▶ シージェイ チェイルジェダン コーポレーションの特許一覧
特表2024-534636Ｌ－アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたＬ－アルギニン生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-20
(54)【発明の名称】Ｌ－アルギニンを生産するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたＬ－アルギニン生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20240912BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240912BHJP
C12P 13/10 20060101ALI20240912BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12N15/31
C12P13/10 B
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024518960
(86)(22)【出願日】2022-10-14
(85)【翻訳文提出日】2024-03-26
(86)【国際出願番号】 KR2022015551
(87)【国際公開番号】W WO2023063763
(87)【国際公開日】2023-04-20
(31)【優先権主張番号】10-2021-0137890
(32)【優先日】2021-10-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513178894
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】チャン、ジン スク
(72)【発明者】
【氏名】キム、ヒョ ギョン
(72)【発明者】
【氏名】チェ、ソン ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】イ、ジウォン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AE24
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA10
4B065AA24X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA24
4B065CA17
4B065CA41
4B065CA44
(57)【要約】
本出願は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が弱化されたＬ－アルギニン生産微生物及びそれを用いたＬ－アルギニン製造方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性が弱化され、Ｌ－アルギニンを生産するコリネバクテリウム属（the genus of Corynebacterium）組換え微生物。
【請求項2】
前記微生物は、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性が弱化されていない親株に比べて、Ｌ－アルギニン生産能が向上したものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項3】
前記微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１に記載の微生物。
【請求項4】
前記微生物は、さらにアルギニンリプレッサー（arginine repressor）の活性が弱化されたものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項5】
前記微生物は、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが欠失したものである、請求項１に記載の微生物。
【請求項6】
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属組換え微生物を培地で培養するステップを含むＬ－アルギニン製造方法。
【請求項7】
前記微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記コリネバクテリウム属微生物は、さらにアルギニンリプレッサーが弱化されたものである、請求項６に記載の方法。
【請求項9】
前記微生物は、前記配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸塩基配列が欠失したものである、請求項６に記載の方法。
【請求項10】
請求項１～５のいずれか一項に記載の微生物のＬ－アルギニン生産への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたＬ－アルギニン生産微生物、及びＬ－アルギニンの製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－アルギニン（L-arginine）は、肝機能促進剤、脳機能改善剤、総合アミノ酸製剤などの医薬用に用いられており、近年は、かまぼこ添加剤、健康飲料添加剤、高血圧患者の食塩代替品などの食品用としても脚光を浴びている物質である。産業的に利用できる高濃度のアルギニンを生産するために微生物を用いる研究が続けられており、グルタミン酸（glutamate）生産菌株であるブレビバクテリウム（Brevibacterium）又はコリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物から誘導された変異株を用いる方法、細胞融合により生育が改善されたアミノ酸生産菌株を用いる方法などが報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】米国特許第８０３４６０２号明細書
【特許文献2】米国特許第７６６２９４３号明細書
【特許文献3】米国特許第１０５８４３３８号明細書
【特許文献4】米国特許第１０２７３４９１号明細書
【特許文献5】韓国公開特許第１０－２０２０－０１３６８１３号公報
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献2】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277
【非特許文献3】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【非特許文献4】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)
【非特許文献5】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)
【非特許文献6】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994
【非特許文献7】[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073
【非特許文献8】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482
【非特許文献9】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)
【非特許文献10】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745
【非特許文献11】J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
【非特許文献12】F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【非特許文献13】van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999
【非特許文献14】Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793
【非特許文献15】Sambrook et al. Molecular Cloning 2012
【非特許文献16】Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986
【非特許文献17】Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16
【非特許文献18】"Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)
【非特許文献19】Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999)52:541-545
【非特許文献20】Moore, S., Stein, W. H., Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. J. Biol. Chem.1948, 176, 367-388
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本出願が解決しようとする課題は、Ｌ－アルギニンを生産するコリネバクテリウム属組換え微生物、それを用いたＬ－アルギニン製造方法及び使用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本出願は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化された、Ｌ－アルギニンを生産するコリネバクテリウム属（the genus of Corynebacterium）組換え微生物を提供することを目的とする。
【0007】
また、本出願は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属組換え微生物を培地で培養するステップを含むＬ－アルギニン製造方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【0008】
本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が弱化されたコリネバクテリウム属微生物は、高収率でＬ－アルギニンを生産することができるので、産業的生産に有用である。
【発明を実施するための形態】
【0009】
以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。さらに、本明細書全体にわたって多くの論文及び特許文献が参照されており、その引用が示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体が本明細書に参照として組み込まれており、それにより本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【0010】
本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属（the genus of Corynebacterium）組換え微生物を提供する。
【0011】
本出願のタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列を含むものであってもよく、前記アミノ酸配列からなるものであってもよく、前記アミノ酸配列から実質的に構成される（essentially consisting of）ものであってもよい。
【0012】
本出願において、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質は、本出願の微生物の内在性タンパク質であるが、これに限定されるものではない。
【0013】
配列番号１のアミノ酸配列は、公知のデータベースである米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）から得られる。本出願において、配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％又は９９．９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。また、そのような相同性又は同一性を有し、本出願のタンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。
【0014】
例えば、アミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端及び／又は内部に、本出願のタンパク質の機能を変更しない配列の付加もしくは欠失、自然に発生し得る突然変異、非表現突然変異（silent mutation）又は保存的置換を有するものが挙げられる。
【0015】
本出願における「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。前記タンパク質は、少なくとも１つの生物学的活性を依然として有する状態で、例えば少なくとも１つの保存的置換を有する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。例えば、電荷を帯びた側鎖（electrically charged amino acid）を有するアミノ酸のうち正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられ、電荷を帯びていない側鎖（uncharged amino acid）を有するアミノ酸のうち非極性アミノ酸（nonpolar amino acid）としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びプロリンが挙げられ、極性（polar）又は親水性（hydrophilic）アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ、前記アミノ酸のうち芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられる。
【0016】
本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は核酸塩基配列が類似する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。
【0017】
保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はタンパク質の配列相同性又は同一性は標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全部又は一部分とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドにおいて一般のコドン又はコドン縮退を考慮したコドンを有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることは言うまでもない。
【0018】
任意の２つのポリヌクレオチド又はタンパク質配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献１のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献３）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献５、６及び７）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
【0019】
ポリヌクレオチド又はタンパク質の相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献８に開示されているように、非特許文献３などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献９に開示されているように、非特許文献１０の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。
【0020】
本出願において、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドをＮＣｇｌ１４６９遺伝子ともいう。
【0021】
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を意味し、より具体的には前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
【0022】
本出願のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする核酸塩基配列を含むものであってもよい。本出願の一例として、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２の核酸塩基配列を有するものであってもよく、配列番号２の核酸塩基配列を含むものであってもよい。また、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２の核酸塩基配列からなるものであってもよく、配列番号２の核酸塩基配列から実質的に構成されるものであってもよい。
【0023】
本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は本出願のタンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、本出願のタンパク質のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２の核酸塩基配列と相同性もしくは同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上及び１００％未満の核酸塩基配列を有するものであるか、前記核酸塩基配列を含むものであるか、又は配列番号２の配列と相同性もしくは同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上及び１００％未満の核酸塩基配列からなるものであるか、前記核酸塩基配列から実質的に構成されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0024】
また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば本出願のポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（非特許文献１１、１２参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性もしくは同一性の高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するポリヌクレオチド同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低いポリヌクレオチド同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。
【0025】
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願のポリヌクレオチドには、実質的に類似する核酸塩基配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。
【0026】
具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検出することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
【0027】
前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（例えば、非特許文献１１）。
【0028】
本出願における「微生物（又は、菌株）」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするポリペプチド、タンパク質又は産物の生産のために遺伝的改変（modification）が行われた微生物である。
【0029】
本出願の微生物は、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が弱化された微生物であってもよく、それをコードするポリヌクレオチドが欠失した微生物であってもよく、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が弱化されるように、又はそれをコードするポリヌクレオチドが欠失するようにベクターにより遺伝的に改変された微生物（例えば、組換え微生物）であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0030】
本出願の微生物は、Ｌ－アルギニン生産能を有する微生物であってもよい。
【0031】
本出願の微生物は、親株に比べてＬ－アルギニン生産能が向上した微生物であってもよい。
【0032】
本出願の微生物は、親株（例えば、自然にＬ－アルギニン生産能を有するか、Ｌ－アルギニン生産能のない親株）に、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質を弱化させることにより、又はそれをコードするポリヌクレオチドを欠失させることにより、Ｌ－アルギニン生産能が付与された微生物であるが、これらに限定されるものではない。
【0033】
一例として、本出願の組換え微生物は、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が弱化されるように、又はそれをコードするポリヌクレオチドが欠失するようにベクターにより形質転換され、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が弱化された菌株もしくは微生物、又はそれをコードするポリヌクレオチドが欠失した菌株もしくは微生物であって、天然の野生型微生物、又はＬ－アルギニンを生産する微生物に、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が弱化されるか、又はそれをコードするポリヌクレオチドが欠失し、Ｌ－アルギニン生産能が天然の野生型微生物、又は配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質もしくはそれをコードするポリヌクレオチドが改変されていない微生物より向上した微生物であるが、これらに限定されるものではない。
【0034】
例えば、前記Ｌ－アルギニン生産能が向上したか否かを比較する対象菌株である非改変微生物又は親株は、ＡＴＣＣ１３８６９菌株、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（非特許文献１３）、又は野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９においてａｒｇＲ遺伝子が欠失した菌株（例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ１Ｒ）であるが、これらに限定されるものではない。
【0035】
一例として、前記生産能が向上した組換え菌株は、変異前の親株又は非改変微生物のＬ－アルギニン生産能に比べて、約１％以上、具体的には約１％以上、約２．５％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上、約８％以上、約９％以上、約１０％以上、約１０．５％以上、約１１％以上、約１１．５％以上、約１２％以上、約１２．５％以上、約１３％以上、約１３．５％以上又は約１４％以上（上限値に特に制限はなく、例えば約２００％以下、約１５０％以下、約１００％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下又は約２５％以下である）向上したものであるが、変異前の親株又は非改変微生物の生産能に比べて、＋値の増加量を有するものであればいかなるものでもよい。他の例として、前記生産能が向上した組換え菌株は、変異前の親株又は非改変微生物に比べて、Ｌ－アルギニン生産能が約１．１倍以上、約１．１２倍以上、約１．１３倍以上又は１．１４倍以上（上限値に特に制限はなく、例えば約１０倍以下、約５倍以下、約３倍以下又は約２倍以下である）に向上したものであるが、これらに限定されるものではない。前記「約（about）」とは、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などが全て含まれる範囲であり、約という用語の後に続く数値と同等又は同程度の範囲の数値であればいかなるものでもよいが、これらに限定されるものではない。
【0036】
本出願における「非改変微生物」とは、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、野生型菌株もしくは天然菌株自体、又は自然要因もしくは人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する前の菌株を意味する。例えば、前記非改変微生物とは、本明細書に記載された配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質が弱化される前の微生物、又はそれをコードするポリヌクレオチドが欠失する前の微生物を意味する。前記「非改変微生物」は、「改変前の菌株」、「改変前の微生物」、「非変異菌株」、「非改変菌株」、「非変異微生物」又は「基準微生物」と混用される。
【0037】
本出願の他の例として、本出願のコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、コリネバクテリウム・シングラレ（Corynebacterium singulare）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Corynebacterium pollutisoli）、コリネバクテリウム・イミタンス（Corynebacterium imitans）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）又はコリネバクテリウム・フラベッセンス（Corynebacterium flavescens）であってもよい。
【0038】
具体的には、本出願の組換え微生物は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの全部又は一部が欠失した微生物であってもよい。
【0039】
また、本出願の微生物は、アルギニンリプレッサー（ArgR, arginine repressor）の活性がさらに弱化された微生物であってもよい。具体的には、本出願の微生物は、ａｒｇＲ遺伝子の全部又は一部がさらに欠失した微生物であってもよい。
【0040】
前記ＡｒｇＲは、配列番号１３のアミノ酸配列で表されるポリペプチドを含むものであってもよい。また、前記ａｒｇＲ遺伝子は、配列番号１４の核酸塩基配列で表されるポリヌクレオチドを含むものであるが、これに限定されるものではない。
【0041】
例えば、本出願の微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（非特許文献１３）においてＮＣｇｌ１４６９遺伝子が欠失した菌株であってもよく、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ１ＲにおいてＮＣｇｌ１４６９遺伝子が欠失した菌株であってもよい。
【0042】
また、本出願の微生物は、ＡｒｇＦ（Ornithine carbamoyltransferase subunit F）、前記ＡｒｇＦをコードするポリヌクレオチド、又はａｒｇＦ遺伝子を含むものであってもよい。本出願のＡｒｇＦは、配列番号１５で表されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。また、本出願のａｒｇＦ遺伝子は、配列番号１６で表される核酸塩基配列からなるものであってもよい。
【0043】
本出願におけるタンパク質の「弱化」は、内在性活性に比べて活性が低下することや、活性がなくなることが全て含まれる概念である。前記弱化は、不活性化（inactivation）、欠乏（deficiency）、下方調節（down-regulation）、減少（decrease）、低下（reduce）、減衰（attenuation）などと混用される。
【0044】
前記弱化には、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの変異などによりタンパク質自体の活性が本来微生物が有するタンパク質の活性に比べて減少又は除去されること、それをコードするポリヌクレオチドの遺伝子の発現阻害やタンパク質への翻訳（translation）阻害などにより細胞内での全体的なタンパク質活性の程度及び／又は濃度（発現量）が天然菌株に比べて低下すること、前記ポリヌクレオチドの発現が全くないこと、及びポリヌクレオチドが発現したとしてもタンパク質の活性がないことの少なくとも１つが含まれる。前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する場合に、形質変化の前の親株、野生型又は非改変微生物が本来有していた特定タンパク質の活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用される。タンパク質の活性が内在性活性に比べて「不活性化」、「欠乏」、「減少」、「下方調節」、「低下」、「減衰」するとは、形質変化の前の親株又は非改変微生物が本来有していた特定タンパク質の活性に比べて低下することを意味する。
【0045】
このようなタンパク質の活性の弱化は、これらに限定されるものではなく、当該分野で周知の様々な方法を適用することにより達成することができる（例えば、非特許文献１４、１５など）。
【0046】
具体的には、本出願のタンパク質の弱化は、１）タンパク質をコードする遺伝子の全部又は一部を欠失させること、２）タンパク質をコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（又は発現調節配列）を改変すること、３）タンパク質の活性が欠失又は弱化されるように前記タンパク質を構成するアミノ酸配列を改変すること（例えば、アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸を欠失／置換／付加すること）、４）タンパク質の活性が欠失又は弱化されるように前記タンパク質をコードする遺伝子配列を改変すること（例えば、タンパク質の活性が欠失又は弱化されるように改変されたタンパク質をコードするように前記タンパク質遺伝子の核酸塩基配列の１つ以上の核酸塩基を欠失／置換／付加すること）、５）タンパク質をコードする遺伝子転写産物の開始コドンもしくは５’ＵＴＲ領域をコードする核酸塩基配列を改変すること、６）タンパク質をコードする前記遺伝子転写産物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入すること、７）リボソーム（ribosome）の付着を不可能にする２次構造物が形成されるようにタンパク質をコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加すること、８）タンパク質をコードする遺伝子配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加すること（Reverse transcription engineering, RTE）、又は９）前記１）～８）から選択される２つ以上の組み合わせにより行われるが、特にこれらに限定されるものではない。
【0047】
例えば、前記１）タンパク質をコードする前記遺伝子の一部又は全部を欠失させることは、染色体内の内在性標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド全体を欠失させること、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行われてもよい。
【0048】
また、前記２）発現調節領域（又は発現調節配列）を改変することは、欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節領域（又は発現調節配列）上の変異を発生させるか、より低い活性を有する配列に置換することにより行われてもよい。前記発現調節領域には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【0049】
さらに、前記３）タンパク質をコードする遺伝子転写産物の開始コドンもしくは５’ＵＴＲ領域をコードする核酸塩基配列を改変することは、例えば、内在性開始コドンに比べてタンパク質の発現率が低い他の開始コドンをコードする核酸塩基配列に置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。
【0050】
さらに、前記４）及び５）のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を改変することは、タンパク質の活性が弱化されるように、前記タンパク質のアミノ酸配列又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より低い活性を有するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列、又は活性がなくなるように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列に置換することにより行われるが、これらに限定されるものではない。例えば、ポリヌクレオチド配列に変異を導入して終止コドンを形成することにより、遺伝子の発現を阻害又は弱化させることができるが、これらに限定されるものではない。
【0051】
前記６）タンパク質をコードする前記遺伝子転写産物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入することは、例えば非特許文献１６のように行われてもよい。
【0052】
前記７）リボソーム（ribosome）の付着を不可能にする２次構造物が形成されるようにタンパク質をコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加することは、ｍＲＮＡ翻訳を不可能にするか、速度を低下させることにより行われてもよい。
【0053】
前記８）タンパク質をコードする遺伝子配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加すること（Reverse transcription engineering, RTE）は、前記タンパク質をコードする遺伝子転写産物に相補的なアンチセンスヌクレオチドを作成して活性を弱化させることにより行われてもよい。
【0054】
本出願におけるタンパク質の活性の「強化」とは、タンパク質の活性を内在性活性に比べて向上させることを意味する。前記強化は、活性化（activation）、上方調節（up-regulation）、過剰発現（overexpression）、向上（increase）などと混用される。ここで、活性化、強化、上方調節、過剰発現、向上には、本来なかった活性を示すようになることや、内在性活性又は改変前の活性に比べて活性が向上することが全て含まれる。前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する場合に、形質変化の前の親株又は非改変微生物が本来有していた特定タンパク質の活性を意味する。これは、「改変前の活性」と混用される。タンパク質の活性が内在性活性に比べて「強化」、「上方調節」、「過剰発現」又は「向上」するとは、形質変化の前の親株又は非改変微生物が本来有していた特定タンパク質の活性及び／又は濃度（発現量）に比べて向上することを意味する。
【0055】
前記強化は、外来タンパク質の導入により達成してもよく、内在性タンパク質の活性強化及び／又は濃度（発現量）増加により達成してもよい。前記タンパク質の活性が強化されたか否かは、当該タンパク質の活性の程度、発現量、又は当該タンパク質から生産される産物の量の増加により確認することができる。
【0056】
前記タンパク質の活性の強化には、当該分野で周知の様々な方法を適用することができ、標的タンパク質の活性を改変前の微生物より強化できるものであればいかなるものでもよい。具体的には、分子生物学における通常の方法であり、当該技術分野における通常の知識を有する者に周知の遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を用いたものであるが、これらに限定されるものではない（例えば、非特許文献１５、１７など）。
【0057】
具体的には、本出願のタンパク質の強化は、１）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させること、２）タンパク質をコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性が強力な配列に置換すること、３）タンパク質をコードする遺伝子転写産物の開始コドンもしくは５’ＵＴＲ領域をコードする核酸塩基配列を改変すること、４）タンパク質の活性が強化されるように前記タンパク質のアミノ酸配列を改変すること、５）タンパク質の活性が強化されるように前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を改変すること（例えば、タンパク質の活性が強化されるように改変されたタンパク質をコードするように前記タンパク質遺伝子のポリヌクレオチド配列を改変すること）、６）タンパク質の活性を示す外来タンパク質もしくはそれをコードする外来ポリヌクレオチドを導入すること、７）タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化すること、８）タンパク質の三次構造を分析し、露出部分を選択して改変すること、もしくは化学的に修飾すること、又は９）前記１）～８）から選択される２つ以上の組み合わせにより行われるが、特にこれらに限定されるものではない。
【0058】
より具体的には、前記１）タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数を増加させることは、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主に関係なく複製されて機能するベクターの宿主細胞に導入することにより行われてもよい。あるいは、当該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内の染色体に１コピー又は２コピー以上導入することにより行われてもよい。前記染色体への導入は、宿主細胞内の染色体に前記ポリヌクレオチドを挿入することのできるベクターを宿主細胞内に導入することにより行われるが、これに限定されるものではない。前記ベクターについては前述した通りである。
【0059】
前記２）タンパク質をコードする染色体上の遺伝子発現調節領域（又は発現調節配列）を活性が強力な配列に置換することは、例えば前記発現調節領域の活性がさらに強化されるように、欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より高い活性を有する配列に置換することにより行われてもよい。前記発現調節領域には、特にこれらに限定されるものではないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結を調節する配列などが含まれる。例えば、本来のプロモーターを強力なプロモーターに置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。
【0060】
公知の強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（特許文献２）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（特許文献３）、Ｏ２プロモーター（特許文献４）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0061】
前記３）タンパク質をコードする遺伝子転写産物の開始コドンもしくは５’ＵＴＲ領域をコードする核酸塩基配列を改変することは、例えば内在性開始コドンに比べてタンパク質の発現率が高い他の開始コドンをコードする核酸塩基配列に置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。
【0062】
前記４）及び５）のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を改変することは、タンパク質の活性が強化されるように、前記タンパク質のアミノ酸配列又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より高い活性を有するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列、又は活性が向上するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列に置換することにより行われるが、これらに限定されるものではない。具体的には、前記置換は、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体に挿入することにより行われるが、これに限定されるものではない。ここで、用いられるベクターは、染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選択マーカーについては前述した通りである。
【0063】
前記６）タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドを導入することは、前記タンパク質と同一／類似の活性を示すタンパク質をコードする外来ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することにより行われてもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記タンパク質と同一／類似の活性を示すものであれば、その由来や配列はいかなるものでもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前述したように導入したポリヌクレオチドが発現することにより、タンパク質が生成されてその活性が向上する。
【0064】
前記７）タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを最適化することは、宿主細胞内で転写又は翻訳が増加するように、内在ポリヌクレオチドのコドンを最適化することにより行われてもよく、宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるように、外来ポリヌクレオチドのコドンを最適化することにより行われてもよい。
【0065】
前記８）タンパク質の三次構造を分析し、露出部分を選択して改変すること、もしくは化学的に修飾することは、例えば分析しようとするタンパク質の配列情報を既知のタンパク質の配列情報が保存されているデータベースと比較し、配列の類似性の程度に応じて鋳型タンパク質の候補を決定し、それを基に構造を確認し、改変又は化学的に修飾する露出部分を選択して改変又は修飾することにより行われてもよい。
【0066】
このようなタンパク質活性の強化は、対応するタンパク質の活性又は濃度、発現量を野生型や改変前の微生物菌株で発現するタンパク質の活性又は濃度に比べて向上させるか、当該タンパク質から生産される産物の量を増加させることにより行われるが、これらに限定されるものではない。
【0067】
本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的ポリペプチドを発現させることができるように、好適な発現調節領域（又は発現調節配列）に作動可能に連結された前記標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸塩基配列を含むＤＮＡ産物を意味する。前記発現調節領域には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞内に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。
【0068】
本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
【0069】
例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え（homologous recombination）により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に挿入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択するためのもの、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否か確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。
【0070】
本出願における「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞又は微生物に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されるものでもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0071】
また、前記「作動可能に連結」されたものとは、本出願の標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されたものを意味する。
【0072】
本出願の微生物において、ポリヌクレオチドの一部又は全部の改変は、（ａ）微生物中の染色体導入用ベクターを用いた相同組換え、もしくは遺伝子はさみ（engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9）を用いたゲノム編集、及び／又は（ｂ）紫外線や放射線などの光及び／もしくは化学物質処理により誘導することができるが、これらに限定されるものではない。前記遺伝子の一部又は全部の改変方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法が含まれる。例えば、標的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列又はベクターを前記微生物に導入して相同組換え（homologous recombination）を起こすことにより遺伝子の一部又は全部の欠失が行われる。この導入されるヌクレオチド配列又はベクターは、優性選択マーカーを含むものであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0073】
本出願の他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属組換え微生物を培地で培養するステップを含むＬ－アルギニン製造方法を提供する。
【0074】
配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、弱化、微生物などについては前述した通りである。
【0075】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムであるが、これに限定されるものではない。
【0076】
前記微生物は、アルギニンリプレッサー（ArgR）活性がさらに弱化されたものであるか、ａｒｇＲ遺伝子がさらに欠失したものであるが、これらに限定されるものではなく、これらについては前述した通りである。
【0077】
本出願における「培養」とは、本出願のコリネバクテリウム属微生物を適宜調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び／又は流加培養であるが、これらに限定されるものではない。
【0078】
本出願における「培地」とは、本出願のコリネバクテリウム属微生物を培養するために必要な栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質や発育因子などを供給するものである。具体的には、本出願のコリネバクテリウム属微生物の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられる培地であればいかなるものでもよく、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願のコリネバクテリウム属微生物を培養することができる。
【0079】
具体的には、コリネバクテリウム属微生物の培養培地は、非特許文献１８に開示されている。
【0080】
本出願における前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコースや殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【0081】
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【0082】
前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができ、それ以外に、アミノ酸、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを用いることができる。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加することができる。しかし、これらに限定されるものではない。
【0083】
また、本出願のコリネバクテリウム属微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加し、培地のｐＨを調整してもよい。さらに、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。さらに、培地の好気状態を維持するために、培地中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。
【0084】
本出願の培養において、培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃に維持し、約１０～１６０時間培養するが、これらに限定されるものではない。
【0085】
本出願の培養により作製されたＬ－アルギニンは、培地中に分泌されるか、細胞に残留する。
【0086】
本出願のＬ－アルギニン製造方法は、本出願のコリネバクテリウム属微生物を準備するステップ、前記微生物を培養するための培地を準備するステップ、又はそれらの組み合わせ（任意の順序，in any order）を、例えば前記培養するステップの前にさらに含んでもよい。
【0087】
本出願のＬ－アルギニン生産方法は、前記培養に用いた培地（培養が行われた培地）又は培養に用いた培地のコリネバクテリウム属微生物からＬ－アルギニンを回収するステップをさらに含んでもよい。前記回収するステップは、前記培養するステップの後にさらに含んでもよい。
【0088】
前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば回分、連続、流加培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて目的とするＬ－アルギニンを回収（collect）するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又はそれらの組み合わせが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするＬ－アルギニンを回収することができる。
【0089】
また、本出願のＬ－アルギニン生産方法は、精製ステップをさらに含んでもよい。前記精製は、当該技術分野で公知の好適な方法により行うことができる。例えば、本出願のＬ－アルギニン生産方法が回収ステップと精製ステップの両方を含む場合、前記回収ステップと前記精製ステップは、順序に関係なく連続的又は非連続的に行ってもよく、同時に又は１つのステップとして統合して行ってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0090】
本出願のさらに他の態様は、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属微生物、それを培養した培地、又はそれらの組み合わせを含むＬ－アルギニン製造用組成物を提供する。
【0091】
本出願の組成物は、アミノ酸生産用組成物に通常用いられる任意の好適な賦形剤をさらに含んでもよい。このような賦形剤としては、例えば保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0092】
本出願の組成物において、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、弱化、微生物、培養、培地などについては前述した通りである。
【0093】
本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性を弱化させるステップを含む、コリネバクテリウム属微生物の製造方法を提供する。
【0094】
本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属微生物のＬ－アルギニン生産への使用を提供する。
【0095】
前記コリネバクテリウム属微生物の製造方法、及びコリネバクテリウム属微生物のＬ－アルギニン生産への使用における、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、弱化、微生物などについては前述した通りである。
【実施例】
【0096】
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示する好ましい実施形態にすぎず、本出願がこれらに限定されるものではない。なお、本明細書に記載されていない技術的な事項は、本出願の技術分野又は類似技術分野における熟練した技術者が十分に理解し、容易に実施することのできるものである。
【実施例1】
【0097】
トランスポゾンを用いたランダム突然変異ライブラリーの作製及びスクリーニング
Ｌ－アルギニン生産能が向上した菌株を得るために、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（特許文献１）を親株とし、ＥＺ－Ｔｎ５ＴＭ＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ／ＫＡＮ－２＞Ｔｎｐ ＴｒａｎｓｐｏｓｏｍｅＴＭ Ｋｉｔ（Epicentre）を用いて得たプラスミドを電気パルス法（非特許文献１９）で形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）含有複合平板培地に塗抹して約２０，０００個のコロニーを確保した。
＜複合平板培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１０ｇ，ペプトン１０ｇ，Ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，酵母抽出物５ｇ，Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ １８．５ｇ，ＮａＣｌ ２．５ｇ，尿素２ｇ，ソルビトール９１ｇ，寒天２０ｇ（蒸留水１リットル中）
Ｌ－アルギニン生産能が向上した菌株を得るために、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（特許文献１）を親株とし、ＥＺ－Ｔｎ５ＴＭ＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ／ＫＡＮ－２＞Ｔｎｐ ＴｒａｎｓｐｏｓｏｍｅＴＭ Ｋｉｔ（Epicentre）を用いて得たプラスミドを電気パルス法（非特許文献１９）で形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）含有複合平板培地に塗抹して約２０，０００個のコロニーを確保した。
＜複合平板培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１０ｇ，ペプトン１０ｇ，Ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，酵母抽出物５ｇ，Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ １８．５ｇ，ＮａＣｌ ２．５ｇ，尿素２ｇ，ソルビトール９１ｇ，寒天２０ｇ（蒸留水１リットル中）
【0098】
ニンヒドリン法（非特許文献２０）を用いて、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ菌株に比べてＬ－アルギニン生産能が向上した上位７種の突然変異株を選択した。
【実施例2】
【0099】
選択したランダム突然変異株のＬ－アルギニン生産能の分析
実施例１で選択した７種の突然変異株を対象に、再現性のあるＬ－アルギニン生産能向上を示す菌株を最終選択するために、次の培地を用いたフラスコ培養を行った。培養終了後に、ＨＰＬＣを用いて培養液中のＬ－アルギニン濃度を分析した。各突然変異株のＬ－アルギニン生産濃度を表１に示す。
＜生産培地（ｐＨ７．２）＞
グルコース６０ｇ，硫酸アンモニウム４５ｇ，硫酸マグネシウム７水和物２ｇ，リン酸二水素カリウム２ｇ，塩化アンモニウム１０ｇ，ビオチン０．０１ｍｇ，チアミンＨＣｌ ０．１ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ，硫酸第一鉄１０ｍｇ，硫酸マンガン１０ｍｇ，硫酸亜鉛０．０２ｍｇ，硫酸銅０．５ｍｇ，炭酸カルシウム３０ｇ（蒸留水１リットル中）
実施例１で選択した７種の突然変異株を対象に、再現性のあるＬ－アルギニン生産能向上を示す菌株を最終選択するために、次の培地を用いたフラスコ培養を行った。培養終了後に、ＨＰＬＣを用いて培養液中のＬ－アルギニン濃度を分析した。各突然変異株のＬ－アルギニン生産濃度を表１に示す。
＜生産培地（ｐＨ７．２）＞
グルコース６０ｇ，硫酸アンモニウム４５ｇ，硫酸マグネシウム７水和物２ｇ，リン酸二水素カリウム２ｇ，塩化アンモニウム１０ｇ，ビオチン０．０１ｍｇ，チアミンＨＣｌ ０．１ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ，硫酸第一鉄１０ｍｇ，硫酸マンガン１０ｍｇ，硫酸亜鉛０．０２ｍｇ，硫酸銅０．５ｍｇ，炭酸カルシウム３０ｇ（蒸留水１リットル中）
【0100】
【表1】
【0101】
選択した１０種の変異株から、Ｌ－アルギニン生産能が有意に向上した菌株としてＫＣＣＭ１０７４１Ｐ／ｍｔ－７を最終選択した。
【実施例3】
【0102】
最終選択株におけるＬ－アルギニン生産能向上の原因解明
実施例２のＫＣＣＭ１０７４１Ｐ／ｍｔ－７において、トランスポゾンのランダムな挿入により不活性化された遺伝子を同定した。
実施例２のＫＣＣＭ１０７４１Ｐ／ｍｔ－７において、トランスポゾンのランダムな挿入により不活性化された遺伝子を同定した。
【0103】
具体的には、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ／ｍｔ－７のＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを抽出して切断し、その後連結して大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）含有ＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換された２０種のコロニーを選択し、その後未知の遺伝子の一部を含むプラスミドを得て、ＥＺ－Ｔｎ５ＴＭ＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ／ＫＡＮ－２＞ Ｔｎｐ ＴｒａｎｓｐｏｓｏｍｅＴＭ Ｋｉｔのプライマー１（配列番号３）及びプライマー２（配列番号４）を用いて核酸塩基配列を分析した。その結果、米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH Genbank）に報告されている核酸塩基配列に基づいて、配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子が不活性化されていることが確認された。
【0104】
【表2】
【0105】
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９において配列番号２をｂｌａｓｔ ｓｅａｒｃｈしたところ、ＮＣｇｌ１４６９遺伝子であることが確認された。
【実施例4】
【0106】
ＮＣｇｌ１４６９遺伝子を欠失させる組換えベクターの作製
ＮＣｇｌ１４６９遺伝子の不活性化がＬ－アルギニン生産に及ぼす影響を再確認するために、コリネバクテリウム属菌株の染色体上においてＮＣｇｌ１４６９遺伝子を欠失させる組換えベクターを作製した。
ＮＣｇｌ１４６９遺伝子の不活性化がＬ－アルギニン生産に及ぼす影響を再確認するために、コリネバクテリウム属菌株の染色体上においてＮＣｇｌ１４６９遺伝子を欠失させる組換えベクターを作製した。
【0107】
まず、前記遺伝子を欠失させる断片を作製するために、プライマー３～６を合成した。それを表３に示す。
【0108】
【表3】
【0109】
配列番号２に基づいてＯＲＦ部分を欠失させるベクターを作製するために、配列番号５と配列番号６のプライマー対、及び配列番号７と配列番号８のプライマー対を用いて、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９ｇＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ここで、ＰＣＲの条件は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間の重合反応を行うものとした。このようにして得られた２つの断片の混合物を鋳型とし、配列番号５と配列番号８のプライマー対を用いて、再びオーバーラップ（overlapping）ＰＣＲを行って断片を得た。ＰＣＲは、９４℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間を３０サイクル行い、次いで７２℃で５分間行うものとした。ｐＤＣＭ２ベクター（特許文献５）は、ｓｍａＩで処理し、前述したように得られたＰＣＲ産物をフュージョンクローニングした。フュージョンクローニングは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤクローニングキット（Clontech）を用いて行った。クローニングの結果として得られたプラスミドをｐＤＣＭ２－△ＮＣｇｌ１４６９と命名した。
【実施例5】
【0110】
ＮＣｇｌ１４６９遺伝子が欠失した菌株の作製及びＬ－アルギニン生産能の評価－１
ｐＤＣＭ２－△ＮＣｇｌ１４６９を用いて、染色体上での相同組換えによりＬ－アルギニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐを形質転換した（非特許文献１３）。
ｐＤＣＭ２－△ＮＣｇｌ１４６９を用いて、染色体上での相同組換えによりＬ－アルギニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐを形質転換した（非特許文献１３）。
【0111】
その後、４％のスクロースを含む固体平板培地において２次組換えを行った。２次組換えが終了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー３とプライマー６を用いたＰＣＲ法により、染色体上で配列番号２の遺伝子が欠失した菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－△ＮＣｇｌ１４６９と命名した。
【0112】
前述したように作製したコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－△ＮＣｇｌ１４６９菌株のＬ－アルギニン生産能を分析するために、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ菌株と共に次の方法で培養した。
【0113】
次の種培地２５ｍｌを入れた２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１ＰとＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－△ＮＣｇｌ１４６９を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを入れた２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．２）＞
グルコース２０ｇ，硫酸アンモニウム４５ｇ，硫酸マグネシウム７水和物２ｇ，リン酸二水素カリウム２ｇ，塩化アンモニウム１０ｇ，ビオチン０．０１ｍｇ，チアミンＨＣｌ ０．１ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ，硫酸第一鉄１０ｍｇ，硫酸マンガン１０ｍｇ，硫酸亜鉛０．０２ｍｇ，硫酸銅０．５ｍｇ（蒸留水１リットル中）。
＜生産培地（ｐＨ７．２）＞
グルコース６０ｇ，硫酸アンモニウム４５ｇ，硫酸マグネシウム７水和物２ｇ，リン酸二水素カリウム２ｇ，塩化アンモニウム１０ｇ，ビオチン０．０１ｍｇ，チアミンＨＣｌ ０．１ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ，硫酸第一鉄１０ｍｇ，硫酸マンガン１０ｍｇ，硫酸亜鉛０．０２ｍｇ，硫酸銅０．５ｍｇ，炭酸カルシウム３０ｇ（蒸留水１リットル中）。
＜種培地（ｐＨ７．２）＞
グルコース２０ｇ，硫酸アンモニウム４５ｇ，硫酸マグネシウム７水和物２ｇ，リン酸二水素カリウム２ｇ，塩化アンモニウム１０ｇ，ビオチン０．０１ｍｇ，チアミンＨＣｌ ０．１ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ，硫酸第一鉄１０ｍｇ，硫酸マンガン１０ｍｇ，硫酸亜鉛０．０２ｍｇ，硫酸銅０．５ｍｇ（蒸留水１リットル中）。
＜生産培地（ｐＨ７．２）＞
グルコース６０ｇ，硫酸アンモニウム４５ｇ，硫酸マグネシウム７水和物２ｇ，リン酸二水素カリウム２ｇ，塩化アンモニウム１０ｇ，ビオチン０．０１ｍｇ，チアミンＨＣｌ ０．１ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ，硫酸第一鉄１０ｍｇ，硫酸マンガン１０ｍｇ，硫酸亜鉛０．０２ｍｇ，硫酸銅０．５ｍｇ，炭酸カルシウム３０ｇ（蒸留水１リットル中）。
【0114】
培養終了後に、ＨＰＬＣ（Waters 2478）によりＬ－アルギニン生産能を測定した。それを表４に示す。
【0115】
【表4】
【0116】
その結果、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ－βは親株に比べてＬ－アルギニン生産能が平均１９．８％向上することが確認された。
【実施例6】
【0117】
ＮＣｇｌ１４６９遺伝子が欠失した菌株の作製及びＬ－アルギニン生産能の評価－２
Ｌ－アルギニンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカム菌株においても実施例５と同じ効果があるか否かを確認した。
Ｌ－アルギニンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカム菌株においても実施例５と同じ効果があるか否かを確認した。
【0118】
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム野生株（ＡＴＣＣ１３８６９）に１種の変異（ａｒｇＲ遺伝子欠失，以下△ａｒｇＲという）を導入し、Ｌ－アルギニンを生産する菌株を作製した。
【0119】
△ａｒｇＲのための組換えベクターは、実施例４の組換えベクター作製方法と同様に作製した。ベクター作製に用いたプライマーを表５に示す。
【0120】
【表5】
【0121】
ＰＣＲにより前記標的遺伝子が挿入されたプラスミドを選択した。そのプラスミドをｐＤＣＭ２－△ａｒｇＲと命名した。ｐＤＣＭ２－△ａｒｇＲを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカム野生株ＡＴＣＣ１３８６９を実施例５と同様に形質転換し、形質転換株を対象に、プライマー７とプライマー１０を用いたＰＣＲ法により、染色体上でａｒｇＲが欠失した菌株を確認し、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ１Ｒと命名した。前記コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ１Ｒを対象に、実施例５と同様にＮＣｇｌ１４６９遺伝子が欠失した菌株を作製し、ＣＪ１Ｒ－△ＮＣｇｌ１４６９と命名した。
【0122】
前記ＣＪ１Ｒ－△ＮＣｇｌ１４６９を実施例５と同様に培養し、培養終了後に、ＨＰＬＣ（Waters 2478）によりＬ－アルギニン生産能を測定した。それを表６に示す。
【0123】
【表6】
【0124】
その結果、ＣＪ１Ｒ－βは親株ＣＪ１Ｒに比べてＬ－アルギニン生産能が平均１９．７％向上することが確認された。
【0125】
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【配列表】
【国際調査報告】