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特表2024-534650細胞外シクロフィリン阻害剤及びその使用

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-20

(54)【発明の名称】細胞外シクロフィリン阻害剤及びその使用

(51)【国際特許分類】

C07K 7/64 20060101AFI20240912BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20240912BHJP

A61P 31/12 20060101ALI20240912BHJP

A61P 3/00 20060101ALI20240912BHJP

A61P 29/00 20060101ALI20240912BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240912BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20240912BHJP

A61P 21/00 20060101ALI20240912BHJP

A61P 9/00 20060101ALI20240912BHJP

A61P 3/04 20060101ALI20240912BHJP

A61P 3/10 20060101ALI20240912BHJP

A61K 38/12 20060101ALI20240912BHJP

【ＦＩ】

C07K7/64 ZNA

A61P43/00 111

A61P31/12

A61P3/00

A61P29/00

A61P35/00

A61P25/00

A61P21/00

A61P9/00

A61P3/04

A61P3/10

A61K38/12

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024519104

(86)(22)【出願日】2021-09-28

(85)【翻訳文提出日】2024-05-27

(86)【国際出願番号】 CN2021121201

(87)【国際公開番号】W WO2023050037

(87)【国際公開日】2023-04-06

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514104645

【氏名又は名称】北京大学深▲ヂェン▼研究生院

【氏名又は名称原語表記】ＰＥＫＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＳＨＥＮＺＨＥＮＧＲＡＤＵＡＴＥＳＣＨＯＯＬ

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】全軍民

(72)【発明者】

【氏名】楊震

(72)【発明者】

【氏名】劉思宇

(72)【発明者】

【氏名】張慶舟

(72)【発明者】

【氏名】胡敏強

(72)【発明者】

【氏名】李鳳霞

(72)【発明者】

【氏名】付佳苗

(72)【発明者】

【氏名】朱振東

(72)【発明者】

【氏名】李勤凱

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA18

4C084BA24

4C084BA32

4C084CA59

4C084MA17

4C084MA23

4C084MA35

4C084MA37

4C084MA41

4C084MA43

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA57

4C084MA58

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA011

4C084ZA012

4C084ZA361

4C084ZA362

4C084ZA701

4C084ZA702

4C084ZA941

4C084ZA942

4C084ZB111

4C084ZB112

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB331

4C084ZB332

4C084ZC021

4C084ZC022

4C084ZC211

4C084ZC212

4C084ZC351

4C084ZC352

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA15

4H045BA16

4H045BA30

4H045CA15

4H045EA20

4H045FA10

(57)【要約】

本発明は、生物医学分野に属し、具体的に、細胞外シクロフィリン阻害剤及びその使用に関する。本発明の細胞外シクロフィリン阻害剤の構造式は、式（Ｉ）に示される。本発明は、新しいシクロスポリン誘導体の側鎖に血液アルブミン上の特異的部位のシステインのチオール基と反応可能な基を導入し、体内に入ると迅速に薬物複合体を形成ことによって、薬物を細胞外に効果的に制限し、細胞外シクロフィリンを標的として抑制することができ、これによって、これに関連する疾患を治療する目的が達成される。
【化１】

【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（Ｉ）で表される構造を有する細胞外シクロフィリン阻害剤。

【化1】

（式中、Ｒ_１は、－ＣＨ＝ＣＨＲ_１’又は－ＣＨ_２ＣＨ_２Ｒ_１’であり、
Ｒ_１’は、アルキル基、カルボキシル基、アセトアミド基又はフェニル基から選択され、
Ｒ_２は、Ｈ、ＳＲ_２’、ＣＨ_２ＳＲ_２’又はＣＨ_２ＯＲ_２’であり、ここで、Ｒ_２’は、アルキル基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アセトアミド基又はフェニル基から選択され、
リンカーは、－（ＣＨ_２）_ｘ－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｙ－又は－（ＣＨ_２）_ｘ－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｙ－から選択され、ここで、ｘは１－４の整数であり、ｙは１－６の整数である。）

【請求項2】

Ｒ_１’は、－ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＯＯＨ、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３、－フェニル基又はシクロアルキル基から選択され、ここで、ｎは１－６の整数であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞外シクロフィリン阻害剤。

【請求項3】

前記フェニル基は、－ＣＯＯＣＨ_３及び／又は－ＣＨ_２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３によって１回以上置換されていることを特徴とする、請求項２に記載の細胞外シクロフィリン阻害剤。

【請求項4】

前記シクロアルキル基は、シクロプロピル基であることを特徴とする、請求項２又は３に記載の細胞外シクロフィリン阻害剤。

【請求項5】

Ｒ_２’は、－ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＯＯＨ、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＨ、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３、－フェニル基又はシクロアルキル基から選択され、ｎは１－６の整数であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞外シクロフィリン阻害剤。

【請求項6】

前記フェニル基は、－ＣＯＯＣＨ_３及び／又は－ＣＨ_２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３によって１回以上置換されていることを特徴とする、請求項５に記載の細胞外シクロフィリン阻害剤。

【請求項7】

Ｒ_１は、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ_３であり、Ｒ_２は、Ｈであり、リンカーは、－（ＣＨ_２）_ｘ－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｙ－又は－（ＣＨ_２）_ｘ－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｙ－から選択され、ここで、ｘは１－４の整数であり、ｙは１－６の整数であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞外シクロフィリン阻害剤。

【請求項8】

Ｒ_１は、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ_３であり、Ｒ_２は、Ｈであり、リンカーは、－（ＣＨ_２）_ｘ－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｙ－であり、ここで、ｘは２又は３であり、ｙは３、４又は５であることを特徴とする、請求項１又は７に記載の細胞外シクロフィリン阻害剤。

【請求項9】

請求項１から８のいずれか１項に記載の細胞外シクロフィリン阻害剤及びその非毒性で薬学的に許容される塩を活性成分とする医薬組成物。

【請求項10】

シクロフィリン媒介疾患を予防又は治療するための薬物の調製における請求項１から８のいずれか１項に記載の細胞外シクロフィリン阻害剤の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物医学分野に属し、具体的に、細胞外シクロフィリン阻害剤及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

シクロフィリン（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎｓ，ＣｙＰｓ）は、自然界に広く分布し、高度に保存された多機能タンパク質ファミリーであり、免疫抑制薬シクロスポリン（ＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉNＡ，ＣｓＡ）の主な細胞内結合タンパク質として同定されている。シクロフィリンは、ペプチジルプロリルシス－トランスイソメラーゼ（ｐｅｐｔｉｄｙｌ－ｐｒｏｌｙｌｃｉｓ－ｔｒａｎｓｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＰＰＩａｓｅ）の活性及び分子シャペロン機能を有し、細胞内タンパク質の正確なフォールディングを補助し、免疫抑制に関与し、炎症反応を媒介し、酸化ストレス応答などの様々な生物学的機能に関与することができる。シクロフィリンは、主に細胞質に位置し、多くの生命プロセスにおいて重要な役割を果たしている。酸化ストレス状態又は炎症環境下で、シクロフィリンＡ（ＣｙｃｌｏｐｈｉｌｉNＡ，ＣｙｐＡ）は、小胞輸送を通じて細胞外に分泌されて細胞外ＣｙｐＡ（ｅＣｙｐＡ）を形成し、次いで膜受容体と結合し、標的細胞においてシグナル伝達応答を開始し、好中球、好酸球、Ｔ細胞などの免疫細胞を走化させ、免疫応答及び炎症反応を媒介することができ、様々な炎症関連疾患と密接に関係している。ＣｙｐＡは、細胞内外の分布に応じて異なる役割を果たしている。

【0003】

細胞外シクロフィリンは、多くの重篤な疾患において重要な役割を果たすと考えられている。慢性的な炎症の状態では、単球、血管平滑筋細胞及び内皮細胞は、ＲＯＳ及び炎症によって刺激されると、小胞により大量の細胞外シクロフィリンを細胞外に分泌する。細胞外に分泌されたシクロフィリンは、膜タンパク質と相互作用してＥＲＫ１／２、ＡＫＴ、ＪＡＫ、ＮＦ－ＫＢ及びＪＮＫの活性化を刺激し、ひいてはＲＯＳ及び炎症をさらに増幅させ、単球及びマクロファージがＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－８を分泌するように誘導することができる。それは、マトリックスメタロプロテイナーゼＭＭＰ－２及びＭＭＰ－９を活性化させ、血管平滑筋細胞の増殖と遊走を促進することができる。細胞外シクロフィリンは、これらの経路の作用下で腫瘍の増殖と遊走、インスリン抵抗性、心血管疾患、神経変性病変などの種々の疾患過程を媒介する。細胞外シクロフィリンは、上記の様々な慢性炎症条件下でアップレギュレーションされた状態にあり、がん、関節リウマチ、呼吸器炎症、糖尿病、高血圧、心血管疾患、狼瘡、皮膚疾患、ドライアイ、腸疾患、脂質代謝異常、老化などの疾患の発症・進行において重要な役割を果たすことが実証されている。シクロフィリンの阻害剤は、広い治療範囲（例えば、感染症、喘息、肺炎、心血管疾患、糖尿病、関節炎、皮膚炎、乾癬、多発性硬化症、腫瘍、アルツハイマー病の治療、及び毛髪成長促進、免疫反応抑制など）を有すると報告されている。したがって、シクロフィリンの阻害剤は、重要な薬物となっている。

【0004】

シクロスポリン（ＣｓＡ）は、最初に発見された天然シクロフィリン阻害剤であり、細胞内ＣｙｐＡと複合体を形成してＮＦＡＴに対するカルシニューリンの脱リン酸化を阻害することによりＴ細胞の活性化を阻害し、免疫抑制作用を発揮し、臓器移植、自己免疫疾患などに幅広く使用されている。ＣｓＡは、細胞外と細胞内両方のシクロフィリン機能を阻害できるため、様々な炎症疾患にも使用されている。しかし、細胞外シクロフィリンに対する特定の細胞外作用を得るのに、細胞内に遊走する分子の「損失」を補うためにより高い用量が必要とされる場合が多い。しかし、細胞内シクロフィリンの多くの重要な機能のため、高用量ＣｓＡによる毒性、特に、膵島損傷、肝臓毒性及び腎臓毒性によって、その発展は大幅に制限されている。そのため、所望の治療効果を奏するとともに細胞に入らない細胞外シクロフィリン類を阻害する化合物を開発できれば、これらの望ましくない副作用は回避することができる。

【0005】

従来技術において、分泌型細胞外シクロフィリンを標的とすることにより呼吸器及び心血管疾患のような炎症を効果的に減少させることができる。ＣｓＡにカルボキシベンゾイミダゾールを導入して改質した分子ＭＭ２８４は、分子の親水性が向上するとともに細胞を透過しないことから、その作用が細胞外のシクロフィリンを制限し、免疫細胞の遊走を効果的に抑制し、これによって炎症を減少させることができる。類似の分子にはＭＭ２１８がさらに含まれる。ＣｓＡにローダミン側鎖を導入することにより、細胞への進入が阻止され、肺の炎症が減少し、哮喘が改善される。しかし、このような基は多剤耐性送達システムと作用できるため、副作用を引き起こす可能性がある。また、このような純粋に化学修飾されたＣｓＡは、負帯電基により細胞への進入が回避されるが、親水性の向上が体内での蓄積が減り、腎臓から速やかに排泄され、代謝が比較的速いことで長期効果を発揮しにくいという顕著な問題が残っている。

【発明の概要】

【0006】

本発明の目的は、細胞外シクロフィリン阻害剤４ＭＣｓＡを提供することである。

【0007】

本発明の別の目的は、上記化合物４ＭＣｓＡの使用を提供することである。

【0008】

本発明の具体的な実施形態に係る細胞外シクロフィリン阻害剤は、その構造が下式（Ｉ）で表される。

【0009】

【化1】

式中、Ｒ_１は、－ＣＨ＝ＣＨＲ_１’又は－ＣＨ_２ＣＨ_２Ｒ_１’であり、Ｒ_１’は、アルキル基、カルボキシル基、アセトアミド基又はフェニル基から選択され、
Ｒ_２は、Ｈ、ＳＲ_２’、ＣＨ_２ＳＲ_２’又はＣＨ_２ＯＲ_２’であり、ここで、Ｒ_２’は、アルキル基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、アセトアミド基又はフェニル基から選択され、
リンカーは、－（ＣＨ_２）_ｘ－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｙ－又は－（ＣＨ_２）_ｘ－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｙ－から選択され、ここで、ｘは１－４の整数であり、ｙは１－６の整数である。

【0010】

本発明の具体的な実施形態に係る細胞外シクロフィリン阻害剤において、Ｒ_１’は、－ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＯＯＨ、－（ＣＨ_２）ｎ－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３、－フェニル基又はシクロアルキル基から選択され、ここで、ｎは１－６の整数であり、即ち、ｎは１、２、３、４、５又は６であり、
前記フェニル基は、－ＣＯＯＣＨ_３及び／又は－ＣＨ_２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３によって１回以上置換されており、
前記シクロアルキル基は、好ましくはシクロプロピル基である。

【0011】

本発明の具体的な実施形態に係る細胞外シクロフィリン阻害剤において、Ｒ_２’は、－ＣＨ_３、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＯＯＨ、－（ＣＨ_２）_ｎ－ＯＨ、－（ＣＨ_２）ｎ－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３、－フェニル基又はシクロアルキル基から選択され、ｎは１－６の整数であり、前記フェニル基は、－ＣＯＯＣＨ_３及び／又は－ＣＨ_２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３によって１回以上置換されている。

【0012】

本発明における「アルキル基」は、飽和炭化水素基、即ち、アルカン分子から水素原子が１つ欠けて形成された炭化水素基であって、炭素原子と水素原子のみを含む鎖状の有機基である。本発明に適用されるアルキル基は、メチル基ＣＨ_３－、エチル基ＣＨ_３ＣＨ_２－、ＣＨ_３ＣＨ_２ＣＨ_２－などを含むが、これらに限定されない。

【0013】

本明細書において、用語「シクロアルキル基」は、炭素数３から１２の飽和の単環式、二環式、三環式又は多環式炭化水素基を含み、そのうち、置換反応が発生可能な任意の環原子が置換基で置換されていてもよい。シクロアルキル基の例は、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロヘキシル基を含むが、これらに限定されない。

【0014】

本発明の具体的な実施形態に係る細胞外シクロフィリン阻害剤において、Ｒ_１は、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ_３であり、Ｒ_２は、Ｈであり、リンカーは、－（ＣＨ_２）_ｘ－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｙ－又は－（ＣＨ_２）_ｘ－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｙ－から選択され、ここで、ｘは１－４の整数であり、ｙは１－６の整数である。
好ましくは、Ｒ_１は、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ_３であり、Ｒ_２は、Ｈであり、リンカーは、－（ＣＨ_２）_ｘ－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｙ－であり、ここで、ｘは２又は３であり、ｙは３、４又は５であり、
より好ましくは、Ｒ_１は、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ_３であり、Ｒ_２は、Ｈであり、リンカーは、－（ＣＨ_２）_３－ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）－（ＣＨ_２）_５－である。

【0015】

本発明によれば、細胞外シクロフィリン阻害剤及びその非毒性で薬学的に許容される塩を活性成分とする医薬組成物がさらに提供される。

【0016】

用語「薬学的に許容される塩」とは、本発明の化合物の生物的有効性及び特性を保持する塩であって、生物学的又はその他の点で非理想的ではないものを指す。多くの例において、本発明の化合物は、アミノ基及び／若しくはカルボキシル基又は類似の基の存在により酸性塩及び／又は塩基性塩を形成することができる。薬学的に許容される酸付加塩は、無機又は有機酸で調製することができる。薬学的に許容される塩基付加塩は、無機又は有機塩基で調製することができる。薬学的に許容される塩については、Ｂｅｒｇｅらの（（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｄ，ｖｏｌ．６６，１）に記載されている。「非毒性で薬学的に許容される塩」とは、非毒性ありかつ薬学的に許容される無機若しくは有機酸又は無機若しくは有機塩基で形成された非毒性の塩を指す。例えば、上記塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、硝酸などの無機酸に由来する塩、及び酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、無水ｐ－アミノベンゼンスルホン酸、フマル酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸などの有機酸に由来する塩を含む。

【0017】

本発明の式（Ｉ）の化合物は単独で投与することができ、好ましくは、それらを医薬組成物として提供する。本発明に有用な上記の医薬組成物は、獣医学用又は人間用にも関わらず、上記の定義を有する少なくとも１種の式（Ｉ）の化合物、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、及び任意の他の治療成分を含む。

【0018】

いくつかの好ましい実施形態において、併用療法に必要な活性成分を単一の医薬組成物に組み込んで同時投与することができる。

【0019】

組成物、担体、希釈剤及び薬剤に言及する場合、用語「薬学的に許容される」及びその文法的変化は互換的に使用され、物質が吐き気、目眩、不安などの有害な生理学的影響を引き起こすことなく哺乳動物に投与され得ることを意味する。

【0020】

活性成分が溶解又は分散した医薬組成物の調製方法は、従来技術において既知のものであり、処方によりそれを限定する必要がない。通常、このような組成物は、液体溶液又は懸濁液として注射剤に調製されているが、使用前に液体中に溶解又は懸濁するのに適した固体形態に調製されてもよい。製剤は、乳化されたものであってもよい。特に、上記の医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉剤、糖丸剤又は顆粒剤などの固体剤形に製剤化することができる。

【0021】

通常、活性化合物の溶解性、化学的性質、投与形態、及び薬学的実践で遵守される規制に基づいて賦形剤の選択及び賦形剤中の活性成分の含有量を確定する。例えば、賦形剤（例えば、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム）と、崩壊剤（例えば、デンプン、アルギン酸及び特定の複合ケイ酸塩）と、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク）とを組み合わせて錠剤を調製することができる。カプセルの調製には、乳糖と高分子量ポリエチレングリコールの使用は有利である。水懸濁液を使用する場合、乳化剤又は懸濁促進剤を含んでもよい。スクロース、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン及びクロロホルム、又はその混合物などの希釈剤を使用してもよい。

【0022】

上記の医薬組成物は、適切な剤形で経口投与、直腸投与、経鼻投与、口腔内投与、眼内投与、舌下投与、経皮投与、直腸投与、局所投与、膣投与、非経口投与（皮下注射、動脈注射、筋肉注射、静脈注射、皮内注射、髄腔内注射、硬膜外注射を含む）、脳槽内投与及び腹腔内投与を含む局所投与又は全身投与によりヒト及び動物に使用することができる。なお、好ましい経路は、例えば、被験体の状況によって変化することができる。

【0023】

処方は、製薬分野で知られている任意の方法によって単位用量で調製することができる。このような方法は、活性成分と、１種又は複数種の助剤からなる担体とを結合させることを含む。通常、上記の処方は、将活性成分と、液体担体及び／又は極細固体担体とを均一かつ緊密に結合させることで調製され、その後、必要に応じて製品を成形する。本発明の化合物の１日の総用量は、単回又は複数回の用量で対象に投与される。

【0024】

本発明によれば、シクロフィリンに媒介される疾患を予防又は治療するための薬物の調製における上記の細胞外シクロフィリン阻害剤の使用がさらに提供される。シクロフィリンに媒介される疾患は、ａ）ウイルス感染、ｂ）代謝性疾患、ｃ）急性及び慢性炎症性疾患、ｄ）がん、ｅ）神経変性疾患、ｆ）退化性筋疾患、ｇ）心血管疾患、ｈ）肥満症、ｉ）糖尿病を含むが、これらに限定されない。

【0025】

本発明の有益な効果
本発明では、シクロフィリンの活性ポケット及び既知のＣｓＡ構造活性相関に基づいて、新しい４ＭＣｓＡ化合物が得られる。この４ＭＣｓＡ化合物は、アルバミンと効率的に反応した後、化合物の作用を細胞外に制限するとともに化合物の代謝時間を延長させ、特異性を向上させることができ、細胞外シクロフィリンの効果的な阻害剤である。この化合物又はその薬学的に許容される塩の形態は、細胞外シクロフィリンに結合することにより慢性炎症の拡大を抑制することができ、腫瘍、２型糖尿病及びアテローム性動脈硬化症などの様々な慢性炎症疾患において良好な治療効果を示している。

【図面の簡単な説明】

【0026】

本発明の実施例又は従来技術における技術的手段をより明確に説明するために、以下、実施例又は従来技術の説明に必要な図面を簡単に紹介する。明らかなように、以下に説明する図面は、本発明のいくつかの実施例に過ぎず、当業者であれば、これらの図面に基づいて創造的努力なしで他の図面を得ることができる。

【0027】

【図1】４ＭＣｓＡで修飾されたアルブミンのマススペクトルである。同図において、上図はＢＳＡ、下図はＢＳＡ－４ＭＣｓＡ複合体である。

【図2】ＢＳＡ上のＣｙｓｔｅｉｎｅ修飾部位に対する４ＭＣｓＡの鑑定結果を示す。同図において、上図はＢＳＡサンプルに対応するペプチド断片の２＋イオンであり、下図はＢＳＡ－４ＭＣｓＡに対応するペプチド断片の３＋イオンである。

【図3】ＣｓＡ、４ＭＣｓＡ及びチオフェノールでブロッキングした４ＭＣｓＡ（Ａｒ－Ｓ－４ＭＣｓＡ）のＥＩＣ図である。同図において、Ｉ．Ｆ．は細胞内抽出部分を示し、Ｅ．Ｓ．は標準品の曲線であり、曲線下面積は細胞内濃度を定量的に計算するために使用され、網掛け部分はＩ．Ｆ．曲線下面積である。

【図4】ＣｓＡ－ＦＩＴＣ蛍光標識Ｊｕｒｋａｔ細胞の競合フローサイトメトリーを示す図である。

【図5】４ＭＣｓＡ分子のインビトロ活性検証を示す。同図において、Ａは競合蛍光偏光法によりＣｙｐＡに対するＣｓＡ（●）、４ＭＣｓＡ（■）及びＢＳＡ－４ＭＣｓＡ（▲）の結合能力を測定することを示す。ＢはＣｓＡ（●）、４ＭＣｓＡ（■）及びＢＳＡ－４ＭＣｓＡ（▲）が用量依存性の方式でＣｙｐＡを抑制するシス－トランスイソメラーゼ活性を示す。Ｃは各阻害剤に対するＫ_ｉ及びＩＣ５０を示す。

【図6】４ＭＣｓＡ分子が免疫抑制活性を有しないことを示す。同図において、ＡはＷｅｓｔｅｒＮＢｌｏｔによりＪｕｒｋａｔ細胞において２５ｎＭＰＭＡ及び１ｍｇ／ｍＬイオノマイシンによって誘導されるＮＦＡＴ１の脱リン酸化に対する分子の抑制（分子量が下方に位置するバンド）を検出することを示し、ＢはＥＬＩＳＡによりＪｕｒｋａｔ細胞が活性化した後のＩＬ－２の分泌を検出することを示す。

【図7】細胞外ＣｙｐＡによって刺激された炎症及び単球遊走に対する４ＭＣｓＡの抑制を示す。同図において、ＡはＴＨＰ－１細胞におけるＩＬ－８の発現に対するＣｙｐＡの誘導を示し、ＴＨＰ－１細胞は１００ｎＭのＣｙｐＡで１２ｈ処理された後、ＩＬ－８のｍＲＮＡレベルが顕著に高くなり、４ＭＣｓＡ及びＣｓＡはいずれもこの効果を抑制することができる。ＢはＣｙｐＡによって誘導されるＴＨＰ－１細胞の遊走係数を示す。Ｃは、細胞遊走実験においてクリスタルバイオレットで染色したＴＨＰ－１細胞の代表図である。

【図8】ヒト腎臓細胞ＨＥＫ２９３に対するＣｓＡ及び４ＭＣｓＡの細胞毒性作用を示す。

【図9】Ｔ２ＤＭマウスモデルにおける疾患の状態及びＣｙｐＡ阻害剤の投与治療後の血清ＣｙｐＡ含有量を示す。

【図10】ＤＢマウス及びＨＦＤマウスにおける血糖に対する、尾静脈注射により投与された４ＭＣｓＡ及びＣＳＡの制御を示す。同図において、ａはＤＢマウスの空腹血糖であり、ｂはＣ５７マウスの空腹血糖であり、ｃはＤＢマウスの投与後の体重であり、ｄはＨＦＤ及びＤＢマウスに対応するＣ５７対照の体重であり、ｅはＨＦＤマウスの空腹血糖であり、ｆはＨＦＤのＨｂＡ１ｃに対する４ＭＣｓＡ及びＣｓＡ５ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋの制御である。

【図11】ＤＢマウスにおけるＧＴＴに対する異なる薬物及び用量の影響を示す。

【図12】ＨＦＤマウスにおける４ＭＣｓＡ及びＣｓＡ、並びにそれらを投与した後の異なる時間間隔でのＧＴＴに対する影響を示す。

【図13】インスリンに対するＣｓＡ及び４ＭＣｓＡの影響を示す。同図において、ａは投与後のＤＢマウスインスリンの基礎レベルを示し、ｂは投与後のブドウ糖刺激に応答するＤＢマウスのインスリン分泌を示す。

【図14】マウスＩＴＴ実験に対するＣｓＡ及び４ＭＣｓＡの影響を示す。同図において、ａ及びｃは投与後のＤＢマウスのＩＴＴを示し、ｂ及びｄはＣ５７マウスにおけるＩＴＴ応答を示し、ｅ及びｆは投与後のＨＦＤマウスのＩＴＴを示す。

【図15】投与後のＤＢマウスの血液中における炎症因子のレベルを示す。同図において、aはＩＬ１βのレベルであり、ｂはＣＲＰのレベルであり、ｃはＴＮＦ－αのレベルであり、ｄはＩＬ－６のレベルである。

【図16】投与後のＤＢマウスの肝毒性及び腎毒性の評価結果を示す。同図において、ａはアスパラギン酸アミノ基転移酵素ＡＳＴのレベルであり、ｂはアラニンアミノ基転移酵素ＡＬＴのレベルであり、Ｃは尿素のレベルであり、ｄはクレアチニンのレベルである。

【図17】腫瘍モデルマウスのインビボでの腫瘍体積の変化状況を示す。

【図18】腫瘍微小環境におけるＣＤ８^＋Ｔ細胞に対する４ＭＣｓＡの影響を示す。

【図19】高脂肪食によって誘導されたアテローム性動脈硬化症マウスの大動脈病変程度に対する４ＭＣｓＡの影響を示す。

【図20】高脂肪食によって誘導されたアテローム性動脈硬化症マウスの血清中のＣＲＰ含有量に対する４ＭＣｓＡの影響を示す。

【図21】高脂肪食によって誘導されたアテローム性動脈硬化症マウスの血清中の血中脂質プロフィール指標に対する４ＭＣｓＡの影響を示す。同図において、ａは血清総コレステロール（ＴＣ）の含有量であり、ｂは血清トリグリセリド（ＴＧ）の含有量であり、ｃはＬＤＬコレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）の含有量であり、ｄはＨＤＬコレステロール（ＨＤＬ－Ｃ）の含有量であり、ｅは総コレステロールとＨＤＬコレステロールとの含有量比（ＴＣ／ＨＤＬ－Ｃ）である。

【図22】高脂肪食によって誘導されたアテローム性動脈硬化症マウスの血清中のＡＬＴ、ＡＳＴ含有量に対する４ＭＣｓＡの長期注射の影響を示す。

【発明を実施するための形態】

【0028】

本発明の目的、技術的手段及び利点をより明確にするために、以下、本発明の技術的手段を詳しく説明する。以下の実施例は、本発明の実施例の一部であり、全ての実施例ではない。本発明の実施例に基づいて、当業者が創造的努力なしで得る全ての他の実施形態は、いずれも本発明の保護範囲に含まれる。

【0029】

本発明では、４位修飾マレイミド（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）によって修飾された４ＭＣｓＡを例とし、ＣｓＡの４位にマレイミド反応性基を導入してＢＳＡと共有結合反応することによって、分子を細胞外に制限する機能を実現することができる。

【0030】

細胞外ＣｙｐＡを選択的に標的とするために、従来の修飾（ＭＭ２８４）はシクロスポリンの１位の二重結合に負帯電基を導入して行われている。シクロスポリンの１位における二重結合の存在により、この位置での修飾は比較的に容易である。しかし、この位置は、シクロスポリンとシクロフィリンの結合部位でもあるため、比較的大きな基の導入に適していない。また、このようなＣｓＡアナログは、通常、血液循環において腎臓によって迅速に除去されるため、さらなる臨床応用が防がれる。シクロスポリンとシクロフィリンの結合形態において、Ｐ４位はシクロフィリンから遠い方向に位置し、理想的な修飾部位であるが、この位点での修飾は比較的困難であり、比較的複雑な合成経路が必要とされる。シクロスポリンは、複雑な天然産物分子として分子量が１０００Ｄａを超え、分離精製及び反応中の不純物の制御が比較的高い挑戦に直面している。そこで、現在、シクロスポリン誘導体とタンパク質をカップリングして薬物に適用する応用は、まだない。

【0031】

本発明では、シクロスポリンの４位をアルブミンにカップリングした活性生成物を得るために、シクロスポリンの４位にマイケル受容体の誘導体分子３及び８を導入し、シクロスポリン－アルブミンのカップリング及び活性検証作業に使用する。

【0032】

本発明では、４ＭＣｓＡの合成過程において、２ステップのカラムクロマトグラフィー精製のみが行われるため、操作の難しさが大幅に軽減され、収率が極めて高くなる。

【0033】

反応の合成経路は下記の通りである。

【化2】

【0034】

本発明の合成スキームは、２つの主なステップを含む。

【0035】

第１のステップは、ＣｓＡ（１）Ｐ３及びＰ４位から開環し、Ｐ４位のアミノ酸を脱離させるデカペプチド４の合成過程である。合成４の主要な課題はエドマン分解ステップである。多くの場合は、ウンデカペプチド（１ｂ）、デカペプチド（４）及びバリン欠失ノナペプチドの混合物が生成する。本発明では、過剰（２．０－５．０当量）なＰｈＮＣＳを１ａと十分に反応させ、その後、ＤＭＡＰＡで未反応のＰｈＮＣＳを捕捉する。このようにして、エドマン分解後の過剰なＤＭＡＰＡが洗浄されて高純度の中間体４が得られる。

【0036】

第２のステップは、デカペプチド４とアミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｎ－Ｍｅ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（５）をカップリングした後、ＮＭｅ４ＯＨでＦｍｏｃ、アセチル基を脱離させ、メチルエステルを加水分解し、最後にＨＡＴＵで大環化反応して環状ペプチド［ＭｅＬｙｓ（Ｂｏｃ）４］ＣｓＡ（６）を得ることである。

【0037】

トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の条件下で［ＭｅＬｙｓ（Ｂｏｃ）４］ＣｓＡ（６）からＢｏｃ保護を外して［ＭｅＬｙｓ４］－ＣｓＡを得た後、６－マレイミドカプロン酸－Ｎ－スクシンイミドエステル（７）とカップリングして４ＭＣｓＡ（３）を生成する。

【0038】

最終的に、ＣｓＡ（１）から１０ステップの反応及び２ステップのカラムクロマトグラフィー精製を経て３０％の総収率で４ＭＣｓＡ（３）を合成する。

【0039】

実施例１：線状デカペプチドの合成プロセス

【化3】

【0040】

ＣｓＡ（２４．０ｇ，２０ｍｍｏｌ，１．０当量）を無水酢酸（８０ｍＬ）とピリジン（８０ｍＬ）の混合物に溶解させた。０℃でＤＭＡＰ（０．８ｇ，６．５ｍｍｏｌ，０．３３当量）を加え、撹拌しながら一晩反応させた。ＬＣ／ＭＳ検出によりＣｓＡが完全に消耗したことを確認した後、反応液を氷浴に入れ、氷水（１００ｍＬ）を滴下して白色固体沈殿を析出させた。その後、濾過により白色固体を分離し、粗生成物をさらにＤＭＦ（７２ｍＬ）に溶解し、水（７２ｍＬ）を加えて沈殿を析出させた。洗浄、濾過及び乾燥を行った後、白色固体１ａ（２３．２ｇ，１８．６ｍｍｏｌ，９３％）を得た。Ｃ_６４Ｈ_１１３Ｎ_１１ＮａＯ_１３ ^＋（［Ｍ＋Ｎａ］^＋）のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：１２６６．８４１２；実測値：１２６６．８４４６。

【0041】

１ａ（３７．４ｇ，３０ｍｍｏｌ，１．０ｅｑｕｉｖ．）をＤＣＭ（３００ｍＬ）に溶解させ、トリメトキシテトラフルオロボレート（１３．３ｇ，９０ｍｍｏｌ，３．０当量）を加えた。２０時間反応させた後、アセトニトリル及び水を加え、さらに３時間反応させた。有機相を分層させ、１００ｍＬ／回で３回水洗した。その後、反応溶液を濃縮して真空乾燥させた。その後、白色結晶粉末を２－メチルテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）とメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（５０ｍＬ）の混合物中で結晶化して１ｂ（２９．９ｇ，２１．９ｍｍｏｌ，７３％）を形成した。Ｃ_６５Ｈ_１１８Ｎ_１１Ｏ_１４ ^＋（［Ｍ＋Ｈ］^＋）のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：１２７６．８８５４；実測値：１２７６．８８８２。

【化4】

【0042】

１ｂ（１３．７ｇ，１０．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、ＤＩＰＥＡ（６．６ｍＬ，４０ｍｍｏｌ，４．０ｅｑｕｉｖ．）及びイソチオシアン酸フェニル（４．１ｇ，３０ｍｍｏｌ，３．０ｅｑｕｉｖ．）を加え、撹拌しながら２．０時間反応させ、Ｎ，Ｎ－ジメチル－１，３－プロピレンジアミン（３．２ｍＬ，２５ｍｍｏｌ，２．５当量）を加え、引き続き撹拌して６０分間反応させた。その後、メタノール（６０ｍＬ）及び５０％ホウフッ化水素酸水溶液（２３ｇ，１３０ｍｍｏｌ）を加え、反応終了までＬＣＭＳにより検出した。ＤＣＭで反応液を希釈し、１ＮＨＣｌ及び塩水で洗浄した。有機相を合わせ、濃縮し、２－メチルテトラヒドロフラン（５０ｍＬ）とメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（２５ｍＬ）の混合溶液中で再結晶し、白色泡状生成物４（１１．２ｇ，９１％）を得た。Ｃ_５８Ｈ_１０５Ｎ_１０Ｏ_１３ ^＋（［Ｍ＋Ｈ］^＋）のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：１１４９．７８５７；実測値：１１４９．７９０２。

【0043】

実施例２：デカペプチドから４ＭＣｓＡまでの合成手順

【化5】

【0044】

４ａ：線状デカペプチド４（１．２０ｇ，０．９７ｍｍｏｌ，１．０ｅｑｕｉｖ．）を１０ｍＬ無水ＤＭＦ中に溶解させ、撹拌しながら引き続きアミノ酸Ｆｍｏｃ－Ｎ－Ｍｅ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ（５）（４６８ｍｇ，０．９７ｍｍｏｌ，１．０当量）及びＨＡＴＵ（７３７ｍｇ，１．９４ｍｍｏｌ，２．０当量）を加えた。反応溶液を氷浴で０℃に冷却した後、ＤＩＰＥＡ（０．６８ｍＬ，３．８８ｍｍｏｌ，４．０当量）を加え、室温下で一晩撹拌した。ＬＣＭＳ検出により反応終了を確認した後、１ＮＨＣｌ（１０ｍＬ）溶液を加えて反応混合物をクエンチし、得られた混合物をＤＣＭ（２×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。抽出液を真空濃縮し、残留物を１５ｍＬメタノールに溶解させた。４ａの特徴データ：Ｃ_８３Ｈ_１３５Ｎ_１２Ｏ_１７ ^＋［Ｍ＋Ｈ］^＋のＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：１５７２．０；実測値：１５７２．０。

【0045】

６：４ａのメタノール溶液に５ｍＬのＮＭｅ_４ＯＨ（２５％メタノール溶液）を加え、室温下で撹拌しながら反応させた。ＬＣＭＳ検出によりＰ１位のアセチル基及びＮ端Ｆｍｏｃが除去されたことを確認した後、０．５ｍＬ水を溶液に入れて３０分間撹拌することでＰ３位のメチルエステルを加水分解した。反応終了後、１ＮＨＣｌを加えてｐＨを５．０に調整することで反応をクエンチし、ＤＣＭで得られた混合物を抽出した。合わせた有機層を塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。真空下で抽出液の溶媒を濃縮して新たに２００ｍＬ無水ＤＣＭに溶解させた。その後、ＨＡＴＵ（１．３２ｇ，３．４７ｍｍｏｌ，３．８５当量）を撹拌した溶液に加えた。ＨＡＴＵが溶解した後、氷浴で０℃に冷却し、Ｎ－メチルモルホリン（０．７６ｍＬ，６．９４ｍｍｏｌ，７．７当量）を滴下した。ＬＣＭＳ検出により反応終了を確認した後、反応混合物を１ＮＨＣｌ、水及び塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで干燥させ、真空濃縮し、残留物をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィー（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝２０：１）により精製し、白色の６（９９２ｍｇ，７８％収率）を得た。

【0046】

６の特徴データ：１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．８８（ｄ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），３．４９（ｓ，３Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），３．２２（ｓ，３Ｈ），３．１２（ｓ，３Ｈ），３．０７（ｓ，３Ｈ），２．７２（ｓ），３Ｈ），２．６９（ｓ，３Ｈ）。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ_６７Ｈ_１２０Ｎ_１２ＮａＯ_１４ ^＋（［Ｍ＋Ｎａ］^＋）の計算値：１３３９．８９３９；実測値：１３３９．８９３７。

【0047】

４ＭＣｓＡ（３）：６（８９ｍｇ，６６．４ｍｏｌ，１．０当量）を２ｍＬのＤＣＭに溶解させた後、６５０ＬのＴＦＡを加え、３０分間撹拌した。その後、溶液を濃縮し、残留物をＤＣＭに溶解させ、水、飽和ＮａＨＣＯ_３及び塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空濃縮した。残留物を１．０ｍＬ無水ＤＣＭに溶解させた後、Ｎ－スクシンイミジル－６－マレイミドカプロン酸エステル（７）（３１ｍｇ，０．１ｍｍｏｌ，１．５当量）及びＥｔ_３Ｎ（２８μＬ，０．２ｍｍｏｌ，３．０当量）を加えた。溶液を一晩撹拌した。その後、１０ｍＬのＤＣＭで反応混合物を希釈し、１ＮＨＣｌ、水及び塩水で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、真空濃縮し、残留物をＨＰＬＣにより精製し、白色の４ＭＣｓＡ（３）（５８ｍｇ，４１．１μｍｏｌ，６２％収率）を得た。

【0048】

４ＭＣｓＡ（３）の特徴データ：ＨＰＬＣ精製法，勾配（７０％ＭｅＯＨ１０ｍｉｎ，７０％－１００％１０－２５ｍｉｎ，１００％２５－３５ｍｉｎ），Ｒｔ＝３２．６ｍｉｎ。１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ７．９１（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．５２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．２０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６８（ｓ，３Ｈ），３．４９（ｍ，６Ｈ），３．３６（ｓ，３Ｈ），３．２１（ｓ，６Ｈ），３．１２（ｓ，３Ｈ），３．０９（ｓ，３Ｈ），２．７１（ｓ，３Ｈ），２．６９（ｓ，３Ｈ）。Ｃ_７２Ｈ_１２３Ｎ_１３ＮａＯ_１５ ^＋［Ｍ＋Ｎａ］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：１４３２．９１５４，実測値１４３２．９１６５。

【0049】

実施例３：化合物８の合成

【化6】

【0050】

８ａ：化合物６からＴＦＡ条件下でＢｏｃ保護を外した生成物（５０ｍｇ，４１．０６μｍｏｌ）、９（２８．０３ｍｇ，８２．１３μｍｏｌ）及びＨＡＴＵ（３１．２３ｍｇ，８２．１３μｍｏｌ）を３ｍｌのＤＣＭに溶解させ、その後、撹拌しながらＤＩＰＥＡ（２１．２３ｍｇ，１６４．２５μｍｏｌ，２８．６１μＬ）を加え、一晩反応させた。カラムクロマトグラフィーにより精製して淡黄色固体生成物８ａ（５０ｍｇ，３２．４５μｍｏｌ，７９％収率）を得た。

【0051】

８：８ａ（１２ｍｇ，７．７９μｍｏｌ）をＭｅＯＨ（２ｍＬ）に溶解させ、その後、炭酸カリウム（２．１５ｍｇ，１５．５７μｍｏｌ，０．９４μＬ）を加え、室温下で原料が完全に添加したまで反応させた。回転蒸発により溶媒を除去した後、生成物をそのままＤＣＭに溶解させた。その後、１０（１．３７ｍｇ，１５．１７μｍｏｌ，１．２５μＬ）及びＤＩＰＥＡ（１．９６ｍｇ，１５．１７μｍｏｌ，２．６４μＬ）を加えた。反応終了後、抽出し、カラムクロマトグラフィーにより精製して生成物９（１０．３ｍｇ，７．４μｍｏｌ，９５％）を得た。

【0052】

４ＭＣｓＡ－２（８）の特徴データ：１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９７（ｄ，Ｊ＝９．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．４８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ）。Ｃ_６９Ｈ_１２１Ｎ_１３ＮａＯ_１５ ^＋［Ｍ＋Ｎａ］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：１３９４．８９９７，実測値１３９４．９００６。

【0053】

実施例４：ＣｓＡ－ＦＩＴＣプローブの合成経路

【化7】

【0054】

ＣｓＡ－ＦＩＴＣの特徴データ：ＨＰＬＣ法，勾配（３０％－１００％ＡＣＮ，０－２５ｍｉｎ），カラム温度７０℃，Ｒ_ｔ＝１６．９分間。Ｃ_９３Ｈ_１３４Ｎ_１４ＮａＯ_１９Ｓ^＋［Ｍ＋Ｎａ］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ計算値：１８０５．９５６３，実測値１８０５．９５３６。

【0055】

実施例５：４ＭＣｓＡとアルバミンの反応性の検証
分子とアルバミンの反応性は、インビトロ結合の後に、ＱＥｘａｃｔｉｖｅＨＦＸｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍＯＦｉｓｈｅｒ）質量分析計を用いてインタクトタンパク質法により測定された。

【0056】

インビトロで４ＭＣｓＡ：ＢＳＡ＝２：１の比率で室温で１時間反応させ、その後、限外濾過チューブを用いて遠心分離して過剰な分子及び塩を除去し、サンプルを逆相フェニルカラム（ＭＡｂＰａｃ，ＴｈｅｒｍＯＦｉｓｈｅｒ，０８８６４８）にかけ、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによりデータを採取し、ＢｉｏＰｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒソフトウェア（ＴｈｅｒｍＯＦｉｓｈｅｒ）を用いて原質量スペクトルのデコンボリューションによりインタクトタンパク質の質量を解析した。

【0057】

図１に示すように、４ＭＣｓＡによりアルブミンの分子量が１４１０Ｄａ増加し、これは、４ＭＣｓＡがアルブミンに効果的に共有結合し、化学量論比が１：１であり、良好な反応性を有することを示している。

【0058】

実施例６：４ＭＣｓＡとアルバミンシステインの反応位置の検証

【0059】

実施例４の複合体を取り、尿素で変性した後、トリプシン：タンパク質＝１：５０の比で希釈後のタンパク質サンプルに加え、３７℃で１８ｈ酵素加水分解した後、Ｃ_１８ＳｐｉＮＣｏｌｕｍｎｓ（ＴｈｅｒｍＯＦｉｓｈｅｒ）脱塩カラムを用いてペプチド断片サンプルから塩を除去し、溶出物を７０％アセトニトリルにより溶出した後、凍結乾燥させ、０．１％ギ酸水溶液で溶解させ、ＬＣ－ＥＳＩ－ＭＳによりペプチド断片を分析し、ＢｉｏＰｈａｒｍａＦｉｎｄｅｒソフトウェア（ＴｈｅｒｍＯＦｉｓｈｅｒ）を用いて修飾位置を分析した。

【0060】

図２に示すように、ｂｏｔｔｏｍ－ｕｐペプチド断片を同定した結果、４ＭＣｓＡ修飾ペプチド断片［Ｋ］．ＧＬＶＬＩＡＦＳＱＹＬＱＱｃＰＦＤＥＨＶＫ．［Ｌ］のペプチド指紋スペクトルを有し、Ｃｙｓ３４が４ＭＣｓＡ分子で修飾されたことを示している。４ＭＣｓＡ分子とＢＳＡの迅速かつ特異的な反応性は、その細胞膜非透過性に役に立っている。

【0061】

実施例７：高分解能質量スペクトルによるＪｕｒｋａｔ細胞に対する分子の膜透過性の測定
分子の透過性を直接測定するために、ＱＥ－Ｆｏｃｕｓ質量分析計を用いて細胞内の化合物濃度を外部標準法により定量した。

【0062】

１×１０^８のＪｕｒｋａｔ細胞を、５μＭのＣｓＡ、４ＭＣｓＡ及びチオフェノールでブロッキングした４ＭＣｓＡを含むＲＰＭＩ１６４０培地に加え、３７℃で２時間インキュベートした後、メタノールで細胞内の化合物成分を抽出して分析し、５μＭの対応する分子のメタノール溶液を外部標準として抽出液を質量分析した。対応する分子のｍ／ｚシグナルを選択してクロマトグラムをピーク抽出し、対応する分子で抽出したイオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を得た。その後、標準品及び細胞抽出物のＥＩＣ図の曲線下ピーク面積を用いて抽出物の濃度を定量した。結果を図３、表１に示す。

【0063】

表１：Ｊｕｒｋａｔ細胞内化合物の含有量

【表1】

【0064】

結果については、表１、図３に示すように、ＣｓＡは、細胞内に豊富なＣｙｐＡに結合し、細胞内に濃化作用が存在するため、細胞内のＣｓＡ濃度は細胞外よりも高かった（７．２μＭｖｓ５μＭ）。４ＭＣｓＡは、細胞内で検出されなかった。一方、疎水性のチオフェノールでブロッキングした４ＭＣｓＡは、細胞内により容易に入った。チオフェノールでブロッキングした４ＭＣｓＡ分子中のマレイミド基はチオフェノールと反応した後、アルブミンに結合できなくなるとともに、細胞膜透過性がＣｓＡよりも高く、これは、４ＭＣｓＡ中のマレイミド基が分子の細胞膜非透過性にとって非常に重要であることを示している。４ＭＣｓＡは、細胞外に効果的に制限された。

【0065】

実施例８：蛍光競合法によるＪｕｒｋａｔ細胞に対する分子の膜透過性の測定
ＣｓＡと４ＭＣｓＡの細胞膜透過性をさらに比較するために、本実施例において、細胞内ＣｙｐＡに結合するＣｓＡ－ＦＩＴＣ蛍光プローブを用い、フローサイトメトリーにより、競合法を用いて細胞内蛍光シグナルに対する化合物の影響を検出した。

【0066】

結果として、図４に示すように、ＣｓＡ－ＦＩＴＣは、細胞内のＣｙｐＡに効果的に結合するため、細胞に蛍光を標識することができ、ＣｓＡは細胞に入った後にＣｓＡ－ＦＩＴＣプローブと競合して細胞内のＣｙｐＡに結合し、これによって、蛍光細胞の割合が大幅に減少した（９５．３０％から６．７５％のレベル）。これに対し、４ＭＣｓＡは、細胞内蛍光シグナルに対する影響が非常に小さかった。

【0067】

実施例６の結果と合わせて、４ＭＣｓＡは、分子を細胞外に制限する作用を達成し、後で細胞外ｅＣｙｐＡを標的とする効果的な分子である。

【0068】

実施例９：ペプチジル－プロリル－シス／トランス－イソメラーゼ（ＰＰＩ酵素）に対する４ＭＣｓＡ及び複合体の結合能力の測定
蛍光偏光（ＦＰ）は、溶液系におけるリガンドと受容体の結合を測定する広く使用されている技術である。遊離状態の遊離蛍光プローブは、溶液系中で高速に回転し、発した蛍光はほとんど偏光解消光（ｄｅｐｏｌａｒｉｚｅｄｌｉｇｈｔ）である。プローブがより大きな分子に結合すると、分子の回転は制限され、この場合、偏光の発光は増加する。

【0069】

本発明では、フルオレセインイソチオシアネートで標識したＣｓＡアナログを蛍光トレーサープローブ（ＣｓＡ－ＦＩＴＣ）として合成し、競合蛍光偏光測定法によりＣｙｐＡに対するリガンドの親和力を測定した。まず、ＣｓＡ－ＦＩＴＣとＣｙｐＡの結合定数Ｋ_ｄ＝１４．８１±０．７０ｎＭを確定した。さらに、５０ｎＭのＣｙｐＡを異なる濃度の阻害剤に結合させ、次いで、２０ｎＭのＣｓＡ－ＦＩＴＣプローブを加え、測定して競合蛍光偏光曲線を得た。

【0070】

結果として、図５に示すように、ＣｓＡ及び４ＭＣｓＡと組換えＣｙｐＡとのＫ_ｉは、それぞれ１９５．８±２５．７ｎＭ及び１９７．８±１７ｎＭであった。また、ＣｙｐＡに対するＢＳＡ－４ＭＣｓＡ複合体のＫ_ｉは、８６．９±６．２ｎＭであった。三者は、ＣｙｐＡへの結合能力が近く、４ＭＣｓＡ及び４ＭＣｓＡとＢＳＡとのカップリングがＣｙｐＡへの阻害剤の結合に影響を与えず、活性がＣｓＡに相当することを示している。

【0071】

実施例１０：ペプチジル－プロリル－シス／トランス－イソメラーゼ（ＰＰＩ酵素）活性に対する４ＭＣｓＡ及び複合体の阻害の測定
キモトリプシンでＮ－スクシニル－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅｐ－ニトロアニリド基質ペプチドを加水分解し、ＣｙｐＡ酵素活性に対する阻害剤の影響を測定した。基質ペプチドのプロリンは、特定の成分系において主にシスであり、この場合、キモトリプシンの切断効率が比較的低いが、プロリンシス－トランスイソメラーゼで触媒された後、その構成がシスからトランスに変換するため、キモトリプシンによって特異的に切断されてｐ－ニトロアニリドを放出することができ、３９０ｎｍ左右に最大吸収がある。したがって、ＣｙｐＡ酵素の活性が高いほど、基質の分解速度が速くなり、３９０ｎｍでの吸光度値の増加が速くなる。５０ｎＭのＣｙｐＡを異なる濃度の阻害剤に結合した後、２５０μｇ／ｍＬキモトリプシンを加え、最後に、オートサンプラーを備えたマイクロプレートリーダーを用いて８０μＭのハイパードライした基質ペプチド溶液（４７０ｍＭのＬｉＣＬのトリフルオロエタノールに溶解）を加えて反応を開始させ、動力学監視した。

【0072】

図５に示すように、ＣｙｐＡを異なる濃度の阻害剤分子と共にインキュベートした後、その酵素活性が顕著に抑制され、曲線をフィッティングした結果、４ＭＣｓＡ、ＣｓＡ及びＢＳＡ－４ＭＣｓＡのＩＣ５０は、それぞれ２２．５５±４．３０ｎＭ、１７．１６±４．０９ｎＭ及び２１．８７±３．１６ｎＭであり、４ＭＣｓＡ及びそれとＢＳＡのカップリング複合体がＣｙｐＡ酵素活性を効果的に抑制でき、ＣｓＡの効率に相当することをさらに示しており、これは、結合活性の測定と一致し、４ＭＣｓＡはＢＳＡにカップリングした後、ＣｙｐＡを標的とする抑制作用を正常に発揮できることを実証している。

【0073】

実施例１１：ＮＦＡＴシグナル伝達における非免疫抑制作用の検出
ＣｓＡの免疫抑制作用は、主に分子が細胞内に入った後、細胞内ＣｙｐＡと共にＣｙｐＡ／ＣｓＡ複合体を形成し、次いでカルシニューリンに結合し、ＮＦＡＴタンパク質の脱リン酸化に対するこの酵素の活性化を阻害するためである。

【0074】

上記に鑑みて、本発明では、イオノマイシン及びＰＭＡに引き起こされるＪｕｒｋａｔＴ細胞活性化過程におけるＮＦＡＴシグナル伝達に対する分子の影響を研究した。１×１０^６のＪｕｒｋａｔ細胞をＣｓＡ及び４ＭＣｓＡを事前に添加したＲＰＭＩ１６４０培地（１０％血清含有）に接種して１．５ｈインキュベートした後、２５ｎＭホルボールエステルＰＭＡ及び１μｇ／ｍＬイオノマイシンで２ｈ処理し、Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化を誘導し、細胞を収集した後、抽出、電気泳動、転写を経た後、ＮＦＡＴ抗体によりＮＦＡＴタンパク質の脱リン酸化レベルを検出した。ＮＦＡＴ脱リン酸化後、リン酸化及び非リン酸化の２本のバンドが現れた。

【0075】

図６に示すように、ＣｓＡは、ＰＭＡ及びイオノマイシンによって誘導されたＮＦＡＴの脱リン酸化を顕著に抑制するのに対し、細胞非透過性の４ＭＣｓＡは、顕著な効果がなかった。

【0076】

また、本発明では、ＮＦＡＴが関与したＴ細胞活性化の下流ＩＬ－２タンパク質の分泌をさらに検出した。ＰＭＡ及びイオノマイシンで２４ｈ刺激した後、ＥＬＩＳＡ方法により培地中ＩＬ－２タンパク質の含有量を測定した。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔの結果と一致し、０．２μＭのＣｓＡはＩＬ－２の分泌を顕著に抑制できるのに対して、４ＭＣｓＡは、濃度が５μＭに達してもＩＬ－２の分泌にほとんど影響を与えなかった。この結果から分かるように、４ＭＣｓＡは、免疫抑制作用を有さず、それが細胞外に効果的に制限される効果と同様であり、したがって、細胞内ＣｙｐＡと複合体を形成してカルシニューリン及びＮＦＡＴの活性化を干渉することができない。

【0077】

実施例１２：炎症性細胞に対する４ＭＣｓＡの影響
本発明では、まず、ＣｙｐＡによって促進される炎症促進因子ＩＬ－８の分泌に対する４ＭＣｓＡの影響を検証した。

【0078】

薬物分子を培地と共にプレインキュベートしてからＣｙｐＡタンパク質で細胞を刺激する方法により、ＣｙｐＡによって刺激された炎症促進因子ＩＬ－８の転写変化及び炎症細胞の遊走に対する４ＭＣｓＡ及びＣｓＡの影響を検出した。４ＭＣｓＡ及びＣｓＡを０．１％ＢＳＡ含有するＲＰＭＩ１６４０培地と共に１時間プレインキュベートした後、ＣｙｐＡでＴＨＰ１細胞を１２時間刺激し、ＲＴ－ＰＣＲ法によりＩＬ－８の転写レベルの変化を検出した。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ遊走実験において、下チャンバで４ＭＣｓＡ及びＣｓＡを０．１％ＢＳＡ含有するＲＰＭＩ１６４０培地と共に１時間プレインキュベートした後、２００ｎｇ／ｍＬのＣｙｐＡを加え、上チャンバに１．０×１０^５のＴＨＰ１細胞を添加し、３７℃で１時間培養した後、ウェル基底膜をクリスタルバイオレット染色した後、撮影して遊走細胞数を記録した。

【0079】

図７に示すように、細胞外ＣｙｐＡは、ＩＬ－８のｍＲＮＡの転写レベルを顕著に向上させた。この効果は、４ＭＣｓＡ及びＣｓＡによって顕著に抑制することができる。また、本発明では、ＴｒａｎｓｗｅｌｌによりＣｙｐＡによって誘導されたＴＨＰ－１細胞遊走に対する４ＭＣｓＡの抑制を検証した。ＣｙｐＡによって促進された遊走活性は、４ＭＣｓＡ及びＣｓＡによって顕著に解消することができる。以上の結果から分かるように、４ＭＣｓＡ及びＣｓＡは、いずれもＣｙｐＡの酵素活性ポケットを標的とすることができ、４ＭＣｓＡは、細胞外ＣｙｐＡの酵素活性ポケットが媒介した炎症効果及び白血球遊走を効果的に抑制することができる。

【0080】

実施例１３：４ＭＣｓＡと天然シクロスポリンの細胞毒性の比較
本実施例では、正常ＨＥＫ２９３ヒト腎臓細胞に対するＣｓＡ及び非細胞透過性４ＭＣｓＡの細胞毒性作用を比較した。

【0081】

薬物の細胞毒性を検証するために、ＭＴＴ法により４ＭＣｓＡ及びＣｓＡで処理した後の細胞殺傷効果を検出した。ＨＥＫ２９３細胞を１．０×１０^４／ウェルの密度で９６ウェルプレートに接種し、細胞を適宜な密度まで接着増殖させた。また、４ＭＣｓＡ及びＣｓＡの勾配濃度薬物を調製し、４％ＢＳＡ含有培地と共に１時間プレインキュベートした後、９６ウェルプレートの培地を薬物プレインキュベーション培地に変更し、引き続き３０時間培養し、ＭＴＴ法により細胞生存率を検出した。図８に示すように、４ＭＣｓＡ濃度が５０μＭに達しても細胞毒性がほぼないのに対し、ＣｓＡは、ＨＥＫ２９３細胞の増殖を顕著に抑制し、濃度の増加につれて濃度依存的な細胞毒性作用を示した。これは、臨床使用におけるＣｓＡの肝毒性及び腎毒性と一致しており、４ＭＣｓＡはこの点で大きな利点を示している。

【0082】

実施例１４：４ＭＣｓＡの投与は糖尿病モデルにおけるＣｙｐＡを減少できる。
本実施例では、レプチン受容体が欠失したｄｂ／ｄｂ遺伝子操作マウス（ＤＢマウス）をＴ２ＤＭモデルとして使用し、マウス血清ＣｙｐＡの含有量に対する薬物の影響を検出した（Ｃ５７マウスを健常対照群とする）。尾静脈注射により５ｍｇ／ｋｇ／週の用量のＣｓＡ又は４ＭＣｓＡ及び１ｍｇ／ｋｇ／週の４ＭＣｓＡをＤＢ及びＣ５７マウスに３週間投与した後、マウス血清を採取し、ＥＬＩＳＡにより血液ＣｙｐＡの含有量を検出した。

【0083】

図９に示すように、糖尿病モデルマウスは、投与後に血液ＣｙｐＡの含有量が減少し、４ＭＣｓＡが炎症及びＲＯＳ循環増幅過程における細胞外シクロフィリンの作用を効果的に遮断し、この増幅過程におけるＣｙｐＡの分泌を減少させることができる。

【0084】

実施例１５：４ＭＣｓＡはＴ２ＤＭマウスモデルの空腹血糖を減少させる。
Ｔ２ＤＭにおける薬物の作用効果を効果的に評価するために、本実施例では、ＤＢマウス及び高脂肪食によって誘導された肥満マウスモデル（ＨＦＤマウス）を選択し、異なる２種の誘因の２型糖尿病マウスモデルとして研究した。ＤＢモデルに対して、対照群Ｃｔｒｌ、４ＭＣｓＡ５ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋ群ＤＢ４ＭＣ５、４ＭＣｓＡ１ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋ群ＤＢ４ＭＣ１、ＣｓＡ５ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋ群ＤＢＣｓＡ５を設け、ＨＦＤモデルにおいて、４ＭＣｓＡ及びＣｓＡの投与量はいずれも５ｍｇ／ｋｇであり、両モデルは、いずれも週１回の尾静脈注射により投与された。

【0085】

図１０に示すように、４ＭＣｓＡ投与後、ＣｓＡと比較してＤＢ及びＨＦＤマウスの空腹血糖を顕著に低減し、糖化ヘモグロビンの含有量を減少させることができ、４ＭＣｓＡが糖尿病の血糖を長期的で効果的に制御できることを示している。なお、正常Ｃ５７マウスに５週間投与した後、ＣｓＡ５ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋ実験群の空腹血糖は、Ｃ５７ｃｔｒｌ群よりもやや高く、４ＭＣｓＡ５ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋ群は正常群に相当した。

【0086】

実施例１６：４ＭＣｓＡはＴ２ＤＭマウスモデルのブドウ糖負荷を改善する。
実施例１５における２種類のモデルマウスに投与し、ブドウ糖負荷試験（ＧＴＴ）を行ってマウスがブドウ糖を制御する能力を検出した。５週間投与後、マウスを１６時間断食させ、次いでマウスに腹腔内注射によりブドウ糖（ＤＢマウス用量：１ｇ／ｋｇ，ＨＦＤマウス用量：２ｇ／ｋｇ）を注射し、その後、異なる時点で採血し、血糖含有量を検出した。対応する時点での血液試料を同時に保存して後のブドウ糖刺激によるインスリン分泌の検出に用いた。

【0087】

図１１に示すように、４ＭＣｓＡ及びＣｓＡ５ｍｇ／ｋｇは、いずれもＤＢマウスブドウ糖負荷の状態を顕著に改善することができる（図ａ－ｂ）。図ｅに示すように、Ｃｔｒｌ群と比較して５ｍｇ／ｋｇの投与群の曲線下面積（ＡＵＣ）は顕著に減少し、インビボでのブドウ糖のクリアランス速度がより速かった。Ｃ５７群のＧＴＴ曲線及びそのＡＵＣ（図ｄ及びｆ）において、ＣｓＡはＣ５７健常マウスのＡＵＣを顕著に増加させ、４ＭＣｓＡ群のＡＵＣはＣｓＡ群に対して増加が比較的少ないことが観察され、ＣｓＡ投与が健常マウスのブドウ糖負荷にある程度の悪影響を与える可能性があるのに対し、４ＭＣｓＡの影響が比較的小さいことを示している。

【0088】

ＨＦＤモデルにおいて、Ｔ２ＤＭマウスＧＴＴに対するＣｓＡ及び４ＭＣｓＡの改善に対してさらに研究した。

【0089】

図１２に示すように、ＨＦＤモデルにおいて、投与の２３日目の３６ｈｒｓ内で測定した結果、４ＭＣｓＡ及びＣｓＡはいずれもＨＦＤのＧＴＴを顕著に改善し、ＡＵＣが顕著に低下した。投与の１７日目の６０時間内で測定した結果、ＣｓＡはＨＦＤのＧＴＴに対して作用がないのに対し、４ＭＣｓＡは依然として顕著な改善を示し、ＡＵＣを顕著に低下させた。上記の結果から分かるように、４ＭＣｓＡは、代謝時間がより長く、細胞外ｅＣｙｐＡに対する持続制御により炎症及びＲＯＳ状態を長期間に改善し、常に薬効を発揮することができる。

【0090】

実施例１７：ブドウ糖刺激によるインスリン分泌に対する４ＭＣｓＡの影響

【0091】

実施例１６におけるブドウ糖注射後の対応する時点での血液試料を取り、ＥＬＩＳＡ法により血液試料中のインスリンの含有量を検出し、ブドウ糖刺激によるインスリン分泌の結果を得た。

【0092】

図１３に示すように、ＤＢマウスインビボでのインスリンの基礎レベルは、Ｃ５７健常群よりも顕著に高く、投与後、ＣｓＡ及び４ＭＣｓＡは、ＤＢマウスのインスリンの基礎レベルに対する影響が大きくない（図ａの左側）のに対し、Ｃ５７健常群では、４ＭＣｓＡ群のインスリンがＣｓＡ群よりもやや高かった（図ａの右側）。ブドウ糖で刺激した後、４ＭＣｓＡ及びＣｓＡでは、ＤＢマウスの異なる段階での刺激によるインスリン分泌は、ＤＢｃｔｒｌ群と比較して顕著な違いがなかった（図ｂの左側）。４ＭＣｓＡ及びＣｓＡ（５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）の使用は、ＤＢマウスのインスリン分泌を変化させないため、ＤＢマウスＧＴＴの改善は、インスリンシグナル応答に影響を与えることによるものである。しかし、健常Ｃ５７マウス（図ｂの右側）では、依然として４ＭＣｓＡは、Ｃ５７ｃｔｒｌと比較してブドウ糖刺激によるインスリン分泌をより多く増加できる一方、ＣｓＡ群では、了ブドウ糖刺激によるインスリン産生を減少させ、ＧＴＴ実験におけるＣ５７に対するＣｓＡ投与の影響を示している。これによって、本発明の４ＭＣｓＡはＣｓＡよりも優れたことがさらに実証されている。

【0093】

実施例１８：インスリン感受性に対する４ＭＣｓＡの影響
実施例１５における２種類のマウスに対してそれぞれインスリン感受性試験（インスリン負荷試験，ＩＴＴ）を行い、さらにインスリンシグナル応答を測定した。マウスを６時間断食させた後、腹腔内注射によりインスリン（ＤＢマウス用量：２Ｕ／ｋｇ，ＨＦＤマウス用量：１Ｕ／ｋｇ）を注射し、その後、異なる時点での血糖含有量を検出した。

【0094】

図１４に示すように、４ＭＣｓＡ及びＣｓＡは、いずれもＤＢインスリン感受性を顕著に改善できるとともに、健常Ｃ５７においても投与後に両者がＩＴＴを改善したことが観察された。４ＭＣｓＡは、ＤＢマウスにおいてＩＴＴに対する影響がある程度の用量効果を有した（例えば、図ａ－ｄ）。ＨＦＤモデルのマウスにおいて、４ＭＣｓＡ及びＣｓＡは、肥満に起因するインスリン抵抗を低減させ、ＩＴＴを改善することもでき、４ＭＣｓＡは、ＣｓＡと比較してＡＵＣがより低く、効果がより顕著であった（例えば、図ｅ－ｆ）。

【0095】

実施例１９：ＤＢマウス炎症因子に対する４ＭＣｓＡの影響
実施例１５におけるＤＢモデルマウス（対照群Ｃｔｒｌ，４ＭＣｓＡ５ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋ群ＤＢ４ＭＣ５，４ＭＣｓＡ１ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋ群ＤＢ４ＭＣ１，ＣｓＡ５ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋ群ＤＢＣｓＡ５）に４２日間投与した後、血液を採取し、ＥＬＩＳＡにより血清中の炎症因子レベルを測定した。

【0096】

図１５に示すように、４ＭＣｓＡは、４２日間投与された後、ＤＢマウス中の炎症因子ＴＮＦ－ａ及びＩＬ１βのレベルを顕著に低下させたのに対し、ＣｓＡは、ＩＬ１βのみを改善した。観察されたのは、４ＭＣｓＡがマウス炎症を軽減でき、かつ効果がＣＳＡよりも高く、これによって、炎症に起因するインスリンシグナル損傷を軽減させ、インスリン感受性を向上させ、マウスの糖尿病状態を改善することができる。

【0097】

実施例２０：ＤＢマウスの肝毒性及び腎毒性に対する４ＭＣｓＡ及びＣＳＡの影響の調査

【0098】

５０日間投与した後、実施例１５における２種類のモデルマウスの対応投与群の血清を取り、南京建成生化製キットを用いて血清中のアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）の含有量（肝毒性指標）及び腎毒性指標（クレアチニン及び尿素）を検出した。

【0099】

図１６のａ及びｂに示すように、ＤＢマウスは、Ｃ５７健常マウスと比較してＡＬＴ及びＡＳＴがいずれも顕著に増加した。これは、肥満マウスが非アルコール性脂肪肝を罹患しやすいためこれらの肝臓指標の上昇を引き起こすためである。４ＭＣｓＡ及びＣｓＡを投与してもＤＢマウスの肝毒性及び腎毒性をさらに向上されなかった（図１６におけるｃ及びｄ）。同様に、４ＭＣｓＡ及びＣＳＡも顕著な腎毒性を引き起こさなかった。その尿素及びクレアチニンレベルは、群間に違いがなかった。しかし、Ｃ５７健常マウスにおいて、５０日間の長期投与後、ＣｓＡ投与群では、ＡＳＴ、ＡＬＴ及び尿素レベルはいずれも顕著に高くなった一方、４ＭＣｓＡは、健常対照に近いレベルを維持したことが見られた。この結果によって、本発明の４ＭＣｓＡは、毒性低減に優れたことがさらに直接実証されている。

【0100】

ＤＢマウス及びＨＦＤの２種類のＴ２ＤＭモデルマウスにおいて、Ｔ２ＤＭの改善効果について４ＭＣｓＡとＣｓＡを比較した。疾患モデルにおいて、低用量、長周期投与の場合、両者とも空腹血糖を減少させ、ブドウ糖負荷を改善し、インスリン感受性を向上できるとともに、インスリン分泌及び他の肝毒性、腎毒性の変化に影響を与えなかった。これらの指標では、４ＭＣｓＡはより高いポテンシャルを示しており、ＣｓＡと比較してより長期間で持続的に制御し、改善効果がより顕著で、効きが早く、毒性がより低かった。

【0101】

また、ＣｓＡは、糖尿病対象において代謝速度がより速いことが報告されているため、健常状態の対象にとっては潜在的な危害を有する。これは、発明の実験において何度も証明されている。具体的には、健常Ｃ５７マウスに長期間投与した後、そのＧＴＴに悪影響を与え、インスリンの分泌が減少し、血糖レベルが向上し、肝毒性及び腎毒性が高くなった。これに対し、本発明者らが設計した４ＭＣｓＡは、健常Ｃ５７のこれらの不具合を顕著に軽減させることができる。

【0102】

実施例２１：４ＭＣｓＡはマウス結腸がん腫瘍モデルにおいて抗腫瘍効果を奏する。
本実施例においてマウス腫瘍モデルを構築し、腫瘍のサイズを測定することで薬物の作用効果を反映した。

【0103】

Ｂａｌｂ／Ｃマウスの背中の側面にＣＴ２６－ＬＵＣマウス結腸がん細胞を接種量１０^６／匹で皮下接種し、６日後に腫瘍のサイズが約１００ｍｍ^３になり、ノギスで測定しながら投与し、４ＭＣｓＡの投与量は５ｍｇ／ｋｇであり、毎日投与し、２日ごとに腫瘍を測定し、腫瘍サイズを統計した。３週間後に実験を終了させた。

【0104】

実験結果として、図１７に示すように、４ＭＣｓＡは、ある程度の抗腫瘍効果を示し、抗腫瘍薬の潜力を有する。

【0105】

実施例２２：４ＭＣｓＡが腫瘍微小環境中のＣＤ８Ｔ細胞の浸潤を向上させることを調査する。

【0106】

凍結切片の厚さは４～８μｍである必要がある。切片を－８０℃から取り出した後、室温で３０分間静置し、４℃でアセトンを用いて１０分間固定し、ＰＢＳ（５分間×３）で洗浄した。５～１０％正常なヤギ血清（ＰＢＳ希釈）でブロッキングし、室温で１０分間インキュベートした。血清を捨て、洗浄せずに適切な割合で希釈した一次抗体又は一次抗体作動液を滴下し、３７℃で１～２時間インキュベートし又は４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで（５分間×３回）で洗い流した。適切な割合で希釈したビオチン標識二次抗体（１％ＢＳＡ－ＰＢＳ希釈）を滴下して３７℃で９０－１２０分間インキュベートし、或いは第２世代ホースラディシャーゼ標識ストレプトアビジン作動液を滴下して３７℃又は室温で１０～３０分間インキュベートし、ＰＢＳ（５分間×３回）で洗い流し、切片を封入した後、倒立蛍光顕微鏡を用いて撮影した。最後にｉｍａｇｅＪを用いて統計分析した。

【0107】

結果として、図１８に示すように、４ＭＣｓＡは、腫瘍微小環境中のＣＤ８Ｔ細胞の浸潤を促進することができ、これによって、腫瘍抑制効果を得られる。

【0108】

実施例２３：高脂肪食によって誘導されたアテローム性動脈硬化症マウスの大動脈病変程度に対する４ＭＣｓＡの影響
ＡｐｏＥ遺伝子欠陥Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（５週齢）を選択し、ランダムに群分けした後、ＷｅｓｔｅｒＮｄｉｅｔ飲食により高脂肪を誘導し、７週目から尾静脈注射により実験群に４ＭＣｓＡを投与し始めた（用量：５ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋ，投与周期：９週間）。実験終了後、実験動物を安楽死させ、解剖した後、右心耳から１０ｍＬのＰＢＳを灌注した後、１０ｍＬ組織固定液（４％パラホルムアルデヒド）を灌注し、立体顕微鏡下で大動脈を完全に分離し、脂肪ピンセットで血管外に付着した脂肪組織を剥離した。オイルレッドＯ染色法により分離した大動脈全体を染色し、撮影して記録し、ＩｍａｇｅＪを用いて実験群及び対照群動物の大動脈弓の病変面積を統計し、差異の有意性を統計した。

【0109】

図１９に示すように、モデル構築に成功したアテローム性動脈硬化症マウスを周期的で断続的に投与した後、対照群（ＡｐｏＥ－／－）と比較して、投与群（４ＭＣｓＡ）の大動脈弓の病変面積は顕著に減少し、４ＭＣｓＡが血管プラーク病変の発生を直接改善できることを示している。

【0110】

実施例２４：高脂肪食によって誘導されたアテローム性動脈硬化症マウスの血清中ＣＲＰ含有量に対する４ＭＣｓＡの影響
アテローム性動脈硬化症マウスのモデルを成功に構築した後、実施例２３に記載の方法により、実験マウスに対して週に１回で５ｍｇ／ｋｇの４ＭＣｓＡを尾静脈注射し、９週間連続投与し、マウス血清中のＣＲＰレベルを検出することにより生体の心血管疾患の発症リスクを評価し、生体の心血管疾患の発症に対する化合物の影響を評価した。

【0111】

図２０に示すように、対照群（ＡｐｏＥ－／－）と比較して、４ＭＣｓＡは、実験群マウスの血清中ＣＲＰの含有量を顕著に減少でき、４ＭＣｓＡが生体の心血管疾患の発症に対して非常に優れた予測的な改善作用を有することを示している。

【0112】

実施例２５：高脂肪食によって誘導されたアテローム性動脈硬化症マウスの血清中の血中脂質プロフィール指標に対する４ＭＣｓＡ影響

【0113】

実施例２３に記載の方法により高脂肪食誘導マウスアテローム性動脈硬化症モデルを構築し、群別に応じて投与し、５ｍｇ／ｋｇの４ＭＣｓＡ又はプラセボを週に１回で尾静脈注射し、９週間連続投与後、マウスを安楽死させ、血清を採取し、血中脂質プロフィールを検出した。

【0114】

結果として、図２１に示すように、対照群と比較して、４ＭＣｓＡは、生体の血清中のＬＤＬ－Ｃ含有量を顕著に減少させ、ＨＤＬ－Ｃの含有量をある程度増加できた（有意性なし）が、ＴＣ及びＴＧの含有量には顕著な影響を与えなかった。また、計算結果から分かるように、４ＭＣｓＡは、生体のＴＣ／ＨＤＬ－Ｃを顕著に減少でき、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病などの心血管疾患に対してある程度の予測的な改善作用を有する。

【0115】

実施例２６：高脂肪食によって誘導されたアテローム性動脈硬化症マウスの血清中のＡＬＴ、ＡＳＴ含有量に対する４ＭＣｓＡの長期注射の影響

【0116】

実施例２５に記載の方法によりマウスアテローム性動脈硬化症モデルの誘導及び投与を行い、動物実験の周期が終了した後、マウスを安楽死させ、血清を採取し、血清中のアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）の含有量を測定した。

【0117】

図２２に示すように、対照群と比較して、実験群の血清中のＡＬＴ、ＡＳＴ活性には顕著な変化がなく、４ＭＣｓＡの周期的で断続的な尾静脈注射は、生体に対して顕著な肝毒性を引き起こさなかった。

【0118】

以上の説明は、本発明の具体的な実施形態に過ぎず、本発明の保護範囲はこれに限定されない。当業者であれば、本発明に開示されている技術的範囲内において変化及び置換を容易に想到することができる。これらの変化及び置換は、本発明の保護範囲内に含まれるべきである。したがって、本発明の保護範囲は、添付する特許請求の範囲に定めるものとする。

【図1】