特表 2024-534612 ポリ乳酸を生産する遺伝子工学菌株及びポリ乳酸を生産する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-20

(54)【発明の名称】ポリ乳酸を生産する遺伝子工学菌株及びポリ乳酸を生産する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20240912BHJP

   C12N 9/04 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 9/10 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/53 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20240912BHJP

   C12P 7/56 20060101ALI20240912BHJP

   C12P 7/62 20220101ALI20240912BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20240912BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20240912BHJP

【ＦＩ】

C12N1/21 ZNA

C12N9/04 Z

C12N9/10

C12N15/53

C12N15/54

C12P7/56

C12P7/62

C12N15/31

C12N15/52 Z

C12N9/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024518773

(86)(22)【出願日】2022-08-19

(85)【翻訳文提出日】2024-05-13

(86)【国際出願番号】 CN2022113485

(87)【国際公開番号】W WO2023051077

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】202111147519.9

(32)【優先日】2021-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524113068

【氏名又は名称】シャンハイ スーポン テクノロジー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＳＩＰＥＮＧ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ４，Ｎｏ．８７８ Ｊｉａｎｃｈｕａｎ Ｒｏａｄ，Ｍｉｎｈａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ，Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０１１１１ ＣＨＩＮＡ

(74)【代理人】

【識別番号】110002734

【氏名又は名称】弁理士法人藤本パートナーズ

(72)【発明者】

【氏名】タオ，フェイ

(72)【発明者】

【氏名】タン，チュンリン

(72)【発明者】

【氏名】シー，ピン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AD83

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064CD01

4B064CE03

4B064CE08

4B064DA16

4B064DA20

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA23Y

4B065AA41Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA01

4B065BD14

4B065CA11

4B065CA27

4B065CA28

4B065CA29

4B065CA60

(57)【要約】

ポリ乳酸を生産する遺伝子工学菌株及びポリ乳酸を生産する方法を提供し、該方法は、Ｄ－乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、プロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ遺伝子及びポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素遺伝子を目的遺伝子に合成し、ベクターと二重酵素切断し、精製後、感受容体細胞を形質転換し、組換えプラスミドを得るステップと、組換えプラスミドのＤＮＡを抽出し、工学菌株に導入し、抽出、検証し、遺伝子工学細胞菌株を得るステップと、その後、培地中に培養し、培地中に二酸化炭素を導入し、光照条件で遠心分離、乾燥、回収するステップと、を含む。本発明は、天然的なシアノバクテリアを改造するとともに、高密度発酵戦略を採用することによって、シアノバクテリアのバイオマスが非常に大きく向上し、本発明は、従来の技術におけるポリ乳酸の生産には糖由来の原料のみを使用するという問題を解決する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細長いシネココッカスの遺伝子工学菌株であって、前記遺伝子工学菌株のゲノムに外因性のＤ－乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列、外因性のプロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ遺伝子のコード配列及び外因性のポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素遺伝子のコード配列を統合することにより、前記遺伝子工学菌株は、外因性のＤ－乳酸デヒドロゲナーゼ、外因性のプロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ及び外因性のポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素を発現することができる、ことを特徴とする細長いシネココッカスの遺伝子工学菌株。

【請求項2】

前記Ｄ－乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列は、Ｐ_ｔｒｃプロモーター、Ｐ_ｐｓｂａプロモーターまたはＰ_{ｃｐｃ５６０}プロモーターによって制御される、請求項１に記載の遺伝子工学菌株。

【請求項3】

前記プロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ遺伝子のコード配列は、Ｐ_ｔｒｃプロモーター、Ｐ_ｐｓｂａプロモーターまたはＰ_{ｃｐｃ５６０}プロモーターによって制御される、請求項１に記載の遺伝子工学菌株。

【請求項4】

前記ポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素遺伝子のコード配列は、Ｐ_ｔｒｃプロモーター、Ｐ_ｐｓｂａプロモーターまたはＰ_{ｃｐｃ５６０}プロモーターによって制御される、請求項１に記載の遺伝子工学菌株。

【請求項5】

前記外因性のＤ－乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列はブルガリア乳酸菌に由来し、前記外因性のプロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ遺伝子のコード配列はプロピオン酸クロストリジウムに由来し、前記外因性のポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素遺伝子のコード配列はシュードモナスに由来する、請求項１に記載の遺伝子工学菌株。

【請求項6】

前記遺伝子工学菌株のゲノムに外因性のアセチル補酵素Ａ合成酵素遺伝子のコード配列を統合することにより、前記遺伝子工学菌株は、外因性のアセチル補酵素Ａ合成酵素遺伝子を発現することができる、請求項１に記載の遺伝子工学菌株。

【請求項7】

前記遺伝子工学菌株の酢酸キナーゼ遺伝子の発現がノックダウンされる、請求項１に記載の遺伝子工学菌株。

【請求項8】

前記遺伝子工学菌株のゲノムに酢酸キナーゼ遺伝子の発現を抑制する外因性のｓＲＮＡのコード配列が統合される、請求項７に記載の遺伝子工学菌株。

【請求項9】

前記遺伝子工学菌株のアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ遺伝子、ケトジェニック合成酵素遺伝子及び／又はβ－ケトアシル－ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩ遺伝子の発現がノックダウンされる、請求項１に記載の遺伝子工学菌株。

【請求項10】

前記遺伝子工学菌株のゲノムにそれぞれアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ遺伝子、ケトジェニック合成酵素遺伝子及び／又はβ－ケトアシル－ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩ遺伝子の発現を抑制できる外因性のｓＲＮＡのコード配列が統合される、請求項９に記載の遺伝子工学菌株。

【請求項11】

前記遺伝子工学菌株は細長いシネココッカスＰＣＣ ７９４２菌株である、請求項１～１０のいずれかに記載の遺伝子工学菌株。

【請求項12】

二酸化炭素を利用してポリ乳酸を生産する方法であって、
１）請求項１～１１のいずれかに記載の細長いシネココッカスの遺伝子工学菌株を提供するステップと、
２）二酸化炭素を導入して光照条件下で前記遺伝子工学菌株を培養するステップと、
３）前記遺伝子工学菌株の成長ＯＤが最大値に達すると、前記遺伝子工学菌株を収集して乾燥し、前記遺伝子工学菌株内のポリ乳酸を回収するステップと、を含む、二酸化炭素を利用してポリ乳酸を生産する方法。

【請求項13】

ステップ２）では、前記二酸化炭素の通気量は１．５ｖｖｍであり、導入される二酸化炭素と空気との体積比は１：（１－１０）である、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

ステップ２）では、前記光照の強度は１２５μｍｏｌ光量子ｍ^－２ｓ^－１から１０００μｍｏｌ光量子ｍ^－２ｓ^－１未満であり、好ましくは、前記光照の強度は１２５－５００μｍｏｌ光量子ｍ^－２ｓ^－１である、請求項１２に記載の方法。

【請求項15】

ステップ２）では、炭酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、クエン酸、クエン酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸、ホウ酸、塩化マンガン、硫酸亜鉛、モリブデン酸ナトリウム、硫酸銅及び硝酸コバルトを含む培地で前記遺伝子工学菌株を培養する、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

前記培地の組成に加えて、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、ＮａＮＯ_３、ＫＨ_２ＰＯ_４及び微量元素を添加し、好ましくは、前記微量元素はＨ_３ＢＯ_３、ＭｎＣｌ_２・７Ｈ_２Ｏ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ及びＣｏ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏから選ばれる、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記培地において、前記炭酸ナトリウムの最終濃度は０．２５－１．５ｇ／Ｌである、請求項１５または１６に記載の方法。

【請求項18】

ステップ２）では、誘導剤の存在下で前記遺伝子工学菌株を培養し、好ましくは、前記誘導剤はＩＰＴＧ、テオフィリンから選ばれる１種または複数種である、請求項１２に記載の方法。

【請求項19】

ステップ３）では、前記遺伝子工学菌株を収集することは、高分子電解質凝集剤と前記遺伝子工学菌株を含む培養液を５分間混合し、５分間静置し、静置した後に、上清を捨て沈殿を収集することを含み、好ましくは、前記高分子電解質凝集剤はポリアクリルアミド凝集剤である、請求項１２に記載の方法。

【請求項20】

ステップ３）では、前記遺伝子工学菌株内のポリ乳酸を、有機溶媒で回収するか、または無機水相抽出法で回収し、好ましくは、前記有機溶媒は、クロロホルム、１，４－エポキシジアン、メチル－テトラヒドロフラン、エチレンカーボネート、アセトン及び酢酸エチルから選ばれる、請求項１２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はバイオエンジニアリング技術の分野に関し、具体的にはポリ乳酸（ＰＬＡ）を生産する遺伝子工学菌株及びＰＬＡを生産する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ＰＬＡは非常に有望な生分解性材料であり、使い捨て包装、農業、医薬、３Ｄプリントなどの分野で広範な応用の見通しを持っている。現在、ＰＬＡの生産は、主に微生物発酵によって乳酸エステルを生成し、乳酸エステルをラクチドに変換することにより、ラクチド環の環化作用によりＰＬＡを合成する。しかし、このような化学重合反応は装置に対する要求が高く、且つ添加する必要がある溶媒や鎖カップリング剤が除去されにくいため、これは、ＰＬＡの商業化生産の進展を大きく制限する。このため、高性能のＰＬＡを開発して調製する方法は非常に意味がある。現在、ＰＬＡをバイオ法で生産するのは、主に糖由来の原料に依存しており、これも工業生産と食糧の競争を引き起こし、潜在的なリスクがある。同時に、工業化の進展の進みに伴い、温室効果ガスＣＯ_２排出はますます激しくなり、地球温暖化問題は深刻である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

従来の技術における不足に対して、本発明は、ＰＬＡを生産する遺伝子工学菌株及びＰＬＡを生産する方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0004】

上記目的を達成するために、本発明の解決手段は、以下の通りである。

【0005】

（１） 細長いシネココッカスの遺伝子工学菌株であって、前記遺伝子工学菌株のゲノムに外因性のＤ－乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列、外因性のプロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ遺伝子のコード配列及び外因性のポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素遺伝子のコード配列を統合することにより、前記遺伝子工学菌株は外因性のＤ－乳酸デヒドロゲナーゼ、外因性のプロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ及び外因性のポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素を発現することができることを特徴とする。

【0006】

（２） （１）に記載の遺伝子工学菌株によれば、前記Ｄ－乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列はＰ_ｔｒｃプロモーター、Ｐ_ｐｓｂａプロモーターまたはＰ_{ｃｐｃ５６０}プロモーターによって制御される。

【0007】

（３） （１）に記載の遺伝子工学菌株によれば、前記プロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ遺伝子のコード配列はＰ_ｔｒｃプロモーター、Ｐ_ｐｓｂａプロモーターまたはＰ_{ｃｐｃ５６０}プロモーターによって制御される。

【0008】

（４） （１）に記載の遺伝子工学菌株によれば、前記ポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素遺伝子のコード配列はＰ_ｔｒｃプロモーター、Ｐ_ｐｓｂａプロモーターまたはＰ_{ｃｐｃ５６０}プロモーターによって制御される。

【0009】

（５） （１）に記載の遺伝子工学菌株によれば、前記外因性のＤ－乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列はブルガリア乳酸菌に由来し、前記外因性のプロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ遺伝子のコード配列はプロピオン酸クロストリジウムに由来し、前記外因性のポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素遺伝子のコード配列はシュードモナスに由来する。

【0010】

（６） （１）に記載の遺伝子工学菌株によれば、前記遺伝子工学菌株のゲノムに外因性のアセチル補酵素Ａ合成酵素遺伝子のコード配列を統合することにより、前記遺伝子工学菌株は外因性のアセチル補酵素Ａ合成酵素遺伝子を発現することができる。

【0011】

（７） （１）に記載の遺伝子工学菌株によれば、前記遺伝子工学菌株の酢酸キナーゼ遺伝子の発現がノックダウンされる。

【0012】

（８） （７）に記載の遺伝子工学菌株によれば、前記遺伝子工学菌株のゲノムに酢酸キナーゼ遺伝子の発現を抑制する外因性のｓＲＮＡのコード配列が統合される。

【0013】

（９） （１）に記載の遺伝子工学菌株によれば、前記遺伝子工学菌株のアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ遺伝子、ケトジェニック合成酵素遺伝子及び／又はβ－ケトアシル－ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩ遺伝子の発現がノックダウンされる。

【0014】

（１０） （９）に記載の遺伝子工学菌株によれば、前記遺伝子工学菌株のゲノムにそれぞれアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ遺伝子、ケトジェニック合成酵素遺伝子及び／又はβ－ケトアシル－ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩ遺伝子の発現を抑制できる外因性のｓＲＮＡのコード配列が統合される。

【0015】

（１１） （１）－（１０）のいずれかに記載の遺伝子工学菌株によれば、前記遺伝子工学菌株は細長いシネココッカスＰＣＣ ７９４２菌株である。

【0016】

（１２） 二酸化炭素を利用してポリ乳酸を生産する方法であって、
１） （１）－（１１）のいずれかに記載の細長いシネココッカスの遺伝子工学菌株を提供するステップと、
２） 二酸化炭素を導入して光照条件下で前記遺伝子工学菌株を培養するステップと、
３） 前記遺伝子工学菌株の成長ＯＤが最大値に達すると、前記遺伝子工学菌株を収集して乾燥し、前記菌株内のポリ乳酸を回収するステップと、を含む。

【0017】

（１３） （１２）に記載の方法によれば、ステップ２）では、前記二酸化炭素の通気量は１．５ｖｖｍであり、導入される二酸化炭素と空気の体積比は１：（１－１０）である。

【0018】

（１４） （１２）に記載の方法によれば、ステップ２）では、前記光照の強度は１２５μｍｏｌ光量子ｍ^－２ ｓ^－１から１０００μｍｏｌ光量子ｍ^－２ ｓ^－１未満であり、好ましくは、前記光照の強度は１２５－５００μｍｏｌ光量子ｍ^－２ ｓ^－１である。

【0019】

（１５） （１２）に記載の方法によれば、ステップ２）では、このような培地で前記遺伝子工学菌株を培養し、前記培地は炭酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、クエン酸、クエン酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸、ホウ酸、塩化マンガン、硫酸亜鉛、モリブデン酸ナトリウム、硫酸銅及び硝酸コバルトを含む。

【0020】

（１６） （１５）に記載の方法によれば、前記培地の組成に加えて、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、ＮａＮＯ_３、ＫＨ_２ＰＯ_４及び微量元素を添加し、好ましくは、前記微量元素はＨ_３ＢＯ_３、ＭｎＣｌ_２・７Ｈ_２Ｏ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ及びＣｏ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏから選ばれる。

【0021】

（１７） （１５）または（１６）に記載の方法によれば、前記培地において、前記炭酸ナトリウムの最終濃度は０．２５－１．５ｇ／Ｌである。

【0022】

（１８） （１２）に記載の方法によれば、ステップ２）では、誘導剤の存在下で前記遺伝子工学菌株を培養し、好ましくは、前記誘導剤はＩＰＴＧ、テオフィリンから選ばれる１種または複数種である。

【0023】

（１９） （１２）に記載の方法によれば、ステップ３）では、前記遺伝子工学菌株を収集することは、高分子電解質凝集剤と前記遺伝子工学菌株を含む培養液を５分間混合し、５分間静置し、静置した後に、上清を捨て沈殿をすることを含み、好ましくは、前記高分子電解質凝集剤はポリアクリルアミド凝集剤である。

【0024】

（２０） （１２）に記載の方法によれば、ステップ３）では、前記遺伝子工学菌株内のポリ乳酸を、有機溶媒で回収するかまたは無機水相抽出法で回収し、好ましくは、前記有機溶媒は、クロロホルム、１，４－エポキシジアン、メチル－テトラヒドロフラン、エチレンカーボネート、アセトン及び酢酸エチルから選ばれる。

【発明の効果】

【0025】

上記手段を採用するため、本発明の有益な効果は以下の通りである。

【0026】

本発明は、天然的な細長いシネココッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）（本文で「シアノバクテリア」ともいう）を出発菌株とし、遺伝子工学技術を利用して異種のＤ－乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、プロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ（ＰＣＴ）及びポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素（ＰＨＡ）を導入することによって、シネココッカスの代謝経路を利用してＰＬＡを合成することに成功した。次に、本発明は、律速ステップ酵素のプロモーター最適化、アセチル補酵素Ａの自己循環の構築、炭素フラックスの再配向を含む、異なる代謝工学戦略を系統的に行った。即ち、律速ステップ酵素ＰＣＴとＰＨＡのプロモーター最適化を行い、アセチル補酵素Ａ合成酵素を過剰発現し、酢酸キナーゼの発現を弱め、脂肪酸経路のキー酵素であるアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ、ケトジェニック合成酵素、β－ケトアシル－ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩの遺伝子をノックダウンすることで、ＰＬＡの収量がさらに向上した。

【0027】

同時に、本発明は、培地へのＣＯ_２の導入条件と光照条件を探索することを含む高密度培養戦略（ＨＤＣ）を探索する。高密度発酵戦略は、高低光の簡単な調整、異なるタイプの光の組み合わせ使用（赤色光と白色光の組合わせ）を実現した。本発明は、凝縮、発酵時に自動的に補充と攪拌を行うことができ、培養条件の攪拌速度は２００ｒｐｍである。本発明は、培養と発酵条件の探索によりＰＬＡの収量がさらに向上される。

【0028】

本発明は、シアノバクテリア細胞工場を利用して二酸化炭素からプラスチックを生産することを開示する。

【0029】

本発明は、天然的なシアノバクテリア（細長いシネココッカス）を改造するとともに、高密度発酵の戦略を採用することにより、ＣＯ_２と光照条件を直接利用してＰＬＡを生産することができ、シアノバクテリアのバイオマスが非常に大きく向上する。本発明は、従来の技術におけるＰＬＡの生産に糖由来の原料のみを使用するという問題を解決し、さらに生産コストと収集コストが削減され、プラスチックの汚染と温室効果ガスＣＯ_２の過度排出の問題を同時に解決することが望ましく、同時に生分解性材料ＰＬＡの生産に使用でき、非常に大きな潜在的な工業化応用価値があり、シアノバクテリアによるＰＬＡの生産の商業化進展も加速する。また、本発明は、両性電解質ポリアクリルアミド凝集剤を利用して、シアノバクテリア細胞の収集を非常に簡単且つ容易に実現することができる。

【図面の簡単な説明】

【0030】

【図1】本発明の一実施手段によるＰＬＡ合成経路及び代謝工学改造戦略の模式図である。

【図2】本発明の実施例７で合成されるＰＬＡの核磁気検出の水素スペクトルと炭素スペクトルであり、図２Ａは水素スペクトルを示し、図２Ｂは炭素スペクトルを示し、図２ＣはＰＬＡの構造式であり、図２Ｄは^１Ｈ－^１Ｈ二次元ＣＯＳＹ図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0031】

本発明の一態様は、細長いシネココッカスの遺伝子工学菌株を提供し、前記遺伝子工学菌株のゲノムに外因性のＤ－乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列、外因性のプロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ遺伝子のコード配列、及び外因性のポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素遺伝子のコード配列を統合することにより、前記遺伝子工学菌株は、外因性のＤ－乳酸デヒドロゲナーゼ、外因性のプロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ及び外因性のポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素を発現することができることを特徴とする。

【0032】

幾つかの実施手段において、前記外因性のＤ－乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列は、ブルガリア乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）に由来し、前記外因性のプロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ遺伝子のコード配列は、プロピオン酸クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）に由来し、前記外因性のポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素遺伝子のコード配列は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）に由来する。

【0033】

本発明において、前記Ｄ－乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列、プロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ遺伝子のコード配列、及びポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素遺伝子のコード配列は、野生型であってもよいし、適切に改造されていてもよい。本発明は、３種類の酵素の遺伝子コード配列に、文献「Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１０，１０５（１）：１５０－１６０．」及び「Ｌｉ， Ｃ．， Ｔａｏ， Ｆ．， Ｎｉ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ－ｄｒｉｖｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄ－ｌａｃｔａｔｅ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ． Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５， ９７７７ （２０１５）．」のように突然変異を行うと、ＰＬＡの収量を向上させることを発見した。上記文献の全部内容は、援用により本文に組み込まれる。

【0034】

本文では、遺伝子、コード配列、タンパク質、酵素などに言及する際に用いられる「外因性」という用語は、自然の状態で、ある特定の菌株に属していない物質を指す。例えば、外因性の遺伝子とは、外部から、ある特定の菌株の遺伝子を導入することであり、該外因性の遺伝子は、前記菌株ゲノム中の既存の遺伝子であってもよいし、ゲノム中に有さない遺伝子であってもよい。本発明の一実施手段において、必要に応じて、外部から細長いシネココッカス菌株ゲノムに既存のアセチル補酵素Ａ合成酵素遺伝子を導入することで、該遺伝子を過剰発現する。

【0035】

本発明は、外因性の遺伝子の転写を制御するプロモーターをさらに最適化することで、ＰＬＡの収量が更に向上する。好ましくは、前記Ｄ－乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のコード配列は、Ｐ_ｔｒｃプロモーター、Ｐ_ｐｓｂａプロモーターまたはＰ_{ｃｐｃ５６０}プロモーターによって制御される。さらに好ましくは、前記プロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ遺伝子のコード配列は、Ｐ_ｔｒｃプロモーター、Ｐ_ｐｓｂａプロモーターまたはＰ_{ｃｐｃ５６０}プロモーターによって制御される。さらに好ましくは、前記ポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素遺伝子のコード配列は、Ｐ_ｔｒｃプロモーター、Ｐ_ｐｓｂａプロモーターまたはＰ_{ｃｐｃ５６０}プロモーターによって制御される。

【0036】

本発明は、前記遺伝子工学菌株のゲノムに外因性のアセチル補酵素Ａ合成酵素遺伝子のコード配列をさらに統合することで、前記遺伝子工学菌株は外因性のアセチル補酵素Ａ合成酵素遺伝子を発現することができ、このように、ＰＬＡ収量を更に向上させることができると発見した。

【0037】

本発明は、さらに、酢酸キナーゼの発現を弱めること、及び／又は、脂肪酸経路のキー酵素であるアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ、ケトジェニック合成酵素、β－ケトアシル－ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩの遺伝子をノックダウンすることによって、ＰＬＡの収量が更に向上すると発見した。

【0038】

このため、好ましくは、前記遺伝子工学菌株の酢酸キナーゼ遺伝子の発現がノックダウンされる。これは、前記菌株のゲノム中に酢酸キナーゼ遺伝子の発現を抑制できる外因性のｓＲＮＡのコード配列を統合することによって実現される。

【0039】

さらに好ましくは、前記遺伝子工学菌株のアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ遺伝子、ケトジェニック合成酵素遺伝子及び／又はβ－ケトアシル－ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩ遺伝子の発現がノックダウンされる。これは、それぞれ前記菌株のゲノム中に、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ遺伝子、ケトジェニック合成酵素遺伝子及び／又はβ－ケトアシル－ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩ遺伝子の発現を抑制できる外因性のｓＲＮＡのコード配列を統合することによって実現される。

【0040】

幾つかの具体的な実施手段において、前記遺伝子工学菌株は、細長いシネココッカスＰＣＣ ７９４２菌株である。

【0041】

本発明の他の態様は、二酸化炭素を利用してポリ乳酸を生産する方法を提供し、
１） （１）－（１１）のいずれかに記載の細長いシネココッカスの遺伝子工学菌株を提供するステップと、
２） 二酸化炭素を導入して光照条件下で前記遺伝子工学菌株を培養するステップと、
３） 前記遺伝子工学菌株の成長ＯＤが最大値に達すると、前記遺伝子工学菌株を収集して乾燥し、前記菌株内のポリ乳酸を回収するステップと、を含む。

【0042】

好ましくは、ステップ２）では、前記二酸化炭素の通気量は１．５ｖｖｍである。さらに好ましくは、導入される二酸化炭素と空気の体積比は１：（１－１０）であり、最も好ましくは５％である。

【0043】

好ましくは、ステップ２）では、前記光照の強度は１２５μｍｏｌ光量子ｍ^－２ ｓ^－１から１０００μｍｏｌ光量子ｍ^－２ ｓ^－１未満であり、より好ましくは、前記光照の強度は１２５～５００μｍｏｌ光量子ｍ^－２ ｓ^－１であり、最も好ましくは５００μｍｏｌ光量子ｍ^－２ ｓ^－１である。

【0044】

さらに、本発明は、前記遺伝子工学菌株が成長初期に光が強過ぎるのは好ましくなく、その場合、好ましくは、１５０μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ^－２ ｓ^－１以下の光の強さ、最も好ましくは１２５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ^－２ ｓ^－１の光の強さを選択し、菌株の成長に伴い、次第に光の強さを５００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ^－２ ｓ^－１に上げることで、菌株を最適に成長させることができると発見した。

【0045】

本発明は、さらに前記菌株の培養に用いられる培地を探索し、以下の組成の培地が前記遺伝子工学菌株のバイオマスを向上させることができる。前記培地は、炭酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、リン酸水素二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、クエン酸、クエン酸鉄アンモニウム、エチレンジアミン四酢酸、ホウ酸、塩化マンガン、硫酸亜鉛、モリブデン酸ナトリウム、硫酸銅及び硝酸コバルトを含む。より好ましくは、上記組成に加えて、Ｎａ_２ＣＯ_３、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、ＮａＮＯ_３、ＫＨ_２ＰＯ_４及び微量元素を添加する。好ましくは、前記微量元素は、Ｈ_３ＢＯ_３、ＭｎＣｌ_２・７Ｈ_２Ｏ、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ及びＣｏ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏから選ばれる。

【0046】

本発明は、前記培地中での前記炭酸ナトリウムの最終濃度は、好ましくは０．２５－１．５ｇ／Ｌであると発見した。

【0047】

好ましくは、ステップ２）では、誘導剤の存在下で前記遺伝子工学菌株を培養し、このように、ＰＬＡの収量をさらに向上させることができる。前記誘導剤は、好ましくは、ＩＰＴＧ、テオフィリンから選ばれる１種または複数種である。

【0048】

ステップ３）では、前記遺伝子工学菌株を収集することは、高分子電解質凝集剤と前記遺伝子工学菌株を含む培養液を５分間混合し、５分間静置し、静置した後に上清を捨て沈殿を収集することを含み、好ましくは、前記高分子電解質凝集剤は、ポリアクリルアミド凝集剤である。

【0049】

前記遺伝子工学菌株の乾燥には、凍結乾燥を採用することができる。

【0050】

ステップ３）では、前記遺伝子工学菌株内のポリ乳酸を、有機溶媒で回収するかまたは無機水相抽出法で回収することができる。

【0051】

用いられる有機溶媒は、クロロホルム、１，４－エポキシジアン、メチル－テトラヒドロフラン、エチレンカーボネート、アセトン及び酢酸エチルから選ばれる。

【0052】

無機水相抽出法は、（ａ）ポリマー粒子を豊富に含む乾燥した細菌細胞を提供するステップと、（ｂ）乾燥した細胞粒子を粉砕するステップと、（ｃ）アルカリ水溶液（ｐＨが８－１０）でステップ（ｂ）から得られた破砕した細胞粉末を溶解するステップと、（ｄ）ポリマーに富むアルカリ溶液を均質化するステップと、（ｅ）細胞内に残された非標的ポリマーの断片を分離し、一次製品を取得するステップと、（ｆ）上記濃縮物を濾過して乾燥し、ポリマー粒子を取得するステップと、を含んでも良い。

【0053】

工業規模で微細藻類バイオマスを収穫することは、藻類バイオマス産業の技術経済的ボトルネックであり、微細藻類の小さな細胞サイズと培養物に希釈したバイオマス濃度によって状況はさらに複雑になる。収穫の過程で大量の水を除去する必要があり、プロセスエネルギーとコストが密集し、バイオマス生産の総コストの約３０％を占めている。ＰＬＡは細胞の内包物であるため、遠心分離によってＰＬＡ粒子と細胞を一緒に収集することができる。本発明は、凝集剤を使用すると、細胞をより迅速かつ簡便に収集できることを発見し、これは大きな潜在的工業的価値を有する。

【0054】

本発明の一具体的な実施手段において、二酸化炭素を利用してポリ乳酸を生産する前記方法は、
（１） 変性されたＤ－乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、変性されたプロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ遺伝子、及び変性されたポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素遺伝子をプライマーにより目的遺伝子に合成し、目的遺伝子とベクターを二重酵素切断し、精製された後、大腸菌感受性細胞を形質転換し、組換えプラスミドを得るステップと、
（２） 組換えプラスミドのＤＮＡを抽出し、シアノバクテリアＳ． ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２に導入し、抽出、検証し、遺伝子工学細胞菌株を得るステップと、
（３） 遺伝子工学細胞菌株を培地中で培養し、培地中に二酸化炭素を導入し、光照条件で遠心分離して収集し、そして凍結乾燥して、回収し、ＰＬＡを得るステップと、を含む。

【0055】

本発明は、培地へのＣＯ_２の導入条件と光照条件を探索することを含む、高密度培養戦略（ＨＤＣ）を探索する。高密度発酵戦略は、高低光の簡単な調整、異なるタイプの光の組み合わせ使用（赤色光と白色光の組合わせ）を実現した。本発明は、凝縮、発酵時に自動的に補充と攪拌を行うことができ、培養条件の攪拌速度は２００ｒｐｍである。本発明は、培養と発酵条件の探索によりＰＬＡの収量がさらに向上される。

【0056】

例示
実施例に基づいて、本発明の技術的内容をさらに説明する。下記の実施例は、説明的なものであり、限定的なものではなく、下記の実施例によって本発明の範囲を限定することはできない。以下の実施例で使用する実験方法は、特に断りのない限り、通常の方法である。下記の実施例で使用する材料、試薬などは、特に断りのない限り、商業的なルートから入手することができる。

【0057】

ＢＧ－１１液体培地（１×）： ＮａＮＯ_３ １．５ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４・３Ｈ_２Ｏ ０．０４ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０７５ｇ、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ ０．０３６ｇ、クエン酸０．００６ｇ、クエン酸鉄アンモニウム ０．００６ｇ、ＥＤＴＡ ０．００１ｇ、Ｎａ_２ＣＯ_３ ０．０２ｇ、金属イオン母液 １ｍＬ（ｇ／Ｌ：ホウ酸 ２．８６、ＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ １．８１、ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．２２２、Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ ０．３９、ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ ０．０７９、Ｃｏ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏ ０．０４９４）を溶解して、１Ｌの蒸留水に定容する。１２１℃の高温高圧で２０ｍｉｎ蒸気滅菌する。

【0058】

ＢＧ－１１固体培地： ＢＧ－１１液体培地に、１．６－２．０％（ｗ／ｖ）寒天粉末を加える。１２１℃の高温高圧で２０ｍｉｎ蒸気滅菌する。

【0059】

培養方法： ＰＬＡを生産するための菌株培養方法は、指数期に成長したＳ． ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２細胞を取り、１００ｍＬのＢＧ－１１液体培地を入れた３００ｍＬの三角フラスコに希釈し、細胞の最終濃度をＯＤ_{７３０ｎｍ}＝０．０５にし、該培地に２０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを添加する。菌体がＯＤ_{７３０ｎｍ}＝０．４－０．６に成長したら、１ｍｍｏｌ／Ｌのイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えて誘導する。毎日、２ｍＬのサンプルを取って細胞の成長を測定し、毎回のサンプリングが終わった後、三角フラスコ中に等体積の除菌したＢＧ－１１液体培地を補充する。

【0060】

実施例１： ＰＬＡ合成の代謝経路の導入

【0061】

図１に示すように、すでに報告されている改造されたＤ－乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｌｄｈＤ）、プロピオニル補酵素Ａトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｃｔ）、ポリヒドロキシ脂肪酸エステル合成酵素遺伝子（ｐｈａ）のコード配列（文献「Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２０１０，１０５（１）：１５０－１６０．」と「Ｌｉ， Ｃ．， Ｔａｏ， Ｆ．， Ｎｉ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｌｉｇｈｔ－ｄｒｉｖｅｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄ－ｌａｃｔａｔｅ ｂｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ．，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ５， ９７７７ （２０１５）．」参照）に基づいて、ＩｄｈＤ、ｐｃｔ、ｐｈａの順序に従って、且つ、２つの遺伝子の間にＲＢＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９：ＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣ）配列を挿入することによって、上記３種類の酵素の改造された遺伝子コード配列からなる全長配列を人工的に合成した後、以下のプライマーを用いて、合成した配列をテンプレートとしてＰＣＲ増幅して、３つのキー酵素を含む組換え遺伝子の断片を得る。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１： ５－ＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＴＣＡＡＡＴＧＡＴＧＡＡ－３；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２： ５－ＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＧＡＣＴＴＣＡＴＴＴＣＴＴＴＣＡＧＧＣＣ－３。

【0062】

組換え遺伝子とｐＡＭＭＣＳ１２を、それぞれＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩで二重酵素切断し、精製後にＴ_４ ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で一晩接続した。接続生成物化学法によって、大腸菌感受性細胞を形質転換する。形質転換液にスペクチノマイシン（５０μｇ／ｍＬ）ＬＢプレートを塗布し、プラスミドを抽出し、二重酵素切断により、構築された組換えプラスミドを検証し、ｐＡＭ－ｌｄｈＤ－ｐｃｔ－ｐｈａと命名した。シーケンシングは上海派森諾生物技術会社により完了した。

【0063】

抽出した組換えプラスミドＤＮＡは、自然形質転換を通じて相同組換えの原理を利用し、標的遺伝子を細長いシネココッカスＰＣＣ ７９４２（全球生物資源センター、ＡＴＣＣから）染色体に統合する。組換え形質転換子のゲノムを抽出した後、検証プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３： ５－ ＡＣＣＴＧＧＡＡＴＴＧＧＴＴＧＡＡＧＧ－３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４： ５－ＡＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣ－３を用いて、ＰＣＲ増幅検証により挿入の成功を確認し、ＰＹＬＷ０１菌株を得る。実施例７に記載の方法に従った測定による、得られたＰＹＬＷ０１菌株の収量は、０．８ｍｇｇ^－１ ＤＣＷである。

【0064】

実施例２： 律速ステップ酵素プロモーターの最適化

【0065】

Ｐ_ｔｒｃプロモーターに従って全遺伝子合成を行い、プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５： ５－ＣＧＡＣＴＧＣＡＣＧＧＴＧＣＡＣＣＡ－３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６： ５－ＣＡＴＧＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＧＡＡ－３を設計し、ＰＣＲ増幅によりＰ_ｔｒｃプロモーターを得る。

【0066】

Ｐ_ｐｓｂａプロモーターに従って全遺伝子合成を行い、プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７： ５－ ＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＴＡＴＴＡＧＧＴＡＴＡＴＧＧ－３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８： ５－ ＡＴＧＴＡＴＴＴＧＴＣＧＡＴＧＴＴＣＡＧＡＴ－３を設計し、ＰＣＲ増幅によりＰ_ｐｓｂａプロモーターを得る。

【0067】

Ｐ_{ｃｐｃ５６０}プロモーターに従って全遺伝子合成を行い、プライマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９： ５－ ＡＣＣＴＧＴＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＣＣＣＴ－３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０： ５－ＴＧＡＡＴＴＡＡＴＣＴＣＣＴＡＣＴＴＧＡＣＴＴＴＡ－３を設計し、ＰＣＲ増幅によりＰ_{ｃｐｃ５６０}プロモーターを得る。

【0068】

ＰＣＲ増幅により得られたＰ_ｔｒｃプロモーター配列、上記ｌｄｈＤ、ｐｃｔ、及びｐｈａの３つの遺伝子コード配列をそれぞれ１μＬ取り、まず、重複誘導体化ＰＣＲでＰ_ｔｒｃ－ｌｄｈＤ断片、Ｐ_ｔｒｃ－ｐｃｔ断片、及びＰ_ｔｒｃ－ｐｈａ断片をそれぞれ形成し、次に、３つの断片を順次にＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ酵素切断酵素によりｐＡＭベクターに連結し、ベクターｐＡＭ－Ｐ_ｔｒｃ－ｌｄｈＤ－Ｐ_ｔｒｃ－ｐｃｔ－Ｐ_ｔｒｃ－ｐｈａを得る。

【0069】

ＰＣＲ増幅により得られたＰ_ｐｓｂａプロモーター配列、上記ｌｄｈＤ、ｐｃｔ及びｐｈａの３つの遺伝子コード配列をそれぞれ１μＬ取り、まず、重複誘導体化ＰＣＲでＰ_ｐｓｂａ－ｌｄｈＤ断片、Ｐ_ｐｓｂａ－ｐｃｔ断片、及びＰ_ｐｓｂａ－ｐｈａ断片をそれぞれ形成し、次に、この３つの断片を順次にＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ酵素切断酵素によりｐＡＭベクターに連結し、ベクターｐＡＭ－Ｐ_ｐｓｂａ－ｌｄｈＤ－Ｐ_ｐｓｂａ－ｐｃｔ－Ｐ_ｐｓｂａ－ｐｈａを得る。

【0070】

ＰＣＲ増幅により得られたＰ_{ｃｐｃ５６０}プロモーター配列、上記ｌｄｈＤ、ｐｃｔ、及びｐｈａの３つの遺伝子コード配列をそれぞれ１μＬ取り、まず、重複誘導体化ＰＣＲでＰ_{ｃｐｃ５６０}－ｌｄｈＤ断片、Ｐ_{ｃｐｃ５６０}－ｐｃｔ断片、及びＰ_{ｃｐｃ５６０}－ｐｈａ断片をそれぞれ形成し、次に、この３つの断片を順次にＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ酵素切断酵素によりｐＡＭベクターに連結し、ベクターｐＡＭ－Ｐ_{ｃｐｃ５６０}－ｌｄｈＤ－Ｐ_{ｃｐｃ５６０}－ｐｃｔ－Ｐ_{ｃｐｃ５６０}－ｐｈａを得る。

【0071】

実施例３： ＰＹＬＷ０２、ＰＹＬＷ０３、ＰＹＬＷ００４遺伝子工学菌株の構築

【0072】

ベクターｐＡＭ－Ｐ_ｔｒｃ－ｌｄｈＤ－Ｐ_ｔｒｃ－ｐｃｔ－Ｐ_ｔｒｃ－ｐｈａを、自然変換により細長いシネココッカスＰＣＣ ７９４２染色体中性サイトＩに統合し、ＰＹＬＷ０２菌株を得る。

【0073】

ベクターｐＡＭ－Ｐ_ｐｓｂａ－ｌｄｈＤ－Ｐ_ｐｓｂａ－ｐｃｔ－Ｐ_ｐｓｂａ－ｐｈａを、自然変換により細長いシネココッカスＰＣＣ ７９４２染色体中性サイトＩに統合し、ＰＹＬＷ０３菌株を得る。

【0074】

ベクターｐＡＭ－Ｐ_{ｃｐｃ５６０}－ｌｄｈＤ－Ｐ_{ｃｐｃ５６０}－ｐｃｔ－Ｐ_{ｃｐｃ５６０}－ｐｈａを、自然変換により細長いシネココッカスＰＣＣ ７９４２染色体中性サイトＩに統合し、ＰＹＬＷ０４菌株を得る。

【0075】

実施例７に記載の方法に従った測定による、得られたＰＹＬＷ０２菌株の収量は最も高く、収量は５．６ ｍｇｇ^－１ ＤＣＷである。

【0076】

実施例４： アセチル補酵素Ａ合成酵素の過剰発現

【0077】

細長いシネココッカスＰＣＣ ７９４２ゲノム（ＮＣ＿００７５９５．１）配列に基づくプライマー：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１：５－ＡＣＴＡＧＴＡＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴＣＡＣＧＡＡ－３；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２：５－ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＴＣＡＣＴＧＣＴＴＴＣＣＡＧＡＡＡＣＡＣ－３を設計する。

【0078】

組換え遺伝子ａｃｓＡ（ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＢＢ５７３８２．１）とｐＢＡ３０３１Ｍを、それぞれＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ二重酵素で切断し、精製後にＴ_４ ＤＮＡリガーゼで１６℃で一晩接続した。接続生成物化学法によって、大腸菌感受性細胞を形質転換する。形質転換液でカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）ＬＢプレートを塗布し、プラスミドを抽出し、二重酵素切断により、構築された組換えプラスミドを検証し、ｐＢＡ－ａｃｓＡと命名した。シーケンシングは、上海派森諾生物技術会社により完了される。

【0079】

抽出した組換えプラスミドＤＮＡは、自然形質転換を通じて相同組換えの原理を利用し、標的遺伝子を、細長いシネココッカスＰＣＣ ７９４２中性サイトＩＩＩ染色体に統合する。組換え形質転換子のゲノムを抽出した後、検証プライマーであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３： ５－ ＡＣＣＴＧＧＡＡＴＴＧＧＴＴＧＡＡＧＧ－３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４： ５－ＡＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣ－３を用いて、ＰＣＲ増幅検証により挿入の成功を確認し、ＰＹＬＷ０５菌株を得る。実施例７に記載の方法に従った測定による、得られたＰＹＬＷ０５菌株の収量は、６．５ｍｇｇ^－１ ＤＣＷである。

【0080】

実施例５： 酢酸キナーゼ遺伝子のノックダウン

【0081】

細長いシネココッカスＰＣＣ ７９４２ゲノム上の酢酸キナーゼの遺伝子配列に基づき、２４ｂｐのアンチセンスＲＮＡを設計し、ｓＲＮＡの骨格であるＭｉｃｃとＴｒｂｃｌの配列に基づいて、酢酸キナーゼのｓＲＮＡ全長配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示す）を人工的に合成する。

【0082】

プライマーであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５：５－ＧＧＡＴＣＣＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＴＡＴＴＡＧＧＴＡＴＡＴＧＧ－３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６：５－ ＧＡＡＴＴＣＧＣＴＧＴＣＧＡＡＧＴＴＧＡＡＣＡＴ－３を設計し、ｓＲＮＡ全長配列を増幅し、ｓＲＮＡ全長配列と実施例４で得られた組換えプラスミドｐＢＡ－ａｃｓＡをそれぞれＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで二重酵素切断し、精製後に、Ｔ_４ ＤＮＡリガーゼで１６℃で一晩接続した。接続生成物化学法によって大腸菌感受性細胞を形質転換する。形質転換液でカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）ＬＢプレートを塗布し、プラスミドを抽出し、二重酵素切断により、構築された組換えプラスミドを検証し、ｐＢＡ－ａｃｓＡ－ａｓ－ａｃｋＡと命名した。シーケンシングは上海派森諾生物技術会社により完了される。

【0083】

抽出した組換えプラスミドＤＮＡは、自然形質転換を通じて相同組換えの原理を利用し、標的遺伝子を、細長いシネココッカスＰＣＣ ７９４２中性サイトＩＩＩ染色体に統合する。ＰＹＬＷ０６菌株を得る。実施例７に記載の方法に従った測定による、得られたＰＹＬＷ０６菌株の収量は、９．８ｍｇｇ^－１ ＤＣＷである。

【0084】

実施例６： アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ遺伝子、ケトジェニック合成酵素遺伝子、β－ケトアシル－ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩ遺伝子をノックダウンし続ける

【0085】

細長いシネココッカスＰＣＣ ７９４２ゲノム上のアセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ遺伝子、ケトジェニック合成酵素遺伝子、β－ケトアシル－ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩ遺伝子の配列に基づいて、それぞれ２４ｂｐのアンチセンスＲＮＡを設計し、ｓＲＮＡの骨格であるＭｉｃｃとＴｒｂｃｌの配列に基づいて、アセチル補酵素Ａカルボキシラーゼ遺伝子、ケトジェニック合成酵素遺伝子、β－ケトアシル－ＡＣＰ合成酵素ＩＩＩのｓＲＮＡ全長配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示す）を人工的に合成する。

【0086】

プライマーであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１７：５－ＧＡＡＴＴＣＴＡＴＣＡＡＴＡＡＧＴＡＴＴＡＧＧＴＡＴＡＴＧＧ－３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１８： ５－ ＧＡＧＣＴＣＧＣＴＧＴＣＧＡＡＧＴＴＧＡＡＣＡＴ－３を設計し、ｓＲＮＡ全長配列を増幅し、ｓＲＮＡ全長配列と実施例５で得られた組換えプラスミドｐＢＡ－ａｃｓＡ－ａｓ－ａｃｋＡをそれぞれＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩで二重酵素切断し、精製後にＴ_４ ＤＮＡリガーゼで１６℃で一晩接続した。形質転換液でカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）ＬＢプレートを塗布し、プラスミドを抽出し、二重酵素切断により、構築された組換えプラスミドを検証し、ｐＢＡ－ａｃｓＡ－ａｓ－ａｃｋＡ－ａｓ－ａｃｃＣ－ａｓ－ｆａｂＦ－ａｓ－ｆａｂＨと命名した。シーケンシングは上海派森諾生物技術会社により完了される。

【0087】

抽出した組換えプラスミドＤＮＡは、自然形質転換を通じて相同組換えの原理を利用し、標的遺伝子を細長いシネココッカスＰＣＣ ７９４２中性サイトＩＩＩ染色体に統合する。ＰＹＬＷ０７菌株を得る。実施例７に記載の方法に従った測定による、得られたＰＹＬＷ０６菌株の収量は、１５．０ｍｇｇ^－１ ＤＣＷである。

【0088】

実施例７： 組換えシアノバクテリア細胞を利用してＰＬＡを調製する

【0089】

実施例１で構築された組換えシアノバクテリア細胞菌株によって、ＢＧ－１１液体培地中で、３０℃で、５％（ｖ：ｖ）の二酸化炭素通気量、光照強度１２５μｍｏｌの光量子ｍ^－２ ｓ^－１の条件下でＯＤ_{７３０ｎｍ}が０．５になるまで、１ｍｏｌ／Ｌの最終濃度のＩＰＴＧを誘導剤として加え、誘導発現後に成長ＯＤが最大値に達する時点で、遠心分離により該菌株を収集する。回収した菌株を凍結乾燥して、クロロホルムで、菌株体内に集めたポリマー物質を回収し、回収されたポリマーを核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析する。結果から、上記得られたポリマー物質はＰＬＡであることが証明され、結果を図２に示す。

【0090】

該菌株からＰＬＡを生産する定量実験について、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）を用いてその単体含有量を測定してＰＬＡの収量を計算し、方法は、Ｊｕｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２０１０， １０５（１）：１６１－１７１に記載されるようなものである。

【0091】

実施例８： 異なる濃度のＣＯ_２がシアノバクテリア成長に与える影響を探る

【0092】

シアノバクテリアは、ＣＯ_２を炭素源として利用して成長する細菌であるため、ＣＯ_２の導入濃度は、シアノバクテリアに非常に大きな影響を与える。シアノバクテリアの高密度発酵戦略を開発するために、本発明は、まず、培養過程で、培地中に異なる濃度のＣＯ_２を導入することによるシアノバクテリアの成長への影響（その他の培養条件は実施例７と同じ、ＰＹＬＷ０７菌株を利用する）を探る。導入するＣＯ_２と空気の体積比が１％、２％、５％、７％、１０％であると、５日間成長のＯＤはそれぞれ２．５、３．０、３．５、３．１、２．８である。ＣＯ_２と空気の体積比が５％であると、細長いシネココッカスＰＣＣ ７９４２菌株における成長のＯＤ_{７３０ｎｍ}が最高３．５であると発見した。

【0093】

実施例９： 光の強さがシアノバクテリアの成長に与える影響を探る

【0094】

実施例８の条件に基づいて、本発明は、さらに光の強さがシアノバクテリアの成長に与える影響（実施例８の最適な条件下で、その他の培養条件は実施例７と同じ、ＰＹＬＷ０７菌株を利用する）を探る。本発明は、１２５－１０００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ^－２ ｓ^－１の光の強さを試みる。光照射が５００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ^－２ ｓ^－１に増加すると、シアノバクテリアの成長ＯＤが最大に達し、５００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ^－２ ｓ^－１を超えると、成長速度が下ることを発見した。１０００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ^－２ ｓ^－１ に達すると、シアノバクテリアが強い光に脅かされて成長しなくなった。光の強さ（μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ^－２ ｓ^－１）がそれぞれ１２５、２５０、５００、７５０であると、５日間成長のＯＤはそれぞれ２．０、２．５、３．５、２．２である。しかし、シアノバクテリアにはＯＤ_{７３０ｎｍ}＝１．０までは光照射が強すぎるべきではないため、シアノバクテリアにはＯＤ_７３０＝１．０までに、１２５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ^－２ ｓ^－１の光の強さを選択し、成長につれて５００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ^－２ ｓ^－１の光の強さに増加させるに伴い、成長を最もよくすることができ、５日間以内にＯＤ_{７３０ｎｍ}が３．５に達することができる。

【0095】

実施例１０： 培地のシアノバクテリアの成長に対する影響を探る

【0096】

実施例９でシアノバクテリア成長に最適な光の強さを見つけた後、培地を最適化することで、成長のＯＤ（実施例９の最適な条件下で、その他の培養条件は実施例７と同じ、ＰＹＬＷ０７菌株を利用する）をさらに高めることができるかどうか探る。本発明は、ＢＧ－１１を出発培地とし、５×ＢＧ－１１培地の組成を参照し、ＢＧ－１１の基礎培地に以下の条件（Ｌ^－１）：Ｎａ_２ＣＯ_３ １ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ５ｇ、ＮａＮＯ_３ ５ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４（１ｍｏｌ／Ｌ）２ ｍＬ及びＢＧ１１微量元素、ＢＧ１１微量元素溶液（ｍＭ）：０．４ Ｈ_３ＢＯ_３、０．１ ＭｎＣｌ_２・７Ｈ_２Ｏ、０．００４ ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．０１ Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、０．００３ ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ及び０．００１ Ｃｏ（ＮＯ_３）_２・６Ｈ_２Ｏを添加する。該培地はＭＢＧ－１１と命名される。これは、成長が以前より向上し、ＯＤ_{７３０ｎｍ}が１．５から４．０に向上した。

【0097】

さらに、高濃度のＮａ_２ＣＯ_３がより多くのバイオマスをもたらすかどうかを探るために、本発明は、異なる濃度Ｎａ_２ＣＯ_３がシアノバクテリアの成長に与える影響を試験し、それぞれ０．２５ｇ／Ｌ、０．５０ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、１．５ｇ／ＬのＮａ_２ＣＯ_３を試みる。実験により、５日間成長のＯＤは、それぞれ３．５、５．０、７．０、３．０である。１．０ｇ／ＬのＮａ_２ＣＯ_３を添加する際に、ＯＤ_{７３０ｎｍ}は最高７．０である。

【0098】

実施例１１： 組換えシアノバクテリアＰＹＬＷ０７の高密度発酵

【0099】

実施例７の実験データから、最も収率の高い菌株はＰＹＬＷ０７であり、該菌株を利用して高密度発酵の戦略を探る。シェイクフラスコを使用して発酵させる場合に、ＰＣＣ ７９４２菌株の基礎培地（ＢＧ－１１液体培地）を使用する。高密度培養戦略に対して、遺伝子工学化されたＰＣＣ ７９４２を、改良されたＢＧ－１１固体培地（即ちＭＢＧ－１１ 液体培地）において３０℃で、自作の光バイオリアクター（中国特許に公開されており、特許番号：ＺＬ２０２２２０２０１５３５．５、その全文は援用により本文に組み込まれる）を使用して培養し、成長初期に光照強度は１２５μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ^－２ ｓ^－１であり、２日後に５００μｍｏｌ ｐｈｏｔｏｎｓ ｍ^－２ ｓ^－１まで増加させる。体積比５％のＣＯ_２を含むバブリング空気培養について、ガスは、５０ｍＬのｍｉｎ^－１の流速バブリングで５μｍ孔径の排気バルブを通過する。ＰＬＡ生産に対して、８００ｍＬのフラスコにおいて２０ｍｇ／Ｌのスペクチノマイシンを含む５００ｍＬのＭＢＧ－１１液体培地にＰＹＬＷ０７菌株を接種し、ＣＯ_２を豊富に含む空気（５％、ｖ／ｖ）を持続的に供給した。次に、ＯＤ_{７３０ｎｍ}が０．４－０．６に成長した後、１ｍｍｏｌ／ＬのＩＰＴＧと２ｍｍｏｌ／Ｌのテオフィリン誘導培養物を加える。

【0100】

ＧＣ－ＭＳによりＰＬＡの収量を検出すると、その収量は最終的に１０８ｍｇ／Ｌに達し、２３ｍｇ／ｇ ＤＣＷに相当し、初期に構築した菌株のシェイクフラスコ培養条件下での収量の約２７０倍である。調製されたＰＬＡの分子量（重量平均分子量Ｍｗが６２．５ｋＤａであり、数平均分子量Ｍｎが３２．８ｋＤａである）は、文献報告されている中で最も高いレベルにある。なお、高密度培養戦略を採用し、その細胞密度を同じ遺伝子工学菌株よりシェイクフラスコ培養時に１０倍増加させた。

【0101】

実施例１２： 組換えシアノバクテリア細胞の収集

【0102】

シアノバクテリア細胞の収集を容易かつ迅速に実現するために、本発明は、高分子電解質凝集剤を用いて自然沈降の効果を探ることを試みた。ポリアクリルアミド凝集剤を、室温下で、それぞれ１：３００（ｗ／ｗ）と５：１００（ｗ／ｗ）の割合で水中に溶解させる。次に、溶解したポリアクリルアミド凝集剤を、１．５％（ｖ／ｖ）の割合で、高密度で培養した発酵液に加える。培養物を混合して２ｍｉｎ攪拌する。次に、培養物は重力沈降を５－１０分間許容する。凝集効率は、ＯＤ_７３０ｎｍの波長で、沈降前後の光学密度測定で特徴付けられ、測定結果により、凝集効率が９０％に達していることが示された。

【0103】

産業上の利用可能性
工業規模で微細藻類バイオマスを収穫することは、藻類バイオマス産業の技術経済的ボトルネックであり、微細藻類の小さな細胞サイズと培養物に希釈したバイオマス濃度によって、状況はさらに複雑になる。収穫の過程で大量の水を除去する必要があり、プロセスエネルギーとコストが密集し、バイオマス生産の総コストの約３０％を占めている。ＰＬＡは細胞の内包物であるため、遠心分離によってＰＬＡ粒子と細胞を一緒に収集することができる。本発明は、凝集剤を使用すると、細胞をより迅速かつ簡便に収集できることを発見し、これは大きな潜在的工業的価値を有する。

【0104】

上記の実施形態の説明は、当業者が本発明を理解し、使用できるようにするためのものである。当業者であれば、これらの実施例にさまざまな修正を容易に加えることができ、本明細書で説明する一般的な原理を創造的な労働を経ることなく他の実施例に適用できることは明らかである。このため、本発明は、上記実施例に制限されない。当業者が本発明の原理に基づいて本発明の範疇から逸脱しない改良や修正を加えることも、本発明の範囲内にあるべきである。

【図1】

【図2】

【配列表】

2024534612000001.xml

【国際調査報告】