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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-20
(54)【発明の名称】トランスアミナーゼ変異体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 9/10 20060101AFI20240912BHJP
C12P 19/26 20060101ALI20240912BHJP
C12N 11/087 20200101ALI20240912BHJP
C12N 15/54 20060101ALN20240912BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240912BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240912BHJP
【ＦＩ】
C12N9/10 ZNA
C12P19/26
C12N11/087
C12N15/54
C12N15/63 Z
C12N15/31
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024519501
(86)(22)【出願日】2021-10-28
(85)【翻訳文提出日】2024-03-29
(86)【国際出願番号】 CN2021127138
(87)【国際公開番号】W WO2023050516
(87)【国際公開日】2023-04-06
(31)【優先権主張番号】202111146751.0
(32)【優先日】2021-09-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516336828
【氏名又は名称】凱菜英医藥集團（天津）股▲分▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＹＭＣＨＥＭ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ （ＴＩＡＮＪＩＮ） ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】100158920
【弁理士】
【氏名又は名称】上野 英樹
(72)【発明者】
【氏名】洪 浩
(72)【発明者】
【氏名】ジェイムズ，ゲイジ
(72)【発明者】
【氏名】肖 毅
(72)【発明者】
【氏名】▲張▼ 娜
(72)【発明者】
【氏名】ヴィヤーサ，ウィリアムズ
(72)【発明者】
【氏名】崔 瑜霞
(72)【発明者】
【氏名】▲趙▼ 佳▲東▼
(72)【発明者】
【氏名】高 妍妍
(72)【発明者】
【氏名】傅 涵
【テーマコード（参考）】
4B033
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B033NA01
4B033NA25
4B033NB03
4B033NB36
4B033NB62
4B033NC02
4B033NC03
4B033ND02
4B033ND12
4B033NF02
4B064AE01
4B064CA21
4B064CA34
4B064CA38
4B064CC24
4B064CD12
4B064DA01
4B064DA16
(57)【要約】
トランスアミナーゼ変異体及びその使用を提供する。ここで、トランスアミナーゼ変異体は、配列番号１で示される配列を基にアミノ酸突然変異が発生したものであり、アミノ酸突然変異はＷ６０Ｙ、Ｙ１６８Ａ、Ｖ３７９Ｗ、Ｖ３７９Ｌ、Ｖ３７９Ｍ、Ｃ４１８Ｑ及びＣ４１８Ｗの単一部位突然変異又は組合せ突然変異であり、これらのトランスアミナーゼ変異体の活性、安定性、温度、ｐＨ及び有機溶媒に対する耐性が向上し、トランスアミナーゼの極端な環境に対する耐性が悪いという従来技術における問題を解決し、酵素工学の分野に適用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１で示される配列を基にアミノ酸突然変異が発生したトランスアミナーゼ変異体であって、前記アミノ酸突然変異は、Ｃ４１８Ｑ、Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ、Ｙ１６８Ａ、Ｖ３７９Ｗ、Ｖ３７９Ｌ、Ｖ３７９Ｍ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｌ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｍ、Ｗ６０Ｙ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ、Ｙ１６８Ａ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｙ１６８Ａ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｗ又はＷ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｗであるか、又は、前記トランスアミナーゼ変異体のアミノ酸配列に突然変異が発生したアミノ酸配列における突然変異部位があり、且つ突然変異が発生したアミノ酸配列と８５％以上の相同性を有するとともに、トランスアミナーゼ活性を有する、ことを特徴とするトランスアミナーゼ変異体。
【請求項2】
前記トランスアミナーゼ変異体のアミノ酸配列は、突然変異が発生したアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の相同性を有するとともに、トランスアミナーゼ活性を有する、ことを特徴とする請求項１に記載のトランスアミナーゼ変異体。
【請求項3】
前記トランスアミナーゼ変異体は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍに由来するものである、ことを特徴とする請求項１又は２に記載のトランスアミナーゼ変異体。
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載のトランスアミナーゼ変異体をコードする、ことを特徴とするＤＮＡ分子。
【請求項5】
請求項４に記載のＤＮＡ分子が連結されている、ことを特徴とする組換プラスミド。
【請求項6】
請求項１～３のいずれか１項に記載のトランスアミナーゼ変異体を含む、ことを特徴とする固定化トランスアミナーゼ。
【請求項7】
前記固定化トランスアミナーゼは、前記トランスアミナーゼ変異体の架橋固定化酵素凝集体であり、好ましくは、前記架橋固定化酵素凝集体は、グルタルアルデヒド架橋の固定化酵素凝集体であり、
好ましくは、前記架橋固定化酵素凝集体は、グルタルアルデヒドによって活性化されたＰＥＩと架橋した固定化酵素凝集体であり、
より好ましくは、前記架橋固定化酵素凝集体は、補因子によって活性化されたＰＥＩとグルタルアルデヒドを介して架橋された固定化酵素凝集体である、
ことを特徴とする請求項６に記載の固定化トランスアミナーゼ。
【請求項8】
前記固定化トランスアミナーゼは、前記トランスアミナーゼ変異体がキャリアに結合された固定化酵素であり、好ましくは、前記キャリアが架橋ポリマー樹脂球であり、
好ましくは、前記樹脂球は、マクロポーラス型吸着樹脂球、アミノ基型樹脂球又はエポキシ型樹脂球を含み、
好ましくは、前記マクロポーラス型吸着樹脂球のマトリックスは、官能基を有さないポリスチレンであり、
より好ましくは、前記マクロポーラス型吸着樹脂は、ＮＫＡ９、ＬＸＥＰ１２０、ＡＢ－８、ＥＣＲ８８０６、ＸＡＤ－７又はＤ３５２０を含み、
好ましくは、前記アミノ基型樹脂球は、アミノ官能基を有する架橋ポリマー樹脂球であり、
より好ましくは、前記アミノ基型樹脂球の官能基は、長さがＣ１～Ｃ４又はＣ５～Ｃ１０のアミノ官能基であり、
より好ましくは、前記アミノ基型樹脂球の官能基は、Ｃ２又はＣ６長さの炭素鎖アームを有するアミノ官能基であり、
より好ましくは、前記アミノ基型樹脂球は、ポリメタクリレート樹脂球、ポリスチレン樹脂球又はメタクリル酸エステルとスチレンとの共重合体の樹脂球であり、
より好ましくは、前記アミノ基型樹脂球は、ＬｉｆｅｔｅｃｈＴＭＥＣＲ８３０９、ＬｉｆｅｔｅｃｈＴＭＥＣＲ８４０９、ＳｅｐｌｉｔｅＬＸ１０００ＨＡ又はＳｅｐｌｉｔｅＬＸＥＰＨＡを含み、
好ましくは、前記エポキシ型樹脂球は、エポキシ官能基を有するポリマー樹脂球であり、
より好ましくは、前記エポキシ型樹脂球はＣ２～Ｃ８長さの炭素鎖アームを有するエポキシ官能基であり、
より好ましくは、前記エポキシ型樹脂球は、エポキシ官能基を有するポリメタクリレート樹脂、ポリスチレン樹脂又はメタクリル酸エステルとスチレンとの共重合体の樹脂球であり、
より好ましくは、前記エポキシ型樹脂球はＳｅｐｌｉｔｅＬＸＨＦＡ００１又はＬｉｆｅｔｅｃｈＴＭＥＣＲ８２８５を含む、
ことを特徴とする請求項６に記載の固定化トランスアミナーゼ。
【請求項9】
前記固定化トランスアミナーゼは、前記トランスアミナーゼ変異体と金属親和性吸着型キャリアとが親和吸着した親和キャリア固定化酵素であり、好ましくは、前記キャリアがポリメタクリル酸マトリックスの樹脂球であり、
より好ましくは、前記樹脂球がＮＴＡ又はＩＤＡを金属イオンとキレートするリガンドとし、
より好ましくは、前記樹脂球は、末端に金属イオンリガンドがキレートされ、
さらに好ましくは、前記金属イオンリガンドはＮｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋又はＦｅ３＋を含み、
さらに好ましくは、前記樹脂球はＩＭＡＣ－Ｎｉ又はＭＩＤＡ－Ｎｉを含み、
さらに好ましくは、前記樹脂球はＢｉｏ－Ｒａｄ ＰｒｏｆｉｎｉｔｙＴＭＩＭＡＣ Ｒｅｓｉｎ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｎｉ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｃｏ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｃｕ又はＰｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｆｅを含む、
ことを特徴とする請求項６に記載の固定化トランスアミナーゼ。
【請求項10】
トランスアミナーゼを用いてケトン系化合物及びアミノ基供与体に対してアミノ基転移触媒反応を行うステップを含むトランスアミナーゼでキラルアミンを生産する方法であって、前記トランスアミナーゼは、請求項１～３のいずれか１項に記載のトランスアミナーゼ変異体又は請求項６～９のいずれか１項に記載の固定化トランスアミナーゼである、ことを特徴とするトランスアミナーゼでキラルアミンを生産する方法。
【請求項11】
バッチ反応又は連続反応であり、好ましくは、前記バッチ反応又は前記連続反応は、水相又は有機相中で行われる反応であり、
好ましくは、前記水相中で反応する条件は、全系体積の７０％以下の、水と相互溶解する有機溶媒を水溶液に加えて溶解補助剤として触媒反応を行うことであり、さらに、有機溶媒は、メタノール、エタノール又はジメチルスルホキシドであり、
好ましくは、前記有機相中で反応する条件は、水と相互溶解しない水飽和有機溶媒中で触媒反応を行うこと、さらに、水飽和のメチル‐ターシャリ‐ブチルエーテル溶液又は水飽和酢酸イソプロピル溶液中で触媒反応を行うことであり、
好ましくは、前記固定化トランスアミナーゼは、請求項６～９のいずれか１項に記載の固定化トランスアミナーゼであり、前記固定化トランスアミナーゼは、管路に充填されて充填層連続反応を行い、
好ましくは、前記固定化酵素の連続使用時間は、４００時間以上であり、
好ましくは、前記固定化酵素の空時収量は３．６～７．２ｍｏｌ／Ｌ／日である、
ことを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ケトン系化合物は【化1】
好ましくは、前記Ｒ１及び前記Ｒ２は、それぞれ独立してＣ５～Ｃ１０ヘテロシクロアルカンであり、前記Ｃ５～Ｃ１０ヘテロシクロアルカン中のヘテロ原子は、それぞれ独立して窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択される少なくとも１種であり、前記Ｃ５～Ｃ１０ヘテロシクロアルカンの炭素環式基は、置換されていないか、又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つによって置換され、
好ましくは、前記ケトン系化合物は
【化2】
【化3】
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
トランスアミナーゼ変異体を固定化するステップを含み、ここで、前記トランスアミナーゼ変異体は、請求項１～３のいずれか１項に記載のトランスアミナーゼ変異体である、ことを特徴とする固定化トランスアミナーゼの生産方法。
【請求項14】
トランスアミナーゼ変異体を固定化するステップは、前記トランスアミナーゼ変異体を架橋固定して固定化酵素凝集体を形成することを含み、好ましくは、前記トランスアミナーゼ変異体を架橋固定して固定化酵素凝集体を形成することは、
沈殿剤で沈殿させた酵素をグルタルアルデヒドと架橋して、前記固定化酵素凝集体を形成するか、又は
沈殿剤で沈殿させた酵素をグルタルアルデヒドによって活性化されたＰＥＩと架橋して、前記固定化酵素凝集体を形成するか、又は
前記トランスアミナーゼ変異体と、補因子によって活性化されたＰＥＩとをグルタルアルデヒドを介して架橋して、前記固定化酵素凝集体を形成することを含む、
ことを特徴とする請求項１３に記載の生産方法。
【請求項15】
トランスアミナーゼ変異体を固定化するステップは、前記トランスアミナーゼ変異体とキャリアとを連結して、固定化酵素を形成することを含み、好ましくは、前記キャリアが架橋ポリマー樹脂球であり、
好ましくは、前記樹脂球は、マクロポーラス型吸着樹脂球、アミノ基型樹脂球又はエポキシ型樹脂球を含み、
好ましくは、前記マクロポーラス型吸着樹脂球のマトリックスは、官能基を有さないポリスチレンであり、
より好ましくは、前記マクロポーラス型吸着樹脂球はＮＫＡ９、ＬＸＥＰ１２０、ＡＢ－８、ＥＣＲ８８０６、ＸＡＤ－７又はＤ３５２０を含み、
好ましくは、前記アミノ基型樹脂球は、アミノ官能基を有する架橋ポリマー樹脂球であり、
より好ましくは、前記アミノ基型樹脂球の官能基は、Ｃ２又はＣ６長さの炭素鎖アームを有するアミノ官能基であり、
より好ましくは、前記アミノ基型樹脂球は、ポリメタクリレート、ポリスチレン樹脂又はメタクリル酸エステルとスチレンとの共重合体の樹脂球を含み、
より好ましくは、前記アミノ基型樹脂球は、ＬｉｆｅｔｅｃｈＴＭＥＣＲ８３０９、ＬｉｆｅｔｅｃｈＴＭＥＣＲ８４０９、ＳｅｐｌｉｔｅＬＸ１０００ＨＡ又はＳｅｐｌｉｔｅＬＸＥＰＨＡを含み、
より好ましくは、前記エポキシ型樹脂球は、エポキシ官能基を有するポリマー樹脂球であり、
より好ましくは、前記エポキシ型樹脂球は、Ｃ２～Ｃ８長さアームのエポキシ官能基を有し、
より好ましくは、前記エポキシ型樹脂球は、エポキシ官能基を有するポリメタクリレート、ポリスチレン樹脂又はメタクリル酸エステルとスチレンとの共重合体の樹脂を含み、
より好ましくは、前記エポキシ型樹脂球はＳｅｐｌｉｔｅＬＸＨＦＡ００１又はＬｉｆｅｔｅｃｈＴＭＥＣＲ８２８５を含む、
ことを特徴とする請求項１３に記載の生産方法。
【請求項16】
トランスアミナーゼ変異体を固定化するステップは、前記トランスアミナーゼ変異体とキャリアとを親和吸着して親和固定化酵素を形成することを含み、好ましくは、前記トランスアミナーゼ変異体と前記キャリアとを共培養し、前記親和固定化酵素を得ることを含み、
好ましくは、前記トランスアミナーゼ変異体は、複数のＨｉｓ－タグを有し、
好ましくは、前記キャリアがポリメタクリル酸マトリックスの樹脂球であり、
より好ましくは、前記樹脂球はＮＴＡ又はＩＤＡリガンドを含み、
より好ましくは、前記樹脂球は、末端に金属イオンリガンドがキレートされ、
さらに好ましくは、前記金属イオンリガンドはＮｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋又はＦｅ３＋を含み、
さらに好ましくは、前記キャリアはＩＭＡＣ－Ｎｉ又はＭＩＤＡ－Ｎｉを含み、
さらに好ましくは、前記キャリアはＢｉｏ－Ｒａｄ ＰｒｏｆｉｎｉｔｙＴＭＩＭＡＣ Ｒｅｓｉｎ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｎｉ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｃｏ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｃｕ又はＰｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｆｅを含む、
ことを特徴とする請求項１３に記載の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、酵素工学の分野に関し、具体的には、トランスアミナーゼ変異体及びその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
キラルアミンは、多くのキラル薬物を合成するための重要な中間体であり、アミノ基を含有する光学的な純薬物の主要成分でもある。神経系薬物、血管薬物、抗高血圧性薬物、抗感染薬物及びワクチン等は、いずれもキラルアミンを中間体とする。トランスアミナーゼは、ケトン系化合物を原料として、立体選択的なアミノ基転移により、キラルアミンを効率よく生産することができる。しかし、遊離酵素での酵素触媒方法は増幅生産用途において、酵素活性が低く且つ酵素の使用量が多いことによる発酵コストが増加すること、反応系中の有機溶媒の影響を受けて変性・失活しやすく、後処理で回収した生成物の乳化現象が厳しく、廃ガスと廃水と廃棄物の発生量が多いこと等の、多くの問題がある。また、アミン製品を分離する過程において、酵素を変性・失活させて沈殿を形成した後に除去して捨てるしかなく、再利用できない。
【0003】
固定化酵素の研究は、１９１０年に始まり、１９６０年代に本格的に研究され、１９７０年代になると、既に世界中で普遍的に行われていた。酵素の固定化（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ）は、固体材料で酵素を一定の領域内に束縛又は制限しても、依然としてその特有の触媒反応を行い、且つ回収・再利用が可能である技術の一種である。固定化酵素は、遊離酵素に比べ、その高効率で特異的且つ温和な酵素触媒反応特性を維持しながら、遊離酵素の欠点を克服し、保存安定性が高く、分離・回収が容易で、複数回繰り返して使用でき、操作が連続的で制御可能で、プロセスが簡便であるなどの一連の利点を現す。固定化酵素は、化学、生物学及び生物工学、医学及び生命科学等の学科分野における研究で異常に活発であり、急速に開発され広く使用されているだけでなく、資源及びエネルギーを節約し、且つ汚染を低減又は防止するエコロジー効果を有するため、持続可能な発展戦略の要件にも適する。そのため、固定化酵素は、すでに近代酵素工学の分野の主要研究内容の１つとなっている。固定化酵素は、その高い安定性により、工業生産において幅広い見通しを持っている。
【0004】
固定化酵素を使用してバッチ撹拌反応を行うことにより、酵素の繰り返し使用を実現するとともに、後処理の乳化現象を極めて大きく緩和して、廃ガスと廃水と廃棄物の発生を低減することができる。しかし、バッチ撹拌反応は、固定化酵素の回収操作を必要とし、断続的な材料供給は生産能力に影響を与え、撹拌によって発生したせん断力により酵素が失活しやすく、且つ撹拌動力の消費が大きい。固定化酵素連続流動酵素反応は、固定化酵素を管路型反応器に充填し、ポンプを用いて基質を適当な流速で反応器の入口から注入し、出口で製品を受け取る。連続流動反応機器は、簡単で、エネルギー消費が少なく、労力を節約し、生産能力が高いため、固定化酵素の増幅応用により適している。
【0005】
既存の基質ケトン（アミノ基受容体）のほとんどは水溶性がよくないため、純水相中で連続的に反応することができない。連続的な反応を実現するためには、高い温度を必要とするか、又は十分な有機溶解補助剤を加えて基質を溶解させる必要があるが、極端な温度、ｐＨ及び有機溶媒等により、トランスアミナーゼが非常に容易に失活する。そのため、高温、有機溶媒等の極端な環境で安定性が悪いことにより使用が制限されるという問題を改善するために、トランスアミナーゼを改良する必要がある。
【0006】
前の段階では、トランスアミナーゼを改変して、４５℃高温や５０％高濃度の有機溶媒に耐えることができる変異体を得（ＣＮ１０８３８４７６７ Ｂ）、キャリアフリー固定化（ＣＬＥＡ）、アミノ基キャリア共有固定化等の技術により、トランスアミナーゼ変異体の固定化に成功し、繰り返し使用回数は１８回にも達した。充填層反応器の連続反応を実現するために、高濃度の溶解補助剤、即ち≧３５％（ｖ／ｖ）のメタノール溶液を使用して基質を完全に溶解した。この高濃度の有機溶媒条件で、キャリア固定化酵素により、トランスアミナーゼ酵素反応の連続化に成功し、保持時間は６００ｍｉｎで、２４０ｈ連続的に実行しても、形質転換率は低下しなかった。しかし、工業的応用において、６００ｍｉｎの保持時間は依然として低い。生産力を向上させるために、固定化酵素の活性及び安定性を一層向上させる必要がある。タンパク質工学技術は、分子構造の観点から酵素分子を指向改変して、性能が向上した（例えば活性、耐性、基質スペクトル等が向上した）変異体を得ることができる。酵素の固定化技術は、一般的に、酵素の保存安定性、使用安定性、及び温度、ｐＨ、有機溶媒等に対する耐性を向上させることができる。最も重要なのは、固定化後の酵素を回収して繰り返して使用することができるため、酵素の浪費を減少することである。通常の場合、酵素は、固定化された後、特に共有結合方式で固定化された後、酵素活性が低下し、即ち酵素活性回収＜１００％であり、固定化酵素の酵素活性回収を向上させるための最も直接で効果的な方法は、先に遊離酵素を指向改変することであり、これにより、酵素の極端な条件に対する耐性を向上させ、共有固定化過程における酵素の活性損失を低下させ、固定化酵素の使用寿命を一層向上させることができる。
【0007】
キャリア固定化酵素は、酵素がキャリアの多孔質構造に固定されているため、反応中に酵素と基質との接触が制限され、物質移動抵抗が大きく、反応効率が低い。キャリアフリー固定化酵素、即ち架橋酵素は、酵素と基質との接触面積及び効率を向上させることにより、反応効率を向上させる。当該物質移動抵抗が小さい架橋酵素が連続反応に適用されると、生産力を極めて大きく向上させる。しかし、架橋酵素は、固体キャリアの支持がないため、強度が弱く、管路に充填される場合、反応溶液を流した後に非常に大きいカラム圧力が発生することにより、連続流動反応ができなくなる。そのため、硬度が高く、機械的強度がよい架橋酵素の開発は、固定化酵素の生産力を高めるもう１つの方向である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の主な目的は、従来技術のトランスアミナーゼの極端な環境における耐性を一層向上させるための、トランスアミナーゼ変異体及びその使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の一態様によれば、上記の目的を実現するために、トランスアミナーゼ変異体を提供し、トランスアミナーゼ変異体は、配列番号１で示される配列を基にアミノ酸突然変異が発生したものであり、アミノ酸突然変異は、Ｃ４１８Ｑ、Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ、Ｙ１６８Ａ、Ｖ３７９Ｗ、Ｖ３７９Ｌ、Ｖ３７９Ｍ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｌ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｍ、Ｗ６０Ｙ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ、Ｙ１６８Ａ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｙ１６８Ａ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｗ又はＷ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｗであるか、又は、トランスアミナーゼ変異体のアミノ酸配列に突然変異が発生したアミノ酸配列における突然変異部位があり、且つ突然変異が発生したアミノ酸配列との相同性が８５％以上であるとともに、トランスアミナーゼ活性を有する。
【0010】
さらに、トランスアミナーゼ変異体のアミノ酸配列は、突然変異が発生したアミノ酸配列との相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上であるとともに、トランスアミナーゼ活性を有する。
【0011】
さらに、当該トランスアミナーゼ変異体は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍに由来するものである。
【0012】
本願の第２態様によれば、上記トランスアミナーゼ変異体をコードするＤＮＡ分子を提供する。
【0013】
本願の第３態様によれば、上記ＤＮＡ分子が連結されている組換プラスミドを提供する。
【0014】
本願の第４態様によれば、上記トランスアミナーゼ変異体を含む固定化トランスアミナーゼを提供する。
【0015】
さらに、固定化トランスアミナーゼは、トランスアミナーゼ変異体の架橋固定化酵素凝集体を含み、好ましくは、架橋固定化酵素凝集体は、グルタルアルデヒド架橋の固定化酵素凝集体であり、好ましくは、架橋固定化酵素凝集体は、グルタルアルデヒドによって活性化されたＰＥＩに架橋される固定化酵素凝集体であり、より好ましくは、架橋固定化酵素凝集体は、補因子によって活性化されたＰＥＩとグルタルアルデヒドを介して架橋された固定化酵素凝集体である。
【0016】
さらに、固定化トランスアミナーゼは、トランスアミナーゼ変異体がキャリアに結合した固定化酵素を含み、好ましくは、キャリアが架橋ポリマー樹脂球であり、好ましくは、樹脂球は、マクロポーラス型吸着樹脂球、アミノ基型樹脂球又はエポキシ型樹脂球を含むが、これらに限定されず、好ましくは、マクロポーラス型吸着樹脂球のマトリックスは、官能基を有さないポリスチレンであり、より好ましくは、マクロポーラス型吸着樹脂は、ＮＫＡ９、ＬＸＥＰ１２０、ＡＢ－８、ＥＣＲ８８０６、ＸＡＤ－７（アンバーライト）又はＤ３５２０を含むが、これらに限定されず、好ましくは、アミノ基型樹脂球は、アミノ官能基を有する架橋ポリマー樹脂球であり、より好ましくは、アミノ基型樹脂球の官能基は、長さがＣ１～Ｃ４又はＣ５～Ｃ１０のアミノ官能基であり、より好ましくは、アミノ基型樹脂球の官能基は、Ｃ２又はＣ６長さの炭素鎖アームを有するアミノ官能基であり、より好ましくは、アミノ基型樹脂球は、ポリメタクリレート樹脂球、ポリスチレン樹脂球又はメタクリル酸エステルとスチレンとの共重合体の樹脂球であり、より好ましくは、アミノ基型樹脂球は、ＬｉｆｅｔｅｃｈＴＭＥＣＲ８３０９、ＬｉｆｅｔｅｃｈＴＭＥＣＲ８４０９、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標。以下同じ）ＬＸ１０００ＨＡ又はＳｅｐｌｉｔｅＬＸＥＰＨＡを含むが、これらに限定されず、好ましくは、エポキシ型樹脂球は、エポキシ官能基を有するポリマー樹脂球であり、より好ましくは、エポキシ型樹脂球はＣ２～Ｃ８長さの炭素鎖アームを有するエポキシ官能基であり、より好ましくは、エポキシ型樹脂球は、エポキシ官能基を有するポリメタクリレート樹脂、ポリスチレン樹脂又はメタクリル酸エステルとスチレンとの共重合体の樹脂球を含むが、これらに限定されず、より好ましくは、エポキシ型樹脂球は、ＳｅｐｌｉｔｅＬＸＨＦＡ００１又はＬｉｆｅｔｅｃｈＴＭＥＣＲ８２８５を含むが、これらに限定されない。
【0017】
さらに、固定化トランスアミナーゼは、トランスアミナーゼ変異体が金属親和性吸着型キャリアと親和吸着した親和キャリア固定化酵素を含み、好ましくは、キャリアがポリメタクリル酸マトリックスの樹脂球であり、より好ましくは、樹脂球がＮＴＡ又はＩＤＡを金属イオンとキレートするリガンドとし、より好ましくは、樹脂球は、末端に金属イオンリガンドがキレートされ、さらに好ましくは、金属イオンリガンドは、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋又はＦｅ３＋を含むが、これらに限定されず、さらに好ましくは、樹脂球は、ＩＭＡＣ－Ｎｉ又はＭＩＤＡ－Ｎｉを含むが、これらに限定されず、さらに好ましくは、樹脂は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＰｒｏｆｉｎｉｔｙＴＭＩＭＡＣ Ｒｅｓｉｎ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｎｉ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｃｏ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｃｕ又はＰｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｆｅを含むが、これらに限定されない。
【0018】
本願の第５態様によれば、上記トランスアミナーゼ変異体又は固定化トランスアミナーゼであるトランスアミナーゼを用いてケトン系化合物及びアミノ基供与体に対してアミノ基転移触媒反応を行うステップを含むトランスアミナーゼでキラルアミンを生産する方法を提供する。
【0019】
さらに、当該方法は、バッチ反応又は連続反応であり、好ましくは、バッチ反応又は連続反応は、水相又は有機相中で行われる反応であり、好ましくは、水相中で反応する条件は、全系体積の７０％以下の、水と相互溶解する有機溶媒を溶解補助剤として水溶液に加えて触媒反応を行うことであり、さらに、有機溶媒は、メタノール、エタノール又はジメチルスルホキシドであり、好ましくは、有機相中で反応する条件は、水と相互溶解しない水飽和有機溶媒中で触媒反応を行うこと、さらに、水飽和のメチル‐ターシャリ‐ブチルエーテル溶液又は水飽和酢酸イソプロピル溶液中で触媒反応を行うことであり、好ましくは、固定化トランスアミナーゼは上記固定化トランスアミナーゼであり、固定化トランスアミナーゼを管路に充填することにより充填層連続反応が実現され、好ましくは、固定化酵素の連続使用時間は、４００時間以上であり、好ましくは、固定化酵素の空時収量は３．６～７．２ｍｏｌ／Ｌ／日である。
【0020】
さらに、上記ケトン系化合物は、
であり、ここで、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立してＣ１～Ｃ８アルキル基、Ｃ５～Ｃ１０シクロアルキル基又はＣ６～Ｃ１０アリール基であり、又は、Ｒ１及びＲ２は、カルボニル基上の炭素と共にＣ５～Ｃ１０複素環基又はＣ５～Ｃ１０炭素環式基を形成し、Ｃ５～Ｃ１０複素環基中のヘテロ原子は、それぞれ独立して窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択される少なくとも１種であり、Ｃ６～Ｃ１０アリール基中のアリール基、Ｃ５～Ｃ１０炭素環式基中の炭素環式基又はＣ５～Ｃ１０複素環基中の複素環基は、それぞれ独立して置換されていないか、又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つによって置換され、好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立してＣ５～Ｃ１０ヘテロシクロアルカンであり、Ｃ５～Ｃ１０ヘテロシクロアルカン中のヘテロ原子は、それぞれ独立して窒素、酸素及び硫黄からなる群より選択される少なくとも１種であり、Ｃ５～Ｃ１０ヘテロシクロアルカンの炭素環式基は、置換されていないか、又はハロゲン、アルコキシ基又はアルキル基のうちの少なくとも１つによって置換され、好ましくは、ケトン系化合物は、
であってもよく、ここで、アミノ基転移反応の生成物は、
である。
【化1】
【化2】
【化3】
【0021】
本願の第６態様によれば、固定化トランスアミナーゼの生産方法を提供し、当該生産方法は、上記トランスアミナーゼ変異体であるトランスアミナーゼ変異体を固定化するステップを含む。
【0022】
さらに、当該生産方法においてトランスアミナーゼ変異体を固定化するステップは、トランスアミナーゼ変異体を架橋固定して固定化酵素凝集体を形成することを含み、好ましくは、トランスアミナーゼ変異体を架橋固定して固定化酵素凝集体を形成することは、沈殿剤で沈殿させた酵素をグルタルアルデヒドと架橋して、固定化酵素凝集体を形成するか、又は沈殿剤で沈殿させた酵素をグルタルアルデヒドによって活性化されたＰＥＩと架橋して、固定化酵素凝集体を形成するか、又はトランスアミナーゼ変異体と、補因子によって活性化されたＰＥＩとをグルタルアルデヒドを介して架橋して、固定化酵素凝集体を形成することを含む。
【0023】
さらに、当該生産方法においてトランスアミナーゼ変異体を固定化するステップは、トランスアミナーゼ変異体とキャリアとを連結して、固定化酵素を形成することを含み、好ましくは、キャリアが架橋ポリマー樹脂球であり、好ましくは、樹脂球は、マクロポーラス型吸着樹脂球、アミノ基型樹脂球又はエポキシ型樹脂球を含み、好ましくは、マクロポーラス型吸着樹脂球のマトリックスは、官能基を有さないポリスチレンであり、より好ましくは、マクロポーラス型吸着樹脂球は、ＮＫＡ９、ＬＸＥＰ１２０、ＡＢ－８、ＥＣＲ８８０６、ＸＡＤ－７又はＤ３５２０を含むが、これらに限定されず、好ましくは、アミノ基型樹脂球は、アミノ官能基を有する架橋ポリマー樹脂球であり、より好ましくは、アミノ基型樹脂球の官能基は、Ｃ２又はＣ６長さの炭素鎖アームを有するアミノ官能基であり、より好ましくは、アミノ基型樹脂球は、ポリメタクリレート、ポリスチレン樹脂又はメタクリル酸エステルとスチレンとの共重合体の樹脂球を含み、より好ましくは、アミノ基型樹脂球は、ＬｉｆｅｔｅｃｈＴＭＥＣＲ８３０９、ＬｉｆｅｔｅｃｈＴＭＥＣＲ８４０９、ＳｅｐｌｉｔｅＬＸ１０００ＨＡ又はＳｅｐｌｉｔｅＬＸＥＰＨＡを含み、より好ましくは、エポキシ型樹脂球は、エポキシ官能基を有するポリマー樹脂球であり、より好ましくは、エポキシ型樹脂球は、Ｃ２～Ｃ８長さアームのエポキシ官能基を有し、より好ましくは、エポキシ型樹脂球は、エポキシ官能基を有するポリメタクリレート、ポリスチレン樹脂又はメタクリル酸エステルとスチレンとの共重合体の樹脂を含み、より好ましくは、エポキシ型樹脂球は、ＳｅｐｌｉｔｅＬＸＨＦＡ００１又はＬｉｆｅｔｅｃｈＴＭＥＣＲ８２８５を含む。
【0024】
さらに、当該生産方法においてトランスアミナーゼ変異体を固定化するステップは、トランスアミナーゼ変異体とキャリアとを親和吸着によって親和固定化酵素に形成することを含み、好ましくは、トランスアミナーゼ変異体とキャリアとを共培養して、親和固定化酵素を得、好ましくは、トランスアミナーゼ変異体は複数のＨｉｓ－タグを有し、好ましくは、キャリアがポリメタクリル酸マトリックスの樹脂球であり、より好ましくは、樹脂球は、ＮＴＡ又はＩＤＡリガンドを含み、より好ましくは、樹脂球は、末端に金属イオンリガンドがキレートされ、さらに好ましくは、金属イオンリガンドはＮｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋又はＦｅ３＋を含み、さらに好ましくは、キャリアはＩＭＡＣ－Ｎｉ又はＭＩＤＡ－Ｎｉを含み、さらに好ましくは、キャリアは、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＰｒｏｆｉｎｉｔｙＴＭＩＭＡＣ Ｒｅｓｉｎ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｎｉ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｃｏ、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｃｕ又はＰｕｒｏｌｉｔｅ ＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｆｅを含む。
【発明の効果】
【0025】
本発明の技術的解決手段を適用して、指向進化・スクリーニングによって得られた、活性、安定性、温度、ｐＨ及び有機溶媒に対する耐性が向上した変異体により、生産における酵素使用量が低下しただけでなく、各種類の固定化酵素に製造する可能性も大きく向上した。上記指向進化後のトランスアミナーゼを固定化（自己架橋又はキャリアと共有結合）することにより、固定化トランスアミナーゼの水相反応及び有機相反応への適用が実現され、酵素と反応系との分離を容易にし、反応後処理過程における酵素タンパク質の残留による乳化現象を低減するとともに、固定化トランスアミナーゼ変異体は、様々な極端環境に耐え得ることができ、活性の損失が小さく、繰り返し使用回数が多く、空時収量が高く、工業化の連続的なアミノ基転移反応に適する。
【発明を実施するための形態】
【0026】
なお、本願における実施例及び実施例の特徴は、矛盾しない限り、互いに組み合わせることができ、以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明する。
【0027】
名詞解釈：
固定化酵素とは、一定の空間範囲内で、その触媒作用を繰り返して連続的に使用できる酵素をいう。通常、酵素触媒反応は、水溶液中で行われるが、固定化酵素は、水溶性酵素を、水に溶解しないが、依然として酵素活性を有する状態になるように物理方法又は化学方法で処理したものである。酵素は、固定化された後、安定性が増すのが一般的で、反応系からの分離が容易で、制御が容易で、複数回の使用が可能で、輸送や保存が容易であるため、自動化生産に有利であるが、活性が低下して、使用範囲が小さくなる。
固定化酵素とは、一定の空間範囲内で、その触媒作用を繰り返して連続的に使用できる酵素をいう。通常、酵素触媒反応は、水溶液中で行われるが、固定化酵素は、水溶性酵素を、水に溶解しないが、依然として酵素活性を有する状態になるように物理方法又は化学方法で処理したものである。酵素は、固定化された後、安定性が増すのが一般的で、反応系からの分離が容易で、制御が容易で、複数回の使用が可能で、輸送や保存が容易であるため、自動化生産に有利であるが、活性が低下して、使用範囲が小さくなる。
【0028】
部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ又はｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）とは、ターゲットＤＮＡ断片の指定された部位に特定の塩基対を導入する方法をいう。遺伝子の特定部位のヌクレオチド配列を変更することにより、コードされるアミノ酸配列を変更し、ある（一部の）アミノ酸残基のタンパク質の構造及び機能に対する影響の研究によく使用される。酵素の合理的設計において、部位特異的突然変異方法を用いて触媒活性、基質の特異性及び／又は安定性が向上した突然変異酵素をスクリーニングすることができる。
【0029】
飽和突然変異は、ターゲットタンパク質のコード遺伝子を改変することにより、標的部位のアミノ酸がそれぞれ他の１９種のアミノ酸によって置換された変異体を短時間内で取得する方法である。この方法は、タンパク質を指向改変する強力なツールであるだけでなく、タンパク質の構造－機能関係を研究する重要な手段でもある。飽和突然変異は、単一部位突然変異よりも理想的な進化体を得ることができる場合がしばしばある。部位特異的突然変異方法で解決できないこれらの問題は、飽和突然変異方法が得意とする独特な点である。
【0030】
活力回収とは、固定化酵素の総活力と、固定化のための酵素の総活力との比をいう。酵素を固定化する際に、キャリアに結合されていない一部の酵素が常に存在し、酵素の活力回収の測定により、固定化の効果を決定でき、一般的な状況で活力回収は１未満である。
【0031】
空時収量（ｓｐａｃｅ－ｔｉｍｅ ｙｉｅｌｄ、ＳＴＹ）とは、単位体積又は単位面積の機器が単位時間内に得るターゲット生成物の数量（又は投入される原料量）をいう。
【0032】
以下、実験を参照して、本願の技術的解決手段及び技術効果について説明する。
【0033】
一、酵素活性及び温度、ｐＨ、有機試薬耐性が向上した変異体のスクリーニング
本解決手段は、ＴＡ－Ｃｖ－１（Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ、ＣＮ１０８３８４７６７Ｂ、配列番号１で示されるような配列）をテンプレートとして、指向進化の方法により、ＴＡ－Ｃｖ－１の活力、温度や有機溶媒に対する耐性を一層向上させ、固定化後に触媒反応によりよく適用するようにした。
本解決手段は、ＴＡ－Ｃｖ－１（Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌ、ＣＮ１０８３８４７６７Ｂ、配列番号１で示されるような配列）をテンプレートとして、指向進化の方法により、ＴＡ－Ｃｖ－１の活力、温度や有機溶媒に対する耐性を一層向上させ、固定化後に触媒反応によりよく適用するようにした。
【0034】
配列番号１の配列は、次のようである。
【化4】
【0035】
ＴＡ－Ｃｖ－１をテンプレートとし、部位特異的突然変異プライマーを設計して、８つの部位に対して部位特異的突然変異（Ｆ２２Ｍ、Ｍ５６Ａ、Ｍ５６Ｇ、Ｍ５６Ｇ、Ｗ６０Ｙ、Ｆ８９Ｖ、Ｙ１６８Ａ、Ｉ２６２Ｌ、Ｖ４２３Ｌ、Ｖ４２３Ｉ、Ｖ３７９Ｗ、４１８Ｗ）を行った。タンパク質構造の分析により、部位Ｖ３７９及びＣ４１８は、酵素安定性を向上させる重要な部位であり、この２つの部位に対して飽和突然変異を行うことに重点を置き、飽和突然変異プライマーの配列を表１に示した。
【表1】
【0036】
プラスミドＰＣＲ全体により完全な線状断片を取得し、上記ＰＣＲ生成物をＤｐｎ Ｉにより消化して出発遺伝子の親テンプレートを除去した後、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換して、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培養皿に塗り、３７℃で一晩培養した。部位特異的突然変異では、遺伝子シークエンシングを用いて突然変異部位を決定し、飽和突然変異では、ハイスループットでスクリーニングしてから遺伝子シークエンシングによって突然変異部位を決定し、部位特異的突然変異手段を利用して、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）を発現キャリアとして、ターゲット遺伝子を持つ突然変異プラスミドを取得した。突然変異プラスミドを大腸菌細胞内に形質転換し、トランスアミナーゼが発現するように誘導する最適条件は、２５℃、０．１ｍＭのＩＰＴＧで一晩誘導することである。超音波で細胞を破砕する方法で粗酵素を取得した。
【0037】
５０～６０℃、ｐＨ１０、５０％～７０％ＤＭＳＯ又は４０％ＭｅＯＨの極端な環境で、突然変異株が発現した酵素液を１ｈ処理した後、基質１（Ｎ－Ｂｏｃ－３－ピペリドン）又は基質２（Ｎ－Ｃｂｚ－３－ピロリドン）を加え、引き続きこの条件で１６ｈ反応させた後、形質転換率を検出し、この方式で温度、ｐＨ及び有機溶媒に対する耐性が向上した変異体をスクリーニングした。突然変異部位のＷ６０Ｙ、Ｙ１６８Ａ、Ｖ３７９Ｗ、Ｖ３７９Ｌ、Ｖ３７９Ｍ、Ｃ４１８Ｑ、Ｃ４１８Ｗにおける変異体の、５０℃、ｐＨ１０、５０％ＤＭＳＯの環境に対する耐性は、親よりも１．０５～１．２倍向上し、６０℃、ｐＨ１０、６０％ＤＭＳＯ環境に対する耐性は、親よりも１．３倍～２．５倍向上し、６０℃、ｐＨ１０、７０％ＤＭＳＯの環境に対する耐性は、親よりも３．３倍～４．２倍向上し、６０℃、ｐＨ１０、４０％ＭｅＯＨの環境に対する耐性は、親よりも２．７倍～４倍向上した。
【化5】
【0038】
本研究では、安定性及び耐性がよりよい酵素に一層進化させるために、トランスアミナーゼの安定性及び耐性に対して肯定的な効果を有するこれらの部位に対して複数部位の組合せ突然変異を行い、指向スクリーニング方法により安定性及び耐性が一層向上した複数部位変異体を取得する。組合せ突然変異を行う突然変異部位の例は、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｌ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｍ、Ｗ６０Ｙ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ、Ｙ１６８Ａ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｙ１６８Ａ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｑ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｗ＋Ｃ４１８Ｗ、Ｗ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｌ＋Ｃ４１８Ｗ又はＷ６０Ｙ＋Ｙ１６８Ａ＋Ｖ３７９Ｍ＋Ｃ４１８Ｗである。
【0039】
本願の変異体は、さらに、上記突然変異部位を有し、且つ突然変異が発生したアミノ酸配列と８５％以上（好ましくは９０％以上、又は９５％以上、又は９９％以上、又は９９．９５％以上、又はさらに９９．９９％以上）の相同性を有する変異体であってもよく、同時にトランスアミナーゼ活性を有する。より好ましくは、これらの変異体は、いずれもＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍに由来し、且つトランスアミナーゼ活性を有するものである。
【0040】
突然変異プラスミドを大腸菌細胞内に形質転換し、２５℃、０．１ｍＭのＩＰＴＧで一晩誘導するのが、トランスアミナーゼの発現を誘導する最適条件である。超音波で細胞を破砕する方法により粗酵素を取得した。
【0041】
７０℃、ｐＨ１０、４５％ＭｅＯＨを含有する環境などのより極端な条件で、酵素液を１ｈ処理した後、基質１を加え、引き続きこの条件で、１６ｈを反応させ、形質転換率を検出した。組合せ突然変異は、この条件で処理された後、活性が親よりも２～６倍向上した。
【0042】
二、トランスアミナーゼの架橋酵素凝集体（ＣＬＥＡｓ）の調製
架橋法により固定化されたトランスアミナーゼは、（親ＴＡ－Ｃｖ－１、及び当該親を基に得られた変異体Ｃ４１８Ｑ＋Ｖ３７９Ｌ、Ｃ４１８Ｑ＋Ｖ３７９Ｍ）から選択され、酵素液を調製する緩衝液に０．４～１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰを含有し、酵素液のｐＨは７．０～８．０であった。酵素タンパク質沈殿を調製するために使用された沈殿剤はエタノール、硫酸アンモニウム、アセトニトリルであった。酵素タンパク質の架橋凝集体を調製し、使用される架橋剤は２５％グルタルアルデヒド溶液又はポリエチレンイミンで処理した後のグルタルアルデヒド（ＣＮ１１１２３５１４０Ｂ）であり、グルタルアルデヒドの最終濃度は、１００ｍＭ～５００ｍＭであった。調製した架橋酵素凝集体は、ろ過して得た水含有架橋酵素を直接使用して水相で触媒反応を行うか、又は水含有架橋酵素を凍結乾燥して乾燥粉末を得てから適用することができ、凍結乾燥粉末は、有機溶媒相中の反応にも適用できる。
架橋法により固定化されたトランスアミナーゼは、（親ＴＡ－Ｃｖ－１、及び当該親を基に得られた変異体Ｃ４１８Ｑ＋Ｖ３７９Ｌ、Ｃ４１８Ｑ＋Ｖ３７９Ｍ）から選択され、酵素液を調製する緩衝液に０．４～１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰを含有し、酵素液のｐＨは７．０～８．０であった。酵素タンパク質沈殿を調製するために使用された沈殿剤はエタノール、硫酸アンモニウム、アセトニトリルであった。酵素タンパク質の架橋凝集体を調製し、使用される架橋剤は２５％グルタルアルデヒド溶液又はポリエチレンイミンで処理した後のグルタルアルデヒド（ＣＮ１１１２３５１４０Ｂ）であり、グルタルアルデヒドの最終濃度は、１００ｍＭ～５００ｍＭであった。調製した架橋酵素凝集体は、ろ過して得た水含有架橋酵素を直接使用して水相で触媒反応を行うか、又は水含有架橋酵素を凍結乾燥して乾燥粉末を得てから適用することができ、凍結乾燥粉末は、有機溶媒相中の反応にも適用できる。
【0043】
架橋酵素凝集体の活力回収は８０％以上に達し得る。架橋酵素凝集体を１回使用した後、遠心分離又はろ過等の方式により回収してから使用することができ、活力損失＜５％の範囲内で繰り返し使用回数を統計し、変異体の架橋酵素凝集体を水相反応に適用する場合、９～３０回繰り返して使用することができ、活性損失＜５％であり、１００％有機相溶媒中で反応させる場合、１９～３５回繰り返して使用することができる。
【0044】
当該トランスアミナーゼの架橋酵素凝集体は、従来技術に比べ、活性、安定性及び機械的強度がある程度向上し、充填層の連続反応、特にキャリアフリー固定化に使用できる。
【0045】
三、トランスアミナーゼの固定化方法及び活性
１．トランスアミナーゼの吸着固定化方法
本研究の吸着固定化方法に使用される樹脂キャリアは、マクロポーラス型吸着樹脂キャリアである。本研究の吸着固定化方法に使用されるキャリア情報を表２に列挙した。
１．トランスアミナーゼの吸着固定化方法
本研究の吸着固定化方法に使用される樹脂キャリアは、マクロポーラス型吸着樹脂キャリアである。本研究の吸着固定化方法に使用されるキャリア情報を表２に列挙した。
【表2】
【0046】
本研究の共有結合法によって固定化されたトランスアミナーゼは、（変異体Ｗ６０Ｙ、Ｃ４１８Ｑ、Ｃ４１８Ｑ＋Ｖ３７９Ｌ、Ｃ４１８Ｑ＋Ｖ３７９Ｍ）から選択され、吸着固定化され、酵素液とキャリアとを直接混合し、２０℃、８０ｒｐｍの低速で一晩撹拌し、ろ過して沈殿を収集し、沈殿を緩衝液で洗った。
【0047】
２．トランスアミナーゼの共有固定化方法
本研究の共有固定化方法に使用される樹脂キャリアは、アミノ基型キャリア及びエポキシ型キャリアを含む。本研究の共有固定化方法に使用されるキャリア情報を表３に列挙した。
本研究の共有固定化方法に使用される樹脂キャリアは、アミノ基型キャリア及びエポキシ型キャリアを含む。本研究の共有固定化方法に使用されるキャリア情報を表３に列挙した。
【表3】
【0048】
上記アミノ基型キャリアは、ピューロライト（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ）のＬｉｆｅｔｅｃｈＴＭＥＣＲ８３０９、ＬｉｆｅｔｅｃｈＴＭＥＣＲ８４０９、藍暁科技（ＳＵＮＲＥＳＩＮ ＮＥＷ ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ ＣＯ．，ＬＴＤ）のＳｅｐｌｉｔｅＬＸ１０００ＨＡ又はＳｅｐｌｉｔｅＬＸＥＰＨＡを含むが、これらに限定されず、エポキシ型キャリアは、藍暁科技のＳｅｐｌｉｔｅＬＸＨＦＡ００１又はピューロライトのＬｉｆｅｔｅｃｈＴＭＥＣＲ８２８５を含むが、これらに限定されない。
【0049】
本研究では、トランスアミナーゼを、エポキシ官能基を有する樹脂と直接共有結合を介して結合させ、グルタルアルデヒドによって活性化された、短鎖又は長鎖アミノ官能基を有する樹脂と共有結合を介して結合させた。
【0050】
本研究の共有結合法により固定化されたトランスアミナーゼは、（親ＴＡ－Ｃｖ－１、変異体Ｗ６０Ｙ、Ｃ４１８Ｑ、Ｃ４１８Ｑ＋Ｖ３７９Ｌ、Ｃ４１８Ｑ＋Ｖ３７９Ｍ）から選択され、酵素液の調製に使用される緩衝液に０．４～１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰを含有し、緩衝液のｐＨは７．０～８．０であり、緩衝塩はＰＢ緩衝液、Ｎａ２ＨＰＯ４－ＮａＨ２ＰＯ４、Ｔｒｉｓ－Ｃｌ又はホウ酸－水酸化ナトリウムであった。
【0051】
アミノ基型キャリアに共有固定化し、まず、キャリアをグルタルアルデヒドで活性化させてから、酵素液を加え、２０℃で一晩培養し、ろ過して沈殿を収集し、沈殿を緩衝液で洗った。
【0052】
エポキシ型キャリアに共有固定化し、酵素液とキャリアとを直接混合し、２０℃で一晩培養し、その後２０ｈ静置し、ろ過して沈殿を収集し、沈殿を緩衝液で洗った。
【0053】
３．トランスアミナーゼの親和固定化方法
本研究の親和固定化方法に使用されるキャリアは、ポリマーフィルムで修飾されるとともに、末端に金属イオンがキレートされている樹脂である。キレートされる金属イオンは、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ３＋を含むが、これらに限定されない。本研究の親和固定化方法に使用されるキャリア情報を表４に列挙した。
本研究の親和固定化方法に使用されるキャリアは、ポリマーフィルムで修飾されるとともに、末端に金属イオンがキレートされている樹脂である。キレートされる金属イオンは、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｆｅ３＋を含むが、これらに限定されない。本研究の親和固定化方法に使用されるキャリア情報を表４に列挙した。
【表4】
【0054】
上記ＩＭＡＣ－Ｎｉキャリアは、バイオ・ラッド（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のＰｒｏｆｉｎｉｔｙＴＭＩＭＡＣ Ｒｅｓｉｎ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ－ｒａｄ．ｃｏｍ／ｚｈ－ｃｎ／ｐｒｏｄｕｃｔ／ｐｒｏｆｉｎｉｔｙ－ｉｍａｃ－ｒｅｓｉｎ？ＩＤ＝ｅ５４ａｂ０３ｃ－ｄ２８１－４ｅ６ｂ－ａａ０ｄ－１９３ｂ７７３７６２６ｄ）を含むが、これらに限定されず、ＭＩＤＡ－Ｎｉキャリアは、ピューロライトのＣｈｒｏｍａｌｉｔｅＴＭＭＩＤＡ／Ｍ／Ｎｉ、ＭＩＤＡ／Ｍ／Ｃｏ、ＭＩＤＡ／Ｍ／Ｃｕ、ＭＩＤＡ／Ｍ／Ｆｅ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｕｒｏｌｉｔｅ．ｃｏｍ／ｌｓ－ｐｒｏｄｕｃｔ／ｓｐｅｃｔｒａｃｈｒｏｍ－ｋｉｔ）を含むが、これらに限定されない。
【0055】
本研究の親和結合法によって固定化されたトランスアミナーゼは、（親ＴＡ－Ｃｖ－１、変異体Ｗ６０Ｙ、Ｃ４１８Ｑ、Ｃ４１８Ｑ＋Ｖ３７９Ｌ、Ｃ４１８Ｑ＋Ｖ３７９Ｍ）から選択される。キャリアに、０．４ｍｇ／ｍＬのＰＬＰを含有するリン酸二水素ナトリウム－リン酸水素二ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）を５ｍＬ加えるとともに、酵素を０．１ｇ加え、２０℃、８０ｒｐｍの低速で４０～６０ｍｉｎ撹拌した。上清を捨て、沈殿を緩衝液で３～４回洗浄した。
【0056】
調製された固定化酵素を、窒素ガスで乾燥、真空乾燥、冷凍乾燥等の方式で乾燥処理することができる。
【0057】
４．固定化トランスアミナーゼの活性
本研究は、トランスアミナーゼを共有結合又は親和吸着の方式で上記キャリアに固定化し、短鎖アミノ基型キャリアに固定化すると、活力回収は５０％～９５％であり、長鎖アミノ基型キャリアに固定化すると、活力回収は９０％～１００％であり、エポキシ型キャリアに固定化すると、活力回収は８０％～１００％であった。親和キャリアに固定化すると、活力回収は９０％～１００％であった。吸着キャリアに固定化して、有機相反応で活力を検証すると、活力回収＞１００％であった。
本研究は、トランスアミナーゼを共有結合又は親和吸着の方式で上記キャリアに固定化し、短鎖アミノ基型キャリアに固定化すると、活力回収は５０％～９５％であり、長鎖アミノ基型キャリアに固定化すると、活力回収は９０％～１００％であり、エポキシ型キャリアに固定化すると、活力回収は８０％～１００％であった。親和キャリアに固定化すると、活力回収は９０％～１００％であった。吸着キャリアに固定化して、有機相反応で活力を検証すると、活力回収＞１００％であった。
【0058】
固定化酵素は、ろ過又は注射器での液体吸引等の方式により回収され、繰り返して使用でき、活力損失＜５％の範囲内で繰り返し使用回数を統計し、短鎖アミノ基型キャリアに固定化すると、一部の酵素は１８回繰り返して使用でき、長鎖アミノ基型キャリアに固定化すると、一部の変異体に対する酵素を２５回まで繰り返して使用でき、エポキシ型キャリアに固定化すると、一部の酵素を２０回繰り返して使用できる。親和キャリアに固定化すると、７～２０回繰り返して使用でき、１００％の有機溶媒中で触媒機能を果たすことができ、１０～２０回繰り返して使用し、活性損失＜５％であった。吸着キャリアに固定化すると、１００％の有機溶媒中で反応するとき、９～２０回繰り返して使用できる。
【0059】
以下、具体的な実施例を参照して本願の有益な効果についてさらに説明する。
【0060】
（実施例１）
変異体の５０℃、ｐＨ１０、５０％のＤＭＳＯに対する耐性検出
粗酵素を５０℃、ｐＨ１０、ＤＭＳＯの濃度が５０％である環境で１ｈ処理し、その後１０ｍＬの反応瓶に基質２を０．１ｇ加え、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び０．６～１ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加えてから、上記処理後の酵素を４ｍｇ加え、５０℃、ｐＨ１０、ＤＭＳＯの濃度が５０％である環境で１６ｈ恒温撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、変異体の反応データを表５に示した。
変異体の５０℃、ｐＨ１０、５０％のＤＭＳＯに対する耐性検出
粗酵素を５０℃、ｐＨ１０、ＤＭＳＯの濃度が５０％である環境で１ｈ処理し、その後１０ｍＬの反応瓶に基質２を０．１ｇ加え、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び０．６～１ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加えてから、上記処理後の酵素を４ｍｇ加え、５０℃、ｐＨ１０、ＤＭＳＯの濃度が５０％である環境で１６ｈ恒温撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、変異体の反応データを表５に示した。
【表5】
【0061】
（実施例２）
変異体の６０℃、ｐＨ１０、６０％のＤＭＳＯに対する耐性検出
粗酵素を６０℃、ｐＨ１０、６０％のＤＭＳＯ濃度の環境で１ｈ処理し、その後１０ｍＬの反応瓶に基質２を０．１ｇ加え、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び０．６ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加えてから、上記処理後の酵素を５ｍｇ加え、引き続き６０℃、ｐＨ１０、６０％ＭｅＯＨ濃度の環境で１６ｈ恒温撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、変異体の反応データを表６に示した。
変異体の６０℃、ｐＨ１０、６０％のＤＭＳＯに対する耐性検出
粗酵素を６０℃、ｐＨ１０、６０％のＤＭＳＯ濃度の環境で１ｈ処理し、その後１０ｍＬの反応瓶に基質２を０．１ｇ加え、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び０．６ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加えてから、上記処理後の酵素を５ｍｇ加え、引き続き６０℃、ｐＨ１０、６０％ＭｅＯＨ濃度の環境で１６ｈ恒温撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、変異体の反応データを表６に示した。
【表6】
【0062】
（実施例３）
変異体の６０℃、ｐＨ１０、７０％のＤＭＳＯに対する耐性検出
粗酵素を６０℃、ｐＨ１０、７０％ＤＭＳＯ濃度の環境で１ｈ処理し、その後１０ｍＬの反応瓶に基質２を０．１ｇ加え、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び０．６～１ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加えてから、上記処理後の酵素を１０ｍｇ加え、続いて６０℃、ｐＨ１０、７０％のＤＭＳＯ濃度の環境で１６ｈ恒温撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、変異体の反応データを表７に示した。
変異体の６０℃、ｐＨ１０、７０％のＤＭＳＯに対する耐性検出
粗酵素を６０℃、ｐＨ１０、７０％ＤＭＳＯ濃度の環境で１ｈ処理し、その後１０ｍＬの反応瓶に基質２を０．１ｇ加え、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び０．６～１ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加えてから、上記処理後の酵素を１０ｍｇ加え、続いて６０℃、ｐＨ１０、７０％のＤＭＳＯ濃度の環境で１６ｈ恒温撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、変異体の反応データを表７に示した。
【表7】
【0063】
（実施例４）
変異体の６０℃、ｐＨ１０、４０％メタノールに対する耐性検出
粗酵素を６０℃、ｐＨ１０、４０％ＭｅＯＨ濃度の環境で１ｈ処理し、その後１０ｍＬの反応瓶に基質１を０．１ｇ加え、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び０．６～１ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加えてから、上記処理後の酵素を１０ｍｇ加え、引き続き６０℃、ｐＨ１０、４０％ＭｅＯＨ濃度の環境で１６ｈ恒温撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、変異体の反応データを表８に示した。
変異体の６０℃、ｐＨ１０、４０％メタノールに対する耐性検出
粗酵素を６０℃、ｐＨ１０、４０％ＭｅＯＨ濃度の環境で１ｈ処理し、その後１０ｍＬの反応瓶に基質１を０．１ｇ加え、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び０．６～１ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加えてから、上記処理後の酵素を１０ｍｇ加え、引き続き６０℃、ｐＨ１０、４０％ＭｅＯＨ濃度の環境で１６ｈ恒温撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、変異体の反応データを表８に示した。
【表8】
【0064】
（実施例５）
変異体の７０℃、ｐＨ１０、４５％メタノールに対する耐性検出
粗酵素を７０℃、ｐＨ１０、４５％ＭｅＯＨ濃度の環境で１ｈ処理し、その後１０ｍＬの反応瓶に基質１を０．１ｇ加え、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び０．６～１ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加えてから、上記処理後の酵素を１０ｍｇ加え、引き続き７０℃、ｐＨ１０、４５％ＭｅＯＨ濃度の環境で１６ｈ恒温撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、変異体の反応データを表９に示した。
変異体の７０℃、ｐＨ１０、４５％メタノールに対する耐性検出
粗酵素を７０℃、ｐＨ１０、４５％ＭｅＯＨ濃度の環境で１ｈ処理し、その後１０ｍＬの反応瓶に基質１を０．１ｇ加え、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び０．６～１ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加えてから、上記処理後の酵素を１０ｍｇ加え、引き続き７０℃、ｐＨ１０、４５％ＭｅＯＨ濃度の環境で１６ｈ恒温撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、変異体の反応データを表９に示した。
【表9】
【0065】
（実施例６）
架橋固定化
０．１ｇの酵素粉末を２ｍＬのリン酸緩衝液（０．１ＭのＰＢ、ｐＨ７．０～８．０、０．４～１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を含有）で溶解し、氷水浴で撹拌しながらエタノールを１０ｍＬ、又はアセトニトリルを７ｍＬ、又はＰＥＧ６０００固体（最終濃度が２０～６０％）又は硫酸アンモニウム（最終濃度が４０～７０％）をゆっくり加えて沈殿剤とし、添加が終了すると、４０～６０ｍｉｎ撹拌してから、２５％のグルタルアルデヒド溶液（最終濃度が１００～５００ｍＭ）を加え、氷水浴で３０～４０ｍｉｎ撹拌した後、遠心分離するか又はろ過し、沈殿をリン酸緩衝液で３回洗浄した後、４℃で保存し、水相反応に直接適用できる。又は、架橋酵素凝集体を凍結乾燥し、凍結乾燥して得た架橋酵素凝集体の凍結乾燥粉末は水相及び有機相反応に適用できる。
架橋固定化
０．１ｇの酵素粉末を２ｍＬのリン酸緩衝液（０．１ＭのＰＢ、ｐＨ７．０～８．０、０．４～１ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を含有）で溶解し、氷水浴で撹拌しながらエタノールを１０ｍＬ、又はアセトニトリルを７ｍＬ、又はＰＥＧ６０００固体（最終濃度が２０～６０％）又は硫酸アンモニウム（最終濃度が４０～７０％）をゆっくり加えて沈殿剤とし、添加が終了すると、４０～６０ｍｉｎ撹拌してから、２５％のグルタルアルデヒド溶液（最終濃度が１００～５００ｍＭ）を加え、氷水浴で３０～４０ｍｉｎ撹拌した後、遠心分離するか又はろ過し、沈殿をリン酸緩衝液で３回洗浄した後、４℃で保存し、水相反応に直接適用できる。又は、架橋酵素凝集体を凍結乾燥し、凍結乾燥して得た架橋酵素凝集体の凍結乾燥粉末は水相及び有機相反応に適用できる。
【0066】
（実施例７）
グルタルアルデヒドによって活性化されたＰＥＩ架橋固定化酵素凝集体の調製（ＧＡ：Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ、ＰＥＩ：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｉｍｉｎｅ、ＧＰ：ＧＡ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＰＥＩ、グルタルアルデヒドによって活性化されたＰＥＩ）
活性化されたＰＥＩ溶液の調製（ＧＰ）：１００ｍＬの水溶液にグルタルアルデヒドを２ｇ及びＰＥＩ（３－７０ＫＤａ）を４ｇ加え、ｐＨ８．０で３ｈ撹拌した。
グルタルアルデヒドによって活性化されたＰＥＩ架橋固定化酵素凝集体の調製（ＧＡ：Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ、ＰＥＩ：Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｉｍｉｎｅ、ＧＰ：ＧＡ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＰＥＩ、グルタルアルデヒドによって活性化されたＰＥＩ）
活性化されたＰＥＩ溶液の調製（ＧＰ）：１００ｍＬの水溶液にグルタルアルデヒドを２ｇ及びＰＥＩ（３－７０ＫＤａ）を４ｇ加え、ｐＨ８．０で３ｈ撹拌した。
【0067】
固定化：１０ｍＬの酵素（酵素タンパク質の含有量は１００～２００ｍｇ／ｍＬであり、対応して１～５ｍｇ／ｍＬの補因子を含有する）を丸底フラスコに入れ、５～１０℃に冷却した後、１０ｍｉｎ混合した。硫酸アンモニウム（４０％～７０％）、エタノール（５０％～９０％）又はＰＥＧ（２０％～６０％）等の沈殿剤をゆっくり加え、３０～６０ｍｉｎ混合して、沈殿酵素を得た。沈殿酵素に活性化されたＰＥＩ溶液を１５ｍＬ滴下して、１０～３０ｍｉｎ混合し、１～２ｈ静置した後に遠心分離した。不溶性の沈殿物を収集して、３０メッシュの篩にかけた。０．１ＭのＰＢ（ｐＨ７．５）で洗浄した。
【0068】
（実施例８）
補因子によって活性化されたＰＥＩ架橋固定化酵素凝集体の調製
補因子によって活性化されたＰＥＩ溶液の調製：ＰＥＩ（Ｍｗ＝３－７０ＫＤａ）を水でＰＥＩの最終濃度が１ｇ／ｍＬ～２ｇ／ｍＬになるまで希釈し、ｐＨ値は７．０～１１．０であった。酵素のニーズに応じて、ＰＥＩ溶液に１～５ｍｇ／ｍＬの補因子ＰＬＰを加え、室温で３０～６０ｍｉｎ混合した。
補因子によって活性化されたＰＥＩ架橋固定化酵素凝集体の調製
補因子によって活性化されたＰＥＩ溶液の調製：ＰＥＩ（Ｍｗ＝３－７０ＫＤａ）を水でＰＥＩの最終濃度が１ｇ／ｍＬ～２ｇ／ｍＬになるまで希釈し、ｐＨ値は７．０～１１．０であった。酵素のニーズに応じて、ＰＥＩ溶液に１～５ｍｇ／ｍＬの補因子ＰＬＰを加え、室温で３０～６０ｍｉｎ混合した。
【0069】
固定化：４～１０℃で、５ｍＬの酵素液（酵素タンパク質の含有量は３０～８０ｍｇ／ｍＬであり、対応して補因子も含有する）に補因子によって活性化されたＰＥＩ溶液を７．５ｍＬ滴下し、３０～６０ｍｉｎ混合した後、架橋剤グルタルアルデヒド又はＰＥＧで修飾したグルタルアルデヒドを加えて、グルタルアルデヒドの最終濃度が０．２～１ｇ／ｍＬになるようにした。３０～６０ｍｉｎ混合した後、遠心分離して、不溶性の沈殿物を収集し、その後３０メッシュの篩にかけた。続いて０．１ＭのＰＢ（ｐＨ７．０～８．０）で洗浄した。
【0070】
（実施例９）
架橋酵素凝集体の水相反応での活性検証
１０ｍＬの反応瓶に、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び０．５ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加え、反応液の最終体積が１ｍＬになるまで０．１ＭのＰＢ７．０を追加してから、酵素を３ｍｇ又は３ｍｇの酵素で調製した架橋酵素凝集体ウェット酵素又は架橋酵素凝集体を加え、４５℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１０に示した。
架橋酵素凝集体の水相反応での活性検証
１０ｍＬの反応瓶に、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び０．５ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加え、反応液の最終体積が１ｍＬになるまで０．１ＭのＰＢ７．０を追加してから、酵素を３ｍｇ又は３ｍｇの酵素で調製した架橋酵素凝集体ウェット酵素又は架橋酵素凝集体を加え、４５℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１０に示した。
【表10】
【0071】
（実施例１０）
架橋酵素の有機相反応での活性検証
１０ｍＬの反応瓶に、水飽和メチル‐ターシャリ‐ブチルエーテルを１ｍＬ加えてから、基質１を１００ｍｇ及び４ｅｑイソプロピルアミンを加え、その後、１００ｍｇの酵素粉末で調製した架橋酵素凝集体の凍結乾燥粉末を加え、３０℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１１に示した。
架橋酵素の有機相反応での活性検証
１０ｍＬの反応瓶に、水飽和メチル‐ターシャリ‐ブチルエーテルを１ｍＬ加えてから、基質１を１００ｍｇ及び４ｅｑイソプロピルアミンを加え、その後、１００ｍｇの酵素粉末で調製した架橋酵素凝集体の凍結乾燥粉末を加え、３０℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１１に示した。
【表11】
【0072】
（実施例１１）
トランスアミナーゼの吸着固定化方法
キャリアに０．４ｍｇ／ｍＬのＰＬＰを含有するＰＢ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）を４ｍＬ加えるとともに、酵素を０．１ｇ加え、２０℃、８０ｒｐｍの低速で一晩撹拌した。上清を捨て、沈殿を緩衝液で３～４回洗浄し、上清を捨て、沈殿を窒素ガスで乾燥させるか、又は冷凍乾燥法で乾燥させ、４℃で保存した。
トランスアミナーゼの吸着固定化方法
キャリアに０．４ｍｇ／ｍＬのＰＬＰを含有するＰＢ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７．０）を４ｍＬ加えるとともに、酵素を０．１ｇ加え、２０℃、８０ｒｐｍの低速で一晩撹拌した。上清を捨て、沈殿を緩衝液で３～４回洗浄し、上清を捨て、沈殿を窒素ガスで乾燥させるか、又は冷凍乾燥法で乾燥させ、４℃で保存した。
【0073】
（実施例１２）
トランスアミナーゼを吸着固定化する酵素の有機相反応での活性検証
１０ｍＬの反応瓶に、水飽和メチル‐ターシャリ‐ブチルエーテルを１ｍＬ加えてから、基質１を１００ｍｇ及び４ｅｑイソプロピルアミンを加え、その後、５０ｍｇの酵素で調製した固定化トランスアミナーゼを加え、３０℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１２に示した。
トランスアミナーゼを吸着固定化する酵素の有機相反応での活性検証
１０ｍＬの反応瓶に、水飽和メチル‐ターシャリ‐ブチルエーテルを１ｍＬ加えてから、基質１を１００ｍｇ及び４ｅｑイソプロピルアミンを加え、その後、５０ｍｇの酵素で調製した固定化トランスアミナーゼを加え、３０℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１２に示した。
【表12】
【0074】
架橋酵素及びキャリア共有固定化酵素に比べ、吸着固定化酵素の活力回収が高く、有機相で反応し、活性及び安定性がより高い。
【0075】
（実施例１３）
アミノ基型キャリアに固定化されたトランスアミナーゼ
キャリアの活性化：１ｇのキャリアを２０ｍＭのイオン強度が低い緩衝液で１～２回洗浄し、上清液を捨て、２％のグルタルアルデヒド（２０ｍＭのイオン強度が低い緩衝液で試薬グレードの２５％グルタルアルデヒドを希釈して調製）４ｍＬを加え、２０℃、８０ｒｐｍで１ｈ活性化させ、２０ｍＭの緩衝液で１～２回洗浄して、上清を捨てた。
アミノ基型キャリアに固定化されたトランスアミナーゼ
キャリアの活性化：１ｇのキャリアを２０ｍＭのイオン強度が低い緩衝液で１～２回洗浄し、上清液を捨て、２％のグルタルアルデヒド（２０ｍＭのイオン強度が低い緩衝液で試薬グレードの２５％グルタルアルデヒドを希釈して調製）４ｍＬを加え、２０℃、８０ｒｐｍで１ｈ活性化させ、２０ｍＭの緩衝液で１～２回洗浄して、上清を捨てた。
【0076】
固定化：活性化済みのキャリアに０．４ｍｇ／ｍＬのＰＬＰを含有するＰＢ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）を４ｍＬ加えるとともに、酵素を０．１～０．２ｇ加え、２０℃、８０ｒｐｍの低速で一晩撹拌した。上清を捨て、沈殿を緩衝液で３～４回洗浄し、上清を捨て、沈殿を窒素ガスで乾燥させるか、又は冷凍乾燥法で乾燥させ、４℃で保存した。
【0077】
（実施例１４）
エポキシ型キャリアに固定化されたトランスアミナーゼ
１ｇのキャリアを１００ｍＭのＰＢ緩衝液で１～２回洗浄し、上清液を捨て、Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭのＰＢ、ｐＨ７．０、１ＭのＮａＣｌを含有）を４ｍＬ加えるとともに、酵素を０．１ｇ～０．２ｇ加え、２０℃、８０ｒｐｍの低速で一晩（１８～２０ｈ）撹拌してから、４℃で２０ｈ静置した。上清を捨て、沈殿をＢｕｆｆｅｒで３～４回洗浄し、窒素ガスで乾燥させ、４℃で保存した。
エポキシ型キャリアに固定化されたトランスアミナーゼ
１ｇのキャリアを１００ｍＭのＰＢ緩衝液で１～２回洗浄し、上清液を捨て、Ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭのＰＢ、ｐＨ７．０、１ＭのＮａＣｌを含有）を４ｍＬ加えるとともに、酵素を０．１ｇ～０．２ｇ加え、２０℃、８０ｒｐｍの低速で一晩（１８～２０ｈ）撹拌してから、４℃で２０ｈ静置した。上清を捨て、沈殿をＢｕｆｆｅｒで３～４回洗浄し、窒素ガスで乾燥させ、４℃で保存した。
【0078】
（実施例１５）
共有固定化トランスアミナーゼの水相反応活性の検証
１０ｍＬの反応瓶に、ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯの最終濃度は５０％）を０．５ｍＬ加え、０．１ｇの基質１を溶解して、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び１．０ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加え、０．１ＭのＰＢ７．０を反応液の最終体積が１ｍＬになるまで追加してから、酵素を３ｍｇ又は３ｍｇの酵素で調製した固定化トランスアミナーゼを加え、４５℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１３に示した。
共有固定化トランスアミナーゼの水相反応活性の検証
１０ｍＬの反応瓶に、ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯの最終濃度は５０％）を０．５ｍＬ加え、０．１ｇの基質１を溶解して、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び１．０ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加え、０．１ＭのＰＢ７．０を反応液の最終体積が１ｍＬになるまで追加してから、酵素を３ｍｇ又は３ｍｇの酵素で調製した固定化トランスアミナーゼを加え、４５℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１３に示した。
【表13】
【0079】
（実施例１６）
共有固定化トランスアミナーゼを３５％～４５％メタノール水溶液中で反応させる活性の検証
１０ｍＬの反応瓶に、メタノールを０．３５～０．４５ｍＬ加え、基質１を０．１ｇ溶解し、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び１．０ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加え、０．１ＭのＰＢ７．０を反応液の最終体積が１ｍＬになるまで追加してから、酵素を１０ｍｇ又は１０ｍｇの酵素で調製した固定化トランスアミナーゼを加え、３０℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１４に示した。
共有固定化トランスアミナーゼを３５％～４５％メタノール水溶液中で反応させる活性の検証
１０ｍＬの反応瓶に、メタノールを０．３５～０．４５ｍＬ加え、基質１を０．１ｇ溶解し、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び１．０ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加え、０．１ＭのＰＢ７．０を反応液の最終体積が１ｍＬになるまで追加してから、酵素を１０ｍｇ又は１０ｍｇの酵素で調製した固定化トランスアミナーゼを加え、３０℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１４に示した。
【表14】
【0080】
（実施例１７）
共有固定化トランスアミナーゼの有機相反応活性の検証
１０ｍＬの反応瓶に、水飽和酢酸イソプロピルを１ｍＬ加えてから、基質１を１００ｍｇ及び４ｅｑイソプロピルアミンを加え、その後、１００ｍｇの酵素で調製した固定化トランスアミナーゼを加え、３０℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１５に示した。
共有固定化トランスアミナーゼの有機相反応活性の検証
１０ｍＬの反応瓶に、水飽和酢酸イソプロピルを１ｍＬ加えてから、基質１を１００ｍｇ及び４ｅｑイソプロピルアミンを加え、その後、１００ｍｇの酵素で調製した固定化トランスアミナーゼを加え、３０℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１５に示した。
【表15】
【0081】
（実施例１８）
親和キャリア固定化
キャリアに０．４ｍｇ／ｍＬのＰＬＰを含有するＰＢ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）５ｍＬ加えるとともに、酵素を０．１ｇ加え、２０℃、８０ｒｐｍの低速で一晩撹拌した。上清を捨て、沈殿を緩衝液で３～４回洗浄し、上清を捨て、沈殿を窒素ガスで乾燥させるか、又は冷凍乾燥法で乾燥させ、４℃で保存した。
親和キャリア固定化
キャリアに０．４ｍｇ／ｍＬのＰＬＰを含有するＰＢ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）５ｍＬ加えるとともに、酵素を０．１ｇ加え、２０℃、８０ｒｐｍの低速で一晩撹拌した。上清を捨て、沈殿を緩衝液で３～４回洗浄し、上清を捨て、沈殿を窒素ガスで乾燥させるか、又は冷凍乾燥法で乾燥させ、４℃で保存した。
【0082】
（実施例１９）
親和固定化酵素の水相反応活性の検証
１０ｍＬの反応瓶に、ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯの最終濃度は６０％である）を０．６ｍＬ加え、基質１を０．１ｇ溶解して、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び１．０ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加え、０．１ＭのＰＢ７．０を反応液の最終体積が１ｍＬになるまで追加してから、酵素を１０ｍｇ又は１０ｍｇの酵素で調製した固定化トランスアミナーゼを加え、３０℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１６に示した。
親和固定化酵素の水相反応活性の検証
１０ｍＬの反応瓶に、ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯの最終濃度は６０％である）を０．６ｍＬ加え、基質１を０．１ｇ溶解して、４ｅｑ塩酸イソプロピルアミン及び１．０ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサール－５’－リン酸）を加え、０．１ＭのＰＢ７．０を反応液の最終体積が１ｍＬになるまで追加してから、酵素を１０ｍｇ又は１０ｍｇの酵素で調製した固定化トランスアミナーゼを加え、３０℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１６に示した。
【表16】
【0083】
（実施例２０）
親和固定化トランスアミナーゼの有機相反応活性の検証
１０ｍＬの反応瓶に、水飽和メチル‐ターシャリ‐ブチルエーテルを１ｍＬ加えてから、基質１を１００ｍｇ及び４ｅｑイソプロピルアミンを加え、その後、１００ｍｇの酵素で調製した固定化トランスアミナーゼを加え、３０℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１７に示した。
親和固定化トランスアミナーゼの有機相反応活性の検証
１０ｍＬの反応瓶に、水飽和メチル‐ターシャリ‐ブチルエーテルを１ｍＬ加えてから、基質１を１００ｍｇ及び４ｅｑイソプロピルアミンを加え、その後、１００ｍｇの酵素で調製した固定化トランスアミナーゼを加え、３０℃で１６ｈ撹拌した。ＨＰＬＣによって系の形質転換率を検出し、反応データを表１７に示した。
【表17】
【0084】
（実施例２１）
固定化酵素トランスアミナーゼ充填層連続反応
３８２ｇの変異体Ｃ４１８Ｑ＋Ｖ３７９ＭがＬＸ１０００ＨＡキャリアに固定化された固定化酵素を反応器に充填し、カラム体積（ＣＶ）は７５０ｍＬであり、プランジャーポンプで２ＣＶの緩衝液（０．１ＭのＰＢ７．０、５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰを含有、２Ｍの塩酸イソプロピルアミン）を充填層に注入した。調製した反応液（０．５Ｍの基質１、２Ｍの塩酸イソプロピルアミン、５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ、４０％ＭｅＯＨ）をプランジャーポンプで充填層に注入し、３７℃の水浴に約２００ｍｉｎ保持し、形質転換率＞９８％であり、ＳＴＹ（空時収量）は、３．６ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙに達した。４００ｈ連続して操作し、形質転換率は低下しなかった。
固定化酵素トランスアミナーゼ充填層連続反応
３８２ｇの変異体Ｃ４１８Ｑ＋Ｖ３７９ＭがＬＸ１０００ＨＡキャリアに固定化された固定化酵素を反応器に充填し、カラム体積（ＣＶ）は７５０ｍＬであり、プランジャーポンプで２ＣＶの緩衝液（０．１ＭのＰＢ７．０、５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰを含有、２Ｍの塩酸イソプロピルアミン）を充填層に注入した。調製した反応液（０．５Ｍの基質１、２Ｍの塩酸イソプロピルアミン、５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ、４０％ＭｅＯＨ）をプランジャーポンプで充填層に注入し、３７℃の水浴に約２００ｍｉｎ保持し、形質転換率＞９８％であり、ＳＴＹ（空時収量）は、３．６ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙに達した。４００ｈ連続して操作し、形質転換率は低下しなかった。
【0085】
（実施例２２）
グルタルアルデヒドによって活性化されたＰＥＩ架橋固定化酵素充填層連続反応
７６ｇの変異体Ｃ４１８Ｑ＋Ｖ３７９ＭがＬＸ１０００ＨＡキャリアに固定化された固定化酵素を反応器に充填し、カラム体積（ＣＶ）は１５０ｍＬであり、プランジャーポンプで２ＣＶの緩衝液（０．１ＭのＰＢ７．０、５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰを含有、２Ｍの塩酸イソプロピルアミン）を充填層に注入した。調製した反応液（０．５Ｍの基質１、２Ｍの塩酸イソプロピルアミン、５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ、４０％ＭｅＯＨ）をプランジャーポンプで充填層に注入し、３７℃の水浴で約１００ｍｉｎ保持し、形質転換率＞９８％であり、ＳＴＹ（空時収量）は７．３ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙに達した。４００ｈ連続して操作し、形質転換率が低下しなかった。
グルタルアルデヒドによって活性化されたＰＥＩ架橋固定化酵素充填層連続反応
７６ｇの変異体Ｃ４１８Ｑ＋Ｖ３７９ＭがＬＸ１０００ＨＡキャリアに固定化された固定化酵素を反応器に充填し、カラム体積（ＣＶ）は１５０ｍＬであり、プランジャーポンプで２ＣＶの緩衝液（０．１ＭのＰＢ７．０、５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰを含有、２Ｍの塩酸イソプロピルアミン）を充填層に注入した。調製した反応液（０．５Ｍの基質１、２Ｍの塩酸イソプロピルアミン、５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰ、４０％ＭｅＯＨ）をプランジャーポンプで充填層に注入し、３７℃の水浴で約１００ｍｉｎ保持し、形質転換率＞９８％であり、ＳＴＹ（空時収量）は７．３ｍｏｌ／Ｌ／ｄａｙに達した。４００ｈ連続して操作し、形質転換率が低下しなかった。
【0086】
以上の説明から分かるように、本発明の上記実施例により下記のような技術効果が実現された。指向進化・スクリーニングによって得られた、活性、安定性、温度、ｐＨ及び有機溶媒に対する耐性が向上した変異体により、生産における酵素使用量が低下しただけでなく、各種類の固定化酵素に調製する可能性も大幅に向上した。そして、本願は、上記指向進化後のトランスアミナーゼを固定化（自己架橋又はキャリアとの共有結合）することにより、固定化トランスアミナーゼの水相反応及び有機相反応への適用が実現され、酵素と反応系との分離を容易にし、反応後処理過程における酵素タンパク質の残留による乳化現象を低減するとともに、固定化トランスアミナーゼ変異体は、様々な極端環境に耐え得ることができ、活性の損失が小さく、繰り返し使用回数が多く、それにより、基質１及び基質２の連続的なアミノ基転移反応が実現された。
【0087】
以上は本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を限定するものではなく、当業者にとって、本発明は様々な修正及び変更が可能である。本発明の精神と原則内で行われた任意の修正、等価置換、改良等は、いずれも本発明の保護範囲に含まれるべきである。
【配列表】
【国際調査報告】