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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-20
(54)【発明の名称】Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）結合ドメイン組成物
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240912BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240912BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240912BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240912BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240912BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240912BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240912BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240912BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024518820
(86)(22)【出願日】2022-09-27
(85)【翻訳文提出日】2024-04-08
(86)【国際出願番号】 US2022077070
(87)【国際公開番号】W WO2023049922
(87)【国際公開日】2023-03-30
(31)【優先権主張番号】63/248,988
(32)【優先日】2021-09-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】510089100
【氏名又は名称】ゼンコア インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】ムーア，グレゴリー
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本明細書では、新規ＢＣＭＡ結合ドメイン組成物、及びそのようなＢＣＭＡ結合ドメインを含む抗ＢＣＭＡ抗体が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインの以下のセットから選択される可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを含む抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む組成物：ａ）配列番号１７のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号１５のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；
ｂ）配列番号２７のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号２９のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号２３のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号２５のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；
ｃ）配列番号３７のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号３８のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号３９のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号３３のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；
ｄ）配列番号４７のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号４９のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号４３のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号４５のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；
ｅ）配列番号５７のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号５９のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号５３のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号５５のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；
ｆ）配列番号６７のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号６８のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号６９のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号６３のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号６４のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号６５のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；並びに
ｇ）配列番号７７のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号７８のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号７９のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号７３のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号７４のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号７５のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン。
【請求項2】
可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインの以下のセットから選択される可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインのセットを含む抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む組成物：ａ）配列番号１６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメインのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号１２のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；
ｂ）配列番号２６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメインのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号２２のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；
ｃ）配列番号３６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメインのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号３２のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；
ｄ）配列番号４６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメインのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号４２のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；
ｅ）配列番号５６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメインのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号５２のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；
ｆ）配列番号６６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメインのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号６２のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；並びに
ｇ）配列番号７６のアミノ酸配列を有する可変軽鎖ドメインのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号７２のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン。
【請求項3】
可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインの以下のセットから選択される可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインのセットを含む抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む組成物：ａ）配列番号１６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメイン及び配列番号１２のアミノ酸を有する可変重鎖ドメイン；
ｂ）配列番号２６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメイン及び配列番号２２のアミノ酸を有する可変重鎖ドメイン；
ｃ）配列番号３６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメイン及び配列番号３２のアミノ酸を有する可変重鎖ドメイン；
ｄ）配列番号４６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメイン及び配列番号４２のアミノ酸を有する可変重鎖ドメイン；
ｅ）配列番号５６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメイン及び配列番号５２のアミノ酸を有する可変重鎖ドメイン；
ｆ）配列番号６６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメイン及び配列番号６２のアミノ酸を有する可変重鎖ドメイン；並びに
ｇ）配列番号７６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメイン及び配列番号７２のアミノ酸を有する可変重鎖ドメイン。
【請求項4】
核酸組成物であって、それぞれ、ａ）請求項１、２又は３に記載の可変重鎖ドメインをコードする第１の核酸；及び
ｂ）請求項１、２又は３に記載の可変軽鎖ドメインをコードする第２の核酸
を含む、核酸組成物。
【請求項5】
発現ベクター組成物であって、ａ）請求項４に記載の第１の核酸を含む第１の発現ベクター；及び
ｂ）請求項４に記載の第２の核酸を含む第２の発現ベクター
を含む発現ベクター組成物。
【請求項6】
請求項５に記載の発現ベクター組成物を含む宿主細胞。
【請求項7】
ＢＣＭＡ結合ドメインを作製する方法であって、前記ＢＣＭＡ結合ドメインが発現される条件下で請求項６に記載の宿主細胞を培養することと、前記ＢＣＭＡ結合ドメインを回収することとを含む、方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（優先権主張）
本出願は、２０２１年９月２７日に出願された米国仮出願第６３／２４８，９８８号の優先権及び利益を主張し、その内容全体はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年９月２７日に出願された米国仮出願第６３／２４８，９８８号の優先権及び利益を主張し、その内容全体はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
（配列表）
本出願は、ＸＭＬフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年９月２６日に作成されたＸＭＬコピーは、０６７４６１－５２９２－ＷＯ．ｘｍｌという名称であり、サイズは１７７，８７１バイトである。
本出願は、ＸＭＬフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年９月２６日に作成されたＸＭＬコピーは、０６７４６１－５２９２－ＷＯ．ｘｍｌという名称であり、サイズは１７７，８７１バイトである。
【背景技術】
【0003】
抗体に基づいた治療法は、種々の疾患を処置するのに成功裏に使用されてきた。
【0004】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）を認識するＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである。例えば、Ｌａａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １１（１１）：３８９７－９０４（１９９２）を参照されたい。ＢＣＭＡは、成熟Ｂリンパ球において優先的に発現され、Ｂ細胞発生及び自己免疫応答に重要な役割を果たすと考えられている。Ｂ細胞の発生において、ＢＣＭＡは、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）に係合することによって、Ｂ細胞の成熟及び形質細胞への分化を調節する際に中心的役割を果たし、骨髄における形質細胞の生存にも必要である。例えば、Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ７：１１８７－１１９９（２０１５）を参照されたい。
【0005】
ＢＣＭＡは、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫を含むがこれらに限定されない様々な血液がんに関与する。Ｍｏｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０３：２１４８－３１５７（２００４）；及びＣｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０９（２）：７２９－７３９（２００７）。多発性骨髄腫に関して、ＢＣＭＡは、多発性骨髄腫細胞株及び悪性形質細胞上で発現され、ＢＣＭＡの発現は、多発性骨髄腫の疾患進行中に増加する。Ｍｏｒｅａｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０３：２１４８－３１５７（２００４）；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９：２０４８－２０６０（２０１３）；及びＹｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２２：４４４７（２０１３）を参照されたい。血液疾患、特にＢＣＭＡを標的とする血液疾患の処置のための新規治療薬が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【0006】
本明細書で提供されるのは、新規ＢＣＭＡ抗原結合ドメイン組成物、及びそのようなＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む抗体である。本明細書で提供されるＢＣＭＡ抗原結合ドメイン及び抗体は、例えば、ＢＣＭＡ関連疾患の処置において有用である。
【0007】
本明細書で提供されるのは、新規ＢＣＭＡ抗原結合ドメイン組成物、及びそのようなＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む抗体である。本明細書で提供されるＢＣＭＡ抗原結合ドメイン及び抗体は、例えば、ＢＣＭＡ関連疾患の処置において有用である。
【0008】
一態様では、可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインの以下のセットから選択される可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインのセットを含む抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む組成物が本明細書で提供される：ａ）配列番号１７のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号１９のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号１３のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号１５のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；ｂ）配列番号２７のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号２８のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号２９のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号２３のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号２４のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号２５のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；ｃ）配列番号３７のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号３８のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号３９のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号３３のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号３４のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号３５のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；ｄ）配列番号４７のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号４８のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号４９のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号４３のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号４４のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号４５のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；ｅ）配列番号５７のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号５８のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号５９のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号５３のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号５４のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号５５のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；ｆ）配列番号６７のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号６８のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号６９のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号６３のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号６４のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号６５のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；並びにｇ）配列番号７７のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ１、配列番号７８のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ２、及び配列番号７９のアミノ酸を有するｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号７３のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ１、配列番号７４のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ２、及び配列番号７５のアミノ酸を有するｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン。
【0009】
別の態様では、可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインの以下のセットから選択される可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインのセットを含む抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む組成物が本明細書で提供される：ａ）配列番号１６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメインのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号１２のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；ｂ）配列番号２６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメインのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号２２のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；ｃ）配列番号３６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメインのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号３２のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；ｄ）配列番号４６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメインのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号４２のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；ｅ）配列番号５６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメインのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号５２のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；ｆ）配列番号６６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメインのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号６２のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン；並びにｇ）配列番号７６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメインのｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む可変軽鎖ドメイン、並びに配列番号７２のアミノ酸配列を有する可変重鎖ドメインのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖ドメイン。
【0010】
一態様では、可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインの以下のセットから選択される可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインのセットを含む抗ＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む組成物が本明細書で提供される：ａ）配列番号１６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメイン及び配列番号１２のアミノ酸を有する可変重鎖ドメイン；ｂ）配列番号２６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメイン及び配列番号２２のアミノ酸を有する可変重鎖ドメイン；ｃ）配列番号３６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメイン及び配列番号３２のアミノ酸を有する可変重鎖ドメイン；ｄ）配列番号４６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメイン及び配列番号４２のアミノ酸を有する可変重鎖ドメイン；ｅ）配列番号５６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメイン及び配列番号５２のアミノ酸を有する可変重鎖ドメイン；ｆ）配列番号６６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメイン及び配列番号６２のアミノ酸を有する可変重鎖ドメイン；並びにｇ）配列番号７６のアミノ酸を有する可変軽鎖ドメイン及び配列番号７２のアミノ酸を有する可変重鎖ドメイン。
【0011】
別の態様では、ａ）本明細書で提供されるＢＣＭＡ ＡＢＤ組成物のいずれかの可変重鎖ドメインをコードする第１の核酸；及びｂ）本明細書で提供されるＢＣＭＡ ＡＢＤ組成物のいずれかの可変軽鎖ドメインをコードする第２の核酸を含む核酸組成物が本明細書で提供される。
【0012】
別の態様では、ａ）第１の核酸を含む第１の発現ベクター；及びｂ）第２の核酸を含む第２の発現ベクターを含む発現ベクター組成物が本明細書で提供される。
【0013】
一態様では、本明細書で提供されるのは、発現ベクター組成物を含む宿主細胞である。更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡ結合ドメインを作製する方法であって、ＢＣＭＡ結合ドメインが発現される条件下で宿主細胞を培養することと、ＢＣＭＡ結合ドメインを回収することとを含む方法である。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】Ａ）ヒト、Ｂ）マウス、Ｃ）ラット及びＤ）カニクイザルのＢＣＭＡの配列を示す。下線の領域は細胞外ドメインである。
【図2】ヒトＢＣＭＡの細胞外ドメインと、Ａ）カニクイザルＢＣＭＡ、Ｂ）マウスＢＣＭＡ、及びＣ）ラットＢＣＭＡとの配列アラインメントを示す。
【図3】本明細書に記載のＢＣＭＡ結合ドメイン組成物の実施形態における使用される定常重鎖ドメインの配列を示す。
【図4】本明細書に記載のＢＣＭＡ結合ドメイン組成物における使用される同族軽鎖の定常ドメインを示す。
【図5】例示的なファージ由来ＢＣＭＡ結合ドメインであるＳ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒの可変重鎖及び可変軽鎖配列、並びにＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを有するＳ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ及びＩｇＧ１骨格に基づく抗ＢＣＭＡ ｍＡｂの配列であるＸＥＮＰ２３３５７を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と定常ドメインとの境界を示す。本明細書に記載され、ＣＤＲを含有するあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表２に示されるように使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、よって、下線が付されたＣＤＲだけでなく、他の番号付けシステムを使用したＶＨ及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも、本明細書に含まれる。
【図6】例示的なファージ由来ＢＣＭＡ結合ドメインであるＳ１Ｒ５＿１２５の可変重鎖及び可変軽鎖配列、並びにＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを有するＳ１Ｒ５＿１２５ｒ及びＩｇＧ１骨格に基づく抗ＢＣＭＡ ｍＡｂであるＸＥＮＰＸＸＸの配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と定常ドメインとの境界を示す。本明細書に記載され、ＣＤＲを含有するあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表２に示されるように使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、よって、下線が付されたＣＤＲだけでなく、他の番号付けシステムを使用したＶＨ及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも、本明細書に含まれる。
【図7】ＸＥＮＰ２３３５７（Ｓ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒに基づくＢＣＭＡ ｍＡｂ）のＡ）還元ＬａｂＣｈｉｐゲル、Ｂ）非還元ＬａｂＣｈｉｐゲル、及びＣ）分析用サイズ排除クロマトグラムを示す。
【図8】ＢＣＭＡに対する一価結合を有する１＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂと関連して、ファージ由来ＢＣＭＡクローンＳ１Ｒ５＿１２５及びＳ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒのヒト及びカニクイザルＢＣＭＡに対する解離定数（ＫＤ）、会合速度（Ｋａ）、及び解離速度（Ｋｄ）を示す。
【図9】ＢＣＭＡに対する一価及び二価結合をそれぞれ有する１＋１及び２＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂと関連して、ファージ由来ＢＣＭＡクローンＳ１Ｒ５＿１２５及びＳ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒによる、Ａ）ヒトＢＣＭＡでトランスフェクトされた３００－１９細胞、Ｂ）カニクイザルＢＣＭＡでトランスフェクトされた３００－１９細胞、及びＣ）親３００－１９細胞への結合を示す。
【図10】それぞれＢＣＭＡに対する一価及び二価結合を有する１＋１及び２＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂとの関連において、Ａ）ファージ由来ＢＣＭＡクローンＳ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ及びＢ）ファージ由来ＢＣＭＡクローンＳ１Ｒ５＿１２５によるリダイレクトＴ細胞細胞傷害性の誘導を示す。２＋１フォーマットがより弱い親和性のＣＤ３結合ドメインを利用することに留意されるべきである。
【図11】例示的なヒト化ハイブリドーマ由来ＢＣＭＡ結合ドメインである１Ａ１の可変重鎖及び可変軽鎖配列、並びにＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを有する１Ａ１及びＩｇＧ１骨格に基づく抗ＢＣＭＡ ｍＡｂであるＸＥＮＰ２４４９５の配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と定常ドメインとの境界を示す。本明細書に記載され、ＣＤＲを含有するあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表２に示されるように使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、よって、下線が付されたＣＤＲだけでなく、他の番号付けシステムを使用したＶＨ及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも、本明細書に含まれる。
【図12】例示的なヒト化ハイブリドーマ由来ＢＣＭＡ結合ドメインである１Ｂ４の可変重鎖及び可変軽鎖配列、並びにＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを有する１Ｂ４及びＩｇＧ１骨格に基づく抗ＢＣＭＡ ｍＡｂであるＸＥＮＰ２４５０３の配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と定常ドメインとの境界を示す。本明細書に記載され、ＣＤＲを含有するあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表２に示されるように使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、よって、下線が付されたＣＤＲだけでなく、他の番号付けシステムを使用したＶＨ及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも、本明細書に含まれる。
【図13】例示的なヒト化ハイブリドーマ由来ＢＣＭＡ結合ドメインである１Ｂ３の可変重鎖及び可変軽鎖配列、並びにＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを有する１Ｂ３及びＩｇＧ１骨格に基づく抗ＢＣＭＡ ｍＡｂであるＸＥＮＰ２４６１７の配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と定常ドメインとの境界を示す。本明細書に記載され、ＣＤＲを含有するあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表２に示されるように使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、よって、下線が付されたＣＤＲだけでなく、他の番号付けシステムを使用したＶＨ及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも、本明細書に含まれる。
【図14】例示的なヒト化ハイブリドーマ由来ＢＣＭＡ結合ドメインである５Ｆ２の可変重鎖及び可変軽鎖配列、並びにＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを有する５Ｆ２及びＩｇＧ１骨格に基づく抗ＢＣＭＡ ｍＡｂであるＸＥＮＰ２４６２１の配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と定常ドメインとの境界を示す。本明細書に記載され、ＣＤＲを含有するあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表２に示されるように使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、よって、下線が付されたＣＤＲだけでなく、他の番号付けシステムを使用したＶＨ及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも、本明細書に含まれる。
【図15】例示的なヒト化ハイブリドーマ由来ＢＣＭＡ結合ドメインである６Ｅ３の可変重鎖及び可変軽鎖配列、並びにＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ除去バリアントを有する６Ｅ３及びＩｇＧ１骨格に基づく抗ＢＣＭＡ ｍＡｂであるＸＥＮＰ２４６２５の配列を示す。ＣＤＲは下線が付され、スラッシュは可変領域と定常ドメインとの境界を示す。本明細書に記載され、ＣＤＲを含有するあらゆる配列に当てはまるように、ＣＤＲ位置の正確な同定は、表２に示されるように使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、よって、下線が付されたＣＤＲだけでなく、他の番号付けシステムを使用したＶＨ及びＶＬドメイン内に含まれるＣＤＲも、本明細書に含まれる。
【図16】ＸＥＮＰ２４４９５（１Ａ１）、ＸＥＮＰ２４５０３（１Ｂ４）、ＸＥＮＰ２４６１７（１Ｂ３）、ＸＥＮＰ２４６２１（５Ｆ２）及びＸＥＮＰ２４６２５（６Ｅ３）についてのＡ）還元ＬａｂＣｈｉｐゲル及びＢ）非還元ＬａｂＣｈｉｐゲルを示す。
【図17】Ａ）ＸＥＮＰ２４４９５（１Ａ１）、Ｂ）ＸＥＮＰ２４５０３（１Ｂ４）、Ｃ）ＸＥＮＰ２４６１７（１Ｂ３）、Ｄ）ＸＥＮＰ２４６２１（５Ｆ２）、及びＥ）ＸＥＮＰ２４６２５（６Ｅ３）の分析サイズ排除クロマトグラムを示す。
【図18】ＢＣＭＡに対する一価結合を有する１＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂと関連して、ヒト化ハイブリドーマ由来ＢＣＭＡクローン１Ｂ４、１Ｂ３、５Ｆ２、６Ｅ３、及び１Ａ１のヒト及びカニクイザルのＢＣＭＡの解離定数（ＫＤ）、会合速度（Ｋａ）及び解離速度（Ｋｄ）を示す。
【図19】二価単一特異性ｍＡｂと関連して、ヒト化ハイブリドーマ由来ＢＣＭＡクローンＳ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ、１Ｂ４、１Ｂ３、５Ｆ２、６Ｅ３、及び１Ａ１による、Ａ）ヒトＢＣＭＡでトランスフェクトされた３００－１９細胞、Ｂ）カニクイザルＢＣＭＡでトランスフェクトされた３００－１９細胞、及びＣ）親３００－１９細胞への結合を示す。
【図20】それぞれＢＣＭＡに対する一価及び二価結合を有する１＋１及び２＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂとの関連において、ヒト化ハイブリドーマ由来ＢＣＭＡクローン１Ａ１、１Ｂ４、１Ｂ３、５Ｆ２、及び６Ｅ３によるリダイレクトＴ細胞細胞傷害性の誘導を示す。２＋１ ｂｓＡｂがより低い親和性のＣＤ３結合ドメインを利用することに留意されるべきである。
【図21】ＢＣＭＡに対する一価結合を有する１＋１におけるＣＤ３ ｂｓＡｂとの関連において、ヒト化ハイブリドーマ由来ＢＣＭＡクローン１Ａ１、１Ｂ４、１Ｂ３、５Ｆ２、及び６Ｅ３の薬物動態を示す。
【図22-1】本明細書で提供される抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体の例示的なフォーマットを示す。Ａは、「１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマットを示し、第１のＦａｂアームが第１の抗原に結合し、第２のｓｃＦｖアームが第２の抗原に結合する。１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットは、第１のヘテロ二量体Ｆｃ骨格のＮ末端に（任意選択でリンカーを介して）共有結合した第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）を含む第１の単量体と、第２の対応するヘテロ二量体Ｆｃ骨格のＮ末端に（任意選択でリンカーを介して）共有結合した単鎖Ｆｖを含む第２の単量体と、軽鎖定常ドメインに共有結合した軽鎖可変領域を含む第３の単量体であって、軽鎖可変領域はＶＨ１に相補的である、第３の単量体とを含む。Ｂは、第１のＦａｂアーム及び第２のＦａｂ－ｓｃＦｖアームを有する「２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマットを示し、Ｆａｂは第１の抗原に結合し、ｓｃＦｖは第２の抗原に結合する。２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットは、第１のヘテロ二量体Ｆｃ骨格のＮ末端に（任意選択でリンカーを介して）共有結合した第１の重鎖可変領域（ＶＨ１）を含む第１の単量体と、第２の対応するヘテロ二量体Ｆｃ骨格のＮ末端に（任意選択でリンカーを介して）共有結合した単鎖Ｆｖに（任意選択でリンカーを介して）共有結合したＶＨ１を含む第２の単量体と、軽鎖定常ドメインに共有結合した軽鎖可変領域を含む第３の単量体であって、軽鎖可変領域はＶＨ１に相補的である、第３の単量体とを含む。
【図22-2】本明細書で提供される抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体の例示的なフォーマットを示す。Ｃは、「２＋１ ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」フォーマットを示し、第１のＦｃは第１の抗原に結合するＮ末端Ｆａｂアームを含み、第２のＦｃは第１の抗原に結合するＮ末端Ｆａｂアーム及び第２の抗原に結合するＣ末端ｓｃＦｖを含む。２＋１ ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマットは、ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む第１の単量体と、ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ｓｃＦｖを含む第２の単量体と、ＶＬ－ＣＬを含む第３の単量体とを含む。ＶＬは、第１及び第２のＶＨ１と対になって、第１の抗原に対する結合特異性を有する結合ドメインを形成する。
【図23A】本明細書で提供される抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体において使用することができるヘテロ二量体化バリアントのセット（スキューバリアント及びｐＩバリアントを含む）の有用な対を示す。図２３Ｆには、対応する「単量体２」バリアントが存在しないバリアントがある。そのようなバリアントは、抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体のいずれかの単量体で単独で使用され得るｐＩバリアントであるか、又は例えば、構成要素としてｓｃＦｖを利用するフォーマットの非ｓｃＦｖ側に含まれる可能性があり、適切な荷電ｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖを利用する第２の単量体で使用される可能性がある。好適な荷電リンカーは、図２６に示される。
【図23B】本明細書で提供される抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体において使用することができるヘテロ二量体化バリアントのセット（スキューバリアント及びｐＩバリアントを含む）の有用な対を示す。図２３Ｆには、対応する「単量体２」バリアントが存在しないバリアントがある。そのようなバリアントは、抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体のいずれかの単量体で単独で使用され得るｐＩバリアントであるか、又は例えば、構成要素としてｓｃＦｖを利用するフォーマットの非ｓｃＦｖ側に含まれる可能性があり、適切な荷電ｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖを利用する第２の単量体で使用される可能性がある。好適な荷電リンカーは、図２６に示される。
【図23C】本明細書で提供される抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体において使用することができるヘテロ二量体化バリアントのセット（スキューバリアント及びｐＩバリアントを含む）の有用な対を示す。図２３Ｆには、対応する「単量体２」バリアントが存在しないバリアントがある。そのようなバリアントは、抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体のいずれかの単量体で単独で使用され得るｐＩバリアントであるか、又は例えば、構成要素としてｓｃＦｖを利用するフォーマットの非ｓｃＦｖ側に含まれる可能性があり、適切な荷電ｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖを利用する第２の単量体で使用される可能性がある。好適な荷電リンカーは、図２６に示される。
【図23D】本明細書で提供される抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体において使用することができるヘテロ二量体化バリアントのセット（スキューバリアント及びｐＩバリアントを含む）の有用な対を示す。図２３Ｆには、対応する「単量体２」バリアントが存在しないバリアントがある。そのようなバリアントは、抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体のいずれかの単量体で単独で使用され得るｐＩバリアントであるか、又は例えば、構成要素としてｓｃＦｖを利用するフォーマットの非ｓｃＦｖ側に含まれる可能性があり、適切な荷電ｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖを利用する第２の単量体で使用される可能性がある。好適な荷電リンカーは、図２６に示される。
【図23E】本明細書で提供される抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体において使用することができるヘテロ二量体化バリアントのセット（スキューバリアント及びｐＩバリアントを含む）の有用な対を示す。図２３Ｆには、対応する「単量体２」バリアントが存在しないバリアントがある。そのようなバリアントは、抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体のいずれかの単量体で単独で使用され得るｐＩバリアントであるか、又は例えば、構成要素としてｓｃＦｖを利用するフォーマットの非ｓｃＦｖ側に含まれる可能性があり、適切な荷電ｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖを利用する第２の単量体で使用される可能性がある。好適な荷電リンカーは、図２６に示される。
【図23F】本明細書で提供される抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体において使用することができるヘテロ二量体化バリアントのセット（スキューバリアント及びｐＩバリアントを含む）の有用な対を示す。図２３Ｆには、対応する「単量体２」バリアントが存在しないバリアントがある。そのようなバリアントは、抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体のいずれかの単量体で単独で使用され得るｐＩバリアントであるか、又は例えば、構成要素としてｓｃＦｖを利用するフォーマットの非ｓｃＦｖ側に含まれる可能性があり、適切な荷電ｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖを利用する第２の単量体で使用される可能性がある。好適な荷電リンカーは、図２６に示される。
【図24】等配電子バリアント抗体の定常領域及びそれぞれ置換のリストを示す。ｐＩ＿（－）は低ｐＩバリアントを示し、ｐＩ＿（＋）は高ｐＩバリアントを示す。これらのバリアントは、本明細書に概説されているヘテロ二量体化バリアントを含む他のバリアントと任意にかつ独立して組み合わせることができる。
【図25】ＦｃγＲ結合を除去する有用な除去バリアントを示す（「ノックアウト」又は「ＫＯ」バリアントとも称される）。いくつかの実施形態では、そのような除去バリアントは、本明細書に記載の対象抗体の両方の単量体のＦｃドメインに含まれる。他の実施形態では、除去バリアントは、１つのバリアントＦｃドメインのみに含まれる。
【図26】本明細書に記載されているように、構成要素として、１つ以上のｓｃＦｖを利用する対象のヘテロ二量体抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体のｐＩを増減させる際に使用された、いくつかの荷電ｓｃＦｖリンカーを示す。単一電荷を有する単一の先行技術ｓｃＦｖリンカーは、「Ｗｈｉｔｌｏｗ」と称される（Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（８））：９８９－９９５（１９９３））。９８９－９９５（１９９３））。このリンカーは、ｓｃＦｖにおける凝集を低減させ、タンパク質分解安定性を高めるために使用されたことに留意すべきである。そのような荷電ｓｃＦｖリンカーは、ｓｃＦｖを含む、本明細書に開示される対象抗体のフォーマットのいずれかで使用することができる（例えば、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ及び２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット）。
【図27】いくつかの例示的なドメインリンカーを示す。いくつかの実施形態では、これらのリンカーは、単鎖ＦｖをＦｃ鎖に連結する用途を見出す。いくつかの実施形態では、これらのリンカーを任意の配向で組み合わせることができる。例えば、ＧＧＧＧＳリンカーは、Ｎ末端又はＣ末端で「下ハーフヒンジ」リンカーと組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、図２７に示されるドメインリンカーの２つ以上を組み合わせて、本明細書に記載のヘテロ二量体抗体で使用するためのより長いドメインリンカーを形成することができる。
【図28】本発明の抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体のヘテロ二量体Ｆｃドメイン（すなわち、この実施形態におけるＣＨ２－ＣＨ３）の特に有用な実施形態を示す。
【図29】本明細書に記載のヘテロ二量体抗体で使用され得る様々なヘテロ二量体スキューバリアントアミノ酸置換を示す。
【図30A】サイトカイン配列を含まない、ヒトＩｇＧ１に基づくいくつかの有用な抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体の骨格の配列を示す。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格１は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格２は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格３は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格４は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＫ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＤ４０１Ｋのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格５は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格６は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアント及びグリコシル化を除去するＮ２９７Ａのバリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格７は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアント及びグリコシル化を除去するＮ２９７Ｓバリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格８は、ヒトＩｇＧ４に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＦａｂアーム交換を除去するＳ２２８Ｐ（ＥＵ番号付けによる、ＫａｂａｔではＳ２４１Ｐ）バリアント（当技術分野で知られている）を含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格９は、ヒトＩｇＧ２に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格１０は、ヒトＩｇＧ２に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアント及び両方の鎖にＳ２６７Ｋ除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格１１は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアント及びＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ Ｘｔｅｎｄバリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格１２は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアント及びＰ２１７Ｒ／Ｐ２２９Ｒ／Ｎ２７６ＫのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。
【図30B】サイトカイン配列を含まない、ヒトＩｇＧ１に基づくいくつかの有用な抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体の骨格の配列を示す。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格１は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格２は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格３は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格４は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＫ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＤ４０１Ｋのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格５は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格６は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアント及びグリコシル化を除去するＮ２９７Ａのバリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格７は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアント及びグリコシル化を除去するＮ２９７Ｓバリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格８は、ヒトＩｇＧ４に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＦａｂアーム交換を除去するＳ２２８Ｐ（ＥＵ番号付けによる、ＫａｂａｔではＳ２４１Ｐ）バリアント（当技術分野で知られている）を含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格９は、ヒトＩｇＧ２に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格１０は、ヒトＩｇＧ２に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアント及び両方の鎖にＳ２６７Ｋ除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格１１は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアント及びＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ Ｘｔｅｎｄバリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格１２は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアント及びＰ２１７Ｒ／Ｐ２２９Ｒ／Ｎ２７６ＫのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。
【図30C】サイトカイン配列を含まない、ヒトＩｇＧ１に基づくいくつかの有用な抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体の骨格の配列を示す。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格１は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格２は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格３は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格４は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＫ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ／Ｔ４１１Ｅのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＤ４０１Ｋのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格５は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｄ／３５８Ｌアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格６は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアント及びグリコシル化を除去するＮ２９７Ａのバリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格７は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアント及びグリコシル化を除去するＮ２９７Ｓバリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格８は、ヒトＩｇＧ４に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＦａｂアーム交換を除去するＳ２２８Ｐ（ＥＵ番号付けによる、ＫａｂａｔではＳ２４１Ｐ）バリアント（当技術分野で知られている）を含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格９は、ヒトＩｇＧ２に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格１０は、ヒトＩｇＧ２に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアント及び両方の鎖にＳ２６７Ｋ除去バリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格１１は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアント、及びＱ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１ＤのｐＩバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアント及びＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ Ｘｔｅｎｄバリアントを含む。ヘテロ二量体Ｆｃ骨格１２は、ヒトＩｇＧ１（３５６Ｅ／３５８Ｍアロタイプ）に基づき、第１のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓのスキューバリアントを含み、第２のヘテロ二量体Ｆｃ鎖にＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑのスキューバリアント及びＰ２１７Ｒ／Ｐ２２９Ｒ／Ｎ２７６ＫのｐＩバリアントを含み、両方の鎖にＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋの除去バリアントを含む。 これらの骨格のそれぞれに含まれるのは、列挙された配列に対して（本明細書に定義されるように）９０、９５、９８、及び９９％同一である配列であり、かつ／又は（当業者には理解されるように、親ヒトＩｇＧ１（又は骨格に応じたＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４）と比較していくつかのアミノ酸修飾を既に含む、図の「親」と比較して）１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の追加のアミノ酸置換を含む。すなわち、列挙された骨格は、この図の骨格内に含まれるスキューバリアント、ｐＩバリアント及び除去バリアントに加えて、又はその代替として、追加のアミノ酸修飾（一般にアミノ酸置換）を含み得る。追加的に、本明細書に示される骨格は、Ｃ末端グリシン（Ｋ４４６＿）及び／又はリジン（Ｋ４４７＿）の欠失を含み得る。Ｃ末端のグリシン及び／又はリジンの欠失は、不均一性を低減するために、又はある特定の二重特異性フォーマットとの関連で、意図的に操作することができる。追加的に、Ｃ末端のグリシン及び／又はリジンの欠失は、例えば生産及び保存中に自然に発生し得る。
【図31】２＋１ ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマットで使用するためのヘテロ二量体抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体の例示的な配列を示す。ここに示されているフォーマットは、図Ｘに示されるヘテロ二量体Ｆｃ骨格１に基づいているが、単量体１（－）にＧ４４６＿及び単量体２（＋）にＧ４４６＿／Ｋ４４７＿が更に含まれている。図３０に示される追加の骨格はいずれも、一方又は両方の鎖にＫ４４７＿を含む又は含まない２＋１ ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマットでの使用に適合され得ることに留意されたい。これらの配列は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを更に含み得ることに留意されたい。
【図32】Ｆａｂ結合ドメインを利用する抗ＢＣＭＡ抗体の実施形態では使用される「ＣＨ１＋ヒンジ」の配列を示す。「ＣＨ１＋ヒンジ」配列は、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）をＦｃ骨格に連結するのに使用される。Ｆａｂが（＋）側にある特定の実施形態では、「ＣＨ１（＋）＋ヒンジ」配列が使用され得る。Ｆａｂが（－）側にある特定の実施形態では、「ＣＨ１（－）＋ヒンジ」配列が使用され得る。
【図33】２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ中の抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体の実施形態では使用される「ＣＨ１＋ハーフヒンジ」ドメインリンカーの配列を示す。２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットでは、「ＣＨ１＋ハーフヒンジ」配列は、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を二重特異性抗体のＦａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ側のｓｃＦｖドメインに連結するのに使用される。「ＣＨ１＋ハーフヒンジ」の代わりに、他のリンカーが使用されてもよいことに留意されたい。ここでの配列はＩｇＧ１配列に基づいているが、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４配列に基づいて等価物が構築され得ることにも留意されたい。
【図34】抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体の実施形態では使用される「ＣＨ１」についての配列を示す。
【図35】抗ＢＣＭＡヘテロ二量体抗体の実施形態では使用される「ヒンジ」についての配列を示す。
【図36】本明細書に示される抗体において使用される同族軽鎖の定常ドメインを示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
Ｉ．概要
本明細書で提供されるのは、新規ＢＣＭＡ抗原結合ドメイン組成物、及びそのようなＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、本明細書で提供されるＢＣＭＡ抗原結合ドメインのうちの少なくとも１つを含むヘテロ二量体及び二重特異性抗体である。例示的な実施形態では、ＢＣＭＡ抗体は、ＣＤ３結合ドメインを含まない。本明細書で提供されるＢＣＭＡ抗原結合ドメイン及び抗体は、例えば、ＢＣＭＡ関連疾患の処置において有用である。
本明細書で提供されるのは、新規ＢＣＭＡ抗原結合ドメイン組成物、及びそのようなＢＣＭＡ抗原結合ドメインを含む抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、本明細書で提供されるＢＣＭＡ抗原結合ドメインのうちの少なくとも１つを含むヘテロ二量体及び二重特異性抗体である。例示的な実施形態では、ＢＣＭＡ抗体は、ＣＤ３結合ドメインを含まない。本明細書で提供されるＢＣＭＡ抗原結合ドメイン及び抗体は、例えば、ＢＣＭＡ関連疾患の処置において有用である。
【0016】
ＩＩ．定義
本出願をより完全に理解できるようにするため、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的同等物を包含することを意図する。
本出願をより完全に理解できるようにするため、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的同等物を包含することを意図する。
【0017】
本明細書における「Ｂ細胞成熟抗原」又は「ＢＣＭＡ」又は「腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７」又はＴＮＦＲＳＦ１７又はＣＤ２６９とは、形質細胞の表面上で主に発現され、ヒトにおけるＴＮＦＲＳＦ１７遺伝子（例えば、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１９２及びＮＰ＿００１１８３（ヒト）；及びＮＭ＿００１１６０８及びＮＰ＿０３５７３８（マウス））によってコードされるＴＮＦ－受容体スーパーファミリーのシングルパスＩＩＩ型膜貫通糖タンパク質が意味される。ＢＣＭＡは、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーのメンバーであるＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＳＦ１３）及びＢＡＦＦ（ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）に結合する。ＢＣＭＡは、免疫器官及び成熟Ｂ細胞（形質細胞）、並びに膠芽腫、多発性骨髄腫、慢性リンパ性白血病及びホジキンリンパ腫などのがん細胞において発現される。Ｄｅｓｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３（１７）：３００５－３０１２（２００４）；Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０３（２）：６８９－６９４（２００４）；Ｎｏｖａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １００（８）：２９７３－２９７９（２００２）；Ｃｈｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０９（２）：７２９－７３９（２００７）。例示的なＢＣＭＡ配列を図１に示す。
【0018】
本明細書で使用される「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」は、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合と相関し、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加はＡＤＣＣ活性の増加をもたらす。
【0019】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、別段に特に記載しない限り、伝統的な免疫グロブリン（Ｉｇ）抗体を指す。
【0020】
従来の免疫グロブリン（Ｉｇ）抗体は、「Ｙ」字型の四量体である。各四量体は、典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は、１つの「軽鎖」単量体及び１つの「重鎖」単量体を有する。
【0021】
抗体重鎖は、典型的には、ｖｈＣＤＲ１～３を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメイン（「重鎖可変ドメイン」とも呼ばれる）と、ＣＨ２－ＣＨ３単量体を含むＦｃドメインとを含む。いくつかの実施形態では、抗体重鎖は、ヒンジ及びＣＨ１ドメインを含む。従来の抗体重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に向かって組織化された単量体：ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３である。ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３は、重鎖「定常ドメイン」又は「定常領域」と総称され、５つの異なるカテゴリー又は「アイソタイプ」（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＭ）が存在する。
【0022】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含むがこれらに限定されないいくつかのサブクラスを有するＩｇＧアイソタイプ定常ドメインを含む。免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスには、重鎖においていくつかの免疫グロブリンドメインがある。本明細書における「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、明確に異なる三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。定常重鎖（ＣＨ）ドメイン及びヒンジドメインを含む重鎖ドメインが本発明における関心対象である。ＩｇＧ抗体の関連において、ＩｇＧアイソタイプは、それぞれ３つのＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧの関連において、「ＣＨ」ドメインは、以下のとおりである：「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔにおけるようにＥＵインデックスに従って１１８～２１５位を指す。「ヒンジ」は、Ｋａｂａｔにおけるように、ＥＵインデックスによる２１６～２３０位を指す。「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔにおけるようにＥＵインデックスに従って２３１～３４０位を指し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔにおけるようにＥＵインデックスに従って３４１～４４７位を指す。表１に示されているように、重鎖ドメインの正確な番号付け及び配置は、異なる番号付けシステム間で異なり得る。本明細書に示され、以下に記載されるように、ｐＩバリアントは、以下に考察されるヒンジ領域と同様に１つ以上のＣＨ領域にあり得る。
【0023】
本明細書で使用される「Ｆｃ」又は「Ｆｃ領域」又は「Ｆｃドメイン」とは、抗体の定常領域を含む、いくつかの場合では、第１の定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１）の全て又はその一部を除外し、いくつかの場合では、任意にヒンジの全部又は一部を含む、ポリペプチドを意味する。ＩｇＧの場合、Ｆｃドメインは免疫グロブリンドメインＣＨ２及びＣＨ３（Ｃγ２及びＣγ３）、並びに任意選択的に、ＣＨ１（Ｃγ１）とＣＨ２（Ｃγ２）との間のヒンジ領域の全て又は一部を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４からのものであり、ＩｇＧ１ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３及びＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３は、多くの実施形態では特に使用される。Ｆｃ領域の境界は異なり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル末端に残基Ｅ２１６、Ｃ２２６又はＡ２３１を含むと定義され、番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。いくつかの実施形態では、以下により完全に記載されるように、例えば１つ以上のＦｃγＲ又はＦｃＲｎへの結合を変化させるために、Ｆｃ領域に対してアミノ酸修飾が行われる。
【0024】
本明細書における「重鎖定常領域」又は「定常重鎖ドメイン」は、可変重鎖ドメインを除く、抗体（又はそのフラグメント）のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３部分を意味し；ヒトＩｇＧ１のＥＵ番号付けでは、これはアミノ酸１１８～４４７である。本明細書における「重鎖定常領域フラグメント」とは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか又は両方からのアミノ酸がより少ない重鎖定常領域を意味するが、別の重鎖定常領域と二量体を形成する能力を依然として保持する重鎖定常領域を意味する。
【0025】
本明細書において「ヒンジ」又は「ヒンジ領域」又は「抗体ヒンジ領域」又は「ヒンジドメイン」とは、抗体の第１の定常ドメインと第２の定常ドメインと間のアミノ酸を含む可動性ポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ ＣＨ１ドメインはＥＵの２１５位で終わり、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインは残基ＥＵの２３１位で始まる。したがって、ＩｇＧについては、抗体ヒンジは、本明細書において、２１６位（ＩｇＧ１中のＥ２１６）～２３０位（ＩｇＧ１中のＰ２３０）を含むように定義され、番号付けは、ＫａｂａｔにおけるようにＥＵインデックスに従う。
【0026】
当業者には理解されるように、重鎖定常領域ドメイン（すなわちＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）の正確な番号付け及び配置は、異なる番号付けシステムで異なり得る。ＥＵ及びＫａｂａｔによる重鎖定常領域の番号付けの有用な比較は以下のとおりであり、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８－８５、及びＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ（参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。他の番号付け規則が当技術分野で利用可能であり、当業者は、本明細書に記載されているものに基づいて、それらの他の番号付け規則システムにおける正確な番号付け及び配置を容易に決定することができる。
【0027】
【表1】
【0028】
抗体軽鎖は、一般に、２つのドメイ：軽鎖ＣＤＲｓ ｖｌＣＤＲ１～３を含む可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）（「軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）及び定常軽鎖領域又は軽鎖定常領域（ＣＬ又はＣκと呼ばれることも多い）を含む。抗体軽鎖は通常、Ｎ末端からＣ末端に向かって組織化されている：ＶＬ－ＣＬ。
【0029】
本明細書において「抗原連結ドメイン」又は「ＡＢＤ」は、抗体配列の一部として存在する場合、本明細書で考察されるような標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ）に特異的に結合する６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のセットを意味する。当技術分野で知られるように、これらのＣＤＲは、一般に、可変重鎖ＣＤＲの第１のセット（ｖｈＣＤＲ又はＶＨＣＤＲ）及び可変軽鎖ＣＤＲの第２のセット（ｖｌＣＤＲ又はＶＬＣＤＲ）として存在し、それぞれが３個のＣＤＲ、すなわち、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、ｖｈＣＤＲ３可変重鎖ＣＤＲ、及びｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２及びｖｌＣＤＲ３可変軽鎖ＣＤＲを含む。ＣＤＲは、可変重鎖ドメイン（ｖｈＣＤＲ１～３）と可変軽鎖ドメイン（ｖｌＣＤＲ１～３）に存在する。可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインがＦｖ領域を形成する。
【0030】
典型的には、「完全ＣＤＲセット」は、３個の可変軽鎖ＣＤＲ及び３個の可変重鎖ＣＤＲ、例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２及びｖｈＣＤＲ３を含む。これらは、それぞれ、より大きな可変軽鎖又は可変重鎖ドメインの一部であり得る。更に、本明細書により詳細に概説されるように、可変重鎖及び可変軽鎖ドメインは、別々のポリペプチド鎖、すなわち、それぞれ重鎖及び軽鎖上にあり得る。
【0031】
当業者によって理解されるように、ＣＤＲの正確な番号付け及び配置は、異なる番号付けシステム間で異なり得る。しかしながら、可変重鎖配列及び／又は可変軽鎖配列の開示は、関連する（固有の）ＣＤＲの開示を含むことが理解されるべきである。したがって、各可変重鎖領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽鎖領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３）の開示である。ＣＤＲ番号付けの有用な比較は以下のとおりであり、Ｌａｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５－７７（２００３）を参照されたい。
【0032】
【表2】
【0033】
本明細書全体を通して、Ｋａｂａｔ番号付けシステムは概して、可変ドメイン内の残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１～１０７及び重鎖可変領域の残基１～１１３）を参照するときに使用され、ＥＵ番号付けシステムは、Ｆｃ領域に対するものである（例えば、上述のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）を参照）。当業者は、本明細書に記載され、当技術分野で公知の他の番号付けシステムにおけるＣＤＲの正確な番号付け及び配置を容易に決定することができる。
【0034】
ＣＤＲは、抗原結合の形成、又はより詳細には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られている抗体分子の可変領域内の特異的抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の群分けであり、通常、特異的構造特性、並びに特異的電荷特性を有する。単一抗原は、１つより多くのエピトープを有してもよい。
【0035】
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（また、エピトープの免疫優性構成要素とも称される）及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特異的抗原結合ペプチドによって効果的に遮断されるアミノ酸残基などを含み得、言い換えれば、アミノ酸残基は、特異的抗原結合ペプチドのフットプリント内にある。
【0036】
エピトープは、立体配座又は直線状のいずれかであってもよい。立体配座エピトープは、直線状のポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖内の隣接アミノ酸残基によって産生されるものである。立体配座エピトープ及び非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないという点で区別され得る。
【0037】
エピトープは、典型的には、固有の空間立体構造内に、少なくとも３個、より通常には、少なくとも５個、又は８～１０個のアミノ酸を含む。同じエピトープを認識する抗体は、ある抗体の別の抗体の標的抗原への結合を遮断する能力、例えば、「ビニング」を示す単純な免疫アッセイにおいて検証され得る。以下に概説されるように、本発明は、列挙された抗原結合ドメイン及び本明細書の抗体を含むだけでなく、列挙された抗原結合ドメインによって結合されるエピトープとの結合について競合するものも含む。
【0038】
対象の抗体の６つのＣＤＲには、可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインが寄与する。「Ｆａｂ」フォーマットでは、６個のＣＤＲのセットには、２個の異なるポリペプチド配列、可変重鎖ドメイン（ｖｈ又はＶＨ；ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む）、及び可変軽鎖ドメイン（ｖｌ又はＶＬ；ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む）が寄与し、ｖｈドメインのＣ末端は重鎖のＣＨ１ドメインのＮ末端に結合しており、ｖｌドメインのＣ末端は定常軽鎖ドメインのＮ末端に結合している（したがって軽鎖を形成している）。
【0039】
本明細書で使用される「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、カッパ、ラムダ、及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座をそれぞれ構成するＶκ、Ｖλ、及び／又はＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含み、抗原特異性を付与するＣＤＲを含む、免疫グロブリンの領域を意味する。したがって、「可変重鎖ドメイン」は「可変軽鎖ドメイン」と対になって抗原結合ドメイン（antigen binding domain、「ＡＢＤ」）を形成する。加えて、各可変ドメインは、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）（可変重鎖ドメインではｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３、可変軽鎖ドメインではｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３）と、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域とを含み、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順序で配置される。
【0040】
本明細書で使用される「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ領域」とは、概して２つの異なるポリペプチド鎖の（例えば、一方の鎖のＶＨ－ＣＨ１、他方の鎖のＶＬ－ＣＬ）、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含む抗体領域を意味する。Ｆａｂは、単独でこの領域、又は本発明の二重特異性抗体との関連でこの領域を指し得る。Ｆａｂの関連で、Ｆａｂは、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに加えてＦｖ領域を含む。
【0041】
本明細書で使用される「Ｆｖ」又は「Ｆｖフラグメント」又は「Ｆｖ領域」は、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む抗体領域を意味する。
【0042】
本明細書における「修飾」又は「バリアント」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸の置換、挿入、及び／若しくは欠失、又はタンパク質と化学的に連結された部分に対する改変を意味する。例えば、修飾は、タンパク質に結合した、改変された炭水化物又はＰＥＧ構造であってもよい。本明細書における「アミノ酸修飾」とは、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入、及び／又は欠失を意味する。明確にするために、別段の記載がない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ中にコドンを有する２０個のアミノ酸に対するものである。
【0043】
本明細書における「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置で天然に存在しない（生物内で天然に存在しないか、又はいずれの生物中にも存在しないかのいずれか）アミノ酸に対するものである。例えば、置換Ｍ４２８Ｌは、２７２位のメチオニンがチロシンで置き換えられているバリアントポリペプチド、この場合はＦｃバリアントを指す。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、開始アミノ酸を変化させないように操作されているタンパク質（例えば、宿主生物の発現レベルを増加させるためにＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（依然としてアルギニンをコードする）に交換すること）は、「アミノ酸置換」ではなく；すなわち、同じタンパク質をコードする新しい遺伝子の作出にもかかわらず、タンパク質が、その特定の開始位置に同じアミノ酸を有する場合、アミノ酸置換ではない。
【0044】
本明細書で使用される「バリアントタンパク質」又は「タンパク質バリアント」又は「バリアント」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾に基づいて親タンパク質のそれとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質バリアントは、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を有するが、バリアントタンパク質は、以下に記載されるようなアラインメントプログラムを使用して親タンパク質と整列しないほど多くはない。
【0045】
以下に記載されているように、いくつかの実施形態では、親ポリペプチド、例えばＦｃ親ポリペプチドは、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２由来の重鎖定常ドメイン又はＦｃ領域などのヒト野生型配列であるが、バリアントを有するヒト配列もまた、「親ポリペプチド」として機能することができ、例えば、米国特許出願公開第２００６／０１３４１０５号のＩｇＧ１／２ハイブリッドを含めることができる。したがって、本明細書で使用される「抗体バリアント」又は「バリアント抗体」とは、少なくとも１個のアミノ酸修飾に基づいて親抗体とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「ＩｇＧバリアント」又は「バリアントＩｇＧ」とは、少なくとも１個のアミノ酸修飾に基づいて親ＩｇＧ（ここでも、多くの場合はヒトＩｇＧ配列に由来）とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される「免疫グロブリンバリアント」又は「バリアント免疫グロブリン」とは、少なくとも１個のアミノ酸修飾に基づいて親免疫グロブリン配列のそれとは異なる免疫グロブリン配列を意味する。本明細書で使用される「Ｆｃバリアント」又は「バリアントＦｃ」は、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ２のＦｃドメインと比較して、Ｆｃドメインにアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。
【0046】
本明細書で使用される「Ｆｃバリアント」又は「バリアントＦｃ」とは、Ｆｃドメインにアミノ酸修飾を含むタンパク質を意味する。修飾は、付加、欠失、又は置換であり得る。Ｆｃバリアントは、それらを構成するアミノ酸修飾に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓ又は４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して４３４位に置換セリンを有するＦｃバリアントであり、番号付けはＥＵインデックスによるものである。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドに対して置換Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを有するＦｃバリアントを定義する。ＷＴアミノ酸の同一性は特定されていなくてもよく、その場合、前述のバリアントは４２８Ｌ／４３４Ｓと称される。置換が提供される順序は任意であり、すなわち、例えば、４２８Ｌ／４３４Ｓは４３４Ｓ／４２８Ｌと同じＦｃバリアントであることなどが留意される。抗体又は誘導体及びそれらのフラグメント（例えば、Ｆｃドメイン）に関連する本発明において議論される全ての位置について、特に明記しない限り、アミノ酸位置の番号付けはＥＵインデックスによるものである。「ＥＵインデックス」又は「ＫａｂａｔのようなＥＵインデックス」若しくは「ＥＵ番号付け」スキームは、ＥＵ抗体の番号付けを指す（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ６３：７８－８５、これにより完全に参照により組み込まれる）。当業者は、本明細書に記載され、そして当技術分野で公知の他の番号付けシステムにおける対応する位置を容易に決定することができる。修飾は、付加、欠失、又は置換であり得る。
【0047】
一般に、バリアントＦｃドメインは、対応する親ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインに対して少なくとも約８０、８５、９０、９５、９７、９８又は９９パーセントの同一性を有する（デフォルトパラメータを使用して、以下に考察される同一性アルゴリズムを使用する（一実施形態では当技術分野で既知のＢＬＡＳＴアルゴリズムを利用する））。更に、本明細書で考察されるように、本明細書に記載のバリアントＦｃドメインは、非変性ゲル電気泳動などの本明細書に記載の既知の技術を使用して測定される別のＦｃドメインと共に二量体を形成する能力を依然として保持する。
【0048】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。加えて、本発明の抗体を構成するポリペプチドには、１つ以上の側鎖又は末端の合成誘導体化、グリコシル化、ＰＥＧ化、円順列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質又はタンパク質ドメインへの融合、及びペプチドタグ又は標識の付加が含まれ得る。
【0049】
本明細書で使用される「天然に存在しない修飾」とは、アイソタイプ性ではないアミノ酸修飾を意味する。例えば、公知のヒトＩｇＧのうちのいずれも４３４位にセリンを含まないので、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２（又はそれらのハイブリッド）における置換４３４Ｓは、天然に生じない修飾であるとみなされる。
【0050】
本明細書で使用される「アミノ酸」及び「アミノ酸同一性」とは、ＤＮＡ及びＲＮＡによってコードされている２０種の天然に存在するアミノ酸のうちの１つを意味する。
【0051】
本明細書で使用される「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体又はリガンドとの相互作用から生じる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣが含まれるが、これらに限定されない。
【0052】
本明細書で使用される「Ｆｃガンマ受容体」、「ＦｃγＲ」、又は「ＦｃガンマＲ」とは、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、かつＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトでは、このファミリーには、アイソフォームであるＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、及びＦｃγＲＩＣを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームであるＦｃγＲＩＩａ（アロタイプであるＨ１３１及びＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ－１及びＦｃγＲＩＩｂ－２を含む）、並びにＦｃγＲＩＩｃを含む、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；並びにアイソフォームであるＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプであるＶ１５８及びＦ１５８を含む）、並びにＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプであるＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（参照により全体が組み込まれるＪｅｆｆｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ ８２：５７－６５）、並びに任意の発見されていないヒトＦｃγＲ又はＦｃγＲアイソフォーム若しくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。マウスＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃγＲＩＩＩ－２（ＣＤ１６－２）、並びに任意の発見されていないマウスＦｃγＲ又はＦｃγＲアイソフォーム若しくはアロタイプが含まれるが、これらに限定されない。
【0053】
本明細書で使用される「ＦｃＲｎ」又は「新生児Ｆｃ受容体」とは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、少なくとも部分的にＦｃＲｎ遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルを含むが、これらに限定されない任意の生物由来であり得る。当技術分野において既知のように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、しばしば重鎖及び軽鎖と称される２つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ－２－ミクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされている。本明細書において別段の記載がない限り、ＦｃＲｎ又はＦｃＲｎタンパク質は、ＦｃＲｎ重鎖とβ－２－ミクログロブリンとの複合体を指す。ＦｃＲｎ受容体への結合を増加させるために、場合によっては、血清半減期を増加させるために、様々なＦｃＲｎバリアントが使用される。「ＦｃＲｎバリアント」とは、ＦｃＲｎ受容体への結合の増加に寄与するアミノ酸修飾であり、好適なＦｃＲｎバリアントを以下に示す。
【0054】
本明細書で使用される「親ポリペプチド」とは、バリアントを生成するように後に修飾される出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、又は天然に存在するポリペプチドのバリアント若しくは操作されたバージョンであってもよい。したがって、本明細書で使用される「親免疫グロブリン」とは、バリアントを生成するように修飾される非修飾免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書で使用される「親抗体」とは、バリアント抗体を生成するように修飾される非修飾抗体を意味する。「親抗体」には、以下に概説されるように、既知の市販の組換えで産生した抗体が含まれることに留意すべきである。これに関連して、「親Ｆｃドメイン」とは、列挙されたバリアントに関連するものであり、したがって、「バリアントヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン」はヒトＩｇＧ１の親Ｆｃドメインと比較され、「バリアントヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメイン」は親ＦｃドメインヒトＩｇＧ４と比較されるといった具合である。
【0055】
本明細書で使用される「位置」とは、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順次に、又は確立されたフォーマット、例えば、抗体ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はヒンジドメイン）の番号付けのためのＥＵインデックスに従って、番号付けされ得る。
【0056】
本明細書における「野生型」又は「ＷＴ」とは、対立遺伝子変異を含む、天然に見出されるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を有する。
【0057】
本明細書には、ヒト抗体ドメインと配列同一性を有するいくつかの抗体ドメイン（例えばＦｃドメイン）が提供される。２つの類似した配列（例えば、抗体可変ドメイン）間の配列同一性は、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ．（１９８１）「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，」Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２［ｌｏｃａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ］；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．＆Ｗｕｎｓｃｈ，ＣＤ．（１９７０）「Ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ Ｔｏ Ｔｈｅ Ｓｅａｒｃｈ Ｆｏｒ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ Ｉｎ Ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｏｆ Ｔｗｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３［ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ］，Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｗ．Ｒ．＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８８）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ Ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４［類似検索方法］、又はＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ，（１９９０）「Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ，」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，ｔｈｅ「ＢＬＡＳＴ」ａｌｇｏｒｉｔｈｍ，ｓｅｅ ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉを参照されたい）などのアルゴリズムによって測定することができる。前述のアルゴリズムのいずれかを使用する場合、デフォルトパラメータ（ウィンドウの長さ、ギャップペナルティなど）が使用される。一実施形態では、配列同一性は、デフォルトパラメータを使用して、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して測定される。
【0058】
本発明の抗体は、一般に、単離されるか、又は組換えである。本明細書に開示される様々なポリペプチドを説明するために使用されるときの「単離された」とは、それが発現された細胞又は細胞培養物から同定、分離、及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって調製されるであろう。「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。「組換え体」は、外来性宿主細胞において組換え核酸技術を使用して抗体が生成されることを意味し、それらも単離され得る。
【0059】
特定の抗原若しくはエピトープへの「特異的結合」、又は特定の抗原若しくはエピトープ「に特異的に結合する」若しくはそれ「に対して特異的である」は、本明細書に記載の又は当技術分野で公知のアッセイを使用して非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に、結合活性を持たない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似する対照分子との競合によって決定することができる。
【0060】
特定の抗原又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、抗原又はエピトープに対して少なくとも約１０－４Ｍ、少なくとも約１０－５Ｍ、少なくとも約１０－６Ｍ、少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、代替的に少なくとも約１０－１０Ｍ、少なくとも約１０－１１Ｍ、少なくとも約１０－１２Ｍ、又はそれ以上のＫＤを有する抗体によって示され得、ＫＤとは特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原又はエピトープと比べて、対照分子に対して２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、又はそれ以上の倍数のＫＤを有することになる。好適な対照分子は、実施例の節を含めて本明細書に記載されており、当技術分野で公知である。
【0061】
また、特定の抗原又はエピトープへの特異的結合は、例えば、抗原又はエピトープに対するＫＡ又はＫａが、対照と比べて、そのエピトープに対して少なくとも２０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍、５，０００倍、１０，０００倍、又はそれ以上の倍数の抗体によって示され得、ＫＡ又はＫａは、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は一般的に、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＳＰＲ又はＢＬＩアッセイを用いて測定される。
【0062】
ＩＩＩ．ＢＣＭＡ結合ドメイン
一態様では、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡに結合するＢＣＭＡ抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、及びそのようなＢＣＭＡ抗原結合ドメイン（例えば、本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体）を含む抗体である。本明細書で提供されるＢＣＭＡ ＡＢＤは、一般に、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む。例示的な実施形態では、ＢＣＭＡは、ヒトＢＣＭＡに結合することが可能である（図１を参照されたい）。
一態様では、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡに結合するＢＣＭＡ抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）、及びそのようなＢＣＭＡ抗原結合ドメイン（例えば、本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体）を含む抗体である。本明細書で提供されるＢＣＭＡ ＡＢＤは、一般に、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）を含む。例示的な実施形態では、ＢＣＭＡは、ヒトＢＣＭＡに結合することが可能である（図１を参照されたい）。
【0063】
当業者によって理解されるように、好適なＢＣＭＡ結合ドメインは、下線が付されているか、又は、本明細書に記載され、表２に示されているように異なる番号付けスキームが使用される場合のいずれかに、図５、６及び１１～１５並びに配列表に示されるような可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）配列内の他のアラインメントを使用して同定されるＣＤＲとして、図に示されるような６つのＣＤＲのセットを含むことができる。好適なＢＣＭＡ ＡＢＤはまた、ｓｃＦｖ又はＦａｂとして使用される、これらの配列及び図に示されるようなＶＨ及びＶＬの全体の配列をも含み得る。
【0064】
一実施形態では、ＢＣＭＡ抗原結合ドメインは、図を含む、本明細書に記載のＢＣＭＡ結合ドメインのいずれかの６つのＣＤＲ（すなわち、ｖｈＣＤＲ１～３及びｖｌＣＤＲ１～３）を含む。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、以下のＢＣＭＡ ＡＢＤ：Ｓ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、Ｓ１Ｒ５＿１２５［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ａ１［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ｂ４［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１．１＿Ｌ１、１Ｂ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、５Ｆ２［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、及び６Ｅ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１のうちの１つである（図５、６、及び１１～１５）。
【0065】
ＢＣＭＡ ＡＢＤを形成する図に開示されている親ＣＤＲのセット（例えば、図５、６及び１１～１５）に加えて、本明細書で提供されるのはＢＣＭＡ ＡＢＤ ＣＤＲの少なくとも１つの修飾を含むＣＤＲを有するバリアントＢＣＭＡ ＡＢＤである（例えば、図５、６及び１１～１５）。一実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、図を含む、本明細書に記載されているＢＣＭＡ ＡＢＤの６つのＣＤＲと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０アミノ酸修飾を有する６つのＣＤＲのセットを含む。例示的な実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、以下のＢＣＭＡ ＡＢＤ：Ｓ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、Ｓ１Ｒ５＿１２５［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ａ１［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ｂ４［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１．１＿Ｌ１、１Ｂ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、５Ｆ２［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、及び６Ｅ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１のうちの１つの６つのＣＤＲと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０アミノ酸修飾を有する６つのＣＤＲのセットを含む（図５、６、及び１１～１５）。ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び／又はＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つによって測定される場合、ＢＣＭＡ抗原に結合することができ、後者は多くの実施形態で特に使用される。特定の実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、ヒトＢＣＭＡ抗原に結合することができる（図１を参照されたい）。
【0066】
いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、図を含む、本明細書に記載されているＢＣＭＡ ＡＢＤの６つのＣＤＲと少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％同一である６つのＣＤＲを含む。例示的な実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、以下のＢＣＭＡ ＡＢＤ：Ｓ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、Ｓ１Ｒ５＿１２５［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ａ１［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ｂ４［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１．１＿Ｌ１、１Ｂ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、５Ｆ２［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、及び６Ｅ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１のうちの１つの６つのＣＤＲと少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％同一である６つのＣＤＲを含む（図５、６、及び１１～１５）。ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び／又はＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つによって測定される場合、ＢＣＭＡ抗原に結合することができ、後者は多くの実施形態で特に使用される。特定の実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、ヒトＢＣＭＡ抗原に結合することができる（図１を参照されたい）。
【0067】
別の例示的な実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、図を含む、本明細書に記載のＢＣＭＡ ＡＢＤのうちのいずれか１つの可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインを含む。例示的な実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、以下のＢＣＭＡ ＡＢＤ：Ｓ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、Ｓ１Ｒ５＿１２５［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ａ１［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ｂ４［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１．１＿Ｌ１、１Ｂ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、５Ｆ２［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、及び６Ｅ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１のうちの１つである（図５、６、及び１１～１５）。
【0068】
本明細書に開示される親ＢＣＭＡ可変重鎖及び可変軽鎖ドメインに加えて、本明細書で提供されるのは、本明細書に開示されるＢＣＭＡ ＡＢＤ ＶＨ及びＶＬドメインのバリアントである可変重鎖ドメイン及び／又は可変軽鎖ドメインを含むＢＣＭＡ ＡＢＤである。一実施形態では、バリアントのＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインは、図を含む、本明細書に記載のＢＣＭＡ ＡＢＤのＶＨ及び／又はＶＬドメインからの１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸変化を有する。いくつかの実施形態では、バリアントのＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインは、フレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、又はＦＲ４）に、図を含む、本明細書に記載のＢＣＭＡ ＡＢＤのＶＨ及び／又はＶＬドメインからの１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸変化を有する。例示的な実施形態では、バリアントＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインは、以下のＢＣＭＡ ＡＢＤ：Ｓ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、Ｓ１Ｒ５＿１２５［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ａ１［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ｂ４［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１．１＿Ｌ１、１Ｂ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、５Ｆ２［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、及び６Ｅ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１のうちの１つのＶＨ及び／又はＶＬドメインからの１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸変化を有する（図５、６、及び１１～１５）。例示的な実施形態では、バリアントＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインは、以下のＢＣＭＡ ＡＢＤ：Ｓ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、Ｓ１Ｒ５＿１２５［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ａ１［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ｂ４［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１．１＿Ｌ１、１Ｂ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、５Ｆ２［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、及び６Ｅ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１のうちの１つのＶＨ及び／又はＶＬドメインのフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、又はＦＲ４）において１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸変化を有する（図５、６、及び１１～１５）。ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び／又はＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つによって測定される場合、ＢＣＭＡに結合することができ、後者は多くの実施形態で特に使用される。特定の実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、ヒトＢＣＭＡ抗原に結合することができる（図１を参照されたい）。
【0069】
一実施形態では、バリアントのＶＨ及び／又はＶＬドメインは、図を含む、本明細書に記載されているＢＣＭＡ ＡＢＤのＶＨ及び／又はＶＬと少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％同一である。例示的な実施形態では、バリアントＶＨ及び／又はＶＬドメインは、以下のＢＣＭＡ ＡＢＤ：Ｓ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、Ｓ１Ｒ５＿１２５［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ａ１［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ｂ４［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１．１＿Ｌ１、１Ｂ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、５Ｆ２［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、及び６Ｅ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１のうちの１つのＶＨ及び／又はＶＬと少なくとも９０、９５、９７、９８又は９９％同一である（図５、６、及び１１～１５）。ある特定の実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤ、Ｂｉａｃｏｒｅ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）及び／又はＢＬＩ（バイオレイヤー干渉法、例えば、Ｏｃｔｅｔアッセイ）アッセイの少なくとも１つによって測定される場合、ＢＣＭＡに結合することができ、後者は多くの実施形態で特に使用される。特定の実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、ヒトＢＣＭＡ抗原に結合することができる（図１を参照されたい）。
【0070】
ＩＶ．抗体
一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のＢＣＭＡ抗原結合ドメインのいずれかを含む抗ＢＣＭＡ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、本明細書に記載のＢＣＭＡ ＡＢＤのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、単一特異性二価抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、本明細書に記載の少なくとも１つのＢＣＭＡ ＡＢＤを含む多重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、少なくとも２、３、４、又は５つの異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体はＣＤ３抗原に結合しない。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書で提供されるＢＣＭＡ ＡＢＤを含む二重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、「１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」又は「２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」二重特異性フォーマット抗体であり、本明細書で提供されるＢＣＭＡ結合ドメインのうちの少なくとも１つを含む。
一態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載のＢＣＭＡ抗原結合ドメインのいずれかを含む抗ＢＣＭＡ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、本明細書に記載のＢＣＭＡ ＡＢＤのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個を含む。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、単一特異性二価抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、本明細書に記載の少なくとも１つのＢＣＭＡ ＡＢＤを含む多重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、少なくとも２、３、４、又は５つの異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体はＣＤ３抗原に結合しない。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書で提供されるＢＣＭＡ ＡＢＤを含む二重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、抗体は、「１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」又は「２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」二重特異性フォーマット抗体であり、本明細書で提供されるＢＣＭＡ結合ドメインのうちの少なくとも１つを含む。
【0071】
本明細書で提供される抗体は、異なる抗体ドメインを含む。本明細書に記載され、当該技術分野において既知であるように、本明細書に記載の抗体は、重鎖及び軽鎖内に異なるドメインを含み、これもまた重複し得る。これらのドメインは、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ヒンジドメイン、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－Ｆｃドメイン又はＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）、可変重鎖ドメイン、可変軽鎖ドメイン、軽鎖定常ドメイン、Ｆａｂドメイン、及びｓｃＦｖドメインを含むが、これらに限定されない。
【0072】
本明細書に示されるように、好適なリンカー（ドメインリンカー又はｓｃＦｖリンカーのいずれかとして使用）にはいくつかあり、列挙されたドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆｃドメインなど）に共有結合（組換え技術により生成される従来型ペプチド結合を含む）するために使用することができる。対象の抗体のドメインを互いに結合させるための例示的なリンカーを図７に示す。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、主に、以下のアミノ酸残基、すなわちＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、又はＴｈｒを含み得る。リンカーペプチドは、それらが所望の活性を保持するように互いに対して正しい立体配座をとるような方法で２つの分子を結合させるのに十分な長さを有するべきである。一実施形態では、リンカーは、約１～５０アミノ酸長、好ましくは約１～３０アミノ酸長である。一実施形態では、１～２０アミノ酸長のリンカーが使用されてもよく、いくつかの実施形態では、約５～約１０個のアミノ酸が使用される。有用なリンカーとしては、例えば、ｎが、少なくとも１つの整数（一般に、３～４）である（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎを含む、グリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、並びに他の可動性リンカーが挙げられる。代替的に、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むがこれらに限定されない様々な非タンパク質性ポリマーが、リンカーとして使用され得る。
【0073】
他のリンカー配列は、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの全ての残基ではないが、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの意の長さの任意の配列、例えば、ＣＬ／ＣＨ１ドメインの最初の５～１２個のアミノ酸残基を含み得る。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖、例えば、Ｃκ又はＣλに由来し得る。リンカーは、例えば、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４、Ｃα１、Ｃα２、Ｃδ、Ｃε、及びＣμを含む、任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。リンカー配列はまた、Ｉｇ様タンパク質（例えば、ＴＣＲ、ＦｃＲ、ＫＩＲ）、ヒンジ領域由来配列、及び他のタンパク質からの他の天然配列などの他のタンパク質に由来し得る。
【0074】
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に概説される任意の２つのドメインを共に連結するために使用される「ドメインリンカー」である。例えば、２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットにおいて、ＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端をｓｃＦｖのＮ末端に結合するドメインリンカーがあってよく、別の任意のドメインリンカーはｓｃＦｖのＣ末端をＣＨ２ドメインに結合させる（ただし、多くの実施形態では、このドメインリンカーとしてヒンジが使用される）。任意の好適なリンカーを使用することができるが、多くの実施形態は、例えば、ｎが少なくとも１（一般に３～４～５）の整数である、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、及び（ＧＧＧＳ）ｎを含むドメインリンカーとしてグリシン－セリンポリマー、並びに各ドメインがその生物学的機能を保持できるように十分な長さ及び可撓性を有する２つのドメインの組換え結合を可能にする任意のペプチド配列を利用する。場合によっては、以下に概説される「撚り度」に注意を払って、ｓｃＦｖリンカーのいくつかの実施形態において使用されるように、荷電ドメインリンカーを使用することができる。
【0075】
いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書で考察されるＶＨ及びＶＬドメインを共有結合するために使用される「ｓｃＦｖリンカー」である。多くの場合には、ｓｃＦｖリンカーは、荷電ｓｃＦｖリンカーであり、そのいくつかは図６に示されている。したがって、第１の単量体と第２の単量体との間のｐＩの分離を促進するための荷電ｓｃＦｖリンカーが本明細書で提供される。すなわち、正又は負のいずれかの荷電ｓｃＦｖリンカー（又は異なる単量体上にｓｃＦｖを使用する足場の場合は両方）を組み込むことによって、これは、Ｆｃドメインを更に変化させることなく、荷電リンカーを含む単量体のｐＩを変えることを可能にする。これらの荷電リンカーは、標準的なリンカーを含む任意のｓｃＦｖ中に置換することができる。また、当業者によって理解されるように、ｐＩの所望の変化に従って、荷電ｓｃＦｖリンカーが正しい「鎖」又は単量体上に使用される。例えば、本明細書中で論じられるように、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットヘテロ二量体抗体を作製するために、所望の抗原結合ドメインのそれぞれについてのＦｖ領域の元のｐＩが計算され、そしてｓｃＦｖを作製するために１つが選択され、ｐＩに応じて、正又は負のリンカーのいずれかが選択される。
【0076】
荷電ドメインリンカーも同様に、本発明の単量体のｐＩ分離を増加させるために使用することができ、したがって、図６に含まれるものは、リンカーが利用される、本明細書の任意の実施形態で使用することができる。
【0077】
提供されるＢＣＭＡ抗原結合ドメインは、例えば、標準的な免疫グロブリン、並びに本明細書で提供される「１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」及び「２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマットを含む任意の有用な抗体フォーマットに含まれ得る（例えば、図２２を参照されたい）。他の有用な抗体フォーマットには、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１８０１２７５０１（Ａ１）号、特に抗体フォーマットに関係する関連部分（例えば図２を参照されたい）に開示されているように、「ｍＡｂ－Ｆｖ」、「ｍＡｂ－ｓｃＦｖ」、「セントラル－Ｆｖ」、「ワンアームｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「ｓｃＦｖ－ｍＡｂ」、「デュアルｓｃＦｖ」、及び「トライデント」フォーマットの抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【0078】
いくつかの実施形態では、対象の抗体は、本明細書で提供されるＢＣＭＡ ＡＢＤのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、１つのＢＣＭＡ ＡＢＤを含む。他の実施形態では、抗体は、２つのＢＣＭＡ ＡＢＤを含む。例示的な実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、以下のＢＣＭＡ ＡＢＤ：Ｓ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、Ｓ１Ｒ５＿１２５［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ａ１［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ｂ４［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１．１＿Ｌ１、１Ｂ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、５Ｆ２［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、及び６Ｅ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１のうちの１つの可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインを含む（図５、６、及び１１～１５）。
【0079】
例示的な実施形態では、抗体は、本明細書で提供されるＢＣＭＡＡＢＤのいずれかを含む、１つ又は２つのＢＣＭＡ ＡＢＤを含む二重特異性抗体である。そのようなＢＣＭＡ ＡＢＤを含む二重特異性抗体には、例えば、「１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」、「２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」二重特異性フォーマット抗体が含まれる（図２２）。例示的な実施形態では、ＢＣＭＡ ＡＢＤは、以下のＢＣＭＡ ＡＢＤ：Ｓ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、Ｓ１Ｒ５＿１２５［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ａ１［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ｂ４［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１．１＿Ｌ１、１Ｂ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、５Ｆ２［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、及び６Ｅ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１のうちの１つである（図５、６、及び１１～１５）。例示的な実施形態では、二重特異性抗体はＣＤ３に結合しない。
【0080】
Ａ．ヘテロ二量体抗体
例示的な実施形態では、本明細書で提供される抗ＢＣＭＡ抗体は、本明細書に記載のＢＣＭＡ抗原結合ドメインのうちの１つを含むヘテロ二量体性二重特異性抗体である。例示的な実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、２つのバリアントＦｃドメイン配列を含む。そのようなバリアントＦｃドメインは、ヘテロ二量体抗体の自己組織化及び／又は精製を容易にするためのアミノ酸修飾を含む。ある特定の態様では、ヘテロ二量体抗体はＣＤ３に結合しない。
例示的な実施形態では、本明細書で提供される抗ＢＣＭＡ抗体は、本明細書に記載のＢＣＭＡ抗原結合ドメインのうちの１つを含むヘテロ二量体性二重特異性抗体である。例示的な実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、２つのバリアントＦｃドメイン配列を含む。そのようなバリアントＦｃドメインは、ヘテロ二量体抗体の自己組織化及び／又は精製を容易にするためのアミノ酸修飾を含む。ある特定の態様では、ヘテロ二量体抗体はＣＤ３に結合しない。
【0081】
抗体技術における継続的な問題は、２つの異なる抗原に同時に結合する「二重特異性」抗体であって、一般に、異なる抗原を近接させ、新しい機能と新しい治療法をもたらすことができる、「二重特異性」抗体に対する要望である。一般に、これらの抗体は、各重鎖及び軽鎖の遺伝子を宿主細胞に含めることによって作製される。これにより、一般に、２つのホモ二量体（Ａ－Ａ及びＢ－Ｂ（軽鎖ヘテロ二量体の問題は含まない））だけでなく、所望のヘテロ二量体（Ａ－Ｂ）が形成される。しかしながら、二重特異性抗体形成における主な障壁は、ホモ二量体形成を上回るように所望のヘテロ二量体形成に偏らせること及び／又はホモ二量体から離してヘテロ二量体抗体を精製することが困難であるということである。
【0082】
対象のヘテロ二量体抗体を生成するために使用することができる多くの機構が存在する。加えて、当業者には理解されるように、これらの異なる機構を組み合わせて高いヘテロ二量体化を確実にすることができる。ヘテロ二量体の産生及び精製を容易にするアミノ酸修飾は、一般的に「ヘテロ二量体化バリアント」と総称される。以下で考察されるように、ヘテロ二量体化バリアントは、「スキュー」バリアント（例えば、下記の「ノブとホール」及び下記の「電荷対」バリアント）並びに「ｐＩバリアント」を含み、それによってホモ二量体から離れてヘテロ二量体の精製を可能にする。その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，６０５，０８４号に一般的に記載されるように、また、具体的には、ヘテロ二量体化バリアントの議論について以下のように、ヘテロ二量体化に有用な機構としては、同第９，６０５，０８４号に記載される「ノブとホール」（「ＫＩＨ」）、同第９，６０５，０８４号に記載される「静電ステアリング」又は「電荷対」、同第９，６０５，０８４号に記載されるｐＩバリアント、並びに同第９，６０５，０８４号及び以下に概説される一般的な更なるＦｃバリアントが挙げられる。
【0083】
対象のヘテロ二量体抗体（例えば、二重特異性抗体）の形成及び精製に有用なヘテロ二量体化バリアントについて、以下で更に詳細に議論する。
【0084】
１．スキューバリアント
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、Ｆｃヘテロ二量体の形成を支持する、第１のＦｃドメイン（Ａ）及び／又は第２のＦｃドメイン（Ｂ）における１以上のアミノ酸修飾であるスキューバリアントを含む（第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインを含むＦｃダイマー；（Ａ～Ｂ）Ｆｃホモ二量体（第１のＦｃドメインのうち２つ又は第２のＦｃドメインのうち２つを含む、Ｆｃ二量体；Ａ～Ａ又はＢ～Ｂ）。好適なスキューバリアントは、全体的に、特に、スキューバリアントの開示について、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０３５５６０８号の図２９、並びに図２３及び２９に含まれる。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、Ｆｃヘテロ二量体の形成を支持する、第１のＦｃドメイン（Ａ）及び／又は第２のＦｃドメイン（Ｂ）における１以上のアミノ酸修飾であるスキューバリアントを含む（第１のＦｃドメイン及び第２のＦｃドメインを含むＦｃダイマー；（Ａ～Ｂ）Ｆｃホモ二量体（第１のＦｃドメインのうち２つ又は第２のＦｃドメインのうち２つを含む、Ｆｃ二量体；Ａ～Ａ又はＢ～Ｂ）。好適なスキューバリアントは、全体的に、特に、スキューバリアントの開示について、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０３５５６０８号の図２９、並びに図２３及び２９に含まれる。
【0085】
スキューバリアントのある特定のタイプは、一般に、当技術分野では「ノブアンドホール」と呼ばれ、ＵＳＳＮ６１／５９６，８４６、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９（７）：６１７（１９９６）；Ａｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９７ ２７０：２６；米国特許第８，２１６，８０５号（これらは全て、参照によりその全体が、具体的には「ノブアンドホール」突然変異の開示のために本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ヘテロ二量体形成を有利にし、ホモ二量体形成を不利にする立体的影響を作り出すアミノ酸操作を指す。これは、本明細書において、「立体バリアント」と称されることもある。これらの図は、「ノブアンドホール」に依拠するいくつかの「単量体Ａ－単量体Ｂ」対を特定する。加えて、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：６７７（１９９８）に記載されているように、これらの「ノブアンドホール」変異をジスルフィド結合と組み合わせ、Ｆｃヘテロ二量体の形成を更に有利にすることができる。
【0086】
ヘテロ二量体の生成に使用される別の方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８５（２５）：１９６３７（２０１０）に記載されているように、「静電ステアリング」と称されることもある。これは、本明細書において、「電荷対」と称されることもある。この実施形態では、静電学を使用して、ヘテロ二量体化に向けて形成をスキューさせる。当業者によって理解されるように、これらは、ｐＩ、すなわち精製にも影響を及ぼす可能性があり、したがって場合によってはｐＩバリアントとみなすこともできる。しかしながら、これらはヘテロ二量体化を強制するために生成され、精製手段として使用されなかったので、それらは「スキューバリアント」として分類される。これらには、Ｄ２２１Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＤ２２１Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／Ｌ３６８Ｅ（例えば、これらは「単量体の対応セット」である）及びＣ２２０Ｒ／Ｅ２２４Ｒ／Ｐ２２８Ｒ／Ｋ４０９Ｒと対になったＣ２２０Ｅ／Ｐ２２８Ｅ／３６８Ｅが含まれるがこれらに限定されない。
【0087】
いくつかの実施形態では、スキューバリアントは、有利かつ同時に、「ノブとホール」機構及び「静電ステアリング」機構の両方に基づくヘテロ二量体化を促進する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、そのようなヘテロ二量体化スキューバリアントの１つ以上のセットを含む。これらのバリアントは、「セット」の「対」になる。すなわち、一方のセットの対が第１の単量体に組み込まれ、他方のセットの対が第２の単量体に組み込まれる。これらのセットは、必ずしも「ノブとホール」バリアントとして挙動するわけではなく、一方の単量体の残基と他方の単量体の残基との間の一対一の対応を有することを留意すべきである。すなわち、セットのこれらの対は、その代わりに、ヘテロ二量体の形成を促進し、ホモ二量体の形成を促進しない２つの単量体間の界面を形成する可能性があり、生物学的条件下で自発的に形成するヘテロ二量体の割合は、予想される５０％（２５％ホモ二量体Ａ／Ａ：５０％ヘテロ二量体Ａ／Ｂ：２５％ホモ二量体Ｂ／Ｂ）ではなく、９０％を超える。例示的な実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、又はＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ（任意選択で、架橋ジスルフィド、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ又はＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９Ｃを含む）「スキュー」バリアントアミノ酸置換セットを含む。例示的な実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」アミノ酸置換セット（ＥＵ番号付け）を含む。命名法に関して、「Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ」の対は、単量体の１つが、アミノ酸置換Ｓ３６４Ｋ及びＥ３５７Ｑを含むＦｃドメインを含み、他方の単量体が、アミノ酸置換Ｌ３６８Ｄ及びＫ３７０Ｓを含むＦｃドメインを含むことを意味する。上述のように、これらの対の「撚り度」は、開始時のｐＩに依存する。
【0088】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるスキューバリアントは、他のスキューバリアント（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号の図３７、特に、スキューバリアントの開示について、参照により本明細書に組み込まれるものを参照されたい）、ｐＩバリアント、アイソタイプバリアント、ＦｃＲｎバリアント、除去バリアントなどを含むがこれらに限定されない、任意の他の修飾と共に、ヘテロ二量体抗体の第１及び第２のＦｃドメインの一方又は両方に、任意選択で、かつ独立して組み込まれ得る。更に、個々の修飾はまた、独立して、かつ任意選択的に、ヘテロ二量体抗体を対象に含めるか、又は対象から除外することができる。
【0089】
いくつかの実施形態では、本明細書に概説されるスキューバリアントは、任意のｐＩバリアント（又はＦｃバリアント、ＦｃＲｎバリアントなどの他のバリアント）を一方又は両方の重鎖単量体に任意にかつ独立して組み込むことができ、本発明のタンパク質に独立してかつ任意に含むか又は除外することができる。
【0090】
２．ヘテロ二量体のｐＩ（等電点）バリアント
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ホモ二量体タンパク質からのヘテロ二量体抗体の分離を有利に可能にする精製バリアントを含む。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、ホモ二量体タンパク質からのヘテロ二量体抗体の分離を有利に可能にする精製バリアントを含む。
【0091】
ヘテロ二量体抗体の精製を容易にし得るいくつかの基本的な機構が存在する。例えば、各単量体が異なるｐＩを有するように抗体重鎖単量体Ａ及びＢの一方又は両方を修飾することにより、単量体Ａ－Ａ及びＢ－Ｂタンパク質からのヘテロ二量体Ａ－Ｂ抗体の等電点精製が可能になる。あるいは、「１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマット及び「２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマットなどの一部の足場フォーマットでも、サイズに基づいて分離を可能にする。上記のように、スキューバリアントを使用してホモ二量体上にヘテロ二量体の形成を「スキュー」することもまた可能である。したがって、ヘテロ二量体化スキューバリアントとｐＩバリアントとの組み合わせは、本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体において特定の用途を見出す。
【0092】
更に、以下でより完全に概説されるように、ヘテロ二量体抗体のフォーマットに応じて、単量体の定常領域及び／若しくはＦｃドメイン内に含まれるｐＩバリアント、並びに／又はドメインリンカーを使用することができる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、Ｆｃ、ＦｃＲｎ及びＫＯバリアントなどの、ｐＩ変化を作り出すこともできる代替機能のための追加の修飾を含む。
【0093】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される対象のヘテロ二量体抗体は、単量体のｐＩを変更する１つ以上の修飾を有する少なくとも１つの単量体（すなわち、「ｐＩバリアント」）を含む。一般に、当業者によって理解されるように、ｐＩバリアントには２つの一般的なカテゴリー、すなわち、タンパク質のｐＩを増加させるもの（塩基性変化）とタンパク質のｐＩを減少させるもの（酸性変化）がある。本明細書に記載されるように、これらのバリアントの全ての組み合わせがなされ得、一方の単量体は野生型、又は野生型と顕著に異なるｐＩを示さないバリアントであり得、他方がより塩基性又はより酸性のいずれかであり得る。代替的に、各単量体は、１つがより塩基性に、１つがより酸性へと変化する。
【0094】
ヘテロ二量体抗体のフォーマットに応じて、ｐＩバリアントは単量体の定常ドメイン及び／又はＦｃドメイン内に含まれるか、又は荷電リンカー、ドメインリンカー若しくはｓｃＦｖリンカーのいずれかが使用され得る。すなわち、「１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」などのｓｃＦｖを利用する抗体フォーマットには、精製目的のために更にｐＩブーストを与える荷電ｓｃＦｖリンカー（正又は負のいずれか）を含むことができる。当業者には理解されるように、本明細書は、単量体の一方又は両方にあるｐＩバリアント、及び／又は荷電ドメインリンカーも提供するが、いくつかの１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ及び２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットは、荷電ｓｃＦｖリンカーのみで有用であり、追加のｐＩ調整はない。加えて、代替の機能性のための追加のアミノ酸操作もまた、Ｆｃ、ＦｃＲｎ、及びＫＯバリアントなどのｐＩ変化を付与し得る。
【0095】
ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にする分離機構としてｐＩを利用する対象のヘテロ二量体抗体では、アミノ酸バリアントが単量体ポリペプチドの一方又は両方に導入される。すなわち、単量体の１つ（単純化のため本明細書では、「単量体Ａ」として称される）のｐＩは、単量体Ｂから離れるように操作させることができ、又は単量体ＡのｐＩを増加させ、単量体ＢのｐＩを減少させつつ、単量体ＡとＢの両方の変化を変化させることができる。下記により完全に概説されるように、いずれか又は両方の単量体のｐＩ変化は、荷電残基を除去又は付加することによって（例えば、中性アミノ酸を正又は負に荷電したアミノ酸残基で置換する、例えば、グリシンからグルタミン酸）、正又は負から反対の電荷への荷電残基の変更によって（アスパラギン酸からリジンへ）、又は荷電残基の中性残基への変更によって（例えば、電荷の消失、リジンからセリンへ）、実施することができる。リジンからセリンへ）行うことができる。
【0096】
したがって、いくつかの実施形態では、対象のヘテロ二量体抗体は、二量体タンパク質の単量体の両方ではないにしても少なくとも１つの等電点（ｐＩ）を、アミノ酸置換（「ｐＩバリアント」又は「ｐＩ置換」）を単量体の一方又は両方に組み込むことによって変更する、定常領域におけるアミノ酸修飾を含む。本明細書に示されるように、２つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、２つの単量体のｐＩが０．１ｐＨ単位だけわずかに異なる場合に達成することができ、０．２、０．３、０．４、及び０．５以上異なるものが全て本発明において使用される。
【0097】
当業者には理解されるように、良好な分離を得るために各単量体又は両方の単量体に含まれるべきｐＩバリアントの数は、構成要素の出発ｐＩ、例えば、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、及び２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットにおいて、関心対象のｓｃＦｖ（１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃ）及びＦａｂの出発ｐＩに部分的に依存するであろう。すなわち、どの単量体を操作するか、又はどの「方向」（例えば、より正又はより負）かを決定するために、２つの標的抗原のＦｖ配列が計算され、そしてそこから決定がなされる。当技術分野において既知のように、異なるＦｖは、本発明において利用される異なる出発ｐＩを有するであろう。一般に、本明細書に概説されるように、ｐＩは、少なくとも約０．１ｌｏｇの各単量体の総ｐＩ差をもたらすように操作され、本明細書に概説されるように０．２～０．５が好ましい。
【0098】
重鎖の定常領域を使用することによって、ヘテロ二量体を達成するためにｐＩバリアントが使用される場合、抗体を含む二重特異性タンパク質を設計し、精製するためのよりモジュール方式のアプローチが提供される。したがって、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化バリアント（スキュー及びｐＩヘテロ二量体化バリアントを含む）は可変領域に含まれず、そのため各個々の抗体を操作しなければならない。加えて、いくつかの実施形態では、ｐＩバリアントから生じる免疫原性の可能性は、顕著な免疫原性を導入することなくｐＩが変化するように、異なるＩｇＧアイソタイプからのｐＩバリアントを移入することによって顕著に低減する。したがって、解決されるべき更なる問題は、高ヒト配列含有量を有する低ｐＩ定常ドメインの解明、例えば、任意の特定位置における非ヒト残基の最小化又は回避である。アイソタイプ置換に代えて、又はこれに加え、ｐＩバリアントから生じる免疫原性の可能性は、等配電子置換（例えば、ＡｓｎからＡｓｐ及びＧｌｎからＧｌｕ）を利用することによって、大幅に低下する。
【0099】
以下に議論するように、このｐＩ操作で起こり得る副次的な利益はまた、血清半減期の延長及びＦｃＲｎ連結の増加である。すなわち、米国特許出願公開第２０１２／００２８３０４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、抗体定常ドメイン（抗体及びＦｃ融合体に見られるものを含む）のｐＩを低下させると、インビボでより長い血清保持をもたらし得る。血清半減期を延長するためのこれらのｐＩバリアントはまた、精製のためのｐＩ変化を促進する。
【0100】
加えて、ｐＩバリアントが、ホモ二量体が存在する場合に、排除、最小化、及び区別するいずれかの能力が顕著であるので、二重特異性抗体の分析及び品質管理プロセスに更なる利益を与えることに留意されるべきである。同様に、ヘテロ二量体抗体産生の再現性を確実に試験する能力は重要である。
【0101】
一般に、特に使用される実施形態は、スキューバリアントを含むバリアントのセットに依存し、これは、２つの単量体間でｐＩ差異を増加させるｐＩバリアントと組み合わせて、ホモ二量体化形成より優先してヘテロ二量体化形成を促し、ホモ二量体を除去してヘテロ二量体の精製を容易にする。
【0102】
ｐＩバリアントの例示的な組合せは、図２４及び２５、並びに米国特許出願公開第２０１６／０３５５６０８号の図３０に示されており、これらの全ては、全体的に、特に、ｐＩバリアントの開示について、参照により本明細書に組み込まれる。
【0103】
一実施形態では、ｐＩバリアントの好ましい組合せは、２０８Ｄ／２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄバリアント（ヒトＩｇＧ１と比較する場合、Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む１つの単量体（負のＦａｂ側）と、（ＧＫＰＧＳ）４を含む正に荷電したｓｃＦｖリンカーを含む第２の単量体（正のｓｃＦｖ側）とを有する。しかしながら、当業者によって理解されるように、第１の単量体は、位置２０８を含むＣＨ１ドメインを含む。したがって、ＣＨ１ドメインを含まない構築物（例えば、ドメインの１つにＣＨ１ドメインを利用しない抗体の場合）において、好ましい負のｐＩバリアントＦｃセットは、２９５Ｅ／３８４Ｄ／４１８Ｅ／４２１Ｄバリアント（ヒトＩｇＧ１対しての場合、Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ）を含む。本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体において使用することができる更なるｐＩバリアントは、図２３及び２４に示されている。
【0104】
いくつかの実施形態では、修飾は、ＥＵ番号付けに基づき、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９及び２３０位を含む、Ｆｃドメインのヒンジで生じる。したがって、ｐＩ変異、特に置換は、２１６～２３０位の１つ以上で行うことができ、用途を見出す１、２、３、４又は５個の変異を有する。同様に、全ての可能な組み合わせが、単独で、又は他のドメイン中の他のｐＩバリアントと共に企図されている。
【0105】
ヒンジドメインのｐＩを低下させるのに使用される具体的な置換は、２２１位の欠失、２２２位の非天然バリン又はトレオニン、２２３位の欠失、２２４位の非天然グルタミン酸、２２５位の欠失、２３５位の欠失、及び２３６位の欠失又は非天然アラニンを含むが、これらに限定されない。場合によっては、ヒンジドメインにおいてはｐＩ置換のみが行われ、他の例では、これらの置換は他のドメイン内の他のｐＩバリアントに任意の組み合わせで加えられる。
【0106】
いくつかの実施形態では、ＥＵ番号付けに基づき、２３３、２３４、２３５、２３６、２７４、２９６、３００、３０９、３２０、３２２、３２６、３２７、３３４及び３３９位を含むＣＨ２領域内に変異を生じさせることができる。２３３～２３６における変化は、ＩｇＧ２骨格におけるエフェクター機能を（３２７Ａと共に）増加させるためになされ得ることに留意されたい。ここでも、これら１４個の位置の全ての可能な組合せを作ることができる。例えば、本明細書で提供される抗ＢＣＭＡ抗体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のＣＨ２のｐＩ置換を有するバリアントＦｃドメインを含み得る。
【0107】
ＣＨ２ドメインのｐＩを低下させるのに使用される具体的な置換は、２７４位の非天然グルタミン又はグルタミン酸、２９６位の非天然フェニルアラニン、３００位の非天然フェニルアラニン、３０９位の非天然バリン、３２０位の非天然グルタミン酸、３２２位の非天然グルタミン酸、３２６位の非天然グルタミン酸、３２７位の非天然グリシン、３３４位の天然グルタミン酸、３３９位の非天然トレオニン、及びＣＨ２内及び他のドメインとの全ての可能な組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【0108】
この実施形態では、修飾は、ＣＨ３領域の３５５、３５９、３６２、３８４、３８９、３９２、３９７、４１８、４１９、４４４及び４４７位（ＥＵ番号付け）から独立して、かつ任意選択的に選択され得る。ＣＨ３ドメインのｐＩを低下させるのに使用される具体的な置換としては、３５５位の非天然グルタミン又はグルタミン酸、３８４位の非天然セリン、３９２位の非天然アスパラギン又はグルタミン酸、３９７位の非天然メチオニン、４１９位の非天然グルタミン酸、３５９位の非天然グルタミン酸、３６２位の非天然グルタミン酸、３８９位の非天然グルタミン酸、４１８位の非天然グルタミン酸、４４４位の非天然グルタミン酸、及び４４７位の欠失又は非天然アスパラギン酸が含まれるがこれらに限定されない。
【0109】
３．アイソタイプバリアント
加えて、主題のヘテロ二量体抗体の多くの実施形態は、あるＩｇＧアイソタイプから別のＩｇＧアイソタイプへの特定の位置でのｐＩアミノ酸の「移入」に依存し、したがって、バリアントに望ましくない免疫原性が導入される可能性を低減又は排除する。これらのいくつかは、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図２１に示され、参照により本明細書に組み込まれる。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含む様々な理由から治療用抗体の一般的なアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重定常領域は、ＩｇＧ２のそれよりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。特定の位置でＩｇＧ２残基をＩｇＧ１骨格に導入することによって、得られる単量体のｐＩは低下（又は上昇）し、加えて、より長い血清半減期を示す。例えば、ＩｇＧ１は１３７位にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２はグルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有し、グルタミン酸を移入することは、得られるタンパク質のｐＩに影響を及ぼす。以下に記載されるように、いくつかのアミノ酸置換は一般に、バリアント抗体のｐＩに顕著な影響を与えるために必要とされる。しかしながら、以下に考察されるようにＩｇＧ２分子中の変化でさえも血清半減期の増加を可能にすることに留意すべきである。
加えて、主題のヘテロ二量体抗体の多くの実施形態は、あるＩｇＧアイソタイプから別のＩｇＧアイソタイプへの特定の位置でのｐＩアミノ酸の「移入」に依存し、したがって、バリアントに望ましくない免疫原性が導入される可能性を低減又は排除する。これらのいくつかは、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図２１に示され、参照により本明細書に組み込まれる。すなわち、ＩｇＧ１は、高いエフェクター機能を含む様々な理由から治療用抗体の一般的なアイソタイプである。しかしながら、ＩｇＧ１の重定常領域は、ＩｇＧ２のそれよりも高いｐＩを有する（８．１０対７．３１）。特定の位置でＩｇＧ２残基をＩｇＧ１骨格に導入することによって、得られる単量体のｐＩは低下（又は上昇）し、加えて、より長い血清半減期を示す。例えば、ＩｇＧ１は１３７位にグリシン（ｐＩ５．９７）を有し、ＩｇＧ２はグルタミン酸（ｐＩ３．２２）を有し、グルタミン酸を移入することは、得られるタンパク質のｐＩに影響を及ぼす。以下に記載されるように、いくつかのアミノ酸置換は一般に、バリアント抗体のｐＩに顕著な影響を与えるために必要とされる。しかしながら、以下に考察されるようにＩｇＧ２分子中の変化でさえも血清半減期の増加を可能にすることに留意すべきである。
【0110】
他の実施形態では、非アイソタイプのアミノ酸変化を行って、（例えば、高ｐＩのアミノ酸から低ｐＩのアミノ酸へと変化させることによって）得られるタンパク質の全体的な荷電状態を低減させるか、又は以下で更に詳細に記載されている安定性などのための構造の調整を可能にするかのいずれかである。
【0111】
加えて、重鎖定常ドメイン及び軽鎖定常ドメインの両方をｐＩ操作することによって、ヘテロ二量体の各単量体における顕著な変化を見ることができる。本明細書で考察されるように、２個の単量体のｐＩが少なくとも０．５だけ異なることは、イオン交換クロマトグラフィー若しくは等電点電気泳動、又は等電点に感受性の他の方法による分離を可能にし得る。
【0112】
４．ｐＩを計算する
本明細書で提供される抗体の各単量体のｐＩは、バリアント重鎖定常ドメインのｐＩ及び全単量体のｐＩに依存し、バリアント重鎖定常ドメイン及び融合パートナーを含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、ｐＩの変化は、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図１９のチャートを使用して、バリアント重鎖定常ドメインに基づいて計算される。
本明細書で提供される抗体の各単量体のｐＩは、バリアント重鎖定常ドメインのｐＩ及び全単量体のｐＩに依存し、バリアント重鎖定常ドメイン及び融合パートナーを含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、ｐＩの変化は、米国特許出願公開第２０１４／０３７００１３号の図１９のチャートを使用して、バリアント重鎖定常ドメインに基づいて計算される。
【0113】
本明細書で考察されるように、どの単量体を操作するかは概して、Ｆｖ領域及び足場領域の固有のｐＩによって決定される。代替的に、各単量体のｐＩを比較することができる。
【0114】
５．より良好なｉｎ ｖｉｖｏ結合のＦｃＲｎも付与するｐＩバリアント
ｐＩバリアントが単量体のｐＩを減少させる場合、ｐＩバリアントはインビボでの血清保持を改善するという更なる利点を有することができる。
ｐＩバリアントが単量体のｐＩを減少させる場合、ｐＩバリアントはインビボでの血清保持を改善するという更なる利点を有することができる。
【0115】
まだ検討中ではあるが、エンドソーム内のｐＨ６でＦｃＲｎに結合するとＦｃが隔離されるため、Ｆｃ領域はインビボでより長い半減期を有すると考えられている（Ｇｈｅｔｉｅ ａｎｄ Ｗａｒｄ，１９９７ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ．１８（１２）：５９２－５９８、参照により全体が組み込まれる）。次いで、エンドソーム区画は、Ｆｃを細胞表面にリサイクルする。区画が細胞外空間に開くと、約７．４のより高いｐＨが、血中に戻るＦｃの放出を誘導する。マウスでは、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａらは、ｐＨ６及びｐＨ７．４でＦｃＲｎ結合が増加したＦｃ変異体は実際に低減した血清濃度及び野生型Ｆｃと同じ半減期を有することが示された（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：５１７１－５１８０、参照により全体が組み込まれる）。ｐＨ７．４でのＦｃＲｎに対するＦｃの親和性の増加は、血中に戻るＦｃの放出を妨げると考えられる。したがって、インビボでのＦｃの半減期を増加させるＦｃ変異は、理想的には、より高いｐＨでのＦｃの放出をなお可能にしながら、より低いｐＨでのＦｃＲｎ結合を増加させる。アミノ酸ヒスチジンは、６．０～７．４のｐＨ範囲でその荷電状態を変化させる。したがって、Ｆｃ／ＦｃＲｎ複合体中の重要な位置にＨｉｓ残基を見出すことは驚くべきことではない。
【0116】
最近、より低い等電点を有する可変領域を有する抗体は、より長い血清半減期も有する可能性があることが示唆されている（Ｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，２０１０ ＰＥＤＳ．２３（５）：３８５－３９２、参照により全体が組み込まれる）。しかし、この機構はまだよくわかっていない。更に、可変領域は抗体ごとに異なる。本明細書に記載されるように、ｐＩが低下し半減期が延長された定常領域バリアントは、抗体の薬物動態特性を改善するためのよりモジュール方式のアプローチを提供するであろう。
【0117】
Ｂ．追加の機能性のための追加のＦｃバリアント
上記に概説されているヘテロ二量体化バリアントに加えて、限定されないが、以下に概説されているように、１個以上のＦｃγＲ受容体との結合を変化させること、ＦｃＲｎへの変化された結合を含む、様々な理由から行われ得るいくつかの有用なＦｃアミノ酸修飾がある。
上記に概説されているヘテロ二量体化バリアントに加えて、限定されないが、以下に概説されているように、１個以上のＦｃγＲ受容体との結合を変化させること、ＦｃＲｎへの変化された結合を含む、様々な理由から行われ得るいくつかの有用なＦｃアミノ酸修飾がある。
【0118】
したがって、本明細書で提供される抗体（ヘテロ二量体、並びにホモ二量体）は、本明細書で概説されるヘテロ二量体化バリアント（例えば、ｐＩバリアント及び立体バリアント）を伴うか、又は伴わない、そのようなアミノ酸修飾を含み得る。バリアントの各セットは、独立して、かつ任意選択的に、任意の特定のヘテロ二量体タンパク質を含み得るか、又はそれから除外し得る。
【0119】
１．ＦｃγＲバリアント
したがって、ＦｃγＲ受容体のうちの１つ以上への結合を改変するために行われ得る、いくつかの有用なＦｃ置換が存在する。ある特定の実施形態では、対象の抗体は、１つ以上のＦｃγＲ受容体（すなわち、「ＦｃγＲバリアント」）への結合を変更する修飾を含む。結合の増加並びに結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、概して、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害；ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応）を増加させることが知られている。同様に、いくつかの状況下では、ＦｃγＲＩＩｂ（阻害性受容体）との結合の減少も有益であり得る。対象の抗体で使用されるアミノ酸置換には、米国特許第８，１８８，３２１号（特に、図４１）及び同第８，０８４，５８２号、並びに米国特許出願公開第２００６／０２３５２０８号及び同第２００７／０１４８１７０号に列挙されるものが挙げられ、これらは全て、参照によりその全体が、特にそこに開示されているＦｃγ受容体結合に影響するバリアントについて明示的に本明細書に組み込まれる。使用される特定のバリアントには、ＥＵ番号付けに従って、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ及び２９９Ｔが含まれるがこれらに限定されない。そのような修飾は、対象抗体の一方又は両方のＦｃドメインに含まれ得る。
したがって、ＦｃγＲ受容体のうちの１つ以上への結合を改変するために行われ得る、いくつかの有用なＦｃ置換が存在する。ある特定の実施形態では、対象の抗体は、１つ以上のＦｃγＲ受容体（すなわち、「ＦｃγＲバリアント」）への結合を変更する修飾を含む。結合の増加並びに結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増加は、概して、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害；ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応）を増加させることが知られている。同様に、いくつかの状況下では、ＦｃγＲＩＩｂ（阻害性受容体）との結合の減少も有益であり得る。対象の抗体で使用されるアミノ酸置換には、米国特許第８，１８８，３２１号（特に、図４１）及び同第８，０８４，５８２号、並びに米国特許出願公開第２００６／０２３５２０８号及び同第２００７／０１４８１７０号に列挙されるものが挙げられ、これらは全て、参照によりその全体が、特にそこに開示されているＦｃγ受容体結合に影響するバリアントについて明示的に本明細書に組み込まれる。使用される特定のバリアントには、ＥＵ番号付けに従って、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ及び２９９Ｔが含まれるがこれらに限定されない。そのような修飾は、対象抗体の一方又は両方のＦｃドメインに含まれ得る。
【0120】
いくつかの実施形態では、主題の抗体は、血清半減期を増加させる１つ以上のＦｃ修飾を含む。ＦｃＲｎ受容体への結合の増加及び血清半減期の増加に使用されるＦｃ置換は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳＳＮ１２／３４１，７６９に具体的に開示されているように、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６Ｉ又はＶ／４３４Ｓ、４３６Ｖ／４２８Ｌ、及び２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌを含むがこれらに限定されない。そのような修飾は、対象抗体の一方又は両方のＦｃドメインに含まれ得る。例示的な実施形態では、抗体は、４２８Ｌ／４３４Ｓ修飾（ＥＵ番号付け）を含む。
【0121】
２．除去バリアント
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）のうちの１つ以上又は全てへのＦｃドメインの通常の結合を低減又は除去して追加の作用機序を回避する１つ以上の修飾を含む。そのような修飾は、「ＦｃγＲ除去バリアント」又は「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯ又はＫＯ）」バリアントと呼ばれる。これらの実施形態では、いくつかの治療用途のために、追加の作用機序を回避するために、１つ以上又は全てのＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）へのＦｃドメインの正常な結合を低減又は除去することが望ましい。すなわち、例えば、多くの実施形態では、特にＢＣＭＡに一価的に結合する二重特異性抗体の使用において、ＡＤＣＣ活性を排除又は顕著に低下させるためにＦｃγＲＩＩＩａ結合を除去することが概して望ましい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題の抗体のうち、Ｆｃドメインの少なくとも１つは、１つ以上のＦｃγ受容体除去バリアントを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題の抗体のうち、Ｆｃドメインの両方が、１つ以上のＦｃγ受容体除去バリアントを含む。これらの除去バリアントはそれぞれ、独立して、かつ任意選択的に含むか、又は除外することができ、好ましい態様は、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ（ＥＵ番号付け）からなる群から選択される除去バリアントを利用する。本明細書で言及される除去バリアントは、ＦｃγＲ結合を除去するが、一般的にはＦｃＲｎ結合を除去しないことに留意すべきである。本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体に含まれ得る更なる除去バリアントが図２４及び２５に示されている。
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）のうちの１つ以上又は全てへのＦｃドメインの通常の結合を低減又は除去して追加の作用機序を回避する１つ以上の修飾を含む。そのような修飾は、「ＦｃγＲ除去バリアント」又は「Ｆｃノックアウト（ＦｃＫＯ又はＫＯ）」バリアントと呼ばれる。これらの実施形態では、いくつかの治療用途のために、追加の作用機序を回避するために、１つ以上又は全てのＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａなど）へのＦｃドメインの正常な結合を低減又は除去することが望ましい。すなわち、例えば、多くの実施形態では、特にＢＣＭＡに一価的に結合する二重特異性抗体の使用において、ＡＤＣＣ活性を排除又は顕著に低下させるためにＦｃγＲＩＩＩａ結合を除去することが概して望ましい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題の抗体のうち、Ｆｃドメインの少なくとも１つは、１つ以上のＦｃγ受容体除去バリアントを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の主題の抗体のうち、Ｆｃドメインの両方が、１つ以上のＦｃγ受容体除去バリアントを含む。これらの除去バリアントはそれぞれ、独立して、かつ任意選択的に含むか、又は除外することができ、好ましい態様は、Ｇ２３６Ｒ／Ｌ３２８Ｒ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２３９Ｋ／Ａ３２７Ｇ、Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋ／Ａ３２７Ｇ及びＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ（ＥＵ番号付け）からなる群から選択される除去バリアントを利用する。本明細書で言及される除去バリアントは、ＦｃγＲ結合を除去するが、一般的にはＦｃＲｎ結合を除去しないことに留意すべきである。本明細書で提供されるヘテロ二量体抗体に含まれ得る更なる除去バリアントが図２４及び２５に示されている。
【0122】
当技術分野で既知であるように、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインはＦｃγ受容体への結合が最も高く、したがってヘテロ二量体抗体の骨格の定常ドメイン（又はＦｃドメイン）がＩｇＧ１である場合、除去バリアントを使用することができる。代替的に、又はＩｇＧ１バックグラウンドの除去バリアントに加えて、グリコシル化位置２９７での（一般にＡ又はＳへの）変異は、例えば、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を有意に除去することができる。ヒトＩｇＧ２及びＩｇＧ４は、Ｆｃγ受容体への結合が自然に低下しているため、これらの骨格は、除去バリアントの有無にかかわらず使用できる。
【0123】
Ｃ．ヘテロ二量体及びＦｃバリアントの組み合わせ
当業者によって理解されるように、列挙されたヘテロ二量体化バリアント（スキューバリアント及び／又はｐＩバリアントを含む）は全て、それらの「撚り度」又は「単量体分割」を保持する限り、任意選択的に、かつ独立して組み合わせることができる。加えて、これらのバリアントの全ては、ヘテロ二量体化フォーマットのいずれにも組み合わせることができる。
当業者によって理解されるように、列挙されたヘテロ二量体化バリアント（スキューバリアント及び／又はｐＩバリアントを含む）は全て、それらの「撚り度」又は「単量体分割」を保持する限り、任意選択的に、かつ独立して組み合わせることができる。加えて、これらのバリアントの全ては、ヘテロ二量体化フォーマットのいずれにも組み合わせることができる。
【0124】
ｐＩバリアントの場合、特に使用される実施形態が図に示されている一方、精製を促進するために２つの単量体間のｐＩの差異を変えるという基本的な規則に従って、他の組み合わせを生成できる。
【0125】
加えて、ヘテロ二量体化バリアント、スキュー、及びｐＩはいずれも、本明細書で概説されるように、Ｆｃ除去バリアント、Ｆｃバリアント、ＦｃＲｎバリアントと、独立して、かつ任意選択的に組み合わされる。
【0126】
ヘテロ二量体１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ及び２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体のいくつかの実施形態に含まれるバリアントの例示的な組合せが図２８に含まれる。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体は、図２８に示されるように、バリアントの組合せを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、ヘテロ二量体１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ、又は２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体である。例示的な実施形態では、抗体は、本明細書で提供されるＢＣＭＡ ＡＢＤの少なくとも１つを含み、ＣＤ３に結合しない。
【0127】
Ｄ．有用な抗体フォーマット
当業者には理解され、以下でより詳細に説明するように、概して図２２に示されるように、本明細書で提供される二重特異性ヘテロ二量体抗体は、いくつかの異なる構成をとることができる。
当業者には理解され、以下でより詳細に説明するように、概して図２２に示されるように、本明細書で提供される二重特異性ヘテロ二量体抗体は、いくつかの異なる構成をとることができる。
【0128】
当業者によって理解されるように、本発明のヘテロ二量体フォーマットは、異なる価数を有し得ると共に、二重特異性であり得る。すなわち、本発明のヘテロ二量体抗体は、二価及び二重特異性、又は三価及び二重特異性であり得、第１の抗原は２つの結合ドメインによって結合され、第２の抗原は第２の結合ドメインによって結合される。
【0129】
本発明は、少なくとも１つのＢＣＭＡ抗原結合ドメインを利用する。当業者によって理解されるように、図のいずれか（特に図５、６、及び１１～１５を参照されたい）に示されるような抗ＣＤＲ、可変軽鎖及び可変重鎖ドメイン、Ｆａｂ並びにｓｃＦｖの任意のコレクションを使用することができる。
１．１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット（「ボトルオープナー」）
１．１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット（「ボトルオープナー」）
【0130】
本明細書で提供される対象の二重特異性抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体抗体フォーマットは、図２２Ａに示されているような「１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」又は「ボトルオープナー」フォーマットである。１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体は、「通常の」重鎖（ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）である第１の単量体を含み、ＶＨ１は第１の可変重鎖ドメインであり、ＣＨ２－ＣＨ３は第１のＦｃドメインである。１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃはまた、第１の可変軽鎖ドメインＶＬ１及び定常軽鎖ドメインＣＬを含む軽鎖を含む。軽鎖は、第１の単量体のＶＨ１－ＣＨ１と相互作用して、Ｆａｂである第１の抗原結合ドメインを形成する。抗体の第２の単量体は、単鎖Ｆｖ（以下に定義される「ｓｃＦｖ」）である第２の結合ドメイン及び第２のＦｃドメインを含む。ｓｃＦｖは、第２の可変重鎖ドメイン（ＶＨ２）及び第２の可変軽鎖ドメイン（ＶＬ２）を含み、ＶＨ２は、荷電可能なｓｃＦｖリンカーを使用してＶＬ２に結合される（例えば、図２６を参照されたい）。ｓｃＦｖは、ドメインリンカーを使用して第２のＦｃドメインに結合される（例えば、図２７を参照されたい）。２つの単量体は、以下により詳細に記載されるように、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域（例えば、Ｆｃドメイン、ＣＨ１ドメイン及び／又はヒンジ領域）におけるアミノ酸バリアント（例えば、上述したヘテロ二量体化バリアント）の使用により一緒にされる。この構造は、ボトルオープナーと視覚的に大まかに似ているため、本明細書では「ボトルオープナー」（フォーマットと称されることがある。いくつかの実施形態では、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体は、二価抗体である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体はＣＤ３に結合しない。
【0131】
いくつかの実施形態では、第１の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ２－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、ＶＨ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ２は、ｓｃＦｖである。他の実施形態では、第２の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＬ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ２－リンカー－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、ここで、ＶＬ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨ２はｓｃＦｖである。
【0132】
現在の「１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」フォーマットにはいくつかの明確な利点が存在する。当技術分野で既知であるように、２つのｓｃＦｖ構築物に依拠する抗体類似体は、しばしば、安定性及び凝集の問題を有し、これは、本発明では「通常の」重鎖及び軽鎖対合を加えることによって軽減することができる。加えて、２つの重鎖及び２つの軽鎖に依存するフォーマットとは対照的に、重鎖と軽鎖の誤った対合（例えば、重鎖１と軽鎖２の対合など）の問題はない。
【0133】
１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体のいくつかの実施形態では、第１又は第２の抗原結合ドメインのうちの１つは、ＢＣＭＡ抗原結合ドメインである。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、本明細書に記載のＢＣＭＡ ＡＢＤのいずれか１つである。ある特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、本明細書に記載のＢＣＭＡ ＡＢＤのうちのいずれか１つである。いくつかの実施形態では、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体は、ＣＤ３結合ドメインを含まない。本明細書で提供されるＢＣＭＡ ＡＢＤのいずれか１つは、以下のＢＣＭＡ ＡＢＤ：Ｓ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、Ｓ１Ｒ５＿１２５［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ａ１［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ｂ４［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１．１＿Ｌ１、１Ｂ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、５Ｆ２［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、及び６Ｅ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１（図５、６、及び１１～１５）のうちの１つ又はそのバリアントを含む、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体に含まれ得る。
【0134】
いくつかの実施形態では、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体の第１及び第２のＦｃドメインは、本明細書に開示されるヘテロ二量体化スキューバリアント（例えば、図２３及び２９を参照されたい）を含むバリアントＦｃドメインである。特に有用なヘテロ二量体化スキューバリアントとしては、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃを含み、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。例示的な実施形態では、第１又は第２のバリアントＦｃドメインのうちの一方はヘテロ二量体化スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、第１又は第２のバリアントＦｃドメインの他方はヘテロ二量体化スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。例示的な実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインはヘテロ二量体化スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、第２のバリアントＦｃドメインはヘテロ二量体化スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。
【0135】
いくつかの実施形態では、バリアントＦｃドメインは、本明細書に開示される除去バリアントを含む（例えば、図２５を参照されたい）。いくつかの実施形態では、第１及び第２のバリアントＦｃドメインのそれぞれが、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。
【0136】
いくつかの実施形態では、第１の単量体の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）は、本明細書に開示されるｐＩバリアントを含む（例えば、図２４を参照されたい）。例示的な実施形態では、第１の単量体の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）は、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。
【0137】
例示的な実施形態では、第１の単量体のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３は、アミノ酸バリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ／Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、第２のＦｃドメインは、アミノ酸バリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。
【0138】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体のｓｃＦｖは、荷電ｓｃＦｖリンカーを含む（例えば、図２７を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体は、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。
【0139】
例示的な実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインは、ヘテロ二量体化スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、第２のバリアントＦｃドメインは、ヘテロ二量体化スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、第１及び第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋを含み、第１の単量体の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）は、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含み、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体のｓｃＦｖは、（ＧＫＰＧＳ）４荷電ｓｃＦｖリンカーを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体は、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。
【0140】
２．２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット（セントラル－ｓｃＦｖフォーマット）
本明細書で提供される対象の二重特異性抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体抗体フォーマットは、図２２Ｂに示される２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット（「セントラル－ｓｃＦｖフォーマット」とも呼ばれる）である。この抗体フォーマットには、２つのＦａｂ部分、及び単量体のうちの１つのＶＨ－ＣＨ１領域とＣＨ２－ＣＨ３領域との間に挿入されたｓｃＦｖの３つの抗原結合ドメインが含まれる。このフォーマットのいくつかの実施形態では、Ｆａｂ部分はそれぞれ、ＢＣＭＡに結合する。いくつかの実施形態では、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、ＢＣＭＡに結合する。いくつかの実施形態では、２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体は、三価抗体である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体はＣＤ３に結合しない。
本明細書で提供される対象の二重特異性抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体抗体フォーマットは、図２２Ｂに示される２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット（「セントラル－ｓｃＦｖフォーマット」とも呼ばれる）である。この抗体フォーマットには、２つのＦａｂ部分、及び単量体のうちの１つのＶＨ－ＣＨ１領域とＣＨ２－ＣＨ３領域との間に挿入されたｓｃＦｖの３つの抗原結合ドメインが含まれる。このフォーマットのいくつかの実施形態では、Ｆａｂ部分はそれぞれ、ＢＣＭＡに結合する。いくつかの実施形態では、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、ＢＣＭＡに結合する。いくつかの実施形態では、２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体は、三価抗体である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体抗体はＣＤ３に結合しない。
【0141】
２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットのいくつかの実施形態では、第１の単量体は、標準的重鎖（すなわち、ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）を含み、ＶＨ１は第１の可変重鎖ドメインであり、ＣＨ２－ＣＨ３は第１のＦｃドメインである。第２の単量体は、別の第１の可変重鎖ドメイン（ＶＨ１）、ＣＨ１ドメイン（及び任意選択的なヒンジ）、第２のＦｃドメイン、並びにｓｃＦｖ可変軽鎖ドメイン（ＶＬ２）、ｓｃＦｖリンカー及びｓｃＦｖ可変重鎖ドメイン（ＶＨ２）を含むｓｃＦｖを含む。ｓｃＦｖは、任意選択的なドメインリンカーを使用して、第２の単量体のＣＨ１ドメインのＣ末端と第２のＦｃドメインのＮ末端の間に共有結合している（ＶＨ１－ＣＨ１－［任意選択的なリンカー］－ＶＨ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨ２－［任意選択的なリンカー］－ＣＨ２－ＣＨ３、又はｓｃＦｖに対して反対方向の、ＶＨ１－ＣＨ１－［任意選択的なリンカー］－ＶＬ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨ２－［任意選択的なリンカー］－ＣＨ２－ＣＨ３）。任意のリンカーは、例えば、図２７に含まれるドメインリンカーを含む任意の好適なペプチドリンカーであり得る。この実施形態は更に、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ１）及び定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）を含む共通軽鎖を利用する。共通軽鎖は、第１及び第２の単量体のＶＨ１－ＣＨ１と会合して、２つの同一のＦａｂを形成する。
【0142】
いくつかの実施形態では、同一のＦａｂはそれぞれ、ＢＣＭＡに結合する。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖはＢＣＭＡに結合する。いくつかの実施形態では、２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体では、Ｆａｂ又はｓｃＦｖはいずれもＣＤ３に結合しない。本明細書で提供されるＢＣＭＡ ＡＢＤのうちのいずれか１つは、以下のＢＣＭＡ ＡＢＤ：Ｓ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、Ｓ１Ｒ５＿１２５［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ａ１［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ｂ４［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１．１＿Ｌ１、１Ｂ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、５Ｆ２［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、及び６Ｅ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１（図５、６、及び１１～１５）のうちの１つ又はそのバリアントを含む、２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体に含まれ得る。
【0143】
いくつかの実施形態では、第１の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。ある特定の実施形態では、第２の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ１－ＣＨ１－第１のドメインリンカー－ＶＨ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ２－第２のドメインリンカー－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、ＶＨ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ２はｓｃＦｖである。他の実施形態では、第２の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ１－ＣＨ１－第１のリンカー－ＶＬ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ２－第２のリンカー－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、ＶＬ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ２はｓｃＦｖである。
【0144】
本明細書における実施形態の多くに関して、これらの構築物には、本明細書で所望され、説明されるように、スキューバリアント、ｐＩバリアント、除去バリアント、追加のＦｃバリアントなどが含まれ得る。
【0145】
いくつかの実施形態では、２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体の第１及び第２のＦｃドメインは、ヘテロ二量体化スキューバリアント（例えば、図２３及び２９に示されているアミノ酸置換のセット）を含むバリアントＦｃドメインである。特に有用なヘテロ二量体化スキューバリアントとしては、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ（ＥＵ番号付け））が挙げられる。例示的な実施形態では、第１又は第２のバリアントＦｃドメインのうちの一方はヘテロ二量体化スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、第１又は第２のバリアントＦｃドメインの他方はヘテロ二量体化スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。例示的な実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインはヘテロ二量体化スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、第２のバリアントＦｃドメインはヘテロ二量体化スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。
【0146】
いくつかの実施形態では、バリアントＦｃドメインは、除去バリアント（図２５に示されているものを含む）を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のバリアントＦｃドメインのそれぞれが、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。
【0147】
いくつかの実施形態では、第１の単量体の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）は、ｐＩバリアント（図２４に示されているものを含む）を含む。例示的な実施形態では、第１の単量体の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）は、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。
【0148】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体のｓｃＦｖは、荷電ｓｃＦｖリンカー（図２６に示されているものを含む）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体は、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。
【0149】
例示的な実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインは、ヘテロ二量体化スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、第２のバリアントＦｃドメインは、ヘテロ二量体化スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、第１及び第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋを含み、第１の単量体の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）は、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含み、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体のｓｃＦｖは、（ＧＫＰＧＳ）４荷電ｓｃＦｖリンカーを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマット抗体は、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。
【0150】
いくつかの実施形態では、第１の単量体のＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３は、アミノ酸バリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ／Ｎ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、第２のＦｃドメインは、アミノ酸バリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ２６７Ｋを含み、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。
【0151】
３．２＋１ ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマット
本明細書で提供される対象の二重特異性抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体抗体フォーマットは、図２２Ｃに示される２＋１ ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマットである。この抗体フォーマットは３つの抗原結合ドメイン：２つのＦａｂ部分及び単量体の１つのＣ末端に結合しているｓｃＦｖを含む。このフォーマットのいくつかの実施形態では、Ｆａｂ部分はそれぞれ、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）に結合する。一部の実施形態では、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）に結合する。
本明細書で提供される対象の二重特異性抗体において特に使用される１つのヘテロ二量体抗体フォーマットは、図２２Ｃに示される２＋１ ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマットである。この抗体フォーマットは３つの抗原結合ドメイン：２つのＦａｂ部分及び単量体の１つのＣ末端に結合しているｓｃＦｖを含む。このフォーマットのいくつかの実施形態では、Ｆａｂ部分はそれぞれ、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）に結合する。一部の実施形態では、「余分な」ｓｃＦｖドメインは、ＢＣＭＡ（例えば、ヒトＢＣＭＡ）に結合する。
【0152】
これらの実施形態では、第１の鎖又は単量体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を含み、第２の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ドメインリンカー－ｓｃＦｖドメインを含み、ｓｃＦｖドメインは、第２のＶＨ（ＶＨ２）、第２のＶＬ（ＶＬ２）及びｓｃＦｖリンカーを含む。本明細書の全てのｓｃＦｖドメインに関して、ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ２又はＶＬ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨ２のいずれかの配向であり得る。したがって、第２の単量体は、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ドメインリンカー－ＶＨ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＬ２又はＶＨ１－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３－ドメインリンカー－ＶＬ２－ｓｃＦｖリンカー－ＶＨ２を含み得る。この組成物は、軽鎖ＶＬ１－ＣＬも含む。これらの実施形態では、ＶＨ１－ＶＬ１はそれぞれ第１のＡＢＤを形成し、ＶＨ２－ＶＬ２は第２のＡＢＤを形成する。いくつかの実施形態では、第１のＡＢＤ及び／又は第２のＡＢＤはヒトＢＣＭＡに結合する。
【0153】
いくつかの実施形態では、２＋１ ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマット抗体の第１及び第２のＦｃドメインは、ヘテロ二量体化スキューバリアント（例えば、図２３及び２９に示されているアミノ酸置換のセット）を含むバリアントＦｃドメインである。特に有用なヘテロ二量体化スキューバリアントとしては、Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ：Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｌ３６８Ｅ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ、Ｔ４１１Ｔ／Ｅ３６０Ｅ／Ｑ３６２Ｅ：Ｄ４０１Ｋ、Ｌ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｌ、Ｋ３７０Ｓ：Ｓ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ：Ｔ３６６Ｗ及びＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ（ＥＵ番号付け））が挙げられる。例示的な実施形態では、第１又は第２のバリアントＦｃドメインのうちの一方はヘテロ二量体化スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、第１又は第２のバリアントＦｃドメインの他方はヘテロ二量体化スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。例示的な実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインはヘテロ二量体化スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、第２のバリアントＦｃドメインはヘテロ二量体化スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。
【0154】
いくつかの実施形態では、バリアントＦｃドメインは、除去バリアント（図２５に示されるものを含む）を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のバリアントＦｃドメインのそれぞれが、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。
【0155】
いくつかの実施形態では、第１の単量体の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）は、ｐＩバリアント（図２４に示されているものを含む）を含む。例示的な実施形態では、第１の単量体の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）は、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。
【0156】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される２＋１ ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマット抗体のｓｃＦｖは、荷電ｓｃＦｖリンカー（図２６に示されているものを含む）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される２＋１ ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマット抗体は、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。
【0157】
例示的な実施形態では、第１のバリアントＦｃドメインは、ヘテロ二量体化スキューバリアントＬ３６８Ｄ／Ｋ３７０Ｓを含み、第２のバリアントＦｃドメインは、ヘテロ二量体化スキューバリアントＳ３６４Ｋ／Ｅ３５７Ｑを含み、第１及び第２のバリアントＦｃドメインはそれぞれ、除去バリアントＥ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６＿／Ｓ２６７Ｋを含み、第１の単量体の定常ドメイン（ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３）は、ｐＩバリアントＮ２０８Ｄ／Ｑ２９５Ｅ／Ｎ３８４Ｄ／Ｑ４１８Ｅ／Ｎ４２１Ｄを含み、番号付けは、ＥＵ番号付けに従う。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される２＋１ ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマット抗体のｓｃＦｖは、（ＧＫＰＧＳ）４荷電ｓｃＦｖリンカーを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される２＋１ ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマットの抗体は、ＦｃＲｎバリアントＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓを含み、番号付けはＥＵ番号付けに従う。
【0158】
いくつかの実施形態では、２＋１ ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマット抗体の第２の単量体のｓｃＦｖは、ＢＣＭＡに結合する。いくつかの実施形態では、第１及び第２の単量体並びに軽鎖のＶＬ１はそれぞれ、ＢＣＭＡに結合する結合ドメインを形成する。本明細書で提供されるＢＣＭＡ結合ドメインのいずれかを含む任意の好適なＣＤ２８結合ドメインは、対象の２＋１ ｍＡｂ－ｓｃＦｖフォーマット抗体に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ結合ドメインは、以下のＢＣＭＡ ＡＢＤ：Ｓ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、Ｓ１Ｒ５＿１２５［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ａ１［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ｂ４［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１．１＿Ｌ１、１Ｂ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、５Ｆ２［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、及び６Ｅ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１（図５、６、及び１１～１５）のうちの１つ又はそのバリアントである。
【0159】
４．単一特異性モノクローナル抗体
当業者によって理解されるように、本明細書に概説される新規のＦｖ配列はまた、単一特異性抗体（例えば、「従来のモノクローナル抗体」）又は非ヘテロ二重特異性フォーマットの両方で使用することができる。したがって、本発明は、図からの６つのＣＤＲ並びに／又はＶＨ及びＶＬ配列を含み、一般にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４定常領域を有する、単一特異性抗体を提供し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐアミノ酸置換を含むＩｇＧ４定常領域を含む）はいくつかの実施形態で特に使用される。すなわち、本明細書で「Ｈ＿Ｌ」の名称を有する任意の配列は、ヒトＩｇＧ１抗体の定常領域に連結することができる。いくつかの実施形態では、単一特異性抗体は、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を有する単量体；及びＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む。
当業者によって理解されるように、本明細書に概説される新規のＦｖ配列はまた、単一特異性抗体（例えば、「従来のモノクローナル抗体」）又は非ヘテロ二重特異性フォーマットの両方で使用することができる。したがって、本発明は、図からの６つのＣＤＲ並びに／又はＶＨ及びＶＬ配列を含み、一般にＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４定常領域を有する、単一特異性抗体を提供し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐアミノ酸置換を含むＩｇＧ４定常領域を含む）はいくつかの実施形態で特に使用される。すなわち、本明細書で「Ｈ＿Ｌ」の名称を有する任意の配列は、ヒトＩｇＧ１抗体の定常領域に連結することができる。いくつかの実施形態では、単一特異性抗体は、Ｎ末端からＣ末端に、ＶＨ－ＣＨ１－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３を有する単量体；及びＶＬ－ＣＬを含む軽鎖を含む。
【0160】
いくつかの実施形態では、単一特異性抗体は、抗ＢＣＭＡ単一特異性抗体である。ある特定の実施形態では、単一特異性抗ＢＣＭＡ抗体は、以下のＢＣＭＡ ＡＢＤ：Ｓ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、Ｓ１Ｒ５＿１２５［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ａ１［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、１Ｂ４［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１．１＿Ｌ１、１Ｂ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、５Ｆ２［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１、及び６Ｅ３［ＢＣＭＡ］＿Ｈ１Ｌ１（図５、６、及び１１～１５）のいずれか又はそれらのバリアントの６つのＣＤＲを含む。
【0161】
Ｖ．組換え方法及び組成物
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供されるＢＣＭＡ抗原結合ドメイン及び抗ＢＣＭＡ抗体をコードする核酸組成物である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供されるＢＣＭＡ抗原結合ドメイン及び抗ＢＣＭＡ抗体をコードする核酸組成物である。
【0162】
当業者によって理解されるように、核酸組成物はヘテロ二量体タンパク質のフォーマット及び足場に依存する。よって、例えば、１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ又は２＋１ Ｆａｂ２－ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットなど、フォーマットが３つのアミノ酸配列を必要とする場合、３つのポリヌクレオチドを発現のために１つ以上の発現ベクターに組み込むことができる。例示的な実施形態では、各ポリヌクレオチドは、異なる発現ベクターに組み込まれる。
【0163】
当技術分野で知られているように、本明細書に開示される結合ドメイン及び抗体の構成要素をコードする核酸は、本発明のヘテロ二量体抗体を産生するために使用される宿主細胞に応じて、当技術分野で知られているように、発現ベクターに組み込むことができる。一般に、核酸は任意の数の調節エレメント（プロモーター、複製起点、選択可能なマーカー、リボソーム結合部位、インデューサーなど）に作動可能に連結される。発現ベクターは、染色体外ベクター又は組み込みベクターであり得る。
【0164】
次いで、本発明のポリヌクレオチド及び／又は発現ベクターを、多くの実施形態において使用される、哺乳動物、細菌、酵母、昆虫及び／又は真菌細胞を含む当技術分野において周知の任意の数の異なる種類の宿主細胞に哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）で形質転換する。
【0165】
いくつかの実施形態では、各単量体をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ一般に異なる又は同じプロモーター制御下で単一の発現ベクター内に含まれる。本発明において特に使用される実施形態では、これらのポリヌクレオチドの各々は異なる発現ベクターに含まれる。本明細書及び参照により本明細書に組み込まれるＵＳ６２／０２５，９３１に示されるように、ヘテロ二量体形成を推進するために異なるベクター比を使用することができる。すなわち、驚くべきことに、（ヘテロ二量体抗体を含む３つのポリペプチドを有する本明細書の実施形態の多くの場合には）タンパク質は、第１の単量体：第２の単量体：軽鎖を１：１：２の比率で含むが、これらは最高の結果が得られる比率ではない。
【0166】
本明細書に記載の抗体及びＡＢＤは、当該技術分野において周知のように、発現ベクターを含む宿主細胞を培養することによって作製される。一旦産生されると、イオン交換クロマトグラフィー工程を含む従来の抗体精製工程が実施される。本明細書で考察されるように、２個の単量体のｐＩが少なくとも０．５だけ異なることは、イオン交換クロマトグラフィー若しくは等電点電気泳動、又は等電点に感受性の他の方法による分離を可能にし得る。すなわち、各単量体異なるｐＩを有し、かつヘテロ二量体も異なるｐＩを有するようになるように各単量体の等電点（ｐＩ）を変化させるｐＩ置換を含むことによって、「１＋１ Ｆａｂ－ｓｃＦｖ－Ｆｃ」ヘテロ二量体の等電点精製（例えば、陰イオン交換カラム、陽イオン交換カラム）を促進する。これらの置換はまた、精製後、混入したデュアルｓｃＦｖ－Ｆｃ及びｍＡｂホモ二量体の決定及びモニタリングにも役立つ（例えば、ＩＥＦゲル、ｃＩＥＦ、及び分析用ＩＥＸカラム）。
【0167】
ＶＩ．抗ＢＣＭＡ抗体の生物学的及び生化学的機能性
一般に、本明細書に記載の二重特異性抗ＢＣＭＡ抗体は、ＢＣＭＡ関連疾患、障害、又は状態（例えば、ＢＣＭＡ関連がん）を有する患者に投与され、かつ有効性が、本明細書に記載されるいくつかの方法で評価される。このため、がん量、腫瘍のサイズ、転移の存在又は程度の評価などの、有効性の標準的なアッセイが実行され得るが、免疫腫瘍学的治療もまた免疫状態評価に基づいて評価され得る。これは、インビトロアッセイ及びインビボアッセイの両方を含むいくつかの方法で行うことができる。
一般に、本明細書に記載の二重特異性抗ＢＣＭＡ抗体は、ＢＣＭＡ関連疾患、障害、又は状態（例えば、ＢＣＭＡ関連がん）を有する患者に投与され、かつ有効性が、本明細書に記載されるいくつかの方法で評価される。このため、がん量、腫瘍のサイズ、転移の存在又は程度の評価などの、有効性の標準的なアッセイが実行され得るが、免疫腫瘍学的治療もまた免疫状態評価に基づいて評価され得る。これは、インビトロアッセイ及びインビボアッセイの両方を含むいくつかの方法で行うことができる。
【0168】
ＶＩＩ．インビボ投与のための抗体組成物
本発明に従って使用される抗体の製剤は、所望の純度を有する抗体を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態である、任意選択的な薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することによって、保存用に調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメソニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール）、低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、及び／又は例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
本発明に従って使用される抗体の製剤は、所望の純度を有する抗体を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態である、任意選択的な薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することによって、保存用に調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤、防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメソニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール）、低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖類、ナトリウムなどの塩形成対イオン、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、及び／又は例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。
【0169】
ＶＩＩＩ．治療的使用
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡ関連疾患、障害、又は状態（例えば、ＢＣＭＡ関連がん）の処置のための方法である。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＢＣＭＡ関連疾患、障害、又は状態（例えば、ＢＣＭＡ関連がん）の処置のための方法である。
【0170】
本明細書で提供される抗体を、ボーラスとしての静脈内投与、静脈内プッシュ又は一定期間にわたる静脈内注入などの公知の方法に従って、対象に投与される。好ましい実施形態では、本明細書で提供される抗ＢＣＭＡ抗体は、静脈内注入によって投与される。
【0171】
本発明の方法では、治療は、疾患、障害又は状態に関して肯定的な治療応答を提供するために使用される。任意の所与の疾患、障害又は状態における肯定的な治療応答は、その疾患又は状態に特有の標準化された応答基準によって決定することができる。
【0172】
これらの肯定的な治療応答に加えて、治療を受けている対象は、疾患に関連する症状の改善の有益な効果を経験し得る。
【0173】
本発明による処置は、使用される抗ＢＣＭＡ抗体の「治療有効量」を含む。「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するために、必要な投薬量及び期間で有効な量を指す。
【0174】
治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに個体において所望の応答を誘発する薬剤の能力などの因子によって異なり得る。治療有効量はまた、抗体又は抗体部分のいずれの毒性又は有害な効果よりも治療上有益な効果が勝る量である。
【0175】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療応答）を提供するように調節される。例えば、単回のボーラスを投与してもよく、いくつかの分割用量を経時的に投与してもよく、又は治療状況の緊急性によって示されるように用量を比例して増減させてもよい。非経口組成物は、投与の容易性及び投薬量の均一性のために、単位剤形で処方され得る。本明細書で使用される単位剤形は、治療対象のための単一投薬量として好適な物理的に別個の単位を指す。各単位は、必要とされる薬学的担体に関連して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
【0176】
本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ抗体の効率的な投薬量及び投薬レジメンは、治療される疾患又は状態に依存し、当業者によって決定され得る。
【0177】
全ての引用文献は、本明細書にそれらの全体が参照により明示的に組み込まれる。
【0178】
本発明の特定の実施形態を説明の目的で上述のように記載してきたが、添付の特許請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく、詳細の多数の変更が行われ得ることが当業者によって理解されるであろう。
【実施例】
【0179】
本発明を説明するために実施例を以下に提供する。これらの実施例は、本発明を任意の特定の用途又は動作理論に限定することを意味するものではない。本発明で考察される全ての定常領域位置について、番号付けは、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、参照により全体が組み込まれる）の場合のようなＥＵインデックスに従う。抗体の技術分野の当業者は、この規則が免疫グロブリン配列の特異的領域における非連続的な番号付けからなり、免疫グロブリンファミリーにおける保存された位置への正規化基準を可能にすることを理解するであろう。したがって、ＥＵインデックスによって定義される任意の所与の免疫グロブリンの位置は、必ずしもその連続配列に対応しないであろう。
【0180】
一般的及び具体的な科学技術は、米国特許出願公開第２０１５／０３０７６２９号、同第２０１４／０２８８２７５号、及び国際公開第２０１４／１４５８０６号に概説されており、それらは全て、特にその中に概説されている技術について、参照によりそれらの全体が明示的に組み込まれる。
【0181】
実施例１：新規ファージ由来ＢＣＭＡ結合ドメイン
新規ＢＣＭＡ結合ドメインについて、社内のｄｅ ｎｏｖｏファージライブラリーをパニングした。ファージ由来クローンＳ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ及びＳ１Ｒ５＿１２５の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインのアミノ酸配列を、それぞれ図５及び６に示す。
新規ＢＣＭＡ結合ドメインについて、社内のｄｅ ｎｏｖｏファージライブラリーをパニングした。ファージ由来クローンＳ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ及びＳ１Ｒ５＿１２５の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインのアミノ酸配列を、それぞれ図５及び６に示す。
【0182】
１Ａ：製造
ファージ由来クローンを二価の単一特異性ｍＡｂとしてフォーマットし、その配列を図５及び６に示す。選択したクローンの可変重鎖及び可変軽鎖ドメインを含有するプラスミドをギブソンアセンブリによって構築し、ＩｇＧ１定常領域（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ６７Ｋ除去バリアントを含む－配列番号９、図３を参照されたい）及びカッパ軽鎖定常領域（配列番号１０、図４を参照されたい）のコード配列を含有するｐＴＴ５発現ベクターにサブクローニングした。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅにトランスフェクトし、得られた二価ｍＡｂをプロテインＡクロマトグラフィーを使用して上清から精製した。ＸＥＮＰ２３３５７を産生し、１３５．２ｍｇ／Ｌの収率で精製し、ＬａｂＣｈｉｐを使用するＣＥＦによって電気泳動に、凝集体については分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって分析し、そのデータを図７に示す。
ファージ由来クローンを二価の単一特異性ｍＡｂとしてフォーマットし、その配列を図５及び６に示す。選択したクローンの可変重鎖及び可変軽鎖ドメインを含有するプラスミドをギブソンアセンブリによって構築し、ＩｇＧ１定常領域（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ６７Ｋ除去バリアントを含む－配列番号９、図３を参照されたい）及びカッパ軽鎖定常領域（配列番号１０、図４を参照されたい）のコード配列を含有するｐＴＴ５発現ベクターにサブクローニングした。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅにトランスフェクトし、得られた二価ｍＡｂをプロテインＡクロマトグラフィーを使用して上清から精製した。ＸＥＮＰ２３３５７を産生し、１３５．２ｍｇ／Ｌの収率で精製し、ＬａｂＣｈｉｐを使用するＣＥＦによって電気泳動に、凝集体については分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって分析し、そのデータを図７に示す。
【0183】
ファージ由来クローンはまた、ＣＤ３二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）としてフォーマットされ、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６２７７２に概して記載されるように産生され、以下に記載されるように結合及び活性について更に特徴付けた。
【0184】
１Ｂ：ＢＣＭＡ結合親和性
この実験では、ＣＤ３に対する一価結合及びＢＣＭＡに対する一価結合を有する１＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂを使用した。Ｏｃｔｅｔを使用して一価ＫＤ値を得た。ＨＩＳ１Ｋセンサーを使用し、ｈｉｓタグ付きヒト又はｃｙｎｏ ＢＣＭＡを捕捉し、センサーを様々な濃度で各ｂｓＡｂに浸漬した。得られた解離定数を図８に示す。
この実験では、ＣＤ３に対する一価結合及びＢＣＭＡに対する一価結合を有する１＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂを使用した。Ｏｃｔｅｔを使用して一価ＫＤ値を得た。ＨＩＳ１Ｋセンサーを使用し、ｈｉｓタグ付きヒト又はｃｙｎｏ ＢＣＭＡを捕捉し、センサーを様々な濃度で各ｂｓＡｂに浸漬した。得られた解離定数を図８に示す。
【0185】
１Ｃ：細胞結合
次に、ＢＣＭＡ＋細胞への結合を調査した。この実験では、ＣＤ３に対する一価結合及びＢＣＭＡに対する一価結合を有する１＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂ、並びにＣＤ３に対する一価結合及びＢＣＭＡに対する二価結合を有する２＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂを使用した。３００－１９細胞を培養し、トランスフェクトし、ｃｙｎｏ ＢＣＭＡ又はヒトＢＣＭＡのいずれかを発現させた。親３００－１９細胞を、ｃｙｎｏ ＢＣＭＡ又はヒトＢＣＭＡのいずれかを発現するトランスフェクトされた３００－１９細胞と共に、１ウェル当たり２００Ｋでプレートに播種した。次いで、３つ全ての細胞型を、図に示される濃度範囲でｂｓＡｂと混合し、氷上で１時間インキュベートした。次に、試料を氷上で更に１時間、１ｕｇ／ｍｌのＰＥ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。試料をＰＢＳで洗浄し、１％のＰＦＡを含むＰＢＳ中で固定した後、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ２サイトメーターで分析した。データは、図９に示される。
次に、ＢＣＭＡ＋細胞への結合を調査した。この実験では、ＣＤ３に対する一価結合及びＢＣＭＡに対する一価結合を有する１＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂ、並びにＣＤ３に対する一価結合及びＢＣＭＡに対する二価結合を有する２＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂを使用した。３００－１９細胞を培養し、トランスフェクトし、ｃｙｎｏ ＢＣＭＡ又はヒトＢＣＭＡのいずれかを発現させた。親３００－１９細胞を、ｃｙｎｏ ＢＣＭＡ又はヒトＢＣＭＡのいずれかを発現するトランスフェクトされた３００－１９細胞と共に、１ウェル当たり２００Ｋでプレートに播種した。次いで、３つ全ての細胞型を、図に示される濃度範囲でｂｓＡｂと混合し、氷上で１時間インキュベートした。次に、試料を氷上で更に１時間、１ｕｇ／ｍｌのＰＥ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。試料をＰＢＳで洗浄し、１％のＰＦＡを含むＰＢＳ中で固定した後、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ２サイトメーターで分析した。データは、図９に示される。
【0186】
１Ｄ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
最後に、ＲＰＭＩ８２２６（ＢＣＭＡ＋）細胞の死滅を調査した。上記のように、１＋１フォーマット及び２＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂを使用した。更に、ＲＳＶｘＣＤ３ ｂｓＡｂを対照として使用した。ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を使用して、リダイレクトＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）を決定し、製造業者の指示に従って乳酸脱水素酵素レベルを測定し、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）上でデータを取得した。図１０に示されるデータは、ファージ由来抗ＢＣＭＡクローンＳ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ又はＳ１Ｒ１＿１２５に基づくＣＤ３ ｂｓＡｂのそれぞれが、用量依存的に細胞死滅を誘導することができたことを示す。
最後に、ＲＰＭＩ８２２６（ＢＣＭＡ＋）細胞の死滅を調査した。上記のように、１＋１フォーマット及び２＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂを使用した。更に、ＲＳＶｘＣＤ３ ｂｓＡｂを対照として使用した。ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を使用して、リダイレクトＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）を決定し、製造業者の指示に従って乳酸脱水素酵素レベルを測定し、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）上でデータを取得した。図１０に示されるデータは、ファージ由来抗ＢＣＭＡクローンＳ１Ｒ４＿１０ｃｏｒｒ又はＳ１Ｒ１＿１２５に基づくＣＤ３ ｂｓＡｂのそれぞれが、用量依存的に細胞死滅を誘導することができたことを示す。
【0187】
実施例２：新規ハイブリドーマ由来ＢＣＭＡ結合ドメイン
更なる新規のＢＣＭＡ結合ドメインを、ラットハイブリドーマ技術によって生成し、ストリング含有量最適化を使用してヒト化した（例えば、米国特許第７，６５７，３８０号を参照されたい）。ヒト化ハイブリドーマ由来のクローン１Ａ１、１Ｂ４、１Ｂ３、４Ｆ２、及び６Ｅ３の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインのアミノ酸配列を図１１～１５に示す。
更なる新規のＢＣＭＡ結合ドメインを、ラットハイブリドーマ技術によって生成し、ストリング含有量最適化を使用してヒト化した（例えば、米国特許第７，６５７，３８０号を参照されたい）。ヒト化ハイブリドーマ由来のクローン１Ａ１、１Ｂ４、１Ｂ３、４Ｆ２、及び６Ｅ３の可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）ドメインのアミノ酸配列を図１１～１５に示す。
【0188】
２Ａ：産生
ハイブリドーマ由来のクローンを二価単一特異性ｍＡｂとしてフォーマットし、その配列を図１１～１５に示す。選択したクローンの可変重鎖及び可変軽鎖ドメインを含有するプラスミドをギブソンアセンブリによって構築し、ＩｇＧ１定常領域（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ６７Ｋ除去バリアントを含む－配列番号９、図３を参照されたい）及びカッパ軽鎖定常領域（配列番号１０、図４を参照されたい）のコード配列を含有するｐＴＴ５発現ベクターにサブクローニングした。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅにトランスフェクトし、得られた二価ｍＡｂをプロテインＡクロマトグラフィーを使用して上清から精製した。ＸＥＮＰ２４４９５（１Ａ１）、ＸＥＮＰ２４５０３（１Ｂ４）、ＸＥＮＰ２４６１７（１Ｂ３）、ＸＥＮＰ２４６２１（５Ｆ２）、及びＸＥＮＰ２４６２５（６Ｅ３）を、それぞれ、６６．４９ｍｇ／Ｌ、１２４．３７ｍｇ／Ｌ、４５．０４ｍｇ／Ｌ、５８．５８ｍｇ／Ｌ、及び７６．４３ｍｇ／Ｌの収率で産生及び精製した。精製されたｍＡｂを、ＬａｂＣｈｉｐを使用するＣＥＦによって電気泳動的に、凝集体については分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって分析し、そのデータを図１６～１７に示す。
ハイブリドーマ由来のクローンを二価単一特異性ｍＡｂとしてフォーマットし、その配列を図１１～１５に示す。選択したクローンの可変重鎖及び可変軽鎖ドメインを含有するプラスミドをギブソンアセンブリによって構築し、ＩｇＧ１定常領域（Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３６ｄｅｌ／Ｓ６７Ｋ除去バリアントを含む－配列番号９、図３を参照されたい）及びカッパ軽鎖定常領域（配列番号１０、図４を参照されたい）のコード配列を含有するｐＴＴ５発現ベクターにサブクローニングした。発現のためにＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｅにトランスフェクトし、得られた二価ｍＡｂをプロテインＡクロマトグラフィーを使用して上清から精製した。ＸＥＮＰ２４４９５（１Ａ１）、ＸＥＮＰ２４５０３（１Ｂ４）、ＸＥＮＰ２４６１７（１Ｂ３）、ＸＥＮＰ２４６２１（５Ｆ２）、及びＸＥＮＰ２４６２５（６Ｅ３）を、それぞれ、６６．４９ｍｇ／Ｌ、１２４．３７ｍｇ／Ｌ、４５．０４ｍｇ／Ｌ、５８．５８ｍｇ／Ｌ、及び７６．４３ｍｇ／Ｌの収率で産生及び精製した。精製されたｍＡｂを、ＬａｂＣｈｉｐを使用するＣＥＦによって電気泳動的に、凝集体については分析的サイズ排除クロマトグラフィーによって分析し、そのデータを図１６～１７に示す。
【0189】
ハイブリドーマ由来のクローンはまた、ＣＤ３二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）としてフォーマットされ、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６２７７２に概して記載されるように産生され、以下に記載されるように結合及び活性について更に特徴付けた。
【0190】
２Ｂ：ＢＣＭＡ結合親和性
この実験では、ＣＤ３に対する一価結合及びＢＣＭＡに対する一価結合を有する１＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂを使用した。Ｏｃｔｅｔを使用して一価ＫＤ値を得た。ＨＩＳ１Ｋセンサーを使用し、ｈｉｓタグ付きヒト又はｃｙｎｏ ＢＣＭＡを捕捉し、センサーを様々な濃度で各ｂｓＡｂに浸漬した。得られた解離定数（ＫＤ）を図１８に示す。
この実験では、ＣＤ３に対する一価結合及びＢＣＭＡに対する一価結合を有する１＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂを使用した。Ｏｃｔｅｔを使用して一価ＫＤ値を得た。ＨＩＳ１Ｋセンサーを使用し、ｈｉｓタグ付きヒト又はｃｙｎｏ ＢＣＭＡを捕捉し、センサーを様々な濃度で各ｂｓＡｂに浸漬した。得られた解離定数（ＫＤ）を図１８に示す。
【0191】
２Ｃ：細胞結合
次に、ＢＣＭＡ＋細胞への結合を調査した。この実験では、二価ＢＣＭＡ ｍＡｂを使用した。３００－１９細胞を培養し、トランスフェクトし、ｃｙｎｏ ＢＣＭＡ又はヒトＢＣＭＡのいずれかを発現させた。親３００－１９細胞を、ｃｙｎｏ ＢＣＭＡ又はヒトＢＣＭＡのいずれかを発現するトランスフェクトされた３００－１９細胞と共に、１ウェル当たり２００Ｋでプレートに播種した。次いで、３つ全ての細胞型を、図に示される濃度範囲でｍＡｂと混合し、氷上で１時間インキュベートした。次に、試料を氷上で更に１時間、１ｕｇ／ｍｌのＰＥ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。試料をＰＢＳで洗浄し、１％のＰＦＡを含むＰＢＳ中で固定した後、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ２サイトメーターで分析した。データは、図１９に示される。
次に、ＢＣＭＡ＋細胞への結合を調査した。この実験では、二価ＢＣＭＡ ｍＡｂを使用した。３００－１９細胞を培養し、トランスフェクトし、ｃｙｎｏ ＢＣＭＡ又はヒトＢＣＭＡのいずれかを発現させた。親３００－１９細胞を、ｃｙｎｏ ＢＣＭＡ又はヒトＢＣＭＡのいずれかを発現するトランスフェクトされた３００－１９細胞と共に、１ウェル当たり２００Ｋでプレートに播種した。次いで、３つ全ての細胞型を、図に示される濃度範囲でｍＡｂと混合し、氷上で１時間インキュベートした。次に、試料を氷上で更に１時間、１ｕｇ／ｍｌのＰＥ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。試料をＰＢＳで洗浄し、１％のＰＦＡを含むＰＢＳ中で固定した後、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ２サイトメーターで分析した。データは、図１９に示される。
【0192】
２Ｄ：ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性
ＲＰＭＩ８２２６（ＢＣＭＡ＋）細胞の死滅を調査した。上記のように、１＋１フォーマット及び２＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂを使用した。更に、ＲＳＶｘＣＤ３ ｂｓＡｂを対照として使用した。ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を使用して、リダイレクトＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）を決定し、製造業者の指示に従って乳酸脱水素酵素レベルを測定し、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）上でデータを取得した。図２０に示されるデータは、ハイブリドーマ由来抗ＢＣＭＡクローンのそれぞれに基づく各ＣＤ３ ｂｓＡｂが、ＲＳＶ結合ドメインを有する対照ｂｓＡｂとは対照的に、用量依存的に細胞死滅を誘導することができたことを示す。
ＲＰＭＩ８２２６（ＢＣＭＡ＋）細胞の死滅を調査した。上記のように、１＋１フォーマット及び２＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂを使用した。更に、ＲＳＶｘＣＤ３ ｂｓＡｂを対照として使用した。ＣｙｔｏＴｏｘ－ＯＮＥ（商標）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）を使用して、リダイレクトＴ細胞細胞傷害性（ＲＴＣＣ）を決定し、製造業者の指示に従って乳酸脱水素酵素レベルを測定し、Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓ．）上でデータを取得した。図２０に示されるデータは、ハイブリドーマ由来抗ＢＣＭＡクローンのそれぞれに基づく各ＣＤ３ ｂｓＡｂが、ＲＳＶ結合ドメインを有する対照ｂｓＡｂとは対照的に、用量依存的に細胞死滅を誘導することができたことを示す。
【0193】
２Ｅ：薬物動態
最後に、分子の安定性を調査するために、１＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂとの関連で、ハイブリドーマ由来の結合ドメインの薬物動態を調べた。調査した各ｂｓＡｂについて、５匹のマウスに０日目に２ｍｇ／ｋｇで投与した。１時間後、５０μｌの全血を各マウスから採取した。この血液採取を１、３、７、１０及び１４日目に繰り返した。半減期を決定するために、マウス血清をＥＬＩＳＡによってアッセイし、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して分析し、そのデータを図２１に示す。
最後に、分子の安定性を調査するために、１＋１フォーマットのＣＤ３ ｂｓＡｂとの関連で、ハイブリドーマ由来の結合ドメインの薬物動態を調べた。調査した各ｂｓＡｂについて、５匹のマウスに０日目に２ｍｇ／ｋｇで投与した。１時間後、５０μｌの全血を各マウスから採取した。この血液採取を１、３、７、１０及び１４日目に繰り返した。半減期を決定するために、マウス血清をＥＬＩＳＡによってアッセイし、Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーを使用して分析し、そのデータを図２１に示す。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22-1】
【図22-2】
【図23A】
【図23B】
【図23C】
【図23D】
【図23E】
【図23F】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30A】
【図30B】
【図30C】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【配列表】
【国際調査報告】