▶ キュー−ステート バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-20
(54)【発明の名称】ハプロ不全状態のための治療薬
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7088 20060101AFI20240912BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20240912BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240912BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20240912BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20240912BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240912BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7088
A61P25/08
A61K31/7105
A61K31/7125
A61K31/712
C12N15/113 Z ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024518376
(86)(22)【出願日】2022-09-22
(85)【翻訳文提出日】2024-05-09
(86)【国際出願番号】 US2022076859
(87)【国際公開番号】W WO2023049800
(87)【国際公開日】2023-03-30
(31)【優先権主張番号】63/247,783
(32)【優先日】2021-09-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516056971
【氏名又は名称】キュー－ステート バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｑ－Ｓｔａｔｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．
【住所又は居所原語表記】１７９ Ｓｉｄｎｅｙ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ０２１３９ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】デンプシー， グラハム ティー．
(72)【発明者】
【氏名】リワーク， ケイトリン
(72)【発明者】
【氏名】マッケイブ， マット
(72)【発明者】
【氏名】フィンク， ジェイムズ
(72)【発明者】
【氏名】ウィリアムズ， ルイス
(72)【発明者】
【氏名】ガーバー， デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】アグラワル， スディール
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA06
(57)【要約】
本発明は、ハプロ不全に関連する障害のための治療組成物に関する。本発明は、シンタキシン結合タンパク質１（ＳＴＸＢＰ１）の発現を促進することによって早期発症てんかん性脳症を処置するために有用な、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む組成物を提供し、この合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、特定のｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１タンパク質の産生に干渉することを防止するか、またはＳＴＸＢＰ１転写物の５’－ＵＴＲに結合してＳＴＸＢＰ１タンパク質の翻訳を増強する。この組成物がＳＴＸＢＰ１ハプロ不全を有する患者に送達された場合、このＡＳＯは、ｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１タンパク質の合成をダウンレギュレートすることを防止する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも１種の核酸を含む組成物であって、前記核酸は、シンタキシン結合タンパク質１（ＳＴＸＢＰｌ）の発現を促進し、前記核酸は、配列番号１～３、７～１３、１５～１８、および２３～１０７のうちの１つに対する少なくとも５０％の配列類似性；
配列番号１９に対する少なくとも６０％の配列類似性；
配列番号２２に対する少なくとも７０％の配列類似性；
配列番号６に対する少なくとも７５％の配列類似性；
配列番号２１に対する少なくとも８０％の配列類似性；
配列番号１４および２０のうちの１つに対する少なくとも８５％の配列類似性；または
配列番号４および５のうちの１つに対する少なくとも９０％の配列類似性
を有する、
組成物。
【請求項2】
前記核酸が約５塩基と約５０塩基との間の長さを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
前記核酸が、配列番号１～２５のうちの１つの内部のセグメントに対する１００％マッチを有する少なくとも約５個連続する塩基の領域を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記核酸が、リボース糖上に２’修飾を有するＲＮＡ塩基を少なくとも約５０％含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項5】
前記核酸中の塩基間結合のうちの少なくとも約５０％がホスホジエステル結合ではない、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
前記核酸中の少なくとも約１２個連続する塩基が、配列番号１～２５のうちの１つの中の対応する約１２個連続する塩基に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項7】
前記核酸の塩基の過半数が２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボースを有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項8】
前記核酸中の過半数の塩基間結合がホスホロチオエート結合である、請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
前記核酸中の塩基のすべてが２’－Ｏ－メトキシエチルリボース糖を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
前記核酸が配列番号１～２５のうちの１つに対する少なくとも８８％の配列類似性を有し、前記核酸中の塩基のすべてが２’－Ｏ－メトキシエチルリボース糖を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
前記核酸が配列番号１～２５のうちの１つに対する少なくとも９４％の配列類似性を有し、前記核酸中の塩基のすべてが２’－Ｏ－メトキシエチルリボース糖を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項12】
前記核酸中の少なくとも約９０％の塩基間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項13】
前記核酸が配列番号１～２５のうちの１つに対する１００％の配列類似性を有し、前記核酸中の塩基のすべてが２’－Ｏ－メトキシエチルリボース糖を含み、すべての場合のＵおよびＣが５位でメチル化されており、前記核酸中のすべての塩基間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１に記載の組成物。
【請求項14】
以下の特徴（ａ）～（ｌ）：（ａ）前記核酸がｍｉＲ－４２３－３ｐの結合部位にハイブリダイズしてｍｉＲ－４２３－３ｐの結合を遮断し、前記核酸は、配列番号１、２、および３からなる群より選択される核酸に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；
（ｂ）前記核酸がｍｉＲ－４９１－５ｐの結合部位にハイブリダイズしてｍｉＲ－４９１－５ｐの結合を遮断し、前記核酸は、配列番号４および５からなる群より選択される核酸に対する少なくとも９０％の配列類似性を有する；
（ｃ）前記核酸がｍｉＲ－３３８－３ｐの結合部位にハイブリダイズしてｍｉＲ－３３８－３ｐの結合を遮断し、前記核酸は配列番号６に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；
（ｄ）前記核酸がｍｉＲ－ｌ－３ｐの結合部位にハイブリダイズしてｍｉＲ－ｌ－３ｐの結合を遮断し、前記核酸は、配列番号７、８、９、２３、２４、および２５からなる群より選択される核酸に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；
（ｅ）前記核酸がｍｉＲ－４２３－５ｐの結合部位にハイブリダイズしてｍｉＲ－４２３－５ｐの結合を遮断し、前記核酸は配列番号１０に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；
（ｆ）前記核酸がｍｉＲ－１５４－５ｐの結合部位にハイブリダイズしてｍｉＲ－１５４－５ｐの結合を遮断し、前記核酸は、配列番号１１および１２からなる群より選択される核酸に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；
（ｇ）前記核酸がｍｉＲ－２１９ａ－５ｐの結合部位にハイブリダイズしてｍｉＲ－２１９ａ－５ｐの結合を遮断し、前記核酸は配列番号１３に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；
（ｈ）前記核酸がｍｉＲ－４２４－５ｐの結合部位にハイブリダイズしてｍｉＲ－４２４－５ｐの結合を遮断し、前記核酸は配列番号１４に対する少なくとも８５％の配列類似性を有する；
（ｉ）前記核酸がｍｉＲ－３０ｂ－５ｐの結合部位にハイブリダイズしてｍｉＲ－３０ｂ－５ｐの結合を遮断し、前記核酸は配列番号１５、１６、および１７からなる群より選択される核酸に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；
（ｊ）前記核酸がｍｉＲ－１４１－３ｐの結合部位にハイブリダイズしてｍｉＲ－１４１－３ｐの結合を遮断し、前記核酸は、配列番号１８および１９からなる群より選択される核酸に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；
（ｋ）前記核酸がｍｉＲ－２１８－５ｐの結合部位にハイブリダイズしてｍｉＲ－２１８－５ｐの結合を遮断し、前記核酸は、配列番号２０に対する少なくとも８５％の配列類似性または配列番号２１に対する少なくとも８０％の配列類似性を有する；ならびに
（ｌ）前記核酸がｍｉＲ－１４３－３ｐの結合部位にハイブリダイズしてｍｉＲ－１４３－３ｐの結合を遮断し、前記核酸は配列番号２２に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する
のうちの１つをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項15】
前記核酸が配列番号１～２５のうちの１つに対する１００％の配列類似性を有する、請求項１４に記載の組成物。
【請求項16】
前記核酸中の塩基の過半数が２’－Ｏ－メトキシエチルリボース糖を含み、かつ／または前記核酸中の過半数の塩基間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１４または請求項１５に記載の組成物。
【請求項17】
前記核酸中の塩基のすべてが２’－Ｏ－メトキシエチルリボース糖を含み、前記核酸中のすべての塩基間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１４または請求項１５に記載の組成物。
【請求項18】
前記核酸が配列番号２６～４９のうちの１つに対する少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項19】
前記塩基間結合のすべてがホスホジエステルである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項20】
前記核酸が配列番号５０～７３のうちの１つに対する少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項21】
前記塩基間結合のすべてがホスホロチオエートである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項22】
早期発症てんかん性脳症を処置する方法であって、それを必要とする患者に請求項１に記載の組成物を送達する工程
を含む、方法。
【請求項23】
前記組成物が血液脳関門を越えて送達される、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記組成物が髄腔内注射によって送達される、請求項２２に記載の方法。
【請求項25】
前記送達する工程が、前記患者においてシンタキシン結合タンパク質ＳＴＸＢＰ１の増加した発現をもたらす、請求項２２に記載の方法。
【請求項26】
ＳＴＸＢＰ１遺伝子におけるヘテロ接合性機能欠失変異を同定することによって前記患者を選択する工程をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項27】
前記核酸が配列番号７４～１０７のうちの１つに対する少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項28】
前記塩基間結合の過半数またはすべてがホスホジエステルである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項29】
前記核酸中の塩基の過半数が２’－Ｏ－メトキシエチルリボース糖を含む、請求項２７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（技術分野）
本発明は、ハプロ不全に関連する障害のための治療組成物に関する。
本発明は、ハプロ不全に関連する障害のための治療組成物に関する。
【0002】
（配列表）
本出願は、本出願とともに提出されたＳＴ．２６フォーマットの電子配列表を含み、この電子配列表を参照によって援用する。２０２２年９月２２日に作成したこの配列表は、「ＱＳＴＡ－０４４－０１ＷＯ－Ｓｅｑｕｅｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」と名付けられており、サイズは９８キロバイトである。
本出願は、本出願とともに提出されたＳＴ．２６フォーマットの電子配列表を含み、この電子配列表を参照によって援用する。２０２２年９月２２日に作成したこの配列表は、「ＱＳＴＡ－０４４－０１ＷＯ－Ｓｅｑｕｅｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｘｍｌ」と名付けられており、サイズは９８キロバイトである。
【背景技術】
【0003】
（背景）
早期発症てんかん性脳症は、重篤なてんかん性活動に関連し最終的な認知・感覚・運動の機能の低下に関連する、知的障害および脳機能障害によって特徴付けられる、破壊的でしばしば致死的な状態である。そのような状態は発症、転帰、および重篤度が変化するだけではなく、そのてんかんは一般には難治性てんかんとして現れ、このことは、それらのてんかんが抗てんかん薬に反応しないことを意味する。したがって、難治性早期発症てんかんを有して生まれた乳児は、非常に悪い予後を有する。
早期発症てんかん性脳症は、重篤なてんかん性活動に関連し最終的な認知・感覚・運動の機能の低下に関連する、知的障害および脳機能障害によって特徴付けられる、破壊的でしばしば致死的な状態である。そのような状態は発症、転帰、および重篤度が変化するだけではなく、そのてんかんは一般には難治性てんかんとして現れ、このことは、それらのてんかんが抗てんかん薬に反応しないことを意味する。したがって、難治性早期発症てんかんを有して生まれた乳児は、非常に悪い予後を有する。
【0004】
難治性早期発症てんかんの症状としては、重篤な言語障害、社会的相互作用を処理する困難性、微細運動の困難性、多動性、失調および振戦、ならびに自閉症の特徴が挙げられる。抗てんかん薬に反応しないてんかん患者には、限定的な選択肢しか存在しない。食事の変更または電気的ニューロモデュレーションによるいくつかの成功が報告されている。しかし、すべての症例が治療可能であるわけではなく、一部の人々は、この状態とともに生きるという難題に直面している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
（概要）
本発明は、シンタキシン結合タンパク質１（ＳＴＸＢＰ１）の発現を促進することによって早期発症てんかん性脳症を処置するために有用な、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。一部の個体は、ＳＴＸＢＰ１をコードするＳＴＸＢＰ１遺伝子上にヘテロ接合性機能欠失変異を有して生まれ、これは、ＳＴＸＢＰ１のハプロ不全として知られる状態である。ＳＴＸＢＰ１のハプロ不全において、ＳＴＸＢＰ１遺伝子の完全に機能的なコピーは１つだけしか存在しない。神経発生の間に、すべてのＳＴＸＢＰ１タンパク質は、その遺伝子のその１つのコピーをプレｍＲＮＡへと転写し、そのプレｍＲＮＡをｍＲＮＡへとスプライシングし、そのｍＲＮＡをタンパク質へと翻訳することによって、産生されなければならない。本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が遺伝子調節においてある役割を果たし得てＳＴＸＢＰ１タンパク質の産生に干渉し得るという、ある洞察を利用する。詳細には、特定のｍｉＲＮＡが、ＳＴＸＢＰ１ ＲＮＡに結合し得てタンパク質産生を防止し得る。本発明の実施形態は、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む組成物を提供し、この合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、特定のｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１タンパク質の産生に干渉することを防止する。本発明はまた、ＳＴＸＢＰ１ ｍＲＮＡの特徴が翻訳効率を妨害し得るという洞察を利用する。詳細には、ＳＴＸＢＰ１ ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は安定なヘアピンを形成し得、このヘアピンは、翻訳機構の動員を阻害する。さらに、ＳＴＸＢＰ１ ｍＲＮＡは、翻訳が開始し得る上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）を含み得、これにより、その下流の主要オープンリーディングフレームでの開始を阻害する。本発明の一部の実施形態は、ＡＳＯを含む組成物を提供し、このＡＳＯは、ヘアピンを不安定化し、かつ／またはｕＯＲＦをマスクすることによって、ＳＴＸＢＰ１タンパク質の翻訳を改善する。ＳＴＸＢＰ１ハプロ不全を有する患者に送達された場合、本発明のＡＳＯは、ｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１タンパク質の合成をダウンレギュレートすることを防止し、かつ／またはヘアピンもしくはｕＯＲＦが翻訳効率を妨害することを防止する。
本発明は、シンタキシン結合タンパク質１（ＳＴＸＢＰ１）の発現を促進することによって早期発症てんかん性脳症を処置するために有用な、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。一部の個体は、ＳＴＸＢＰ１をコードするＳＴＸＢＰ１遺伝子上にヘテロ接合性機能欠失変異を有して生まれ、これは、ＳＴＸＢＰ１のハプロ不全として知られる状態である。ＳＴＸＢＰ１のハプロ不全において、ＳＴＸＢＰ１遺伝子の完全に機能的なコピーは１つだけしか存在しない。神経発生の間に、すべてのＳＴＸＢＰ１タンパク質は、その遺伝子のその１つのコピーをプレｍＲＮＡへと転写し、そのプレｍＲＮＡをｍＲＮＡへとスプライシングし、そのｍＲＮＡをタンパク質へと翻訳することによって、産生されなければならない。本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が遺伝子調節においてある役割を果たし得てＳＴＸＢＰ１タンパク質の産生に干渉し得るという、ある洞察を利用する。詳細には、特定のｍｉＲＮＡが、ＳＴＸＢＰ１ ＲＮＡに結合し得てタンパク質産生を防止し得る。本発明の実施形態は、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む組成物を提供し、この合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、特定のｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１タンパク質の産生に干渉することを防止する。本発明はまた、ＳＴＸＢＰ１ ｍＲＮＡの特徴が翻訳効率を妨害し得るという洞察を利用する。詳細には、ＳＴＸＢＰ１ ｍＲＮＡの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は安定なヘアピンを形成し得、このヘアピンは、翻訳機構の動員を阻害する。さらに、ＳＴＸＢＰ１ ｍＲＮＡは、翻訳が開始し得る上流オープンリーディングフレーム（ｕＯＲＦ）を含み得、これにより、その下流の主要オープンリーディングフレームでの開始を阻害する。本発明の一部の実施形態は、ＡＳＯを含む組成物を提供し、このＡＳＯは、ヘアピンを不安定化し、かつ／またはｕＯＲＦをマスクすることによって、ＳＴＸＢＰ１タンパク質の翻訳を改善する。ＳＴＸＢＰ１ハプロ不全を有する患者に送達された場合、本発明のＡＳＯは、ｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１タンパク質の合成をダウンレギュレートすることを防止し、かつ／またはヘアピンもしくはｕＯＲＦが翻訳効率を妨害することを防止する。
【0006】
他の方法では処置されていないＳＴＸＢＰ１ハプロ不全が神経発生の間に発現されるタンパク質の欠乏をもたらし得る場合、本発明の組成物による処置は、非変異体アレルからの機能的ＳＴＸＢＰ１タンパク質の産生を増加させる。ＳＴＸＢＰ１タンパク質の増加は、ハプロ不全遺伝子型にも関わらず健常な表現型をもたらす。したがって、本発明の組成物は、早期発症てんかんもしくはその症状および関連状態を処置するため、またはそれらの発症を予防するために、有用である。処置は、なんらかの症状の検出の際、またはハプロ不全の（例えば、遺伝子スクリーニングによる）検出の際に、送達され得る。
【0007】
いかなる作用機構によっても拘束されないが、ｍｉＲＮＡがプレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの内部の配列（例えば、ｍＲＮＡの３’ＵＴＲまたは３’調節領域）に結合するという、可能性がある。この配列特異的結合は、翻訳抑制、ＲＮＡ切断、ｍＲＮＡ脱アデニル化、またはｍＲＮＡ脱キャップ化を誘導し得る。本発明の組成物において、ＡＳＯは、そのＡＳＯをＳＴＸＢＰ１ ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡのいずれかに結合させ得てｍｉＲＮＡ媒介性翻訳抑制を防止もしくは阻害し得る、ヌクレオチド配列を含む。好ましくは、そのＡＳＯはＳＴＸＢＰ１ ｍＲＮＡに結合し、そのＡＳＯはそのｍｉＲＮＡがその通常の標的部位に結合することを立体的に遮断し得る。一態様において、本発明は、４９１プレｍｉＲＮＡ、４２４プレｍｉＲＮＡ、４２３プレｍｉＲＮＡ、３３８プレｍｉＲＮＡ、２１９プレｍｉＲＮＡ、２１８プレｍｉＲＮＡ、１５４プレｍｉＲＮＡ、１４３プレｍｉＲＮＡ、１４１プレｍｉＲＮＡ、３０プレｍｉＲＮＡ、および１プレｍｉＲＮＡに由来する、ｍｉＲＮＡを遮断することを含む。本発明の特定のＡＳＯは、ＳＴＸＢＰ１ ｍＲＮＡとｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｍｉＲ－４２３－３ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１８－５ｐ、ｍｉＲ－１５４－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４１－３ｐ、およびｍｉＲ－ｌ－３ｐのいずれかなど）との相互作用を特異的に遮断するように設計される。本発明の洞察は、そのＡＳＯが、そのｍｉＲＮＡか、またはＳＴＸＢＰ１プレＲＮＡもしくはＳＴＸＢＰ１ ｍＲＮＡ上のそのｍｉＲＮＡの結合位置のかいずれかの、配列とも、その配列の逆相補体とも、完全な同一性を有する必要がないということである。
【0008】
一態様において、ｍｉＲＮＡの効果は、そのｍｉＲＮＡ中の７ヌクレオチド～８ヌクレオチド（または５塩基もしくは６塩基程度の短さである可能性がある）のシード領域が、その標的中の同族配列とマッチする場合に明白である。一態様において、そのｍｉＲＮＡとｍＲＮＡ標的とのマッチングは１対１ではなく、１対多および／または多対１であり、これは、１つのｍｉＲＮＡが複数のｍＲＮＡを調節し得、１つのｍＲＮＡが複数のｍｉＲＮＡによって調節され得ることを意味する。本発明の標的は、ｍｉＲＮＡの結合の遮断がＳＴＸＢＰ１タンパク質のアップレギュレーションおよびＳＴＸＢＰ１ハプロ不全の有効な処置を提供する、ｍｉＲＮＡであり得る。短いシード領域だけがｍｉＲＮＡ効果のためには必要であり、標的化するためのｍｉＲＮＡを選択することが難題であるという可能性があるので、正しいｍｉＲＮＡまたはその逆相補体に対して限定的な配列同一性しか有しない一部のＡＳＯは、ＳＴＸＢＰ１ハプロ不全を処置することにおいて有用である。したがって、本開示は、発明され早期発症てんかんなどの状態またはその症状を処置することにおいて有用であることが発見された、方法および組成物を提供し、それらにおいて、その新規な有用性は、開示され本発明の組成物によって対処される特定のｍｉＲＮＡ標的に、少なくとも部分的には存在し得る。
【0009】
他の態様において、本開示の方法および組成物は、５’ＵＴＲヘアピンを不安定化するＡＳＯを提供すること、および／または潜在的ＯＲＦ（例えば、ｕＯＲＦ）をマスクすることによって、作動する。本発明の組成物は、少なくとも１種の核酸を含み得、その核酸は、シンタキシン結合タンパク質１（ＳＴＸＢＰ１）の発現を促進し、配列番号２６～７３のうちの１つに対する少なくとも５０％の配列類似性を有する。好ましくは、その核酸は、そのリボース糖上に２’－Ｏ－メチルを有するが、配列番号２６～配列番号７３のうちの１つに対して実質的に同一な（例えば、少なくとも９０％以上同一な）配列を有する。ホスホロチオエート結合が含まれ得るが、これらの態様のＡＳＯは、好ましくは、ほとんどまたは完全にホスホジエステル（ＰＯ）の結合を有し得る。これらの態様のＡＳＯは、ＳＴＸＢＰ１ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のヘアピンを不安定化すること、ｕＯＲＦをマスクすること、またはそれらの両方によって、作動し得る。詳細には、配列番号２６～７３に基づくＡＳＯは、ＳＴＸＢＰ１ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のヘアピンを不安定化することによって、機能し得る。配列番号２７～３１、４５～４７、５１～５５、および６９～７１に基づくＡＳＯは、ＳＴＸＢＰ１ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ中のヘアピンを不安定化すること、およびｕＯＲＦをマスクすることによって、作動し得る。
【0010】
本発明の組成物は、少なくとも１種の核酸を含み得、その核酸は、シンタキシン結合タンパク質１（ＳＴＸＢＰ１）の発現を促進し、配列番号７４～１０７のうちの１つに対する少なくとも５０％の配列類似性を有する。好ましくは、その核酸は、配列番号７４～配列番号１０７のうちの１つに対して実質的に同一な（例えば、少なくとも９０％以上同一な）配列を有するが、その核酸中の塩基の過半数は２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）リボース糖を有し、かつ／またはその核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート結合を有するが、これらの態様のＡＳＯはホスホジエステル（ＰＯ）結合を有し得る。これらの態様のＡＳＯは、ＳＴＸＢＰ１ ｍＲＮＡの３’調節領域を不安定化および／もしくはマスクすること、ならびに／またはｕＯＲＦをマスクすることによって、作動し得る。詳細には、配列番号８５～１０７に基づくＡＳＯは、ＳＴＸＢＰ１ ｍＲＮＡの３’調節領域との相互作用によって、機能し得る。
【0011】
特定の態様において、本発明は、少なくとも１種の核酸を含む組成物を提供し、その核酸は、シンタキシン結合タンパク質１（ＳＴＸＢＰ１）の発現を促進し、配列番号１～３、７～１３、１５～１８、および２３～１０７のうちの１つに対する少なくとも２５％の配列類似性；配列番号１～３、７～１３、１５～１９、および２３～１０７のうちの１つに対する少なくとも６０％の配列類似性；配列番号１～３、７～１３、１５～１９、および２２～１０７のうちの１つに対する少なくとも７０％の配列類似性；配列番号１～３、６～１３、１５～１９、および２２～１０７のうちの１つに対する少なくとも７５％の配列類似性；配列番号１～３、６～１３、１５～１９、および２１～１０７のうちの１つに対する少なくとも８０％の配列類似性；配列番号１～３、および６～１０７のうちの１つに対する少なくとも８５％の配列類似性；ならびに／または配列番号１～１０７のうちの１つに対する少なくとも９０％の配列類似性を有する。好ましくは、その核酸は、少なくとも約４～６塩基の連続するストレッチを含み、その連続するストレッチは、配列番号１～１０７のうちの１つの中の対応する連続する領域に対する少なくとも８０％の配列類似性を（その連続するストレッチにおいて）有する。好ましくは、その連続するストレッチは、所定の配列中の対応するストレッチと１００％マッチし、より好ましくは、その連続するマッチするストレッチは約４塩基長または約５塩基長または約６塩基長または約７塩基長または約８塩基長または約９塩基長である。その連続するストレッチは、好ましくは、シード領域に対応し、そのシード領域によって、関連するｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１ ＲＮＡ（例えば、プレｍＲＮＡまたはｍＲＮＡ）に最初に結合する。実施形態において、その核酸は、約５塩基と約５０塩基との間の長さを有し、その核酸は、配列番号１～２５のうちの１つの内部のセグメントに対する１００％マッチを有する少なくとも約５個連続する塩基の領域を有する。その核酸は、リボース糖上に２’修飾を有するＲＮＡ塩基を少なくとも約５０％含み得る。その核酸中の塩基間結合のうちの少なくとも約５０％は、ホスホジエステル（ＰＯ）結合ではない可能性がある。それらの結合のいくらかまたはすべては、ＰＯまたはホスホロチオエート（ＰＳ）であり得る。一部の実施形態において、その核酸中の少なくとも約１２個連続する塩基は、配列番号１～２５のうちの１つの中の対応する約１２個連続する塩基に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する。好ましくは、その核酸の塩基の過半数は、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボース、２’－ＯＭｅ、またはそれらの組合せを有する。その核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート（ＰＳ）結合であり得る。特定の実施形態において、その核酸中の塩基のすべては２’－Ｏ－メトキシエチルリボース糖を含み、かつ／またはすべての結合はＰＳである。
【0012】
一部の実施形態において、その核酸は配列番号１～２５のうちの１つに対する少なくとも９０％の配列類似性を有し、その核酸中の塩基のすべては２’－Ｏ－メトキシエチルリボース糖を含む。その核酸は配列番号１～２５のうちの１つに対する少なくとも９４％の配列類似性を有し得、その核酸中の塩基のすべては２’－Ｏ－メトキシエチルリボース糖である。特定の実施形態において、その核酸中の少なくとも約９０％の塩基間結合はホスホロチオエート結合である。その核酸は配列番号１～２５のうちの１つに対する１００％の配列類似性を有し得、その核酸中の塩基のすべては２’－Ｏ－メトキシエチルリボース糖であり得、その核酸中のすべての塩基間結合はホスホロチオエート結合であり得る。
【0013】
本発明の組成物は、以下の特徴（ａ）～（ｌ）を有する核酸のうちの１種またはそれらの核酸の任意の組合せを含み得る：（ａ）その核酸はｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－４２３－３ｐ）の結合部位にハイブリダイズしてそのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－４２３－３ｐ）の結合を遮断し、その核酸は、配列番号１、２、および３からなる群より選択される核酸に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；（ｂ）その核酸はｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒＲ－４９１－５ｐ）の結合部位にハイブリダイズしてそのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒＲ－４９１－５ｐ）の結合を遮断し、その核酸は、配列番号４および５からなる群より選択される核酸に対する少なくとも９０％の配列類似性を有する；（ｃ）その核酸はｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－３３８－３ｐ）の結合部位にハイブリダイズしてそのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－３３８－３ｐ）の結合を遮断し、その核酸は配列番号６に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；（ｄ）その核酸はｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１－３ｐ）の結合部位にハイブリダイズしてそのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１－３ｐ）の結合を遮断し、その核酸は、配列番号７、８、９、２３、２４、および２５からなる群より選択される核酸に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；（ｅ）その核酸はｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－４２３－５ｐ）の結合部位にハイブリダイズしてそのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－４２３－５ｐ）の結合を遮断し、その核酸は配列番号１０に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；（ｆ）その核酸はｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１５４－５ｐ）の結合部位にハイブリダイズしてそのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１５４－５ｐ）の結合を遮断し、その核酸は、配列番号１１および１２からなる群より選択される核酸に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；（ｇ）その核酸はｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－２１９ａ－５ｐ）の結合部位にハイブリダイズしてそのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－２１９ａ－５ｐ）の結合を遮断し、その核酸は配列番号１３に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；（ｈ）その核酸はｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒＲ－４２４－５ｐ）の結合部位にハイブリダイズしてそのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉｒＲ－４２４－５ｐ）の結合を遮断し、その核酸は配列番号１４に対する少なくとも８５％の配列類似性を有する；（ｉ）その核酸はｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ）の結合部位にハイブリダイズしてそのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ）の結合を遮断し、その核酸は、配列番号１５、１６、および１７からなる群より選択される核酸に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；（ｊ）その核酸はｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１４１－３ｐ）の結合部位にハイブリダイズしてそのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１４１－３ｐ）の結合を遮断し、その核酸は、配列番号１８および１９からなる群より選択される核酸に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する；（ｋ）その核酸はｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－２１８－５ｐ）の結合部位にハイブリダイズしてそのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－２１８－５ｐ）の結合を遮断し、その核酸は配列番号２０に対する少なくとも８５％の配列類似性を有するかまたはその核酸は配列番号２１に対する少なくとも８０％の配列類似性を有する；ならびに（ｌ）その核酸はｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１４３－３ｐ）の結合部位にハイブリダイズしてそのｍｉＲＮＡ（例えば、ｍｉＲ－１４３－３ｐ）の結合を遮断し、その核酸は配列番号２２に対する少なくとも７５％の配列類似性を有する。この段落において、「７５％」、「８０％」、「８５％」、および「９０％」の任意の出現が、より好ましい実施形態を首尾よく記載するために、それに応じて、より高い値「８５％」で、９５％で、またはさらには「９９％」で置き換えられ得る。
【0014】
特定の立体遮断性オリゴヌクレオチド（ＳＢＯ）の実施形態において、その核酸は、配列番号１～２５および７４～８４のうちの１つに対する１００％の配列類似性を有し、例えば、その核酸中の塩基の過半数は２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）リボース糖を有し、かつ／またはその核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート結合を有する。その核酸は、修飾された糖（例えば、２’－ＭＯＥおよび／もしくは２’－Ｏ－メチル）の任意の組合せならびに／または塩基間結合の任意の組合せ（例えば、任意の組合せのＰＳ／ＰＯ）をその骨格中に有し得る。必要に応じて、その核酸中の塩基のすべては２’－Ｏ－メトキシエチルリボース糖を含み、その核酸中のすべての塩基間結合はホスホロチオエート結合である。その窒素塩基はいずれもメチル化され得る（すなわち、５－メチルシトシン（ｍＣ）および／または５－メチルウリジン（ｍＵ）（これはＴである））。
【0015】
他のＵＴＲ／ＯＲＦの実施形態において、その核酸は配列番号２６～７３のうちの１つに対する１００％の配列類似性を有し、例えば、その核酸中の塩基の過半数は２’－Ｏ－メチルリボース糖を有し、かつ／またはその核酸中の過半数の塩基間結合はホスホジエステル結合を有する。その核酸は、修飾された糖（例えば、２’－ＭＯＥおよび／もしくは２’－ＯＭｅ）の任意の組合せならびに／または塩基間結合の任意の組合せ（例えば、任意の組合せのＰＳ／ＰＯ）をその骨格中に有し得る。必要に応じて、その核酸中の塩基のすべては２’－ＯＭｅリボース糖を含む。窒素塩基はメチル化され得る（すなわち、ｍＣ、ｍＵ（これはＴである））。配列番号２６～４９について、その核酸中のすべての塩基間結合はホスホジエステル結合である。配列番号５０～７３について、その核酸中のすべての塩基間結合はホスホロチオエート結合である。
【0016】
３’調節領域を標的とする他の実施形態において、その核酸は配列番号８５～１０７のうちの１つに対する１００％の配列類似性を有し、例えば、その核酸中の塩基の過半数は２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－ＭＯＥ）リボース糖を有し、かつ／またはその核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート結合を有する。その核酸は、修飾された糖（例えば、２’－ＭＯＥおよび／もしくは２’－Ｏ－メチル）の任意の組合せならびに／または塩基間結合の任意の組合せ（例えば、任意の組合せのＰＳ／ＰＯ）をその骨格中に有し得る。必要に応じて、その核酸中の塩基のすべては２’－Ｏ－メトキシエチルリボース糖を含み、その核酸中のすべての塩基間結合はホスホロチオエート結合である。その窒素塩基はいずれもメチル化され得る（すなわち、５－メチルシトシン（ｍＣ）および／または５－メチルウリジン（ｍＵ）（これはＴである））。
【0017】
関連する態様は、早期発症てんかん性脳症を処置する方法を提供する。方法は、それを必要とする患者に上記の組成物のうちの１つを送達する工程を含む。好ましくは、その組成物は血液脳関門を越えて送達される。その組成物は髄腔内注射によって送達され得る。その送達する工程は、その患者においてシンタキシン結合タンパク質１（ＳＴＸＢＰ１）の増加した発現をもたらす。方法は、ＳＴＸＢＰ１遺伝子におけるヘテロ接合性機能欠失変異を同定することによってその患者を選択する工程を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【0028】
【0029】
【0030】
【0031】
【0032】
【発明を実施するための形態】
【0033】
（詳細な説明）
本発明は、シンタキシン結合タンパク質１（ＳＴＸＢＰ１）の発現を促進することによって早期発症てんかん性脳症を処置するために有用な、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。一部の個体は、ＳＴＸＢＰ１をコードするＳＴＸＢＰ１遺伝子上にヘテロ接合性機能欠失変異を有して生まれ、これは、ＳＴＸＢＰ１のハプロ不全として知られる状態である。本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が、ＳＴＸＢＰ１タンパク質の産生に干渉する役割を遺伝子調節において果たし得るという、洞察を利用する。詳細には、特定のｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１ ＲＮＡに結合し得てタンパク質産生を防止し得ると、考えられる。本発明は、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む組成物を提供し、この合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、特定のｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１タンパク質の産生に干渉することを防止する。この組成物がＳＴＸＢＰ１ハプロ不全を有する患者に送達された場合、そのＡＳＯは、ｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１タンパク質の合成をダウンレギュレートすることを防止する。
本発明は、シンタキシン結合タンパク質１（ＳＴＸＢＰ１）の発現を促進することによって早期発症てんかん性脳症を処置するために有用な、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。一部の個体は、ＳＴＸＢＰ１をコードするＳＴＸＢＰ１遺伝子上にヘテロ接合性機能欠失変異を有して生まれ、これは、ＳＴＸＢＰ１のハプロ不全として知られる状態である。本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が、ＳＴＸＢＰ１タンパク質の産生に干渉する役割を遺伝子調節において果たし得るという、洞察を利用する。詳細には、特定のｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１ ＲＮＡに結合し得てタンパク質産生を防止し得ると、考えられる。本発明は、合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を含む組成物を提供し、この合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）は、特定のｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１タンパク質の産生に干渉することを防止する。この組成物がＳＴＸＢＰ１ハプロ不全を有する患者に送達された場合、そのＡＳＯは、ｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１タンパク質の合成をダウンレギュレートすることを防止する。
【0034】
本発明の組成物および方法は、少なくとも１種の核酸を好ましくは使用し、その核酸は、シンタキシン結合タンパク質１の発現を促進し、その核酸は、配列番号１～３、７～１３、１５～１８、および２３～１０７のうちの１つに対する少なくとも２５％の配列同一性もしくは配列類似性；配列番号１～３、７～１３、１５～１９、および２３～１０７のうちの１つに対する少なくとも６０％の配列同一性もしくは配列類似性；配列番号１～３、７～１３、１５～１９、および２２～１０７のうちの１つに対する少なくとも７０％の配列同一性もしくは配列類似性；配列番号１～３、６～１３、１５～１９、および２２～１０７のうちの１つに対する少なくとも７５％の配列同一性もしくは配列類似性；配列番号１～３、６～１３、１５～１９、および２１～１０７に対する少なくとも８０％の配列同一性もしくは配列類似性；配列番号１～３、および６～１０７に対する少なくとも８５％の配列同一性もしくは配列類似性；ならびに／または配列番号１～１０７のうちの１つに対する少なくとも９０％の配列同一性もしくは配列類似性を有する。好ましい態様において、その核酸は、配列番号１～３、７～１３、１５～１９、および２３－２５のうちの１つに対する少なくとも２５％の配列同一性もしくは配列類似性；配列番号１９に対する少なくとも６０％の配列同一性もしくは配列類似性；配列番号２２に対する少なくとも７０％の配列同一性もしくは配列類似性；配列番号６に対する少なくとも７５％の配列同一性もしくは配列類似性；配列番号２１に対する少なくとも８０％の配列同一性もしくは配列類似性；配列番号１４および２１のうちの１つに対する少なくとも８５％の配列同一性もしくは配列類似性；配列番号４および５のうちの１つに対する少なくとも９０％の配列同一性もしくは配列類似性を有する。好ましくは、その核酸は、少なくとも約６塩基の連続するストレッチを含み、この連続するストレッチは、配列番号１～２５のうちの１つの中の対応する連続する領域に対する少なくとも８０％の配列類似性を有する。好ましくは、その連続するストレッチは、所定の配列中の対応するストレッチと１００％マッチし、より好ましくは、その連続するマッチするストレッチは約４塩基長または約５塩基長または約６塩基長または約７塩基長または約８塩基長または約９塩基長である。
【0035】
ＳＴＸＢＰ１遺伝子は、ヒト９番染色体に位置し、シナプス前神経伝達物質放出のために必須のタンパク質（シンタキシン結合タンパク質１（ＳＴＸＢＰ１））をコードする。ＳＴＸＢＰ１遺伝子におけるヘテロ接合性機能欠失変異は、早期発症乳児てんかん性脳症ＩＶ型（ＥＩＥＥ４）（ＳＴＸＢＰ１脳症としても知られ、これは、重篤な発作および知的障害によって特徴付けられる障害である）をもたらす。ＳＴＸＢＰ１脳症は、３番目に多い遺伝的てんかん（米国において約２０００人の既知患者）であり、推定発生率は１：３０，０００である。本発明は、ハプロ不全障害（例えば、ＳＴＸＢＰ１脳症）を矯正するためのアプローチとして、罹患していないアレルからの発現のＡＳＯ媒介性ブーストを提供する。ＳＴＸＢＰ１脳症は、ＳＴＸＢＰ１遺伝子におけるヘテロ接合性機能欠失変異によって一般的には引き起こされ、既知の疾患機構を含む。ＳＴＸＢＰ１脳症患者は、典型的な抗てんかんレジメン（一般的に使用される抗てんかん薬はフェノバルビタール、バルプロ酸、およびビガバトリンである）では、不良な転帰を典型的には経験する。本発明は、この疾患の根本原因に対処して疾患修飾の可能性を有する処置において使用され得る組成物および方法を用いる、新規で異なるアプローチを提供する。罹患していないアレルからのＳＴＸＢＰ１発現のＡＳＯ媒介性ブーストは、この疾患の遺伝子機構に直接的に対処する。
【0036】
本発明の組成物およびその効果は、Ｏｐｔｏｐａｔｃｈアッセイを用いて評価され得る。一般に、Ｏｐｔｏｐａｔｃｈは、光刺激（例えば、光に反応してニューロンが発火することを引き起こす、改変型藻類チャネルロドプシン）と神経活性の光レポーター（ニューロン膜電位に比例する光を放出してニューロン活性のシグナルを生じる、改変型アーキロドプシン）との下で神経活性化を提供する光遺伝学的構築物を含む、インビトロニューロンの使用を含む。そのインビトロニューロンは蛍光顕微鏡機器でアッセイされ得、そのインビトロニューロンはまた、例えば、染色（例えば、免疫細胞化学）、ＲＮＡ－Ｓｅｑ、または他のそのようなアッセイによっても、（例えば、後に）評価され得る。任意の適切な光遺伝学的構築物、光遺伝学顕微鏡、または他のアッセイが使用され得る。例えば、適切な光遺伝学的構築物としては、米国特許第９，５９４，０７５号（参照によって援用される）に記載されるものが挙げられる。適切な光遺伝学顕微鏡としては、米国特許第１０，２８８，８６３号（参照によって援用される）に記載されるものが挙げられる。本発明の組成物およびその効果は、ＳＴＸＢＰ１遺伝子中に変異（ヘテロ接合性機能欠失変異およびホモ接合性機能欠失変異の両方）を有するｉＰＳＣ由来ニューロン細胞株を使用して、評価され得る。Ｏｐｔｏｐａｔｃｈ表現型決定は、このような細胞株に対して実施される。
【0037】
本発明の組成物および方法を提供するために、ＡＳＯの配列は、以下などの種々の要因のバランスを保つことを含むプロセスによって選択され得る：１．標的転写物領域を決定して配列（可能なすべてのＮマー）を作製する；２．実験的制約（アイソフォーム、相同性）に基づく除外；３．ヒトおよび非ヒト霊長類（アカゲザルおよびカニクイザル）における予測されるオフターゲットのｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびｌｎｃＲＮＡのヒットに基づく除外；４．配列特徴（テトラＧ、テトラＣ、ＣｐＧ、パリンドローム、ＧＣ含量、およびポリＸストレッチ）に基づく除外／フィルタリング；５．熱力学的パラメータ（Ｔｍ、ヘアピンΔＧ、ＡＳＯ二重鎖ΔＧ、ＡＳＯ：標的ΔＧ）に基づいてフィルタリングする；ならびに７．熱力学的パラメータ、間隔、および実験の目標（全体的ΔＧ）に基づいて領域内部のＡＳＯを選択する。標的転写物領域を決定するために、文献、配列決定に基づくアッセイ、および遮断するｍｉＲＮＡ結合部位を同定するためのモデルに由来する基準が、適用され得る。この基準に合格する標的について、７ヌクレオチド～８ヌクレオチドの予測されるｍｉＲＮＡ結合部位が、シード配列と、種々の文脈情報を含むモデルとに基づいて、同定される。保存部位は、機能的である／関連性がある可能性がより高い。
【0038】
本発明の組成物で対処するための標的を同定することは、任意の適切な技術または技術の組合せを使用して実施され得る。好ましい実施形態は、本発明の標的を同定し本発明の配列を設計するためのツールとして、ＣＬＩＰ－Ｓｅｑ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、およびｍｉＲＮＡアトラスを使用した。
【0039】
架橋免疫沈降（ＣＬＩＰ）は、ＲＮＡの相互作用および修飾を分析するためにＵＶ架橋および免疫沈降を使用し、架橋免疫沈降（ＣＬＩＰ）は、ゲノムワイドＲＮＡ相互作用マップを作成するために配列決定とともに使用され（ＣＬＩＰ－Ｓｅｑと呼ばれる）、組織および細胞の培養物およびサンプルにおけるマイクロＲＮＡ－ｍＲＮＡ相互作用およびタンパク質－ＲＮＡ相互作用のマップを解読することによるマイクロＲＮＡ標的の同定のために使用された。Ｔｈｏｍｓｏｎ、２０１１、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、３９（１６）：６８４５～５３（参照によって援用される）を参照のこと。
【0040】
ＴａｒｇｅｔＳｃａｎは、各ｍｉＲＮＡのシード領域とマッチする保存された８マー、７マー、および６マーの部位の存在について探索することによってｍｉＲＮＡの生物学的標的を予測する、デジタルツールである。Ｌｅｗｉｓ、２００５、Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｓｅｅｄ Ｐａｉｒｉｎｇ，Ｏｆｔｅｎ Ｆｌａｎｋｅｄ ｂｙ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅｓ，Ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈａｔ Ｔｈｏｕｓａｎｄｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｓ ａｒｅ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｔａｒｇｅｔｓ．、Ｃｅｌｌ、１２０：１５～２０（参照によって援用される）を参照のこと。ＴａｒｇｅｔＳｃａｎは、保存部位、ほとんど保存されていない部位、および保存された３’対形成によって補償されるミスマッチを有するシード領域中の部位、ならびに中心部位を同定するために、使用され得る。Ｆｒｉｅｄｍａｎ、２００９、Ｍｏｓｔ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｍＲＮＡｓ ａｒｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ、１９：９２～１０５およびＳｈｉｎ、２０１０、Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｏｄｅ：ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ ｃｅｎｔｅｒｅｄ ｐａｉｒｉｎｇ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ、３８（６）：７８９～８０２（両方とも参照によって援用される）を参照のこと。ＴａｒｇｅｔＳｃａｎは、それらの部位の累積重み付きコンテクスト＋＋スコア（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｗｅｉｇｈｔｅｄ ｃｏｎｔｅｘｔ＋＋ ｓｃｏｒｅ）を使用して算出された予測標的化効率に基づいて、予測をランク付けする。予測はまた、それらの保存された標的化の確率によって、ランク付けされ得る。ＴａｒｇｅｔＳｃａｎＨｕｍａｎは、ＵＣＳＣ全ゲノムアラインメントによって規定される、ヒト３’ＵＴＲおよびそのオルソログに対するマッチを考慮する。保存された標的化はまた、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）内部でも検出された。
【0041】
ｍｉＲＮＡのアトラスが存在する。例えば、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ ｍｉＲＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ａｔｌａｓは、６２種の組織にわたる組織特異的マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）発現のカタログである。Ｌｕｄｗｉｇ、２０１６、Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｃｒｏｓｓ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、４４（８）：３８６５～７７（参照によって援用される）を参照のこと。別の例は、４９２種の短鎖ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）ライブラリーをディープシークエンシングし、３９６種のヒトＲＮＡサンプルおよび４７種のマウスＲＮＡサンプルに由来するＣａｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＣＡＧＥ）データとマッチングすることによって作成した、ｍｉＲＮＡおよびそれらのプロモーターの統合的発現アトラスである。ｄｅ Ｒｉｅ、２０１７、Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｔｌａｓ ｏｆ ｍｉＲＮＡｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ、３５：８７２～８７８（参照によって援用される）を参照のこと。その２０１７年のアトラスについて、１，３５７種のヒトｍｉＲＮＡおよび８０４種のマウスｍｉＲＮＡのプロモーターが同定され、それらのプロモーターは、種間で強い配列保存を示した。一次ｍｉＲＮＡ発現レベルと成熟ｍｉＲＮＡ発現レベルは相関していることが見出され、このことは、その一次ｍｉＲＮＡ測定値を、合計１，８２９種のヒトおよび１，０２９種のマウスのＣＡＧＥライブラリーにおいて成熟ｍｉＲＮＡレベルについての代用品として使用することを可能にした。そのようなツールは、初代哺乳動物細胞におけるｍｉＲＮＡ発現およびプロモーターのアトラスを提供して、ｍｉＲＮＡ発現パターンおよび転写制御領域の詳細な分析の基礎を確立する。そのようなｍｉＲＮＡアトラスは、本発明の標的を同定するために使用され得る。
【0042】
本開示の核酸はＣＬＩＰ－Ｓｅｑデータから情報を抽出することによって選択され、本開示の核酸はまた、以下：ｍｉＲＮＡシード結合領域を完全に遮断し、それにより立体遮断性オリゴヌクレオチド（ＳＢＯ）として機能する；ヒトまたはモデル霊長類（例えば、カニクイザル）においてオフターゲットヒットを全く（または最小限しか）有しない；そのモデル霊長類において密接なマッチ（例えば、好ましくは、正確に２０マーまたは１９／２０ヌクレオチドのいずれか）を有する；全体的ΔＧを最小化すること、正確なカニクイザル（ｃｙｎｏ）相同性を求めること、またはそのＳＢＯの末端にミスマッチを配置することのバランスをとる、という要件のバランスを最適化し；そして問題になる配列モチーフ（例えば、高ＧＣ含量もしくはヘアピン）または熱力学的特性（例えば、極端なＴｍ）を回避するためにも選択された。適用される基準は、遮断する標的ｍｉＲＮＡを同定する。同定されたｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ－４９１－５ｐ、ｍｉＲ－４２４－５ｐ、ｍｉＲ－４２３－５ｐ、ｍｉＲ－４２３－３ｐ、ｍｉＲ－３３８－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２１９ａ－５ｐ、ｍｉＲ－２１８－５ｐ、ｍｉＲ－１５４－５ｐ、ｍｉＲ－１４３－３ｐ、ｍｉＲ－１４１－３ｐ、およびｍｉＲ－１－３ｐが挙げられる。
【0043】
ｍｉＲ－４９１－５ｐ標的は、腫瘍抑制因子としても機能すると理解される。そのｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１の翻訳を抑制する能力を遮断することは、そのｍｉＲＮＡの他の機能（例えば、腫瘍の抑制）において関連がある顕著な結果を何も有しない可能性がある。同様に、ｍｉＲ－４２４－５ｐは、ＳＴＸＢＰ１転写物に対するそのｍｉＲ－４２４－５ｐの効果に干渉することがそれ自体を機構的に妥当な経路として示唆するように細胞増殖を調節すると、報告されている。文献は、ｍｉＲ－４２３－５ｐおよびｉＲ－４２３－３ｐが有用なバイオマーカーまたは診断指標であること、およびこれらが悪性神経膠腫に関連があり得ることを報告している。ｍｉＲ－３３８－３ｐは増殖、アポトーシス、およびニューロン成熟を調節すると疑われている。ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐは脂質代謝および増殖に関連がある。ｍｉＲ－２１９ａ－５ｐは、ＥＹＡ２の３’－ＵＴＲへの結合を介してＥＹＡ２発現を抑制すると理解されている。文献は、ｍｉＲ－２１８－５ｐが皮膚および毛包の発達において役割を果たすと、報告している。ｍｉＲ－１５４－５ｐは、Ｗｎｔ１１の３’ＵＴＲを直接的に標的とすることによって、Ｗｎｔ／ＰＣＰ経路を通じて脂肪由来間葉系幹細胞の骨形成分化を負に調節する。文献は、ｍｉＲ－１４３－３ｐが骨肉腫を阻害すると報告している。ｍｉＲ－１４１－３ｐは、増殖を抑制しアポトーシスを促進する。文献は、細胞質分裂のタンパク質調節因子１（ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ １）を標的とすることおよび腺癌腫瘍形成を阻害することをを含む、ｍｉＲ－ｌ－３ｐの種々の役割を報告している。これらのｍｉＲＮＡのこのような役割が文献において報告されており、このような役割が医学のオンラインライブラリーの使用を通じて理解され得ることを、当業者は認識する。これらのｍｉＲＮＡの機能から、本発明の組成物の臨床的有用性を上回るさらなる有害作用は何も、ＳＴＸＢＰ１転写物内部のｍｉＲＮＡのシード結合部位を遮断することからは生じない可能性があると考えられ得る。したがって、患者細胞中のＳＴＸＢＰ１転写物中のこれらの標的を標的とすることが機構的に妥当であること、およびこれらのｍｉＲＮＡの当該分野で認識された役割がそのような治療戦略と適合することもまた、当業者は認識する。
【0044】
これらの標的を選択して、ＳＴＸＢＰ１ ＲＮＡ中のこれらの標的の少なくともシード結合部位にハイブリダイズする核酸が、提供（例えば、合成）され得る。したがって、少なくとも５個連続する塩基のストレッチを有する核酸を本発明の組成物が含み、そのストレッチがＳＴＸＢＰ１ ＲＮＡ中の５個連続する同族塩基の逆相補体であり、その５個連続する同族塩基にｍｉＲＮＡが他の状況では結合する場合に、本発明の組成物は有用であることが、見出され得る。そのような核酸は、そのｍｉＲＮＡのダウンレギュレート効果を阻害することによってＳＴＸＢＰ１タンパク質の合成をアップレギュレートするために有用な立体遮断性オリゴヌクレオチド（ＳＢＯ）として、提供される。したがって、本発明は、本開示の標的ｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１タンパク質合成に干渉することを遮断する、新規なＳＢＯを提供する。本発明のＳＢＯは、臨床的有用性を増進する特徴を好ましくは含む。本開示の配列は、全体的ΔＧを最小化しながらモデル霊長類において相同性を有することのバランスを保つ。その配列は、好ましくは、ＳＢＯの末端にミスマッチを配置し、問題のある配列モチーフ（例えば、ヘアピン）または熱力学的特性を回避する。配列番号１～２５および７４～１０７に基づく本発明のＳＢＯは、好ましくは、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボース糖（「２’－ＭＯＥ」）を含み、好ましくはホスホロチオエート（ＰＳ）塩基間結合もまた含む。必要に応じて、２’－Ｏ－メチルと２’－ＭＯＥとの任意の組合せが含まれ得、ＰＳ骨格とＰＯ骨格との任意の組合せが含まれ得る。そのような特徴は、そのＳＢＯを細胞中での加水分解または分解（酵素触媒性もしくは化学触媒性）に対して抵抗性にし得る。したがって、それらの特徴は、本発明の組成物についての臨床的に有用な長いインビボ半減期を増進し得る。
【0045】
５’末端および３’末端のうちの少なくとも一方または両方での（好ましくは全体にわたる）修飾（例えば、２’－Ｏ－メトキシエチル）がヌクレアーゼ分解に対する増加した抵抗性を提供するだけではなく、それらの修飾は、毒性を減少し得、相補的ＲＮＡへの結合について増加した親和性を提供し得る。Ｖｉｃｋｅｒｓ、２００１、Ｆｕｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ２’ ＭＯＥ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｒｅｄｉｒｅｃｔ ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ、２９（６）：１２９３～９（参照によって援用される）を参照のこと。標準的ＲＮＡ塩基と比較して、２’－ＭＯＥ塩基は、ヌクレアーゼ分解に対する増加した抵抗性、減少した毒性、および相補的ＲＮＡへ結合についての増加した親和性を提供する。
【0046】
ヌクレアーゼ抵抗性を増加するために、本発明の組成物は、そのオリゴに対するホスホロチオエート（ＰＳ）修飾を好ましくは含む。ホスホロチオエートにおいて、硫黄原子がそのオリゴのリン酸骨格中の非架橋酸素の代わりになる。ＰＳオリゴは安定性を提供し得る。ホスホロチオエート結合はまた血清タンパク質への結合を促進し、これは、そのＡＳＯのバイオアベイラビリティを増加し、生産的細胞取込みを促進する。
【0047】
表１は、本開示の組成物中の核酸において使用され得る塩基の配列を提供する。
（表１）
（表１）
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【表1-5】
【表1-6】
【表1-7】
【表1-8】
【0048】
表１は、「注記」の列を含み、この列では、各エントリーが、コンマで分けられた３つの部分（機構、糖修飾、および塩基間結合）を有する。１番目の部分はｍ、５、または５＊を示す。各注記の２番目の部分はＭＯＥまたはＯＭｅのいずれかを示す。各注記の３番目の部分はＰＳまたはＰＯを示す。１番目の部分において、「ｍ」はｍｉＲＮＡの結合を遮断することにより作動するＡＳＯを示し、「５」は５’ＵＴＲを不安定化するＡＳＯを示し、アステリスク（「＊」）はｕＯＲＦをマスクすると疑われるＡＳＯを示す。２番目の部分において、「ＭＯＥ」はその糖が実質的または全体的に２’－Ｏ－メトキシエチルリボースであることが好ましいＡＳＯを示し、「ＯＭｅ」はその糖が実質的または全体的に２’－Ｏ－メチルリボースであることが好ましいＡＳＯを示す。表１において、配列番号１～２５および７４～１０７はＤＮＡ様の特徴（Ｔの使用により示される）を使用し、配列番号２６～７３はＲＮＡ様の特徴（Ｕの使用により示される）を使用する。その使用法は、合成オリゴヌクレオチドを注文する場合に利用可能な特定の産業上の基準と一致し、その基準により、特定の供給業者は、２’－ＭＯＥを含むことを特定する場合にはＴを使用し、２’－Ｏ－Ｍｅを含む場合にはＵを使用する。各注記の３番目の部分において、「ＰＳ」はその塩基間結合が実質的または全体的にホスホロチオエート結合であることが好ましいＡＳＯを示し、一方、「ＰＯ」はその塩基間結合が実質的または全体的にホスホジエステル結合であることが好ましいＡＳＯを示す。配列番号２６～７３について、その窒素塩基のいずれもがｍＣおよび／またはｍＵであり得る。好ましくは、ｍＵは２’－ＭＯＥ塩基のために使用される。「実質的に」とは、記載された特性の少なくとも８５％を有することを含む。例えば、２０塩基オリゴについて、その１９個の結合のうち、それらすべてがＰＳであり得るか、またはそれらが実質的にすべてＰＳ（例えば、１８個のＰＳおよび１個のＰＯ）であり得、その分子が本質的に同様に機能することを、分子生物学の当業者は認識する。
【0049】
表１において列挙された配列は、ベースライン参照物と扱われ得、本発明の組成物中の核酸（例えば、立体遮断性オリゴヌクレオチドまたはＳＢＯ）は、列挙された配列のうちの１つと比較して記載され得る。例えば、ミスマッチが許容されることが見出され得、これは、ＳＴＸＢＰ１転写物が配列番号１～１０７のうちの１つの逆相補体を含む場合でさえ、本発明の核酸は、それが配列番号１～１０７のうちの１つに対する１００％未満のマッチである場合でさえ十分に機能することを意味する。結果は、ミスマッチがそのＳＢＯの末端付近で最も許容されること、およびｍｉＲＮＡシード配列の結合領域を遮断するために最も重要であり、そのシードは約７塩基長～約８塩基長であり得、または５塩基長もしくは６塩基長程度の短さでさえあり得ることもまた、示唆する。表１中の配列は１６塩基長～２０塩基長である。重要であり得ることは、本発明の核酸が、配列番号１～１０７のうちの１つの中の対応する塩基ストレッチに対して１００％マッチである、５個もしくは６個もしくは７個もしくは８個もしくは９個連続する塩基のシード領域を有すること、ならびに本発明の核酸がまた、配列番号１～３、７～１３、１５～１８、および２３～１０７のうちの１つに対する少なくとも５０％の配列類似性；配列番号１～３、７～１３、１５～１９、および２３～１０７のうちの１つに対する少なくとも６０％の配列同一性もしくは配列類似性；配列番号１～３、７～１３、１５～１９、および２２～１０７のうちの１つに対する少なくとも７０％の配列同一性もしくは配列類似性；配列番号１～３、６～１３、１５～１９、および２２～１０７のうちの１つに対する少なくとも７５％の配列同一性もしくは配列類似性；配列番号１～３、６～１３、１５～１９、および２１～１０７に対する少なくとも８０％の配列同一性もしくは配列類似性；配列番号１～３、および６～１０７のうちの１つに対する少なくとも８５％の配列同一性もしくは配列類似性；ならびに／または配列番号１～１０７のうちの１つに対する少なくとも９０％の配列同一性もしくは配列類似性を有することである。
【0050】
表１において使用された特定の特徴は、ＤＮＡ命名法を使用して（例えば、文字Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧを使用して）配列内に提示されており、リボース糖組成または塩基間結合に関しては言及しないこともまた、留意される。本発明の核酸は、ＲＮＡ塩基（例えば、Ｔが示されている窒素塩基の代わりにウラシル）を含む場合、かつまた、または代替的に修飾リボース糖（例えば、２’－ＭＯＥ）を含む場合に最も有用であることが、見出され得る。実際、列挙された配列中の文字Ｔは本発明の核酸中で核酸塩基チミンもしくはウラシルとして存在し得ること、および／またはそれらの塩基はＳＢＯと混合され得るかもしくは混じり合った状態であり得ることさえも、見出され得る。一部の実施形態において、本発明の核酸は２’－ＭＯＥ「メチル化」Ｕ（５－メチルウリジン）（これは本質的には２’－ＭＯＥ－Ｔである）を含む。
【0051】
詳細には、２’－ＭＯＥ塩基は５－メチルシトシンおよび５－メチルウリジンを使用し得る。５－メチルシトシンを使用して非メチル化ＣｐＧを回避することが、好ましいものであり得る。非メチル化ＣｐＧを回避することは炎症の可能性を減少または回避することが、見出され得る。さらに、５－メチルシトシン２’－ＭＯＥ塩基は、臨床的に検証された化学を用いて整列されることが見出され得、５－メチルシトシン２’－ＭＯＥ塩基はそのような理由で必要に応じて好ましいものであり得る。その５－メチル－Ｕ（Ｔ）塩基は、製造および市販を容易にするために、２’－ＭＯＥ化学とともに使用され得る。２’－ＯＭｅ化学を使用する配列について、製造および／または市販の容易さは、５－メチルＣおよび／または５－メチル－Ｕ（Ｔ）を使用しないことを支持し得る。
【0052】
特定の実施形態において、文字Ｔによって表される塩基の過半数またはすべては核酸塩基ウラシルを有する。好ましい実施形態において、文字Ｔによって表される塩基の過半数またはすべては２’－ＭＯＥ－Ｔを有する。それらの結合のいずれか、ほとんど、またはすべては、ホスホロチオエートであり得る。好ましい実施形態は、配列番号１～２５、５０～１０７についてすべてホスホロチオエート結合を使用する。好ましい実施形態は、配列番号２６～４９についてホスホジエステルを使用する。
【0053】
実際、１つの第一の実施形態は、ＳＴＸＢＰ１発現を促進するためのＡＳＯとして使用するための核酸を含む組成物を提供する。その核酸は、配列番号１～１０７のうちの１つに対する少なくとも８８％マッチ（すなわち、２個以下のミスマッチ）を有する塩基配列を有する。その窒素塩基のすべてはＡ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、またはＧであり、必要に応じてｍＣを用いる。それらの糖のすべては配列番号１～２５および７４～１０７について２’－ＭＯＥであり、それらの結合のすべては配列番号１～２５および５０～１０７についてＰＳである。糖は配列番号２６～７３について２’－ＯＭｅである。これらの第一の実施形態は、製造の容易さのために魅力的である。そのようなＡＳＯは、標準的なベンチトップ型ＲＮＡ合成システムで合成され得、かつ／または商業的供給業者から注文され得る。
【0054】
より一般に記載される場合、好ましくは、その核酸中の少なくとも約６個～約１２個連続する塩基は、（標的に安定的に結合するために）配列番号１～１０７のうちの１つの中の対応する１２個連続する塩基に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する。好ましくは、その核酸中の少なくとも約６個～約１２個連続する塩基は、（例えば、関連するｍｉＲＮＡのシード領域を遮断するために）配列番号１～２５のうちの１つの中の対応する１２個連続する塩基に対する少なくとも９０％の配列同一性を有する。
【0055】
好ましくは、その核酸の塩基の過半数は（配列番号１～２５および７４～１０７において）２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボースを有し、その核酸中の過半数の塩基間結合は（配列番号１～２５および５０～１０７において）ホスホロチオエート結合であり、窒素塩基はＡ、Ｔ、Ｕ、Ｃ、Ｇ、またはｍＣである。上記で示唆されたとおり、表１中の配列番号１～２５および７４～８４は、特定のｍｉＲＮＡがＳＴＸＢＰ１転写物をダウンレギュレートするのを遮断するように特異的に設計されており、配列番号２６～７３は５’ＵＴＲヘアピンを不安定化するように設計されており、配列番号８５～１０７は３’調節領域を標的とするように設計されている。
【0056】
ｍｉＲ－４２３－３ｐの実施形態において、その核酸は、ｍｉＲ－４２３－３ｐの結合部位にハイブリダイズしてＳＴＸＢＰ１転写物へのｍｉＲ－４２３－３ｐの結合を遮断する。例えば、その核酸は、配列番号１、２、および３のうちの１つに対する少なくとも５０％または７５％または８３％または９０％または９５％または１００％の配列類似性を有し得る。好ましくは、その核酸中の少なくとも約６個～約１２個連続する塩基は、（関連するｍｉＲＮＡのシード領域を遮断するために）示された配列中の連続する塩基の対応するセグメントに対する少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有し、好ましくは：その核酸の塩基の過半数は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボースを有し、その核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ／またはどの窒素塩基もＲＮＡ化学である（例えば、文字Ｔは５－メチルウラシルを示す）。好ましくは文字Ｃは５’－メチルシトシンを表す可能性がある。その核酸は、示された配列に対する少なくとも８８％マッチ（すなわち、２個以下のミスマッチ）を有する塩基配列を有し得る。それらの糖のすべては２’－ＭＯＥであり得、それらの結合のすべてはＰＳであり得る。
【0057】
ｍｉＲ－４９１－５ｐの実施形態において、その核酸は、ｍｉＲ－４９１－５ｐの結合部位にハイブリダイズしてＳＴＸＢＰ１転写物へのｍｉＲ－４９１－５ｐの結合を遮断する。例えば、その核酸は、配列番号４および５のうちの１つに対する少なくとも９０％または９５％または１００％の配列類似性を有し得る。好ましくは、その核酸中の少なくとも約６個～約１２個連続する塩基は、（関連するｍｉＲＮＡのシード領域を遮断するために）示された配列中の連続する塩基の対応するセグメントに対する少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有し、好ましくは：その核酸の塩基の過半数は２’メトキシエチル修飾リボースを有し、その核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ／またはどの窒素塩基もＴについて５－メチルウラシル（Ｔ）を使用し、Ｃについて５－メチルシトシンを使用する。その核酸は、示された配列に対する少なくとも９０％マッチ（すなわち、２個以下のミスマッチ）を有する塩基配列を有し得る。それらの糖のすべては２’－ＭＯＥであり得、それらの結合のすべてはＰＳであり得る。
【0058】
ｍｉＲ－３３８－３ｐの実施形態において、その核酸は、ｍｉＲ－３３８－３ｐの結合部位にハイブリダイズしてＳＴＸＢＰ１転写物へのｍｉＲ－３３８－３ｐの結合を遮断する。例えば、その核酸は、配列番号６に対する少なくとも７５％または８５％または９０％または９５％または１００％の配列類似性を有し得る。好ましくは、その核酸中の少なくとも約６個～約１２個連続する塩基は、（関連するｍｉＲＮＡのシード領域を遮断するために）示された配列中の連続する塩基の対応するセグメントに対する少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有し、好ましくは：その核酸の塩基の過半数は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボースを有し、その核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ／あるいはどの窒素塩基もＴについて５－メチルウラシル（Ｔ）を使用しＣについて５－メチルシトシンを使用する。その核酸は、示された配列に対する少なくとも９０％マッチ（すなわち、２個以下のミスマッチ）を有する塩基配列を有し得る。それらの糖のすべては２’－ＭＯＥであり得、それらの結合のすべてはＰＳであり得る。
【0059】
ｍｉＲ－１－３ｐの実施形態において、その核酸は、ｍｉＲ－１－３ｐの結合部位にハイブリダイズしてＳＴＸＢＰ１転写物へのｍｉＲ－１－３ｐの結合を遮断する。例えば、その核酸は、配列番号７、８、９、２３、２４、および２５のうちの１つに対する少なくとも５０％または７５％または８５％または９０％または９５％または１００％の配列類似性を有し得る。好ましくは、その核酸中の少なくとも約６個～約１２個連続する塩基は、（関連するｍｉＲＮＡのシード領域を遮断するために）示された配列中の連続する塩基の対応するセグメントに対する少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有し、好ましくは：その核酸の塩基の過半数は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボースを有し、その核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ／またはどの窒素塩基もＴについて５－メチルウラシル（Ｔ）を使用し、Ｃについて５－メチルシトシンを使用する。その核酸は、示された配列に対する少なくとも９０％マッチ（すなわち、２個以下のミスマッチ）を有する塩基配列を有し得る。それらの糖のすべては２’－ＭＯＥおよび／または２’ＯＭｅであり得、それらの結合のすべてはＰＳおよび／またはＰＯであり得る。
【0060】
ｍｉＲ－４２３－５ｐの実施形態において、その核酸は、ｍｉＲ－４２３－５ｐの結合部位にハイブリダイズしてＳＴＸＢＰ１転写物へのｍｉＲ－４２３－５ｐの結合を遮断する。例えば、その核酸は、配列番号１０に対する少なくとも５０％または７５％または８５％または９０％または９５％または１００％の配列類似性を有し得る。好ましくは、その核酸中の少なくとも約６個～約１２個連続する塩基は、（関連するｍｉＲＮＡのシード領域を遮断するために）示された配列中の連続する塩基の対応するセグメントに対する少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有し、好ましくは：その核酸の塩基の過半数は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボースを有し、その核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ／またはどの窒素塩基もＴについて５－メチルウラシル（Ｔ）を使用し、Ｃについて５－メチルシトシンを使用する。その核酸は、示された配列に対する少なくとも９０％マッチ（すなわち、２個以下のミスマッチ）を有する塩基配列を有し得る。それらの糖のすべては２’－ＭＯＥであり得、それらの結合のすべてはＰＳであり得る。
【0061】
ｍｉＲ－１５４－５ｐの実施形態において、その核酸は、ｍｉＲ－１５４－５ｐの結合部位にハイブリダイズしてＳＴＸＢＰ１転写物へのｍｉＲ－１５４－５ｐの結合を遮断する。例えば、その核酸は、配列番号１１および１２のうちの１つに対する少なくとも５０％または７５％または８５％または９０％または９５％または１００％の配列類似性を有し得る。好ましくは、その核酸中の少なくとも約６個～約１２個連続する塩基は、（関連するｍｉＲＮＡのシード領域を遮断するために）示された配列中の連続する塩基の対応するセグメントに対する少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有し、好ましくは：その核酸の塩基の過半数は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボースを有し、その核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ／またはどの窒素塩基もＴについて５－メチルウラシル（Ｔ）を使用し、Ｃについて５－メチルシトシンを使用する。その核酸は、示された配列に対する少なくとも９０％マッチ（すなわち、２個以下のミスマッチ）を有する塩基配列を有し得る。それらの糖のすべては２’－ＭＯＥであり得、それらの結合のすべてはＰＳであり得る。
【0062】
ｍｉＲ－２１９ａ－５ｐの実施形態において、その核酸は、ｍｉＲ－２１９ａ－５ｐの結合部位にハイブリダイズしてＳＴＸＢＰ１転写物へのｍｉＲ－２１９ａ－５ｐの結合を遮断する。例えば、その核酸は、配列番号１３に対する少なくとも５０％または７５％または８５％または９０％または９５％または１００％の配列類似性を有し得る。好ましくは、その核酸中の少なくとも約６個～約１２個連続する塩基は、（関連するｍｉＲＮＡのシード領域を遮断するために）示された配列中の連続する塩基の対応するセグメントに対する少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有し、好ましくは：その核酸の塩基の過半数は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボースを有し、その核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ／またはどの窒素塩基もＴについて５－メチルウラシル（Ｔ）を使用し、Ｃについて５－メチルシトシンを使用する。その核酸は、示された配列に対する少なくとも９０％マッチ（すなわち、２個以下のミスマッチ）を有する塩基配列を有し得る。それらの糖のすべては２’－ＭＯＥであり得、それらの結合のすべてはＰＳであり得る。
【0063】
ｍｉＲ－４２４－５ｐの実施形態において、その核酸は、ｍｉＲ－４２４－５ｐの結合部位にハイブリダイズしてＳＴＸＢＰ１転写物へのｍｉＲ－４２４－５ｐの結合を遮断する。例えば、その核酸は、配列番号１４に対する少なくとも８５％または９０％または９５％または１００％の配列類似性を有し得る。好ましくは、その核酸中の少なくとも約６個～約１２個連続する塩基は、（関連するｍｉＲＮＡのシード領域を遮断するために）示された配列中の連続する塩基の対応するセグメントに対する少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有し、好ましくは：その核酸の塩基の過半数は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボースを有し、その核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ／またはどの窒素塩基もＴについて５－メチルウラシル（Ｔ）を使用し、Ｃについて５－メチルシトシンを使用する。その核酸は、示された配列に対する少なくとも９０％マッチ（すなわち、２個以下のミスマッチ）を有する塩基配列を有し得る。それらの糖のすべては２’－ＭＯＥであり得、それらの結合のすべてはＰＳであり得る。
【0064】
ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐの実施形態において、その核酸は、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐの結合部位にハイブリダイズしてＳＴＸＢＰ１転写物へのｍｉＲ－３０ｂ－５ｐの結合を遮断する。例えば、その核酸は、配列番号１５、１６、および１７のうちの１つに対する少なくとも５０％または７５％または８５％または９０％または９５％または１００％の配列類似性を有し得る。好ましくは、その核酸中の少なくとも約６個～約１２個連続する塩基は、（関連するｍｉＲＮＡのシード領域を遮断するために）示された配列中の連続する塩基の対応するセグメントに対する少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有し、好ましくは：その核酸の塩基の過半数は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボースを有し、その核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ／またはどの窒素塩基もＴについて５－メチルウラシル（Ｔ）を使用し、Ｃについて５－メチルシトシンを使用する。その核酸は、示された配列に対する少なくとも９０％マッチ（すなわち、２個以下のミスマッチ）を有する塩基配列を有し得る。それらの糖のすべては２’－ＭＯＥであり得、それらの結合のすべてはＰＳであり得る。
【0065】
ｍｉＲ－１４１－３ｐの実施形態において、その核酸は、ｍｉＲ－１４１－３ｐの結合部位にハイブリダイズしてＳＴＸＢＰ１転写物へのｍｉＲ－１４１－３ｐの結合を遮断する。例えば、その核酸は、配列番号１８に対する少なくとも５０％または７５％または８５％または９０％または９５％または１００％の配列類似性あるいは配列番号１９に対する少なくとも６０％または７５％または８５％または９０％または９５％または１００％の配列類似性を有し得る。好ましくは、その核酸中の少なくとも約６個～約１２個連続する塩基は、（関連するｍｉＲＮＡのシード領域を遮断するために）示された配列中の連続する塩基の対応するセグメントに対する少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有し、好ましくは：その核酸の塩基の過半数は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボースを有し、その核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ／またはどの窒素塩基もＴについて５－メチルウラシル（Ｔ）を使用し、Ｃについて５－メチルシトシンを使用する。その核酸は、示された配列に対する少なくとも９０％マッチ（すなわち、２個以下のミスマッチ）を有する塩基配列を有し得る。それらの糖のすべては２’－ＭＯＥであり得、それらの結合のすべてはＰＳであり得る。
【0066】
ｍｉＲ－２１８－５ｐの実施形態において、その核酸は、ｍｉＲ－２１８－５ｐの結合部位にハイブリダイズしてＳＴＸＢＰ１転写物へのｍｉＲ－２１８－５ｐの結合を遮断する。例えば、その核酸は、配列番号２０に対する少なくとも８５％または９０％または９５％または１００％の配列類似性あるいは配列番号２１に対する少なくとも８０％または８５％または９０％または９５％または１００％の配列類似性を有し得る。好ましくは、その核酸中の少なくとも約６個～約１２個連続する塩基は、（関連するｍｉＲＮＡのシード領域を遮断するために）示された配列中の連続する塩基の対応するセグメントに対する少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有し、好ましくは：その核酸の塩基の過半数は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボースを有し、その核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ／またはどの窒素塩基もＴについて５－メチルウラシル（Ｔ）を使用し、Ｃについて５－メチルシトシンを使用する。その核酸は、示された配列に対する少なくとも８８％マッチ（すなわち、２個以下のミスマッチ）を有する塩基配列を有し得る。それらの糖のすべては２’－ＭＯＥであり得、それらの結合のすべてはＰＳであり得る。
【0067】
ｍｉＲ－１４３－３ｐの実施形態において、その核酸は、ｍｉＲ－１４３－３ｐの結合部位にハイブリダイズしてＳＴＸＢＰ１転写物へのｍｉＲ－１４３－３ｐの結合を遮断する。例えば、その核酸は、配列番号２２に対する少なくとも７０％または７５％または８３％または９０％または９５％または１００％の配列類似性を有し得る。好ましくは、その核酸中の少なくとも約６個～約１２個連続する塩基は、（関連するｍｉＲＮＡのシード領域を遮断するために）示された配列中の連続する塩基の対応するセグメントに対する少なくとも９０％または１００％の配列同一性を有し、好ましくは：その核酸の塩基の過半数は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾リボースを有し、その核酸中の過半数の塩基間結合はホスホロチオエート結合であり、かつ／またはどの窒素塩基もＴについて５－メチルウラシル（Ｔ）を使用し、Ｃについて５－メチルシトシンを使用する。その核酸は、示された配列に対する少なくとも８８％マッチ（すなわち、２個以下のミスマッチ）を有する塩基配列を有し得る。それらの糖のすべては２’－ＭＯＥであり得、それらの結合のすべてはＰＳであり得る。
【0068】
オリゴヌクレオチドは、実験室で固相化学合成によって一般的に作製され、その後、精製および単離が行われる。そのオリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合されたヌクレオチドもしくは共有結合されたヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその核酸塩基部分の修飾に対して言及がなされる。本発明のオリゴヌクレオチドは人工的であり得（すなわち、化学合成され得）、典型的には精製または単離され得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチド（例えば、２’糖修飾ヌクレオシド）を含み得る。
【0069】
その修飾ヌクレオチドは、デオキシヌクレオチド、３’－末端デオキシチミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックトヌクレオチド、アンロックトヌクレオチド（ｕｎｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ ｅｔｈｙｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－ヒドロキシル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルフォリノヌクレオチド、ホスホルアミダート、非天然塩基含有ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基含有ヌクレオチド、メチルホスホネート基含有ヌクレオチド、５’－ホスフェート含有ヌクレオチド、５’－ホスフェート模倣物含有ヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド、および２’－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド、ならびにそれらの組合せからなる群より独立的に選択され得る。
【0070】
そのＡＳＯの窒素塩基は、天然に存在する核酸塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチン）、ならびに天然に存在しない改変体（例えば、置換プリンまたは置換ピリミジン（例えば、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５－メチルシトシン、５－チアゾロ（ｔｈｉｏｚｏｌｏ）シトシン、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－ブロモウラシル ５－チアゾロウラシル、２－チオウラシル、２’チオチミン、イノシン、ジアミノプリン、６－アミノプリン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンから選択される、核酸塩基））であり得る。
【0071】
その核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基についての文字コード（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵ）によって示され得、各文字は同等の機能の修飾核酸塩基を必要に応じて含み得る。例えば、例示されたオリゴヌクレオチドにおいて、その核酸塩基部分はＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、および５－メチルシトシンから選択される。必要に応じて、５－メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
【0072】
本開示のオリゴヌクレオチドは、ＳＴＸＢＰ１の発現をアップレギュレート可能である。
【0073】
本開示のオリゴヌクレオチドは、修飾糖部分（すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見出されるリボース糖部分と比較した場合のその糖部分の修飾）を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。そのリボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドの特定の特性（例えば、親和性および／またはヌクレアーゼ抵抗性）を改善することを主に目的として、作製された。そのような修飾としては、そのリボース環構造が例えばヘキソース環での置換によって修飾されたもの（ＨＮＡ）、または二環式環（これは典型的にはそのリボース環上のＣ２炭素とＣ４炭素との間に架橋を有する）での置換によって修飾されたもの（ＬＮＡ）、または連結されていないリボース環（これはそのＣ２炭素とＣ３炭素との間に結合を典型的には欠く）での置換によって修飾されたもの（例えば、ＵＮＡ）が挙げられる。修飾ヌクレオシドとしてはまた、その糖部分が非糖部分で置換されたヌクレオシド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはモルフォリノ核酸の場合）が挙げられる。
【0074】
糖修飾としてはまた、そのリボース環上の置換基を水素以外の基へ、またはＤＮＡヌクレオシドおよびＲＮＡヌクレオシドにおいて天然で見出される２’－ＯＨ基へと変更することによって行われる修飾が挙げられる。置換基は、例えば、２’位、３’位、４’位または５’位に導入され得る。
【0075】
そのオリゴヌクレオチドは、１つ以上のロックト核酸（ＬＮＡ）塩基を含み得る。ＬＮＡは、ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とを連結するビラジカル（ｂｉｒａｄｉｃａｌ）（「２’－４’架橋」とも呼ばれる）を含む２’－修飾ヌクレオシドを含み得、このビラジカルはそのリボース環の立体配座を制限またはロックする。これらのヌクレオシドはまた、文献では架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも呼ばれる。そのリボースの立体配座のロックは、そのＬＮＡが相補的ＲＮＡ分子または相補的ＤＮＡ分子のためのオリゴヌクレオチドに組み込まれた場合に、ハイブリダイゼーションの増加した親和性（二重鎖安定性）に関連する。このことは、そのオリゴヌクレオチド／相補体二重鎖の融解温度を測定することによって、慣用的に決定され得る。非限定的で例示的なＬＮＡヌクレオシドが、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、ＷＯ２００４／０４６１６０、ＷＯ００／０４７５９９、ＷＯ２００７／１３４１８１、ＷＯ２０１０／０７７５７８、ＷＯ２０１０／０３６６９８、ＷＯ２００７／０９００７１、ＷＯ２００９／００６４７８、ＷＯ２０１１／１５６２０２、ＷＯ２００８／１５４４０１、ＷＯ２００９／０６７６４７、およびＷＯ２００８／１５０７２９（すべてが参照により援用される）において開示されている。
【0076】
本開示のオリゴヌクレオチドの薬学的に受容可能な塩としては、遊離塩基または遊離酸の生物学的有効性および特性を保持する塩（これらは生物学的にも他の点でも望ましくないものではない）が挙げられる。それらの塩は、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、特に塩酸）、および有機酸（例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、スルホン酸、またはサリチル酸）を用いて形成される。さらに、それらの塩は、遊離酸への無機塩基または有機塩基の添加から調製され得る。無機塩基由来の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩が挙げられるが、これらに限定はされない。有機塩基由来の塩としては、一級アミンの塩、二級アミンの塩、および三級アミンの塩、置換アミン（天然に存在する置換アミンが挙げられる）、環状アミンの塩および塩基性イオン交換樹脂の塩、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、Ｎ－エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂が挙げられるが、これらに限定はされない。
【0077】
ＡＳＯは、２’置換ヌクレオシド（例えば、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡ単位、２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ、２’－アミノ－ＤＮＡ単位、２’－フルオロ－ＤＮＡ単位、２’－アルコキシ－ＲＮＡ、２’－ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、２’－フルオロ－ＡＮＡ単位、またはそれらの組合せからなる群より独立的に選択される、２’置換ヌクレオシド）を含み得る。
【0078】
１つ以上の非ヌクレオチド部分へのそのオリゴヌクレオチドの結合体化は、例えば、そのオリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取込みまたは安定性に影響を与えることによって、そのオリゴヌクレオチドの薬理を改善し得る。一部の実施形態において、その結合体部分は、そのオリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、透過性、および／もしくは細胞取込みを改善することによって、そのオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改変または増強し得る。詳細には、その結合体は、そのオリゴヌクレオチドを特定の器官、組織または細胞型に対して標的化させ得、それにより、その器官、組織または細胞型におけるそのオリゴヌクレオチドの有効性を増強し得る。その結合体はまた、非標的細胞型、非標的組織、または非標的器官におけるそのオリゴヌクレオチドの活性（例えば、オフターゲット活性、または非標的細胞型、非標的組織、もしくは非標的器官における活性）を減少するようにも役立ち得る。
【0079】
ある実施形態において、その非ヌクレオチド部分（結合体部分）は、炭水化物、細胞表面レセプターリガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、カプシド）またはそれらの組合せからなる群より選択される。一部の実施形態において、本発明のＡＳＯは、抗体に結合体化される。例えば、抗体はＡＳＯに結合体化されて、そのＡＳＯの送達を増進または促進させ得る。
【0080】
本開示の組成物は、上記の核酸またはその塩のいずれかと、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、塩および／または佐剤とを含む、医薬組成物中で提供され得る。薬学的に受容可能な希釈剤としてはＡＣＳＦ（人工脳脊髄液）が挙げられ、薬学的に受容可能な塩としてはナトリウム塩およびカリウム塩が挙げられるがこれらに限定はされない。一部の実施形態において、その薬学的に受容可能な希釈剤は、滅菌リン酸緩衝食塩水または滅菌炭酸ナトリウム緩衝液である。一部の好ましい実施形態において、臨床適用のための希釈剤としては、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ Ｂ溶液および／またはＡＣＳＦ（人工脳脊髄液）が挙げられる。
【0081】
一部の実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、薬学的に受容可能な希釈剤中の（例えば、食塩水、ＰＢＳ、または炭酸ナトリウム緩衝液に溶解した）溶液の形態である。そのオリゴヌクレオチドは、その溶液中に予め処方された状態であり得、または一部の実施形態では、投与前に薬学的に受容可能な希釈剤中に溶解され得る乾燥粉末（例えば、凍結乾燥粉末）の形態であり得る。適切には、例えば、そのオリゴヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬ（例えば、１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ）の濃度で溶解され得る。
【0082】
本発明は早期発症てんかん性脳症を処置する方法を提供し、この方法は、それを必要とする患者に本開示の組成物のいずれかを送達することによる。送達される組成物は、本開示の核酸のうちの１種または本開示の核酸の任意の組合せを含み得る。「１種の核酸」と述べることは、単一の分子を意味せず、むしろ、例えば、その分子の多数の化学的に同一なコピーを含む組成物を意味する。それら核酸のうちの２種以上を組み合わせてかまたは別の時点で同じ患者に送達することが、好ましいものであり得る。好ましくは、その組成物は血液脳関門を越えて送達される。その核酸は、血液脳関門を越えることを増進するベクター（例えば、このような目的に役立つ特定のウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター）が挙げられる）を使用して、送達され得る。その核酸は、粒子（例えば、ウイルスベクター、小胞、または脂質ナノ粒子など）でパッケージングされ得る。その送達粒子は、次に、送達を増進するリガンド（例えば、血液脳関門を越えるレセプター媒介性トランスサイトーシスを増進することが既知である抗体など）で装飾され得る。概説について、Ｓｔａｎｉｍｉｒｏｖｉｃ、２０１８、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ、ＢｉｏＤｒｕｇｓ、３２（６）：５４７～５５９（参照によって援用される）を参照のこと。その組成物は、例えば、全身注入または髄腔内注射によって、送達され得る。その核酸は、その患者におけるＳＴＸＢＰ１の発現を増加させるために送達される。方法は、その患者がＳＴＸＢＰ１遺伝子におけるヘテロ接合性機能欠失変異を保有することを同定することによってその患者を選択する工程を含み得る。
【実施例】
【0083】
（実施例）
（実施例１：ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯプログラム）
ｍｉＲＮＡの実施形態において、２５種のｍｉＲＮＡ遮断性ＡＳＯを本明細書に記載したとおりに設計した。それらはすべて、２’－ＭＯＥ化学およびＰＳ骨格を有する、２０マーのＡＳＯであった。それらは配列番号１～２５によって表される。
（実施例１：ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯプログラム）
ｍｉＲＮＡの実施形態において、２５種のｍｉＲＮＡ遮断性ＡＳＯを本明細書に記載したとおりに設計した。それらはすべて、２’－ＭＯＥ化学およびＰＳ骨格を有する、２０マーのＡＳＯであった。それらは配列番号１～２５によって表される。
【0084】
ＵＴＲの実施形態において、４８種の５’ＵＴＲヘアピン遮断性ＡＳＯを設計して作製した。それらは、１６マー～２０マーの範囲の種々の長さを有した。すべての塩基は２’－Ｏ－メチルである。２４種のＡＳＯはＰＯ結合を有する。２４種のＡＳＯはＰＳ結合を有する。最初のスクリーニングを２００ｎＭ、１００ｎＭ、および／または５０ｎＭで行った。
【0085】
ＰＯ骨格を有するＰＯ ＵＴＲ ＡＳＯが配列番号２６～４９によって表される。
【0086】
ＰＳ骨格を有するＰＳ ＵＴＲ ＡＳＯが配列番号５０～７３によって表される。
【0087】
スクリーニングを線維芽細胞、ｉＰＳＣ由来ＮＧＮ２ニューロン、および／またはＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞において実行した。少なくとも３つのプロトコルを使用した：（ｉ）線維芽細胞およびＮＧＮ２ニューロン実験；（ｉｉ）ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫実験、ならびに（ｉｉｉ）ＮＧＮ２ニューロン／膠細胞共培養実験。（ｉ）線維芽細胞およびＮＧＮ２ニューロン実験について、細胞をＤＩＶ０（インビトロ培養０日）にプレーティングした。ＤＩＶ０３に、ＡＳＯ処理（Ｔｘ）。ＤＩＶ１０（７日間のＡＳＯ処理）に、収集。ＤＩＶ１３に、収集（１０日間のＡＳＯ処理であった）。（ｉｉ）ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫実験において、ＤＩＶ０１にＴｘ；ＤＩＶ０３に４８時間での収集、およびＤＩＶ０５に９６時間での収集。（ｉｉｉ）ＮＧＮ２ニューロン／膠細胞共培養実験について、ＤＩＶ２０に処理、ＤＩＶ２４にＡＳＯ処理後４日での収集、およびＤＩＶ３０にＡＳＯ処理後１０日での収集。
【0088】
本実施例全体を通して、および対応する図において、ＡＳＯの番号は表１におけるコード番号によって与える。したがって、例えば、図１において言及するＡＳＯ－０１８はまた表１中のコードｑ１８でもあり、配列番号９によって表される。または、同様に、ＡＳＯ－０３４はまたコードｑ３４でもあり、配列番号２５によって表される。
【0089】
図１は、対照線維芽細胞（処理後７日）に対する２１種のＳＴＸＢＰ１ ｍｉＲＮＡ遮断性ＡＳＯのスクリーニングからの結果を示す。棒の上に描かれた円は、用量反応試験のために選択したＡＳＯを示す。ヒト線維芽細胞を１ウェルあたり８ｋ個でプレーティングし、合計１０日間培養した。ＲＮＡｉ Ｍａｘを使用して、ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯを３日目に２００ｎＭにて線維芽細胞にトランスフェクトした。細胞を１０日目に処理後７日で収集し、ｑＰＣＲを使用してＳＴＸＢＰ１転写物発現を評価した。各棒は、単一の生物学的反復からの２つの技術的反復を示す。ＳＴＸＢＰ１発現をアクチンに対して正規化する。
【0090】
実験パラメータ：ｑＰＣＲ；細胞型：対照線維芽細胞（ＤＩＶ１０）；トランスフェクション：ＲＮＡｉ Ｍａｘ ０．５μＬ；処理：２００ｎＭのＡＳＯ；ｑＰＣＲ：ＡＳＯ処理の７日後；標的遺伝子：ＳＴＸＢＰ１（Ｈｓ００１６２４３０＿ｍｌ）；ならびに対照遺伝子：ｈＡｃｔｉｎ（Ｈｓ９９９９９９９０３＿ｍｌ）。
【0091】
図２は、線維芽細胞における５種のＳＴＸＢＰ１ ｍｉＲＮＡ遮断性ＡＳＯの用量反応を示す。ヒト線維芽細胞を１ウェルあたり８ｋ個でプレーティングし、合計１０日間培養した。ＲＮＡｉ Ｍａｘを使用して、ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯを３日目に２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、または４００ｎＭのいずれかで線維芽細胞にトランスフェクトした。細胞を１０日目に処理後７日で収集し、ｑＰＣＲを使用してＳＴＸＢＰ１転写物発現を評価した。各棒は、単一の生物学的反復からの２つの技術的反復を示す。ＳＴＸＢＰ１発現をアクチンに対して正規化する。
【0092】
重要な結果は、ＳＴＸＢＰ１発現レベルが本発明の組成物での処理に対して用量依存的反応を示すことである。
【0093】
実験パラメータ：ｑＰＣＲ；細胞型：対照線維芽細胞（ＤＩＶ１０）；トランスフェクション：ＲＮＡｉ Ｍａｘ ０．５μＬ；処理：４００ｎＭ、２００ｎＭ、ｌ００ｎＭ、５０ｎＭ および２５ｎＭのＡＳＯ（ＤＩＶ３）；ｑＰＣＲ：ＡＳＯ処理の７日後；標的遺伝子：ＳＴＸＢＰ１（Ｈｓ００１６２４３０＿ｍｌ）；対照遺伝子：ｈＡｃｔｉｎ（Ｈｓ９９９９９９９０３＿ｍｌ）。
【0094】
図３は、線維芽細胞におけるＡＳＯ－０１８、および修飾配列を用いてＡＳＯ－０１８から誘導した３種の追加のＡＳＯの用量反応を示す。ヒト線維芽細胞を１ウェルあたり５ｋ個でプレーティングし、合計１０日間培養した。ＲＮＡｉ Ｍａｘを使用して、ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯを３日目に１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、または２００ｎＭのいずれかで線維芽細胞にトランスフェクトした。細胞を１０日目に処理後７日で収集し、ｑＰＣＲを使用してＳＴＸＢＰ１転写物発現を評価した。各棒は、単一の生物学的反復からの２つの技術的反復を示す。ＳＴＸＢＰ１発現をＧＡＰＤＨに対して正規化する。
【0095】
重要な結果は、ＳＴＸＢＰ１発現レベルが本発明の組成物での処理に対して用量依存的反応を示すことである。
【0096】
実験パラメータ：ｑＰＣＲ；細胞型：ヒト線維芽細胞（ＤＩＶ１０）；トランスフェクション：ＬｉｐｏＲＮＡｉＭａｘ ０．５μＬ；処理：２００ｎＭ、ｌ００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、および１２．５ｎＭのＡＳＯ（ＤＩＶ３）；ｑＰＣＲ：ＡＳＯ処理の７日後；標的遺伝子：ＳＴＸＢＰ１（Ｈｓ００１６２４３０＿ｍｌ）；ならびに対照遺伝子：ＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇｌ）。
【0097】
図４は、ｉＰＳＣ由来ＮＧＮ２ニューロン（処理後７日）に対する２１種のＳＴＸＢＰ１ ｍｉＲＮＡ遮断性ＡＳＯのスクリーニングからの結果を示す。ヒトｉＰＳＣ由来ＮＧＮ２興奮性ニューロンを１ウェルあたり８０ｋ個でプレーティングし、合計１０日間培養した。ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯを３日目に単一濃度２００ｎＭでニューロンにトランスフェクトした。細胞を１０日目に処理後７日で収集し、ｑＰＣＲを使用してＳＴＸＢＰ１転写物発現を評価した。各棒は、単一の生物学的反復からの２つの技術的反復を示す。ＳＴＸＢＰ１発現をアクチンに対して正規化する。
【0098】
コードｑ１１およびｑ１５～ｑ３１を有するＡＳＯ（これらは配列番号２および６～２２である）が、ＳＴＸＢＰ１発現に対して最も強い効果を示す。
【0099】
実験パラメータ：ｑＰＣＲ；細胞型：ＮＧＮ２ニューロン（ＤＩＶ１０）；トランスフェクション：Ｅｎｄｏｐｏｒｔｅｒ ＰＥＧ ０．６μＬ；処理：２００ｎＭのＡＳＯ；ｑＰＣＲ：ＡＳＯ処理の７日後；標的遺伝子：ＳＴＸＢＰ１（Ｈｓ００１６２４３０＿ｍｌ）；ならびに対照遺伝子：ｈＡｃｔｉｎ（Ｈｓ９９９９９９９０３＿ｍｌ）。
【0100】
図５～８は、処理後４８時間のＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞における８種の例示的なＳＴＸＢＰ１ ｍｉＲＮＡ遮断性ＡＳＯをスクリーニングしたことについての結果を示す。ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を１ウェルあたり４５ｋ個でプレーティングし、合計３日間培養した。ＲＮＡｉ Ｍａｘを使用して、ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯを１日目に単一濃度１００ｎＭで細胞にトランスフェクトした。細胞を３日目に処理後４８時間で収集し、ウェスタンブロットを使用してＳＴＸＢＰ１発現を評価した。ＴＵＪ１をタンパク質ローディングについてのマーカーとして使用した。その後、ＳＴＸＢＰ１タンパク質レベルをサンプル内でＴＵＪ１に対して正規化し、図９に示すとおり定量化した。「．１」および「．２」は、同じ生物学的反復からの技術的反復を示す。
【0101】
図５は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（処理後４８時間）に対する２種のＳＴＸＢＰ１ ｍｉＲＮＡ遮断性ＡＳＯ（ｑ２０およびｑ２３）のスクリーニングからの結果を示す。
【0102】
図６は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（処理後４８時間）に対する２種のＳＴＸＢＰ１ ｍｉＲＮＡ遮断性ＡＳＯ（ｑ１３およびｑ１８）のスクリーニングからの結果を示す。
【0103】
図７は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（処理後４８時間）に対する２種のＳＴＸＢＰ１ ｍｉＲＮＡ遮断性ＡＳＯ（ｑ２４およびｑ４）のスクリーニングからの結果を示す。
【0104】
図８は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（処理後４８時間）に対するＳＴＸＢＰ１ ｍｉＲＮＡ遮断性ＡＳＯ（ｑ８）のスクリーニングからの結果を示す。
【0105】
実験パラメータ：ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を用いてｑ２０、ｑ２３、ｑ１３、ｑ１８、ｑ２４、ｑ４、およびｑ８をスクリーニングすることについて：細胞型：ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（ＤＩＶ３）；トランスフェクション：ＲＮＡｉ Ｍａｘ（０．５μＬ）（ＤＩＶ１）；処理：ｌ００ｎＭのＡＳＯ；タンパク質収集：ＡＳＯ処理の４８時間後；一次標的抗体：ウサギ（Ｒｂ）抗Ｍｕｎｃ１８－１（細胞シグナル伝達）；ならびに対照標的抗体：マウス（Ｍｓ）抗βＩＩＩチューブリン（ＴＵＪ１）。
【0106】
図９は、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞（処理後４８時間）に対する８種のＳＴＸＢＰ１ ｍｉＲＮＡ遮断性ＡＳＯのスクリーニングからの結果を示す。ＳＨ－ＳＹ５Ｙ神経芽細胞腫細胞を１ウェルあたり４５ｋ個でプレーティングし、合計３日間培養した。ＲＮＡｉ Ｍａｘを使用して、ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯを１日目に単一濃度１００ｎＭで細胞にトランスフェクトした。細胞を３日目に処理後４８時間で収集し、ウェスタンブロットを使用してＳＴＸＢＰ１発現を評価した－ウェスタンブロットを図５～８に提示する。ＴＵＪ１をタンパク質ローディングについてのマーカーとして使用した。その後、ＳＴＸＢＰ１タンパク質レベルをサンプル内でＴＵＪ１に対して正規化して、相対的タンパク質発現を得た。その後、各条件についての相対的ＳＴＸＢＰ１タンパク質発現を細胞条件に対して正規化して、相対的正規化発現を得た。
【0107】
実験パラメータ：細胞型：ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞（ＤＩＶ３）；トランスフェクション：ＲＮＡｉ Ｍａｘ（０．５μＬ）（ＤＩＶ１）；処理：ｌ００ｎＭのＡＳＯ；タンパク質収集：ＡＳＯ処理の４８時間後；一次標的抗体：Ｒｂ抗Ｍｕｎｃ１８－１（細胞シグナル伝達）；ならびに対照標的抗体：Ｍｓ抗βＩＩＩチューブリン（ＴＵＪ１）。
【0108】
図１０～図１１はゲルの画像を示し、これらは、ヒトｉＰＳＣ由来ＮＧＮ２ニューロンにおけるｍｉＲＮＡ遮断性ＡＳＯでのＳＴＸＢＰ１タンパク質のブーストの例示的スクリーニングの結果を提示する。ヒトｉＰＳＣ由来ＮＧＮ２興奮性ニューロンを１ウェル当たり２０と５０ｋとの間の密度でプレーティングし、合計１０日間培養した。ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯを４日目に単一濃度ｌ００ｎＭでニューロンにトランスフェクトした。細胞を１０日目に処理後６日で収集し、ウェスタンブロットを使用してＳＴＸＢＰ１発現を評価した。ＧＡＰＤＨをタンパク質ローディングについての対照マーカー／タンパク質として使用した。「－０１」、「－０２」、「０３」などは生物学的反復を示す。
【0109】
図１０はウェスタンブロットゲルの画像を示し、これは、ヒトｉＰＳＣ由来ＮＧＮ２ニューロンにおける４種のＳＴＸＢＰ１ ｍｉＲＮＡ遮断性ＡＳＯの処理後６日でのスクリーニングについての結果を提示する。試験したＡＳＯは、ＡＳＯ－１９（これは配列番号１０の配列を含む）、ＡＳＯ－０２９（これは配列番号２０の配列を含む）、およびＡＳＯ－０１３（これは配列番号４の配列を含む）を含んだ。
【0110】
図１１はウェスタンブロットゲルの画像を示し、これは、ヒトｉＰＳＣ由来ＮＧＮ２ニューロンにおける６種のＳＴＸＢＰ１ ｍｉＲＮＡ遮断性ＡＳＯの処理後６日でのスクリーニングについての結果を提示する。試験したＡＳＯは、ＡＳＯ－１８（これは配列番号９の配列を含む）を含んだ。
【0111】
図１２～図１３は、培養中の２つの時点での、ヒトｉＰＳＣ由来ＮＧＮ２ニューロンにおけるいくつかの３’ｍｉＲＮＡ標的化ＡＳＯにわたるＳＴＸＢＰ１タンパク質のブーストについてのスクリーニングの概要を提示する。ヒトｉＰＳＣ由来ＮＧＮ２興奮性ニューロンを１ウェル当たり２０と５０ｋとの間の密度でプレーティングし、合計３０日間（図１２）または１０日間（図１３）培養した。ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯを２０日目（図１２）または４日目（図１３）のいずれかに単一濃度１００ｎＭもしくは２００ｎＭでニューロンにトランスフェクトした。細胞を処理後１０日（図１２）または処理後６日（図１３）のいずれかで収集し、ウェスタンブロットを使用してＳＴＸＢＰ１発現を評価した。ＧＡＰＤＨをタンパク質ローディングについての対照マーカー／タンパク質として使用した。例示のウェスタンブロットを図１０～図１１に提示する。ＧＡＰＤＨをタンパク質ローディングについてのマーカーとして使用した。ＳＴＸＢＰ１タンパク質レベルをサンプル内でＧＡＰＤＨに対して正規化して、相対的タンパク質発現を得た。その後、各条件についての相対的ＳＴＸＢＰ１タンパク質発現をビヒクル条件に対して正規化して、相対的正規化発現を得た。ＡＳＯごとの各ドットは、独立した生物学的反復を示す。
【0112】
図１４は、ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯのヒットがヒトｉＰＳＣ由来ＮＧＮ２ニューロンにおける用量反応でＳＴＸＢＰ１タンパク質を調節することを示す結果を提示する。ヒトｉＰＳＣ由来ＮＧＮ２興奮性ニューロンを１ウェル当たり２０と５０ｋとの間の密度でプレーティングし、合計１０日間培養した。ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯを４日目に５０ｎＭ、１００ｎＭ、または２００ｎＭの濃度でニューロンにトランスフェクトした。細胞を処理後６日で収集し、ウェスタンブロットを使用してＳＴＸＢＰ１発現を評価した。ＧＡＰＤＨをタンパク質ローディングについての対照マーカー／タンパク質として使用した。ＳＴＸＢＰ１タンパク質レベルをサンプル内でＧＡＰＤＨに対して正規化して、相対的タンパク質発現を得た。その後、各条件についての相対的ＳＴＸＢＰ１タンパク質発現をビヒクル条件に対して正規化して、相対的正規化発現を得た。単一濃度スクリーニングからのヒットＡＳＯにボックスで印を付けている。
【0113】
図１５は、ウェスタンブロット法でヒトｉＰＳＣ由来ニューロンにおいてスクリーニングした５’ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯの定量化を示し、これは、本発明のいくつかのＡＳＯについてのＳＴＸＢＰ１タンパク質のブーストを明らかにする。ヒトｉＰＳＣ由来ＮＧＮ２興奮性ニューロンを１ウェル当たり２０と５０ｋとの間の密度でプレーティングし、合計３０日間培養した。ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯを２０日目に１００ｎＭの濃度でニューロンにトランスフェクトした。細胞を処理後１０日で収集し、ウェスタンブロットを使用してＳＴＸＢＰ１発現を評価した。ＧＡＰＤＨをタンパク質ローディングについての対照マーカー／タンパク質として使用した。ＳＴＸＢＰ１タンパク質レベルをサンプル内でＧＡＰＤＨに対して正規化して、相対的タンパク質発現を得た。その後、各条件についての相対的ＳＴＸＢＰ１タンパク質発現をビヒクル条件（最も右の棒）に対して正規化して、相対的正規化発現を得た。すべてのラウンドは、およそＤＩＶ２０にＡＳＯ（ｌ００ｎＭ）で処理しおよそＤＩＶ３０にＡＳＯ後１０日で収集した、ｉＰＳＣ由来ＮＧＮ２ニューロンに由来する。ビヒクルについての概要データは４９個のウェスタンブロットゲルにわたってのものであり、それらのゲルにわたって１３８個のビヒクルサンプルを含む。
【0114】
図１６～図１７は、ＢＲＩＴＥ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑ－Ｓｔａｔｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用した全光型（ａｌｌ－ｏｐｔｉｃａｌ）電気生理学的シナプス細胞表現型の同定を示す結果を提示する。
【0115】
アイソジェニックｉＰＳＣ由来ニューロンを、ＳＴＸＢＰ１遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ編集を使用して作製した。ＣＲＩＳＰＲ編集したｉＰＳＣクローンを選択し、ウェスタンブロットを使用してスクリーニングして、これらの細胞株由来のニューロンを遺伝子型決定した。野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合性（Ｈｅｔ）ノックアウト、ホモ接合性ノックアウト（ＫＯ）を同定した（図１６）。
【0116】
ヒトｉＰＳＣ由来ＮＧＮ２興奮性ニューロンを、誘発されたシナプス伝達の機能的光遺伝学的記録のために９６ウェルプレートにプレーティングし、用量依存的ＳＴＸＢＰ１関連細胞表現型を、図１７において示すとおり、野生型対照（ＳＴＸＢＰ１＋／＋）と比較してヘテロ接合性（Ｈｅｔ）ノックアウト（ＳＴＸＢＰ１＋／－）細胞株、およびホモ接合性ノックアウト（ＳＴＸＢＰ１－／－、ＫＯ）細胞株において同定した。ニューロンを２０日目に測定した。ＳＴＸＢＰ１に対するｓｉＲＮＡで処理した初代マウス皮質ニューロンは、類似する誘発されたシナプス細胞表現型を示し、このことは、ヒトＣＲＩＳＰＲ細胞株の機能的表現型を確認した。
【0117】
図１８は、レンチウイルス送達によるＳＴＸＢＰ１遺伝子の再導入によるシナプス表現型レスキューを示す。図１６～図１７からのシナプス表現型のＳＴＸＢＰ１依存性を調べるために、レンチウイルス構築物を設計した。すべてＨＳｙｎプロモーターの制御下にある全長ＳＴＸＢＰ１、未成熟終止コドン含有ＳＴＸＢＰ１、および蛍光タグ（ＥＧＦＰ）を、この実験のために作製した。ＳＴＸＢＰ１－／－ニューロンは野生型（ＳＴＸＢＰ１＋／＋）ニューロンと比較してシナプス伝達の完全な喪失を示し（左上）、これは、以前のデータおよび図１６～図１７に提示したデータを繰り返した。ＳＴＸＢＰ１－／－ニューロンをＳＴＸＢＰ１レンチウイルスで処理すると、これは、これらの細胞においてシナプス伝達の欠損をレスキューした。変異体ＳＴＸＢＰ１の送達は何の効果も有しなかった。レンチウイルスを１７日目に送達した。ニューロンを４５日目に測定し、画像化後にタンパク質および転写物の発現のために収集した。ＳＴＸＢＰ１レンチウイルス処理したＫＯ細胞はＳＴＸＢＰ１タンパク質の発現を示し、これは、欠損タンパク質がレンチウイルス送達によってこれらの細胞において首尾よく再確立されたことを確認する。未処理細胞でも、ＥＧＦＰで処理した細胞でも、変異体ＳＴＸＢＰ１で処理した細胞でも、何のタンパク質も認められなかった（右下）。すべての条件でｑＰＣＲによってＳＴＸＢＰ１転写物を検出したが、ナンセンス媒介性減衰の欠如と一致して、正常なＳＴＸＢＰ１レンチウイルスで処理したＫＯ細胞は、他の条件と比較してＳＴＸＢＰ１転写物のアップレギュレーションを示す。
（実施例２．ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯ－３’調節領域タイリング（ｔｉｌｉｎｇ）プログラム）
（実施例２．ＳＴＸＢＰ１ ＡＳＯ－３’調節領域タイリング（ｔｉｌｉｎｇ）プログラム）
【0118】
実施例１において開発し試験したＡＳＯについての肯定的な結果に基づいて、タイリング（ｔｉｌｉｎｇ）アプローチを実行して、ＳＴＸＢＰ１の３’調節領域を経験的に見出し、それを本発明のＡＳＯで標的化した。この戦略を使用して、ＳＴＸＢＰ１ ｍｉＲＮＡ部位を標的とするＡＳＯ（配列番号７３～８４）または３’調節領域を標的とするＡＳＯ（配列番号８５～１０７）の両方を、見出した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】