特表 2024-534714 スペクトルイメージングのための方法及びシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-24

(54)【発明の名称】スペクトルイメージングのための方法及びシステム

(51)【国際特許分類】

   G01N 21/64 20060101AFI20240913BHJP

   G01J 3/36 20060101ALI20240913BHJP

   G01J 3/45 20060101ALI20240913BHJP

   G02B 21/06 20060101ALI20240913BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240913BHJP

【ＦＩ】

G01N21/64 Z

G01J3/36

G01J3/45

G02B21/06

G01N33/53 Y

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024508624

(86)(22)【出願日】2022-08-09

(85)【翻訳文提出日】2024-04-08

(86)【国際出願番号】 IL2022050872

(87)【国際公開番号】W WO2023017520

(87)【国際公開日】2023-02-16

(31)【優先権主張番号】63/260,071

(32)【優先日】2021-08-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524053823

【氏名又は名称】ペンタオミックス リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＰＥＮＴＡＯＭＩＸ ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】５２ Ｃａｒｍｅｌ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｒｅｈｏｖｏｔ， Ｉｓｒａｅｌ

(74)【代理人】

【識別番号】110002952

【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ブリル ボアズ

【テーマコード（参考）】

2G020

2G043

2H052

【Ｆターム（参考）】

2G020CB43

2G020CB54

2G020CC21

2G020CC22

2G020CC63

2G020CD03

2G020CD16

2G020CD24

2G020CD35

2G043EA01

2G043EA06

2G043HA01

2G043HA09

2G043HA15

2G043JA01

2G043LA03

2G043NA05

2H052AA04

2H052AA09

2H052AC14

2H052AF14

2H052AF25

(57)【要約】

サンプルをイメージングする方法は、それぞれが異なる中心波長を有する複数の光ビームによってサンプルを連続的に照射することを含む。本方法はまた、イメージャによってサンプルから画像データを連続的に取得することであって、画像データは、複数の光ビームに応答してサンプルから受け取った光信号を表す、取得することを含む。本方法はまた、イメージャに対してサンプルの視野をシフトさせることと、シフトさせた視野に対して連続照射及び画像データ取得を繰り返すことと、複数の光ビームのそれぞれに対して、複数の視野においてイメージャによって取得された画像データを用いて、サンプルのスペクトル画像を生成することとを含む。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

サンプルをイメージングする方法であって、
それぞれが異なる中心波長を持つ複数の光ビームでサンプルを連続的に照射することと、
イメージャによって、前記複数の光ビームに応答して、前記サンプルから受け取った光信号を表す画像データを、前記サンプルから連続的に取得することと、
前記イメージャに対して前記サンプルの視野をシフトさせ、前記シフトされた視野に対して、連続的な前記照射と、前記画像データの取得とを繰り返すことと、
前記複数の光ビームのそれぞれに対して、複数の視野で、前記イメージャによって取得された画像データを使用して、前記サンプルのスペクトル画像を生成することと、
を含む、前記方法。

【請求項2】

前記画像データを連続的に取得することは、前記視野が静止している間に行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記画像データを連続的に取得することは、前記視野が変化している間に行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記サンプルは、それぞれが異なる発光スペクトルを有する複数の蛍光体を含有し、前記光ビームの少なくとも１つのスペクトル帯域幅が、少なくとも２つの異なる蛍光体を励起するように選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記サンプルは、それぞれが異なる発光スペクトルを有する複数の蛍光体を含有し、前記光ビームの少なくとも１つのスペクトル帯域幅が、少なくとも２つの異なる蛍光体を励起するように選択される、請求項２～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記照射することはピンホールを介して行われ、前記取得することは、前記光ビームの前記画像データへの寄与を低減させるように構成されたビームストップを介して行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記照射することはピンホールを介して行われ、前記取得することは、前記光ビームの前記画像データへの寄与を低減させるように構成されたビームストップを介して行われる、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記照射することは、前記光ビームを反射して前記光信号を透過させるか、またはその逆を行うように、構成され、配置されたビームスプリッタを介して行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記照射することは、前記光ビームを反射して前記光信号を透過させるか、またはその逆を行うように、構成され、配置されたビームスプリッタを介して行われる、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記光信号をコリメートすることであって、前記照射することは、前記コリメートを規定する光軸に対して周辺に配置された複数の光源によって行われる、前記コリメートすることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記光信号をコリメートすることであって、前記照射することは、前記コリメートを規定する光軸に対して周辺に配置された複数の光源によって行われる、前記コリメートすることを含む、請求項２～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記光信号の一部を、各光信号の局所スペクトルを測定するために、分光計に向けることと、前記測定されたスペクトルを前記スペクトル画像の局所スペクトルと比較することと、前記比較に関するレポートを生成することとを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記光信号の一部を、各光信号の局所スペクトルを測定するために、分光計に向けることと、前記測定されたスペクトルを前記スペクトル画像の局所スペクトルと比較することと、前記比較に関するレポートを生成することとを含む、請求項２～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

非スペクトル画像も生成するために、前記光信号の一部を追加のイメージャに向けることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

非スペクトル画像も生成するために、前記光信号の一部を追加のイメージャに向けることを含む、請求項２～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記サンプル上にイメージング可能なパターンを投影することと、前記追加のイメージャによって前記パターンをイメージングすることと、前記パターンの前記画像に基づいて、デフォーカスパラメータを計算することとを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記サンプル上にイメージング可能なパターンを投影することと、前記追加のイメージャによって前記パターンをイメージングすることと、前記パターンの前記画像に基づいて、デフォーカスパラメータを計算することとを含む、請求項１５に記載の方法。

【請求項18】

前記投影することは、前記イメージング可能なパターンの異なる部分が、前記画像データが取得される対物レンズから異なる距離で、前記サンプル上に焦点を合わせられるように行われる、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記投影することは、前記イメージング可能なパターンの異なる部分が、前記画像データが取得される対物レンズから異なる距離で、前記サンプル上に焦点を合わせられるように行われる、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

前記投影することは、前記光信号を包含する波長範囲の外側の波長で行われる、請求項１６に記載の方法。

【請求項21】

前記投影することは、前記光信号を包含する波長範囲の外側の波長で行われる、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記光信号を、光透過特性を変化させる性質を有する光学システムに通過させることを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項23】

前記光信号を、光透過特性を変化させる性質を有する光学システムに通過させることを含む、請求項２～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記光学システムが、光透過特性を時間的に変化させる性質を有する、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

前記光学システムが、光透過特性を時間的に変化させる性質を有する、請求項２３に記載の方法。

【請求項26】

前記光学システムが、光透過特性を空間的及び時間的に変化させる性質を有する、請求項２２に記載の方法。

【請求項27】

前記光学システムが、光透過特性を空間的及び時間的に変化させる性質を有する、請求項２３に記載の方法。

【請求項28】

前記光学システムが、光透過特性を空間的に変化させる性質を有する、請求項２２に記載の方法。

【請求項29】

前記光学システムが、光透過特性を空間的に変化させる性質を有する、請求項２３に記載の方法。

【請求項30】

前記光透過特性を空間的に変化させることが、離散的に変化する、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

前記光透過特性を空間的に変化させることが、離散的に変化する、請求項２９に記載の方法。

【請求項32】

前記光透過特性を空間的に変化させることが、連続的に変化する、請求項２８に記載の方法。

【請求項33】

前記光透過特性を空間的に変化させることが、連続的に変化する、請求項２９に記載の方法。

【請求項34】

前記光学システムがサニャック干渉計を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項35】

前記光学システムがサニャック干渉計を含む、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記サニャック干渉計は、
一方のプリズムに入射端面を有し、他方のプリズムに出射端面を有する非対称モノリシック構造を形成する２つの取り付けられたプリズムと、
前記プリズム間の取り付け領域の一部と係合し、前記入射端面を通って入射する前記光信号を、前記出射端面を通って出射する２つの二次光信号に分割するように構成されたビームスプリッタと、を備え、
前記ビームスプリッタのサイズは、前記二次光信号の光路が、前記ビームスプリッタによって係合される位置と、前記ビームスプリッタによって係合されない位置との両方で、前記取り付け領域に確実に当たるように選択される、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

前記サニャック干渉計は、
一方のプリズムに入射端面を有し、他方のプリズムに出射端面を有する非対称モノリシック構造を形成する２つの取り付けられたプリズムと、
前記プリズム間の取り付け領域の一部と係合し、前記入射端面を通って入射する前記光信号を、前記出射端面を通って出射する２つの二次光信号に分割するように構成されたビームスプリッタと、を備え、
前記ビームスプリッタのサイズは、前記二次光信号の光路が、前記ビームスプリッタによって係合される位置と、前記ビームスプリッタによって係合されない位置との両方で、前記取り付け領域に確実に当たるように選択される、請求項３５に記載の方法。

【請求項38】

前記２つのプリズムは、同一であるが、互いにずらして取り付けられ、それによって前記非対称性を確保する、請求項３６に記載の方法。

【請求項39】

前記２つのプリズムは、同一であるが、互いにずらして取り付けられ、それによって前記非対称性を確保する、請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

前記２つのプリズムが異なる形状を有し、それによって前記非対称性を保証する、請求項３６に記載の方法。

【請求項41】

前記２つのプリズムが異なる形状を有し、それによって前記非対称性を保証する、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記モノリシック構造が、前記取り付け領域に、前記光路のいずれかから離れて、前記ビームスプリッタから間隔を置いて配置されたスペーサを備える、請求項３６に記載の方法。

【請求項43】

前記モノリシック構造が、前記取り付け領域に、前記光路のいずれかから離れて、前記ビームスプリッタから間隔を置いて配置されたスペーサを備える、請求項３７～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記スペーサが、前記ビームスプリッタと同じ材料及び厚さで作られている、請求項４２に記載の方法。

【請求項45】

前記スペーサが、前記ビームスプリッタと同じ材料及び厚さで作られている、請求項４３に記載の方法。

【請求項46】

異なるスペクトル特性を有する複数の染色剤で染色された病理学的スライドをイメージングする方法であって、
請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法を実行することと、
各染色剤の相対的寄与について前記スペクトル画像を分析することと、
前記相対的寄与に基づいて、前記染色剤の表示可能な密度マップを生成することと、を含む、前記方法。

【請求項47】

前記スペクトル画像を複数のセグメントに空間的にセグメント化することを含み、前記セグメントの少なくとも１つが単一の生物学的細胞に対応し、前記密度マップが前記単一の生物学的細胞のマップである、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記細胞における各染色剤の平均密度を計算し、それによって前記細胞の発現プロファイルを提供することを含む、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記発現プロファイルに従って前記細胞を分類することを含む、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

複数の細胞のそれぞれについて、前記平均密度及び前記分類の前記計算を繰り返すことを含む、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

異なる細胞クラスに分類された細胞の間の幾何学的関係に基づいて、前記病理学的スライドを分類することを含む、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

サンプルをイメージングするためのシステムであって、
それぞれが異なる中心波長を有する複数の光ビームによってサンプルを連続的に照射するように構成された照射システムと、
前記サンプルから画像データを取得するように構成されたイメージャであって、前記画像データが、前記複数の光ビームに応答して、前記サンプルから受け取った光信号を表す、前記イメージャと、
前記イメージャに対して前記サンプルの視野をシフトさせるように構成されたステージと、
前記視野を段階的にシフトさせるように前記ステージを制御すること、ならびに前記照射システムが前記光ビームによって前記サンプルを連続的に照射し、前記イメージャが前記画像データを連続的に取得するように、前記照射システム及び前記イメージャを制御すること、を行うように構成されたコントローラと、
前記複数の光ビームのそれぞれに対して、複数の視野で、前記イメージャによって取得された画像データを使用して、前記サンプルのスペクトル画像を生成するように構成された画像プロセッサと、
を備える、前記システム。

【請求項53】

前記光ビームの立体角を低減させるように構成されたピンホールと、前記光ビームの前記画像データへの寄与を低減させるように構成されたビームストップとを備える、請求項５２に記載のシステム。

【請求項54】

前記光ビームを反射して前記光信号を透過させるか、またはその逆を行うように、構成され、配置されたビームスプリッタを備える、請求項５２～５３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項55】

前記光信号をコリメートするためのコリメートレンズを備え、前記照射システムが、前記コリメートレンズの光軸に対して周辺に配置された複数の光源を備える、請求項５２～５４のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項56】

各光信号の局所スペクトルを測定するための分光計を備え、前記画像プロセッサが、前記測定されたスペクトルを前記スペクトル画像の局所スペクトルと比較することと、前記比較に関するレポートを生成することと、を行うように構成される、請求項５２～５５のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項57】

前記光信号を使用して、前記サンプルの非スペクトル画像も生成するための追加のイメージャを備える、請求項５２～５６のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項58】

前記追加のイメージャによっても較正パターンがイメージングされるようにして、前記較正パターンを前記サンプル上に投影するためのプロジェクタを備え、前記画像プロセッサが、デフォーカスパラメータを計算するために、前記較正パターンの前記画像を処理するように構成される、請求項５７に記載のシステム。

【請求項59】

前記プロジェクタは、前記光信号を包含する波長範囲の外側の波長で前記較正パターンを生成するように構成されている、請求項５８に記載のシステム。

【請求項60】

前記サンプルと前記イメージャとの間の光路に配置され、光透過特性を変化させる性質を有する、光学システムを備える、請求項５２～５９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項61】

前記光学システムが、光透過特性を時間的に変化させる性質を有する、請求項６０に記載のシステム。

【請求項62】

前記光学システムが、光透過特性を空間的及び時間的に変化させる性質を有する、請求項６０に記載のシステム。

【請求項63】

前記光学システムが、光透過特性を空間的に変化させる性質を有する、請求項６０に記載のシステム。

【請求項64】

前記光透過特性を空間的に変化させることが、離散的に変化する、請求項６３に記載のシステム。

【請求項65】

前記光透過特性を空間的に変化させることが、連続的に変化する、請求項６３に記載のシステム。

【請求項66】

前記光学システムがサニャック干渉計を含む、請求項６２～６５のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項67】

前記サニャック干渉計は、
一方のプリズムに入射端面を有し、他方のプリズムに出射端面を有する非対称モノリシック構造を形成する２つの取り付けられたプリズムと、
前記プリズム間の取り付け領域の一部と係合し、前記入射端面を通って入射する前記光信号を、前記出射端面を通って出射する２つの二次光信号に分割するように構成されたビームスプリッタと、を備え、
前記ビームスプリッタのサイズは、前記二次光信号の光路が、前記ビームスプリッタによって係合される位置と、前記ビームスプリッタによって係合されない位置との両方で、前記取り付け領域に確実に当たるように選択される、請求項６６に記載のシステム。

【請求項68】

前記２つのプリズムは、同一であるが、互いにずらして取り付けられ、それによって前記非対称性を確保する、請求項６７に記載のシステム。

【請求項69】

前記２つのプリズムが異なる形状を有し、それによって前記非対称性を保証する、請求項６７及び請求項６８のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項70】

サニャック干渉計であって、
一方のプリズムに入射端面を有し、他方のプリズムに出射端面を有する非対称モノリシック構造を形成する２つの取り付けられたプリズムと、
前記プリズム間の取り付け領域の一部と係合し、前記入射端面を通って入射する光信号を、前記出射端面を通って出射する２つの二次光信号に分割するように構成されたビームスプリッタと、を備え、
前記ビームスプリッタのサイズは、前記二次光信号の光路が、前記ビームスプリッタによって係合される位置と、前記ビームスプリッタによって係合されない位置との両方で、前記取り付け領域に確実に当たるように選択される、前記サニャック干渉計。

【請求項71】

前記２つのプリズムは、同一であるが、互いにずらして取り付けられ、それによって前記非対称性を確保する、請求項７０に記載のサニャック干渉計。

【請求項72】

前記２つのプリズムが異なる形状を有し、それによって前記非対称性を保証する、請求項７０及び請求項７１のいずれか一項に記載のサニャック干渉計。

【請求項73】

前記モノリシック構造が、前記取り付け領域に、前記光路のいずれかから離れて、前記ビームスプリッタから間隔を置いて配置されたスペーサを備える、請求項７０～７２のいずれか一項に記載のサニャック干渉計。

【請求項74】

前記スペーサが、前記ビームスプリッタと同じ材料及び厚さで作られている、請求項７３に記載のサニャック干渉計。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２１年８月９日に出願された米国仮特許出願第６３／２６０，０７１号の優先権の利益を主張するものであり、この米国仮特許出願の内容を参照により全体として本明細書に援用する。

【背景技術】

【0002】

本発明は、そのいくつかの実施形態において、イメージングに関し、より詳細には、スペクトルイメージングのための方法及びシステムに関するが、これに限定されない。

【0003】

現在利用可能なほとんどのがん治療は、患者の約２０％にのみ有効であることが知られており、一方ほとんどの患者は治療に反応しない。事前に、どの患者が、いかなる薬に反応するかを特定することができないため、治療は主に試行錯誤に基づいており、いずれの患者に対しても数種の薬がテストされる可能性がある。この状況は、多くの場合、必要のない副作用及び資源の非効率的な使用に起因して、患者の死亡、生活の質の低下をもたらす。

【0004】

いくつかの薬については、コンパニオン診断が利用可能であり、治療に反応する可能性が他よりも高い患者を特定することを可能にする。これらのコンパニオン診断の多くは、特定のバイオマーカー、例えば、ＰＤ－１またはＨＥＲ２の発現レベルに基づいている。これらのバイオマーカーは、典型的には、免疫組織化学的（ＩＨＣ）方法を利用して、抗体を用いた特異的染色の後に、生検の組織学的検査において特定される。

【0005】

当技術分野では、スペクトルイメージングを用いる組織学的手法が知られている［Ｙ．Ｇａｒｉｎｉ ａｎｄ Ｅ．Ｔａｕｂｅｒ，Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｒ．Ｌｉａｎｇ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２０１３）］。スペクトルイメージングは、イメージャの画素ごとにスペクトルを測定する技術である。得られるデータセットは、２次元がイメージャ面に平行であり、第３の次元が波長である、３次元（３Ｄ）である。このようなデータセットは、Ｉ（ｘ，ｙ，λ）として表され得る「スペクトル画像」として知られており、ここで、ｘ及びｙはイメージャ面内の位置であり、λは波長であり、Ｉは各点及び波長における強度である。

【0006】

様々なスペクトルイメージング方法の中には、フーリエ変換（一般的には、フーリエ変換赤外のためのＦＴＩＲとして知られる）を使用する方法もあり、その方法は、視野（ＦｏＶ）内の各画素のインターフェログラム（信号対位相遅延）を収集し、後に、フーリエ変換を用いることでインターフェログラムをスペクトル領域に変換することを含む。

【0007】

米国特許第５，５３９，５１７号は、ＦＴＩＲベースのスペクトルイメージングシステムを開示している。このシステムは、可変スペクトルフィルタとして機能する干渉計を利用する。干渉計の２つのアーム間の位相遅延は、ＦｏＶの軸の１つに沿って変化している。この軸に沿って対象物を走査し、ＦｏＶの異なる部分で撮影された異なる画像にわたって対象物内の同じ点からのデータを収集することによって、対象物内の各点の完全インターフェログラムが得られる。その後、これらのインターフェログラムを、例えばＦＦＴを用いてスペクトルに変換して、スペクトル画像を生成する。

【0008】

Ｓｈｍｉｌｏｖｉｃｈ ｅｔ． ａｌ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，（２０２０） １０：３４５５は、スペクトル画像を得るための類似の走査方法（使用される可変スペクトルフィルタが、この方法では、くさび型液晶構成に基づくことを除いては類似の走査方法）を開示している。

【0009】

国際公開第ＷＯ２０２１／０１４４５５Ａ１号は、個々のがん細胞を特定する目的で、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色されたサンプルのスペクトルイメージングを得るのに有用な一群の様々なスペクトルイメージング方法を開示している。

【0010】

米国特許第１１，３００，７９９Ｂ２号は、取り付けられた２つのプリズムと、その２つのプリズムの間の界面領域にあるビームスプリッタとを含む光学デバイスを開示している。このデバイスは、光源から放射されたビームが、検出器に到達する前に、２つの異なる光路に沿ってプリズム中を伝搬するマイケルソン型干渉計として働く。

【発明の概要】

【0011】

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、サンプルをイメージングする方法が提供される。本方法は、それぞれが異なる中心波長を有する複数の光ビームによってサンプルを連続的に照射することを含む。本方法はまた、イメージャによってサンプルから画像データを連続的に取得することであって、画像データは、複数の光ビームに応答してサンプルから受け取った光信号を表す、取得することを含む。本方法はまた、イメージャに対してサンプルの視野をシフトさせることと、シフトさせた視野に対して連続照射及び画像データ取得を繰り返すことと、複数の光ビームのそれぞれに対して、複数の視野においてイメージャによって取得された画像データを用いて、サンプルのスペクトル画像を生成することとを含む。

【0012】

本発明のいくつかの実施形態によれば、画像データの連続取得は、視野が静止している間に行われる。

【0013】

本発明のいくつかの実施形態によれば、画像データの連続取得は、視野が変化している間に行われる。

【0014】

本発明のいくつかの実施形態によれば、サンプルは、それぞれが異なる発光スペクトルを有する複数の蛍光体を含有し、光ビームの少なくとも１つのスペクトル帯域幅が、少なくとも２つの異なる蛍光体を励起するように選択される。

【0015】

本発明のいくつかの実施形態によれば、照射することはピンホールを介して行われ、取得することは、光ビームの画像データへの寄与を低減させるように構成されたビームストップを介して行われる。

【0016】

本発明のいくつかの実施形態によれば、照射することは、光ビームを反射して光信号を透過させるか、またはその逆を行うように、構成され、配置されたビームスプリッタを介して行われる。

【0017】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、光信号をコリメートすることであって、照射することは、コリメートを規定する光軸に対して周辺に配置された複数の光源によって行われる、コリメートすることを含む。

【0018】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、光信号の一部を、各光信号の局所スペクトルを測定するために、分光計に向けることと、測定されたスペクトルをスペクトル画像の局所スペクトルと比較することと、比較に関するレポートを生成することとを含む。

【0019】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、非スペクトル画像も生成するために、光信号の一部を追加のイメージャに向けることを含む。

【0020】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、サンプル上にイメージング可能なパターンを投影することと、追加のイメージャによってパターンをイメージングすることと、パターンの画像に基づいて、デフォーカスパラメータを計算することとを含む。

【0021】

本発明のいくつかの実施形態によれば、パターンは、イメージング可能なパターンの異なる部分が、画像データが取得される対物レンズから異なる距離で、サンプル上に焦点を合わせられるように投影される。

【0022】

本発明のいくつかの実施形態によれば、パターンは、光信号を包含する波長範囲外の波長で投影される。

【0023】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、光信号を、光透過特性を変化させる性質を有する光学システムに通過させることを含む。

【0024】

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、異なるスペクトル特性を有する複数の染色剤で染色された病理学的スライドをイメージングする方法が提供される。本方法は、上記の方法、及び任意選択で好ましくは以下でさらに詳述する方法を実行することと、各染色剤の相対的寄与についてスペクトル画像を分析することと、相対的寄与に基づいて、染色剤の表示可能な密度マップを生成することと、を含む。

【0025】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、スペクトル画像を複数のセグメントに空間的にセグメント化することを含み、セグメントの少なくとも１つが、単一の生物学的細胞に対応し、密度マップが、単一の生物学的細胞のマップである。

【0026】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、細胞における各染色剤の平均密度を計算し、それによって細胞の発現プロファイルを提供することを含む。

【0027】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、発現プロファイルに従って細胞を分類することを含む。

【0028】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、複数の細胞のそれぞれについて、平均密度及び分類の計算を繰り返すことを含む。

【0029】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本方法は、異なる細胞クラスに分類された細胞間の幾何学的関係に基づいて病理学的スライドを分類することを含む。

【0030】

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、サンプルをイメージングするシステムが提供される。本システムは、サンプルをイメージングするためのシステムであって、それぞれが異なる中心波長を有する複数の光ビームによってサンプルを連続的に照射するように構成された照射システムと、サンプルから画像データを取得するように構成されたイメージャであって、画像データが、複数の光ビームに応答して、サンプルから受け取った光信号を表す、イメージャと、イメージャに対してサンプルの視野をシフトさせるように構成されたステージと、視野を段階的にシフトさせるようにステージを制御すること、ならびに照射システムが光ビームによってサンプルを連続的に照射し、イメージャが画像データを連続的に取得するように、照射システム及びイメージャを制御すること、を行うように構成されたコントローラと、複数の光ビームのそれぞれに対して、複数の視野で、イメージャによって取得された画像データを使用して、サンプルのスペクトル画像を生成するように構成された画像プロセッサと、を備える。

【0031】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本システムは、光ビームの立体角を低減させるように構成されたピンホールと、光ビームの画像データへの寄与を低減させるように構成されたビームストップとを備える。

【0032】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本システムは、光ビームを反射して光信号を透過させるか、またはその逆を行うように、構成され、配置されたビームスプリッタを備える。

【0033】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本システムは、光信号をコリメートするためのコリメートレンズを含み、照射システムは、コリメートレンズの光軸に対して周辺に配置された複数の光源を含む。

【0034】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本システムは、各光信号の局所スペクトルを測定するための分光計を備え、画像プロセッサが、測定されたスペクトルをスペクトル画像の局所スペクトルと比較することと、比較に関するレポートを生成することと、を行うように構成される。

【0035】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本システムは、光信号を用いてサンプルの非スペクトル画像も生成するための追加のイメージャを含む。

【0036】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本システムは、追加のイメージャによっても較正パターンがイメージングされるようにして、較正パターンをサンプル上に投影するためのプロジェクタを備え、画像プロセッサが、デフォーカスパラメータを計算するために、較正パターンの画像を処理するように構成される。

【0037】

本発明のいくつかの実施形態によれば、プロジェクタは、光信号を包含する波長範囲外の波長で較正パターンを生成するように構成される。

【0038】

本発明のいくつかの実施形態によれば、本システムは、サンプルとイメージャとの間の光路に配置され、光透過特性を変化させる性質を有する、光学システムを含む。

【0039】

本発明のいくつかの実施形態によれば、光学システムは、光透過特性を時間的に変化させる性質を有する。

【0040】

本発明のいくつかの実施形態によれば、光学システムは、光透過特性を空間的及び時間的に変化させる性質を有する。

【0041】

本発明のいくつかの実施形態によれば、光学システムは、光透過特性を空間的に変化させる性質を有する。

【0042】

本発明のいくつかの実施形態によれば、透過特性を空間的に変化させることが、離散的に変化する。

【0043】

本発明のいくつかの実施形態によれば、透過特性を空間的に変化させることが、連続的に変化する。

【0044】

本発明のいくつかの実施形態によれば、光学システムは、サニャック干渉計を含む。

【0045】

本発明のいくつかの実施形態によれば、サニャック干渉計は、一方のプリズムに入射端面を有し、他方のプリズムに出射端面を有する非対称モノリシック構造を形成する２つの取り付けられたプリズムと、プリズム間の取り付け領域の一部と係合し、入射端面を通って入射する光信号を、出射端面を通って出射する２つの二次光信号に分割するように構成されたビームスプリッタと、を備え、ビームスプリッタのサイズは、二次光信号の光路が、ビームスプリッタによって係合される位置と、ビームスプリッタによって係合されない位置との両方で、取り付け領域に確実に当たるように選択される。

【0046】

本発明のいくつかの実施形態の態様によれば、サニャック干渉計が提供される。本サニャック干渉計は、一方のプリズムに入射端面を有し、他方のプリズムに出射端面を有する非対称モノリシック構造を形成する２つの取り付けられたプリズムと、プリズム間の取り付け領域の一部と係合し、入射端面を通って入射する光信号を、出射端面を通って出射する２つの二次光信号に分割するように構成されたビームスプリッタと、を備え、ビームスプリッタのサイズは、二次光信号の光路が、ビームスプリッタによって係合される位置と、ビームスプリッタによって係合されない位置との両方で、取り付け領域に確実に当たるように選択される。

【0047】

本発明のいくつかの実施形態によれば、２つのプリズムは同一であるが、互いにずらして取り付けられ、それによって非対称性を確保する。

【0048】

本発明のいくつかの実施形態によれば、２つのプリズムは、異なる形状を有し、それによって非対称性を確保する。

【0049】

本発明のいくつかの実施形態によれば、モノリシック構造は、取り付け領域に、光路のいずれかから離れてビームスプリッタから間隔を置いて配置されたスペーサを含む。

【0050】

本発明のいくつかの実施形態によれば、スペーサは、ビームスプリッタと同じ材料及び厚さで作られる。

【0051】

別段の定義のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本発明の実施形態の実践または試験には、本明細書に記載したものと類似または同等の方法及び材料を用いることができるが、例示的な方法及び／または材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む特許明細書が優先する。さらに、材料、方法、及び実施例は、一例にすぎず、必ずしも限定することを意図していない。

【0052】

本発明の実施形態の方法及び／またはシステムの実施は、選択されたタスクを手動で、自動的に、またはそれらの組み合わせで実行または完了することを含み得る。さらに、本発明の方法及び／またはシステムの実施形態の実際の計装及び設備によれば、いくつかの選択されたタスクは、ハードウェア、ソフトウェア、またはファームウェア、またはそれらの組み合わせによって、オペレーティングシステムを使用して実施することができる。

【0053】

例えば、本発明の実施形態に従って選択されたタスクを行うためのハードウェアは、チップまたは回路として実装され得る。ソフトウェアとして、本発明の実施形態による選択されたタスクは、任意の適切なオペレーティングシステムを使用してコンピュータによって実行される複数のソフトウェア命令として実施することができる。本発明の例示的な実施形態では、本明細書に記載の方法及び／またはシステムの例示的な実施形態による１つまたは複数のタスクは、複数の命令を実行するためのコンピューティングプラットフォームなどのデータプロセッサによって実行される。任意選択で、データプロセッサは、命令及び／またはデータを格納するための揮発性メモリ、及び／または命令及び／またはデータを格納するための不揮発性ストレージ、例えば、磁気ハードディスク及び／またはリムーバブルメディアを含む。任意選択で、ネットワーク接続も提供される。ディスプレイ、及び／またはキーボードまたはマウスなどのユーザ入力デバイスも任意選択で提供される。

【0054】

本発明のいくつかの実施形態を、本明細書では、単なる例示として、添付の図面を参照しながら説明する。このとき図面を詳細にわたって具体的に参照するが、図示されている細部は例示として本発明の実施形態を説明的に考察することを目的としたものであることが強調される。この点に関して、図面を用いた説明は、本発明の実施形態がどのように実践され得るかを当業者に明らかにする。

【図面の簡単な説明】

【0055】

【図1】本発明のいくつかの実施形態による、サンプルをイメージングするシステムの概略図である。

【図2】本発明のいくつかの実施形態による、連続画像取得プロセスの概略図である。

【図3】サニャック干渉計が使用される本発明の実施形態による、サンプルをイメージングするシステムの概略図である。

【図4】サンプルを照射する光ビームの立体角を低減するためにピンホールが使用される本発明の実施形態による、サンプルをイメージングするシステムの概略図である。

【図5】周辺照射システムがサンプルを照射するために使用される本発明の実施形態による、サンプルをイメージングするシステムの概略図である。

【図6】本発明のいくつかの実施形態による例示的なサンプル分析プロトコルを示すフローチャート図である。

【図7】システムが分光計及び／または追加のイメージャも含む本発明の実施形態による、サンプルをイメージングするシステムの概略図である。

【図8】システムが、サンプル上に投影されるパターンを使用する本発明の実施形態による、サンプルをイメージングするシステムの概略図である。

【図9】本発明の実施形態のシステムと共に使用することができるいくつかの蛍光体の正規化発光スペクトルを示すグラフである。

【図10】本発明のいくつかの実施形態による、モノリシックサニャック干渉計を備える光学システムの概略図である。

【図11】本発明のいくつかの実施形態による、図１０に示されるモノリシックサニャック干渉計のより詳細を示す概略図である。

【図12】図１０に示される光学システムのより詳細を示す概略図である。

【図13】本発明のいくつかの実施形態による、モノリシックサニャック干渉計の出射端面を示す概略図である。

【図14】Ａ及びＢは、本発明のいくつかの実施形態による、ビームスプリッタの角度が４５．０３３３°である干渉計の構成において、モノリシックサニャック干渉計に対して実施された光線追跡シミュレーションの結果を示す。

【図15】Ａ及びＢは、干渉計が、互いにずれた関係で取り付けられた２つのプリズムを含む、本発明の実施形態によるモノリシックサニャック干渉計の概略図である。ここで、図１５Ｂは、図１５Ａの点線部分の拡大図である。

【図16A】本発明のいくつかの実施形態による、モノリシックサニャック干渉計に入る前の光信号の異なる伝搬距離について行われた光線追跡シミュレーションの結果を示す。

【図16B】本発明のいくつかの実施形態による、モノリシックサニャック干渉計に入る前の光信号の異なる伝搬距離について行われた光線追跡シミュレーションの結果を示す。

【図16C】本発明のいくつかの実施形態による、モノリシックサニャック干渉計に入る前の光信号の異なる伝搬距離について行われた光線追跡シミュレーションの結果を示す。

【図17】干渉計がスペーサを含む本発明の実施形態におけるモノリシックサニャック干渉計の概略図である。

【図18】モノリシックマイケルソン干渉計の概略図である。

【図19A】モノリシックマイケルソン干渉計について、製造誤差をシミュレートせずに行われた光線追跡シミュレーションの結果を示す。

【図19B】モノリシックマイケルソン干渉計について、製造誤差をシミュレートして行われた光線追跡シミュレーションの結果を示す。

【図19C】モノリシックサニャック干渉計について、製造誤差をシミュレートせずに行われた光線追跡シミュレーションの結果を示す。

【図19D】モノリシックサニャック干渉計について、製造誤差をシミュレートして行われた光線追跡シミュレーションの結果を示す。

【図20】本発明のいくつかの実施形態による、サンプルをイメージングするのに好適な方法のフローチャート図である。

【発明を実施するための形態】

【0056】

本発明は、そのいくつかの実施形態において、イメージングに関し、より詳細には、スペクトルイメージングのための方法及びシステムに関するが、これに限定されない。

【0057】

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、以下の記述で記載される、及び／または図面及び／または実施例に示される、構造の詳細及び構成要素及び／または方法の配列に必ずしも限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実践もしくは実行することが可能である。

【0058】

本発明者は、例えば、４００～８００ｎｍの典型的な波長範囲内で分離され得る異なる発光スペクトルの数が、実際には約８に制限されているため、従来のスペクトルイメージング手法は、測定可能な異なる染色剤または蛍光色素の種類に制限があることを見出した。その結果として、本発明者は、測定の精度を損なうことなく、多数の異なる染色剤または蛍光色素を測定し、分析することを可能にする手法を考案した。この手法は、多くの異なる種類の細胞を含む病理学的スライドの分析においては特に有用である。

【0059】

ここで図面を参照すると、図２０は、本発明の様々な例示的実施形態による、サンプルをイメージングするのに好適な方法のフローチャート図である。別段の定めがない限り、以下に説明される操作は、多くの組み合わせまたは実行順序で同時にまたは連続して実行できることを理解されたい。具体的には、フローチャート図の順序付けは限定的と見なされるべきではない。例えば、以下の説明にまたはフローチャート図に特定の順序で表示される２つ以上の操作は、異なる順序（例えば、逆順）で、または実質的に同時に実行することができる。さらに、以下で説明されるいくつかの操作は任意選択であり、実行されない場合がある。この方法の選択された操作を実行するのに好適なシステム３２０が、少なくとも図１、図３～図５、図７、及び図８に示されている。

【0060】

画像化すべきサンプル１０１は、任意の種類であり得る。好ましくは、サンプルは、インビトロでのイメージングのため細胞及び／または組織を支持するスライドを含む。あるいは、サンプル１０１は、生組織であり得る。さらに代替的に、サンプルは、半導体ウェハ、及び印刷される対象物、例えば、プリント回路基板などの非生物学的なものであり得るが、これらに限定されない。

【0061】

より好ましくは、サンプル１０１は、顕微鏡スライドである。サンプル１０１は、任意選択で好ましくは透明に作られた支持基板１００上に置かれ得る。本発明のいくつかの実施形態では、サンプル１０１は、組織学、任意選択で好ましくは免疫組織化学（ＩＨＣ）に適したスライドである。

【0062】

サンプル１０１は好ましくは、少なくとも１つの染色剤で染色される。より好ましくは、必ずではないが、サンプルは、複数の染色剤、例えば、少なくとも５、または少なくとも１０、または少なくとも１５の異なる染色剤で染色される。染色は、当技術分野で公知の任意の染色手法を用いることができる。

【0063】

本明細書で使用する場合、用語「染色剤」は、蛍光性、発光性、及び／または発色性のいずれかの着色剤を指し、さらに着色をもたらすために使用される試薬または物質を指す。

【0064】

本発明の実施形態に適した代表的な染色剤の例としては、直接免疫組織化学的染色剤、二次免疫組織化学的染色剤、組織学的染色剤、免疫蛍光染色剤、ＤＮＡ倍数性染色剤、核酸配列特異的プローブ、色素、酵素、非有機ナノ粒子及びこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0065】

本明細書で使用する場合、「免疫組織化学的染色剤」という用語は、細胞学的マーカーまたは受容体（例えば、タンパク質受容体）マーカーに結合する一次抗体を使用して、検査される生物学的サンプルを直接的または間接的に（「サンドイッチ」試薬及び／または酵素反応を介して）染色する着色剤、反応、及び関連試薬を指す。免疫組織化学的染色剤は、多くの場合、科学文献において、免疫染色剤、免疫細胞染色剤、免疫組織病理学的染色剤などと呼ばれる。

【0066】

本明細書で使用される「組織学的染色剤」という用語は、タンパク質のタイプ（酸性、塩基性）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、成分、核成分、膜成分などの細胞成分と関連して細胞及び組織を染色するために使用される任意の着色剤、反応及び／または関連試薬を指す。組織学的染色剤は、多くの場合、対比染色用染料、細胞学的染色剤、病理組織学的染色剤などと呼ばれる。

【0067】

本明細書で使用される場合、用語ＤＮＡ倍数性染色剤は、限定されないが、ＤＮＡまたはヒストンなどの染色体成分に化学量論的に結合する染色剤を指す。抗ヒストン抗体などの抗体が関与する場合、そのような染色剤は、ＤＮＡ免疫倍数性染色剤としても知られている。

【0068】

本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、サンプル１０１が既に染色された後にサンプル１０１を受け取り、本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、染色前にサンプル１０１を受け取る。後者の実施形態では、以下に説明するイメージング方法３００の前に、サンプル１０１を染色する操作が行われる。染色は、自動染色システムまたは手動で、当技術分野で公知の任意の手法によって行うことができる。染色は、任意選択で好ましくは、複数の染色剤を用いて、単一の染色プロセスまたは２つ以上の染色プロセスにおいて同時に実行される。例えば、染色は、当技術分野で公知の複数の異なる蛍光染色剤を用いてサンプルを染色する第１の染色プロセスと、染色されたサンプルを、限定されないが、Ｈ＆Ｅ染色剤、過ヨウ素酸シッフ染色剤、及びロマノフスキー染色剤などの１つまたは複数の非蛍光染色剤でさらに染色する第２の染色プロセスとを含むことができる。２つ以上の染色プロセスを用いる場合、それらを任意の実行順序で実行することができる。

【0069】

この方法は３００で開始し、任意選択で好ましくは３０１に進み、ここでサンプル１０１は、それぞれが異なる中心波長を有する複数の光ビームによって照射される。光ビームは、以下に更に詳細に説明するように、照射システム１０によって生成することができ、任意選択的に、光方向転換要素１１及び２０によって、照射システム１０からサンプル１０１に向け直すことができる。システム１０からの光ビームは、好ましくは、サンプルのイメージングされる側に向けられる。

【0070】

光ビームの中心波長は、好ましくは可視範囲（例えば、約４００ｎｍ～約７００ｎｍ）であるが、赤外線または紫外線の使用も企図される。各光ビームの帯域幅は、３０ｎｍ未満、または２０ｎｍ未満、例えば、１５ｎｍ以下であることが好ましい。

【0071】

サンプル１０１は、それぞれが異なる発光スペクトルを有する複数の蛍光体で染色することができる。いくつかの実施形態では、光ビームの少なくとも１つのスペクトル帯域幅は、少なくとも２つの異なる蛍光体を励起するように任意選択的に選択される。いくつかの実施形態では、２つ以上の蛍光体は、異なる励起スペクトルを有する。いくつかの実施形態では、２つ以上の蛍光体は、異なる励起スペクトルを有するが、（例えば、１０ｎｍもしくは１０ｎｍ以内の、または互いに）類似した発光スペクトルを有する。

【0072】

３０１で使用することができる典型的な中心波長は、限定することなく、約４００ｎｍ～約４１０ｎｍ、例えば、約４０５ｎｍ、及び／または約４７５ｎｍ～約５００ｎｍ、例えば、例えば、約４８８ｎｍ、及び／または約５２５ｎｍ～約５４０ｎｍ、例えば、約５３２ｎｍ、及び／または約６２５ｎｍ～約６４０ｎｍ、例えば、約６３３ｎｍを含む。

【0073】

本発明のいくつかの実施形態では、サンプル１０１は、より広い帯域幅、例えば、本明細書で明視野（ＢＦ）と呼ばれる、少なくとも１００ｎｍの帯域幅を有する光ビームによっても照射される。このような光ビームは、追加の光源８０によって生成され得る。例えば、明視野は、波長範囲４００～７００ｎｍにわたる複数の波長を有する多色（例えば、白色）光であり得る。光源８０からの光ビームは、好ましくは、イメージングされる側とは反対側のサンプルの側に向けられる（透過モード）。

【0074】

また、照射システム１０の光源の１つ以上が、明視野モードまたは暗視野モードのいずれかで、反射モードでのイメージングを容易にするために選択された光ビームを生成する実施形態もまた企図される。

【0075】

照射３０１は、ｎ個の期間のシーケンスの各期間の間に、サンプル１０１が異なるスペクトル特性を有する光によって照射されるという意味で連続である。ｎ期間のシーケンスは、本発明の様々な例示的実施形態において繰り返し実行される照射サイクルを規定し得る。最も単純な場合には、各期間中に、サンプル１０１は、単一の中心波長を有する光ビーム、例えば、単一の単色光源によって生成された光ビームによって照射される。このような連続照射プロセスの代表的な例は、図２の上部に概略的に示されており、複数の期間Δｔ_１、Δｔ_２、等を有する時間軸を示している。代表的な例では、これは限定と見なされるべきではなく、期間のシーケンスは、４つの期間（上記の形式論ではｎ＝４）を含む結果、第１の期間Δｔ_１の間に（例えば、照射システム１０の第１の光源１０ａを使用して）第１の光ビームが生成され、第２の期間Δｔ_２の間に（例えば、照射システム１０の第１の光源１０ｂを使用して）第２の光ビームが生成され、第３の期間Δｔ_３の間に（例えば、照射システム１０の第１の第３の光源１０ｃを使用して）第３の光ビームが生成され、第４の期間Δｔ_４の間に（例えば、追加の光源８０を使用して）明視野ビームが生成される。図２の例示では、４つの期間Δｔ_１～Δｔ_４は、照射サイクルＩを形成する。連続照射は、例えば図２に示すように周期的に繰り返すことができる。

【0076】

しかしながら、サンプル１０１を照射する光ビームのスペクトル特性が照射サイクル内の各期間で異なる場合、所与の期間の間に２つ以上の光源を使用することができることを理解されたい。代表的かつ非限定的な例として、５つの期間を含む照射サイクルを考える。ここで、第１の期間中に、サンプル１０１は、光源１０ａからの光ビームによって照射され、第２の期間中に、サンプル１０１は、光源１０ａ及び１０ｂを共に活性化することによって生成される光ビームによって照射され、第３の期間、第４の期間、及び第５の期間のそれぞれの間中に、サンプル１０１は、光源１０ｂ、１０ｃ、及び８０のうちの異なる１つの光源によって生成される光ビームによって照射される。

【0077】

方法は３０２に進み、そこでは画像データがイメージャ７０によってサンプルから連続的に取得される。操作３０１及び３０２は、任意選択で好ましくは同時に実行される。３０２で取得された画像データは、光ビームに応答してサンプル１０１から受け取った光信号を表す。例えば、サンプルが蛍光体で染色される場合、光ビームは蛍光体を刺激し、光信号は対応する蛍光発光である。イメージャ７０は、好ましくは、光ビーム間で切り替えを行いながら、サンプルの視野をイメージャに対してシフトさせることなく、光ビームのそれぞれによる照射に続いて画像データを取得する。イメージャに対するサンプルの視野が、図２の下部に示されている。図示のように、視野は、サイクル全体にわたって静的なままである。例えば、フレーム２０１は、照射サイクルＩを形成する４つの連続する時間周期Δｔ_１～Δｔ_４の全ての間の視野を表す。

【0078】

代替的に、イメージャ７０は、視野が照射サイクル内の持続時間に対して十分にゆっくりと変化する間に、画像データを取得することができる。これらの実施形態では、各サイクル内の期間は十分に短い。例えば、各サイクル内の期間は、視野が１画素サイズの量だけシフトされる時間よりも短くすることができる。

【0079】

３０３では、イメージャに対するサンプルの視野は、任意選択で好ましくはシフトされる。３０３からは、方法は３０１にループして戻り、シフトされた視野に対して３０１及び３０２の実行を繰り返す。ループバックは、好ましくは一度より多く実行される。再び図２を参照すると、フレーム２０２は照射サイクルＩＩ（期間Δｔ_５～Δｔ_８）の間の視野を表し、フレーム２０３は照射サイクルＩＩＩ（期間Δｔ_９～Δｔ_１２）の間の視野を表し、フレーム２０４は照射サイクルＩＶ（期間Δｔ_１３～Δｔ_１６）の間の視野を表す。図２は、各サイクルにおいて４つの期間を有する４つのサイクルを示すが、本方法は、任意の数のサイクル、及びサイクル当たり任意の数の期間を採用することができることを理解されたい。

【0080】

３０３でのシフトは、好ましくは１画素より大きい量、例えば２～２００画素、より好ましくは１０～２００画素である。

【0081】

サイクル当たりの照射の数をＮで、サイクルの数をＭで表すと、操作３０１～３０３を通じてイメージャ７０によって取得されるデータセットは、タイムインターレース方式で取得されるＮ・Ｍ個の画像を含み、第１の光ビームに対して取得される画像のセットは、第２の光ビームに対して取得される画像のセットとインターレースされる、などである。大まかに言って、例えば、第１の光ビームによってのみサンプルを照射して、Ｍ個の異なる視野で画像を取得し、次いで、第２の光ビームによってのみサンプルを照射して、同じＭ個の異なる視野で画像を再度取得する、などによって、同じＮ・Ｍ画像を、インターレースせずに取得することができる。しかしながら、全体の測定時間を短縮し、所与の視野で取得された全ての画像間の正確な重なりを保証するので、タイムインターレース方式での取得が有利であることが、本発明者らによって見出された。

【0082】

イメージャ７０によるデータ取得は、３０４でのスペクトル画像の生成を可能にするために、イメージャ７０内の各画素について十分に長いデータベクトル（たとえば、６以上の強度値、または１０以上の強度値、または２０以上の強度値、または３０以上の強度値を有するデータベクトル）を収集するのに十分なデータを提供する方法で実行される。これは、任意選択で好ましくは、サンプルからの光信号を、光透過特性を変動させるという性質を持っている光学システム５０に通すことによって保証される。光透過特性は、好ましくはスペクトル帯域を含むが、代替的にまたは追加的に、偏光及び／または強度であってもよい。光透過特性の変動は、時間的または空間的であり得る。

【0083】

変動が一時的である場合、光学システム５０は、好ましくは、各照射サイクルに対して異なる光学的透過特性（または光学的透過特性の異なるセット）を有する。これにより、イメージャ７０は、各画素が光信号の異なる波長成分の光強度を表す値のセットを有する画像データを収集することが可能になる。時間的変動の場合に光学システム５０として使用するのに適した光学システムの代表的な例は、限定されないが、異なる透過特性を有する光学フィルタ間を機械的に切り替えるフィルタホイール、印加される電圧の関数としてその光学透過特性を変化させる液晶システム、及び音響光学可変フィルタを含む。変動が一時的である実施形態では、操作３０２は、好ましくは、イメージャ７０に提供される視野がイメージングされるサンプル１０１の視野よりも小さい場合にのみ実行される。イメージャ７０に提供される視野がサンプル１０１を全体として含む場合、またはイメージャ７０に提供される視野がサンプル１０１内の関心領域を含む場合には、操作３０２を飛ばすことができる。

【0084】

変動が空間的である場合、光学システム５０は、光学システム５０の表面上の位置の関数として、または光信号の各光線の光学システム５０への入射角の関数として変動する光透過特性（または光透過特性の異なるセット）を有することが好ましく。これらの実施形態では、光学システム５０は、例えば、干渉計、好ましくはサニャック干渉計であり得、各画素におけるデータベクトルは、干渉計によって生成されるインターフェログラムである。光学システム５０がサニャック干渉計を含む実施形態におけるシステム３２０の代表的な例示が、図３に提供される。

【0085】

光学システム５０が干渉計であり得る実施形態では、サンプル１０１からの光信号は、干渉計のアームに沿って伝搬し、最終的に干渉計の出口で互いに干渉する２つの二次光信号に分割される。干渉計のアームは、各アームに沿って異なる光路長が存在するように構成され、２つの二次光信号の干渉パターンは、光路長差及びサンプルからの光信号の波長に依存する。干渉計は、光信号の干渉計への入射角に依存する可変スペクトル透過関数を効果的に提供する。例えば、サンプルにわたって単色で均一な光信号の場合、視野にわたる異なる点が異なる角度で干渉計に入るので、スペクトル透過関数は、視野にわたるコサイン関数である。一般に、空間干渉パターンは、光信号のフーリエ変換に関連する。

【0086】

干渉計を出ると、再結合された二次光信号は、イメージャ７０によってイメージングされ、その結果、再結合された信号内の各光線は、その異なる検出要素に到達する。これにより、干渉計で作られた干渉パターンによって変調されるサンプルの画像が提供される。したがって、サンプル内の任意の点からの信号に対して干渉計によって与えられるスペクトル透過率は、視野内のその位置に依存する。画像データは複数の視野にわたって取得されるので、光信号の複数の波長成分の強度は、例えば高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を用いて、干渉計の特性透過関数を入射角の関数として考慮して、サンプル内の各点について測定することができる。

【0087】

干渉計を使用し、フーリエ変換によってスペクトルを得る利点は、低信号という状況でその信号対雑音が優れていることであり、これは、殆ど全ての放射光信号が測定プロセスに使用され、フィルタ除去されないという事実の結果である。この効果は、フェルゲットのマルチプレックスアドバンテージとして知られており、蛍光が低強度信号という性質を持っているので、蛍光との関連で特に有利である。

【0088】

したがって、３０４で提供されるスペクトル画像は、複数の画素にわたって配置されたデータを含み、各画素は、光信号の波長成分のセットにそれぞれ対応する複数の強度値のセットを記憶し、したがって、その画素における光信号の局所スペクトルを表す。

【0089】

本発明のいくつかの実施形態では、方法は３０５に進み、そこでスペクトル画像が分析されて、サンプル中の各染色剤の相対的寄与が決定される。これは、例えば、サンプルを染色するために使用された染色剤の特徴的な発光スペクトルに基づいて、各画素におけるスペクトルをビニングすることによって行うことができる。次いで、方法は３０６に進むことができ、そこで相対的寄与に基づいて、染色剤の表示可能な密度マップが生成される。密度マップは、ディスプレイ装置に表示されるか、または遠隔位置で表示するため遠隔位置に送られる。

【0090】

本発明のいくつかの実施形態では、方法は３０７に進み、そこで密度マップは複数のセグメントに空間的にセグメント化され、セグメントの少なくとも１つ、より好ましくは複数のセグメントの少なくとも一部のそれぞれは、単一の生物学的細胞に対応する。セグメント化は、サンプル１０１中の染色剤の一部に関連するデータに基づいて行われ得る。具体的には、セグメント化は、スペクトル画像の各画素に記憶されるスペクトルの所定の部分に対応する密度マップの部分に基づいて行うことができる。本発明のいくつかの実施形態では、セグメント化は、サンプル１０１中の単一の染色剤に関連するデータに基づいて行われる。例えば、セグメント化は、サンプル１０１が明視野光源８０を用いて照射されている間にイメージングされた非蛍光性染色剤（例えば、Ｈ＆Ｅ染色剤）に対応する画像データに基づいて行われ、サンプル１０１が照射システム１０の光源の１つを用いて照射されている間にイメージングされた染色剤に対応する画像データには行われない。

【0091】

操作３０５が実行される実施形態では、本方法は、好ましくは、単一の生物学的細胞の少なくとも１つの密度マップを生成する。本発明のいくつかの実施形態では、方法は３０８に進み、そこで細胞の発現プロファイルを提供するために、細胞内の各染色剤の平均密度が計算される。好ましくは、プロファイルは、１つより多い細胞について、より好ましくはサンプル中の細胞の少なくとも大部分について計算される。

【0092】

次いで、方法は、任意選択で好ましくは、３０９に進むことができ、そこで、計算された発現プロファイル（複数可）に従って細胞（複数可）が分類される。これは、各細胞のプロファイルを発現プロファイルのデータベースと比較することによって、またはサンプルの細胞の間でプロファイルを比較することによって行われ得る。任意選択的に、分類は、細胞の識別、例えば、細胞ががん細胞であるか免疫系細胞であるかを識別することを含む。そのような識別は、計算されたプロファイルと、データベースに記憶され得る以前に識別された細胞クラスまたは細胞タイプのプロファイルとの間の類似性に基づいて行われ得る。

【0093】

本発明のいくつかの実施形態では、方法は３１０に進み、そこで、異なる細胞クラスに分類された細胞間の幾何学的関係に基づいてサンプルが分類される。例えば、幾何学的関係に基づいて、サンプルは、がん性または良性として分類され得、任意選択的に、がんのグレードに従って分類され得る。

【0094】

方法は３１１で終了する。

【0095】

本実施形態の方法及びシステムのさらなる詳細な説明を提供する前に、本明細書で詳細に上述したように、それによって提供される利点及び潜在的な用途に注目する。

【0096】

多くの従来のシステムでは、スライド当たり単一のバイオマーカーのみが染色される。場合によっては、連続するスライドを異なるＩＨＣバイオマーカーで染色することによって複数のバイオマーカーが分析されるが、この方法では、異なるスライドが異なる細胞を示すので、バイオマーカーの共局在性が失われ、個々の細胞の完全な発現プロファイルを得ることは困難である。本実施形態の手法は、同じスライド上で多くの染色剤の使用を可能にし、この結果として、個々の細胞の発現プロファイルを決定するための有用なツールを提供する。これは、詳細な細胞分類及び腫瘍微小環境の特徴付けを可能にする。

【0097】

他の従来の手法は、異なって染色されたバイオマーカーの発現を決定するために、フローサイトメトリーを使用する。しかしながら、本実施形態の手法とは異なり、ほとんどのフローサイトメトリーシステムは、複数のバイオマーカーのデータを同じ細胞に結び付けることができない。いくつかの高価なフローサイトメトリーシステムは、同じ細胞上の複数のバイオマーカーの測定を可能にするが、本実施形態の手法とは異なり、これらのフローサイトメトリーシステムは、細胞が測定のために組織から放出されなければならず、腫瘍及び／またはがんを特徴付けるために有用であり得る空間情報を失うので、固形腫瘍用には向かない。

【0098】

他の従来の手法は、光学システムではなく質量分析（例えば、飛行時間型質量分析ＴＯＦ－ＭＳ）を使用し、それによって、集束ビームがスライドの表面にわたってポイントごとに走査され、スライドの表面からイオンを放出し、質量分析測定を可能にする。これらの手法は、多数のバイオマーカーを特定することができるが、それらは、サンプルのポイントごとの走査を必要とするので、本実施形態の手法よりもはるかに遅い。さらに、本実施形態の手法とは異なり、質量分析手法は高価で操作が複雑である。

【0099】

したがって、本実施形態の手法は、空間分解能及び幾何学的状況の観点から光学顕微鏡法の利点と、バイオマーカー分離能力の観点からフローサイトメトリー及び質量分析などの非イメージング手法の利点との両方を享受する。

【0100】

以下は、本発明のいくつかの実施形態によるシステム３２０のより詳細な説明である。

【0101】

システム３２０は、視野シフトを提供する機構以外の任意の可動部分を欠いていることが好ましい。

【0102】

図１を参照すると、システム３２０は、好ましくは、イメージャ７０に対してサンプル１０１の視野をシフトさせるように構成された機械的ステージ１１０を備える。図１は、イメージャ７０が静止し、サンプル１０１が移動可能である好ましい実施形態を示すが、システム３２０の光学セットアップがステージ１１０上に配置され、サンプル１０１が静止している構成も企図されており、サンプル１０１がより大きな対象物（例えば、生体）の一部である場合に有用である。典型的には、ステージ１１０は、サンプルの表面に平行な２つの横軸ＸＹに沿って移動可能である。必要に応じて、必ずではないが、ステージ１１０はまた、例えば、集束の目的で、サンプルの表面に垂直に、Ｚ軸に沿って移動するように構成される。本発明のいくつかの実施形態では、ステージ１１０は、１つの横軸、例えば、Ｘ軸に沿ってのみ移動可能であり、本発明のいくつかの実施形態では、ステージ１１０は、例えば、１つの横軸、例えば、Ｘ軸と、垂直のＺ軸とに沿って移動可能であるが、他の横軸、例えば、Ｙ軸に沿って移動可能ではない。ステージ１１０の動きは、モータ及びギア機構（図示せず）を用いることができ、好ましくはコントローラ２００によって制御される。

【0103】

システム３２０の光学セットアップは、上述の照射システム１０を備えており、これは、任意選択で好ましくは、２つ以上の光源を含み、それぞれは、上記でさらに詳述したように、異なる中心波長を有する光ビームを提供する。図１には、３つの光源１０ａ、１０ｂ、及び１０ｃが示されているが、本発明のいくつかの実施形態によれば、任意の数の光源を使用することができる。光源のそれぞれは、所望の中心波長及び十分に狭い帯域幅（例えば、３０ｎｍ未満、または２０ｎｍ未満、例えば、１５ｎｍ以下）で光を生成するように選択された発光ダイオード（ＬＥＤ）またはレーザ光源であり得る。光源１０ａ、１０ｂ、及び１０ｃのそれぞれの中心波長及び帯域幅は、任意選択的に、好ましくは、それぞれ１３ａ、１３ｂ、及び１３ｃで概して示されるスペクトル選択フィルタによって選択することができる。本発明のいくつかの実施形態では、照射システム１０の光源の１つ以上は、明視野モードまたは暗視野モードのいずれかで反射モードでのイメージングを容易にするために選択された光ビームを生成する。

【0104】

システム３２０の光学セットアップは、好ましくは、システム１０からの光ビームが、そのイメージング側（本例では上側）から、任意選択で好ましくは対物レンズ３０を通して、サンプル１０１を照射するように配置される。図１に示される構成では、光源１０ａ、１０ｂ、１０ｃからの光ビームは、例えば、ダイクロイックビームスプリッタ１１ａ、１１ｂ及び／またはミラー１１ｃの配置を含み得る光方向転換システム１１を使用して、１つの光軸（本例では－Ｘ軸）に沿って伝搬するように方向転換される。しかしながら、この構成は、いくつかの実施形態では、光方向転換システム１１を使用せずに光を方向付けることができるため、必ずしもそのようである必要はない。例えば、システム１０は、図５に示すような周辺照射システムとすることができ、または図８に示すような光ファイバ１７の導波路を用いて照射を提供することができる。

【0105】

本発明のいくつかの実施形態では、光源１０からの照射は集光レンズ１２を透過する。光源１０からの照射は、マルチバンドビームスプリッタ２０を使用してサンプル１０１に向けて再方向付けすることができ、このマルチバンドビームスプリッタは、システム１０からの異なる光ビームの中心波長の周りの狭い波長帯域のみを任意選択で好ましくは選択的に反射し、一方、他の波長の光を透過させる。

【0106】

本発明のいくつかの実施形態では、システム３２０はまた、さらに詳細に上述したように、イメージング側とは反対側からサンプル１０１を照射するように配置された明視野光源８０も備える。好ましくは、光源８０からの明視野は、集光レンズ８１を通して伝達され、サンプル１０１に向けて（例えば下から）ミラー８２によって向け直される。

【0107】

照射システム１０及び光源８０はまた、任意選択で好ましくは、コントローラ２００によって制御される。

【0108】

本発明のいくつかの実施形態では、システム３２０はまた、サンプル１０１から反射された可能性がある励起波長をフィルタリング除去するためのスペクトルフィルタまたはフィルタのセット３５を含む。フィルタ３５の透過曲線は、フィルタ３５のスペクトル窓が、励起光のより良好な排除を提供するために、任意選択で好ましくはビームスプリッタ２０の透過曲線よりもわずかに広い（例えば、５％、１０％、または１５％広い）ことを除いて、ビームスプリッタ２０によって提供される透過曲線と同じまたは同様であり得る。

【0109】

光ビームのいずれかによる照射に応答して、サンプル１０１によって出力された光信号は、イメージャ７０上に投影される。イメージャ７０は、任意選択で好ましくは、ＣＣＤまたはＣＭＯＳイメージャ等であるが、これらに限定されない、画素化したイメージャである。光信号は、好ましくは、対物レンズ３０、像平面４２を有するチューブレンズ４０、及び光学システム５０のうちの１つ以上を通して、イメージャ７０上に投影される。任意選択的に、ミラー４１が、チューブレンズ４０と光学システム５０との間に配置され、例えば、チューブレンズ４０と像平面４２との間に配置される。

【0110】

イメージャ７０は、任意選択で好ましくは、コントローラ２００がイメージャ７０から画像データを受け取ることを可能にするために、１つまたは複数のデータ・チャネル７２を介してコントローラ２００と通信する。コントローラ２００は、画像処理能力を有するコンピュータ制御のコントローラであることが好ましい。本発明のいくつかの実施形態では、コントローラ２００は、データをローカルに記憶するデータベース２１０、及び／またはクラウドストレージ設備と通信する。データベース２１０及び／またはクラウドストレージ設備は、以前に識別された細胞発現プロファイル、組織分類及び／または識別等を格納することができる。

【0111】

上述のように、光学システム５０は、可変光透過特性を有する。図１は、光学システム５０が、空間的に変化する光透過特性を有する構成を示し、この場合、光信号は、レンズ６１によって光学システム５０に入る前に、かつレンズ６２によって光学システム５０から出た後に、コリメートされる。光学システム５０が、時間的に変化する光透過特性を有する実施形態では、光学システムは、チューブレンズ４０の像平面４２に任意選択で好ましくは、配置される。

【0112】

図３は、光学システム５０がサニャック干渉計を備える、本発明の実施形態によるシステム３２０の概略図である。干渉計５０は、１つの平面における干渉計５０への入射角の関数として光路長差が変化するようにアラインされる。干渉計５０は、一般に、ビームスプリッタ５０３、及び２つのミラー５０１、５０２で形成されており、干渉計５０に入る光信号が、ミラー５０１及び５０２の反射により、干渉計５０内で反対方向にループする２つの二次光信号に分割されるように配置されている。２つの二次光信号のそれぞれは、サニャックループを完成させて、ビームスプリッタ５０３で他の二次信号と干渉する。

【0113】

像平面４２で形成されるサンプル１０１の像は、像の各点が異なる角度でビームスプリッタ５０３上に投影され、したがって、２つのサニャック間の異なる経路長差を受け、その結果、サンプル１０１の像の異なる点に対して異なるスペクトル透過関数が生じるように、入射レンズ６１によって干渉計５０内に投影される。単色光源の場合、この配置は、明るい領域と暗い領域の線で作られる干渉パターン（フリンジとしても知られる）を提供し、この干渉パターンは、余弦関数によって記述される。

【0114】

干渉計５０を出ると、像平面４２におけるサンプル１０１の像の各点は、干渉計の出口レンズ６２によってイメージャ７０上の異なる位置に像を作り、したがって、干渉計５０によって生成された干渉パターンによって重ね合わされたサンプル１０１の画像を提供する。したがって、サンプル１０１の任意の点からの信号に対して干渉計５０によって与えられるスペクトル透過率は、視野内のその位置に依存する。この構成により、サンプル１０１の任意の点からの光信号のスペクトルを測定することが可能になる。そのような測定のための代表的な手順は、（ａ）視野にわたってサンプル１０１を走査することと、（ｂ）サンプル１０１のそれぞれの点についてイメージャ７０の各ピクセルによって生成されたデータを、視野内の位置の関数として（または等価的に入射角の関数として）収集して、各画素にデータベクトルを提供することと、（ｃ）入射角の関数としての干渉計の透過を考慮して、例えば、高速フーリエ変換（ＦＦＴ）によって、データベクトルに逆フーリエ変換を適用することによって、サンプル１０１の各点のスペクトルを計算することとを含む。フーリエ変換は、任意選択で好ましくは、当技術分野で公知のように、アポダイゼーション、ゼロ充填及びスペクトル平滑化のための前処理及び／または後処理を伴ってもよい。

【0115】

したがって、システム３２０は、照射システム１０によって生成された光ビームのそれぞれに対してサンプル１０１の全ての点からのスペクトルを測定することを可能にする。サンプル１０１の少なくとも一部（例えば、スライドの一部またはスライド全体）の全ての点からスペクトルを収集することにより、スペクトル画像を作成する。

【0116】

本明細書でさらに詳細に上述したように、異なるスペクトル特性を有する複数の光ビームが照射サイクルにおいて連続的に使用される場合、コントローラ２００によって、イメージャ７０と同期して個々の光ビームを作動させるように照射システム１０を制御する。再び図２を参照すると、本発明の好ましい実施形態において、励起蛍光である光源は、最初に１０ａから始めて、１０ｂ及び１０ｃと続いて稼働され、最後に透過光源８０も稼働される。次に、イメージャ７０によるフレームの全てのキャプチャの間に、単一の光源が作動するように、照射サイクルが繰り返される。各サイクル（全ての異なる光源を使う）は、図２のフレーム２０１、２０２、２０３、２０４に概略的に示されるように、イメージャ７０に対するサンプル１０１の異なる視野で撮影される。

【0117】

ステージ１１０の移動は、各フレームにおいて対象物が異なる位置にあり、露光中でも対象物が移動している（画像内のスミアの許容可能なレベルに寄与している）ように、連続的であってもよく、または段階的であってもよい。後者の選択肢（一方の位置から他方の位置へのステッピング）は、この場合、照射サイクル内の各光ビームに対して生成されるデータが、同じ視野に対応するので、好ましい。ステージ１１０が進められるステップは、ナイキスト最小サンプリング則に従って、最短波長に対するフリンジ幅よりも小さいことが好ましい。発明者は、このような基準を用いることにより、運動中のイメージャ７０の活性化が、スペクトルの品質を著しく劣化させないことを見出した。本発明のいくつかの実施形態では、以下のパラメータ、すなわち、ステージ１１０の運動方向とイメージャ７０のグリッドの軸の１つとの間の角度、ステージ１１０の運動と画像の位置との間の比、及びステージ１１０の速度のうちの１つ以上を較正するために、較正手順が使用される。

【0118】

したがって、全ての照射サイクル及び対応する画像取得の終わりに、収集された画像データは、それぞれがイメージャ７０の１つの画素に対応する複数のデータベクトルを含み、各データベクトルは、視野におけるシフト及び照射のスペクトル特性間の切り替えの両方を考慮に入れる複数の値を含む。理想的には、各データベクトルは、Ｎ・Ｍ個のデータ値を含むことができ、ここで、Ｎ及びＭは、述べたように、それぞれ、１サイクル当たりの照射の数（光源の数または光源の組み合わせ）及びサイクルの数である。しかしながら、Ｎ・Ｍよりも短いデータベクトルもまた同様に適切であることが分かる。Ｎ・Ｍ個のデータ値を含むデータベクトルを生成する代わりに、各画素に対して、長さＭのＮ個のデータベクトルを代替的に生成することができ、したがって、Ｎ個のスペクトル画像、光源に対する１つのスペクトル画像、または光源の組み合わせを生成することを可能にすることが理解される。

【0119】

システム３２０の利点は、サンプル１０１を視野にわたって１回だけ走査することができ、画像データが複数の異なる光源について並行して収集されることである。例えば、画像データは、蛍光を生じさせる複数の励起光源１０ａ、１０ｂ、１０ｃと、明視野光源８０からの透過信号とについて、並行して収集され得る。照射システム１０の光源の１つ以上が、明視野モードまたは暗視野モードのいずれかで、反射モードでのイメージングを容易にするために選択された光ビームを生成し得る。

【0120】

単一の単色光源がシステム３２０によって使用される場合、異なるバイオマーカー（例えば、抗体）と共に複数の蛍光体で染色されたサンプルは、複数のバイオマーカーの密度を同時に提供するために、イメージングされ、分析され得る。例えば、約４０５ｎｍの励起波長を有する蛍光体の典型的なセットは、蛍光体のＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔセットに基づく。図９に、ＢＶ４２１、ＢＶ４８０、ＢＶ５１０、ＢＶ６０５、ＢＶ６５０、ＢＶ７１１、ＢＶ７５０、及びＢＶ７８６の発光スペクトルを示す代表例を示す。図示されるように、全ての蛍光体の発光スペクトル間の差は、混合を取り除くのに十分に大きい。システム３２０は、いくつかの異なる励起波長（それぞれがシステム１０の光源の１つ以上によって提供される）の使用を促進するので、それぞれが異なる波長によって励起可能な複数の蛍光体で染色されたサンプルを、イメージングすることができ、したがって、同じスライド上の同じスキャンで、複数（少なくとも６または少なくとも８または少なくとも１２または少なくとも１６）の蛍光体を分離することを可能にする。例えば、システム３２０は、約４０５ｎｍ、約４８８ｎｍ、約５３２ｎｍ及び約６４０ｎｍからなる群から選択される中心波長の少なくとも２つ、または少なくとも３つ、またはそれぞれを提供する光源を用いることができる。

【0121】

データ収集は、連続走査モードまたはステップアンドメジャーモードのいずれかで行うことができる。連続走査モードでは、サンプル１０１は連続的に移動しているため、異なる光源を作動させた場合の画像は異なる。しかしながら、このことは、サンプル１０１内の各点に対するデータが（異なるフレーム間の視野の重なりのために）複数回収集されるので、システムの性能を制限しないことが見出された。連続走査モードでは、各サイクル内の期間は、任意選択で好ましくはスメアリングを最小限に抑えるのに十分に短い。例えば、各サイクル内の期間は、ステージ１１０がサンプル平面上の画素サイズに等しい距離をカバーするのにかかる時間よりも短くすることができる。数値例として、ステージ１１０が１ｍｍ／秒の速度で移動し、画素サイズが１ミクロンの場合を考える。この場合、各照射サイクル内の期間は約１ｍｓである。各照射サイクル内の期間は、代替的に、上記の期間の任意の乗数未満、例えば、期間の０．５倍、０．２５倍、２倍、４倍であり得る。したがって、このモードは、測定速度の観点からより好ましく、空間分解能及びスペクトル分解能の観点からはあまり好ましくない。

【0122】

ステップアンドメジャー動作モードでは、ステージ１１０は、各照射サイクル後の位置の間で割り込み、異なる光源を使用して全ての画像が撮影されるまで静止したままである。このモードは、より長い露光を可能にし、場合によっては、単一フレーム時間より長い照射パルスを使用することさえも可能にし、したがって、空間分解能及びスペクトル分解能の観点からより好ましく、測定速度の観点からはあまり好ましくない。

【0123】

光学システム５０が時間の関数としてその透過特性を変化させる場合、それは、回転フィルタセット、電圧制御液晶要素、またはフィルタ特性を時間的に切り替えることを可能にする任意の他の技術として具現化され得る。この走査方法によれば、スペクトル透過特性の完全なセットが各視野で使用される。次いで、得られた画像を使用して、視野内の各点に対するデータベクトルを計算することができる。さらに、１つの照射条件下で画像の完全なセットを撮影することに加えて、プロセス全体は、任意選択で好ましくは、異なる照射条件を用いてサイクルで繰り返される。スペクトル透過特性間の切り替え及び光源間の切り替えは、いずれの順序でも行うことができる。例えば、光学システム５０のスペクトル透過特性の間の切り替えが光源間の切り替えよりも遅い場合、システム３２０は、光学システム５０の全てのスペクトル透過特性が使用されるまで、光学システム５０の最初のスペクトル透過特性、例えば、連続するフレームにおいて、全ての異なる光源を使用して画像を収集し、次に、光学システム５０のスペクトル透過特性を変更し、再び、異なる光源のそれぞれを使用して画像を収集するなどができる。逆に、光学システム５０のスペクトル透過特性の間の切り替えが光源間の切り替えよりも速い場合、システム３２０は、１つの光源を使用して光学システム５０の全ての可能なスペクトル透過特性に関するデータを収集し、次いで、別の光源を使用して光学システム５０の全ての可能なスペクトル透過特性に関するデータを収集することなどができる。

【0124】

光学システム５０、及び全ての光源の全てのスペクトル透過特性についての全データが１つの視野で収集されると、システム３２０は、視野をシフトし、全サンプルが走査されるまで新しい視野に対するプロセスを繰り返す。

【0125】

本発明者は、データベクトルが数十のデータ値を有する場合、十分に正確なスペクトルを得ることができることを見出した。したがって、同じ光源で撮影された連続する画像フレーム間の視野のシフト（例えば、図２に示す非限定的な例では、フレームΔｔ_１及びΔｔ_５）は、空間及びスペクトル分解能を損なうことなく、数画素の量とすることができる。例えば、システムのスペクトル範囲が約４００ｎｍ～約８００ｎｍであり、必要なスペクトル分解能が約１０ｎｍである場合、データベクトルに対して約４０個のデータ値を有することが十分であり、またはデータベクトルが対称である場合には約８０個のデータ値を有することが十分である。したがって、視野にわたって約９６０画素を有するイメージャの場合、同じ照射源画像で撮影された連続する画像フレーム間の視野のシフトは、約１２画素の量とすることができる。

【0126】

図４は、サンプルを照射する光ビームの立体角を低減するためにピンホールが使用される本発明の実施形態による、システム３２０の概略図である。これらの実施形態の利点は、取得された画像データに対する励起光の寄与を低減できることである。図４に示すように、ピンホール１４は、集光レンズ１２の後の照射経路に、典型的には集光レンズ１２の焦点面の近くに挿入される。ピンホール１４は、レンズ１２３によって対物レンズ３０の後方焦点面３１上にイメージングされることによって、照射の立体角を低減する。

【0127】

サンプル１０１からの信号は、３つの主要な成分を有し、これらの成分は、典型的にはランバートであり、広い立体角を有するサンプルからの蛍光、照射と同じ立体角を有するサンプルからの反射、及びサンプルの平面に対する法線から角度が増加するにつれて減少するサンプルからの散乱を含む。画像データ内に不要な背景を生成する２つの後者の成分をさらに排除するために、追加のビームストップ４３が戻り経路に配置される。好ましくは、ビームストップ４３は、チューブレンズ４０を通して対物レンズの後方焦点面３１の像面に配置される。したがって、サンプル１０１から法線方向に近い角度で出た光ビームは、ビームストップ４３の面内で光軸に近い円板に閉じ込められ、ビームストップ４３によって遮断される。ビームストップ４３の直径は、任意選択で好ましくは、照射の立体角を超えて、例えば、照射コーンの角度の２倍に等しい、または代替的に、ビームストップ４３の平面におけるシステムの開口の全直径の半分を遮断し、したがって、反射信号及び散乱信号のかなりの部分、ならびに蛍光信号の小さな部分のみを除去するように選択される。

【0128】

図５は、システム１０が周辺照射システムである、本発明の実施形態によるシステム３２０の概略図である。この実施形態では、光源のアレイ、例えばＬＥＤのアレイは、それらが対物レンズ３０の開口の外側でサンプル１０１を照射するように、配置されている。例えば、図５に示すように、光源は、集束光学システムを用いてまたは用いずに、対物レンズ３０の光軸に対して周辺に配置することができる。共に動作する複数の同様の光源、例えば同じ発光スペクトルを有するＬＥＤが、照射の均一性を改善するために、本配置の複数の周辺位置に配置され得る。光源の配置は、例えば１０’に示すように、概ね平面であり得るか、または１０’’に示すように非平面形状を形成し得る。図５において、Ｒ、Ｇ、Ｂ及びＶは、異なる中心波長で照射する異なるＬＥＤタイプを示す。正弦波照射、暗視野モード、全内部反射モード、高傾斜ビーム、またはＨｉＬｏ照射のような他の照射方法も、システム３２０によって使用することができる。

【0129】

図７は、本発明の実施形態によるシステム３２０の概略図であり、システムは、分光計９０、及び／または追加のイメージャ７１（任意選択で好ましくはレビュー及び較正チャネルとして使用されてもよい）も含む。図示の実施形態では、照射システム１０からの光ビームは、レンズ１２によって照射ピンホール１５上に結像され、次いで、この照射ピンホールがレンズ１２３及び対物レンズ３０によってサンプル１０１の表面上に結像され、サンプル１０１の特定の部分を照射する。ピンホール１５は、ピンホール１４（図７には示さず、図４参照）とは異なる機能を有することに留意されたい。ピンホール１５がサンプル１０１上に結像される間、ピンホール１４は、対物レンズ３０の後方焦点面３１上に結像される。好ましくは、ピンホール１５は、分光計９０を使用して較正プロトコルを実行する前にシステム３２０に導入され、画像データを取得する前にシステム３２０から除去されてスペクトル画像を生成する。

【0130】

照明に応答する光信号の一部（例えば、蛍光、透過、反射）は、ビームスプリッタ４４によって、任意選択で好ましくはレンズ４６の像平面に配置され、光信号を空間的に狭める収集ピンホール４５に方向転換される。典型的には、サンプル１０１の表面上の収集ピンホール４５の像は、照明ピンホール１５の像よりも小さいため、実際にサンプリングされる領域を小さくする。例えば、サンプル１０１の表面における収集ピンホール４５の像の大きさは、単細胞または核の大きさであり、あるいは、それより小さくてもよい。光信号は、ピンホール４５を通過し、次いで、レンズ４８によって分光計９０（好ましくは非結像分光計）の入口に結像される。あるいは、分光計９０は、光ファイバ入口を含むことができ、その場合、ファイバの端部（図示せず）は、ピンホール４５として機能するか、またはピンホール４５の直後に取り付けることが可能である。分光計９０を含む光チャネルは、典型的には、イメージャ７０の空間分解能よりも低い空間分解能を有し、したがって、分光計９０によって得られるスペクトルは、イメージャ７０の複数の画素にわたる平均に対応することに留意されたい。

【0131】

システム３２０内に分光計９０、を有することの利点は、分光計９０によって得られた測定値と、光学システム５０を用いてイメージャ７０によって得られた測定値との間の差及び類似性に対する性能指数を提供することにより、システム３２０によって生成されたスペクトル画像の精度を評価するために分光計９０を使用できることである。この評価は、入力としてイメージャ７０及び光学システム５０によって測定されたスペクトルを受け取り、分光計９０を用いて同じ位置で測定されたスペクトルに近い補正されたスペクトルを返す補正関数を構築するために用いることができる。補正関数は、システム３２０によって測定された他のデータを補正するためにも使用され得る。本実施形態に適した較正プロトコルの代表的な例は、以下の実施例のセクションで提供される（実施例２参照）。

【0132】

システム３２０は、任意選択で好ましくは、追加のイメージャ７１を利用する追加のイメージングチャネルを含み得る。イメージャ７１は、チューブレンズ４０の像平面に位置決めすることができる。この構成において、ミラー４１（例えば、図１参照）は、光信号の一部をイメージャ７１にも向け直すために、チューブレンズ４０の像平面の前に配置されたビームスプリッタ４７に置き換えられる。この追加のイメージングチャネルは、サンプル１０１の非スペクトル画像（例えば、１画素あたり３つの強度値を有するＲＧＢ画像、または１画素あたり１つの強度値を有するグレースケール画像）を得るために使用され得る。好ましくは、イメージャ７１は、例えば透過モードにおいて、明視野光源８０と併せて利用される。これは、サンプル１０１が透過モードでイメージング可能な染色剤（例えば、Ｈ＆Ｅなど）で染色される場合に、特に有用である。

【0133】

図８は、システム３２０が、サンプル上に投影されるパターンを使用する本発明の実施形態による、システム３２０の概略図である。図示の実施形態では、プロジェクタシステム８８が、イメージャ７０及び／または７１上に生成された画像の焦点を測定し補正するために使用される。プロジェクタシステム８８は、追加の光源８４と、レンズ８６と、パターン化要素８３と、ビームスプリッタ８５とを含む。システム８８は、レンズ８６の像平面８７が、ビームスプリッタ８５による方向転換の後にレンズ１２の像平面と一致するように配置することができ、その結果、像平面８７に配置された対象物がサンプル平面上に鋭い影を作り出す。パターン化要素８３は、例えば、限定されないが、ガラス基板上のクロムマスクなど、透過材料と非透過材料との交互の線から作られた粗い線状グリッドを含むことができ、パターン化要素８３のパターンがサンプル１０１上に投影されると、それがイメージャ７１によってイメージングされ得るような線幅及び頻度でカバーされる。例えば、パターン化要素８３は、イメージャの視野を横切る約１０～約１００本の線を含むことができる。パターン化要素８３は、レンズ８６の光軸に対して斜めの角度φで、像平面８７に配置される。典型的なφの値は、９０°を除いて、約８０°～約１００°である。斜角は、像平面８７にある、または像平面に近い、パターン化要素８３の小さな部分のみがサンプル平面に集束され、一方、パターンの他の部分は次第にデフォーカスされることを保証する。

【0134】

サンプル１０１は、通常、均一な厚さを有しないので、パターン化要素８３の傾斜は、サンプルの任意の所与の高さにおいて、焦点が合った投影パターンの一部が存在することを保証する。画像内のその部分の位置は、焦点を改善することができる補正の量及び方向の両方に関する情報を提供する。

【0135】

使用時には、イメージャ７１は、サンプル１０１上の要素８３のパターンの投影をイメージングする。投影パターンの異なる部分のデフォーカスパラメータを決定するために、画像が分析される。例えば、分析は、グリッド線の方向に沿って強度を平均化し、線を横切る強度のベクトルを得ることを含み、これにより、ノイズに対する信号が改善され、基礎となるパターンの影響が除去される。この分析はまた、投影されたグリッドの画像上の各線または線群にデフォーカスパラメータを割り当てること、及び最良の焦点が得られる画像内の領域を識別することを含むことができる。最良焦点が達成される領域と公称最良焦点領域との間の距離は、デフォーカスの直接的な尺度であり得、コントローラ２００は、例えば、ステージ１１０をＺ軸に沿って移動させることによって、この差を最小化するように動作し得る。これは、システム３２０の動作の間に、任意選択で好ましくは連続的にまたは繰り返し実行される。スペクトル画像の画像データの取得に対する外乱を低減するために、集束チャネルは、任意選択で好ましくは、測定スペクトル範囲を超えるスペクトルの一部、例えば赤外線で動作される。集束測定は、ステージ１１０の運動中に、または測定停止間に、行うことができる。

【0136】

図３に示すサニャック干渉計は十分な結果を得ることができるが、本発明者は、従来のサニャック干渉計を改善できることを見出した。従来のサニャック干渉計の３つの主な光学要素（２つのミラー５０１及び５０２、及びビームスプリッタ５０３）は、典型的には、３つの独立した光学要素として実装される。本発明者は、この配置が、特に環境温度の変化及び輸送中に、これらの光学要素の互いに対する位置合わせ不良に敏感であり得ることを見出した。したがって、本発明者は、従来の干渉計と比較して、振動、衝撃及び温度変動に対してより安定で強固なモノリシックサニャック干渉計を考案した。

【0137】

図１０～図１３、図１５Ａ～図１５Ｂ及び図１７は、システム５０がモノリシックサニャック干渉計を含む本発明の実施形態における光学システム５０の概略図である。図示の実施形態では、光学システム５０は、２つの取り付けられたプリズム５１、５２、を含み、プリズム５１に入射端面５１０、及びプリズム５２に出射端面５２０を有する非対称モノリシック構造を共に形成する。光学システム５０は、プリズム５１とプリズム５２との間の取り付け領域５１４の一部に係合するビームスプリッタ５１２も備える。典型的には、光信号（例えば、像平面４２で結像される光信号）は、レンズ６１によってコリメートされ、入射端面５１０を通ってモノリシック構造に入射する。光信号は、モノリシック構造体内で、サニャックループを実行し、出射端面５２０を通って出る２つの二次光信号に分けられる。二次光信号は、次に、レンズ６２によって集束され、イメージャ７０によって検出される。

【0138】

ビームスプリッタ５１２は、入射端面５１０を通って入射する光信号を、出射端面５２０を通って出射する２つの二次光信号に分割するように構成されている。図１１及び図１２を参照する。２つの二次光信号は、モノリシック構造内でサニャックループを実行し、端面５２０において間隔を置いて配置された点Ｉ及びＪを通って出射する。ビームスプリッタ５１２のサイズは、二次光信号の光路が、ビームスプリッタ５１２によって係合される位置５１６、及びビームスプリッタ５２０によって係合されない位置５１８の両方で、取付領域５１４に確実に当たるように選択されることが好ましい。

【0139】

モノリシック構造の非対称性は、１つ以上の方法で確保できる。本発明のいくつかの実施形態では、図１０～図１３に示され、２つのプリズムが異なる形状を有する。例えば、取付領域５１４と端面５１０及び５２０との間の角α１、α２は、それぞれ、異なり得る。α１とα２との間の差の絶対値を２ｄで表すと、ｄθ＝｜α１－α２｜／２となり、本発明者は、許容可能なＯＰＤ範囲が、差１分≦ｄθ≦２０分の範囲内でｄθの値を選択することにより、許容可能なＯＰＤ範囲が得られることを発見した。代替的または追加的に、取付領域５１４の反対側であり、プリズム５１及び５２の隣接する端面の間でそれぞれ画定される角度β１、β２は、異なっていてもよい。図１５Ａ～図１５Ｂ及び図１７に示す別の実施形態では、プリズム５１及び５２は同一であるが、互いにずれた関係で取り付けられており、入射端面５１０とプリズム５２に取り付けられたプリズム５１の端面との間に形成される頂点Ａ１は、出射端面５２０とプリズム５１に取り付けられるプリズム５２の端面との間に形成される頂点Ａ２に対してずらされている。ずれの量（図１７のＡ１とＡ２との間の距離）は、数百マイクロメートル（例えば、約２００μｍ～約５００μｍ例えば、約４００μｍ）であることが好ましい。

【0140】

本明細書の実施形態のいずれかにおいても、取り付け面における個々のプリズム５１及び５２の角度の合計は、（図１０～図１３、図１５Ａ～図１５Ｂ及び図１７におけるα１＋α２）は任意選択で約９０°である。

【0141】

本発明のいくつかの実施形態では、モノリシック構造は、取付領域５１４にスペーサ５２２（図１７）を含み、スペーサ５２２は、モノリシック構造内の二次光信号の光路のいずれかからも離れて、ビームスプリッタ５１２から間隔を置いて配置される。これらの実施形態の利点は、プリズム５１及び５２の取り付けられた端面を、互いに平行になるように容易に位置合わせできることである。好ましい実施形態では、スペーサ５２２は、ビームスプリッタ５１２と同じ材料及び厚さで作られ、したがって、プリズム５１及び５２の取り付けられた端面間の距離が、ビームスプリッタ５１２の領域内とスペーサ５２２の領域内とで同じであることが保証される。

【0142】

次に、図１１を特に参照すると、２つのプリズム５１及び５２がＡＤで指定された端面上に取り付けられている。取り付けは、システムの意図されたスペクトル範囲において透明であり、プリズムの屈折率と同様の屈折率を有する光学接着剤によって行うことができる。プリズム５１及び５２の形状は、端面５１０から入射する光信号の方向と、端面５２０から出射する光信号の方向との間の角度が約９０°となるように選択されることが好ましい。モノリシック構造は、いくつかの実施形態では、ペンタプリズムの形状を有し得る。

【0143】

プリズム５１及び５２は、同一の光学材料、例えば、ガラス、石英、または可視範囲で透過する他の材料、あるいはＩＲ透過材料またはＵＶ透過材料で作ることができる好ましくは、入射端面５１０、及び出射端面５２０は、反射防止コーティングによってコーティングされる。好ましくは、反射コーティングは、二次光信号が内部反射される端面（本例では、端面ＥＦ及びＣＢ）に適用される。ビームスプリッタ５１２は、プリズム５１及び５２の一方の取付端面の一部の上のコーティングとして具体化することが可能である。ビームスプリッタ材料によって被覆される取付端面の部分をＡＧと呼ぶ。

【0144】

ビームスプリッタ５１２が取付領域５１４の一部のみと係合する構成により、二次光信号は、反射端面ミラーＦＥ及びＢＣで反射した後、プリズム５１及び５２の間を自由に通過することができる。Ｇの最適な位置は、好ましくは、入射端面５１０における光信号の幅及びその角度広がりに基づいて選択される。長さＡＧの典型的な値は、端面５１０の長さの約５５％～約１１５％、より好ましくは端面５１０の長さの約７０％～約１００％である。ビームスプリッタ５１２のサイズの最適化に関するさらなる詳細が、以下の実施例のセクションに提供される（実施例４参照）。

【0145】

角度α１及びα２の典型的な値は約４５°、角度β１及びβ２の典型的な値は約１１２．５°、角度γ１及びγ２の典型的な値は約２２．５°である。

【0146】

本実施の形態のモノリシック構造の動作原理は、図１２及び図１３を参照すると良く理解することができる。図１２には、端面５１０を通って入射し、点Ｈでビームスプリッタ５１２に当たる光信号の代表的な光線が示されている。次に説明するように、光線は２つの二次光線に分割され、時計回りの経路と反時計回りの経路とに沿って伝搬する。時計回りの経路は、プリズム５１内のビームスプリッタ５１２からの反射、反射端面ＦＥからの反射、領域５１８を通ってプリズム５２への伝搬、反射端面ＢＣからの反射、プリズム５２内のビームスプリッタ５１２からの反射によって始まり、出射ファセット５２０の点Ｉ_ｎに向かう。時計回りの経路は、二次光線がビームスプリッタ５１２によって２回反射されるので、本明細書では反射経路とも呼ばれる。反時計回りの経路は、プリズム５１からプリズム５２へのビームスプリッタ５１２を介した透過、反射端面ＢＣからの反射、領域５１８を介したプリズム５１への伝搬、反射端面ＦＥからの反射、プリズム５１からプリズム５２へのビームスプリッタ５１２を介した出射端面５２０の点Ｊ_ｎへの透過によって始まる。反時計回りの経路は、二次光線がビームスプリッタ５１２によって２回透過されるので、本明細書では透過経路とも呼ばれる。

【0147】

経路は、入射端面５１０への入射角θ_ｎに依存し、出射端面５２０における出射点Ｉ_ｎ、Ｊ_ｎも同様である。本発明者らは、コンピュータシミュレーションにより、広範囲の条件に対して、両方の光線が互いに平行であるが、距離ｄＸ＝Ｊ_ｎ－Ｉ_ｎが変化することに伴って端面５２０から出射することを見出した。発明者らは、ｄＸはプリズムの形状（例えば、角度α１、α２、β１、β２の値）に依存するが、入射角θに依存しないことを見出した。

【0148】

プリズム５２を出る２つの光線は、レンズ６２によってイメージャ７０上に集束される。それらは互いに平行であるので、それらはイメージャ７０の同じ画素に到達して、干渉計内ではなくイメージャで干渉が生じる。

【0149】

図１３を参照すると、光線の間の相対位相は、光線が点Ｈで分割された時点からイメージャ７０上で干渉する時点までに蓄積された光路差（ＯＰＤ）に依存する。ＯＰＤに対する２つの寄与がある。第１の寄与は、点Ｈから各光線が端面５２０上の点Ｉ_ｎ及びＪ_ｎに到達するまでの累積長さの差であり、第２の寄与は、端面５２０と、２つの二次光線が光線の伝搬方向に垂直な同じ波面に到達する位置との間の累積長さの差である。第２の寄与は図１３に示され、Ｉｎを通って出る光線上の出射点Ｊｎの投影はＫ_ｎで示され、セグメントＫｎ－ＩｎはＯＰＤ１として示される。基本的なレンズ光学システムによれば、イメージャへの経路の残りは同一である。発明者は、ＨからＩ_ｎ及びＪ_ｎまでの累積長さが類似しているので、ＯＰＤへの主な寄与が短いセグメントＯＰＤ１であることをコンピュータシミュレーションによって見出した。したがって、ＯＰＤは、およそ

【数1】

となる。発明者は、広い範囲の条件の下で、出射光線の方向θ_{ｅｘｉｔ，ｎ}が入射角θ_ｎに等しいかまたはほぼ等しいこと、したがって

【数2】

であることを見出した。ｄＸは通常θ_ｎに依存しないため、光路差ＯＰＤと入射角の正弦との間には線形依存性があり、θ_ｎの値が十分に小さい場合、光路差ＯＰＤと入射角との間には線形依存性がある。

【0150】

発明者は、プリズムが同じ材料で作られ、入射面のサイズが５０ｍｍ程度である場合、ＯＰＤへの非線形寄与は可視光の波長よりもはるかに小さいため、干渉パターンに影響を与えないという、典型的な条件を見出した。したがって、関連する角度範囲内のほぼ均一な照射の条件下では、均一な間隔の干渉縞がイメージャ７０の表面上に形成される。

【0151】

本実施形態のモノリシック構造は、米国特許第１１，３００，７９９Ｂ２号に記載のマイケルソン型干渉計に勝る多くの利点を享受する。第１の利点は、マイケルソン型干渉計の特許では、２つのプリズム間のシフトに対して高い感度が存在することである。このことは、十分な性能を得るには数マイクロメートルの製造精度を必要とするので、製造が困難になる。マイケルソン型干渉計のもう１つの問題は、シフトが２つのプリズム間のサイズ差に適合しなければならず、そのため、プリズム間のサイズ差の許容誤差も補償しなければならないことである。その結果、マイケルソン型干渉計の製造は、結果として生じる縞の検査下でのプリズムの組み立てを含まなければならず、数ミクロン以内の精度が要求される。本実施形態のモノリシック構造は、数十マイクロメートルのシフトを許容し、これは標準的な組立ジグを使用して達成することができる公差であり、検査下での組み立てを必要としない。

【0152】

さらに、７９９特許のマイケルソン型干渉計内の光路は、５つの反射面を含む複雑な光路である。本実施形態のモノリシック構造内の光路は、３つの反射面のみを含み、反射端面の角度公差の影響をあまり受けない。したがって、マイケルソン型干渉計は、反射回数が増えるにつれて収差が非常に増加しやすい。

【0153】

別の利点は、本実施形態のモノリシック構造において、入射光線と出射光線とが互いに対して概ね垂直であることである。これは、入射角と出射角との間に約４５°の傾きがあり、全体の光学セットアップにおいてデバイスがコンパクトにならないマイケルソン型干渉計よりも有利である。

【0154】

本明細書で使用する場合、用語「約」は±１０％を指す。

【0155】

「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語及びそれらの同根語は、「限定ではないが、～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」を意味する。

【0156】

「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、「を含み（備え）、～に限定される」ことを意味する。

【0157】

用語「本質的に～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物、方法または構造体が、追加の成分、ステップ及び／または部品を含むことができることを意味するが、追加の成分、ステップ及び／または部品が、特許請求された組成物、方法または構造体の基本的かつ新規な特性を実質的に変えない場合に限る。

【0158】

本明細書で使用する場合、文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、「ある、１つの（ａ）」、「ある、１つの（ａｎ）」及び「この、その（ｔｈｅ）」という単数形には、複数の指示対象が含まれる。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」という用語は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。

【0159】

本願を通して、本発明の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対して変更できない制限として解釈するべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、全ての可能な部分的範囲を具体的に開示していると見なすべきである。例えば、１～６等の範囲の記述は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等の部分的範囲、及びその範囲内の個々の数字、例えば、１、２、３、４、５、及び６を、具体的に開示していると見なすべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

【0160】

本明細書で数値範囲が示されるときはいつでも、それは、示された範囲内の任意の引用された数字（分数または整数）を含むことを意味する。第１の表示番号と第２の表示番号との「間の範囲（ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ）」という句、及び第１の表示番号「から」第２の表示番号「まで（ｔｏ）」の「範囲（ｒａｎｇｉｎｇ／ｒａｎｇｅｓ ｆｒｏｍ）」という句は、本明細書では互換的に使用され、第１の表示番号及び第２の表示番号と、それらの間の分数及び整数の数字のすべてを含むことを意味する。

【0161】

明確にするために別個の実施形態の文脈において説明される本発明のある特徴を、単一の実施形態において組み合わせで設けることもできることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の文脈において説明される本発明の様々な特徴を、別々に、または任意の好適なサブコンビネーションで、または本発明の任意の他の説明された実施形態において好適なものとして設けることもできる。様々な実施形態の文脈で説明される特定の特徴は、実施形態がそれらの要素なしでは機能しない場合を除いて、それらの実施形態の本質的な特徴と見なすべきではない。

【0162】

上記で説明され、以下の特許請求の範囲で特許請求される本発明の様々な実施形態及び態様は、以下の実施例で実験的裏付けを見出す。

【実施例】

【0163】

ここで、以下の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明とともに、本発のいくつかの実施形態を非限定様式で例示する。

【0164】

実施例１
代表的なプロトコル
以下は、システム３２０を使用して実行し得る例示されたプロトコルである。

【0165】

（ａ）スライドを複数の免疫組織化学的染色剤で染色する。各染色剤は、特定のタンパク質に特異的な抗体、あるいは特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に結合する抗体、あるいは異なる生物学的組織切片に結合する抗体（例えば、ＦＩＳＨ）抗体を含む。異なる抗体に接続された蛍光レポータは、例えばフローサイトメトリーで行われるように、スペクトルの分離を可能にするために、それらの異なるスペクトル特性の性質によって十分に分離可能であるべきであることに留意されたい。任意選択的に、同じスライド上でヘマトキシリン、エオシンなどの吸収染色剤でさらに染色する。

【0166】

（ｂ）システム３２０を使用してサンプルを走査して、各光源に対するサンプルのスペクトル画像を得る。

【0167】

（ｃ）画像の各点に対する一連のスペクトルを計算し、各スペクトルは、光源の１つ（または組み合わせ）を用いた照射に対応する。

【0168】

（ｄ）オプションのローカルフィルタリング。固定ウィンドウでの平均化、平滑化関数による畳み込み、中央値または最近傍値などの局所フィルタリングを使用して、横方向（ＸＹ）及び／またはスペクトル次元のノイズを除去する。

【0169】

（ｅ）対象物内の各点で測定したスペクトルのスペクトル分析により、使用した各バイオマーカーの密度を求める。この分析は、この分析では、スペクトル分離アルゴリズムを利用できるだけでなく、異なる励起光源や画像分析アルゴリズムを使用した異なる測定値間の相互参照も利用できる。

【0170】

このプロトコルの出力は、サンプルの全領域にわたる各バイオマーカーの密度マップを提供することができる。

【0171】

実施例２
代表的な較正プロトコル
以下は、システム３２０が分光計を含む実施形態において、システム３２０を使用して実行できる例示的なプロトコルである。

【0172】

（ａ）任意選択的に、較正サンプルを基板１００上に置く。

【0173】

（ｂ）上でさらに詳述したように、システム３２０を使用してサンプルを走査してスペクトル画像を取得する。

【0174】

（ｃ）レビューのために関心のある箇所を（手動または自動で）特定する。

【0175】

（ｄ）第１の関心点が視野内にあり、サンプル空間内の収集ピンホール４５の像によって画定される収集領域の中心と互換性のある位置にあるように、ステージ１１０を移動する。

【0176】

（ｅ）分光計９０を使用してスペクトル（または異なる光源を使用して複数のスペクトル）を収集する。

【0177】

（ｆ）ステージ１１０を次の関心点に移動させ、すべての関心点が測定されるまで（ｄ）と（ｅ）とを繰り返す。

【0178】

（ｇ）走査モードを使用して得られたスペクトルと、（ｄ）～（ｆ）で分光計によって収集されたスペクトルとの間の類似性を比較し、スペクトル測定の精度を評価するために、差異と類似性の性能指数を提供する。

【0179】

（ｈ）任意選択で、走査中にシステム３２０によって測定されたスペクトルを入力として受け取り、選択されたメリット関数に従って、分光計を使用して同じ場所で測定されたであろうスペクトルにより近い補正されたスペクトルを返す補正関数を構築する。

【0180】

（ｉ）任意選択で、追加の分析の前に、走査中にシステム３２０によって測定されたすべてのデータに対して（ｈ）で構築された補正関数を利用する。

【0181】

実施例３
代表的なサンプル分析プロトコル
図６は、本発明のいくつかの実施形態による例示的なサンプル分析プロトコルを示すフローチャートである。

【0182】

フローは、任意選択で好ましくは、上記でさらに詳述した染色及び走査から始まり、各光源のスペクトル画像をもたらす。データ収集は複数回の走査反復で実行できることに留意されたい。例えば、最初の反復ではいくつかのバイオマーカーを使用し、各バイオマーカーを異なる（蛍光）レポータで色分けし、その後、（蛍光）レポータの一部またはすべてを除去する洗浄操作を行うことができる。その後、例えば２回目の染色操作を使用するか、サンプルに既に結合している他の抗体に同じまたは異なるレポータを結合させることによって、新しいセットのバイオマーカーを活性化することができる。次いで、同じサンプル上に追加のバイオマーカーをマッピングするために、走査の第２の反復を実行できる。反復プロセスの別の例は、蛍光レポータを適用して測定する少なくとも１つの操作と、吸収染色（例えばヘマトキシリン＆エオシン、Ｈ＆Ｅ）をサンプルに適用して、明視野（ＢＦ）モードで測定する別の操作とを含む。蛍光バイオマーカーがサンプルに適用された後にＢＦ測定が行われる場合、Ｈ＆Ｅ染色の前にＢＦ中のサンプルを測定すると、２つの測定モード間のクロストークを排除するために、染色後に画像から後で、背景画像を除去することができる場合がある。蛍光染色前にＨ＆Ｅ染色サンプルを蛍光モードで測定すると、初期の染色（吸収染色など）から、または未染色組織内の蛍光分子によって引き起こされる自己蛍光から後の染色（例えば蛍光染色剤）へのクロストークを低減する参照画像が提供される可能性がある。

【0183】

データ収集に続いて、単一値分解（ＳＶＤ）などのスペクトル分解法を使用して、スペクトル画像から、各バイオマーカーの密度マップを抽出して分析を続ける。あるいは、走査に続いて、サンプルの各点からのデータベクトルを直接分析することができる。この場合、データベクトルはスペクトル領域に変換されない。代わりに、このシステムには、サンプルに適用された異なる染色に対応する一連の予想データベクトル（例えば、インターフェログラム）が含まれており、各バイオマーカーの密度の抽出は、各点で測定された生データベクトルを、期待データベクトルの組み合わせとしてフィッティングすることによって、データベクトル空間内で行われる。任意の点における測定されたベクトルに対する期待される各生データベクトルの寄与を抽出することは、他の方法を使用して、例えば、これに限定されないがニューラルネットワークなどの機械学習の使用によって行うこともできる。

【0184】

次に、画像は、任意選択で好ましくは、古典的なセグメント化手法または機械学習を使用して、核、細胞質、膜などの個々の細胞または細胞部分にセグメント化される。次に、バイオマーカー値が、各セグメントにわたって平均化され、各細胞または細胞の一部のバイオマーカープロファイルを作成する。セグメント化プロセスからの追加の任意選択の出力は、各細胞の形態学的特徴のセットである。セグメント化ステージへの入力は、任意選択的に複数の密度マップを含み得るので、一部のバイオマーカーの密度マップでは形態が他のものよりも顕著である可能性があるため、この段階で抽出できる情報は多い。したがって、形態学的パラメータは、例えば、各バイオマーカーに対する不均一性、及び任意の密度マップで独立して観察されるようなテクスチャを特定する追加のパラメータを含み得る。

【0185】

明視野画像から分析されるバイオマーカーの１つは、任意選択で好ましくは、がん細胞と正常細胞との間の予備的分類を可能にするヘマトキシリンであり得る。労働集約的な手動のタグ付けを使用するのではなく、個々のがん細胞を自動的に識別する能力により、本実施形態のシステムは、効果的な教師なし機械学習を実行することが可能になり、分類のプロセス及び追加の分析タスクが、より迅速かつ効果的になる。

【0186】

類似したプロファイルを有する細胞のグループを特定するか、またはサンプル内のプロファイルをデータベース内の既知のプロファイルと比較することにより、強化されたバイオマーカープロファイル（任意選択で形態学的パラメータを含む）に基づいて、より高度な分類を行うことができる。類似のバイオマーカープロファイルを有するが、データベース内の既知の細胞クラスのいずれとも相関しない、特定された細胞グループは、ユーザに特定を促すことができ、それらの共通特性を後で参照できるようにデータベースに保存することができる。他の症例で見つかったバイオマーカープロファイルクラスと、それらの潜在的な識別情報のクラウドストレージとを利用して、患者のプライバシーを侵害することなく、医療現場間で知識を共有できるようにすることもできまる。細胞分類は、例えば、これら２つのバイオマーカーの密度から作成できる再構成されたＨ＆Ｅ画像の上に重ね合わせて、ユーザに視覚的に表示できる。細胞クラスは、任意選択で好ましくは、細胞の領域の偽色を使用して表示され、細胞の各クラスに塗りつぶしの色と周囲（膜）の色との固有のセットを割り当てる。

【0187】

細胞クラスが識別されると、異なる細胞クラス間の相互作用を測定することができる。例えば、識別されたがん細胞の密度が、より高い、より大きな領域は、腫瘍組織として識別され得、一方他の大きな領域は正常組織として識別され得る。その後、腫瘍組織と正常組織との間で、さまざまな細胞タイプの相対密度を比較することができる。異なる種類の細胞間の平均距離またはそれらの低解像度密度マップのおける相関関係を測定することもでき、一緒に見つかる傾向にある細胞のタイプ（がん細胞や免疫系細胞など）を特定できる。

【0188】

サンプルの上記の特性を含むデータセットを作成し、腫瘍の特性と腫瘍内の異なる細胞型間の相互作用とを一般的に要約した腫瘍のフィンガープリントとして定義することができる。

【0189】

任意選択で、プロトコルは、腫瘍のフィンガープリントパラメータと、所定の治療に対するさまざまな患者の反応との間の相関関係を探索する。遡及的または前向き臨床研究により、腫瘍フィンガープリント特徴を特定することを可能にするデータを提供することができ、それに基づいて、特定の治療が成功する可能性を予測することができる。予測は、任意選択で好ましくは、限定されないが、機械学習などの人工知能手法に基づくことができる。

【0190】

実施例４
コンピュータシミュレーション
以下に、モノリシック干渉計について本発明のいくつかの実施形態に従って実行されるコンピュータシミュレーションの説明を示す。

【0191】

非同一プリズム
非同一プリズムの場合についてシミュレーションを行った。１組のシミュレーションでは、以下の角度を用いた。すなわち、β１＝β２＝１１２．５°、α１＝４５＋ｄθ及びα２＝４５－ｄθ、または逆に、α１＝４５－ｄθ及びα２＝４５＋ｄθ、である。

【0192】

図１４Ａ及び図１４Ｂは、ビームスプリッタの角度が４５．０３３３°である干渉計の構成において、モノリシックサニャック干渉計に対して実施された光線追跡シミュレーションの結果を示す。シミュレーションは、約１０分角であるｄθが約１０μｍの合計ＯＰＤを提供できることを示しており、これは約５０ｍｍの入射面に対して平面の半分で約２０の干渉縞をサポートする。

【0193】

干渉計の主要パラメータに必要な許容誤差を設定するために、感度解析を行った。各許容係数が、シミュレーション範囲－０．０５～＋０．０５ラジアン（約＋／－３度）のどの入射角においても、ＯＰＤに０．５μｍ以上の影響を与えないことを要求する。

【0194】

いくつかの要因がランダムに追加されると仮定すると、製造された個々の干渉計に対する累積効果は、公称ＯＰＤが約１０μｍであるのに対し、約１μｍになると予想される。

【0195】

以下の結果は、ＯＰＤに約０．５μｍの変化を引き起こす公称値からの偏差に関するシミュレーションによって得た。
β１＝１５秒角（０．２５秒角）
β２＝１５秒角（０．２５秒角）

【0196】

同様に、１５秒角のα１の許容値は、β１によって補償されず、上部反射鏡ＥＦの表面が傾く原因になると仮定すると、同じ影響を引き起こすことが判明した。この場合、入射面への追加の影響は無視できる。

【0197】

シミュレーションでは、取り付け面に沿った１つのプリズムの相対的なずれによってＯＰＤが変化することも確認され、２０μｍシフトするとＯＰＤが０．５μｍ変化した。

【0198】

個々の干渉計の間の差異は、システム製造中に較正することができ、主にシステムのスペクトル較正に影響を与える。干渉計はモノリシックであるので、出荷後または温度変化後に再較正は必要とされない。

【0199】

ずれた関係にある同一プリズム
同一プリズムの場合についてシミュレーションを行った。１組のシミュレーションでは、以下のパラメータα１＝α２＝４５°、及び４００μｍのずれｄＳを使用した（図１５Ａ及び図１５Ｂ）。シミュレーションによると、４００μｍのオフセットにより、－／＋０．０５ラジアンの入射角に対して＋／－１０μｍのＯＰＤが生成される。

【0200】

この構成は、同一のプリズムの作製が容易であり、０．４ｍｍのずれの制御が比較的容易であるため、製造精度の点で有利である。感度は上記でシミュレーションした通りのままであるので、ユニット間の一貫した結果を得るには、シフトは４００＋／－２０μｍである必要がある。さらに、シミュレーションは、すべてのプリズム角度に対する約１５秒角の許容誤差が、約１０％以内の同様のＯＰＤを提示することを示している。さらに、単一ブロックの一部として両方のプリズムを製造することで生じる対称的許容差は、互いに打ち消し合い、ＯＰＤに影響を及ぼさないことが判明し、したがって製造性が向上する。

【0201】

このシミュレーションでは、ＯＰＤがずれｄＳに線形的に依存することも示している。一方、ＯＰＤは干渉計のスケールに依存しないため、２倍大きな干渉計でも、同じずれｄＳと同じ入力角とに対して、同じＯＰＤを生成することができる。両方のプリズムで屈折率が同一である限り、屈折率はＯＰＤに影響しない。約５０ｍｍの入射端面サイズでＯＰＤを大きく変化させないプリズム間の屈折率の許容差は、約５＊１０^－４であり、約１＊１０^－３以下である。差が大きくなると、ＯＰＤが大幅に異なり、入力角度に対するＯＰＤの非線形依存性が生じ、出力ＣＷ光線とＣＣＷ光線とが異なる角度で干渉計を出る可能性がある。この許容差は、干渉計のスケールに反比例するため、２倍大きい干渉計の場合、許容できる差は半分になる。２つのプリズムが光学グレード材料の同じブロックから製造される場合、この実施形態は容易に満たされる。

【0202】

ビームスプリッタの推奨サイズ
ビームスプリッタの最適なサイズは、干渉計への入力光線角度の範囲と入力光線位置の範囲との両方を含むシミュレーションを実行することによって決定した。入射ビーム幅が干渉計のサイズより大幅に小さく、角度範囲が小さいスパース構成の場合、ビームスプリッタのサイズは、広範囲の値から問題なく選択できる。よりコンパクトな構成では、ビームの断面及び／または角度広がりが入射端面のサイズに比べて小さくない場合、ビームスプリッタの長さは、入射端面の長さの約８０％であることが好ましい。

【0203】

例えば、図１６Ａに示すように、入射面の高さの３０％付近（ＡＦ＝５０ｍｍの場合、ＡからＡＦに沿って１５ｍｍ）で干渉計に入射し、ＡＦの２０％の幅（この構成では１０ｍｍ）を有し、＋／－０．０５ラジアンの角度広がりを有するビームについて、高さの約５６％に点Ｇを特定することができ、この点Ｇは、ビームスプリッタを通過することを意図したすべての光線がその点より下の面ＡＤに当たり、ビームスプリッタを通過することを意図していないすべての光線がそれより上に行くように光線を分離する。したがって、ビームスプリッタの端部である点Ｇは、直角の頂点Ａから５６％＊ｓｑｒｔ（２）＊ｌｅｎｇｔｈ（ＡＦ）の距離にあることができ。

【0204】

角度範囲を＋／－０．０７５に増加させても（図１６Ｂ）、または光源を３０ｍｍ離して取り除いても（図１６Ｃ）、点Ｇの最適な位置は大きく変化しない。

【0205】

マイケルソン型干渉計との比較
シミュレーションは、図１８に光線追跡シミュレーションと共に示されるマイケルソン型モノリシック干渉計と、本実施形態のサニャックモノリシック干渉計（例えば、図１７を参照）との間の比較研究として実施した。

【0206】

マイケルソン型モノリシック干渉計のシミュレーション結果を図１９Ａ及び図１９Ｂに示す。ここで、図１９Ａは、公称ケースの入射角の関数としてＯＰＤを示し、図１９Ｂは、２つのプリズム間の位置（スライド）に１０μｍの誤差がある角度の関数としてのＯＰＤを示す。図１９ＡのＯＰＤ範囲は２１．６７２６μｍであり、図１９ＢのＯＰＤ範囲は１８．８２５７μｍである。図１９Ｂに示すように、ＯＰＤ＝０はもはや利用可能ではなく、これは欠点である。

【0207】

本実施形態のサニャックモノリシック干渉計のシミュレーション結果を、図１９Ｃ及び図１９Ｄに示す。ここで、図１９Ｃは、公称ケース（ずれｄＳが４００μｍ）の入射角の関数としてＯＰＤを示し、図１９Ｄは、ずれ（ｄＳ＝４２０μｍ）における位置誤差が２０μｍであるＯＰＤの角度関数を示す。図１９ＣのＯＰＤ範囲は２４．５９２８μｍであり、図１９ＢのＯＰＤ範囲は２３．４２１７μｍである。図示するように、製造上の不正確さの結果、範囲内の差異は５％以内であり、ＯＰＤ＝０が利用可能である。結果として生じる変化はＯＣＤ＝０に対して対称的であるが、これは必須ではないことに留意されたい。ＯＰＤ＝０が中心からシフトする状況が、最大絶対ＯＰＤを拡張するため、場合によっては有益となる場合があるためである。そのような状況は、入力ビームに対して干渉計全体を回転させ、入力角度の範囲を非対称にすることによって実現できる。

【0208】

実施例５
モノリシックサニャック干渉計の解析的考察
図１５Ａ及び図１５Ｂに示すように、２つのプリズム間に所与のスライディングシフトｄＳがあり、ビームスプリッタ面に沿ってＯＰＤが干渉計を通る。

【0209】

スライドシフトｄＳにより、反射面はｓだけ通常の動きをする。これはｓ＝ｄＳ＊ｓｉｎ（π／４－φ）＝ｄＳ＊ｓｉｎ（π／８）であることがわかる。ここで、φは反射面の角度で、通常は約π／８ラジアン、π／４ラジアンはビームスプリッタの角度である（すべての角度は正のｘ方向に対して測定される）。

【0210】

したがって、角度αで表面から反射する光線は、ｂ＝ｓ＊ｓｉｎ（２α）だけシフトされる。入射端面から角度θで入射した光線から分割された二次光線は、反射時計回りの経路を伝搬する場合は角度φ＋θで、透過反時計回りの経路を伝搬する場合は角度φ－θで、プリズムの内部反射面で反射する。ミラーのシフトの効果は、２つの経路に逆効果を生じさせる。

【0211】

したがって、出射面におけるビーム位置の総差Δｂは、以下の和になる。

【0212】

Δｂ＝ｓ＊ｓｉｎ（２（φ＋θ））＋ｓ＊ｓｉｎ（２（φ－θ））
これはリーディングオーダーに近似できる。

【数3】

したがって、リーディングオーダーでは、Δｂは入射角θに依存しない。通常、角度は約０．０５以下と非常に小さいため、次の次数の補正は無視できる。

【0213】

２つの二次光線間のＯＰＤは、ＯＰＤ＝Δｂ＊ｓｉｎ（θ）である。上の式をｓとΔｂに代入すると、次のようになる。

【0214】

ＯＰＤ＝２＊ｄＳ＊ｓｉｎ（π／８）＊ｓｉｎ（π／４）＊ｓｉｎ（θ）
したがって、θの値が小さい場合、ＯＰＤはθ及びｄＳに対して線形になる。

【0215】

典型的な値、例えばｄＳ＝４００μｍ及びθ＝０．０５ラジアンの場合、ＯＰＤ＝１０．８μｍが得られ、これは例４のシミュレーションと互換性がある。

【0216】

本発明をその特定の実施形態に関連して説明したが、多くの代替案、修正及び変形が当業者には明らかであろうことは明白である。したがって、添付の特許請求の範囲の趣旨及び広い範囲に含まれるそのような全ての代替案、修正及び変形を包含することが意図されている。

【0217】

本明細書に記述されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により本明細書に組み込まれることが示されているときに、これが明確かつ個別に注記されているかのように、参照によりその全体が本明細書に組み込まれることが出願人（出願人ら）の意図である。さらに、本願におけるいずれかの参考文献の引用または特定は、そのような参考文献が本発明の先行技術として利用可能であることの承認として解釈するべきではない。セクションの見出しが使用されている場合、それらは必ずしも限定的であると解釈されるべきではない。さらに、本願のいずれかの優先権書類（複数可）は、本明細書により、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0218】

参考文献
［１］Ｋｅｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ｃｅｌｌ １７４，１３７３－１３８７．
［２］Ｍｉｃｈａｅｌａ Ａｉｃｈｌｅｒ ａｎｄ Ａｘｅｌ Ｗａｌｃｈ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２０１５）９５，４２２－４３１
［３］Ｙ．Ｇａｒｉｎｉ ａｎｄ Ｅ．Ｔａｕｂｅｒ，Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｒ．Ｌｉａｎｇ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，２０１３）
［４］米国特許第５，５３９，５１７号
［５］Ｓｈｍｉｌｏｖｉｃｈ ｅｔ．ａｌ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，（２０２０）１０：３４５５
［６］ＷＯ２０２１／０１４４５５ Ａ１

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図19C】

【図19D】

【図20】

【国際調査報告】