特表 2024-534545 インターロイキン２変異体およびその融合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-20

(54)【発明の名称】インターロイキン２変異体およびその融合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240912BHJP

   C07K 14/55 20060101ALI20240912BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240912BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/26 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240912BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240912BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240912BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240912BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240912BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240912BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28

C07K14/55 ZNA

C07K19/00

C07K16/18

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/26

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/09 Z

C12P21/08

C12P21/02 C

A61K39/395 U

A61K38/20

A61P35/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024518144

(86)(22)【出願日】2022-09-21

(85)【翻訳文提出日】2024-05-10

(86)【国際出願番号】 CN2022120265

(87)【国際公開番号】W WO2023045977

(87)【国際公開日】2023-03-30

(31)【優先権主張番号】202111110032.3

(32)【優先日】2021-09-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523353465

【氏名又は名称】フォートビタ バイオロジクス（シンガポール）プライベート リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100108903

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和広

(74)【代理人】

【識別番号】100123593

【弁理士】

【氏名又は名称】関根 宣夫

(74)【代理人】

【識別番号】100208225

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 修二郎

(74)【代理人】

【識別番号】100217179

【弁理士】

【氏名又は名称】村上 智史

(74)【代理人】

【識別番号】100227592

【弁理士】

【氏名又は名称】孔 詩麒

(72)【発明者】

【氏名】ホー カイチエ

(72)【発明者】

【氏名】フー フォンケン

(72)【発明者】

【氏名】ウー ウェイウェイ

(72)【発明者】

【氏名】チョウ ショアイシアン

(72)【発明者】

【氏名】コアン チエン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG05

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA41

4C084DA14

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA21

4C085BB01

4C085BB11

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C085GG06

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA04

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、新規インターロイキン２（ＩＬ－２）変異タンパク質およびその使用に関する。具体的には、本発明は、野生型ＩＬ－２と比較して、改善された特性、例えば、改善されたＩＬ－２受容体結合特性および改善された創薬可能性を有するＩＬ－２変異タンパク質に関する。本発明は、当該ＩＬ－２変異タンパク質を含む融合タンパク質、二量体、免疫複合体、および当該ＩＬ－２変異タンパク質、二量体、免疫複合体をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。より具体的には、本発明は、特にＩＬ－２変異タンパク質および抗ＰＤ－１抗体を含む免疫複合体を提供する。本発明は、当該ＩＬ－２変異タンパク質、融合タンパク質、二量体および免疫複合体の調製方法、それらを含む医薬組成物および治療的使用をさらに提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）ＰＤ－１に結合する抗体、および（ｉｉ）ＩＬ－２変異タンパク質を含む免疫複合体であって、前記変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２（好ましくはヒトＩＬ－２で、より好ましくは配列番号３の配列を含むＩＬ－２）と比較して、以下の変異を含む：
（ｉ）ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒα結合界面において、特に位置３５および／または４２に、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合親和性を排除または低減する変異、
かつ／または
（ｉｉ）ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβγ結合界面において、特に位置８８、１２７および／または１３０から選択される少なくとも１つの位置に、ＩＬ－２Ｒβγ受容体に対する結合を弱める変異、
ならびに
（ｉｉｉ）短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域（すなわち、アミノ酸残基ａａ７２とａａ８４を連結する配列）であって、好ましくは、前記短縮されたループ領域は１０個、９個、８個、７個、６個、または５個未満のアミノ酸長を有し、かつ好ましくは７個のアミノ酸長であり、好ましくは、前記短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域はタンパク質の発現量および／または純度の改善をもたらし、
そのうち、アミノ酸の位置は配列番号３に従って番号付けられる、
免疫複合体。

【請求項2】

前記変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、
（ｉ）Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１３０Ｒ、
Ｎ８８Ｄ、
Ｎ８８Ｒ、
Ｆ４２Ａ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ、または
Ｋ３５Ｅ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ、および
（ｉｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＡＧＤＡＳＩＨまたはＡＱＳＫＮＦＨ、
ならびに、任意に（ｉｉｉ）Ｔ３Ａを含む、
請求項１に記載の免疫複合体。

【請求項3】

前記ＩＬ－２変異タンパク質は、配列番号４、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９もしくは配列番号３１のアミノ酸配列またはそれらと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる、
請求項１に記載の免疫複合体。

【請求項4】

前記免疫複合体は、
Ｆｃ断片と融合されるＩＬ－２変異タンパク質を含む第１のモノマー、および
ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその断片を含む第２のモノマーであって、好ましくは、前記断片は、前記抗ＰＤ－１抗体の１つの重鎖および１つの軽鎖を含む、第２のモノマーを含む、
請求項１～３のいずれか１項に記載の免疫複合体。

【請求項5】

第１のモノマーのＦｃ断片においてＫｎｏｂ変異を含み、第２のモノマーの抗体重鎖においてｈｏｌｅ変異を含み、または第１のモノマーのＦｃ断片においてｈｏｌｅ変異を含み、第２のモノマーの抗体重鎖においてｋｎｏｂ変異を含む、
請求項４に記載の免疫複合体。

【請求項6】

前記第１のモノマー中のＦｃ断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のＦｃ断片であり、好ましくは配列番号６、配列番号４２もしくは配列番号４３のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、
請求項４または５に記載の免疫複合体。

【請求項7】

前記Ｆｃ断片と融合されるＩＬ－２変異タンパク質は、配列番号７、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０もしくは配列番号３２のアミノ酸配列またはそれらと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる、
請求項４～６のいずれか１項に記載の免疫複合体。

【請求項8】

前記ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域を含む重鎖を含み、前記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１のアミノ酸配列に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む、
請求項４～７のいずれか１項に記載の免疫複合体。

【請求項9】

前記ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域を含む軽鎖を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８のアミノ酸配列に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、
請求項４～８のいずれか１項に記載の免疫複合体。

【請求項10】

前記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号８に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる重鎖可変領域、および
配列番号１５に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる軽鎖可変領域を含む、
請求項４～９のいずれか１項に記載の免疫複合体。

【請求項11】

前記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１４もしくは配列番号２２に示されるアミノ酸配列またはそれらと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる重鎖、および
配列番号２０に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる軽鎖を含む、
請求項４～９のいずれか１項に記載の免疫複合体。

【請求項12】

前記ＩＬ－２変異タンパク質とＦｃはリンカーを介して連結され、または前記ＩＬ－２変異タンパク質と前記抗ＰＤ－１抗体はリンカーを介して連結され、好ましくは、前記リンカーは（ＧＧＧＧＳ）_ｎから選択され、そのうち、ｎ＝１、２、３もしくは４であり、例えば、前記リンカーは配列番号５である、
請求項１～１１のいずれか１項に記載の免疫複合体。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか１項に記載の免疫複合体の１つまたは複数の鎖、あるいは第１のモノマーおよび／または第２のモノマーをコードする、
単離されたポリヌクレオチド。

【請求項14】

請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む、
発現ベクター。

【請求項15】

請求項１３に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは、前記宿主細胞は、酵母細胞または哺乳動物細胞、特にＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である、
宿主細胞。

【請求項16】

請求項１～１２のいずれか１項に記載の免疫複合体を生産するための方法であって、前記免疫複合体の発現に適する条件で、請求項１５に記載の宿主細胞を培養することを含む、
方法。

【請求項17】

請求項１～１２のいずれか１項に記載の免疫複合体、および任意に医薬賦形剤を含む、
医薬組成物。

【請求項18】

請求項１～１２のいずれか１項に記載の免疫複合体または請求項１７に記載の医薬組成物の、癌の予防および／または治療のための薬物の調製における使用であって、好ましくは、前記癌は、固形腫瘍または血液腫瘍、例えば、胃腸腫瘍または黒色腫、例えば、結腸直腸癌または結腸癌であり、例えば、前記癌は、ＰＤ－１抗体治療抵抗性癌である、
使用。

【請求項19】

前記医薬組成物は、第２の治療剤をさらに含む、
請求項１８に記載の使用。

【請求項20】

対象における癌を予防および／または治療するための方法であって、請求項１～１２のいずれか１項に記載の免疫複合体または請求項１７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、好ましくは、前記癌は、固形腫瘍または血液腫瘍、例えば、胃腸腫瘍または黒色腫、例えば、結腸直腸癌または結腸癌であり、例えば、前記癌は、ＰＤ－１抗体治療抵抗性癌である、
方法。

【請求項21】

前記変異タンパク質、前記融合タンパク質または前記医薬組成物は、第２の治療剤と併用療法により投与される、
請求項２０に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規インターロイキン２（ＩＬ－２）変異タンパク質およびその使用に関する。具体的には、本発明は、野生型ＩＬ－２と比較して、改善された特性、例えば、改善されたＩＬ－２受容体結合特性および改善された創薬可能性を有するＩＬ－２変異タンパク質に関する。本発明は、当該ＩＬ－２変異タンパク質を含む融合タンパク質、二量体、免疫複合体、および当該ＩＬ－２変異タンパク質、二量体、免疫複合体をコードする核酸、当該核酸を含むベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。より具体的には、本発明は、特にＩＬ－２変異タンパク質および抗ＰＤ－１抗体を含む免疫複合体を提供する。本発明は、当該ＩＬ－２変異タンパク質、融合タンパク質、二量体および免疫複合体の調製方法、それらを含む医薬組成物および治療的使用をさらに提供する。

【背景技術】

【0002】

Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）とも呼ばれるインターロイキン－２（ＩＬ－２）は、主に活性化Ｔ細胞、特にＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞によって産生される多能性サイトカインである。真核細胞において、ヒトＩＬ－２（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８）は１５３個のアミノ酸の前駆体ポリペプチドとして合成され、Ｎ末端の２０個のアミノ酸を除去した後、成熟した分泌性ＩＬ－２を産生する。他の種のＩＬ－２の配列も開示されており、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ Ｓｅｑ Ｎｏ．ＮＰ０３２３９２（マウス）、ＮＰ４４６２８８（ラット）またはＮＰ５１７４２５（チンパンジー）を参照する。

【0003】

インターロイキン２は、その機能に不可欠な４次構造を形成する４つの逆平行両親媒性αヘリックスを有する（Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０、１１６９－７６（１９８８）；Ｂａｚａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７、４１０－４１３（１９９２））。ほとんどの場合、ＩＬ－２は、インターロイキン２受容体α（ＩＬ－２Ｒα、ＣＤ２５）、インターロイキン２受容体β（ＩＬ－２Ｒβ、ＣＤ１２２）、およびインターロイキン２受容体γ（ＩＬ－２Ｒγ、ＣＤ１３２）という３つの異なる受容体を介して作用する。ＩＬ－２ＲβおよびＩＬ－２ＲγはＩＬ－２のシグナル伝達に非常に重要であるが、ＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）はシグナル伝達に必須ではないが、ＩＬ－２の受容体への高親和性結合を与えることができる（Ｋｒｉｅｇら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ １０７、１１９０６－１１（２０１０））。ＩＬ－２Ｒα、β、およびγを組み合わせて形成される三量体受容体（ＩＬ－２αβγ）はＩＬ－２高親和性受容体（ＫＤが約１０ｐＭ）であり、βとγからなる二量体受容体（ＩＬ－２βγ）は中間親和性受容体（ＫＤが約１ｎＭ）であり、αサブユニットのみから形成されるＩＬ－２受容体は、低親和性受容体である。

【0004】

免疫細胞は二量体または三量体ＩＬ－２受容体を発現する。二量体受容体は細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞で発現され、三量体受容体は主に活性化リンパ球とＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋ＦｏｘＰ３^＋抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）で発現される（Ｂｙｍａｎ、Ｏ．およびＳｐｒｅｎｔ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２、１８０－１９０（２０１２））。静止状態のエフェクターＴ細胞およびＮＫ細胞は、細胞表面上にＣＤ２５を持たないので、ＩＬ－２に対して比較的非感受性である。一方、Ｔｒｅｇ細胞は一貫してインビボで最高レベルのＣＤ２５を発現しているため、通常ＩＬ－２はＴｒｅｇ細胞の増殖を優先的に刺激する。

【0005】

ＩＬ－２は、異なる細胞上のＩＬ－２受容体との結合を介して、免疫応答において多重作用を媒介する。一方では、ＩＬ－２は免疫系刺激作用を有し、Ｔ細胞とナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖と分化を刺激することができる。したがって、ＩＬ－２は、免疫治療剤として癌や慢性ウイルス感染の治療に使用されることが承認されている。他方では、ＩＬ－２は、免疫抑制性ＣＤ４^＋ＣＤ２５^＋制御性Ｔ細胞（すなわち、Ｔｒｅｇ細胞）の維持を促進することもでき（Ｆｏｎｔｅｎｏｔら、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６、１１４２－５１（２００５）；Ｄ’ＣｒｕｚおよびＫｌｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６、１１５２－５９（２００５）；ＭａｌｏｙおよびＰｏｗｒｉｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６、１１７１－７２（２００５））、患者において活性化Ｔｒｅｇ細胞による免疫抑制を引き起こす。

【0006】

なお、長年の臨床実践経験により、高用量のＩＬ－２は、黒色腫や腎臓癌などの癌の治療において顕著な臨床効果をもたらすことができるが、同時に、血管漏出症候群や低血圧などの心血管系毒性を含む薬物関連の重度の毒性と副作用を引き起こす可能性もあることが見出されている。研究によると、これらの毒性は、リンパ球（特にＴ細胞とＮＫ細胞）に対するＩＬ－２の過剰な活性化によって、炎症性因子の放出を刺激することが原因である可能性が高いことが示されている。例えば、これは血管内皮細胞を収縮させ、細胞間の隙間を大きくし、組織液の流出を引き起こし、それにより血管漏出の副作用を引き起こす可能性がある。

【0007】

ＩＬ－２の臨床使用に関する別の制限的な問題は、その半減期が非常に短いため、投与が困難になることである。ＩＬ－２の分子量はわずか１５ＫＤａであるため、主に糸球体の濾過作用によって除去され、ヒト半減期はわずか１時間程度である。十分に高いヒトへの曝露量を達成するために、臨床的には８時間ごとに高用量のＩＬ－２を注入する必要がある。しかし、頻繁な投与は、患者に大きな負担をかけるだけでなく、さらに重要なことにＩＬ－２の高用量注入は非常に高いピーク血中濃度（Ｃｍａｘ）を引き起こし、これは薬物毒性を引き起こすの別の要因である可能性が高い。

【0008】

ＩＬ－２免疫療法に関連するこれらの問題を克服するために、いくつかのアプローチが取られてきた。例えば、ＩＬ－２といくつかの抗ＩＬ－２モノクローナル抗体との組み合わせは、インビボでＩＬ－２の治療効果を増強することが見出されている（Ｋａｍｉｍ ｕｒａら、ＪＩｍｍｕｎｏｌ１７７、３０６－１４（２００６）；Ｂｏｙｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３１１、１９２４－２７（２００６））。ＩＬ－２分子のいくつかの操作方法も提案されている。例えば、Ｈｅｌｅｎ Ｒ．Ｍｏｔｔらは、排除されたＩＬ－２Ｒα結合能力を有するヒトＩＬ－２の変異タンパク質Ｆ４２Ａを開示している。Ｒｏｄｒｉｇｏ Ｖａｚｑｕｅｚ－Ｌｏｍｂａｒｄｉら（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、８：１５３７３、ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５３７３）は、排除されたＩＬ－２Ｒα結合能力を有する三重変異ヒトＩＬ－２変異タンパク質ＩＬ－２^３Ｘも提案し、当該タンパク質はアミノ酸残基位置３８、４３および６１にそれぞれ残基変異Ｒ３８Ｄ＋Ｋ４３Ｅ＋Ｅ６１Ｒを有する。ＣＮ１３０９７０５Ａは、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβγとの結合の低減をもたらす、位置Ｄ２０、Ｎ８８およびＱ１２６の変異を開示している。これらの変異タンパク質は、薬物動態学的および／または薬力学的特性に依然として欠陥があり、かつ哺乳動物細胞で発現される場合、発現量が低い、および／または分子安定性が比較的悪いという問題も存在する。

【0009】

プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１またはＣＤ２７９）は、ＣＤ２８受容体ファミリーの阻害性メンバーであり、当該ファミリーは、さらにＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、およびＢＴＬＡも含む。ＰＤ－１は、細胞表面受容体であり、かつ活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞、および骨髄細胞上で発現される。ＰＤ－１の構造は、免疫グロブリン可変様細胞外ドメインと、チロシンベースの免疫受容体の阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）およびチロシンベース免疫受容体のスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む細胞質ドメインとからなるモノマー１型膜貫通タンパク質である。ＰＤ－１の２つのリガンド、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２が同定されており、これらはＰＤ－１への結合後にＴ細胞の活性化をダウンレギュレートすることが示されている。ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－Ｌ２は両方ともＢ７ホモログであり、ＰＤ－１に結合するが、他のＣＤ２８ファミリーメンバーに結合しない。ＰＤ－１の１つのリガンドであるＰＤ－Ｌ１は、多くのヒト癌に豊富に存在する。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の間の相互作用は、腫瘍浸潤リンパ球の減少、Ｔ細胞受容体媒介性増殖の低減、および癌細胞の免疫逃避をもたらす。

【0010】

ＰＤ－１に結合する様々な抗体、例えば、ＷＯ２０１７０２４４６５Ａ１に開示されているＰＤ－１抗体が当該分野で知られている。

【0011】

したがって、当該分野では、改善された特性（例えば、その受容体への結合の低減、創薬可能性の改善など）を有する新規ＩＬ－２分子、特にＰＤ－１抗体との免疫複合体をさらに開発する必要がある。

【発明の概要】

【0012】

本発明は、以下の実施形態に関する。
１．（ｉ）ＰＤ－１に結合する抗体、および（ｉｉ）ＩＬ－２変異タンパク質を含む免疫複合体であって、前記変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２（好ましくはヒトＩＬ－２で、より好ましくは配列番号３の配列を含むＩＬ－２）と比較して、以下の変異を含む：
（ｉ）ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒα結合界面において、特に位置３５および／または４２に、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合親和性を排除または低減する変異、
かつ／または
（ｉｉ）ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβγ結合界面において、特に位置８８、１２７および／または１３０から選択される少なくとも１つの位置に、ＩＬ－２Ｒβγ受容体に対する結合を弱める変異、
ならびに
（ｉｉｉ）短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域（すなわち、アミノ酸残基ａａ７２とａａ８４を連結する配列）であって、好ましくは、前記短縮されたループ領域は１０個、９個、８個、７個、６個、または５個未満のアミノ酸長を有し、かつ好ましくは７個のアミノ酸長であり、好ましくは、前記短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域はタンパク質の発現量および／または純度の改善をもたらし、ならびに
任意に（ｉｖ）ＩＬ－２のＮ末端、特に位置３に、ＩＬ２のＮ末端のＯ糖修飾を除去する変異を有し、
ここで、前記アミノ酸の位置は配列番号３に従って番号付けられる、
免疫複合体。
２．前記変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、
（ｉ）Ｎ８８Ｄ、
Ｎ８８Ｒ、
Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１３０Ｒ、
Ｆ４２Ａ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ、
Ｆ４２Ａ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ、または
Ｋ３５Ｅ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ、
および
（ｉｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＡＧＤＡＳＩＨまたはＡＱＳＫＮＦＨ、
ならびに、任意に（ｉｉｉ）Ｔ３Ａを含む、実施形態１に記載の免疫複合体。
３．前記ＩＬ－２変異タンパク質は、配列番号４、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９もしくは配列番号３１のアミノ酸配列またはそれらと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる、実施形態１に記載の免疫複合体。
４．前記免疫複合体は、
Ｆｃ断片と融合されるＩＬ－２変異タンパク質を含む第１のモノマー、および
ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその断片を含む第２のモノマーであって、好ましくは、前記断片は、前記抗ＰＤ－１抗体の１つの重鎖および１つの軽鎖を含む、第２のモノマーを含む、実施形態１～３のいずれか１項に記載の免疫複合体。
５．第１のモノマーのＦｃ断片においてＫｎｏｂ変異を含み、第２のモノマーの抗体重鎖においてｈｏｌｅ変異を含み、または第１のモノマーのＦｃ断片においてｈｏｌｅ変異を含み、第２のモノマーの抗体重鎖においてｋｎｏｂ変異を含む、実施形態４に記載の免疫複合体。
６．前記第１のモノマー中のＦｃ断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のＦｃ断片であり、好ましくは配列番号６、配列番号４２もしくは配列番号４３のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる、実施形態４または５に記載の免疫複合体。
７．前記Ｆｃ断片と融合されるＩＬ－２変異タンパク質は、配列番号７、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０もしくは配列番号３２のアミノ酸配列またはそれらと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる、実施形態４～６のいずれか１項に記載の免疫複合体。
８．前記ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域を含む重鎖を含み、前記重鎖可変領域は、それぞれ配列番号９、配列番号１０、および配列番号１１のアミノ酸配列に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む、実施形態４～７のいずれか１項に記載の免疫複合体。
９．前記ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域を含む軽鎖を含み、前記軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１６、配列番号１７、および配列番号１８のアミノ酸配列に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む、実施形態４～８のいずれか１項に記載の免疫複合体。
１０．前記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号８に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる重鎖可変領域、および
配列番号１５に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる軽鎖可変領域を含む、実施形態４～９のいずれか１項に記載の免疫複合体。
１１．前記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１４もしくは配列番号２２に示されるアミノ酸配列またはそれらと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる重鎖、および
配列番号２０に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる軽鎖を含む、実施形態４～９のいずれか１項に記載の免疫複合体。
１２．前記ＩＬ－２変異タンパク質とＦｃはリンカーを介して連結され、または前記ＩＬ－２変異タンパク質と前記抗ＰＤ－１抗体はリンカーを介して連結され、好ましくは、前記リンカーは（ＧＧＧＧＳ）_ｎであり、ここで、ｎ＝１、２、３もしくは４であり、例えば、前記リンカーは配列番号５である、実施形態１～１１のいずれか１項に記載の免疫複合体。
１３．実施形態１～１２のいずれか１項に記載の免疫複合体の１つまたは複数の鎖、あるいは第１のモノマーおよび／または第２のモノマーをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
１４．実施形態１３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
１５．実施形態１３に記載のポリヌクレオチドまたは実施形態１４に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは前記宿主細胞は酵母細胞または哺乳動物細胞、特にＨＥＫ２９３細胞またはＣＨＯ細胞である、宿主細胞。
１６．実施形態１～１２のいずれか１項に記載の免疫複合体を生産するための方法であって、前記免疫複合体の発現に適する条件で、実施形態１５に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
１７．実施形態１～１２のいずれか１項に記載の免疫複合体、および任意に医薬賦形剤を含む医薬組成物。
１８．実施形態１～１２のいずれか１項に記載の免疫複合体または実施形態１７に記載の医薬組成物の、癌の予防および／または治療のための薬物の調製における使用であって、好ましくは、前記癌は、固形腫瘍または血液腫瘍、例えば、胃腸腫瘍または黒色腫、例えば、結腸直腸癌または結腸癌であり、例えば、前記癌は、ＰＤ－１抗体治療抵抗性癌である、使用。
１９．前記医薬組成物は、第２の治療剤をさらに含む、実施形態１８に記載の使用。
２０．対象における癌を予防および／または治療するための方法であって、実施形態１～１２のいずれか１項に記載の免疫複合体または実施形態１７に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含み、好ましくは、前記癌は、固形腫瘍または血液腫瘍、例えば、胃腸腫瘍または黒色腫、例えば、結腸直腸癌または結腸癌であり、例えば、前記癌は、ＰＤ－１抗体治療抵抗性癌である、方法。
２１．前記変異タンパク質、前記融合タンパク質または前記医薬組成物は、第２の治療剤と併用療法により投与される、実施形態２０に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1A】本発明の抗ＰＤ－１とＩＬ－２変異体の免疫複合体の分子構造であり、

【図1B】分子２１２４および分子３０１０のＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質の分子構造である。

【図2】ＩＬ－２の受容体に結合した結晶構造（ＰＤＢ：２ＥＲＪ）である。

【図3】ＩＬ－２Ｒβγに対する免疫複合体および対照分子の結合曲線である。

【図4】ＩＬ－２Ｒαに対する免疫複合体または対照分子の結合曲線である。

【図5】ヒトＰＤ１に対する免疫複合体または対照分子の結合曲線である。

【図6】ＣＴＬＬ２ＷＴ（ｈｕＰＤ１－）およびＣＴＬＬ２－ｈＰＤ－１（ｈｕＰＤ１＋）における免疫複合体または対照分子の活性アッセイである。

【図7】それぞれＰＤ－１－およびＰＤ－１＋のＴ細胞集団（ＣＤ４またはＣＤ８）における免疫複合体または対照分子の活性である。

【図8】それぞれＨＥＫ－Ｂｌｕｅ^ＴＭ ＩＬ－２Ｃｅｌｌｓ（ｈｕＰＤ－１－細胞）および過剰発現したＰＤ－１の細胞（ＨＥＫ２９３＋ｈＩＬ２Ｒ＋ｈＰＤ－１／ＳＥＡＰ安定形質転換細胞株（ｈｕＰＤ－１＋細胞））における免疫複合体の活性を示す。

【図9A】マウス抗腫瘍効果に対する２１３２および２０６３の影響を示し、

【図9B】マウス体重に対する２１３２および２０６３の影響を示す。

【図10A】マウスＭＣ３８腫瘍の抗腫瘍効果に対する２０６３の影響を示し、

【図10B】マウス体重に対する２０６３の影響を示す。

【図11A】マウスＢ１６Ｆ１０腫瘍の抗腫瘍効果に対する２０６３の影響を示し、

【図11B】マウスＢ１６Ｆ１０腫瘍の抗腫瘍効果に対する２０６３の影響－個体の腫瘍値を示し、

【図11C】マウス体重に対する２０６３の影響を示す。

【図12A】マウスＭＣ３８腫瘍の抗腫瘍効果に対する２１４９の影響を示し、

【図12B】マウスＭＣ３８腫瘍の抗腫瘍効果に対する２１４９の影響－生存曲線を示し、

【図12C】マウス体重に対する２１４９の影響を示す。

【図13A】マウスＢ１６Ｆ１０腫瘍の抗腫瘍効果に対する２１４９の影響を示し、

【図13B】マウスＢ１６Ｆ１０腫瘍の抗腫瘍効果に対する２１４９の影響－個体の腫瘍値を示し、

【図13C】マウスＢ１６Ｆ１０腫瘍の抗腫瘍効果に対する２１４９の影響－生存曲線を示し、

【図13D】マウス体重に対する２１４９の影響を示す。

【図14A】マウスＢ１６Ｆ１０腫瘍の抗腫瘍効果に対する２０６１および２１４９の影響－個体の腫瘍値を示し、

【図14B】マウスＢ１６Ｆ１０腫瘍の抗腫瘍効果に対する２０６１および２１４９の影響－生存曲線プロットを示し、

【図14C】マウス体重に対する２０６１および２１４９の影響を示す。

【図15A】マウス抗腫瘍効果に対する２２１４の影響を示し、

【図15B】マウス抗腫瘍効果に対する２２１４の影響－生存曲線を示し、

【図15C】マウス体重に対する２２１４の影響を示す。

【図16A】マウスＢ１６Ｆ１０腫瘍の抗腫瘍効果に対する２２１４の影響を示し、

【図16B】マウスＢ１６Ｆ１０腫瘍の抗腫瘍効果に対する２２１４の影響－生存曲線を示し、

【図16C】マウス体重に対する２２１４の影響を示す。

【発明の詳細な説明】

【0014】

Ｉ．定義
以下、本発明を詳細に説明するに先立ち、本明細書に記載される特定の方法学、形態または試薬が変更され得るため、本発明はそれらに限定されるものではないことが理解すべきである。また、本明細書に使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定しようとは意図せず、本発明の範囲は、特許請求の範囲のみによって限定されると理解すべきである。特に定義のない限り、本明細書に使用される技術・科学用語は、当業者による通常の理解と同じ意味を有する。

【0015】

本明細書を解釈するために次の定義が使用され、また、適切であるならば、単数形で使用される用語には複数形が含まれてもよく、その逆も同様である。本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定するためのものではないと理解しなければならない。

【0016】

用語「約」は、数字または数値とともに使用される場合、下限として指定された数字または数値より５％小さく、上限として指定された数字または数値より５％大きい範囲内の数字または数値をカバーすることを意味する。

【0017】

本明細書で使用されるように、用語「および／または」は、選択可能なオプションのうちのいずれか１つ、または選択可能なオプションの２つもしくは複数を指す。

【0018】

本明細書で使用されるように、用語「包含する」または「含む」は、記載される要素、整数またはステップを含むが、任意の他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。本明細書において、用語「包含する」または「含む」を使用する場合、特記しない限り、言及される要素、整数またはステップからなる場合も含まれる。例えば、ある変異または変異の組み合わせを「包含する」または「含む」ＩＬ－２変異タンパク質に言及する場合、上記変異または変異の組み合わせのみを有するＩＬ－２変異タンパク質を包含することも意図される。

【0019】

本明細書において、野生型「インターロイキン－２」または「ＩＬ－２」とは、本発明の変異または変異の組み合わせを導入するテンプレートとしての親ＩＬ－２タンパク質、好ましくは天然に存在するＩＬ－２タンパク質、例えば、未処理（例えば、シグナルペプチドが除去されていない）の形態および処理済み（例えば、シグナルペプチドが除去された）の形態を含む、ヒト、マウス、ラット、非ヒト霊長類由来の天然ＩＬ－２タンパク質を指す。シグナルペプチドを含む全長の天然ヒトＩＬ－２配列は配列番号１に示され、その成熟タンパク質の配列は配列番号２に示される。なお、この表現には、天然に存在するＩＬ－２対立遺伝子変異体およびスプライス変異体、アイソタイプ、相同体、および種相同体も含まれる。この表現には、天然ＩＬ－２の変異体も含まれ、例えば、上記変異体は、天然ＩＬ－２と少なくとも９５％～９９％もしくはそれ以上の同一性を有してもよく、または１個～１０個以下もしくは１個～５個以下のアミノ酸変異（例えば、保存的置換）を有してもよく、かつ好ましくは、天然ＩＬ－２タンパク質と基本的に同一のＩＬ－２Ｒα結合親和性および／またはＩＬ２Ｒβγ結合親和性を有する。したがって、いくつかの実施形態において、野生型ＩＬ－２は、天然ＩＬ－２タンパク質と比較して、ＩＬ－２受容体へのその結合に影響を及ぼさないアミノ酸変異を含んでもよく、例えば、変異Ｃ１２５Ｓを１２５位に導入した天然ヒトＩＬ－２タンパク質（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ６０５６８）は、本発明の野生型ＩＬ－２に属する。Ｃ１２５Ｓ変異を含む野生型ヒトＩＬ－２タンパク質の実例は配列番号３に示される。いくつかの実施形態において、野生型ＩＬ－２配列は、配列番号１もしくは配列番号２もしくは配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９５％、さらには少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有する。

【0020】

本明細書において、アミノ酸変異は、アミノ酸置換、欠失、挿入および付加であってもよい。置換、欠失、挿入および付加の任意の組み合わせを行うことで、所望の特性（例えば、低減されたＩＬ－２Ｒα結合親和性および／または改善された創薬可能性および／または弱められたＩＬ－２Ｒβγ）を有する最終的な変異タンパク質構築物を得ることができる。アミノ酸の欠失および挿入は、ポリペプチド配列のアミノ基および／またはカルボキシ基末端での欠失および挿入を含むとともに、ポリペプチド配列内での欠失および挿入も含む。例えば、全長ヒトＩＬ－２位置１でアラニン残基を欠失するか、またはＢ’Ｃ’ループ領域で１つまたは複数のアミノ酸を欠失することで、当該ループ領域の長さを短縮することができる。いくつかの実施形態において、好ましいアミノ酸変異は、単一アミノ酸置換の組み合わせまたはアミノ酸配列セグメントの置換など、アミノ酸置換である。例えば、野生型ＩＬ－２のＢ’Ｃ’ループ領域配列の全体または一部を異なる配列（例えば、ＩＬ－１５のＢ’Ｃ’ループ）で置換することができ、好ましくは、長さが短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域配列を得ることができる。

【0021】

本発明において、ＩＬ－２タンパク質またはＩＬ－２配列セグメントにおけるアミノ酸位置に言及する場合、野生型ヒトＩＬ－２タンパク質（ＩＬ－２^ＷＴとも呼ばれる）の配列番号３のアミノ酸配列を参照することによって決定される。配列番号３とのアミノ酸配列アラインメントによって、他のＩＬ－２タンパク質またはポリペプチド（全長配列または切り詰め断片を含む）上の対応するアミノ酸位置を同定することができる。したがって、本発明において、特記しない限り、ＩＬ－２タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸位置は、配列番号３に従って番号付けられるアミノ酸位置である。例えば、「Ｆ４２」に言及する場合は、配列番号３の第４２位のフェニルアラニン残基Ｆ、または他のＩＬ－２ポリペプチド配列上にアラインメントされた対応する位置のアミノ酸残基を指す。同時に、理解と比較を容易にするために、本発明の変異がいくつかの特定のセグメントの部位の切り詰めまたは欠失（例えば、Ｂ’Ｃ’ループ領域の配列、すなわち配列番号３の第７３～８３位の合計１１個のアミノ酸残基）に関する時、特定の変異領域およびその変異方式が与えられた場合、この領域外のアミノ酸残基の番号付けは依然として変更されず、例えば、Ｂ’Ｃ’ループ領域の配列、すなわち、配列番号３の第７３～８３位の合計１１個のアミノ酸残基を７個のアミノ酸残基に切り詰めた後、番号付けにおける８０～８３は割り当てられなくなり、Ｂ’Ｃ’ループ領域のすぐ次のアミノ酸残基の位置番号付けは依然として８４である。アミノ酸位置決定のために実施される配列アラインメントは、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉから得ることができるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを使用して、デフォルトパラメータを用いて行うことができる。

【0022】

本明細書において、ＩＬ－２変異タンパク質に言及する場合、以下のように単一アミノ酸置換を説明する：［元のアミノ酸残基／位置／置換のアミノ酸残基］。例えば、グルタミン酸による位置３５のリジンの置換は、Ｋ３５Ｅと表すことができる。１つの所定の位置（例えば、Ｋ３５位）に複数の選択可能なアミノ酸置換方式（例えば、Ｄ、Ｅ）があり得る場合、当該アミノ酸置換は、Ｋ３５Ｄ／Ｅと表すことができる。対応的に、個々の単一アミノ酸置換は、プラス記号「＋」または「－」によって連結されて、複数の所定の位置での組み合わせ変異を表すことができる。例えば、位置Ｆ４２Ａ、Ｎ８８Ｒ、およびＳ１２７Ｅの組み合わせ変異は、Ｆ４２Ａ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ、またはＦ４２Ａ－Ｎ８８Ｒ－Ｓ１２７Ｅと表すことができる。

【0023】

本明細書において、「配列同一性パーセント」は、比較ウィンドウ内で２つの最適アラインメント配列を比較することによって決定されることができる。好ましくは、配列同一性は、参照配列（例えば、配列番号３）の全長にわたって決定される。比較のための配列アラインメント方法は、当該分野において周知である。配列同一性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムは、例えば、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを含む（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－４０２、１９７７およびＡｌｔｓｃｈｕｌら Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０、１９９０参照）。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）から公的に入手可能である。本願の目的のため、同一性パーセントは、ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉから得ることができるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを使用して、デフォルトパラメータを使用して決定されることができる。

【0024】

本明細書で使用されるように、用語「保存的置換」は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの生物学的機能に悪影響を及ぼさない、または変化させないアミノ酸置換を意味する。例えば、保存的置換は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの当該分野で既知の標準的な技術によって導入されることができる。典型的な保存的アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸に置換することを指す。機能的に類似するアミノ酸の保存的置換表は、当該分野でよく知られているものである。本発明において、保存的置換残基は、以下の保存的置換表Ｘ、特に表Ｘにおける好ましい保存的アミノ酸置換残基に由来する。

【0025】

【表1】

【0026】

例えば、野生型ＩＬ－２タンパク質は、配列番号１～３の１つに対して保存的アミノ酸置換を有してもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有してもよく、かつ１つの好ましい実施形態において、保存的置換は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個の残基など、１０個以下のアミノ酸残基を有する。さらに例えば、本発明の変異ＩＬ－２タンパク質は、本明細書に具体的に示されるＩＬ－２変異タンパク質配列（例えば配列番号４、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、および配列番号３１のいずれか１つ）に対して保存的アミノ酸置換を有してもよく、または保存的アミノ酸置換のみを有してもよく、かつ１つの好ましい実施形態において、保存的置換は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個もしくは１０個の残基など、１０個以下のアミノ酸残基を有する。

【0027】

「親和性」または「結合親和性」は、結合対のメンバー間の相互作用の内部結合能力を反映するために使用することができる。分子Ｘのその結合パートナーＹに対する親和性は、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）によって示されてもよく、平衡解離定数は、解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋ_ｄｉｓとｋ_ｏｎである）との比率である。結合親和性は当該分野で既知の常用方法で測定されてもよい。親和性を測定するための一具体的な方法は、本明細書のＳＰＲ親和性測定技術またはＢＬＩ測定技術である。

【0028】

本明細書において、抗原結合分子は、抗原に特異的に結合し得るポリペプチド分子、例えば免疫グロブリン分子、抗体または抗体断片、例えばＦａｂ断片およびｓｃＦｖ断片である。一実施形態において、本発明の抗原結合分子は、免疫チェックポイント分子に対して抗原とする結合分子、例えば抗体、例えばモノクローナル抗体である。一実施形態において、免疫チェックポイント分子はＰＤ－１もしくはＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２である。

【0029】

本明細書において、抗体Ｆｃ断片とは、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ－末端領域であり、かつ天然配列Ｆｃ断片および変異体Ｆｃ断片を含むことができる。天然配列Ｆｃ断片は、様々なＩｇサブタイプおよびそのアロタイプのＦｃ領域など、天然に存在する様々な免疫グロブリンＦｃ配列を含む（Ｇｅｓｔｕｒ Ｖｉｄａｒｓｓｏｎら、ＩｇＧ ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ ａｎｄ ａｌｌｏｔｙｐｅｓ：ｆｒｏｍ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ、２０ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１４．００５２０．）。一実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ断片は、重鎖のＣｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０からカルボキシ基末端まで延びる。他の実施形態において、Ｆｃ－断片のＣ－末端リジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、存在しなくてもよい。他のいくつかの実施形態において、Ｆｃ断片は変異を含む変異体Ｆｃ断片であり、例えば、Ｌ２３４Ａ－Ｌ２３５Ａ変異を含む。本明細書に特記しない限り、Ｆｃ断片におけるアミノ酸残基の番号付けは、ＥＵ番号付けシステムによるものであり、ＥＵインデックスとも呼ばれ、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ（１９９１）、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１～３２４２に記載される。いくつかの実施形態において、抗体Ｆｃ断片は、Ｎ末端にＩｇＧ１ヒンジ配列またはＩｇＧ１ヒンジ配列の一部、例えばＥＵ番号付けによる配列Ｅ２１６からＴ２２５または配列Ｄ２２１からＴ２２５を有することができる。上記ヒンジ配列に変異が含まれ得る。

【0030】

ＩＬ－２タンパク質は、４つのαヘリックスバンドル（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）構造を有する短鎖Ｉ型サイトカインファミリーのメンバーに属する。本明細書において、用語「Ｂ’Ｃ’Ｌｏｏｐ」または「Ｂ’Ｃ’ループ領域」または「Ｂ’Ｃ’ループ配列」は交換して使用されてもよく、ＩＬ－２タンパク質のＢヘリックスとＣヘリックスとの間の連結配列を指す。ＩＬ－２の結晶構造の分析（例えばＰＤＢ：２ＥＲＪ）により、１つのＩＬ－２タンパク質のＢ’Ｃ’ループ配列を決定することができる。本発明の目的のために、配列番号３の番号付けによれば、当該Ｂ’Ｃ’ループ配列は、ＩＬ－２ポリペプチドにおける位置７２の残基と位置８４の残基を連結する配列を指す。配列番号１、配列番号２および配列番号３の野生型ＩＬ－２タンパク質において、当該連結配列は、Ａ７３－Ｒ８３の合計１１個のアミノ酸を含む。対応的には、本明細書において、用語「短縮されたループ領域」または「短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域」は、野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して、長さが短縮されたＢ’Ｃ’ループ配列を有する変異タンパク質を指し、すなわち、配列番号３の番号付けによると、アミノ酸残基ａａ７２とａａ８４との間の連結配列の長さが短縮されている。「短縮されたループ領域」は、ループ配列の置換または切断によって実現することができる。上記置換または切断は、Ｂ’Ｃ’ループ配列の任意の領域または部分で発生することができる。例えば、置換または切り詰めは、ループ領域Ａ７３－Ｒ８３配列の置換（例えば、ＩＬ－１５のＢ’Ｃループ領域に置換する）または当該配列Ｃ末端の１つもしくは複数のアミノ酸残基からの切り詰めであってもよい。さらに例えば、置換もしくは切り詰めは、ループ領域Ｑ７４－Ｒ８３配列の置換または当該配列Ｃ末端の１つもしくは複数のアミノ酸残基からの切り詰めであってもよい。上記置換または切り詰めの後、必要に応じて、創薬可能性などの変異タンパク質の特性をさらに改善するために、グリコシル化を排除するためのアミノ酸置換などの単一アミノ酸置換、および／または逆変異をさらにループ領域配列に導入することができる。したがって、本明細書において、変異後の短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域は、変異の導入後、位置７２の残基と位置８４の残基との間の配列を連結することにより説明することができる。

【0031】

本明細書において、「ＩＬ－２Ｒα結合界面」変異は、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒα（すなわち、ＣＤ２５）が相互作用するアミノ酸部位で発生する変異を指す。ＩＬ－２およびその受容体複合体の結晶構造（例えばＰＤＢ：１Ｚ９２）を分析することにより、これらの相互作用部位を決定することができる。いくつかの実施形態において、上記変異は、特にＩＬ－２のアミノ酸残基３５～７２領域での変異を指し、特にアミノ酸部位３５、３７、３８、４１、４２、４３、４５、６１、６２、６８、７２での変異を指す。好ましくは、上記変異を導入する前の対応するタンパク質と比較して、上記変異を含むＩＬ－２タンパク質は、低減または排除されたＩＬ－２Ｒα結合を有する。

【0032】

本明細書において、「ＩＬ－２βγ結合界面」変異は、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβγ（すなわち、ＣＤ１２２とＣＤ１３２）が相互作用するアミノ酸部位で発生する変異を指す。ＩＬ－２およびその受容体複合物の結晶構造（例えばＰＤＢ：２ＥＲＪ）を分析することにより、これらの相互作用アミノ酸部位を決定することができる。いくつかの実施形態において、上記変異は、特にＩＬ－２のアミノ酸残基１２～２０、アミノ酸残基８４～９５、およびアミノ酸残基１２６～１３０領域での変異を指し、特にアミノ酸部位１２、１５、１６、１９、２０、８４、８７、８８、９１、９２、９５、１２６、１２７、１３０での変異を指す。好ましくは、上記変異を導入する前の対応するタンパク質と比較して、上記変異を含むＩＬ－２タンパク質は、弱められたＩＬ－２Ｒβγ結合を有する。

【0033】

本明細書において、ＩＬ－２Ｒβγ受容体結合に関しては、ＩＬ－２タンパク質分子の「弱め」は、ＩＬ－２Ｒβγ結合界面に変異を導入することを指し、ここでこの変異の導入前の対応するＩＬ－２タンパク質と比較して、上記変異は、ＩＬ－２Ｒβγ受容体に対する結合親和性の低減をもたらす。さらに好ましくは、対応するタンパク質と比較して、上記弱め分子は、低減されたＴ細胞（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞）および／またはＮＫ細胞を活性化する活性を有する。例えば、上記弱め分子と対応するタンパク質のＴ細胞ｐＳＴＡＴ５シグナルを活性化するＥＣ５０値の比率を検出することにより、減少する倍数は例えば５倍以上、例えば１０倍以上、または５０倍以上、または１００倍以上、またはさらに１０００倍以上に達することができる。例えば、対応するタンパク質と比較して、弱め分子のＴ細胞を活性化する活性は、１０倍～５０倍、または５０倍～１００倍、または１００倍～１０００倍、またはそれ以上の倍数減少することができる。したがって、本発明において、いくつかの実施形態において、本発明の弱め分子は、「弱められ」たＩＬ－２Ｒβγ受容体への結合親和性および「弱められ」たＴ細胞活性化活性を有する。

【0034】

「抗原結合断片」とは、完全な抗体の一部を含むとともに、完全な抗体の結合する抗原と結合する、完全な抗体とは異なる分子を指す。抗体断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２、ｄＡｂ（ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、線状抗体、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、二価抗体またはその断片、あるいはラクダ科抗体を含むが、これらに限定されない。

【0035】

用語「抗原」とは、免疫応答を引き起こす分子を指す。このような免疫応答は、抗体の産生または特異性免疫細胞の活性化に関係し、あるいは両方に関係する可能性がある。当業者であれば、ほぼすべてのタンパク質またはペプチドを含む高分子は、いずれも抗原として利用できると理解される。なお、抗原は、組換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから誘導されてもよい。いくつかの実施形態において、本発明に記載される抗原は腫瘍関連抗原、すなわち腫瘍の発生、発展または進行に関連する抗原、例えばＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２である。

【0036】

「相補性決定領域」、「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」は、抗体可変ドメインにおいて、配列において超可変であるとともに構造上に形成されて決定されたループ（「超可変ループ」）であり、および／または抗原接触残基（「抗原接触点」）を含む領域である。ＣＤＲは、主に抗原エピトープに結合する役割を果たす。重鎖および軽鎖のＣＤＲは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ－末端から順に番号付けられる。抗体の重鎖可変ドメインにあるＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と呼ばれ、抗体の軽鎖可変ドメインにあるＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる。１つの所定の軽鎖可変領域または重鎖可変領域のアミノ酸配列において、各ＣＤＲの精確なアミノ酸配列の境界は、多くの公知の抗体ＣＤＲ割り当てシステムのいずれか１種またはその組み合わせにより決定されることができ、上記割り当てシステムは、例えば、抗体の３次元構造とＣＤＲループのトポロジーに基づくＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａら．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７～８８３、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉら、「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２７３、９２７～９４８（１９９７））、抗体配列の可変性に基づくＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、４ｔｈ Ｅｄ．、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））、ＡｂＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｔｈ）、Ｃｏｎｔａｃｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）（ワールドワイドウェブのｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／にて利用可能）、および大量の結晶構造が利用されるアフィニティ伝播クラスタリング（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に基づくＮｏｒｔｈ ＣＤＲ定義を含む。

【0037】

例えば、異なるＣＤＲの決定方案によって、それぞれのＣＤＲの残基は、以下のとおりである。

【0038】

【表2】

【0039】

ＣＤＲは、参照ＣＤＲの配列（例えば、本発明の例示的なＣＤＲのいずれか１つ）と同じＫａｂａｔ番号付け位置を有することで決定されてもよい。

【0040】

特記しない限り、本発明において、用語「ＣＤＲ」または「ＣＤＲ配列」は、上記いずれか１つの方法で決定されるＣＤＲ配列を含む。

【0041】

特記しない限り、本発明において、抗体可変領域における残基位置（重鎖可変領域残基と軽鎖可変領域残基を含む）に言及する場合、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１））に基づく番号付け位置を指す。

【0042】

一実施形態において、本発明抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域ＣＤＲは、Ｎｏｒｔｈ番号付け方案に基づいて定義されるＣＤＲ配列である。

【0043】

本明細書で使用される用語「リンカー」は、融合タンパク質の異なる部分に直接連結可能な任意の分子を指す。融合タンパク質の異なる部分の間で共有結合を確立するリンカーの例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレンまたはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体を含むが、これらに限定されないペプチドリンカーおよび非タンパク質ポリマーが含まれる。本発明による用語「ペプチドリンカー」は、融合タンパク質の第１の部分のアミノ酸配列を融合タンパク質の第２の部分に連結するアミノ酸の配列を指す。例えば、ペプチドリンカーは、融合タンパク質のＩＬ－２部分をＦｃドメインまたはその断片に連結することができる。例えば、ペプチドリンカーは、抗体重鎖のＣ末端をＩＬ－２に連結するなど、抗体をＩＬ－２に連結することもできる。好ましくは、上記ペプチドリンカーは、所望の活性を妨害せずに、それらが互いに対してコンフォメーションを維持するように、２つの実体を連結するのに十分な長さを有する。ペプチドリンカーは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、ＡｌａもしくはＴｈｒというアミノ酸残基を主に含んでもよいが、主に含まなくてもよい。有用なリンカーには、例えば（ＧＳ）_ｎ、（ＧＳＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ、（ＧＧＧＳ）_ｎおよび（ＧＧＧＧＳ）_ｎＧを含むグリシン－セリンポリマーが含まれ、ここで、ｎは少なくとも１（かつ好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０）の整数である。有用なリンカーには、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマーおよび他のフレキシブルリンカーがさらに含まれる。好ましくは、本発明のリンカーは（ＧＧＧＧＳ）_ｎであり、ここで、ｎ＝１、２、３、４もしくは５であり、好ましくは２である。好ましくは、本発明のリンカーは配列番号５である。

【0044】

「ＩｇＧ形態の抗体」は、抗体の重鎖定常領域の属するＩｇＧ形態を指す。すべての同じタイプの抗体は、その重鎖定常領域がいずれも同じであり、異なるタイプの抗体は、その重鎖定常領域が異なる。例えば、ＩｇＧ４形態の抗体は、その重鎖定常領域がＩｇＧ４由来のものであることを指し、またはＩｇＧ１形態の抗体は、その重鎖定常領域がＩｇＧ１由来のものであることを指す。

【0045】

「ヒト化」抗体は、非ヒトＣＤＲからのアミノ酸残基とヒトＦＲからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、ほぼすべての可変ドメインの少なくとも１つ、一般的に２つを含み、ここで、すべてまたはほぼすべてのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ）は、非ヒト抗体に由来する部分に対応し、かつすべてまたはほぼすべてのＦＲは、ヒト抗体に由来する部分に対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化形態」は、ヒト化が行われた抗体を指す。

【0046】

「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」または「完全ヒト化抗体」は、交換して使用されてもよく、ヒトまたはヒト細胞から生成され、または非ヒト由来のものから由来し、ヒト抗体ライブラリーや他のヒト抗体で配列がコードされた抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体についての当該定義には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が明確に除外されている。

【0047】

本発明の免疫複合体における抗体部分は、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはキメラ抗体であってもよい。

【0048】

本明細書で使用される用語「融合物」は、２つまたは複数の最初別々のタンパク質／遺伝子／化合物を連結することによって形成される融合物を指す。融合物を構成する実体がタンパク質である場合、融合タンパク質と呼ばれる。融合タンパク質は、本願の融合物の範囲内に含まれる。例えば、ＩＬ－２とＦｃ二量体との連結は、ＩＬ－２融合タンパク質を構成してもよい。融合物を構成する２つの実体の間の連結は、リンカーを介して達成されてもされなくてもよい。

【0049】

本明細書で使用される用語「免疫複合体」とは、少なくとも１つのＩＬ－２分子および少なくとも１つの抗体または抗体断片を含むポリペプチド分子を指す。本明細書に記載されるように、ＩＬ－２分子は、様々な相互作用および様々な構造により抗体に連結されてもよい。例えば、ＩＬ－２とＦｃの融合タンパク質、および重鎖と軽鎖を含む抗体分子の断片は、二量体化を通じて免疫複合体を構成してもよい。好ましくは、本発明の免疫複合体は、図１Ａに示される構造、またはＩＬ－２部分とＰＤ－１抗体部分が入れ替わった図１Ａに示される構造を有する。

【0050】

本明細書で使用されるような用語「第１の」および「第２の」は、Ｆｃドメインまたはモノマーなどに関して、各タイプのモジュールが２つ以上ある場合の区別を容易にするために使用される。そのように明示的に記載されていない限り、これらの用語の使用は、免疫複合体に特定の順序や配向を付与することを意図していない。

【0051】

本明細書に記載の用語「治療剤」は、癌などの腫瘍の治療または予防に有効ないずれの物質も含み、化学療法剤、サイトカイン、血管新生抑制剤、細胞傷害剤、他の抗体、低分子薬物、または免疫調節剤（例えば、免疫抑制剤）を含む。

【0052】

用語「有効量」とは、本発明の抗体もしくは断片または組成物または組み合わせの１回分または複数回分の量を患者に投与した後、治療または予防が必要な患者に所望の効果が得られるという量または投与量を指す。「有効量」には、「治療有効量」または「予防有効量」が含まれてもよい。

【0053】

「治療有効量」とは、必要な期間にわたって必要な用量で所望の治療結果を効果的に実現するための量を指す。治療有効量は、抗体もしくは抗体断片または組成物または組み合わせのいずれの毒性または有害作用も治療による有益な作用に及ばないという量でもある。未治療の対象と比較して、「治療有効量」は、好ましくは、測定可能なパラメータ（例えば腫瘍体積）を少なくとも約４０％、さらに、より好ましくは少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％ひいては１００％抑制する。「予防有効量」とは、必要な期間にわたって必要な用量で所望の予防結果を効果的に実現するための量を指す。一般的に、予防目的の用量が対象における疾患の初期段階より前にまたは疾患の初期段階に適用されるため、予防有効量は治療有効量を下回る。

【0054】

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」は、交換して使用されてもよく、外因性核酸が導入された細胞を指し、この細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」と「形質転換細胞」を含み、初代形質転換細胞および継代数に関係なくそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸の内容において親細胞とは全く同じではない可能性があり、変異を含んでもよい。本明細書では、初代形質転換細胞からスクリーニングまたは選択された同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫を含む。

【0055】

本明細書で使用される用語「標識」とは、試薬（例えば、ポリヌクレオチドプローブもしくは抗体）に直接的または間接的に結合または融合され、かつ、その結合または融合の対象試薬による検出を促進する化合物または組成物を指す。標識は、それ自体が検出可能（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）であるか、または、酵素触媒によって標識される場合に、検出可能な基質化合物または組成物の化学的改変に触媒作用を及ぼすことができる。当該用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体にカップリング（すなわち、物理的連結）することによってプローブもしくは抗体を直接標識すること、および、直接標識されている別の試薬との反応によりプローブもしくは抗体を間接的に標識することを含もうとする。

【0056】

「個体」または「対象」は、哺乳動物を含む。哺乳動物は、家畜（例えば、ウシ、ヤギ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類動物（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類動物）、ウサギ、およびげっ歯類動物（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、個体または対象はヒトである。

【0057】

用語「抗腫瘍作用」とは、さまざまな手段により表示できる生物学的効果であり、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の低減または腫瘍細胞の生存率の減少を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗腫瘍効果は、対象の体重を減少させない抗腫瘍効果にも関する。

【0058】

用語「腫瘍」および「癌」は、本明細書において交換して使用され、固形腫瘍および血液腫瘍を含む。

【0059】

用語「癌」とは、無秩序な細胞成長を典型的に特徴とする哺乳動物の生理学的疾患を指すか、または説明する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体による治療に適する癌は、癌の転移性形態を含む固形腫瘍または血液腫瘍などを含む。用語「腫瘍」とは、悪性か良性かを問わず、すべての腫瘍性（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）の細胞の成長と増殖、およびすべての前癌性（ｐｒｅ－ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）と癌性の細胞や組織を指す。用語「癌」、「癌性」および「腫瘍」は、本明細書で言及される場合、互いに排他的ではない。

【0060】

用語「薬用補助材料」は、活性物質とともに投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全もしくは不完全））、賦形剤、ベクターや安定化剤などを指す。

【0061】

用語「医薬組成物」とは、それに含まれる活性成分の生物学的活性を有効にする形態で存在するとともに、上記組成物が投与された対象に許容されない毒性がある別の成分を含まない組成物を指す。

【0062】

用語「薬物組み合わせまたは組み合わせ製品」とは、非固定組み合わせ製品または固定組み合わせ製品を指し、薬物キット、医薬組成物を含むが、これらに限定されない。用語「非固定組み合わせ」とは、活性成分（例えば、（ｉ）本発明の変異タンパク質または融合物、および（ｉｉ）他の治療剤）が、別個の実体で同時に、特定の時間制限なしに、または同じもしくは異なる時間間隔で、患者に順に投与されるものを指し、ここで、このような投与は、患者の体内において予防的または治療的に有効なレベルの２つ以上の活性剤を提供する。用語「固定組み合わせ」とは、２つ以上の活性剤が単一実体の形態で同時に患者に投与されるものを指す。好ましくは、２つ以上の活性剤の用量かつ／または時間間隔を選択することにより、各成分の併用が疾患または病症の治療において、いずれか１つの成分を単独で使用する場合よりもよい効果を達成することができる。各成分はそれぞれ、単独の製剤形態であってもよく、その製剤形態は同じであってもよく、異なってもよい。

【0063】

用語「組み合わせ療法」とは、２つ以上の治療剤または治療形態（例えば、放射線治療や手術）を投与することにより、本明細書に記載の疾患を治療するものを指す。そのような投与は、ほぼ同時に、例えば、一定の割合の活性成分を有する単一のカプセルで、これらの治療剤を共投与することを含む。または、このような投与は、複数または別個の容器（例えば、錠剤、カプセル、粉末および液体）での各有効成分の共投与を含む。粉末および／または液体は、投与前に所望の用量に再構成または希釈することができる。なお、このような投与は、各タイプの治療剤を実質的に同じ時間、または異なる時間で順番によって使用することを含む。いずれの場合においても、治療プログラムは、本明細書に記載の病症または病状の治療における医薬組み合わせの有益な効果を提供する。

【0064】

本明細書で使用される場合、「治療」とは、存在している症状、病症、病状または疾患の進行もしくは重症度を軽減、中断、遅延、寛解、停止、低減、または逆転することを指す。

【0065】

本明細書で使用される場合、「予防」は、疾患、病症、または特定の疾患もしくは病症に係る症状の発生または進行に対する阻害を含む。いくつかの実施形態において、癌の家族歴がある対象は、予防プログラムの候補である。一般的に、癌の背景では、用語「予防」とは、癌にかかる病徴または症状が生じる前に、特に、癌に罹患するリスクのある対象に癌が生じる前の医薬投与を指す。

【0066】

用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、それに連結された別の核酸を増殖可能な核酸分子を指す。当該用語は、自己複製の核酸構造であるベクター、およびそれが導入された宿主細胞のゲノムに結合されたベクターを含む。一部のベクターは、それに操作可能に連結された核酸の発現をガイドすることができる。かかるベクターは本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。

【0067】

「対象／患者／個体試料」とは、患者または対象から得た細胞または流体の集まりを指す。組織または細胞試料の由来としては、新鮮な、冷凍されたおよび／または保存された器官や組織試料や生検試料や穿刺試料などの固形組織、血液もしくは任意の血液成分、脳脊髄液、羊膜液（羊水）、腹膜液（腹水）や間質液などの体液、対象における妊娠もしくは発育の任意段階に由来する細胞であってもよい。組織試料は、自然界において天然に組織と混ぜ合わせない化合物、例えば、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質などを含んでもよい。

ＩＩ．本発明のＩＬ－２変異タンパク質
本発明のＩＬ－２変異タンパク質の有利な生物学的特性
本発明者らは、長期の研究を通じて、以下の分子変異および改造を次のように実施し、または上記変異および改造のうちの１つまたは複数を組み合わせて、ＩＬ－２の薬効を同時に改善し、ＩＬ－２の毒性と副作用を低減し、および良好な生産性能を達成することができることを発見した。

【0068】

（ｉ）ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβγ受容体の結合界面に特定の残基変異を導入し、ＩＬ－２Ｒβγ受容体との結合を弱め、ＩＬ－２の活性をある程度ダウンレギュレートする。ＩＬ－２Ｒβγ受容体結合を弱めるこのような変異を含むことにより、本発明のＩＬ－２変異タンパク質はリンパ球を活性化して腫瘍を殺傷すると同時に、リンパ球の過剰な活性化によって引き起こされる大量の炎症性因子の放出、およびそれによってもたらした薬物関連毒性を回避することができる。なお、当該弱める変異は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質の、リンパ球に広く存在するＩＬ－２受容体との結合親和性を低減することにより、ＩＬ－２受容体によって媒介されるＩＬ－２変異タンパク質のクリアランスを減少させ、ＩＬ－２変異タンパク質の作用持続時間を遅延することができる。

【0069】

（ｉｉ）本発明の変異ＩＬ－２タンパク質をＩＬ－２－Ｆｃ二量体に構築する。当該二量体の形成は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質の分子量を増加させ、腎クリアランスを大幅に減少させ、かつインビボでのＦｃＲｎ媒介のリサイクルを通じて、ＩＬ２－Ｆｃ融合タンパク質の半減期をさらに延長することができる。それにより、ＩＬ－２の短い半減期および高頻度と高用量の投与によって引き起こされる高いピーク血中濃度の問題を克服する。

【0070】

（ｉｉｉ）ＩＬ－２のＢ’Ｃ’ｌｏｏｐ構造を改造し、例えば、それぞれＩＬ－１５分子のｌｏｏｐで置換するまたはＩＬ－２分子Ｂ’Ｃ’ｌｏｏｐを切り詰める。当該Ｂ’Ｃ’ループ変異は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質におけるＢ’Ｃ’ｌｏｏｐ構造の安定性を顕著に増強し、顕著に向上した発現量と純度などの、ＩＬ－２変異タンパク質およびそれによって構築されるＩＬ－２－Ｆｃ二量体分子の生産性能を顕著に向上させることができる。

【0071】

（ｉｖ）野生型ＩＬ－２と実質的に同等のＩＬ－２Ｒα結合活性を保持する。あるいは、（ｖ）ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒα受容体の結合界面での１つまたは複数の特定の変異をさらに組み合わせて、ＩＬ－２変異タンパク質のＩＬ－２Ｒαへの結合性能を変化させることができる。また、本発明者らは、本発明の変異タンパク質において、上記優れた特性を維持すると同時に、抗腫瘍または自己免疫疾患の治療などの多くの側面におけるＩＬ－２の異なる薬物形成要件を満たすために、必要に応じて、ＩＬ－２変異タンパク質のＩＬ－２Ｒαとの結合活性を調節することもでき、それにより、本発明の変異タンパク質に優れた薬力学的特性をさらに付与することを見出した。

【0072】

それにより、本発明のＩＬ２－Ｆｃシリーズ分子は、配列を改造することにより、その受容体ＩＬ２Ｒβ／γへの結合親和性を弱め、より優れた薬物動態学実験結果および薬効結果を達成する一方で、タンパク質の発現量と純度などの創薬可能性の面で顕著に向上する。

【0073】

したがって、本発明は、改善された創薬可能性および改善されたＩＬ－２受容体結合特性を有するＩＬ－２変異タンパク質を提供する。本発明のＩＬ－２変異タンパク質を含むＩＬ－２－Ｆｃ分子は、リンパ球の強力な刺激によって引き起こされる炎症性因子の過剰な放出を効果的に回避することができ、より安定して長時間作用する薬物動態特性を有する。したがって、比較的低い単回投与量によって、Ｃｍａｘが高すぎることによる薬物関連毒性を回避するのに十分に高いヒト薬物曝露量を達成することができる。なお、より有意義なことに、本発明の長時間作用型ＩＬ－２－Ｆｃ分子は、天然ＩＬ－２と比較して弱められたリンパ球免疫刺激活性を有するが、薬物動態特性が顕著に改善されるため、本発明の分子のインビボ有効薬物濃度の持続時間がより長く、リンパ球に対する比較的長時間の連続刺激を発揮し、天然ＩＬ－２分子と同等であるか、またはそれよりも優れた薬力学的効果を達成し、動物において、より優れた抗腫瘍効果と耐性を達成することができる。

【0074】

なお、本発明の有利な生物学的特性を有する変異ＩＬ－２タンパク質はさらに、抗原結合分子（例えば、抗体またはその断片）と免疫複合体を形成してもよく、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を活性化するとともに増殖させると同時に、抗原結合分子の免疫または免疫療法効果を増強する。

【0075】

改善された創薬可能性
いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、改善された創薬可能性を有し、例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞で発現される場合、特にＦｃ融合タンパク質で発現される場合、以下から選択される１項または複数項の特性を有する。（ｉ）野生型ＩＬ－２タンパク質より優れた発現量、および（ｉｉ）より高いタンパク質の純度に精製されやすいこと。

【0076】

本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して発現レベルの増加を示す。本発明のいくつかの実施形態において、増加する発現は哺乳動物細胞発現系で起こる。発現レベルは、細胞培養上清（好ましくはワンステップアフィニティークロマトグラフィー精製後の上清）中の組換えＩＬ－２タンパク質の量を定量的または半定量的に分析することを可能にする任意の適切な方法によって測定することができる。例えば、試料中の組換えＩＬ－２タンパク質の量は、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって評価することができる。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、哺乳動物細胞における発現量が少なくとも１．１倍、または少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍、３倍もしくは４倍以上、または少なくとも５、６、７、８もしくは９倍、またはさらに約１０、１５、２０、２５、３０および３５倍など、１０倍以上増加する。

【0077】

いくつかの実施形態において、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー後の精製タンパク質の純度を測定することによって示されるように、本発明のＩＬ－２変異タンパク質－Ｆｃ融合体は、野生型ＩＬ－２タンパク質融合体と比較して、より高い純度を示す。いくつかの実施形態において、タンパク質の純度は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ技術によって検出される。いくつかの好ましい実施形態において、ワンステップタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー精製後、本発明のＩＬ－２変異タンパク質－Ｆｃ融合体の純度は、７０％、または８０％、または９０％以上、好ましくは９２％、９３％、９４％、９５％、９８％もしくは９９％以上に達することができる。

【0078】

いくつかの実施形態において、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー後の精製タンパク質の純度を測定することによって示されるように、本発明のＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質は、野生型ＩＬ－２タンパク質によって形成された対応するＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質と比較して、より高い純度を示す。いくつかの実施形態において、タンパク質の純度は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ技術によって検出される。いくつかの好ましい実施形態において、ワンステップタンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー精製後、本発明のＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質の純度は、７０％、または８０％、または９０％以上、好ましくは９２％、９３％、９４％、９５％、９８％もしくは９９％以上に達することができる。

【0079】

弱められたＩＬ－２βγ受容体結合性
ＩＬ－２Ｒβγ結合界面に変異を導入することにより、いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、上記変異を導入する前の対応するタンパク質と比較して、弱められたＩＬ－２βγ結合親和性を有する。

【0080】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異を導入して弱める前と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβおよび／またはＩＬ－２Ｒβγ受容体への結合親和性が低減する。いくつかの実施形態において、弱める前と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβ受容体への結合親和性が低減し、例えば、いくつかの実施形態におけるＩＬ－２Ｒβ受容体への結合の除去を含めて、１倍～２０倍またはそれ以上低減する。いくつかの実施形態において、弱める前と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβγ受容体への結合親和性が低減し、例えば１倍～１００倍またはそれ以上低減する。いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２Ｒβ受容体と結合しないが、それでもＩＬ－２Ｒβγ受容体と結合することができ、好ましくは、上記ＩＬ－２Ｒβγ受容体との結合は、弱める前と比較して、例えば、約２０倍～８０倍など、１倍～１００倍低減することができる。ＳＰＲ親和性測定技術により、Ｆｃ断片と融合された本発明のＩＬ－２変異タンパク質またはその二量体分子などの本発明のＩＬ－２変異タンパク質と受容体ＩＬ－２ＲβまたはＩＬ－２Ｒβγ受容体の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定することで、結合親和性を決定することができる。

【0081】

ＩＬ－２Ｒβγ結合界面に変異を導入することにより、いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、上記変異を導入する前の対応するタンパク質と比較して、弱められたＩＬ－２活性、例えば、以下の少なくとも１項から選択されるＩＬ－２活性を有する。

【0082】

－弱める前と比較して、Ｔ細胞（例えばＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞、例えばＣＤ４＋／ＣＤ８＋ＣＤ２５－Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞）に対する活性化の低減、
－弱める前と比較して、ＮＫ細胞に対する活性化の低減、
－弱める前と比較して、ＩＬ－２によって刺激されるＴ細胞／ＮＫ細胞の炎症性因子の放出の低減。

【0083】

一実施形態において、弱める前と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２により媒介されるリンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）の活性化および／または増殖の低下をもたらす。一実施形態において、リンパ球は、ＣＤ２５^－Ｔ細胞などのＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞である。一実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化するＩＬ－２変異タンパク質の能力は、ＩＬ－２変異タンパク質によるＴ細胞またはＮＫ細胞などのリンパ球におけるＳＴＡＴ５リン酸化シグナルの活性化を検出することによって同定される。例えば、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）は、本出願の実施例に記載されるように、フローサイトメトリーによって細胞中のＳＴＡＴ５リン酸化を分析することによって決定されることができる。例えば、上記の本発明のＩＬ－２弱め分子と対応するタンパク質の、Ｔ細胞のＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化するＥＣ５０値の比率を検出することにより、本発明のＩＬ－２変異分子は「弱められ」たＴ細胞活性化活性を有する。当該比率に基づき、本発明のＩＬ－２変異分子のＴ細胞活性化活性は、例えば５倍以上、例えば１０倍以上、または５０倍以上、または１００倍以上、またはさらに１０００倍以上減少することができる。例えば、対応するタンパク質と比較して、本発明のＩＬ－２変異分子のＴ細胞活性化活性は、１０倍～５０倍、または５０倍～１００倍、または１００倍～１０００倍、またはそれ以上の倍数減少することができる。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、低減された細胞表面ＩＬ－２受容体により媒介されるＩＬ－２のクリアランスを有し、増加したインビボ半減期を示す。

【0084】

いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、低減されたＩＬ－２およびその受容体により媒介されるインビボ毒性を有する。

【0085】

維持または変化した（好ましくは弱められた）ＩＬ－２Ｒα受容体結合
ＩＬ－２タンパク質は、ＩＬ－２受容体と相互作用することによってシグナル伝達を開始し、機能を発揮する。野生型ＩＬ－２は、異なるＩＬ－２受容体に対して異なる親和性を示す。野生型ＩＬ－２との親和性が低いＩＬ－２βおよびγ受容体は、静止エフェクター細胞（ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む）上で発現される。野生型ＩＬ－２との親和性が高いＩＬ－２Ｒαは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）細胞および活性化エフェクター細胞上で発現される。高い親和性のために、野生型ＩＬ－２は、細胞表面のＩＬ－２Ｒαに優先的に結合し、さらにＩＬ－２Ｒβγを動員し、ＩＬ－２Ｒβγを介して下流のｐ－ＳＴＡＴ５シグナルを放出し、Ｔｒｅｇ細胞および活性化エフェクター細胞を刺激する。理論に束縛されることなく、ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒα受容体に対する親和性を変化させると、ＣＤ２５^＋細胞を優先的に活性化するＩＬ－２の偏向性を変化させ、ＩＬ－２により媒介されるＴｒｅｇ細胞の免疫ダウンレギュレート作用を変化させる。

【0086】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、維持または変化したＩＬ－２Ｒα受容体結合能力を有する。

【0087】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合が維持される。本明細書において、「ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合の維持」という表現は、ＩＬ－２変異タンパク質が野生型ＩＬ－２タンパク質と比較してＩＬ－２Ｒα受容体と同等の結合活性を有することを指す。好ましくは、「同等の結合活性」は、同じ測定方法によって測定する場合、ＩＬ－２変異タンパク質と野生型ＩＬ－２タンパク質との結合活性の値（例えば結合親和性Ｋ_Ｄ）の間の比率が１：２０～２０：１の間にあり、好ましくは、１：１０～１０：１の間にある。好ましくは、ＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を有さない。

【0088】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、弱めＩＬ－２変異分子であり、かつＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合が維持される。さらなるいくつかの実施形態において、本発明の弱めＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を有さない。好ましくは、上記弱めＩＬ－２変異分子は、改善されたＴｒｅｇ選択性および／または改善されたＮＫ細胞（例えば、ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞）選択性を有する。一実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、リンパ球に対するＩＬ－２変異タンパク質の選択性は、ＩＬ－２変異タンパク質によるＴｒｅｇ細胞、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞など、異なるリンパ球におけるＳＴＡＴ５リン酸化シグナルの活性化を検出することによって同定される。一実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、ＩＬ－２変異タンパク質の選択性は、他のリンパ球を実質的に活性化することなく、特定（１種または複数種）のリンパ球を選択的に活性化するＩＬ－２変異タンパク質用量ウィンドウによって反映することができる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の弱めＩＬ－２変異タンパク質は、ＣＤ２５^{－／ｌｏｗ}ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋エフェクターＴリンパ球などのエフェクターＴ細胞と比較して、改善されたＴｒｅｇ選択性および／または改善されたＮＫ細胞（ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞）選択性を示すことができる。さらなるいくつかの実施形態において、改善された選択性は、ＩＬ－２変異タンパク質の低い薬物関連毒性によって反映することができる。

【0089】

他のいくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２変異タンパク質がＩＬ－２Ｒα受容体結合を低減または排除するＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を導入する。

【0090】

さらなるいくつかの実施形態において、本発明の当該ＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＣＤ２５^＋細胞を優先的に活性化するＩＬ－２の偏向性を低減する。さらなるいくつかの実施形態において、本発明の当該ＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２により媒介されるＴｒｅｇ細胞の免疫ダウンレギュレート作用を低減する。

【0091】

他のいくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、免疫ダウンレギュレート作用を有する。さらなるいくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、自己免疫疾患の治療に使用することができる。

【0092】

したがって、いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、例えば、以下の１項または複数項から選択される改善された特性を有する。

【0093】

－野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒ受容体（ＩＬ－２Ｒαβγ、ＩＬ－２Ｒαおよび／またはＩＬ２Ｒαβγ）に対する結合親和性の維持または変化（例えば、低減または増加、好ましくは低減）、
－野生型ＩＬ－２と比較して、ＣＤ２５＋細胞（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞とＴｒｅｇ細胞）に対する活性化の維持または変化（例えば、低減または増加）、
－野生型ＩＬ－２と比較して、ＣＤ２５＋細胞（例えばＴｒｅｇ細胞）を優先的に活性化するＩＬ－２の偏向性の維持または変化（例えば、除去もしくは低減、または増加）、
－野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２により誘導されるＴｒｅｇ細胞による免疫反応のダウンレギュレート作用の維持または変化（例えば、低減または増加）。

【0094】

いくつかの実施形態において、野生型ＩＬ－２（例えば、配列番号１または配列番号３に示されるＩＬ－２^ＷＴ）と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合親和性が少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも２５倍、特に少なくとも３０倍、５０倍もしくは１００倍以上低減した。好ましい実施形態において、本発明の変異タンパク質はＩＬ－２受容体αに結合しない。ＳＰＲ親和性測定技術により、Ｆｃ断片と融合された本発明のＩＬ－２変異タンパク質またはその二量体分子などの本発明のＩＬ－２変異タンパク質と受容体ＩＬ－２Ｒα受容体の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を測定することで、結合親和性を決定することができる。

【0095】

一実施形態において、野生型ＩＬ－２と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ－２により媒介されるＣＤ２５^＋細胞の活性化および／または増殖の低下をもたらす。一実施形態において、ＣＤ２５^＋細胞はＣＤ２５^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。別の実施形態において、ＣＤ２５^＋細胞はＴｒｅｇ細胞である。一実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、ＣＤ２５^＋細胞を活性化するＩＬ－２変異タンパク質の能力は、ＩＬ－２変異タンパク質によるＣＤ２５^＋細胞におけるＳＴＡＴ５リン酸化シグナルの活性化を検出することによって同定される。例えば、最大半量有効濃度（ＥＣ５０）は、本出願の実施例に記載されるように、フローサイトメトリーによって細胞中のＳＴＡＴ５リン酸化を分析することによって決定されることができる。

【0096】

一実施形態において、野生型ＩＬ－２と比較して、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＣＤ２５^＋細胞を優先的に活性化するＩＬ－２の偏向性を除去または低減する。一実施形態において、ＣＤ２５^＋細胞はＣＤ２５^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。別の実施形態において、ＣＤ２５^＋細胞はＴｒｅｇ細胞である。一実施形態において、ＳＴＡＴ５リン酸化測定試験において、ＣＤ２５^－細胞を活性化するＩＬ－２変異タンパク質の能力は、それぞれＣＤ２５^－細胞およびＣＤ２５^＋細胞においてＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化するＩＬ－２変異タンパク質のＥＣ５０値を検出することによって同定される。例えば、ＣＤ２５^＋細胞に対するＩＬ－２変異タンパク質の活性化偏向性は、ＣＤ２５^－およびＣＤ２５^＋Ｔ細胞でＳＴＡＴ５リン酸化シグナルを活性化するＥＣ５０値の比率を計算することによって決定される。好ましくは、野生型タンパク質と比較して、ＣＤ２５^＋に対する変異タンパク質の偏向性は、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍、１５０倍、２００倍、３００倍またはそれ以上低減した。

【0097】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０８１８４０に示される変異タンパク質の特性を有し、上記特許はその全体が本明細書に組み込まれる。

本発明の変異タンパク質
一態様において、本発明は、野生型ＩＬ－２（好ましくはヒトＩＬ－２で、より好ましくは配列番号３配列を含むＩＬ－２）と比較して、以下の変異を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。

【0098】

（ｉ）ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒα結合界面において、特に位置３５および／または４２に、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合親和性を排除または低減する変異、
かつ／または
（ｉｉ）ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβγ結合界面において、特に位置８８、１２７および／または１３０から選択される少なくとも１つの位置に、ＩＬ－２Ｒβγ受容体に対する結合を弱める／低減する変異、
および
（ｉｉｉ）短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域（すなわち、アミノ酸残基ａａ７２とａａ８４を連結する配列）であって、好ましくは、上記短縮されたループ領域は１０個、９個、８個、７個、６個、または５個未満のアミノ酸長を有し、かつ好ましくは７個のアミノ酸長であり、好ましくは、上記短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域はタンパク質の発現量および／または純度の改善をもたらし、
ここで、アミノ酸の位置は配列番号３に従って番号付けられる。

【0099】

一実施形態において、上記変異タンパク質は、変異（ｉ）と（ｉｉｉ）を含むか、または変異（ｉｉ）と（ｉｉｉ）を含むか、または（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）を含む。

【0100】

ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異
本発明の変異タンパク質に適用されるＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異は、本発明の他の変異と組み合わせるとともに、ＩＬ－２Ｒβγ結合親和性の弱めもしくは低減および／またはリンパ球（例えばＴ細胞／ＮＫ細胞）を活性化する活性の弱めをもたらすことができる任意の変異であってもよい。

【0101】

このような変異の例は、ＩＬ－２とＩＬ－２Ｒβγ結合界面において、特に位置８８、１２７および１３０から選択される少なくとも１つの位置に、ＩＬ－２Ｒβγ受容体結合の弱めまたは低減をもたらす変異を含むが、これらに限定されない。

【0102】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異は、以下の変異の１つもしくは複数または以下の変異の組み合わせを含む。

【0103】

Ｎ８８Ｄ、Ｎ８８Ｒ、Ｓ１２７Ｅ、Ｓ１３０Ｒ、Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１３０ＲおよびＮ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ。

【0104】

他のいくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異を含む本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、弱められたかまたは低減したＩＬ－２Ｒβγ結合を有し、例えば、ＳＰＲ親和性測定による弱められたかまたは低減したＩＬ－２Ｒβγ結合親和性を有する。

【0105】

Ｂ’Ｃ’ループ領域の変異
一態様において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、Ｂ’Ｃ’ループ領域の変異を含み、好ましくは上記変異はＢ’Ｃ’ループ領域の安定性の向上をもたらし、より好ましくは、上記変異は本発明のＩＬ－２変異タンパク質が増加された発現量および／または純度など、改善された創薬可能性を有することをもたらす。

【0106】

いくつかの実施形態において、導入された変異は、野生型ＩＬ－２（好ましくはヒトＩＬ－２、より好ましくは配列番号３配列を含むＩＬ－２）と比較して、変異タンパク質が短縮されたＢ’Ｃ’ループ領域（すなわち、アミノ酸残基ａａ７２とａａ８４との間の連結配列長が短縮された）を含むことをもたらす。

【0107】

好ましくは、上記短縮されたループ領域は、１０個、９個、８個、７個、６個または５個未満のアミノ酸長を有し、かつ好ましくは７個のアミノ酸長であり、ここで、アミノ酸残基は配列番号３に従って番号付けられる。

【0108】

本明細書において、本発明に適用されるＢ’Ｃ’ループ領域の変異はＢ’Ｃ’ループ領域の切り詰めおよび置換を含む。一実施形態において、上記変異は、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７３～ａａ８３の切り詰め（例えば、Ｂ’Ｃ’ループ領域の１、２、３、もしくは４個のアミノ酸の切り詰め）または置換を含み、例えば、Ａ（Ｑ／Ｇ）ＳＫＮ（Ｆ／Ｉ）Ｈに切り詰め、好ましくはＡＱＳＫＮＦＨに切り詰め、またはＳＧＤＡＳＩＨに置換する。他の実施形態において、上記変異は、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７４～ａａ８３の切り詰めまたは置換を含み、例えば、（Ｑ／Ｇ）ＳＫＮ（Ｆ／Ｉ）Ｈに切り詰め、またはＧＤＡＳＩＨもしくはＡＧＤＡＳＩＨに置換する。

【0109】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、Ｂ’Ｃ’ループキメラ変異を含む。野生型ＩＬ－２と比較して、上記変異タンパク質は、他の４ヘリックス短鎖サイトカインファミリーのメンバー由来の短いＢ’Ｃ’ループ配列による置換など、ａａ７２～ａａ８４を連結する配列のすべてまたは一部に対する置換を含む。ＩＬ－１５、ＩＬ－４、ＩＬ－２１などの他の４ヘリックス短鎖サイトカインＩＬファミリーのメンバーから、または非ヒト種（例えば、マウス）由来のＩＬファミリーのメンバーから、結晶構造のｓｕｐｅｒｐｏｓｅにより、野生型ＩＬ－２を置換するのに適用される短いＢ’Ｃ’ループを同定することができる。一実施形態において、置換のための配列は、インターロイキンＩＬ－１５（特にヒトＩＬ－１５）由来のＢ’Ｃ’ループ配列である。一実施形態において、上記置換は、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７３～ａａ８３の置換を含む。他の実施形態において、上記置換は、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７４～ａａ８３の置換を含む。好ましくは、置換後、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＳＧＤＡＳＩＨまたはＡＧＤＡＳＩＨから選択され、ＡＧＤＡＳＩＨが好ましいＢ’Ｃ’ループ配列（すなわち、ａａ７２～ａａ８４を連結する配列）を有する。

【0110】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、Ｂ’Ｃ’ループ切り詰め変異を含む。野生型ＩＬ－２と比較して、上記変異タンパク質は、ａａ７２～ａａ８４を連結する配列に対する切り詰めを含む。一実施形態において、上記切り詰めは、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７３～ａａ８３の切り詰めを含む。他の実施形態において、上記切り詰めは、Ｂ’Ｃ’ループ領域のアミノ酸残基ａａ７４～ａａ８３の切り詰めを含む。例えば、Ｃ末端から１個、２個、３個または４個のアミノ酸を切り詰めることができる。好ましくは、切り詰め後、本発明のＩＬ－２変異タンパク質のＢ’Ｃ’ループ領域は配列Ａ（Ｑ／Ｇ）ＳＫＮ（Ｆ／Ｉ）Ｈを有し、好ましくは、ＡＱＳＫＮＦＨである。好ましくは、切り詰め後、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は以下から選択されるＢ’Ｃ’ループ配列（すなわち、ａａ７２～ａａ８４を連結する配列）を有する。

【0111】

【表3】

１つの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＡＱＳＫＮＦＨまたはＡＧＤＡＳＩＨから選択されるＢ’Ｃ’ループ領域配列（すなわち、ａａ７２～ａａ８４を連結する配列）を含む。

【0112】

ＩＬ－２Ｒα結合界面の変異
一態様において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２と比較して、ＩＬ－２Ｒα結合界面において、好ましくは位置３５および／または４２に、１つまたは複数の変異を含む。好ましくは、上記変異は、ＩＬ－２Ｒα受容体に対する結合親和性を排除または低減する。

【0113】

いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２Ｒα結合界面の変異は、変異Ｋ３５Ｅおよび／またはＦ４２Ａを含む。

【0114】

他のいくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２Ｒα結合界面の変異を含む本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、変化したＩＬ－２Ｒα結合を有し、例えば、ＳＰＲ親和性測定による変化した（好ましくは、低減または排除した）ＩＬ－２Ｒα結合を有する。

【0115】

他の変異
上記「ＩＬ－２Ｒβγ結合界面の変異」、「Ｂ’Ｃ’ループ領域の変異」および「ＩＬ－２Ｒα結合界面の変異」を除いて、本発明のＩＬ－２変異タンパク質の上記の１つまたは複数の有益な特性を保持すれば、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、他の領域または位置に１つまたは複数の変異をさらに有してもよい。例えば、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、発現または均質性または安定性の改善などのさらなる利点を提供するために、位置１２５での置換、例えばＣ１２５Ｓ、Ｃ１２５Ａ、Ｃ１２５Ｔ、またはＣ１２５Ｖをさらに含んでもよい（例えば、米国特許第４，５１８，５８４号参照）。さらに、例えば、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、ＩＬ２のＮ末端でのＯ糖修飾を除去するために、Ｔ３Ａなど、位置３での置換をさらに含んでもよい。当業者は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質に組み込まれることができる追加の変異をどのように決定するかを知っている。

【0116】

好ましい例示的な変異の組み合わせ
いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、弱められたＩＬ－２Ｒβγ結合を有し、かつ（ｉ）低減された（または排除された）ＩＬ－２Ｒα結合、および（ｉｉ）改善された発現レベルと純度の１項またはすべて２項から選択される改善された特性を有する。いくつかの実施形態において、上記ＩＬ－２変異タンパク質は、野生型ＩＬ－２タンパク質と比較して、ＩＬ－２Ｒα受容体結合が維持される。

【0117】

いくつかの実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ－２と比較して、以下を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。

【0118】

（ｉ）Ｎ８８Ｄ、
Ｎ８８Ｒ、
Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１３０Ｒ、
Ｆ４２Ａ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ、または
Ｋ３５Ｅ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ、
および
（ｉｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＡＧＤＡＳＩＨまたはＡＱＳＫＮＦＨ、
ならびに、任意に（ｉｉｉ）Ｔ３Ａを含む。

【0119】

いくつかの実施形態において、本発明は、野生型ＩＬ－２と比較して、以下を含むＩＬ－２変異タンパク質を提供する。

【0120】

（ｉ）Ｎ８８Ｄ、
Ｎ８８Ｒ、
Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１３０Ｒ、
Ｆ４２Ａ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ、または
Ｋ３５Ｅ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ、
および
（ｉｉ）Ｂ’Ｃ’ループ領域配列ＡＧＤＡＳＩＨまたはＡＱＳＫＮＦＨ、
ならびに、（ｉｉｉ）Ｔ３Ａを含む。

【0121】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化を含み、
好ましくは、上記変異タンパク質は、Ｎ８８Ｄ置換およびＢ’Ｃ’ループ領域配列ＡＧＤＡＳＩＨ、ならびに、任意にＴ３Ａを含む。

【0122】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、
（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化を含み、
好ましくは、上記変異タンパク質は、Ｎ８８Ｒ置換およびＢ’Ｃ’ループ領域配列ＡＧＤＡＳＩＨ、ならびに、任意にＴ３Ａを含む。

【0123】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、
（ｉ）配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化を含み、
好ましくは、上記変異タンパク質は、Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１３０Ｒ置換およびＢ’Ｃ’ループ領域配列ＡＧＤＡＳＩＨ、および任意にＴ３Ａを含む。

【0124】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、
（ｉ）配列番号２７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化を含み、
好ましくは、上記変異タンパク質は、Ｆ４２Ａ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ置換およびＢ’Ｃ’ループ領域配列ＡＱＳＫＮＦＨ、および任意にＴ３Ａを含む。

【0125】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、
（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号２９のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化を含み、
好ましくは、上記変異タンパク質は、Ｆ４２Ａ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ置換およびＢ’Ｃ’ループ領域配列ＡＧＤＡＳＩＨ、および任意にＴ３Ａを含む。

【0126】

いくつかの実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、
（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化を含み、
好ましくは、上記変異タンパク質は、Ｋ３５Ｅ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ置換およびＢ’Ｃ’ループ領域配列ＡＱＳＫＮＦＨ、および任意にＴ３Ａを含む。

【0127】

本発明に適用される変異および変異の組み合わせについては、本出願人の同時係属中の出願ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／０８１８４０を参照することもできる。当該出願は、全て参照として本明細書に組み込まれている。

【0128】

ＩＬ－２変異タンパク質と野生型タンパク質との間の配列の相違点は、配列同一性によって表してもよく、または両方の間の異なるアミノ酸の数によって表してもよい。一実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質と野生型タンパク質との間は、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％の同一性、好ましくは９０％以上の同一性、好ましくは９５％であるが、好ましくは９７％以下、より好ましくは９６％以下の同一性を有する。他の実施形態において、本発明の上記変異を除いて、ＩＬ－２変異タンパク質と野生型タンパク質との間は、１５個以下、例えば１個～１０個、または１個～５個の変異、例えば、０個、１個、２個、３個、４個の変異を有してもよい。一実施形態において、上記残りの変異は保存的置換であってもよい。
ＩＩＩ．融合タンパク質とＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質
一態様において、本発明は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質を含む融合タンパク質をさらに提供する。１つの好ましい実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、改善された薬物動態特性を付与することができる別のポリペプチド、例えばアルブミン、より好ましくは抗体Ｆｃ断片と融合される。

【0129】

一実施形態において、本発明は、抗体Ｆｃ断片と融合される本発明のＩＬ－２変異タンパク質を含むＩＬ－２変異タンパク質融合タンパク質を提供する。

【0130】

本発明に使用されるＦｃ断片は、エフェクター機能を低減または除去する変異を含むことができる。一好ましい実施形態において、Ｆｃ断片は、低減されたＦｃ領域により媒介されるエフェクター機能を有し、例えば低減または排除されたＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣエフェクター機能を有する。例えば、いくつかの特別な実施形態において、本発明に使用されるＦｃ断片は、Ｆｃγ受容体に対する結合を低減するＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異またはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａを有する。

【0131】

さらなる好ましい実施形態において、Ｆｃ断片は、血清半減期を増加する変異、例えばＦｃ断片とＦｃＲｎとの結合を改善する変異を有してもよい。

【0132】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質と融合されるＦｃ断片は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ、ヒトＩｇＧ２ ＦｃまたはヒトＩｇＧ４ ＦｃなどのヒトＩｇＧ Ｆｃである。一実施形態において、Ｆｃ断片は、配列番号６、配列番号１２、配列番号４２もしくは配列番号４３のアミノ酸配列またはそれらと少なくとも９０％の同一性、例えば９５％、９６％、９７％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、あるいはそれらからなる。

【0133】

いくつかの実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質は、直接またはリンカーによってＦｃと融合される。いくつかの実施形態において、ＣＤ２５^－Ｔ細胞に対するＦｃ融合タンパク質の活性化作用を向上させるために、リンカーを選択することができる。一実施形態において、リンカーは（ＧＧＧＧＳ）_ｎまたはＧＳＧＳであり、より好ましくは（ＧＧＧＧＳ）_２である。

【0134】

さらなる態様において、本発明はまた、Ｆｃ断片と融合される本発明のＩＬ－２変異タンパク質を含む二量体分子を提供する。このような二量体分子は、分子量を６０ＫＤａ～８０ＫＤａに増加させ、腎クリアランスを大幅に減少させ、かつインビボでのＦｃＲｎ媒介リサイクルを通じて、ＩＬ２－Ｆｃ融合タンパク質の半減期をさらに延長することができる。

【0135】

いくつかの実施形態において、本発明により提供されるＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質は、ホモ二量体であり、ここで、第１のモノマーと第２のモノマーはそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端まで、ｉ）ＩＬ－２変異タンパク質、ｉｉ）リンカー、およびｉｉｉ）Ｆｃ断片を含む。

【0136】

他のいくつかの実施形態において、本発明により提供されるＩＬ－２－Ｆｃ二量体タンパク質は、ヘテロ二量体であり、
ａ）Ｎ末端からＣ末端まで、ｉ）ＩＬ－２変異タンパク質、ｉｉ）リンカー、およびｉｉｉ）第１のＦｃ断片を含む第１のモノマーと、
ｂ）第２のＦｃ断片を含む第２のモノマーと、を含む。

【0137】

いくつかの実施形態において、第１のＦｃ断片と第２のＦｃ断片はそれぞれ、第１のモノマーと第２のモノマーがヘテロ二量体を形成することを促進する第１と第２のヘテロ二量体化変異を含む。いくつかの好ましい実施形態において、第１と第２のヘテロ二量体化変異は、、Ｋｎｏｂ：Ｈｏｌｅ変異の組み合わせ、例えば変異の組み合わせＴ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ：Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖを含む。

【0138】

いくつかの好ましい実施形態において、第１のＦｃ断片における第１のヘテロ二量体変異はＫｎｏｂ変異を含み、第２のＦｃ断片における第２のヘテロ二量体変異はＨｏｌｅ変異を含み、あるいは、第１のＦｃ断片における第１のヘテロ二量体変異はＨｏｌｅ変異を含み、第２のＦｃ断片における第２のヘテロ二量体変異はＫｎｏｂ変異を含む。

【0139】

当業者に理解されるように、本発明に適用される融合タンパク質と二量体分子のＦｃ断片は任意の抗体Ｆｃ断片であってもよい。一実施形態において、本発明のＦｃ断片は、エフェクター機能サイレントである。

【0140】

一実施形態において、Ｆｃ領域のエフェクター機能とＦｃ領域の補体活性化機能から選択される１つまたは複数の特性でＦｃ断片を修飾する。一実施形態において、上記エフェクター機能または補体活性化機能は、同じアイソタイプの野生型Ｆｃ領域と比較して、低減または排除されている。一実施形態において、Ｆｃ領域のグリコシル化を低減すること、低減または排除されたエフェクター機能を天然に有するＦｃアイソタイプを使用すること、およびＦｃ領域を修飾することなどの方法によって、エフェクター機能を低減または排除する。

【0141】

一実施形態において、Ｆｃ領域のグリコシル化を低減することによってエフェクター機能を低減または排除する。一実施形態において、野生型のグリコシル化を許容しない環境で本発明の融合タンパク質または二量体分子を生産すること、Ｆｃ領域ですでに存在する炭水化物基を除去すること、および野生型のグリコシル化が起こらないようにＦｃ領域を修飾することなどの方法によって、Ｆｃ領域のグリコシル化を低減する。一実施形態において、野生型のグリコシル化が起こらないように修飾する方法によって、Ｆｃ領域のグリコシル化を低減し、例えば、下記位置の野生型アスパラギン残基が当該位置のグリコシル化に干渉する別のアミノ酸で置換されるように、Ｆｃ領域の位置２９７で変異、例えばＮ２９７Ａ変異を含む。

【0142】

一実施形態において、少なくとも１つのＦｃ領域の修飾によって、エフェクター機能を低減または排除する。一実施形態において、少なくとも１つのＦｃ領域の修飾は、位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８および４３９から選択され、１つまたは複数のＦｃ受容体との結合を破壊するＦｃ領域の点変異、位置２７０、３２２、３２９および３２１から選択され、Ｃ１ｑとの結合を破壊するＦｃ領域の点変異、およびＣＨ１構造ドメインの位置１３２の点変異から選択される。一実施形態において、エフェクター機能は、Ｆｃ領域における点変異Ｌ２３４Ａ＆Ｌ２３５Ａ（すなわち、ＬＡＬＡ変異）によって低減または排除される。一実施形態において、上記修飾は、位置２７０、３２２、３２９および３２１から選択され、Ｃ１ｑとの結合を破壊するＦｃ領域の点変異である。別の実施形態において、上記修飾は、いくつかのＦｃ領域を排除することである。

【0143】

当業者に理解されるように、本発明のヘテロ二量体の形成を促進するために、本発明の二量体分子のＦｃ断片は、第１のモノマーと第２のモノマーの二量体化に有利な変異を含むことができる。好ましくは、Ｋｎｏｂ－ｉｎ－Ｈｏｌｅ技術に基づいて、第１のモノマーと第２のモノマーに対応するＫｎｏｂ変異とＨｏｌｅ変異を導入する。

【0144】

したがって、一実施形態において、本発明の二量体分子は、
ｉ）任意に変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有するか、または変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有するヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ－領域、あるいは
ｉｉ）任意に変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅを有する、ヒトＩｇＧ４サブクラスのホモ二量体Ｆｃ－領域、あるいは
ｉｉｉ）ヘテロ二量体Ｆｃ－領域であって、ここで、
a） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｗを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、または
b） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＹ３４９Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＳ３５４Ｃを含み、または
c） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ－領域、
あるいは
ｉｖ）ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ－領域であって、ここで、２つのＦｃ－領域ポリペプチドはいずれも、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含み、かつ
a） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｗを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、または
b） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＹ３４９Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＳ３５４Ｃを含み、または
c） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含む、ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ－領域、
あるいは
ｖ）ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ－領域であって、ここで、２つのＦｃ－領域ポリペプチドはいずれも、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅを含み、かつ
a） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｗを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、または
b） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＹ３４９Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＳ３５４Ｃを含み、または
c） １つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含む、ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ－領域、を含む。

【0145】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域は、ヘテロ二量体の精製に有利な他の変異をさらに含む。例えば、タンパク質Ａを使用したヘテロ二量体の精製を容易にするために、Ｈ４３５Ｒ変異（Ｅｒｉｃ Ｊ．Ｓｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｜ ５：１７９４３ ｜ ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ１７９４３）をヘテロ二量体のＦｃ領域の１つ（例えば、Ｈｏｌｅ変異を持つＦｃ領域）に導入することができる。他のいくつかの実施形態において、ヒンジ領域を含むヘテロ二量体モノマーに関しては、ヘテロ二量体の形成を容易にするために、ヒンジ領域にＣ２２０Ｓなどの変異を導入することもできる。

【0146】

本発明の融合タンパク質に適用されるＦｃ領域は、本発明の免疫複合体におけるＦｃ部分として使用することもできる。

【0147】

いくつかの実施形態において、Ｆｃ領域と融合されるＩＬ－２変異タンパク質は、
（ｉ）配列番号７、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０もしくは配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号７、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０もしくは配列番号３２のアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号７、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０もしくは配列番号３２のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化を含み、
ここで、上記ＩＬ－２変異タンパク質は本明細書に記載の変異を含む。

【0148】

いくつかの実施形態において、本発明のＦｃと融合されるＩＬ－２変異タンパク質は、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化を含み、
好ましくは、上記変異タンパク質は、Ｎ８８Ｄ置換およびＢ’Ｃ’ループ領域配列ＡＧＤＡＳＩＨ、ならびに、任意にＴ３Ａを含む。

【0149】

いくつかの実施形態において、本発明のＦｃと融合されるＩＬ－２変異タンパク質は、
（ｉ）配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化を含み、
好ましくは、上記変異タンパク質は、Ｎ８８Ｒ置換およびＢ’Ｃ’ループ領域配列ＡＧＤＡＳＩＨ、ならびに、任意にＴ３Ａを含む。

【0150】

いくつかの実施形態において、本発明のＦｃと融合されるＩＬ－２変異タンパク質は、
（ｉ）配列番号２６のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５、４、３、２、１個以下）のアミノ酸変化を含み、
好ましくは、上記変異タンパク質は、Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１３０Ｒ置換およびＢ’Ｃ’ループ領域配列ＡＧＤＡＳＩＨ、および任意にＴ３Ａを含む。

【0151】

いくつかの実施形態において、本発明のＦｃと融合されるＩＬ－２変異タンパク質は、
（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５、４、３、２、１個以下）のアミノ酸変化を含み、
好ましくは、上記変異タンパク質は、Ｆ４２Ａ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ置換およびＢ’Ｃ’ループ領域配列ＡＱＳＫＮＦＨ、および任意にＴ３Ａを含む。

【0152】

いくつかの実施形態において、本発明のＦｃと融合されるＩＬ－２変異タンパク質は、
（ｉ）配列番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５、４、３、２、１個以下）のアミノ酸変化を含み、
好ましくは、上記変異タンパク質は、Ｆ４２Ａ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ置換およびＢ’Ｃ’ループ領域配列ＡＧＤＡＳＩＨ、および任意にＴ３Ａを含む。

【0153】

いくつかの実施形態において、本発明のＦｃと融合されるＩＬ－２変異タンパク質は、
（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号３２のアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５、４、３、２、１個以下）のアミノ酸変化を含み、
好ましくは、上記変異タンパク質は、Ｋ３５Ｅ＋Ｎ８８Ｒ＋Ｓ１２７Ｅ置換およびＢ’Ｃ’ループ領域配列ＡＱＳＫＮＦＨ、および任意にＴ３Ａを含む。

【0154】

当業者には明らかなように、本発明に適用される融合タンパク質と二量体分子においてＩＬ－２変異タンパク質とＦｃ断片を連結するリンカーは、当該分野で既知の任意のリンカーであってもよい。いくつかの実施形態において、リンカーはＩｇＧ１ヒンジを含んでもよく、または（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、および（ＧＧＧＳ）ｎから選択されるリンカー配列を含んでもよく、ここで、ｎは少なくとも１の整数である。好ましくは、リンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_２、すなわちＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）を含む。
ＩＶ．免疫複合体
本発明は、本発明のＩＬ２変異タンパク質またはＩＬ－２変異タンパク質融合タンパク質（例えば、Ｆｃ断片と融合した融合タンパク質）および抗原結合分子を含む免疫複合体をさらに提供する。好ましくは、抗原結合分子は、免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ分子、または抗体もしくは抗体断片、特にＦａｂ分子およびｓｃＦｖ分子、または半抗体（１つの重鎖および１つの軽鎖を含む、または１つの重鎖と１つの軽鎖で構成される）である。

【0155】

いくつかの実施形態において、上記抗原結合分子は、腫瘍細胞上または腫瘍環境中に提示される抗原に特異的に結合し、特に好ましくは、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２である。したがって、本発明の免疫複合体は、対象への投与後に腫瘍細胞または腫瘍環境を標的にすることができ、さらなる治療上の利点、例えば、より低い用量での治療の可能性およびそれによる副作用の低減、免疫療法効果または抗腫瘍効果の増強などを提供する。

【0156】

本発明の免疫複合体において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質は、別の分子または抗原結合分子に直接またはリンカーを介して結合することができ、かついくつかの実施形態において、タンパク質加水分解切断部位が両者の間に含まれる。本発明の免疫複合体において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質またはその融合タンパク質は、二量体化を介して他の分子または抗原結合分子に連結されてもよい。

【0157】

いくつかの実施形態において、上記抗体は、腫瘍に関連する抗原に対する抗体、例えばＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１もしくはＰＤ－Ｌ２である。

【0158】

ＩＬ－２変異タンパク質との連結に適する抗体は、完全な抗体、またはその抗原結合断片であってもよい。いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＩｇＧ１形態の抗体、ＩｇＧ２形態の抗体、ＩｇＧ３形態の抗体またはＩｇＧ４形態の抗体であり、好ましくは、ＩｇＧ１形態の抗体である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はヒト化されたものである。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態において、本発明の抗体はキメラ抗体である。一実施形態において、本発明の抗体の抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、単鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体（例えばＶＨＨ）、ｄＡｂ（ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、線状抗体または半抗体という抗体断片から選択される。

【0159】

本発明の一実施形態において、本発明の免疫複合体は、ＩＬ－２変異タンパク質またはその融合タンパク質、および抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片を含む。

【0160】

本発明の一実施形態において、本発明の免疫複合体は、
Ｆｃ断片と融合されるＩＬ－２変異タンパク質を含む第１のモノマー、および
ＰＤ－１に特異的に結合する抗体またはその断片を含む第２のモノマーであって、好ましくは、上記抗ＰＤ－１抗体の１つの重鎖および１つの軽鎖を含む断片である、第２のモノマーを含む。

【0161】

いくつかの実施形態において、第１のモノマーのＦｃ断片にＫｎｏｂ変異を含み、第２のモノマーの抗体重鎖にｈｏｌｅ変異を含み、逆にも同じである。いくつかの実施形態において、Ｋｎｏｂ変異は、Ｋｎｏｂ：Ｓ３５４Ｃ＆Ｔ３６６Ｗであり、かつ／またはＨｏｌｅ変異は、Ｙ３４９Ｃ＆Ｔ３６６Ｓ＆Ｌ３６８Ａ＆Ｙ４０７Ｖである。

【0162】

一具体的な実施形態において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質融合タンパク質は、図１ＡのＦｏｒｍａｔ１に示される形態を有する。

【0163】

本発明の一実施形態において、上記ＰＤ－１に対する抗体またはその抗原結合断片は、ＷＯ２０１７０２４４６５Ａ１に開示される抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片である。一実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、ＷＯ２０１７０２４４６５Ａ１に開示される抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の１つもしくは複数のＣＤＲ（好ましくは３つのＣＤＲ、すなわちＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２ＨおよびＨＣＤＲ３、またはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、より好ましくは６つのＣＤＲ、すなわちＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３）を含むか、またはＷＯ２０１７０２４４６５Ａ１に開示される抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片のＶＨおよび／またはＶＬを含むか、または上記抗体の重鎖および／または軽鎖を含む。

【0164】

いくつかの実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）と、軽鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）とを含む。

【0165】

いくつかの態様において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの態様において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、軽鎖可変領域（ＶＨ）を含む。いくつかの態様において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態において、上記重鎖可変領域は、重鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、上記軽鎖可変領域は、軽鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。

【0166】

いくつかの実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、抗体重鎖を含む。いくつかの実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体重鎖は、重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、抗体軽鎖を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－１抗体の軽鎖は、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、重鎖および軽鎖をさらに含む。

【0167】

いくつかの実施形態において、上記重鎖可変領域ＶＨは、
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、好ましくは、上記アミノ酸変化はＣＤＲ領域に生じない。

【0168】

いくつかの実施形態において、上記軽鎖可変領域ＶＬは、
（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、あるいは
（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列と比較して、１つもしくは複数（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、好ましくは、上記アミノ酸変化はＣＤＲ領域に生じない。

【0169】

いくつかの実施形態において、上記重鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＨＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３は、
（ｉ）配列番号８に示されるＶＨに含まれる３つの相補性決定領域であるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、あるいは
（ｉｉ）（ｉ）の配列に対して、上記３つのＨＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ５個、４個、３個、２個もしくは１個以下のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）が含まれる配列、から選択される。

【0170】

いくつかの実施形態において、上記軽鎖可変領域からの３つの相補性決定領域（ＬＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３は、
（ｉ）配列番号１５に示されるＶＬに含まれる３つの相補性決定領域であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３、あるいは
（ｉｉ）（ｉ）の配列に対して、上記３つのＬＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ５個、４個、３個、２個もしくは１個以下のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）が含まれる配列、から選択される。

【0171】

いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ１は、配列番号９のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、ＨＣＤＲ１は、配列番号９のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

【0172】

いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ２は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、ＨＣＤＲ２は、配列番号１０のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

【0173】

いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ３は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、ＨＣＤＲ３は、配列番号１１のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

【0174】

いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ１は、配列番号１６のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、ＬＣＤＲ１は、配列番号１６のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

【0175】

いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ２は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、ＬＣＤＲ２は、配列番号１７のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

【0176】

いくつかの実施形態において、ＬＣＤＲ３は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは、ＬＣＤＲ３は、配列番号１８のアミノ酸配列と比較して１個、２個もしくは３個の変化（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を有するアミノ酸配列を含む。

【0177】

いくつかの実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の重鎖定常領域ＨＣは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域、好ましくはＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、例えばＬ２３４Ａ＆Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）変異を有するＩｇＧ１の重鎖定常領域である。いくつかの実施形態において、重鎖定常領域にｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅの変異を導入する。例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗの変異を導入してｋｎｏｂ変異を含む抗体重鎖を取得し、および／またはＹ３４９Ｃ＆Ｔ３６６Ｓ＆Ｌ３６８Ａ＆Ｙ４０７Ｖの変異を導入してｈｏｌｅ変異を含む抗体重鎖を取得する。いくつかの実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片の軽鎖定常領域は、ｌａｍｂｄａまたはＫａｐｐａ軽鎖定常領域である。

【0178】

いくつかの実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片の重鎖定常領域は、
（ｉ）配列番号２１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号２１から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号２１から選択されるアミノ酸配列と比較して１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0179】

いくつかの実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片のｈｏｌｅ変異を含む重鎖定常領域は、
（ｉ）配列番号１３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号１３から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１３から選択されるアミノ酸配列と比較して１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0180】

いくつかの実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片のｈｏｌｅ変異を含む重鎖は、
（ｉ）配列番号１４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号１４から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１４から選択されるアミノ酸配列と比較して１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0181】

いくつかの実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片の重鎖は、
（ｉ）配列番号２２から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号２２から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号２２から選択されるアミノ酸配列と比較して１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0182】

いくつかの実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片の軽鎖定常領域は、
（ｉ）配列番号１９から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号１９から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号１９から選択されるアミノ酸配列と比較して１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0183】

いくつかの実施形態において、上記抗体またはその抗原結合断片の軽鎖は、
（ｉ）配列番号２０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号２０から選択されるアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、あるいは
（ｉｉｉ）配列番号２０から選択されるアミノ酸配列と比較して１つもしくは複数（好ましくは２０個もしくは１０個以下、より好ましくは５個、４個、３個、２個、１個以下）のアミノ酸変化（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくはアミノ酸保存的置換）を有するアミノ酸配列を含むかまたはそれらからなる。

【0184】

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号８に示されるＶＨに含まれる３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに配列番号１５に示されるＶＬに含まれる３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。

【0185】

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、
それぞれアミノ酸配列の配列番号９、配列番号１０および配列番号１１に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３、ならびに、それぞれアミノ酸配列の配列番号１６、配列番号１７および配列番号１８に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む。

【0186】

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号８に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかあるいはそれらからなるＶＨと、配列番号１５に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかあるいはそれらからなるＶＬと、を含む。

【0187】

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合断片は、
配列番号１４もしくは配列番号２２に示されるアミノ酸配列またはそれらと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかあるいはそれらからなる重鎖と、配列番号２０に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかあるいはそれらからなる軽鎖と、を含む。

【0188】

いくつかの好ましい実施形態において、上記免疫複合体中の抗ＰＤ－１抗体断片は、１つの重鎖および１つの軽鎖を含むか、またはそれらからなる。

【0189】

本発明のいくつかの具体的な実施形態において、上記抗ＰＤ－１抗体断片は、
配列番号１４に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかあるいはそれらからなる、ｈｏｌｅ変異を含む重鎖、および
配列番号２０に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかあるいはそれらからなる軽鎖を含む。

【0190】

本発明の免疫複合体は、好ましくは、抗ＰＤ－１抗体と比較して、ＩＬ－２変異タンパク質もしくはそのＦｃとの融合タンパク質と比較して、および／または抗ＰＤ－１抗体およびＩＬ－２変異タンパク質を含む既知の免疫複合体と比較して、以下の特性の１つもしくは複数もしくはすべてを有する：
（１）特に野生型ＩＬ－２またはその融合タンパク質と比較して、ＩＬ－２Ｒαに対する結合親和性が低減または排除しており、
（２）特にＩＬ－２変異タンパク質またはそのＦｃとの融合タンパク質と比較して、および／または抗ＰＤ－１抗体およびＩＬ－２変異タンパク質を含む既知の免疫複合体と比較して、ＩＬ－２Ｒβγに対する結合親和性が低減しており、
（３）ＰＤ－１を発現する細胞を選択的に活性化することができ、すなわち、ＰＤ－１に対して高度選択性を有し、
（４）ＰＤ－１を発現しないＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞）では活性が低く、ＰＤ－１を発現するＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞）では活性が高く、特に抗ＰＤ－１抗体およびＩＬ－２変異タンパク質を含む既知の免疫複合体と比較して、ＰＤ－１に対する高度選択性を有することを示し、
（５）ＩＬ－２受容体を発現する（例えば、過剰発現する）細胞におけるＩＬ－２の活性は、特に抗ＰＤ－１抗体およびＩＬ－２変異タンパク質を含む既知の免疫複合体と比較してより弱く、
（６）ＩＬ－２受容体とＰＤ－１を発現する細胞において、ＩＬ－２受容体を発現するがＰＤ－１を発現しない細胞より強いＩＬ－２活性を有し、ＰＤ－１陽性細胞に対する選択性を示し、
（７）好ましくは、抗ＰＤ－１抗体と比較するか、ＩＬ－２変異タンパク質もしくはそのＦｃとの融合タンパク質と比較するか、または抗ＰＤ－１抗体とＩＬ－２変異タンパク質もしくはその融合タンパク質との併用と比較するか、かつ／または抗ＰＤ－１抗体およびＩＬ－２変異タンパク質を含む既知の免疫複合体と比較して、より強力な抗腫瘍効果を有し、および／またはより低い毒性（例えば、治療対象の体重に影響しないか、または影響が比較的少ない）を有する。

Ｖ．ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主
本発明は、上記ＩＬ－２変異タンパク質または融合タンパク質または二量体分子または複合体のいずれかの鎖またはいずれかのモノマーまたはドメインをコードする核酸を提供する。本発明の変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、当該分野で周知の方法により、新規固相ＤＮＡ合成、または野生型ＩＬ－２をコードする既存の配列のＰＣＲ変異誘発によって産生することができる。なお、本発明のポリヌクレオチドおよび核酸は、分泌シグナルペプチドをコードするセグメントを含んでもよく、本発明の変異タンパク質をコードするセグメントに操作可能に連結されて、本発明の変異タンパク質の分泌発現を誘導することができる。

【0191】

本発明はまた、本発明の核酸を含むベクターを提供する。一実施形態において、ベクターは発現ベクター、例えば、真核発現ベクターである。ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明の発現ベクターはｐＹＤＯ＿０１７発現ベクターである。

【0192】

本発明はまた、上記核酸または上記ベクターを含む宿主細胞を提供する。変異ＩＬ－２タンパク質または融合体または二量体または免疫複合体の発現を複製および支持するのに適用される宿主細胞は、当該分野で周知である。特定の発現ベクターでこのような細胞をトランスフェクションまたは形質導入することができるとともに、ベクターを含む多くの細胞を大規模な発酵槽に接種するために増殖させることができ、臨床的使用のための十分な量のＩＬ－２変異体または融合体または二量体または免疫複合体が得られる。一実施形態において、宿主細胞は真核のものである。別の実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞もしくは２９３細胞）から選ばれる。有用な哺乳動物宿主細胞系の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓系（例えばＧｒａｈａｍら、ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ３６、５９（１９７７）に記載された２９３または２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ（ｓｅｒｔｏｌｉ）細胞（例えばＭａｔｈｅｒ、ＢｉｏｌＲｅｐｒｏｄ２３、２４３－２５１（１９８０）に記載されたＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、ｂｕｆｆａｌｏラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばＭａｔｈｅｒら、ＡｎｎａｌｓＮ．Ｙ．ＡｃａｄＳｃｉ３８３、４４－６８（１９８２）に記載された）、ＭＲＣ５細胞およびＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ７７、４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。一実施形態において、宿主細胞は真核生物細胞であり、好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ球（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）などの哺乳動物細胞である。
ＶＩ．調製方法
さらなる態様において、本発明は、本発明のＩＬ－２変異タンパク質または融合体または二量体または複合体を調製する方法を提供し、上記方法は、ＩＬ－２変異タンパク質または融合体または二量体または複合体の発現に適した条件下で、上記タンパク質または融合体または二量体または複合体をコードする核酸を含む上記で提供されるような宿主細胞を培養するステップと、任意に上記宿主細胞（または宿主細胞培地）から上記タンパク質または融合体または二量体または複合体を回収するステップとを含む。

【0193】

一実施形態において、ＩＬ－２変異タンパク質をコードする核酸を含むベクターを細胞内にトランスフェクショして発現させ、次いで細胞（または細胞培養上清）を収集し、上記ＩＬ－２変異タンパク質を抽出し、精製して上記ＩＬ－２変異タンパク質を得る。一具体的な実施形態において、上記精製方法はアフィニティー精製方法である。別の具体的な実施形態において、上記精製方法はイオン交換精製である。

【0194】

一実施形態において、Ｆｃと融合されるＩＬ－２変異タンパク質をコードする核酸を含むベクターを細胞内にトランスフェクショして発現させ、次いで細胞（または細胞培養上清）を収集し、上記Ｆｃと融合されるＩＬ－２変異タンパク質を抽出し、精製して上記Ｆｃと融合されるＩＬ－２変異タンパク質を得る。一具体的な実施形態において、上記精製方法はアフィニティー精製方法である。別の具体的な実施形態において、上記精製方法はイオン交換精製である。

【0195】

一実施形態において、Ｆｃと融合されるＩＬ－２変異タンパク質をコードする核酸、ＰＤ－１抗体重鎖をコードする核酸、およびＰＤ－１抗体軽鎖をコードする核酸を含むベクターを細胞内にトランスフェクショし、それぞれ発現させて免疫複合体として集合させ、その後細胞（または細胞培養上清）を収集し、上記免疫複合体を抽出し、精製を行って上記免疫複合体を得る。一具体的な実施形態において、上記精製方法はアフィニティー精製方法である。別の具体的な実施形態において、上記精製方法はイオン交換精製である。

ＶＩＩ．測定法
当該分野で既知の様々な測定方法を利用して、本明細書により提供されるＩＬ－２変異タンパク質に対して同定、スクリーニング、またはその物理的／化学的特性および／または生物学的活性の特性評価を行うことができる。

【0196】

一態様において、本発明のＩＬ－２変異タンパク質に対してＩＬ－２受容体へのその結合活性を測定することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットなどのような当該分野で既知の方法、または本明細書の実施例に開示されている例示的な方法によって、ヒトＩＬ－２Ｒαまたはβタンパク質またはＩＬ－２ＲβγまたはＩＬ－２Ｒαβγとの結合を測定することができる。例えば、細胞表面上で変異タンパク質を発現するようにトランスフェクションされた酵母ディスプレイ細胞などの細胞を、標識された（例えばビオチン標識された）ＩＬ－２Ｒαまたはβタンパク質またはＩＬ－２ＲβγまたはＩＬ－２Ｒαβγ複合物と反応させるフローサイトメトリーによって測定することができる。代替的には、結合ダイナミクス（例えばＫ_Ｄ値）を含めて、変異タンパク質の受容体への結合は、ＩＬ－２－Ｆｃ融合体または二量体分子の形態を使用してＳＰＲ測定法において測定することができる。

【0197】

さらなる態様において、受容体結合の下流で起こるシグナル伝達および／または免疫賦活効果を測定することによって、ＩＬ－２変異タンパク質のＩＬ－２受容体に結合する能力を間接的に測定することができる。

【0198】

したがって、いくつかの実施形態において、生物学的活性を有する変異ＩＬ－２タンパク質を同定するための測定法を提供する。生物学的活性は、例えば、ＩＬ－２受容体を有するＴおよび／またはＮＫ細胞および／またはＴｒｅｇ細胞の増殖を誘導する能力、ＩＬ－２受容体を有するＴおよび／またはＮＫ細胞および／またはＴｒｅｇ細胞におけるＩＬ－２シグナル伝達を誘導する能力、低下したＴ細胞におけるアポトーシスを誘導する能力、腫瘍の退縮を誘導するおよび／または生存を改善する能力、ならびに低下した血管透過性などの低下したインビボ毒性特性を含んでもよい。本発明は、インビボおよび／またはインビトロにこのような生物学的活性を有する変異ＩＬ－２タンパク質、そのＦｃ融合体およびそれを含む二量体分子も提供する。

【0199】

当該分野で周知の様な方法は、ＩＬ－２の生物学的活性を測定するために使用することができる。例えば、（例えば、二量体分子の形態で）ＮＫ細胞によるＩＦＮ－γの生成を刺激する本発明のＩＬ－２変異タンパク質の能力を試験するための適切な測定法は、培養されたＮＫ細胞を本発明の変異ＩＬ－２タンパク質とインキュベートし、その後、ＥＬＩＳＡによって培地中のＩＦＮ－γ濃度を測定するステップを含むことができる。ＩＬ－２シグナル伝達は、いくつかのシグナル伝達経路を誘導し、ＪＡＫ（Ｊａｎｕｓキナーゼ）およびＳＴＡＴ（シグナル伝達物質および転写活性化因子）シグナル伝達分子に関与する。

【0200】

ＩＬ－２と受容体βおよびγサブユニットとの相互作用は、受容体およびＪＡＫ１とＪＡＫ３（βおよびγサブユニットとそれぞれ結合する）のリン酸化をもたらす。次に、ＳＴＡＴ５はリン酸化受容体と結合し、それ自体が非常に重要なチロシン残基上でリン酸化される。これによりＳＴＡＴ５が受容体から解離し、ＳＴＡＴ５が二量体化され、ＳＴＡＴ５二量体が細胞核に移行し、当該位置に標的遺伝子の転写を促進する。これにより、ＩＬ－２受容体を介してシグナル伝達を誘導する変異体ＩＬ－２ポリペプチドの能力は、例えばＳＴＡＴ５のリン酸化を測定することによって評価することができる。この方法の詳細は、実施例に開示されている。例えば、ＰＢＭＣを本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または二量体または免疫複合体で処理し、リン酸化ＳＴＡＴ５のレベルをフローサイトメトリーによって測定することができる。

【0201】

本発明の抗原に対する抗体との免疫複合体の場合、ＩＬ－２の上記活性またはレベルは、抗原を発現する細胞においてアッセイすることによって決定することができる。

【0202】

さらに、腫瘍の増殖および生存に対する変異ＩＬ－２またはその融合体または二量体または免疫複合体の影響は、当該分野で知られている様々な動物腫瘍モデルにおいて評価することができる。例えば、癌細胞系の異種移植片を免疫不全マウスに移植し、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または二量体または免疫複合体で処理することができる。腫瘍抑制率（例えば、アイソタイプ対照抗体と比較して計算される）に基づいて、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチド、融合体、二量体および免疫複合体のインビボ抗腫瘍効果を検出することができる。なお、動物の体重変化（例えば、投与前と比較して、絶対体重の変化または体重変化パーセント）に基づいて、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチド、融合体、二量体分子および免疫複合体のインビボ毒性を測定することができる。死亡率、生存期間観察（行動、体重、体温などの有害作用の目に見える症状）および臨床的および解剖学的病理学（例えば、血液化学値の測定および／または組織病理学的分析）に基づいて、上記インビボ毒性を測定することもできる。

【0203】

さらなる態様において、当該分野で既知の方法によって、発現量と製品の純度などの本発明の変異タンパク質の創薬可能性を特徴付けることができる。発現量の測定について、変異タンパク質が培養細胞から分泌され、培養上清で発現される場合、遠心分離により収集された細胞培養液のタンパク質含有量を測定することができる。あるいは、収集された細胞培養液のワンステップの精製後に、例えばワンステップアフィニティークロマトグラフィー精製後に、測定することができる。製品純度の測定について、得られた生産細胞の培養上清に対してワンステップアフィニティークロマトグラフィー精製を実施した後、純度を測定して、変異タンパク質の精製性能を検出することができる。好ましくは、本発明の変異タンパク質は、このワンステップアフィニティークロマトグラフィーによる精製後、野生型タンパク質よりも顕著に優れた純度を有し、本発明の変異タンパク質がより良好な精製性能を有することを示している。純度測定法は、ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法を含むが、これに限定されない、当該分野で既知の任意の従来の方法であってもよい。

【0204】

さらに別の態様において、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または二量体または免疫複合体の半減期などの薬物動態特性は、当該分野で知られている方法によって特徴付けることができる。
ＶＩＩＩ．医薬組成物および医薬製剤
本発明は、変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または二量体または免疫複合体を含む組成物（医薬組成物または医薬製剤を含む）、および変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合物または二量体または免疫複合体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物をさらに含む。これらの組成物はまた、任意に本分野で既知の薬学的に許容可能なベクター、緩衝剤を含む薬用賦形剤などの、適切な薬用補助材料を含んでもよい。

【0205】

本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または二量体または免疫複合体を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスによって調製することができる。医薬組成物は、タンパク質を薬学的に使用可能な製剤に加工することを助ける１つまたは複数の生理学的に許容されるベクター、希釈剤、賦形剤または助剤を使用して従来の方法で製剤化することができる。適切な製剤は、選択した投与経路に依存する。

【0206】

免疫複合体は、遊離酸または遊離塩基、中性または塩の形態で組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸または遊離塩基の生物学的活性を実質的に保持する塩である。これらには、タンパク質性組成物の遊離アミノ基、無機酸（例えば、塩酸やリン酸など）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸との間で形成されるような酸付加塩（ａｃｉｄ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｓａｌｔ）が含まれる。遊離のカルボキシル基と形成される塩は、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムもしくは鉄、または有機塩基、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンもしくはプロカイン（ｐｒｏｃａｉｎｅ）から誘導されることもできる。薬学的に許容される塩は、対応する遊離塩基の形態より水性溶媒および他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
ＩＸ．組み合わせ製品
一態様において、本発明は、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または二量体または免疫複合体、および１つまたは複数の他の治療剤（例えば、化学療法剤、他の抗体、細胞傷害剤、ワクチン、抗感染症剤など）を含む組み合わせ製品をさらに提供する。本発明の組み合わせ製品は、本発明の治療方法に使用することができる。

【0207】

いくつかの実施形態において、上記組み合わせ製品は癌の予防または治療に用いられる。
Ｘ．治療方法および使用
一態様では、本発明は、対象の癌などの疾患を予防または治療する方法に関し、上記方法は、有効量の本明細書に記載の任意の変異体ＩＬ－２ポリペプチドもしくは融合体もしくは二量体もしくは免疫複合体を上記対象に投与することを含む。癌は、早期、中期または末期にある癌または転移性癌であってもよい。いくつかの実施形態において、癌は固形腫瘍または血液腫瘍であってもよい。いくつかの実施形態において、上記癌は、胃腸腫瘍または黒色腫、例えば、結腸癌または結腸直腸癌である。いくつかの実施形態において、上記腫瘍は、既知の薬物、例えば、既知の抗ＰＤ－１抗体に対して耐性を有する腫瘍またはは癌、例えば、難治性腫瘍または癌である。

【0208】

いくつかの実施形態において、上記癌は、上昇したＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、および／またはＰＤ－Ｌ２のタンパク質レベルおよび／または核酸レベルを有する（例えば、発現の上昇）ことによって特徴付けられる癌である。いくつかの実施形態において、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または二量体または免疫複合体は、宿主の免疫系を刺激し、例えば細胞性免疫応答を増強するように使用され得る。上記実施形態のいずれかによる「免疫系を刺激する」は、免疫機能の全体的な増加、Ｔ細胞機能の増加、Ｂ細胞機能の増加、リンパ球機能の回復、ＩＬ－２受容体発現の増加、Ｔ細胞応答性の増加、ナチュラルキラー細胞活性またはリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性の増加などのうちの１つまたは複数を含み得る。

【0209】

本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または二量体または免疫複合体（およびそれらを含む医薬組成物、任意に他の治療剤）は、非経口投与、肺内投与および鼻腔内投与を含む任意の適切な方法により投与されてもよく、かつ、局所治療に必要な場合、病巣内に投与されてもよい。非経口注入は、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与を含む。投与が短期であるか長期であるかによってある程度決まり、任意の適切な経路、例えば、静脈内注射投与または皮下注射投与などの注射により投与することができる。本明細書において、様々な投与スケジュールが含まれ、単回投与または複数の時点での複数回投与、ボーラス投与およびパルス注入を含むが、これらに限定されない。

【0210】

疾患を予防または治療するために、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または二量体または免疫複合体の適切な用量（単独で投与される場合または１つもしくは複数の他の治療剤と組み合わせて投与される場合）が、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度とその進行、予防目的の投与か治療目的の投与か、過去の治療、患者の臨床病歴および上記抗体に対する応答、主治医の判断によって決定される。上記抗体は、単回の治療で、または一連の治療を経て患者に適当に投与される。いくつかの実施形態において、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合タンパク質または二量体または免疫複合体は、毒性を生じることなく、より高い用量で患者に投与され得る。

【0211】

さらに別の態様において、本発明は、本発明の変異体ＩＬ－２ポリペプチドまたは融合体または二量体または免疫複合体の、前述の方法（例えば、治療のため）で使用するための薬物の調製における使用をさらに提供する。

【0212】

本発明の理解を補助するために、以下の実施例を説明する。如何なる方法によって、実施例を、本発明の請求範囲を制限するものと解釈する意図もなく、そうすべきでもない。

【0213】

本発明にかかる上記と他の態様および実施形態は、図面（図面の簡単な説明がその後に続く）と以下の発明の詳細な説明において記載され、以下の実施例に例示されている。上記および本願にわたって説明された特徴のいずれかまたはすべては、本発明の各実施形態において組み合わせることができる。以下の実施例を用いて本発明をさらに説明するが、実施例は、限定ではなく、説明することで記載され、当該業者は、様々な変更を行うことができると理解すべきである。

【0214】

実施例１．抗－ｈＰＤ－１およびＩＬ－２変異体の免疫複合体の設計
本発明は、ヒトＰＤ－１に特異的に結合してＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の組み合わせを遮断して、免疫ブレーキ機構を解除することができると同時に、Ｔ細胞またはＮＫ上のＩＬ－２受容体にも特異的に結合でき、これによりＴ細胞またはＮＫ細胞を活性化および増殖させる免疫複合体分子（αＰＤ－１／ＩＬ－２ｍ免疫複合体）設計し、上記免疫複合体分子は、抗ＰＤ－１抗体とＩＬ－２変異体を含み、ＰＤ－１抗体の免疫効果を増強することができた。

【0215】

本発明の免疫複合体の分子形態は図１Ａに示すように、１）第２のモノマーであって、ＰＤ－１に結合する抗体に由来し、上記ＰＤ－１に結合する抗体配列は、ＷＯ２０１７０２４４６５Ａ１に由来する第２のモノマー、および２）ＩＬ－２変異体（ＩＬ－２変異タンパク質またはＩＬ－２ｍ）である第１のモノマーという２つの部分を含み、上記変異体は、ＩＬ－２および受容体複合体の結晶構造２ＥＲＪによると（図２）、受容体の結合界面に変異部位を選択し、受容体へのＩＬ－２の結合を減少させ、ＩＬ－２のＢ’Ｃ’ループ領域配列（Ａ７３～Ｒ８３、野生型は配列番号４０）を最適化してＩＬ－２の創薬可能性を改善するように改造され、上記ループ領域は、ＩＬ－２のＢ’Ｃ’ループ領域をヒトＩＬ－１５Ｂ’Ｃ’ループ領域（ＡＧＤＡＳＩＨ、配列番号３９）に置換すること、またはＩＬ－２Ｂ’Ｃ’ループ領域の最後の４アミノ酸を欠失させて、切り詰めされたＩＬ－２Ｂ’Ｃ’ループ領域（ＡＱＳＫＮＦＨ、配列番号４１）を得るように最適化した。

【0216】

実施例で使用した対照分子、ＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質、およびＩＬ－２変異体－抗ＰＤ－１抗体免疫複合体における配列情報は配列表に示し、ＩＬ－２変異情報は以下の表に示した。

【0217】

【表4】

【0218】

実施例２．ＩＬ－２受容体および免疫複合体の調製
ＩＬ－２受容体の発現と精製
ベクターの構築
ＩＬ－２受容体ＩＬ－２Ｒα（Ｕｉｐｒｏｔ：Ｐ０１５８９、ａａ２２－２１７）は、配列のＣ末端にａｖｉタグ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ、このタグペプチドはＢｉｒＡ酵素によって触媒されてビオチン化される）および６つのヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）を付加し、ｐＴＴ５ベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）に構築し、次いでＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして発現させ、ニッケルカラム（Ｈｉｓｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ、ＧＥ、１７－３７１２－０６）を通してアフィニティー精製してＩＬ－２Ｒαを得た。

【0219】

ＩＬ－２Ｒβγ複合物はＫｎｏｂｓ ｉｎ ｈｏｌｅｓに基づいたＦｃヘテロ二量体であり、ＩＬ－２Ｒβの配列はＦｃ－ＫｎｏｂのＮ末端（配列番号３７）に構築され、ＩＬ－２Ｒγの配列はＦｃ－ＨｏｌｅのＮ末端（配列番号３８）に構築され、それぞれｐｃＤＮＡ３．１ベクターに構築された後、細胞で共発現された。一過性トランスフェクション法を使用してＩＬ－２Ｒβを含むベクターおよびＩＬ－２Ｒγを含むベクターを、ＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトして発現させた。まず超クリーンベンチでプラスミドＤＮＡとトランスフェクション試薬ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６）を準備し、３ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ製品番号：３１９８５－０７０）を５０ｍＬの遠心管に入れ、対応するプラスミドのＤＮＡを３０μｇ加え、プラスミドを含むＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を０．２２μｍのフィルターヘッドで濾過し、続いて９０μｇのＰＥＩ（１ｇ／Ｌ）を加え、２０ｍｉｎ静置した。ＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を２７ｍＬのＨＥＫ２９３細胞に穏やかに注ぎ、均一に混合し、３７℃、８％ＣＯ_２で６日間培養し続けた。細胞上清を精製のために得て、ＩＬ－２Ｒβγ複合体を得た。ニッケルカラムアフィニティー精製は、精製に使用したニッケルカラム（５ｍＬ Ｈｉｓｔｒａｐ ｅｘｃｅｌ、ＧＥ、１７－３７１２－０６）を０．１ＭのＮａＯＨで２ｈ浸漬した後、５倍～１０倍カラム体積の超純水ですすぎ、アルカリ液を除去した。精製前に５倍カラム体積の結合緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ）で精製カラムを平衡化し、細胞上清を平衡化したカラムに通し、１０倍カラム体積の洗浄緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのｉｍｉｄａｚｏｌｅ）をカラムに通し、非特異的に結合するヘテロタンパク質を除去し、次いで目的のタンパク質を３倍～５倍カラム体積の溶出液（２０ｍＭのＴｒｉｓ ７．４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で溶出した。収集したタンパク質を限外濾過によって濃縮してＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、７００１１－０４４）に交換した後、ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ ｉｎｃｒｅａｓｅ（ＧＥ、１０／３００ＧＬ、１０２４５６０５）でさらに単離して精製し、モノマーの溶出ピークを収集し、カラムの平衡化および溶出緩衝液はＰＢＳであった。

【0220】

Ｍａｂｓｅｌｅｃｔアフィニティー精製は、１３０００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離し、上清を収集し、プレ充填カラムＨｉｔｒａｐ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅを用いて上清を精製した。操作は以下のとおりであった：精製前に５倍カラム体積の平衡液（０．２ＭのＴｒｉｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で充填カラムを平衡化し、収集した上清をカラムに通し、さらに１０倍カラム体積の平衡液で充填カラムを洗浄し、非特異的に結合するタンパク質を除去し、５倍カラム体積の溶出緩衝液（０．１Ｍのｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ、ｐＨ３．５）で充填剤をすすぎ、溶出液を収集し、溶出液１ｍＬあたり８０μＬのＴｒｉｓ（２ＭのＴｒｉｓ）を加え、限外濾過濃縮管を用いてＰＢＳ緩衝液に交換し、濃度および純度を測定した。

【0221】

イオン交換精製は、イオン交換クロマトグラフィーを使用して、二重特異性分子中のヘテロ二量体分子を分離し、ホモ二量体不純物を除去した。

【0222】

免疫複合体の調製
抗ＰＤ－１抗体の重鎖Ｈｏｌｅと軽鎖をそれぞれｐｃＤＮＡ３．１ベクターに構築し、ＩＬ－２タンパク質をリンカーを介してＩｇＧ１ Ｆｃ ＫｎｏｂのＮ末端に接続してｐｃＤＮＡ３．１ベクターに構築し、上記３つのプラスミドを３倍量のＰＥＩ（例えば、３ｍＬのＨＥＫ２９３をトランスフェクトするには、１ｕｇ重鎖Ｈｏｌｅ＋１ｕｇ軽鎖＋１ｕｇのＩＬ－２ｍ－リンカー－Ｆｃ－Ｋｎｏｂ＋９μｇのＰＥＩ）とＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクトして発現させ、本実施例で使用される各免疫複合体分子を調製した。

【0223】

細胞の調製および試料の収集精製は、上記受容体の調製方法と同様であった。

【0224】

実施例３．ＩＬ－２と受容体の親和性測定
表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）は、ヒトＩＬ－２受容体（ＩＬ２ＲαまたはＩＬ－２Ｒβγ）に結合する本発明の免疫複合体の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を決定するために使用された。ＳＰＲの原理により、偏光ビームがプリズムの端面に一定の角度で入射すると、プリズムと金膜の界面で表面プラズモン波が発生し、金属膜内の自由電子の共鳴、すなわち表面プラズモン共鳴を引き起こした。分析時、まずセンシングチップの表面に一層のタンパク質を固定し、次に測定対象の試料がチップ表面を流れ、チップ表面のタンパク質と相互作用可能な分子が試料中に存在すると、金膜表面の屈折率変化を引き起こし、最終的にＳＰＲ角度の変化につながり、ＳＰＲ角度の変化を検出することにより、被分析物の親和性、動力学定数などの情報を得た。

【0225】

本実施例は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ）により免疫複合体とＩＬ－２受容体のＫ_Ｄを測定し、具体的な方法は次のとおりであった：ビオチンタグを含むＩＬ２ＲαおよびＩＬ２Ｒβγタンパク質をそれぞれＳＡ（ストレプトアビジン）がカップリングされたチップ表面に捕獲した後、チップ表面タンパク質と、移動相中で検討した免疫複合体および対照分子との間の結合および解離を検出することにより、親和性と速度定数を得た。

【0226】

この方法は、チップの調製および親和性の検出を含んだ。測定プロセスは、１０倍に希釈した１０×ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＢＲ－１００６－６９、Ｃγｔｉｖａ）を実験緩衝液として使用した。チップの調製プロセスは、アミノカップリングキット（ＢＲ－１００６－３３、Ｃγｔｉｖａ）を使用し、ＳＡをＣＭ５チップ（２９－１４９６－０３、Ｃγｔｉｖａ）の表面にカップリングし、カップリングした後、１Ｍのエタノールアミンを注入して残りの活性化部位をブロッキングした。親和性検出に関しては、各サイクルは、受容体の捕獲、特定濃度の研究対象の分子への結合、およびチップの再生を含んだ。勾配希釈された分子（分子濃度勾配は０ｎＭ～４００ｎＭ）が、流速３０μＬ／ｍｉｎで低濃度から高濃度の順にチップ表面を流れ、結合時間１８０ｓ、解離時間３００ｓであった。最後に、５ｍＭのＮａＯＨ（ＢＲ－１００３－５８、Ｃｙｔｉｖａ）を使用してチップを再生した。データ結果は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００分析ソフトウェア（バージョン３．１）を使用し、分析１：１結合または定常状態分析モデルを使用して分析された。

【0227】

Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ、Ｔ２００）は、研究対象の免疫複合体または対照分子とヒトＰＤ１（製品番号：ＰＤ１－Ｈ５２２１、ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍ）の親和性を測定し、具体的な方法は次のとおりであった：研究対象の分子をＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（２９１２７５５５、Ｃｙｔｉｖａ）がカップリングされた表面に捕獲した後、チップ表面分子と移動相中の抗原との間の結合および解離を検出することによって、親和性と速度定数を得た。測定プロセスは、１０倍に希釈した１０×ＨＢＳ－ＥＰ＋（ＢＲ－１００６－６９、Ｃγｔｉｖａ）を実験緩衝液として使用した。親和性検出に関しては、各サイクルは、研究対象の分子の捕獲、特定濃度の抗原への結合、およびチップの再生を含んだ。勾配希釈された抗原（研究対象の分子と結合する場合、抗原の濃度勾配は０ｎＭ～４０ｎＭ）が、流速３０μＬ／ｍｉｎで低濃度から高濃度の順にチップ表面を流れ、結合時間１８０ｓ、解離時間６００ｓであった。最後に、１０ｍＭのＧｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌを使用し、ｐＨ１．５（ＢＲ－１００３－５４、Ｃｙｔｉｖａ）でチップを再生した。データ結果は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００分析ソフトウェア（バージョン３．１）を使用し、１：１結合モデルを使用して分析された。

【0228】

表２と図３は、それぞれ免疫複合体または対照分子のＩＬ－２Ｒβγに対する結合定数と結合曲線であり、３０１０はＦｃと融合した野生型ＩＬ－２配列であり、配列は配列リストを参照し、その親和性は１．０９ｎＭであり、２０６１（ＵＳ２０１８０３２６０１０Ａ１に由来）は対照分子であり、ＩＬ－２Ｒβγに対する２０６１の親和性は１．４８ｎＭであり、本研究におけるＩＬ－２免疫複合体の親和性はいずれも３０１０および２０６１より弱いであった。

【0229】

表３と図４は、それぞれ免疫複合体または対照分子のＩＬ－２Ｒαに対する親和性と結合曲線であり、ＩＬ－２Ｒαに対する３０１０の親和性は４．３８Ｅ－０８Ｍであり、２０６１は非結合であり、本研究における二重特異性分子は、ＩＬ－２Ｒαに対する結合が野生型ＩＬ－２より弱いが、対照分子２０６１より強いであった。

【0230】

表４と図５は、それぞれ免疫複合体または対照分子のヒトＰＤ１に対する親和性と結合曲線であり、対照分子と本研究の分子は両方ともヒトＰＤ１に対して強い親和性を有した。

【0231】

【表5】

【0232】

【表6】

【0233】

【表7】

【0234】

実施例４．免疫複合体のインビトロ活性アッセイ
１．ＣＴＬＬ２（ｈｕＰＤ１－）およびＣＴＬＬ２－ｈＰＤ－１（ｈｕＰＤ１＋）におけるＰＤ－１の活性検出
ＩＬ－２は、ＣＴＬＬ２細胞表面のＩＬ－２受容体に結合し、ＣＴＬＬ２ ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化し、レポーター遺伝子シグナルを誘導した。ＣＴＬＬ２細胞株表面でヒトＰＤ－１（ｈＰＤ－１、ｕｎｐｒｏｔ：Ｑ１５１１６）を過剰発現させ、ｈＰＤ－１の濃縮作用下でＣＴＬＬ２ ＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路をさらに強化する可能性があった。

【0235】

ＣＴＬＬ２－ｈＰＤ－１細胞株の構築：
Ｌｅｎｔｖｉｒｕｓ＋ｈＰＤ－１レンチウイルスの構築とパッケージ化：
１．６ｘ１０＾６個の２９３Ｔ細胞をＴ７５培養フラスコにプレーティングして、融合率が７５％～８０％に達するようにした。

【0236】

２．以下の表に示すように、均一に混合してパッケージシステムをし、室温で１５分間静置した。

【0237】

【表8】

３．予めペトリ皿培地を捨て、新鮮な１０％ＦＢＳ（ＰＥＡＫ）ＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ）培地を６ｍＬ加えた。

【0238】

４．ステップ＜３＞で交換した後の培地に、ステップ＜２＞で調製した中パッケージシステムを添加し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内で４ｈ～６ｈ静置した。

【0239】

５．３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーター内に４ｈ～６ｈ静置した後、２％血清を除去したＤＭＥＭ培地に交換して培養し、それぞれ４８ｈと７２ｈでウイルスを収集した。

【0240】

６．ウイルス濃縮は、収集したウイルスを遠心分離し、０．４５μｍフィルター膜で濾過した。各成分の体積比は、ウイルス上清：５０％のＰＥＧ８０００：５ＭのＮａＣｌ＝８７：１０：３であり、均一に混合し、４℃で一晩濃縮した。４℃、３０００ｇ、２０ｍｉｎ遠心分離し、１ｍＬのＣＴＳ培地（Ｇｉｂｃｏ、Ａ３０２１００２）にウイルスを再懸濁し、４℃で溶解し、－８０℃で保存した。

【0241】

ＣＴＬＬ２（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＳ２０２８Ｂ０４）をＬｅｎｔｖｉｒｕｓ＋ｈＰＤ－１に感染させ、圧力スクリーニングとソーティングを通じてＣＴＬＬ２－ｈＰＤ－１安定形質転換細胞株を得た。

【0242】

実験方法：
１．Ａｓｓａｙ Ｍｅｄｉｕｍ：１％のＭＥＭ ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ、１１１４０－０５０）、１０％のＦＢＳ（ＰＥＡＫ、ＰＳ－ＦＢ１）および８９％のＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ、１２４４０－０５３）を配置した。

【0243】

２．ＣＴＬＬ２またはＣＴＬＬ２－ｈＰＤ－１細胞をＡｓｓａｙ Ｍｅｄｉｕｍで２回洗浄した。

【0244】

３．０．４ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ２（Ｒ＆Ｄ、２０２－ＩＬ）を含むＡｓｓａｙ Ｍｅｄｉｕｍを使用してＣＴＬＬ２またはＣＴＬＬ２－ｈＰＤ－１細胞の密度を調整し、９６ウェル白色細胞培養プレート（ＮＵＮＣ）の中央に、各ウェルに５００００個の細胞をプレーティングした。

【0245】

４．エッジウェルに等体積のＡｓｓａｙ Ｍｅｄｉｕｍをプレーティングし、５％ＣＯ_２、３７℃で１８ｈ～２０ｈ飢餓処理をした。

【0246】

５．希釈した被験免疫複合体分子を細胞プレートにそれぞれ加え、５％ＣＯ_２、３７℃で６ｈインキュベートした。

【0247】

６．培養プレートを取り出し、室温で１５ｍｉｎ～２０ｍｉｎ平衡化し、各ウェルに等体積のＬｕｃｉｆｅｒｅａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ試薬（Ｂｉｏ－Ｇｌｏ）を加え、室温で５ｍｉｎ～１５ｍｉｎインキュベートし、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み取った。

【0248】

結果は図６に示された。図６の結果は、本研究のαＰＤ－１／ＩＬ－２ｍ免疫複合体は、ＰＤ－１陽性のＣＴＬＬ２細胞上の活性がＰＤ－１陰性のＣＴＬＬ２細胞上の活性より強く、ここで、２１３２の２つの細胞間での活性（ＥＣ５０）は２４倍の選択性を有し、２０６３の選択性は４２倍、２１４９の選択性は１１５倍、２２１９の選択性は５００倍、２２１３と２２１４の選択性は＞１００００倍であることを示した。この結果は、本発明の免疫複合体分子がＰＤ－１陽性のＣＴＬＬ２細胞を選択的に活性化し得ることを示した。

【0249】

二、ＰＢＭＣ細胞におけるαＰＤ－１／ＩＬ２ｍ免疫複合体分子のｐＳＴＡＴ５シグナルの検出
ＩＬ－２とＴ細胞表面ＩＬ－２受容体との結合は、Ｔリンパ球のＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル経路を活性化し、ここで、ＳＴＡＴ５リン酸化レベルは、当該シグナル経路の活性化レベルを評価する重要な指標であった。

【0250】

実験方法：
１．ＰＢＭＣ細胞の蘇生
（１）、ＰＢＭＣ細胞を液体窒素で凍結し（ＭｉａｏｔｏｎｇＢｉｏｔｅｃｈ、商品番号ＰＢ１００Ｃ）、３７℃ですばやく振って融解した。

【0251】

（２）、細胞を１０ｍＬのＣＴＳ培地（Ｇｉｂｃｏ）にゆっくりと加え、培地を事前に３７℃に予熱し、１００μＬのＤＮＡ酵素（ＳＴＲＭＣＥＬＬ、商品番号０７９００）を加えた。

【0252】

（３）、３００ｇ／８ｍｉｎで遠心分離し、上清を除去した。

【0253】

（４）、１０ｍＬのＣＴＳで再懸濁し、Ｔ７５培養フラスコに移し、３７℃で５％のインキュベーターで一晩安定化した。

【0254】

２．ｐＳＴＡＴ５実験
（１）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ^ＴＭ４８８Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ａ２０１８１）を使用してＰＤ－１ｍＡｂ（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ、ＡＤＩ－１１４１６）を標識し、ＡＦ４８８－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＰＤ－１蛍光抗体を調製し、蛍光抗体で一晩培養したＰＢＭＣ浮遊細胞を標識した。

【0255】

（２）、標識されたＰＢＭＣ懸濁細胞を５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で９６ウェルＵ字型プレートにプレーティングした。

【0256】

（３）、異なる希釈濃度の被験免疫複合体を９６ウェルプレートに加え、被験試料と細胞を３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。

【0257】

（４）、４００ｇ／５ｍｉｎで遠心分離し、上清を除去した。

【0258】

（５）、２００μＬ／ウェルで、４％の組織細胞固定液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｐ１１１０）を加え、常温で４００ｇ／３０ｍｉｎ遠心分離した。

【0259】

（６）、破膜液を２００μＬ／ウェルで加え、４℃で３０ｍｉｎ静置し、４００ｇ／１０ｍｉｎ遠心分離した。

【0260】

（７）、ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ）を２００μＬ／ウェルで加え、細胞を共に２回洗浄した。

【0261】

（８）、抗体染色溶液を配置し、ＡＦ６４７－ｐＳＴＡＴ５抗体の量は３μＬ／１００μＬのｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／ｗｅｌｌであり、残りの染色抗体は１μＬ／１００μＬのｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／ｗｅｌｌであり、室温で１．５ｈインキュベートし、ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。

【0262】

【表9】

【0263】

（９）、１５０μＬのｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／ｗｅｌｌで再懸濁し、フローサイトメトリーを行った。

三、活性化されたＰＢＭＣ細胞における免疫複合体分子のｐＳＴＡＴ５シグナルの検出
Ｔリンパ球が活性化された後、ＰＤ－１の作用下で、活性化Ｔリンパ球のｐＳＴＡＴ５シグナルに対する免疫複合体の影響を調査し、検証した。

【0264】

１．ＰＢＭＣ細胞の蘇生
（１）、ＰＢＭＣ細胞を液体窒素で凍結し、３７℃ですばやく振って融解した。

【0265】

（２）、細胞を１０ｍＬのＣＴＳ培地（３７℃で予熱し、１００μＬのＤＮＡ酵素を含む）にゆっくりと加えた。

【0266】

（３）、３００ｇ／８ｍｉｎで遠心分離し、上清を除去した。

【0267】

（４）、１０ｍＬのＣＴＳで再懸濁し、Ｔ７５培養フラスコに移し、３７℃で５％のインキュベーターで一晩安定化した。

【0268】

２．Ｔリンパ球の活性化と静止
（１）、一晩培養したＰＢＭＣから懸濁細胞を取り出し、細胞をカウントし、細胞の数と同等のＣＤ３／ＣＤ２８ Ｂｅａｄｓを加え、４８ｈ活性化して刺激した。

【0269】

（２）、Ｂｅａｄｓと培地を除去し、活性化細胞を洗浄した。

【0270】

（３）、活性化細胞をＴ７５培養フラスコに移し、３７℃、５％で４８ｈ静止した。

【0271】

３．ｐＳＴＡＴ５実験
（１）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ^ＴＭ４８８Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ａ２０１８１）を使用してＰＤ－１ｍＡｂ（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ、ＡＤＩ－１１４１６）を標識し、ＡＦ４８８－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＰＤ－１蛍光抗体を調製し、蛍光抗体で活性化Ｔ細胞と静止Ｔ細胞を標識した。

【0272】

（２）、５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞数で９６ウェルＵ字型プレートにプレーティングした。

【0273】

（３）、異なる希釈度の検出分子をそれぞれ９６ウェルプレートに加え、検出分子を細胞とともに３７℃で３０ｍｉｎインキュベートした。

【0274】

（４）、４００ｇ／５ｍｉｎで遠心分離し、上清を除去した。

【0275】

（５）、２００μＬ／ウェルで、４％の組織細胞固定液を加え、常温で４００ｇ／３０ｍｉｎ遠心分離した。

【0276】

（６）、破膜液を２００μＬ／ウェルで加え、４℃で３０ｍｉｎ静置し、４００ｇ／１０ｍｉｎ遠心分離した。

【0277】

（７）、ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ／ウェルで加え、細胞を共に２回洗浄した。

【0278】

（８）、抗体染色溶液を配置し、ｐＳＴＡＴ５抗体（ＢＤ）の量は３μＬ／１００μＬのｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／ｗｅｌｌであり、残りの染色抗体は１μＬ／１００μＬのｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／ｗｅｌｌであり、室温で１．５ｈインキュベートし、ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄した。

【0279】

（９）、１５０μＬのｐｅｒｍ／ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ／ｗｅｌｌで再懸濁し、フローサイトメトリーを行った。

【0280】

図７の結果は、ＰＤ－１陰性（ＰＤ－１－）のＴ細胞（ＣＤ４＋ＰＤ１－ＴまたはＣＤ８＋ＰＤ１－Ｔ）において、本研究の分子活性がいずれも対照分子２０６１より弱いことを示し、ＰＤ－１陽性（ＰＤ－１＋）のＴ細胞（ＣＤ４＋ＰＤ１＋ＴまたはＣＤ８＋ＰＤ１＋Ｔ）において、２０６３の活性は対照分子２０６１より優れており、２０６３のＰＤ－１に対する選択性は２０６１より大きいことが示され、本研究の他のいくつかの分子もＰＤ－１＋のＴ細胞において活性が２０６１より弱く、本研究の分子は高活性ＩＬ－２による毒性が２０６１より小さく、インビボで耐え得る用量も２０６１より高いことが示された。
四、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ^ＴＭ ＩＬ－２ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙによる本発明の免疫複合体の活性の検出
ＨＥＫ２９３細胞において、ＩＬ２Ｒ（ＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＣＤ１３２）、ＪＡＫ３およびＳＴＡＴ５遺伝子の過剰発現を導入して、ＩＬ２シグナル伝達経路を持つＨＥＫ２９３＋ｈＩＬ２Ｒ／ＳＥＡＰ細胞株（ｈｕＰＤ－１－細胞、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ^ＴＭ ＩＬ－２ Ｃｅｌｌｓ、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ｈｋｂ－ｉｌ２）を構築し、ＩＬ２の作用下で、ＨＥＫ２９３＋ｈＩＬ２Ｒ／ＳＥＡＰ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｅｒレポーター遺伝子を活性化した。

【0281】

【表10】

【0282】

ＨＥＫ２９３＋ｈＩＬ２Ｒ＋ｈＰＤ－１／ＳＥＡＰ細胞株の構築：以下の実験のために、上記のようにＬｅｎｔｖｉｒｕｓ＋ｈＰＤ－１レンチウイルスを構築およびパッケージングし、ＨＥＫ２９３＋ｈＩＬ２Ｒ／ＳＥＡＰ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ、ｈｋｂ－ｉｌ２）をＬｅｎｔｖｉｒｕｓ＋ｈＰＤ－１で感染させ、ＨＥＫ２９３＋ｈＩＬ２Ｒ＋ｈＰＤ－１／ＳＥＡＰ安定形質転換細胞株（ｈｕＰＤ－１＋細胞）を加圧スクリーニングとソーティングした。

【0283】

実験方法：
１．細胞を消化し、細胞密度を調整し、６０ウェルの中央に、各ウェルに５００００個の細胞をプレーティングした。

【0284】

２．図に示すように、希釈した免疫複合体と対照分子をそれぞれ対応する細胞ウェルプレートに加え、３７℃で２０ｈ～２４ｈインキュベートした。

【0285】

４．２０μＬの細胞培養上清を１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅに加え、室温で１５ｍｉｎ放置し、ＯＤ６３０を測定した。

【0286】

ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ^ＴＭ ＩＬ－２ Ｃｅｌｌｓ（ｈｕＰＤ－１－細胞）は、ＩＬ－２受容体を過剰発現したＨＥＫ２９３細胞であった。図８および表４からわかるように、本研究で得られた免疫複合体のＩＬ－２活性は、２０６１より最小３．１４倍弱く、最大２．２１Ｅ＋０８倍まで弱まった。

【0287】

ＰＤ－１を過剰発現した細胞（ＨＥＫ２９３＋ｈＩＬ２Ｒ＋ｈＰＤ－１／ＳＥＡＰ安定形質導入細胞株（ｈｕＰＤ－１＋細胞））において、免疫複合体は強力なＩＬ－２活性に達することができ、２つの細胞で高い選択性を維持し、２０６３の選択性は３．５２倍、２１３２の選択性は５３．４５倍、２１４９の選択性は９６．０４倍、２２１９は６０６．１１倍、２２１４は５１１９．７８倍、２２１３は１．５７Ｅ＋０７倍に達することができた。

【0288】

【表11】

実施例５．免疫複合体のインビボ薬効実験
αＰＤ－１／ＩＬ２ｍ免疫複合体のインビボでの薬効を証明するために、ＭＣ３８細胞（マウス結腸癌細胞株、上海和元生物）を使用してｈＰＤ－１ノックインマウスに接種し、本発明の二機能性ＰＤ－１抗体およびＩＬ－２変異分子免疫複合体（２０６３、２１３２）の抗腫瘍薬効を測定した。実験は、ＳＰＦグレードの雌性ｈＰＤ－１ノックインマウス（ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＭＯＤＥＬ ＯＲＧＡＮＩＳＭＳから購入）を使用し、認証番号はＮＯ．２０１７００１０００５７４８であった。

【0289】

ＭＣ３８細胞を定期的に継代培養してその後のインビボ実験に使用した。遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳ（１×）でＭＣ３８細胞を再懸濁し、細胞濃度が５×１０^６個／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。０日目に細胞懸濁液０．２ｍＬを取ってｈＰＤ－１ノックインマウスの右腹部領域に皮下接種し、ＭＣ３８担腫瘍マウスモデルを確立した。

【0290】

腫瘍細胞接種の６日後、各マウスの腫瘍体積を検出し、群分けを行い（１群あたり８匹のマウス）、投与量および投与方式は表５に示された。

【0291】

【表12】

【0292】

ｈ－ＩｇＧ、２０６３および２１３２をそれぞれ２ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用し、週に１回、合計３回（ＱＷｘ３）投与した。ＭＣ３８細胞接種後の６日目、１３日目、２０日目にそれぞれ投与し、図９Ａに示すように、マウスの腫瘍体積と体重を週に２回モニタリングし、２４日後にモニタリングを終了した。

【0293】

接種後の２４日目に、相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を算出し、算出式は、ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積－対照群投与前腫瘍体積）であった。腫瘍体積の測定：ノギスを用いて腫瘍の最大長軸（Ｌ）と最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積は下記式：Ｖ＝Ｌ×Ｗ^２／２に従って計算された。電子天びんを用いて体重を測定した。

【0294】

腫瘍阻害率の結果を表６に示した。接種後２４日目に、ｈ－ＩｇＧ，２０ｍｇ／ｋｇ群と比較して、２０６３および２１３２の腫瘍阻害率はそれぞれ９８％および９６％であった。同時に、マウス体重の検出結果（図９Ｂ）から、接種後の２４日目に、マウスの体重は有意差がないことが示された。

【0295】

【表13】

αＰＤ－１／ＩＬ２ｍ免疫複合体のインビボ薬効が親抗ＰＤ－１モノクローナル抗体（Ｓｉｎｔｉｌｉｍａｂ、ＩＢＩ３０８とも称される）より優れていることをさらに証明するために、ＭＣ３８細胞（マウス結腸癌細胞株、上海和元生物）を使用してｈＰＤ－１ノックインマウスを接種し、本発明の免疫複合体（２０６３）の抗腫瘍薬効を測定した。実験は、ＳＰＦグレードの雌性ｈＰＤ－１ノックインマウス（ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＭＯＤＥＬ ＯＲＧＡＮＩＳＭＳから購入）を使用し、認証番号はＮＯ．２０１７００１０００４２３７であった。

【0296】

ＭＣ３８細胞を定期的に継代培養してその後のインビボ実験に使用した。遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳ（１×）でＭＣ３８細胞を再懸濁し、細胞濃度が５×１０^６個／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。０日目に細胞懸濁液０．２ｍＬを取ってｈＰＤ－１ノックインマウスの右腹部領域に皮下接種し、ＭＣ３８担腫瘍マウスモデルを確立した。

【0297】

腫瘍細胞接種の１２日後、各マウスの腫瘍体積を検出し、群分けを行い（１群あたり８匹のマウス）、投与量および投与方式は表７に示された。

【0298】

【表14】

【0299】

ｈ－ＩｇＧ、２０６３およびＩＢＩ３０８をすべて１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用し、週に１回、合計３回（ＱＷｘ３）投与した。ＭＣ３８細胞接種後の１２日目、１９日目、２６日目にそれぞれ投与し、図１０Ａに示すように、マウスの腫瘍体積と体重を週に２回モニタリングし、２９日後にモニタリングを終了した。接種後の２９日目に、相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を算出し、算出式は、ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積－対照群投与前腫瘍体積）であった。腫瘍体積の測定：ノギスを用いて腫瘍の最大長軸（Ｌ）と最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積は下記式：Ｖ＝Ｌ×Ｗ^２／２に従って計算された。電子天びんを用いて体重を測定した。

【0300】

腫瘍阻害率の結果を表８に示した。接種後２９日目に、ｈ－ＩｇＧ，２０ｍｇ／ｋｇ群と比較して、２０６３およびＩＢＩ３０８の腫瘍阻害率はそれぞれ１１２％および５６％であった。同時に、マウス体重の検出結果（図１０Ｂ）から、接種後の２９日目に、マウスの体重は有意差がないことが示された。

【0301】

【表15】

【0302】

αＰＤ－１／ＩＬ２ｍ免疫複合体のインビボ薬効をさらに証明するために、ＰＤ－１抗体耐性Ｂ１６Ｆ１０細胞（マウス黒色腫細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６４７５）を使用してｈＰＤ－１ノックインマウスに接種し、本発明のαＰＤ－１／ＩＬ２ｍ免疫複合体（２０６３）、親抗ＰＤ－１モノクローナル抗体（ＩＢＩ３０８）、およびＰＤ－１モノクローナル抗体とＩＬ２ｍ－Ｆｃ融合タンパク質（２１２４、ＩＬ－２配列は２０６３と同じで、配列は配列表を参照）を併用投与した抗腫瘍薬効を測定した。実験は、ＳＰＦグレードの雌性ｈＰＤ－１ノックインマウス（ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＭＯＤＥＬ ＯＲＧＡＮＩＳＭＳから購入）を使用し、認証番号はＮＯ．２０１７００１０００４７６８であった。

【0303】

Ｂ１６Ｆ１０細胞を定期的に継代培養してその後のインビボ実験に使用した。遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳ（１×）でＢ１６Ｆ１０細胞を再懸濁し、細胞濃度が２．５×１０^６個／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。０日目に細胞懸濁液０．２ｍＬを取ってｈＰＤ－１ノックインマウスの右腹部領域に皮下接種し、Ｂ１６Ｆ１０担腫瘍マウスモデルを確立した。

【0304】

腫瘍細胞接種の７日後、各マウスの腫瘍体積を検出し、群分けを行い（１群あたり６匹のマウス）、投与量および投与方式は表９に示された。

【0305】

【表16】

ｈ－ＩｇＧ、ＩＢＩ３０８、２１２４および２０６３をそれぞれ１ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬおよび１ｍｇ／ｍＬの濃度で使用し、週に１回、合計３回（ＱＷｘ３）投与した。Ｂ１６Ｆ１０細胞接種後の８日目、１５日目、２２日目にそれぞれ投与し、図１１Ａ～図１１Ｃに示すように、マウスの腫瘍体積と体重を週に２回モニタリングし、２８日後にモニタリングを終了した。

【0306】

Ｂ１６Ｆ１０細胞が容易に転移してマウスの死亡を誘導するため、接種後の２２日目に、相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を算出し、算出式は、ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積－対照群投与前腫瘍体積）であった。腫瘍体積の測定：ノギスを用いて腫瘍の最大長軸（Ｌ）と最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積は下記式：Ｖ＝Ｌ×Ｗ^２／２に従って計算された。電子天びんを用いて体重を測定した。腫瘍が２０００ｍｍ^３を超えると、このマウスを安楽死させた。群内の死亡率が半数を超える場合、群全体の腫瘍増殖曲線は、この時点で示されなかった。

【0307】

腫瘍阻害率の結果を表１０に示した。接種後２２日目に、ｈ－ＩｇＧ群と比較して、ＩＢＩ３０８、ＩＢＩ３０８＋２２１４、および２０６３の腫瘍阻害率は、それぞれ２％、８４％、および９９％で、かつ２０６３のＣＲ率は、明らかにＩＢＩ３０８およびＩＢＩ３０８と非標的化ＩＬ２ｍ－Ｆｃ分子の併用（２１２４）より優れていた。同時に、マウス体重の検出結果（図１１Ｃ）から、モニタリング期間中に、マウスの体重は有意差がないことが示された。

【0308】

【表17】

【0309】

本発明のαＰＤ－１／ＩＬ２ｍ免疫複合体２１４９のインビボ薬効をさらに証明するために、ＭＣ３８細胞（マウス結腸癌細胞株、上海和元生物）を使用してｈＰＤ－１ノックインマウスを接種し、本発明の免疫複合体（２１４９）の抗腫瘍薬効を測定した。実験は、ＳＰＦグレードの雌性ｈＰＤ－１ノックインマウス（ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＭＯＤＥＬ ＯＲＧＡＮＩＳＭＳから購入）を使用し、認証番号はＮＯ．２０１７００１０００６７６２であった。

【0310】

ＭＣ３８細胞を定期的に継代培養してその後のインビボ実験に使用した。遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳ（１×）でＭＣ３８細胞を再懸濁し、細胞濃度が５×１０^６個／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。０日目に細胞懸濁液０．２ｍＬを取ってｈＰＤ－１ノックインマウスの右腹部領域に皮下接種し、ＭＣ３８担腫瘍マウスモデルを確立した。

【0311】

腫瘍細胞接種の８日後、各マウスの腫瘍体積を検出し、群分けを行い（１群あたり８匹のマウス）、投与量および投与方式は表１１に示された。

【0312】

【表18】

【0313】

ｈ－ＩｇＧ、２１４９，１０ｍｇ／ｋｇ、２１４９，２０ｍｇ／ｋｇ、および２１４９，４０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ４ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、および４ｍｇ／ｍＬの濃度で使用し、週に１回、合計３回（ＱＷｘ３）投与した。ＭＣ３８細胞接種後の８日目、１５日目、２２日目にそれぞれ投与し、図１２Ａ～図１２Ｂに示すように、マウスの腫瘍体積と体重を週に２回モニタリングした。腫瘍が２０００ｍｍ^３を超えると、マウスを安楽死させ、６１日間が終了するまで実験全体を通してマウスをモニタリングした。一部のマウス群では腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えて安楽死させたため、接種後の３６日目に相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を算出し、算出式は、ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積－対照群投与前腫瘍体積）であった。腫瘍体積の測定：ノギスを用いて腫瘍の最大長軸（Ｌ）と最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積は下記式：Ｖ＝Ｌ×Ｗ^２／２に従って計算された。電子天びんを用いて体重を測定した。

【0314】

腫瘍増殖曲線と生存曲線を図１２Ａおよび図１２Ｂに示すように、２１４９分子の異なる用量群の抗腫瘍効果は用量依存性であり、２０ｍｇ／ｋｇ群と４０ｍｇ／ｋｇ群ではマウス腫瘍が完全に退縮した。この利点は、図１２Ｂの生存曲線にも反映されており、これらの２群のマウスは、１００％腫瘍退縮したが、１０ｍｇ／ｋｇ群では、８匹のマウスのうち２匹だけの腫瘍が完全に退縮した。腫瘍阻害率の結果を表１２に示した。接種後の３６日目に、ｈ－ＩｇＧ群と比較して、２１４９，１０ｍｇ／ｋｇ、２１４９，２０ｍｇ／ｋｇ、および２１４９，４０ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率はそれぞれ８４％、１０３％、１０３％であった。同時に、マウス体重の検出結果（図１２Ｃ）から、接種後の３６日目に、マウスの体重は有意差がないことが示された。

【0315】

【表19】

【0316】

免疫複合体２１４９のインビボ薬効を証明するために、ＰＤ－１抗体耐性Ｂ１６Ｆ１０細胞（マウス黒色腫細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６４７５）を使用してｈＰＤ－１ノックインマウスに接種し、本発明の二機能性ＰＤ－１抗体およびＩＬ－２変異分子融合タンパク質（２１４９）の抗腫瘍薬効を測定した。実験は、ＳＰＦグレードの雌性ｈＰＤ－１ノックインマウス（ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＭＯＤＥＬ ＯＲＧＡＮＩＳＭＳから購入）を使用し、認証番号はＮＯ．２０１７００１０００７９０９であった。

【0317】

Ｂ１６Ｆ１０細胞を定期的に継代培養してその後のインビボ実験に使用した。遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳ（１×）でＢ１６Ｆ１０細胞を再懸濁し、細胞濃度が２．５×１０^６個／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。０日目に細胞懸濁液０．２ｍＬを取ってｈＰＤ－１ノックインマウスの右腹部領域に皮下接種し、Ｂ１６Ｆ１０担腫瘍マウスモデルを確立した。

【0318】

腫瘍細胞接種の６日後、各マウスの腫瘍体積を検出し、群分けを行い（１群あたり８匹のマウス）、投与量および投与方式は表１３に示された。

【0319】

【表20】

【0320】

ｈ－ＩｇＧ、ＩＢＩ３０８，２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＢＩ３０８，４０ｍｇ／ｋｇ、２１４９，２０ｍｇ／ｋｇおよび２１４９，４０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ４ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬおよび４ｍｇ／ｍＬの濃度で使用し、週に１回、合計３回（ＱＷｘ３）投与した。Ｂ１６Ｆ１０細胞接種後の８日目、１５日目、２２日目にそれぞれ投与し、図１３Ａ～図１３Ｂに示すように、マウスの腫瘍体積と体重を週に２回モニタリングし、２２日後にモニタリングを終了した。Ｂ１６Ｆ１０細胞が容易に転移してマウスの死亡を誘導するため、接種後の１５日目に、相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を算出し、算出式は、ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積－対照群投与前腫瘍体積）であった。腫瘍体積の測定：ノギスを用いて腫瘍の最大長軸（Ｌ）と最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積は下記式：Ｖ＝Ｌ×Ｗ^２／２に従って計算された。電子天びんを用いて体重を測定した。腫瘍が２０００ｍｍ^３を超えると、このマウスを安楽死させた。

【0321】

マウス腫瘍増殖曲線を図１３Ａおよび１３Ｂに示すように、ＰＤ１耐性モデルでは、ＩＢＩ３０８はほとんど薬効を示さなかったが、２１４９の２０ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇ群は一定の抗腫瘍効果を示し、かつ高用量の抗腫瘍効果は低用量より優れており、この効果は同時にマウスの生存曲線にも反映されており、高用量群では、実験終了時にまだ２匹のマウスの腫瘍が完全に退縮していなかった（図１３Ｃおよび表１４）。

【0322】

腫瘍阻害率の結果を表１２に示した。接種後１５日目、４０ｍｇ／ｋｇ群のｈ－ＩｇＧと比較して、ＩＢＩ３０８，２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＢＩ３０８，４０ｍｇ／ｋｇ、２１４９，２０ｍｇ／ｋｇ、および２１４９，４０ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率は、それぞれ２９％、２７％、８２％および８６％であった。同時に、マウス体重の検出結果（図１３Ｄ）から、接種後の２２日目に、マウスの体重は有意差がないことが示された。

【0323】

【表21】

【0324】

αＰＤ－１／ＩＬ２ｍ免疫複合体２１４９のインビボ薬効が対照薬物ＰＤ－１－ＩＬ２ｖ（分子番号２０６１、配列はＵＳ２０１８０３２６０１０Ａ１に由来し、配列表も参照）より優れていることを証明するために、ＰＤ－１抗体耐性Ｂ１６Ｆ１０細胞（マウス黒色腫細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６４７５）を使用してｈＰＤ－１ノックインマウスに接種し、本発明の二機能性ＰＤ－１抗体およびＩＬ－２変異分子融合タンパク質（２１４９）の抗腫瘍薬効を測定した。実験は、ＳＰＦグレードの雌性ｈＰＤ－１ノックインマウス（ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＭＯＤＥＬ ＯＲＧＡＮＩＳＭＳから購入）を使用し、認証番号はＮＯ．２０１７００１０００８９４２であった。

【0325】

Ｂ１６Ｆ１０細胞を定期的に継代培養してその後のインビボ実験に使用した。遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳ（１×）でＢ１６Ｆ１０細胞を再懸濁し、細胞濃度が２．５×１０^６個／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。０日目に細胞懸濁液０．２ｍＬを取ってｈＰＤ－１ノックインマウスの右腹部領域に皮下接種し、Ｂ１６Ｆ１０担腫瘍マウスモデルを確立した。

【0326】

腫瘍細胞接種の８日後、各マウスの腫瘍体積を検出し、群分けを行い（１群あたり７匹のマウス）、投与量および投与方式は表１５に示された。

【0327】

【表22】

【0328】

ｈ－ＩｇＧ、ＩＢＩ３０８，４０ｍｇ／ｋｇ、２０６１，１０ｍｇ／ｋｇ、２０６１，２０ｍｇ／ｋｇ、２０６１，４０ｍｇ／ｋｇ、２１４９，１０ｍｇ／ｋｇ、２１４９，２０ｍｇ／ｋｇ、および２１４９，４０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ４ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、および４ｍｇ／ｍＬの濃度で使用し、週に１回、合計３回（ＱＷｘ３）投与した。Ｂ１６Ｆ１０細胞接種後の８日目、１５日目、２２日目にそれぞれ投与し、図１４Ａに示すように、マウスの腫瘍体積と体重を週に２回モニタリングし、３３日後にモニタリングを終了した。Ｂ１６Ｆ１０細胞が容易に転移してマウスの死亡を引き起こすため、接種後の１９日目に、相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を算出し、算出式は、ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積－対照群投与前腫瘍体積）であった。腫瘍体積の測定：ノギスで腫瘍の最大長軸（Ｌ）および最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積は下記式：Ｖ＝Ｌ＊Ｗ^２／２に従って計算された。電子天びんを用いて体重を測定した。腫瘍が２０００ｍｍ^３を超えると、このマウスを安楽死させた。群内の死亡率が半数を超える場合、群全体の腫瘍増殖曲線は、この時点で示されなかった。

【0329】

腫瘍阻害率の結果を表１６に示した。接種後１９日目、ｈ－ＩｇＧ，４０ｍｇ／ｋｇ群と比較して、ＩＢＩ３０８，４０ｍｇ／ｋｇ、２０６１，１０ｍｇ／ｋｇ、２１４９，１０ｍｇ／ｋｇ、２１４９，２０ｍｇ／ｋｇ、および２１４９，４０ｍｇ／ｋｇの腫瘍阻害率は、それぞれ２１％、９６％、７９％、８７％および９７％であった。２０６１の２０ｍｇ／ｋｇおよび４０ｍｇ／ｋｇについては、最初の注射後に体重が大幅に減少し、かつマウスが死亡したため、この群のＴＧＩは計算されなかった。

【0330】

さらに、マウス生存率について統計分析を行い（図１４Ｂ）、図に示すように、本実験における２０６１と２１４９の最大投与量／耐性用量を比較すると、２１４９が４０ｍｇ／ｋｇの用量で、２０６１が１０ｍｇ／ｋｇの分子用量でマウスの生存率が高く、２１４９については、７匹のマウスのうちの３匹の腫瘍が完全に退縮したが、２０６１については１匹だけのマウスの腫瘍が完全に退縮したことが分かった。同時に、マウスの体重を検出した結果（図１４Ｃ）は、接種後の２９日目に、２１４９の各用量群のマウスの体重はいずれも減少しなかったが、２０６１群のマウスは体重が減少し、低用量（１０ｍｇ／ｋｇ）では、マウスの体重は平均５％超減少し、中用量（２０ｍｇ／ｋｇ）および高用量（４０ｍｇ／ｋｇ）ではマウスの死亡が現れ、各群のマウスは合計７匹で、６匹が死亡したことが示され、詳細は表１２に示した。２１４９は比較的安全で、低用量、中用量、高用量のいずれであっても、体重減少は明らかではなく、低用量と中用量では１匹のマウスのみが死亡したが、高用量ではマウスが死亡せず、かつ２０６１より高い完全腫瘍寛解率を有した（表１６）。したがって、２１４９は２０６１より薬効が優れており、より安全であり、より高い治療可能時間域を有した。

【0331】

【表23】

【0332】

αＰＤ－１／ＩＬ２ｍ免疫複合体２２１４のインビボ薬効を検証するために、ＭＣ３８細胞（マウス結腸癌細胞株、上海和元生物）を使用してｈＰＤ－１ノックインマウスに接種し、本発明の二機能性ＰＤ－１抗体およびＩＬ－２変異分子融合タンパク質（２２１４）の抗腫瘍薬効を測定した。実験は、ＳＰＦグレードの雌性ｈＰＤ－１ノックインマウス（ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＭＯＤＥＬ ＯＲＧＡＮＩＳＭＳから購入）を使用し、認証番号はＮＯ．２０１７００１００１０８２９であった。

【0333】

ＭＣ３８細胞を定期的に継代培養してその後のインビボ実験に使用した。遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳ（１×）でＭＣ３８細胞を再懸濁し、細胞濃度が５×１０^６個／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。０日目に細胞懸濁液０．２ｍＬを取ってｈＰＤ－１ノックインマウスの右腹部領域に皮下接種し、ＭＣ３８担腫瘍マウスモデルを確立した。

【0334】

腫瘍細胞接種の７日後、各マウスの腫瘍体積を検出し、群分けを行い（１群あたり７匹のマウス）、投与量および投与方式は表１７に示された。

【0335】

【表24】

【0336】

ｈ－ＩｇＧおよび２２１４をすべて４ｍｇ／ｍＬの濃度で使用し、週に１回、合計３回（ＱＷｘ３）投与した。ＭＣ３８細胞接種後の７日目、１４日目、２１日目にそれぞれ投与し、図１５Ａに示すように、マウスの腫瘍体積と体重を週に２回モニタリングし、５６日後にモニタリングを終了した。対照群の腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えたため、接種後の２８日目に相対腫瘍阻害率（ＴＧＩ％）を算出し、算出式は、ＴＧＩ％＝１００％×（対照群腫瘍体積－治療群腫瘍体積）／（対照群腫瘍体積－対照群投与前腫瘍体積）であった。腫瘍体積の測定：ノギスを用いて腫瘍の最大長軸（Ｌ）と最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積は下記式：Ｖ＝Ｌ×Ｗ^２／２に従って計算された。電子天びんを用いて体重を測定した。

【0337】

腫瘍阻害率の結果を表１８に示した。接種後２８日目に、ｈ－ＩｇＧ，２０ｍｇ／ｋｇ群と比較して、２２１４の腫瘍阻害率は１０４％であった。同時に、マウス体重の検出結果（図１５Ｃ）から、接種後の２８日目に、マウスの体重は有意差がないことが示された。

【0338】

【表25】

【0339】

αＰＤ－１／ＩＬ２ｍ免疫複合体２２１４のインビボ薬効を証明するために、ＰＤ－１抗体耐性Ｂ１６Ｆ１０細胞（マウス黒色腫細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－６４７５）を使用してｈＰＤ－１ノックインマウスに接種し、本発明の二機能性ＰＤ－１抗体およびＩＬ－２変異分子融合タンパク質（２２１４）の抗腫瘍薬効を測定した。実験は、ＳＰＦグレードの雌性ｈＰＤ－１ノックインマウス（ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＭＯＤＥＬ ＯＲＧＡＮＩＳＭＳから購入）を使用し、認証番号はＮＯ．２０１７００１００１０８２９であった。

【0340】

Ｂ１６Ｆ１０細胞を定期的に継代培養してその後のインビボ実験に使用した。遠心分離により細胞を収集し、ＰＢＳ（１×）でＢ１６Ｆ１０細胞を再懸濁し、細胞濃度が２．５×１０^６個／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。０日目に細胞懸濁液０．２ｍＬを取ってｈＰＤ－１ノックインマウスの右腹部領域に皮下接種し、Ｂ１６Ｆ１０担腫瘍マウスモデルを確立した。

【0341】

腫瘍細胞接種の７日後、各マウスの腫瘍体積を検出し、群分けを行い（１群あたり７匹のマウス）、投与量および投与方式は表１９に示された。

【0342】

【表26】

【0343】

ｈ－ＩｇＧ、２２１４，２０ｍｇ／ｋｇおよび２２１４，４０ｍｇ／ｋｇをそれぞれ４ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、および４ｍｇ／ｍＬの濃度で使用し、週に１回、合計３回（ＱＷｘ３）投与した。Ｂ１６Ｆ１０細胞接種後の７日目、１４日目、２１日目にそれぞれ投与し、図１６Ａ～１６Ｂに示すように、マウスの腫瘍体積と体重を週に２回モニタリングし、６３日後にモニタリングを終了した。腫瘍体積の測定：ノギスを用いて腫瘍の最大長軸（Ｌ）と最大幅軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積は下記式：Ｖ＝Ｌ×Ｗ^２／２に従って計算された。電子天びんを用いて体重を測定した。腫瘍が２０００ｍｍ^３を超えると、このマウスを安楽死させた。

【0344】

マウス生存曲線は図１６Ａに示すように、２２１４の２つの用量は、両方ともマウスの生存期間を顕著に延長することができた。同時に、マウス体重の検出結果（図１６Ｃ）から、接種後の２２日目に、マウスの体重は有意差がないことが示された。

【0345】

【表27-1】

【0346】

【表27-2】

【0347】

【表27-3】

【0348】

【表27-4】

【0349】

【表27-5】

【0350】

【表27-6】

【0351】

【表27-7】

【0352】

【表27-8】

【0353】

【表27-9】

【0354】

【表27-10】

【0355】

【表27-11】

【0356】

【表27-12】

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15A】

【図15B】

【図15C】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【配列表】

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【国際調査報告】