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特表2024-534603組換えタンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物及び宿主細胞
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-20
(54)【発明の名称】組換えタンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物及び宿主細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240912BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240912BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240912BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240912BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240912BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/21
C12P21/08
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024518677
(86)(22)【出願日】2022-09-23
(85)【翻訳文提出日】2024-04-19
(86)【国際出願番号】 EP2022076591
(87)【国際公開番号】W WO2023046930
(87)【国際公開日】2023-03-30
(31)【優先権主張番号】2130258-3
(32)【優先日】2021-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(31)【優先権主張番号】2130259-1
(32)【優先日】2021-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(31)【優先権主張番号】2130261-7
(32)【優先日】2021-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(31)【優先権主張番号】2130263-3
(32)【優先日】2021-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(31)【優先権主張番号】2130264-1
(32)【優先日】2021-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(31)【優先権主張番号】2130265-8
(32)【優先日】2021-09-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SE
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522359512
【氏名又は名称】エックスブレイン バイオファーマ エービー
(74)【代理人】
【識別番号】110000877
【氏名又は名称】弁理士法人ＲＹＵＫＡ国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ミルザデー、キアヴァシュ
(72)【発明者】
【氏名】ヴィクストロム、デイヴィッド
(72)【発明者】
【氏名】イスマイル、ヌルジアン
(72)【発明者】
【氏名】サミュエルソン、パトリック
(72)【発明者】
【氏名】バラシュキェヴィチ、マリウシュ
(72)【発明者】
【氏名】サリフ、タグリド
(72)【発明者】
【氏名】セーカー、キャスリーン
(72)【発明者】
【氏名】チュイ、ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】グディセ、サントシュ
(72)【発明者】
【氏名】エデブリンク、ペル
(72)【発明者】
【氏名】カドー、マリア
(72)【発明者】
【氏名】ステファンソン、カリン
(72)【発明者】
【氏名】ストランドバーグ、クリスティン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE10
4B064DA01
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
(57)【要約】
【要約】
配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つであって、ここで配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列はＴＩＲ配列である、配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つ；及び
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；を備え、
配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列は、前記シグナルペプチドをコードする配列のうちの少なくとも最初の９ヌクレオチドを含む、
組換えタンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物。
配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つであって、ここで配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列はＴＩＲ配列である、配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つ；及び
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；を備え、
配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列は、前記シグナルペプチドをコードする配列のうちの少なくとも最初の９ヌクレオチドを含む、
組換えタンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つであって、ここで配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列はＴＩＲ配列である、配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つ；及びシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；を備え、
ここで配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列は、前記シグナルペプチドをコードする配列のうちの少なくとも最初の９ヌクレオチドを含む、
組換えタンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物。
【請求項2】
前記ＴＩＲ配列は、ｍＲＮＡ転写におけるタンパク質翻訳開始部位として機能するＲＮＡモチーフに転写される、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項3】
前記ＤＮＡ構築物が配列番号２０のヌクレオチド配列のＴＩＲを含む場合、シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項4】
前記ＤＮＡ構築物が配列番号２１のヌクレオチド配列のＴＩＲを含む場合、シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項5】
前記ＤＮＡ構築物は配列番号２０及び配列番号２１の前記ヌクレオチド配列を含み、シグナルペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列を含み、シグナルペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号１８の前記ヌクレオチド配列を含み、シグナルペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号１９の前記ヌクレオチド配列を含み、配列番号２０の前記ヌクレオチド配列は、少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含み、配列番号１８の前記ヌクレオチド配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含み、配列番号２１の前記ヌクレオチド配列は配列番号１９の前記ヌクレオチド配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項6】
前記組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物であって、前記組換えタンパク質は好ましくは抗体であり、前記抗体は最も好ましくはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体又は前記抗体のうちのいずれかのフラグメントである、請求項１～５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項7】
シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記組換えタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列に作用可能に連結される、請求項１～６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項8】
前記組換えタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は；抗体の軽鎖をコードする第１の核酸配列；及び
抗体の重鎖をコードする第２の核酸配列
を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項9】
シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は：抗体の前記軽鎖をコードする第１のヌクレオチド配列；及び／又は
抗体の前記重鎖をコードする第２のヌクレオチド配列
に作用可能に連結される、請求項８に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項10】
シャイン・ダルガーノ配列を含むＤＮＡ構築物であって、好ましくは、前記シャイン・ダルガーノ配列はシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列のＡＴＧ開始コドンより上流に位置し、より好ましくは、前記シャイン・ダルガーノ配列は抗体の前記軽鎖に作用可能に連結されたシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列の前記ＡＴＧ開始コドンより上流に位置する、請求項１～９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項11】
抗体の前記軽鎖をコードする前記第１のヌクレオチド配列は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項12】
抗体の前記重鎖をコードする前記第２のヌクレオチド配列は、配列番号４のアミノ酸配列をコードする、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項13】
抗体の前記軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする前記第１のヌクレオチド配列及び前記第２のヌクレオチド配列は、配列番号３及び配列番号４の前記アミノ酸配列をそれぞれコードする、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項14】
抗体の前記軽鎖をコードする前記第１のヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項15】
抗体の前記重鎖をコードする前記第２のヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項16】
抗体の前記軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする前記第１のヌクレオチド配列及び前記第２のヌクレオチド配列は、配列番号５及び配列番号６のヌクレオチド配列をそれぞれ含む、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
【請求項18】
細菌細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、最も好ましくはラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を含む染色体を有する大腸菌である、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む、又は請求項１７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項19】
（ｉ）ＲｈａＢを不活性化するｒｈａＢ遺伝子の前記ヌクレオチド配列における突然変異を含む染色体、又は（ｉｉ）ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列が欠失した染色体、のいずれかを含む、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項20】
好ましくはＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列においてフレームシフト突然変異を含む染色体を有する大腸菌Ｗ３１１０である、請求項１８又は１９に記載の宿主細胞。
【請求項21】
ａ．ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異；ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む染色体を有する、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項22】
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、請求項１８～２１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項23】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物によって発現されるＲＮＡ。
【請求項24】
請求項１８～２２のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用を含む、組換えタンパク質を発現させる方法。
【請求項25】
前記宿主細胞から前記組換えタンパク質を回収する段階を更に含み；任意選択的に、前記回収された組換えタンパク質を、好ましくは１つ又は複数のクロマトグラフィ段階によって精製する１つ又は複数の段階を更に含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
請求項２４又は２５に記載の方法によって得られる組換えタンパク質。
【請求項27】
セルトリズマブは、（ｉ）配列番号３の前記アミノ酸配列を含む軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号４の前記アミノ酸配列を含む重鎖を有し、前記ＤＮＡ構築物は、セルトリズマブをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡ構築物は、セルトリズマブの前記軽鎖及び／又はセルトリズマブの前記重鎖をコードする前記ヌクレオチド配列に転写方向において作用可能に連結されたシグナルペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を更に含み、
前記ＤＮＡ構築物は：
ｒｈａＢＡＤプロモーター、
ＲｈａＲ転写活性化因子、
ＲｈａＳ転写活性化因子、
抗生物質耐性マーカー、
少なくとも１つのターミネーター、及び
複製起点
をコードするヌクレオチド配列を更に含む、宿主細胞内でセルトリズマブを発現させるためのＤＮＡ構築物。
【請求項28】
前記抗生物質耐性マーカーをコードする前記ヌクレオチド配列に作用可能に連結されたプロモーターをコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項29】
前記少なくとも１つのターミネーターは２つのターミネーターを有し、好ましくは、前記ターミネーターはｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーター及びｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターを含む、請求項２８に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項30】
前記複製起点はｐＭＢ１複製起点を含む、請求項２９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項31】
前記抗生物質耐性マーカーはカナマイシン耐性マーカーであり、好ましくは配列番号１２の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むカナマイシン耐性マーカーである；前記抗生物質耐性マーカーをコードする前記ヌクレオチド配列に作用可能に連結された前記プロモーターは、ＡｍｐＲプロモーター、好ましくは配列番号１３の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＡｍｐＲプロモーターである；
前記ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターは、配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；
前記ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターは、配列番号１５の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；及び／又は
前記ｐＭＢ１複製起点は、配列番号１６の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、
請求項３０に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項32】
前記抗生物質耐性マーカーは、配列番号１２の前記ヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカーである；前記抗生物質耐性マーカーをコードする前記ヌクレオチド配列に作用可能に連結された前記プロモーターは、配列番号１３の前記ヌクレオチド配列を含むＡｍｐＲプロモーターである；
前記ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターは、配列番号１４の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターは、配列番号１５の前記ヌクレオチド配列を含む；及び／又は
前記ｐＭＢ１複製起点は配列番号１６の前記ヌクレオチド配列を含む、
請求項３１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項33】
前記ｒｈａＢＡＤプロモーターは、配列番号８の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号８の前記ヌクレオチド配列を含む；前記ＲｈａＲ転写活性化因子は、配列番号９の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号９の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記ＲｈａＳ転写活性化因子は、配列番号１１の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１１の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記抗生物質耐性マーカーは、配列番号１２の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１２の前記ヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカーである；
前記ＡｍｐＲプロモーターは、配列番号１３の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１３の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターは、配列番号１４の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１４の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターは、配列番号１５の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１５の前記ヌクレオチド配列を含む；及び
前記ｐＭＢ１複製起点は、配列番号１６の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましく配列番号１６の前記ヌクレオチド配列を含む、
請求項３１又は３２に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項34】
前記組換えタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ｒｈａＢＡＤプロモーターに作用可能に連結されている、請求項２７～３３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項35】
セルトリズマブをコードする前記ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号５の前記配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むセルトリズマブの前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列、及び／又は（ｉｉ）配列番号６の前記配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むセルトリズマブの前記重鎖をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項２７～３４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項36】
セルトリズマブをコードする前記ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号５の前記配列を含むセルトリズマブの前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列、及び／又は（ｉｉ）配列番号６の前記配列を含むセルトリズマブの前記重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２７～３４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項37】
シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号５及び配列番号６のヌクレオチド配列のいずれか一方又は両方に転写方向に作用可能に連結される、請求項３６に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項38】
前記シグナルペプチドは、ＭａｌＥ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＤｓｂＡ及びＰｅｌｂからなる群から選択され、好ましくは、前記シグナルペプチドはＰｅｌＢである、請求項２７～３７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項39】
配列番号２０及び２１の前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含むＤＮＡ構築物であって、配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列はＴＩＲ配列であり、配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列は、前記シグナルペプチドをコードする配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含む、請求項２７～３８のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項40】
前記シグナルペプチドはＰｅｌＢであり、前記軽鎖に前記転写方向に作用可能に連結された前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１８の前記配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２７～３９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項41】
前記軽鎖に前記転写方向に作用可能に連結された前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１８の前記配列を含む、請求項４０に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項42】
配列番号２０のヌクレオチド配列のＴＩＲを含むＤＮＡ構築物であって、配列番号２０の前記ヌクレオチド配列は、前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする配列番号１８の前記ヌクレオチド配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含む、請求項４０又は４１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項43】
前記シグナルペプチドはＰｅｌＢであり、前記重鎖に前記転写方向に作用可能に連結された前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１９の前記配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項２７～４２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項44】
前記重鎖に前記転写方向に作用可能に連結された前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１９の配列を含む、請求項４３に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項45】
配列番号２１のヌクレオチド配列のＴＩＲを含むＤＮＡ構築物であって、配列番号２１の前記ヌクレオチド配列は、前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする配列番号１９の前記ヌクレオチド配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含む、請求項４３又は４４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項46】
配列番号１７の前記配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、好ましくは配列番号１７の配列を含む、請求項２７～４５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項47】
請求項２７～４６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
【請求項48】
細菌宿主細胞、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、最も好ましくはラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を含む染色体を有する大腸菌である、請求項２７～４６のいずれかに記載のＤＮＡ構築物、又は請求項４７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項49】
（ｉ）ＲｈａＢを不活性化する前記ｒｈａＢ遺伝子の前記ヌクレオチド配列における突然変異を含む染色体、又は（ｉｉ）ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列が欠失した染色体のいずれかを含む、請求項４８に記載の宿主細胞。
【請求項50】
大腸菌Ｗ３１１０細胞であり、好ましくはＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列においてフレームシフト突然変異を含む染色体を有する、請求項４８又は４９に記載の宿主細胞。
【請求項51】
ａ．ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異；ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む染色体を有する、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項52】
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項53】
請求項２７～４６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物によって発現されるＲＮＡ。
【請求項54】
請求項４８～５２のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用を含む、セルトリズマブを発現させる方法。
【請求項55】
前記宿主細胞から前記セルトリズマブを回収する段階を更に含み；任意選択的に、前記回収されたセルトリズマブを、好ましくは１つ又は複数のクロマトグラフィ段階によって精製する１つ又は複数の段階を更に含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
請求項５４又は５５に記載の方法によって得られるセルトリズマブ。
【請求項57】
請求項５４又は５５に記載の方法によって得られるセルトリズマブバイオシミラー。
【請求項58】
セルトリズマブバイオシミラー又はその誘導体であって、好ましくは、前記誘導体はポリエチレングリコール部分を含み、より好ましくは、前記誘導体は約４０ｋＤａのポリエチレングリコール部分を含む、薬剤としての使用のための請求項５７に記載のセルトリズマブバイオシミラー又はその誘導体。
【請求項59】
クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎の治療における使用のための、請求項５８に記載のセルトリズマブバイオシミラー。
【請求項60】
前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含み、前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１８及び１９の前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含む、シグナルペプチドを発現させるためのＤＮＡ構築物。
【請求項61】
配列番号１８及び１９の前記ヌクレオチド配列の両方を含む、請求項６０に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項62】
配列番号１８の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項６０に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項63】
配列番号１９の前記ヌクレオチド配列を含む、請求項６０に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項64】
請求項６０～６３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
【請求項65】
好ましくは細菌細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、最も好ましくはラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を含む染色体を有する大腸菌である、請求項６０～６３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、又は請求項６４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項66】
（ｉ）ＲｈａＢを不活性化する前記ｒｈａＢ遺伝子の前記ヌクレオチド配列における突然変異を含む染色体、又は（ｉｉ）ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列が欠失した染色体のいずれかを含む、請求項６５に記載の宿主細胞。
【請求項67】
大腸菌Ｗ３１１０であり、好ましくはＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列においてフレームシフト突然変異を含む染色体を有する、請求項６５又は６６に記載の宿主細胞。
【請求項68】
ａ．ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異；ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む染色体を有する、請求項６５～６７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項69】
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、請求項６５～６８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項70】
請求項６０～６３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物によって発現されるＲＮＡ。
【請求項71】
請求項６５～６９のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用を含む、シグナルペプチドを発現させる方法。
【請求項72】
配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項７１に記載の方法によって得られるＰｅｌＢシグナルペプチド。
【請求項73】
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、前記アミノ酸配列は：ｄ．セルトリズマブについての前記アミノ酸配列；
ｅ．セルトリズマブの軽鎖アミノ酸配列のＮ末端に融合した配列番号７のアミノ酸配列の第１のシグナルペプチド；及び
ｆ．セルトリズマブの重鎖アミノ酸配列のＮ末端に融合した配列番号７のアミノ酸配列の第２のシグナルペプチド
を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項74】
前記第１のシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１８のヌクレオチド配列を含む、請求項７３に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項75】
前記第２のシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、請求項７３に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項76】
請求項７３～７５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
【請求項77】
好ましくは細菌細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、最も好ましくはラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を含む染色体を有する大腸菌である、請求項７３～７５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、又は請求項７６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項78】
（ｉ）ＲｈａＢを不活性化する前記ｒｈａＢ遺伝子の前記ヌクレオチド配列における突然変異を含む染色体、又は（ｉｉ）ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列が欠失した染色体のいずれかを含む、請求項７７に記載の宿主細胞。
【請求項79】
大腸菌Ｗ３１１０であり、好ましくはＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列においてフレームシフト突然変異を含む染色体を有する、請求項７７又は７８に記載の宿主細胞。
【請求項80】
ａ．ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異；ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む染色体を有する、請求項７７～７９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項81】
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、請求項７７～８０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項82】
請求項７３～７５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物によって発現されるＲＮＡ。
【請求項83】
請求項７７～８１のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用を含む、組換えタンパク質を発現させる方法。
【請求項84】
前記細菌宿主細胞から前記組換えタンパク質を回収する段階を更に含み；任意選択的に、前記回収された組換えタンパク質を、好ましくは１つ又は複数のクロマトグラフィ段階によって精製する１つ又は複数の段階を更に含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項85】
請求項８３又は８４に記載の方法によって得られるセルトリズマブ。
【請求項86】
請求項８３又は８４による方法によって得られるセルトリズマブバイオシミラー。
【請求項87】
セルトリズマブバイオシミラー又はその誘導体であって、好ましくは、前記誘導体はポリエチレングリコール部分を含み、より好ましくは、前記誘導体は約４０ｋＤａのポリエチレングリコール部分を含む、薬剤としての使用のための、請求項８６に記載のセルトリズマブバイオシミラー又はその誘導体。
【請求項88】
クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎の治療における使用のための、請求項８６又は８７に記載のセルトリズマブバイオシミラー。
【請求項89】
ａ．ラムノース代謝を無効にする、ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列における突然変異；ｂ．（ｉ）ＤｅｇＰプロテアーゼの発現及び／又は（ｉｉ）ＤｅｇＰプロテアーゼの活性を無効にする、前記ｄｅｇＰ遺伝子における突然変異；
ｃ．Ｐｒｃプロテアーゼの発現及び／又はＰｒｃプロテアーゼの活性を無効にする、ｐｒｃ遺伝子における突然変異；及び
ｄ．前記ｓｐｒ遺伝子における突然変異
を含む染色体を特徴とする、組換えタンパク質の発現のために好適な宿主細胞。
【請求項90】
突然変異は、フレームシフト、欠失、置換及び挿入からなる群から選択される、請求項８９に記載の宿主細胞。
【請求項91】
ラムノース代謝を無効にする、ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列における前記突然変異は、ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異である、請求項８９又は９０に記載の宿主細胞。
【請求項92】
前記ｄｅｇＰ遺伝子における前記突然変異はｄｅｇＰ欠失である、請求項８９～９１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項93】
前記ｐｒｃ遺伝子における前記突然変異はｐｒｃ欠失である、請求項８９～９２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項94】
前記ｓｐｒ遺伝子における上記突然変異は、１４８位のトリプトファンがアルギニンに変化することをもたらす前記ｓｐｒ遺伝子における置換を特徴とするｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異である、請求項８９～９３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項95】
ａ．ラムノース代謝を無効にする、ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列における突然変異は、ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異である；ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む、請求項８９～９４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項96】
前記宿主細胞は、細菌細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、最も好ましくは大腸菌Ｗ３１１０である、請求項８９～９５のいずれか一項に記載の宿主。
【請求項97】
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、請求項８９～９６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項98】
前記宿主細胞は組換えタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を用いて形質転換され、前記組換えタンパク質は好ましくは抗体であり、前記抗体は最も好ましくはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体又は前記抗体のフラグメントである、請求項８９～９７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
【請求項99】
組換えタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を用いて、請求項８９～９８のいずれか一項に記載の宿主細胞を形質転換させる；得られた形質転換された宿主細胞をラムノースに曝露し、それにより前記組換えタンパク質の発現を誘導する；及び
前記宿主細胞から前記組換えタンパク質を回収する
段階を有し、任意選択的に、前記回収された組換えタンパク質を、好ましくは１つ又は複数のクロマトグラフィ段階によって精製する１つ又は複数の段階を更に有する、組換えタンパク質を発現させる方法。
【請求項100】
前記組換えタンパク質は抗体であり、前記抗体は好ましくはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体又は前記抗体のフラグメントであり、より好ましくはＦａｂ'フラグメントであり、最も好ましくはセルトリズマブである、請求項９９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細菌宿主細胞内で組換えタンパク質を発現させるために好適なＤＮＡ構築物に関する。本発明は更に、ＤＮＡ構築物を含むベクター及び細菌宿主細胞、並びに、上記細菌宿主細胞をラムノースに曝露すること、及び、それにより上記組換えタンパク質の発現を誘導することによって、上記組換えタンパク質を産生する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ラムノースの代謝には、Ｌ－ラムノースが透過酵素ＲｈａＴを介して細胞に取り込まれ、次にＬ－ラムノースイソメラーゼ（ＲｈａＡ）によってＬ－ラムヌロースに異性化され、Ｌ－ラムヌロースが次にラムヌロキナーゼ（ＲｈａＢ）によって更にリン酸化され、最終的にはラムヌロース－１－リン酸アルドラーゼ（ＲｈａＤ）によって加水分解されてジヒドロキシアセトンリン酸及びＬ－ラクトアルデヒドをもたらすことを伴う［１］。ｒｈａＡ、ｒｈａＢ、及びｒｈａＤ遺伝子はｒｈａＢＡＤと称されるオペロンを形成し、ｒｈａＢＡＤプロモーターの助けを得て転写される［１］。他の系と比較すると、ラムノース代謝経路は、以下で説明される通り、ＲｈａＳ及びＲｈａＲとして知られる２つの転写活性化因子が制御のために必要とされるという事実によって区別される［１］。
【0003】
ｒｈａＢＡＤオペロンは、上述のｒｈａＢ、ｒｈａＡ、及びｒｈａＤ遺伝子を、それらのそれぞれの転写開始部位を隔てる約２４０ｂｐのＤＮＡを有するｒｈａＳＲオペロンから分岐して転写する、正に制御された異化オペロンである［１］。ｒｈａＳＲオペロンはＲｈａＳ及びＲｈａＲをコードし、二量体ＲｈａＳ及びＲｈａＲタンパク質の各モノマーは２つのヘリックス－ターン－ヘリックス－モチーフを含み、ＤＮＡの２つの主要な溝に接触する。ＲｈａＲは、ｒｈａＳＲ転写開始部位に対して－３２塩基から－８２塩基にまたがるプロモーターＤＮＡに結合することにより、ｒｈａＳＲの転写を制御する［１］。ｒｈａＳＲ発現に続き、ＲｈａＳは転写開始部位に対して－３２～－８１塩基でｒｈａＢＡＤオペロンの上流のＤＮＡに結合し、ｒｈａＢＡＤ発現を増加させる［１］。更に、ｒｈａＳＲ－ｒｈａＢＡＤ遺伝子間領域は、ｒｈａＢＡＤオペロンの転写開始部位に対して－９２．５位（ＣＲＰ１）にてＣＲＰ結合部位を含み、ｒｈａＳＲオペロンの転写開始部位に対して－９２．５位（ＣＲＰ２）、－１１５．５位（ＣＲＰ３）、及び－１１６．５位（ＣＲＰ４）にてＣＲＰ結合部位を含む［１］。環状ＡＭＰ受容タンパク質（ｃｙｃｌｉｃ ＡＭＰ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＣＲＰ）は、大腸菌内の１００を上回るプロモーターの発現を制御する。
【0004】
ＲｈａＳ、ＲｈａＲ及びｒｈａＢＡＤプロモーターをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物が、当技術分野において知られている。ＵＳ８１３８３２４は、ＲｈａＳ、ＲｈａＲ及びｒｈａＢＡＤプロモーターをコードするＤＮＡ配列を含むｐＴＡＣＯ及びｐＬＥＭＯ由来のプラスミド（すなわち、ＤＮＡ構築物）について開示している。しかしながら、ＵＳ８１３８３２４は、無効化されたラムノース代謝を有する宿主細胞の使用については言及していない。
【0005】
ＲｈａＳ、ＲｈａＲ及びｒｈａＢＡＤプロモーターをコードするＤＮＡ配列を含むｐＲｈａ由来のプラスミドに基づくＤＮＡ構築物はまた、例えばＧｉａｃａｌｏｎｅら［５］又はＨｊｅｌｍら［２］から、当技術分野において知られている。Ｇｉａｃａｌｏｎｅらは、例えばプラスミドｐＲｈａ６７Ａ及びｐＲｈａ１０９Ａについて記載しており、一方でＨｊｅｌｍらはプラスミドｐＲｈａ６７Ｋについて開示している。
【0006】
ＲｈａＳ、ＲｈａＲ及びｒｈａＢＡＤプロモーターをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物は当技術分野において知られているが、とりわけ組換えタンパク質、特にモノクローナル抗体又はそのフラグメントの工業規模での産生には依然として多くの課題がある。主な課題は以下の通りである。
（ｉ）宿主細胞がストレスに晒されており、その結果、膜、タンパク質、及び核酸などの細胞高分子が損傷する；
（ｉｉ）宿主細胞の増殖不良；
（ｉｉｉ）産生された組換えタンパク質の活性不良；及び／又は
（ｉｖ）低収率で組換えタンパク質を得ること。
（ｉ）宿主細胞がストレスに晒されており、その結果、膜、タンパク質、及び核酸などの細胞高分子が損傷する；
（ｉｉ）宿主細胞の増殖不良；
（ｉｉｉ）産生された組換えタンパク質の活性不良；及び／又は
（ｉｖ）低収率で組換えタンパク質を得ること。
【0007】
それ故に、モノクローナル抗体又はそのフラグメントなどの組換えタンパク質の高収率での効率的な産生のために好適な、改良されたＤＮＡ構築物並びに宿主細胞及び方法が必要である。
【0008】
特に、ＴＮＦ－アルファに対する親和性を有する抗腫瘍壊死因子（ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ：ＴＮＦ）モノクローナル抗体の（ＩｇＧ １アイソタイプからの）ヒト化Ｆａｂ'フラグメントであるセルトリズマブの効率的な産生のための改良されたＤＮＡ構築物並びに宿主細胞が必要である。セルトリズマブと約４０ｋＤａのポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）の結合によりセルトリズマブペゴルが得られ、これはＵＣＢによってＣｉｍｚｉａ（登録商標）として市販されている医薬品であり、これはクローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎、及び強直性脊椎炎の治療のために皮下注射により投与される。
【0009】
ＥＰ１２８７１４０及びＵＳ７０１２１３５などの特許は、セルトリズマブの産生のためのＤＮＡ構築物を開示している。しかしながら、未進化の翻訳開始領域（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ：ＴＩＲ）を含み、更に、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を欠いていると思われるこれらのＤＮＡ構築物は、高収率でセルトリズマブを産生するために最適ではない。
【0010】
典型的には、ＥＰ１２８７１４０及びＵＳ７０１２１３５において開示されているものなどの組換え発現ベクターを生成する場合、ＴＩＲは、発現ベクターからの５'ＵＴＲ（すなわち、ＡＴＧ開始コドンの上流の非翻訳領域）をシグナルペプチドのコード配列と融合させることによって形成される。異なるシグナルペプチドが使用されるたびに、異なるＴＩＲが生成される。そのようなＴＩＲは、それらが本発明並びにＵＳ１０６９６９６３及びＷＯ２１１５８１６３において記載されている合成的に進化させたＴＩＲではなくアドホックな遺伝子融合によって形成されたものであることから、未進化と称される。
【0011】
ＵＳ６８２８１２１及びＥＰ１３４１８９９などの特許は、様々なタイプの抗体及びヒト化Ｆａｂ'フラグメントなどの抗体フラグメントを産生するための宿主細胞に関する。これらの宿主細胞によって産生され得る抗体の幾つかの具体例は、抗ＩｇＥ、抗ＩｇＧ、抗Ｈｅｒ－２、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、抗ＣＤ２０、及び抗ＶＥＧＦである。ＵＳ６８２８１２１及びＥＰ１３４１８９９において開示されている宿主細胞の例は、プロテアーゼＤｅｇＰ及びＰｒｃをそれぞれコードする染色体ｄｅｇＰ及びｐｒｃを欠損し、突然変異ｓｐｒ遺伝子を保有する大腸菌株であり、突然変異ｓｐｒ遺伝子の産物は、１４８位のトリプトファンがアルギニンに変化することを特徴とする。しかしながら、ＵＳ６８２８１２１及びＥＰ１３４１８９９はいずれも、（ａ）ラムノースの代謝に関する宿主細胞の突然変異、及び（ｂ）セルトリズマブなどの特定のＦａｂ'フラグメントの産生については言及していない。
【0012】
国際特許出願ＷＯ２１１５８１６３は、組換えタンパク質の産生においてシグナルペプチドの性能を制御するために合成的に進化させたＴＩＲを含むＤＮＡ構築物に関する。ＷＯ２１１５８１６３は、合成的に進化させたＴＩＲが未進化のＴＩＲに対して技術的利点を有することを明確に示している。しかしながら、ＷＯ２１１５８１６３は、セルトリズマブの最適な発現のために特別に開発された合成的に進化させたＴＩＲについては言及していない。
【0013】
ＷＯ２１１５８１６３は更に、Ｐｅｌｂシグナルペプチドの発現のためのヌクレオチド配列に関する。しかしながら、ＷＯ２１１５８１６３は、セルトリズマブの最適な発現のために特別に開発されたヌクレオチド配列については言及していない。
【0014】
それ故に、セルトリズマブなどの組換えタンパク質の発現のために、ＤＮＡ構築物、宿主細胞、ＴＩＲ及びシグナルペプチドを最適化する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0015】
本発明の目的は、ＤＮＡ構築物の有利な技術的効果を提供することである。
【0016】
本発明の更なる目的は、ＴＩＲの有利な技術的効果を提供することである。
【0017】
本発明の更なる目的は、宿主細胞の有利な技術的効果を提供することである。
【0018】
本発明の更なる目的は、シグナルペプチドヌクレオチド配列の有利な技術的効果を提供することである。
【0019】
本発明の更なる目的は、組換えタンパク質の効率的な産生のための有利な方法を提供することである。
【0020】
本発明の目的は、以下で開示される本発明の態様のうちのいずれか１つ又は複数によって達成されてきた。
【0021】
本発明の第１の態様は、宿主細胞内でセルトリズマブを発現させるために好適なＤＮＡ構築物に関し、セルトリズマブは、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖、を備え、上記ＤＮＡ構築物は、セルトリズマブをコードするヌクレオチド配列を有し、上記ＤＮＡ構築物は、セルトリズマブの軽鎖及び／又はセルトリズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列に転写方向において作用可能に連結されたシグナルペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を更に含み、上記ＤＮＡ構築物は、以下をコードするヌクレオチド配列を更に含む：
プロモーター、
ＲｈａＲ転写活性化因子、
ＲｈａＳ転写活性化因子、
抗生物質耐性マーカー、
少なくとも１つのターミネーター、及び
複製起点。
プロモーター、
ＲｈａＲ転写活性化因子、
ＲｈａＳ転写活性化因子、
抗生物質耐性マーカー、
少なくとも１つのターミネーター、及び
複製起点。
【0022】
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は、以下を特徴とする：
プロモーター、
ＲｈａＲ転写活性化因子、
ＲｈａＳ転写活性化因子、
抗生物質耐性マーカー、
抗生物質耐性マーカーをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結されたプロモーター、
少なくとも１つのターミネーター、及び
複製起点。
プロモーター、
ＲｈａＲ転写活性化因子、
ＲｈａＳ転写活性化因子、
抗生物質耐性マーカー、
抗生物質耐性マーカーをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結されたプロモーター、
少なくとも１つのターミネーター、及び
複製起点。
【0023】
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は、以下を特徴とする：
ｒｈａＢＡＤプロモーター、
ＲｈａＲ転写活性化因子、
ＲｈａＳ転写活性化因子、
抗生物質耐性マーカー、
抗生物質耐性マーカーをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結されたプロモーター、
ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーター、
ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーター、及び
ｐＭＢ１複製起点。
ｒｈａＢＡＤプロモーター、
ＲｈａＲ転写活性化因子、
ＲｈａＳ転写活性化因子、
抗生物質耐性マーカー、
抗生物質耐性マーカーをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結されたプロモーター、
ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーター、
ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーター、及び
ｐＭＢ１複製起点。
【0024】
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は以下を特徴とする：
抗生物質耐性マーカーは、カナマイシン耐性マーカーであり、好ましくは、配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むカナマイシン耐性マーカーである；
抗生物質耐性マーカーをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結されたプロモーターは、ＡｍｐＲプロモーターであり、好ましくは、配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＡｍｐＲプロモーターである；
ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターは、配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；
ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターは、配列番号１５のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；及び／又は
ｐＭＢ１複製起点は、配列番号１６のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。
抗生物質耐性マーカーは、カナマイシン耐性マーカーであり、好ましくは、配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むカナマイシン耐性マーカーである；
抗生物質耐性マーカーをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結されたプロモーターは、ＡｍｐＲプロモーターであり、好ましくは、配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＡｍｐＲプロモーターである；
ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターは、配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；
ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターは、配列番号１５のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；及び／又は
ｐＭＢ１複製起点は、配列番号１６のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【0025】
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は以下を特徴とする：
抗生物質耐性マーカーが、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカーであること；
抗生物質耐性マーカーをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結されたプロモーターが、配列番号１３のヌクレオチド配列を含むＡｍｐＲプロモーターであること；
ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターが、配列番号１４のヌクレオチド配列を含むこと；
配列番号１５のヌクレオチド配列を含むｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーター；及び／又は
ｐＭＢ１複製起点が、配列番号１６のヌクレオチド配列を含むこと。
抗生物質耐性マーカーが、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカーであること；
抗生物質耐性マーカーをコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結されたプロモーターが、配列番号１３のヌクレオチド配列を含むＡｍｐＲプロモーターであること；
ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターが、配列番号１４のヌクレオチド配列を含むこと；
配列番号１５のヌクレオチド配列を含むｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーター；及び／又は
ｐＭＢ１複製起点が、配列番号１６のヌクレオチド配列を含むこと。
【0026】
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は以下を特徴とする：
ｒｈａＢＡＤプロモーターは、配列番号８のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；
ＲｈａＲ転写活性化因子は、配列番号９のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；
ＲｈａＳ転写活性化因子は、配列番号１１のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；
抗生物質耐性マーカーは、配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むカナマイシン耐性マーカーである；
ＡｍｐＲプロモーターは、配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；
ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターは、配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；
ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターは、配列番号１５のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；及び
ｐＭＢ１複製起点は、配列番号１６のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。
ｒｈａＢＡＤプロモーターは、配列番号８のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；
ＲｈａＲ転写活性化因子は、配列番号９のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；
ＲｈａＳ転写活性化因子は、配列番号１１のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；
抗生物質耐性マーカーは、配列番号１２のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むカナマイシン耐性マーカーである；
ＡｍｐＲプロモーターは、配列番号１３のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；
ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターは、配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；
ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターは、配列番号１５のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；及び
ｐＭＢ１複製起点は、配列番号１６のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【0027】
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は以下を特徴とする：
ｒｈａＢＡＤプロモーターは、配列番号８のヌクレオチド配列を含む；
ＲｈａＲ転写活性化因子は、配列番号９のヌクレオチド配列を含む；
ＲｈａＳ転写活性化因子は、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む；
抗生物質耐性マーカーは、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカーである；
ＡｍｐＲプロモーターは、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む；
ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む；
ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターは、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む；及び
ｐＭＢ１複製起点は、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。
ｒｈａＢＡＤプロモーターは、配列番号８のヌクレオチド配列を含む；
ＲｈａＲ転写活性化因子は、配列番号９のヌクレオチド配列を含む；
ＲｈａＳ転写活性化因子は、配列番号１１のヌクレオチド配列を含む；
抗生物質耐性マーカーは、配列番号１２のヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカーである；
ＡｍｐＲプロモーターは、配列番号１３のヌクレオチド配列を含む；
ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターは、配列番号１４のヌクレオチド配列を含む；
ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターは、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む；及び
ｐＭＢ１複製起点は、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。
【0028】
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は、ＥｃｏＲＩ、ＮｄｅＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＰｓｐＸＩ、ＰａｅＲ７１、ＢｂｓＩ、ＳｔｙＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＫｐｎＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＳａｃＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＰｓｔＩ、ＳｂｆＩ、ＳｐｈＩ及び／又はＨｉｎｄＩＩＩなどの制限酵素によって切断可能な１つ又は複数の制限部位を含み得る。
【0029】
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は、ｒｈａＢＡＤプロモーターに作用可能に連結された上記組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を更に含み、ここで上記組換えタンパク質は、モノクローナル抗体又はそのフラグメントであり、好ましくは、上記組換えタンパク質はセルトリズマブである。より好ましくは、上記組換えタンパク質は、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む軽鎖、及び／又は（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖を有するセルトリズマブである。
【0030】
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は、（ｉ）配列番号５の配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むセルトリズマブの軽鎖をコードするヌクレオチド配列、及び／又は（ｉｉ）配列番号６の配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むセルトリズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列、を有するｒｈａＢＡＤプロモーターに作用可能に連結された組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み；好ましくは、上記ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号５の配列を含むセルトリズマブの軽鎖をコードするヌクレオチド配列、及び／又は（ｉｉ）配列番号６の配列を含むセルトリズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列、を備える組換えタンパク質をコードする。
【0031】
実施形態において、ＤＮＡ構築物は、配列番号５及び配列番号６のヌクレオチド配列のうちのいずれか一方又は両方に転写方向において作用可能に連結されたシグナルペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むｒｈａＢＡＤプロモーターに作用可能に連結された組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を更に含み、好ましくは、シグナルペプチドはＰｅｌＢ（ペクチン酸リアーゼＢ）シグナルペプチドである。
【0032】
セルトリズマブの軽鎖のヌクレオチド配列に転写方向に作用可能に連結されたＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、本発明においてＰｅｌＢ１と称される。ＰｅｌＢ１のヌクレオチド配列は、配列番号１８の配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【0033】
セルトリズマブの重鎖のヌクレオチド配列に転写方向に作用可能に連結されたＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、本発明においてＰｅｌＢ２と称される。ＰｅｌＢ２のヌクレオチド配列は、配列番号１９の配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【0034】
得られたＰｅｌＢシグナルペプチドは、配列番号７［６］：ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡのアミノ酸配列を含む。
【0035】
実施形態において、ＤＮＡ構築物は、配列番号２０のヌクレオチド配列を有するＴＩＲを含み、配列番号２０の上記配列は、ＰｅｌＢ１のヌクレオチド配列の少なくとも最初の９ヌクレオチド、すなわち配列番号１８の最初の９ヌクレオチドを含む。この特定のＴＩＲは、本発明においてＴＩＲ－ＬＣとも称される。
【0036】
実施形態において、ＤＮＡ構築物は、配列番号２１の配列を有するＴＩＲを含み、配列番号２１の上記配列は、ＰｅｌＢ２のヌクレオチド配列の少なくとも最初の９ヌクレオチド、すなわち配列番号１９の最初の９ヌクレオチドを含む。この特定のＴＩＲは、本発明においてＴＩＲ－ＨＣとも称される。
【0037】
好ましい実施形態において、ＤＮＡ構築物は、配列番号１７の配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、好ましくは配列番号１７の配列を含む。
【0038】
本発明の第２の態様は、組換えタンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物に関し、ここでＤＮＡ構築物は、以下を備える：
配列番号Ｎｏ．２０及び２１のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つ、ここで配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列はＴＩＲ配列である；及び
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ここで配列番号Ｎｏ．２０及び２１のヌクレオチド配列は、上記シグナルペプチドをコードする配列のうちの少なくとも最初の９ヌクレオチドを含む。
配列番号Ｎｏ．２０及び２１のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つ、ここで配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列はＴＩＲ配列である；及び
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ここで配列番号Ｎｏ．２０及び２１のヌクレオチド配列は、上記シグナルペプチドをコードする配列のうちの少なくとも最初の９ヌクレオチドを含む。
【0039】
実施形態において、ＤＮＡ構築物は、配列番号２０のヌクレオチド配列を有するＴＩＲを含み、配列番号２０の上記配列は、ＰｅｌＢ１のヌクレオチド配列の少なくとも最初の９ヌクレオチド、すなわち配列番号１８の最初の９ヌクレオチドを含む。この特定のＴＩＲは、本発明においてＴＩＲ－ＬＣとも称される。
【0040】
実施形態において、ＤＮＡ構築物は、配列番号２１の配列を有するＴＩＲを含み、配列番号２１の上記配列は、ＰｅｌＢ２のヌクレオチド配列の少なくとも最初の９ヌクレオチド、すなわち配列番号１９の最初の９ヌクレオチドを含む。この特定のＴＩＲは、本発明においてＴＩＲ－ＨＣとも称される。
【0041】
実施形態において、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、以下に作用可能に連結される：
抗体の軽鎖をコードする第１のヌクレオチド配列；及び／又は
抗体の重鎖をコードする第２のヌクレオチド配列。
抗体の軽鎖をコードする第１のヌクレオチド配列；及び／又は
抗体の重鎖をコードする第２のヌクレオチド配列。
【0042】
実施形態において、ＤＮＡ構築物はシャイン・ダルガーノ配列を含む。シャイン・ダルガーノ配列は、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列のＡＴＧ開始コドンより上流に位置する。実施形態において、上記シャイン・ダルガーノ配列は、抗体の軽鎖及び／又は重鎖に作用可能に連結されたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列のＡＴＧ開始コドンより上流に位置する。実施形態において、上記シャイン・ダルガーノ配列は、転写方向におけるヌクレオチド配列ＡＧＧＡＧＧＡＡ及び／又はＧＡＧＧＡＧＡＡを含む。好ましくは、ＡＧＧＡＧＧＡＡは、抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列の上流にある。好ましくは、ＧＡＧＧＡＧＡＡは、抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列の上流にある。より好ましくは、ＡＧＧＡＧＧＡＡは、ＴＩＲ－ＬＣの上流にある。より好ましくは、ＧＡＧＧＡＧＡＡは、ＴＩＲ－ＨＣの上流にある。
【0043】
実施形態において、シグナルペプチド（例えば、ＰｅｌＢ１）をコードする第１のヌクレオチド配列は、抗体の軽鎖をコードする第１のヌクレオチド配列に作用可能に連結される。
【0044】
実施形態において、シグナルペプチド（例えば、ＰｅｌＢ２）をコードする第２のヌクレオチド配列は、抗体の重鎖をコードする第２のヌクレオチド配列に作用可能に連結される。
【0045】
実施形態において、抗体の軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする第１及び第２のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．３及び配列番号Ｎｏ．４のアミノ酸配列をそれぞれコードする。
【0046】
実施形態において、抗体の軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする第１及び第２のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．５及び配列番号Ｎｏ．６のヌクレオチド配列をそれぞれ含む。
【0047】
本発明の第３の態様は、シグナルペプチドを発現させるためのＤＮＡ構築物に関し、上記ＤＮＡ構築物は、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、上記該ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．１８及び１９の前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含む。実施形態において、ＤＮＡ構築物は、ヌクレオチド配列の配列番号Ｎｏ．１８及び１９の両方を含む。
【0048】
本発明の第４の態様は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有するＤＮＡ構築物に関し、アミノ酸配列は以下を含む：
ａ．セルトリズマブについてのアミノ酸配列
ｂ．セルトリズマブの軽鎖アミノ酸配列のＮ末端に融合した配列番号Ｎｏ．７のアミノ酸配列の第１のシグナルペプチド；及び
ｃ．セルトリズマブの重鎖アミノ酸配列のＮ末端に融合した配列番号Ｎｏ．７のアミノ酸配列の第２のシグナルペプチド。
ａ．セルトリズマブについてのアミノ酸配列
ｂ．セルトリズマブの軽鎖アミノ酸配列のＮ末端に融合した配列番号Ｎｏ．７のアミノ酸配列の第１のシグナルペプチド；及び
ｃ．セルトリズマブの重鎖アミノ酸配列のＮ末端に融合した配列番号Ｎｏ．７のアミノ酸配列の第２のシグナルペプチド。
【0049】
実施形態において、上記第１及び第２のシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号Ｎｏ．１８及び１９のヌクレオチド配列を含む。
【0050】
本発明の第５の態様は、本発明の第１、第２、第３及び／又は第４の態様によるＤＮＡ構築物のいずれかを含む発現ベクターに関する。
【0051】
本発明の第６の態様は、以下を含む染色体を特徴とする宿主細胞に関する：
ａ．ラムノース代謝を無効にする、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列における突然変異；
ｂ．（ｉ）ＤｅｇＰプロテアーゼの発現及び／又は（ｉｉ）ＤｅｇＰプロテアーゼの活性を無効にする、ｄｅｇＰ遺伝子における突然変異；
ｃ．Ｐｒｃプロテアーゼの発現及び／又はＰｒｃプロテアーゼの活性を無効にする、ｐｒｃ遺伝子における突然変異；及び
ｄ．ｓｐｒ遺伝子における突然変異。
ａ．ラムノース代謝を無効にする、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列における突然変異；
ｂ．（ｉ）ＤｅｇＰプロテアーゼの発現及び／又は（ｉｉ）ＤｅｇＰプロテアーゼの活性を無効にする、ｄｅｇＰ遺伝子における突然変異；
ｃ．Ｐｒｃプロテアーゼの発現及び／又はＰｒｃプロテアーゼの活性を無効にする、ｐｒｃ遺伝子における突然変異；及び
ｄ．ｓｐｒ遺伝子における突然変異。
【0052】
実施形態において、突然変異は、フレームシフト、欠失、置換及び挿入からなる群から選択される。
【0053】
実施形態において、ラムノース代謝を無効にする、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列における上記突然変異は、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異である。
【0054】
実施形態において、ｄｅｇＰ遺伝子における上記突然変異は、ｄｅｇＰ欠失である。
【0055】
実施形態において、ｐｒｃ遺伝子における上記突然変異は、ｐｒｃ欠失である。
【0056】
実施形態において、ｓｐｒ遺伝子における上記突然変異は、１４８位のトリプトファンがアルギニンに変化することをもたらすｓｐｒ遺伝子における置換を特徴とするｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異である。
【0057】
実施形態において、上記宿主細胞は、以下を含む染色体を特徴とする：
ａ．ラムノース代謝を無効にする、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列における突然変異；
ｂ．ＤｅｇＰプロテアーゼの発現を無効にする、ｄｅｇＰ遺伝子における突然変異；
ｃ．Ｐｒｃプロテアーゼの発現を無効にする、ｐｒｃ遺伝子における突然変異；及び
ｄ．ｓｐｒ遺伝子における突然変異。
ａ．ラムノース代謝を無効にする、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列における突然変異；
ｂ．ＤｅｇＰプロテアーゼの発現を無効にする、ｄｅｇＰ遺伝子における突然変異；
ｃ．Ｐｒｃプロテアーゼの発現を無効にする、ｐｒｃ遺伝子における突然変異；及び
ｄ．ｓｐｒ遺伝子における突然変異。
【0058】
実施形態において、上記宿主細胞は細菌細胞であり、より好ましくは大腸菌であり、最も好ましくは大腸菌Ｗ３１１０である。
【0059】
実施形態において、上記宿主細胞は、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列においてフレームシフト突然変異を含む染色体を有する大腸菌Ｗ３１１０である。この特定の宿主細胞は、本発明において大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓ並びにＸＢ１７と称される。
【0060】
実施形態において、上記宿主細胞は、ｄｅｇＰ欠失を含む染色体を更に有する大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓである。この特定の宿主細胞は、本発明において大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰ並びにＸＢ８３と称される。
【0061】
実施形態において、上記宿主細胞は、ｐｒｃ欠失を含む染色体を更に有する大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰである。この特定の宿主細胞は、本発明において大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔｄｅｇＰΔｐｒｃ並びにＸＢ１５２と称される。
【0062】
実施形態において、上記宿主細胞は、ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異を含む染色体を更に有する大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔｄｅｇＰΔｐｒｃである。この特定の宿主細胞は、本発明において大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒ並びにＸＢ１６６と称される。
【0063】
本発明の第７の態様は、本発明の第１、第２、第３及び／又は第４の態様によるＤＮＡ構築物を含む、本発明の第６の態様による宿主細胞に関する。
【0064】
本発明の第８の態様は、本発明の第７の態様による宿主細胞をラムノースに曝露し、それにより上記組換えタンパク質の発現を誘導する段階を含む、組換えタンパク質を産生する方法に関する。好ましい実施形態において、本方法は、細菌宿主細胞から組換えタンパク質を回収する段階を更に含み；且つ任意選択的に、回収された組換えタンパク質を、好ましくは１つ又は複数のクロマトグラフィ段階によって精製する１つ又は複数の段階を更に含む。
【0065】
本発明の第９の態様は、本発明の第１、第２、第３及び／又は第４の態様によるＤＮＡ構築物を、本発明の第６の態様による宿主細胞に導入する段階を含む、組換えタンパク質を産生する方法に関する。
【0066】
実施形態において、本方法は、宿主細胞をラムノースに曝露し、それにより組換えタンパク質の発現を誘導する段階を更に含む。
【0067】
実施形態において、本方法は、宿主細胞から組換えタンパク質を回収する段階を更に含み；且つ任意選択的に、回収された組換えタンパク質を、好ましくは１つ又は複数のクロマトグラフィ段階によって精製する１つ又は複数の段階を更に含む。
【0068】
実施形態において、本方法は、精製された組換えタンパク質を、好ましくはポリエチレングリコール部分で、より好ましくは約４０ｋＤａのポリエチレングリコール部分で誘導体化する段階を更に含む。
【0069】
本発明の第１０の態様は、本発明の第９の態様による方法によって得られる組換えタンパク質に関する。組換えタンパク質は、好ましくは抗体又はそのフラグメントであり、より好ましくはＦａｂ'フラグメント抗体であり、最も好ましくはセルトリズマブである。
【0070】
本発明の第１１の態様は、本発明の第９の態様による方法によって得られるセルトリズマブバイオシミラーに関する。好ましくは、セルトリズマブバイオシミラーは、約４０ｋＤａのポリエチレングリコール部分などのポリエチレングリコール部分を含む。セルトリズマブバイオシミラーは、セルトリズマブバイオシミラーの分子構造を十分に保護するため、ここではプロダクト・バイ・プロセスとして開示される。バイオシミラーは参照製剤の高度な類似体であり、すなわち、セルトリズマブバイオシミラーは、参照製剤スポンサーによって産生されるセルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））と高度に類似した分子構造及び生理活性を有する。更に、バイオシミラーは参照製剤との臨床的に意味のある差異を有せず、バイオシミラーに対して行われる臨床試験は薬物動態及び免疫原性を査定する。それにも関わらず、本発明によるセルトリズマブバイオシミラー及び参照製剤スポンサーのセルトリズマブペゴルの間の小さな構造的差異は、部分的に、本発明の第９の態様（並びに本発明の第８の態様）による方法に起因するであろう。
【0071】
本発明の第１２の態様は、薬剤としての使用のための、好ましくはクローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎の治療における使用のための、セルトリズマブバイオシミラー又はその誘導体に関する。上記誘導体は、好ましくは、約４０ｋＤａのポリエチレングリコール部分などのポリエチレングリコール部分を含む。本発明の実施形態は、セルトリズマブバイオシミラーを用いることにより疾患を治療する方法に関する。当該疾患は、クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎であり得る。発明の第１３の態様は、本発明の第１、第２、第３及び／又は第４の態様によるＤＮＡ構築物を、本発明の第６の態様による宿主細胞に導入する段階を含む、シグナルペプチドを産生する方法に関する。
【0072】
本発明の様々な態様（及びその実施形態）の上記で示された配列番号１～２１のうちの１つ又は複数は、幾つかの実施形態において、それに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列によって置換され得る。本明細書において使用される場合、「配列同一性」という用語は、アミノ酸又はヌクレオチド配列に関して使用され、配列同一性は指定された配列の全長にわたる。従って、配列は、指定されたアミノ酸又はヌクレオチド配列と、配列において少なくとも９０パーセント、少なくとも９２パーセント、少なくとも９５パーセント、少なくとも９６パーセント、少なくとも９７パーセント、少なくとも９８パーセント、又は少なくとも９９パーセント同一であり得る。従って、本発明のそのような配列は、本発明の配列に対する単一又は複数のヌクレオチド又はアミノ酸の改変（付加、置換、挿入又は欠失）を含む。アミノ酸レベルでの上記で定義された配列同一性を有する好ましい配列は、本発明の配列において、最大５個、例えば１、２、３、４又は５個、好ましくは１、２又は３個、より好ましくは１又は２個の改変されたアミノ酸のみを含む。
【図面の簡単な説明】
【0073】
【図1】ＫＴＸＨＩＳについてのプラスミドマップ
【図2】ＫＴＸＨＩＳのマルチクローニング部位（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ：ＭＣＳ）のヌクレオチド配列
【図3】ＫＴＸＨＩＳ－Ｃｅｒｔ－ＰｅｌＢ１－ＬＣ－ＰｅｌＢ２－ＨＣのプラスミドマップ
【図4】ＴＩＲライブラリ選択及びそこからの進化したＴＩＲの単離の例
【図5】培地画分のウェスタンブロット解析
【図6】総画分のウェスタンブロット解析
【図7】発現系ＸＢ６２（未進化のＴＩＲを有する発現ベクターＤ３７を含むＸＢ１７宿主細胞）及びＸＢ１０２（セルトリズマブ重鎖発現の制御のために合成的に進化させたＴＩＲを有する発現ベクターＥ８３を含むＸＢ１７宿主細胞）の間の収率及び力価の差異を検出するために実施されたＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）及びＡＫＴＡクロマトグラフィ
【0074】
【図8】ペリプラズム抽出及びその後のアフィニティＨＰＬＣを通じた、ＸＢ１６６宿主細胞において発現したＥ８３ベクターに対するＸＢ１７宿主細胞において発現したＥ８３発現ベクターの比較発現解析
【図9】ペリプラズム抽出及びその後のアフィニティＨＰＬＣを通じた、ＸＢ１６６宿主細胞において発現したＥ１１１ベクターに対するＸＢ１６６宿主細胞において発現したＥ８３発現ベクターの比較発現解析
【発明を実施するための形態】
【0075】
本発明の特定の実施形態は、抗体の発現のためのＤＮＡ構築物に関し、ここで上記ＤＮＡ構築物は、配列番号２０の改良されたＴＩＲを含む：
ＴＴＧＣＴＣＡＴＧＡＡＧＴＡＴ.
ＴＴＧＣＴＣＡＴＧＡＡＧＴＡＴ.
【0076】
別の特定の実施形態は、抗体の発現のためのＤＮＡ構築物に関し、ここで上記ＤＮＡ構築物は、配列番号２１の改良されたＴＩＲを含む：
ＴＧＴＴＡＡＡＴＧＡＡＧＴＡＴ.
ＴＧＴＴＡＡＡＴＧＡＡＧＴＡＴ.
【0077】
配列番号２０及び２１のＴＩＲは、同じＤＮＡ構築物中に含まれ得る。そのような実施形態の例は、配列番号２０のＴＩＲが抗体又はそのフラグメント（セルトリズマブなど）の軽鎖を発現するヌクレオチド配列の上流にあり、一方、配列番号２１のＴＩＲが抗体又はそのフラグメント（セルトリズマブなど）の重鎖を発現するヌクレオチド配列の上流にあることである。
【0078】
本発明の特定の実施形態は、抗体の鎖をコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結されたＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする配列番号１８の改良されたヌクレオチド配列に関する：
ＡＴＧＡＡＧＴＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＡ.
ＡＴＧＡＡＧＴＡＴＣＴＴＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＡ.
【0079】
別の特定の実施形態は、抗体の鎖をコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結されたＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする配列番号１９の改良されたヌクレオチド配列に関する：
ＡＴＧＡＡＧＴＡＴＣＴＧＴＴＧＣＣＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＡＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＧ.
ＡＴＧＡＡＧＴＡＴＣＴＧＴＴＧＣＣＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＡＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＧ.
【0080】
配列番号１８及び１９のＰｅｌＢヌクレオチド配列は、同じＤＮＡ構築物中に含まれ得る。そのようなＤＮＡ構築物の例は、配列番号１８のＰｅｌＢヌクレオチド配列が抗体又はそのフラグメント（セルトリズマブなど）の軽鎖をコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結され、一方、配列番号１９のＰｅｌＢヌクレオチド配列が抗体又はそのフラグメント（セルトリズマブなど）の重鎖をコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結される場合である。
【0081】
更に他の特定の実施形態において、配列番号１８～２１の上記配列は、同じＤＮＡ構築物中に含まれ得る。そのような実施形態において、配列番号Ｎｏ．２０及び２１のＴＩＲヌクレオチド配列は、配列番号１８及び１９のシグナルペプチドヌクレオチド配列の少なくとも最初の９ヌクレオチドを含むことになる。
【0082】
本発明の他の特定の実施形態は、セルトリズマブなどの組換えタンパク質のＬ－ラムノースｒｈａＢＡＤプロモーターベースの産生を制御することに関し得る。換言すれば、セルトリズマブは、以下により産生され得る：
ａ．セルトリズマブをコードするヌクレオチド配列を、当該ヌクレオチド配列がｒｈａＢＡＤプロモーターに作用可能に連結されるようＤＮＡ構築物にクローニングすること、及び
ｂ．得られたヌクレオチド配列を、ラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を含む染色体を有する細菌宿主細胞に導入すること。
ａ．セルトリズマブをコードするヌクレオチド配列を、当該ヌクレオチド配列がｒｈａＢＡＤプロモーターに作用可能に連結されるようＤＮＡ構築物にクローニングすること、及び
ｂ．得られたヌクレオチド配列を、ラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を含む染色体を有する細菌宿主細胞に導入すること。
【0083】
実施形態において、ｒｈａＢＡＤプロモーターのヌクレオチド配列は、配列番号８の配列を含む（当該配列は図１及び３において「ｒｈａＢＡＤ」と称される）：
ＣＡＣＣＡＣＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＴＴＣＡＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＧＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＣＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＧＡＡＧＧＴＣＧＣＧＡＡＴＣＣＡＧＧＣＧＣＴＴＴＴＴＡＧＡＣＴＧＧＴＣＧＴＡ.
ＣＡＣＣＡＣＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＣＧＴＴＣＡＴＣＴＴＴＣＣＣＴＧＧＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧＣＣＣＡＴＴＴＴＣＴＴＧＴＣＡＧＴＡＡＣＧＡＧＡＡＧＧＴＣＧＣＧＡＡＴＣＣＡＧＧＣＧＣＴＴＴＴＴＡＧＡＣＴＧＧＴＣＧＴＡ.
【0084】
ＤＮＡ構築物は、ＲｈａＲ転写活性化因子をコードするヌクレオチド配列を含み得る。本発明の実施形態において、ＲｈａＲ転写活性化因子のヌクレオチド配列は、配列番号９の配列を含む（当該配列は、図１及び図３において「ｒｈａＲ」と称される）：
ＡＴＧＧＣＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＡＡＣＧＣＧＡＡＴＣＴＴＣＴＣＡＡＣＧＴＡＴＴＴＧＴＡＣＧＣＣＡＴＡＴＴＧＣＧＡＡＴＡＡＴＣＡＡＣＴＴＣＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＡＧＣＣＡＣＧＧＴＧＧＣＧＣＡＴＣＡＧＴＴＡＡＡＡＣＴＴＣＴＣＡＡＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＧＣＣＡＧＣＧＡＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＴＣＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣＣＧＴＴＡＴＣＣＧＣＡＡＧＡＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＧＡＡＣＡＴＡＣＡＣＡＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＧＣＴＧＧＴＧＡＴＴＧＴＣＴＧＧＣＧＣＧＧＴＡＡＴＧＧＣＣＴＧＣＡＴＧＴＡＣＴＣＡＡＣＧＡＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＣＧＣＡＴＴＡＣＣＣＧＴＧＧＣＧＡＴＣＴＣＴＴＴＴＡＣＡＴＴＣＡＴＧＣＴＧＡＴＧＡＴＡＡＡＣＡＣＴＣＣＴＡＣＧＣＴＴＣＣＧＴＴＡＡＣＧＡＴＣＴＧＧＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＧＣＣＣＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＴＣＴＴＧＡＣＴＧＧＣＡＧＧＧＧＧＣＧＡＴＴＣＣＧＧＧＡＴＴＴＡＡＣＧＣＣＡＧＣＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＣＡＣＡＣＴＧＧＣＧＣＴＴＡＧＧＴＡＧＣＡＴＧＧＧＧＡＴＧＧＣＧＣＡＧＧＣＧＣＧＧＣＡＧＧＴＴＡＴＴＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＧＡＡＡＧＴＡＧＴＣＡＧＣＡＴＧＴＧＣＣＧＴＴＴＧＣＴＡＡＣＧＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＧＴＴＧＣＴＧＴＴＣＧＧＧＣＡＧＴＴＧＧＴＧＡＴＧＴＴＧＣＴＧＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＧＴＴＡＣＡＣＣＡＧＴＧＡＴＴＣＧＴＴＧＣＣＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＧＣＧＡＡＡＣＧＴＴＧＣＴＧＧＡＴＡＡＧＣＴＧＡＴＴＡＣＣＣＧＧＣＴＧＧＣＧＧＣＴＡＧＣＣＴＧＡＡＡＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＣＧＣＴＧＧＡＴＡＡＡＴＴＴＴＧＴＧＡＴＧＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧＴＴＴＴＧＣＧＴＣＡＧＣＡＡＴＴＴＣＧＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＡＴＧＡＣＣＡＴＣＡＡＴＣＡＡＴＡＴＣＴＧＣＧＡＣＡＧＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＧＴＣＡＴＧＣＧＣＡＡＴＡＴＣＴＴＣＴＣＣＡＧＣＡＴＡＧＣＣＧＣＣＴＧＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＴＴＴＣＧＡＣＣＧＡＡＴＧＴＧＧＣＴＴＴＧＡＡＧＡＴＡＧＴＡＡＣＴＡＴＴＴＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＡＣＣＣＧＧＧＡＡＡＣＣＧＧＧＡＴＧＡＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＧＴＧＧＣＧＴＣＡＴＣＴＣＡＡＴＴＣＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴ.
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【0085】
ＤＮＡ構築物は、終止コドンが欠落しているためにＲｈａＲとインフレームであるＲｈａＲ転写活性化因子の伸長部分をコードするヌクレオチド配列を更に含み得る。本発明の実施形態において、ＲｈａＲ転写活性化因子の伸長部分のヌクレオチド配列は、配列番号１０の配列を含む（当該配列は、図１及び図３において「伸長されたｒｈａＲ」と称される）：
ＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＣＣＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＧ.
ＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＣＣＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＧ.
【0086】
ＤＮＡ構築物は、ＲｈａＳ転写活性化因子をコードするヌクレオチド配列を含み得る。本発明の実施形態において、ＲｈａＳ転写活性化因子のヌクレオチド配列は、配列番号１１の配列を含む（当該配列は、図１及び図３において「ｒｈａＳ」と称される）：
ＡＴＧＡＣＣＧＴＡＴＴＡＣＡＴＡＧＴＧＴＧＧＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＧＴＣＴＧＧＴＡＡＣＧＣＧＴＣＣＧＴＧＧＣＧＡＴＡＧＡＡＣＣＣＣＧＧＣＴＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＡＴＴＴＴＣＡＴＧＡＡＡＴＴＧＴＧＡＴＴＧＴＣＧＡＡＣＡＴＧＧＣＡＣＧＧＧＴＡＴＴＣＡＴＧＴＧＴＴＴＡＡＴＧＧＧＣＡＧＣＣＣＴＡＴＡＣＣＡＴＣＡＣＣＧＧＴＧＧＣＡＣＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＧＴＡＣＧＣＧＡＴＣＡＴＧＡＴＣＧＧＣＡＴＣＴＧＴＡＴＧＡＡＣＡＴＡＣＣＧＡＴＡＡＴＣＴＧＴＧＴＣＴＧＡＣＣＡＡＴＧＴＧＣＴＧＴＡＴＣＧＣＴＣＧＣＣＧＧＡＴＣＧＡＴＴＴＣＡＧＴＴＴＣＴＣＧＣＣＧＧＧＣＴＧＡＡＴＣＡＧＴＴＧＣＴＧＣＣＡＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＡＧＴＡＴＣＣＧＴＣＴＣＡＣＴＧＧＣＧＣＧＴＴＡＡＣＣＡＣＡＧＣＧＴＡＴＴＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＴＴＧＣＡＣＡＧＡＴＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＧＡＡＧＧＧＧＡＡＡＡＴＧＡＴＴＴＡＣＣＣＴＣＧＡＣＣＧＣＣＡＧＴＣＧＣＧＡＧＡＴＣＴＴＧＴＴＴＡＴＧＣＡＡＴＴＡＣＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＧＣＧＴＡＡＡＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＧＣＡＴＣＡＣＧＴＣＴＣＡＡＣＴＴＧＣＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＴＧＡＧＧＴＧＡＡＴＴＧＧＧＡＴＧＣＣＧＴＧＧＣＧＧＡＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＡＣＴＧＣＧＴＡＣＧＣＴＡＣＡＴＣＧＧＣＡＧＣＴＴＡＡＧＣＡＧＣＡＡＡＣＧＧＧＡＣＴＧＡＣＧＣＣＴＣＡＧＣＧＡＴＡＣＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＴＧＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＡＡＧＣＣＣＧＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＣＧＣＣＡＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＡＧＣＧＴＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＧＴＧＧＡＴＴＣＡＧＣＧＡＣＡＧＴＡＡＣＣＡＣＴＴＴＴＣＧＡＣＧＣＴＴＴＴＴＣＧＣＣＧＡＧＡＧＴＴＴＡＡＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＣＧＴＧＡＴＡＴＴＣＧＣＣＡＧＧＧＡＣＧＧＧＡＴＧＧＣＴＴＴＣＴＧＣＡＡＴＡＡ.
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【0087】
ＤＮＡ構築物は、「抗生物質耐性マーカー」又は「選択マーカー」をコードするヌクレオチド配列を含み得る。そのようなマーカーは、その産物が抗生物質（例えば、クロラムフェニコール、アンピシリン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、カナマイシン、ネオマイシン）に対する耐性、又は選択培地（例えば、ｕｒａ（ウラシル）、ｌｅｕ（ロイシン）、ｔｒｐ（トリプトファン）、ｈｉｓ（ヒスチジン））上で増殖する能力を与える遺伝子を含むＤＮＡのフラグメントである。通常、プラスミドは細菌細胞にプラスミドを維持させるための抗生物質耐性マーカーを含む。本発明の実施形態において、ＤＮＡ構築物はカナマイシン耐性マーカーのヌクレオチド配列を含み得る。本発明の特定の実施形態において、カナマイシン耐性を与えるためのヌクレオチド配列は、配列番号１２の配列を含む（当該配列は、図１及び図３において「ＫａｎＲ」と称される）：
ＡＴＧＡＧＣＣＡＴＡＴＴＣＡＡＣＧＧＧＡＡＡＣＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＡＧＧＣＣＧＣＧＡＴＴＡＡＡＴＴＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＡＴＡＴＧＧＧＴＡＴＡＡＡＴＧＧＧＣＴＣＧＣＧＡＴＡＡＴＧＴＣＧＧＧＣＡＡＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＣＡＡＴＣＴＡＴＣＧＡＴＴＧＴＡＴＧＧＧＡＡＧＣＣＣＧＡＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＡＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＧＴＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＧＡＴＧＧＴＣＡＧＡＣＴＡＡＡＣＴＧＧＣＴＧＡＣＧＧＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＴＴＴＴＡＴＣＣＧＴＡＣＴＣＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＧＧＴＴＡＣＴＣＡＣＣＡＣＴＧＣＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＴＣＣＡＧＧＴＡＴＴＡＧＡＡＧＡＡＴＡＴＣＣＴＧＡＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＴＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧＧＴＴＧＣＡＴＴＣＧＡＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴＴＴＴＡＡＣＡＧＣＧＡＴＣＧＣＧＴＡＴＴＴＣＧＴＣＴＣＧＣＴＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＣＧＧＴＴＴＧＧＴＴＧＡＴＧＣＧＡＧＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＣＧＴＡＡＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡＧＴＣＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＣＡＴＡＡＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＡＣＣＧＧＡＴＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＧＡＴＴＴＣＴＣＡＣＴＴＧＡＴＡＡＣＣＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＴＧＡＴＧＴＴＧＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＡＴＣＧＣＡＧＡＣＣＧＡＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＴＴＧＣＣＡＴＣＣＴＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＴＧＡＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＴＡＣＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＴＧＧＴＡＴＴＧＡＴＡＡＴＣＣＴＧＡＴＡＴＧＡＡＴＡＡＡＴＴＧＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＴＧＡＴＧＣＴＣＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＣＴＡＡ.
ＡＴＧＡＧＣＣＡＴＡＴＴＣＡＡＣＧＧＧＡＡＡＣＧＴＣＴＴＧＣＴＣＴＡＧＧＣＣＧＣＧＡＴＴＡＡＡＴＴＣＣＡＡＣＡＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＴＴＴＡＴＡＴＧＧＧＴＡＴＡＡＡＴＧＧＧＣＴＣＧＣＧＡＴＡＡＴＧＴＣＧＧＧＣＡＡＴＣＡＧＧＴＧＣＧＡＣＡＡＴＣＴＡＴＣＧＡＴＴＧＴＡＴＧＧＧＡＡＧＣＣＣＧＡＴＧＣＧＣＣＡＧＡＧＴＴＧＴＴＴＣＴＧＡＡＡＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＧＴＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＴＴＡＣＡＧＡＴＧＡＧＡＴＧＧＴＣＡＧＡＣＴＡＡＡＣＴＧＧＣＴＧＡＣＧＧＡＡＴＴＴＡＴＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧＣＡＴＴＴＴＡＴＣＣＧＴＡＣＴＣＣＴＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＧＧＴＴＡＣＴＣＡＣＣＡＣＴＧＣＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＣＡＴＴＣＣＡＧＧＴＡＴＴＡＧＡＡＧＡＡＴＡＴＣＣＴＧＡＴＴＣＡＧＧＴＧＡＡＡＡＴＡＴＴＧＴＴＧＡＴＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＴＧＴＴＣＣＴＧＣＧＣＣＧＧＴＴＧＣＡＴＴＣＧＡＴＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＡＡＴＴＧＴＣＣＴＴＴＴＡＡＣＡＧＣＧＡＴＣＧＣＧＴＡＴＴＴＣＧＴＣＴＣＧＣＴＣＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＡＣＧＡＡＴＧＡＡＴＡＡＣＧＧＴＴＴＧＧＴＴＧＡＴＧＣＧＡＧＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＣＧＴＡＡＴＧＧＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＧＡＡＣＡＡＧＴＣＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＴＧＣＡＴＡＡＡＣＴＴＴＴＧＣＣＡＴＴＣＴＣＡＣＣＧＧＡＴＴＣＡＧＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＧＡＴＴＴＣＴＣＡＣＴＴＧＡＴＡＡＣＣＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＣＧＡＧＧＧＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＧＧＴＴＧＴＡＴＴＧＡＴＧＴＴＧＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＡＴＣＧＣＡＧＡＣＣＧＡＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣＴＴＧＣＣＡＴＣＣＴＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＴＧＡＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＴＡＣＡＧＡＡＡＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＡＴＡＴＧＧＴＡＴＴＧＡＴＡＡＴＣＣＴＧＡＴＡＴＧＡＡＴＡＡＡＴＴＧＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＴＧＡＴＧＣＴＣＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＣＴＡＡ.
【0088】
ＤＮＡ構築物は、抗生物質耐性マーカーをコードする核酸配列に作用可能に連結されたプロモーターをコードするヌクレオチド配列を含み得る。そのようなプロモーターは、先の段落で論述された抗生物質耐性マーカーの発現を増加させ得る。本発明の実施形態において、アンピシリン耐性についてのプロモーターは、アンピシリン耐性マーカーの発現を促進することができるのみならず、カナマイシン耐性マーカーの発現を促進することもできるＡｍｐＲプロモーターである。本発明の特定の実施形態において、ＡｍｐＲプロモーターの核酸配列は、配列番号１３の配列を含む（当該配列は、図１及び図３において「ＡｍｐＲプロモーター」と称される）：
ＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴ.
ＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡＡＡＴＡＣＡＴＴＣＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣＧＣＴＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＡＧＴ.
【0089】
ＤＮＡ構築物は、ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーター及びｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターの両方をコードするヌクレオチド配列を含み得る。ｒｒｎＢ Ｔ１及びＴ２ターミネーターは両方とも、単離された形態において効率的な転写ターミネーターであるが、共に使用された場合、ｒｒｎＢ Ｔ１及びＴ２ターミネーターは、より効率的に転写を終結させ得る。
【0090】
実施形態において、ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターのヌクレオチド配列は、配列番号１４の配列を含む：
ＣＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＴＣＧＡＡＡＧＡＣＴＧＧＧＣＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＣＧＧＴＧＡＡＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＣＡＡＡＴ.
ＣＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＡＡＡＧＧＣＴＣＡＧＴＣＧＡＡＡＧＡＣＴＧＧＧＣＣＴＴＴＣＧＴＴＴＴＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＴＣＧＧＴＧＡＡＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＡＧＴＡＧＧＡＣＡＡＡＴ.
【0091】
実施形態において、ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターのヌクレオチド配列は、配列番号１５の配列を含む：
ＡＧＡＡＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＧＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＴ.
ＡＧＡＡＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＧＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＴ.
【0092】
ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ複製が開始される特定のヌクレオチド配列である複製起点を更に含み得る。ＤＮＡ複製は、この点から双方向又は一方向に進行し得る。一般的に使用される幾つかの複製起点は、ＣｏｌＥ１、ｐＭＢ１、ｐＳＣ１０１、Ｒ６Ｋ、ｐＢＲ３２２、Ｒ６Ｋ、ｐ１５Ａ、及びｐＵＣである。本発明の実施形態において、複製起点はｐＭＢ１又はその誘導体である。本発明の特定の実施形態において、ｐＭＢ１の核酸配列は、配列番号１６の配列を含む：
ＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡ.
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【0093】
実施形態において、ＤＮＡ構築物は、以下のうちの１つ又は複数をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターである：
－ ｒｈａＢＡＤプロモーター、
－ ＲｈａＲ転写活性化因子、
－ ＲｈａＳ転写活性化因子、
－ 抗生物質耐性マーカー、
－ 抗生物質耐性マーカーをコードする核酸に作用可能に連結されたプロモーター、
－ 少なくとも１つのターミネーター、及び
－ 複製起点。
－ ｒｈａＢＡＤプロモーター、
－ ＲｈａＲ転写活性化因子、
－ ＲｈａＳ転写活性化因子、
－ 抗生物質耐性マーカー、
－ 抗生物質耐性マーカーをコードする核酸に作用可能に連結されたプロモーター、
－ 少なくとも１つのターミネーター、及び
－ 複製起点。
【0094】
実施形態において、発現ベクターは、以下をコードするヌクレオチド配列を含む：
－ ｒｈａＢＡＤプロモーター、
－ ＲｈａＲ転写活性化因子、
－ ＲｈａＳ転写活性化因子、
－ 抗生物質耐性マーカー、
－ 抗生物質耐性マーカーをコードする核酸配列に作用可能に連結されたプロモーター、
－ ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーター、
－ ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーター、及び
－ 複製起点。
－ ｒｈａＢＡＤプロモーター、
－ ＲｈａＲ転写活性化因子、
－ ＲｈａＳ転写活性化因子、
－ 抗生物質耐性マーカー、
－ 抗生物質耐性マーカーをコードする核酸配列に作用可能に連結されたプロモーター、
－ ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーター、
－ ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーター、及び
－ 複製起点。
【0095】
実施形態において、発現ベクターは、以下をコードするヌクレオチド配列を含む：
－ ｒｈａＢＡＤプロモーター、
－ ＲｈａＲ転写活性化因子、
－ ＲｈａＳ転写活性化因子、
－ カナマイシン耐性マーカー、
－ ＡｍｐＲプロモーター、
－ ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーター、
－ ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーター、及び
－ ｐＭＢ１複製起点。
－ ｒｈａＢＡＤプロモーター、
－ ＲｈａＲ転写活性化因子、
－ ＲｈａＳ転写活性化因子、
－ カナマイシン耐性マーカー、
－ ＡｍｐＲプロモーター、
－ ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーター、
－ ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーター、及び
－ ｐＭＢ１複製起点。
【0096】
実施形態において、発現ベクターは、以下をコードするヌクレオチド配列を含む：
－ 配列番号８のヌクレオチド配列を含むｒｈａＢＡＤプロモーター、
－ 配列番号９のヌクレオチド配列を含むＲｈａＲ転写活性化因子、
－ 配列番号１１のヌクレオチド配列を含むＲｈａＳ転写活性化因子、
－ 配列番号１２のヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカー、
－ 配列番号１３のヌクレオチド配列を含むＡｍｐＲプロモーター、
－ 配列番号１４のヌクレオチド配列を含むｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーター、
－ 配列番号１５のヌクレオチド配列を含むｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーター、及び
－ 配列番号１６のヌクレオチド配列を含むｐＭＢ１複製起点。
－ 配列番号８のヌクレオチド配列を含むｒｈａＢＡＤプロモーター、
－ 配列番号９のヌクレオチド配列を含むＲｈａＲ転写活性化因子、
－ 配列番号１１のヌクレオチド配列を含むＲｈａＳ転写活性化因子、
－ 配列番号１２のヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカー、
－ 配列番号１３のヌクレオチド配列を含むＡｍｐＲプロモーター、
－ 配列番号１４のヌクレオチド配列を含むｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーター、
－ 配列番号１５のヌクレオチド配列を含むｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーター、及び
－ 配列番号１６のヌクレオチド配列を含むｐＭＢ１複製起点。
【0097】
上記のＤＮＡ構築物にクローニングされることになる組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、モノクローナル抗体又はそのフラグメント、好ましくはセルトリズマブをコードする核酸を含み得る。セルトリズマブをコードする核酸は、セルトリズマブの軽鎖及び重鎖をコードする核酸を含む。
【0098】
実施形態において、セルトリズマブの軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号５の配列を含む：
ｇａｔａｔｔｃａｇａｔｇａｃｔｃａｇａｇｃｃｃａａｇｔｔｃｇｃｔｇａｇｃｇｃｔｔｃｔｇｔｔｇｇｃｇａｔｃｇｔｇｔｇａｃｃａｔｔａｃａｔｇｃａａａｇｃｃｔｃａｃａｇａａｃｇｔｔｇｇｔａｃｃａａｔｇｔｃｇｃｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃｔｇｇａａａａｇｃｇｃｃｃａａａｇｃｇｃｔｃａｔｃｔａｃｔｃａｇｃｇａｇｃｔｔｃｃｔｇｔａｔｔｃａｇｇｃｇｔｇｃｃｇｔａｔｃｇｃｔｔｔａｇｃｇｇｃｔｃｔｇｇｔｔｃｃｇｇｔａｃａｇａｃｔｔｔａｃｃｃｔｃａｃｇａｔｔｔｃｇｔｃｃｔｔａｃａａｃｃｇｇａａｇａｔｔｔｃｇｃｃａｃｇｔａｃｔａｔｔｇｃｃａｇｃａａｔａｃａａｃａｔｃｔａｔｃｃｇｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｇａｃａａｇｇｃａｃｃａａａｇｔｇｇａｇａｔｃａａａｃｇｃａｃｔｇｔｔｇｃｔｇｃａｃｃｇａｇｔｇｔｇｔｔｃａｔｃｔｔｔｃｃａｃｃｇｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｃｔｇａａｇｔｃｔｇｇｔａｃａｇｃａａｇｔｇｔｔｇｔｇｔｇｔｃｔｇｃｔｇａａｃａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｇｔｇａａｇｃｔａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａａｇｔｃｇａｃａａｔｇｃｃｔｔｇｃａａｔｃｃｇｇｇａａｔａｇｃｃａｇｇａａａｇｃｇｔｇａｃｔｇａａｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｔｔｃｇａｃｃｔａｃａｇｔｃｔｇａｇｃａｇｔａｃｃｔｔａａｃｃｔｔｇｔｃｇａａａｇｃｇｇａｔｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａｇｇｔｃｔａｔｇｃｃｔｇｔｇａａｇｔｃａｃｇｃａＴＣＡＡＧＧＣＣＴＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＧＴＴＡＣＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡ.
本発明の実施形態において、セルトリズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６の配列を含む：
ｇａａｇｔｇｃａｇｃｔｔｇｔｇｇａｇｔｃｔｇｇａｇｇｔｇｇｃｔｔａｇｔｃｃａｇｃｃａｇｇｔｇｇｔｔｃｃｃｔｇｃｇｃｔｔｇｔｃｃｔｇｔｇｃａｇｃｇａｇｃｇｇｇｔａｔｇｔＡｔｔｃａｃａｇａｔｔａｔｇｇｃａｔｇａａｃｔｇｇｇｔｔｃｇｇｃａａｇｃａｃｃａｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｃｇａａｔｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｇａｔｃａａｃａｃｇｔａｔａｔｔｇｇｇｇａａｃｃｇａｔｔｔａｔｇｃｇｇａｔａｇｃｇｔｃａａａｇｇｔｃｇｃｔｔｃａｃｇｔｔｃａｇｔｃｔｇｇａｔａｃｃａｇｃａａａｔｃａａｃｃｇｃｇｔａｔｃｔｃｃａｇａｔｇａａｔａｇｃｃｔｃｃｇｔｇｃｔｇａａｇａｔａｃｔｇｃｃｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｔｇｃｇｃｇｔｇｇｔｔａｔｃｇｃａｇｔｔａｔｇｃｇａｔｇｇａｔｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａａｇｇｃａｃｃｔｔａｇｔｃａｃｃｇｔｔａｇｔｔｃｔｇｃｃｔｃｃａｃｃａａａｇｇｃｃｃａｔｃａｇｔｇｔｔｔｃｃｇｃｔｇｇｃｃｃｃｔｔｃｇｔｃｔａａａｔｃｇａｃｇａｇｔｇｇｔｇｇｃａｃａｇｃｃｇｃａｃｔｇｇｇａｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇａｃｔａｃｔｔｔｃｃｃｇａａｃｃｔｇｔａａｃｃｇｔａａｇｃｔｇｇａａｔａｇｔｇｇｔｇｃｔｔｔｇａｃｃｔｃａｇｇｃｇｔｇｃａｔａｃｇｔｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃｃｔｇｃａｇｔｃａｔｃｃｇｇｔｃｔｇｔａｃｔｃｇｃｔｔｔｃｇａｇｃｇｔｔｇｔｔａｃｔｇｔａｃｃｃｔｃｔａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｇｃａｃｃｃａｇａｃｇｔａｃａｔｃｔｇｃａａｔｇｔｇａａｃｃａｔａａｇｃｃｇｔｃｇａａｃａｃｃａａａｇｔｇｇａｃａａｇａａａｇｔｔｇａｇｃｃｇａａａａｇｃｔｇｃｇａｃａａａａｃｇｃａｃａｃａｔｇｔｇｃｃｇｃｃＴＡＡ.
実施形態において、セルトリズマブの軽鎖及び重鎖をコードする核酸は、セルトリズマブの重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列のいずれか一方又は両方に作用可能に連結されたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に含む。シグナルペプチドは、好ましくは、ＭａｌＥ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＤｓｂＡ及びＰｅｌｂからなる群から選択される。シグナルペプチドをコードする核酸配列は、好ましくは、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
ｇａｔａｔｔｃａｇａｔｇａｃｔｃａｇａｇｃｃｃａａｇｔｔｃｇｃｔｇａｇｃｇｃｔｔｃｔｇｔｔｇｇｃｇａｔｃｇｔｇｔｇａｃｃａｔｔａｃａｔｇｃａａａｇｃｃｔｃａｃａｇａａｃｇｔｔｇｇｔａｃｃａａｔｇｔｃｇｃｃｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａａｃｃｔｇｇａａａａｇｃｇｃｃｃａａａｇｃｇｃｔｃａｔｃｔａｃｔｃａｇｃｇａｇｃｔｔｃｃｔｇｔａｔｔｃａｇｇｃｇｔｇｃｃｇｔａｔｃｇｃｔｔｔａｇｃｇｇｃｔｃｔｇｇｔｔｃｃｇｇｔａｃａｇａｃｔｔｔａｃｃｃｔｃａｃｇａｔｔｔｃｇｔｃｃｔｔａｃａａｃｃｇｇａａｇａｔｔｔｃｇｃｃａｃｇｔａｃｔａｔｔｇｃｃａｇｃａａｔａｃａａｃａｔｃｔａｔｃｃｇｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｇａｃａａｇｇｃａｃｃａａａｇｔｇｇａｇａｔｃａａａｃｇｃａｃｔｇｔｔｇｃｔｇｃａｃｃｇａｇｔｇｔｇｔｔｃａｔｃｔｔｔｃｃａｃｃｇｔｃｔｇａｔｇａｇｃａｇｃｔｇａａｇｔｃｔｇｇｔａｃａｇｃａａｇｔｇｔｔｇｔｇｔｇｔｃｔｇｃｔｇａａｃａａｃｔｔｃｔａｔｃｃｇｃｇｔｇａａｇｃｔａａａｇｔａｃａｇｔｇｇａａａｇｔｃｇａｃａａｔｇｃｃｔｔｇｃａａｔｃｃｇｇｇａａｔａｇｃｃａｇｇａａａｇｃｇｔｇａｃｔｇａａｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇａｔｔｃｇａｃｃｔａｃａｇｔｃｔｇａｇｃａｇｔａｃｃｔｔａａｃｃｔｔｇｔｃｇａａａｇｃｇｇａｔｔａｃｇａｇａａａｃａｃａａｇｇｔｃｔａｔｇｃｃｔｇｔｇａａｇｔｃａｃｇｃａＴＣＡＡＧＧＣＣＴＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＧＴＴＡＣＴＡＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＴＧＴＴＡＡ.
本発明の実施形態において、セルトリズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６の配列を含む：
ｇａａｇｔｇｃａｇｃｔｔｇｔｇｇａｇｔｃｔｇｇａｇｇｔｇｇｃｔｔａｇｔｃｃａｇｃｃａｇｇｔｇｇｔｔｃｃｃｔｇｃｇｃｔｔｇｔｃｃｔｇｔｇｃａｇｃｇａｇｃｇｇｇｔａｔｇｔＡｔｔｃａｃａｇａｔｔａｔｇｇｃａｔｇａａｃｔｇｇｇｔｔｃｇｇｃａａｇｃａｃｃａｇｇｃａａａｇｇｃｃｔｃｇａａｔｇｇａｔｇｇｇｇｔｇｇａｔｃａａｃａｃｇｔａｔａｔｔｇｇｇｇａａｃｃｇａｔｔｔａｔｇｃｇｇａｔａｇｃｇｔｃａａａｇｇｔｃｇｃｔｔｃａｃｇｔｔｃａｇｔｃｔｇｇａｔａｃｃａｇｃａａａｔｃａａｃｃｇｃｇｔａｔｃｔｃｃａｇａｔｇａａｔａｇｃｃｔｃｃｇｔｇｃｔｇａａｇａｔａｃｔｇｃｃｇｔｇｔａｃｔａｃｔｇｔｇｃｇｃｇｔｇｇｔｔａｔｃｇｃａｇｔｔａｔｇｃｇａｔｇｇａｔｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａａｇｇｃａｃｃｔｔａｇｔｃａｃｃｇｔｔａｇｔｔｃｔｇｃｃｔｃｃａｃｃａａａｇｇｃｃｃａｔｃａｇｔｇｔｔｔｃｃｇｃｔｇｇｃｃｃｃｔｔｃｇｔｃｔａａａｔｃｇａｃｇａｇｔｇｇｔｇｇｃａｃａｇｃｃｇｃａｃｔｇｇｇａｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇａｃｔａｃｔｔｔｃｃｃｇａａｃｃｔｇｔａａｃｃｇｔａａｇｃｔｇｇａａｔａｇｔｇｇｔｇｃｔｔｔｇａｃｃｔｃａｇｇｃｇｔｇｃａｔａｃｇｔｔｔｃｃｇｇｃｔｇｔｃｃｔｇｃａｇｔｃａｔｃｃｇｇｔｃｔｇｔａｃｔｃｇｃｔｔｔｃｇａｇｃｇｔｔｇｔｔａｃｔｇｔａｃｃｃｔｃｔａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｇｃａｃｃｃａｇａｃｇｔａｃａｔｃｔｇｃａａｔｇｔｇａａｃｃａｔａａｇｃｃｇｔｃｇａａｃａｃｃａａａｇｔｇｇａｃａａｇａａａｇｔｔｇａｇｃｃｇａａａａｇｃｔｇｃｇａｃａａａａｃｇｃａｃａｃａｔｇｔｇｃｃｇｃｃＴＡＡ.
実施形態において、セルトリズマブの軽鎖及び重鎖をコードする核酸は、セルトリズマブの重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列のいずれか一方又は両方に作用可能に連結されたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を更に含む。シグナルペプチドは、好ましくは、ＭａｌＥ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＤｓｂＡ及びＰｅｌｂからなる群から選択される。シグナルペプチドをコードする核酸配列は、好ましくは、ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【0099】
実施形態において、セルトリズマブの軽鎖をコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結されたＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８の配列を含み、本発明においてはＰｅｌＢシグナル配列１（図３を参照）とも称され、ＰｅｌＢ１と略記される：
ＡＴＧＡＡＧＴＡＴＣＴｔＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＡ.
ＡＴＧＡＡＧＴＡＴＣＴｔＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＧＣＡＡＴＧＧＣＡ.
【0100】
本発明の実施形態において、セルトリズマブの重鎖をコードするヌクレオチド配列に作用可能に連結されたＰｅｌＢシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１９の配列を含み、本発明においてはＰｅｌＢシグナル配列２（図３を参照）とも称され、ＰｅｌＢ２と略記される：
ＡＴＧＡＡＧＴＡＴＣＴＧＴＴＧＣＣＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＡＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＧ.
ＡＴＧＡＡＧＴＡＴＣＴＧＴＴＧＣＣＧＡＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＧＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＡＧＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＧ.
【0101】
実施形態において、ＤＮＡ構築物は配列番号２０の改良されたＴＩＲを含む：
ＴＴＧＣＴＣＡＴＧＡＡＧＴＡＴ.
ＴＴＧＣＴＣＡＴＧＡＡＧＴＡＴ.
【0102】
実施形態において、ＤＮＡ構築物は、配列番号２１の改良されたＴＩＲを含む：
ＴＧＴＴＡＡＡＴＧＡＡＧＴＡＴ.
ＴＧＴＴＡＡＡＴＧＡＡＧＴＡＴ.
【0103】
実施形態において、ＤＮＡ構築物は、配列番号Ｎｏ．２０及び２１のヌクレオチド配列のＴＩＲを含み、これらのＴＩＲヌクレオチド配列は、配列番号１８及び１９のシグナルペプチドヌクレオチド配列の少なくとも最初の９ヌクレオチドをそれぞれ含むことになる。
【0104】
本発明の特定の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、本発明においてＫＴＸＨＩＳ－Ｃｅｒｔ－ＰｅｌＢ１－ＬＣ－ＰｅｌＢ２－ＨＣとも称される配列番号１７のヌクレオチド配列を含む。このＤＮＡ構築物は、好ましくは発現ベクターである。
【0105】
組換えタンパク質を産生するために使用されることになる細菌宿主細胞は、ラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を有する染色体を含む。細菌宿主細胞は、大腸菌細胞であり得る。好ましい実施形態において、細菌宿主細胞は大腸菌Ｋ－１２細胞であり、より好ましくは、細菌宿主細胞は大腸菌Ｗ３１１０細胞である。ラムノース代謝の無効化は、ＲｈａＢを不活性化する、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列における突然変異によって達成される。或いは、ラムノース代謝の無効化は、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列が欠失した染色体を有する細菌宿主細胞を用いることにより達成され；これは例えば、ＲｈａＢをコードするヌクレオチド配列を欠失させることによって達成され得る。好ましくは、細菌宿主細胞の染色体はＲｈａＴをコードする核酸配列を含み、すなわち、ＲｈａＴ遺伝子はインタクトである。
【0106】
本発明の特定の実施形態において、細菌宿主細胞は、大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである。
【0107】
本発明の特定の実施形態において、細菌宿主細胞である大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒは、ＫＴＸＨＩＳ－Ｃｅｒｔ－ＰｅｌＢ１－ＬＣ－ＰｅｌＢ２－ＨＣ発現ベクターを含み、セルトリズマブバイオシミラーの産生において使用され得るセルトリズマブを発現させる方法において使用される。
【0108】
バイオシミラーは参照製剤の高度な類似体であり、すなわち、セルトリズマブバイオシミラーは、参照製剤スポンサー（すなわち、オリジネーター）によって産生されるセルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ（登録商標））と高度に類似した分子構造及び機能（すなわち、生理活性）を有する。更に、バイオシミラーは参照製剤との臨床的に意味のある差異を有せず、バイオシミラーに対して行われる臨床試験は薬物動態及び免疫原性を査定する。最も重要なことに、バイオシミラーは、（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｍｅｄｉａ／１０８９０５／ｄｏｗｎｌｏａｄにおいて示されている通り）（ａ）医療機関の承認基準を満たし、（ｂ）医療機関の認可を受けた施設において製造され、且つ（ｃ）継続的な安全性を確保するために市販後調査の一環として追跡されている。
【0109】
本発明は、以下の非限定的な例のセクションにおける例１～９で開示されているように例示され得る。
【0110】
ＸＢ１６６宿主細胞及びＫＴＸＨＩＳ－Ｃｅｒｔ－ＰｅｌＢ１－ＬＣ－ＰｅｌＢ２－ＨＣ発現ベクター、並びにそれらの併用に関するこれらの例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示としてのみ与えられていることを理解されたい。上記で開示された本発明の実施形態及び以下の例から、当業者は本発明の本質的な特性を確認することができ、その趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更及び修正を行い、それを様々なタイプの治療用抗体及び免疫グロブリンに適合させることができる。従って、本明細書において示され、記載されたものに加えて、本発明の様々な修正が上述の記載から当業者にとって明らかになるであろう。そのような修正はまた、添付した特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されている。そのような修正の例は、上記で示された配列番号１～２１のうちの１つ又は複数が、それに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列によって置換され得ることである。
例
例
【0111】
例１は、本発明において大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒとも称されるＸＢ１６６宿主細胞の構築に関する。
【0112】
例２は、ＫＴＸＨＩＳ－Ｃｅｒｔ－ＰｅｌＢ１－ＬＣ－ＰｅｌＢ２－ＨＣ発現ベクターの構築に関する。
【0113】
例３は、例２において開示された発現ベクターによって発現されるセルトリズマブの軽鎖及び重鎖に関する。
【0114】
例４は、本発明に従って産生されたセルトリズマブがバクテリオファージを含まないことを示す。
【0115】
例５は、ＴＩＲライブラリ選択及び進化したＴＩＲの単離に関する。
【0116】
例６は、培地画分発現のウェスタンブロット解析に関し、その結果は、セルトリズマブ重鎖発現の制御のために合成的に進化させたＴＩＲを含むＥ８３発現ベクターにより、最高レベルのセルトリズマブがもたらされたことを示す。
【0117】
例７は、総画分発現のウェスタンブロット解析に関し、その結果は、セルトリズマブ重鎖発現の制御のために合成的に進化させたＴＩＲを含むＥ８３発現ベクターにより、最高レベルのセルトリズマブがもたらされたことを示す。
【0118】
例８は、発現系ＸＢ６２（未進化のＴＩＲ、及び、セルトリズマブの軽鎖及び重鎖についてのヌクレオチド配列の各々の上流にあるＰｅｌＢシグナルペプチドについての野生型ヌクレオチド配列を有するＤ３７発現ベクターを含むＸＢ１７宿主細胞）及びＸＢ１０２（セルトリズマブ重鎖発現の制御のために合成的に操作されたＴＩＲを有する発現ベクターＥ８３を含むＸＢ１７宿主細胞）の間の収率及び力価の差異を検出するために実施されたＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）及びＡＫＴＡクロマトグラフィに関し、その結果は、（セルトリズマブ重鎖発現の制御のための）合成的に操作されたＴＩＲを含む発現ベクターＥ８３を有する発現系ＸＢ１０２により、セルトリズマブの最高の収率及び力価がもたらされることを示す。
【0119】
例９は、宿主細胞ＸＢ１７及びＸＢ１６６におけるセルトリズマブ発現の比較に関し、その結果は、Ｅ１１１（ＫＴＸＨＩＳ－Ｃｅｒｔ－Ｐｅｌｂ１－ＬＣ－Ｐｅｌｂ２－ＨＣ）と組み合わせたＸＢ１６６宿主細胞（大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒ）の使用により、セルトリズマブの最高相対収率がもたらされることを示す。
【0120】
例１－菌株の開発
ＸＢ１６６宿主細胞は、抗体及び抗体フラグメントなどの組換えタンパク質の産生のために遺伝子的に操作された大腸菌Ｗ３３１０誘導体である。更に、ＸＢ１６６宿主細胞は、対象の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列をＫＴＸＨＩＳプラスミドにクローニングし、ラムノース誘導性プロモーターの制御下で発現させるラムノース誘導系のための菌株として設計された。
ＸＢ１６６宿主細胞は、抗体及び抗体フラグメントなどの組換えタンパク質の産生のために遺伝子的に操作された大腸菌Ｗ３３１０誘導体である。更に、ＸＢ１６６宿主細胞は、対象の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列をＫＴＸＨＩＳプラスミドにクローニングし、ラムノース誘導性プロモーターの制御下で発現させるラムノース誘導系のための菌株として設計された。
【0121】
ＸＢ１６６宿主細胞は、イェール大学（米国ニューヘブン）大腸菌遺伝子ストックセンター（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ：ＣＧＳＣ）から取得された、カタログ番号４４７４、遺伝子型Ｆ－、λ－、ＩＮ（ｒｒｎＤ－ｒｒｎＥ）１、ｒｐｈ－１の親大腸菌株Ｗ３１１０から開発された。
【0122】
ＸＢ１６６は、ｒｈａＢ遺伝子を不活性化することによるラムノース依存性プロモーターからの効率的な誘導のためにカスタマイズされた［７］。更に、以下のサブセクションで詳細に記載されている通り、抗体フラグメントの産生に有用な３つのゲノム修飾［８］が導入された。
【0123】
要約すると、ＸＢ１６６宿主細胞を開発するための方法は、以下に列挙される修飾を伴い、これは以下のサブセクションにおいて詳細に論述される：
ａ）ＲｈａＢフレームシフト突然変異；
ｂ）ｄｅｇＰ欠失；
ｃ）ｐｒｃ欠失；及び
ｄ）ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異。
ａ）ＲｈａＢフレームシフト突然変異；
ｂ）ｄｅｇＰ欠失；
ｃ）ｐｒｃ欠失；及び
ｄ）ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異。
【0124】
段階（ａ）－ＲｈａＢフレームシフト突然変異体の構築。
【0125】
親大腸菌株Ｗ３１１０は、ｒｈａＢの染色体コピーにおいてフレームシフトを有する誘導体を生成し、それが炭素源としてラムノースを利用できないようにすべく操作された。この目的のために、遺伝子置換プラスミドｐＭＡＫ７０５－ｒｈａＢｆｓ［９］を用いて細胞を遺伝子的に操作した。
【0126】
操作された菌株の表現型を検査して、ラムノースがもはや炭素源として利用できないことを実証した。更に、ｒｈａＢフレームシフトを含む染色体フラグメントをＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物の塩基配列を決定して、２塩基の正しい挿入を確認した（以下で開示される配列番号Ｎｏ．２２の下線付きのＣＧ塩基を参照）：
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単一のコロニーを摘出し、ＬＢベジトン内で増殖させ、グリセロールストックを調製した。得られた大腸菌株Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓはＸＢ１７と呼ばれ、以下の遺伝子修飾のための出発菌株として作用した。
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単一のコロニーを摘出し、ＬＢベジトン内で増殖させ、グリセロールストックを調製した。得られた大腸菌株Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓはＸＢ１７と呼ばれ、以下の遺伝子修飾のための出発菌株として作用した。
【0127】
段階（ｂ）－ｄｅｇＰ欠失
ＸＢ１７（大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓ）菌株は、ペリプラズムにおける軽鎖のタンパク質分解の減少に起因して、組換え抗体フラグメントの高レベル蓄積を可能にする「三重突然変異」宿主菌株を作成するために、３つの重要な修飾（ｄｅｇＰ ｐｒｃ ｓｐｒ）を備えるように更に操作された［８］。
ＸＢ１７（大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓ）菌株は、ペリプラズムにおける軽鎖のタンパク質分解の減少に起因して、組換え抗体フラグメントの高レベル蓄積を可能にする「三重突然変異」宿主菌株を作成するために、３つの重要な修飾（ｄｅｇＰ ｐｒｃ ｓｐｒ）を備えるように更に操作された［８］。
【0128】
この目的のために、ペリプラズムセリンエンドプロテアーゼＤｅｇＰをコードする遺伝子のゲノムコピーを、ｄｅｇＰ上流領域に相同なフラグメントがｄｅｇＰ下流領域に相同なフラグメントと融合する遺伝子置換プラスミドｐＭＡＫ７０５－ｓａｃＢ－ＤｅｇＰを用いてノックアウトした。極性効果を回避するために、最後の７ｄｅｇＰコドンのみならずｄｅｇＰ開始コドンも保存するように遺伝子置換カセットを設計した。この遺伝子置換プラスミドはまた、温度感受性の複製起点の隣に対抗選択のためのｓａｃＢ遺伝子を保持しており、それにより、菌株構築後のプラスミドキュアリング［１０］を容易にしている。
【0129】
染色体のｄｅｇＰ遺伝子の欠失は、ｄｅｇＰ「傷」領域のＰＣＲ増幅及びＰＣＲ産物の塩基配列決定によって確認された（下線付きコドンはｄｅｇＰ開始コドンであり、太字のコドンはｄｅｇＰ遺伝子の最後の７コドンである、以下の配列番号２３を参照）：
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操作された菌株の単一のコロニーを摘出し、ＬＢベジトン内で増殖させ、グリセロールストックを調製した。得られた大腸菌株Ｗ３１１０ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰはＸＢ８３と呼ばれ、以下の遺伝子修飾のための出発菌株として作用した。
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操作された菌株の単一のコロニーを摘出し、ＬＢベジトン内で増殖させ、グリセロールストックを調製した。得られた大腸菌株Ｗ３１１０ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰはＸＢ８３と呼ばれ、以下の遺伝子修飾のための出発菌株として作用した。
【0130】
段階（ｃ）－ｐｒｃ欠失
大腸菌Ｗ３１１０ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰ（ＸＢ８３）を出発菌株として、上記ｄｅｇＰ欠失と同様に遺伝子置換プラスミドｐＭＡＫ７０５－ｓａｃＢ－ｐｒｃを用い、ｐｒｃ遺伝子をノックアウトした。染色体のｐｒｃ遺伝子の欠失は、ｐｒｃ傷領域のＰＣＲ増幅及びＰＣＲ産物の塩基配列決定によって確認された（下線付きコドンはｐｒｃ開始コドンであり、太字のコドンはｐｒｃ遺伝子の最後の７コドンである、以下の配列番号２４を参照）：
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操作された菌株の単一のコロニーを摘出し、ＬＢベジトン内で増殖させ、グリセロールストックを調製した。得られた大腸菌株Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔｄｅｇＰΔｐｒｃはここでＸＢ１５２と呼ばれ、最終遺伝子操作段階のための出発菌株として作用した。
大腸菌Ｗ３１１０ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰ（ＸＢ８３）を出発菌株として、上記ｄｅｇＰ欠失と同様に遺伝子置換プラスミドｐＭＡＫ７０５－ｓａｃＢ－ｐｒｃを用い、ｐｒｃ遺伝子をノックアウトした。染色体のｐｒｃ遺伝子の欠失は、ｐｒｃ傷領域のＰＣＲ増幅及びＰＣＲ産物の塩基配列決定によって確認された（下線付きコドンはｐｒｃ開始コドンであり、太字のコドンはｐｒｃ遺伝子の最後の７コドンである、以下の配列番号２４を参照）：
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操作された菌株の単一のコロニーを摘出し、ＬＢベジトン内で増殖させ、グリセロールストックを調製した。得られた大腸菌株Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔｄｅｇＰΔｐｒｃはここでＸＢ１５２と呼ばれ、最終遺伝子操作段階のための出発菌株として作用した。
【0131】
段階（ｄ）－ｓｐｒＷ１４８Ｒ発現宿主を操作する最終段階は、ｓｐｒ遺伝子のアミノ酸置換をもたらすｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異の導入によって三重突然変異遺伝子型を補完することに費やされた。ｄｅｇＰ及びｐｒｃの欠失により、抗体フラグメントの軽鎖のタンパク質分解が減少した菌株がもたらされると予想される一方で、ｓｐｒ突然変異によってより多量の組換えタンパク質が産生されると記載されている［８］。
【0132】
大腸菌Ｗ３１１０ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ（ＸＢ１５２）を出発菌株として用い、突然変異体ｓｐｒフラグメントを含む遺伝子置換プラスミドｐＭＡＫ７０５－ｓａｃＢ－ｓｐｒＷ１４８Ｒを用いて、ｓｐｒ遺伝子のゲノムコピーを操作した［１０］。ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異を含む染色体フラグメントをＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物の塩基配列を決定して、ゲノムｓｐｒ遺伝子が突然変異対立遺伝子によって正しく置換されていることを確認した（下記配列番号２５を参照；ＴからＡへの突然変異は太字で強調表示されている）：
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操作された菌株の単一のコロニーを摘出し、ＬＢベジトン内で増殖させ、グリセロールストックを調製した。得られた大腸菌株Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８ＲはＸＢ１６６と呼ばれる。
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操作された菌株の単一のコロニーを摘出し、ＬＢベジトン内で増殖させ、グリセロールストックを調製した。得られた大腸菌株Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８ＲはＸＢ１６６と呼ばれる。
【0133】
ＸＢ１６６の有利な技術的効果は、例８及び図８において詳細に示され、論述される。
【0134】
例２－ＫＴＸＨＩＳ－Ｃｅｒｔ－ＰｅｌＢ１－ＬＣ－ＰｅｌＢ２－ＨＣ
作製されたセルトリズマブの最初の構築物は、シグナルペプチドＯｍｐＡ－ＬＣ、ＰｅｌＢ－ＨＣ（遺伝子合成）を用いたものであり、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を介してＫＴＸＨＩＳプラスミドにクローニングされた。この最初の構築物から、次に、大腸菌内でのＰＣＲフラグメントの相同組換えを使用して、シグナルペプチドを交換した。発明者は、ＫＴＸＨＩＳベクターでＰｅｌＢＬＣ、ＰｅｌＢＨＣの幾つかのバージョンを作製したが、得られるＰｅｌＢのアミノ酸配列が同じであっても、コドンは異なっていた。率直に言えば、発明者において、キアヴァッシュ（Ｋｉａｖａｓｈ）がどれを開始プラスミドとして使用したかは定かではない。
作製されたセルトリズマブの最初の構築物は、シグナルペプチドＯｍｐＡ－ＬＣ、ＰｅｌＢ－ＨＣ（遺伝子合成）を用いたものであり、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を介してＫＴＸＨＩＳプラスミドにクローニングされた。この最初の構築物から、次に、大腸菌内でのＰＣＲフラグメントの相同組換えを使用して、シグナルペプチドを交換した。発明者は、ＫＴＸＨＩＳベクターでＰｅｌＢＬＣ、ＰｅｌＢＨＣの幾つかのバージョンを作製したが、得られるＰｅｌＢのアミノ酸配列が同じであっても、コドンは異なっていた。率直に言えば、発明者において、キアヴァッシュ（Ｋｉａｖａｓｈ）がどれを開始プラスミドとして使用したかは定かではない。
【0135】
セルトリズマブの発現のためのマザー構築物は、シグナルペプチドＯｍｐＡ（軽鎖をコードするヌクレオチド配列の上流）及びＰｅｌＢ（重鎖をコードするヌクレオチド配列の上流）を用いて作製され、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位（配列番号２を参照）を介してＫＴＸＨＩＳプラスミド（配列番号１を参照）にクローニングされた。このマザー構築物から、既存のシグナルペプチドヌクレオチド配列を次に配列番号１８及び１９のシグナルペプチドヌクレオチド配列と入れ替え、大腸菌内でＰＣＲフラグメントの相同組換えを用いることにより、発現ベクターＤ３７を産出した。（以下の例５～１０において説明される通り）セルトリズマブの軽鎖及び重鎖の発現を制御する両ＴＩＲの合成構築後、配列番号１７を含む発現ベクターを生成した。
【0136】
発現プラスミドＫＴＸＨＩＳについては、欧州特許出願ＥＰ２０２０１０９６．３において以前に記載されている。得られたヌクレオチド配列は配列番号１７のヌクレオチド配列を含み、本発明においてＫＴＸＨＩＳ－Ｃｅｒｔ－ＰｅｌＢ１－ＬＣ－ＰｅｌＢ２－ＨＣと称される。ＫＴＸＨＩＳ－Ｃｅｒｔ－ＰｅｌＢ１－ＬＣ－ＰｅｌＢ２－ＨＣのプラスミドマップが図３において示される：
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【0137】
例３－組換えタンパク質－セルトリズマブ
発現ベクターＫＴＸＨＩＳ－Ｃｅｒｔ－ＰｅｌＢ１－ＬＣ－ＰｅｌＢ２－ＨＣによって発現されるセルトリズマブの軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３の配列を含む：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＡＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＩＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ.
発現ベクターＫＴＸＨＩＳ－ｃｅｒｔ－ＰｅｌＢ１－ＬＣ－ＰｅｌＢ２－ＨＣによって発現されるセルトリズマブの重鎖のアミノ酸配列は、配列番号４の配列を含む：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＶＦＴＤＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＩＧＥＰＩＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＲＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＡＡ.
更に、得られたＰｅｌＢシグナルペプチドは、配列番号３［６］：ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡのアミノ酸配列を含む。
例４－細胞バンキング
ＸＢ１６６をＫＴＸＨＩＳ－Ｃｅｒｔ－Ｐｅｌｂ１－ＬＣ－Ｐｅｌｂ２－ＨＣを用いて形質転換した。
発現ベクターＫＴＸＨＩＳ－Ｃｅｒｔ－ＰｅｌＢ１－ＬＣ－ＰｅｌＢ２－ＨＣによって発現されるセルトリズマブの軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号３の配列を含む：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＮＶＧＴＮＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＡＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＩＹＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ.
発現ベクターＫＴＸＨＩＳ－ｃｅｒｔ－ＰｅｌＢ１－ＬＣ－ＰｅｌＢ２－ＨＣによって発現されるセルトリズマブの重鎖のアミノ酸配列は、配列番号４の配列を含む：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＶＦＴＤＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＷＩＮＴＹＩＧＥＰＩＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＹＲＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＡＡ.
更に、得られたＰｅｌＢシグナルペプチドは、配列番号３［６］：ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡのアミノ酸配列を含む。
例４－細胞バンキング
ＸＢ１６６をＫＴＸＨＩＳ－Ｃｅｒｔ－Ｐｅｌｂ１－ＬＣ－Ｐｅｌｂ２－ＨＣを用いて形質転換した。
【0138】
単一のコロニーを摘出し、定義されたバイオリアクター規定培地（Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＢＭ）内で一晩増殖させることにより、ＲＣＢを調製した。翌日、２０％（最終濃度）のグリセロールを無菌的に添加し、培養物を分注して、－８０℃で保管した。
【0139】
ＲＣＢの製造において使用される全ての材料は、非動物及び非ヒト由来である。
【0140】
例５－ＴＩＲライブラリ選択及び進化したＴＩＲの単離
ＵＳ１０６９６９６３及びＭｉｒｚａｄｅｈら２０１５年［１１］において開示され、本例において簡潔に記載されている方法を利用することによって宿主細胞のリボソームとより適合性の高いＴＩＲを選択するために合成進化を使用した（類似のＴＩＲの合成的進化については、併せてＷＯ２１１５８１６３を参照）。ＴＩＲライブラリは、ＡＴＧ開始コドンのすぐ上流の６ヌクレオチドが完全にランダム化され、ＡＴＧ開始コドンのすぐ下流の６ヌクレオチドが同義コドンの変更のみを用いてランダム化されることを意図した設計によって作成された。各ＴＩＲライブラリは理論上、異なるＴＩＲを有する１８，０００を超える発現プラスミドを含む。この実験において、次にβ－ラクタマーゼに融合された発現カセットＰｅｌＢｓｓ－セルトリズマブ－ＬＣ－ＰｅｌＢｓｓ－セルトリズマブ－ＨＣ（「ｓｓ」はシグナル配列の略称である）を含む発現プラスミドを、記載されたＴＩＲライブラリ生成に供した。別個の実験において、各セルトリズマブ鎖について、ＴＩＲライブラリを細菌に形質転換し、固定量のラムノース及び漸増濃度のアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングした（図４）。高濃度のアンピシリンに耐性を示した、又は未進化の発現カセットプレート（図４における下部のパネル／列）からの対応するコロニーに比べて視覚的により大きかったＴＩＲライブラリープレート（図４における上部パネル／列）からのコロニーを単離し、ＴＩＲの塩基配列を決定した。次に、同定されたＴＩＲ（すなわち、合成的に進化させたＴＩＲ）を、より大きな発酵スケールでのセルトリズマブ発現に対するそれらの効果を査定するために、β－ラクタマーゼを欠いたプラスミドにバックエンジニアリングした。
ＵＳ１０６９６９６３及びＭｉｒｚａｄｅｈら２０１５年［１１］において開示され、本例において簡潔に記載されている方法を利用することによって宿主細胞のリボソームとより適合性の高いＴＩＲを選択するために合成進化を使用した（類似のＴＩＲの合成的進化については、併せてＷＯ２１１５８１６３を参照）。ＴＩＲライブラリは、ＡＴＧ開始コドンのすぐ上流の６ヌクレオチドが完全にランダム化され、ＡＴＧ開始コドンのすぐ下流の６ヌクレオチドが同義コドンの変更のみを用いてランダム化されることを意図した設計によって作成された。各ＴＩＲライブラリは理論上、異なるＴＩＲを有する１８，０００を超える発現プラスミドを含む。この実験において、次にβ－ラクタマーゼに融合された発現カセットＰｅｌＢｓｓ－セルトリズマブ－ＬＣ－ＰｅｌＢｓｓ－セルトリズマブ－ＨＣ（「ｓｓ」はシグナル配列の略称である）を含む発現プラスミドを、記載されたＴＩＲライブラリ生成に供した。別個の実験において、各セルトリズマブ鎖について、ＴＩＲライブラリを細菌に形質転換し、固定量のラムノース及び漸増濃度のアンピシリンを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングした（図４）。高濃度のアンピシリンに耐性を示した、又は未進化の発現カセットプレート（図４における下部のパネル／列）からの対応するコロニーに比べて視覚的により大きかったＴＩＲライブラリープレート（図４における上部パネル／列）からのコロニーを単離し、ＴＩＲの塩基配列を決定した。次に、同定されたＴＩＲ（すなわち、合成的に進化させたＴＩＲ）を、より大きな発酵スケールでのセルトリズマブ発現に対するそれらの効果を査定するために、β－ラクタマーゼを欠いたプラスミドにバックエンジニアリングした。
【0141】
上記の合成進化法を用いることにより得られたＴＩＲの具体例は、本発明においてＴＩＲ－ＬＣと称され、配列番号２０を有し、このＴＩＲ－ＬＣはセルトリズマブの軽鎖の発現を制御する。配列番号２０のＴＩＲ－ＬＣは、例１０において論述されたＥ１１１発現ベクターに含まれるＴＩＲである。
【0142】
例６－ＤＡＳｂｏｘ（登録商標）発酵槽（すなわち、ＤＡＳｂｏｘ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）での２０時間の誘導発現後における培地画分のウェスタンブロット解析。
【0143】
セルトリズマブを、以下を用いることにより発現させた：
ｉ．セルトリズマブの重鎖のヌクレオチド配列の上流にある（配列番号１９の）野生型ＰｅｌＢシグナルペプチドヌクレオチド配列のコドン最適化バージョンを含む、Ｄ３６と称される発現ベクター、及び
ｉｉ．発現ベクターＥ８１、Ｅ８２及びＥ８３であって、当該Ｅ８１、Ｅ８２及びＥ８３発現ベクターは、セルトリズマブ重鎖発現の制御に関与するＴＩＲ（すなわち、セルトリズマブ重鎖のヌクレオチド配列の上流のＴＩＲ）の合成的に操作された修飾をそれぞれ含むという点においてＤ３６ベクターとは異なる、発現ベクターＥ８１、Ｅ８２及びＥ８３。
ｉ．セルトリズマブの重鎖のヌクレオチド配列の上流にある（配列番号１９の）野生型ＰｅｌＢシグナルペプチドヌクレオチド配列のコドン最適化バージョンを含む、Ｄ３６と称される発現ベクター、及び
ｉｉ．発現ベクターＥ８１、Ｅ８２及びＥ８３であって、当該Ｅ８１、Ｅ８２及びＥ８３発現ベクターは、セルトリズマブ重鎖発現の制御に関与するＴＩＲ（すなわち、セルトリズマブ重鎖のヌクレオチド配列の上流のＴＩＲ）の合成的に操作された修飾をそれぞれ含むという点においてＤ３６ベクターとは異なる、発現ベクターＥ８１、Ｅ８２及びＥ８３。
【0144】
Ｅ８３発現ベクターに含まれる（セルトリズマブ重鎖発現の制御のための）合成的に操作されたＴＩＲは、配列番号２１のヌクレオチド配列を有する。Ｅ８１及びＥ８２（及び、研究、開発、及び検査された他の発現ベクター）の重鎖の上流のＴＩＲのヌクレオチド配列は、本発明において示されていない。重鎖ヌクレオチド配列の上流のＴＩＲの合成操作の目的は、セルトリズマブの発現に対するヌクレオチド置換の効果を検査することであった。
【0145】
１００μｌ容積の各セルトリズマブ含有サンプルを１４０００Ｘｇで５分間にわたり遠心沈殿させ、その後上清を分離し、合計１００μｌになるまでＨ２Ｏを注ぎ足した。次に、当該サンプルを９５℃で５分間にわたり煮沸する前に、それに１００μｌの２ｘサンプルバッファを添加し、その後、各ウェルに等量の容積をロードして、１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質レベルは、セルトリズマブに対する抗血清を用いた免疫ブロット法によって可視化された。結果は、左から右に、Ｄ３６、Ｅ８１、Ｅ８２及びＥ８３発現ベクターを示す図５に示されている通りである。
【0146】
図５におけるウェスタンブロットで示されている通り、Ｅ８３発現ベクターは培地画分において最高レベルのセルトリズマブ（図においてフラグメント抗体Ｆａｂ'として示されている）をもたらした。また、サンプル中にはＦａｂ'二量体及び遊離軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ：ＬＣ）及び重鎖（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ：ＨＣ）が存在した。
【0147】
例７－ＤＡＳｂｏｘ（登録商標）発酵槽における２０時間にわたる誘導発現後の総（培地及び細胞）画分のウェスタンブロット解析
セルトリズマブは、Ｄ３６、Ｅ８１、Ｅ８２、Ｅ８３発現ベクターを用いることにより発現された。
セルトリズマブは、Ｄ３６、Ｅ８１、Ｅ８２、Ｅ８３発現ベクターを用いることにより発現された。
【0148】
次に、５μｌ容積の各サンプルを９５℃で５分間にわたり煮沸する前に、それを１００μｌの２ｘサンプルバッファに添加し、各ウェルに等量の容積をロードして、１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質レベルは、セルトリズマブに対する抗血清を用いた免疫ブロット法によって可視化された。結果は、左から右に、Ｄ３６、Ｅ８１、Ｅ８２及びＥ８３発現ベクターを示す図６に示されている通りである。
【0149】
図６におけるウェスタンブロットに示されている通り、Ｅ８３発現ベクター（セルトリズマブ重鎖発現の制御のために合成的に進化させたＴＩＲを含む）は、図においてフラグメント抗体Ｆａｂ'として示されている通り、最高レベルのセルトリズマブをもたらした。
【0150】
例８－ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）及びＡＫＴＡクロマトグラフィ
セルトリズマブは、ＸＢ１７宿主細胞（大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓ）を用いることにより、（ｉ）未進化のＴＩＲ、及び、セルトリズマブの軽鎖及び重鎖についてのヌクレオチド配列の各々の上流にＰｅｌＢシグナルペプチドについての野生型ヌクレオチド配列を有するＤ３７発現ベクター、及び（ｉｉ）セルトリズマブ重鎖発現の制御のために合成的に操作されたＴＩＲを含む発現ベクターＥ８３、を用いることにより発現された。
セルトリズマブは、ＸＢ１７宿主細胞（大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓ）を用いることにより、（ｉ）未進化のＴＩＲ、及び、セルトリズマブの軽鎖及び重鎖についてのヌクレオチド配列の各々の上流にＰｅｌＢシグナルペプチドについての野生型ヌクレオチド配列を有するＤ３７発現ベクター、及び（ｉｉ）セルトリズマブ重鎖発現の制御のために合成的に操作されたＴＩＲを含む発現ベクターＥ８３、を用いることにより発現された。
【0151】
ＤＡＳｂｏｘ（登録商標）発酵槽における２０時間にわたる発現の後、発現系ＸＢ１０２及びＸＢ６２からの凍結清澄化ライセートを用いてセルトリズマブ精製動作を実施した。上記清澄化ライセートを、（１）約８００～９００バール（８８８ａｔｍ）で３継代にわたる均質化、（２）遠心分離、及び（３）０．４５ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）フィルタを用いた上清の濾過、によって調製した。より具体的には、各精製動作について、９．５ｍＬの清澄化ライセートをＡＫＴＡクロマトグラフィ系に連結されたＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（登録商標）ＣＨ１－ＸＬカラム（ＣＨ１ドメインについての選択性を有するアフィニティー樹脂）にロードし、アセンブルされたセルトリズマブの大部分を含む２８ｍＬの溶出相を各動作から収集した。
【0152】
収集した溶出プール内のタンパク質濃度を、２８０ｎｍの波長で、消衰係数を１．６として設定したＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）微容量ＵＶ－ＶＩＳ分光光度計を用いることにより測定した（その結果については、図７の「Ｎａｎｏｄｒｏｐ」というタイトルの列を参照）。次に、溶出プール内のタンパク質の総量は、２８ｍＬの溶出に測定された濃度を乗じることにより計算され得る。次に、収集した溶出プール内のタンパク質の総量をカラムにロードされた容積サンプルで割り、清澄化ライセート中の標的タンパク質の収率を計算し、これを２つのバッチ間で比較した。
【0153】
加えて、消衰係数を１．６として設定した（ＡＫＴＡ系の）Ｕｎｉｃｏｒｎ内部評価ソフトウェアを用いることにより、溶出相及びストライプ相全体を通じたタンパク質の量を計算することによっても、２度の動作を評価した（その結果については、図７の「ＡＫＴＡ」というタイトルの列を参照）。カラム上での精製に先立つ清澄化中に失われる採取物中の細胞塊の容積に起因して、力価値は収率値の２／３である。
【0154】
図７において要約されたＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標）及びＡＫＴＡ解析の両方からの結果は、（セルトリズマブ重鎖発現の制御のために）合成的に操作されたＴＩＲを含む発現ベクターＥ８３を有する発現系ＸＢ１０２が、（セルトリズマブ重鎖発現の制御のために合成的に操作されたＴＩＲを欠く発現ベクターＤ３７と比較した場合に）セルトリズマブの最高の収率及び力価をもたらすことを明確に示している。
【0155】
例９－宿主細胞ＸＢ１７及びＸＢ１６６におけるセルトリズマブ発現の比較
（セルトリズマブ重鎖発現の制御のために合成的に操作されたＴＩＲを含む）Ｅ８３発現ベクターを以下の宿主細胞内で用いた場合のセルトリズマブ発現レベルを解析した：
－ ＸＢ１７（大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓ）、及び
－ ＸＢ１６６（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒ）。
（セルトリズマブ重鎖発現の制御のために合成的に操作されたＴＩＲを含む）Ｅ８３発現ベクターを以下の宿主細胞内で用いた場合のセルトリズマブ発現レベルを解析した：
－ ＸＢ１７（大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓ）、及び
－ ＸＢ１６６（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒ）。
【0156】
ＤＡＳｂｏｘ（登録商標）発酵槽内での２０時間にわたる誘導発現の後に、１ｍｌのサンプルを、１３５００ｒｐｍで２０分間にわたり４℃で遠心分離した。ペレット及び培地画分を分離し、ペレットを０．５ｍｌの１００ｍＭトリスＨＣｌ／１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４で再懸濁した。次に、再懸濁液を完全にボルテックスした後、６０℃で１６時間にわたりインキュベートした。次に、ペレットサンプルを、１３５００ｒｐｍで２０分間にわたり４℃で遠心分離することにより清澄化した後、上清（抽出したペリプラズムサンプル）を収集し、ＤＮａｓｅ（最終濃度０．０２ｍｇ／ｍｌ）で処理した。サンプルを低タンパク質結合シリンジフィルタ（０．２μｍ、Ｓｐａｒｔａｎ１３、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で濾過した。ペリプラズム抽出後、サンプルを１４０００Ｘｇで５分間にわたり遠心分離し、その後、２０μｌの上清をアフィニティカラム（ＣＨ１－ＸＬ）－ＨＰＬＣを用いて直接解析した。タンパク質濃度を、既知の濃度を有する精製されたセルトリズマブを用いた標準曲線と比較した。
【0157】
図８において示されている結果は、ＸＢ１６６宿主細胞の使用が、宿主細胞ＸＢ１７における発現と比較した場合、セルトリズマブのより高い相対収率をもたらすことを示している。
【0158】
例１０－Ｅ８３及びＥ１１１発現ベクターを用いることによる宿主細胞ＸＢ１６６におけるセルトリズマブ発現の比較
Ｅ８３発現ベクターの上記の有利な効果（例６～９を参照）に起因して、（例５に記載の一般的な方法に従い）Ｅ８３発現ベクターを鋳型として使用し、軽鎖ＴＩＲを合成的に進化させた。得られた最高技術を有するベクターは、配列番号２０を有する軽鎖の上流にある合成的に進化させたＴＩＲ（ＴＩＲ－ＬＣ）を含んでいた。上記ベクターは、本発明においてＥ１１１と称される。
Ｅ８３発現ベクターの上記の有利な効果（例６～９を参照）に起因して、（例５に記載の一般的な方法に従い）Ｅ８３発現ベクターを鋳型として使用し、軽鎖ＴＩＲを合成的に進化させた。得られた最高技術を有するベクターは、配列番号２０を有する軽鎖の上流にある合成的に進化させたＴＩＲ（ＴＩＲ－ＬＣ）を含んでいた。上記ベクターは、本発明においてＥ１１１と称される。
【0159】
換言すれば、Ｅ１１１発現ベクターは、以下を含む：
－ セルトリズマブの軽鎖の発現を制御するための配列番号２０の合成的に進化させたＴＩＲ（ＴＩＲ－ＬＣ）；及び
－ セルトリズマブの重鎖の発現を制御するための配列番号２１の合成的に操作されたＴＩＲ（ＴＩＲ－ＨＣ）。この例は例９と類似しているが、セルトリズマブ発現の差異を代わりに以下の間で比較した点において異なる：
－ （セルトリズマブの重鎖のみを制御するための配列番号Ｎｏ．２１の合成的に操作されたＴＩＲを有する）Ｅ８３発現ベクターを含むＸＢ１６６宿主細胞、ここで宿主細胞及びベクターの組み合わせは、図９においてＸＢ１７４と称される；及び
－ セルトリズマブの軽鎖及び重鎖の発現をそれぞれ制御するための配列番号２０及び配列番号Ｎｏ．２１の合成的に構築されたＴＩＲを有する発現ベクターＥ１１１を含むＸＢ１６６宿主細胞。
－ セルトリズマブの軽鎖の発現を制御するための配列番号２０の合成的に進化させたＴＩＲ（ＴＩＲ－ＬＣ）；及び
－ セルトリズマブの重鎖の発現を制御するための配列番号２１の合成的に操作されたＴＩＲ（ＴＩＲ－ＨＣ）。この例は例９と類似しているが、セルトリズマブ発現の差異を代わりに以下の間で比較した点において異なる：
－ （セルトリズマブの重鎖のみを制御するための配列番号Ｎｏ．２１の合成的に操作されたＴＩＲを有する）Ｅ８３発現ベクターを含むＸＢ１６６宿主細胞、ここで宿主細胞及びベクターの組み合わせは、図９においてＸＢ１７４と称される；及び
－ セルトリズマブの軽鎖及び重鎖の発現をそれぞれ制御するための配列番号２０及び配列番号Ｎｏ．２１の合成的に構築されたＴＩＲを有する発現ベクターＥ１１１を含むＸＢ１６６宿主細胞。
【0160】
図９において示されている結果は、発現ベクターＥ１１１の使用が、Ｅ８３と比較した場合、セルトリズマブのより高い相対収率をもたらすことを示している。換言すれば、Ｅ１１１発現ベクターは、以下を含む：
－ 重鎖を制御するために合成的に操作されたＴＩＲ；及び
－ 軽鎖発現を制御するために合成的に進化させたＴＩＲを有しないＥ８３と比較した場合にセルトリズマブのより高い収率をもたらす、軽鎖を制御するために合成的に進化させたＴＩＲ。
－ 重鎖を制御するために合成的に操作されたＴＩＲ；及び
－ 軽鎖発現を制御するために合成的に進化させたＴＩＲを有しないＥ８３と比較した場合にセルトリズマブのより高い収率をもたらす、軽鎖を制御するために合成的に進化させたＴＩＲ。
【0161】
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【0162】
［項目１］
配列番号Ｎｏ．２０及び２１のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つ、ここで配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列はＴＩＲ配列である；及び
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ここで配列番号Ｎｏ．２０及び２１のヌクレオチド配列は、前記シグナルペプチドをコードする配列のうちの少なくとも最初の９ヌクレオチドを含む
を備える、組換えタンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物。
［項目２］
前記ＴＩＲ配列は、ｍＲＮＡ転写におけるタンパク質翻訳開始部位として機能するＲＮＡモチーフに転写される、項目１に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３］
前記ＤＮＡ構築物が配列番号Ｎｏ．２０のヌクレオチド配列のＴＩＲを含む場合、シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は配列番号Ｎｏ．１８のヌクレオチド配列を含む、項目１又は２に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４］
前記ＤＮＡ構築物が配列番号Ｎｏ．２１のヌクレオチド配列のＴＩＲを含む場合、シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は配列番号Ｎｏ．１９のヌクレオチド配列を含む、項目１～３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目５］
前記ＤＮＡ構築物は配列番号Ｎｏ．２０及び配列番号Ｎｏ．２１の前記ヌクレオチド配列を含み、シグナルペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列を含み、シグナルペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．１８の前記ヌクレオチド配列を含み、シグナルペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．１９の前記ヌクレオチド配列を含み、配列番号Ｎｏ．２０の前記ヌクレオチド配列は、少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含み、配列番号Ｎｏ．１８の前記ヌクレオチド配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含み、配列番号Ｎｏ．２１の前記ヌクレオチド配列は配列番号Ｎｏ．１９の前記ヌクレオチド配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含む、項目１～４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目６］
前記組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物であって、前記組換えタンパク質は好ましくは抗体であり、前記抗体は最も好ましくはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体又は前記抗体のうちのいずれかのフラグメントである、項目１～５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目７］
シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記組換えタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列に作用可能に連結される、項目１～６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目８］
前記組換えタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は；
抗体の軽鎖をコードする第１の核酸配列；及び
抗体の重鎖をコードする第２の核酸配列
を含む、項目１～７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目９］
シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は：
抗体の前記軽鎖をコードする第１のヌクレオチド配列；及び／又は
抗体の前記重鎖をコードする第２のヌクレオチド配列
に作用可能に連結される、項目８に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１０］
シャイン・ダルガーノ配列を含むＤＮＡ構築物であって、好ましくは、前記シャイン・ダルガーノ配列はシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列のＡＴＧ開始コドンより上流に位置し、より好ましくは、前記シャイン・ダルガーノ配列は抗体の前記軽鎖に作用可能に連結されたシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列の前記ＡＴＧ開始コドンより上流に位置する、項目１～９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１１］
抗体の前記軽鎖をコードする前記第１のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．３のアミノ酸配列をコードする、項目８～１０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１２］
抗体の前記重鎖をコードする前記第２のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．４のアミノ酸配列をコードする、項目８～１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１３］
抗体の前記軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする前記第１及び第２のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．３及び配列番号Ｎｏ．４の前記アミノ酸配列をそれぞれコードする、項目８～１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１４］
抗体の前記軽鎖をコードする前記第１のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．５のヌクレオチド配列を含む、項目８～１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１５］
抗体の前記重鎖をコードする前記第２のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．６のヌクレオチド配列を含む、項目８～１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１６］
抗体の前記軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする前記第１及び第２のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．５及び配列番号Ｎｏ．６のヌクレオチド配列をそれぞれ含む、項目８～１５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１７］
項目１～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
［項目１８］
細菌細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、最も好ましくはラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を含む染色体を有する大腸菌である、項目１～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む、又は項目１７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
［項目１９］
（ｉ）ＲｈａＢを不活性化するｒｈａＢ遺伝子の前記ヌクレオチド配列における突然変異を含む染色体、又は（ｉｉ）ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列が欠失した染色体、のいずれかを含む、項目１８に記載の宿主細胞。
［項目２０］
好ましくはＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列においてフレームシフト突然変異を含む染色体を有する大腸菌Ｗ３１１０である、項目１８又は１９に記載の宿主細胞。
［項目２１］
ａ．ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異；
ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む染色体を有する、項目１８～２０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目２２］
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、項目１８～２１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目２３］
項目１～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物によって発現されるＲＮＡ。
［項目２４］
項目１８～２２のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用を含む、組換えタンパク質を発現させる方法。
［項目２５］
前記宿主細胞から前記組換えタンパク質を回収する段階を更に含み；任意選択的に、前記回収された組換えタンパク質を、好ましくは１つ又は複数のクロマトグラフィ段階によって精製する１つ又は複数の段階を更に含む、項目２４に記載の方法。
［項目２６］
項目２４又は２５に記載の方法によって得られる組換えタンパク質。
［項目２７］
セルトリズマブは、（ｉ）配列番号３の前記アミノ酸配列を含む軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号４の前記アミノ酸配列を含む重鎖を有し、
前記ＤＮＡ構築物は、セルトリズマブをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡ構築物は、セルトリズマブの前記軽鎖及び／又はセルトリズマブの前記重鎖をコードする前記ヌクレオチド配列に転写方向において作用可能に連結されたシグナルペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を更に含み、
前記ＤＮＡ構築物は：
ｒｈａＢＡＤプロモーター、
ＲｈａＲ転写活性化因子、
ＲｈａＳ転写活性化因子、
抗生物質耐性マーカー、
少なくとも１つのターミネーター、及び
複製起点
をコードするヌクレオチド配列を更に含む、宿主細胞内でセルトリズマブを発現させるためのＤＮＡ構築物。
［項目２８］
前記抗生物質耐性マーカーをコードする前記ヌクレオチド配列に作用可能に連結されたプロモーターをコードするヌクレオチド配列を更に含む、項目２７に記載のＤＮＡ構築物。
［項目２９］
前記少なくとも１つのターミネーターは２つのターミネーターを有し、好ましくは、前記ターミネーターはｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーター及びｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターを含む、項目２８に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３０］
前記複製起点はｐＭＢ１複製起点を含む、項目２９に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３１］
前記抗生物質耐性マーカーはカナマイシン耐性マーカーであり、好ましくは配列番号１２の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むカナマイシン耐性マーカーである；
前記抗生物質耐性マーカーをコードする前記ヌクレオチド配列に作用可能に連結された前記プロモーターは、ＡｍｐＲプロモーター、好ましくは配列番号１３の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＡｍｐＲプロモーターである；
前記ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターは、配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；
前記ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターは、配列番号１５の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；及び／又は
前記ｐＭＢ１複製起点は、配列番号１６の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、
項目３０に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３２］
前記抗生物質耐性マーカーは、配列番号１２の前記ヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカーである；
前記抗生物質耐性マーカーをコードする前記ヌクレオチド配列に作用可能に連結された前記プロモーターは、配列番号１３の前記ヌクレオチド配列を含むＡｍｐＲプロモーターである；
前記ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターは、配列番号１４の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターは、配列番号１５の前記ヌクレオチド配列を含む；及び／又は
前記ｐＭＢ１複製起点は配列番号１６の前記ヌクレオチド配列を含む、
項目３１に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３３］
前記ｒｈａＢＡＤプロモーターは、配列番号８の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号８の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記ＲｈａＲ転写活性化因子は、配列番号９の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号９の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記ＲｈａＳ転写活性化因子は、配列番号１１の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１１の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記抗生物質耐性マーカーは、配列番号１２の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１２の前記ヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカーである；
前記ＡｍｐＲプロモーターは、配列番号１３の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１３の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターは、配列番号１４の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１４の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターは、配列番号１５の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１５の前記ヌクレオチド配列を含む；及び
前記ｐＭＢ１複製起点は、配列番号１６の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましく配列番号１６の前記ヌクレオチド配列を含む、
項目３１又は３２に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３４］
前記組換えタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ｒｈａＢＡＤプロモーターに作用可能に連結されている、項目２７～３３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３５］
セルトリズマブをコードする前記ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号５の前記配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むセルトリズマブの前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列、及び／又は（ｉｉ）配列番号６の前記配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むセルトリズマブの前記重鎖をコードするヌクレオチド配列を有する、項目２７～３４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３６］
セルトリズマブをコードする前記ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号５の前記配列を含むセルトリズマブの前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列、及び／又は（ｉｉ）配列番号６の前記配列を含むセルトリズマブの前記重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、項目２７～３４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３７］
シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号５及び配列番号６のヌクレオチド配列のいずれか一方又は両方に転写方向に作用可能に連結される、項目３６に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３８］
前記シグナルペプチドは、ＭａｌＥ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＤｓｂＡ及びＰｅｌｂからなる群から選択され、好ましくは、前記シグナルペプチドはＰｅｌＢである、項目２７～３７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３９］
配列番号Ｎｏ．２０及び２１の前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含むＤＮＡ構築物であって、配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列はＴＩＲ配列であり、配列番号Ｎｏ．２０及び２１のヌクレオチド配列は、前記シグナルペプチドをコードする配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含む、項目２７～３８のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４０］
前記シグナルペプチドはＰｅｌＢであり、前記軽鎖に前記転写方向に作用可能に連結された前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１８の前記配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項目２７～３９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４１］
前記軽鎖に前記転写方向に作用可能に連結された前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１８の前記配列を含む、項目４０に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４２］
配列番号Ｎｏ．２０のヌクレオチド配列のＴＩＲを含むＤＮＡ構築物であって、配列番号Ｎｏ．２０の前記ヌクレオチド配列は、前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする配列番号１８の前記ヌクレオチド配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含む、項目４０又は４１に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４３］
前記シグナルペプチドはＰｅｌＢであり、前記重鎖に前記転写方向に作用可能に連結された前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１９の前記配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項目２７～４２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４４］
前記重鎖に前記転写方向に作用可能に連結された前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１９の配列を含む、項目４３に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４５］
配列番号Ｎｏ．２１のヌクレオチド配列のＴＩＲを含むＤＮＡ構築物であって、配列番号Ｎｏ．２１の前記ヌクレオチド配列は、前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする配列番号１９の前記ヌクレオチド配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含む、項目４３又は４４に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４６］
配列番号１７の前記配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、好ましくは配列番号１７の配列を含む、項目２７～４５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４７］
項目２７～４６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
［項目４８］
細菌宿主細胞、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、最も好ましくはラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を含む染色体を有する大腸菌である、項目２７～４６のいずれかに記載のＤＮＡ構築物、又は項目４７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
［項目４９］
（ｉ）ＲｈａＢを不活性化する前記ｒｈａＢ遺伝子の前記ヌクレオチド配列における突然変異を含む染色体、又は（ｉｉ）ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列が欠失した染色体のいずれかを含む、項目４８に記載の宿主細胞。
［項目５０］
大腸菌Ｗ３１１０細胞であり、好ましくはＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列においてフレームシフト突然変異を含む染色体を有する、項目４８又は４９に記載の宿主細胞。
［項目５１］
ａ．ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異；
ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む染色体を有する、項目２２～２４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目５２］
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、項目２２～２５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目５３］
項目２７～４６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物によって発現されるＲＮＡ。
［項目５４］
項目４８～５２のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用を含む、セルトリズマブを発現させる方法。
［項目５５］
前記宿主細胞から前記セルトリズマブを回収する段階を更に含み；任意選択的に、前記回収されたセルトリズマブを、好ましくは１つ又は複数のクロマトグラフィ段階によって精製する１つ又は複数の段階を更に含む、項目５４に記載の方法。
［項目５６］
項目５４又は５５に記載の方法によって得られるセルトリズマブ。
［項目５７］
項目５４又は５５に記載の方法によって得られるセルトリズマブバイオシミラー。
［項目５８］
セルトリズマブバイオシミラー又はその誘導体であって、好ましくは、前記誘導体はポリエチレングリコール部分を含み、より好ましくは、前記誘導体は約４０ｋＤａのポリエチレングリコール部分を含む、薬剤としての使用のための項目５７に記載のセルトリズマブバイオシミラー又はその誘導体。
［項目５９］
クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎の治療における使用のための、項目５８に記載のセルトリズマブバイオシミラー。
［項目６０］
前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含み、前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．１８及び１９の前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含む、シグナルペプチドを発現させるためのＤＮＡ構築物。
［項目６１］
配列番号Ｎｏ．１８及び１９の前記ヌクレオチド配列の両方を含む、項目６０に記載のＤＮＡ構築物。
［項目６２］
配列番号Ｎｏ．１８の前記ヌクレオチド配列を含む、項目６０に記載のＤＮＡ構築物。
［項目６３］
配列番号Ｎｏ．１９の前記ヌクレオチド配列を含む、項目６０に記載のＤＮＡ構築物。
［項目６４］
項目６０～６３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
［項目６５］
好ましくは細菌細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、最も好ましくはラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を含む染色体を有する大腸菌である、項目６０～６３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、又は項目６４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
［項目６６］
（ｉ）ＲｈａＢを不活性化する前記ｒｈａＢ遺伝子の前記ヌクレオチド配列における突然変異を含む染色体、又は（ｉｉ）ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列が欠失した染色体のいずれかを含む、項目６５に記載の宿主細胞。
［項目６７］
大腸菌Ｗ３１１０であり、好ましくはＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列においてフレームシフト突然変異を含む染色体を有する、項目６５又は６６に記載の宿主細胞。
［項目６８］
ａ．ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異；
ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む染色体を有する、項目６５～６７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目６９］
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、項目６５～６８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目７０］
項目６０～６３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物によって発現されるＲＮＡ。
［項目７１］
項目６５～６９のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用を含む、シグナルペプチドを発現させる方法。
［項目７２］
配列番号Ｎｏ．７のアミノ酸配列を含む、項目７１に記載の方法によって得られるＰｅｌＢシグナルペプチド。
［項目７３］
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、前記アミノ酸配列は：
ｄ．セルトリズマブについての前記アミノ酸配列；
ｅ．セルトリズマブの軽鎖アミノ酸配列のＮ末端に融合した配列番号Ｎｏ．７のアミノ酸配列の第１のシグナルペプチド；及び
ｆ．セルトリズマブの重鎖アミノ酸配列のＮ末端に融合した配列番号Ｎｏ．７のアミノ酸配列の第２のシグナルペプチド
を含む、ＤＮＡ構築物。
［項目７４］
前記第１のシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．１８のヌクレオチド配列を含む、項目７３に記載のＤＮＡ構築物。
［項目７５］
前記第２のシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．１９のヌクレオチド配列を含む、項目７３に記載のＤＮＡ構築物。
［項目７６］
項目７３～７５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
［項目７７］
好ましくは細菌細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、最も好ましくはラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を含む染色体を有する大腸菌である、項目７３～７５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、又は項目７６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
［項目７８］
（ｉ）ＲｈａＢを不活性化する前記ｒｈａＢ遺伝子の前記ヌクレオチド配列における突然変異を含む染色体、又は（ｉｉ）ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列が欠失した染色体のいずれかを含む、項目７７に記載の宿主細胞。
［項目７９］
大腸菌Ｗ３１１０であり、好ましくはＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列においてフレームシフト突然変異を含む染色体を有する、項目７７又は７８に記載の宿主細胞。
［項目８０］
ａ．ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異；
ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む染色体を有する、項目７７～７９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目８１］
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、項目７７～８０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目８２］
項目７３～７５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物によって発現されるＲＮＡ。
［項目８３］
項目７７～８１のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用を含む、組換えタンパク質を発現させる方法。
［項目８４］
前記細菌宿主細胞から前記組換えタンパク質を回収する段階を更に含み；任意選択的に、前記回収された組換えタンパク質を、好ましくは１つ又は複数のクロマトグラフィ段階によって精製する１つ又は複数の段階を更に含む、項目８３に記載の方法。
［項目８５］
項目８３又は８４に記載の方法によって得られるセルトリズマブ。
［項目８６］
項目８３又は８４による方法によって得られるセルトリズマブバイオシミラー。
［項目８７］
セルトリズマブバイオシミラー又はその誘導体であって、好ましくは、前記誘導体はポリエチレングリコール部分を含み、より好ましくは、前記誘導体は約４０ｋＤａのポリエチレングリコール部分を含む、薬剤としての使用のための、項目８６に記載のセルトリズマブバイオシミラー又はその誘導体。
［項目８８］
クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎の治療における使用のための、項目８６又は８７に記載のセルトリズマブバイオシミラー。
［項目８９］
ａ．ラムノース代謝を無効にする、ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列における突然変異；
ｂ．（ｉ）ＤｅｇＰプロテアーゼの発現及び／又は（ｉｉ）ＤｅｇＰプロテアーゼの活性を無効にする、前記ｄｅｇＰ遺伝子における突然変異；
ｃ．Ｐｒｃプロテアーゼの発現及び／又はＰｒｃプロテアーゼの活性を無効にする、ｐｒｃ遺伝子における突然変異；及び
ｄ．前記ｓｐｒ遺伝子における突然変異
を含む染色体を特徴とする、組換えタンパク質の発現のために好適な宿主細胞。
［項目９０］
突然変異は、フレームシフト、欠失、置換及び挿入からなる群から選択される、項目８９に記載の宿主細胞。
［項目９１］
ラムノース代謝を無効にする、ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列における前記突然変異は、ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異である、項目８９又は９０に記載の宿主細胞。
［項目９２］
前記ｄｅｇＰ遺伝子における前記突然変異はｄｅｇＰ欠失である、項目８９～９１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目９３］
前記ｐｒｃ遺伝子における前記突然変異はｐｒｃ欠失である、項目８９～９２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目９４］
前記ｓｐｒ遺伝子における上記突然変異は、１４８位のトリプトファンがアルギニンに変化することをもたらす前記ｓｐｒ遺伝子における置換を特徴とするｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異である、項目８９～９３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目９５］
ａ．ラムノース代謝を無効にする、ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列における突然変異は、ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異である；
ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む、項目８９～９４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目９６］
前記宿主細胞は、細菌細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、最も好ましくは大腸菌Ｗ３１１０である、項目８９～９５のいずれか一項に記載の宿主。
［項目９７］
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、項目８９～９６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目９８］
前記宿主細胞は組換えタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を用いて形質転換され、前記組換えタンパク質は好ましくは抗体であり、前記抗体は最も好ましくはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体又は前記抗体のフラグメントである、項目８９～９７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目９９］
組換えタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を用いて、項目８９～９８のいずれか一項に記載の宿主細胞を形質転換させる；
得られた形質転換された宿主細胞をラムノースに曝露し、それにより前記組換えタンパク質の発現を誘導する；及び
前記宿主細胞から前記組換えタンパク質を回収する
段階を有し、任意選択的に、前記回収された組換えタンパク質を、好ましくは１つ又は複数のクロマトグラフィ段階によって精製する１つ又は複数の段階を更に有する、組換えタンパク質を発現させる方法。
［項目１００］
前記組換えタンパク質は抗体であり、前記抗体は好ましくはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体又は前記抗体のフラグメントであり、より好ましくはＦａｂ'フラグメントであり、最も好ましくはセルトリズマブである、項目９９に記載の方法。
配列番号Ｎｏ．２０及び２１のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つ、ここで配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列はＴＩＲ配列である；及び
シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ここで配列番号Ｎｏ．２０及び２１のヌクレオチド配列は、前記シグナルペプチドをコードする配列のうちの少なくとも最初の９ヌクレオチドを含む
を備える、組換えタンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物。
［項目２］
前記ＴＩＲ配列は、ｍＲＮＡ転写におけるタンパク質翻訳開始部位として機能するＲＮＡモチーフに転写される、項目１に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３］
前記ＤＮＡ構築物が配列番号Ｎｏ．２０のヌクレオチド配列のＴＩＲを含む場合、シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は配列番号Ｎｏ．１８のヌクレオチド配列を含む、項目１又は２に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４］
前記ＤＮＡ構築物が配列番号Ｎｏ．２１のヌクレオチド配列のＴＩＲを含む場合、シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は配列番号Ｎｏ．１９のヌクレオチド配列を含む、項目１～３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目５］
前記ＤＮＡ構築物は配列番号Ｎｏ．２０及び配列番号Ｎｏ．２１の前記ヌクレオチド配列を含み、シグナルペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列を含み、シグナルペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．１８の前記ヌクレオチド配列を含み、シグナルペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．１９の前記ヌクレオチド配列を含み、配列番号Ｎｏ．２０の前記ヌクレオチド配列は、少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含み、配列番号Ｎｏ．１８の前記ヌクレオチド配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含み、配列番号Ｎｏ．２１の前記ヌクレオチド配列は配列番号Ｎｏ．１９の前記ヌクレオチド配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含む、項目１～４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目６］
前記組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物であって、前記組換えタンパク質は好ましくは抗体であり、前記抗体は最も好ましくはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体又は前記抗体のうちのいずれかのフラグメントである、項目１～５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目７］
シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記組換えタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列に作用可能に連結される、項目１～６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目８］
前記組換えタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は；
抗体の軽鎖をコードする第１の核酸配列；及び
抗体の重鎖をコードする第２の核酸配列
を含む、項目１～７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目９］
シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は：
抗体の前記軽鎖をコードする第１のヌクレオチド配列；及び／又は
抗体の前記重鎖をコードする第２のヌクレオチド配列
に作用可能に連結される、項目８に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１０］
シャイン・ダルガーノ配列を含むＤＮＡ構築物であって、好ましくは、前記シャイン・ダルガーノ配列はシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列のＡＴＧ開始コドンより上流に位置し、より好ましくは、前記シャイン・ダルガーノ配列は抗体の前記軽鎖に作用可能に連結されたシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列の前記ＡＴＧ開始コドンより上流に位置する、項目１～９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１１］
抗体の前記軽鎖をコードする前記第１のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．３のアミノ酸配列をコードする、項目８～１０のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１２］
抗体の前記重鎖をコードする前記第２のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．４のアミノ酸配列をコードする、項目８～１１のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１３］
抗体の前記軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする前記第１及び第２のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．３及び配列番号Ｎｏ．４の前記アミノ酸配列をそれぞれコードする、項目８～１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１４］
抗体の前記軽鎖をコードする前記第１のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．５のヌクレオチド配列を含む、項目８～１３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１５］
抗体の前記重鎖をコードする前記第２のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．６のヌクレオチド配列を含む、項目８～１４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１６］
抗体の前記軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする前記第１及び第２のヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．５及び配列番号Ｎｏ．６のヌクレオチド配列をそれぞれ含む、項目８～１５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目１７］
項目１～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
［項目１８］
細菌細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、最も好ましくはラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を含む染色体を有する大腸菌である、項目１～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む、又は項目１７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
［項目１９］
（ｉ）ＲｈａＢを不活性化するｒｈａＢ遺伝子の前記ヌクレオチド配列における突然変異を含む染色体、又は（ｉｉ）ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列が欠失した染色体、のいずれかを含む、項目１８に記載の宿主細胞。
［項目２０］
好ましくはＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列においてフレームシフト突然変異を含む染色体を有する大腸菌Ｗ３１１０である、項目１８又は１９に記載の宿主細胞。
［項目２１］
ａ．ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異；
ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む染色体を有する、項目１８～２０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目２２］
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、項目１８～２１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目２３］
項目１～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物によって発現されるＲＮＡ。
［項目２４］
項目１８～２２のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用を含む、組換えタンパク質を発現させる方法。
［項目２５］
前記宿主細胞から前記組換えタンパク質を回収する段階を更に含み；任意選択的に、前記回収された組換えタンパク質を、好ましくは１つ又は複数のクロマトグラフィ段階によって精製する１つ又は複数の段階を更に含む、項目２４に記載の方法。
［項目２６］
項目２４又は２５に記載の方法によって得られる組換えタンパク質。
［項目２７］
セルトリズマブは、（ｉ）配列番号３の前記アミノ酸配列を含む軽鎖、及び（ｉｉ）配列番号４の前記アミノ酸配列を含む重鎖を有し、
前記ＤＮＡ構築物は、セルトリズマブをコードするヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡ構築物は、セルトリズマブの前記軽鎖及び／又はセルトリズマブの前記重鎖をコードする前記ヌクレオチド配列に転写方向において作用可能に連結されたシグナルペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列を更に含み、
前記ＤＮＡ構築物は：
ｒｈａＢＡＤプロモーター、
ＲｈａＲ転写活性化因子、
ＲｈａＳ転写活性化因子、
抗生物質耐性マーカー、
少なくとも１つのターミネーター、及び
複製起点
をコードするヌクレオチド配列を更に含む、宿主細胞内でセルトリズマブを発現させるためのＤＮＡ構築物。
［項目２８］
前記抗生物質耐性マーカーをコードする前記ヌクレオチド配列に作用可能に連結されたプロモーターをコードするヌクレオチド配列を更に含む、項目２７に記載のＤＮＡ構築物。
［項目２９］
前記少なくとも１つのターミネーターは２つのターミネーターを有し、好ましくは、前記ターミネーターはｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーター及びｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターを含む、項目２８に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３０］
前記複製起点はｐＭＢ１複製起点を含む、項目２９に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３１］
前記抗生物質耐性マーカーはカナマイシン耐性マーカーであり、好ましくは配列番号１２の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むカナマイシン耐性マーカーである；
前記抗生物質耐性マーカーをコードする前記ヌクレオチド配列に作用可能に連結された前記プロモーターは、ＡｍｐＲプロモーター、好ましくは配列番号１３の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むＡｍｐＲプロモーターである；
前記ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターは、配列番号１４のヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；
前記ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターは、配列番号１５の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む；及び／又は
前記ｐＭＢ１複製起点は、配列番号１６の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、
項目３０に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３２］
前記抗生物質耐性マーカーは、配列番号１２の前記ヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカーである；
前記抗生物質耐性マーカーをコードする前記ヌクレオチド配列に作用可能に連結された前記プロモーターは、配列番号１３の前記ヌクレオチド配列を含むＡｍｐＲプロモーターである；
前記ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターは、配列番号１４の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターは、配列番号１５の前記ヌクレオチド配列を含む；及び／又は
前記ｐＭＢ１複製起点は配列番号１６の前記ヌクレオチド配列を含む、
項目３１に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３３］
前記ｒｈａＢＡＤプロモーターは、配列番号８の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号８の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記ＲｈａＲ転写活性化因子は、配列番号９の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号９の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記ＲｈａＳ転写活性化因子は、配列番号１１の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１１の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記抗生物質耐性マーカーは、配列番号１２の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１２の前記ヌクレオチド配列を含むカナマイシン耐性マーカーである；
前記ＡｍｐＲプロモーターは、配列番号１３の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１３の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記ｒｒｎＢ Ｔ１ターミネーターは、配列番号１４の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１４の前記ヌクレオチド配列を含む；
前記ｒｒｎＢ Ｔ２ターミネーターは、配列番号１５の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましくは配列番号１５の前記ヌクレオチド配列を含む；及び
前記ｐＭＢ１複製起点は、配列番号１６の前記ヌクレオチド配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、好ましく配列番号１６の前記ヌクレオチド配列を含む、
項目３１又は３２に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３４］
前記組換えタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、前記ｒｈａＢＡＤプロモーターに作用可能に連結されている、項目２７～３３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３５］
セルトリズマブをコードする前記ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号５の前記配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むセルトリズマブの前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列、及び／又は（ｉｉ）配列番号６の前記配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むセルトリズマブの前記重鎖をコードするヌクレオチド配列を有する、項目２７～３４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３６］
セルトリズマブをコードする前記ヌクレオチド配列は、（ｉ）配列番号５の前記配列を含むセルトリズマブの前記軽鎖をコードするヌクレオチド配列、及び／又は（ｉｉ）配列番号６の前記配列を含むセルトリズマブの前記重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む、項目２７～３４のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３７］
シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号５及び配列番号６のヌクレオチド配列のいずれか一方又は両方に転写方向に作用可能に連結される、項目３６に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３８］
前記シグナルペプチドは、ＭａｌＥ、ＯｍｐＡ、ＰｈｏＡ、ＤｓｂＡ及びＰｅｌｂからなる群から選択され、好ましくは、前記シグナルペプチドはＰｅｌＢである、項目２７～３７のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目３９］
配列番号Ｎｏ．２０及び２１の前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含むＤＮＡ構築物であって、配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列はＴＩＲ配列であり、配列番号Ｎｏ．２０及び２１のヌクレオチド配列は、前記シグナルペプチドをコードする配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含む、項目２７～３８のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４０］
前記シグナルペプチドはＰｅｌＢであり、前記軽鎖に前記転写方向に作用可能に連結された前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１８の前記配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項目２７～３９のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４１］
前記軽鎖に前記転写方向に作用可能に連結された前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１８の前記配列を含む、項目４０に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４２］
配列番号Ｎｏ．２０のヌクレオチド配列のＴＩＲを含むＤＮＡ構築物であって、配列番号Ｎｏ．２０の前記ヌクレオチド配列は、前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする配列番号１８の前記ヌクレオチド配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含む、項目４０又は４１に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４３］
前記シグナルペプチドはＰｅｌＢであり、前記重鎖に前記転写方向に作用可能に連結された前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１９の前記配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む、項目２７～４２のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４４］
前記重鎖に前記転写方向に作用可能に連結された前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号１９の配列を含む、項目４３に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４５］
配列番号Ｎｏ．２１のヌクレオチド配列のＴＩＲを含むＤＮＡ構築物であって、配列番号Ｎｏ．２１の前記ヌクレオチド配列は、前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする配列番号１９の前記ヌクレオチド配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含む、項目４３又は４４に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４６］
配列番号１７の前記配列又はそれに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、好ましくは配列番号１７の配列を含む、項目２７～４５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物。
［項目４７］
項目２７～４６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
［項目４８］
細菌宿主細胞、好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、最も好ましくはラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を含む染色体を有する大腸菌である、項目２７～４６のいずれかに記載のＤＮＡ構築物、又は項目４７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
［項目４９］
（ｉ）ＲｈａＢを不活性化する前記ｒｈａＢ遺伝子の前記ヌクレオチド配列における突然変異を含む染色体、又は（ｉｉ）ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列が欠失した染色体のいずれかを含む、項目４８に記載の宿主細胞。
［項目５０］
大腸菌Ｗ３１１０細胞であり、好ましくはＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列においてフレームシフト突然変異を含む染色体を有する、項目４８又は４９に記載の宿主細胞。
［項目５１］
ａ．ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異；
ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む染色体を有する、項目２２～２４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目５２］
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、項目２２～２５のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目５３］
項目２７～４６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物によって発現されるＲＮＡ。
［項目５４］
項目４８～５２のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用を含む、セルトリズマブを発現させる方法。
［項目５５］
前記宿主細胞から前記セルトリズマブを回収する段階を更に含み；任意選択的に、前記回収されたセルトリズマブを、好ましくは１つ又は複数のクロマトグラフィ段階によって精製する１つ又は複数の段階を更に含む、項目５４に記載の方法。
［項目５６］
項目５４又は５５に記載の方法によって得られるセルトリズマブ。
［項目５７］
項目５４又は５５に記載の方法によって得られるセルトリズマブバイオシミラー。
［項目５８］
セルトリズマブバイオシミラー又はその誘導体であって、好ましくは、前記誘導体はポリエチレングリコール部分を含み、より好ましくは、前記誘導体は約４０ｋＤａのポリエチレングリコール部分を含む、薬剤としての使用のための項目５７に記載のセルトリズマブバイオシミラー又はその誘導体。
［項目５９］
クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎の治療における使用のための、項目５８に記載のセルトリズマブバイオシミラー。
［項目６０］
前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列を含み、前記ＰｅｌＢシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．１８及び１９の前記ヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含む、シグナルペプチドを発現させるためのＤＮＡ構築物。
［項目６１］
配列番号Ｎｏ．１８及び１９の前記ヌクレオチド配列の両方を含む、項目６０に記載のＤＮＡ構築物。
［項目６２］
配列番号Ｎｏ．１８の前記ヌクレオチド配列を含む、項目６０に記載のＤＮＡ構築物。
［項目６３］
配列番号Ｎｏ．１９の前記ヌクレオチド配列を含む、項目６０に記載のＤＮＡ構築物。
［項目６４］
項目６０～６３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
［項目６５］
好ましくは細菌細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、最も好ましくはラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を含む染色体を有する大腸菌である、項目６０～６３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、又は項目６４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
［項目６６］
（ｉ）ＲｈａＢを不活性化する前記ｒｈａＢ遺伝子の前記ヌクレオチド配列における突然変異を含む染色体、又は（ｉｉ）ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列が欠失した染色体のいずれかを含む、項目６５に記載の宿主細胞。
［項目６７］
大腸菌Ｗ３１１０であり、好ましくはＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列においてフレームシフト突然変異を含む染色体を有する、項目６５又は６６に記載の宿主細胞。
［項目６８］
ａ．ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異；
ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む染色体を有する、項目６５～６７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目６９］
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、項目６５～６８のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目７０］
項目６０～６３のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物によって発現されるＲＮＡ。
［項目７１］
項目６５～６９のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用を含む、シグナルペプチドを発現させる方法。
［項目７２］
配列番号Ｎｏ．７のアミノ酸配列を含む、項目７１に記載の方法によって得られるＰｅｌＢシグナルペプチド。
［項目７３］
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を有し、前記アミノ酸配列は：
ｄ．セルトリズマブについての前記アミノ酸配列；
ｅ．セルトリズマブの軽鎖アミノ酸配列のＮ末端に融合した配列番号Ｎｏ．７のアミノ酸配列の第１のシグナルペプチド；及び
ｆ．セルトリズマブの重鎖アミノ酸配列のＮ末端に融合した配列番号Ｎｏ．７のアミノ酸配列の第２のシグナルペプチド
を含む、ＤＮＡ構築物。
［項目７４］
前記第１のシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．１８のヌクレオチド配列を含む、項目７３に記載のＤＮＡ構築物。
［項目７５］
前記第２のシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、配列番号Ｎｏ．１９のヌクレオチド配列を含む、項目７３に記載のＤＮＡ構築物。
［項目７６］
項目７３～７５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
［項目７７］
好ましくは細菌細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、最も好ましくはラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を含む染色体を有する大腸菌である、項目７３～７５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物、又は項目７６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
［項目７８］
（ｉ）ＲｈａＢを不活性化する前記ｒｈａＢ遺伝子の前記ヌクレオチド配列における突然変異を含む染色体、又は（ｉｉ）ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列が欠失した染色体のいずれかを含む、項目７７に記載の宿主細胞。
［項目７９］
大腸菌Ｗ３１１０であり、好ましくはＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列においてフレームシフト突然変異を含む染色体を有する、項目７７又は７８に記載の宿主細胞。
［項目８０］
ａ．ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異；
ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む染色体を有する、項目７７～７９のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目８１］
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、項目７７～８０のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目８２］
項目７３～７５のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物によって発現されるＲＮＡ。
［項目８３］
項目７７～８１のいずれか一項に記載の宿主細胞の使用を含む、組換えタンパク質を発現させる方法。
［項目８４］
前記細菌宿主細胞から前記組換えタンパク質を回収する段階を更に含み；任意選択的に、前記回収された組換えタンパク質を、好ましくは１つ又は複数のクロマトグラフィ段階によって精製する１つ又は複数の段階を更に含む、項目８３に記載の方法。
［項目８５］
項目８３又は８４に記載の方法によって得られるセルトリズマブ。
［項目８６］
項目８３又は８４による方法によって得られるセルトリズマブバイオシミラー。
［項目８７］
セルトリズマブバイオシミラー又はその誘導体であって、好ましくは、前記誘導体はポリエチレングリコール部分を含み、より好ましくは、前記誘導体は約４０ｋＤａのポリエチレングリコール部分を含む、薬剤としての使用のための、項目８６に記載のセルトリズマブバイオシミラー又はその誘導体。
［項目８８］
クローン病、関節リウマチ、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎の治療における使用のための、項目８６又は８７に記載のセルトリズマブバイオシミラー。
［項目８９］
ａ．ラムノース代謝を無効にする、ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列における突然変異；
ｂ．（ｉ）ＤｅｇＰプロテアーゼの発現及び／又は（ｉｉ）ＤｅｇＰプロテアーゼの活性を無効にする、前記ｄｅｇＰ遺伝子における突然変異；
ｃ．Ｐｒｃプロテアーゼの発現及び／又はＰｒｃプロテアーゼの活性を無効にする、ｐｒｃ遺伝子における突然変異；及び
ｄ．前記ｓｐｒ遺伝子における突然変異
を含む染色体を特徴とする、組換えタンパク質の発現のために好適な宿主細胞。
［項目９０］
突然変異は、フレームシフト、欠失、置換及び挿入からなる群から選択される、項目８９に記載の宿主細胞。
［項目９１］
ラムノース代謝を無効にする、ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列における前記突然変異は、ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異である、項目８９又は９０に記載の宿主細胞。
［項目９２］
前記ｄｅｇＰ遺伝子における前記突然変異はｄｅｇＰ欠失である、項目８９～９１のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目９３］
前記ｐｒｃ遺伝子における前記突然変異はｐｒｃ欠失である、項目８９～９２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目９４］
前記ｓｐｒ遺伝子における上記突然変異は、１４８位のトリプトファンがアルギニンに変化することをもたらす前記ｓｐｒ遺伝子における置換を特徴とするｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異である、項目８９～９３のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目９５］
ａ．ラムノース代謝を無効にする、ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列における突然変異は、ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異である；
ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む、項目８９～９４のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目９６］
前記宿主細胞は、細菌細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、最も好ましくは大腸菌Ｗ３１１０である、項目８９～９５のいずれか一項に記載の宿主。
［項目９７］
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、項目８９～９６のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目９８］
前記宿主細胞は組換えタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を用いて形質転換され、前記組換えタンパク質は好ましくは抗体であり、前記抗体は最も好ましくはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体又は前記抗体のフラグメントである、項目８９～９７のいずれか一項に記載の宿主細胞。
［項目９９］
組換えタンパク質をコードするＤＮＡ構築物を用いて、項目８９～９８のいずれか一項に記載の宿主細胞を形質転換させる；
得られた形質転換された宿主細胞をラムノースに曝露し、それにより前記組換えタンパク質の発現を誘導する；及び
前記宿主細胞から前記組換えタンパク質を回収する
段階を有し、任意選択的に、前記回収された組換えタンパク質を、好ましくは１つ又は複数のクロマトグラフィ段階によって精製する１つ又は複数の段階を更に有する、組換えタンパク質を発現させる方法。
［項目１００］
前記組換えタンパク質は抗体であり、前記抗体は好ましくはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体又は前記抗体のフラグメントであり、より好ましくはＦａｂ'フラグメントであり、最も好ましくはセルトリズマブである、項目９９に記載の方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-23
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つであって、ここで配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列はＴＩＲ配列である、配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つ；及びシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列；を備え、
ここで配列番号２０及び２１のヌクレオチド配列は、前記シグナルペプチドをコードする配列のうちの少なくとも最初の９ヌクレオチドを含む、
組換えタンパク質を発現させるためのＤＮＡ構築物。
【請求項2】
前記ＴＩＲ配列は、ｍＲＮＡ転写におけるタンパク質翻訳開始部位として機能するＲＮＡモチーフに転写される、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項3】
前記ＤＮＡ構築物が配列番号２０のヌクレオチド配列のＴＩＲを含む場合、シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は配列番号１８のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項4】
前記ＤＮＡ構築物が配列番号２１のヌクレオチド配列のＴＩＲを含む場合、シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は配列番号１９のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項5】
前記ＤＮＡ構築物は配列番号２０及び配列番号２１の前記ヌクレオチド配列を含み、シグナルペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列を含み、シグナルペプチドをコードする第１のヌクレオチド配列は、配列番号１８の前記ヌクレオチド配列を含み、シグナルペプチドをコードする第２のヌクレオチド配列は、配列番号１９の前記ヌクレオチド配列を含み、配列番号２０の前記ヌクレオチド配列は、少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含み、配列番号１８の前記ヌクレオチド配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含み、配列番号２１の前記ヌクレオチド配列は配列番号１９の前記ヌクレオチド配列の少なくとも前記最初の９ヌクレオチドを含む、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項6】
前記組換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物であって、前記組換えタンパク質は好ましくは抗体であり、前記抗体は最も好ましくはモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体又は前記抗体のうちのいずれかのフラグメントである、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項7】
シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は、前記組換えタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列に作用可能に連結される、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項8】
前記組換えタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は；抗体の軽鎖をコードする第１の核酸配列；及び
抗体の重鎖をコードする第２の核酸配列
を含む、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項9】
シグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列は：抗体の前記軽鎖をコードする第１のヌクレオチド配列；及び／又は
抗体の前記重鎖をコードする第２のヌクレオチド配列
に作用可能に連結される、請求項８に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項10】
シャイン・ダルガーノ配列を含むＤＮＡ構築物であって、好ましくは、前記シャイン・ダルガーノ配列はシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列のＡＴＧ開始コドンより上流に位置し、より好ましくは、前記シャイン・ダルガーノ配列は抗体の軽鎖に作用可能に連結されたシグナルペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列の前記ＡＴＧ開始コドンより上流に位置する、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項11】
抗体の前記軽鎖をコードする前記第１のヌクレオチド配列は、配列番号３のアミノ酸配列をコードする、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項12】
抗体の前記重鎖をコードする前記第２のヌクレオチド配列は、配列番号４のアミノ酸配列をコードする、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項13】
抗体の前記軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする前記第１のヌクレオチド配列及び前記第２のヌクレオチド配列は、配列番号３及び配列番号４のアミノ酸配列をそれぞれコードする、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項14】
抗体の前記軽鎖をコードする前記第１のヌクレオチド配列は、配列番号５のヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項15】
抗体の前記重鎖をコードする前記第２のヌクレオチド配列は、配列番号６のヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項16】
抗体の前記軽鎖及び重鎖をそれぞれコードする前記第１のヌクレオチド配列及び前記第２のヌクレオチド配列は、配列番号５及び配列番号６のヌクレオチド配列をそれぞれ含む、請求項９に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
【請求項18】
細菌細胞、より好ましくは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、最も好ましくはラムノース代謝を無効にする突然変異又は修飾を含む染色体を有する大腸菌である、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＤＮＡ構築物を含む、又は請求項１７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項19】
（ｉ）ＲｈａＢを不活性化するｒｈａＢ遺伝子の前記ヌクレオチド配列における突然変異を含む染色体、又は（ｉｉ）ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列が欠失した染色体、のいずれかを含む、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項20】
好ましくはＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列においてフレームシフト突然変異を含む染色体を有する大腸菌Ｗ３１１０である、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項21】
ａ．ＲｈａＢをコードする前記ヌクレオチド配列におけるフレームシフト突然変異；ｂ．ｄｅｇＰ欠失；
ｃ．ｐｒｃ欠失；及び
ｄ．ｓｐｒＷ１４８Ｒ突然変異
を含む染色体を有する、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項22】
大腸菌Ｗ３１１０ ｒｈａＢｆｓΔＤｅｇＰΔｐｒｃ ｓｐｒＷ１４８Ｒである、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項23】
請求項１に記載のＤＮＡ構築物によって発現されるＲＮＡ。
【請求項24】
請求項１８に記載の宿主細胞の使用を含む、組換えタンパク質を発現させる方法。
【請求項25】
前記宿主細胞から前記組換えタンパク質を回収する段階を更に含み；任意選択的に、前記回収された組換えタンパク質を、好ましくは１つ又は複数のクロマトグラフィ段階によって精製する１つ又は複数の段階を更に含む、請求項２４に記載の方法。
【国際調査報告】