＩＧＨＶ１－３＊０１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＩＧＨＪ６＊０１のＪＨ６領域（ＦＲ４として）をヒト化抗体重鎖フレームワーク領域として選択し、軽鎖のテンプレートとしては、ＩＧＫＶ１－３９＊０１／ＩＧＫＪ４＊０１を選択し、即ち、ヒト生殖細胞系軽鎖ＩＧＫＶ１－３９＊０１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＩＧＫＪ４＊０１のＪＫ４領域（ＦＲ４として）をヒト化抗体軽鎖フレームワーク領域として選択した。まず、マウス抗体ｍＡｂ－９９のＣＤＲ領域を選択されたヒト化テンプレートに移植し、ヒトテンプレートのＣＤＲ領域を置換してｍＡｂ－９９のヒト化抗体の可変領域配列を得た。その後、ヒト化抗体の重鎖可変領域における１、２４、４４、７１及び／又は９１番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）のアミノ酸残基に復帰変異を行い、軽鎖可変領域における２、４、３６、３８、４３、４４及び／又は５８番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）のアミノ酸残基に復帰変異を行い、ヒト化抗体の重／軽鎖可変領域を得て、具体的な配列は以下の通りである：
＞ｈＡｂ９９ＶＨ１のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｑ１Ｅ、Ｒ７１Ｓ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＧＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号３０
＞ｈＡｂ９９ＶＨ２のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｑ１Ｅ、Ｒ４４Ｇ、Ｒ７１Ｓ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＧＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号３１
＞ｈＡｂ９９ＶＨ３のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｑ１Ｅ、Ａ２４Ｔ、Ｒ４４Ｇ、Ｒ７１Ｓ、Ｙ９１Ｆ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＧＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号３２
＞ｈＡｂ９９ＶＬ１のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｐ４４Ｎ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＳＩＳＫＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＮＫＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＮＥＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号３３
＞ｈＡｂ９９ＶＬ２のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｙ３６Ｆ、Ａ４３Ｔ、Ｐ４４Ｎ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＳＩＳＫＦＬＡＷＦＱＱＫＰＧＫＴＮＫＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＮＥＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号３４
＞ｈＡｂ９９ＶＬ３のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｉ２Ｖ、Ｍ４Ｉ、Ｙ３６Ｆ、Ａ４３Ｔ、Ｐ４４Ｎ）
ＤＶＱＩＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＳＩＳＫＦＬＡＷＦＱＱＫＰＧＫＴＮＫＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＮＥＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号３５
＞ｈＡｂ９９ＶＬ４のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｉ２Ｖ、Ｍ４Ｉ、Ｙ３６Ｆ、Ｑ３８Ｅ、Ａ４３Ｔ、Ｐ４４Ｎ、Ｖ５８Ｉ）
ＤＶＱＩＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＳＩＳＫＦＬＡＷＦＱＥＫＰＧＫＴＮＫＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＮＥＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号３６
１． ｍＡｂ－９９のヒト化
ｍＡｂ－９９抗体のヒト化重鎖のテンプレートとしては、ＩＧＨＶ１－３＊０１／ＩＧＨＪ６＊０１を選択し、即ち、ヒト生殖細胞系重鎖ＩＧＨＶ１－３＊０１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＩＧＨＪ６＊０１のＪＨ６領域（ＦＲ４として）をヒト化抗体重鎖フレームワーク領域として選択し、軽鎖のテンプレートとしては、ＩＧＫＶ１－３９＊０１／ＩＧＫＪ４＊０１を選択し、即ち、ヒト生殖細胞系軽鎖ＩＧＫＶ１－３９＊０１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＩＧＫＪ４＊０１のＪＫ４領域（ＦＲ４として）をヒト化抗体軽鎖フレームワーク領域として選択した。まず、マウス抗体ｍＡｂ－９９のＣＤＲ領域を選択されたヒト化テンプレートに移植し、ヒトテンプレートのＣＤＲ領域を置換してｍＡｂ－９９のヒト化抗体の可変領域配列を得た。その後、ヒト化抗体の重鎖可変領域における１、２４、４４、７１及び／又は９１番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）のアミノ酸残基に復帰変異を行い、軽鎖可変領域における２、４、３６、３８、４３、４４及び／又は５８番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）のアミノ酸残基に復帰変異を行い、ヒト化抗体の重／軽鎖可変領域を得て、具体的な配列は以下の通りである：
＞ｈＡｂ９９ＶＨ１のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｑ１Ｅ、Ｒ７１Ｓ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＧＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号３０
＞ｈＡｂ９９ＶＨ２のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｑ１Ｅ、Ｒ４４Ｇ、Ｒ７１Ｓ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＧＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号３１
＞ｈＡｂ９９ＶＨ３のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｑ１Ｅ、Ａ２４Ｔ、Ｒ４４Ｇ、Ｒ７１Ｓ、Ｙ９１Ｆ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＧＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号３２
＞ｈＡｂ９９ＶＬ１のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｐ４４Ｎ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＳＩＳＫＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＮＫＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＮＥＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号３３
＞ｈＡｂ９９ＶＬ２のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｙ３６Ｆ、Ａ４３Ｔ、Ｐ４４Ｎ）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＳＩＳＫＦＬＡＷＦＱＱＫＰＧＫＴＮＫＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＮＥＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号３４
＞ｈＡｂ９９ＶＬ３のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｉ２Ｖ、Ｍ４Ｉ、Ｙ３６Ｆ、Ａ４３Ｔ、Ｐ４４Ｎ）
ＤＶＱＩＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＳＩＳＫＦＬＡＷＦＱＱＫＰＧＫＴＮＫＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＮＥＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号３５
＞ｈＡｂ９９ＶＬ４のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｉ２Ｖ、Ｍ４Ｉ、Ｙ３６Ｆ、Ｑ３８Ｅ、Ａ４３Ｔ、Ｐ４４Ｎ、Ｖ５８Ｉ）
ＤＶＱＩＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＳＩＳＫＦＬＡＷＦＱＥＫＰＧＫＴＮＫＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＮＥＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
配列番号３６
【0127】
さらに、抗体重鎖可変領域のＨＣＤＲ２（ＹＩＹＩＧＮＧＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧ）の６及び７番目のアミノ酸残基にＮＧからＮＶ、ＮＬ又はＱＧへの変異を行い、新たなヒト化抗体の可変領域配列を得て、具体的に以下の通りである：
＞ｈＡｂ９９ＶＨ１－ＮＶのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＶＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４０
＞ｈＡｂ９９ＶＨ２－ＮＶのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＶＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４１
＞ｈＡｂ９９ＶＨ３－ＮＶのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＶＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４２
＞ｈＡｂ９９ＶＨ１－ＮＬのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＬＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４３
＞ｈＡｂ９９ＶＨ２－ＮＬのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＬＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４４
＞ｈＡｂ９９ＶＨ３－ＮＬのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＬＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４５
＞ｈＡｂ９９ＶＨ１－ＱＧのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＱＧＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４６
＞ｈＡｂ９９ＶＨ２－ＱＧのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＱＧＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４７
＞ｈＡｂ９９ＶＨ３－ＱＧのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＱＧＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４８
ｈＡｂ９９重鎖可変領域のＨＣＤＲ２変異配列は、下記の表６に示す通りである：
＞ｈＡｂ９９ＶＨ１－ＮＶのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＶＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４０
＞ｈＡｂ９９ＶＨ２－ＮＶのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＶＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４１
＞ｈＡｂ９９ＶＨ３－ＮＶのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＶＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４２
＞ｈＡｂ９９ＶＨ１－ＮＬのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＬＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４３
＞ｈＡｂ９９ＶＨ２－ＮＬのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＬＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４４
＞ｈＡｂ９９ＶＨ３－ＮＬのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＬＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４５
＞ｈＡｂ９９ＶＨ１－ＱＧのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＱＧＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４６
＞ｈＡｂ９９ＶＨ２－ＱＧのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＱＧＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４７
＞ｈＡｂ９９ＶＨ３－ＱＧのアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＱＧＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＦＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４８
ｈＡｂ９９重鎖可変領域のＨＣＤＲ２変異配列は、下記の表６に示す通りである：
【0128】
【表6】
【0129】
上記重鎖可変領域を重鎖定常領域（配列番号２２で示される）と融合し、軽鎖可変領域を軽鎖定常領域（配列番号２３で示される）と融合して、抗ＫＬＢ抗体を構築し、得られた抗体のＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢに対する結合活性を検出し（実験の方法は本開示の試験例２を参照する）、実験の結果を表７に示す。
【0130】
【表7】
【0131】
備考：ｍＡｂ９９－ｈＩｇＧ１は、重鎖定常領域が配列番号２２で示され、軽鎖定常領域が配列番号２３で示されるｍＡｂ９９のキメラ抗体である。
【0132】
例示的に、ｈＡｂ９９－１３抗体の軽鎖、重鎖配列は以下の通りである：
＞ｈＡｂ９９－１３抗体の重鎖のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＶＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号７８
＞ｈＡｂ９９－１３抗体の軽鎖のアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＳＩＳＫＦＬＡＷＦＱＱＫＰＧＫＴＮＫＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＮＥＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号７９
＞ｈＡｂ９９－１３抗体の重鎖のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＩＮＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＹＩＹＩＧＮＶＤＩＥＹＮＡＫＦＫＧＲＶＴＩＴＳＤＴＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＧＬＧＨＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号７８
＞ｈＡｂ９９－１３抗体の軽鎖のアミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＫＳＩＳＫＦＬＡＷＦＱＱＫＰＧＫＴＮＫＬＬＩＹＳＧＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＮＥＹＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号７９
【0133】
２． ｍＡｂ－１８のヒト化
ｍＡｂ－１８抗体ヒト化重鎖のテンプレートは、ＩＧＨＶ１－３＊０１／ＩＧＨＪ６＊０１であり、即ち、ヒト生殖細胞系重鎖ＩＧＨＶ１－３＊０１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＩＧＨＪ６＊０１のＪＨ６領域（ＦＲ４）をヒト化抗体重鎖フレームワーク領域として選択し、軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ６－２１＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１又はＩＧＫＶ３－２０＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１であり、即ち、ヒト生殖細胞系軽鎖ＩＧＫＶ６－２１＊０２又はＩＧＫＶ３－２０＊０２のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＪＧＫＪ２＊０１のＪＫ２領域（ＦＲ４として）をヒト化抗体軽鎖フレームワーク領域として選択した。まず、マウス抗体ｍＡｂ－１８のＣＤＲ領域を選択されたヒト化テンプレートに移植し、ヒトテンプレートのＣＤＲ領域を置換してｍＡｂ－１８のヒト化抗体の可変領域配列を得た。さらに、ヒト化抗体の重鎖可変領域における２４、４８、６７、６９、７１及び／又は７３番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）のアミノ酸残基に復帰変異を行い、また１番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）のアミノ酸残基に変異を行ってもよく、軽鎖可変領域の２、４５、４７、４９、５８及び／又は７１番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）のアミノ酸残基に復帰変異を行い、ヒト化抗体の可変領域配列を得て、具体的な配列は以下の通りである：
＞ｈＡｂ１８ＶＨ１のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｑ１Ｅ、Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＶＩＳＴＹＳＧＴＴＮＹＮＱＮＦＫＧＲＶＴＩＴＶＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＰＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４９
＞ｈＡｂ１８ＶＨ２のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｑ１Ｅ、Ａ２４Ｇ、Ｉ６９Ｖ、Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＧＳＧＹＴＦＴＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＶＩＳＴＹＳＧＴＴＮＹＮＱＮＦＫＧＲＶＴＶＴＶＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＰＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号５０
＞ｈＡｂ１８ＶＨ３のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｑ１Ｅ、Ａ２４Ｇ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９Ｖ、Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＧＳＧＹＴＦＴＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＶＩＳＴＹＳＧＴＴＮＹＮＱＮＦＫＧＲＡＴＶＴＶＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＰＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号５１
＞ｈＡｂ１８ＶＬ１のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ（ＩＧＫＶ６－２１＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１）＋Ｌ４７Ｗ、Ｋ４９Ｙ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５２
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ（ＩＧＫＶ６－２１＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１）＋Ｉ２Ｎ、Ｌ４７Ｗ、Ｋ４９Ｙ、Ｆ７１Ｙ）
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５３
＞ｈＡｂ１８ＶＬ３のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ（ＩＧＫＶ３－２０＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１）＋Ｒ４５Ｋ、Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５４
＞ｈＡｂ１８ＶＬ４のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ（ＩＧＫＶ３－２０＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１）＋Ｉ２Ｎ、Ｒ４５Ｋ、Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ、Ｆ７１Ｙ）
ＥＮＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５５
ｍＡｂ－１８抗体ヒト化重鎖のテンプレートは、ＩＧＨＶ１－３＊０１／ＩＧＨＪ６＊０１であり、即ち、ヒト生殖細胞系重鎖ＩＧＨＶ１－３＊０１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＩＧＨＪ６＊０１のＪＨ６領域（ＦＲ４）をヒト化抗体重鎖フレームワーク領域として選択し、軽鎖テンプレートはＩＧＫＶ６－２１＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１又はＩＧＫＶ３－２０＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１であり、即ち、ヒト生殖細胞系軽鎖ＩＧＫＶ６－２１＊０２又はＩＧＫＶ３－２０＊０２のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＪＧＫＪ２＊０１のＪＫ２領域（ＦＲ４として）をヒト化抗体軽鎖フレームワーク領域として選択した。まず、マウス抗体ｍＡｂ－１８のＣＤＲ領域を選択されたヒト化テンプレートに移植し、ヒトテンプレートのＣＤＲ領域を置換してｍＡｂ－１８のヒト化抗体の可変領域配列を得た。さらに、ヒト化抗体の重鎖可変領域における２４、４８、６７、６９、７１及び／又は７３番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）のアミノ酸残基に復帰変異を行い、また１番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）のアミノ酸残基に変異を行ってもよく、軽鎖可変領域の２、４５、４７、４９、５８及び／又は７１番目（Ｋａｂａｔ番号付けシステムによって番号付けされる）のアミノ酸残基に復帰変異を行い、ヒト化抗体の可変領域配列を得て、具体的な配列は以下の通りである：
＞ｈＡｂ１８ＶＨ１のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｑ１Ｅ、Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＶＩＳＴＹＳＧＴＴＮＹＮＱＮＦＫＧＲＶＴＩＴＶＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＰＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号４９
＞ｈＡｂ１８ＶＨ２のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｑ１Ｅ、Ａ２４Ｇ、Ｉ６９Ｖ、Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＧＳＧＹＴＦＴＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＶＩＳＴＹＳＧＴＴＮＹＮＱＮＦＫＧＲＶＴＶＴＶＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＰＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号５０
＞ｈＡｂ１８ＶＨ３のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ＋Ｑ１Ｅ、Ａ２４Ｇ、Ｍ４８Ｉ、Ｖ６７Ａ、Ｉ６９Ｖ、Ｒ７１Ｖ、Ｔ７３Ｋ）
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＧＳＧＹＴＦＴＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＩＧＶＩＳＴＹＳＧＴＴＮＹＮＱＮＦＫＧＲＡＴＶＴＶＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＰＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
配列番号５１
＞ｈＡｂ１８ＶＬ１のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ（ＩＧＫＶ６－２１＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１）＋Ｌ４７Ｗ、Ｋ４９Ｙ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５２
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ（ＩＧＫＶ６－２１＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１）＋Ｉ２Ｎ、Ｌ４７Ｗ、Ｋ４９Ｙ、Ｆ７１Ｙ）
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５３
＞ｈＡｂ１８ＶＬ３のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ（ＩＧＫＶ３－２０＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１）＋Ｒ４５Ｋ、Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５４
＞ｈＡｂ１８ＶＬ４のアミノ酸配列（Ｇｒａｆｔ（ＩＧＫＶ３－２０＊０２／ＪＧＫＪ２＊０１）＋Ｉ２Ｎ、Ｒ４５Ｋ、Ｌ４７Ｗ、Ｉ５８Ｖ、Ｆ７１Ｙ）
ＥＮＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５５
【0134】
さらに、ｈＡｂ１８ＶＬ２軽鎖可変領域のＬＣＤＲ１（ＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（配列番号１５））の２、３、５、６、７、８番目のアミノ酸残基及びＬＣＤＲ２（ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１６））の４番目のアミノ酸残基を変異させて、新たなヒト化抗体の軽鎖可変領域配列を得て、具体的な配列は以下の通りである：
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－１のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５６
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－２のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＴＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５７
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－３のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＶＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５８
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－４のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＳＴＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５９
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－５のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＴＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６０
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－６のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＬＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６１
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－７のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＮＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６２
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－８のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＴＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６３
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－９のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＶＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６４
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－１０のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＳＴＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６５
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－１１のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＴＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６６
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－１２のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＬＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６７
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－１３のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＮＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６８
ｈＡｂ１８ＶＬ２軽鎖可変領域変異配列のＣＤＲは、下記の表８に示す通りである：
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－１のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５６
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－２のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＴＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５７
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－３のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＶＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５８
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－４のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＳＴＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号５９
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－５のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＴＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６０
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－６のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＬＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６１
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－７のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＮＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６２
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－８のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＴＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６３
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－９のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＶＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６４
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－１０のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＳＴＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６５
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－１１のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＶＴＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６６
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－１２のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＳＬＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６７
＞ｈＡｂ１８ＶＬ２－１３のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＳＳＮＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ
配列番号６８
ｈＡｂ１８ＶＬ２軽鎖可変領域変異配列のＣＤＲは、下記の表８に示す通りである：
【0135】
【表8】
【0136】
上記重鎖可変領域を重鎖定常領域（配列番号２２で示される）と融合し、軽鎖可変領域を軽鎖定常領域（配列番号２３で示される）と融合して、抗ＫＬＢ抗体を構築し、得られた抗体のＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢに対する結合活性を検出し（実験の方法は本開示の試験例２を参照する）、実験の結果を表９に示す：
【0137】
【表9】
【0138】
備考：ｍＡｂ１８－ｈＩｇＧ１は、重鎖定常領域が配列番号２２で示され、軽鎖定常領域が配列番号２３で示されるｍＡｂ１８のキメラ抗体である。
【0139】
例示的に、ｈＡｂ１８－８抗体の軽・重鎖配列は以下の通りである：
＞ｈＡｂ１８－８抗体の重鎖のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＶＩＳＴＹＳＧＴＴＮＹＮＱＮＦＫＧＲＶＴＩＴＶＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＰＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号８０
＞ｈＡｂ１８－８抗体の軽鎖のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＴＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号８１
＞ｈＡｂ１８－８抗体の重鎖のアミノ酸配列
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＲＬＥＷＭＧＶＩＳＴＹＳＧＴＴＮＹＮＱＮＦＫＧＲＶＴＩＴＶＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＧＰＬＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号８０
＞ｈＡｂ１８－８抗体の軽鎖のアミノ酸配列
ＥＮＶＬＴＱＳＰＤＦＱＳＶＴＰＫＥＫＶＴＩＴＣＲＡＴＳＳＶＳＳＳＹＬＨＷＹＱＱＫＰＤＱＳＰＫＬＷＩＹＳＴＳＱＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＮＳＬＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＹＳＧＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
配列番号８１
【0140】
実施例４． 抗体の調製
１． 抗体の分子クローン
設計された抗体配列を、コドン最適化した後、ヒトコドンバイアスのコード遺伝子配列を産生し、プライマーＰＣＲを設計して各抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子断片を構築し、さらに発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）断片）と相同組換えを行い、抗体全長発現プラスミドＶＨ－ＣＨ１－ＦＣ－ｐＨｒ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＨｒを構築した。
１． 抗体の分子クローン
設計された抗体配列を、コドン最適化した後、ヒトコドンバイアスのコード遺伝子配列を産生し、プライマーＰＣＲを設計して各抗体ＶＨ／ＶＫ遺伝子断片を構築し、さらに発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチド及び定常領域遺伝子（ＣＨ１－ＦＣ／ＣＬ）断片）と相同組換えを行い、抗体全長発現プラスミドＶＨ－ＣＨ１－ＦＣ－ｐＨｒ／ＶＫ－ＣＬ－ｐＨｒを構築した。
【0141】
２． 抗体の発現及び精製
抗体重軽鎖を発現したプラスミドをそれぞれ１：１．５の割合でＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクションし、６日後に発現上清を収集し、高速遠心分離により不純物を除去し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムで精製した。Ａ２８０読取値が基線に低減されるまで、ＰＢＳでカラムを濯いだ。１００ ｍＭの酢酸ｐＨ３．０で目的タンパク質を溶離し、１ ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。溶離試料を適当に濃縮した後、ＰＢＳで平衡されたゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）によりさらに精製することで、量体を除去し、単体ピークを収集し、分注して使用に備えた。
抗体重軽鎖を発現したプラスミドをそれぞれ１：１．５の割合でＨＥＫ２９３Ｅ細胞にトランスフェクションし、６日後に発現上清を収集し、高速遠心分離により不純物を除去し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムで精製した。Ａ２８０読取値が基線に低減されるまで、ＰＢＳでカラムを濯いだ。１００ ｍＭの酢酸ｐＨ３．０で目的タンパク質を溶離し、１ ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。溶離試料を適当に濃縮した後、ＰＢＳで平衡されたゲルクロマトグラフィーＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ）によりさらに精製することで、量体を除去し、単体ピークを収集し、分注して使用に備えた。
【0142】
以下、生化学的試験方法により本開示の抗体の技術的効果を検証する
試験例１． Ｂｉａｃｏｒｅによる抗ｈＫＬＢ抗体の親和性検出実験
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａバイオセンサーチップ（Ｃａｔ． ＃２９１２７５５６、ＧＥ）で抗体を親和的に捕捉した後、チップ表面で一定濃度のｈＫＬＢ（Ｒ＆Ｄ、製品番号：５８８９－ＫＢ）を流し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器により反応シグナルをリアルタイムで検出して結合と解離曲線を得た。各試験サイクルの解離が完了した後、Ｇｌｙｃｉｎｅ１．５（Ｃａｔ． ＃ＢＲ－１００３－５４、ＧＥ）によりバイオセンサーチップを洗浄して再生した。１：１モデルを用いてデータをフィッティングし、抗体親和性データを取得し、具体的な実験の結果を下記の表１０に示す。
試験例１． Ｂｉａｃｏｒｅによる抗ｈＫＬＢ抗体の親和性検出実験
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａバイオセンサーチップ（Ｃａｔ． ＃２９１２７５５６、ＧＥ）で抗体を親和的に捕捉した後、チップ表面で一定濃度のｈＫＬＢ（Ｒ＆Ｄ、製品番号：５８８９－ＫＢ）を流し、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器により反応シグナルをリアルタイムで検出して結合と解離曲線を得た。各試験サイクルの解離が完了した後、Ｇｌｙｃｉｎｅ１．５（Ｃａｔ． ＃ＢＲ－１００３－５４、ＧＥ）によりバイオセンサーチップを洗浄して再生した。１：１モデルを用いてデータをフィッティングし、抗体親和性データを取得し、具体的な実験の結果を下記の表１０に示す。
【0143】
【表10】
【0144】
実験の結果から明らかなように、本開示の抗体は、ヒトＫＬＢに対して良好な結合機能を有する。
【0145】
試験例２． フローサイトメトリーによる抗体の細胞膜表面ＫＬＢに対する結合検出実験
フローサイトメトリー法により、ヒトＫＬＢとサルＫＬＢを過剰発現したＣＨＯＫ１細胞株ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ、ＣＨＯＫ１－ｃｙｎｏＫＬＢ（具体的な調製は実施例１を参照する）に対する抗体の結合能力を検出した。具体的に、上記細胞を１０％ＦＢＳのＩＭＤＭの培地に培養し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置き、２日間培養し、１×１０５細胞／ウェルで細胞を細胞プレートに加え、３００ ｇで５分間遠心分離し、１％のＢＳＡで１回洗浄した。勾配希釈した抗体を加え、１００ μＬ／ウェルで細胞プレートに加え、４℃で１時間インキュベートし、１％のＢＳＡで１回洗浄し、各ウェルに１００ μＬのＡＰＣ－ヒツジ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ蛍光二次抗体希釈液（１：４００）を加え、４℃で１時間インキュベートした。１％のＢＳＡでプレートを３回洗浄し、各ウェルに１００ μＬのＰＢＳを加えてプレートを読み取った。実験の結果は、下記の表１１に示す通りである。
フローサイトメトリー法により、ヒトＫＬＢとサルＫＬＢを過剰発現したＣＨＯＫ１細胞株ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ、ＣＨＯＫ１－ｃｙｎｏＫＬＢ（具体的な調製は実施例１を参照する）に対する抗体の結合能力を検出した。具体的に、上記細胞を１０％ＦＢＳのＩＭＤＭの培地に培養し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置き、２日間培養し、１×１０５細胞／ウェルで細胞を細胞プレートに加え、３００ ｇで５分間遠心分離し、１％のＢＳＡで１回洗浄した。勾配希釈した抗体を加え、１００ μＬ／ウェルで細胞プレートに加え、４℃で１時間インキュベートし、１％のＢＳＡで１回洗浄し、各ウェルに１００ μＬのＡＰＣ－ヒツジ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ蛍光二次抗体希釈液（１：４００）を加え、４℃で１時間インキュベートした。１％のＢＳＡでプレートを３回洗浄し、各ウェルに１００ μＬのＰＢＳを加えてプレートを読み取った。実験の結果は、下記の表１１に示す通りである。
【0146】
【表11】
【0147】
実験の結果から示されるように、本開示の抗体ｈＡｂ９９－１３、ｈＡｂ１８－８及びｈＡｂ－２３は、何れも強い結合能力で細胞膜表面のヒトＫＬＢ及びサルＫＬＢに結合することができる。
【0148】
試験例３． ＫＬＢに対する抗体とＦＧＦ１９／ＦＧＦ２１の競合的結合実験
Ｂｉｏ－ＦＧＦ２１／Ｂｉｏ－ＦＧＦ１９（ＦＧＦ２１は配列番号７６で示され、ＦＧＦ１９は配列番号７７で示され、それぞれＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（ＤＯＪＩＮＤＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入、ＬＫ０３）によりＦＧＦ２１とＦＧＦ１９をＢｉｏｔｉｎで標識することで得られた）を２ μｇ／ｍＬの濃度でＳＡセンサー（８０秒間インキュベート）に固定化した後、センサーを、ＫＬＢ（Ｒ＆Ｄ、５８８９－ＫＢ－１ ｍｇ）を含むか又はＫＬＢ＋抗体予備混合物（予め少なくとも１５分間インキュベートしておいた）を含む試料ウェルに移し、１８０秒間結合させた。ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＯＣＴＥＴ ＨＴＸ機器により反応シグナルをリアルタイムで検出し、結合曲線を得た。実験の結果は、下記の表１２に示す通りである。
Ｂｉｏ－ＦＧＦ２１／Ｂｉｏ－ＦＧＦ１９（ＦＧＦ２１は配列番号７６で示され、ＦＧＦ１９は配列番号７７で示され、それぞれＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ２（ＤＯＪＩＮＤＯ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入、ＬＫ０３）によりＦＧＦ２１とＦＧＦ１９をＢｉｏｔｉｎで標識することで得られた）を２ μｇ／ｍＬの濃度でＳＡセンサー（８０秒間インキュベート）に固定化した後、センサーを、ＫＬＢ（Ｒ＆Ｄ、５８８９－ＫＢ－１ ｍｇ）を含むか又はＫＬＢ＋抗体予備混合物（予め少なくとも１５分間インキュベートしておいた）を含む試料ウェルに移し、１８０秒間結合させた。ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＯＣＴＥＴ ＨＴＸ機器により反応シグナルをリアルタイムで検出し、結合曲線を得た。実験の結果は、下記の表１２に示す通りである。
【0149】
【表12】
【0150】
備考：単独ＫＬＢタンパク質のＢｉｏ－ＦＧＦ２１又はＢｉｏ－ＦＧＦ１９への結合シグナルを１００％と定義した
実験の結果から明らかなように、本開示のｈＡｂ９９－１３、ｈＡｂ１８－８及びｈＡｂ－２３は、何れもＫＬＢに対してＦＧＦ２１又はＦＧＦ１９と競合的に結合しない。
実験の結果から明らかなように、本開示のｈＡｂ９９－１３、ｈＡｂ１８－８及びｈＡｂ－２３は、何れもＫＬＢに対してＦＧＦ２１又はＦＧＦ１９と競合的に結合しない。
【0151】
試験例４． 組換え細胞株ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃに対する抗体のアゴニスト活性検出実験
以下、インビトロ細胞実験により被験抗体の組換え細胞株ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ（実施例１参照）への活性化作用を測定し、ＧＡＬ４結合要素（ＧＡＬ４ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）により調節されるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子及びＧＡＬ４－Ｅｌｋ１融合タンパク質遺伝子を組換え細胞株に一過性導入し、その活性化活性をＥＣ５０値で示す。実験の方法は、以下の通りである：
実験初日に、１０％のＦＢＳ、１０ μｇ／ｍＬのｐｕｒｏｍｙｃｉｎ及び８００ μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＤＭＥ／Ｆ１２培地を用いて、ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞を１５，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３９０３）に接種し、１ウェルあたり１００ μＬの細胞懸濁液であり、９６ウェルプレートの外周に１００ μＬのＰＢＳのみを加えた。３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて一晩培養した。翌日、培地を捨て、各ウェルに５０ μＬの飢餓培地（ＦＢＳフリーのＤＭＥ／Ｆ１２）を加えた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００によりｐＦＡ２－Ｅｌｋ１及びｐＦＲ－Ｌｕｃを１：６の割合で細胞にトランスフェクションし、各ウェルにプラスミドとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００の混合物１０ μＬを加えた。トランスフェクションした後、ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに２４時間置いた。３日目に、各ウェルに、飢餓培地で勾配希釈した測定待ちの抗体６０ μＬを加え、抗体の最終濃度が２００ ｎＭから４倍勾配希釈した９つの濃度ポイントとされ、飢餓培地をブランク対照ウェルとして設定し、ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて２４時間培養した。４日目に、９６ウェル細胞培養プレートを取り出し、各ウェルにＯｎｅ－ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（シグナル活性化蛍光アッセイ試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６１２０）５５ μＬを加え、多機能マイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ２０１５、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により発光シグナル値を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにより、抗体の対数濃度及びシグナル値からカーブフィッティングを行い、ＥＣ５０値を算出した。活性化倍数＝試料の最大シグナル値／ブランク対照のシグナル値であり、抗体の最高濃度で、抗体のＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ受容体への活性化程度については、活性化倍数が大きいほど、活性化程度が大きくなることが示される。実験においてＭＫ３６５５（ＷＯ２０１５１１２８８６Ａ２中の抗ＫＬＢ抗体ｈ５Ｈ２３を参照）を対照として加え、実験の結果は、下記の表１３に示す通りである。
以下、インビトロ細胞実験により被験抗体の組換え細胞株ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ（実施例１参照）への活性化作用を測定し、ＧＡＬ４結合要素（ＧＡＬ４ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）により調節されるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子及びＧＡＬ４－Ｅｌｋ１融合タンパク質遺伝子を組換え細胞株に一過性導入し、その活性化活性をＥＣ５０値で示す。実験の方法は、以下の通りである：
実験初日に、１０％のＦＢＳ、１０ μｇ／ｍＬのｐｕｒｏｍｙｃｉｎ及び８００ μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＤＭＥ／Ｆ１２培地を用いて、ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞を１５，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３９０３）に接種し、１ウェルあたり１００ μＬの細胞懸濁液であり、９６ウェルプレートの外周に１００ μＬのＰＢＳのみを加えた。３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて一晩培養した。翌日、培地を捨て、各ウェルに５０ μＬの飢餓培地（ＦＢＳフリーのＤＭＥ／Ｆ１２）を加えた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００によりｐＦＡ２－Ｅｌｋ１及びｐＦＲ－Ｌｕｃを１：６の割合で細胞にトランスフェクションし、各ウェルにプラスミドとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００の混合物１０ μＬを加えた。トランスフェクションした後、ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに２４時間置いた。３日目に、各ウェルに、飢餓培地で勾配希釈した測定待ちの抗体６０ μＬを加え、抗体の最終濃度が２００ ｎＭから４倍勾配希釈した９つの濃度ポイントとされ、飢餓培地をブランク対照ウェルとして設定し、ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて２４時間培養した。４日目に、９６ウェル細胞培養プレートを取り出し、各ウェルにＯｎｅ－ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（シグナル活性化蛍光アッセイ試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６１２０）５５ μＬを加え、多機能マイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ２０１５、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により発光シグナル値を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにより、抗体の対数濃度及びシグナル値からカーブフィッティングを行い、ＥＣ５０値を算出した。活性化倍数＝試料の最大シグナル値／ブランク対照のシグナル値であり、抗体の最高濃度で、抗体のＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ受容体への活性化程度については、活性化倍数が大きいほど、活性化程度が大きくなることが示される。実験においてＭＫ３６５５（ＷＯ２０１５１１２８８６Ａ２中の抗ＫＬＢ抗体ｈ５Ｈ２３を参照）を対照として加え、実験の結果は、下記の表１３に示す通りである。
【0152】
【表13】
【0153】
実験の結果から示されるように、本開示の抗体は、ＣＨＯＫ１－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞に対して明らかな活性化活性を有するとともに、活性化程度が対照分子よりも強い。
【0154】
試験例５． ヒトＫＬＢ及びヒトＦＧＦＲ１ｃを発現するＨＥＫ２９３Ｔに対する抗体のアゴニスト活性検出実験
以下、インビトロ細胞実験により、ヒトＫＬＢとヒトＦＧＦＲ１ｃを一過性発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞ＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ（実施例１参照）に対する被験抗体の活性化作用を測定し、ヒトＫＬＢ、ヒトＦＧＦＲ１ｃ及びリン酸化Ｅｌｋにより調節されるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子を細胞株に一過性導入し、その活性化活性をＥＣ５０値で示す。具体的な方法は、以下の通りである：
実験初日に、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／ＨＩＧＨ ＧＬＵＣＯＳＥ培地を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４００００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＢｉｏＣｏａｔ、＃３５６６９２）に接種し、１ウェルあたり１００ μＬの細胞懸濁液であり、９６ウェルプレートの外周に１００ μＬのＰＢＳのみを加えた。ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて一晩培養した。翌日、元の培地を捨て、各ウェルに５０ μＬの飢餓培地（ＦＢＳフリーのＤＭＥＭ／ＨＩＧＨ ＧＬＵＣＯＳＥ）を加えた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００により、ＳＲＥ－Ｌｕｃ２Ｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１３４０）、ｈＫＬＢ（配列がＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｑ８６Ｚ１４を参照）及びｈＦＧＦＲ１ｃ（配列がＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ１１３６２を参照）を３０：９：１の割合で細胞にトランスフェクションした。各ウェルにプラスミドとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００の混合物１０ μＬを加えた。トランスフェクションした後、ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに２４時間置いた。３日目に、各ウェルに、飢餓培地で勾配希釈した測定待ちの抗体６０ μＬを加え、抗体の最終濃度が２００ ｎＭから４倍勾配希釈した９つの濃度ポイントとされ、飢餓培地をブランク対照ウェルとして設定し、ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて２４時間培養した。４日目に、９６ウェル細胞培養プレートを取り出し、各ウェルにＯｎｅ－ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６１２０）６０ μＬを加え、多機能マイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ２０１５、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により発光シグナル値を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにより、抗体の対数濃度及びシグナル値からカーブフィッティングを行い、ＥＣ５０値を算出した。活性化倍数＝試料の最大シグナル値／ブランク対照のシグナル値であり、抗体の最高濃度で、抗体のＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ受容体への活性化程度については、活性化倍数が大きいほど、活性化程度が大きくなることが示される。実験の結果は、表１４に示されている。
以下、インビトロ細胞実験により、ヒトＫＬＢとヒトＦＧＦＲ１ｃを一過性発現したＨＥＫ２９３Ｔ細胞ＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃ（実施例１参照）に対する被験抗体の活性化作用を測定し、ヒトＫＬＢ、ヒトＦＧＦＲ１ｃ及びリン酸化Ｅｌｋにより調節されるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅレポーター遺伝子を細胞株に一過性導入し、その活性化活性をＥＣ５０値で示す。具体的な方法は、以下の通りである：
実験初日に、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／ＨＩＧＨ ＧＬＵＣＯＳＥ培地を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４００００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＢｉｏＣｏａｔ、＃３５６６９２）に接種し、１ウェルあたり１００ μＬの細胞懸濁液であり、９６ウェルプレートの外周に１００ μＬのＰＢＳのみを加えた。ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて一晩培養した。翌日、元の培地を捨て、各ウェルに５０ μＬの飢餓培地（ＦＢＳフリーのＤＭＥＭ／ＨＩＧＨ ＧＬＵＣＯＳＥ）を加えた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００により、ＳＲＥ－Ｌｕｃ２Ｐ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ１３４０）、ｈＫＬＢ（配列がＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｑ８６Ｚ１４を参照）及びｈＦＧＦＲ１ｃ（配列がＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ１１３６２を参照）を３０：９：１の割合で細胞にトランスフェクションした。各ウェルにプラスミドとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００の混合物１０ μＬを加えた。トランスフェクションした後、ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに２４時間置いた。３日目に、各ウェルに、飢餓培地で勾配希釈した測定待ちの抗体６０ μＬを加え、抗体の最終濃度が２００ ｎＭから４倍勾配希釈した９つの濃度ポイントとされ、飢餓培地をブランク対照ウェルとして設定し、ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて２４時間培養した。４日目に、９６ウェル細胞培養プレートを取り出し、各ウェルにＯｎｅ－ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６１２０）６０ μＬを加え、多機能マイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ２０１５、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により発光シグナル値を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにより、抗体の対数濃度及びシグナル値からカーブフィッティングを行い、ＥＣ５０値を算出した。活性化倍数＝試料の最大シグナル値／ブランク対照のシグナル値であり、抗体の最高濃度で、抗体のＫＬＢ＆ＦＧＦＲ１ｃ受容体への活性化程度については、活性化倍数が大きいほど、活性化程度が大きくなることが示される。実験の結果は、表１４に示されている。
【0155】
【表14】
【0156】
実験の結果から示されるように、本開示の抗体は、ＨＥＫ２９３Ｔ－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ１ｃに対して明らかなアゴニスト活性を有するとともに、対照分子よりも強い。
【0157】
試験例６． 抗体の組換え細胞株ＨＥＫ２９３－ｈＦＧＦＲ１ｃへの活性化作用検出実験
抗体のヒトＫＬＢとヒトＦＧＦＲ１ｃ安定細胞株への活性化がヒトＫＬＢに依存することを検証するために、本試験例は、ヒトＦＧＦＲ１ｃ（配列がＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ１１３６２を参照）を安定的に発現したＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１５７３）細胞ＨＥＫ２９３－ｈＦＧＦＲ１ｃに対する被験抗体の活性化作用を測定した。具体的な方法は、以下の通りである：
実験初日に、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／ＨＩＧＨ ＧＬＵＣＯＳＥ培地を用いて、ＨＥＫ２９３－ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞を２５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３９０３）に接種し、１ウェルあたり１００ μＬの細胞懸濁液であり、９６ウェルプレートの外周に１００ μＬのＰＢＳのみを加えた。ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて一晩培養した。翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００によりＳＲＥ－Ｌｕｃ２Ｐを細胞にトランスフェクションし、各ウェルにプラスミドとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００の混合物１０ μＬを加えた。トランスフェクションした後、ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに２４時間置いた。３日目に、各ウェルに、播種培地で勾配希釈した測定待ちの抗体１０ μＬを加え、抗体の最終濃度が２００ ｎＭから４倍勾配希釈した９つ目の濃度ポイントとされ、播種培地をブランク対照ウェルとして設定し、ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて１６時間培養した。４日目に、９６ウェル細胞培養プレートを取り出し、各ウェルにＯｎｅ－ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（シグナル活性化蛍光アッセイ試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６１２０）６０ μＬを加え、多機能マイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ２０１５、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により発光シグナル値を読み取った。測定待ちの抗体のシグナル値とブランク対照の読取値との比率は、抗体のＦＧＦＲ１ｃへの活性化活性を示し、活性化倍数＝試料の最大シグナル値／ブランク対照のシグナル値であり、試料の最高濃度で、抗体のＨＥＫ２９３－ｈＦＧＦＲ１ｃへの活性化程度については、活性化倍数が大きいほど、活性化程度が大きくなることが示される。実験においてＦＧＦ２（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１００１４－ＨＮＡＥ）を対照として加えた。実験の結果は、表１５に示されている。
抗体のヒトＫＬＢとヒトＦＧＦＲ１ｃ安定細胞株への活性化がヒトＫＬＢに依存することを検証するために、本試験例は、ヒトＦＧＦＲ１ｃ（配列がＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｐ１１３６２を参照）を安定的に発現したＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１５７３）細胞ＨＥＫ２９３－ｈＦＧＦＲ１ｃに対する被験抗体の活性化作用を測定した。具体的な方法は、以下の通りである：
実験初日に、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／ＨＩＧＨ ＧＬＵＣＯＳＥ培地を用いて、ＨＥＫ２９３－ｈＦＧＦＲ１ｃ細胞を２５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３９０３）に接種し、１ウェルあたり１００ μＬの細胞懸濁液であり、９６ウェルプレートの外周に１００ μＬのＰＢＳのみを加えた。ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて一晩培養した。翌日、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００によりＳＲＥ－Ｌｕｃ２Ｐを細胞にトランスフェクションし、各ウェルにプラスミドとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００の混合物１０ μＬを加えた。トランスフェクションした後、ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに２４時間置いた。３日目に、各ウェルに、播種培地で勾配希釈した測定待ちの抗体１０ μＬを加え、抗体の最終濃度が２００ ｎＭから４倍勾配希釈した９つ目の濃度ポイントとされ、播種培地をブランク対照ウェルとして設定し、ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて１６時間培養した。４日目に、９６ウェル細胞培養プレートを取り出し、各ウェルにＯｎｅ－ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（シグナル活性化蛍光アッセイ試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ６１２０）６０ μＬを加え、多機能マイクロプレートリーダー（ＥｎＶｉｓｉｏｎ２０１５、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により発光シグナル値を読み取った。測定待ちの抗体のシグナル値とブランク対照の読取値との比率は、抗体のＦＧＦＲ１ｃへの活性化活性を示し、活性化倍数＝試料の最大シグナル値／ブランク対照のシグナル値であり、試料の最高濃度で、抗体のＨＥＫ２９３－ｈＦＧＦＲ１ｃへの活性化程度については、活性化倍数が大きいほど、活性化程度が大きくなることが示される。実験においてＦＧＦ２（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１００１４－ＨＮＡＥ）を対照として加えた。実験の結果は、表１５に示されている。
【0158】
【表15】
【0159】
実験の結果から明らかなように、本開示の抗体は、ＨＥＫ２９３－ｈＦＧＦＲ１ｃに対して活性化活性が弱いので、本開示の抗体のヒトＫＬＢ及びヒトＦＧＦＲ１ｃ安定細胞株に対する活性化はヒトＫＬＢに依存することが示される。
【0160】
試験例７． 抗体によるＦＧＦＲ２ｃ／ＦＧＦＲ３ｃ／ＦＧＦＲ４を発現したＬ６／ｈＫＬＢ細胞のＥＲＫリン酸化レベルの測定
以下、インビトロ細胞実験により、ヒトＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ又はＦＧＦＲ４を発現したＬ６／ｈＫＬＢ細胞株のＥＲＫリン酸化レベルの向上に対する被験抗体の作用を測定することにより、抗体のＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ又はＦＧＦＲ４に対する選択性を測定した。具体的な方法は、以下の通りである：
まず、レンチウィルス感染法により、ヒトＫＬＢ（配列がＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｑ８６Ｚ１４を参照）を安定的に発現するＬ６－ｈＫＬＢモノクローナル細胞株（Ｌ６細胞がＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１４５８に由来）を構築した後、レンチウィルス感染法により、ヒトＦＧＦＲ２ｃ（ｈｕｍａｎ ＦＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２ｃ）、ヒトＦＧＦＲ３ｃ（ｈｕｍａｎ ＦＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３ｃ）及びヒトＦＧＦＲ４（ｈｕｍａｎ ＦＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）を安定的に発現するＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及びＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞をそれぞれ構築した。実験初日に、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１００９９－１４１Ｃ）を含むＤＭＥＭ／ＨＩＧＨ ＧＬＵＣＯＳＥ培地（ＧＥ、ＳＨ３０２４３．０１）を用いて、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及びＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞をそれぞれ２５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに接種し、各ウェルに１００ μＬの細胞懸濁液を加え、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて一晩培養した。翌日、ウェルプレートにおける完全培地を廃棄し、０．１％のＦａｔｔｙ－ｆｒｅｅ ＢＳＡ（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａ６０２４４８）を含むＤＭＥＭ／ＨＩＧＨ ＧＬＵＣＯＳＥ培地９０ μＬを各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置いて１時間インキュベートした。各ウェルに、ＰＢＳで勾配希釈した測定待ちの抗体１０ μＬを加え、抗体の最終濃度が５０又は５００ ｎＭから４倍勾配希釈した９つの濃度ポイントとされ、抗体を含まないブランク対照細胞ウェルを設定し、ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置いて１５分間インキュベートした。Ａｄｖａｎｃｅｄ ＥＲＫ ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｔ２０２／Ｙ２０４ ｋｉｔ（Ｃｉｓｂｉｏ、６４ＡＥＲＰＥＨ）及びＥＲＫ ｔｏｔａｌ Ｋｉｔ（Ｃｉｓｂｉｏ、６４ＮＲＫＰＥＨ）を利用し、取扱説明書の操作手順に従って細胞溶解液におけるｐＥＲＫとｔｏｔａｌ ＥＲＫのレベルを検出した。ＰＨＥＲＡｓｔａｒ多機能プレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）により、３３７ ｎｍの波長で励起し、６６５ ｎｍと６２０ ｎｍの波長で発光した蛍光値を読み取った。比率＝シグナル値６６５ｎｍ／シグナル値６２０ｎｍという式によって化合物の各濃度に対応するｐＥＲＫのｔｏｔａｌ ＥＲＫに対する比率をそれぞれ算出した。抗体の最高濃度でのｐＥＲＫ／ｔｏｔａｌ ＥＲＫの比率をブランク対照ウェルの比率で割ることで、Ｓ／Ｎ値、即ち、活性化倍数を算出し、活性化倍数が大きいほど、活性化程度が大きくなることが示される。本開示の抗体のＥＲＫリン酸化レベルに対する活性化活性は上記分析から得られ、実験においてＡＫＲ００１（ＷＯ２０１０１２９５０３Ａ１中の配列番号４７のＦＧＦ２１類似体を参照）を対照として加えた。実験の結果は、下記の表１６に示す通りである：
以下、インビトロ細胞実験により、ヒトＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ又はＦＧＦＲ４を発現したＬ６／ｈＫＬＢ細胞株のＥＲＫリン酸化レベルの向上に対する被験抗体の作用を測定することにより、抗体のＦＧＦＲ２ｃ、ＦＧＦＲ３ｃ又はＦＧＦＲ４に対する選択性を測定した。具体的な方法は、以下の通りである：
まず、レンチウィルス感染法により、ヒトＫＬＢ（配列がＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ：Ｑ８６Ｚ１４を参照）を安定的に発現するＬ６－ｈＫＬＢモノクローナル細胞株（Ｌ６細胞がＡＴＣＣ、ＣＲＬ－１４５８に由来）を構築した後、レンチウィルス感染法により、ヒトＦＧＦＲ２ｃ（ｈｕｍａｎ ＦＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２ｃ）、ヒトＦＧＦＲ３ｃ（ｈｕｍａｎ ＦＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３ｃ）及びヒトＦＧＦＲ４（ｈｕｍａｎ ＦＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）を安定的に発現するＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及びＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞をそれぞれ構築した。実験初日に、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１００９９－１４１Ｃ）を含むＤＭＥＭ／ＨＩＧＨ ＧＬＵＣＯＳＥ培地（ＧＥ、ＳＨ３０２４３．０１）を用いて、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及びＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞をそれぞれ２５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに接種し、各ウェルに１００ μＬの細胞懸濁液を加え、３７℃、５％ＣＯ２の細胞インキュベーターに置いて一晩培養した。翌日、ウェルプレートにおける完全培地を廃棄し、０．１％のＦａｔｔｙ－ｆｒｅｅ ＢＳＡ（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａ６０２４４８）を含むＤＭＥＭ／ＨＩＧＨ ＧＬＵＣＯＳＥ培地９０ μＬを各ウェルに加え、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置いて１時間インキュベートした。各ウェルに、ＰＢＳで勾配希釈した測定待ちの抗体１０ μＬを加え、抗体の最終濃度が５０又は５００ ｎＭから４倍勾配希釈した９つの濃度ポイントとされ、抗体を含まないブランク対照細胞ウェルを設定し、ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターに置いて１５分間インキュベートした。Ａｄｖａｎｃｅｄ ＥＲＫ ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｔ２０２／Ｙ２０４ ｋｉｔ（Ｃｉｓｂｉｏ、６４ＡＥＲＰＥＨ）及びＥＲＫ ｔｏｔａｌ Ｋｉｔ（Ｃｉｓｂｉｏ、６４ＮＲＫＰＥＨ）を利用し、取扱説明書の操作手順に従って細胞溶解液におけるｐＥＲＫとｔｏｔａｌ ＥＲＫのレベルを検出した。ＰＨＥＲＡｓｔａｒ多機能プレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）により、３３７ ｎｍの波長で励起し、６６５ ｎｍと６２０ ｎｍの波長で発光した蛍光値を読み取った。比率＝シグナル値６６５ｎｍ／シグナル値６２０ｎｍという式によって化合物の各濃度に対応するｐＥＲＫのｔｏｔａｌ ＥＲＫに対する比率をそれぞれ算出した。抗体の最高濃度でのｐＥＲＫ／ｔｏｔａｌ ＥＲＫの比率をブランク対照ウェルの比率で割ることで、Ｓ／Ｎ値、即ち、活性化倍数を算出し、活性化倍数が大きいほど、活性化程度が大きくなることが示される。本開示の抗体のＥＲＫリン酸化レベルに対する活性化活性は上記分析から得られ、実験においてＡＫＲ００１（ＷＯ２０１０１２９５０３Ａ１中の配列番号４７のＦＧＦ２１類似体を参照）を対照として加えた。実験の結果は、下記の表１６に示す通りである：
【0161】
【表16】
【0162】
実験の結果から示されるように、本開示の抗体は、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ２ｃ、Ｌ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ３ｃ及びＬ６－ｈＫＬＢ＆ｈＦＧＦＲ４細胞への活性化作用が対照分子ＡＫＲ００１よりも弱い。
【0163】
試験例８． 抗体のインビボ薬効実験
本実験は、アカゲザル種から自発された非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルを選択し、ＭＲＩイメージング技術と肝生検技術により、抗体による肝臓における脂肪含有量、ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ）スコア、体重、ＢＭＩ（Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ Ｉｎｄｅｘ）、腹囲及び糖・脂質代謝への影響を評価した。
本実験は、アカゲザル種から自発された非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）モデルを選択し、ＭＲＩイメージング技術と肝生検技術により、抗体による肝臓における脂肪含有量、ＮＡＳ（ＮＡＦＬＤ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ）スコア、体重、ＢＭＩ（Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ Ｉｎｄｅｘ）、腹囲及び糖・脂質代謝への影響を評価した。
【0164】
実験の方法：ＮＡＳＨアカゲザルを３５日間馴化飼育し、その間にアカゲザルの糖・脂質代謝指標を検定し、超音波ガイド下の肝生検病理検査を行い、ＭＲＩ（ＧＥ、３Ｔ）により肝内脂肪含有量を定量的に分析し、肝内脂肪含有量指標が安定したアカゲザルをスクリーニングして、ｈＡｂ９９－１３群（１３ ｍｇ／ｋｇ）、ｈＡｂ１８－８群（１３ ｍｇ／ｋｇ）及びプラセボ群（溶媒対照群、１０ ｍＭの氷酢酸、９％のスクロース、ｐＨ５．２）という３群に等分した。各群には、静脈内注射で２週間ごとに１回、合計５回投与した。投与後に、ＭＲＩ（ＧＥ、３Ｔ）により肝内脂肪含有量を定量的に分析し、ＧＥ超音波ガイド下で肝生検を行い、投与前後のアカゲザルの座高及び腹囲を調べ、アカゲザルの糖・脂質代謝、肝機能指標及び体重を定期的に検出し、その平均値を算出した。実験の結果は表１７－１～表１７－１０に示されており、ここで、
肝内脂肪含有量についての実験結果は表１７－１に示され、実験の結果から示されるように、プラセボ群は投与前及び投与後６０日目（Ｄ６０）に、ＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）パーセンテージに明らかな変化が認められいが、ｈＡｂ９９－１３群は投与後６０日目に、ＲＯＩ％値が投与前（Ｄ０）の８．４％から６．６％へと明らかに低減されている（Ｐ＜０．０５）。
肝内脂肪含有量についての実験結果は表１７－１に示され、実験の結果から示されるように、プラセボ群は投与前及び投与後６０日目（Ｄ６０）に、ＲＯＩ（Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）パーセンテージに明らかな変化が認められいが、ｈＡｂ９９－１３群は投与後６０日目に、ＲＯＩ％値が投与前（Ｄ０）の８．４％から６．６％へと明らかに低減されている（Ｐ＜０．０５）。
【0165】
【表17】
【0166】
注：表中、変化率＝（現在値－ベースライン値）／ベースライン値＊１００％であり、ここで、ベースライン値は投与前のＲＯＩ（％）であり、現在値は検出待ちの時点（Ｄ６０）でのＲＯＩ（％）である
肝組織生検の病理学的分析の結果は表１７－２に示され、実験の結果から示されるように、プラセボ群は、投与前後の肝組織の病理学的結果に明らかな改善が認められいが、ｈＡｂ９９－１３投与群は、投与前と比較して、投与後の６５日目に平均ＮＡＳスコアが３．７から２．７に低減され、脂肪変化スコアも明らかに低下している。
肝組織生検の病理学的分析の結果は表１７－２に示され、実験の結果から示されるように、プラセボ群は、投与前後の肝組織の病理学的結果に明らかな改善が認められいが、ｈＡｂ９９－１３投与群は、投与前と比較して、投与後の６５日目に平均ＮＡＳスコアが３．７から２．７に低減され、脂肪変化スコアも明らかに低下している。
【0167】
【表18】
【0168】
注：Ｄ０は投与前の測定値であり、Ｄ６５は初回投与後の６５日目の測定値である。
【0169】
抗体の膵島機能への影響についての実験結果は、表１７－３及び表１７－４に示されている。実験の結果から示されるように、各実験群のＡＵＣＩｎｓ０～３０ ｍｉｎは何れも低減され、ｈＡｂ９９－１３及びｈＡｂ１８－８は５０％を超える程度低減され、ｈＡｂ９９－１３群及びｈＡｂ１８－８群は投与後に、ＨＯＭＡ－ＩＲ（インスリン抵抗性レベルの評価に用いられ、インスリン抵抗性レベルの上昇につれて上昇する恒常性モデル評価－インスリン抵抗性指数）が比較的大幅に低減されている。
【0170】
【表19】
【0171】
備考：変化率＝（現在値－ベースライン値）／ベースライン値＊１００％であり、ここで、ベースライン値は投与前のＡＵＣＩｎｓ０～３０ ｍｉｎ（Ｕ＊ｍｉｎ／Ｌ）であり、現在値は検出待ちの時点（Ｄ６５）でのＡＵＣＩｎｓ０～３０ ｍｉｎ（Ｕ＊ｍｉｎ／Ｌ）である
【0172】
【表20】
【0173】
備考：ＨＯＭＡ－ＩＲ変化率＝（現在値－ベースライン値）／ベースライン値＊１００％であり、ここで、ベースライン値は投与前のＨＯＭＡ－ＩＲであり、現在値は投与後の検出待ちの時点でのＨＯＭＡ－ＩＲである。
【0174】
抗体によるＮＡＳＨアカゲザルの空腹時血糖（ＦＰＧ）及び空腹時インスリン（ＦＰＩ）への影響についての実験結果は、表１７－５及び表１７－６に示されている。実験の結果から示されるように、プラセボ群は、投与前後に動物のＦＰＧ及びＦＰＩに明らかな変化が認められないが、抗体投与群は、ＦＰＧとＦＰＩが両方とも明らかに低減されている。
【0175】
【表21】
【0176】
備考：Ｄ０は投与前、Ｄ７は初回投与後の７日目であり、ＦＰＧ変化率＝（現在値－ベースライン値）／ベースライン値＊１００％であり、ここで、ベースライン値は投与前のＦＰＧ値であり、現在値は投与後の検出待ちの時点でのＦＰＧ値である。
【0177】
【表22】
【0178】
備考：Ｄ０は投与前、Ｄ７は初回投与後の７日目であり、変化率＝（現在値－ベースライン値）／ベースライン値＊１００％であり、ここで、ベースライン値は投与前のＦＰＩ値であり、現在値は投与後の検出待ちの時点でのＦＰＩ値である。
【0179】
抗体によるＮＡＳＨアカゲザルＴＧへの影響についての実験結果は、表１７－７に示されている。実験の結果から示されるように、プラセボ群はＴＧに明らかな変化が認められないが、ｈＡｂ９９－１３投与群はＴＧが若干低下している。
【0180】
【表23】
【0181】
備考：Ｄ０は投与前、Ｄ７は初回投与後の７日目であり、変化率＝（現在値－ベースライン値）／ベースライン値＊１００％であり、ここで、ベースライン値は投与前のＴＧ値であり、現在値は投与後の検出待ちの時点でのＴＧ値である。
【0182】
抗体によるＮＡＳＨアカゲザルのアディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）への影響についての実験結果は表１７－８に示され、実験の結果から示されるように、プラセボ群は、動物のアディポネクチンが減少する傾向があり、本開示の抗体投与群は、アディポネクチンが若干上昇している。
【0183】
【表24】
【0184】
備考：Ｄ０は投与前、Ｄ７は初回投与後の７日目であり、変化率＝（現在値－ベースライン値）／ベースライン値＊１００％であり、ここで、ベースライン値は投与前のＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ値であり、現在値は投与後の検出待ちの時点でのＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ値である。
【0185】
抗体によるアカゲザルの腹囲及びＢＭＩへの影響についての実験結果は、表１７－９及び表１７－１０に示されている。実験の結果から明らかなように、プラセボ群は、動物の腹囲及びＢＭＩに明らかな変化が認められないが、本開示の抗体投与群は、腹囲及びＢＭＩが両方とも明らかに低減されている。
【0186】
【表25】
【0187】
備考：変化率＝（現在値－ベースライン値）／ベースライン値＊１００％であり、ここで、ベースライン値は投与前の検出値であり、現在値は投与後の検出待ちの時点（Ｄ６０）での検出値である。
【0188】
【表26】
【0189】
備考：ＢＭＩ＝体重／座高、変化率＝（現在値－ベースライン値）／ベースライン値＊１００％であり、ここで、ベースライン値は投与前の検出値であり、現在値は投与後の検出待ち時点（Ｄ６０）の検出値である。
【0190】
明らかに理解されるように、図面と実例によって上記発明を詳しく説明したが、説明と実例は、本開示を制限する範囲として解釈すべきではない。本明細書に引用された全ての特許と科学文献の開示内容は、引用により完全且つ明らかに組み込まれている。
【配列表】
【国際調査報告】