特表 2024-534537 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の結合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-20

(54)【発明の名称】末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の結合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20240912BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240912BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240912BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240912BHJP

【ＦＩ】

C07K16/18 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N5/0783

A61K35/17

A61P35/00

A61P35/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024517550

(86)(22)【出願日】2022-09-20

(85)【翻訳文提出日】2024-05-17

(86)【国際出願番号】 GB2022052368

(87)【国際公開番号】W WO2023047089

(87)【国際公開日】2023-03-30

(31)【優先権主張番号】2113437.4

(32)【優先日】2021-09-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】515202863

【氏名又は名称】オスロ ユニヴェルジテットサイケフス ホーエフ

(71)【出願人】

【識別番号】510179537

【氏名又は名称】ウニヴァーシテテット イ オスロ

【住所又は居所原語表記】Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ １０７２，Ｂｌｉｎｄｅｒｎ，０３１６ Ｏｓｌｏ Ｎｏｒｗａｙ

(74)【代理人】

【識別番号】110000040

【氏名又は名称】弁理士法人池内アンドパートナーズ

(72)【発明者】

【氏名】オルヴェウス、ヨハンナ

(72)【発明者】

【氏名】アリ、ムハンマド

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087DA31

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、配列番号１に記載のアミノ酸配列ＡＬＹＤＫＴＫＲＩ（ペプチドＴ１）又はヒト末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）に由来する配列番号１５に記載のアミノ酸配列ＡＬＹＤＫＴＫＲＩＦＬ（ペプチドＴ３）を有するペプチドを提示するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体Ａ２型に特異的に結合することができる結合タンパク質を提供する。結合タンパク質は、ペプチドを認識するＴＣＲに由来するそれぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有するα鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインを含有する抗原結合単位を含有する。結合タンパク質及びそれらを発現する細胞は、癌治療において使用することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１５に記載のアミノ酸配列ＡＬＹＤＫＴＫＲＩＦＬを有するペプチドを提示するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体Ａ２型に特異的に結合することができる結合タンパク質であって、
前記タンパク質がα鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインを含有する抗原結合単位を含有し、
ここで、前記α鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号１６、１７及び１８に記載のアミノ酸配列を含有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有し、
β鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号１９、２０及び２１に記載のアミノ酸配列を含有する３つのＣＤＲ：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有する、
結合タンパク質。

【請求項2】

前記α鎖可変ドメインが、配列番号２２に記載のアミノ酸配列又はそれに対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有し、且つ、
前記β鎖可変ドメインが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列又はそれに対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する、
請求項１に記載の結合タンパク質。

【請求項3】

配列番号１に記載のアミノ酸配列ＡＬＹＤＫＴＫＲＩを有するペプチドを提示するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体Ａ２型に特異的に結合することができる結合タンパク質であって、
ここで、前記タンパク質が、α鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインを含有する抗原結合単位を含有し、
ここで、前記α鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号２、３及び４に記載のアミノ酸配列を含有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有し、
前記β鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号５、６及び７に記載のアミノ酸配列を含有する３つのＣＤＲ：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有する、
結合タンパク質。

【請求項4】

前記α鎖可変ドメインが、配列番号８に記載のアミノ酸配列又はそれに対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有し、且つ、
前記β鎖可変ドメインが、配列番号９に記載のアミノ酸配列又はそれに対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する、
請求項３に記載の結合タンパク質。

【請求項5】

前記結合タンパク質が、前記α鎖可変ドメインを含有する第１の鎖と前記β鎖可変ドメインを含有する第２の鎖とを含有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の結合タンパク質。

【請求項6】

前記第１の鎖が更に細胞外α鎖定常ドメインを含有し、且つ、前記第２の鎖が更に細胞外β鎖定常ドメインを含有する、請求項５に記載の結合タンパク質。

【請求項7】

前記細胞外α鎖定常ドメインが、配列番号１０に記載のアミノ酸配列又はそれに対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有し、且つ、
前記細胞外β鎖定常ドメインが、配列番号１１に記載のアミノ酸配列又はそれに対して９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する、
請求項６に記載の結合タンパク質。

【請求項8】

前記第１の鎖及び／又は前記第２の鎖が、更に、膜貫通ドメインを含有する、請求項６又は７に記載の結合タンパク質。

【請求項9】

前記第１の鎖及び／又は前記第２の鎖が、更に、細胞質ドメインを含有する、請求項８に記載の結合タンパク質。

【請求項10】

（ａ）前記第１の鎖が、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含有するα鎖であり、且つ、前記第２の鎖が、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含有するβ鎖であるか、又は
（ｂ）前記第１の鎖が、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含有するα鎖であり、且つ、前記第２の鎖が、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含有するβ鎖である、
請求項５～９のいずれか１項に記載の前記結合タンパク質

【請求項11】

請求項１～１０のいずれか１項に定義された結合タンパク質をコードする組換え核酸分子。

【請求項12】

前記核酸分子が、ｃＤＮＡ分子を含有する、請求項１１に記載の組換え核酸分子。

【請求項13】

前記核酸分子が、第２の鎖に連結された第１の鎖を含有するポリペプチドをコードし、ここで、好ましくは、前記第１の鎖が自己スプライシングリンカーによって前記第２の鎖に連結されている、請求項１１又は１２に記載の組換え核酸分子。

【請求項14】

前記自己スプライシングリンカーが、配列番号２６に記載のアミノ酸配列又はそれに対して５０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する２Ａペプチドである、請求項１３に記載の組換え核酸分子。

【請求項15】

請求項１１～１４のいずれか１項に記載の組換え核酸分子を含有するベクター。

【請求項16】

結合タンパク質の第１の鎖をコードする第１の核酸分子と結合タンパク質の第２の鎖をコードする第２の核酸分子とを含有するキットであって、
（ｉ）前記第１の鎖及び前記第２の鎖が、それぞれ、請求項１又は２に定義されるα鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインを含有するか、又は
（ｉｉ）前記第１の鎖及び前記第２の鎖が、それぞれ、請求項３又は４に定義されるα鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインを含有する、
キット。

【請求項17】

請求項１１～１４のいずれか１項に定義された組換え核酸分子、請求項１５に定義されたベクター、又は請求項１６に定義された組換え核酸分子の対を含み、その細胞膜に請求項１～１０のいずれか１項に記載の結合タンパク質を発現する、細胞。

【請求項18】

前記細胞が、免疫エフェクター細胞又はその前駆体である、請求項１７に記載の細胞。

【請求項19】

前記細胞がＴ細胞若しくはナチュラルキラー細胞又はその前駆体であるか、或いは前記細胞が幹細胞である、請求項１７又は請求項１８に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項20】

前記細胞が、Ｔヘルパー細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項１９に記載の免疫エフェクター細胞。

【請求項21】

請求項１７～２０のいずれか１項に定義された細胞を含有する医薬組成物。

【請求項22】

治療に使用するための、請求項１７～２０のいずれか１項に定義された細胞又は請求項２１に定義された医薬組成物。

【請求項23】

癌の処置における使用のための、請求項１７～２０のいずれか１項に定義された細胞又は請求項２１に定義された医薬組成物であって、ここで、前記癌が末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を発現するものである、医薬組成物。

【請求項24】

前記癌が、急性リンパ芽球性白血病、好ましくはＴ細胞起源又はＢ細胞起源の急性リンパ芽球性白血病、である、請求項２３に記載の使用のための細胞。

【請求項25】

末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）特異的細胞を生成する方法であって、請求項１１～１４のいずれか１項に定義された組換え核酸分子、請求項１５に定義されたベクター、又は請求項１６に定義された組換え核酸分子の対を、細胞に導入することを含有する、方法。

【請求項26】

前記細胞が、Ｔ細胞若しくはＮＫ細胞又はその前駆体であり、ここで、好ましくは、前記Ｔ細胞がＴヘルパー細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞である、請求項２５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）由来の配列に基づく結合タンパク質に関する。結合タンパク質は、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ－Ａ２又はＨＬＡ－Ａ^*０２）を含有する主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩに関連して、ヒト末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）の断片を認識する。本明細書中に開示される結合タンパク質及びそれらを発現する細胞は、癌治療において使用することができる。

【背景技術】

【0002】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する自己リンパ球に基づく癌治療はよく知られている。腫瘍関連抗原を標的とする種々のＣＡＲが、過去１０年間に開示されている。しかしながら、従来のＣＡＲの主な欠点は、細胞表面タンパク質のみを標的とするそれらの能力である。

【0003】

急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）は、新しい治療法が緊急に必要とされている血液癌である。Ｂ細胞ＡＬＬ（Ｂ－ＡＬＬ）では、ＣＡＲ Ｔ細胞療法によるＢ細胞特異的抗原ＣＤ１９のターゲティングは、しばしば完全寛解を誘導する。しかしながら、Ｂ ＡＬＬ患者の約４０～５０％が抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法後に再発する（非特許文献１、非特許文献２）が、癌からのＣＤ１９の喪失が原因であることが最も多い。（非特許文献３）。更に、ＣＤ１９は腫瘍特異的抗原ではないので、正常Ｂ細胞及び悪性Ｂ細胞が、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法によって同様に殺される。Ｂ細胞無形成症は比較的寛容性が良好であるが、生涯に亘る免疫グロブリン補充を必要とし、持続性ＣＤ１９特異性ＣＡＲ－Ｔ細胞の長期的な効果は不明である。従って、同種造血幹細胞移植に伴う毒性を伴わずに、正常なＢリンパ球産生を維持する治療が望ましい。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１７／０２９０８９７号

【特許文献2】国際公開第９１／１８０１９号（Ｓｑｕｉｂｂ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｄａｎａ Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）

【特許文献3】国際公開第９６／１８１０５号（Ｈａｒｖａｒｄ）

【特許文献4】国際公開第２０００／０３１２３９号（Ｙｅｄａ Ｒ＆Ｄ）

【特許文献5】国際公開第２０１９／１６６４６３号

【特許文献6】国際公開第２００４／０５４５１２号

【特許文献7】国際公開第２０１６／１１６６０１号

【特許文献8】国際公開第２０１８／１２９１９９号

【特許文献9】国際公開第２０１４／０３７４２２号

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｍａｕｄｅら、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３７８：４３９－４４８（２０１８）

【非特許文献2】Ｓ.Ａ．Ｇｒｕｐｐら、Ｂｌｏｏｄ １３２、８９５－８９５（２０１８）

【非特許文献3】Ｓｈａｈ及びＦｒｙ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １６：３７２－３８５（２０１９）

【非特許文献4】Ｓｅｌｌａｒら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １８１：５１５－５２２（２０１８）

【非特許文献5】Ｋｏｍｏｒｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１１７１－１１７５（１９９３）

【非特許文献6】Ｄｒｅｘｌｅｒら、Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉａ ７５：１２－１７（１９８６）

【非特許文献7】Ｐｅｌｌｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ１０：２３９５（２０１９）

【非特許文献8】Ｌｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７８：９５１－９６０（１９９３）

【非特許文献9】Ｂｏｕｌｔｅｒ、Ｊ．Ｍ．ら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１６（９）：７０７－７１１（２００３）

【非特許文献10】Ｃｏｈｅｎら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６７（８）：３８９８～９０３（２００７）

【非特許文献11】Ｗａｌｓｅｎｇら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（４）：ｅ０１１９５５９（２０１５）

【非特許文献12】Ｗａｌｓｅｎｇら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ７：Ａｒｔｉｃｌｅ １０７１３（２０１７）

【非特許文献13】Ｂｕｓｃｈ及びＳａｓｓｏｎｅ－Ｃｏｒｓｉ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：３６－４０（１９９０）

【非特許文献14】Ｌｅｗｉｓら、２０１５、Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５６：２２－２９

【非特許文献15】Ｗａｎｇら、２０１５（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：Ａｒｔｉｃｌｅ Ｎｏ．１６２７３）

【非特許文献16】Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１（１）：２２３－２３２（１９７７）

【非特許文献17】Ｍｕｌｌｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：３３－３７（１９９２）

【非特許文献18】Ｗａｅｌｃｈｌｉら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（１１）：ｅ２７９３０（２０１１）

【非特許文献19】Ｓａｅｂｏｅｅ－Ｌａｒｓｓｅｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５９：１９１－２０３（２００２），１９１－２０３（２００２）

【非特許文献20】Ｒｉｃｅ，Ｐ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６、（６）ｐｐ２７６－２７７（２０００）

【非特許文献21】Ｓｉｅｖｅｒｓ Ｆ．ら、Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．７：５３９（２０１１）

【非特許文献22】Ｅｄｇａｒ，Ｒ．Ｃ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２（５）：１７９２－１７９７（２００４）

【非特許文献23】Ｂｅｃｋｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ６５：４７７－４８４（２０１６）

【非特許文献24】Ｓｐａｎｈｏｌｔｚら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（６）：ｅ２０７４０（２０１１）

【非特許文献25】Ｔｏｓａｔｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈａｐｔｅｒ ７，Ｕｎｉｔ ７ ２２（２００７）

【非特許文献26】Ａｌｉら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １４：１９２６－１９４３（２０１９）

【非特許文献27】Ｓｃｈｅｐｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２５：８９－９４（２０１９）

【非特許文献28】Ｓｔｒｏｎｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５２：１３３７－１３４１（２０１６）

【非特許文献29】Ｌｉｎｎｅｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９：１５３４－１５４１（２０１３）

【非特許文献30】Ｂｒｏｃｈｅｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３６：Ｗ５０３－５０８（２００８）

【非特許文献31】Ｋｕｍａｒｉら、ＰＮＡＳ １１１：４０３－４０８（２０１４）

【非特許文献32】Ｒａｐｏｐｏｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１：９１４－９２１（２０１５）

【非特許文献33】Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７，６５４８－６５５９（２００６）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

多数のＴ細胞特異的マーカーがあるにも拘わらず、全てのＴ－ＡＬＬサブタイプに亘って効率的に悪性細胞を標的とし、同時に成熟した健常なＴ細胞を残すＴ細胞ＡＬＬ（Ｔ－ＡＬＬ）に対しては、ＣＡＲ療法は承認されていない。健康なＴ細胞の枯渇は、極端に毒性であるか又は生命と両立し得ないので、これを達成することは極めて重要である。更に、Ｔ－ＡＬＬでは腫瘍特異的標的は同定されておらず、臨床試験で有効性が証明されている免疫療法もない。化学療法が失敗した場合（１５～２０％）、Ｔ－ＡＬＬは予後不良であり、全生存率は２５％未満である。

【0007】

本発明者らは、Ｂ－ＡＬＬ及びＴ－ＡＬＬにおける免疫療法のための標的として、細胞内酵素末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を同定した。ＴｄＴの機能は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＢ細胞受容体遺伝子の組換えの際に、Ｎ－ヌクレオチドをＶ－Ｄ－Ｊ結合に付加することであり（非特許文献５）、従って、ＴｄＴの発現は、Ｂ及びＴ細胞系列に限定される。ＴｄＴは、Ｂ及びＴ細胞由来のＡＬＬ及びリンパ芽球性リンパ腫の８０～９４％で過剰発現しているが（非特許文献６）、造血幹細胞では発現していない（非特許文献７）ため、赤血球及び血小板産生を含有する骨髄造血はＴｄＴのターゲティングの影響を受けないはずであり、ＴｄＴは分化中に下方制御される（非特許文献８）ため、正常な成熟Ｂ及びＴ細胞は温存すべきである。本発明者らは、ＡＬＬ療法に使用することができるＴｄＴ由来ペプチドを認識するＴＣＲを作製した。ＴｄＴは、癌免疫療法の潜在的な標的として既に同定されているが、ＴｄＴを標的とする現在の治療法は知られていない。

【0008】

ここで提供されたＴＣＲは、ＡＬＬにおける癌性Ｔ細胞及びＢ細胞を標的とするが、健常なＴ細胞及びＢ細胞のごく僅かなサブセットのみを標的とする。このように、本明細書で提供されるＴＣＲは、大多数のＴ－ＡＬＬサブタイプの治療のための最初の免疫療法及び生涯に亘る免疫障害を引き起こさない、Ｂ－ＡＬＬのための改良された免疫療法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本開示は、配列番号１又は配列番号１５に記載のＴｄＴ－ペプチドを提示するヒト白血球抗原複合体クラスＩに特異的に結合することができる結合タンパク質を提供する。このような結合タンパク質（又はそれらを発現する細胞）は、ＴｄＴ、特にＡＬＬ、を発現する癌細胞を標的化するために使用することができる。実施例において実証されるように、特許請求される結合タンパク質は、生理学的条件下で、配列番号１に記載のＴｄＴ－ペプチド又は配列番号１５に記載のＴｄＴ－ペプチドのいずれかを提示するＨＬＡ－Ａ^*０２：０１に対して優れた特異性を有する。特に、ＨＬＡ－Ａ^*０２：０１は、ＡＬＬに罹患しているヨーロッパ、中東又は北アフリカ系の先祖を持つ患者の大部分によって発現される。従って、Ｔ－ＡＬＬ及びＢ－ＡＬＬに対する新規な治療法が提供されており、これは化学療法抵抗性患者に特に有益であると考えられる。

【0010】

従って、本明細書において、第１の局面では、配列番号１５に記載のアミノ酸配列ＡＬＹＤＫＴＫＲＩＦＬを有するペプチドを提示するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体Ａ２型に特異的に結合することができる結合タンパク質であって；
前記結合タンパク質がα鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインを含有する抗原結合単位を含有し；
前記α鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号１６、１７及び１８に記載のアミノ酸配列を含有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含有し、
前記β鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号１９、２０及び２１に記載のアミノ酸配列を含有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含有する、
結合タンパク質
が、提供される；

【0011】

本明細書において、第２の局面では、配列番号１に記載のアミノ酸配列ＡＬＹＤＫＴＫＲＩを有するペプチドを提示するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体Ａ２型に特異的に結合することができる結合タンパク質であって；
前記結合タンパク質が、α鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインを含有する抗原結合単位を含有し；
前記α鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号２、３及び４に記載のアミノ酸配列を含有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含有し、
前記β鎖可変ドメインが、それぞれ、配列番号５、６及び７に記載のアミノ酸配列を含有する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含有する、
結合タンパク質
が、提供される。

【0012】

第３の局面では、本明細書で提供される結合タンパク質をコードする組換え核酸分子が提供される。

【0013】

第４の局面では、本明細書で提供される組換え核酸分子を含有するベクターが提供される。

【0014】

第５の局面は、結合タンパク質の第１の鎖をコードする第１の組換え核酸分子と、結合タンパク質の第２の鎖をコードする第２の組換え核酸分子とを含有するキットであって、
（ｉ）前記第１の鎖が、本開示の前記第１の局面のα鎖可変ドメインを含有し、前記第２の鎖が、前記第１の局面のβ鎖可変ドメインを含有するか；又は
（ｉｉ）前記第１の鎖が、本開示の前記第２の局面のα鎖可変ドメインを含有し、前記第２の鎖が、前記第２の局面のβ鎖可変ドメインを含有する、
キット
を、提供する。

【0015】

第６の局面は、本明細書で提供される組換え核酸分子、本明細書で提供されるベクター、又は本明細書で提供されるキットに含まれる組換え核酸分子の対を含み、本明細書で提供される結合タンパク質をその細胞膜で発現する免疫エフェクター細胞を提供する。

【0016】

第７の局面は、本明細書で提供される免疫エフェクター細胞を含有する医薬組成物を提供する。

【0017】

第８の局面は、治療に使用するための、本明細書で提供される免疫エフェクター細胞又は本明細書で提供される医薬組成物を提供する。

【0018】

第９の局面は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を発現する癌の処置において使用するための、本明細書で提供される免疫エフェクター細胞又は本明細書で提供される医薬組成物を提供する。

【0019】

同様に、被験者の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を発現する癌を治療する方法であって、本明細書で提供される免疫エフェクター細胞又は本明細書で提供される医薬組成物を被験者に投与することを含有する方法が提供される。

【0020】

また、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を発現する癌の処置のための医薬の製造における本明細書で提供される免疫エフェクター細胞の使用も提供される。

【0021】

本明細書の開示に従って治療される癌は、限定されるわけではないが、特に急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、例えばＢ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）又はＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ－ＡＬＬ）、であり得る。

【0022】

第１０の局面では、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）特異的免疫エフェクター細胞を生成する方法であって、本明細書で提供される組換え核酸分子、本明細書で提供されるベクター、又は本明細書で提供されるキットに含まれる組換え核酸分子の対を、前記免疫エフェクター細胞に導入することを含有する方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】図１：種々のＴＣＲ構築物の模式図 図１Ａは、α鎖及びβ鎖を含有する全長ＴＣＲを示す。両鎖は、３つのＣＤＲ（より明色の長方形）を有する可変ドメイン、細胞外定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び短い細胞質ドメインを含有する。 図１Ｂは、３つのＣＤＲ（より明色の長方形）を有するα鎖可変ドメイン及び３つのＣＤＲ（より明色の長方形）を有するβ鎖可変ドメインを含有する最小結合単位を示す。 図１Ｃは、３つのＣＤＲ（より明色の長方形）を有するα鎖可変ドメイン及び３つのＣＤＲ（より明色の長方形）を有するβ鎖可変ドメインを含有する結合単位（本明細書ではＴＣＲ－ｓｃＦｖと呼ぶ）を示し、ここで、β鎖可変ドメインは、ペプチドリンカーを介してα鎖可変ドメインに接続されている。 図１Ｄは、結合単位、細胞外定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質シグナルドメインを含有する受容体（本明細書ではキメラＴＣＲと呼ぶ）を示す。 図１Ｅは、α鎖及びβ鎖を含有する切断型ＴＣＲ（本明細書では可溶性ＴＣＲと呼ぶ。）を示し、この受容体は、結合単位、細胞外定常ドメイン及び２つのシステイン架橋を含有する。 図１Ｆは、図１Ｅからの構造を含有する受容体（本明細書では、ＴＣＲ－ＣＡＲと呼ぶ。）を示し、ここでは、鎖の１つは、更に、膜貫通ドメイン及び細胞質シグナルドメインを含有する。

【図2】図２－ＴｄＴ反応性ＴＣＲはＨＬＡ－Ａ２に限定される。 図２Ａは、ペプチドパルスＴ２リンパ芽球細胞との共インキュベーションに続くＴ１及びＴ３細胞の活性化を示す。ＥＣ₅₀＝最大有効濃度の２分の１。データは、３つの独立した実験からプールされ、ここで、各円は、個々の実験からの３つの技術的反復の平均を表す。エラーバーは、ＳＤを示す。 図２Ｂは、１つのＨＬＡ－Ａ２^pos及び１つのＨＬＡ－Ａ２^neg供与体に由来するＥＢＶ－ＬＣＬとの共培養後のＣＤ８⁺Ｔ１及びＴ３細胞に対するＣＤ１３７上方制御を示す。細胞株を、指示された濃度のペプチド－１（Ｔ１）又はペプチド－３（Ｔ３）でパルスするか、又は全長ＴｄＴをコードするｍＲＮＡでエレクトロポレーションした。データポイントは、実施された２つを代表する１つの実験における３つの技術的反復を表す。 図２Ｃは、ＴｄＴペプチド（２×１０^-7Ｍ）をロードした又はロードしなかった、表示されたＨＬＡ－Ａ２及びＴｄＴ発現を有する種々の細胞株との共培養後のＴ１及びＴ３細胞の活性化を示す。接尾辞＋Ａ２は、ＨＬＡ－Ａ^*０２：０１で形質導入された細胞株を示す。結果は、異なるＴ細胞ドナーを用いて実施された２又は３の実験を代表する１つの実験からのものであり、データ点は技術的反復（２～３）を表わし、エラーバーは範囲を示す。

【図3】図３：ＴｄＴ反応性ＴＣＲはオフターゲット反応性を示さない。 図３Ａは、ミモトープライブラリーからのペプチド（ペプチド濃度：２×１０^-7Ｍ）でパルスしたＥＢＶ－ＬＣＬと共インキュベートしたＴ１細胞（上）及びＴ３細胞（下）の培養上清中のＩＦＮ－γ濃度のヒートマップを示す。行／列の交点は、所与の位置で置換されたアミノ酸を示し、白丸は野生型ペプチド中のアミノ酸を示す。陽性反応のＩＦＮ－γ濃度範囲は、５００～３１２５４ｐｇ／ｍＬであった。条件ごとに１回繰り返す。 図３Ｂ～Ｃは、表示されたペプチドを負荷した標的細胞との共培養後のＴ１（Ｂ）及びＴ３（Ｃ）細胞によるＩＦＮ－γ産生を示す。ＴｄＴタンパク質配列中の野生型ペプチド－１及び３の上流又は下流のアミノ酸を含有する９量体及び１１量体ペプチドを含めた。更に、ペプチド－１及び－３の一部又は全部を含有する８～１２アミノ酸長のペプチドを含めた。条件ごとに１回繰り返す。

【図4】図４：Ｔ１及びＴ３細胞は、ＴｄＴ^pos ＨＬＡ－Ａ２^pos白血病細胞系列によって活性化され、効果的に白血病細胞系列を死滅させる 図４Ａは、Ｔ１及びＴ３細胞（１：１のＥ：Ｔ比率）との４８時間の共培養後の生育可能なＴｄＴ^pos ＨＬＡ－Ａ２^pos ＮＡＬＭ－６及びＢＶ１７３細胞を、フローサイトメトリーによって定量化された、モック形質導入Ｔ細胞処理後の対応する数の百分率で示す。データポイントは、実施された３つの実験を代表する１つの実験における技術的反復を表す。 図４Ｂは、モック、Ｔ１及びＴ３細胞と４８時間共培養したＢＶ１７３細胞のフローサイトメトリープロットを示す。挿入されている数は、生存腫瘍細胞ゲート内の事象カウントを表示する。

【図5-1】図５：Ｔ１及びＴ３細胞は、ＢＶ１７３及びＮＡＬＭ－６動物モデルにおいて、インビトロ及びインビボで白血病細胞を効率的に死滅させる 図５Ａ～Ｂ及びＤ～Ｅは、（ＮＹ－ＥＳＯ－１に反応性の）１Ｇ４、Ｔ１又はＴ３を形質導入したヒトＴ細胞で処理した１日前、２１日後（ＢＶ１７３、Ａ－Ｂ）又は１４日後（ＮＡＬＭ－６、Ｄ－Ｅ）の白血病担癌マウスの生物発光イメージングを示す。未処理マウスを対照として含めた。

【図5-2】図５Ｃ及び５Ｆは、未処理（ｎ＝１０（ＢＶ１７３）若しくはｎ＝１１（ＮＡＬＭ－６））、又は１Ｇ４（ｎ＝７（ＢＶ１７３）若しくはｎ＝９（ＮＡＬＭ－６））、Ｔ１（ｎ＝８（ＢＶ１７３））若しくはＴ３（ｎ＝９（ＢＶ１７３）若しくはｎ＝１１（ＮＡＬＭ－６））細胞で処理した白血病担癌マウスの生存分析を示す。 図５Ｂ及びＣ並びに図５Ｅ及びＦに示されるデータは、２つの独立した実験からプールされる。図５Ｂ及びＥの箱ひげ図では、四分位範囲（２５～７５パーセンタイル）が示されており、中央の棒がその中央値を示し、ひげがその範囲を示している。ドットは個々のマウスからのデータを表す。Ｐ＝有意でない（ｎｓ）、^**Ｐ＜０．０１、^****Ｐ＜０．０００１、通常の一元配置分散分析により算出、テューキーの事後検定との多重比較で補正。生存分析（図５Ｃ及びＦ）は、両側ログランク (マンテル－コックス)検定、^****Ｐ＜０．０００１によって行なった。

【図5-3】図５Ｇは、６０日目（Ｍ１－Ｍ５）のＴ３処理マウスにおける骨髄腫瘍量を屠殺時（２１日目）の１Ｇ４処理マウス又は未処理マウスとの比較で示すフローサイトメトリープロットである。白血病陽性の閾値は、生細胞の０．０１％以上のＧＦＰ+細胞として設定された。

【図6】図６：Ｔ１細胞及びＴ３細胞は、成熟Ｂ及びＴリンパ球並びに非系統の拘束性（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）造血前駆細胞を温存しながら原発性（ｐｒｉｍａｒｙ）癌細胞を枯渇させる 図６Ａは、生存ＨＬＡ－Ａ２^pos，ＴｄＴ^pos Ｂ－ＡＬＬ腫瘍細胞（ＣＤ１９⁺ＣＤ１０⁺事象，左パネル）及びＴ－ＡＬＬ腫瘍細胞（ＣＤ５⁺ＣＤ７⁺ＣＤ９９⁺及び表面ＣＤ^3-ＣＤ^4-事象、右パネル）、正常Ｂ細胞（ＣＤ１９⁺ＣＤ１０^-）、正常Ｔ細胞（ＣＤ３⁺及びＣＤ８⁺又はＣＤ４⁺）及びＣＤ３４⁺ｌｉｎ^-前駆細胞を、モック－、Ｔ１－又はＴ３－形質導入されたＴセル（Ｅ：Ｔ比＝１：１）と７２時間共培養した後の、フローサイトメトリーによって定量化されたものとして示す代表的なｔ分布確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）プロットである。ＴＣＲ形質導入細胞は、ＣＴＶ陽性事象として分析から除外した。 図６Ｂは、６Ａに記載されたようにアッセイされた、ＨＬＡ－Ａ２^pos，ＴｄＴ^posＢ－ＡＬＬ又はＴ－ＡＬＬを有する１２人の患者からの診断試料を示す。各ドットは、Ｔ１（緑）又はＴ３（紫色）細胞との共培養後の、生存腫瘍細胞、正常Ｂ細胞又はＴ細胞の数を、モック形質導入Ｔ細胞で処理した培養物中の対応する数に対する百分率で表す。データ点は３回又は４回の技術的反復を表わし、エラーバーは範囲を示す。示されたデータは、各患者試料について実施された少なくとも２つの実験を代表する１つの実験からのものである。

【図7】図７：Ｔ１又はＴ３を形質導入した患者由来ＣＤ⁸⁺Ｔ細胞は、自己由来のＢ－ＡＬＬ細胞を効率的に死滅させる 図７Ａは、Ｔ１、Ｔ３又はモックで形質導入された自己由来Ｔ細胞との７２時間の共培養後のＢ－ＡＬＬ患者由来の末梢血診断試料のｔ－ＳＮＥプロットを示す。挿入された数は、モック細胞、Ｔ１細胞及びＴ３細胞との共培養後の、示された細胞集団の絶対事象数を示す。 図７Ｂは、フローサイトメトリーに基づく細胞毒性アッセイを７２時間実施した後の、悪性細胞、正常なＢ、Ｔ及びＣＤ３４＋ｌｉｎ^-前駆細胞の定量化を示す。データポイントは、実施された２つのうちの１つの代表的な実験からの技術的反復（３～４）を表わし、エラーバーは範囲を示す。

【図8-1】図８：Ｔ３細胞は、インビボで健康な造血を温存しながら、原発性Ｂ－ＡＬＬ細胞を効率的に排除する 図８Ａ～８Ｃ中、未処理 ｎ＝５、ＤＭＦ５処理 ｎ＝８、Ｔ３処理 ｎ＝８。図は、２つの実験からのプールされたデータを示す。

【図8-2】図８Ａは、原発性ヒトＢ－ＡＬＬ細胞を移植したＴ３処理（上）－及びＤＭＦ５処理（下)－ＮＳＧマウスの骨髄（ＢＭ）からの生存単核細胞（ＭＮＣ）の代表的なＦＡＣＳプロットを示す。 図８Ｂは、ベースラインにおいて及びＴ細胞注入後１１日目に、ヒトＴ細胞について調整されたＢＭ中の白血病細胞（ｈＣＤ４５⁺ＣＤ１９⁺ＣＤ１０⁺）の割合を示す。 図８Ｃは、ＢＭに存在する白血病細胞の数を示す。 図８Ｄは、ＢＭ中のＭＮＣの数を示す。データを２つの独立した実験からプールし、未処理、ＤＭＦ５処理及びＴ３処理マウスの処理１１日後の末端分析における平均±ＳＥＭとして提示する。集団は、図８Ａに示すゲート戦略に従ってフローサイトメトリーによって同定した。Ｄｕｎｎの多重比較試験によるＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ ＡＮＯＶＡは、統計解析のためにＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて実施された（^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１、^***Ｐ＜０．００１）。

【発明を実施するための形態】

【0024】

ＴｄＴの発現プロフィールは上に記載されている。詳細に述べるように、正常な造血の際には、Ｂ細胞系列とＴ細胞系列は、ともに、一過性にＴｄＴを発現するが、成熟したＢ細胞及びＴ細胞並びにＣＤ３４⁺造血幹細胞はＴｄＴの発現を欠く。これにより、造血幹細胞及び成熟リンパ球を温存しながら、癌性ＴｄＴ発現細胞をターゲットとすることが可能となる。従って、ＴｄＴを標的とした治療が成功すれば、患者には健常なＢ細胞及びＴ細胞コンパートメントが残され、適応免疫応答が維持されることになる。上で詳述したように、ＴｄＴは、ほとんどのＡＬＬで過剰発現される。ＴｄＴは細胞内に局在するので、抗体からの標的化単位を利用する従来のＣＡＲによって標的化することはできない。しかしながら、本明細書で提供されるＴＣＲ及びＴＣＲ由来結合タンパク質は、ＭＨＣクラスＩ分子によって提示される場合、ＴｄＴ由来ペプチドを認識し、従って、ＴｄＴ発現細胞を標的化することができる。

【0025】

本明細書で提供される結合タンパク質は、本明細書でＴ１ ＴＣＲ及びＴ３ ＴＣＲと呼ぶＴＣＲに由来する。Ｔ１ ＴＣＲ及びＴ３ ＴＣＲは、いずれもαβ ＴＣＲ、即ち、α鎖及びβ鎖を含有するヘテロ二量体である。αβＴＣＲの一般的な構造は、当技術分野において周知であり、図１Ａに概略的に表わされている。結合タンパク質は、古典的、又は「天然の（ｎａｔｉｖｅ）」、全長２鎖表面受容体形式（例えば、αβ形式）、又は単鎖抗原結合単位を有する形式を始めとする種々の形式で、又は可溶性分子などとして、提供することができる。

【0026】

周知のように、α及びβ鎖の可変ドメインは、それぞれ、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と番号付け（Ｎ末端から開始する）された３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。それは、標的エピトープ／ＭＨＣ複合体と直接相互作用し、従ってＴＣＲの特異性を決定するＣＤＲであり、ＴＣＲ特異性を決定する際の最も重要なＣＤＲ３を有するＣＤＲである。ＣＤＲは、それらの空間配置が標的結合に適切であるように、ＣＤＲのための足場を形成するフレームワーク配列によって分離され、これと隣接している。

【0027】

Ｔ３ ＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ２を含有するクラスＩ ＭＨＣによって提示される場合、配列番号１５に記載のアミノ酸配列ＡＬＹＤＫＴＫＲＩＦＬを有するペプチドを認識する。配列番号１５は、ヒトＴｄＴのアミノ酸（ＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ０４０５３、配列番号２７）４７５～４８５に対応する。Ｔ３ ＴＣＲのα鎖は、ＣＤＲ１（ＶαＣＤＲ１と呼ぶことができる）が配列番号１６に示すアミノ酸配列ＴＳＩＮＮを有し、ＶαＣＤＲ２が配列番号１７に示すアミノ酸配列ＩＲＳＮＥＲＥを有し、そして、ＶαＣＤＲ３が配列番号１８に示すアミノ酸配列ＣＡＴＤＡＧＡＹＳＧＧＧＡＤＧＬＴＦを有する、可変領域を含有する。Ｔ３ ＴＣＲのβ鎖は、ＣＤＲ１（ＶβＣＤＲ１と呼ぶことができる）が配列番号１９に示すアミノ酸配列ＭＮＨＥＹを有し、ＶβＣＤＲ２が配列番号２０に示すアミノ酸配列ＳＭＮＶＥＶを有し、ＶβＣＤＲ３が配列番号２１に示すアミノ酸配列ＣＡＳＳＬＳＳＳＹＮＥＱＦＦを有する可変領域を含有する。

【0028】

Ｔ１ ＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ２を含有するクラスＩ ＭＨＣによって提示される場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列ＡＬＹＤＫＴＫＲＩを有するペプチドを認識する。配列番号１は、ヒトＴｄＴのアミノ酸４７５～４８３に対応する。Ｔ１ ＴＣＲのα鎖は、ＶαＣＤＲ１が配列番号２に記載のアミノ酸配列ＶＳＧＬＲＧを有し、ＶαＣＤＲ２が配列番号３に記載のアミノ酸配列ＬＹＳＡＧＥＥを有し、そして、ＶαＣＤＲ３が配列番号４に記載のアミノ酸配列ＣＡＶＱＡＳＳＮＳＧＹＡＬＮＦを有する、可変領域を含有する。Ｔ１ ＴＣＲのβ鎖は、ＶβＣＤＲ１が配列番号５に記載のアミノ酸配列ＳＱＶＴＭを有し、ＶβＣＤＲ２が配列番号６に記載のアミノ酸配列ＡＮＱＧＳＥＡを有し、そして、ＶβＣＤＲ３が配列番号７に記載のアミノ酸配列ＣＳＶＥＰＧＹＡＤＴＱＹＦを有する、可変領域を含有する。

【0029】

従って、本開示の第１の局面は、Ｔ３ ＴＣＲに基づく、上記の結合タンパク質を提供する。

【0030】

Ｔ３ ＴＣＲのα鎖及びβ鎖は、それぞれ、配列番号２２及び配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含有する可変ドメインを有する。特定の実施形態において、Ｔ３ ＴＣＲに基づく結合タンパク質は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するか又はそれからなるα鎖可変ドメインを含有する抗原結合単位を含有する。別の実施形態において、Ｔ３ ＴＣＲに基づく結合タンパク質は、配列番号２３に記載のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するか又はそれからなるβ鎖可変ドメインを含有する抗原結合単位を含有する。特定の実施形態では、Ｔ３ ＴＣＲに基づく結合タンパク質は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するか又はそれからなるアミノ酸配列を含有するα鎖可変ドメイン；及び配列番号２３に記載のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するか又はそれからなるβ鎖可変ドメインを含有する抗原結合単位を含有する。

【0031】

結合タンパク質が配列番号２２の変異体（即ち、配列番号２２に対して９０％以上であるが１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列）を含有するα鎖可変ドメインを含有する場合、ＶαＣＤＲ配列は、それにもかかわらず、上記で定義されるとおりである（即ち、ＶαＣＤＲ１、ＶαＣＤＲ２及びＶαＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１６、１７及び１８に記載のアミノ酸配列を含有するか又はそれらからなる）。従って、任意の配列改変は、可変ドメインのフレームワーク領域内でなされる。結合タンパク質が配列番号２３の変異体（即ち、配列番号２３に対して９０％以上であるが１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列）を含有するβ鎖可変ドメインを含有する場合、ＶβＣＤＲ配列は、それにもかかわらず、上記で定義されるとおりである（即ち、ＶβＣＤＲ１、ＶβＣＤＲ２及びＶβＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１９、２０及び２１に記載のアミノ酸配列を含有するか又はそれらからなる）。従って、任意の配列改変は、可変ドメインのフレームワーク領域内でなされる。

【0032】

本開示の第２の局面は、Ｔ１ ＴＣＲに基づく上記の結合タンパク質を提供する。

【0033】

Ｔ１ ＴＣＲのα鎖及びβ鎖は、それぞれ、配列番号８及び配列番号９に記載のアミノ酸配列を含有する可変ドメインを有する。特定の実施形態において、Ｔ１ ＴＣＲに基づく結合タンパク質は、配列番号８に記載のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するか又はそれからなるα鎖可変ドメインを含有する抗原結合単位を含有する。別の実施形態において、Ｔ１ ＴＣＲに基づく結合タンパク質は、配列番号９に記載のアミノ酸配列若しくはそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するか又はそれからなるβ鎖可変ドメインを含有する抗原結合単位を含有する。特定の実施形態では、Ｔ１ ＴＣＲに基づく結合タンパク質は、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含有するか若しくはそれからなるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するα鎖可変ドメイン；及び配列番号９に記載のアミノ酸配列を含有するか若しくはそれからなるアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するβ鎖可変ドメインを含有する抗原結合単位を含有する。

【0034】

結合タンパク質が配列番号８の変異体（即ち、配列番号８に対して９０％以上であるが１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列）を含有するα鎖可変ドメインを含有する場合、ＶαＣＤＲ配列は、それにもかかわらず、上記で定義されるとおりである（即ち、ＶαＣＤＲ１、ＶαＣＤＲ２及びＶαＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２、３及び４に記載のアミノ酸配列を含有するか又はそれらからなる）。従って、任意の配列改変は、可変ドメインのフレームワーク領域内でなされる。結合タンパク質が配列番号９の変異体（即ち、配列番号９に対して９０％以上であるが１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列）を含有するβ鎖可変ドメインを含有する場合、ＶβＣＤＲ配列は、それにもかかわらず、上記で定義されるとおりである（即ち、ＶβＣＤＲ１、ＶβＣＤＲ２及びＶβＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号５、６及び７に記載のアミノ酸配列を含有するか又はそれらからなる）。従って、任意の配列改変は、可変ドメインのフレームワーク領域内でなされる。

【0035】

本明細書で定義される「結合タンパク質」は、標的分子に結合する（又は標的分子を認識する）タンパク質である。本明細書で提供される結合タンパク質は、上記のように、ヒトＴｄＴに由来するペプチドを含有するＭＨＣ－Ｉ分子に特異的に結合することができる。「特異的結合」とは、結合タンパク質がそれらの特定の分子パートナーに特異的に結合することを意味する（Ｔ３ ＴＣＲに由来する結合タンパク質の分子パートナーは、配列番号１５のＴｄＴペプチドを提示するＨＬＡ－Ａ２分子であり；Ｔ１ ＴＣＲに由来する結合タンパク質の分子パートナーは、配列番号１のＴｄＴペプチドを提示するＨＬＡ－Ａ２分子である）。標的への特異的結合は、オフターゲット又は非特異的結合と区別することができる。例えば、結合タンパク質は、他の分子（又は少なくともほとんどの他の分子）に結合するよりも高い親和性で、それらの分子パートナーに結合する。標的への結合タンパク質の結合は、当技術分野で公知の任意の適切な方法、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、によって測定することができる。

【0036】

特に、結合タンパク質は、ＴｄＴ以外のタンパク質に由来するペプチドを含有するＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するよりも高い親和性で（上記で定義されたような）それらの分子パートナーに結合する。結合タンパク質は、非同族ＭＨＣ－ペプチド複合体、特にＴｄＴ以外のタンパク質に由来するペプチドを含有するＭＨＣ－ペプチド複合体、への最小限の結合を示すか又は全く結合を示さない。本明細書で提供される結合タンパク質は、生理学的条件下で、即ち、宿主動物の体内、特にヒトの体内、に見出される条件下で、それらの分子パートナーに特異的に結合し得る。特に、結合タンパク質は、ヒト腫瘍内に見出される条件において、それらの分子パートナーに特異的に結合し得る。

【0037】

上で詳述したように、Ｔ３ ＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ２と配列番号１５のペプチドとを含有するＭＨＣ－Ｉ複合体に特異的に結合し、Ｔ１ ＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ２と配列番号１のペプチドとを含有するＭＨＣ－Ｉ複合体に特異的に結合する。特に、配列番号１及び配列番号１５のペプチドは非常に類似しているが（上記で詳述したように、両ペプチドは、配列番号１５のＣ末端における２つのアミノ酸伸長だけが異なる）、以下の実施例に示されるように、Ｔ３及びＴ１ ＴＣＲは、それらのそれぞれの結合パートナーとの交差反応性を示さない。

【0038】

上記で詳述したように、本明細書で提供される結合タンパク質は、α鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインを含有する抗原結合単位を含有する。本明細書で定義される「α鎖可変ドメイン」は、ＴＣＲ（特にヒトＴＣＲ）のα鎖由来の可変ドメイン、又はそれに基づくポリペプチドである。同様に、本明細書で定義される「β鎖可変ドメイン」は、ＴＣＲ（特にヒトＴＣＲ）のβ鎖由来の可変ドメイン、又はそれに基づくポリペプチドである。ＴＣＲのα又はβ鎖の可変ドメインに基づくポリペプチドは、例えば、天然可変ドメインに対する配列改変を含有する可変ドメインの変異体を包含する。

【0039】

本明細書で言及する「抗原結合単位」は、単に、α鎖及びβ鎖可変ドメインから形成され、標的ＭＨＣペプチド複合体に結合する結合タンパク質のドメインである。

【0040】

従って、本開示の最小結合タンパク質は、図１Ｂに示されるようなα鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインを含有する抗原結合単位である。

【0041】

α鎖可変ドメインは、図１Ｃ及び図１Ｄに示されるように、例えばペプチドリンカーによって、β鎖可変ドメインに共有結合して抗原結合単位を形成し得る。そのような抗原結合単位及びそれらを含有するタンパク質は、特許文献１、特許文献２及び特許文献３に開示されている。適切なペプチドリンカーは、例えば、１、２、３若しくは４個のアミノ酸、５、１０若しくは１５個のアミノ酸、又は都合のよい１～２０の範囲の他の中間数のアミノ酸を含有し得る。ペプチドリンカーは、グリシン及び／又はセリンなどの、任意の一般的に好都合なアミノ酸残基から形成され得る。適切なリンカーの一例は、Ｇｌｙ４Ｓｅｒである。このようなリンカーの多量体、例えば、二量体、三量体、四量体又は五量体、例えば、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₂、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₃、（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₄又は（Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ）₅、を使用することができる。ペプチドリンカーは、α鎖可変ドメインのＣ末端をβ鎖可変ドメインのＮ末端に、又はα鎖可変ドメインのＮ末端をβ鎖可変ドメインのＣ末端に連結し得る。

【0042】

（上記のように）ポリペプチドリンカーによってβ鎖可変ドメインに連結されたα鎖可変ドメインから構成される結合タンパク質は、本明細書では（抗体の可変ドメインに由来する標準ｓｃＦｖと同様に）ＴＣＲ－ｓｃＦｖと呼ぶ。ＴＣＲ－ｓｃＦｖは最小可溶性ＴＣＲ種であり、図１Ｃに概略的に示されている。一実施形態では、結合タンパク質はＴＣＲ－ｓｃＦｖである。ＴＣＲ－ｓｃＦｖの使用は、以下で更に議論される。

【0043】

別の実施形態では、本明細書で提供される結合タンパク質は、α鎖可変ドメインを含有する第１の鎖とβ鎖可変ドメインを含有する第２の鎖とを含有する。即ち、α鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインは、（互いに会合して結合タンパク質を形成する）別個のポリペプチド鎖内に位置し得る。従って、第１及び第２の鎖は、古典的な全長αβ ＴＣＲのα及びβ鎖に対応するが、全長α又はβ鎖中に天然に存在する全てのドメインを含有する必要はない。一実施形態では、第１及び第２の鎖は、それぞれα又はβ鎖の全てのドメイン、即ち、可変ドメイン、定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン（エンドドメイン）を含有し得る。他の実施形態において、第１及び第２の鎖は、可変ドメイン及び定常ドメインを含有し得る。換言すれば、第１の鎖は、α鎖可変ドメイン及びα鎖定常ドメインを含有し得る。第２の鎖は、β鎖可変ドメイン及びβ鎖定常ドメインを含有し得る。更に他の実施形態において、鎖は、更に、膜貫通ドメイン、又は膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含有し得る。従って、第１及び第２の鎖は、それぞれ、全長又は切断されたα及びβ鎖に対応し得るか又はそれを表わし得る（又は実際に、全長又は切断されたα及びβ鎖、と呼ばれ得る）。「全長」とは、鎖がα又はβ鎖の全てのドメインを含有することを意味する。換言すれば、全長鎖は、可変ドメイン、定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含有する。膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインは、適宜、α又はβ鎖から得てもよいし、それらに由来するものであってもよいが、或いは、任意の他のタンパク質から得てもよいし、それに由来するものであってもよい。従って、全長α又はβ鎖は、天然又は合成若しくは改変タンパク質であり得る。「切断された」とは、その鎖が、定常ドメイン、膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインのいずれか１つ以上の全て又は一部を欠いていてもよいことを意味する。従って、本開示に従う全長の又は切断されたα又はβ鎖において、可変及び定常ドメインは、ＴＣＲ α又はβ鎖ドメインであり得るが、膜貫通及び細胞質ドメインは、ＴＣＲ α又はβ鎖から得られ又はこれらに由来するものに限定されない。本明細書で広く使用される用語「第１の鎖」は、少なくともα鎖から得られるか又はそれに由来する可変ドメインを含有するポリペプチド鎖を意味し、本明細書で広く使用される用語「第２の鎖」は、少なくともβ鎖から得られるか又はそれに由来する可変ドメインを含有するポリペプチド鎖を意味する。従って、第１の鎖は「αに基づく鎖」とみなすことができ、第２の鎖は「βに基づく鎖」とみなすことができる。

【0044】

それにもかかわらず、一実施形態では、個々のポリペプチド鎖は、（例えば、システイン残基の側鎖間に形成される１つ以上のジスルフィド結合によって）共有結合されてもよい。例えば、天然αβＴＣＲの細胞外定常ドメインは、ヘテロ二量体を安定化すると考えられている鎖間ジスルフィド架橋を形成することが知られている。鎖間ジスルフィド架橋は、定常ドメイン（Ｃ）を接続する実線の垂直なバーとして図１Ａに示されている。

【0045】

従って、上記のように、第１の鎖（即ち、全長又は切断α鎖）及び／又は第２の鎖（即ち、全長又は切断β鎖）は、細胞外定常ドメインを含有し得る。理論に拘束されるわけではないが、α鎖定常ドメインとβ鎖定常ドメインとの間の相互作用は、抗原結合単位を安定化し得る。一実施形態では、第１の鎖は、（可変ドメインに対してＣ末端に、例えば、定常ドメインのＮ末端アミノ酸がペプチド結合によって可変ドメインのＣ末端アミノ酸に結合するように直接Ｃ末端に、位置する）細胞外α鎖定常ドメインを含有する。別の実施形態において、第２の鎖は、（可変ドメインに対してＣ末端に、例えば、可変ドメインに対して直接Ｃ末端に、位置する）細胞外β鎖定常ドメインを含有する。一実施形態では、第１の鎖及び第２の鎖の両方が細胞外定常ドメインを含有する。

【0046】

任意の適切な細胞外定常ドメインを使用することができる。定常ドメインは、ヒトＴＣＲ定常ドメインであってもよく、又は別の動物由来のＴＣＲ定常ドメインであってもよく、例えば定常ドメインはマウス定常ドメインであってもよい。或いは、定常ドメインは、合成定常ドメイン、又は合成タンパク質に由来する定常ドメインであり得る。第１及び第２の鎖が両方とも定常ドメインを含有する場合、両定常ドメインは、同じ種又は異なる種由来であり得る。ヒトα鎖及びβ鎖１型及び２型の細胞外定常ドメイン配列は、それぞれ配列番号２８～３０に記載されている。一実施形態では、細胞外α鎖定常ドメインは、配列番号２８に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有し、及び／又は、細胞外β鎖定常ドメインは、配列番号２９若しくは配列番号３０に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する。

【0047】

マウスα鎖及びβ鎖１型及び２型の細胞外定常ドメイン配列は、それぞれ配列番号３１～３３に記載される。特定の実施形態では、細胞外α鎖定常ドメインは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有し、及び／又は、細胞外β鎖定常ドメインは、配列番号３２若しくは配列番号３３に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する。

【0048】

また、挿入によって、又は各鎖上の適切なアミノ酸残基をシステイン残基で置換することによって、追加のシステイン架橋を導入することができることが知られている。図１Ｅ及び１Ｆは、追加のシステイン架橋（定常ドメイン（Ｃ）を接続する実線垂直バーとして示されている）を有する結合タンパク質を示す。追加のシステイン残基は、導入された残基間のジスルフィド結合の形成が、例えば、非特許文献９によって開示されているように、可変領域が正しく配置され互いに向き合う機能的複合体の形成をもたらすような位置に導入されるべきである。

【0049】

システイン残基の導入のためのヒトＴＣＲ鎖定常領域における公知の適切な位置は、非特許文献１０及び特許文献４に開示されている。配列番号２８のヒトＴＣＲ α鎖定常領域において、追加のシステイン残基は、４９位のトレオニン残基をシステイン残基へ置換することによって導入することができる。このＴｈｒ４９Ｃｙｓ置換によって得られた改変ヒトα鎖細胞外定常ドメインは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有する。配列番号２９のヒトＴＣＲ β鎖１型定常領域又は配列番号３０の２型定常領域において、追加のシステイン残基は、５７位のセリン残基のシステイン残基への置換によって導入することができる。これらのＳｅｒ５７Ｃｙｓ置換によって得られた改変ヒトβ鎖細胞外定常ドメインは、それぞれ配列番号３５及び３６に記載のアミノ酸配列を有する。従って、一実施形態では、第１の鎖は、配列番号３４に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する細胞外α鎖定常ドメインを含有し、第２の鎖は、配列番号３５若しくは３６に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する細胞外β鎖定常ドメインを含有する。

【0050】

上記で詳述したように、配列番号３４～３６の細胞外定常ドメインは、２つの鎖間ジスルフィド結合を形成するために改変されている。従って、本明細書で提供される結合タンパク質が、細胞外定常ドメインとしてこれらの配列のいずれか１つの変異体（即ち、配列番号３４～３６のいずれか１つに対して９０％以上であるが１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列）を含有する場合、ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基は保持され得る（即ち、置換又は欠失されない）。配列番号３４のα鎖細胞外ドメインにおいて、ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基は、Ｃｙｓ４９及びＣｙｓ９６である。配列番号３５及び３６のβ鎖細胞外ドメインにおいて、ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基は、Ｃｙｓ５７及びＣｙｓ１３１である。

【0051】

マウスＴＣＲ鎖細胞外定常ドメインにおいて、ヒトＴＣＲ定常ドメインにおける上記の位置と等価な位置は、追加のシステイン残基の導入に適している。従って、配列番号３１のマウスＴＣＲ α鎖定常領域において、追加のシステイン残基は、４９位のトレオニン残基のシステイン残基への置換によって導入することができる。このＴｈｒ４９Ｃｙｓ置換によって得られた改変マウスα鎖細胞外定常ドメインは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する。マウスＴＣＲ β鎖において、配列番号３２の１型定常領域又は配列番号３３の２型定常領域において、追加のシステイン残基は、５７位のセリン残基のシステイン残基への置換によって導入することができる。これらのＳｅｒ５７Ｃｙｓ置換によって得られた改変マウスβ鎖細胞外定常ドメインは、それぞれ配列番号３７及び１１に記載のアミノ酸配列を有する。従って、特定の実施形態では、第１の鎖は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する細胞外α鎖定常ドメインを含有し、第２の鎖は、配列番号１１若しくは３７に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する細胞外β鎖定常ドメインを含有する。

【0052】

上記の改変されたヒト配列に関しては、配列番号１０、１１及び３７のいずれか１つの変異体（即ち、配列番号１０、１１又は３７のいずれか１つに対して９０％以上であるが１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列）において、ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基が保持され得る（即ち、置換又は欠失されない）。配列番号１０のα鎖細胞外ドメインにおいて、ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基は、Ｃｙｓ４９及びＣｙｓ９２である。配列番号３５及び３６のβ鎖細胞外ドメインにおいて、ジスルフィド結合形成に関与するシステイン残基は、Ｃｙｓ５７及びＣｙｓ１２７である。

【0053】

Ｔ１及びＴ３ ＴＣＲにおいて、α鎖は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含有する細胞外α鎖定常ドメインを含有し、β鎖は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含有する細胞外β鎖定常ドメインを含有する。従って、特定の実施形態では、結合タンパク質は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するか或いはそれからなる細胞外α鎖定常ドメインを含有する第１の鎖；及び配列番号１１に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するか或いはそれからなる細胞外β鎖定常ドメインを含有する第２の鎖を含有する。

【0054】

本明細書で提供されるような、それぞれ可変ドメイン及び細胞外ドメインを含有する第１の鎖及び第２の鎖を含有する、結合タンパク質は、図１Ｅに示され、非特許文献１１及び非特許文献１２に既に開示されているように、可溶性ＴＣＲ（即ち、膜に埋め込まれていない）であり得る。本明細書で使用される「可溶性ＴＣＲ」という用語は、別個の第１及び第２の鎖を含有するが、膜結合性ではないＴＣＲ分子を意味する。言い換えれば、可溶性ＴＣＲはＴＭドメイン又は細胞質ドメインを含まない。可溶性ＴＣＲは、特に、各々が細胞外ドメインのみからなる第１及び第２の鎖を含有し得る。

【0055】

第１及び第２の鎖が連結されることは、可溶性ＴＣＲの必須の局面である。もしそれらが連結されていなければ、鎖は溶液中で拡散して離れ、ＴＣＲは、もし機能したとしても、それは微々たるものであろう。鎖は、共有結合で又は共有結合に依らずに連結することができる。切断されたα及びβ鎖を共有結合で連結させることができる１つの方法は、上記のように、システイン残基間の１つ以上のジスルフィド結合によるものである。可溶性ＴＣＲの切断されたα及びβ鎖を連結することができる別の方法は、共有結合に依らない相互作用によるものである。一実施形態では、ロイシンジッパーを用いて、鎖を共有結合に依らずに連結させる。この実施形態において、切断されたα鎖及びβ鎖の両方が、それらの細胞外定常ドメインのＣ末端にロイシンジッパードメインを含有する。ロイシンジッパー及びそれらの配列は、当技術分野で周知であり、例えば、非特許文献１３に概説されている。共有結合及び共有結合に依らない相互作用の組合せも、可溶性ＴＣＲの切断されたα及びβ鎖を連結するために使用することができる。

【0056】

可溶性ＴＣＲ（及びｓｃＦｖ－ＴＣＲ、これもまた可溶性であるが、本明細書で使用される「可溶性ＴＣＲ」の定義には該当しない）の使用は、以下に更に記述される。可溶性ＴＣＲ及びｓｃＦｖ－ＴＣＲは、アフィニティータグでコード化することができ、これは、その合成後の可溶性ＴＣＲ又はｓｃＦｖ－ＴＣＲの精製において使用することができる。可溶性ＴＣＲの場合、一実施形態では、ただ１つの鎖（即ち、切断されたα又はβ鎖）のみが、アフィニティータグと共に生成される。アフィニティータグは、切断されたα又はβ鎖のいずれかの末端、例えばＣ末端、に位置することができる。アフィニティータグは、当業者に公知の任意の適切なタグ、例えば、ＦＬＡＧ－タグ、Ｈｉｓ－タグ、ＨＡ－タグ、Ｓｔｒｅｐ－タグ、Ｓ－タグ、Ｍｙｃ－タグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）など、であってよい。

【0057】

リンカー及び／又はプロテアーゼ開裂部位は、結合タンパク質配列とアフィニティータグとの間に位置することができる。プロテアーゼ開裂部位を含めることにより、精製後に結合タンパク質からアフィニティータグを除去することができる。適切なプロテアーゼ開裂部位は、当業者に周知であり、トロンビン、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）３Ｃ及びタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）切断部位を包含する。

【0058】

第１の鎖及び／又は第２の鎖は、更に、膜貫通ドメインを含有し得る。第１又は第２の鎖では、膜貫通ドメインは細胞外定常ドメインのＣ末端に位置する。

【0059】

任意の適切な膜貫通ドメインを使用することができる。特定の実施形態において、膜貫通ドメインはＴＣＲ鎖の膜貫通ドメインである。即ち、第１の鎖が膜貫通ドメインを含有する場合、それはＴＣＲ α鎖の膜貫通ドメインであってもよく；第２の鎖が膜貫通ドメインを含有する場合、それはＴＣＲ β鎖の膜貫通ドメインであってもよい。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒトＴＣＲ鎖の膜貫通ドメインである。別の実施形態において、膜貫通ドメインは、マウスＴＣＲ鎖の膜貫通ドメインである。一実施形態では、第１及び第２の鎖の両方がＴＣＲ鎖膜貫通ドメインを含有する場合、ＴＣＲ膜貫通ドメインは両方とも同じ種に由来する。

【0060】

ヒトＴＣＲ α鎖膜貫通ドメインは、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有し、従って、一実施形態では、第１の鎖は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する膜貫通ドメインを含有する。マウスα鎖膜貫通ドメインは、配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有し、従って、別の実施形態では、第１の鎖は、配列番号４４に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する膜貫通ドメインを含有する。

【0061】

ヒト及びマウスＴＣＲ β鎖１型及び２型の膜貫通ドメインは、すべて、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を有する。従って、特定の実施形態では、第２の鎖は、配列番号３９に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する膜貫通ドメインを含有する。

【0062】

実施例において開示されるＴ１及びＴ３ ＴＣＲは、両方とも、配列番号４４の膜貫通ドメインを有するα鎖及び配列番号３９の膜貫通ドメインを有するβ鎖を有する。従って、特定の実施形態では、第１及び第２の鎖は、両方とも、膜貫通ドメインを含有し、結合タンパク質の第１の鎖の膜貫通ドメインは、配列番号４４に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有し、結合タンパク質の第２の鎖の膜貫通ドメインは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する。

【0063】

或いは、そして、以下で更に議論するように、膜貫通ドメインは、任意の他の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインに基づくか又はそれに由来してもよい。典型的には、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ１５４からの、例えばこれらのタンパク質のいずれか１つのヒトバージョンからの、膜貫通ドメインであってもよく又はこれから誘導されてもよい。１つの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ４又はＣＤ３ζからの、例えば、ヒトＣＤ２８、ＣＤ４又はＣＤ３ζからの、膜貫通ドメインであってもよく又はこれから誘導されてもよい。

【0064】

一実施形態では、膜貫通ドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列を有するヒトＣＤ２８の膜貫通ドメインである。即ち、膜貫通ドメインは、配列番号４０に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有し得る。

【0065】

第１の鎖及び／又は第２の鎖は、更に、細胞質ドメインを含有し得る。当技術分野において公知であるように、天然ＴＣＲにおいて、α鎖及びβ鎖は、Ｃ末端に位置する短い細胞質ドメインを含有する。任意の適切な細胞質ドメインを使用することができる。１つの実施形態において、細胞質ドメインは、ＴＣＲ鎖の細胞質ドメインである。即ち、第１の鎖が細胞質ドメインを含有するα鎖である場合、それはＴＣＲ α鎖の細胞質ドメインであってもよく、第２の鎖が細胞質ドメインを含有するβ鎖である場合、それはＴＣＲ β鎖の細胞質ドメインであってもよい。

【0066】

１つの実施形態において、細胞質ドメインは、ヒトＴＣＲ鎖の細胞質ドメインである。別の実施形態において、細胞質ドメインは、マウスＴＣＲ鎖の細胞質ドメインである。第１鎖及び第２鎖の両方がＴＣＲ鎖細胞質ドメインを含有する場合、ＴＣＲ細胞質ドメインは、両方とも同じ種に由来することができる。

【0067】

ヒト及びマウスＴＣＲ α鎖細胞質ドメインは、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を有し、従って、一実施形態では、第１の鎖は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する細胞質ドメインを含有するα鎖である。ヒトＴＣＲ β鎖１型細胞質ドメインは、配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有し、ヒトＴＣＲ β鎖２型細胞質ドメインは、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有する。従って、１つの実施形態において、第２の鎖は、配列番号４２若しくは配列番号４３に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する細胞質ドメインを含有するβ鎖である。

【0068】

マウスＴＣＲ β鎖１型細胞質ドメインは、配列番号４６に記載のアミノ酸配列を有し、マウスＴＣＲ β鎖２型細胞質ドメインは、配列番号４７に記載のアミノ酸配列を有する。従って、一実施形態では、第２の鎖は、配列番号４６又は配列番号４７に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する細胞質ドメインを含有するβ鎖である。

【0069】

Ｔ１及びＴ３ ＴＣＲは、両方とも、配列番号４１の細胞質ドメインを有するα鎖及び配列番号４７の細胞質ドメインを有するβ鎖を有する。特定の実施形態では、第１の鎖及び第２の鎖は、両方とも、細胞質ドメインを含有し（即ち、それらは全長α鎖及びβ鎖である）、α鎖の細胞質ドメインは、配列番号４１に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有し、β鎖の細胞質ドメインは、配列番号４７に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する。

【0070】

別の実施形態では、第１鎖及び／又は第２鎖（一般に、第１鎖又は第２鎖のいずれか）は、細胞内シグナル伝達ドメインを含有する細胞質ドメインを含有する。用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、本明細書では、標的抗原－ＭＨＣ複合体への有効な受容体結合のメッセージを、その受容体を発現する免疫エフェクター細胞の内部に変換し、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖及び／又は結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出を始めとする細胞傷害活性、又はその標的への受容体の結合によって誘発されるその他の細胞応答、を誘導することに関与する結合タンパク質鎖のドメインを意味する。

【0071】

使用することができる細胞内シグナル伝達ドメインの例には、ＣＤ３ζ、ＦｃＲｙ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来するものが包含される。幾つかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ又はＦｃＲγ、例えば、ヒトＣＤ３ζ又はＦｃＲγに由来する。一実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号４８に記載のアミノ酸配列又は配列番号４８に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するヒトＣＤ３ζドメインである。

【0072】

更に、受容体を発現する免疫エフェクター細胞の完全な活性化を可能にするか又は増大させるために、細胞質ドメインは、更に、（細胞内シグナル伝達ドメインに加えて）共刺激ドメインを含有し得る。従って、細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原依存的な一次活性化を開始することができ（即ち、一次細胞質シグナル伝達配列であり得る。）、共刺激ドメインは、抗原非依存的に作用して二次又は共刺激シグナルを提供する（即ち、二次細胞質シグナル伝達配列であり得る）。

【0073】

用語「共刺激シグナルドメイン」又は「共刺激ドメイン」は、共刺激分子の細胞内ドメインを含有する細胞質ドメインの部分を指す。共刺激分子は、抗原受容体又はＦｃ受容体以外の細胞表面分子であり、抗原に結合すると免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）の効率的な活性化及び機能に必要な第２のシグナルを提供する。本明細書で使用することができる共刺激ドメインの例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＤ２Ｃ及びＢ７－Ｈ２の細胞内ドメイン、例えば、これらのヒトバージョンが挙げられる。共刺激ドメインは、単独で又は組み合わせて使用することができる（即ち、１つ以上の共刺激ドメインが含まれ得る）。１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含有することにより、本明細書で提供される受容体を発現する免疫エフェクター細胞の効力及び拡大を増強し得る。一実施形態では、共刺激ドメインは、配列番号４９のアミノ酸配列又は配列番号４９に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するヒトＣＤ２８の細胞内ドメインであってもよく又はこれを含んでいてもよい。

【0074】

本明細書中の実施例は、α鎖及びβ鎖を含有する全長Ｔ１及びＴ３ ＴＣＲの機能性を実証する（用語「全長ＴＣＲ」は、本明細書で用語「ＴＣＲ」と交換可能である）。ＨＬＡ－Ａ^*０２：０１に関連してリンパ系特異的酵素末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）由来のペプチドを標的とするこれらのＴＣＲを発現するように改変されたＴ細胞は、インビトロ及び播種性ＡＬＬのマウスモデルの両方において、Ｔ細胞及びＢ細胞由来の原発性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞を特異的に排除することが実証されている。対照的に、ＴｄＴ発現を欠く、正常な、成熟Ｔ及びＢ細胞レパートリー並びに非系統拘束性造血前駆細胞は温存される。実施例に記載されたＴＣＲ反応性の広範なマッピングでは、ヒトプロテオーム中の任意の天然に存在するペプチドとの交差反応性は確認されず、非常に高いペプチド特異性を示した。

【0075】

上記及び実施例において記載したように、Ｔ１及びＴ３ ＴＣＲは、ヒトＴＣＲ可変ドメイン並びにマウスＴＣＲ細胞外定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含有する。従って、特定の実施形態では、本明細書で提供される結合タンパク質は、図１Ａに例示されるような構造を有するＴＣＲである。この実施形態では、ＴＣＲは、従って、α鎖及びβ鎖を含み、α鎖は、ＴＣＲ α鎖可変ドメイン、ＴＣＲ α鎖細胞外定常ドメイン、ＴＣＲ α鎖膜貫通ドメイン及びＴＣＲ α鎖細胞質ドメインを含有し、β鎖は、ＴＣＲ β鎖可変ドメイン、ＴＣＲ β鎖細胞外定常ドメイン、ＴＣＲ β鎖膜貫通ドメイン及びＴＣＲ β鎖細胞質ドメインを含有する。

【0076】

種々のドメインは、上記の配列を有し得る。特に、ＴＣＲは、α鎖及びβ鎖を含有することができ、その各々は、ヒト可変ドメイン及びマウス細胞外定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含有する。

【0077】

特定の実施形態では、ＴＣＲは、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号２２に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する可変ドメイン；配列番号１０に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する細胞外定常ドメイン；配列番号４４に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する膜貫通ドメイン；及び配列番号４１に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する細胞質ドメインを含有するα鎖、並びに、
（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号２３に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する可変ドメイン；配列番号１１に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する細胞外定常ドメイン；配列番号３９に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する膜貫通ドメイン；及び配列番号４７に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する細胞質ドメインを含有するβ鎖、
を含有するＴ３ ＴＣＲである。

【0078】

全長成熟Ｔ３ ＴＣＲ α鎖は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する。従って、一実施形態では、結合タンパク質は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するα鎖を含有する。全長成熟Ｔ３ ＴＣＲ β鎖は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する。従って、一実施形態では、結合タンパク質は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するβ鎖を含有する。

【0079】

特定の実施形態において、本明細書で提供されるＴＣＲは、
（ｉ）配列番号２４に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するα鎖；及び
（ｉｉ）配列番号２５に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するβ鎖、
を含有するＴ３ ＴＣＲである。

【0080】

別の特定の実施形態では、ＴＣＲは、
（ｉ）Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号８に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するα鎖を含有する可変ドメイン；配列番号１０に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する細胞外定常ドメイン；配列番号４４に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する膜貫通ドメイン；及び配列番号４１に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する細胞質ドメインを含有するα鎖；及び
（ｉｉ）Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号９に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する可変ドメイン；配列番号１１に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する細胞外定常ドメイン；配列番号３９に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する膜貫通ドメイン；及び配列番号４７に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する細胞質ドメインを含有するβ鎖、
を、含有するＴ１ ＴＣＲである。

【0081】

全長成熟Ｔ１ ＴＣＲ α鎖は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する。従って、一実施形態では、結合タンパク質は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するα鎖を含有する。全長成熟Ｔ１ ＴＣＲ β鎖は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する。従って、一実施形態では、結合タンパク質は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するβ鎖を含有する。

【0082】

特定の実施形態において、本明細書で提供されるＴＣＲは、
（ｉ）配列番号１２に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するα鎖；及び
（ｉｉ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するβ鎖、
を含有するＴ１ ＴＣＲである。

【0083】

上記のように、本明細書で提供される結合タンパク質の細胞質ドメインは、ＴＣＲ細胞質ドメインではなく、細胞内シグナル伝達ドメイン（及び所望により共刺激ドメイン）を含有し得る。このような代替細胞質ドメインは、キメラ受容体において使用することができる。

【0084】

例示的なキメラ受容体はキメラＴＣＲであり、その基本構造を図１Ｄに示す。キメラＴＣＲは、特許文献３及び特許文献４に既に記載されている。キメラＴＣＲは、（Ｎ末端からＣ末端まで）単鎖ＴＣＲ可変領域（ｓｃＦｖ－ＴＣＲ）、細胞外定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含有する単一のポリペプチド鎖を含有する。

【0085】

本明細書で提供されるキメラＴＣＲにおいて、ｓｃＦｖ－ＴＣＲは、上記のとおりである。細胞外定常ドメインは、α鎖の定常ドメイン又はβ鎖の定常ドメインであり得る。上記のように、ＴＣＲ α鎖又はβ鎖の任意の適切な細胞外定常ドメイン、例えば、ＴＣＲ α鎖又はβ鎖のヒト又はマウス細胞外定常ドメイン、を使用することができる。キメラＴＣＲは、ＴＣＲ鎖の単一の細胞外定常ドメインのみを含有する。本明細書において提供されるキメラＴＣＲは、任意の適切な膜貫通ドメイン、例えば、上記のもの、を含有し得る。キメラＴＣＲの膜貫通ドメインは、上記のようにＴＣＲ鎖の膜貫通ドメインであってもよく、又は上記のように非ＴＣＲタンパク質の膜貫通ドメインであってもよい。細胞質ドメインは、上記のように、細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。細胞質ドメインは、上記のように、更に、共刺激ドメインを含有し得る。

【0086】

キメラＴＣＲとの関連では、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインが一緒になって「シグナル伝達尾部」を構成する。細胞内シグナル伝達ドメインと共刺激ドメインの両方を含有するシグナル伝達尾部において、細胞内シグナル伝達ドメインと共刺激ドメインは、膜貫通ドメインのＣ末端と直列に任意の順序で連結され得る。１つの実施形態において、シグナル伝達尾部は、以下の順序で、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内ドメイン及びＣＤ３ζ細胞内ドメインを含有する。

【0087】

別の例示的なキメラ受容体は、ＴＣＲ－ＣＡＲであり、その基本構造を図１Ｆに示す。ＴＣＲ－ＣＡＲは、非特許文献１２に最初に記載された。ＴＣＲ－ＣＡＲは、標準ＣＡＲと同じ理論的根拠に基づくが、標準ＣＡＲのｓｃＦｖは、（上記のように）可溶性ＴＣＲで置換される。これにより、ＣＡＲの機能的可能性を有するがＴＣＲの基質幅を有する構築物が提供される（即ち、それらは、細胞タンパク質分解から生じる任意のペプチドに対して向けられ得る）。

【0088】

従って、ＴＣＲ－ＣＡＲは、上記のように可溶性ＴＣＲを含有するが、可溶性タンパク質ではなく、可溶性ＴＣＲ構築物の１つの鎖は、キメラＴＣＲに関連して、上記のように、シグナル伝達尾部を含有する。シグナル伝達尾部は、第１の（即ち、切断されたα－）鎖又は第２の（即ち、切断されたβ－）鎖のいずれかのＣ－末端（細胞外定常ドメインに対するＣ－末端）に位置していてもよい。

【0089】

本明細書で提供される可溶性結合タンパク質（即ち、上記のように、膜貫通ドメインを欠く結合タンパク質、例えばＴＣＲ－ｓｃＦｖ及び可溶性ＴＣＲ）は、原核生物（例えば、細菌）細胞又は真核生物（例えば、酵母、真菌、昆虫又は哺乳動物）細胞を使用する細胞発現系などのタンパク質発現系を使用して合成することができる。代替的なタンパク質発現系は無細胞インビトロ発現系であり、この系では結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列がｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡはインビトロでタンパク質に翻訳される。無細胞発現系キットは広く入手可能であり、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社(米国）から購入することができる。或いは、結合タンパク質は、非生物学的系において、例えば液相又は固相合成によって、化学的に合成することができる。

【0090】

合成後、当技術分野で公知の技術を用いて、特異的結合分子を単離及び精製する。例えば、結合タンパク質は、宿主真核細胞を使用して産生することができる。結合タンパク質は、（以下に論じるように）それをエクスポートに導くリーダー配列を含有するように発現され得る。この場合、結合タンパク質は、生産細胞から培養培地にエクスポートされる。次いで、培養培地は、例えば遠心分離によって、生産細胞から分離される。次いで、結合タンパク質は、例えば（もし、結合タンパク質が上述のようなアフィニティータグを含有するならば）アフィニティークロマトグラフィーによって、精製することができる。プロテアーゼ開裂部位がタグと成熟結合タンパク質との間に存在する場合、タグは、結合タンパク質の精製後に、適切なプロテアーゼを使用して切断することができる。

【0091】

本明細書で提供される可溶性結合タンパク質（即ち、膜貫通ドメインを欠く結合タンパク質、例えばＴＣＲ－ｓｃＦｖ及び可溶性ＴＣＲ）は、治療薬若しくは診断薬或いは治療薬若しくは診断薬を含有するか又は含む担体に連結又は結合することができる。治療薬は、治療に使用される薬剤である。治療とは、疾患の処置又は予防を意味する。治療薬は、腫瘍性条件、特に癌、の処置において有用な薬剤であり得る。

【0092】

治療薬は、薬物分子、例えば標的細胞を死滅させるための毒素、であり得る。適切な毒素は、単独ではヒト細胞に侵入したり、これを殺したり、又はその他の方法で破壊したりすることもできないが、結合分子を介してヒト細胞に取り込まれると、その毒性効果を発揮することができる毒素である。従って、このような毒素は、毒素を保有する可溶性結合タンパク質（毒素を保有する可溶性ＴＣＲなど）によって結合された細胞によってのみ取り込まれ、その細胞にその標的効果を及ぼし、その細胞に可溶性結合タンパク質が取り込まれる。

【0093】

適切な毒素には、標的ドメインを欠くペプチド毒素が含まれる。例えば、それは、もともと標的ドメインを欠くペプチド毒素であってもよく、又は、それは、そのもともとの形態を改変してその標的ドメインを除去したペプチド毒素であってもよい。このような毒素の例としては、サポリン及びゲロニンが挙げられ、これらは、例えばリシンと同じファミリーのリボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）であるが、細胞の原形質膜を通過することができない。同様に、細菌細胞毒素の酵素ドメイン、例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ又はクロストリジウム細胞毒素、例えば、クロストリジウム・ソルデリイのＴｃｓＬ、の酵素ドメインのような病原体の細胞毒素の酵素ドメイン（即ち、触媒ドメイン）を使用してもよい。

【0094】

可溶性結合タンパク質は、そのＣ末端に位置する毒素を有する融合タンパク質としてコードすることができる（可溶性ＴＣＲの場合、毒素は、切断されたα鎖又はβ鎖のいずれかのＣ末端に位置し得る）。或いは、毒素は、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して（例えば、ビオチン／ストレプトアビジンシステムを使用して）、可溶性結合タンパク質に結合することができる。

【0095】

治療薬は、必要に応じて、他の有用な治療薬、例えば、化学療法薬、又は他の抗癌剤、又は抗ウイルス剤などであってもよい。

【0096】

診断薬は、診断目的に有用な薬剤である。そのような薬剤は、例えば、トレーサー又は標識、即ち、その人体の通過を追跡するために検出できる薬剤であってよい。トレーサー又は標識は、スキャン、例えばＰＥＴスキャン又はＣＴスキャン、によって検出することができる。放射性標識を始めとする多くのトレーサー及び標識が当技術分野で公知である。一般的な放射性同位体¹¹Ｃ、¹³Ｎ、¹⁵Ｏ、¹⁸Ｆ、⁹⁹Ｔｃ、¹²³Ｉ及び¹²⁵Ｉを始めとする任意の適切なトレーサー又は標識を使用することができる。診断薬は、当技術分野で公知の任意の適当な標識群、例えば放射性標識付きビオチン、を使用して、可溶性結合タンパク（例えば、可溶性ＴＣＲ）に結合することができる。

【0097】

治療薬に結合した可溶性結合タンパク質（例えば、可溶性ＴＣＲ）は、治療において使用することができる。診断薬に結合された可溶性ＴＣＲ又は診断薬を含有する担体は、インビボ診断方法において使用することができる。

【0098】

本明細書で提供される不溶性結合タンパク質（即ち、膜貫通ドメインを含有する結合タンパク質、例えばＴＣＲなど）は、結合タンパク質を発現する細胞との関連において提供される。このような細胞は、特に、以下に記載されるように、その中で結合タンパク質の機能的発現が達成される免疫エフェクター細胞であってよい。

【0099】

本明細書で提供される結合タンパク質及び／又は抗原結合単位をコードする組換え核酸分子も、また、本明細書で提供される。本明細書で提供される核酸分子は、単離された核酸分子であってよく、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの化学誘導体を含有していてよい。「核酸分子」という用語は、具体的には、ＤＮＡ及びＲＮＡの一本鎖及び二本鎖形態を包含する。核酸（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）は、環状又は線状であり得る。「組換え」核酸分子は、組換え技術、例えば分子クローニング、を用いて合成された核酸分子である。

【0100】

本明細書で提供される組換え核酸分子は、本明細書で提供される結合タンパク質をコードする。上で詳述したように、結合タンパク質は、２つのポリペプチド鎖（特に、第１の鎖（即ち、全長の又は切断されたα鎖）及び第２の鎖（即ち、全長の又は切断されたβ鎖））を含有し得る。２つのポリペプチド鎖を含有する結合タンパク質をコードする組換え核酸分子は、２つの鎖の両方をコードする（即ち、第１の鎖及び第２の鎖は、両方とも、同じ組換え核酸分子によってコードされる）。この場合、２つの鎖は、２つの別々の遺伝子としてコードされてよく、それぞれは、２つの鎖が別々に発現されるように、それ自体のプロモーターの制御下にある。或いは、以下で更に議論されるように、２つの鎖は、単一の遺伝子によって、単一のポリペプチド内にコードされてよい。

【0101】

本明細書の特定の一実施形態では、組換え核酸分子はｃＤＮＡ分子を含有する。特に、結合タンパク質又はその鎖は、ｃＤＮＡによってコードされてよい。「ｃＤＮＡ」とは、本明細書で使用される場合、その真の及び元々の意味でのＤＮＡ（即ち、ｍＲＮＡの逆転写によって合成されたＤＮＡ）、元のｃＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、及びｃＤＮＡと等価であるＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡと等価なＤＮＡとは、本明細書で提供される結合タンパク質（又はその第１鎖又は第２鎖）をコードし且つイントロンを欠き、その結果、かつｍＲＮＡの逆転写によって得られるタンパク質コード配列に類似するＤＮＡである。本明細書の特定の一実施形態では、本明細書で提供される結合タンパク質をコードする核酸分子は、コドン最適化される。特に、結合タンパク質は、コドン最適化ｃＤＮＡ配列によってコードされてもよい。

【0102】

本明細書で定義されるヌクレオチド配列を構築するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、従来のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を包含する。

【0103】

核酸分子の単離のための方法もまた、当技術分野で周知である。例えば、ＤＮＡは、適切なキットを使用して単離することができる。プラスミドＤＮＡは、製造業者の指示に従って、Ｍｉｎｉｐｒｅｐ又はＭａｘｉｐｒｅｐキットを使用して細菌から単離することができる。そのようなキットは、例えばＱｉａｇｅｎ社(ドイツ）から入手可能である。ゲノムＤＮＡは、例えば、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）又はＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、製造業者の指示に従って、真核細胞又は原核細胞から抽出することができる。或いは、フェノール－クロロホルム抽出の従来の方法を使用して、目的の細胞からＤＮＡを単離することができる。ＲＮＡは、キット（例えば、ＲＮｅａｓｙ ミニキット、Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して、又はＤＮａｓｅ処理と組み合わせたフェノール－クロロホルム抽出の伝統的な方法によって細胞から抽出することができる。ｃＤＮＡは、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、米国）などのキットを使用して、ＲＮＡの逆転写によって生成することができる。

【0104】

本明細書で提供される組換え核酸分子は、異種核酸配列に連結された組換え核酸分子を含有する組換え構築物内に提供することができる。本明細書において、「異種」とは、本明細書に記載の核酸分子に天然には連結されない、即ち、自然界では、本明細書に記載の核酸分子に連結されない核酸配列を意味する。構築物に関して本明細書で使用される「連結された」という用語は、単に、核酸分子が異種核酸配列に直接結合されていることを意味する。一実施形態では、組換え構築物において、本明細書で提供される核酸分子は、異種発現制御配列に作動可能に連結される。

【0105】

「発現制御配列」という用語は、コード配列の上流、コード配列内又はコード配列の下流に位置し、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は翻訳に影響を及ぼす（即ち、コードされる特異的結合分子の発現の任意の局面に影響を及ぼす）ヌクレオチド配列を指す。発現制御配列には、プロモーター、ＴＡＴＡボックス又はＢ認識エレメントなどのプロモーターエレメント、オペレーター、エンハンサー、翻訳リーダー配列、ターミネーター配列などが含まれる。

【0106】

構築物において、核酸分子は、１つ以上の異種発現制御配列に作動可能に連結することができる。核酸分子は、典型的には、少なくともプロモーターに作動可能に連結される。適当なプロモーター配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、構成的シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶ ＬＴＲプロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、ＥＢＶ前初期プロモーター及びラウス肉腫ウイルスプロモーターが包含される。これらに限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター及びクレアチンキナーゼプロモーターを始めとするヒト遺伝子プロモーターも、また、使用することができる。或る実施形態において、誘導性プロモーターを使用することができる。これらは、核酸分子の発現をオン又はオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター又はテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

【0107】

「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響されるように、単一の核酸断片上に２つ以上の核酸分子が会合していることを指す。例えば、プロモーターは、それがそのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（即ち、コード配列がそのプロモーターの転写制御下にある）場合、コード配列に作動可能に連結される。

【0108】

上記で詳述したように、本明細書で提供される組換え核酸分子は、本明細書で提供される結合タンパク質をコードする。結合タンパク質が２つのポリペプチド鎖（即ち、全長又は切断されたα鎖及び全長又は切断されたβ鎖）を含有する場合、例えば、結合タンパク質がＴＣＲである場合、両方のポリペプチド鎖は、同じ核酸分子によってコードされる。この場合、第１及び第２の鎖の等モル発現は、例えばリンカーによって第２の鎖に連結された第１の鎖を含有する単一のポリペプチドとして結合タンパク質をコードすることによって達成することができる（即ち、結合タンパク質は、第１及び第２の鎖がリンカーによって分離されている単一のポリペプチド鎖としてコードすることができる）。リンカーは、任意の適切なアミノ酸配列を有し得る。適切なリンカーは、当技術分野において公知である。リンカーは、任意の適切な長さのものであり得る。例えば、それは、１～３０アミノ酸長、例えば、１～２５又は１～２０アミノ酸長であり得る。リンカーは、開裂可能であり得、それにより、第１及び第２のポリペプチドの分離を可能にする。もし第１及び第２のポリペプチドが分離できないと、２つの鎖は、第１及び第２の鎖の可変領域からの抗原結合部位の形成に必要とされる正しい立体配座を採用することができない場合がある。当業者は、適切なリンカーを選択することができる。リンカーは、リンカーの特異的な翻訳後開裂、従って第１及び第２のポリペプチドの分離、を可能にするために、プロテアーゼ開裂部位を含有し得る。適切なプロテアーゼ開裂部位は、当業者に周知であり、トロンビン、第Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）３Ｃ及びタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位を包含する。

【0109】

特定の実施形態では、リンカーは自己スプライシングである。自己スプライシングリンカーは、それ自体の開裂を触媒することができ、従って、活性開裂ステップを必要とせずに第１及び第２のポリペプチドを分離する。自己スプライシング反応を起こすために、刺激や誘導は必要ない。開裂反応は、単一鎖特異的結合分子からリンカーを完全に切除し得る。或いは、リンカー又はリンカーの一部は、生じた別個のポリペプチド鎖の一方又は両方に付着したままであり得る。リンカーによって触媒される自己スプライシング反応は、翻訳後に起こり得る（即ち、自己触媒的タンパク質分解反応であり得る）か、又はそれは、同時翻訳的に起こり得る。同時翻訳スプライシングは、リンカー内での又はリンカーとそのいずれかの側のポリペプチド鎖の１つとの間のペプチド結合の形成を防止することによって起こり得る。

【0110】

自己スプライシングリンカーは、リボソームスキッピング配列を利用し得る。このようなリボソームスキッピング配列は当業者に周知である。適切な自己スプライシングリンカーは、ピコルナウイルス自己開裂２Ａペプチドに由来するものである。２Ａペプチドは約２０～２５アミノ酸長であり、保存された配列モチーフＡｓｐ－Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ａｓｎ－Ｐｒｏ－ＧｌｙＰｒｏ（配列番号：５０）で終わる。２Ａペプチドは、リンカー内の最終位置に保存されたグリシン残基とＣ末端プロリン残基との間のペプチド結合の形成を防止することによって、同時翻訳自己スプライシングを受け、その結果、効果的にこれら２つのアミノ酸間のタンパク質の開裂をもたらす。開裂後、２Ａペプチド（Ｃ末端プロリンを除く）は、上流タンパク質のＣ末端に結合したままであり、最終プロリン残基は、下流タンパク質のＮ末端に結合したままである。２Ａペプチドは、非特許文献１４に記載されている。

【0111】

本明細書の実施例は、配列番号２６のブタテシコウイルス由来２Ａ配列によって分離されたα鎖及びβ鎖をコードするベクターからのＴＣＲの発現を実証する。従って、本明細書で提供される核酸分子は、本明細書で提供される結合タンパク質をコードすることができ、ここで、結合タンパク質は、自己スプライシング２Ａペプチドによって第２の鎖（例えば、β鎖）に連結された第１の鎖（例えば、α鎖）を含有する単一のポリペプチドの形態でコードされる。２Ａペプチドリンカーは、自己スプライシング活性を有するように、任意の適切な配列を有し得る。いくつかの２Ａペプチド配列が知られており（例えば、非特許文献１５及び特許文献４に開示された２Ａ配列）、そのいずれも、本開示に従って使用することができる。リンカーがそのＣ末端に配列番号５０の２Ａペプチドモチーフを含有する限り、本質的に任意の配列を使用することができる。一実施形態では、自己スプライシングリンカーは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する２Ａペプチドである。

【0112】

本明細書で提供される結合タンパク質（又は、関連する場合、結合タンパク質の第１の鎖及び第２の鎖）は、Ｎ末端リーダー配列でコードすることができる。このようなリーダー配列は、エクスポート（可溶性結合タンパク質の場合）又は膜への挿入（膜貫通ドメインを含有する結合タンパク質の場合）のいずれかのために、結合タンパク質（又はその鎖）を細胞膜に導くと考えられ、タンパク質のエクスポート又は膜へのその挿入の際に、トリミングされて、成熟タンパク質を生じる。例示的なα鎖Ｎ末端リーダー配列は、配列番号５１に記載のアミノ酸配列を有し、例示的なβ鎖Ｎ末端リーダー配列は、配列番号５２及び配列番号５３（これらのリーダー配列は、以下の実施例において使用される）に記載のアミノ酸配列を有する。具体的には、配列番号５２は、Ｔ１ ＴＣＲ β鎖のリーダー配列として使用され、配列番号５３は、Ｔ３ ＴＣＲ β鎖のリーダー配列として使用される。任意の適切なリーダー配列が、本開示に従って使用され得るが、一実施形態では、第１鎖（例えばα鎖）は、配列番号５１に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するリーダー配列でコードされ；第２鎖（例えばβ鎖）は、配列番号５２若しくは配列番号５３に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有するリーダー配列でコードされる。

【0113】

１つの実施形態において、Ｔ１ ＴＣＲベースの結合タンパク質は、配列番号５１のリーダー配列又はそれに対して９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する第１の鎖（例えばα鎖）；及び配列番号５２のリーダー配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する第２の鎖（例えばβ鎖）を含有し得る。別の実施形態において、Ｔ３ ＴＣＲに基づく結合タンパク質は、配列番号５１のリーダー配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する第１の鎖（例えばα鎖）；及び配列番号５３のリーダー配列又はそれに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する第２の（例えばβ鎖）を含有し得る。結合タンパク質が単一のポリペプチド鎖のみを含有する場合、任意のリーダー配列、例えば、ＴＣＲ α鎖又はＴＣＲ β鎖からのリーダー配列、を使用することができる。例えば、リーダー配列は、配列番号５１、５２又は５３に記載のアミノ酸配列又はそれらに対して少なくとも９０％若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有し得る。

【0114】

Ｔ３ ＴＣＲ鎖を含有する例示的な単一ポリペプチドは、配列番号４５に記載のアミノ酸配列を有する。このポリペプチド構築物は、Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号５３のＮ末端リーダーを有する配列番号２５のβ鎖、配列番号２６の２Ａペプチドリンカー及び配列番号５１のＮ末端リーダーを有する配列番号２４のα鎖を含有する。Ｔ１ ＴＣＲ鎖を含有する例示的な単一ポリペプチドは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する。このポリペプチド構築物は、Ｎ末端からＣ末端まで、配列番号５２のＮ末端リーダーを有する配列番号１３のβ鎖、配列番号２６の２Ａペプチドリンカー及び配列番号５１のＮ末端リーダーを有する配列番号１２のα鎖を含有する。Ｔ３単鎖ＴＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、配列番号５５に示され、Ｔ１単鎖ＴＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、配列番号５４に示されている。

【0115】

本明細書で提供される組換え核酸分子又は構築物は、ベクター内に提供することができる。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、本明細書で提供される核酸分子又は構築物を導入することができる（例えば、共有結合的に挿入することができる）媒介物を指し、そこから、核酸分子によってコードされる特異的結合分子が発現され及び／又は核酸分子／構築物がクローン化され得る。従って、ベクターは、クローニングベクター又は発現ベクターであり得る。

【0116】

ベクターの例としては、プラスミド、自律複製配列及び転移因子が挙げられる。更なる例示的ベクターには、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、ラムダファージ又はＭ１３ファージなどのバクテリオファージ、及びヒトウイルス（即ちウイルスベクター）などの動物ウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。ベクターとして有用な動物ウイルスのカテゴリーの例としては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス及びパポバウイルス（例えばＳＶ４０）が挙げられるが、これらに限定されない。発現ベクターの例は、哺乳動物細胞における発現のためのｐＣｌ－ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び哺乳動物細胞におけるレンチウイルス媒介遺伝子導入及び発現のためのｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）及びｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５－ＤＥＳＴ（商標）である。

【0117】

ベクターは、細菌又は原核生物ベクター（即ち、細菌又は原核生物細胞における、例えばクローニング又は発現に使用するためのベクター）又は真核生物ベクター（即ち、哺乳類細胞における使用のためのベクター）、例えば哺乳類ベクター、であってもよい。本明細書で提供される核酸分子又は構築物は、細菌クローニングベクター、例えば、大腸菌クローニングベクター、などの汎用クローニングベクター中で産生することができるか又はその中に導入することができる。典型的には、クローニングベクターは、細菌プラスミド、例えば大腸菌プラスミド、である。このようなクローニングベクターの例としては、ｐＵＣ１９（例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）社、米国から入手可能）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ａｇｉｌｅｎｔ社、米国）及びＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社からのｐＣＲ ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターが挙げられる。

【0118】

本明細書で提供される核酸分子又は構築物は、哺乳動物発現ベクターなどの、本明細書で提供される特異的結合分子の発現のための発現ベクター中にサブクローニングすることができる。発現ベクターは、種々の発現制御配列を含有し得る。発現ベクターは、そのそれぞれの宿主細胞における効率的な遺伝子転写及び翻訳のために、翻訳開始部位におけるＫｏｚａｋ配列であるＴＡＴＡボックス及び転写終結をシグナルで知らせる３’ＵＴＲ ＡＡＴＡＡＡポリアデニル化シグナル配列を始めとするプロモーター配列（上述）などの必須の５’上流及び３’下流調節エレメントを有していなければならない。

【0119】

転写及び翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターは、例えばベクター複製、選択マーカーなどを始めとする、他の機能を果たす追加の核酸配列を含有し得る。細菌宿主細胞の選択に適した選択マーカーの例としては、アンピシリン耐性遺伝子（例えば、β－ラクタマーゼ）、カナマイシン耐性遺伝子又はクロラムフェニコール耐性遺伝子（例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。哺乳類宿主細胞における使用に適した選択マーカーには、ヒグロマイシンＢに対する耐性を付与するヒグロマイシン－Ｂホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ又はａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）及び多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子が含まれる。このような選択マーカーは、ベクターを保有する細胞のインビトロ選択を可能にする。

【0120】

ベクターは、そのベクターを保有する免疫エフェクター細胞を、インビボで、負の選択に感受性にさせるマーカーを含有することができる。このようなマーカーを含有させることにより、このような細胞が投与された個人、例えば養子細胞療法を用いて治療された患者、において、ベクターを保有する免疫エフェクター細胞を選択的に破壊することが可能になる。これは、例えば患者が治療に対して重度の副作用を経験した場合に重要となることがある。負の選択が可能な表現型は、投与された薬剤に対する感受性を付与する遺伝子の挿入に起因し得る。負の選択が可能な遺伝子は、当技術分野で公知であり、とりわけ、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｉ ＴＫ）遺伝子（非特許文献１６）、及び５－フルオロシトシン感受性を付与する細菌シトシンデアミナーゼ（非特許文献１７）を包含する。

【0121】

ベクターはウイルスベクターであってもよい。ウイルスベクターは、レンチウイルス又はスパマウイルス／泡沫状ウイルスのようなレトロウイルスに由来することができる。本明細書において、用語「ウイルスベクター」は、本明細書で提供される核酸分子又は構築物を保有し、この核酸分子／構築物を標的細胞に送達することができるウイルス由来の粒子をいう。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに又は天然ウイルス遺伝子に加えて、本明細書で提供される核酸分子を含有することができる。ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は他の核酸を、インビトロ又はエクスビボのいずれかで、細胞に移入する目的で利用することができる。

【0122】

多数の形態のウイルスベクターが当技術分野で公知であり、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡウイルスベクター並びにＤＮＡウイルスベクターの両方を含む、任意の適切なウイルスベクターが、本教示に従って使用され得る。一本鎖ウイルスベクターは、ポジティブ検知（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｎｓｅ）又はネガティブ検知（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｅｎｓｅ）ウイルスベクターであり得る。或る実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター（即ち、レンチウイルスに由来するウイルスベクター）などのレトロウイルスベクター（即ち、レトロウイルスに由来するウイルスベクター）である。レトロウイルスゲノムは感染細胞のゲノムに組み込まれるので、本明細書に記載したレトロウイルスベクターを用いて、標的細胞を安定的に形質導入する、即ち、標的細胞の遺伝子構成を永久的に変化させる、ことができる。

【0123】

ウイルスベクターは、自己不活化ベクター又は複製欠損ベクターであってもよい。複製欠損レトロウイルスベクターは、例えば、ウイルスゲノムの（Ｕ３領域として知られている）３’ＬＴＲエンハンサー－プロモーター領域を改変（例えば、欠失又は置換）して、ウイルス複製の第１ラウンドを超えるウイルス転写を防止することによって得ることができる。その結果、ベクターは、宿主ゲノムに感染した後、一度だけ組み込まれることができ、更に通過することができない。

【0124】

本明細書で使用するためのレトロウイルスベクターは、例えば、任意の公知のレトロウイルス、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウイルス（Ｍ－ＭＳＶ）、Ｈａｒｖｅｙマウス肉腫ウイルス（Ｈａ－ＭｕＳＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ｇｉｂｂｏｎ ａｐｅ白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ、Ｆｒｉｅｎｄウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）及びＲｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などのＣ型レトロウイルス；ＨＴＬＶ－１及びＨＴＬＶ－２などのヒトＴ細胞白血病ウイルス；ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、馬免疫不全ウイルス（ＥＩＶ）及び他のクラスのレトロウイルスなどのレンチウイルスファミリーに由来し得る。

【0125】

レトロウイルスパッケージング細胞株（典型的には、哺乳動物細胞株）は、ウイルスベクターを産生するために使用することができ、次いで、これは、Ｔ細胞の形質導入のために使用することができる。パッケージング細胞株は、ウイルス粒子組立体に必要な遺伝子を保有する１つ以上のベクター（例えば、プラスミド）でのトランスフェクションによってウイルスベクターを産生するために使用することができる。例示的なウイルスベクターは、例えば特許文献５に記載されている。レトロウイルスベクターの産生のための例示的なプラスミドは、非特許文献１８に記載されているｐＭＰ７１である。

【0126】

別の実施形態では、ベクターはｍＲＮＡベクターである。ｍＲＮＡベクターは、上記の核酸分子又は構築物を含有するポジティブ検知ｍＲＮＡ鎖である。ｍＲＮＡベクターは翻訳可能なｍＲＮＡ鎖であり、標的細胞に送出されると、リボソームに結合し、コードされたタンパク質の合成を開始することができる。ｍＲＮＡベクターは、そのコードされたタンパク質の生産を開始するために核への侵入や転写を必要とせず、代わりに細胞質リボソームに直接結合して翻訳を開始することができるので、有利である。従って、ｍＲＮＡベクターによる標的細胞のトランスフェクションは、コードされた特異的結合分子の迅速な産生のために使用することができる。ＲＮＡは、その固有の不安定性のために限定された半減期しか有しておらず、従って、ｍＲＮＡベクターは、標的細胞の一過性トランスフェクションのために使用することができる。

【0127】

ｍＲＮＡベクターは、翻訳のための必須要素、例えば、リボソーム認識のための５’ ７－メチルグアニル酸頭部及びポリアデニル酸尾部を含有する。ｍＲＮＡベクターは、当該分野で公知の方法に従って、細胞系又は無細胞系を用いてｍＲＮＡ発現ベクターから産生することができる。適切なｍＲＮＡ発現ベクターには、ｐＣｌｐＡ１０２（非特許文献１９）及びｐＣＩｐＡ１２０－Ｇ(非特許文献１８）が含まれる。無細胞系は、転写される遺伝子及び適切なプロモーターを含有するＤＮＡ鋳型を必要とし、ＲＮＡポリメラーゼ、一般的にはファージＲＮＡポリメラーゼ、を利用する。インビトロ転写の実施のためのキット（例えば、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＰ６ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ）は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から得ることができる。

【0128】

本明細書では、本明細書で提供される結合タンパク質の第１の鎖をコードする第１の核酸分子と本明細書で提供される第２の鎖をコードする第２の核酸分子とを含有するキットも、また、提供される。従って、キットは、上述のように、一方が第１の鎖をコードし他方が第２の鎖をコードする一対の核酸分子を含有する。

【0129】

第１及び第２の核酸分子は、上述のようなものであり、例えば、それらは、ＤＮＡ又はＲＮＡ、二本鎖又は一本鎖、線状又は環状などであり得る。第１の組換え核酸分子及び第２の核酸分子は、第１の組換え構築物及び第２の組換え構築物（第１の核酸分子を含有する第１の組換え構築物及び第２の核酸分子を含有する第２の組換え構築物）に関連してキットで、又は第１のベクター及び第２のベクター内に提供され得る。組換え構築物及びベクターは、上述した。キットの第１及び第２の核酸分子は、別個の分子として提供される。即ち、それらは両方ともが同じ構築物又はベクター内には位置しない。

【0130】

上記のように、ベクターは、ベクターを取り込んだ細胞が積極的に選択され得るように、選択マーカーを含有し得る。１つの実施形態において、第１及び第２の核酸分子が第１及び第２のベクター内に提供される場合、第１のベクター及び第２のベクターは、それぞれ、選択マーカーを含有する。第１及び第２のベクターのマーカーは、一般的に異なっており、その結果、両方のベクターを取り込んだ細胞は、２つのベクターのうちの一方のみを取り込んだ（又はいずれのベクターも取り込まなかった）細胞よりも多く選択され得る。適切な選択マーカーは、上記で議論している。

【0131】

キットの２つの核酸分子（例えば、第１及び第２の組換え構築物又は第１及び第２のベクター）は、単一の容器で（即ち、２つの核酸分子の混合物で）又は別個の容器で提供することができる。核酸分子は、水溶液（例えば、水又はＴＥ緩衝液などの適切な緩衝液）で提供されてもよく、又は凍結乾燥形態で提供されてもよい。

【0132】

キット中の核酸分子によってコードされる第１の鎖及び第２の鎖は、両方とも、Ｔ１又はＴ３ ＴＣＲのいずれかに由来する（即ち、キットは、Ｔ１ ＴＣＲに由来する鎖をコードする１つの核酸分子及びＴ３ ＴＣＲに由来する鎖をコードする１つの核酸分子を含まない）。

【0133】

従って、第１の実施形態では、キットは、Ｔ３ ＴＣＲベースの結合タンパク質の第１及び第２の鎖をコードする核酸分子を含有し、このキットは、下記を含有する。
（ｉ）それぞれ、配列番号１６、１７及び１８に示すアミノ酸配列を含有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有する可変ドメインを含有する第１の鎖をコードする第１の核酸分子であって、特に、可変ドメインが、配列番号２２に示すアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する第１の核酸分子；及び
（ｉｉ）それぞれ、配列番号１９、２０及び２１に示すアミノ酸配列を含有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有する可変ドメインを含有する第２の鎖をコードする第２の核酸分子であって、特に、可変ドメインが、配列番号２３に示すアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する第２の核酸分子。

【0134】

従って、第１の鎖は、上述のように、任意の、Ｔ３ ＴＣＲベースの全長又は切断α鎖であってよく、第２の鎖は、上述のように、任意の、Ｔ３ ＴＣＲベースの全長又は切断β鎖であってよい。

【0135】

従って、第２の実施形態では、キットは、Ｔ１ ＴＣＲベースの結合タンパク質の第１及び第２の鎖をコードする核酸分子を含有し、このキットは、下記を含有する。
（ｉ）それぞれ、配列番号２、３及び４に示すアミノ酸配列を含有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有する可変ドメインを含有する第１の鎖をコードする第１の核酸分子であって、特に、可変ドメインが、配列番号８に示すアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する第１の核酸分子；及び
（ｉｉ）それぞれ、配列番号５、６及び７に示すアミノ酸配列を含有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含有する可変ドメインを含有する第２の鎖をコードする第２の核酸分子であって、特に、可変ドメインが、配列番号９に示すアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも９０％又は９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含有する第２の核酸分子。

【0136】

従って、第１の鎖は、上述のように、任意の、Ｔ１ ＴＣＲベースの全長又は切断α鎖であってよく、第２の鎖は、上述のように、任意の、Ｔ１ ＴＣＲベースの全長又は切断β鎖であってよい。

【0137】

配列同一性は、任意の好都合な方法によって評価することができる。しかしながら、配列間の配列同一性の程度を決定するためには、配列のペアごとの又は多重のアラインメントを作成するコンピュータープログラムが便利である。例えば、ペアごとの配列アラインメントには、ＥＭＢＯＳＳニードル又はＥＭＢＯＳＳストレッチャー（いずれも、非特許文献２０）を使用することができ、一方、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（非特許文献２１）又はＭＵＳＣＬＥ（非特許文献２２）を多重配列アラインメントに使用することができるが、任意の他の適切なプログラムを使用することもできる。別の適切なアラインメントプログラムは、タンパク質アラインメントのためのｂｌａｓｔｐアルゴリズム及び核酸アラインメントのためのｂｌａｓｔｎアルゴリズムを使用するＢＬＡＳＴである。アラインメントは、ペアごとであるか多重であるかにかかわらず、局所的ではなく全体的に（即ち、参照配列の全体に亘って）行なわれなければならない。

【0138】

配列アラインメント及び％同一性計算は、例えば、標準的なＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａパラメーター：マトリックスＧｏｎｎｅｔ、ギャップ開放ペナルティ６、ギャップ延長ペナルティ１を使用して決定することができる。代わりに、標準のＥＭＢＯＳＳニードルパラメータ：マトリクスＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５を使用することもできる。これらに代えて、任意の他の適切なパラメーターを使用することができる。

【0139】

配列が本明細書に引用される参照配列に対して１００％未満の同一性を有する場合、配列は、参照配列（又はその任意の組合せ）と比較して、アミノ酸の置換、欠失又は付加によって変更することができる。

【0140】

本明細書で提供される核酸分子、構築物及びベクターは、周知の方法によって、細胞、例えば免疫エフェクター細胞、に導入することができる。本明細書で提供されるキットの第１及び第２の核酸分子は、同様に、宿主細胞に同時導入することができる。核酸分子、構築物及びベクターは、トランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション若しくはバイオリスティック、又は当技術分野で公知の任意の他の方法）又はウイルスベクターを使用する形質導入によって、標的真核生物（例えば、ヒト）細胞に導入することができる。核酸分子、構築物及びベクターは、当技術分野で公知の任意の方法、例えば形質転換、形質導入又はコンジュゲーション、によって、標的原核（例えば、細菌）細胞に導入することができる。

【0141】

従って、本明細書で提供される組換え核酸分子若しくはベクター又は本明細書で提供されるキットに含まれる核酸分子の対を含有する細胞が、更に、本明細書で提供される。

【0142】

細胞は、特に、本明細書で提供される組換え核酸分子若しくはベクター、又は膜貫通ドメインを含有する上述の結合タンパク質をコードするキット由来の核酸分子の対を含有する、エフェクター細胞、より具体的には、免疫エフェクター細胞又はそのための前駆体若しくは前駆細胞であり得る。組換え核酸分子、ベクター又は核酸分子の対は、ＴＣＲをコードし得る。或いは、ＴＣＲ－ＣＡＲ又はキメラＴＣＲがコードされ得る。細胞、例えばエフェクター細胞、又は免疫エフェクター細胞がその細胞膜においてそのような結合タンパク質を発現する場合、それらはＴｄＴ発現細胞を認識し、標的とすることができる。従って、このような組換え核酸分子、ベクター又は核酸分子の対を含有する細胞は、その細胞膜においてコードされた特異的結合タンパク質を発現する。即ち、コードされた特異的結合タンパク質は、細胞膜において発現及び局在化され、機能的である。特定の実施形態において、細胞、例えばエフェクター、又は免疫エフェクター細胞は、その細胞膜において機能的ＴＣＲを発現する。

【0143】

本明細書で言及する「免疫エフェクター細胞」とは、活性化されるとエフェクター機能（例えば、細胞毒性による標的細胞殺傷、サイトカイン放出など）を発揮することができ、機能的ＴＣＲを発現することができる任意の免疫細胞を意味する。より一般的には、「エフェクター細胞」は、エフェクター機能を実行することができる任意の細胞である。これは、細胞によって発揮される任意の有用な効果、又は細胞の任意の有用な特性であり得る。エフェクター細胞は、幹細胞を含有する。エフェクター細胞（この用語は、特に免疫エフェクター細胞を含有する）は、治療的使用、例えば養子細胞移入療法における使用、に適した細胞と見なすことができるか又はそれを包含し得る。従って、エフェクター細胞は、代替的に、治療用細胞又は治療のための細胞と称することができる。

【0144】

「免疫エフェクター細胞」という用語は、特に、成熟した又は完全に分化した免疫エフェクター細胞を包含し得るが、上述のように、本明細書の開示の範囲内にも含まれ、本明細書における使用は、幹細胞（例えば、造血幹細胞、ＨＳＣ）又はＨＳＣ若しくは他の幹細胞に由来する細胞、並びに、より拘束性の前駆体を包含する、前駆体（又は前駆体）細胞である。従って、免疫エフェクター細胞の前駆体は、造血組織、例えば骨髄、臍帯血又は血液、例えば動員された（ｍｏｂｉｌｉｓｅｄ）末梢血に由来する細胞のＣＤ３４⁺集団内に含まれるＨＳＣから得られるか又は誘導される細胞であってよく、これらの細胞は、被験者への投与時に成熟免疫エフェクター細胞に分化するか又はインビボ若しくはインビトロで免疫エフェクター細胞に分化するように誘導することができる。幹細胞は、また、誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよく、従って免疫エフェクター細胞の前駆体であってもよく、ｉＰＳＣ又はｉＰＳＣ細胞から得られた若しくは誘導された細胞であってもよい。

【0145】

特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、任意のタイプのＴ細胞であり得る。例えば、それは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８⁺Ｔ細胞）、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４⁺Ｔ細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、ナイーブＴ細胞、記憶Ｔ細胞又は任意の他のタイプのＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞であり得る。別の特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞はナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）である。

【0146】

従って、免疫エフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＴヘルパー細胞から選択することができる。１つの実施形態において、免疫エフェクター細胞はＮＫ細胞であり、発現される結合タンパク質はＴＣＲである。この場合、１つ以上のＣＤ３鎖の更なる発現が、特許文献６及び特許文献７に開示されるように必要となり得る。

【0147】

本明細書に記載されるような組換え核酸分子、ベクター又は核酸分子の対を含有するＴ細胞又はＮＫ細胞は、上記のように、標的Ｔ細胞又はＮＫ細胞をトランスフェクト（ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）又は形質導入することによって得ることができる。トランスフェクトされるべきＴ細胞又はＮＫ細胞は、既存の細胞系に由来してもよく又は対象の被験者（治療される患者又はドナーであり得る）から単離される原発性のＴ細胞又はＮＫ細胞であってもよい。Ｔ細胞又はＮＫ細胞は、また、結合分子を発現するように改変される前及び／又は後に、インビトロで増殖するように活性化され、また、刺激され得る（増殖するためのこのような活性化及び刺激は、増殖と呼ばれ得る）。ＮＫ細胞は、特許文献８に記載された方法を用いて増殖され活性化され得る。

【0148】

Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織及び腫瘍を始めとする多くの供給源から得ることができる。Ｔ細胞は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して単離することができる。Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから得ることができ、これは、全血の密度勾配遠心分離によって得られるバフィーコートから単離することができる。ＣＤ４⁺又はＣＤ８⁺Ｔ細胞などのＴ細胞の特異的サブ集団は、正又は負の選択手法によって更に単離することができる。例えば、ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択された細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組合せで達成することができる。このようなネガティブ選択は、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって、行なうことができる。

【0149】

ＮＫ細胞は、同様に、Ｔ細胞と同じ供給源から、上述のような当技術分野で公知の標準的方法を使用して得ることができる。例えば、細胞株由来のＮＫ細胞、例えばＮＫ－９２細胞、を使用することができる。一次ＮＫ細胞は、例えば、非特許文献２３又は非特許文献２４に記載されているように、血液、例えばＰＢＭＣ又は非胆汁性臍帯血（ＵＣＢ）、から単離することができる。

【0150】

細胞、例えば、本明細書で使用されるエフェクター細胞又は免疫エフェクター細胞は、ヒトであり得る。エフェクター細胞、例えばＴＣＲ（又は本明細書で提供される他の膜結合結合タンパク質）を発現する免疫エフェクター細胞、は、自己由来又は同種異系であり得る。即ち、細胞、例えばエフェクター細胞又は免疫エフェクター細胞、が治療用である場合、それは、自己由来細胞であり、即ち、治療される患者に由来し、これは、組織適合性及び非免疫原性を保証し、一旦遺伝的に改変されれば、それは患者からの免疫応答を誘導しないことを意味する。或いは、細胞は、治療的使用のための非自己由来細胞（即ち、それは、患者以外の個体から得られたドナー細胞である）であることができ、この場合、それは同種異系であり得る。

【0151】

治療用の非自己由来細胞は、被験者に投与されたとき、治療における細胞の使用に影響し、干渉し又は妨害する免疫応答を生じないような、非免疫原性であり得る。非自己由来細胞（例えば免疫エフェクター細胞又はその前駆体など）は、それらが患者にＨＬＡ適合性である場合、勿論、非免疫原性であり得る。非自己由来細胞は、ＭＨＣ分子の発現を減少し又は排除するための改変により、例えば、ＭＨＣタンパク質をコードする遺伝子の発現をノックアウトし又はノックダウンすることにより、非免疫原性にすることができる。細胞は、ＨＬＡ陰性ヒト細胞であってもよい。一実施形態では、クラスＩ ＭＨＣ発現の破壊は、β₂－ミクログロブリン（β₂－ｍ）をコードする遺伝子をノックアウトすることによって行なうことができる。

【0152】

細胞（例えばエフェクター細胞、又はより具体的には免疫エフェクター細胞）は、代替的には、被験者に投与される前に照射され得る。理論に拘束されることを望まないが、細胞の照射は、細胞を一時的にのみ被験者中に存在させ、従って被験者の免疫系が細胞に対する免疫学的応答を開始するために利用可能な時間を減少させると考えられる。このような細胞は、その細胞表面に機能的なＭＨＣ分子を発現する可能性があるが、非免疫原性であるとも考えられる。放射線は、α、β又はγ放射線の任意の供給源からのものであってもよく、又は、Ｘ線放射線又は紫外線であってもよい。増殖を抑制するには、５～１０Ｇｙの放射線量で十分であろう。或いは、細胞を改変して「自殺遺伝子」を発現させてもよく、これにより、細胞が誘導的に殺傷されるか又は外部刺激に応答して複製することを妨げることが可能になる。

【0153】

本明細書で提供される細胞は、或いは、産生宿主細胞であり得、組換え核酸分子、ベクター又は核酸分子の対は、上述のような可溶性結合タンパク質（例えば可溶性ＴＣＲ）をコードする。生産宿主細胞は、タンパク質生産における使用に適した任意の細胞である。適切な産生宿主は、当該分野で公知である。産生宿主は、原核生物、例えばＲｏｓｅｔｔａ株のような真核生物タンパク質産生のために最適化された大腸菌株、であってもよい。産生宿主は、真核細胞、例えば、酵母細胞、例えばＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、のような真菌細胞、であってもよい。産生宿主は、ヒト細胞又は非ヒト細胞などの哺乳動物細胞であってもよい。非ヒト哺乳動物細胞が使用される場合、細胞は、ヒトタンパク質発現のために最適化することができる。適切な哺乳動物細胞は、Ｃｏｓ細胞、例えばＣｏｓ－７細胞、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞、を包含するが、任意の適切な細胞株又はタイプを使用することができる。ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞は、タンパク質産生のために当技術分野で一般的に使用されるが、本開示に従って使用することができる。特異的結合分子をコードする遺伝子は、選択された宿主における発現のためにコドン最適化することができる。

【0154】

本明細書で提供される細胞は、本明細書で提供される組換え核酸又はベクターの合成中に使用されるクローニング宿主か又はキットによって提供される核酸分子の対の１つであり得る。原核細胞は、上述の核酸分子、構築物又はベクターのためのクローニング宿主として使用することができる。クローニング宿主として使用するのに適した原核細胞には、グラム陰性又はグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、大腸菌などのエシェリチア属などの腸内細菌科及び枯草菌などの桿菌、が含まれる。クローニング宿主は、代替的に、真菌細胞、例えばＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、又は酵母細胞、又は哺乳動物細胞のような高等真核細胞であってもよい。

【0155】

本開示の別の局面は、ＴｄＴ特異的細胞、又はより特定のエフェクター細胞、又は免疫エフェクター細胞（即ち、本明細書で提供される免疫エフェクター細胞）若しくはその前駆体を生成する方法を提供し、この方法は、本明細書で提供される組換え核酸分子、本明細書で提供されるベクター又は本明細書で提供されるキットに含まれる組換え核酸分子の対を細胞（例えば、免疫エフェクター細胞又はその前駆体）に導入することを含む。免疫エフェクター細胞は、上述のような任意の免疫エフェクター細胞、特にＴ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞又はＴヘルパー細胞など）又はＮＫ細胞であり、前駆体は、任意の幹細胞、例えばｉＰＳＣ又はそれに由来する細胞、を包含し得る。核酸分子又はベクターは、上にも記載したように、当技術分野で公知の任意の方法、例えばトランスフェクション又は形質導入、によって細胞に導入することができる。細胞は、上述のように、更に改変することができる（例えば、それを非免疫原性にするために又は対象の更なるタンパク質を発現するために、例えば、上述のように、ＮＫ細胞は、機能的ＴＣＲ－ＣＤ３複合体を発現させるために、ＴＣＲ及びＣＤ３鎖の両方を発現するように改変することができる）。エフェクター細胞は、また、上記のように拡大することができる。細胞の改変及び拡大は、任意の順序で実施することができる。

【0156】

更に本明細書では、本明細書で提供される細胞、特にエフェクター細胞、より具体的には、そのための免疫エフェクター細胞又は前駆体、を含有する医薬組成物が提供される。また、本明細書で提供される可溶性結合タンパク質（例えば、ＴＣＲ－ｓｃＦｖ又は可溶性ＴＣＲ）を含有する医薬組成物が提供される。本明細書で提供される細胞を含有する医薬組成物は、以下に更に記載されるように、癌処置において使用することができる。同様に、本明細書で提供される可溶性結合タンパク質を含有する医薬組成物は、上述し、また、以下に更に論じるように、癌の処置又は診断において使用することができる。

【0157】

本明細書で提供される医薬組成物は、活性医薬（即ち、細胞又は可溶性結合タンパク質）及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤を含有する。組成物は、医薬分野で公知の技術及び手順に従って、任意の好都合な様式で製剤化することができる。本明細書で使用される「薬学的に許容可能な」という用語は、組成物の他の成分と適合性があり、且つ、レシピエントに生理学的に許容可能な成分を指す。組成物及び担体又は賦形剤材料の特性、投薬量などは、選択及び所望の投与経路、治療の目的などに従って、日常的な様式で選択することができる。

【0158】

医薬組成物は、被験者への投与のために、任意の適切な手段によって調製することができる。このような投与は、例えば、経口、経鼻又は非経口であり得る。本明細書で使用される経口投与は、頬側及び舌下投与を包含する。本明細書で定義される非経口投与は、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内及び皮内投与を包含する。

【0159】

本明細書で提供される医薬組成物は、液体溶液又はシロップ、粉末、顆粒、錠剤又はカプセルのような固体組成物、クリーム、軟膏及び他技術分野で一般的に使用される任意の他のスタイルの組成物を含有する。このような組成物で使用するための薬学的に許容可能な希釈剤、担体及び賦形剤は、当技術分野で周知である。

【0160】

例えば、適切な賦形剤には、ラクトース、トウモロコシデンプン又はその誘導体、ステアリン酸又はその塩、植物油、ワックス、脂肪及びポリオールが含まれる。適切な担体又は希釈剤としては、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、デキストロース、トレハロース、リポソーム、ポリビニルアルコール、医薬品グレードのデンプン、マンニトール、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース（及び他の糖）、炭酸マグネシウム、ゼラチン、油、アルコール、界面活性剤、及びポリソルベートなどの乳化剤が挙げられる。安定化剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料なども使用することができる。

【0161】

液体医薬組成物は、溶液、懸濁液又は他の同様の形態であっても、以下のものの１つ以上を含有し得る：注射用水、生理食塩水（生理学的であってよい）、リンゲル溶液、等張性塩化ナトリウム、溶媒又は懸濁媒体として働き得る合成モノ又はジグリセリドなどの不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；ＥＤＴＡなどのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝液、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性調節剤。非経口製剤は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器又は多数回投与バイアルに封入することができる。注射可能な医薬組成物は、無菌であり得る。

【0162】

本明細書では、治療に使用するための本明細書で提供されるような細胞、特にエフェクター細胞、より具体的にはそのための免疫エフェクター細胞又は前駆体、が提供される。同様に、本明細書では、治療に使用するためのこのような細胞（上記）を含有する医薬組成物が提供される。また、本明細書では、治療に使用するための又は診断に使用するための、本明細書で提供される可溶性結合タンパク質（例えば、ＴＣＲ-ｓｃＦｖ又は可溶性ＴＣＲ）も提供される。同様に、本明細書では、治療に使用するための又は診断に使用するための、そのような可溶性結合タンパク質を含有する医薬組成物が提供される。本明細書で提供される可溶性結合タンパク質の関連において、（上記に詳述した）治療薬に連結又は接合された可溶性結合タンパク質は、治療において使用することができ、診断薬（上記に詳述した）に連結又は接合された可溶性結合タンパク質は、診断において使用することができる。

【0163】

本明細書で使用される「治療」とは、任意の医学的状態の治療を意味する。そのような治療は、予防的（即ち、防止的）、治癒的（又は治癒することを意図した治療）、又は緩和的（即ち、状態の症状を、単に制限し、軽減し又は改善するために設計された治療）であり得る。

【0164】

細胞又は細胞を含有する組成物を使用する治療は、養子移入療法（或いは養子移入として知られている）である。養子移送療法は、公知の技術を用いて行なうことができる。細胞は、最初にそれらをそれらの培養培地から回収し、次いで、細胞を処置有効量での投与に適した培地及び容器システム（薬学的に受容可能なキャリア）中で洗浄し、濃縮することによって、治療のために処方され得る。適切な注入媒体は、任意の等張性媒体製剤、典型的には通常の生理食塩水、例えば、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ社）又はＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ社）であり得るが、水又は乳酸リンゲル液中の５％デキストロースも利用することができる。注入媒体は、ヒト血清アルブミンを補充することができる。

【0165】

上述のように膜結合特異的結合分子（例えば、ＴＣＲ）を発現する、本明細書で治療的使用のために提供される細胞は、単独で、或いは、希釈剤と、及び／又は、ＩＬ－２若しくは他のサイトカイン又は細胞集団などの他の構成要素と組み合わせた医薬組成物としての、いずれかで、投与することができる。このような医薬組成物は上述されている。

【0166】

本明細書で提供される治療的使用のための細胞及びそのような細胞を含有する医薬組成物は、任意の適切な経路によって患者に投与することができる。特に、細胞は、静脈内投与又は腫瘍内注射によって投与することができる。

【0167】

本明細書に記載されるような治療は、本明細書中の細胞の薬学的に有効な用量の投与を含み得る。薬学的に効果的な投与量は、例えば、結合タンパク質（例えば、ＴＣＲ）を発現する１×１０⁵～１×１０¹⁰細胞の範囲又はそれ以上であり得る。薬学的に効果的な投与量は、例えば、ＴＣＲを発現する１×１０⁷～５×１０⁹のＴ細胞であり得る。本明細書で提供される使用のために、細胞は、一般に、１リットル以下、５００ｍＬ以下、更には２５０ｍＬ又は１００ｍＬ以下の体積である。従って、所望の細胞の密度は、典型的には、１０⁶細胞／ｍＬを超え、一般的には、１０⁷細胞／ｍＬを超え、一般的には、１０⁸細胞／ｍＬ以上である。臨床的に関連する数は、累積して、１０⁵、１０⁶、１０⁷、１０⁸、１０⁹、１０¹⁰、１０¹¹又は１０¹²細胞以上となる複数の注加物に分配することができる。例えば、２、３、４、５、６以上の別個の注加物を、２４若しくは４８時間の間隔で、又は３、４、５、６又は７日毎に、患者に投与することができる。注入は、また、週１回、２週間若しくは月１回の間隔、又は６週間若しくはそれ以上の間隔で行なってもよい。細胞組成物は、上記の範囲内の用量で複数回投与することができる。所望であれば、治療は、また、免疫応答の誘導を増強するために、マイトジェン（例えば、ＰＨＡ）又はリンホカイン、サイトカイン及び／又はケモカイン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１８、及びＴＮＦ－β、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、Ｆｌｔ３－Ｌ、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＧＲＴαなど）の投与を含むこともできる。

【0168】

本明細書で提供される可溶性結合タンパク質を使用する治療において、用量などは、選択及び所望の投与経路、処置の目的などに従って、日常的に選択することができる。用量も同様に、患者の性質、例えば、年齢、大きさ及び容態、並びに、患者の疾患の種類及び重症度に依存し得る。適切な用量は、臨床試験によって決定することができる。本明細書で提供される可溶性結合タンパク質は、代替的に、インビボ診断方法において使用され、この場合、可溶性結合タンパク質は、上述のように、診断薬に連結又は結合される。適切なインビボ診断方法は、熟練した医師に知られており、患者のスキャンにおけるトレーサー又はそのようなもの、例えば放射性標識、に結合された可溶性結合タンパク質の利用が含まれる。

【0169】

可溶性結合タンパク質は、当技術分野で一般的な任意の経路によって、例えば上述のような経口、経鼻又は非経口経路によって、投与することができる。

【0170】

本開示は、Ｔ細胞起源の癌の処置において使用するための、ＴｄＴペプチドを提示するＨＬＡ複合体（又は前述の細胞を含有する医薬組成物）に特異的に結合するＴＣＲを発現する細胞、より具体的には、エフェクター細胞又は免疫エフェクター細胞又はそのための前駆体を広く提供する。同様に、本開示は、ＴｄＴペプチドを提示するＨＬＡ複合体に特異的に結合するＴＣＲを発現する細胞の薬学的に有効な用量を含有する医薬組成物を投与することを含む、Ｔ細胞起源の癌を治療するための方法を提供する。

【0171】

本明細書では、更に、本明細書で提供される細胞、特にエフェクター細胞、より具体的には免疫エフェクター細胞又はその前駆体、本明細書で提供される可溶性結合タンパク質、又はＴｄＴを発現する癌の治療に使用するための本明細書で提供される医薬組成物が提供される。癌は、本明細書において、悪性、前悪性又は非悪性を問わず、任意の腫瘍性状態を包含するように、広範に定義される。しかし、一般的には悪性の状態である。固形腫瘍と非固形腫瘍の両方が含まれており、「癌細胞」という用語は「腫瘍細胞」と同義とみなすことができる。ＴｄＴを発現する癌は、構成癌細胞がＴｄＴを発現する癌である。癌がＴｄＴを発現するかどうかは、例えば生検試料の分析によって、同定することができる。固体又は液体の試料は、標準的な生検手順によって得られ、組織学、例えば抗ＴｄＴ抗体を使用する免疫組織化学、によって分析され、ＴｄＴ発現を同定する。ＴｄＴ発現を同定するために、他の免疫学的方法、例えば生検試料のウェスタンブロット、を使用してもよい。ＴｄＴ発現は、また、ｍＲＮＡ分析、例えばｑＰＣＲ又はＲＮＡ－Ｓｅｑ、によって同定することができる。本開示のこの局面は、ＨＬＡ－Ａ２遺伝子を保有する患者において癌を治療するために使用することができ、これは、癌細胞がＨＬＡ－Ａ２を発現する（即ち、癌がＨＬＡ－Ａ２陽性であるか、又はＨＬＡ－Ａ^*０２陽性であり、場合により、ＨＬＡ－Ａ^*０２：０１陽性である）ことを意味する。従って、開示に従って治療される癌は、ＨＬＡ－Ａ２陽性である。

【0172】

癌はあらゆる癌であってよいが、特に血液癌の場合もある。特定の実施形態において、血液癌は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）である。癌は、Ｂ細胞起源のＡＬＬ（Ｂ－ＡＬＬ）又はＴ細胞起源のＡＬＬ（Ｔ－ＡＬＬ）の場合がある。特定の実施形態において、癌はＴ－ＡＬＬである。別の実施形態において、血液癌は、非ホジキンリンパ腫、特にリンパ芽球性リンパ腫、である。

【0173】

同様に、ＴｄＴを発現するＨＬＡ－Ａ^*０２陽性癌を治療するための方法であって、本明細書で提供される細胞、特にエフェクター細胞、より具体的には免疫エフェクター細胞又はその前駆体、可溶性結合タンパク質又は医薬組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含む方法、が本明細書で提供される。このような被験者は、このような癌（即ち、ＴｄＴ及びＨＬＡ－Ａ^*０２を発現する癌）を患うヒト被験者である。癌は、特に、上記で詳述されたものであり得る。

【0174】

一般に、本発明者らは、また、ＴｄＴから得られ得るペプチド断片を提示するＨＬＡクラスＩ分子に特異的に結合した受容体を発現する細胞、特にエフェクター細胞及びより具体的には免疫エフェクター細胞又はその前駆体を含有する医薬組成物を投与するステップを含む、患者におけるＴｄＴ陽性癌を治療するための、方法を提供する。本発明者らは、また、ＴｄＴから得られ得るペプチド断片を提示するＨＬＡクラスＩ分子に特異的に結合した細胞傷害性タンパク質を含有する医薬組成物を投与するステップを含む、患者におけるＴｄＴ陽性癌を治療するための方法を提供する。ＴｄＴから得られ得る適切なペプチド断片は、８～１２アミノ酸残基を含有していてよく、好ましくは、ＴｄＴに特有のものであり得る。

【0175】

同様に、本明細書では、被験者におけるＴｄＴを発現するＨＬＡ－Ａ^*０２陽性癌の処置のための医薬の製造における、細胞、特にエフェクター細胞、より具体的にはそのための免疫エフェクター細胞若しくは前駆体、又は本明細書で提供される可溶性結合タンパク質の使用が提供される。癌は、特に、上述のような癌であり得る。

【0176】

更に、本明細書では、ＴｄＴを発現するＨＬＡ－Ａ^*０２陽性癌の診断に使用するための本明細書で提供される可溶性結合タンパク質が提供される。癌の診断における可溶性結合タンパク質の使用については、上記に詳述している。癌は、癌治療における本開示の使用に関して上記で詳述したように、任意の癌であり得る。同様に、本明細書において、ＨＬＡ－Ａ^*０２陽性でありＴｄＴを発現する癌を有することが疑われる被験者に、本明細書において提供される可溶性結合タンパク質を投与することを含む、癌を診断する方法が提供される。

【0177】

本開示は、以下の非限定的な実施例から及び図面を参照して、より完全に理解することができるであろう。

【実施例】

【0178】

［材料及び方法］
（原発性の患者細胞と細胞株）
小児及び若年成人の再発又は難治性（ｒ／ｒ）Ｂ－ＡＬＬ患者を登録し、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）Ｔ細胞試験 ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＮＣＴ０２４３５８４９及びＮＣＴ０３１２３９３９に従って治療し、小児Ｔ－ＡＬＬ患者は、ＮＯＰＨＯ－ＡＬＬ－２００８（ＮＣＴ００８１６０４９）に従った。

【0179】

オスロ大学病院の血液バンクから得た健康なドナーバフィーコートから密度勾配遠心分離（Ａｘｉｓ－Ｓｈｉｅｌｄ）によって末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ＰＢＭＣは、フローサイトメトリーによりＨＬＡ－Ａ２発現についてタイピングした。エプスタイン・バー・ウイルス形質転換リンパ芽球細胞株（ＥＢＶ－ＬＣＬ）は、非特許文献２５に記載されているようにＨＬＡ－Ａ２^posおよびＨＬＡ Ａ２^neg ＰＢＭＣから生成した。胸腺組織から血栓、結合組織、脂肪組織及び壊死組織を除去し、小片に切断し、これを広口径ピペットチップに取り付けた１ｍＬマイクロピペットでやさしく粉砕し、冷ＲＰＭＩ－１６４０培地に胸腺細胞を放出させた。胸腺細胞を培地中で２回洗浄し、次いで凍結保存した。

【0180】

Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）又はＧｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｖｏｒｉｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＤＳＭＺ）から以下の細胞株を得た：ＮＡＬＭ－６、ＢＶ１７３、ＲＥＨ、ＨＰＢ－ＡＬＬ、ＲＳ４；１１、Ｔ２、ＲＤ、Ｕ－２ ＯＳ、ＦＭ－６、ＨｅＬａ、ＨａＣａＴ、ＭＣＦ７、Ｋ５６２、ＣＯＬＯ ６８８、ＥＡ．ｈｙ９２６、ＥＳＴ１４９、Ｕ－８７ ＭＧ、Ｄａｏｙ、ＨＣＴ－１１６、ＣＨＰ－２１２及びＰｈｏｅｎｉｘ－ＡＭＰＨＯ。ほとんどの細胞株は、研究のためにＡＴＣＣ及びＤＳＭＺから購入され、既に認証され、継代に従って標識された凍結保存アリコートであった。低継代細胞株のみを用いて新鮮培養を開始した。これらの研究に先立って取得された細胞株の同一性は、米国ノースカロライナ州、ラボコープＤＮＡ同定検査室（Ｌａｂｃｏｒｐ ＤＮＡ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｌａｂ）（旧Ｇｅｎｅｔｉｃａ、ｈｔｔｐｓ：／／ｃｅｌｌｌｉｎｅａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｉｏｎ．ｃｏｍ／）が提供するサービスである、短縦列反復ＤＮＡプロファイリング（ｓｈｏｒｔ ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ ＤＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）によって確かめられた。細胞株を、供給者によって指示された培地中、３７℃で、５％ＣＯ₂を含有する加湿細胞インキュベーター中で培養し、マイコプラズマ汚染を定期的に検査した。

【0181】

（抗原特異的Ｔ細胞の誘導）
ＴｄＴペプチドに反応性のＴ細胞の誘導並びに細胞傷害性Ｔ細胞株及びクローンの生成を、非特許文献２６記載のように、但し、いくつかの改変を加えて行なった。簡潔に説明すると、４日目に、単球を、ＣＤ１４反応性マイクロビーズ及びＡｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて、ＨＬＡ－Ａ２^pos健常ドナーのＰＢＭＣから単離し、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ヒト血清（ＨＳ、Ｔｒｉｎａ ｂｉｏｔｅｃｈ社）並びに５０ＩＵ／ｍＬインターロイキン（ＩＬ）－４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）及び８００ＩＵ／ｍＬ ＧＭ－ＣＳＦ（Ｇｅｎｚｙｍｅ社）を含有する１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Ｐ／Ｓを補充したＣｅｌｌＧｒｏ ＧＭＰ ＤＣ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ社）中で、３日間、培養した。続いて、単球由来樹枝状細胞（ＭｏＤＣ）を、リポ多糖（ＬＰＳ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＩＦＮ－γ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）をそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬ及び１００ＩＵ／ｍＬの最終濃度となるように添加することによって、１４～１６時間成熟させた。１日目に、未処置のＣＤ８⁺Ｔ細胞を、ＨＬＡ－Ａ２^neg供与体からのＰＢＭＣから、ＡｕｔｏＭＡＣＳ Ｐｒｏ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ並びにＣＤ４５ＲＯ－及びＣＤ５７－反応性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｓ社）と混合したＣＤ８⁺Ｔ細胞単離キットの使用によって単離した。０日目に、ＭｏＤＣを回収し、全長ＴｄＴをコードするｍＲＮＡでエレクトロポレーションし、３０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）を補充したＤＣ－Ｔ細胞培地中でＤＣ：Ｔ細胞比１：４でナイーブＴ細胞と共培養した。並行対照共培養を、無関係なｍＲＮＡをトランスフェクトしたＭｏＤＣで開始した。

【0182】

（ｐＭＨＣ多量体＋ＣＤ８⁺Ｔ細胞の選別とクローニング）
ペプチド－１及びペプチド－３特異性ＣＤ８⁺Ｔ細胞の単一細胞クローニングを、非特許文献２６に記載されているように行なった。機能性を評価するために、Ｔ細胞クローンを、関連ペプチドでパルスしたＥＢＶ－ＬＣＬ及びＴｄＴを自然発現するＮＡＬＭ－６細胞株で刺激し、ＣＤ１３７の上方制御について評価した。

【0183】

（ＴＣＲの配列決定とクローニング）
ペプチド－１に対して反応性である３つのクローン及びペプチド－３に対して反応性である１つのクローンからのＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖とのペアを、ＴＣＲα及びβ転写物の標的化増幅のために改変され適合された、非特許文献２７及び非特許文献２８に記載されたプロトコルを用いて、増幅した。簡潔に述べると、ＲＮＡを抽出し、処理してＴＣＲ特異的ｃＤＮＡを得た。４対のＴＣＲα／β定常ドメイン特異的プライマーを用いて、各クローンについてＲＴ ＰＣＲを行ない、続いてポリＧテールと鋳型スイッチを付加して二本鎖ＤＮＡを得た。最後に、追加の定常ドメインプライマー及びポリ－Ｇドメインに導入されたアンカー配列にアニーリングするアダプタープライマーを用いて、ネステッドＰＣＲ増幅の２ラウンドを行なった。カッパ Ｉｌｌｕｍｉｎａキットを利用してライブラリーを調製し、後で、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑで配列を決定した。ＭｉＴＣＲスクリプトを用いて配列決定データを分析し、社内のＰｙｔｈｏｎスクリプトＴＣＲプライマーを用いて、非特許文献２７及び非特許文献２９に記載されたように、全長ＴＣＲ鎖を再構築した。ＩＭＧＴ／Ｖ－Ｑｕｅｓｔ（非特許文献３０）において、各サンプルについて出力を手動で検証した。同定されたＴＣＲの可変ＴＣＲα及びＴＣＲβフラグメントを、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔによってコドン最適化し、合成し、クローニングした。

【0184】

（ヒトＰＢＭＣ及び細胞株への遺伝子移入）
Ｔ１及びＴ３ ＴＣＲを、ＨＬＡ－Ａ２^posドナー由来及び患者由来ＰＢＭＣに形質導入した。１Ｇ４及びＤＭＦ５ ＴＣＲを、また、インビボ実験のための対照として、ＨＬＡ－Ａ２^posドナー由来ＰＢＭＣに形質導入した。ヒトＰＢＭＣの刺激のために、６ウェル又は１２ウェル組織培養処理プレートを、抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）及び抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）抗体で被覆した。ＩＬ－７及びＩＬ－１５（それぞれ５ｎｇ／ｍＬ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）を補充したＴ細胞培地中のＰＢＭＣ（２×１０⁶細胞／ｍＬ）を抗体被覆したプレートに添加し、５％ＣＯ₂で３７℃において７２時間インキュベートした。レトロウイルス上清の生成のために、４×１０⁶のフェニックス－ＡＭＰＨＯパッケージング細胞を１０ｃｍのペトリ皿に２４時間プレートし、細胞をγ－レトロウイルスベクターＤＮＡでトランスフェクトし、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ９ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ中で混合した。翌日、培地をリフレッシュし、細胞を３２℃、５％ＣＯ₂で２４時間インキュベートした。続いて、ＰＢＭＣを回収し、ＩＬ－７及びＩＬ－１５を補充したＴ細胞培地に再懸濁し、レトロウイルス上清と混合し、レトロネクチン（２０μｇ／ｍＬ、Ｔａｋａｒａ社）で予めコーティングした非組織培養処理６ウェルプレートに載置し、９００×ｇで６０分間スピノキュレートした。翌日、新鮮なレトロウイルス上清を用いて第２のスピノキュレーションを行ない、３～５日後に抗マウスＴＣＲβ鎖抗体及び／又はｐＭＨＣ多量体で染色し、続いてフローサイトメトリーを行なうことによって形質導入効率を決定した。機能性実験の前に、細胞を、低濃度のサイトカイン（０．５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７及びＩＬ－１５）を含有するＴ細胞培地中で４８～７２時間培養した。また、細胞を後の実験のために凍結した。

【0185】

全長ＨＬＡ－Ａ２及びＴｄＴをコードするウイルスＤＮＡを含有するレトロウイルス上清も上記のように産生され、ＲＥＨ、ＲＤ、ＨｅＬａ、Ｋ５６２、ＨａＣａＴ、ＣＯＬＯ６８８、ＥＡ．ｈｙ９２６及びＨＬＡ－Ａ２を有するＨＰＢ－ＡＬＬ細胞株、並びにＴｄＴを有するＥＢＶ－ＬＣＬを形質導入するために利用された。インビボ実験のために、ＢＶ１７３細胞株を安定的に形質導入してホタルルシフェラーゼ及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現させ、ＢＶ１７３ｆｆｌｕｃ－ｅＧＦＰと名付けた。その後、形質導入された全ての細胞株をＦＡＣＳソーティングによって精製し、拡大し、後の実験で使用するために凍結した。

【0186】

ＴｄＴ及びＨＬＡ－Ａ２のｃＤＮＡを、非特許文献３１に記載されたように、ｍＲＮＡ産生のためにｐＣｌｐＡ１０２ベクター中にクローン化した。

【0187】

（抗体とフローサイトメトリー）
フローサイトメトリーは、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で行ない、データは、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社）又はＦＡＣＳ ＤＩＶＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）ソフトウェアを用いて分析した。表面抗体染色のために、抗体を氷上で１５～２０分に亘って細胞に添加し、続いて洗浄工程を行なった。細胞内染色のために、細胞をＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）溶液に２０分間懸濁し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で洗浄し、次いで抗体で染色した。以下の蛍光結合抗ヒト抗体は、特に明記しない限り、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社又はＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社から取得した。抗ＣＤ１４（ＨＣＤ１４）、－ＨＬＡ－Ａ２（ＢＢ７．２）、－ＣＤ６２Ｌ（ＤＲＥＧ－５６）、ＣＤ５６（ＨＣＤ５６）、－ＣＤ５７（ＨＮＫ－１）、－ＣＤ４５ＲＯ（ＵＣＨＬ１）、－ＣＤ４５ＲＡ（ＨＩ１００）、－ＣＣＲ７（１５０５０３）、－ＣＤ１３７（４Ｂ４－１）、－ＣＤ４５（ＨＩ３０）、－ＴｄＴ（Ｅ１７－１５１９）、－ＣＤ１０（ＨＩ１０ａ）、－ＣＤ１９（ＨＩＢ１９、ＳＪ２５Ｃ１）、－ＣＤ３８（ＨＩＴ２）、－ＣＤ３４（５８１）、－ＣＤ１ａ（ＨＩ１４９）、－ＣＤ２（Ｓ５．２）、－ＣＤ３（ＵＣＨＴ１，ＯＫＴ３）、－ＣＤ８ａ（ＲＰＡ－Ｔ８）、－ＣＤ４（ＲＰＡ－Ｔ４）、－ＣＤ５（ＵＣＨＴ２、Ｌ１７Ｆ１２）、－ＣＤ７（Ｍ－Ｔ７０１）、抗マウスＣＤ４５（３０－Ｆ１１）、－ＣＤ９９（ＤＮ１６、Ｂｉｏ－Ｒａｄ社）及び－ＣＤ３（ＳＫ７）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）。抗マウスＴＣＲβ鎖ＰＥ（Ｈ５７－５９７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて、ヒト細胞におけるＴ１及びＴ３ ＴＣＲの形質導入効率を試験し、マウスにおけるインビボ処理に用いた形質導入Ｔ細胞をモニターした。全てのフローサイトメトリー実験において、死細胞を排除するために、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ－ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用した。

【0188】

（Ｔ細胞活性化分析）
Ｔ細胞クローン及びＴＣＲ形質導入Ｔ細胞の反応性を、ＣＤ１３７上方制御又はＩＦＮ－γ放出を測定することによって調査した。簡単に述べれば、１００，０００細胞／ウェルの示された標的細胞株又は原発性の患者腫瘍細胞を、Ｔ細胞クローン又はＴＣＲ形質導入ＰＢＭＣ（５０，０００細胞／ウェル）と、共インキュベートした。指示された場合、標的細胞は、特定の濃度のペプチドで１～２時間パルスされるか、又は全長ＴｄＴをコードするｍＲＮＡでエレクトロポレーションされ、洗浄され、次いでエフェクター細胞と共培養された。１４～１６時間の共インキュベーション後、プレートを４００×ｇで３分間遠心分離した。ＥＬＩＳＡによるＩＦＮ－γの測定のために培養上清を回収し、残りの細胞をフローサイトメトリーのために染色して、生存ＣＤ８⁺細胞上のＣＤ１３７の上方制御を測定した。結果は、ＴＣＲ形質導入ＣＤ８⁺Ｔ細胞中のＣＤ１３７⁺／ＣＤ８＋細胞の百分率（形質導入効率＞９０％）又はＣＤ１３７⁺事象の百分率として報告する。いくつかの実験では、細胞を、０．７５μＭの、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）又はカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＳＦＥ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）のいずれかの蛍光細胞染色色素で標識して、標的細胞とエフェクター細胞とを区別した。以下の試薬は、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社又はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から取得した：マウス抗ヒトＩＦＮ－γ捕捉抗体（ＮＩＢ４２）、ビオチンマウス抗ヒトＩＦＮ－γ検出抗体（４Ｓ．Ｂ３）、ストレプトアビジン－ＨＲＰ、基質溶液としての安定化テトラメチルベンジジン及び過酸化水素、停止溶液としての硫酸、及び、標準としての組換えヒトＩＦＮ－γタンパク質。アッセイは、製造業者の指示に従って行なった。

【0189】

（細胞株をターゲットとして使用したフローサイトメトリーに基づく細胞毒性アッセイ）
Ｂ－及びＴ－ＡＬＬ細胞株に対する細胞毒性アッセイのために、Ｔ細胞培地中の５０，０００個の標的細胞を、丸底９６ウェルプレート中で、Ｔ１又はＴ３ ＴＣＲ形質導入ＰＢＭＣと共に３連で４８時間共培養した。エフェクター細胞は、ＰＢＭＣ産物中のＴＣＲ形質導入ＣＤ８⁺Ｔ細胞（通常は、形質導入効率９０％超、ＣＤ８⁺Ｔ細胞５５～６５％、残りはＣＤ４⁺Ｔ細胞）と定義され、エフェクター対標的比は１：１であった。共培養後、細胞を回収し、洗浄し、ヒト抗－ＣＤ３、－ＣＤ８、－ＣＤ１９及び生／死固定近赤外線で染色して、死細胞を排除した。１５分後、細胞を洗浄し、１０，０００個のＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社）を含有する２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。データ取得時に、等しい数のビーズ事象（５０００）を各ウェルから記録した。データを正規化し、同じドナーからのモック形質導入Ｔ細胞と共培養した３つの並行ウェルから得た平均生腫瘍細胞数の百分率として報告した。

【0190】

（原発性のヒトＢ－ＡＬＬ及びＴ－ＡＬＬ試料を用いたＴ細胞活性化及び細胞毒性に関するフローサイトメトリーに基づく分析）
Ｂ－ＡＬＬ及びＴ－ＡＬＬ患者からの末梢血又は骨髄試料を解凍し、低濃度のＩＬ－７及びＩＬ－１５（０．５ｎｇ／ｍＬ）を含有するＴ細胞培地に再懸濁した。細胞を丸底９６ウェルプレートに移して、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞に対するＣＤ１３７アップレギュレーション又は標的細胞に対する細胞毒性を測定するアッセイを行った。悪性芽球及び正常白血球集団を同定するための個別化抗体パネル及びゲート設定戦略を、病院の記録で利用可能な診断的表現型分類を再検討した後に、設計した。ＴＣＲで形質導入された、同種異系Ｔ細胞又は患者１Ｎの場合は患者由来の自己由来Ｔ細胞を実験に使用した。ＴＣＲ形質導入細胞をＣＴＶ色素で前標識し、標的細胞から区別した。示されている場合はいつでも、標的細胞に関連ペプチドを１～２時間負荷し、洗浄し、次いで、上述のように、ＣＤ１３７上方制御の測定のためにＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と共インキュベートした。

【0191】

細胞毒性アッセイのために、ウェルあたり５０，０００個の標的細胞を同数のエフェクター細胞と、条件ごとに、２～４を並行して、４８～７２時間共インキュベートし、次いで、フローサイトメトリーのために個別化抗体パネルで染色した。ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓを取得標準化のために利用し、データを標準化し、上記のように報告した。フローサイトメトリープロットを視覚的に表示するために、本発明者らは、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ社）ソフトウェアを用いたＴ－分散確率的近傍埋め込み（ｔ－ＳＮＥ）のような教師なし（ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ）非線形次元縮小アルゴリズムを利用した。

【0192】

（２種類の異種移植Ｂ－ＡＬＬ細胞系モデルにおけるインビボＴｄＴ ＴＣＲ Ｔ細胞活性）
これらの実験では、８～１０週齢の雌雄のＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒｇｎｕｌｌ（ＮＳＧ）系の自家飼育したネズミを用いた。１１日目に、ＭｕｌｔｉＲａｄ２２５ Ｘ線照射器（ＲＰＳ ｓｅｒｖｉｃｅｓ社）を用いて、マウスに２．５Ｇｙ放射線を亜致死的に照射した。１０日目に、ＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼを発現するヒトＢ－ＡＬＬ細胞株ＢＶ１７３の４×１０⁶個の細胞を、尾静脈を通して注入した。白血病が確立され、１日目に生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって確認された後、マウスをＴＣＲ形質導入ＰＢＭＣで処理し、癌精巣抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１（１Ｇ４）（非特許文献３２）を標的とするＴ１、Ｔ３又は対照ＴＣＲのいずれかで形質導入した。別の対照マウス群には、Ｔ細胞注射を全く行なっていない。マウスに毎日２５００ＩＵのＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を腹腔内注射により注射し、ＢＬＩ画像（ＩＶＩＳシステム、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）及び血液分析を異なる間隔でフローサイトメトリーにより行なった。生存分析のために、腫瘍の広がりの臨床徴候についてマウスを観察し、２０％以上の体重減少、円背姿勢、波状毛皮又は四肢麻痺を発症した場合には屠殺した。移植片対宿主病のリスクを避けるため、Ｔ細胞注射の２カ月後に実験を終了し、処置群の生存マウスを人道的に屠殺した。１つの実験群では、生存しているＴ３処置マウスの骨髄を屠殺時に採取し、フローサイトメトリー用に処理してＴ細胞及び腫瘍細胞の存在並びにＴｄＴ及びＨＬＡ－Ａ２の発現を分析した。

【0193】

（患者由来異種移植モデルにおけるインビボＴｄＴ ＴＣＲ Ｔ細胞活性）
原発性ヒトＢ－ＡＬＬ異種移植マウスを確立するために、ＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^scid Ｉｌ２ｒｇ^tm1Wjl／ＳｚＪ（ＮＳＧ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔｏｃｋ ００５５５７）マウス９～１５週齢を、４時間間隔で１．６５Ｇｙ（Ｘ線源）を２回照射することによって亜致死的に照射した。ＨＬＡ－Ａ２^pos Ｂ－ＡＬＬ患者２０Ｏからの生存骨髄細胞を、７ＡＡＤ排除によって同定し、Ｔ細胞枯渇骨髄細胞を、ＣＤ³⁺細胞の排除によって、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ（商標） Ｆｕｓｉｏｎ上で収率仕分けした。４×１０⁵個の生存ＣＤ３陰性骨髄細胞を、最終照射線量の４～６時間後にＮＳＧマウスの尾静脈を介して注射した。移植後１８～１９日及び２０～２６日に、それぞれ、全移植マウスからのＰＢ分析及び骨髄吸引の両方により安定した生着が確認された。

【0194】

ＮＳＧマウスは、その生着レベルに基づいて、未処置、ＤＭＦ５及びＴ３ Ｔ細胞群に割り当てられ、その結果、平均ヒト白血病生着は、処置群間で同等であった。ＤＭＦ５ ＴＣＲ又はＴ３ ＴＣＲで形質導入した７．５×１０⁶個のｍＴＣＲβ⁺ＣＤ８⁺Ｔ細胞を、原発性のＢ－ＡＬＬ細胞の移植の２２～２５日後に注射し、全ての群に、毎日、マウス当たり腹腔内（ＩＰ）２５００ＩＵ ＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を与えた。Ｔ細胞注入の３日後と１０日後にＰＢで生着をモニターした。Ｔ細胞注入１１日後のマウスの屠殺時に、骨髄、脾臓及びＰＢを、ヒト抗－ＣＤ４５、－ＣＤ８ａ、－ＣＤ４、－ＣＤ３、－ＣＤ１９、－ＨＬＡ－Ａ２、－ＣＤ１０及びマウス抗－ＣＤ４５、－Ｔｅｒ１１９及び－ＴＣＲβで、詳細なフローサイトメトリー分析に供した。ＢＭ試料の分析のために、最低１．８×１０⁵の事象を全てのマウスについて獲得し、少なくとも３×１０⁵の事象を、２匹を除く全てのＴ３細胞処理マウスについて獲得し、ＮＯＰＨＯガイドラインに従ってＭＲＤレベルを決定した。

【0195】

骨髄（脛骨２例、大腿骨２例、及び稜２例）、及び屠殺マウスの脾臓の細胞数をＳｙｓｍｅｘ血液細胞カウンターにより測定した。ＴｒｕｅＣｏｕｎｔビーズ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を、製造業者の指示に従って、全ＰＢに添加し、マウスＣＤ４５．１及びヒトＣＤ４５について染色して、血液１μＬ当たりの絶対ＭＮＣカウントを決定した。

【0196】

各組織について、白血病負荷及びＴＣＲ形質導入ＣＤ８⁺細胞を、それぞれ、ヒトＣＤ４５⁺ＣＤ１９⁺ＣＤ１０⁺及びヒトＣＤ４５⁺ＣＤ３⁺ＣＤ８⁺ｍＴＣＲβ⁺細胞の頻度に基づき、総細胞数に関連して定量した。

【0197】

（ヒト化ＮＳＧマウスにおける正常ヒト造血に対するＴ３細胞処理のインビボでの影響）
ＨＬＡ－Ａ２^posヒト臍帯血細胞で安定に生着したＮＳＧマウスを、ジャクソン研究所から購入した。移植２１週後にヒトの生着が確認された時点で、３匹のマウスを屠殺した。３匹の生着ＮＳＧマウスの脾臓からの単一細胞懸濁液を、１Ｇ４又はＴ３ ＴＣＲ構築物で形質導入し、上記のように増殖させた。ＮＳＧ由来１Ｇ４及びＴ３細胞の活性は、残りのヒト化ＮＳＧマウスへの注入と並行して、ＢＶ１７３細胞に対してフローサイトメトリーに基づく細胞毒性アッセイを実施することにより、インビトロで確認した。１０⁷個のＮＳＧ由来１Ｇ４又はＴ３細胞を生着マウスに尾静脈を介して注入し、注入した細胞が正常造血に及ぼす影響を、Ｔ細胞注入の１７日後に、ＰＢ、脾臓、胸腺及び骨髄で調べた。生着したマウスには、ＩＬ－２産生能を有する内因性臍帯血由来Ｔ細胞も含まれていたことから、ＩＬ－２の１日５００ＩＵのＩＰ用量の補助的な注入（ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）は半数のマウスでは含まれなかった（ＩＬ－２補助的な注入の有無で差が認められなかったため、これらの群のデータを統合した）。注入されたＴ細胞の残存をＰＢでモニターし、治療の成熟血球系統への影響を、ヒト抗－ＣＤ４５、－ＣＤ８ａ、－ＣＤ１９、－ＣＤ３３、－ＣＤ４、－ＣＤ３及びマウス抗ＣＤ４５、－Ｔｅｒ１１９及びＴＣＲβを用いたフローサイトメトリーにより、ＰＢ、脾臓、胸腺及び骨髄でモニターした。マウス胸腺におけるヒトＴ細胞前駆細胞への影響を、ヒト抗－ＴｄＴ、－ＣＤ４５、－ＣＤ８ －ＣＤ１９、－ＣＤ３（細胞内及び表面）、－ＣＤ４、－ＨＬＡ－Ａ２及びマウス抗ＣＤ４５による表面及び細胞内染色により検討した。屠殺したマウスの骨髄（脛骨２例、大腿骨２例、及び稜２例）の細胞計数は、シスメックス血液細胞カウンターにより実施した。

【0198】

（正常造血前駆細胞のクローン形成能に対するインビトロの影響）
カロリンスカ大学病院で集められた４人のＨＬＡ－Ａ２^pos健常ドナーから、インフォームドコンセント及び医療承認（ＥＰＮ ２０１８／９０１－３１）を得て、骨髄単核細胞を得た。生存可能な単一のＣＤ３４⁺前駆細胞を、ＤＡＰＩ及び成熟系統排除によって同定し、そしてＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ上で選別した。２５０個のＣＤ３４⁺系統前駆体を、５００個のＣＤ４^-ＣＤ１９^-（抗－ヒトＣＤ４－ＰＥ－Ｃｙ５及び抗－ヒトＣＤ１９－ＰＥ－Ｃｙ５によって同定され、ＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ Ｆｕｓｉｏｎ上で選別された）１Ｇ４、Ｔ１又はＴ３ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞と、１０％ ＢＩＴ９５００（（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ペニシリン／ストレプトアビジン（１００Ｕ／ｍＬ；Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、２－メルカプトエタノール（２－ＭＥ；０．１ｍＭ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）、幹細胞因子（ＳＣＦ；１０ｎｇ／ｍＬ）、ｆｌｔ３配位子（ＦＬ；１０ｎｇ／ｍｌ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ；１０ｎｇ／ｍＬ）、インターロイキン３（ＩＬ３；５ｎｇ／ｍＬ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ；１０ｎｇ／ｍＬ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ；１０ｎｇ／ｍＬ）及びエリスロポイエチン（ＥＰＯ；１Ｕ／ｍＬ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）中で、３７℃、５％ＣＯ₂で共培養した。Ｔ細胞なしで培養したＣＤ３４⁺系統前駆体を対照として使用した。

【0199】

７２時間後、共培養物からの細胞を、２０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ペニシリン／ストレプトアビジン（１００Ｕ／ｍＬ）及び２－ＭＥ（０．１ｍＭ）を補充したＩｓｃｏｖｅの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ社）中のサイトカイン含有メチルセルロース（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｈ４４３４、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に移して、コロニーを生成させた。メチルセルロース中で１４日後、コロニーを倒立顕微鏡下で骨髄性又は赤血球性としてスコア化した。陽性対照として、ＣＤ３４⁺系統前駆体を、ＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ中の１μＭのペプチド－１又はペプチド－３で、２時間、外部負荷し、続いて、１００ｎＭペプチドの存在下で、形質導入Ｔ細胞を伴い又は伴わないで、４８時間共培養し、細胞をメチルセルロースに移した１０日後に、上記のようにコロニーをスコア化した。

【0200】

（統計解析）
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖｅｒｓｉｏｎ ６又は７（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて行なった。ＢＬＩシグナル分析のために、Ｔｕｋｅｙのポスト試験との多重比較のための調整を伴う通常の一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）試験を採用した。生存分析は、Ｌｏｇ－ｒａｎｋ（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）試験により実施した。ＰＤＸマウスモデルとヒト化ＮＳＧマウスモデルにおけるインビボ投与群の差を明らかにするため、Ｄｕｎｎの多重比較試験及びＭａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ試験によるＫｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ ＡＮＯＶＡを実施した。Ｐ＜０．０５を統計学的に有意とみなした。

【0201】

［結果］
（ＴＣＲ Ｔ１及びＴＣＲ Ｔ３は、ＨＬＡ－Ａ２制限的な方法でＴｄＴペプチドを特異的に認識する）
ＨＬＡ－Ａ２バインダー（ペプチド－１（配列番号１）及びペプチド－３（配列番号１５））として同定された２つのＴｄＴ由来ペプチドを使用して、ＴｄＴタンパク質を認識するＴ細胞クローンを得た。解析した３種のペプチド－１反応性クローンからのＴＣＲ配列は同一であり、Ｔ１と命名し、ペプチド－３反応性クローンからの配列をＴ３と命名した。

【0202】

両ＴＣＲは、ｐＭＨＣ多量体による又はＴＣＲに導入されたマウス定常領域に対して反応性である抗マウスＴＣＲ－β抗体による染色によって実証されるように、第三者末梢血（ＰＢ）ＣＤ８⁺Ｔ細胞において効率的に発現された（データは示していない。）。全てのＴ３形質導入細胞及び抗マウスＴＣＲ－βで陽性に染色されたＴ１形質導入細胞の大部分は、ｐＭＨＣ－多量体陽性であり、これは、レトロウイルス形質導入後に導入されたＴＣＲα及びβ鎖の優先的なペアリングを示す（データは示していない）。

【0203】

Ｔ１及びＴ３は、それらの同族ペプチドを高感度で認識した（Ｔ１ ＥＣ₅₀＝５．８ｎＭ及びＴ３ ＥＣ₅₀＝１．２ｎＭ、図２Ａ）。

【0204】

Ｔ１及びＴ３ ＴＣＲ（以下、Ｔ１細胞及びＴ３細胞と呼ぶ。）を形質導入したＴ細胞は、ＨＬＡ制限的な方法で抗原を認識した。Ｔ１細胞及びＴ３細胞は、ＴｄＴ^posＨＬＡ－Ａ２^negＥＢＶ－ＬＣＬによってではなく、外部負荷ペプチドを提示するか又は完全長ＴｄＴをコードするｍＲＮＡに由来する内因的に処理された抗原を提示するＨＬＡ－Ａ２^posＥＢＶ－ＬＣＬによって活性化された（図２Ｂ）。同様に、元々ＴｄＴ^posだがＨＬＡ－Ａ２^negの細胞株ＲＥＨ（Ｂ－ＡＬＬ起源）及びＨＰＢ－ＡＬＬ（Ｔ－ＡＬＬ起源）は、ＨＬＡ－Ａ^*０２：０１が導入された場合にのみＴ１及びＴ３細胞を活性化した。更に、本発明者らは、Ｔ１及びＴ３細胞を種々の組織起源のヒトＴｄＴ^neg細胞株の大規模パネルと共培養したところ、関連ペプチドを負荷し、かつ生来的に又は遺伝子導入によってＨＬＡ－Ａ２を発現しない限り、いかなるＴＣＲ活性化も観察しなかった（図２Ｃ）。これらの結果から、Ｔ１及びＴ３ ＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ２上に提示された意図しない標的、又は細胞株によって発現された多種多様な他のＨＬＡ分子上に提示された意図しない標的と反応しないことが示された。

【0205】

（ＴＣＲ Ｔ１及びＴＣＲ Ｔ３の反応性のマッピングでは交差認識ペプチドが明らかにならない）
候補ＴＣＲの前臨床試験では、潜在的な臨床的意義のある交差反応性を除外すべきである。この目的のために、本発明者らは、経験的アプローチとコンピュータを用いたアプローチとを組み合わせて採用して潜在的なオフターゲット毒性を同定した。本発明者らは、最初に、各位置のアミノ酸残基が全ての他の天然アミノ酸によって、一度に１つずつ、置き換えられたペプチド－１及びペプチド－３の配列をコードするペプチドミモトープライブラリーを合成した。Ｔ１及びＴ３細胞を、関連ライブラリーからの単一ミモトープを負荷した標的細胞と組み合わせた。得られたＴ細胞活性化は、ＩＦＮ－γの産生又はＣＤ１３７の上方制御によって測定したところ、高度に相関していた（図３Ａ）。次に、ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅツール（ｈｔｔｐｓ://ｐｒｏｓｉｔｅ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ/）を使用することによって、Ｔ１又はＴ３細胞において反応性を誘導するａａ置換の全ての組合せについて、管理されたヒトプロテオームデータベースＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに照会した。検索では、これらの組み合わせに一致するヒトプロテオーム内の天然に存在する９量体又は１１量体ペプチドは特定されなかった。

【0206】

ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔの約２６１倍のエントリーを含有する非管理データベースＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／ＴｒＥＭＢＬを検索すると、Ｔ３に対する反応性の組合せに合致する小さな内在性膜タンパク質１９（ＧＬＦＭＹＡＫＲＩＦＧ）に由来する１つのペプチドを見出した。しかし、機能的チャレンジでは、このペプチドはＴ３細胞においていかなる応答も誘導しなかった（記載せず）。総合すると、データはＴ１とＴ３によるオフターゲット反応性の証拠を提供しなかった。更に、ＴｄＴタンパク質配列中のペプチド－１及び３配列の上流及び／又は下流にシフトしたペプチドは、全同族ペプチド配列を包含するより長い変異体が使用されない限り、Ｔ１及びＴ３細胞を活性化することができなかった（図３Ｂ－Ｃ）。更に、ペプチド－１は、Ｔ３細胞を活性化しなかったが、ペプチド－３は、Ｔ１細胞を高濃度でのみ活性化し、おそらく、培養物中でペプチド－１を生成するペプチド－３の分解によるものと考えられる。

【0207】

（Ｔ１及びＴ３はマウスモデルにおける播種性白血病の拒絶反応を媒介する）
次に、本発明者らは、Ｔ１及びＴ３細胞がＴｄＴを自然発現する白血病細胞株を殺傷できるかどうかを検討した。Ｔ１及びＴ３細胞は、ＩＦＮ－γの産生、増殖及び死滅によって測定されるように、Ｂ細胞白血病細胞株ＢＶ１７３及びＮＡＬＭ６（本来はＴｄＴ^pos及びＨＬＡ－Ａ２^pos）に強く応答した（低エフェクター対標的比率（Ｅ：Ｔ＝１：１）で９６％～９９％）（図４Ａ～Ｂ）。

【0208】

インビボでの効力を研究するために、ＢＶ１７３ｆｆｌｕｃ－ｅＧＦＰ細胞をＮＯＤ－ｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒｇｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウスに生着させ、白血病確立後にＴ１又はＴ３細胞による処置を開始した。これらのマウスでは、２１日目（ＢＶ１７３、図５Ａ、Ｂ）及び１４日目（ＮＡＬＭ－６、図５Ｄ、Ｅ）に、腫瘍シグナルが非常に低い（Ｔ１）か、又は認められず（Ｔ３）、その直後に、未処置及び１Ｇ４処置の対照マウス（ＮＹ－ＥＳＯ－１に対する対照ＴＣＲ）を、高い腫瘍量のために屠殺しなければならなかった（図５Ｃ、Ｆ）。特に、Ｔ３細胞で処置したマウスでは、白血病細胞の注射後の観察期間中に、白血病により死亡したマウスは、いなかった（図５Ｃ、Ｆ）。ＮＡＬＭ－６モデルの中の２匹のＴ３細胞処理マウスは、白血病の蔓延とは関係なく、原因不明で死亡した。生物発光イメージング（ＢＬＩ）は、ＮＡＬＭ－６モデルのＴ３細胞処置マウスでは５７日目でも陰性のままであり、屠殺マウスの骨髄に腫瘍が認められなかったことと一致している（図示せず）。Ｔ３処置ＢＶ１７３マウス５匹中１匹のみが、屠殺時に、骨髄にＧＦＰ⁺腫瘍細胞を有していた（図５Ｇ）。対照の１Ｇ４ ＴＣＲ－形質導入Ｔ細胞も、おそらくＩＬ－２の注射により、最初に増殖した。Ｔ１細胞で処置したＢＶ１７３マウスについては、生存利益もきわめて有意であったが（図５Ｃ）、これらのマウスのいくつかは最終的に腫瘍を発症し、Ｔ３と比較してＴ１に対するペプチド感受性がより低いことと一致している。

【0209】

（Ｔ１及びＴ３はＢ－ＡＬＬ及びＴ－ＡＬＬから一次芽球を排除するが、正常リンパ球及び非系統の拘束性造血前駆細胞を温存する）
本発明者らは、次に、正常なＢ細胞及びＴ細胞並びに非系統の拘束性造血前駆細胞を含有する試料中のヒト原発性のＡＬＬ細胞を選択的に認識するＴ１及びＴ３細胞の能力を定量した。次に、様々な割合の白血病芽細胞、正常Ｂ及びＴ細胞並びに正常ＣＤ３４⁺造血前駆細胞（ＣＤ３４⁺ｌｉｎ^-）を含有する９名のＢ－ＡＬＬ及び３名のＴ－ＡＬＬ患者からの凍結保存したＴｄＴ^pos及びＨＬＡ－Ａ２^pos診断試料を、Ｔ１又はＴ３細胞と共培養した。４８～７２時間の共培養後、Ｔ３細胞は平均９７％の、Ｔ１細胞は６９％の白血病芽球を排除した（Ｔ３：平均９７％、範囲９２％～９９．９％；Ｔ１：平均６９％、範囲１３％～９６％、ｎ＝１２）。対照的に、正常Ｂ細胞及びＴ細胞は影響を受けず（図６Ａ～Ｂ）、４例で検出された非癌性ＣＤ３４⁺ｌｉｎ^-細胞も影響を受けなかった（図６Ａ）。

【0210】

次に、本発明者らは、ＨＬＡ－Ａ２^posＴｄＴ^pos Ｂ－ＡＬＬ患者からの正常Ｔ細胞へのＴ３の導入が、Ｔ細胞の活性化及び実質的に全ての自己由来腫瘍細胞の排除をもたらしたことを示した（図７Ａ）。正常なＢ、Ｔ及びＣＤ３４⁺ｌｉｎ^-前駆細胞は温存された（図７Ａ～Ｂ）。まとめると、これらのデータは、代表的なＴｄＴ及びＨＬＡ－Ａ２発現を有する原発性白血病細胞に対するＴ１及びＴ３細胞の高度の標的選択性及び治療有効性を示す。

【0211】

（Ｔ３細胞を示す更なる研究はインビボでの健常造血を維持しながら原発性Ｂ－ＡＬＬ細胞を効率的に排除する）
本発明者らは、次に、原発性Ｂ－ＡＬＬ白血病患者由来の細胞を安定的に生着させたＮＳＧマウスのＴ３細胞処置の有効性を検討した。未処置のマウス及び対照のＭＡＲＴ－１（ＤＭＦ５)(非特許文献３３）又はＴ３ ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞で処置したマウスは、ベースラインで骨髄中の白血病負荷が高く、同等であり（未処置の平均９．７±３．４％、ＤＭＦ５平均１５．６±５．７％、Ｔ３平均１５．４±７．２％）、治療効果を検証するための厳密な条件が示された。本発明者らは、ＨＬＡ－Ａ２発現に適合したが、それ以外の点ではＡＬＬとＨＬＡ－適合ではないＴ細胞を利用した。注入Ｔ細胞は、主に、養子Ｔ細胞療法における抗腫瘍反応性を促進する臨床製品に似た、ナイーブ及びセントラルメモリーＴ細胞並びに平均して３４％のＣＤ４⁺Ｔ細胞を含有していた。しかしながら、治療対象のマウスにおいて、Ｔ細胞とＨＬＡ－適合ではない白血病細胞の負荷が高いことと同様に、ナイーブＴ細胞の割合が高いことも同種反応性を促進する。本発明者らは、そこで、ＤＭＦ５（対照ＴＣＲ）処置マウスの血液中の白血病性生着を未処置マウスと比較することにより、移植片対白血病効果の発現の可能性についてマウスをモニターし、結果が有意な同種反応性により交絡する前に詳細な最終段階分析を実施した。これは処置１０～１１日後に観察された。この実験のエンドポイントにおいて、対照マウス群の白血病負荷は非常に高く、骨髄では同等であったが（未処置の平均４２．９±３．４％、ＤＭＦ５平均４０．１±４．５％）、Ｔ３細胞による処置後には僅か０．００９±０．００５％に低下した（図８Ａ－Ｄ）。

【0212】

未処置及びＤＭＦ５細胞処置マウスにおける末梢血及び脾臓の白血病負荷は骨髄よりも低かった。それにもかかわらず、同様でほぼ完全な白血病細胞消失が、Ｔ３細胞で処置したマウスで観察された（ＰＢ：平均０．００３±０．００１％；脾臓：平均０．００２±０．００１％）（データは示していない）。総合すると、白血病負荷は、ＮＯＰＨＯ－２００８プロトコル（ＮＣＴ００８１６０４９）によって設定された基準に従って、微小残存病変（ＭＲＤ）陰性とみなされるレベル（０．１％未満）まで低下した。ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞は、全てのマウスの骨髄、ＰＢ及び脾臓で検出された（図示せず）。白血病生着マウスの骨髄で抑制されるマウスの造血は、ＤＭＦ５マウスよりもＴ３マウスで有意に高かった（図示せず）。

【0213】

正常な末梢のＢ細胞とＴ細胞のレパートリーはＴｄＴ陰性であり、インビトロ殺傷試験や形質導入細胞の増殖中にはＴ３やＴ１のＴＣＲの影響を受けなかった（例えば、図６Ｂを参照）。正常個体におけるナイーブＴ細胞の恒常性が、遡及的な¹⁴Ｃ年代測定を用いて測定された研究は、ナイーブＴ細胞のレパートリーは、若年者であっても末梢適応性Ｔ細胞免疫を生涯に亘って維持できるほど十分に多様であり、従って、胸腺細胞に対する潜在的な毒性影響は、長期に亘る治療中でさえ大きな懸念にはならないという見解を支持する。しかし、末梢レパートリーへの胸腺の寄与は２０歳未満の個体において、より高く、この年齢群では毒性がより高くなる可能性を高めている。この疑問に答えるために、本発明者らは、ヒト胸腺細胞分化中のＴｄＴとＨＬＡ－Ａ２の発現を研究した。本発明者らは、興味深いことに、ＨＬＡ－Ａ２発現が、初期の二重陰性（ＤＮ）及び単一陽性（ＳＰ）細胞を含有するＴｄＴ^neg胸腺細胞上でのみ高く、一方、二重陽性（ＤＰ）細胞に移行する後期ＤＮ細胞では、ＨＬＡ－Ａ２発現がＴｄＴの上方制御と同時に下方制御されることを見出した（データは示していない）。

【0214】

本発明者らは、次に、マウス脾臓から採取したＴ３－又は１Ｇ４－形質導入自己由来ヒトＴ細胞を注射したヒト化ＣＤ３４⁺ＮＳＧマウスにおける胸腺細胞に対するＴ３細胞療法の影響を調べた。Ｔ３細胞が注射前にインビトロでＴｄＴ^pos細胞株を効果的に殺傷することが実証された（図示せず）。ＴｄＴ^pos胸腺細胞の割合は、Ｔ３及び１Ｇ４処置マウスで同様であった。ＨＬＡ－Ａ２レベルは、両方の実験群において、表層ＣＤ３⁺ＴｄＴ^neg胸腺細胞と比較して、ＴｄＴ^pos胸腺細胞上で同様に低かった（図示せず）。これに対応して、マウス胸腺内の臍帯血前駆細胞によって補充されたヒト胸腺細胞のごく一部のみが、ヒト胸腺に由来する胸腺細胞についても観察されたように、両方の群において、ＴｄＴ^highとＨＬＡ－Ａ２^highであった（図示せず）。実験は、Ｔ細胞注射後１７日目に終了した。このとき、ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞は依然としてＰＢで検出可能であり、１Ｇ４形質導入Ｔ細胞の割合は、Ｔ３形質導入Ｔ細胞の割合より速く低下した。これは、おそらく、Ｔ３ Ｔ細胞の低レベル抗原刺激を示唆している（図示せず）。ＰＢ、骨髄、脾臓及び胸腺におけるヒト骨髄系及びリンパ系の分布、並びに骨髄における細胞充実性の分析では、１Ｇ４群とＴ３群との間に差異は観察されなかった（図示せず）。造血幹細胞及び骨髄前駆細胞に対する毒性がないことを更に裏付けるように、成人ＣＤ３４⁺骨髄前駆細胞からの骨髄及び赤血球コロニーの形成は、共培養をペプチド１又は３の存在下で行なわない限り、Ｔ１又はＴ３細胞との共培養後に悪影響を受けなかった（図示せず）。

【0215】

［結論］
本発明者らの研究は、同種異系ＨＬＡ－Ａ２との関連で、新規癌標的ＴｄＴ由来のペプチドを認識するＴＣＲで形質導入されたＴ細胞が、インビトロで、Ｂ細胞及びＴ細胞起源のＴｄＴ^posＨＬＡ－Ａ２^pos患者由来リンパ芽球性白血病細胞を効率的に死滅させたことを示す。ＴｄＴ ＴＣＲは、多数のＴｄＴ^posＡＬＬ細胞株並びに原発性のＡＬＬ細胞を死滅させるのに非常に効率的であった。更に、ＴｄＴ ＴＣＲは、Ｂ－ＡＬＬの３つの異なるマウスモデルにおいて、インビボで、生着白血病の枯渇を仲介した。本発明者らのデータは更に、ＴＣＲを、有害な毒性なしに治療において使用できることを示す。

【0216】

本発明者らは、更に、ＴｄＴペプチド及びＨＬＡ－Ａ２制限に対する特異性が、ＴｄＴがノックアウトされ又はＨＬＡ－Ａ２が存在しない、ＴｄＴ^pos白血病細胞に対する反応性の喪失によって確認され、原発性白血病細胞のＨＬＡによって提示される同族ペプチドがマススペクトロメトリーによって直接的に同定されたことを示す、本明細書には提示されていないデータを作製した。ＴｄＴ^negである種々のＨＬＡ－Ａ２^pos細胞株は認識されず、ＴＣＲ反応性のマッピングでは、Ｔ１又はＴ３が反応性を示す置換ペプチドの組合せに適合するヒトプロテオーム中の天然に存在する９量体又は１１量体ペプチドは同定されなかった。総合すると、ＴｄＴ ＴＣＲの高い有効性と特異性をＴｄＴの独自の発現プロファイルと組み合わせて示すデータは、現在予後が不良である患者群を包含する、ＴｄＴ^pos急性白血病の治療のための新しい可能性を開く。

【0217】

配列表における配列の説明

【表1-1】

【表1-2】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図6】

【図7】

【図8-1】

【図8-2】

【配列表】

2024534537000001.xml

【国際調査報告】