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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-20
(54)【発明の名称】ＰＣＳＫ９を標的とするポリ核酸分子およびその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240912BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240912BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20240912BHJP
A61K 31/7115 20060101ALI20240912BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20240912BHJP
A61K 47/54 20170101ALI20240912BHJP
A61K 47/56 20170101ALI20240912BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240912BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20240912BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240912BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 130Z
C12N15/113 ZNA
A61K31/7088
A61K31/7125
A61K31/7115
A61K31/712
A61K47/54
A61K47/56
A61K47/64
A61P3/06
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024518572
(86)(22)【出願日】2022-09-22
(85)【翻訳文提出日】2024-05-17
(86)【国際出願番号】 US2022044444
(87)【国際公開番号】W WO2023049294
(87)【国際公開日】2023-03-30
(31)【優先権主張番号】63/247,677
(32)【優先日】2021-09-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/337,958
(32)【優先日】2022-05-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524110296
【氏名又は名称】シリウス セラピューティクス，インク．
(74)【代理人】
【識別番号】110003797
【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ブラッドショー，カート
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA95
4C076BB01
4C076BB11
4C076BB13
4C076BB16
4C076BB22
4C076BB25
4C076BB29
4C076BB31
4C076CC11
4C076CC41
4C076EE59
4C084AA13
4C084MA52
4C084MA55
4C084MA57
4C084MA59
4C084MA60
4C084MA63
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZC33
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA52
4C086MA55
4C086MA57
4C086MA59
4C086MA60
4C086MA63
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZC33
(57)【要約】
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型セリンプロテアーゼ（ＰＣＳＫ９）の発現を抑制するためのｓｉＲＮＡ二本鎖、医薬組成物、および方法が本明細書に開示される。いくつかの態様では、ポリ核酸分子は一本鎖核酸分子である。いくつかの例では、一本鎖核酸分子は、１つ、２つ、３つ、４つ以下のミスマッチを有する、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９から選択される配列に相補的な少なくとも１４個、１５個、１６個、１７個、１８個の連続するヌクレオチドを含む。他の例では、一本鎖核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９から選択される配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相補的な配列を含む。
【選択図】図１Ａ
【選択図】図１Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型セリンプロテアーゼ（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子であって、１つ、２つ、３つ、４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９から選択される配列に相補的な少なくとも１６個、１７個、または１８個の連続するヌクレオチドを含む、ポリ核酸分子。
【請求項2】
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型セリンプロテアーゼ（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子であって、配列番号１、３、５、７、および９から選択される配列に少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相補的な配列を含む、ポリ核酸分子。
【請求項3】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二重鎖核酸分子である、請求項１または２に記載のポリ核酸分子。
【請求項4】
前記センス鎖は、配列番号１、３、５、７、および９から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を含む、請求項３に記載のポリ核酸分子。
【請求項5】
前記アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、および１０から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を含む、請求項３に記載のポリ核酸分子。
【請求項6】
前記センス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９から選択される配列の少なくとも１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含む、請求項３～５のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項7】
前記アンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、および１０から選択される配列の少なくとも１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含む、請求項３～６のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項8】
前記センス鎖は、配列番号１、３、５、７、９のうちの１つを含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、１０のうちの１つを含む、請求項３～７のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項9】
（１）２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、（２）２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、または（３）修飾ヌクレオチド間結合を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項10】
５’末端に少なくとも２つの連続する修飾ヌクレオチド間結合を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項11】
修飾ヌクレオチド間結合で置換された３’末端の３つのヌクレオチド間結合のうち少なくとも２つのヌクレオチド間結合を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項12】
前記センス鎖は、‘５－ＮｆｓｎｓＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆＮｆＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆ－３’を含み、前記アンチセンス鎖は、‘５－ｎｓＮｆｓｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎｎｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎｓｎｓｎ－３’を含み、「Ｎｆ」は、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味し、「ｓ」は、３’－ホスホロチオエートを意味する、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項13】
前記センス鎖は、‘５－ｎｓｎｓｎｎｎｎＮｆｎＮｆＮｆＮｆｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、前記アンチセンス鎖は、‘５－ｎｓＮｆｓｎｎｎＮｆｎＮｆＮｆｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｎｎｓｎｓｎ－３’を含み、「Ｎｆ」は、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味し、「ｓ」は、３’－ホスホロチオエートを意味する、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項14】
前記センス鎖は、‘５－ｎｓｎｓｎｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、前記アンチセンス鎖は、‘５－ｎｓＮｆｓｎｎｎｎｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎｓｎｓｎ－３’を含み、「Ｎｆ」は、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味し、「ｓ」は、３’－ホスホロチオエートを意味する、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項15】
前記センス鎖は、‘５－ｎｓｎｓｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、前記アンチセンス鎖は、‘５－ｎｓＮｆｓｎｎｎｎｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎｎｎｎｎｓｎｓｎ－３’を含み、「Ｎｆ」は、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味し、「ｓ」は、３’－ホスホロチオエートを意味する、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項16】
前記修飾ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオエート結合である、請求項９～１５のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項17】
前記ホスホロチオエート結合は、立体化学的に富化されたホスホロチオエートヌクレオチド間結合である、請求項１６に記載のポリ核酸分子。
【請求項18】
前記立体化学的に富化されたホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、Ｓｐキラルヌクレオチド間ホスホロチオエート結合である、請求項１７に記載のポリ核酸分子。
【請求項19】
ポリ核酸が複数の修飾ヌクレオチド間結合を含み、前記複数の修飾ヌクレオチド間結合のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つは、立体化学的に富化されたホスホロチオエートヌクレオチド間結合である、請求項９～１５のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項20】
前記立体化学的に富化されたホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、Ｒ異性体およびＳ異性体の両方を含む、請求項１９に記載のポリ核酸分子。
【請求項21】
前記立体化学的に富化されたホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、前記センス鎖または前記アンチセンス鎖の５’または３’終端ヌクレオシドのうちの２つである２つの連続するヌクレオシドの間に配置される、請求項１７～２０のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項22】
ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシド置換を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項23】
前記ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシド置換は、イノシン置換である、請求項２２に記載のポリ核酸分子。
【請求項24】
前記イノシン置換は、前記アンチセンス鎖のシード領域内にある、請求項２３に記載のポリ核酸分子。
【請求項25】
前記イノシン置換は、前記アンチセンス鎖の５’末端から７ヌクレオチド以内にある、請求項２３に記載のポリ核酸分子。
【請求項26】
脱塩基置換を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項27】
前記脱塩基置換は、５’末端から５番目または７番目のヌクレオチドにある、請求項２６に記載のポリ核酸分子。
【請求項28】
未修飾ポリ核酸と比較して、前記ポリ核酸分子の細胞毒性は減少する、請求項９～２７のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項29】
前記センス鎖は、配列番号１３、１５、１７、１９、および２１から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である核酸配列を含む、請求項９～２８のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項30】
前記センス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１３、１５、１７、１９、および２１から選択される配列の少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含む、請求項９～２８のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項31】
前記アンチセンス鎖は、配列番号１４、１６、１８、２０、および２２から選択される配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である核酸配列を含む、請求項９～３０のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項32】
前記アンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１４、１６、１８、２０、および２２から選択される配列の少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含む、請求項９～３０のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項33】
前記センス鎖は、配列番号１３、１５、１７、１９、および２１の核酸配列から選択される配列を含み、前記アンチセンス鎖は、配列番号１４、１６、１８、２０、および２２の核酸配列から選択される配列を含む、請求項９～３２のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項34】
一本鎖核酸分子である、請求項１に記載のポリ核酸分子。
【請求項35】
長さが１６～３０塩基対である、請求項１～３４のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項36】
長さが１９～２５塩基対または２１～２３塩基対である、請求項１～３４のいずれか一項に記載のポリ核酸分子。
【請求項37】
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型セリンプロテアーゼ（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子であって、（ａ）ｕｓＵｆｓａｃａａａａｇｃａＡｆａＡｆｃＡｆｇｇｕｃｕｓａｓｇ（配列番号１４）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖およびａｓｇｓａｃｃｕＧｆｕＵｆｕＵｆｇｃｕｕｕｕｇｕａａ（配列番号１３）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、または
（ｂ）ｕｓＵｆｓｕｃａａｇｕｕａｃＡｆａＡｆａＧｆｃａａａａｓｃｓａ（配列番号１６）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖およびｕｓｕｓｕｕｇｃＵｆｕＵｆｕＧｆｕａａｃｕｕｇａａａ（配列番号１５）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖
を含み、
ここで、小文字の「ｎ」は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味し、「ｆ」が後に続く大文字（すなわち、「Ｎｆ」）は、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｓ」は、３’－ホスホロチオエートを意味する、ポリ核酸分子。
【請求項38】
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型セリンプロテアーゼ（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子コンジュゲートであって、請求項１～３７のいずれか一項に記載のポリ核酸分子およびアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含む、ポリ核酸分子コンジュゲート。
【請求項39】
前記ポリ核酸分子および前記アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、リンカーによって結合される、請求項３８に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
【請求項40】
前記リンカーは、以下の式（ＩＶ）【化1】
式中、Ｙ１およびＹ２のうちの少なくとも１つは、前記ポリ核酸分子中のヌクレオチドである、
請求項３９に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
【請求項41】
前記Ｙ１は、前記ポリ核酸分子のセンス鎖の３’終端上の最後のヌクレオチドである、請求項４０に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
【請求項42】
前記Ｙ１およびＹ２は、前記ポリ核酸分子中の２つの連続するヌクレオチドである、請求項４０に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
【請求項43】
前記アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
【請求項44】
前記ポリ核酸分子のセンス鎖の３’終端上の最後のヌクレオチドを有する、前記リンカーおよび前記アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、式（Ｖ’）【化2】
式中、式（Ｖ’）中のＺは、－Ｈ、－ＯＨ、－Ｏ－メチル、－Ｆ、または－Ｏ－メトキシエチルであり、式（Ｖ’）中のＲは、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、チミン、脱塩基、またはその他のものである、請求項３９～４３のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート。
【請求項45】
請求項１～３７のいずれか一項に記載のポリ核酸分子または請求項３８～４４のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項46】
ナノ粒子製剤として製剤化される、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項47】
非経口投与用、経口投与用、鼻腔内投与用、頬側投与用、直腸内投与用、経皮投与用、静脈内投与用、皮下投与用、または髄腔内投与用に製剤化される、請求項４５または４６に記載の医薬組成物。
【請求項48】
対象におけるプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型セリンプロテアーゼ（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を調節する方法であって、前記対象に、請求項１～３７のいずれか一項に記載のポリ核酸分子、請求項３８～４４のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または請求項４５～４７に記載の医薬組成物を投与することで、前記対象における前記ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節する工程を含む、方法。
【請求項49】
調節を必要とする対象における低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を調節する方法であって、前記対象に、請求項１～３７のいずれか一項に記載のポリ核酸分子、請求項３８～４４のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または請求項４５～４７に記載の医薬組成物を投与する工程を含み、請求項１～３７のいずれか一項に記載のポリ核酸分子、請求項３８～４４のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または請求項４５～４７に記載の医薬組成物は、前記対象における前記ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を減少させる、方法。
【請求項50】
前記調節を必要とする対象は、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、または他の高コレステロール関連疾患に罹患している、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
調節を必要とする対象におけるコレステロールを調節する方法であって、前記対象に、請求項１～３７のいずれか一項に記載のポリ核酸分子、請求項３８～４４のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または請求項４５～４７に記載の医薬組成物を投与する工程を含み、請求項１～３７のいずれか一項に記載のポリ核酸分子、請求項３８～４４のいずれか一項に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または請求項４５～４７に記載の医薬組成物は、前記対象における前記ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を減少させる、方法。
【請求項52】
前記調節を必要とする対象は、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、または他の高コレステロール関連疾患に罹患している、請求項５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
相互参照
本出願は、２０２１年９月２３日出願の米国仮出願第６３／２４７，６７７号、および２０２２年５月３日出願の米国仮出願第６３／３３７，９５８号の利益を主張し、これらの出願は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
本出願は、２０２１年９月２３日出願の米国仮出願第６３／２４７，６７７号、および２０２２年５月３日出願の米国仮出願第６３／３３７，９５８号の利益を主張し、これらの出願は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【0002】
ｍＲＮＡを選択的に分解する細胞機構としてのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の発見は、細胞培養における細胞表現型の標的操作および指向性治療法（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）の開発の可能性の両方を可能にする（Ｂｅｈｌｋｅ，２００６，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１３，６４４－６７０；Ｘｉｅらによる、２００６，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １１，６７～７３頁）。別のＲＮＡ治療法として、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）がＲＮＡ処理に含まれ、かつタンパク質発現を調節する（Ｒｉｎａｌｄｉ ＆ Ｗｏｏｄ，２０１８，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ １４，９～２１頁）。
【0003】
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型セリンプロテアーゼ（ＰＣＳＫ９）遺伝子は、セリンプロテアーゼの哺乳類ファミリーの９番目のメンバーである。ＰＣＳＫ９は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の代謝、ならびに神経炎症、アルツハイマー病、アルコール使用障害（ＡＵＤ）、脳卒中などを含む神経疾患の発生および進行において重要な役割を果たす。したがって、細胞毒性を持たない有効なＰＣＳＫ９阻害剤の開発への需要が存在する。ポリ核酸分子、そのコンジュゲート、および本明細書に記載の方法は、この需要を満たし、かつ関連する利点をもたらす。
【0004】
参照による援用
本明細書で言及される刊行物、特許、および特許出願はすべて、個々の公報、特許、または特許出願がそれぞれ参照によって援用されるように個別に示されるのと同程度に、参照によって本明細書に援用される。
本明細書で言及される刊行物、特許、および特許出願はすべて、個々の公報、特許、または特許出願がそれぞれ参照によって援用されるように個別に示されるのと同程度に、参照によって本明細書に援用される。
【発明の概要】
【0005】
特定の態様では、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子が本明細書に開示され、このポリ核酸分子は、表１、表２、および表３の核酸配列を含む。
【0006】
いくつかの態様では、ポリ核酸分子は一本鎖核酸分子である。いくつかの例では、一本鎖核酸分子は、１つ、２つ、３つ、４つ以下のミスマッチを有する、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９から選択される配列に相補的である少なくとも１４個、１５個、１６個、１７個、１８個の連続するヌクレオチドを含む。他の例では、一本鎖核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９から選択される配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相補的である配列を含む。いくつかの例では、一本鎖核酸分子は、１つ、２つ、３つ、４つ以下のミスマッチを有する、配列番号１、３、５、７、および９から選択される配列に相補的である少なくとも１４個、１５個、１６個、１７個、１８個の連続するヌクレオチドを含む。他の例では、一本鎖核酸分子は、配列番号１、３、５、７、および９から選択される配列に少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相補的である配列を含む。
【0007】
いくつかの態様では、ポリ核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子である。いくつかの例では、センス鎖は、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を含む。いくつかの例では、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を含む。いくつかの例では、センス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９から選択される配列の少なくとも１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含む。他の例では、アンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３から選択される配列の少なくとも１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含む。いくつかの例では、センス鎖は、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９のうちの１つを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３のうちの１つを含む。いくつかの例では、センス鎖は、配列番号１、３、５、７、および９から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を含む。いくつかの例では、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、および１０から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を含む。いくつかの例では、センス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９から選択される配列の少なくとも１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含む。他の例では、アンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、および１０から選択される配列の少なくとも１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含む。いくつかの例では、センス鎖は、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９のうちの１つを含み、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、および１０のうちの１つを含む。
【0008】
いくつかの例では、センス鎖は、配列番号１、３、５、７、および９から選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を含む。いくつかの例では、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、および１０から選択される配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を含む。他の例では、センス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、９から選択される配列の少なくとも１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含む。他の例では、アンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、および１０から選択される配列の少なくとも１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含む。他の例では、センス鎖は、配列番号１、３、５、７、および９のうちの１つを含み、アンチセンス鎖は、２、４、６、８、および１０のうちの１つを含む。
【0009】
いくつかの態様では、ポリ核酸分子は、（１）２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、（２）２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、または（３）修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、５’末端に少なくとも２つの連続する修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、修飾ヌクレオチド間結合で置換された３つのヌクレオチド間結合のうちの少なくとも２つのヌクレオチド間結合を３’末端に含む。
【0010】
いくつかの例では、センス鎖は、‘５－ＮｆｓｎｓＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎ－３’を含み、アンチセンス鎖は、‘５－ｎｓＮｆｓＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎｓｎ－３’を含み、「Ｎｆ」は２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味し、「ｓ」は３’－ホスホロチオエートを意味する。他の例では、センス鎖は、‘５－ｎｓｎｓｎｎｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎｎｎｎｎ－３’を含み、アンチセンス鎖は、‘５－ｎｓＮｆｓｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、「Ｎｆ」は２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味し、「ｓ」は３’－ホスホロチオエートを意味する。他の例では、センス鎖は、‘５－ｎｓｎｓｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、アンチセンス鎖は、‘５－ｎｓｎｓｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、「Ｎｆ」は２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味し、「ｓ」は３’－ホスホロチオエートを意味する。他の例では、センス鎖は、‘５－ｎｓｎｓｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎｎｎｎｎ－３’を含み、アンチセンス鎖は、‘５－ｎｓｎｓｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、「Ｎｆ」は２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」は２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味し、「ｓ」は３’－ホスホロチオエートを意味する。
【0011】
いくつかの例では、修飾ヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合である。いくつかの例では、修飾ヌクレオチド間結合は、立体化学的に富化されたホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。いくつかの例では、修飾ヌクレオチド間結合は、ＳＰキラルヌクレオチド間結合である。いくつかの例では、ポリ核酸は、複数の修飾ヌクレオチド間結合を含み、複数の修飾ヌクレオチド間結合のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つは、立体化学的に富化されたホスホロチオエートヌクレオチド間結合である。いくつかの例では、立体化学的に富化されたホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、Ｒ異性体およびＳ異性体の両方を含む。いくつかの例では、少なくとも１つの立体化学的に富化されたホスホロチオエートは、センス鎖またはアンチセンス鎖の６つの５’または３’終端ヌクレオシドのうちの２つである２つの連続するヌクレオシドの間に配置される。
【0012】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシド置換を含む。いくつかの例では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシド置換は、イノシン置換である。いくつかの例では、イノシン置換は、アンチセンス鎖のシード領域内にある。いくつかの例では、イノシン置換は、アンチセンス鎖の５’末端から７ヌクレオチド以内である。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、脱塩基置換を含む。いくつかの例では、脱塩基置換は、５’末端から５番目または７番目のヌクレオチドにある。
【0013】
いくつかの例では、非修飾ポリ核酸と比較して、ポリ核酸分子の細胞毒性は減少する。
【0014】
いくつかの例では、センス鎖は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、および１２８～２３０から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を含む核酸配列を含む。いくつかの例では、センス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１３、１５、１７、１９、２１、および１２８～２３０から選択される配列の少なくとも１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含む。他の例では、アンチセンス鎖は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、および３３４～４３６から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を含む核酸配列を含む。他の例では、アンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１４、１６、１８、２０、２２、および３３４～４３６から選択される配列の少なくとも１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含む。いくつかの例では、センス鎖は、配列番号１３、１５、１７、１９、２１、および１２８～２３０の核酸配列から選択される配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１４、１６、１８、２０、２２、および３３４～４３６の核酸配列から選択される配列を含む。いくつかの例では、センス鎖は、配列番号１３、１５、１７、１９、および２１から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を含む核酸配列を含む。いくつかの例では、センス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１３、１５、１７、１９、および２１から選択される配列の少なくとも１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含む。他の例では、アンチセンス鎖は、配列番号１４、１６、１８、２０、および２２から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を含む核酸配列を含む。他の例では、アンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１４、１６、１８、２０、および２２から選択される配列の少なくとも１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の連続するヌクレオチドを含む核酸配列を含む。いくつかの例では、センス鎖は、配列番号１３、１５、１７、１９、および２１の核酸配列から選択される配列を含み、アンチセンス鎖は、配列番号１４、１６、１８、２０、および２２の核酸配列から選択される配列を含む。
【0015】
いくつかの例では、ポリ核酸分子は、長さが１９～２５塩基対である。いくつかの例では、ポリ核酸分子は、長さが１６～３０塩基対である。他の例では、ポリ核酸分子は、長さが２１～２３塩基対である。他の例では、ポリ核酸分子は、長さが１９～２５塩基対である。
【0016】
プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型セリンプロテアーゼ（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子であって、（ａ）ｕｓＵｆｓａｃａａａａｇｃａＡｆａＡｆｃＡｆｇｇｕｃｕｓａｓｇ（配列番号１４）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖およびａｓｇｓａｃｃｕＧｆｕＵｆｕＵｆｇｃｕｕｕｕｇｕａａ（配列番号１３）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖、または（ｂ）ｕｓＵｆｓｕｃａａｇｕｕａｃＡｆａＡｆａＧｆｃａａａａｓｃｓａ（配列番号１６）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖およびｕｓｕｓｕｕｇｃＵｆｕＵｆｕＧｆｕａａｃｕｕｇａａａ（配列番号１５）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖を含み、ここで、小文字の「ｎ」は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味し、「ｆ」が後に続く大文字（すなわち、「Ｎｆ」）は、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｓ」は、３’－ホスホロチオエートを意味する、ポリ核酸分子。
【0017】
いくつかの態様では、プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型セリンプロテアーゼ（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子コンジュゲートであって、本明細書に記載のポリ核酸分子およびアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含む、ポリ核酸分子コンジュゲート、が本明細書に開示される。いくつかの例では、ポリ核酸分子およびアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、リンカーによって結合される。いくつかの例では、リンカーは、以下の式（ＩＶ）
【0018】
【化1】
式中、Ｙ１およびＹ２のうちの少なくとも１つは、ポリ核酸分子中のヌクレオチドである。いくつかの例では、Ｙ１は、ポリ核酸分子のセンス鎖の３’終端上の最後のヌクレオチドである。他の例では、Ｙ１およびＹ２は、ポリ核酸分子中の２つの連続するヌクレオチドである。いくつかの例では、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む。いくつかの例では、ポリ核酸分子のセンス鎖の３’終端上の最後のヌクレオチドを有するリンカーおよびアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、式（Ｖ’）
【0019】
【化2】
式中、式（Ｖ’）中のＺは、－Ｈ、－ＯＨ、－Ｏ－メチル、－Ｆ、または－Ｏ－メトキシエチルであり、式（Ｖ’）中のＲは、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、チミン、脱塩基、またはその他のものである。
【0020】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子または本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物、が本明細書に提供される。いくつかの例では、医薬組成物は、ナノ粒子製剤として製剤化される。いくつかの例では、医薬組成物は、非経口投与用、経口投与用、鼻腔内投与用、頬側投与用、直腸内投与用、経皮投与用、静脈内投与用、皮下投与用、または髄腔内投与用に製剤化される。
【0021】
いくつかの態様では、対象におけるプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型セリンプロテアーゼ（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を調節する方法であって、対象に、本明細書に記載のポリ核酸分子、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または本明細書に記載の医薬組成物を投与することで、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節する工程を含む、方法、が本明細書に提供される。
【0022】
他の態様では、調節を必要とする対象における低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を調節する方法であって、対象に、本明細書に記載のポリ核酸分子、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または本明細書に記載の医薬組成物を投与する工程を含み、本明細書に記載のポリ核酸分子、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または本明細書に記載の医薬組成物は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を減少させる、方法、が本明細書に提供される。いくつかの例では、調節を必要とする対象は、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、または他の高コレステロールに関連する疾患に罹患している。
【0023】
いくつかの態様では、調節を必要とする対象におけるコレステロールを調節する方法であって、対象に、本明細書に記載のポリ核酸分子、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または本明細書に記載の医薬組成物を投与する工程を含み、本明細書に記載のポリ核酸分子、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または本明細書に記載の医薬組成物は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を減少させる、方法、が本明細書に提供される。いくつかの例では、調節を必要とする対象は、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、または他の高コレステロールに関連する疾患に罹患している。
【図面の簡単な説明】
【0024】
本開示の様々な態様は、添付の特許請求の範囲において詳細に記載される。本開示の特徴および利点のより良い理解は、本開示の原理が利用される例示的な態様を記載する以下の詳細な説明、および以下の添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【図1A】図１Ａ～図１Ｊは、非ヒト霊長類におけるＰＣＳＫ９レベル、ＬＤＬ－ｃレベル、トリグリセリド（ＴＧ）レベル、ＨＤＬ－ｃレベル、および総コレステロール（Ｔ－Chol）レベルに対する複数のｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図1B】図１Ａ～図１Ｊは、非ヒト霊長類におけるＰＣＳＫ９レベル、ＬＤＬ－ｃレベル、トリグリセリド（ＴＧ）レベル、ＨＤＬ－ｃレベル、および総コレステロール（Ｔ－Chol）レベルに対する複数のｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図1C】図１Ａ～図１Ｊは、非ヒト霊長類におけるＰＣＳＫ９レベル、ＬＤＬ－ｃレベル、トリグリセリド（ＴＧ）レベル、ＨＤＬ－ｃレベル、および総コレステロール（Ｔ－Chol）レベルに対する複数のｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図1D】図１Ａ～図１Ｊは、非ヒト霊長類におけるＰＣＳＫ９レベル、ＬＤＬ－ｃレベル、トリグリセリド（ＴＧ）レベル、ＨＤＬ－ｃレベル、および総コレステロール（Ｔ－Chol）レベルに対する複数のｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図1E】図１Ａ～図１Ｊは、非ヒト霊長類におけるＰＣＳＫ９レベル、ＬＤＬ－ｃレベル、トリグリセリド（ＴＧ）レベル、ＨＤＬ－ｃレベル、および総コレステロール（Ｔ－Chol）レベルに対する複数のｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図1F】図１Ａ～図１Ｊは、非ヒト霊長類におけるＰＣＳＫ９レベル、ＬＤＬ－ｃレベル、トリグリセリド（ＴＧ）レベル、ＨＤＬ－ｃレベル、および総コレステロール（Ｔ－Chol）レベルに対する複数のｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図1G】図１Ａ～図１Ｊは、非ヒト霊長類におけるＰＣＳＫ９レベル、ＬＤＬ－ｃレベル、トリグリセリド（ＴＧ）レベル、ＨＤＬ－ｃレベル、および総コレステロール（Ｔ－Chol）レベルに対する複数のｓｉＲＮＡの効果を示す。
【図1H】図１Ａ～図１Ｊは、非ヒト霊長類におけるＰＣＳＫ９レベル、ＬＤＬ－ｃレベル、トリグリセリド（ＴＧ）レベル、ＨＤＬ－ｃレベル、および総コレステロール（Ｔ－Chol）レベルに対する複数のｓｉＲＮＡの効果を示す。
【0025】
発明の詳細な説明
ＰＣＳＫ９は、不活性な分泌前駆体を生物活性タンパク質およびペプチドに切断するタンパク質転換酵素の群であるセリンプロテイナーゼの哺乳類ファミリーの９番目のメンバーである。ヒトＰＣＳＫ９遺伝子は、染色体１ｐ３２．３上に位置し、小胞体において８２ｋＤａチモーゲンに翻訳される（Ａｂｉｆａｄｅｌらによる、２００３，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３４，１５４～１５６頁；Ｐｉｐｅｒらによる、２００７，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １５，５４５～５５２頁を参照）。ＰＣＳＫ９は、主に肝細胞によって血流中に分泌され、血漿中に存在する。
ＰＣＳＫ９は、不活性な分泌前駆体を生物活性タンパク質およびペプチドに切断するタンパク質転換酵素の群であるセリンプロテイナーゼの哺乳類ファミリーの９番目のメンバーである。ヒトＰＣＳＫ９遺伝子は、染色体１ｐ３２．３上に位置し、小胞体において８２ｋＤａチモーゲンに翻訳される（Ａｂｉｆａｄｅｌらによる、２００３，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３４，１５４～１５６頁；Ｐｉｐｅｒらによる、２００７，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １５，５４５～５５２頁を参照）。ＰＣＳＫ９は、主に肝細胞によって血流中に分泌され、血漿中に存在する。
【0026】
ＰＣＳＫ９は、ＬＤＬ－コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）の分解およびその後の状態の高コレステロール血症に関与することが示されている（Ａｂｉｆａｄｅｌらによる２００３，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３４，１５４～１５６頁を参照）。高コレステロール血症は、高脂肪食、不活動の結果として生じ、特定の遺伝的危険因子と組み合わされる。高レベルのＬＤＬは、周知のリスク因子である。高コレステロール血症に関連する例示的な遺伝的危険因子には、血液中のＬＤＬのレベルに影響を及ぼすタンパク質をコードする遺伝子の突然変異が含まれる。例えば、ＰＣＳＫ９をコードする遺伝子における機能獲得型突然変異は、高コレステロール血症に関連する。ＰＣＳＫ９がＬＤＬＲに結合すると、ＬＤＬＲは分解を受け、その結果、血流からのＬＤＬ－Ｃの取り込みを減少させ、それによって高コレステロール血症をもたらす。したがって、ＰＣＳＫ９の阻害は、高コレステロール血症、特に家族性高コレステロール血症および他のコレステロール関連疾患を処置するための潜在的な治療戦略と見なされる。
【0027】
肝臓の他に、ＰＣＳＫ９は、小腸、腎臓、および脳で発現される。具体的には、ＰＣＳＫ９は神経炎症に関与している（Ａｐａｉｊａｉらによる、２０１９，Ｊ．Ａｍ．Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃ．８：ｅ０１０８３８を参照）。さらに、ＰＣＳＫ９はアルツハイマー病の病因と関連している。脳剖検は、対照と比較して後期発症ＡＤ患者の前頭皮質におけるＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの上昇を明らかにする（Ｐｉｃａｒｄらによる、２０１９，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １４：ｅ０２２０２５４を参照）。さらに、ＰＣＳＫ９はＡＵＤに関与し、ＡＵＤを有する患者のＣＳＦ中のＰＣＳＫ９レベルが対照と比較して有意に高いという観察結果を有する（Ｃｈｅｎらによる、２０１４，Ｌｉｐｉｄｓ ４９，４４５～４５５頁を参照）。さらに、虚血性脳卒中は、血漿ＬＤＬ－Ｃの増加を引き起こすＰＣＳＫ９遺伝子におけるいくつかの機能獲得型突然変異に関連する（Ｒｏｕｓｓｅｌｅｔらによる、２０１１，Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．５２，１３８３～１３９１頁を参照）。したがって、ＰＣＳＫ９を標的とする治療薬の開発は、上述の神経障害にとって有用であり得る。
【0028】
ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、表１、表２、および表３の核酸配列を含むポリ核酸分子、が本明細書に記載される。したがって、本明細書に記載のポリ核酸分子がハイブリダイズするヒトＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの様々な標的領域が本明細書に提供される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子の配列が本明細書に提供される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子の可能な修飾が本明細書に提供される。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子の可能なコンジュゲートが本明細書に提供される。
【0029】
対象におけるプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型セリンプロテアーゼ（ＰＣＳＫ９）遺伝子の発現を調節する方法が本明細書にさらに記載される。調節を必要とする対象におけるＬＤＬおよび／またはコレステロールを調節する方法が本明細書にさらに記載される。
【0030】
ポリ核酸分子
ポリ核酸分子の標的領域
ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子が本明細書に記載される。いくつかの態様では、ポリ核酸分子は、ｍＲＮＡの特定の領域にハイブリダイズする一本鎖核酸分子である。いくつかの態様では、ポリ核酸分子は二本鎖核酸分子である。いくつかの例では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖はＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの特定の領域にハイブリダイズする。
ポリ核酸分子の標的領域
ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子が本明細書に記載される。いくつかの態様では、ポリ核酸分子は、ｍＲＮＡの特定の領域にハイブリダイズする一本鎖核酸分子である。いくつかの態様では、ポリ核酸分子は二本鎖核酸分子である。いくつかの例では、ポリ核酸分子はセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖はＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの特定の領域にハイブリダイズする。
【0031】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ヒトＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの特定の領域にハイブリダイズする。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、非ヒトＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの特定の領域にハイブリダイズする。
【0032】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ヒトＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ領域にハイブリダイズする。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ヒトＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡのコード領域にハイブリダイズする。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ヒトＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域にハイブリダイズする。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ヒトＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの３’ＵＴＲのサブセット（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿１７４９３６．３）に、２３４２～２４４１、２４４２～２５４１、２５４２～２６４１、２６４２～２７４１、２７４２～２８４１、２８４２～２９４１、２９４２～３０４１、３０４２～３１４１、３１４２～３２４１、３２４２～３３４１、３３４２～３４４１、３４４２～３５４１、３５４２～３６４１、３６４２～３７３１の転写開始部位の範囲でハイブリダイズする。
【0033】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子がハイブリダイズする標的領域は、最大ＰＣＳＫ９サイレンシング有効性および可能な限り低いオフターゲット効果を予測するアルゴリズムによって決定される。いくつかの特定の実施形態では、アルゴリズムは、Ｈｅらによる、２０１７，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，７，４４８３６に開示されている。いくつかの特定の実施形態では、アルゴリズムは、Ｈａｎらによる、２０１８，ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９，６６９に開示されている。いくつかの特定の実施形態では、アルゴリズムは、ｓｉＲＮＡｒｕｌｅｓ、ｓｉＲＮＡ－Ｆｉｎｄｅｒ、ｓｉＲＮＡ Ｗｉｚａｒｄ、ｓｉＤｉｒｅｃｔ、ｓｉＲＮＡ Ｗｉｚａｒｄ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ｓｉＲＮＡ設計ツール、Ｗｈｉｔｅ ｈｅａｄ ｓｉＲＮＡ設計ツール、またはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ ｓｉＲＮＡソフトウェアである。
【0034】
単鎖核酸分子の構造
ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子が本明細書に記載され、ポリ核酸分子の一本鎖核酸分子は、上記ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に逆相補的である。
ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子が本明細書に記載され、ポリ核酸分子の一本鎖核酸分子は、上記ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に逆相補的である。
【0035】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に対して１００％相補的ではない。したがって、いくつかの例では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に対して約９５％相補的である。いくつかの具体的な態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に対して約９０％相補的である。いくつかの具体的な態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に対して約８５％相補的である。いくつかの具体的な態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に対して約８０％相補的である。いくつかの具体的な態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に対して約７５％相補的である。いくつかの具体的な態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に対して約７０％相補的である。
【0036】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、表１、表２、および表３の核酸配列を含む。他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、表１、表２、および表３の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。いくつかの例では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９から選択される配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相補的である。いくつかの例では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、配列番号１、３、５、７、および９から選択される配列に、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％相補的である。
【0037】
さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの１５個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の核酸配列に相補的な１５個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの１６個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の核酸配列に相補的な１６個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの１７個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の核酸配列に相補的な１７個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの１８個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の核酸配列に相補的な１８個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの１９個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の核酸配列に相補的な１９個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの２０個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の核酸配列に相補的な２０個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの２１個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の核酸配列に相補的な２１個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの２２個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の核酸配列に相補的な２２個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。
【0038】
特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の核酸配列に相補的な１５個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の核酸配列に相補的な１６個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の核酸配列に相補的な１７個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の核酸配列に相補的な１８個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の核酸配列に相補的な１９個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の核酸配列に相補的な２０個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の核酸配列に相補的な２１個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の核酸配列に相補的な２２個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。
【0039】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、約１５～３０、１６～３０、１７～３０、１８～３０、１８～２７、１８～２５、１８～２３、１９～２３、２０～２３、または２１～２３ヌクレオチド長を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、約１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド長を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、約２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチド長を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、約２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長を含む。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１９ヌクレオチド長を含む。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２１ヌクレオチド長を含む。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２３ヌクレオチド長を含む。
【0040】
二本鎖核酸分子
ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子が本明細書に記載され、ポリ核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であり、アンチセンス鎖は、上記ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に逆相補的である。
ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子が本明細書に記載され、ポリ核酸分子は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖分子であり、アンチセンス鎖は、上記ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に逆相補的である。
【0041】
いくつかの態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に対して１００％相補的である。いくつかの態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に対して１００％相補的でない。したがって、いくつかの例では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に対して約９５％相補的である。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に対して約９０％相補的である。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に対して約８５％相補的である。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に対して約８０％相補的である。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に対して約７５％相補的である。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、ＰＣＳＫ９ ｍＲＮＡの標的領域に対して約７０％相補的である。
【0042】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、表１、表２、および表３の核酸配列を含む。他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、表１、表２、および表３の配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である核酸配列を含む。いくつかの例では、本明細書に記載のセンス鎖は、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である。いくつかの例では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である。いくつかの例では、本明細書に記載のセンス鎖は、配列番号１、３、５、７、および９から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である。いくつかの例では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、および１０から選択される配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一である。
【0043】
さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの１４個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の１４個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３の１４個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの１５個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１、２、３、または４以下のミスマッチを有する、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の１５個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３の１５個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの１６個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の１６個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３の１６個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの１７個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の１７個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３の１７個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの１８個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の１８個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３の１８個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの１９個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の１９個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３の１９個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの２０個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の２０個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３の２０個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうち２１個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の２１個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３の２１個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。さらに他の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する表１、表２、および表３の配列のうちの２２個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９の２２個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３の２２個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。
【0044】
特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の１４個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、および１０の１４個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の１５個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、および１０の１５個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の１６個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、および１０の１６個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の１７個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、および１０の１７個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の１８個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、および１０の１８個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の１９個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、および１０の１９個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の２０個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、および１０の２０個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の２１個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、および１０の２１個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号１、３、５、７、および９の２２個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。特定の態様では、本明細書に記載のアンチセンス鎖は、１つ、２つ、または３つ以下のミスマッチを有する配列番号２、４、６、８、および１０の２２個の連続するヌクレオチドである核酸配列を含む。
【0045】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、約１５～３０、１６～３０、１７～３０、１８～３０、１８～２７、１８～２５、１８～２３、１９～２３、２０～２３、または２１～２３ヌクレオチド長のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、約１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド長のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、約２１、２２、２３、２４、２５ヌクレオチド長のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、約２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチド長のセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、１９ヌクレオチド長のセンス鎖および約２１ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含む。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、２１ヌクレオチド長のセンス鎖および約２３ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含む。
【0046】
いくつかの態様では、本明細書に記載のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、互いに逆相補的であり、かつアンチセンス鎖上に３’オーバーハングを有する二本鎖を形成する。いくつかの態様では、本明細書に記載のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、互いに逆相補的であり、かつアンチセンス鎖上の５’オーバーハングを有する二本鎖を形成する。いくつかの態様では、本明細書に記載のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、互いに逆相補的であり、かつセンス鎖上に３’オーバーハングを有する二本鎖を形成する。いくつかの態様では、本明細書に記載のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、互いに逆相補的であり、かつセンス鎖上に５’オーバーハングを有する二本鎖を形成する。
【0047】
ポリ核酸分子の修飾
いくつかの態様では、修飾を有する本明細書に記載のポリ核酸分子が本明細書に記載される。いくつかの態様では、本明細書に記載の修飾は、本明細書に記載のポリヌクレオチド酸分子の１つ以上の異なる構造（例えば、糖環、骨格、塩基の修飾）で生じる。いくつかの態様では、本明細書に記載の修飾は、本明細書に記載のポリ核酸分子における１つ以上のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子の異なるパーセンテージは、本明細書に記載の修飾を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子の異なる位置は、本明細書に記載の修飾を含む。ＷＯ／２０１８／０３５３８０は、参照によってその全体が本明細書に援用される。
いくつかの態様では、修飾を有する本明細書に記載のポリ核酸分子が本明細書に記載される。いくつかの態様では、本明細書に記載の修飾は、本明細書に記載のポリヌクレオチド酸分子の１つ以上の異なる構造（例えば、糖環、骨格、塩基の修飾）で生じる。いくつかの態様では、本明細書に記載の修飾は、本明細書に記載のポリ核酸分子における１つ以上のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子の異なるパーセンテージは、本明細書に記載の修飾を含む。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子の異なる位置は、本明細書に記載の修飾を含む。ＷＯ／２０１８／０３５３８０は、参照によってその全体が本明細書に援用される。
【0048】
修飾の種類
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド酸分子は、１つ以上の糖修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。いくつかの例では、糖修飾ヌクレオチドは、リボース部分の２’ヒドロキシル基に修飾を含む。いくつかの例では、糖修飾ヌクレオチドは、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮによる修飾を含み、ここで、Ｒはアルキル部分である。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドまたは２’－アルコキシ修飾ヌクレオチド（例えば、２’－メトキシ修飾ヌクレオチド）である。いくつかの例では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）を含む。いくつかの例では、アルキル部分はヘテロ置換を含む。いくつかの例では、複素環式基の炭素は、窒素、酸素、または硫黄によって置換される。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、２’－アミノ修飾ヌクレオチドである。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、２’－アジド修飾ヌクレオチドである。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、２’－デオキシ修飾ヌクレオチドである。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシチル（２’－ＭＯＥ）である。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドはロックド核酸（ＬＮＡ）である。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドはエチレン架橋核酸（ＥＮＡ）である。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、（Ｓ）拘束エチル（ｃＥｔ）である。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドはトリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）である。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、２’－ＮＨ２核酸である。
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド酸分子は、１つ以上の糖修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ修飾ヌクレオチドである。いくつかの例では、糖修飾ヌクレオチドは、リボース部分の２’ヒドロキシル基に修飾を含む。いくつかの例では、糖修飾ヌクレオチドは、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２、またはＣＮによる修飾を含み、ここで、Ｒはアルキル部分である。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドまたは２’－アルコキシ修飾ヌクレオチド（例えば、２’－メトキシ修飾ヌクレオチド）である。いくつかの例では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－デオキシ、２’－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、または２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）を含む。いくつかの例では、アルキル部分はヘテロ置換を含む。いくつかの例では、複素環式基の炭素は、窒素、酸素、または硫黄によって置換される。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、２’－アミノ修飾ヌクレオチドである。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、２’－アジド修飾ヌクレオチドである。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、２’－デオキシ修飾ヌクレオチドである。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メトキシチル（２’－ＭＯＥ）である。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドはロックド核酸（ＬＮＡ）である。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドはエチレン架橋核酸（ＥＮＡ）である。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、（Ｓ）拘束エチル（ｃＥｔ）である。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドはトリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）である。いくつかの態様では、糖修飾ヌクレオチドは、２’－ＮＨ２核酸である。
【0049】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド酸分子は、１つ以上の糖リン酸修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、修飾された糖リン酸は、ホスホロジアミデートモルホリノ（ＰＭＯ）である。いくつかの態様では、修飾された糖リン酸は、ホスホラミデートである。いくつかの例では、複素環置換は、イミダゾールおよびピロリジノを含む。いくつかの態様では、修飾された糖リン酸は、チオホスホルアミデートである。いくつかの態様では、修飾された糖リン酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
【0050】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド酸分子は、１つ以上の骨格修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの特定の態様では、修飾骨格はメチルホスホネートである。いくつかの特定の態様では、修飾骨格はホスホロチオエートである。いくつかの特定の態様では、修飾骨格はグアニジノプロピルホスホルアミダートである。いくつかの特定の態様では、修飾された骨格はメシル－ホスホルアミダート（ＭｓＰＡ）結合である。いくつかの例では、修飾された骨格は、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、５’－アルキレンホスホネート、５’－メチルホスホネート、３’－アルキレンホスホネート、ボロントリフルオロデート、３’－５’結合または２’－５’結合のボラノリン酸エステルおよびセレノリン酸エステル、ホスホトリエステル、チオノアルキルホスホトリエステル、水素ホスホネート結合、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、アリールホスホノチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロアミデートのうちの１つ以上を含む。
【0051】
いくつかの態様では、修飾ヌクレオチドは、修飾グアニン（例えば、イノシン）または任意の型の非天然核酸の１つ以上を含む。
【0052】
いくつかの特定の態様では、修飾された骨格はホスホロチオエートであり、ホスホロチオエートは立体化学的に富化されたホスホロチオエートである。ある特定の態様では、鎖は、少なくとも１つの立体化学的に富化されたホスホロチオエートを含有する。いくつかの態様では、鎖は、少なくとも１つ、２つ、３つの立体化学的に富化されたホスホロチオエートを含む。いくつかの態様では、鎖は、１つ、２つ、３つ、または４つの立体化学的に富化されたホスホロチオエートのみを含む。さらなる態様では、少なくとも１つ（例えば、１つまたは２つ）の立体化学的に富化されたホスホロチオエートが、鎖の６つの５’終端ヌクレオシドのうちの２つである２つの連続するヌクレオシド間に配置される。なおさらなる態様では、少なくとも１つ（例えば、１つまたは２つ）の立体化学的に富化されたホスホロチオエートは、鎖の６つの３’終端ヌクレオシドのうちの２つである２つの連続するヌクレオシド間に配置される。なおさらなる態様では、１つの立体化学的に富化されたホスホロチオエートは、鎖内の５’末端から第１のヌクレオシドおよび第２のヌクレオシドに共有結合される。いくつかの態様では、１つの立体化学的に富化されたホスホロチオエートは、鎖内の５’末端から２０個の第１のヌクレオシドおよび２０個の第２のヌクレオシドに共有結合される。ある特定の態様では、１つの立体化学的に富化されたホスホロチオエートは、鎖内の５’末端から２０個の第２のヌクレオシドおよび２０個の第３のヌクレオシドに共有結合される。特定の態様では、立体化学的に富化されたホスホロチオエートは、ＲＰ立体化学的同一性を含む。ある特定の態様では、立体化学的に富化されたホスホロチオエートは、ＳＰ立体化学的同一性を含む。
【0053】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子は、１つ以上の（例えば、１～２０、１～１０、または１～５の）立体化学的に富化された（例えば、ヌクレオシド間）ホスホロチオエート（例えば、Ｐ－ステレオジェン中心（Ｐ－ｓｔｅｒｅｏｇｅｎｉｃ ｃｅｎｔｅｒ）について、少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％、例えば、最大約９９％のジアステレオマー過剰率を有する）を含む。本明細書に記載のポリヌクレオチド分子は、１つ以上の（例えば、１～２０、１～１０、または１～５の、例えば、ヌクレオシド間結合）ホスホロジチオエートを含む。ホスホロジチオエートは、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子において非Ｐ－ステレオジェニック（ｎｏｎ－Ｐ－ｓｔｅｒｅｏｇｅｎｉｃ）であり得る。ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエートは、血清のエキソヌクレアーゼ活性に対する本明細書に記載のポリヌクレオチド分子の安定性を増強し得る。非Ｐ－ステレオジェニックホスホロジチオエートは、可能なジアステレオマーの数を減少させることによって、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子の合成を単純化し得る。典型的には、ホスホロチオエートまたはホスホロジチオエートは、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子の６つの３’終端ヌクレオシドおよび６つの５’終端ヌクレオシド内の２つの連続するヌクレオシドを接続し得る。いくつかの態様では、立体化学的に富化されたホスホロチオエート（例えば、ＲＰ富化ホスホロチオエート）は、アンチセンス鎖の５’末端から第１のヌクレオシド（例えば、第１のヌクレオシドの３’炭素原子）および第２のヌクレオシド（例えば、第２のヌクレオシドの５’－炭素原子）に共有結合され得る。さらにまたはあるいは、立体化学的に富化されたホスホロチオエート（例えば、ＳＰ富化されたホスホロチオエート）は、アンチセンス鎖の５’末端から２１番目のヌクレオシド（例えば、２１番目のヌクレオシドの３’炭素原子）および２２番目のヌクレオシド（例えば、第２２ヌクレオシドの５’炭素原子）に共有結合され得る。さらに、付加的または代替的に、立体化学的に富化されたホスホロチオエート（例えばＳＰ富化ホスホロチオエート）は、アンチセンス鎖の５’末端から２２番目のヌクレオシド（例えば、第２２ヌクレオシドの３’炭素原子）および２３番目のヌクレオシド（例えば、２３番目のヌクレオシドの５’炭素原子）に共有結合され得る。５’末端からの第１のヌクレオシド（例えば、第１のヌクレオシドの３’－炭素原子）および第２のヌクレオシド（例えば、第２のヌクレオシドの５’－炭素原子）に共有結合した５’ＲＰ－富化したホスホロチオエート（例えば、ＲＰ富化ホスホロチオエート）と３’ＳＰ－富化したホスホロチオエート（例えば、ＳＰ－）との組合せアンチセンス鎖の５’末端から２１番目のヌクレオシド（例えば、２１番目のヌクレオシドの３’炭素原子）および２２番目のヌクレオシド（例えば、２２番目のヌクレオシドの５’炭素原子）に共有結合した富化ホスホロチオエートは、優れた有効性および／または作用持続時間をもたらすことができる。例えば、５’ＲＰ富化ホスホロチオエートおよび３’ＳＰ富化ホスホロチオエートの組合せを欠く参照ガイド鎖に対する標的の活性の低下によって測定される。
【0054】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子は、１つ以上のプリン修飾を含む。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のプリン修飾は２，６－ジアミノプリンである。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のプリン修飾は３－デアザ－アデニンである。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のプリン修飾は７－デアザ－グアニンである。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のプリン修飾は８－アジド－アデニンである。
【0055】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子は、１つ以上のピリミジン修飾を含む。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のピリミジン修飾は、２－チオ－チミジンである。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のピリミジン修飾は、５－カルボキサミド－ウラシルである。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のピリミジン修飾は、５－メチル－シトシンである。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載のピリミジン修飾は、５－エチニルウラシルである。
【0056】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、脱塩基置換を含む。ハイブリダイズされたポリヌクレオチド構築物がｓｉＲＮＡとしての使用を企図する場合、ｍｉＲＮＡ様オフターゲット効果の低減が望ましい。脱塩基置換は、塩基対合相互作用に関与し、立体障害を軽減することができる核酸塩基を欠くので、ハイブリダイズされたポリヌクレオチド構築物に１つ以上（例えば、１つまたは２つ）の脱塩基置換を含めることは、ｍｉＲＮＡ様オフターゲット効果を低減またはさらには排除し得る。したがって、本明細書に開示されるポリヌクレオチド分子は、１つ以上（例えば、１つまたは２つ）の脱塩基置換を含み得る。特定の態様では、脱塩基置換は、本明細書に記載のアンチセンス鎖の５’末端から５番目のヌクレオチドにある。特定の態様では、脱塩基置換は、本明細書に記載のアンチセンス鎖の５’末端から７番目のヌクレオチドにある。
【0057】
本明細書に開示されるポリヌクレオチド分子が２つ以上の脱塩基置換を含む場合、それらの構造は同じであっても異なっていてもよい。ある態様では、センス鎖は、１つの脱塩基置換（例えば、アンチセンス鎖は、脱塩基置換を含まなくてもよい）を含有する。他の態様では、アンチセンス鎖は、１つの脱塩基置換（例えば、センス鎖は、脱塩基置換を含まなくてもよい）を含有する。さらに他の態様では、アンチセンス鎖は１つの脱塩基置換を含有し、センス鎖は１つの脱塩基置換を含有する。さらなる態様では、センス鎖は、ヌクレオシド数（ｘ）とヌクレオシド数（ｘ＋１）との間の脱塩基置換を含み、ここでｘは２～７の整数である。なおさらなる態様では、アンチセンス鎖は、ヌクレオシド数（ｘ）とヌクレオシド数（ｘ＋１）との間の脱塩基置換を含み、ここでｘは２～７の整数である。
【0058】
脱塩基置換は、式（ＩＩＩ）
【0059】
【化3】
式中、
Ｌは、糖アナログ（ｓｕｇａｒ ａｎａｌｏｇｕｅ）であるか、Ａ、Ｕ、Ｃ、Ｇからのヘテロアシルで置換されているか、任意の他の置換された核酸（例えば、ロックドまたはアンロックド核酸、グリコール核酸など）であり、
各Ｘ４は独立して、ＯまたはＳであり、
各Ｘ５は独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、または結合であり、
各Ｒ９は独立して、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１－６アルキル、任意選択で置換されたＣ２－６アルケニル、任意選択で置換されたＣ２－６アルキニル、任意選択で置換された（Ｃ１－９ヘテロシクリル）－Ｃ１－６－アルキル、任意選択で置換された（Ｃ６－１０アリール）－Ｃ１－６－アルキル、任意選択で置換された（Ｃ３－８シクロアルキル）－Ｃ１－６－アルキル、-ＬｉｎｋＡ（-Ｔ）ｐ、または共役部分（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｍｏｉｅｔｙ）であり、
各ＬｉｎｋＡは独立して、多価リンカー（例えば、-Ｃ（Ｏ）-Ｎ（Ｈ）-を含む）であり、
各Ｔは独立して、補助部分であり、
Ｒ１０は、鎖中のヌクレオシド（ｘ）の３’－炭素原子への結合であり、
Ｒ１１は、鎖中のヌクレオシド（ｘ＋１）の５’－酸素原子への結合であり、
Ｐは、１～６の整数であり、および
Ｔは、１～６の整数である。
【0060】
いくつかの態様では、本明細書に記載の脱塩基置換は、本明細書に記載のポリ核酸分子のアンチセンス鎖に結合される。特定の態様では、脱塩基置換（例えば、ｔが１である式（ＩＩＩ）のヌクレオチド間脱塩基スペーサー）は、本明細書に記載のアンチセンス鎖（例えば、ガイド鎖のシード領域内である）に含まれ得る。いくつかの態様では、脱塩基置換（例えば、ｔが１である式（ＩＩＩ）のヌクレオチド間脱塩基スペーサー）は、本明細書に記載されるアンチセンス鎖の５’末端から２番目、３番目、４番目、または５番目のヌクレオシドの３’炭素原子に結合され得る。特定の態様では、脱塩基置換（例えば、ｔが１である式（ＩＩＩ）のヌクレオチド間脱塩基スペーサー）は、本明細書に記載のアンチセンス鎖の５’末端から１３番目、１４番目、１５番目、または１６番目のヌクレオシドの３’炭素原子に結合され得る。いくつかの態様では、脱塩基置換は、本明細書に記載のアンチセンス鎖の５’末端からの第４、第５、第６、第７、第８、および／または第９のヌクレオシドである。
【0061】
本明細書に記載のポリヌクレオチド分子は、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシド（例えば、イノシン）を含むシード領域を含む鎖を含有し得る。
【0062】
特定の態様では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖の５’末端から２番目のヌクレオシドである。さらなる態様では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖の５’末端から３番目のヌクレオシドである。なおさらなる態様では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖の５’末端から４番目のヌクレオシドである。なおさらなる態様では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖の５’末端から５番目のヌクレオシドである。特定の態様では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖中の第６のヌクレオシドである。特定の態様では、ヒポキサンチン核酸塩基含有ヌクレオシドは、鎖中の第７のヌクレオシドである。
【0063】
修飾の量および位置
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子は、上記の１つ以上の型の修飾を含む。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約１０％は、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約２０％が、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約３０％は、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約４０％が、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約５０％は、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約６０％は、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約７０％は、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約８０％が、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約９０％は、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの１００％が、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子は、上記の１つ以上の型の修飾を含む。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約１０％は、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約２０％が、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約３０％は、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約４０％が、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約５０％は、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約６０％は、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約７０％は、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約８０％が、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの約９０％は、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。他の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子由来のヌクレオチドの１００％が、上記の１つ以上の型の修飾で修飾される。
【0064】
いくつかの態様では、本明細書に記載の１つ以上の型の修飾は、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子内の異なる位置で生じる。特定の態様では、本明細書に記載の１つ以上の型の修飾は、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子内のシード領域で生じる。特定の態様では、本明細書に記載の１つ以上の型の修飾は、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子の３’終端で生じる。特定の態様では、本明細書に記載の１つ以上の型の修飾は、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子の５’終端で生じる。特定の態様では、本明細書に記載の１つ以上の型の修飾は、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子内に分散して生じる。特定の態様では、本明細書に記載の１つ以上の型の修飾は、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子内のクラスターで生じる。
【0065】
特定の修飾パターン
いくつかの態様では、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子であるポリ核酸分子の特異的修飾パターンが本明細書に記載され、センス鎖は約１２個の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドおよび約９個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は約９個の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドおよび約１４個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの態様では、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖核酸分子であるポリ核酸分子の特異的修飾パターンが本明細書に記載され、センス鎖は約１２個の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドおよび約９個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖は約９個の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドおよび約１４個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。
【0066】
いくつかの態様では、センス鎖が完全に修飾され、１２個の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、９個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が完全に修飾され、９個の２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、および１４個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0067】
いくつかの態様では、センス鎖が‘５－ＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆ－３’を含み、アンチセンス鎖が‘５－ｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｎｎ－３’を含み、ここで、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味する、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0068】
いくつかの態様では、センス鎖が‘５－ＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎ－３’を含み、アンチセンス鎖が‘５－ＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｎｎ－３’を含み、センス鎖および／またはアンチセンス鎖が１つ以上のホスホロチオエート結合を含み、ここで、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味する、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。他の態様では、センス鎖が‘５－ＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎ－３’を含み、アンチセンス鎖が‘５－ＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎＮｆｎ－３’を含み、センス鎖が２つのホスホロチオエート結合を含み、アンチセンスが４つのホスホロチオエート結合を含み、ここで、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味する、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0069】
いくつかの態様では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖が表４のＩ型として修飾されている特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0070】
【表1】
【0071】
いくつかの態様では、本明細書に提供されるポリヌクレオチド分子は、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９のうちの１つからのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３のうちの１つを含む。他の態様では、本明細書に提供されるポリヌクレオチド分子は、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９のうちの１つからのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３のうちの１つを含み、センスおよび／またはアンチセンス鎖は、表４に指定されるＩ型修飾パターンで修飾される。いくつかの態様では、本明細書に提供されるポリヌクレオチド分子は、配列番号１、３、５、７、および９のうちの１つからのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、および１０のうちの１つを含む。他の態様では、本明細書に提供されるポリヌクレオチド分子は、配列番号１、３、５、７、および９のうちの１つからのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、および１０のうちの１つを含み、センスおよび／またはアンチセンス鎖は、表４に指定されるＩ型修飾パターンで修飾される。
【0072】
いくつかの態様では、センス鎖が約４個の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドおよび約１７個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が約６個の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドおよび約１７個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0073】
いくつかの態様では、センス鎖が４つの２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、１７個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、他のヌクレオチドを含まず、アンチセンス鎖が６つの２’－フルオロ修飾ヌクレオチドおよび１７個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、他のヌクレオチドを含まない、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0074】
いくつかの態様では、センス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、アンチセンス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味する、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0075】
いくつかの態様では、センス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆＮｆｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、アンチセンス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、センスおよび／またはアンチセンス鎖が１つ以上のホスホロチオエート結合を含み、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味する、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。他の態様では、センス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、アンチセンス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、センスが２つのホスホロチオエート結合を含み、アンチセンスが４つのホスホロチオエート結合を含み、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味する、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0076】
いくつかの態様では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖が表４のＩＩ型として修飾されている特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0077】
いくつかの態様では、本明細書に提供されるポリヌクレオチド分子は、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９のうちの１つを含むセンス鎖、ならびに／または配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３のうちの１つを含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、表４に指定されるＩＩ型修飾パターンで修飾される。他の態様では、本明細書に提供されるポリヌクレオチド分子は、配列番号１、３、５、７、および９のうちの１つを含むセンス鎖、ならびに／または配列番号２、４、６、８、および１０のうちの１つを含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、表４に指定されるＩＩ型修飾パターンで修飾される。
【0078】
いくつかの態様では、センス鎖が約２個の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドおよび約１９個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が約３個の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドおよび約２０個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0079】
いくつかの態様では、センス鎖が２つの２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、１９個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、他のヌクレオチドを含まず、アンチセンス鎖が３つの２’－フルオロ修飾ヌクレオチドおよび２０個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、他のヌクレオチドを含まない、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0080】
いくつかの態様では、センス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、アンチセンス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味する、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0081】
いくつかの態様では、センス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、アンチセンス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、センス鎖および／またはアンチセンス鎖が１つ以上のホスホロチオエート結合を含み、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味する、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。他の態様では、センス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、アンチセンス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、センスが２つのホスホロチオエート結合を含み、アンチセンスが４つのホスホロチオエート結合を含み、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味する、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0082】
いくつかの態様では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖が表４のＩＩＩ型として修飾されている特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0083】
いくつかの態様では、本明細書に提供されるポリヌクレオチド分子は、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９のうちの１つからのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３のうちの１つを含み、センスおよび／またはアンチセンス鎖は、表４に指定されるＩＩＩ型修飾パターンで修飾される。他の態様では、本明細書に提供されるポリヌクレオチド分子は、配列番号１、３、５、７、および９のうちの１つからのセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、配列番号２、４、６、８、および１０のうちの１つを含み、センスおよび／またはアンチセンス鎖は、表４に指定されるＩＩＩ型修飾パターンで修飾される。
【0084】
いくつかの態様では、センス鎖が約３個の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドおよび約１８個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、アンチセンス鎖が約４個の２’－フルオロ修飾ヌクレオチドおよび約１９個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0085】
いくつかの態様では、センス鎖が３つの２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、１８個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、他のヌクレオチドを含まず、アンチセンス鎖が４つの２’－フルオロ修飾ヌクレオチドおよび１９個の２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含み、他のヌクレオチドを含まない、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0086】
いくつかの態様では、センス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、アンチセンス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを表し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを表す、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0087】
いくつかの態様では、センス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、アンチセンス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、センスおよび／またはアンチセンス鎖が１つ以上のホスホロチオエート結合を含み、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味する、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。他の態様では、センス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎＮｆｎＮｆｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、アンチセンス鎖が‘５－ｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎｎ－３’を含み、センス鎖が２つのホスホロチオエート結合を含み、アンチセンス鎖が４つのホスホロチオエート結合を含み、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味する、特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0088】
いくつかの態様では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖が表４のＩＶ型として修飾されている特異的修飾パターンが本明細書に記載される。
【0089】
いくつかの態様では、本明細書に提供されるポリヌクレオチド分子は、配列番号１、３、５、７、９、２５～１２７、および４３７～５３９のうちの１つを含むセンス鎖、ならびに／または配列番号２、４、６、８、１０、および２３１～３３３のうちの１つを含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、表４において特定されるＩＶ型修飾パターンで修飾される。他の態様では、本明細書に提供されるポリヌクレオチド分子は、配列番号１、３、５、７、および９のうちの１つを含むセンス鎖、ならびに／または配列番号２、４、６、８、および１０のうちの１つを含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、表４に指定されるＩＶ型修飾パターンで修飾される。
【0090】
ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子であって、ｕｓＵｆｓａｃａａａａｇｃａＡｆａＡｆｃＡｆｇｇｕｕｓａｓｇ（配列番号１４）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、ａｓｇｓａｃｃｕＧｆｕＵｆｕＵｆｇｃｕｕｕｕｕａａ（配列番号１３）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖とを含み、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味し、および「ｓ」は、３’－ホスホロチオエートを意味する、ポリ核酸分子。
【0091】
ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子であって、ｕｓＵｆｓｕｃａａｇｕｕａｃＡｆａＡｆａＧｆｃａａａａｓｃｓａ（配列番号１６）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、ｕｓｕｓｕｕｇｃＵｆｕＵｆｕＧｆｕａａｃｕｕｇａａａ（配列番号１５）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖とを含み、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味し、および「ｓ」は、３’－ホスホロチオエートを意味する、ポリ核酸分子。
【0092】
ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子であって、ａｓＡｆｓｕａｕｃｕｕｃａａＧｆｕＵｆａＣｆａａａａａｇｓｃｓａ（配列番号１８）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、ｃｓｕｕｕｕｇＵｆａＡｆｃＵｆｕｇａａｇａｕａｕｕ（配列番号１７）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖とを含み、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味し、および「ｓ」が３’－ホスホロチオエートを意味する。
【0093】
ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子であって、ａｓＵｆｓｕａａｕａａａａａＵｆｇＣｆｕＡｆｕＡｆｕａａａａａｓｃｓｃ（配列番号２０）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、ｕｓｕｓｕｕｕｕＡｆｇＣｆａＵｆｕｕｕｕａｕｕａａｕ（配列番号１９）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖とを含み、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味し、および「ｓ」が３’－ホスホロチオエートを意味する、ポリ核酸分子。
【0094】
ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節するためのポリ核酸分子であって、ａｓＵｆｓａｕｕａａｕａａａａａａａｆａＵｆｇＣｆｕａｃａａｓａ（配列番号２２）のヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖と、ｕｓｕｓｇｕａｇＣｆａＵｆｕＵｆｕｕａｕｕａｕａｕａｕ（配列番号２１）のヌクレオチド配列を含むセンス鎖とを含み、「Ｎｆ」が２’－フルオロ修飾ヌクレオチドを意味し、「ｎ」が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを意味し、および「ｓ」が３’－ホスホロチオエートを意味する、ポリ核酸分子。
【0095】
コンジュゲーション
結合部分
ある特定の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子は、１つ以上の標的化部分とカップリングまたはコンジュゲートされて、ポリヌクレオチド－標的化部分コンジュゲート分子を形成する。いくつかの例では、標的化部分は、本明細書に記載のコンジュゲート分子を所望の細胞集団、組織、または器官に選択的にまたは好ましくは標的化するその能力に基づいて選択される。いくつかの例では、標的化部分は、標的化部分の対応する結合パートナー（例えば、対応する受容体またはリガンドのいずれかである）を発現する細胞、組織、または器官を標的化する。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子は、標的化部分としてＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含有する標的化部分を選択することによって、アシアロ糖タンパク質（ＡＳＧＰ－Ｒ）を発現する肝細胞に標的化され得る。細胞内の所望の部位（例えば、小胞体、ゴルジ体、核、またはミトコンドリア）を標的とする標的化部分（すなわち、細胞内標的化部分）は、本明細書に開示されるハイブリダイズされたポリヌクレオチド構築物に含まれ得る。細胞内標的化部分の非限定的な例は、ＷＯ２０１５／０６９９３２およびＷＯ２０１５／１８８１９７で提供され、ＷＯ２０１５／０６９９３２およびＷＯ２０１５／１８８１９７における細胞内標的化部分の開示は、参照によって本明細書に援用される。
結合部分
ある特定の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子は、１つ以上の標的化部分とカップリングまたはコンジュゲートされて、ポリヌクレオチド－標的化部分コンジュゲート分子を形成する。いくつかの例では、標的化部分は、本明細書に記載のコンジュゲート分子を所望の細胞集団、組織、または器官に選択的にまたは好ましくは標的化するその能力に基づいて選択される。いくつかの例では、標的化部分は、標的化部分の対応する結合パートナー（例えば、対応する受容体またはリガンドのいずれかである）を発現する細胞、組織、または器官を標的化する。例えば、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子は、標的化部分としてＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含有する標的化部分を選択することによって、アシアロ糖タンパク質（ＡＳＧＰ－Ｒ）を発現する肝細胞に標的化され得る。細胞内の所望の部位（例えば、小胞体、ゴルジ体、核、またはミトコンドリア）を標的とする標的化部分（すなわち、細胞内標的化部分）は、本明細書に開示されるハイブリダイズされたポリヌクレオチド構築物に含まれ得る。細胞内標的化部分の非限定的な例は、ＷＯ２０１５／０６９９３２およびＷＯ２０１５／１８８１９７で提供され、ＷＯ２０１５／０６９９３２およびＷＯ２０１５／１８８１９７における細胞内標的化部分の開示は、参照によって本明細書に援用される。
【0096】
したがって、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子は、細胞内標的化部分、細胞外標的化部分、およびこれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の標的化部分を含み得る。したがって、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子における１つ以上の標的化部分（例えば、葉酸、マンノース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、および前立腺特異的膜抗原からなる群から独立して選択される標的化部分を含む細胞外標的化部分）および１つ以上の細胞内標的化部分（例えば、小胞体、ゴルジ体、核、またはミトコンドリアを標的とする部分）の包含は、特定の細胞集団内の特定の部位へのポリヌクレオチドの送達を促進することができる。いくつかの態様では、標的化部分は、１つ以上のマンノース炭水化物を含有する。マンノースはマンノース受容体を標的とし、これは、類洞肝細胞および抗原提示細胞（例えば、マクロファージおよび樹状細胞）上で発現される１７５ＫＤａの膜関連受容体である。これは、マンノシル化病原体およびタンパク質に結合し、内部移行する非常に有効なエンドサイトーシス／リサイクリング受容体である（Ｌｅｎｎａｒｔｚらによる、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：９９４２－９９４４，１９８７ １；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２１５６－６２，１９９０）。
【0097】
標的化部分のいくつかが本明細書に記載されている。いくつかの態様では、標的化部分は、インスリン、インスリン様成長因子受容体１（ＩＧＦ１Ｒ）、ＩＧＦ２Ｒ、インスリン様成長因子（ＩＧＦ、例えば、ＩＧＦ１またはＩＧＦ２）、間葉系上皮移行因子受容体（ｃ－ｍｅｔ、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）としても知られている）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘレグリン、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、ＴＮＦ－β、葉酸受容体（ＦＯＬＲ）、葉酸、トランスフェリン、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、メソテリン、Ｆｃ受容体、ｃ－ｋｉｔ受容体、ｃ－ｋｉｔ、インテグリン（例えば、α４インテグリンまたはβ－１インテグリン）、Ｐ－セレクチン、スフィンゴシン－１－ホスフェート受容体－１（Ｓ１ＰＲ）、ヒアルロン酸受容体、白血球機能抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１８、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８５、ＣＤ９５（Ｆａｓ受容体）、ＣＤ１０６（血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１））、ＣＤ１６６（活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ））、ＣＤ１７８（Ｆａｓリガンド）、ＣＤ２５３（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ））、ＩＣＯＳリガンド、ＣＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＸＣＬ１２（間質細胞由来因子１（ＳＤＦ－１））、インターロイキン１（ＩＬ－１）、ＩＬ－１ｒａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＣＴＬＡ－４、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ－１、エフリン（Ｅｐｈ）受容体、粘膜アドレッシング細胞接着分子１（ＭＡｄＣＡＭ－１）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＬｅｗｉｓＹ、ＭＵＣ－１、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＴＡＧ－７２抗原、およびそのフラグメントを含む群から選択されるタンパク質を含むか、またはそれに特異的に結合する。さらなる態様では、標的化部分は、赤芽球性白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＥｒｂＢ）受容体（例えば、ＥｒｂＢ１受容体、ＥｒｂＢ２受容体、ＥｒｂＢ３受容体、およびＥｒｂＢ４受容体）を含む。いくつかの態様では、標的化部分は、１つ以上（例えば、１つ～６つ）のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含有する。ある特定の態様では、標的化部分は、１つ以上（例えば、１つ～６つ）のマンノースを含有する。他の態様では、標的化部分は葉酸リガンドを含有する。葉酸配位子は、以下の構造を有する。
【0098】
【化4】
【0099】
本明細書に記載のポリヌクレオチド分子における標的化補助部分として使用するための他のペプチドは、ＫｉＳＳペプチドおよび類似体、ウロテンシンＩＩペプチドおよび類似体、ＧｎＲＨ ＩおよびＩＩペプチドおよび類似体、デプレオチド、バプレオチド、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ＲＧＤ含有ペプチド、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）ペプチド、ニューロテンシン、カルシトニン、グルタチオン、ＹＩＧＳＲ（血小板因子－４のヘパリン結合領域（ＰＦ－４）およびリジンリッチ配列を含有する白血球反応性ペプチド、例えば、Ｐ４８３Ｈ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、β－アミロイドペプチド、δ－オピオイドアンタゴニスト（ＩＴＩＰＰ（ｐｓｉ）など）、アネキシン－Ｖ、エンドセリン、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、走化性ペプチド（例えば、Ｎ－ホルミル－メチオニル－ロイシル－フェニルアラニン－リシン（ｆＭＬＦＫ））、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アンタゴニスト（例えば、ＤＭＰ４４４）、ヒト好中球エラスターゼ阻害剤（ＥＰＩ－ＨＮＥ－２およびＥＰＩ－ＨＮＥ－４）、プラスミン阻害剤、抗微生物ペプチド、アプタイド（Ｐ２８０およびＰ２７４）、トロンボスポンジン受容体（ＴＰ－１３００などの類似体を含む）、ビチスタチン、下垂体アデニリルシクラーゼＩ型受容体（ＰＡＣ１）、フィブリンα鎖、ファージディスプレイライブラリー由来のペプチド、ならびにその保存的置換から選択可能である。
【0100】
１つ以上（例えば、１つ～６つ）の標的化部分は、－ＬｉｎｋＡ－を介して、式（Ｖ’、Ｖ’’、またはＶ’’’）中のＭＯＩＥＴＹまたはＸ２に連結され得る。
【0101】
いくつかの態様では、標的化部分は、１つ以上（例えば、１つ～６つまたは１つ～３つ）のアシアロ糖タンパク質受容体リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ）を含む。いくつかの態様では、アシアロ糖タンパク質受容体リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ）リガンドは、アノマー炭素（例えば、ここで、アノマー炭素は、アセタールまたはヘミアミナール中の炭素原子である）を介して－ＬｉｎｋＡ－に結合される。いくつかの態様では、アシアロ糖タンパク質受容体リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ）は、３価、４価、５価、または６価のリンカーに結合したアノマー炭素を含み、アノマー炭素はヘミアミナール基の一部である。ヘミアミナールを介してリンカーに結合されるアシアロ糖タンパク質受容体リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ）は、アセタールを介してリンカーに結合されるアシアロ糖タンパク質受容体リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ）を有するハイブリダイズされたポリヌクレオチド構築物と比較して、遺伝子サイレンシングにおいて優れた有効性を有するハイブリダイズされたポリヌクレオチド構築物を生成し得る。
【0102】
いくつかの態様では、リンカーおよび３つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分（それぞれＧａｌＮＡｃを含む）は、式（Ｖ）に示される通りである。場合によっては、本明細書に記載のコンジュゲートは、１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分のみを含み、したがって、コンジュゲートは、任意の２つの標的化部分が除去された式（Ｖ）の構造を含む。場合によっては、本明細書に記載のコンジュゲートは、２つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分のみを含み、したがって、本明細書に記載のコンジュゲートは、標的化部分のいずれか１つが除去された式（Ｖ）の構造を含む。
【0103】
【化5】
【0104】
いくつかの態様では、本明細書に記載のリンカーおよび標的化部分は、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる（例えば、式（Ｖ’））。いくつかの態様では、本明細書に記載のリンカーおよび標的化部分は、センス鎖の５’末端にコンジュゲートされる（例えば、式（Ｖ’’）または（Ｖ’’’）に示す通り）。いくつかの態様では、本明細書に記載のリンカーおよび標的化部分は、アンチセンス鎖（例えば、式（Ｖ’））の３’末端にコンジュゲートされる。いくつかの態様では、本明細書に記載のリンカーおよび標的化部分は、アンチセンス鎖の５’末端にコンジュゲートされる（例えば、式（Ｖ’’）または（Ｖ’’’）に示す通り）。
【0105】
【化6】
式（Ｖ’）中のＺは、本明細書に記載の糖修飾の１つ（例えば、－Ｈ、－ＯＨ、－Ｏ－メチル、－Ｆ、または－Ｏ－メトキシエチル）に対応し、式（Ｖ’）中のＲは、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、チミン、脱塩基、またはその他である。
【0106】
【化7】
式（Ｖ’’）中のＺは、本明細書に記載の糖修飾の１つ（例えば、－Ｈ、－ＯＨ、－Ｏ－メチル、－Ｆ、または－Ｏ－メトキシエチル）に対応する部分であり、式（Ｖ’’）中のＲは、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、チミン、脱塩基、またはその他である。
【0107】
【化8】
式（Ｖ’’’）中のＺは、本明細書に記載の糖修飾の１つ（例えば、－Ｈ、－ＯＨ、－Ｏ－メチル、－Ｆ、または－Ｏ－メトキシエチルである）に対応する部分であり、式（Ｖ’’’）中のＲは、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、チミン、脱塩基、またはその他である。
【0108】
いくつかの例では、表１、表２、または表３からのパッセンジャー／センス鎖の３’末端は、Ｘ２－ＧａｌＮＡｃとコンジュゲートされる（式（Ｖ）または（Ｖ’）を参照）。いくつかの例では、表１、表２、または表３からのパッセンジャー／センス鎖の５’末端は、Ｘ２－ＧａｌＮＡｃとコンジュゲートされる（式（Ｖ）、（Ｖ’’）、または（Ｖ’’’）を参照）。いくつかの例では、表１、表２、または表３のパッセンジャー／センス鎖（５’末端または３’末端ではない）内の核酸は、Ｘ２－ＧａｌＮＡｃとコンジュゲートされる（式（Ｖ）を参照）。いくつかの例では、表１、表２、または表３からのガイド／アンチセンス鎖の３’末端は、Ｘ２－ＧａｌＮＡｃとコンジュゲートされる（式（Ｖ）または（Ｖ’）を参照）。いくつかの例では、表１、表２、または表３からのガイド／アンチセンス鎖の５’末端は、Ｘ２－ＧａｌＮＡｃとコンジュゲートされる（式（Ｖ）、（Ｖ’’）、または（Ｖ’’’）を参照）。いくつかの例では、表１、表２、または表３のガイド／アンチセンス鎖（５’末端または３’末端ではない）内の核酸は、Ｘ２－ＧａｌＮＡｃとコンジュゲートされる（式（Ｖ）を参照）。
【0109】
１つ以上（例えば、１つ～６つまたは１つ～３つ）のエンドソームエスケープ部分は、補助部分として本明細書に開示されるポリヌクレオチド構築物またはハイブリダイズされたポリヌクレオチド構築物に結合され得る。例示的なエンドソームエスケープ部分としては、化学療法剤（例えば、クロロキンなどのキノロン）；融合性脂質（例えば、ジオレオイルホスファチジル－エタノールアミン（ＤＯＰＥ））；およびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などのポリマー；ポリ（β－アミノエステル）；ポリアルギニン（例えば、オクタアルギニン）およびポリリジン（例えば、オクタリシン）などのポリペプチド；プロトンスポンジ、ウイルスカプシド、および本明細書に記載されるペプチド形質導入ドメインなどが挙げられる。例えば、融合ペプチドは、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ２タンパク質；インフルエンザウイルス血球凝集素のペプチド類似体；Ｃ型インフルエンザウイルスのＨＥＦタンパク質；フィロウイルスの膜貫通糖タンパク質；狂犬病ウイルスの膜貫通糖タンパク質；水疱性口内炎ウイルスの膜貫通糖タンパク質（Ｇ）；センダイウイルスの融合タンパク質； Ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓｔウイルスの膜貫通糖タンパク質；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質；麻疹ウイルスの融合タンパク質； ニューカッスル病ウイルスの融合タンパク質；ビスナウイルスの融合タンパク質；マウス白血病ウイルスの融合タンパク質；ＨＴＬウイルスの融合タンパク質；およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）の融合タンパク質などに由来してもよい。エンドソーム脱出を促進するために用いることができる他の部分は、Ｄｏｍｉｎｓｋａらによる、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２３（８）：１１８３～１１８９頁，２０１０に記載されている。本明細書に開示されるハイブリダイズされたポリヌクレオチド構築物へのコンジュゲーションに適した部分を含むエンドソームエスケープ部分の特定の例は、例えば、ＷＯ２０１５／１８８１９７において提供され、これらのエンドソームエスケープ部分の開示は、参照によって本明細書に援用される。
【0110】
１つ以上のエンドソームエスケープ部分（例えば、１つ～６つまたは１つ～３つ）は、本明細書に記載されるように、－ＬｉｎｋＡ－を介して、式（Ｖ’、Ｖ’’、またはＶ’’’）中のＭＯＩＥＴＹまたはＸ２に結合され得る。
【0111】
１つ以上（例えば、１つ～６つまたは１つ～３つ）の細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、補助部分として本明細書に開示されるポリヌクレオチド構築物またはハイブリダイズされたポリヌクレオチド構築物に結合され得る。ＣＰＰは、本明細書に開示されるように、ジスルフィド結合を介してハイブリダイズされたポリヌクレオチドに生物可逆的に連結されることができる。したがって、細胞に送達されると、ＣＰＰは、例えば細胞内酵素（例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、チオレドキシン、またはチオエステラーゼ）によって細胞内で切断され、それによってポリヌクレオチドを放出することができる。
【0112】
ＣＰＰは、当技術分野において公知である（例えば、ＴＡＴまたはＡｒｇ８）（Ｓｎｙｄｅｒ ａｎｄ Ｄｏｗｄｙ，２００５，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２，４３～５１頁）。本明細書に開示されるハイブリダイズされたポリヌクレオチド構築物へのコンジュゲーションに適した部分を含むＣＰＰの具体例は、例えば、ＷＯ２０１５／１８８１９７において提供され、これらのＣＰＰの開示は、参照によって本明細書に援用される。
【0113】
ＣＰＰは、細胞への生物学的カーゴの送達を促進することができる正に荷電したペプチドである。ＣＰＰのカチオン電荷は、それらの機能に必須であると考えられる。さらに、これらのタンパク質の形質導入は、細胞型によって影響されないようであり、これらのタンパク質は、明らかな毒性を伴わずに、培養物中のほぼ全ての細胞を効率的に形質導入することができる（Ｎａｇａｈａｒａらによる、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１４４９－５２，１９９８）。全長タンパク質に加えて、ＣＰＰはまた、ＤＮＡ（Ａｂｕ－Ａｍｅｒ、上記）、アンチセンスポリヌクレオチド（Ａｓｔｒｉａｂ－Ｆｉｓｈｅｒらによる、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ，１９：７４４－５４，２００２）、小分子（Ｐｏｌｙａｋｏｖらによる、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１１：７６２－７１，２０００）、および無機４０ｎｍ鉄粒子（Ｄｏｄｄらによる、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５６：８９－１０５，２００１；Ｗｕｎｄｅｒｂａｌｄｉｎｇｅｒらによる、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１３：２６４－８，２００２；Ｌｅｗｉｎらによる、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：４１０－４，２０００；Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎらによる、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：１８６－９１，１９９９）の細胞内取り込みを誘導するために首尾よく使用されており、このプロセスにおいて粒径にかなりの柔軟性があることを示唆している。
【0114】
一実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物において有用なＣＰＰは、実質的なアルファヘリシティーを特徴とするペプチドを含む。ＣＰＰが有意なアルファヘリシティーを示す場合、遺伝子導入が最適化されることが発見された。別の実施形態では、ＣＰＰは、ペプチドの少なくとも１つの面に沿って実質的に整列した塩基性アミノ酸残基を含む配列を含む。本明細書に記載のＣＰＰは、天然に存在するペプチドまたは合成ペプチドであり得る。
【0115】
１つ以上（例えば、１つ～６つまたは１つ～３つ）の細胞透過性ペプチドは、本明細書に記載されるように、－ＬｉｎｋＡ－を介して、式（Ｖ’、Ｖ’’、またはＶ’’’）中のＭＯＩＥＴＹまたはＸ２に結合され得る。
【0116】
本明細書に開示されるポリヌクレオチド構築物およびハイブリダイズされたポリヌクレオチド構築物はまた、共有結合した中性ポリマーベースの補助部分を含み得る。中性ポリマーとしては、ポリ（Ｃ１－６アルキレンオキシド）、例えば、ポリ（エチレングリコール）およびポリ（プロピレングリコール）ならびにそのコポリマー、例えば、ジブロックコポリマーおよびトリブロックコポリマーが挙げられる。ポリマーの他の例としては、エステル化ポリ（アクリル酸）、エステル化ポリ（グルタミン酸）、エステル化ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（エチレン－コ－ビニルアルコール）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（エチルオキサゾリン）、ポリ（アルキルアクリレート）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（Ｎ－アルキルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ－アクリロイルモルホリン）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（カプロラクトン）、スチレン－無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリウレタン、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、およびポリ（Ｎ，Ｎ－ジアルキルアクリルアミド）が挙げられる。例示的なポリマー補助部分は、１００Ｄａ、３００Ｄａ、５００Ｄａ、１０００Ｄａ、または５０００Ｄａ未満（例えば、１００Ｄａ超）の分子量を有し得る。他のポリマーは、当技術分野において公知である。
【0117】
１つ以上（例えば、１つ～６つまたは１つ～３つ）のポリマーは、本明細書に記載されるように、－ＬｉｎｋＡ－を介して、式（Ｖ’、Ｖ’’、またはＶ’’’）中のＭＯＩＥＴＹまたはＸ２に結合され得る。
【0118】
コンジュゲーションリンカー
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、式（Ｉ）
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、式（Ｉ）
【0119】
【化9】
式中、
各Ｘ１は独立して、ＯまたはＳであり、
各Ｘ２は独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、または結合であり、
ＭＯＩＥＴＹは、任意選択で置換されたＣ２－１０アルカン－テトライル、または-Ｍ１-Ｍ２-Ｍ３-である基であり、ここで、各Ｍ１および各Ｍ３は独立して、存在しないか、任意選択で置換されたＣ１－６アルキレンであり、Ｍ２は、任意選択で置換されたＣ３－９ヘテロ環－テトライル、任意選択で置換されたＣ６－１０アレーン－テトライル、または任意選択で置換されたＣ３－８シクロアルカン－テトライルであり、
各Ｒ１および各Ｒ２は独立して、少なくとも１つのＲ１または少なくとも１つのＲ２がコンジュゲーション部分または-ＬｉｎｋＡ（-Ｔ）ｐであるならば、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１－１６アルキル、任意選択で置換されたＣ２－１６ヘテロアルキル、コンジュゲーション部分、または-ＬｉｎｋＡ（-Ｔ）ｐであり、
各Ｒ３は独立して、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１－１６アルキル、任意選択で置換されたＣ２－１６ヘテロアルキル、任意選択で置換されたＣ２－１６アルケニル、任意選択で置換されたＣ２－１６アルキニル、任意選択で置換された（Ｃ１－９ヘテロシクリル）－Ｃ１－６－アルキル任意選択で置換された（Ｃ６－１０アリール）－Ｃ１－６－アルキル、任意選択で置換された（Ｃ３－８シクロアルキル）－Ｃ１－６－アルキル、コンジュゲーション部分、または-ＬｉｎｋＡ（-Ｔ）ｐであり、
Ｒ４は、Ｈ、任意選択で置換されたＣ１－６アルキル、-ＬｉｎｋＡ（-Ｔ）ｐ、または-Ｓｏｌであり、
各ＬｉｎｋＡは独立して、多価リンカー（例えば、-Ｃ（Ｏ）-Ｎ（Ｈ）-を含む（例えば、Ｔに結合された-Ｃ（Ｏ）-Ｎ（Ｈ）-を含む少なくとも１つの多価リンカー））であり、
各Ｔは独立して、補助部分であり
Ｓｏｌは固体支持体であり、
ｍは１～６の整数であり、
各ｎは独立して、０または１であり、
各ｐは独立して、１～６の整数であり
ｑは０～３の整数であり、
式（Ｉ）の少なくとも１つの基は、ポリヌクレオチドの５’終端、３’終端、ヌクレオシド間リン酸塩、ヌクレオシド間ホスホロチオエート、またはヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合されることができる。式（Ｉ）の少なくとも１つの基がヌクレオシド間リン酸、ヌクレオシド間ホスホロチオエート、またはヌクレオシド間ホスホロジチオエートに結合される場合、ｑは０である。ポリヌクレオチド構築物は、１つ以下のＳｏｌを含有する。
【0120】
基－ＬｉｎｋＡ－は、０～３つの多価モノマー（例えば、任意選択で置換されたＣ１－６アルカン－トリイル、任意選択で置換されたＣ１－６アルカン－テトライル、または３価の窒素原子）および１つ以上（例えば、１つ～４０個）の二価モノマーを含むことができ、各二価モノマーは独立して、任意選択で置換されたＣ１～６アルキレンであり、任意選択で置換されたＣ２～６アルケニレン、任意選択で置換されたＣ２～６アルキニレン、任意選択で置換されたＣ３～８シクロアルキレン、任意選択で置換されたＣ３～８シクロアルケニレン、任意選択で置換されたＣ６～１４アリーレン、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ～４つのヘテロ原子を有する任意選択で置換されたＣ１～９ヘテロアリーレン、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ～４つのヘテロ原子を有する任意選択で置換されたＣ１～９ヘテロシクリレン、イミノ、任意選択で置換されたＮ、Ｏ、またはＳ（Ｏ）ｍ（式中、ｍは、０、１、または２である）である。いくつかの態様では、各モノマーは独立して、任意選択で置換されたＣ１～６アルキレンであり、任意選択で置換されたＣ３～８シクロアルキレン、任意選択で置換されたＣ３～８シクロアルケニレン、任意選択で置換されたＣ６～１４アリーレン、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ～４つのヘテロ原子を有する任意選択で置換されたＣ１～９ヘテロアリーレン、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ～４つのヘテロ原子を有する任意選択で置換されたＣ１～９ヘテロシクリレン、イミノ、任意選択で置換されたＮ、Ｏ、またはＳ（Ｏ）ｍ（式中、ｍは０、１または２である（例えば、ｍは２である））。特定の態様では、各モノマーは独立して、任意選択で置換されたＣ１～６アルキレンであり、任意選択で置換されたＣ３～８シクロアルキレン、任意選択で置換されたＣ３～８シクロアルケニレン、任意選択で置換されたＣ６～１４アリーレン、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ～４つのヘテロ原子を有する任意選択で置換されたＣ１～９ヘテロアリーレン、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１つ～４つのヘテロ原子を有する任意選択で置換されたＣ１～９ヘテロシクリレン、任意選択で置換されたＮ、Ｏ、またはＳ（Ｏ）ｍであり、ここで、ｍは０、１または２である（例えば、ｍは２である）。補助部分をコンジュゲート部分またはその反応生成物に接続する非生体可逆性リンカーは、２～５００（例えば、２～３００または２～２００である）のそのようなモノマーを含むことができる。グループ－ＬｉｎｋＡ－は、ポリ（アルキレンオキシド）（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリ（トリメチレンオキシド）、ポリブチレンオキシド、ポリ（テトラメチレンオキシド）、およびそのジブロックまたはトリブロックコポリマー）を含み得る。いくつかの態様では、非生体可逆性リンカーはポリエチレンオキシド（例えば、１ｋＤａ未満の分子量を有するポリ（エチレンオキシド））を含む。
【0121】
式（Ｉ）中の基-ＬｉｎｋＡ（-Ｔ）ｐは、以下の欄に記載のプロセスで調製され得る。いくつかの例では、-ＬｉｎｋＡ（-Ｔ）ｐは、式（ＩＩ）
【0122】
【化10】
式中、
各ｓは独立して、０～２０（例えば、０～１０）の整数であり、ここで、反復単位は、同じであるか異なる、
Ｑ１は、コンジュゲーションリンカー（例えば、［-Ｑ３-Ｑ４-Ｑ５］ｓ-ＱＣ-、ここで、ＱＣは任意選択で置換されたＣ２－１２ヘテロアルキレン（例えば、-Ｃ（Ｏ）-Ｎ（Ｈ）-、-Ｎ（Ｈ）-Ｃ（Ｏ）-、-Ｓ（Ｏ）２-Ｎ（Ｈ）-、または-Ｎ（Ｈ）-Ｓ（Ｏ）２-を含有するヘテロアルキレン）、任意選択で置換されたＣ１－１２ チオヘテロシクリレン（例えば、
【0123】
【化11】
【0124】
【化12】
Ｑ２は、ｐが１の場合、線形基（例えば、［-Ｑ３-Ｑ４-Ｑ５］ｓ-）であり、ｐが２～６の整数である場合、分岐基（例えば、［-Ｑ３-Ｑ４-Ｑ５］ｓ-Ｑ７（［-Ｑ３-Ｑ４-Ｑ５］ｓ-（Ｑ７）ｐ１）ｐ２であり、ここで、ｐ１は０または１、ｐ２は０、１、２、または３である）であり、
各Ｑ３および各Ｑ６は独立して、存在しないか、-ＣＯ-、-ＮＨ-、-Ｏ-、-Ｓ-、-ＳＯ２-、-ＯＣ（Ｏ）-、-ＣＯＯ-、-ＮＨＣ（Ｏ）-、-Ｃ（Ｏ）ＮＨ-、-ＣＨ２-、-ＣＨ２ＮＨ-、-ＮＨＣＨ２-、-ＣＨ２Ｏ-、または-ＯＣＨ２-であり、
各Ｑ４は独立して、存在しないか、任意選択で置換されたＣ１－１２アルキレン、任意選択で置換されたＣ２－１２アルケニレン、任意選択で置換されたＣ２－１２アルキニレン、任意選択で置換されたＣ２－１２ヘテロアルキレン、任意選択で置換されたＣ６－１０アリーレン、任意選択で置換されたＣ１－９ヘテロアリリン（ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌｅｎｅ）または任意選択で置換されたＣ１－９ヘテロシクリレンであり、
各Ｑ５は独立して、存在しないか、-ＣＯ-、-ＮＨ-、-Ｏ-、-Ｓ-、-ＳＯ２-、-ＣＨ２-、-Ｃ（Ｏ）Ｏ-、-ＯＣ（Ｏ）-、-Ｃ（Ｏ）ＮＨ-、-ＮＨ-Ｃ（Ｏ）-、-ＮＨ-ＣＨ（Ｒａ）-Ｃ（Ｏ）-、または-Ｃ（Ｏ）-ＣＨ（Ｒａ）-ＮＨ-であり、
各Ｑ７は独立して、任意選択で置換されたＣ１－６アルカン－トリイル、任意選択で置換されたＣ１－６アルカン－テトライル、任意選択で置換されたＣ２－６ヘテロアルカン－トリイル、または任意選択で置換されたＣ２－６ヘテロアルカン－テトライル、ならびに
各Ｒａは独立して、Ｑ３、Ｑ４、およびＱ５の少なくとも１つが存在するのであれば、Ｈまたはアミノ酸側鎖である。
【0125】
いくつかの態様では、各Ｑ４は独立して、存在しないか、任意選択で置換されたＣ１－１２アルキレン、任意選択で置換されたＣ２－１２アルケニレン、任意選択で置換されたＣ２－１２アルキニレン、任意選択で置換されたＣ２－１２ヘテロアルキレン、または任意選択で置換されたＣ１－９ヘテロシクリレンである。特定の態様では、ｓは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。
【0126】
したがって、式（ＩＩ）において、ＬｉｎｋＡは、各ｐ１が０である場合、単一の分岐点、または少なくとも１つのｐ１が１である場合、複数の分岐点を含み得る。
【0127】
式（ＩＩ）において、Ｑ１は－Ｏ－ＱＬ－ＱＣ－であってもよく、ここで、ＱＬは任意選択で置換されたＣ２－１２ヘテロアルキレン、任意選択で置換されたＣ１－１２アルキレン、または－（任意選択で置換されたＣ１－６アルキレン）－（任意選択で置換されたＣ６－１０アリーレン）－である。いくつかの態様では、ＱＬは、任意選択で置換されたＣ２－１２ヘテロアルキレンまたは任意選択で置換されたＣ１－１２アルキレンである。式（ＩＩ）において、ＱＣは、
【0128】
【化13】
【0129】
式（ＩＩ）において、Ｑ２は、式［-Ｑ３-Ｑ４-Ｑ５］ｓ-の線形基であってもよく、式中、Ｑ３、Ｑ４、およびＱ５は、式（ＩＩ）に関して定義される。代替的には、Ｑ２は、［-Ｑ３-Ｑ４-Ｑ５］ｓ-Ｑ７（［-Ｑ３-Ｑ４-Ｑ５］ｓ-（Ｑ７）ｐ１）ｐ２である分岐基であってもよく、式中、各Ｑ７は独立して、任意選択で置換されたＣ１－６アルカン－トリイル、任意選択で置換されたＣ１－６アルカン－テトライル、任意選択で置換されたＣ２－６ヘテロアルカン－トリイル、または任意選択で置換されたＣ２－６ヘテリアルカン－テトライルであり、
式中、
ｐ１は０または１であり、
ｐ２は、０、１、２、または３であり
ここで、ｐ１が０の場合、ＬｉｎｋＡは３価または４価のリンカーであり、ｐ１が１の場合、ＬｉｎｋＡは４価、５価または６価のリンカーである。特定の態様では、ｐ１は０である。いくつかの態様では、Ｑ７は、
式中、
ｐ１は０または１であり、
ｐ２は、０、１、２、または３であり
ここで、ｐ１が０の場合、ＬｉｎｋＡは３価または４価のリンカーであり、ｐ１が１の場合、ＬｉｎｋＡは４価、５価または６価のリンカーである。特定の態様では、ｐ１は０である。いくつかの態様では、Ｑ７は、
【0130】
【化14】
【0131】
式（Ｉ）中の基-ＬｉｎｋＡ（-Ｔ）ｐの調製に使用され得る化合物は、本明細書、ならびにＷＯ２０１５／１８８１９７に記載される。-ＬｉｎｋＡの非限定的な例は、
【0132】
【化15-1】
【0133】
【化15-2】
【0134】
【化15-3】
Ｒ１８は、ＭＯＩＥＴＹへの結合であり、
各Ｒ１９は独立して、補助部分への結合であり、
各ｍ５は独立して、１～２０の整数であり、
各ｍ６は独立して、１～１０の整数であり、
ｍ７は、１～６の整数であり、および
各Ｘ６は独立して、ＯまたはＳである。
式（ＩＩ）において、式［-Ｑ３-Ｑ４-Ｑ５］ｓ-ＱＣ-，-Ｑ２（［-Ｑ３-Ｑ４-Ｑ５］ｓ-Ｑ６-Ｔ）ｐのコンジュゲーションリンカーは、
【0135】
【化16-1】
【0136】
【化16-2】
Ｒ２０は、Ｑ１中のＱＣへの結合であり、
各Ｒ１９は独立して、補助部分への結合であり、
各ｍ５は独立して、１～２０の整数であり、
各ｍ６は独立して、１～１０の整数であり、
ｍ７は、１～６の整数であり、および
各Ｘ６は独立して、ＯまたはＳである。
【0137】
いくつかの態様では、本明細書に記載のリンカーは切断可能性である。いくつかの態様では、本明細書に記載のリンカーは切断不可能性である。
【0138】
いくつかの態様では、本明細書に記載のポリ核酸分子は、式（ＩＶ）
【0139】
【化17】
式中、
Ｙ１またはＹ２の少なくとも１つは、このポリ核酸分子からのヌクレオチドである。
【0140】
いくつかの例では、Ｙ１は、ポリ核酸分子の鎖のうちの１つの、３’終端上の最後のヌクレオチドか、５’終端上の最初のヌクレオチドである。いくつかの例では、Ｙ１は、ポリ核酸分子のセンス鎖の、３’終端上の最後のヌクレオチドか、５’終端上の最初のヌクレオチドである。いくつかの例では、Ｙ１は、ポリ核酸分子のセンス鎖の、３’終端上の最後のヌクレオチドか、５’終端上の最初のヌクレオチドであり、Ｙ２は、３－ヒドロキシ－プロポキシ基である。いくつかの例では、Ｙ２は、ポリ核酸分子の鎖のうちの１つの、５’終端上の最初のヌクレオチドか、３’終端上の最後のヌクレオチドである。いくつかの例では、Ｙ２は、ポリ核酸分子のセンス鎖の、５’終端上の最初のヌクレオチドか、３’終端上の最後のヌクレオチドである。いくつかの例では、Ｙ２は、ポリ核酸分子のセンス鎖の、５’終端上の最初のヌクレオチドか、３’終端上の最後のヌクレオチドであり、Ｙ１は、３－ヒドロキシ－プロポキシ基である。他の例では、Ｙ１およびＹ２は、ポリ核酸分子の鎖のうちの１つにおける２つの連続するヌクレオチドである。
【0141】
いくつかの態様では、本明細書に記載の標的化部分は、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる（例えば、式（ＩＶ’））。いくつかの態様では、本明細書に記載の標的化部分は、センス鎖の５’末端にコンジュゲートされる（例えば、式（ＩＶ’’）または式（ＩＶ’’’））。いくつかの態様では、本明細書に記載の標的化部分は、アンチセンス鎖の３’末端にコンジュゲートされる（例えば、式（ＩＶ’））。いくつかの態様では、本明細書に記載の標的化部分は、アンチセンス鎖の５’末端にコンジュゲートされる（例えば、式（ＩＶ’’）または式（ＩＶ’’’））。
【0142】
【化18】
式（ＩＶ’）中のＺは、本明細書に記載の糖修飾のうちの１つ（例えば、－Ｈ、－ＯＨ、－Ｏ－メチル、－Ｆ、または－Ｏ－メトキシエチル）に対応する部分であり、式（ＩＶ’）中のＲは、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、チミン、脱塩基、または他のものである。
【0143】
【化19】
式（ＩＶ’’）中のＺは、本明細書に記載の糖修飾のうちの１つ（例えば、－Ｈ、－ＯＨ、－Ｏ－メチル、－Ｆ、または－Ｏ－メトキシエチル）に対応する部分であり、式（ＩＶ’’）中のＲは、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、チミン、脱塩基、または他のものである。
【0144】
【化20】
式（ＩＶ’’’）中のＺは、本明細書に記載の糖修飾のうちの１つ（例えば、－Ｈ、－ＯＨ、－Ｏ－メチル、－Ｆ、または－Ｏ－メトキシエチル）に対応する部分であり、式（ＩＶ’’’）中のＲは、アデニン、ウラシル、グアニン、シトシン、チミン、脱塩基、または他のものである。
【0145】
医薬組成物
本明細書に記載のポリヌクレオチド分子の送達は、様々な方法を用いて細胞を構築物と接触させることによって達成することができる。特定の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子は、本明細書の他の箇所により完全に説明されるように、様々な賦形剤、ビヒクル、および担体と共に製剤化される。
本明細書に記載のポリヌクレオチド分子の送達は、様々な方法を用いて細胞を構築物と接触させることによって達成することができる。特定の態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子は、本明細書の他の箇所により完全に説明されるように、様々な賦形剤、ビヒクル、および担体と共に製剤化される。
【0146】
本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に開示されるハイブリダイズされたポリヌクレオチド構築物を、担体、賦形剤、およびビヒクルを使用して対象に投与するのに適した形態に含むように調製することができる。頻繁に使用される賦形剤には、マグネシウムカルボネート、二酸化チタン、ラクトース、マンニトールおよび他の糖、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロースおよびその誘導体、動物油および植物油、ポリエチレングリコール、ならびに、滅菌水、アルコール、グリセロール、および多価アルコールなどの溶媒が含まれる。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補充物を含む。保存剤には、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスが含まれる。他の薬学的に許容可能なビヒクルには、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００５）、および２０１３年発行のＴｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ（ＵＳＰ ３６ ＮＦ３１）に記載されるように、水溶液、塩、防腐剤、緩衝剤などを含む非毒性賦形剤が含まれる。医薬組成物の様々な成分のｐＨおよび正確な濃度は、当技術分野における日常的な技能に従って調整される。ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎらによる、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓを参照されたい。
【0147】
本明細書に記載の医薬組成物は、局所的または全身的に投与され得る。治療有効量は、対象における感染の程度、個体の年齢、性別、および体重などの因子に従って変動する。投与レジメンは、最適な治療応答を提供するように調整することができる。例えば、いくつかの分割用量を毎日投与することができ、または治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減少させることができる。
【0148】
医薬組成物は、注射（例えば、皮下、静脈内、眼窩内など）、経口投与、眼適用、吸入、局所適用、または直腸投与などの好都合な方法で投与することができる。投与経路に応じて、薬学的組成物は、酵素、酸、および薬学的組成物を不活性化し得る他の自然条件の作用から薬学的組成物を保護するための材料でコーティングされ得る。医薬組成物は、非経口または腹腔内に投与することもできる。分散物はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために保存剤を含有し得る。
【0149】
注射用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。組成物は、典型的には無菌であり、容易な注射可能性が存在する程度に流動性である。典型的には、組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定であり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存される。ビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、それらの好適な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、または塩化ナトリウムが組成物に使用される。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【0150】
滅菌注射用溶液は、必要量の医薬組成物を、必要に応じて上に列挙した成分の１つまたは組合せと共に適切な溶媒に組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散剤は、塩基性分散媒および上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に医薬組成物を組み込むことによって調製される。
【0151】
投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位形態で製剤化することが特に有利である。本明細書で使用される単位剤形は、処置される対象のための単位投与量として適した物理的に別個の単位を指し、所定の量の医薬組成物を含有する各単位は、必要な医薬ビヒクルと関連して所望の治療効果をもたらすように計算される。単位剤形の仕様は、医薬組成物の特性および達成すべき特定の治療効果に関連する。主要な医薬組成物は、有効量で便利かつ有効な投与のために、適切な薬学的に許容可能なビヒクルと共に許容可能な投与単位に配合される。補助的な活性成分を含有する組成物の場合、投与量は、成分の通常の用量および投与様式を参照して決定される。
【0152】
医薬組成物は、例えば担体中で、例えば腸溶コーティングされた単位剤形で経口投与することができる。医薬組成物および他の成分はまた、硬質もしくは軟質シェルゼラチンカプセルに封入するか、または錠剤に圧縮することができる。経口治療投与のために、医薬組成物は、賦形剤と共に組み込むことができ、摂取可能な錠剤、トローチ、カプセル、丸薬、ウエハースなどの形態で使用することができる。このような組成物および調製物は、少なくとも１重量％の活性化合物を含有するべきである。組成物および調製物のパーセンテージは、当然ながら変えることができ、好都合には単位の重量の約５％～約８０％であり得る。錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは、以下のものを含有することもできる：トラガカントゴム、アカシア、トウモロコシデンプン、またはゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム；および甘味剤、例えばスクロース、ラクトースもしくはサッカリン、または香味剤、例えばペパーミント、ウィンターグリーンの油、またはチェリー香味剤。投薬単位形態がカプセルである場合、投薬単位形態は、上記のタイプの材料に加えて、液体担体を含有し得る。様々な他の材料が、コーティングとして、または投薬単位の物理的形態を別様に改変するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、シェラック、糖、またはその両方でコーティングすることができる。シロップ剤またはエリキシル剤は、薬剤、甘味剤としてのスクロース、防腐剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、染料、ならびにチェリーまたはオレンジフレーバーなどのフレーバー剤を含有することができる。任意の投薬単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に許容可能な純度であり、使用される量において実質的に無毒であるべきである。加えて、医薬組成物は、徐放性調製物および製剤に組み込むことができる。
【0153】
本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子のバイオアベイラビリティを促進する１つ以上の透過促進剤を含み得る。ＷＯ２０００／６７７９８，Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，１９９０，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓ ｙｓｔｅｍｓ，７，１，Ｌｅｅらによる、１９９１，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，８，９１は、参照によってその全体が本明細書に援用される。いくつかの態様では、透過促進剤は腸内投与用である。いくつかの態様では、透過促進剤は経皮投与用である。いくつかの態様では、透過促進剤は、脳血液関門の通過を促進するものである。いくつかの態様では、透過促進剤は、経口、鼻、口腔、肺、膣、または角膜送達モデルにおける透過性を改善する。いくつかの態様では、透過促進剤は脂肪酸またはその誘導体である。いくつかの態様では、透過促進剤は、界面活性剤またはその誘導体である。いくつかの態様では、透過促進剤は胆汁酸塩またはその誘導体である。いくつかの態様では、透過促進剤はキレート剤またはその誘導体である。いくつかの態様では、透過促進剤は、非キレート性非界面活性剤またはその誘導体である。いくつかの態様では、透過促進剤はエステルまたはその誘導体である。いくつかの態様では、透過促進剤はエーテルまたはその誘導体である。いくつかの特定の態様では、透過促進剤は、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、グリセリル１－モノカプリン酸、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、またはその薬学的に許容可能な塩である。ある特定の態様では、透過促進剤はカプリン酸ナトリウム（Ｃ１０）である。いくつかの特定の態様では、透過促進剤は、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、ウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸、グリコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ナトリウムタウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシデートまたはグリコジヒドロフシデートナトリウムである。いくつかの特定の態様では、透過促進剤はポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテルまたはポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルである。
【0154】
本明細書に記載のポリヌクレオチド分子について、適切な薬学的に許容可能な塩としては、（ｉ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウムなどのカチオン、スペルミンおよびスペルミジンなどのポリアミンと形成される塩；（ｉｉ）無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、りん酸などと形成される酸付加塩；（ｉｉｉ）有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などと形成される塩が挙げられる。
【0155】
本明細書に記載のハイブリダイズされたポリヌクレオチド構築物は、標的細胞への送達のための賦形剤の使用を必要としない場合があるが、賦形剤の使用は、いくつかの態様では有利であり得る。したがって、標的細胞への送達のために、本明細書に記載のハイブリダイズされたポリヌクレオチド分子は、賦形剤に非共有結合して複合体を形成することができる。賦形剤は、送達後の生体内分布を変化させるため、取り込みを増強するため、ハイブリダイズされたポリヌクレオチド構築物中の鎖の半減期もしくは安定性を増加させるため（例えば、ヌクレアーゼ耐性を改善するため）、および／または特定の細胞もしくは組織型への標的化を増加させるために使用することができる。
【0156】
規格としては、例えば、縮合剤（例えば、イオンまたは静電相互作用を介して核酸を誘引または結合することができる薬剤）；融合剤（例えば、細胞膜を融合および／または輸送することができる薬剤）；特定の細胞または組織型を標的とするタンパク質（例えば、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントプロテインＡ、または任意の他のタンパク質）；脂質；リポ多糖類；脂質ミセルまたはリポソーム（例えば、ホスホチジルコリンなどのリン脂質、脂肪酸、糖脂質、セラミド、グリセリド、コレステロール、またはこれらの任意の組合せから形成される）；ナノ粒子（例えば、シリカ、脂質、炭水化物、または他の薬学的に許容可能なポリマーナノ粒子）；カチオン性ポリマーおよびアニオン性剤（例えば、ＣＲＯ）から形成されるポリプレックスであって、例示的なカチオン性ポリマーは、ポリアミン（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアミドアミン、およびポリエチレンイミン）を含む、ポリプレックス；コレステロール；ａデンドリマー（例えば、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー）；血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）または低密度リポタンパク質（ＬＤＬ））；炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、またはヒアルロン酸）；脂質；合成ポリマー、（例えば、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリエチレンイミン、ポリ－Ｌ－アスパラギン酸、ポリ－Ｌ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコール酸）コポリマー、ジビニルエーテル－無水マレイン酸コポリマー、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマー、プソイドペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、またはポリアミン）；カチオン性部分（例えば、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはαらせんペプチド）；多価糖（例えば、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン、多価マンノース、または多価フコース）；ａビタミン（例えば、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、ビタミンＢ、葉酸、ビタミンＢ１２、リボフラビン、ビオチン、またはピリドキサール）；補因子；または細胞骨格を破壊して取り込みを増加させる薬物（例えば、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド、ラトランクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシン、またはミオセルビン）などが挙げられる。
【0157】
本明細書に記載の他の治療剤は、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子と組み合わせて、本明細書に記載の医薬組成物に含まれ得る。
【0158】
処置方法
いくつかの態様では、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節する方法が本明細書に記載され、この方法は、本明細書に記載のポリ核酸分子、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することで、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節する工程を含む。
いくつかの態様では、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節する方法が本明細書に記載され、この方法は、本明細書に記載のポリ核酸分子、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することで、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を調節する工程を含む。
【0159】
いくつかの具体的な態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を約または少なくとも１０％減少させる。いくつかの具体的な態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を約または少なくとも２０％減少させる。いくつかの具体的な態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を約または少なくとも３０％減少させる。いくつかの具体的な態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を約または少なくとも４０％減少させる。いくつかの具体的な態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を約または少なくとも５０％減少させる。いくつかの具体的な態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を約または少なくとも６０％減少させる。いくつかの具体的な態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を約または少なくとも７０％減少させる。いくつかの具体的な態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を約または少なくとも８０％減少させる。いくつかの具体的な態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を約または少なくとも９０％減少させる。いくつかの具体的な態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を約１００％減少させる。
【0160】
いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約５ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約１０ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約１５ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約２０ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約２５ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約３０ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約３５ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約４０ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約４５ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約５０ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約５５ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約６０ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約６５ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約７０ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約７５ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約８０ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約８５ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約９０ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約９５ｎＭのＩＣ５０値を達成する。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、約１００ｎＭのＩＣ５０値を達成する。
【0161】
いくつかの態様では、調節を必要とする対象におけるＬＤＬを調節する方法が本明細書に記載され、この方法は、対象に、本明細書に記載のポリ核酸分子、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または本明細書に記載の医薬組成物を投与する工程を含み、本明細書に記載のポリ核酸分子、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または本明細書に記載の医薬組成物は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を減少させる。
【0162】
いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＬＤＬレベルを約または少なくとも１０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＬＤＬレベルを約または少なくとも２０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＬＤＬレベルを約または少なくとも３０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＬＤＬレベルを約または少なくとも４０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＬＤＬレベルを約または少なくとも５０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＬＤＬレベルを約または少なくとも６０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＬＤＬレベルを約または少なくとも７０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＬＤＬレベルを約または少なくとも８０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＬＤＬレベルを約または少なくとも９０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるＬＤＬレベルを約１００％減少させる。
【0163】
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法を受ける対象は、高コレステロール血症に罹患している。いくつかの具体的な実施態様では、本明細書に記載の方法を受ける対象は、家族性高コレステロール血症に罹患している。他の態様では、本明細書に記載の方法を受ける対象は、他の高コレステロール関連疾患に罹患している。他の態様では、本明細書に記載の方法を受ける対象は、神経炎症に罹患している。他の態様では、本明細書に記載の方法を受ける対象は、アルツハイマー病に罹患している。他の態様では、本明細書に記載の方法を受ける対象は、ＡＵＤに罹患している。他の態様では、本明細書に記載の方法を受ける対象は、脳卒中に罹患している。
【0164】
いくつかの態様では、調節を必要とする対象におけるコレステロールを調節する方法が本明細書に記載され、この方法は、本明細書に記載のポリ核酸分子、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含み、本明細書に記載のポリ核酸分子、本明細書に記載のポリ核酸分子コンジュゲート、または本明細書に記載の医薬組成物は、対象におけるＰＣＳＫ９遺伝子の発現を減少させる。
【0165】
いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるコレステロールレベルを約または少なくとも１０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるコレステロールレベルを約または少なくとも２０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるコレステロールレベルを約または少なくとも３０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるコレステロールレベルを約または少なくとも４０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるコレステロールレベルを約または少なくとも５０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるコレステロールレベルを約または少なくとも６０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるコレステロールレベルを約または少なくとも７０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるコレステロールレベルを約または少なくとも８０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるコレステロールレベルを約または少なくとも９０％減少させる。いくつかの特定の態様では、本明細書に記載の方法は、陰性対照と比較して、対象におけるコレステロールレベルを約１００％減少させる。
【0166】
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法を受ける対象は、高コレステロール血症に罹患している。いくつかの具体的な実施態様では、本明細書に記載の方法を受ける対象は、家族性高コレステロール血症に罹患している。他の態様では、本明細書に記載の方法を受ける対象は、他の高コレステロール関連疾患に罹患している。他の態様では、本明細書に記載の方法を受ける対象は、神経炎症に罹患している。他の態様では、本明細書に記載の方法を受ける対象は、アルツハイマー病に罹患している。他の態様では、本明細書に記載の方法を受ける対象は、ＡＵＤに罹患している。他の態様では、本明細書に記載の方法を受ける対象は、脳卒中に罹患している。
【実施例】
【0167】
以下の実施例は、例示的な目的でのみ提供され、本明細書に提供される特許請求の範囲を制限するものではない。
【0168】
実施例１－非ヒト霊長類におけるＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡの試験
非ヒト霊長類試験において、ＰＣＳＫ９を標的とする既知のｓｉＲＮＡ（表１で「ＳＲＳ－００６」として示す）をベンチマークとして使用して、５つのＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ（表１からの「ＳＲＳ－００１」～「ＳＲＳ－００５」として示す）を試験した。
非ヒト霊長類試験において、ＰＣＳＫ９を標的とする既知のｓｉＲＮＡ（表１で「ＳＲＳ－００６」として示す）をベンチマークとして使用して、５つのＰＣＳＫ９ ｓｉＲＮＡ（表１からの「ＳＲＳ－００１」～「ＳＲＳ－００５」として示す）を試験した。
【0169】
【表2】
【0170】
図１Ａ～図１Ｊに示すように、ＳＲＳ－００６を対照として用いてＳＲＳ－００１～ＳＲＳ－００５を試験し、血清ＰＣＳＫ９発現レベル、ＬＤＬ－ｃレベル、総コレステロールレベル、トリグリセリドレベル、およびＨＤＬ－ｃレベルをモニタリングして、投与前のレベルと比較して定量化した。他の臨床マーカー（例えば、体重、食物摂取量、総エネルギー摂取量、臨床化学、全血球計算（ＣＢＣ）、動物訓練、ケージサイド観察、および臨床挙動の確認など）もモニタリングした。具体的には、以下のパラメータ：ＧＬＵ、ＩＮＳ、Ｃｒ、ＢＵＮ、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＡＬＢ、ＢＩＬ、Ｃａ、ＰＨＯＳ、ＡＬＰ、ＧＧＴ、ＴＰ、ＣＯ２、ＣＫ、Ｎａ、Ｋ、ＣＬ、ＧＬＢ、およびＡ／Ｇを用いて臨床化学をプロファイリングした。ＷＢＣ、ＲＢＣ、ＨＧＢ、ＨＣＴ、ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣ、ＰＬＴ、ＲＤＷ－ＣＶ、ＭＰＶ、ＮＥＵＴ、ＮＥＵＴ％、ＬＹＭＰ、ＬＹＭＰ％、ＭＯＮＯ、ＭＯＮＯ％、ＥＯ、ＥＯ％、ＢＡＳＯ、およびＢＡＳＯ％に対して、ＣＢＣを行った。臨床挙動の確認における例示的な項目は、全身の様子、呼吸の状態、尿の状態、歯の状態、眼の状態、消化系の状態、陰部および会陰部の状態、皮膚および毛の状態、挙動および神経学的徴候、口腔の状態、口の状態、耳の状態、鼻の状態、摂食の状態、筋肉の状態、背部の状態、関節の状態、骨の状態、ならびに四肢の状態を含んだ。血清ＰＣＳＫ９タンパク質レベル、ＬＤＬ－ｃレベル、および総コレステロールレベルの減少が観察された。具体的には、ＳＲＳ－００１およびＳＲＳ－００２は、ＰＣＳＫ９タンパク質レベル、ＬＤＬ－ｃレベル、および総コレステロールレベルを効果的に減少させた。
【0171】
実施例２－ＰＣＳＫ９を標的とするｓｉＲＮＡのＩｎ ｖｉｔｒｏ有効性
ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴからの初代非ヒト肝細胞を解凍して、コラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレート上に、１ウェルあたり５．４×１０５個の細胞の密度で蒔いた。コンジュゲートされたｓｉＲＮＡを用いて、遺伝子導入試薬のない状態で肝細胞を処置した（（自由取り込み（ｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ））。１０ｎＭ、１００ｎＭ、または５００ｎＭの濃度のｓｉＲＮＡで細胞を処置した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２で４８時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、細胞を溶解し、ｍＲＮＡを単離し、さらに、ｑＰＣＲを用いて標的遺伝子の発現を測定して、標準プロトコルを使用してハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。
ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴからの初代非ヒト肝細胞を解凍して、コラーゲンでコーティングされた９６ウェルプレート上に、１ウェルあたり５．４×１０５個の細胞の密度で蒔いた。コンジュゲートされたｓｉＲＮＡを用いて、遺伝子導入試薬のない状態で肝細胞を処置した（（自由取り込み（ｆｒｅｅ ｕｐｔａｋｅ））。１０ｎＭ、１００ｎＭ、または５００ｎＭの濃度のｓｉＲＮＡで細胞を処置した。細胞を３７℃、５％ ＣＯ２で４８時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、細胞を溶解し、ｍＲＮＡを単離し、さらに、ｑＰＣＲを用いて標的遺伝子の発現を測定して、標準プロトコルを使用してハウスキーピング遺伝子に対して正規化した。
【0172】
試験したｓｉＲＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖の修飾を表２に列挙する。ｓｉＲＮＡのｉｎ－ｖｉｔｒｏ効力を表３に列挙する。
【0173】
【表3-1】
【0174】
【表3-2】
【0175】
【表3-3】
【0176】
【表3-4】
【0177】
【表3-5】
【0178】
【表3-6】
【0179】
【表3-7】
【0180】
【表3-8】
【0181】
【表3-9】
【0182】
【表4-1】
【0183】
【表4-2】
【0184】
【表4-3】
【0185】
本開示の好ましい態様を本明細書に記載してきたが、これらの態様が例としてのみ提供されることは、当業者にとって明らかである。多数の変形、変化、および置換は、本開示から逸脱することなく、当業者によって現在想到されるものである。本明細書に記載する本開示の態様に対する様々な代替物が本開示を実施するにあたって使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は本開示の範囲を定義するものであり、この特許請求の範囲およびそれらの同等物の範囲内の方法および構成は、それによって包含されることが、意図される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図1F】
【図1G】
【図1H】
【図1I】
【図1J】
【配列表】
【国際調査報告】