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特表2024-534688細胞株識別と濃縮のためのトランスジェニックげっ歯類

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-20

(54)【発明の名称】細胞株識別と濃縮のためのトランスジェニックげっ歯類

(51)【国際特許分類】

C12N 15/09 20060101AFI20240912BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20240912BHJP

A01K 67/0275 20240101ALI20240912BHJP

C12Q 1/04 20060101ALI20240912BHJP

C12P 21/08 20060101ALI20240912BHJP

C07K 16/00 20060101ALI20240912BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20240912BHJP

C12N 15/63 20060101ALN20240912BHJP

C12N 5/0781 20100101ALN20240912BHJP

C12N 5/16 20060101ALN20240912BHJP

C12N 5/0735 20100101ALN20240912BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12N5/10

A01K67/0275

C12Q1/04

C12P21/08

C07K16/00

A61K39/395 N

A61K39/395 Y

C12N15/63 Z ZNA

C12N5/0781

C12N5/16

C12N5/0735

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024520084

(86)(22)【出願日】2022-09-30

(85)【翻訳文提出日】2024-05-28

(86)【国際出願番号】 US2022077363

(87)【国際公開番号】W WO2023056430

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】63/261,987

(32)【優先日】2021-10-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524122705

【氏名又は名称】アブセレラ・バイオロジクス・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＢＣＥＬＬＥＲＡＢＩＯＬＯＧＩＣＳＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井陽子

(72)【発明者】

【氏名】シャン，ピン

(72)【発明者】

【氏名】ウェイ，ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】ペッラカーニ，ダヴィデ

(72)【発明者】

【氏名】ルシュマン，イェンス

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA18

4B063QQ08

4B063QQ79

4B063QX02

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA20

4B065AA91X

4B065AA92X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA46

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA33

4C085BB31

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB43

4C085CC22

4C085CC23

4C085DD61

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045DA76

4H045EA50

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、アフィニティタグ、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、および蛍光レポータータンパク質をコードする膜貫通レポーターカセットを含む核酸コンストラクトを提供する。実施形態では、核酸コンストラクトが非ヒト哺乳動物の細胞のセーフハーバー部位または免疫グロブリン定常領域部位に挿入される。実施形態では、膜貫通レポーターカセットが細胞内で発現し、アフィニティタグを細胞表面に呈しており、蛍光レポータータンパク質は細胞膜内部に位置している。アフィニティタグおよび蛍光レポータータンパク質の存在は、核酸コンストラクトを発現する細胞の識別、ソーティング、および／または単離を可能にする。本開示は、本開示の方法を使用して生成した細胞および非ヒト生物の実施形態に沿って、細胞および非ヒト生物を核酸コンストラクトで改変する方法の実施形態も開示する。
【選択図】図１Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

リーダー配列、ＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセット、並びにアフィニティタグ、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、および蛍光レポータータンパク質をコードする膜貫通レポーターカセットを含む核酸コンストラクト。

【請求項2】

一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、プラスミド、またはウイルスベクターを含む、請求項１に記載の核酸コンストラクト。

【請求項3】

非ヒト哺乳動物のセーフハーバー部位内の第１の標的配列および第２の標的配列にそれぞれ相同である第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームをさらに含む、請求項１に記載の核酸コンストラクト。

【請求項4】

第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームがそれぞれ独立して、約１５から約１２０００ヌクレオチドを含む、請求項３に記載の核酸コンストラクト。

【請求項5】

セーフハーバー部位が、マウスゲノムの６番染色体上のＲｏｓａ２６部位またはマウスゲノムの１１番染色体上のＨｉｐｐ１１部位を含む、請求項３または４に記載の核酸コンストラクト。

【請求項6】

リーダー配列の発現駆動プロモーターをさらに含む、請求項１に記載の核酸コンストラクト。

【請求項7】

プロモーターが、哺乳動物プロモーターを含む、請求項６に記載の核酸コンストラクト。

【請求項8】

プロモーターが、ＣＡＧ、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、またはヒトベータアクチンプロモーターを含む、請求項１６に記載の核酸コンストラクト。

【請求項9】

リーダー配列が、分泌シグナルペプチドを含む、請求項１に記載の核酸コンストラクト。

【請求項10】

分泌シグナルペプチドが、ＩＬ－２リーダー配列ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２）を含む、請求項９に記載の核酸コンストラクト。

【請求項11】

アフィニティタグが、ＳｔｒｅｐＩＩタグを含む、請求項１に記載の核酸コンストラクト。

【請求項12】

アフィニティタグが、ＳｔｒｅｐＩＩタグのタンデムリピートを含む、請求項１に記載の核酸コンストラクト。

【請求項13】

アフィニティタグが、リピート間にタグリンカーを有する約１から約１８個のＳｔｒｅｐＩＩタグのタンデムリピートを含む、請求項１に記載の核酸コンストラクト。

【請求項14】

アフィニティタグが、ＳｔｒｅｐＩＩタグの３個のタンデムリピートを含む、請求項１に記載の核酸コンストラクト。

【請求項15】

ＳｔｒｅｐＩＩタグが、８個のアミノ酸のペプチド配列ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１）を含む、請求項１９から２２のいずれかに記載の核酸コンストラクト。

【請求項16】

膜貫通ドメインが疎水性αヘリックスを含む、請求項１に記載の核酸コンストラクト。

【請求項17】

蛍光レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、または強化型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を含む、請求項１に記載の核酸コンストラクト。

【請求項18】

（ａ）非ヒト哺乳動物細胞に請求項１から１７のいずれかに記載の核酸コンストラクトを導入することと、
（ｂ）非ヒト哺乳動物細胞にヌクレアーゼを導入することであって、ヌクレアーゼが非ヒト哺乳動物細胞のゲノム中のセーフハーバー部位で一本鎖切断または二本鎖切断を引き起こし、核酸コンストラクトが相同組換えにより前記セーフハーバー部位で前記非ヒト哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれることと、
を含む遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞の生成方法。

【請求項19】

ヌクレアーゼを導入することがヌクレアーゼをコードする発現コンストラクトを導入することを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

ヌクレアーゼを導入することがヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを導入することを含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはクラスター化され規則的間隔で配置された短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

ｇＲＮＡが、認識部位を標的にするＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性型ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

非ヒト哺乳動物細胞がげっ歯類細胞である、請求項１８から２３のいずれかに記載の方法。

【請求項25】

げっ歯類細胞が、ラット細胞またはマウス細胞である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

セーフハーバー部位が、マウスゲノムの６番染色体上のＲｏｓａ２６部位または１１番染色体上のＨｉｐｐ１１部位を含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項27】

非ヒト哺乳動物細胞が多能性細胞である、請求項１８から２６のいずれかに記載の方法。

【請求項28】

多能性細胞が、非ヒト接合子または非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

多能性細胞が、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラット胚性幹（ＥＳ）細胞、マウス接合子、またはラット接合子である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

核酸コンストラクトがセーフハーバー部位で組み込まれた遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を単離することをさらに含む、請求項１８から２９のいずれかに記載の方法。

【請求項31】

請求項１８から３０のいずれかに記載の方法により生成される、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項32】

胚盤胞に単離した細胞をインジェクションすること、およびセーフハーバー部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を生成することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

請求項３２に記載の方法により生成される、遺伝子改変非ヒトトランスジェニック哺乳動物。

【請求項34】

哺乳動物がげっ歯類である、請求項３３に記載の遺伝子改変非ヒトトランスジェニック哺乳動物。

【請求項35】

げっ歯類がラットまたはマウスである、請求項３４に記載の遺伝子改変非ヒトトランスジェニック哺乳動物。

【請求項36】

セーフハーバー部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、Ｃｒｅ組換え酵素を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物と交配させて、アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質を発現する細胞を有する非ヒト哺乳動物を取得することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項37】

セーフハーバー部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物が、Ｒｏｓａ２６部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むマウスであり、Ｃｒｅ組換え酵素を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

セーフハーバー部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物が、Ｈｉｐｐ１１部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むマウスであり、Ｃｒｅ組換え酵素を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

トランスジェニックマウスにおけるＣｒｅ発現が組織特異的である、請求項３７または３８に記載の方法。

【請求項40】

請求項３７または３８に記載の方法により生成される、アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質を発現する細胞を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物。

【請求項41】

セーフハーバー部位に組み込まれた請求項１から１７のいずれかに記載の核酸コンストラクトを含むゲノムを含む遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項42】

セーフハーバー部位が、マウスゲノムの２６番染色体上のＲｏｓａ２６部位またはマウスゲノムの１１番染色体上のＨｉｐｐ１１部位を含む、請求項４１に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項43】

ハイブリドーマ、幹細胞、または不死化細胞である、請求項４１または４２に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項44】

アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質を発現する、請求項４１から４３のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項45】

アフィニティタグが、非ヒト哺乳動物細胞の細胞表面に発現する、請求項４４に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項46】

アフィニティタグが、ＳｔｒｅｐＩＩタグを含む、請求項４５に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項47】

蛍光レポータータンパク質が、非ヒト哺乳動物細胞の細胞質面に露出する、請求項４４から４６のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項48】

蛍光レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、または強化型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を含む、請求項４７に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項49】

（ａ）請求項４０に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物から細胞を取得することと、
（ｂ）アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質の発現について遺伝子改変非ヒト哺乳動物から取得した細胞をスクリーニングすることと、
（ｃ）前記融合タンパク質を発現する細胞を単離することと、
を含む、遺伝子改変非ヒト哺乳動物から取得した細胞を単離するための方法。

【請求項50】

細胞が蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によりスクリーニングされる、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

アフィニティタグが、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞の細胞表面に発現する、請求項４９に記載の方法。

【請求項52】

アフィニティタグが、ＳｔｒｅｐＩＩタグを含む、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

蛍光レポータータンパク質が、非ヒト哺乳動物細胞の細胞質面に露出する、請求項４９に記載の方法。

【請求項54】

蛍光レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、または強化型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を含む、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

リンカー、リーダー配列、並びにアフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質をコードする膜貫通レポーターカセットを含む核酸コンストラクト。

【請求項56】

一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、プラスミド、またはウイルスベクターを含む、請求項５５に記載の核酸コンストラクト。

【請求項57】

第１の標的配列および第２の標的配列にそれぞれ相同である第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームをさらに含み、第１および第２の標的配列が免疫グロブリン定常領域部位に隣接している、請求項５６に記載の核酸コンストラクト。

【請求項58】

第１の標的配列が免疫グロブリン定常領域部位の上流に存在し、第２の標的配列が免疫グロブリン定常領域部位の終止コドンの下流に存在する、請求項５６に記載の核酸コンストラクト。

【請求項59】

免疫グロブリン定常領域部位が、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位である、請求項５８に記載の核酸コンストラクト。

【請求項60】

免疫グロブリン軽鎖定常領域部位が、免疫グロブリンカッパ定常領域部位である、請求項５９に記載の核酸コンストラクト。

【請求項61】

免疫グロブリン軽鎖定常領域部位が、免疫グロブリンラムダ定常領域部位である、請求項５９に記載の核酸コンストラクト。

【請求項62】

免疫グロブリン定常領域部位が、免疫グロブリン重鎖定常領域部位である、請求項５８に記載の核酸コンストラクト。

【請求項63】

免疫グロブリン重鎖定常領域部位が、ガンマ、デルタ、アルファ、ミュー、またはイプシロン免疫グロブリン重鎖定常領域部位である、請求項６２に記載の核酸コンストラクト。

【請求項64】

第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームがそれぞれ独立して、約１５から約１２０００ヌクレオチドを含む、請求項５７から６３のいずれかに記載の核酸コンストラクト。

【請求項65】

リンカーが、終止コドンおよび内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項５５に記載の核酸コンストラクト。

【請求項66】

リンカーが、プロテアーゼ認識部位および自己切断ペプチドを含む、請求項５５に記載の核酸コンストラクト。

【請求項67】

リンカーが、ペプチドリンカーを有するリーキー終止コドン（ＬＳＣ）、プロテアーゼ認識部位、および自己切断ペプチドを含む、請求項５５に記載の核酸コンストラクト。

【請求項68】

プロテアーゼ認識部位が、フーリンプロテアーゼ認識部位を含む、請求項６６または６７に記載の核酸コンストラクト。

【請求項69】

フーリンプロテアーゼ認識部位が、ペプチドＡｒｇ－Ｘ－Ａｒｇ－Ａｒｇをコードする核酸配列を含み、Ｘが疎水性アミノ酸または親水性アミノ酸である、請求項６８に記載の核酸コンストラクト。

【請求項70】

フーリンプロテアーゼ認識部位が、ペプチドＸ－Ａｒｇ－Ｘ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－ＸまたはＸ－Ａｒｇ－Ｘ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｘをコードする核酸配列を含み、Ｘが疎水性アミノ酸または親水性アミノ酸である、請求項６８に記載の核酸コンストラクト。

【請求項71】

疎水性アミノ酸が、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである、または親水性アミノ酸がリシンである、請求項６９または７０に記載の核酸コンストラクト。

【請求項72】

自己切断ペプチドが、２Ａ自己切断ペプチドを含む、請求項６６または６７に記載の核酸コンストラクト。

【請求項73】

リーキー終止コドンが、ＴＧＡＣＴＡＧを含む、請求項６７に記載の核酸コンストラクト。

【請求項74】

ペプチドリンカーが、Ｌｅｕ－Ｇｌｙを含む、請求項６７に記載の核酸コンストラクト。

【請求項75】

リーダー配列が、分泌シグナルペプチドを含む、請求項５５から７４のいずれかに記載の核酸コンストラクト。

【請求項76】

分泌シグナルペプチドが、ＩＬ－２リーダー配列ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２）を含む、請求項７５に記載の核酸コンストラクト。

【請求項77】

アフィニティタグが、ＳｔｒｅｐＩＩタグを含む、請求項５５から７６のいずれかに記載の核酸コンストラクト。

【請求項78】

アフィニティタグが、ＳｔｒｅｐＩＩタグのタンデムリピートを含む、請求項７７に記載の核酸コンストラクト。

【請求項79】

アフィニティタグが、リピート間にタグリンカーを有する約１から約１８個のＳｔｒｅｐＩＩタグのタンデムリピートを含む、請求項７７に記載の核酸コンストラクト。

【請求項80】

アフィニティタグが、ＳｔｒｅｐＩＩタグの３個のタンデムリピートを含む、請求項７７に記載の核酸コンストラクト。

【請求項81】

ＳｔｒｅｐＩＩタグが、８個のアミノ酸のペプチド配列ＴｒｐＳｅｒＨｉｓＰｒｏＧｌｎＰｈｅＧｌｕＬｙｓ（配列番号ＸＸ）を含む、請求項７７から８０のいずれかに記載の核酸コンストラクト。

【請求項82】

膜貫通ドメインが疎水性αヘリックスを含む、請求項５５から８１のいずれかに記載の核酸コンストラクト。

【請求項83】

蛍光レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、または強化型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を含む、請求項５５から８２のいずれかに記載の核酸コンストラクト。

【請求項84】

（ａ）非ヒト哺乳動物細胞に請求項５５から８３のいずれかに記載の核酸コンストラクトを導入することと、
（ｂ）非ヒト哺乳動物細胞にヌクレアーゼを導入することであって、ヌクレアーゼが非ヒト哺乳動物細胞のゲノム中の免疫グロブリン定常領域部位で一本鎖切断または二本鎖切断を引き起こし、核酸コンストラクトが相同組換えにより前記免疫グロブリン定常領域部位で前記非ヒト哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれることと、
を含む、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞の生成方法。

【請求項85】

免疫グロブリン定常領域部位が、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位である、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

免疫グロブリン軽鎖定常領域部位が、免疫グロブリンカッパ定常領域部位である、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

免疫グロブリン軽鎖定常領域部位が、免疫グロブリンラムダ定常領域部位である、請求項８５に記載の方法。

【請求項88】

免疫グロブリン定常領域部位が、免疫グロブリン重鎖定常領域部位である、請求項８４に記載の方法。

【請求項89】

免疫グロブリン重鎖定常領域部位が、ガンマ、デルタ、アルファ、ミュー、またはイプシロン免疫グロブリン重鎖定常領域部位である、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

ヌクレアーゼを導入することが、ヌクレアーゼをコードする発現コンストラクトを導入することを含む、請求項８４から８９のいずれかに記載の方法。

【請求項91】

ヌクレアーゼを導入することが、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを導入することを含む、請求項８４から８９のいずれかに記載の方法。

【請求項92】

ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはクラスター化され規則的間隔で配置された短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項８４から８９のいずれかに記載の方法。

【請求項93】

ｇＲＮＡが、認識部位を標的にするＣＲＩＳＰＲ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性型ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９を含む、請求項９２に記載の方法。

【請求項95】

非ヒト哺乳動物細胞がげっ歯類細胞である、請求項８４から９４のいずれかに記載の方法。

【請求項96】

げっ歯類細胞がラット細胞またはマウス細胞である、請求項９５に記載の方法。

【請求項97】

非ヒト哺乳動物細胞が多能性細胞である、請求項８４から９６のいずれかに記載の方法。

【請求項98】

多能性細胞が、非ヒト接合子または非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

多能性細胞が、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞、ラット胚性幹（ＥＳ）細胞、マウス接合子、またはラット接合子である、請求項９８に記載の方法。

【請求項100】

核酸コンストラクトが免疫グロブリン定常領域部位で組み込まれた遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を単離することをさらに含む、請求項８４から９９のいずれかに記載の方法。

【請求項101】

請求項８４から１００のいずれかに記載の方法により生成された遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項102】

胚盤胞に単離した細胞をインジェクションすること、および免疫グロブリン定常領域部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を生成することをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。

【請求項103】

請求項１０１に記載の方法により生成される、遺伝子改変非ヒトトランスジェニック哺乳動物。

【請求項104】

免疫グロブリン定常領域部位に組み込まれた請求項５５から８３のいずれかに記載の核酸コンストラクトを含むゲノムを含む遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項105】

定常領域部位が軽鎖定常領域部位である、請求項１０４に記載の遺伝子改変非ヒト細胞。

【請求項106】

軽鎖定常領域部位がカッパ定常領域部位である、請求項１０５に記載の遺伝子改変非ヒト細胞。

【請求項107】

軽鎖定常領域部位がラムダ定常領域部位である、請求項１０５に記載の遺伝子改変非ヒト細胞。

【請求項108】

定常領域部位が重鎖定常領域部位である、請求項１０４に記載の遺伝子改変非ヒト細胞。

【請求項109】

免疫グロブリン重鎖定常領域部位が、ガンマ、デルタ、アルファ、ミュー、またはイプシロン免疫グロブリン重鎖定常領域部位である、請求項１０８に記載の遺伝子改変非ヒト細胞。

【請求項110】

免疫グロブリン発現細胞が免疫化哺乳動物から取得される、請求項１０４から１０９のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項111】

免疫グロブリン発現細胞である、請求項１０４から１１０のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項112】

遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞が免疫グロブリンカッパ軽鎖を発現する、請求項１０４に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物。

【請求項113】

免疫グロブリン発現細胞が未熟Ｂ細胞または未熟Ｂ細胞の子孫である、請求項１０４から１１２のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項114】

ハイブリドーマ、幹細胞、または不死化細胞である、請求項１０４から１１２のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項115】

アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質を発現する、請求項１０４から１１４のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項116】

アフィニティタグが、非ヒト哺乳動物細胞の細胞表面で発現する、請求項１１５に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項117】

アフィニティタグが、ＳｔｒｅｐＩＩタグを含む、請求項１１６に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項118】

蛍光レポータータンパク質が非ヒト哺乳動物細胞の細胞質面に露出する、請求項１１５から１１７のいずれかに記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項119】

蛍光レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、または強化型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を含む、請求項１１８に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項120】

融合タンパク質の発現が内在性免疫グロブリン転写制御因子により駆動される、請求項１１５に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項121】

内在性免疫グロブリン転写制御因子が、内在性免疫グロブリン軽鎖転写制御因子である、請求項１２０に記載の遺伝子改変非ヒト細胞。

【請求項122】

内在性免疫グロブリン軽鎖転写制御因子が、プロモーターおよびマウス軽鎖部位の他のシスエレメントを含む、請求項１２１に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項123】

内在性免疫グロブリン転写制御因子が、内在性免疫グロブリン重鎖転写制御因子である、請求項１２０に記載の遺伝子改変非ヒト細胞。

【請求項124】

内在性免疫グロブリン重鎖転写制御因子が、プロモーターおよびマウス重鎖部位の他のシスエレメントを含む、請求項１２３に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞。

【請求項125】

（ａ）請求項１０３に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物から細胞を取得することと、
（ｂ）アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質の発現について遺伝子改変非ヒト哺乳動物から取得された細胞をスクリーニングすることと、
（ｃ）前記融合タンパク質の発現に基づき免疫グロブリン発現細胞を識別することと、
を含む、遺伝子改変非ヒト哺乳動物から取得された免疫グロブリン発現細胞を識別するための方法。

【請求項126】

細胞が蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によりスクリーニングされる、請求項１２５に記載の方法。

【請求項127】

アフィニティタグが、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞の細胞表面に発現する、請求項１２５に記載の方法。

【請求項128】

アフィニティタグが、ＳｔｒｅｐＩＩタグを含む、請求項１２７に記載の方法。

【請求項129】

蛍光レポータータンパク質が、非ヒト哺乳動物細胞の細胞質面に露出する、請求項１２５に記載の方法。

【請求項130】

蛍光レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、または強化型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を含む、請求項１２９に記載の方法。

【請求項131】

遺伝子改変非ヒト哺乳動物が目的の抗原で免疫されている、請求項１２５から１３０のいずれかに記載の方法。

【請求項132】

免疫グロブリン発現細胞が免疫グロブリンカッパ軽鎖を発現する、請求項１２５から１３１のいずれかに記載の方法。

【請求項133】

前記融合タンパク質をコードする遺伝子が免疫グロブリン定常領域部位において細胞のゲノムに組み込まれている、請求項１２５から１３２のいずれかに記載の方法。

【請求項134】

免疫グロブリン定常領域部位が、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位である、請求項１３３に記載の方法。

【請求項135】

免疫グロブリン軽鎖定常領域部位が、免疫グロブリンカッパ定常領域部位である、請求項１３４に記載の方法。

【請求項136】

免疫グロブリン軽鎖定常領域部位が、免疫グロブリンラムダ定常領域部位である、請求項１３４に記載の方法。

【請求項137】

免疫グロブリン定常領域部位が、免疫グロブリン重鎖定常領域部位である、請求項１３３に記載の方法。

【請求項138】

免疫グロブリン重鎖定常領域部位が、ガンマ、デルタ、アルファ、ミュー、またはイプシロン免疫グロブリン重鎖定常領域部位である、請求項１３７に記載の方法。

【請求項139】

免疫グロブリン発現細胞が未熟Ｂ細胞およびその子孫を含む、請求項１２５から１３８のいずれかに記載の方法。

【請求項140】

遺伝子改変非ヒト哺乳動物から取得された細胞から発現する免疫グロブリンを単離することをさらに含む、請求項１２５から１３８のいずれかに記載の方法。

【請求項141】

請求項１４０に記載の方法により取得された免疫グロブリン。

【請求項142】

（ｉ）請求項１４１に記載の免疫グロブリンの可変領域をクローニングすることと、
（ｉｉ）（ｉ）で取得された可変領域を含む治療用または診断用免疫グロブリンを生成することと、
を含む、治療用または診断用免疫グロブリンを生産する方法。

【請求項143】

（ｉ）請求項１０３に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物から免疫グロブリン発現細胞を取得することと、
（ｉｉ）（ｉ）で取得した免疫グロブリン発現細胞を不死化することと、
（ｉｉｉ）不死化した免疫グロブリン発現細胞またはモノクローナル抗体をコードする核酸配列により発現するモノクローナル抗体を単離することと、
を含む、モノクローナル抗体を生産する方法。

【請求項144】

（ｉｖ）単離したモノクローナル抗体の可変領域をクローニングすることと、
（ｖ）クローン化した可変領域を含む治療用または診断用抗体を生産することと、
をさらに含む、請求項１４３に記載の方法。

【請求項145】

請求項１４４に記載の方法により生産された治療用または診断用抗体。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、核酸コンストラクト、トランスジェニックげっ歯類、げっ歯類細胞株、および特定の細胞タイプ、例えば、特定の発生段階にある細胞、特定のプロモーターを発現する細胞、または抗体などの特定のタンパク質を発現する細胞の識別と濃縮を可能にする方法に関する。

【背景技術】

【0002】

特定のタンパク質を発現するように、または特定の発生段階にあるように改変された細胞を識別および濃縮することは、生物学的治療薬の開発における重要な課題である。特定の細胞集団を濃縮するための一般的なワークフローは、単一細胞懸濁液を作製し、その細胞混合物を表面マーカーを認識する抗体パネルで染色し、磁気またはフローベースのいずれかの方法を用いて細胞を分離することである。しかし、この手順は、細胞種特異的な細胞表面マーカーに関する現在の知識、およびそれらのマーカーを認識する抗体の特異性と利用可能性によって制限される。この手順では一般に、濃縮後の目的細胞の収率および純度が理想的ではなく、不要な汚染細胞の割合が高くなり、濃縮中に目的細胞が失われる結果となる。例えば、Ｉｇ発現細胞を識別する一般的な戦略は、既知の内因性系譜表面マーカーと抗体染色を組み合わせ、それらのマーカーを検出することに基づいている。

【0003】

マウスＩｇ発現細胞を濃縮するためによく使用される抗体は、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ１３８抗体、および抗Ｉｇ抗体である。しかし、Ｂ細胞分化の過程でこれら３つのマーカーの発現に差があり、細胞表面マーカーを使用してすべての集団を効率的に濃縮できるわけではない。例えば、ＣＤ１９は汎Ｂ細胞マーカー（Ｉｇを発現しないＢ細胞前駆細胞を含む）と考えられているが、その発現は抗体分泌細胞で劇的に減少するため、その有用な集団を濃縮することはできない。ＣＤ１３８は形質細胞マーカーと考えられているが、Ｉｇを発現しない初期段階の前駆Ｂ細胞の一部にも発現している。それゆえ、このマーカーはこの望みではない集団を濃縮することになる。Ｂ細胞の発生過程において、プレＢ細胞が未熟Ｂ細胞に分化した後、細胞表面にＩｇを呈し始めるので、Ｉｇマーカーを用いてこの集団を捕捉できる。しかし、成熟Ｂ細胞が形質細胞に完全に分化すると、Ｉｇの表面発現は失われる。その結果、Ｉｇ発現細胞を濃縮するためにこれらのマーカーを磁気ベースの戦略（フローベースのソーティングに比べ、より良いスケールと時間効率を提供する）で使用する場合、結果として濃縮した細胞集団は、非Ｉｇ発現Ｂ細胞のコンタミを含むことが多く、非効率的な濃縮と抗体分泌細胞の損失となる。

【0004】

組織特異的プロモーターを発現する細胞株の単離および濃縮もまた、同様の理由で挑戦的なことである。組織特異性は主に転写因子によって決定され、組織特異的な方法でタンパク質を発現している細胞株を濃縮するために、細胞表面マーカーが利用できないこともあり、利用できるマーカーが有用な濃縮の提供に十分な特異性を持っていないこともある。

【発明の概要】

【0005】

実施形態では、本開示は、リーダー配列、ＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセット、およびアフィニティタグ、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、および蛍光レポータータンパク質をコードする膜貫通レポーターカセットを含む核酸コンストラクトを提供する。実施形態では、核酸コンストラクトは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、プラスミド、またはウイルスベクターを含む。

【0006】

実施形態では、核酸コンストラクトは、非ヒト哺乳動物におけるセーフハーバー部位内の第１の標的配列および第２の標的配列にそれぞれ相同である第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームをさらに含む。実施形態では、第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームは、それぞれ独立して、約１５ヌクレオチドから約１２０００ヌクレオチドを含む。

【0007】

核酸コンストラクトの実施形態では、セーフハーバー部位は、マウスゲノムの６番染色体上のＲｏｓａ２６部位またはマウスゲノムの１１番染色体上のＨｉｐｐ１１部位を含む。

【0008】

実施形態では、核酸コンストラクトはプロモーターをさらに含む。実施形態では、プロモーターは哺乳動物プロモーターを含む。実施形態では、プロモーターはＣＡＧ、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、またはヒトベータアクチンプロモーターを含む。実施形態では、リーダー配列は分泌シグナルペプチドを含む。実施形態では、分泌シグナルペプチドは、ＩＬ－２リーダー配列ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号：２）を含む。

【0009】

核酸コンストラクトの実施形態では、アフィニティタグはＳｔｒｅｐＩＩタグを含む。実施形態では、アフィニティタグはＳｔｒｅｐＩＩタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、リピート間にタグリンカーを有するＳｔｒｅｐＩＩタグの約１から約１８個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグはＳｔｒｅｐＩＩタグの３個のタンデムリピートを含む。実施形態では、ＳｔｒｅｐＩＩタグは、ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１）の８個のアミノ酸のペプチド配列を含む。実施形態では、膜貫通ドメインは疎水性αヘリックスを含む。

【0010】

核酸コンストラクトの実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、または強化型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を含む。

【0011】

実施形態では、本開示は、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を生成する方法を提供し、その方法は、（ａ）非ヒト哺乳動物細胞に本明細書に記載される核酸コンストラクトを導入することと、および（ｂ）非ヒト哺乳動物細胞にヌクレアーゼを導入することであって、ヌクレアーゼが非ヒト哺乳動物細胞のゲノム中のセーフハーバー部位で一本鎖切断または二本鎖切断を引き起こし、核酸コンストラクトが相同組換えによりセーフハーバー部位で非ヒト哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれることを含む。

【0012】

本方法の実施形態では、ヌクレアーゼを導入することは、ヌクレアーゼをコードする発現コンストラクトを導入することを含む。実施形態では、ヌクレアーゼを導入することは、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを導入することを含む。実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはクラスター化され規則的間隔で配置された短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、認識部位を標的にするＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９を含む。

【0013】

本方法の実施形態では、非ヒト哺乳動物細胞はげっ歯類細胞である。実施形態では、げっ歯類細胞はラット細胞またはマウス細胞である。実施形態では、セーフハーバー部位は、マウスゲノムの６番染色体上のＲｏｓａ２６部位または１１番染色体上のＨｉｐｐ１１部位を含む。実施形態では、非ヒト哺乳動物細胞は多能性細胞である。実施形態では、多能性細胞は非ヒト接合子または非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である。実施形態では、多能性細胞はマウス接合子細胞またはラット接合子細胞である。実施形態では、多能性細胞はマウス胚性幹（ＥＳ）細胞またはラット胚性幹（ＥＳ）細胞である。

【0014】

実施形態では、本方法は、核酸コンストラクトがセーフハーバー部位で組み込まれた遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を単離することをさらに含む。

【0015】

実施形態では、本開示は、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を生成する方法によって生成された遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を提供する。

【0016】

本方法の実施形態では、本方法は、単離した細胞を胚盤胞にインジェクションし、セーフハーバー部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を生成することをさらに含む。実施形態では、本開示は、本方法により生成された遺伝子改変非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する。実施形態では、哺乳動物はげっ歯類である。実施形態では、げっ歯類はラットまたはマウスである。

【0017】

実施形態では、本方法は、セーフハーバー部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、Ｃｒｅ組換え酵素を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物と交配させて、アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質を発現する細胞を有する非ヒト哺乳動物を取得することをさらに含む。実施形態では、セーフハーバー部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、Ｒｏｓａ２６部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むマウスであり、Ｃｒｅ組換え酵素を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物はマウスである。実施形態では、セーフハーバー部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、Ｈｉｐｐ１１部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むマウスであり、Ｃｒｅ組換え酵素を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物はマウスである。実施形態では、トランスジェニックマウスにおけるＣｒｅ発現は組織特異的である。実施形態では、本開示は、アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および本方法により生成された蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質を発現する細胞を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物を提供する。

【0018】

実施形態では、本開示は、セーフハーバー部位に組み込まれた本明細書に記載の核酸コンストラクトを含むゲノムを含む遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を提供する。実施形態では、セーフハーバー部位は、マウスゲノムの２６番染色体上のＲｏｓａ２６部位、またはマウスゲノムの１１番染色体上のＨｉｐｐ１１部位を含む。実施形態では、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞は、ハイブリドーマまたは不死化細胞である。

【0019】

遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞の実施形態では、細胞はアフィニティタグ、膜貫通ドメイン、蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質を発現する。実施形態では、アフィニティタグは非ヒト哺乳動物細胞の細胞表面に発現する。実施形態では、アフィニティタグはＳｔｒｅｐＩＩタグを含む。実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、非ヒト哺乳動物細胞の細胞質面に露出している。実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、または強化型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を含む。

【0020】

実施形態では、本開示は、遺伝子改変非ヒト哺乳動物から取得された細胞を単離するための方法を提供し、本方法は、（ａ）本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト哺乳動物から細胞を取得することと、（ｂ）アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質の発現について、遺伝子改変非ヒト哺乳動物から取得した細胞をスクリーニングすることと、および（ｃ）融合タンパク質を発現する細胞を単離することを含む。

【0021】

細胞を単離する方法の実施形態では、細胞は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によりソーティングされる。実施形態では、アフィニティタグは遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞の細胞表面に発現する。実施形態では、アフィニティタグはＳｔｒｅｐＩＩタグを含む。実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、非ヒト哺乳動物細胞の細胞質面に露出している。実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、または強化型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を含む。

【0022】

実施形態では、本開示は、リンカー、リーダー配列、並びにアフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポーターをコードする膜貫通レポーターカセットを含む核酸コンストラクトをさらに提供する。

【0023】

実施形態では、核酸コンストラクトは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、プラスミド、またはウイルスベクターを含む。実施形態では、核酸コンストラクトは、第１の標的配列および第２の標的配列にそれぞれ相同である第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームをさらに含む。実施形態では、第１の標的配列は免疫グロブリン定常領域部位の上流に存在し、第２の標的配列は免疫グロブリン定常領域部位の終止コドンの下流に存在する。実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は免疫グロブリン軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位は免疫グロブリンカッパ定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位は免疫グロブリンラムダ定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は免疫グロブリン重鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域部位は、ガンマ、デルタ、アルファ、ミュー、またはイプシロン免疫グロブリン重鎖定常領域部位である。

【0024】

核酸コンストラクトの実施形態では、第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームは、それぞれ独立して、約１５ヌクレオチドから約１２０００ヌクレオチドを含む。実施形態では、リンカーは終止コドンおよび内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。実施形態では、リンカーはプロテアーゼ認識部位および自己切断ペプチドを含む。実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカー、プロテアーゼ認識部位、および自己切断ペプチドを有するリーキー終止コドン（ＬＳＣ）を含む。実施形態では、プロテアーゼ認識部位はフーリンプロテアーゼ認識部位を含む。実施形態では、フーリンプロテアーゼ認識部位は、Ａｒｇ－Ｘ－Ａｒｇ－Ａｒｇのペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、Ｘは疎水性アミノ酸である。実施形態では、Ｘは親水性アミノ酸である。実施形態では、Ｘはリシンである。実施形態では、フーリンプロテアーゼ認識部位は、Ｘ－Ａｒｇ－Ｘ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－ＸまたはＸ－Ａｒｇ－Ｘ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｘのペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、Ｘは疎水性アミノ酸である。実施形態では、疎水性アミノ酸はＧｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒである。実施形態では、Ｘは親水性アミノ酸である。実施形態では、親水性アミノ酸はリシンである。実施形態では、自己切断ペプチドは２Ａ自己切断ペプチドを含む。実施形態では、リーキー終止コドンはＴＧＡＣＴＡＧを含む。実施形態では、ジペプチドリンカーはＬｅｕ－Ｇｌｙを含む。

【0025】

核酸コンストラクトの実施形態では、リーダー配列は分泌シグナルペプチドを含む。実施形態では、分泌シグナルペプチドは、ＩＬ－２リーダー配列ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２）を含む。

【0026】

【0027】

【0028】

実施形態では、本開示は、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を生成する方法を提供し、その方法は（ａ）本明細書に記載の核酸コンストラクトを非ヒト哺乳動物細胞に導入することと、および（ｂ）ヌクレアーゼを非ヒト哺乳動物細胞に導入することであって、ヌクレアーゼが、非ヒト哺乳動物細胞のゲノム中の免疫グロブリン定常領域部位において一本鎖切断または二本鎖切断を引き起こし、核酸コンストラクトが、相同組換えにより免疫グロブリン定常領域部位において非ヒト哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれることを含む。実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は免疫グロブリン軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位はカッパ軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位はラムダ軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は免疫グロブリン重鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域部位は、ガンマ、デルタ、アルファ、ミュー、またはイプシロン免疫グロブリン定常領域部位である。

【0029】

本方法の実施形態では、ヌクレアーゼを導入することは、ヌクレアーゼをコードする発現コンストラクトを導入することを含む。実施形態では、ヌクレアーゼを導入することは、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを導入することを含む。実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはクラスター化され規則的間隔で配置された短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、認識部位を標的にするＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）および、トランス活性化型ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９を含む。

【0030】

本方法の実施形態では、非ヒト哺乳動物細胞はげっ歯類細胞である。実施形態では、げっ歯類細胞はラット細胞またはマウス細胞である。実施形態では、非ヒト哺乳動物細胞は多能性細胞である。実施形態では、多能性細胞は非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である。実施形態では、多能性細胞はマウス胚性幹（ＥＳ）細胞またはラット胚性幹（ＥＳ）細胞である。

【0031】

実施形態では、本方法は、核酸コンストラクトが免疫グロブリン定常領域部位で組み込まれた遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を単離することをさらに含む。実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は免疫グロブリン軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位はカッパ軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位はラムダ軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は免疫グロブリン重鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域部位は、ガンマ、デルタ、アルファ、ミュー、またはイプシロン免疫グロブリン定常領域部位である。

【0032】

実施形態では、本開示は、本明細書に開示される方法によって生成された遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を提供する。

【0033】

実施形態では、本方法はさらに、単離された細胞を胚盤胞にインジェクションし、免疫グロブリン定常領域部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を生成することを含む。実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は免疫グロブリン軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位はカッパ軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位はラムダ軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は免疫グロブリン重鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域部位は、ガンマ、デルタ、アルファ、ミュー、またはイプシロン免疫グロブリン定常領域部位である。実施形態では、本開示は、本方法によって生成された遺伝子改変非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する。

【0034】

実施形態では、本開示は、免疫グロブリン定常領域部位に組み込まれた、本明細書に記載の核酸コンストラクトを含むゲノムを含む遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を提供する。実施形態では、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞は、免疫グロブリン定常領域部位に組み込まれた本明細書に記載の核酸コンストラクトを含むゲノムを含む。実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は軽鎖定常領域部位である。実施形態では、軽鎖定常領域部位はカッパ定常領域部位である。実施形態では、軽鎖定常領域部位はラムダ定常領域部位である。実施形態では、定常領域部位は重鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン発現細胞は免疫化哺乳動物から取得される。実施形態では、細胞は免疫グロブリン発現細胞である。実施形態では、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞は免疫グロブリンカッパ軽鎖を発現する。

【0035】

免疫グロブリン発現非ヒト哺乳動物細胞の実施形態では、細胞は未熟Ｂ細胞または未熟Ｂ細胞の子孫である。実施形態では、細胞はハイブリドーマ、幹細胞、または不死化細胞である。

【0036】

免疫グロブリン発現非ヒト哺乳動物細胞の実施形態では、細胞はアフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質を発現する。実施形態では、アフィニティタグは非ヒト哺乳動物細胞の細胞質面に発現する。実施形態では、アフィニティタグはＳｔｒｅｐＩＩタグを含む。実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、非ヒト哺乳動物細胞の細胞質面に露出している。実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、または強化型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を含む。実施形態では、蛍光レポータータンパク質は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含む。実施形態では、赤色蛍光タンパク質は、単量体チェリー（ｍＣｈｅｒｒｙ）またはタンデム二量体トマト（ｔｄＴｏｍａｔｏ）である。他の蛍光タンパク質も知られており、本明細書に記載のコンストラクトに使用できる。例えば、Ｌｉら（２０１８）"Overview of the reporter genes and reporter mouse models," Anim Models and Exp Med.1:29-35 (doi.org/10.1002/ame2.12008)を参照のこと。

【0037】

免疫グロブリン発現非ヒト哺乳動物細胞の実施形態では、融合タンパク質の発現は内因性免疫グロブリン転写制御因子によって駆動される。実施形態では、内因性免疫グロブリン転写調節因子は内因性免疫グロブリン軽鎖転写調節因子である。実施形態では、内因性免疫グロブリン軽鎖転写調節因子は、プロモーターおよびマウス軽鎖部位の他のシスエレメントを含む。実施形態では、内因性免疫グロブリンカッパ軽鎖転写制御因子は、プロモーターおよびマウス軽鎖部位における他のシスエレメントを含む。実施形態では、内因性免疫グロブリンラムダ軽鎖転写調節因子は、プロモーターおよびマウス軽鎖部位における他のシスエレメントを含む。実施形態では、内因性免疫グロブリン転写調節因子は内因性免疫グロブリン重鎖転写調節因子である。実施形態では、内因性免疫グロブリン重軽鎖転写調節因子は、プロモーターおよびマウス重鎖部位における他のシスエレメントを含む。

【0038】

実施形態では、本開示は、遺伝子改変非ヒト哺乳動物から取得された免疫グロブリン発現細胞を識別するための方法を提供し、本方法は（ａ）本明細書に記載される遺伝子改変非ヒト哺乳動物から細胞を取得することと、（ｂ）アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質の発現について、遺伝子改変非ヒト哺乳動物から取得された細胞をスクリーニングすることと、および（ｃ）融合タンパク質の発現に基づいて、免疫グロブリン発現細胞を識別することを含む。

【0039】

本方法の実施形態では、細胞は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によりスクリーニングされる。実施形態では、アフィニティタグは遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞の細胞表面に発現する。実施形態では、アフィニティタグはＳｔｒｅｐＩＩタグを含む。実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、非ヒト哺乳動物細胞の細胞質面に露出している。実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、または強化型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を含む。実施形態では、蛍光レポータータンパク質は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含む。実施形態では、赤色蛍光タンパク質は、単量体チェリー（ｍＣｈｅｒｒｙ）またはタンデム二量体トマト（ｔｄＴｏｍａｔｏ）である。

【0040】

本方法の実施形態では、遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、目的の抗原で免疫されている。実施形態では、免疫グロブリン発現細胞は免疫グロブリン軽鎖を発現する。実施形態では、免疫グロブリン発現細胞は免疫グロブリンカッパ軽鎖を発現する。実施形態では、免疫グロブリン発現細胞は免疫グロブリンラムダ軽鎖を発現する。実施形態では、免疫グロブリン発現細胞は免疫グロブリン重鎖を発現する。実施形態では、免疫グロブリン発現細胞は未熟Ｂ細胞とその子孫を含む。

【0041】

実施形態では、本方法は、遺伝子改変非ヒト哺乳動物から取得された細胞から発現された免疫グロブリンを単離することをさらに含む。実施形態では、本開示は、本方法によって取得された免疫グロブリンを提供する。

【0042】

実施形態では、本開示は、治療用または診断用免疫グロブリンを生産する方法を提供し、その方法は（ｉ）本明細書に記載される免疫グロブリンの可変領域をクローニングすることおよび（ｉｉ）（ｉ）で取得された可変領域を含む治療用または診断用免疫グロブリンを生成することを含む。

【0043】

実施形態では、本開示は、モノクローナル抗体を生産する方法を提供し、その方法は（ｉ）本明細書に記載の遺伝子改変非ヒト哺乳動物から免疫グロブリン発現細胞を取得すること（ｉｉ）（ｉ）で取得された免疫グロブリン発現細胞を不死化すること、および（ｉｉｉ）不死化された免疫グロブリン発現細胞により発現されるモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体をコードする核酸配列を単離することを含む。実施形態では、本方法は（ｉｖ）単離されたモノクローナル抗体の可変領域をクローニングすること、および（ｖ）クローニングされた可変領域を含む治療用または診断用抗体を生産することをさらに含む。実施形態では、本開示は、本方法により生産される治療用抗体または診断用抗体を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1A-C】本明細書に記載のコンディショナルレポーター核酸コンストラクトの一実施形態の構成と使用の模式図である。図１Ａに示すように、核酸コンストラクトはＲＯＳＡ２６部位のセーフハーバー部位に挿入される。図では、ＣＡＧＧＳはＣＡＧプロモーター、Ｌはリーダー配列を表し、ＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセットは示すように配置され、ＳＴＸ３はＳｔｒｅｐ－ＩＩタグの３個のタンデムリピート、ＴＭは膜貫通ドメイン、ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質レポーターを表す。図１Ｂは、組織特異的レポーターマウス系統を形成するために、Ｃｒｅスイッチ系統とコンディショナルレポーター系統との間で行われた交差の模式図である。模式的に示すように、コンディショナルレポーター系統をスイッチ系統と交差させた後、Ｃｒｅ組換え酵素がレポーターの前の終止コドンを除去し、Ｃｒｅ発現細胞の核内でレポーターの発現をオンにする。その結果、これらの細胞は、細胞表面のアフィニティタグと細胞内の蛍光マーカーで恒久的に標識される。図１Ｃは、図１Ｂのスイッチレポーター株から単離された細胞が、本明細書に記載されているようにＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを用いてどのように分離されるかを表す模式図である。

【0045】

【図2】マウス／ラットＩｇＫ部位のターゲティング戦略の模式図である。ターゲティング後、標識カセットはＩｇＫ遺伝子の終止コドンで、およびＩｇＫ部位プロモーターの制御下でノックインされる（下図のＬＫはリンカー配列であることに留意、詳細は以下）。図中、黒色の長方形はその領域のＶおよびＪセグメントを、ＬＫはリンカー配列を、Ｌはリーダー配列を、ＳＴＸ３はＳｔｒｅｐ－ＩＩタグの３個のタンデムリピートを、ＴＭは膜貫通ドメインを、ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質レポーターを表す。

【0046】

【図3】本明細書に記載されるように形成されたＩｇＫレポーターマウスの実施形態の構成の模式図であり、本明細書に記載されるように、マウスから単離されたプール細胞がＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを用いてどのように分離されるかの模式図である。

【発明を実施するための形態】

【0047】

本開示は、アフィニティタグ、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、および蛍光レポータータンパク質をコードする膜貫通レポーターカセットを含む核酸コンストラクトの実施形態を提供する。実施形態では、核酸コンストラクトは、非ヒト哺乳動物の細胞内のセーフハーバー部位または免疫グロブリン定常領域部位に挿入される。実施形態では、膜貫通レポーターカセットが細胞内で発現すると、アフィニティタグは細胞表面に表示され、蛍光レポータータンパク質は細胞膜の内側に位置する。アフィニティタグおよび蛍光レポータータンパク質の存在により、核酸コンストラクトを発現する細胞の識別、ソーティング、および／または単離が可能になる。本開示はまた、開示された方法を用いて生産された細胞および非ヒト生物の実施形態とともに、核酸コンストラクトを用いて細胞および非ヒト生物を改変する方法の実施形態も提供する。

【0048】

Ａ．定義
他に定義がない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形、例えば「ひとつ（ａ）」または「ひとつ（ａｎ）」を含み、複数形、例えば「ひとつ以上（ｏｎｅｏｒｍｏｒｅ）」や「少なくともひとつ（ａｔｌｅａｓｔｏｎｅ）」を含み、用語「または（ｏｒ）」は「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味しうる。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」なる用語は、限定するものではない。本明細書で提供される範囲は、その種類を問わず、記述された特定の範囲内のすべての値、および特定の範囲の終点に関する値を含む。

【0049】

本明細書で使用される「約（ａｂｏｕｔ）」なる用語は、例えば、組成物中の成分の量、濃度、容積、プロセス温度、プロセス時間、収率、流量、圧力、およびそれらの範囲を修飾するために使用される。「約（ａｂｏｕｔ）」なる用語は、例えば、化合物、組成物、濃縮物、または製剤の作製に使用される典型的な測定、および取り扱い手順で、これらの手順における偶発的な誤差で、方法を実施するために使用される製造機器、原料、または出発材料または成分の純度の違いで、およびその他の同様の考慮事項で発生しうる数値量の変動を意味する。「約（ａｂｏｕｔ）」なる用語は、特定の初期濃度または混合物を有する製剤の経年により異なる量、および特定の初期濃度または混合物を有する製剤の混合またはプロセスにより異なる量も含む。「約（ａｂｏｕｔ）」なる用語で修飾されている場合、添付の特許請求の範囲にはそのような等価物が含まれる。

【0050】

一般に、本明細書に記載されている細胞培養および組織培養、分子生物学、タンパク質化学およびオリゴまたはポリヌクレオチド化学、およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、およびその技術は、当該技術分野でよく知られ、一般的に使用されているものである。アミノ酸は、一般的に知られている３文字の記号か、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名法委員会が推奨する１文字の記号のいずれかで本明細書で呼ばれることがある。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられている１文字コードで呼ばれることがある。

【0051】

本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」または「タンパク質」なる用語は、ペプチド結合によって互いに結合した２つ以上のアミノ酸残基を有する分子を指すために互換的に使用できる。「ポリペプチド」なる用語は、抗体およびその他の非抗体タンパク質を意味しうる。非抗体タンパク質は、酵素、レセプター、細胞表面タンパク質のリガンド、分泌タンパク質、および融合タンパク質またはその断片などのタンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。ポリペプチドは、タンパク質ベースの治療薬を含む、科学的または商業的に関心のあるものであってもよい。

【0052】

本明細書で使用する場合、「抗体」および「免疫グロブリン」なる用語は互換的に使用でき、抗原の抗原決定基の特徴と相補的な内部表面形状および電荷分布を有する三次元結合空間を有するポリペプチド鎖の折り畳みから形成される少なくとも１つの結合ドメインを含むポリペプチドまたはポリペプチド群を意味する。天然に存在する抗体は通常４量体で、２対のポリペプチド鎖を持ち、各対は１本の「軽鎖」と１本の「重鎖」を持つ。各軽鎖／重鎖対の可変領域は抗体結合部位を形成する。各軽鎖は１つの共有結合ジスルフィド結合で重鎖と結合しているが、ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのアイソタイプによって異なる。重鎖と軽鎖はそれぞれ、鎖内に規則的な間隔でジスルフィド結合を持つ。各重鎖の一端には可変領域（ＶＨ）があり、その後にいくつかの定常領域（ＣＨ）が続く。各軽鎖は、一端に可変領域（ＶＬ）、他端に定常領域（ＣＬ）を有し、軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域と並び、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と並ぶ。軽鎖は、軽鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいてラムダ鎖とカッパ鎖に分類される。重鎖は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、ガンマ鎖、デルタ鎖、アルファ鎖、ミュー鎖、またはイプシロン鎖のいずれかに分類される。

【0053】

「抗原結合フラグメント」または「免疫学的に活性なフラグメント」なる用語は、少なくとも１つの抗原結合部位を含み、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体のフラグメントを意味する。免疫グロブリン分子は、いずれかのアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹなど）、サブアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２など）、またはアロタイプ（例えば、Ｇｍ、例えば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａ、またはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、またはｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、およびＫｍ（１、２、または３））であり得る。サブタイプには、げっ歯類などの非ヒト哺乳動物に見られる、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、およびＩｇＧ３などのサブクラスが含まれる。免疫グロブリンには、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの異なるエピトープ結合断片（例：二重特異性抗体）から形成される多重特異性抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、イントラボディ、および組換え生産抗体断片を含むその所望の抗原結合断片が含まれるが、これらに限定されない。組換え生産が可能な抗体断片の例としては、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片などの可変重鎖、および軽鎖ドメインを含む抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。抗体断片には、上記に列挙した抗体のエピトープ結合断片または誘導体も含まれる。

【0054】

「組換え体（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」なる用語は、例えば核酸やタンパク質など、人工的または合成的に（すなわち、非天然的に）改変された、または人の介入によって生産された生物学的物質を意味する。「組換え抗体」なる用語は、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体ならびに、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体など、組換えＤＮＡプロセスによって調製された抗体を意味する。実施形態では、組換え抗体は組換えヒト抗体であり、これにはヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニック動物から単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列を別のＤＮＡ配列にスプライシングすることによって調製された抗体が含まれるが、これらに限定されない。

【0055】

本明細書で使用する「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列とは、適切な調節配列（または「コントロールエレメント」）の制御下に置かれると、例えばインビボで転写され（ＤＮＡの場合）、ポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）核酸分子のことである。コード配列の境界は通常、５’（アミノ）末端の開始コドンと３’（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、ウイルス、原核生物、または真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルスまたは原核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、さらには合成ＤＮＡ配列が含まれるが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の３’に位置することもある。他の「制御エレメント」もコード配列と関連付けられることがある。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、選択された細胞が好むコドンを用いて、所望のポリペプチドコード配列のＤＮＡコピーを表すことにより、選択された細胞での発現に最適化できる。

【0056】

本明細書で使用する「コードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を意味し、ポリペプチド配列またはその一部は、核酸配列によってコードされるポリペプチドから少なくとも約３から約５アミノ酸、少なくとも約８から約１０アミノ酸、または少なくとも約１５から約２０アミノ酸のアミノ酸配列を含む。また、配列によってコードされるポリペプチドと免疫学的に識別可能なポリペプチド配列も含む。

【0057】

本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、このように説明された構成要素が通常の機能を果たすように構成された要素の配置を意味する。したがって、コード配列（例えば、レポーター発現カセット）に作動可能に連結された所定のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合、コード配列の発現をもたらすことができる。プロモーターまたは他の制御エレメントは、その発現を指示するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。例えば、プロモーター配列とコード配列の間に、まだ転写されていない介在配列が存在しても、プロモーター配列はコード配列と「作動可能に連結」しているとみなすことができる。

【0058】

本明細書で使用する「ベクター」とは、遺伝子配列を標的細胞に導入できるものである。典型的には、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」、および「遺伝子導入ベクター」とは、目的の遺伝子の発現を誘導でき、遺伝子配列を標的細胞に導入できるあらゆる核酸コンストラクトを意味する。したがって、この用語は、クローニング、発現ビヒクル、および組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｎｇ）ベクターを含む。

【0059】

本明細書で使用する「発現カセット」は、目的の遺伝子／コード配列の発現を誘導できるいずれかの核酸コンストラクトを含む。このようなカセットは、発現カセットを標的細胞に導入するために、「ベクター」、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」、または「遺伝子導入ベクター」に構築されうる。したがって、この用語には、クローニングや発現ビヒクル、ウイルスベクターも含まれる。

【0060】

本明細書で使用する「タンデムリピート」とは、（核酸中の）１つ以上のヌクレオチドまたは（タンパク質中の）１つ以上のアミノ酸残基のリピートであり、リピートは配列中で互いに隣接して存在する。タンデムリピートは連続していてもよく（すなわち、リピートの間に他のヌクレオチドまたは残基がない）、またはタンデムリピートはリピートの間に１つ以上のヌクレオチドまたは残基によって隔てられていてもよい。

【0061】

本明細書で使用する「発現ベクター」なる用語は、好適な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするのに使用できる、いずれかの適当な組換え発現ベクターを意味する。本明細書で使用する「宿主細胞」なる用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。「宿主細胞」なる用語は、発現ベクターが導入された細胞（「親」細胞）だけでなく、そのような細胞の子孫も意味する。例えば、突然変異または環境の影響により、後代に改変が起こる可能性があるため、子孫細胞は親細胞と同一ではないかもしれないが、依然として「宿主細胞」なる用語の範囲に含まれる。

【0062】

本明細書で使用する「形質転換」なる用語は、外来ＤＮＡの取り込みによって生じる細胞の遺伝的変化を意味する。細胞の形質転換に好適な方法には、ウイルス感染、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクションなどがある。方法の選択は一般に、形質転換される細胞の種類と、形質転換が行われる状況（すなわち、インビトロ、エクスビボ、インビボ）に依存する。これらの方法に関する一般的な議論は、Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed, Wiley & Sons, 1995に記載される。

【0063】

本明細書で使用する「不死化細胞」とは、通常は無限に増殖しないタイプの細胞であるが、細胞老化を回避する変異を持つことで、無限に細胞分裂を続けることができる細胞を意味する。実施形態では、不死化細胞株は腫瘍細胞株に由来する、または細胞が無限に増殖するように改変された細胞株に由来しうる。

【0064】

本明細書で使用する「ノックイン」とは、特定のゲノム位置に異種ＤＮＡ配列を挿入する遺伝子工学的手法によって生成されたトランスジェニック細胞または動物を意味する。ある態様では、異種ＤＮＡ配列は相同組換えによって挿入される。ある態様では、異種ＤＮＡ配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて挿入される。ある態様では、異種ＤＮＡ配列は「セーフハーバー部位」に挿入される。本明細書で使用する「セーフハーバー部位」とは、新しい遺伝要素が予測通りに機能し、宿主細胞や生物に危険をもたらすような宿主ゲノムの変化を引き起こさないように、新しい遺伝物質の組み込むを受け入れることができるゲノム中の部位のことである。「ノックイン」は、少なくとも１つの対立遺伝子に異種ＤＮＡ配列を含む子孫が含む。実施形態では、この部位にレポーター遺伝子を付加することにより、細胞の系譜を追跡することが可能である。

【0065】

本明細書で使用する「異種」とは、細胞または動物内に天然には存在しない核酸、または細胞または動物に天然に存在するが改変または変異された核酸を意味する。

【0066】

本明細書で使用する「膜貫通ドメイン」（ＴＭドメイン）とは、細胞の細胞膜を横断するタンパク質の一般的に疎水性の領域を意味する。実施形態では、ＴＭドメインはコンストラクトの細胞外部分を細胞内部分に連結する。実施形態では、ＴＭドメインは細胞外アフィニティタグと細胞内蛍光レポータータンパク質を連結している。ＴＭドメインは、タンパク質の膜貫通領域、タンパク質の膜貫通フラグメント、人工的な疎水性配列、またはそれらの組み合わせを含み得る。実施形態では、膜貫通ドメインはＩ型膜貫通タンパク質である。実施形態では、ＴＭドメインは１つ以上のα－ヘリックスを含む。実施形態では、ＴＭドメインは１本以上のβ－ストランドを含む。実施形態では、膜貫通ドメインはＩｇＧ膜貫通ドメインを含む。実施形態では、膜貫通ドメインはヒトＩｇＧ膜貫通ドメインを含む。実施形態では、膜貫通ドメインはマウスＩｇＧ膜貫通ドメインを含む。

【0067】

実施形態では、膜貫通ドメインは哺乳動物の膜貫通ドメインを含む。実施形態では、膜貫通ドメインは、マウスタンパク質Ｔｍｅｍ５３、Ｌｒｔｍ１、またはＮｒｇ１の膜貫通ドメインを含む。本明細書では具体例を示すが、他の膜貫通ドメインも当業者には明らかであり、本明細書に記載のコンストラクトに関連して使用できる。例えば、Yu and Zhang (2013) "A simple method for predicting transmembrane proteins based on wavelet transform," Int.J. Biol.Sci.9(1):22-33を参照のこと。

【0068】

Ｂ．Ｂ細胞の発生
実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて識別および／または単離された細胞はＢ細胞である。Ｂ細胞は骨髄の造血幹細胞（ＨＳＣ）から発生し、抗原に依存しないいくつかの発生段階を経て、未熟Ｂ細胞が生成される。未熟Ｂ細胞は表面にＩｇＭを発現している（膜ＩｇＭ発現）。未熟Ｂ細胞は骨髄から脾臓に移動し、そこで成熟したナイーブＢ細胞（膜型ＩｇＭおよびＩｇＤを発現する）に分化する。これらの成熟したナイーブＢ細胞の一部はメモリーＢ細胞に分化する。メモリーＢ細胞は寿命が長く、静止している細胞で、抗原に再曝露されると速やかに活性化し、増殖して、新たな感染と闘うための形質細胞に分化する。ナイーブＢ細胞またはメモリーＢ細胞が抗原によって活性化されると、増殖し、抗体分泌細胞へと分化する。

【0069】

その後、細胞が完全に成熟して形質細胞になると、分泌型Ｉｇを発現するが、Ｉｇ表面発現は失われる。マウスとラットでは、抗体発現細胞の約９９％がＩｇカッパを軽鎖として使用している。

【0070】

造血幹細胞がＢ細胞系譜にコミットした後、Ｂ細胞前駆細胞は一連の分化イベントを介して成熟Ｂ細胞になる。

【0071】

Ｃ．相同組換えと部位特異的ヌクレアーゼ
本明細書に記載されるように、本開示は、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞および生物を生成する方法を提供し、その方法は、非ヒト哺乳動物細胞にヌクレアーゼを導入することを含み、そのヌクレアーゼは、改変される細胞のゲノムの位置において一本鎖切断または二本鎖切断を引き起こす。実施形態では、この一本鎖切断または二本鎖切断の修復により、核酸配列が改変される細胞のゲノムに組み込まれる。実施形態では、この組み込みは相同組換えを介して起こる。

【0072】

相同組換え（ＨＲ）：相同組換えは、生物のゲノム内の特定の部位に標的遺伝子を挿入することを可能にする（遺伝子ターゲティング）。標的にするゲノム配列に一致するテンプレートを含むＤＮＡコンストラクトを作製することにより、細胞内のＨＲプロセスがコンストラクトを所望の位置に挿入することを可能にする。本方法を胚性幹細胞に用いることで、標的遺伝子をノックアウト、すなわちゲノムから除去した、またはノックイン、すなわちゲノムに追加した、トランスジェニックマウスが開発された。

【0073】

二本鎖切断後のＨＲを利用した遺伝子ノックイン方法は、当該技術分野で記載されており、例えば、米国特許第5,474,896；5,792,632；5,866,361；5,948,678；5,948,678, 5,962,327；6,395,959；6,238,924；および5,830,729号に記載されており、それぞれが参照により本明細書に援用される。相同組換えの例示的な方法論は、米国特許第6,689,610；6,204,061；5,631,153；5,627,059；5,487,992；および5,464,764号に記載されており、それぞれが参照により本明細書に援用される。

【0074】

実施形態では、一本鎖切断または二本鎖切断は部位特異的ヌクレアーゼを用いて導入される。そのようなヌクレアーゼは当該技術分野で公知であり、そのようなヌクレアーゼの例は本明細書で提供される。

【0075】

ジンクフィンガーヌクレアーゼ：ジンクフィンガーヌクレアーゼはＤＮＡ結合ドメインを持っており、ＤＮＡ配列を正確にターゲティングできる。各ジンクフィンガーは所望のＤＮＡ配列の一部を認識でき、それゆえ特定の配列に結合するようにモジュール式に組み立てることができる。結合ドメインは、ＤＮＡの二本鎖切断を引き起こす制限酵素の切断を誘導する。

【0076】

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）：転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）もＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡを切断するヌクレアーゼを含む。ＤＮＡ結合領域には、それぞれ目的の標的ＤＮＡ配列の１塩基対を認識するアミノ酸リピートが含まれる。ヌクレアーゼはＤＮＡに二本鎖切断を引き起こす。

【0077】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ：クラスター化され規則的間隔で配置された短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）は、Ｃａｓタンパク質と複合体化したガイドＲＮＡを含むゲノム編集法である。ガイドＲＮＡは、ジンクフィンガーやＴＡＬＥＮが必要とするコンストラクトの組み立てとは対照的に、単純な相補的塩基対形成によって所望のＤＮＡ配列と一致するように設計できる。結合したＣａｓはＤＮＡに二本鎖切断を引き起こす。実施形態では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９を含む。実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、またはＣａｓΦを含む。実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１１、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、またはＣａｓΦを含む。

【0078】

Ｄ．Ｃｒｅ組換え酵素
Ｃｒｅ（Ｃｒｅ組換え酵素）は、フリッパーゼ（Ｆｌｐ）やＤ６特異的組換え酵素（Ｄｒｅ）を含むチロシン部位特異的組換え酵素（Ｔ－ＳＳＲ）の一つである。バクテリオファージＰ１のｃｒｅ（環化組換え酵素）遺伝子から産生される３８ｋＤａのＤＮＡ組換え酵素として発見された。これはｌｏｘＰ（ｌｏｃｕｓｏｆｘ－ｏｖｅｒ，Ｐ１）と呼ばれる特定のＤＮＡ断片配列を認識し、２つのｌｏｘＰ部位間のＤＮＡ配列の部位特異的欠失を媒介する。ｌｏｘＰ部位は３４ｂｐの配列で、２つの１３ｂｐの逆方向リピートおよび回文リピート、および８ｂｐのコア配列を含む。

【0079】

本明細書でさらに述べるように、リーダー配列と導入遺伝子をコードするレポーター配列の間に、ｌｏｘＰ隣接「停止」配列（転写終結エレメント）を適切に挿入すると、遺伝子の発現が遮断される。コンディショナルレポーター系統をスイッチ系統と交配した後、Ｃｒｅ組換え酵素がレポーターの前の停止エレメントを除去し、Ｃｒｅ発現細胞の核内でレポーターの発現をオンにする。その結果、これらの細胞は、細胞表面のアフィニティタグと細胞内の蛍光マーカーで恒久的に標識される。このプロセスを図１Ｂに模式的に示す。

【0080】

Ｃｒｅが組織特異的プロモーターの制御下にあるマウス系統は何千も開発されている。つまり、Ｃｒｅはマウスの特定の組織でのみ発現している。本明細書でさらに述べるように、異なるスイッチ系統に交配することで、目的の異なる細胞をレポータータンパク質で標識し、ラージスケールの磁気ベースの方法またはフローベースの方法で単離できる。

【0081】

Ｅ．げっ歯類の免疫グロブリン
ヒトと同様、マウスとラットには５つの抗体アイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）がある。それぞれのアイソタイプは異なる重鎖を持つ。アイソタイプはクラスと呼ばれることもある。ナイーブＢ細胞はＩｇＭおよびＩｇＤを産生する。Ｂ細胞が成熟する過程で、アイソタイプスイッチングにより、成熟Ｂ細胞はＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥのアイソタイプおよびサブクラスのいずれかを産生する。アイソタイプによってインビボでの半減期は異なり、１２時間から８日間の範囲である。

【0082】

ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの重鎖は、３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを持つ定常領域を持っている。他のタイプの重鎖は、免疫グロブリンドメインの数が異なる場合がある。ＩｇＥおよびＩｇＭの重鎖は、４つの免疫グロブリンドメインを持つ定常領域を持っている。上記のアイソタイプの各重鎖は、転写時の選択的スプライシングイベントにより、Ｃ末端領域に膜結合型と分泌型を有する。膜結合型ｍＲＮＡは、Ｃ末端にさらに２つのエキソンを含む。したがって、膜結合型重鎖のタンパク質は、膜貫通ドメインと細胞質Ｃ末端尾部を持つ、より長いタンパク質となる。すべてのアイソタイプの重鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを持つ可変領域を持つ。

【0083】

各軽鎖（カッパまたはラムダのいずれか）は、１つの定常免疫グロブリンドメインと１つの可変免疫グロブリンドメインを持つ。ラットとマウスでは、カッパとラムダの軽鎖使用率はおよそ９９対１であり、抗体発現細胞の約９９％がカッパ軽鎖を発現していることを意味する。マウス免疫グロブリンカッパ（カッパ）軽鎖多遺伝子ファミリーは、定常領域部位（Ｃカッパ）、４つの接合領域遺伝子、および約９５のカッパ可変（Ｖカッパ）領域ファミリーを含む。

【0084】

Ｆ．トランスジェニック動物
「トランスジェニック動物」とは、外来性の核酸配列が染色体外エレメントとして細胞の一部に存在するか、生殖細胞系列のＤＮＡ（すなわち、細胞のほとんどまたはすべてのゲノム配列）に安定的に組み込まれた非ヒト動物、通常は哺乳動物である。本明細書の実施形態では、トランスジェニック動物は、当該技術分野で周知の方法にしたがって、例えば宿主動物の胚または胚性幹細胞を遺伝子操作することにより、そのようなトランスジェニック動物の生殖細胞系列に導入された外因性核酸を含む。本明細書の実施形態では、トランスジェニック動物は、本明細書に記載の核酸レポーターコンストラクトより多くを含む。実施形態では、トランスジェニック動物は、トランスジェニック動物によって産生される産物、例えば、酵素または免疫グロブリンなどのタンパク質、またはＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸をコードする１つ以上の付加的な核酸を含む。具体的な態様では、本明細書の方法は、本明細書に記載のレポーターコンストラクトをコードする核酸とともに部分的に導入されたヒト免疫グロブリン領域を含むトランスジェニック動物の生成を提供する。

【0085】

実施形態では、トランスジェニック動物はげっ歯類、例えばマウスまたはラットである。実施形態では、トランスジェニックげっ歯類は、創薬目的で部分的または完全なヒト抗体を作製するために、ヒト免疫グロブリン配列と内因性マウス免疫グロブリン領域を含む。このようなマウスの例としては、例えば、米国特許第7,145,056号; 7,064,244号；7,041,871号；6,673,986号；6,596,541号；6,570,061号；6,162,963号；6,130,364号；6,091,001号；6,023,010号；5,593,598号；5,877,397号；5,874,299号；5,814,318号；5,789,650号；5,661,016号；5,612,205号；および5,591,669号に記載されものを含み、これらは参照により本明細書に援用される。実施形態では、トランスジェニックげっ歯類は、ゲノムが、欠失し、改変免疫グロブリン部位可変領域と置換された内因性マウス免疫グロブリン部位可変領域全体を含むトランスジェニックマウスである。このようなマウスの例としては、例えば、米国特許第10,881,084号および米国特許出願公開第2020/0190218に記載されているものを含む。実施形態では、トランスジェニックマウスはヒトまたは部分的にヒトの抗体を発現するように改変される。他の実施形態では、トランスジェニックマウスはイヌ、ウマ、またはウシの抗体を発現するように改変される。米国特許出願公開第10,793,829号、2020/0308307号および2021/0000087号、および国際公開第2021/003152号を参照のこと。

【0086】

Ｇ．セルソーティング方法
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）は、フローサイトメトリーの特殊なタイプである。本方法は、不均一な細胞の混合物を、各細胞の特異的な光散乱と蛍光特性に基づいて、一度に１細胞ずつ、２つ以上の容器にソーティングできる。ＦＡＣＳは、この技術のために設計されたセルソーティング装置を用いて行われる。ＦＡＣＳは、個々の細胞からの蛍光シグナルを迅速、客観的、および定量的に記録し、特に関心のある細胞を物理的に分離する。

【0087】

実施形態では、ＦＡＣＳは一般に以下のように行われる。ソーティングされる細胞の懸濁液は、狭く急速に流れる液体の流れの中心に巻き込まれる。流れは、直径に対して細胞間の間隔が大きくなるように配置される。振動メカニズムによって、細胞の流れは個々の液滴に分解される。システムは、液滴１つにつき複数の細胞が存在する確率が低くなるように調整される。流れが液滴に分かれる直前に、流れは蛍光測定ステーションを通過し、そこで各細胞の蛍光特性が測定される。帯電リングは、ストリームが液滴に分かれるちょうどその地点に設置される。直前の蛍光強度測定に基づいてリングに電荷がかけられ、液滴が流れから離れるときに反対の電荷が液滴に捕捉される。帯電した液滴は、静電偏向システムを通って落下し、その帯電に基づいて液滴を容器に方向転換させる。いくつかのシステムでは、電荷は流れに直接印加され、分離する液滴は流れと同じ符号の電荷を保持する。その後、液滴が途切れた後、ストリームはニュートラルに戻り、次の液滴が測定およびソーティングされる。

【0088】

磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ；ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ）は、細胞表面のマーカーによって細胞を分離する方法である。実施形態では、ＭＡＣＳシステムは超常磁性ナノ粒子およびカラムを使用する。超常磁性ナノ粒子は１００ｎｍオーダーのナノ粒子である。ナノ粒子は標的にする細胞にタグを付け、カラム内に捕捉する。カラムは永久磁石の間に置かれ、磁性粒子と細胞の複合体がそこを通過するとき、タグ付けされた細胞が捕捉されるようになっている。磁性ナノ粒子は、その表面に特定のマーカーを結合させる試薬でコーティングされている。マーカーを発現する細胞は磁性ナノ粒子に付着する。ビーズと細胞をインキュベートした後、溶液を強磁場中のカラムに移す。ナノ粒子に付着した細胞（マーカーを発現している）はカラムに留まり、他の細胞（マーカーを発現していない）はカラムを通過する。

【0089】

実施形態では、細胞は細胞表面に発現したアフィニティタグを用いてソーティングされる。この目的のためのアフィニティタグは本明細書に記載される。これらの実施形態では、当該技術分野で公知の方法を用いて、アフィニティタグに結合するアフィニティ精製カラムまたは樹脂を用いて細胞をソーティングできる。非限定的な例として、細胞がその表面にＳｔｒｅｐＩＩタグを発現している場合、ＳｔｒｅｐＩＩタグに結合する樹脂、例えばＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）（ＩＢＡＬｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて細胞を捕捉することができ、したがってソーティングできる。

【0090】

Ｈ．コンディショナルレポーター核酸コンストラクト
実施形態では、本明細書で提供されるのは、リーダー配列、ＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセット、およびアフィニティタグ、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、および蛍光レポータータンパク質をコードする膜貫通レポーターカセットを含む核酸コンストラクトである。この核酸コンストラクトの実施形態を、本明細書では「コンディショナルレポーター核酸コンストラクト」と呼ぶことがある。

【0091】

前記コンストラクトの実施形態では、リーダー配列はＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセットの上流に存在する。実施形態では、リーダー配列はＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセットの下流に存在する。

【0092】

実施形態では、ＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセットは停止エレメント、例えば、翻訳または転写を終結させるいずれかのタイプの配列を含む。実施形態では、停止エレメントは１つ以上のＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。

【0093】

実施形態では、ＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセットは、転写の終結を引き起こす配列に隣接する２つのＬｏｘＰ部位を含む。実施形態では、ＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセットは、転写の終結を引き起こすＬｏｘＰ隣接ポリアデニル化配列を含む。実施形態では、ポリアデニル化シグナルはＳＶ４０、ｈＧＨ、ＢＧＨ、またはｒｂＧｌｏｂポリアデニル化シグナルである。実施形態では、ＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセットはポリアデニル化配列のＬｏｘＰ隣接トリプルリピートを含む。実施形態では、ＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセットはポリアデニル化配列のＬｏｘＰ－ｆｌａｎｋｅｄダブルリピートを含む。実施形態では、ＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセットはＬｏｘＰ隣接シングルポリアデニル化配列を含む。

【0094】

実施形態では、ＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセットはＳＶ４０ポリアデニル化配列のＬｏｘＰ隣接トリプルリピートを含む。実施形態では、ＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセットはＳＶ４０ポリアデニル化配列のＬｏｘＰ隣接ダブルリピートを含む。実施形態では、ＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセットはＬｏｘＰ隣接シングルＳＶ４０ポリアデニル化配列を含む。

【0095】

実施形態では、停止エレメントは、翻訳の終結を引き起こす１つ以上の終止コドンを含む。実施形態では、ＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセットはＬｏｘＰ隣接終止コドンを含む。実施形態では、終止コドンはＴＡＧ、ＴＡＡ、またはＴＧＡである。

【0096】

実施形態では、核酸コンストラクトは、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、プラスミド、またはウイルスベクターを含む。実施形態では、核酸コンストラクトは直鎖ＤＮＡである。実施形態では、核酸コンストラクトは環状ＤＮＡである。

【0097】

実施形態では、核酸コンストラクトは、非ヒト哺乳動物のゲノム中の第１の標的配列および第２の標的配列に相同である第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームをさらに含む。相同領域は、本明細書に記載され当該技術分野で公知の方法を用いて、核酸コンストラクトを非ヒト哺乳動物のゲノムに組み込むことを可能にする。実施形態では、核酸コンストラクトは、非ヒト哺乳動物におけるセーフハーバー部位内の第１の標的配列および第２の標的配列にそれぞれ相同である第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームをさらに含む。

【0098】

実施形態では、第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームは、それぞれ独立して、約１５ヌクレオチドから約１２０００ヌクレオチドを含む。実施形態では、第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームは、それぞれ独立して、約３０ヌクレオチドから約１１０００ヌクレオチドを含む。実施形態では、第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームは、それぞれ独立して、約５０ヌクレオチドから約１００００ヌクレオチドを含む。実施形態では、第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームは、それぞれ独立して、約１００ヌクレオチドから約７５００ヌクレオチドを含む。実施形態では、第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームは、それぞれ独立して、約２００ヌクレオチドから約５０００ヌクレオチドを含む。実施形態では、第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームは、それぞれ独立して、約３００ヌクレオチドから約２５００ヌクレオチドを含む。

【0099】

実施形態では、セーフハーバー部位は、新たな遺伝要素が予測通りに機能し、宿主細胞または生物に危険をもたらす宿主ゲノムの変化を引き起こさないように、新しい遺伝物質の組み込みを受け入れることができるゲノム中のいずれかの部位である。実施形態では、セーフハーバー部位はマウスセーフハーバー部位である。実施形態では、セーフハーバー部位はラットセーフハーバー部位である。実施形態では、セーフハーバー部位は、マウスゲノムの６番染色体上のＲｏｓａ２６部位を含む。実施形態では、セーフハーバー部位はマウスゲノムの１１番染色体上のＨｉｐｐ１１部位を含む。

【0100】

実施形態では、核酸コンストラクトは内因性プロモーターを用いて発現する。実施形態では、核酸コンストラクトは、セーフハーバー部位に位置する内因性プロモーターを用いて発現する。

【0101】

実施形態では、核酸コンストラクトはプロモーターをさらに含む。実施形態では、プロモーターは哺乳動物構成的プロモーターである。実施形態では、プロモーターはヒトプロモーターである。実施形態では、プロモーターはマウスプロモーターである。実施形態では、プロモーターはラットプロモーターである。実施形態では、プロモーターはウイルスプロモーターである。実施形態では、プロモーターはＣＡＧプロモーターを含む。実施形態では、プロモーターはＣＡＧ、ＣＭＶ、ＥＦ１ａ、ＳＶ４０、ＰＧＫ１、Ｕｂｃ、またはヒトベータアクチンプロモーターを含む。

【0102】

実施形態では、リーダー配列は分泌シグナルペプチドを含む。実施形態では、分泌シグナルペプチドはＩＬ－２リーダー配列である。実施形態では、分泌シグナルペプチドは、ヒトＯＳＭ、ＶＳＶ－ＧマウスＩｇカッパ、ヒトＩｇＧ２Ｈ、ＢＭ４０、セクリコンン（Ｓｅｃｒｅｃｏｎ）、ヒトＩｇＫＶＩＩＩ、ＣＤ３３、ｔＰＡ、ヒトキモトリプシノーゲン、ヒトトリプシノーゲン－２、ヒトＩＬ－１２、またはヒト血清アルブミンシグナルペプチドである。実施形態では、分泌シグナルペプチドは、ＩＬ－２リーダー配列ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２）を含む。当業者であれば、シグナルペプチドは当該技術分野で公知のアルゴリズム、例えばＳｉｇｎａｌＰ－５．０ (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)やＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ２．０ (www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/)を用いて予測できることを理解するであろう。

【0103】

核酸コンストラクトのアフィニティタグは、コンストラクトによって発現されたタンパク質を後で単離または精製するために使用できる。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩ、ヘキサヒスタジン、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＶＡ、ＧＳＴ、β－ＧＡＬ、ＭＢＰ、またはＶＳＶ－Ｇタグを含む。実施形態では、アフィニティタグは約１から約１８個のタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約２から約１５個のタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは約３から約１０個のタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグはタグの３個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８個のタグのタンデムリピートを含む。

【0104】

実施形態では、アフィニティタグはＳｔｒｅｐＩＩタグを含む。実施形態では、アフィニティタグはＳｔｒｅｐＩＩタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約１から約１８個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約２から約１５のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約３から約１０個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグはＳｔｒｅｐＩＩタグの３個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８個のタンデムリピートを含む。実施形態では、タンデムリピートはリピート間にタグリンカーを有する。実施形態では、リンカーはジペプチドまたはトリペプチドである。実施形態では、タグリンカーはジペプチドＳｅｒ－Ａｌａである。

【0105】

実施形態では、ＳｔｒｅｐＩＩタグは、ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号１）の８個のアミノ酸のペプチド配列を含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＷＳＨＰＱＦＥＫＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号３）を含む。

【0106】

膜貫通レポーターカセットによってコードされる膜貫通ドメインは、核酸コンストラクトを発現する細胞の表面にアフィニティタグを提示することを可能にする。実施形態では、膜貫通ドメインは疎水性αヘリックスを含む。実施形態では、膜貫通ドメインはＩｇＧ膜貫通ドメインを含む。実施形態では、膜貫通ドメインはヒトＩｇＧ１膜貫通ドメインを含む。実施形態では、膜貫通ドメインはマウスＩｇＧ膜貫通ドメインを含む。実施形態では、膜貫通ドメインは、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、またはＩｇＧ２ｃ膜貫通ドメインを含む。実施形態では、膜貫通ドメインは、マウスタンパク質Ｔｍｅｍ５３、Ｌｒｔｍ１、またはＮｒｇ１の膜貫通ドメインを含む。

【0107】

蛍光レポータータンパク質は、核酸コンストラクトを発現している細胞の検出を可能にする。実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、またはオレンジ色蛍光タンパク質を含む。実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、または強化型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を含む。実施形態では、蛍光レポータータンパク質は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含む。実施形態では、赤色蛍光タンパク質は、単量体チェリー（ｍＣｈｅｒｒｙ）またはタンデム二量体トマト（ｔｄＴｏｍａｔｏ）である。

【0108】

実施形態では、核酸コンストラクトは、図１Ａに模式的に示される核酸コンストラクトであり、ここで、ＣＡＧＧＳはＣＡＧプロモーターを表し、Ｌはリーダーを表し、示されるように配置されたＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセットを表し、ＳＴＸ３はＳｔｒｅｐ－ＩＩタグの３個のタンデムリピートを表し、ＴＭは膜貫通ドメインを表し、およびＧＦＰは緑色蛍光タンパク質レポーターを表す。

【0109】

Ｉ．コンディショナルレポーター改変細胞および生物の生成方法
実施形態では、本明細書で提供されるのは、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を生成する方法であり、その方法は以下を含む：
（ａ）本明細書に記載のコンディショナルレポーター核酸コンストラクトを非ヒト哺乳動物細胞に導入すること；および
（ｂ）非ヒト哺乳動物細胞にヌクレアーゼを導入し、前記ヌクレアーゼが前記非ヒト哺乳動物細胞のゲノムのセーフハーバー部位で一本鎖切断または二本鎖切断を引き起こし、核酸コンストラクトが相同組換えにより前記非ヒト哺乳動物細胞の前記セーフハーバー部位のゲノムに組み込まれること。

【0110】

実施形態では、ヌクレアーゼは二本鎖切断を引き起こす。実施形態では、ヌクレアーゼは一本鎖切断（例えば、ニック）を引き起こす。

【0111】

ヌクレアーゼは、当該技術分野で公知の方法を用いて細胞内に導入できる。実施形態では、ヌクレアーゼを導入することは、ヌクレアーゼをコードする発現コンストラクトを導入することを含む。実施形態では、発現コンストラクトの導入はインジェクションまたはエレクトロポレーションによって行われる。実施形態では、ヌクレアーゼを導入することは、ヌクレアーゼをコードするプラスミドを導入することを含む。実施形態では、ヌクレアーゼを導入することは、ヌクレアーゼをコードするウイルスベクターを導入することを含む。実施形態では、ヌクレアーゼを導入することは、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを導入することを含む。実施形態では、ｍＲＮＡは１つ以上の修飾塩基を含む。実施形態では、ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子に被包されている。実施形態では、プラスミド、ウイルスベクター、またはｍＲＮＡの導入は、インジェクションまたはエレクトロポレーションを介して行われる。実施形態では、ヌクレアーゼを導入することはヌクレアーゼタンパク質を細胞に直接導入することを含む。実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質の細胞への直接導入は、インジェクションまたはエレクトロポレーションを介して行われる。

【0112】

実施形態では、ヌクレアーゼは本明細書に記載のヌクレアーゼである。実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはクラスター化され規則的間隔で配置された短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、認識部位を標的にするＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９を含む。実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、またはＣａｓΦを含む。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１１、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、またはＣａｓΦを含む。

【0113】

実施形態では、非ヒト哺乳動物細胞は、科学研究に使用される哺乳動物由来である。実施形態では、非ヒト哺乳動物細胞はげっ歯類細胞である。実施形態では、げっ歯類細胞はラット細胞またはマウス細胞である。

【0114】

実施形態では、セーフハーバー部位は、新しい遺伝要素が予測可能に機能し、宿主細胞または生物に危険をもたらす宿主ゲノムの変化を引き起こさないように、新しい遺伝物質の組み込みを受け入れることができるゲノム中のいずれかの部位である。実施形態では、セーフハーバー部位はマウスセーフハーバー部位である。実施形態では、セーフハーバー部位はラットのセーフハーバー部位である。実施形態では、セーフハーバー部位は６番染色体上のＲｏｓａ２６部位を含む。実施形態では、セーフハーバー部位はマウスゲノムの１１番染色体上のＨｉｐｐ１１部位を含む。

【0115】

実施形態では、非ヒト哺乳動物細胞は多能性細胞である。実施形態では、多能性細胞は非ヒト接合子である。実施形態では、多能性細胞はマウス接合子である。実施形態では、多能性細胞はラット接合子である。実施形態では、多能性細胞は非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である。実施形態では、多能性細胞はマウス胚性幹（ＥＳ）細胞またはラット胚性幹（ＥＳ）細胞である。

【0116】

実施形態では、接合子に本明細書に記載の核酸コンストラクトをインジェクションする。実施形態では、核酸コンストラクトは接合子の前核にインジェクションされる。実施形態では、マイクロインジェクション接合子は、擬似妊娠中の雌げっ歯類の卵管に移植される。実施形態では、擬似妊娠雌げっ歯類はマウスである。実施形態では、擬似妊娠雌げっ歯類はラットである。実施形態では、移植された接合子は胎児に成長し、出生して遺伝子改変非ヒト哺乳動物を提供する。実施形態では、遺伝子改変非ヒト哺乳動物はマウスである。実施形態では、遺伝子改変非ヒト哺乳動物はラットである。

【0117】

実施形態では、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を生成する方法は、核酸コンストラクトがセーフハーバー部位で組み込まれた遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を単離することをさらに含む。

【0118】

実施形態では、上記の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞の生成方法により生成された遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞も本明細書で提供される。実施形態では、非ヒト哺乳動物はげっ歯類である。実施形態では、非ヒト哺乳動物はマウスまたはラットである。

【0119】

遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を生成する方法の実施形態では、本方法は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を生成する工程をさらに含む。実施形態では、本方法はさらに、単離された細胞を胚盤胞にインジェクションし、セーフハーバー部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を生成することを含む。

【0120】

実施形態では、本開示は、本方法により生成された遺伝子改変非ヒトトランスジェニック哺乳動物を提供する。実施形態では、トランスジェニック哺乳動物はげっ歯類である。実施形態では、げっ歯類はラットまたはマウスである。

【0121】

トランスジェニック非ヒト哺乳動物を生成するための方法の実施形態では、本方法は、アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質を発現する細胞を有する非ヒト哺乳動物を取得するために、セーフハーバー部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、Ｃｒｅ組換え酵素を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物と交配させることをさらに含む。

【0122】

本方法の実施形態では、セーフハーバー部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、Ｒｏｓａ２６部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むマウスであり、Ｃｒｅ組換え酵素を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物はマウスである。

【0123】

本方法の実施形態では、セーフハーバー部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、Ｈｉｐｐ１１部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むマウスであり、Ｃｒｅ組換え酵素を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物はマウスである。

【0124】

実施形態では、Ｃｒｅ組換え酵素を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、組織特異的プロモーターの制御下でＣｒｅ組換え酵素を発現する。実施形態では、Ｃｒｅ組換え酵素を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、細胞発生中の特定の時期にのみ活性化されるプロモーターの制御下でＣｒｅ組換え酵素を発現する。

【0125】

実施形態では、トランスジェニック非ヒト哺乳動物はＣｒｅスイッチ系統マウスであり、例えば、ＭｏｕｓｅＧｅｎｏｍｅＩｎｆｏｒｍａｔｉｃｓデータベース: www.informatics.jax.org/home/recombinaseで見つけられるＣｒｅスイッチ系統である。実施形態では、Ｃｒｅスイッチ系統マウスはＢｌｉｍｐ１－Ｃｒｅ^ＥＲＴ２マウス系統である。非限定的な例として、このＢｌｉｍｐ１－Ｃｒｅ^ＥＲＴ２は、Ｂｌｉｍｐ１転写因子を発現する形質芽細胞や形質細胞を標識するために、上述の遺伝子改変非ヒトトランスジェニック哺乳動物との交配に用いることができる。実施形態では、Ｃｒｅスイッチ系統マウスは、Ｊｃｈａｉｎ^{ｃｒｅＥＲＴ２}マウス系統である。実施形態では、Ｊｃｈａｉｎ^{ｃｒｅＥＲＴ２}マウスは、すべての免疫グロブリンアイソタイプを含む形質細胞をより特異的に標識するために、本明細書に記載の遺伝子改変非ヒトトランスジェニック哺乳動物と交配できる。実施形態では、Ｃｒｅスイッチ系統マウスはＸｂｐ１マウス系統である。実施形態では、Ｃｒｅスイッチ系統マウスはＩｒｆ４マウス系統である。

【0126】

実施形態では、トランスジェニックマウスにおけるＣｒｅ発現は組織特異的である。実施形態では、トランスジェニックマウスにおけるＣｒｅ発現は、細胞の発生状態に対し特異的である。

【0127】

実施形態では、セーフハーバー部位に組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を、Ｃｒｅ組換え酵素を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物と交配させて、アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質を発現する細胞を有する非ヒト哺乳動物を取得することを含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を生成する方法は、図１Ｂの模式図によって表されるように行われる。本方法で生成したトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、図１Ｂに示すように機能する。組織特異的プロモーターが活性化していない細胞では、停止配列がコンストラクトに残っているため、導入遺伝子はサイレントである。組織特異的プロモーターが発現すると、発現したＣｒｅが停止配列を切除し、導入遺伝子が発現する。

【0128】

実施形態では、本明細書で提供されるのは、上述の方法によって生成されたアフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質を発現する細胞を有する遺伝子改変非ヒト哺乳動物である。

【0129】

Ｊ．コンディショナルレポーター改変細胞
実施形態では、本明細書で提供されるのは、セーフハーバー部位に組み込まれた本明細書に記載のコンディショナルレポーター核酸コンストラクトを含むゲノムを含む遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞である。前記細胞の実施形態では、セーフハーバー部位は、マウスゲノムの２６番染色体上のＲｏｓａ２６部位を含む。前記細胞の実施形態では、セーフハーバー部位はマウスゲノムの１１番染色体上のＨｉｐｐ１１部位を含む。

【0130】

実施形態では、細胞はハイブリドーマである。実施形態では、細胞は幹細胞である。実施形態では、幹細胞は胚性幹細胞である。実施形態では、幹細胞は成体幹細胞である。実施形態では、幹細胞は人工多能性幹細胞である。実施形態では、幹細胞は周産期幹細胞である。実施形態では、細胞は不死化細胞である。

【0131】

実施形態では、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞は、アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質を発現する。実施形態では、アフィニティタグは非ヒト哺乳動物細胞の細胞表面に発現する。非ヒト哺乳動物細胞の細胞表面に発現可能なアフィニティタグの例を本明細書に記載する。

【0132】

実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩ、ヘキサヒスタジン、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＶＡ、ＧＳＴ、β－ＧＡＬ、ＭＢＰ、またはＶＳＶ－Ｇタグを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約１から約１８個のタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約２から約１５個のタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約３から約１０個のタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、タグの３個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８個のタグのタンデムリピートを含む。

【0133】

実施形態では、アフィニティタグはＳｔｒｅｐＩＩタグを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約１から約１８個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約２から約１５のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約３から約１０のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの３個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８個のタンデムリピートを含む。実施形態では、タンデムリピートは、リピート間にタグリンカーを有する。実施形態では、リンカーは、ジペプチドまたはトリペプチドである。実施形態では、タグリンカーは、ジペプチドＳｅｒ－Ａｌａである。

【0134】

【0135】

実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、非ヒト哺乳動物細胞の細胞質面に露出している。

【0136】

実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、またはオレンジ色蛍光タンパク質を含む。実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、または強化型シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）を含む。実施形態では、蛍光レポータータンパク質は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含む。実施形態では、赤色蛍光タンパク質は、単量体チェリー（ｍＣｈｅｒｒｙ）またはタンデム二量体トマト（ｔｄＴｏｍａｔｏ）である。

【0137】

Ｋ．コンディショナルレポーター改変細胞の単離方法
実施形態では、本明細書で提供されるのは、遺伝子改変非ヒト哺乳動物から取得された細胞を単離する方法であり、その方法は以下を含む：
（ａ）本明細書に記載の遺伝子改変コンディショナルレポーター非ヒト哺乳動物から細胞を取得すること；
（ｂ）アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質の発現について、遺伝子改変非ヒト哺乳動物から取得された細胞をスクリーニングすること；および
（ｃ）融合タンパク質を発現する細胞を単離すること。

【0138】

細胞を単離する方法の実施形態では、細胞は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によりソーティングされる。実施形態では、細胞を単離する方法において、細胞は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によりスクリーニングされる。実施形態では、細胞を単離する方法において、細胞は磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によりソーティングされる。ＦＡＣＳとＭＡＣＳの両方の技術は当該技術分野で公知であり、本明細書の他の箇所に記載されている。実施形態では、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳのいずれかを用いた細胞の分離を図１Ｃに模式的に示す。細胞を単離する方法の実施形態では、本明細書に記載されるように、細胞の表面に発現させたアフィニティタグを用いて細胞を分離する。アフィニティタグを用いて細胞を分離する実施形態では、当該技術分野で公知の方法を用いて、アフィニティタグを結合するアフィニティカラムまたはアフィニティ樹脂を用いて細胞を分離する。

【0139】

実施形態では、アフィニティタグは遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞の細胞表面に発現する。

【0140】

【0141】

実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約１から約１８個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約２から約１５個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約３から約１０個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの３個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８個のタンデムリピートを含む。実施形態では、タンデムリピートは、リピート間にタグリンカーを有する。実施形態では、リンカーは、ジペプチドまたはトリペプチドである。実施形態では、タグリンカーは、ジペプチドＳｅｒ－Ａｌａである。

【0142】

【0143】

実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、非ヒト哺乳動物細胞の細胞質面に露出する。

【0144】

【0145】

Ｌ．免疫グロブリンレポーター核酸コンストラクト
実施形態では、本明細書で提供されるのは、リンカー、リーダー配列、並びにアフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポーターをコードする膜貫通レポーターカセットを含む核酸コンストラクトである。この核酸コンストラクトの実施形態を、本明細書では「免疫グロブリンレポーター核酸コンストラクト」と呼ぶことがある。

【0146】

【0147】

実施形態では、核酸コンストラクトは、非ヒト哺乳動物のゲノム中の第１の標的配列および第２の標的配列に相同である第１のホモロジーアーム、および第２のホモロジーアームをさらに含む。相同領域は、本明細書に記載され当該技術分野で公知の方法を用いて、核酸コンストラクトを非ヒト哺乳動物のゲノムに組み込むことを可能にする。実施形態では、核酸コンストラクトは、非ヒト哺乳動物における免疫グロブリン部位、例えば免疫グロブリン可変領域部位または免疫グロブリン定常領域部位、またはその中間の部位内の第１の標的配列および第２の標的配列にそれぞれ相同である第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームをさらに含む。実施形態では、核酸コンストラクトは、非ヒト哺乳動物における免疫グロブリン定常領域部位内の第１の標的配列および第２の標的配列にそれぞれ相同である第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームをさらに含む。

【0148】

実施形態では、第１の標的配列および第２の標的配列にそれぞれ相同である第１のホモロジーアームおよび第２のホモロジーアームであって、第１の標的配列および第２の標的配列は免疫グロブリン定常領域部位に隣接する。実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は免疫グロブリン軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位はカッパ軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位はラムダ軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は免疫グロブリン重鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域部位は、ガンマ、デルタ、アルファ、ミュー、またはイプシロン免疫グロブリン定常領域部位である。

【0149】

実施形態では、第１の標的配列は免疫グロブリン定常領域部位の上流に存在し、第２の標的配列は免疫グロブリン定常領域部位の終止コドンの下流に存在する。実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は免疫グロブリン軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位は免疫グロブリンカッパ定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位は免疫グロブリンラムダ定常領域部位である。

【0150】

実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は免疫グロブリン重鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域部位は、ガンマ、デルタ、アルファ、ミュー、またはイプシロン免疫グロブリン定常領域部位である。

【0151】

【0152】

いくつかの実施形態では、リンカーは、終止コドンと内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。実施形態では、リンカーは、プロテアーゼ認識部位および自己切断ペプチドを含む。実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカー、プロテアーゼ認識部位、および自己切断ペプチドを有するリーキー終止コドン（ＬＳＣ）を含む。

【0153】

プロテアーゼ認識部位の実施形態を本明細書に記載する。実施形態では、プロテアーゼ認識部位は、フーリンプロテアーゼ認識部位を含む。実施形態では、フーリンプロテアーゼ認識部位は、Ａｒｇ－Ｘ－Ａｒｇ－Ａｒｇのペプチドをコードする核酸配列を含む。実施形態では、Ｘは疎水性アミノ酸である。実施形態では、Ｘは親水性アミノ酸である。実施形態では、Ｘはリシンである。実施形態では、正統的には、フーリンプロテアーゼ認識部位は、ペプチドＸ－Ａｒｇ－Ｘ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－ＸまたはＸ－Ａｒｇ－Ｘ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ｘをコードする核酸配列を含む。実施形態では、Ｘは疎水性アミノ酸である。実施形態では、疎水性アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒを含む。実施形態では、Ｘは親水性アミノ酸である。実施形態では、親水性アミノ酸はリシンである。実施形態では、フーリンプロテアーゼ認識部位は、ペプチドＡｒｇ－Ｌｙｓ－Ａｒｇ－Ａｒｇをコードする核酸配列を含む。実施形態では、フーリンプロテアーゼ認識部位は、ペプチドＡｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇ－Ａｒｇをコードする核酸配列を含む。実施形態では、フーリンプロテアーゼ認識部位は、ペプチドＡｒｇ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－Ａｒｇをコードする核酸配列を含む。実施形態では、フーリンプロテアーゼ認識部位は、ペプチドＡｒｇ－Ｌｙｓ－Ｌｙｓ－Ａｒｇをコードする核酸配列を含む。実施形態では、フーリンプロテアーゼ部位の直前のＬｙｓ残基が欠失している。実施形態では、フーリンプロテアーゼ認識部位は、Fangら、Molecular Therapy 15(6):1153-1159(2007)に記載されているようなフーリンプロテアーゼ認識部位であり、これは参照により本明細書に援用される。

【0154】

実施形態では、プロテアーゼはエンドプロテアーゼである。実施形態では、プロテアーゼは哺乳動物のエンドプロテアーゼである。実施形態では、プロテアーゼは核酸コンストラクトを含む細胞で内因的に発現するエンドプロテアーゼである。実施形態では、プロテアーゼ認識部位は、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、サーモリシン、ペプシン、グルタミルエンドペプチダーゼ、またはネプリライシン認識部位を含む。

【0155】

自己切断ペプチドの実施形態が本明細書に記載されている。実施形態では、自己切断ペプチドは２Ａ自己切断ペプチドを含む。実施形態では、自己切断ペプチドは、Ｔ２Ａ（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号：４）、Ｐ２Ａ（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ；配列番号：５）、Ｅ２Ａ（ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号：６）、またはＦ２Ａ（ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号：７）自己切断ペプチドを含む。

【0156】

リーキー終止コドンの実施形態が本明細書に記載されている。実施形態では、リーキー終止コドンをコードする配列はＴＧＡＣＴＡＧを含む。実施形態では、リーキー終止コドンをコードする配列はＴＧＡＣＧＧを含む。実施形態では、リーキー終止コドンをコードする配列はＴＡＧＣＡＡＴＴＡを含む。実施形態では、リーキー終止コドンをコードする配列はＴＡＧＣＡＡＴＣＡを含む。実施形態では、リーキー終止コドンをコードする配列はＴＧＡＣＴＡを含む。

【0157】

リンカーがリーキー終止コドンを含む実施形態では、リーキー終止コドンは、コドンのある程度のリードスルーを可能にし、膜貫通レポーターカセットを発現させる。実施形態では、リーキーコドンのリードスルー転写は約５％の割合で発生する。実施形態では、リーキーコドンのリードスルー転写は約１％から約１０％の割合で発生する。実施形態では、リードスルー転写が発生しない場合、免疫グロブリンは内在性のフォーマットで発現され、膜貫通レポーターカセットは発現されない。

【0158】

実施形態では、リンカーはペプチドリンカーであり、例えば長さ２から２４残基のアミノ酸鎖である。実施形態では、ペプチドリンカーはジペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーはトリペプチドリンカーである。実施形態では、リンカーは４アミノ酸の長さである。実施形態では、リンカーはＬｅｕ－Ｇｌｙを含む。実施形態では、リンカーはＧｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙを含む。実施形態では、リンカーはＬｅｕ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙを含む。実施形態では、リンカーは約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０個のアミノ酸残基を含む。実施形態では、ペプチドリンカーは４から２４アミノ酸残基を含む。実施形態では、ペプチドリンカーは５から２０アミノ酸残基を含む。実施形態では、ペプチドリンカーは７から１５のアミノ酸残基を含む。

【0159】

実施形態では、リーダー配列は分泌シグナルペプチドをさらに含む。実施形態では、分泌シグナルペプチドはＩＬ－２リーダー配列である。実施形態では、分泌シグナルペプチドは、ヒトＯＳＭ、ＶＳＶ－ＧマウスＩｇカッパ、ヒトＩｇＧ２Ｈ、ＢＭ４０、セクレコン（Ｓｅｃｒｅｃｏｎ）、ヒトＩｇＫＶＩＩＩ、ＣＤ３３、ｔＰＡ、ヒトキモトリプシノーゲン、ヒトトリプシノーゲン－２、ヒトＩＬ－２、またはヒト血清アルブミンシグナルペプチドである。実施形態では、分泌シグナルペプチドは、ＩＬ－２リーダー配列ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号２）を含む。当業者であれば、シグナルペプチドは当該技術分野で公知のアルゴリズム、例えばＳｉｇｎａｌＰ－５．０（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）およびＳｅｃｒｅｔｏｍｅＰ２．０（www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/）を用いて予測できることを理解するであろう。

【0160】

核酸コンストラクトのアフィニティタグは、コンストラクトによって発現されたタンパク質を後で単離または精製するために使用できる。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩ、ヘキサヒスタジン、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＶＡ、ＧＳＴ、β－ＧＡＬ、ＭＢＰ、またはＶＳＶ－Ｇタグを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約１から約１８個のタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約２から約１５個のタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約３から約１０個のタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、タグの３個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８個のタグのタンデムリピートを含む。

【0161】

実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約１から約１８個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約２から約１５個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約３から約１０個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの３個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８個のタンデムリピートを含む。実施形態では、タンデムリピートはリピート間にタグリンカーを有する。実施形態では、タグリンカーはジペプチドまたはトリペプチドである。実施形態では、タグリンカーはジペプチドＳｅｒ－Ａｌａである。実施形態では、タグリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号８）を含む。実施形態では、タグリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２リンカー（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号８）である。

【0162】

【0163】

膜貫通レポーターカセットによってコードされる膜貫通ドメインは、核酸コンストラクトを発現する細胞の表面にアフィニティタグを提示することを可能にする。実施形態では、膜貫通ドメインは疎水性αヘリックスを含む。実施形態では、膜貫通ドメインはＩｇＧ膜貫通ドメインである。実施形態では、膜貫通ドメインはヒトＩｇＧ１膜貫通ドメインである。実施形態では、膜貫通ドメインはマウスＩｇＧ膜貫通ドメインを含む。実施形態では、膜貫通ドメインは、マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、またはＩｇＧ２ｃ膜貫通ドメインを含む。実施形態では、膜貫通ドメインはマウスタンパク質Ｔｍｅｍ５３、Ｌｒｔｍ１、またはＮｒｇ１の膜貫通ドメインである。

【0164】

【0165】

実施形態では、核酸コンストラクトは、軽鎖カッパ定常領域に組み込まれた特定の実施形態について図２に模式的に示される核酸コンストラクトであり、ここで、黒い長方形はその領域のＶおよびＪセグメントを、ＬＫはリンカー配列を、Ｌはリーダー配列を、ＳＴＸ３はＳｔｒｅｐ－ＩＩタグの３個のタンデムリピートを、ＴＭは膜貫通ドメインを、ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質レポーターを表す。他の実施形態（図で示していない）では、核酸コンストラクトは軽鎖ラムダ定常領域または重鎖定常領域に組み込まれる。

【0166】

Ｍ．免疫グロブリンレポーター改変細胞および生物の生成方法
実施形態では、本明細書で提供されるのは、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を生成する方法であり、その方法は以下を含む：
（ａ）本明細書に記載の免疫グロブリンレポーター核酸コンストラクトを非ヒト哺乳動物細胞に導入すること；および
（ｂ）非ヒト哺乳動物細胞にヌクレアーゼを導入し、前記ヌクレアーゼが前記非ヒト哺乳動物細胞のゲノム中の免疫グロブリン定常領域部位において一本鎖切断または二本鎖切断を引き起こし、前記核酸コンストラクトが相同組換えにより前記非ヒト哺乳動物細胞のゲノム中の免疫グロブリン定常領域部位に組み込まれること。

【0167】

実施形態では、ヌクレアーゼは二本鎖切断を引き起こす。実施形態では、ヌクレアーゼは一本鎖切断（例えば、ニック）を引き起こす。

【0168】

ヌクレアーゼは、当該技術分野で公知の方法を用いて細胞内に導入できる。実施形態では、ヌクレアーゼを導入することは、ヌクレアーゼをコードする発現コンストラクトを導入することを含む。実施形態では、発現コンストラクトの導入はインジェクションまたはエレクトロポレーションによって行われる。実施形態では、ヌクレアーゼを導入することは、ヌクレアーゼをコードするプラスミドを導入することを含む。実施形態では、ヌクレアーゼを導入することは、ヌクレアーゼをコードするウイルスベクターを導入することを含む。実施形態では、ヌクレアーゼを導入することは、ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを導入することを含む。実施形態では、ｍＲＮＡは１つ以上の修飾塩基を含む。実施形態では、ｍＲＮＡは脂質ナノ粒子に被包されている。実施形態では、プラスミド、ウイルスベクターまたはｍＲＮＡの導入は、インジェクションまたはエレクトロポレーションを介して行われる。実施形態では、ヌクレアーゼを導入することはヌクレアーゼタンパク質を細胞に直接導入することを含む。実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質の細胞への直接導入は、インジェクションまたはエレクトロポレーションを介して行われる。

【0169】

実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位は、免疫グロブリンカッパ定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位は、免疫グロブリンラムダ定常領域部位である。ある態様では、免疫グロブリン定常領域部位は、免疫グロブリン重鎖定常領域部位である。

【0170】

実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は、免疫グロブリン重鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域部位は、ガンマ、デルタ、アルファ、ミュー、またはイプシロン免疫グロブリン定常領域部位である。

【0171】

実施形態では、ヌクレアーゼは本明細書に記載のヌクレアーゼである。実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、またはクラスター化され規則的間隔で配置された短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質およびガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。実施形態では、ｇＲＮＡは、認識部位を標的にするＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とを含む。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９を含む。実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、またはＣａｓΦを含む。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１１、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１４、またはＣａｓΦを含む。

【0172】

【0173】

【0174】

【0175】

実施形態では、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を生成する方法は、核酸コンストラクトが免疫グロブリン定常領域部位で組み込まれた遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を単離することをさらに含む。

【0176】

実施形態では、上記の遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞の生成方法により生成された遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞も本明細書で提供される。実施形態では、非ヒト哺乳動物はげっ歯類である。

【0177】

遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞を生成する方法の実施形態では、本方法は、トランスジェニック非ヒト哺乳動物を生成する工程をさらに含む。実施形態では、本方法はさらに、遺伝子編集材料を接合子にまたは改変された単離細胞を胚盤胞にインジェクションして、免疫グロブリン定常領域部位で組み込まれた核酸コンストラクトを含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を生成することを含む。

【0178】

【0179】

Ｎ．免疫グロブリンレポーター改変細胞
実施形態では、本明細書で提供されるのは、免疫グロブリン定常領域部位に組み込まれた、本明細書に記載の免疫グロブリンレポーター核酸コンストラクトを含むゲノムを含む遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞である。

【0180】

前記細胞の実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位は、免疫グロブリンカッパ定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域部位は、免疫グロブリンラムダ定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は、免疫グロブリン重鎖定常領域部位である。

【0181】

前記細胞の実施形態では、免疫グロブリン定常領域部位は、免疫グロブリン重鎖定常領域部位である。実施形態では、免疫グロブリン重鎖定常領域部位は、ガンマ、デルタ、アルファ、ミュー、またはイプシロン免疫グロブリン定常領域部位である。

【0182】

実施形態では、免疫グロブリン発現細胞は免疫化哺乳動物から取得される。実施形態では、免疫化哺乳動物はげっ歯類である。実施形態では、免疫化哺乳動物はマウスまたはラットである。

【0183】

実施形態では、前記細胞は免疫グロブリン発現細胞である。実施形態では、免疫グロブリン発現細胞は未熟Ｂ細胞または未熟Ｂ細胞の子孫である。実施形態では、前記細胞はハイブリドーマ、幹細胞、または不死化細胞である。実施形態では、幹細胞は胚性幹細胞である。実施形態では、幹細胞は成体幹細胞である。実施形態では、幹細胞は人工多能性幹細胞である。実施形態では、幹細胞は周産期幹細胞（perinatal stem cell）である。

【0184】

実施形態では、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞は、免疫グロブリンカッパ軽鎖を発現する。実施形態では、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞は、免疫グロブリンラムダ軽鎖を発現する。実施形態では、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞は、免疫グロブリン重鎖を発現する。

【0185】

実施形態では、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞は、アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質を発現する。実施形態では、アフィニティタグは、非ヒト哺乳動物細胞の細胞表面に発現する。非ヒト哺乳動物細胞の細胞表面に発現可能なアフィニティタグの例を本明細書に記載する。

【0186】

実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩ、ヘキサヒスタジン、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＶＡ、ＧＳＴ、β－ＧＡＬ、ＭＢＰ、またはＶＳＶ－Ｇタグを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約１から約１８個のタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約２から約１５個のタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約３から約１０個のタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグはタグの３個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８個のタグのタンデムリピートを含む。

【0187】

実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約１から約１８個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約２から約１５個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約３から約１０個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの３個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８個のタンデムリピートを含む。実施形態では、タンデムリピートはリピート間にタグリンカーを有する。実施形態では、タグリンカーはジペプチドまたはトリペプチドである。実施形態では、タグリンカーはジペプチドＳｅｒ－Ａｌａである。

【0188】

【0189】

実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、非ヒト哺乳動物細胞の細胞質面に露出する。

【0190】

【0191】

前記細胞の実施形態では、融合タンパク質の発現は内因性の免疫グロブリン転写制御因子により駆動される。実施形態では、内因性免疫グロブリン転写調節因子は内因性免疫グロブリン軽鎖転写調節因子である。実施形態では、内因性免疫グロブリン軽鎖転写調節因子は、プロモーターおよびマウス軽鎖部位内の他のシスエレメントを含む。実施形態では、内因性免疫グロブリン転写調節因子は、内因性免疫グロブリン重鎖転写調節因子である。実施形態では、内因性免疫グロブリン重鎖転写調節因子は、プロモーターおよびマウス重鎖部位における他のシスエレメントを含む。

【0192】

Ｏ．免疫グロブリンレポーター改変細胞の識別方法
実施形態では、本明細書で提供されるのは、遺伝子改変免疫グロブリンレポーター非ヒト哺乳動物から取得された免疫グロブリン発現細胞を識別する方法であり、その方法は以下を含む：
（ａ）本明細書に記載の遺伝子改変免疫グロブリンレポーター非ヒト哺乳動物から細胞を取得すること；
（ｂ）アフィニティタグ、膜貫通ドメイン、および蛍光レポータータンパク質を含む融合タンパク質の発現について、遺伝子改変非ヒト哺乳動物から取得された細胞をスクリーニングすること；および
（ｃ）融合タンパク質の発現に基づいて免疫グロブリン発現細胞を識別すること。

【0193】

実施形態では、細胞を単離する方法において、細胞は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によりソーティングされる。実施形態では、細胞を単離する方法において、細胞は蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によりスクリーニングされる。実施形態では、細胞を単離する方法において、細胞は磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）によりソーティングされる。ＦＡＣＳとＭＡＣＳの両方の技術は当該技術分野で知られており、本明細書の他の箇所に記載されている。実施形態では、免疫グロブリンレポーターを改変したげっ歯類から細胞を取得し、細胞をプールし、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳのいずれかを用いて細胞を分離するプロセスの一例を図３に模式的に示す。細胞を単離する方法の実施形態では、本明細書に記載されるように、細胞の表面に発現させたアフィニティタグを用いて細胞を分離する。アフィニティタグを用いて細胞を分離する実施形態では、当該技術分野で公知の方法を用いて、アフィニティタグを結合するアフィニティカラムまたはアフィニティ樹脂を用いて細胞を分離する。

【0194】

実施形態では、アフィニティタグは、遺伝子改変非ヒト哺乳動物細胞の細胞表面に発現する。

【0195】

実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩ、ヘキサヒスタジン、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｍｙｃ、ＶＡ、ＧＳＴ、β－ＧＡＬ、ＭＢＰ、またはＶＳＶ－Ｇタグを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約１から約１８個のタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約２から約１５個のタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約３から約１０個のタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、タグの３個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７または約１８個のタグのタンデムリピートを含む。

【0196】

実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグのタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約１から約１８個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約２から約１５個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約３から約１０個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグはＳｔｒｅｐＩＩタグの３個のタンデムリピートを含む。実施形態では、アフィニティタグは、ＳｔｒｅｐＩＩタグの約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、または約１８個のタンデムリピートを含む。実施形態では、タンデムリピートはリピート間にタグリンカーを有する。実施形態では、タグリンカーはジペプチドまたはトリペプチドである。実施形態では、タグリンカーはジペプチドＳｅｒ－Ａｌａである。

【0197】

【0198】

実施形態では、蛍光レポータータンパク質は、非ヒト哺乳動物細胞の細胞質面に露出する。

【0199】

【0200】

本方法の実施形態では、遺伝子改変非ヒト哺乳動物は、目的の抗原で免疫されている。実施形態では、免疫グロブリン発現細胞は、免疫グロブリンカッパ軽鎖を発現する。実施形態では、免疫グロブリン発現細胞は、免疫グロブリンラムダ軽鎖を発現する。実施形態では、免疫グロブリン発現細胞は、免疫グロブリン重鎖を発現する。実施形態では、免疫グロブリン発現細胞は未熟Ｂ細胞とその子孫を含む。

【0201】

実施形態では、本方法は、遺伝子改変非ヒト哺乳動物から取得された細胞から発現された免疫グロブリンを単離することをさらに含む。実施形態では、本明細書で提供されるのは、本方法によって取得された免疫グロブリンである。

【0202】

実施形態では、本明細書で提供されるのは、治療用または診断用免疫グロブリンを生産する方法であり、その方法は以下を含む：
（ｉ）本明細書に開示される免疫グロブリンの可変領域をクローニングすること；および
（ｉｉ）（ｉ）で取得した可変領域を含む治療用または診断用免疫グロブリンを生成すること。

【0203】

実施形態では、モノクローナル抗体を生産する方法も本明細書に提供され、本方法は以下のことを含む：
（ｉ）本明細書で開示する遺伝子改変非ヒト哺乳動物から免疫グロブリン発現細胞を取得すること；
（ｉｉ）（ｉ）で取得した免疫グロブリン発現細胞を不死化すること；および
（ｉｉｉ）不死化した免疫グロブリン発現細胞またはモノクローナル抗体をコードする核酸配列により発現されるモノクローナル抗体を単離すること。
実施形態では、本方法はさらに以下のことを含む：
（ｉｖ）単離されたモノクローナル抗体の可変領域をクローニングすること；および
（ｖ）クローニングされた可変領域を含む治療用抗体または診断用抗体を作製すること。

【0204】

実施形態では、本明細書で提供されるのは、上記の方法により生産される治療用または診断用抗体である。

【0205】

Ｐ．参照による援用
特許、特許出願、論文、教科書などを含む本明細書で引用したすべての文献、およびその中で引用した文献は、未掲載である限り、その全体が参照により本明細書に援用される。

【実施例】

【0206】

実施例１．免疫グロブリン標識カセットおよびターゲティングベクターの構築
工程１：膜貫通標識カセットは、構成配列をライゲーションして連続したカセットを形成することにより組み立てられる。この実施例では、標識カセットは、図２に模式的に示すように、リンカー、リーダー配列、タグリンカー付きＳｔｒｅｐ－ＩＩタグの３個のリピート（ＷＳＨＰＱＦＥＫＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫＳＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号３））、膜貫通ドメイン、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列を含む。

【0207】

３つの異なるリンカーオプションがある。
オプション１：ＬＳＬ－フーリン－２Ａ。このリンカーは、リーキー終止コドン、Ｌｅｕ－Ｇｌｙリンカー配列、フーリンプロテアーゼ認識および切断部位、および２Ａ自己切断ペプチドを含む。この設計の利点は、内在性フォーマット内のＩｇＫの大部分を維持できることである。リーキー終止コドンは転写の５％しかリードスルーさせないので、ＳｔｒｅｐＩＩタグ－ＧＦＰの発現レベルはＩｇＫ全体の５％しかない。したがって、このデザインでは、ＳｔｒｅｐＩＩタグ－ＧＦＰの発現レベルが低すぎて、場合によってはＦＡＣＳ／ＭＡＣＳを使ってそのような細胞を効率的に濃縮できない可能性がある。
オプション２：フーリン－２Ａ。このリンカーはフーリンプロテアーゼ認識および切断部位、および２Ａ自己切断ペプチドを含む。このリンカーの利点は、ＳｔｒｅｐＩＩタグ－ＧＦＰの高発現を確実にすることであるが、このレベルの発現は、場合によっては細胞に毒性を示す可能性がある。
オプション３：終止コドン－ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）。このリンカーは、終止コドンに続くＩＲＥＳを含み、これによりレポーター遺伝子は免疫グロブリンとは別のタンパク質として転写される。ＩＲＥＳは、上記２つの戦略の中間のＳｔｒｅｐＩＩタグ－ＧＦＰ発現レベルを提供する。

【0208】

工程２：工程１からのコンストラクトを、げっ歯類Ｉｇカッパ（ＩｇＫ）ゲノム領域の終止コドンを標的にする相同な隣接領域を持つターゲティングベクターにライゲーションする。ノックインに使用できるベクターには、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ＋がある。このベクターは、図２に模式的に示すように、ＩｇＫの終止コドンにＳｔｒｅｐＩＩタグ－ＧＦＰ標識カセットをノックインする。

【0209】

あるいは、標識カセットの両側に２００－５００ｂｐの相同性を規定する領域を持つ合成一本鎖ＤＮＡを合成し、合成ターゲティングカセットを形成することもできる。この合成ターゲティングカセットコンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲターゲティングシステムを使って直接組み込むことができる。

【0210】

実施例２．ＳｔｒｅｐＩＩタグとＧＦＰ発現量のインビトロ評価
下流のアプリケーションに適合するＳｔｒｅｐＩＩタグ－ＧＦＰの発現レベルを確保するために、げっ歯類のＢ細胞株を用いてターゲティングベクターによるインビトロ実験を行い、ＩｇＫの発現レベルとともにＳｔｒｅｐＩＩタグとＧＦＰの発現レベルを評価する。ＩｇＫ発現レベルが最も高く、下流への応用に適切なＳｔｒｅｐＩＩタグとＧＦＰレベルを与えるベクターを、さらなる研究のために選択する。分泌された抗体を、オクテットなどの生化学的測定によって定量する。細胞表面に表示された抗体は、フロー分析によって検出される。簡単に説明すると、細胞を蛍光標識抗免疫グロブリン抗体とともに４℃で３０分間インキュベートし、その蛍光シグナルをフローサイトメーターで測定する。ＩｇＫ部位における標識カセットの発現がＩｇＫの機能を妨げないことを確実にするために、理想的なリンカー配列を同定するために、げっ歯類のＢ細胞株を用いたインビトロ試験を行う。

【0211】

実施例３．ＩｇＫレポーターげっ歯類系統の生成
マウス胚性幹細胞をターゲティングベクターで形質転換し、相同組換えによってＩｇＫ終止コドンに標識カセットを挿入できるようにする。このＩｇＫ終止コドンでのターゲティングノックインの効率を高めるために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムが使用される。ゲノム中のＩｇＫ終止コドン周辺の隣接領域を標的にするｓｇＲＮＡ成分を設計および合成し、次いでＣａｓ９酵素と会合することによりＲＮＰ複合体を形成し、相同組換え修復（ＨＤＲ）テンプレートと一緒に一本鎖ＤＮＡまたはベクターとして受精卵または胚性幹細胞にインジェクションする。相同組換えによって、標識カセットを含むドナー断片を、Ｃａｓ９によって引き起こされる標的二本鎖切断の後にその部位に組み込む。組換えに成功した胚性幹細胞（サザンブロット分析とＰＣＲによって決定される）を胚盤胞にマイクロインジェクションし、トランスジェニックマウスを生成する。

【0212】

トランスジェニックマウスからｍＡｂ発現細胞を取得して、標識効率を評価する。簡単に説明すると、抗体発現細胞は、ＦＡＣＳによる従来のフローマーカーを用いて単離する。細胞を蛍光標識抗免疫グロブリン抗体とともに４℃で３０分間インキュベートする。蛍光シグナルはフローサイトメーターを用いて測定する。

【0213】

実施例４．コンディショナルレポーター標識カセットとターゲッティングベクターの構築
工程１：膜貫通標識カセット導入遺伝子は、構成配列をライゲーションして連続カセットを形成することにより組み立てられる。図１Ａに模式的に示すように、標識カセットには、ＣＡＧプロモーター、リーダー配列、ＬｏｘＰ－Ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰカセット、ＳｔｒｅｐＩＩタグの３個のタンデムリピート、膜貫通ドメイン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が含まれる。

【0214】

工程２：工程１からのコンストラクトを、ＲＯＳＡ２６ゲノム領域のイントロン１を標的にする相同隣接領域を持つターゲティングベクターにライゲーションする。スプライスアクセプター（ＳＡ）配列とＤＮＡカセットが、ＲＯＳＡ２６遺伝子の第１イントロン内のＸｂａ１制限酵素部位に挿入される。このベクターは、図１Ａに模式的に示すように、セーフハーバーＲＯＳＡ２６部位にＳｔｒｅｐＩＩタグ－ＧＦＰ標識カセットをノックインする。

【0215】

あるいは、標識カセットの両側に２００－５００ｂｐの相同性を規定する領域を持つ合成一本鎖ＤＮＡを合成し、合成ターゲティングカセットを形成することもできる。この合成ターゲティングカセットコンストラクトは、ＣＲＩＳＰＲターゲティングシステムを用いてＲＯＳＡ２６のイントロン１に直接組み込むことができる。

【0216】

実施例５．コンディショナルレポーターげっ歯類系統の生成
マウス胚性幹細胞をトランスジーンターゲティングベクターで形質転換し、相同組換えによってＲＯＳＡ２６のイントロン１に標識カセットを挿入できるようにする。別の方法として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムはＲＯＳＡ２６のイントロン１に標的を定めたノックインである。ゲノム中のＲＯＳＡ２６のイントロン１を標的にするｓｇＲＮＡを設計および合成し、次いでＣａｓ９酵素で組み立てＲＮＰ複合体を形成し、受精卵または胚性幹細胞に一本鎖ＤＮＡまたはベクターとして相同組換え修復（ＨＤＲ）テンプレートと共インジェクションまたはエレクトロポレーションする。相同組換えによって、標識カセットを含むドナー断片は、Ｃａｓ９によって引き起こされる標的二本鎖切断の後にその部位に組み込まれる。組換えに成功した胚性幹細胞（サザンブロット分析とＰＣＲによって決定される）を胚盤胞にマイクロインジェクションし、トランスジェニックマウスを生成する。

【0217】

組み込まれた導入遺伝子を含むマウスを、Ｃｒｅスイッチ系統マウス（目的の組織特異的プロモーターの制御下にＣｒｅを持つマウス系統）と交配する。ある実験では、Ｃｒｅスイッチ系統マウスはＢｌｉｍｐ１－Ｃｒｅ^ＥＲＴ２マウス系統であり、形質芽細胞および形質細胞で発現するＢｌｉｍｐ１プロモーターの制御下でＣｒｅを発現する。別の実施形態では、スイッチ系統マウスはＪｃｈａｉｎ^{ｃｒｅＥＲＴ２}マウスである。

【0218】

実施例６．接合子からのレポーターげっ歯類系統の生成
実施例１または３に記載のベクターをマウスの接合子に直接インジェクションする。このベクターは、接合子（マウスの受精卵）の前核にマイクロインジェクションされる。得られた胚を偽妊娠雌の卵管に移植し、発育させることができる。胚はマウスの卵管に排出され、傷口は傷口クリップで閉じる。マウスを１８から２１日目に、生きた子の出産について試験する。新たに生まれたマウスは、上記の方法を用いて膜貫通標識コンストラクトの発現を解析する。

【0219】

配列