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▶ ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポールの特許一覧 ▶ チョーチアン ユニバーシティの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-25
(54)【発明の名称】人工酵素・細菌系及びその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 35/745 20150101AFI20240917BHJP
A61P 1/12 20060101ALI20240917BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20240917BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240917BHJP
A61P 1/06 20060101ALI20240917BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240917BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240917BHJP
A61K 35/747 20150101ALI20240917BHJP
A61K 35/741 20150101ALI20240917BHJP
A61K 35/74 20150101ALI20240917BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240917BHJP
A61K 38/44 20060101ALI20240917BHJP
C12N 11/16 20060101ALI20240917BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20240917BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20240917BHJP
【ＦＩ】
A61K35/745
A61P1/12
A61P1/00
A61P1/04
A61P1/06
A61P29/00
A61P37/06
A61K35/747
A61K35/741
A61K35/74 A
A61K47/64
A61K38/44
C12N11/16
C12N1/20 E
C12N9/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024507083
(86)(22)【出願日】2022-09-02
(85)【翻訳文提出日】2024-04-02
(86)【国際出願番号】 SG2022050638
(87)【国際公開番号】W WO2023033745
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/116214
(32)【優先日】2021-09-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509034605
【氏名又は名称】ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポール
(71)【出願人】
【識別番号】514157940
【氏名又は名称】チョーチアン ユニバーシティ
【氏名又は名称原語表記】ＺＨＥＪＩＡＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【住所又は居所原語表記】ＮＯ．８６６ Ｙｕｈａｎｇｔａｎｇ Ｒｄ， Ｘｉｈｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１００５８， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002952
【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チェン シアオユアン
(72)【発明者】
【氏名】マオ チョンウェイ
(72)【発明者】
【氏名】カオ ファンファン
【テーマコード（参考）】
4B033
4B065
4C076
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B033NA23
4B033NB56
4B033NC03
4B033ND12
4B065AA21X
4B065AA30X
4B065BD44
4B065CA44
4C076AA99
4C076BB01
4C076CC16
4C076CC29
4C076EE23
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA44
4C084DC23
4C084DC24
4C084MA02
4C084MA52
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA661
4C084ZA662
4C084ZA681
4C084ZA682
4C084ZA721
4C084ZA722
4C084ZB081
4C084ZB082
4C084ZB111
4C084ZB112
4C084ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC55
4C087BC56
4C087BC59
4C087BC75
4C087MA02
4C087MA52
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZA66
4C087ZA68
4C087ZA72
4C087ZB08
4C087ZB11
4C087ZC75
(57)【要約】
人工酵素、プロバイオティクス細菌、並びに前記人工酵素及びプロバイオティクス細菌をコンジュゲートするリンカーを含む系を開示する。さらに、前記系を含む組成物。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ）レドックス反応を促進する人工酵素、ｂ）プロバイオティクス細菌、及び
ｃ）人工酵素及びプロバイオティクス細菌とコンジュゲートするリンカー、
を含む、系。
【請求項2】
前記人工酵素が、一つ以上の活性酸素種（ＲＯＳ）を除去する活性酸素種（ＲＯＳ）除去能を有する、請求項１に記載の系。
【請求項3】
前記人工酵素が、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）及びグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）からなる群から選択される活性酸素種（ＲＯＳ）除去酵素の活性酸素種（ＲＯＳ）除去能を有する、請求項２に記載の系。
【請求項4】
前記人工酵素が、グルタチオン（ＧＳＨ）、システイン（Ｃｙｓ）、ポリフェノール、及びビタミンＣからなる群から選択される抗酸化分子の活性酸素種（ＲＯＳ）除去能を有する、請求項２に記載の系。
【請求項5】
前記人工酵素がナノザイムを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の系。
【請求項6】
前記ナノザイムが、単原子ナノザイム（ＳＡｚｙｍｅ）、炭素系ナノザイム、及びクラスター系ナノザイムからなる群から選択される、請求項５に記載の系。
【請求項7】
前記リンカーがフェニルボロン酸官能基を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の系。
【請求項8】
前記リンカーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む、請求項７に記載の系。
【請求項9】
前記プロバイオティクス細菌が、Bifidobacterium、Lactobacillus、Komagataeibacter、及びLeuconostocからなる群から選択される属由来である、請求項１～８のいずれか一項に記載の系。
【請求項10】
前記プロバイオティクス細菌がBifidobacteriumである、請求項９に記載の系。
【請求項11】
前記Bifidobacteriumが、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium infantis、及びBifidobacterium animalisからなる群から選択される、請求項１０に記載の系。
【請求項12】
約１×１０７ＣＦＵのプロバイオティクス細菌に対して、人工酵素及びリンカーの量が約１０μｇ～約５００μｇである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の系。
【請求項13】
約１×１０７ＣＦＵのプロバイオティクス細菌に対して、人工酵素及びリンカーの量が約５０μｇである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の系。
【請求項14】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の系を含む医薬組成物。
【請求項15】
薬剤的に許容される担体をさらに含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項16】
治療上有効な量の請求項１～１３のいずれか一項に記載の系又は請求項１４若しくは１５に記載の医薬組成物を投与することによって、それを必要とする対象における疾患を治療する方法。
【請求項17】
前記疾患が胃腸管障害である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記胃腸管障害が、潰瘍性大腸炎の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ディスバイオシス、壊死性腸炎、急性感染性下痢症、抗生物質関連下痢症、乳児疝痛からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
約１．０×１０７～約３．０×１０８ＣＦＵ／ｋｇのプロバイオティクス細菌と、約１．０～約３．０ｍｇ／ｋｇの人工酵素及びリンカーと
を含む、有効量の前記系又は前記医薬組成物を投与することを含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
約２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇのプロバイオティクス細菌と、約１．２５ｍｇ／ｋｇの人工酵素及びリンカーと
を含む、有効量の前記系又は前記医薬組成物を投与することを含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
請求項１～１３のいずれか一項に記載の系を製造する方法であって、（ｉ）リンカーにコンジュゲートした人工酵素及び（ｉｉ）プロバイオティクス細菌をインキュベートすることを含み、前記リンカーが前記人工酵素及びプロバイオティクス細菌をコンジュゲートする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２１年９月２日に出願されたＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／１１６２１４の優先権の利益を主張し、その内容はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０２１年９月２日に出願されたＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２１／１１６２１４の優先権の利益を主張し、その内容はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、概して、バイオテクノロジーの分野に関する。特に、人工酵素系に関し、さらに詳細には、人工酵素とプロバイオティクス細菌とリンカーとを含む系を使用して胃腸管障害を治療するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【0003】
胃腸管障害には、些細な胃もたれやディスバイオシスから、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの重篤な状態まで及ぶ無数の状態が含まれる。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、クローン病（ＣＤ）や潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などの、消化管の炎症を引き起こす特発性腸障害の系統群である。そのような状態は、世界中の地域社会に健康及び経済的負担をかけ、患者の生活の質を大きく低下させる可能性がある。
【0004】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の現在の臨床治療は、主に炎症症状の管理に集中しており、一般に、根本的な原因は無視されている。さらに、これらの抗炎症薬や免疫抑制薬は完全に有効なわけではなく、これらの長期間の使用は、有害な副作用及び／又は重篤な合併症を引き起こす可能性がある。
【0005】
以上のことから、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に対して、より効果的な新規治療法を提供する必要がある。
【発明の概要】
【0006】
一態様において、本開示は：
ａ）レドックス反応を促進する人工酵素、
ｂ）プロバイオティクス細菌、及び
ｃ）人工酵素及びプロバイオティクス細菌をコンジュゲートさせるリンカーと
を含む系を指す。
ａ）レドックス反応を促進する人工酵素、
ｂ）プロバイオティクス細菌、及び
ｃ）人工酵素及びプロバイオティクス細菌をコンジュゲートさせるリンカーと
を含む系を指す。
【0007】
別の態様では、本開示は、本明細書中に開示する系を含む医薬組成物を指す。
【0008】
別の態様では、本開示は、治療上有効な量の本明細書中で開示する系又は医薬組成物を投与することによって、それを必要とする対象における疾患を治療する方法に関する。
【0009】
別の態様では、本開示は、本明細書中に開示する系を製造する方法であって、（ｉ）リンカーにコンジュゲートした人工酵素、及び（ｉｉ）プロバイオティクス細菌をインキュベートすることを含み、前記リンカーが前記人工酵素及びプロバイオティクス細菌をコンジュゲートさせる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0010】
本発明は、非限定的な例や添付の図面とあわせて考慮すれば、詳細な説明を参照してよりよく理解されるであろう。
【図1】図１は人工酵素・プロバイオティクス細菌系の概略図である。（ａ）は、本明細書中で開示する人工酵素・プロバイオティクス細菌系の一般的な構造を示す。（ｂ）リンカーがフェニルボロン酸官能基を有する人工酵素・プロバイオティクス細菌系の一例。（ｃ）は、リンカーがフェニルボロン酸官能基とＰＥＧとを有する人工酵素・プロバイオティクス細菌系のもう一つの例。図１は、本明細書中で開示する人工酵素・プロバイオティクス系の例示的構造を提示する。
【図2】図２は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）治療における人工酵素・プロバイオティクス細菌系の例示的な調製とその微小環境制御を示す画像である。（ａ）ＢＬ＠Ｂ－ＳＡは、人工酵素（例えば、ＦｅＳＡ）、プロバイオティクス細菌（例えば、Bifidobacterium longum（ＢL））、並びに人工酵素及びプロバイオティクス細菌をコンジュゲートさせるためのリンカー（例えば、Ｃ１８－ＰＥＧ－Ｂ）で構成される。この例では、ＺＩＦ－８カプセル化Ｆｅ前駆体（Ｆｅ＠ＭＯＦ）の熱分解によってＦｅＳＡを作製する。リンカーＣ１８－ＰＥＧ－Ｂは、非共有相互作用によりＦｅＳＡ表面に結合できる疎水性Ｃ１８基と、ボロン酸隣接ジオールベースのクリック反応により細菌を捕捉するフェニルボロン酸官能基とを含む。（ｂ）ＢＬ＠Ｂ－ＳＡは、ＳＯＤ及びＣＡＴ抗酸化酵素を模倣することができ、また複数の活性酸素種（ＲＯＳ）を除去する抗酸化分子として機能して、細胞や微生物の運命を制御することができる。（ｃ）ＩＢＤの臨床で使用される治療薬は、臨床薬の不可逆的喪失や回避不能なオフターゲット効果、また酸化的ストレスに対するプロバイオティクス特有の脆弱性のために、有効性が低く、重大な全身毒性という問題に直面している。対照的に、人工酵素・プロバイオティクス細菌系は、ＳＡｚｙｍｅの標的抗酸化療法と耐久性プロバイオティクス細菌の迅速なマイクロバイオーム制御との組み合わせを使用することによって炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの胃腸管障害を治療できる。図２は、人工酵素・プロバイオティクス細菌系の調製と、それらが胃腸微小環境とどのように相互作用するかを示す。
【図3-1】図３は、人工酵素・プロバイオティクス細菌系の特徴を表す透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像とグラフである。（ａ）は透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像であり、（ｂ）は人工酵素・プロバイオティクス細菌系の一部を示す収差補正型高角環状暗視野走査型透過電子顕微鏡（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）画像であり、（ｃ）は鉄単原子（ＦｅＳＡ）の拡大画像である。鉄（Ｆｅ）単原子は白丸で示されている。（ｄ）ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ画像と、Ｆｅ（右下）、Ｃ（右上）、及びＮ（左下）の分布を示す対応する元素マップ。Ｆｅホイル、Ｆｅ２Ｏ３、ＦｅＰｃ及びＦｅＳＡのＦｅＫエッジのＦｅＫエッジの、（ｅ）ＸＡＮＥＳスペクトルおよび（ｆ）フーリエ変換（ＦＴ）。（ｇ）Ｒ空間でのＦｅＳＡの対応するＥＸＡＦＳフィッティング曲線。（ｈ）ｋ空間でのＦｅＳＡのＥＸＡＦＳフィッティング曲線。異なる倍率での（ｉ，ｊ）Ｂ－ＳＡ及び（ｋ，ｌ）ＢＬ＠Ｂ－ＳＡのＴＥＭ画像。図３は、人工酵素・プロバイオティクス細菌系の特性評価及び活性酸素種（ＲＯＳ）除去能を示す。
【図3-2】同上。
【図4-1】図４は、インビトロにおける複数のＲＯＳ除去能の結果を示す。Ｂ－ＳＡの（ａ）Ｏ２
－、（ｂ）Ｈ２Ｏ２、及び（ｃ）・ＯＨ除去能のグラフ。異なる物質の（ｄ）Ｏ２
－、（ｅ）Ｈ２Ｏ２、及び（ｆ）・ＯＨ除去能の比較を示すグラフ。ｎｓ：有意性なし、ＢＬ群に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｇ）２時間、２００μＭのＨ２Ｏ２中、異なる濃度のＢ－ＳＡの保護下でのＢＬの相対的生存率を示す棒グラフ。ｎｓ：有意性なし、ＢＬ群に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。異なる期間、２００μＭのＨ２Ｏ２の（ｈ）非存在下又は（ｉ）存在下で、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の保護下でのＢＬの相対的生存率を示すグラフ。ｎｓ：有意性なし、０ｈに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｊ）様々な処理を受けたＨＴ２９細胞の相対的細胞生存率を示す棒グラフ。非処置群に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｋ）２００μＭのＨ２Ｏ２の存在下で様々な処置を受けたＨＴ２９細胞の相対的生存率を示す棒グラフ。対照群に対してｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。＃＃＃Ｐ＜０．００１。（ｌ）異なる物質で処置し、続いて４００μＭのＨ２Ｏ２で処置した後のＨＴ２９細胞における細胞内ＲＯＳのフローサイトメトリ測定を示す棒グラフ。細胞内ＲＯＳをＤＣＦＨ－ＤＡによって示した。ｎｓ：有意性なし、非処置群に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。＃＃＃Ｐ＜０．００１。（ｍ）異なる処置を受けたＨＴ－２９細胞におけるＲＯＳレベルの共焦点蛍光画像。細胞をＲＯＳプローブジクロロフルオロセインジアセタート（ＤＣＦＨ－ＤＡ）及びＨｏｅｃｈｓｔで染色した。図４は、例示的人工酵素・プロバイオティクスリンカー系がＨＴ２９細胞の成長を促進し、それらをＲＯＳの攻撃から保護することを示す。
【図4-2】同上。
【図4-3】同上。
【図5-1】図５は、炎症を起こした腸におけるＢＬ＠Ｂ－ＳＡの安定性及び蓄積を示すグラフ及び画像である。（ａ）模擬胃液（ＳＧＦ）、（ｂ）模擬腸液（ＳＩＦ）、及び（ｃ）模擬炎症性結腸液（ＳＩＣＦ）の模擬胃腸環境におけるＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０及びＢＬのＲＯＳ除去能力を示す棒グラフ。（ｄ）ＳＧＦ、（ｅ）ＳＩＦ、及び（ｆ）ＳＩＣＦにおけるＢＬの対応する生存率を示す棒グラフ。ｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｇ）６時間ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ及びＢ－ＳＡを強制経口投与した後の腸管の代表的光音響（ＰＡ）画像及びＰＡシグナルの強度。ｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊Ｐ＜０．００１。図５は、例示的人工酵素・プロバイオティクス細菌系の修飾がＲＯＳ除去及び炎症軽減を改善することを示す。
【図5-2】同上。
【図6-1】図６は、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡのインビボ毒性試験の結果を示す。ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０を２８日間経口投与したか又は経口投与していない健常マウスの（ａ）血液分析及び（ｂ）血液生化学分析。１は対照マウスを指す。２は、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０で処置したマウスを指す。（ｃ）ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０を２８日間経口投与したか、又は投与していない健常マウスの体重。データは平均±ｓ．ｄ．で示す（ｎ＝５／群）。対照マウス及び様々な処置を第２８日に受けた健常マウスの主要臓器から得られた、（ｄ）代表的な写真及び（ｅ）ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）画像。スケールバー：５０μｍ。
【図6-2】同上。
【図6-3】同上。
【図6-4】同上。
【図6-5】同上。
【図7-1】図７は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）に対するＢＬ＠Ｂ－ＳＡの有効性を示す画像及びグラフである。（ａ）実験セットアップの概略図。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、水又は３％ＤＳＳ含有水を４日間与える。第４日、第５日、第６日、及び第７日に、マウスに、培地、Ｂ－ＳＡ（１．２５ｍｇ／ｋｇ）、ＢＬ（２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ）、ＢＬ（２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ）＋Ｂ－ＳＡ（１．２５ｍｇ／ｋｇ）、又はＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（ＢＬ：２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、Ｂ－ＳＡ：１．２５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。（ｂ）９日間の各群における毎日の体重変化を示すグラフ。データを第０日の体重のパーセンテージとして正規化した。対照群に対してｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｃ）便のかたさ指数（０～３）、便出血指数（０～３）、及び体重減少指数（０～４）の総和である疾患活動性指数（ＤＡＩ）の９日間の変化を示すグラフ。対照群に対してｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｄ）第８日に表示された処置を受けたマウスの結腸の長さを示す棒グラフ。対照群に対してｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｅ）表示された処置後第８日のマウスの結腸のＨ＆Ｅ染色及び免疫組織化学的分析の写真。表示された処置後第８日のマウスの結腸の（ｆ）相対的ＲＯＳ及び（ｇ）典型的炎症性サイトカインを示す棒グラフ、対照群に対してｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。＃Ｐ＜０．０５。（ｈ）表示された処置後二週間のマウスの生存率を示すグラフ。データは平均±ｓ．ｄ．（ｎ＝５／群）として提示した。（ｉ）シャノン指数によって示される便マイクロバイオームのα多様性を示す棒グラフ。ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０群に対してｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｊ）便マイクロバイオームのβ多様性を示すＮＭＤＳプロットの画像、（ｋ）選択分類群の相対的存在量を示す棒グラフ。Verrucomicrobiota及びFirmicutesの場合、対照群に対してｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意性なし、＃Ｐ＜０．０５。Firmicutes／Bacteroidotaの場合、ｎｓ：有意性なし、＃Ｐ＜０．０５。Lachnospiraceaeの場合、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０群に対して、＊＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．００１。（ｌ）表示された処置後第８日のマウスの結腸（上）及び直腸部（下）の画像。図７は、例示的な人工酵素・プロバイオティクス細菌系がＤＳＳ誘導性潰瘍性大腸炎を改善することを示す。
【図7-2】同上。
【図7-3】同上。
【図7-4】同上。
【図7-5】同上。
【図7-6】同上。
【図8-1】図８は、異なる割合のＢＬ及びＢ－ＳＡと、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡの潰瘍性大腸炎（ＵＣ）療法を比較した画像及びグラフを示す。（ａ）実験セットアップの概略図。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、水又は３％ＤＳＳ含有水を４日間与えた。第４日、第５日、第６日、及び第７日に、マウスに培地、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ２５（ＢＬ：２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、Ｂ－ＳＡ：０．６２５ｍｇ／ｋｇ）、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（ＢＬ：２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、Ｂ－ＳＡ：１．２５ｍｇ／ｋｇ）、又はＢＬ＠Ｂ－ＳＡ１００（ＢＬ：２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、Ｂ－ＳＡ：２．５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。（ｂ）９日間の各群における毎日の体重変化を示すグラフ。データは第０日の体重のパーセンテージとして正規化した。対照群に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｃ）便の硬さ指数（０～３）、便出血指数（０～３）、及び体重減少指数（０～４）の総和である疾患活動性指数（ＤＡＩ）の変化を示すグラフ。対照群に対して＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｄ）第８日に表示された処置を受けたマウスの結腸の長さを示す棒グラフ。大腸炎群に対して＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意性なし、健常群に対して＃Ｐ＜０．０５。（ｅ）それぞれ、第８日に表示された処置を受けたマウスの結腸の画像。データは平均±ｓ．ｄ．で示した（ｎ＝５／群）。図８は、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡ１００が動物に対してより良好な保護を与えたことを示す。
【図8-2】同上。
【図9-1】図９は、投与量が異なるＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０のＵＣ療法を比較する画像及びグラフを示す。（ａ）実験セットアップの概略図。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、水又は３％ＤＳＳ含有水を４日間与えた。第４日、第５日、第６日、及び第７日に、マウスに０、０．６２５ｍｇ／ｋｇ（ＢＬ：１．２５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、Ｂ－ＳＡ：０．６２５ｍｇ／ｋｇ）、１．２５ｍｇ／ｋｇ（ＢＬ：２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、Ｂ－ＳＡ：１．２５ｍｇ／ｋｇ）、２．５ｍｇ／ｋｇ（ＢＬ：５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、Ｂ－ＳＡ：２．５ｍｇ／ｋｇ）及び５ｍｇ／ｋｇのＢＬ＠Ｂ－ＳＡ（ＢＬ：１０×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、Ｂ－ＳＡ：５ｍｇ／ｋｇ）のＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０を経口投与した。（ｂ）９日間の各群における毎日の体重変化を示すグラフ。データを第０日の体重のパーセンテージとして正規化した。ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０を与えていない対照群に対して＊Ｐ＜０．０５及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｃ）便の硬さ指数（０～３）、便出血指数（０～３）、及び体重減少指数（０～４）の総和である疾患活動性指数（ＤＡＩ）の変化を示すグラフ。対照群に対してｎｓ：有意性なし、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｄ）第８日に指示された治療を受けたマウスの結腸の長さを示す棒グラフ。対照群に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｅ）それぞれ、第８日に表示された治療を受けたマウスの結腸の画像。データは平均±ｓ．ｄ．で示した（ｎ＝５／群）。図９は、副作用を最小限に抑えることができる例示的人工酵素・プロバイオティクス系の様々な用量を示す。
【図9-2】同上。
【図10-1】図１０は、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡと臨床薬とでの潰瘍性大腸炎（ＵＣ）療法を比較した画像及びグラフを示す。（ａ）実験セットアップの概略図。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、水又は３％ＤＳＳ含有水を４日間与えた。第４日、第５日、第６日、及び第７日に、マウスに、培地、５－ＡＳＡ（３０ｍｇ／ｋｇ）、ＤＥＸ（１ｍｇ／ｋｇ）、ＭＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）又はＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（ＢＬ：２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、Ｂ－ＳＡ：１．２５ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した。（ｂ）９日間各群における毎日の体重変化を示すグラフ。データを０日の体重のパーセンテージとして正規化した。対照群に対してｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｃ）便の硬さ指数（０～３）、便出血指数（０～３）、及び体重減少指数（０～４）の総和である疾患活動性指数（ＤＡＩ）の変化を示すグラフ。対照群に対してｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｄ）第８日に表示された処置を受けたマウスの結腸の長さを示す棒グラフ。対照群に対してｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｅ）それぞれ、第８日に表示された処置を受けたマウスの結腸の画像。データは平均±ｓ．ｄ．で示した（ｎ＝５／群）。図１０は、例示的人工酵素・プロバイオティクス系が、５－ＡＳＡ、ＭＰＳ、及びＤＥＸなどの他の従来型ＩＢＤ治療薬と比較して、ＤＳＳ誘導性大腸炎に対して有効性の増強を示すことを示す。
【図10-2】同上。
【図11-1】図１１は、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡを用いたクローン病（ＣＤ）療法の効果を示す画像及びグラフである。（ａ）実験セットアップの概略図。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＴＮＢＳ溶液を皮膚から吸収させることによって前感作させた。一週間後、ＴＮＢＳ溶液をマウスの結腸内腔にゆっくりと投与して、ＣＤを誘導した。次いで、マウスに培地又はＢ－ＳＡ（１．２５ｍｇ／ｋｇ）、ＢＬ（２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ）、ＢＬ（２．５×１０８ＣＦＵｋｇ－１）＋Ｂ－ＳＡ（１．２５ｍｇ／ｋｇ）、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（ＢＬ：２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、Ｂ－ＳＡ：１．２５ｍｇ／ｋｇ）１．２５ｍｇ／ｋｇ（ＢＬ：２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、Ｂ－ＳＡ：１．２５ｍｇ／ｋｇ）を４日間に経口投与した。（ｂ）ＴＮＢＳ溶液を結腸内腔に投与した後の毎日の体重変化を示すグラフ。データを第８日の体重のパーセンテージとして正規化した。対照群に対してｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｃ）便の硬さ指数（０～３）、便出血指数（０～３）、及び体重減少指数（０～４）の総和である疾患活動性指数（ＤＡＩ）の変化を示すグラフ。対照群に対してｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｄ）第１３日に表示された処置を受けたマウスの結腸の長さを示す棒グラフ。対照群に対してｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｅ）それぞれ、第８日に表示された処理を受けたマウスの結腸の画像。データは平均±ｓ．ｄ．として提示した（ｎ＝５／群）。図１１は、クローン病を治療するために使用できる例示的人工酵素・プロバイオティクス系を示す。
【図11-2】同上。
【図12-1】図１２は、ビーグル犬におけるＢＬ＠Ｂ－ＳＡを使用した潰瘍性大腸炎（ＵＣ）療法の効果を示す画像及びグラフである。（ａ）実験セットアップの概略図。ビーグル犬を７％２ｍＬ／ｋｇ酢酸で１２０秒間灌流した。一日後、治療を施すＵＣ群には、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（ＢＬ：１×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、Ｂ－ＳＡ：０．５ｍｇ／ｋｇ）を連続６日間経口投与した。（ｂ）それぞれ、第７日に表示された処置を受けたイヌの白血球（ＷＢＣ）含有量を示す棒グラフ。対照群に対してｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。（ｃ）７日間異なる処置を受けたイヌの内視鏡写真画像。（ｄ）第７日に表示された処置を受けたイヌから得られた結腸の画像。（ｅ）第７日に表示された処置を受けたイヌから得られた結腸のＨ＆Ｅ染色及び免疫組織化学分析の写真。（ｆ）第７日に表示された処置を受けたイヌから得られた結腸の典型的な炎症性サイトカインを示す棒グラフ。対照群に対してｎｓ：有意性なし、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、及び＊＊＊Ｐ＜０．００１。スケールバー：５０μｍ。図１２は、例示的人工酵素・プロバイオティクス系が、イヌにおける潰瘍性大腸炎（ＵＣ）の治療に有効であることを示す。
【図12-2】同上。
【図12-3】同上。
【図12-4】同上。
【発明を実施するための形態】
【0011】
胃腸管の異なる障害は病因も異なる。一般的な胃腸管障害の一例は、クローン病（ＣＤ）や潰瘍性大腸炎（ＵＣ）などの炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が腸粘膜バリアの機能不全と細菌叢の乱れとによって引き起こされ、その結果、フリーラジカルや炎症性因子の発現の増加などの過剰な免疫応答をもたらすことが新たな証拠によって示唆されている。
【0012】
本明細書中で使用する場合、「フリーラジカル」という語は、原子軌道中に一つ以上の不対電子を含む分子を指し、独立して存在できる。フリーラジカルは細胞代謝の産物であり、限定されるものではないが、活性酸素種（ＲＯＳ）を挙げることができる。一つ以上の不対電子が存在するために、フリーラジカルは反応性の高い種であり、一つ以上の不対電子を別の分子に供与できるか、又は一つ以上の不対電子を別の分子に受容できる。これにより、他の分子がフリーラジカルになり、それによって連鎖反応が開始され、フリーラジカルのレベルが不均衡な状態になると細胞において悪影響を及ぼす可能性がある。したがって、フリーラジカルが胃腸管障害や炎症性障害をはじめとする多種多様な状態や疾患に関与していることは驚くことではない。
【0013】
現行の臨床治療は、腸の炎症負荷を抑制することによって疾患に関連する症状を軽減することに主に重点を置いている。抗炎症薬の開発が進んでいるが、従来の治療はあまり有効ではない。さらに、そのような薬剤を長期間使用すると、薬剤代謝が変化し、依存性が増加する可能性がある。抗炎症薬はまた、オフターゲット効果により望ましくない副作用を引き起こし、場合によっては重篤な合併症をもたらす可能性がある。さらに重大なことに、ほとんどの抗炎症薬は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の根本的な原因である腸粘膜バリアの機能不全や細菌叢の乱れを標的にしない。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の根本的な原因の治療を軽視すると、炎症反応がさらに強まる可能性がある。
【0014】
プロバイオティクス細菌は、腸部位に蓄積することで、病原体の定着を阻害し、それによって、菌体成分のバランスを積極的に調節することが示されている。これにより、腸粘膜の修復が促進され、健康な免疫系が積極的に形成される。現在、プロバイオティクス細菌は、胃腸管中のＨ＋、プロテアーゼ、及び抗生物質からの攻撃に抵抗できる物理的コーティングを用いて送達される。しかしながら、プロバイオティクス細菌の有効性は、依然として、不適合ｐＨ、温度、又は抗酸化酵素の欠乏などの環境因子によって悪影響を受ける可能性がある。例えば、プロバイオティクス細菌の菌株は、胃内の酸性条件下で機能できるが、腸内の非酸性条件では有効性が低下する。例えば、Bifidobacterium longum（ＢＬ）は、大腸炎の重症度を軽減することが示されている嫌気性菌である。さらに、炎症を起こした胃腸管中に存在する機能亢進性活性酸素種（ＲＯＳ）も嫌気性菌の代謝に有害である。
【0015】
人工酵素は小分子抗酸化剤の代替物である。人工酵素は、コストが低く、安定性と耐久性が高く、酵素模倣活性を有するように調節できる。単原子人工酵素は非常に高い触媒活性と頑強な安定性を有し、ＳＯＤ及びＣＡＴを模倣して、ＩＢＤ治療のためにスーパーオキシドラジカル（Ｏ２
－）及び過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の複数のＲＯＳを効率的に除去できる。さらに、ヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）を除去して、結果をさらに改善することもできる。
【0016】
したがって、炎症を抑制し、腸バリア機能を再構築し、感染組織における腸マイクロバイオームを調節することによって、胃腸管の任意の炎症を起こした臓器を効果的に標的とすることができ、微小環境を再形成できる、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの胃腸管障害の新規かつより有効な治療が必要とされる。さらに、プロバイオティクス細菌の利点を活かして胃腸管障害の治療で利用できるように、酸化的ストレスに対するプロバイオティクス細菌に固有の脆弱性に対処する必要もある。
【0017】
前記観点から、本発明者らは、
ａ）レドックス反応を促進する人工酵素、
ｂ）プロバイオティクス細菌、及び
ｃ）人工酵素及びプロバイオティクス細菌をコンジュゲートさせるリンカー
を含む系を開発した。
ａ）レドックス反応を促進する人工酵素、
ｂ）プロバイオティクス細菌、及び
ｃ）人工酵素及びプロバイオティクス細菌をコンジュゲートさせるリンカー
を含む系を開発した。
【0018】
一例において、系は、ａ）レドックス反応を促進する人工酵素、及びｂ）プロバイオティクス細菌を含み、前記プロバイオティクス細菌及び人工酵素は、リンカーを介してコンジュゲート（結合）する。別の例では、系は、ａ）レドックス反応を促進する人工酵素、及びｂ）プロバイオティクス細菌、をコンジュゲートするリンカーを含む。
【0019】
本明細書中で使用する場合、「人工酵素」という用語は、天然に存在しない合成タンパク質又は物質を指す。人工酵素は、天然に存在する酵素の触媒機能を保有し得る。人工酵素は、内因性触媒ドメインを有さないが、フリーラジカルと反応することによって化学反応に関与し得る化合物でもあり得る。
【0020】
一例において、人工酵素は、ナノザイム、又は遺伝子改変酵素若しくは双直交触媒を含む。別の例では、人工酵素はナノザイムである。
【0021】
本明細書中で使用する場合、「ナノザイム」という用語は、内因性酵素様活性を含むナノマテリアルで作製された合成分子を指す。ナノザイムは、限定されるものではないが、単原子触媒、金属クラスター、金属－有機フレームワーク、及び炭素系ナノマテリアルなどのナノマテリアルから作製された人工酵素である。ナノザイムは、天然酵素の触媒部位を模倣することによって機能し、この機能は、活性金属元素及び配位化学構造を変化させることによって適切に調節できる。一例において、ナノザイムは、限定されるものではないが、単原子ナノザイム（ＳＡｚｙｍｅ）、炭素系ナノザイム、及びクラスター系ナノザイムのいずれか一つであり得る。別の例では、ナノザイムは単原子ナノザイム（ＳＡｚｙｍｅ）である。
【0022】
理解されるように、本明細書において用いられる「単原子ナノザイム」又は「ＳＡｚｙｍｅ」という用語は、酵素様活性を有する単原子触媒を指す。単原子触媒は、全ての活性金属種が、別の金属の担持によって、又は別の金属との合金にすることによって安定化される、孤立した単原子として存在する触媒と定義される。一例において、ＳＡｚｙｍｅは、限定されるものではないが、鉄単原子ナノザイム、銅単原子ナノザイム、亜鉛単原子ナノザイム、コバルト単原子ナノザイム、金単原子ナノザイム、白金単原子ナノザイム、ニッケル単原子ナノザイム、または前記のいずれかの組み合わせのうちのいずれか一つであり得る。別の例では、ＳＡｚｙｍｅは鉄単原子ナノザイム（ＳＡｚｙｍｅ）である。
【0023】
ナノザイムと同様に、単原子ナノザイム機能も、配位化学構造を変えることによって調節できる。一例において、ＳＡｚｙｍｅはＦｅ－Ｎ五配位構造、四配位構造、又はＳ／Ｐドーピング構造を含む。別の例では、ＳＡｚｙｍｅはＦｅ－Ｎ五配位構造を含む。
【0024】
本願では、人工酵素はレドックス反応を促進する。本明細書中で使用する場合、「レドックス反応」という用語は、分子における一つ以上の電子の交換を含む反応を指す。レドックス反応は、別名酸化還元反応とも呼ばれる。一例では、レドックス反応は還元反応である。還元は、分子中で一つ以上の電子が増えるか、分子中で一つ以上の酸素が失われるか、又は分子中で一つ以上の水素が増える場合に起こる。別の例では、レドックス反応は酸化反応である。酸化は、分子中で一つ以上の電子が失われるか、分子中で一つ以上の酸素が増えるか、又は分子中で一つ以上の水素が失われる場合に起こる。酸化反応により、フリーラジカルが生成する可能性がある。
【0025】
別の例では、レドックス反応は抗酸化反応である。理解されるように、抗酸化反応は、還元反応と同じではないにしても、似ている。抗酸化剤は抗酸化反応を可能にすることが知られている。本明細書中で使用する場合、「抗酸化剤」という用語は、酸化反応を阻害又は低減する任意の天然又は合成化合物を指す。抗酸化剤は、細胞がフリーラジカルレベルのある特定のバランスを維持できるようにフリーラジカルを除去できる。抗酸化剤の作用は、フリーラジカルの悪影響から細胞を保護するのに役立つ。一例において、抗酸化剤は、活性酸素種（ＲＯＳ）除去酵素などの酵素的抗酸化剤である。別の例では、抗酸化剤は、活性酸素種（ＲＯＳ）除去能を有する低分子量化合物である、抗酸化分子である。
【0026】
したがって、レドックス反応を促進する人工酵素は、本質的に、前記のようにレドックス反応を始動、開始、触媒、又は可能にできる人工触媒を指す。
【0027】
本明細書中に記載する系は、一つ以上の活性酸素種（ＲＯＳ）を除去する活性酸素種（ＲＯＳ）除去能を有する人工酵素を含む。「活性酸素種」又は「ＲＯＳ」という用語は、本明細書で使用する場合、酸素分子由来の高反応性分子及びフリーラジカルを指し、通常、細胞における酸化的代謝から生じる。活性酸素種の例としては、限定されるものではないが、スーパーオキシドラジカル（Ｏ２・－）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）及びヒドロキシルラジカル（・ＯＨ）が挙げられる。
【0028】
一例において、系は、活性酸素種（ＲＯＳ）除去酵素の活性酸素種（ＲＯＳ）除去能を有する人工酵素を含む。活性酸素種（ＲＯＳ）除去酵素は任意のＲＯＳ除去酵素であり得る。別の例では、人工酵素は、限定されるものではないが、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、カタラーゼ（ＣＡＴ）、及びグルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）のいずれか一つであり得る活性酸素種（ＲＯＳ）除去酵素を模倣する。別の例では、系は、抗酸化分子の活性酸素種（ＲＯＳ）除去能を有する人工酵素を含む。抗酸化分子は当該技術分野で公知の任意の抗酸化分子であり得る。別の例では、人工酵素は、限定されるものではないが、グルタチオン（ＧＳＨ）、システイン（Ｃｙｓ）、ポリフェノール及びビタミンＣのいずれか一つであり得る抗酸化分子の活性酸素種（ＲＯＳ）除去能を有する。
【0029】
人工酵素に加えて、系はプロバイオティクス細菌も含む。本明細書中で使用する場合、「プロバイオティクス細菌」という用語は、微生物バランスを改善することによって宿主対象に有益な影響を及ぼす任意の細菌を指す。プロバイオティクス細菌の利点としては、限定されるものではないが、健常な腸微生物叢を維持すること、健常な消化管を維持すること、健常な免疫系を維持することが挙げられる。系は任意の公知プロバイオティクス細菌を含み得る。一例において、プロバイオティクス細菌は、限定されるものではないが、Bifidobacterium、Lactobacillus、Komagataeibacter、及びLeuconostocのいずれか一つの属由来である。別の例では、プロバイオティクス細菌はBifidobacteriumである。
【0030】
Bifidobacterium属には多種多様な種が含まれ、プロバイオティクス細菌はBifidobacteriumの特定種に限定されないと理解される。一例において、Bifidobacteriumは、限定されるものではないが、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium infantis、及びBifidobacterium animalisのいずれか一つであり得る。別の例では、BifidobacteriumはBifidobacterium longumである。
【0031】
系は、人工酵素及びプロバイオティクス細菌をコンジュゲートするリンカーをさらに含む。本明細書中で使用する場合、「コンジュゲート」という用語は、化学的コンジュゲーション又は組換え手段を含むあらゆる手段によって、二つ以上の化学要素又は成分をあわせて結合させることを指す。一例において、リンカーはフェニルボロン酸官能基を含む。本明細書中で使用する場合、「フェニルボロン酸官能基」という用語は、以下の化学構造
【0032】
【化1】
【0033】
を指す。一例では、フェニルボロン酸官能基はプロバイオティクス細菌とコンジュゲートする。化学構造
【0034】
【化2】
【0035】
中で示される「Ｂ」はホウ素を指す。
【0036】
フェニルボロン酸官能基に加えて、リンカーは、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン－コ無水マレイン酸、ポリスチレン－コ無水マレイン酸、ポリ（１－ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、又は２－メタクリロイルオキシ－２’－エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）をさらに含み得る。これらの化合物のうちのいくつか、例えば、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、炭水化物、多糖類、キトサン、又はデキストランは、アミド化反応によりカルボキシルフェニルホウ酸と反応できる活性アミノオキシ基又はエステル化反応によりカルボキシルフェニルホウ酸と反応できるヒドロキシル基を含む。一例において、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をさらに含む。
【0037】
一例において、リンカーはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をさらに含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、ＰＥＧ化のプロセスによってリンカーに付加させることができる。本明細書で記載するように、「ＰＥＧ化」という用語は、限定されるものではないが、例えばフェニルボロン酸官能基、ペプチド、タンパク質又は薬剤などの分子又は物質へのポリエチレングリコールの付加を指す。ＰＥＧ化は、分子又は物質に対するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の共有結合によって起こる。一例において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は直鎖状又は分枝状である。別の例では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は直鎖状である。共役炭素鎖長の数に応じてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の異なる形態が存在し得る。本明細書中で用いられるＰＥＧは、Ｃｎ－ＰＥＧと記載することができ、ここで、Ｃｎ－ＰＥＧは、非共有相互作用によって人工酵素を修飾するＣｎアルキル鎖と、ＰＥＧ（分子量（Ｍｗ）＝２０００）リンカーとを含む。「ｎ」はアルキル鎖中の炭素の数を表す。ＰＥＧ中の炭素の数は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれ以上であり得る。したがって、ＰＥＧは、Ｃ１－ＰＥＧ、Ｃ２－ＰＥＧ、Ｃ３－ＰＥＧ、Ｃ４－ＰＥＧ、Ｃ５－ＰＥＧ、Ｃ６－ＰＥＧ、Ｃ７－ＰＥＧ、Ｃ８－ＰＥＧ、Ｃ９－ＰＥＧ、Ｃ１０－ＰＥＧ、Ｃ１１－ＰＥＧ、Ｃ１２－ＰＥＧ、Ｃ１３－ＰＥＧ、Ｃ１４－ＰＥＧ、Ｃ１５－ＰＥＧ、Ｃ１６－ＰＥＧ、Ｃ１７－ＰＥＧ、Ｃ１８－ＰＥＧ、Ｃ１９－ＰＥＧ、Ｃ２０－ＰＥＧ、Ｃ２１－ＰＥＧ、Ｃ２２－ＰＥＧ、Ｃ２３－ＰＥＧ、Ｃ２４－ＰＥＧ、Ｃ２５－ＰＥＧ、Ｃ２６－ＰＥＧ、Ｃ２７－ＰＥＧ、Ｃ２８－ＰＥＧ、Ｃ２９－ＰＥＧ、又はＣ３０－ＰＥＧであり得る。別の例では、ＰＥＧはＣ１２－ＰＥＧ又はＣ１８－ＰＥＧである。一例において、リンカーはフェニルボロン酸官能基とＰＥＧとを含む。さらに詳細な例では、リンカーはフェニルボロン酸官能基とＣ１２－ＰＥＧとを含む。別の特定の例において、リンカーはフェニルボロン酸官能基とＣ１８－ＰＥＧとを含む。一例において、リンカーは構造
【0038】
【化3】
【0039】
を含む。
【0040】
別の例では、リンカーは一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をさらに含む。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）は１０～５０残基の長さであり得る。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）はまた、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０残基の長さであり得る。
【0041】
一例において、本明細書中に記載する系は、まず人工酵素及びリンカーを合成し、続いてプロバイオティクス細菌を人工酵素及びリンカーと共にインキュベートすることによって産生される。プロバイオティクス細菌の数は、固定量の人工酵素及びリンカーに基づいて増加又は減少させることができるか、或いは人工酵素及びリンカーの量は、固定数のプロバイオティクス細菌に基づいて増加又は減少させることができることが理解される。
【0042】
一例において、系は、約１×１０５～約１×１０１０ＣＦＵのプロバイオティクス細菌、又は約１×１０６～約１×１０９ＣＦＵのプロバイオティクス細菌、又は約１×１０５～約１×１０７ＣＦＵのプロバイオティクス細菌、約１×１０６～約１×１０８ＣＦＵのプロバイオティクス細菌、約１×１０７～約１×１０９ＣＦＵのプロバイオティクス細菌、約１×１０８～約１×１０１０ＣＦＵのプロバイオティクス細菌、又は約１×１０５～約５×１０５ＣＦＵ、５×１０５～約１×１０６ＣＦＵ、約１×１０６～約５×１０６ＣＦＵ、５×１０６～約１×１０７ＣＦＵ、約１×１０７～約５×１０７ＣＦＵ、５×１０７～約１×１０８ＣＦＵ、約１×１０８～約５×１０８ＣＦＵ、５×１０８～約１×１０９ＣＦＵ、約１×１０９～約５×１０９ＣＦＵ、５×１０９～約１×１０１０ＣＦＵ、又は約１．０×１０５ＣＦＵ、約１．５×１０５ＣＦＵ、約２．０×１０５ＣＦＵ、約２．５×１０５ＣＦＵ、約３．０×１０５ＣＦＵ、約３．５×１０５ＣＦＵ、約４．０×１０５ＣＦＵ、約４．５×１０５ＣＦＵ、約５．０×１０５ＣＦＵ、約５．５×１０５ＣＦＵ、約６．０×１０５ＣＦＵ、約６．５×１０５ＣＦＵ、約７．０×１０５ＣＦＵ、約７．５×１０５ＣＦＵ、約８．０×１０５ＣＦＵ、約８．５×１０５ＣＦＵ、約９．０×１０５ＣＦＵ、約９．５×１０５ＣＦＵ、約１．０×１０６ＣＦＵ、約１．５×１０６ＣＦＵ、約２．０×１０６ＣＦＵ、約２．５×１０６ＣＦＵ、約３．０×１０６ＣＦＵ、約３．５×１０６ＣＦＵ、約４．０×１０６ＣＦＵ、約４．５×１０６ＣＦＵ、約５．０×１０６ＣＦＵ、約５．５×１０６ＣＦＵ、約６．０×１０６ＣＦＵ、約６．５×１０６ＣＦＵ、約７．０×１０６ＣＦＵ、約７．５×１０６ＣＦＵ、約８．０×１０６ＣＦＵ、約８．５×１０６ＣＦＵ、約９．０×１０６ＣＦＵ、約９．５×１０６ＣＦＵ、約１．０×１０７ＣＦＵ、約１．５×１０７ＣＦＵ、約２．０×１０７ＣＦＵ、約２．５×１０７ＣＦＵ、約３．０×１０７ＣＦＵ、約３．５×１０７ＣＦＵ、約４．０×１０７ＣＦＵ、約４．５×１０７ＣＦＵ、約５．０×１０７ＣＦＵ、約５．５×１０７ＣＦＵ、約６．０×１０７ＣＦＵ、約６．５×１０７ＣＦＵ、約７．０×１０７ＣＦＵ、約７．５×１０７ＣＦＵ、約８．０×１０７ＣＦＵ、約８．５×１０７ＣＦＵ、約９．０×１０７ＣＦＵ、約９．５×１０７ＣＦＵ、約１．０×１０８ＣＦＵ、約１．５×１０８ＣＦＵ、約２．０×１０８ＣＦＵ、約２．５×１０８ＣＦＵ、約３．０×１０８ＣＦＵ、約３．５×１０８ＣＦＵ、約４．０×１０８ＣＦＵ、約４．５×１０８ＣＦＵ、約５．０×１０８ＣＦＵ、約５．５×１０８ＣＦＵ、約６．０×１０８ＣＦＵ、約６．５×１０８ＣＦＵ、約７．０×１０８ＣＦＵ、約７．５×１０８ＣＦＵ、約８．０×１０８ＣＦＵ、約８．５×１０８ＣＦＵ、約９．０×１０８ＣＦＵ、約９．５×１０８ＣＦＵ、約１×１０９ＣＦＵ、約１．５×１０９ＣＦＵ、約２．０×１０９ＣＦＵ、約２．５×１０９ＣＦＵ、約３．０×１０９ＣＦＵ、約３．５×１０９ＣＦＵ、約４．０×１０９ＣＦＵ、約４．５×１０９ＣＦＵ、約５．０×１０９ＣＦＵ、約５．５×１０９ＣＦＵ、約６．０×１０９ＣＦＵ、約６．５×１０９ＣＦＵ、約７．０×１０９ＣＦＵ、約７．５×１０９ＣＦＵ、約８．０×１０９ＣＦＵ、約８．５×１０９ＣＦＵ、約９．０×１０９ＣＦＵ、約９．５×１０９ＣＦＵ、又は約１．０×１０１０ＣＦＵのプロバイオティクス細菌を含む。別の例では、系は約１×１０７ＣＦＵのプロバイオティクス細菌を含む。
【0043】
系中の人工酵素及びリンカーの量は約１０μｇ～約１０ｍｇであり得る。一例において、系中の人工酵素及びリンカーの量は、約１０μｇ～約１ｍｇ、約１ｍｇ～約２ｍｇ、約２ｍｇ～約３ｍｇ、約３ｍｇ～約４ｍｇ、約４ｍｇ～約５ｍｇ、約５ｍｇ～約６ｍｇ、約６ｍｇ～約７ｍｇ、約７ｍｇ～約８ｍｇ、約８ｍｇ～約９ｍｇ、約９ｍｇ～約１０ｍｇ、又は約１０μｇ、約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約６０μｇ、約７０μｇ、約８０μｇ、約９０μｇ、約１００μｇ、約１５０μｇ、約２００μｇ、約２５０μｇ、約３００μｇ、約３５０μｇ、約４００μｇ、約４５０μｇ、約５００μｇ、約１．０ｍｇ、約１．５ｍｇ、約２．０ｍｇ、約２．５ｍｇ、約３．０ｍｇ、約３．５ｍｇ、約４．０ｍｇ、約４．５ｍｇ、約５．０ｍｇ、約５．５ｍｇ、約６．０ｍｇ、約６．５ｍｇ、約７．０ｍｇ、約７．５ｍｇ、約８．０ｍｇ、約８．５ｍｇ、約９．０ｍｇ、約９．５ｍｇ、又は約１０．０ｍｇであり得る。別の例では、系中の人工酵素及びリンカーの量は約１０μｇ～約５００μｇである。別の例では、系中の人工酵素及びリンカーの量は約５０μｇである。
【0044】
使用される人工酵素及びリンカーの量は、系において使用される細菌数と相関させることができる。一例において、系で使用される約１×１０７ＣＦＵのプロバイオティクス細菌に対して、人工酵素及びリンカーの量は、約１０μｇ～約１０００μｇ、又は約１０μｇ～約５００μｇ、又は約１０μｇ～約２００μｇ、又は約１００μｇ～約３００μｇ、約２００μｇ～約４００μｇ、約３００μｇ～約５００μｇ、約４００μｇ～約６００μｇ、約５００μｇ～約７００μｇ、約６００μｇ～約８００μｇ、約７００μｇ～約９００μｇ、約８００μｇ～約１０００μｇ、又は約１０μｇ、約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約６０μｇ、約７０μｇ、約８０μｇ、約９０μｇ、約１００μｇ、約１１０μｇ、約１２０μｇ、約１３０μｇ、約１４０μｇ、約１５０μｇ、約１６０μｇ、約１７０μｇ、約１８０μｇ、約１９０μｇ、約２００μｇ、約２１０μｇ、約２２０μｇ、約２３０μｇ、約２４０μｇ、約２５０μｇ、約２６０μｇ、約２７０μｇ、約２８０μｇ、約２９０μｇ、約３００μｇ、約３１０μｇ、約３２０μｇ、約３３０μｇ、約３４０μｇ、約３５０μｇ、約３６０μｇ、約３７０μｇ、約３８０μｇ、約３９０μｇ、約４００μｇ、約４１０μｇ、約４２０μｇ、約４３０μｇ、約４４０μｇ、約４５０μｇ、約４６０μｇ、約４７０μｇ、約４８０μｇ、約４９０μｇ、約５００μｇ、約５５０μｇ、約６００μｇ、約６５０μｇ、約７００μｇ、約７５０μｇ、約８００μｇ、約８５０μｇ、約９００μｇ、約９５０μｇ、又は約１０００μｇである。別の例では、系で使用される約１×１０７ＣＦＵのプロバイオティクス細菌に対して、人工酵素及びリンカーの量は約５０μｇである。
【0045】
本明細書中に記載する系は、レドックス反応を促進する人工酵素とプロバイオティクス細菌とリンカーとを組み合わせることによって製造され、前記リンカーは、前記人工酵素及びプロバイオティクス細菌のコンジュゲートに関与する。一例において、本明細書中で開示する系を製造する方法であって、（ｉ）リンカーにコンジュゲートされた人工酵素であって、レドックス反応を促進する前記人工酵素と、（ｉｉ）プロバイオティクス細菌とをインキュベートすることを含み、前記リンカーが前記人工酵素及びプロバイオティクス細菌をコンジュゲートする方法が提供される。人工酵素とリンカーとをインキュベートすることを含む第一インキュベーションステップによって、まずリンカーを人工酵素とコンジュゲートさせる。第一インキュベーションステップは、例えば、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、又は約１０時間であり得る。第一インキュベーションステップ後に、人工酵素及びリンカーを第二インキュベーションステップにおいてプロバイオティクス細菌と共にインキュベートする。第二インキュベーションステップは、例えば、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、又は約６０分であり得る。この第二インキュベーションステップにより、プロバイオティクス細菌は、リンカーによるコンジュゲーションを介して人工酵素及びリンカーと結合することが可能になる。インキュベーションの方法は当該技術分野で一般的に知られている。
【0046】
別の例では、プロバイオティクス細菌とリンカーとをインキュベートすることを含む第一インキュベーションステップによって、リンカーをまずプロバイオティクス細菌とコンジュゲートさせる。第一インキュベーションステップ後に、プロバイオティクス細菌及びリンカーを第二インキュベーションステップにおいて人工酵素と共にインキュベートする。別の例では、リンカーは、人工酵素及びプロバイオティクス細菌と同時にコンジュゲートされる。
【0047】
本明細書中に記載する系は、投与に適した組成物、例えば、医薬組成物に処方することができる。適用できる場合、系は薬剤的に許容される担体と共に投与してもよい。「担体」は、担体が処方の他の成分と適合性することができ、患者にとって有害でない限り、任意の薬剤的に許容される担体を含むことができる。したがって、使用される医薬組成物は、活性化合物の薬剤的に使用できる製剤に加工することを容易にする賦形剤及び補助薬を含む一つ以上の生理学的に許容される担体を使用して従来の方法で処方できる。適切な処方は、選択された投与経路に依存する。したがって、一例では、本開示は、限定されるものではないが、本明細書中に記載する系を含む医薬組成物を記載する。一例において、医薬組成物は本明細書中に記載する系を含む。さらに別の例において、医薬組成物は、一つ以上の薬剤的に許容される賦形剤、ビヒクル又は担体をさらに含む。別の例では、医薬組成物は、薬剤的に許容される担体をさらに含む。したがって、一例では、医薬組成物は、限定されるものではないが、薬剤的に許容される担体、リポソーム担体、賦形剤、アジュバント又はそれらの組み合わせであり得る化合物をさらに含んでもよい。
【0048】
本明細書中に記載する系の組成、形状、及び剤形の種類は、典型的には、意図する用途に応じてさまざまであろう。例えば、疾患又は関連する疾患の急性治療で使用される剤形では、それに含まれる一つ以上の活性化合物の量が、同じ疾患の慢性治療で使用される剤形よりも多くてもよい。同様に、非経口剤形では、それに含まれる一つ以上の活性化合物の量は、同じ疾患又は障害を治療するために使用される経口剤形よりも少ない量であってよい。本発明に含まれる特定の剤形が互いに異なる、これらの方法やその他の方法は、当業者には容易に明らかになるであろう。剤形の例としては、限定されるものではないが：錠剤；カプレット；ソフト弾性ゼラチンカプセルなどのカプセル；カシェー剤；トローチ；ロゼンジ；分散剤；坐剤；軟膏；パップ剤（湿布）；ペースト；粉末；包帯材；プラスター；溶液；ゲル；懸濁液（例えば、水性若しくは非水性懸濁液、水中油エマルジョン、又は油中水液体エマルジョン）、溶液、及びエリキシル；患者への非経口投与に特に適した液体投与形態をはじめとする、患者への経口又は粘膜投与に適した液体投与形態；及び患者への非経口投与に適した液体投与形態を提供するように復元できる滅菌固体（例えば、結晶性又はアモルファス固体）が挙げられる。したがって、一例では、本明細書中に記載する系は、限定されるものではないが、錠剤、カプレット、カプセル、ハードカプセル、ソフトカプセル、ソフト弾性ゼラチンカプセル、ハードゼラチンカプセル、カシェー剤、トローチ、ロゼンジ、分散剤、坐剤、軟膏、パップ剤、湿布、ペースト、粉末、包帯材、プラスター、溶液、ゲル、懸濁液、水性懸濁液、非水性懸濁液、水中油エマルジョン、油中水液体エマルジョン、溶液、滅菌固体、結晶性固体、アモルファス固体、復元用固体又はそれらの組み合わせであり得る形態で提供される。
【0049】
組成物は、経口、非経口、局所、経直腸、経鼻、又は頬側をはじめとする任意の好適な方法で対象に投与することができる。本明細書において用いられる「非経口」という用語は、静脈内又は頭蓋内注射を含む。
【0050】
薬剤的に許容される担体は、任意の好適な希釈剤、アジュバント、賦形剤、緩衝液、安定剤、等張剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃｉｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、保存料又は抗酸化剤を含むことができる。薬剤的に許容される担体は、非毒性でなければならず、また本明細書中に記載する系又は医薬組成物の有効性を妨げてはならないと理解される。担体又は組成物への任意の他の添加剤の詳細な特質は、投与経路や必要とされる治療の種類に依存するであろう。医薬組成物は、例えば、従来型の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、湿式粉砕（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、捕捉、又は凍結乾燥プロセスによって製造することができる。
【0051】
組成物の経口的に許容される剤形としては、限定されるものではないが、カプセル、錠剤、丸薬、散剤、リポソーム、顆粒剤、球剤（ｓｐｈｅｒｅ）、糖衣錠、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤などが挙げられる。好適な経口形態は当業者には公知であろう。錠剤は、ゼラチンなどの固体担体又はアジュバント又は不活性希釈剤を含み得る。液体医薬組成物には、概して、水、石油、動物油若しくは植物油、鉱物油又は合成油などの液体担体が含まれる。生理的食塩水溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれていてもよい。そのような組成物や製剤は、概して、所与の担体中の溶解度に応じて、少なくとも０．１重量％、一例では、約２５重量％までの本明細書中に記載する系又は医薬組成物を含有する。
【0052】
組成物は、化合物を特定の臓器若しくは組織に送達するため、及び／又は化合物が生物学的効率を失うことなく、例えば腸から摂取され得ることを確実にするための送達ビヒクルを含み得る。送達ビヒクルは、例えば、脂質、ポリマー、リポソーム、エマルジョン、抗体及び／又はタンパク質を含み得る。リポソームは、皮膚を通して化合物を送達するために特に好ましい。一例では、リポソームは、本明細書中に記載する系を含む蛍光リポソームである。蛍光リポソームは、本明細書中に記載する系を含むリポソームの産生中に一つ以上の蛍光色素を導入することによって産生される。蛍光色素は、限定されるものではないが、ＤｉＩＣ１８（７）（１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物（ＤＩＣ）、ＤｉＲヨウ化物、ＩＲ８００、ＢＯＤＩＹ、ＩＲ８０８及びＣｙ５．５、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。
【0053】
組成物は、前記化合物を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放系を用いて送達することができる。当業者にとって、様々な徐放性物質が利用可能であり、周知である。徐放性カプセルは、それらの化学的性質に応じて、前記化合物を約１～２０週間放出することができる。
【0054】
炎症は、炎症誘発性因子や抗炎症性因子などの多種多様な因子が関与する複雑なプロセスである。本明細書中に記載する系及び医薬組成物は、炎症誘発性因子のレベルを低下させるか、又は抗炎症性因子のレベルを増加させることによって、任意の炎症負荷及び障害を軽減できることが想定される。一態様において、治療上有効な量の本明細書中に記載する系又は本明細書中に記載する医薬組成物を投与することによって、炎症誘発性因子のレベルを低下させる方法が提供される。一例において、本明細書中で開示する系又は本明細書中に記載する医薬組成物は、その対象における炎症誘発性因子のレベルを低下させるのに使用される。例えば、炎症誘発性因子は、限定されるものではないが、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）及びＣＤ４５を含む。
【0055】
別の態様において、治療上有効な量の本明細書中に記載する系又は本明細書中で開示する医薬組成物を投与することによって抗炎症性因子のレベルを低下させる方法が提供される。一例において、本明細書中に記載する系又は本明細書中に記載する医薬組成物は、その対象において抗炎症性因子のレベルを増加させるのに使用される。例えば、抗炎症性因子には、限定されるものではないが、インターロイキン１０（ＩＬ－１０）又は形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）が含まれる。
【0056】
本明細書中に記載する系又は本明細書中に記載する医薬組成物が療法において使用されることも想定される。したがって、本明細書中に記載する系及び医薬組成物は、治療ツール、治療レジメン、又は治療方法に組み込むことができる。本明細書中で使用する場合、「治療」という用語は、疾患状態又は症状を治療する、疾患の確立を予防する、或いはいずれの方法によるかを問わず、疾患若しくは他の望ましくない症状の進行を予防、阻害、遅延、又は逆行させる、あらゆる使用を指す。
【0057】
一態様において、治療上有効な量の本明細書中に記載する系又は本明細書中に記載する医薬組成物を投与することによって、それを必要とする対象における微生物のバランスを改善することによって、胃腸管の健康を改善する方法が提供される。一例において、本明細書中に記載する系又は本明細書中に記載する医薬組成物は、微生物のバランスを改善することによって胃腸管の健康を改善するのに使用される。別の例では、微生物のバランスを改善することによって胃腸管の健康を改善するための薬剤の製造における本明細書中に記載する系又は本明細書中に記載する医薬組成物の使用が提供される。本明細書中で使用する場合、「胃腸管」という用語は、食物や水が入り、消化及び／又は吸収され、排出される臓器を指す。臓器としては、限定されるものではないが、小腸、大腸、胃、口、咽頭、食道、直腸、及び肛門が挙げられる。
【0058】
微生物のバランスが崩壊すると、ディスバイオシスとなる可能性があり、ディオバイオシスとは、本明細書で使用される場合、胃腸管内の微生物叢の不均衡を指し、機能的組成及び代謝活性の変化をもたらす。微生物叢不均衡の例としては、プロバイオティクス細菌集団の減少及び／又は潜在的に有害な細菌集団の増加が挙げられる。ディスバイオシスは胃腸管障害であり、限定されるものではないが、腹部膨満、放屁、痙攣、胃もたれなどの症状によって特徴づけることができる。慢性的ディスバイオシスは重篤な胃腸管障害を引き起こす可能性もある。例えば、過敏性腸症候群の患者は、Firmicutesの割合及びFirmicutes／Bacteroidetes比の低下、並びにVerrucomicrobiotaの増加を特徴とするディスバイオシスを有することが示されている。
【0059】
別の態様において、治療上有効な量の本明細書中に記載する系又は本明細書中に記載する医薬組成物を投与することによって、それを必要とする対象における疾患を治療する方法が提供される。本明細書中で使用する場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、衰弱及び／又は不健康な状態の発症を予防するために予防的に作用するのに充分な、薬剤的に有効な量の系又はその各医薬組成物若しくは薬剤を提供すること；並びに／或いは疾患状態及び／又は疾患状態の症状、並びに衰弱及び／又は不健康な状態を軽減又は除去するために充分な量の複合体又は医薬組成物又は薬剤を対象に提供することを指すことが意図される。一例において、疾患は胃腸管障害である。別の例では、本明細書中に記載する系又は本明細書中に記載する医薬組成物は、胃腸管障害の治療で使用されるものである。別の例では、それを必要とする対象における胃腸管障害の治療用薬剤の製造における本明細書中に記載する系又は本明細書中に記載する医薬組成物の使用が提供される。例えば、胃腸管障害は、限定されるものではないが、潰瘍性大腸炎の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、ディスバイオシス、壊死性腸炎、急性感染性下痢症、抗生物質関連下痢症、乳児疝痛である。
【0060】
系又はその医薬組成物は、それを必要とする対象に投与できる。本明細書で使用される「対象」という用語には、投与、治療、観察、又は実験の対象となる動物、好ましくは、哺乳類又は鳥類を指す。「哺乳類」には、ヒトや、実験動物や家庭用ペット（例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギ）などの家畜、野生生物、家禽、鳥類などの家畜以外の動物の両方が含まれる。さらに詳細には、哺乳動物は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、リス）である。さらに、最も詳細には、哺乳動物はヒトである。
【0061】
系又はその医薬組成物は、本明細書に記載の疾患の必要に応じて予防上有効な量又は治療上有効な量のいずれかで対象に投与することができる。組成物の実際の量、並びに組成物の投与速度及び投与時間経過は、治療される胃腸管障害の性質及び重症度又は必要な予防法に依存するであろう。投与量などの決定といった治療の処方は、対象のケアを担当する医師又は獣医師の技術範囲内である。典型的には、対象に投与するための系又は医薬組成物は、体重１ｋｇあたり約１．０×１０７～約３．０×１０８ＣＦＵのプロバイオティクス細菌、並びに体重１ｋｇあたり約１．０ｍｇ～約３．０ｍｇの人工酵素及びリンカーを含む。単位「ＣＦＵ／ｋｇ」が体重１ｋｇあたりのプロバイオティクス細菌数を指すことは容易に理解されるであろう。一例において、単位「ＣＦＵ／ｋｇ」は、体重１ｋｇあたり経口投与されるBifidobacterium longumの数を指す。単位「ｍｇ／ｋｇ」は、体重１ｋｇ当たりの人工酵素及びリンカーの量を指す。一例において、投与される系又は医薬組成物は、約１．０×１０７～約３．０×１０８ＣＦＵ／ｋｇのプロバイオティクス細菌；並びに約１．０～約３．０ｍｇ／ｋｇの人工酵素及びリンカーを含む。別の例では、投与される系又は医薬組成物は、約１．０×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約１．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約２．０×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約２．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約３．０×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約３．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約４．０×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約４．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約５．０×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約５．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約６．０×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約６．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約７．０×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約７．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約８．０×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約８．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約９．０×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約９．５×１０７ＣＦＵ／ｋｇ、約１．０×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、約１．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、約２．０×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、約２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇ、若しくは約３．０×１０８ＣＦＵ／ｋｇのプロバイオティクス細菌；及び約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．１ｍｇ／ｋｇ、約１．２ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ、約１．４ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．８ｍｇ／ｋｇ、約１．９ｍｇ／ｋｇ、約２．０ｍｇ／ｋｇ、約２．１ｍｇ／ｋｇ、約２．２ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ、約２．９ｍｇ／ｋｇ、若しくは約３．０ｍｇ／ｋｇの人工酵素及びリンカー、又はそれらの任意の組み合わせを含む。別の例では、投与される系又は医薬組成物は、約２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇのプロバイオティクス細菌、並びに約２．５ｍｇ／ｋｇの人工酵素及びリンカーを含む。別の例では、投与される系又は医薬組成物は、約２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇのプロバイオティクス細菌；並びに約１．２５ｍｇ／ｋｇの人工酵素及びリンカーを含む。
【0062】
本願で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上明らかに別段の指示が無い限り、複数の言及が含まれる。例えば、「遺伝子マーカー」という用語には、その混合物及び組み合わせを含む複数の遺伝子マーカーが含まれる。
【0063】
本明細書中で使用する場合、「増加」及び「減少」という用語は、集団全体に存在するのと同じ形質又は特徴と比較して、集団のサブセットにおける選択された形質又は特徴の相対的変化を指す。したがって、増加は正のスケールでの変化を示し、減少は負のスケールでの変化を示す。本明細書中で使用される「変化」という用語はまた、全体としての集団における同じ形質又は特徴と比較した、単離された集団サブセットの選択された形質又は特徴間の差も指す。しかしながら、この用語は、見た目の違いの評価ではない。
【0064】
本明細書中で使用する場合、「約」と言う用語は、物質の濃度、物質のサイズ、時間の長さ、又は他の記載された値の関連で、記載された値±５％、又は記載された値±４％又は記載された値±３％、又は記載された値±２％、又は記載された値±１％、又は記載された値±０．５％を意味する。
【0065】
本開示全体を通して、ある特定の実施形態は範囲形式で開示される場合がある。範囲形式での記載は単に便宜上や簡潔にするためと理解すべきであり、開示された範囲に対する柔軟性のない限定と解釈すべきでない。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分的範囲並びにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分的範囲、並びにその範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５、及び６を具体的に開示したものとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく当てはまる。
【0066】
本明細書で例示的に記載された発明は、本明細書で具体的に開示されていない任意の要素、限定がなくても、好適に実施できる。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などという用語は、限定することなく拡大解釈されるものとする。さらに、本明細書中で採用した用語や表現は、限定ではなく説明の用語として使用され、そのような用語や表現の使用では、図示され説明された特徴又はその一部の均等物を排除することを意図しないが、発明の請求の範囲内で様々な修飾が可能であることが認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態や任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書中で開示されて具現化された発明の修飾や変更を当業者は使用することができ、そのような修飾及び変更は、本発明の範囲内であると考えられると理解されるべきである。
【0067】
本発明を本明細書中で広く一般的に記載した。一般的な開示に含まれるより狭い種及び亜属のグループのそれぞれも本発明の一部を形成する。これには、取り出された内容が本明細書中で具体的に記載されているか否かにかかわらず、但し書きや否定的な限定付きでの発明の一般的記載が含まれる。
【0068】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲と非限定的例の範囲内である。さらに、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群に関して記載されている場合、当業者は、本発明がマーカッシュ群の任意の個々のメンバー又はメンバーのサブグループに関してもそれによって記載されていることを認識するであろう。
【実施例】
【0069】
材料及び方法
化学物質
硝酸亜鉛六水和物（Ｚｎ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ）及びメタノールをＢｅｉｊｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（中華人民共和国、北京）から入手した。２，４－ペンタジオン酸鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅ（ａｃａｃ）３）及び２－メチルイミダゾール（２－ＭＩ）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国、ミズーリ州、セントルイス）社に注文した。Ｃ１２－ＰＥＧ－Ｂは、Ｓｈａｏｘｉｎｇ Ｑｉｘｉｎ Ｔｒａｄｉｎｇ Ｃｏ．，ＬＴＤ（中華人民共和国、紹興）から取得した。Bifidobacterium longum（ＢＬ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ９９９（商標））はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。
化学物質
硝酸亜鉛六水和物（Ｚｎ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ）及びメタノールをＢｅｉｊｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（中華人民共和国、北京）から入手した。２，４－ペンタジオン酸鉄（ＩＩＩ）（Ｆｅ（ａｃａｃ）３）及び２－メチルイミダゾール（２－ＭＩ）をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国、ミズーリ州、セントルイス）社に注文した。Ｃ１２－ＰＥＧ－Ｂは、Ｓｈａｏｘｉｎｇ Ｑｉｘｉｎ Ｔｒａｄｉｎｇ Ｃｏ．，ＬＴＤ（中華人民共和国、紹興）から取得した。Bifidobacterium longum（ＢＬ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＢＡＡ９９９（商標））はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入した。
【0070】
単原子ナノザイム（ＦｅＳＡ）の合成
単原子ナノザイム（ＦｅＳＡ）は、不活性窒素（Ｎ２）環境でのＦｅ（ａｃａｃ）＿ＥＮＲＥＦ＿２３：Ｆｅ（ａｃａｃ）３カプセル化金属有機フレームワーク（ＭＯＦ）（Ｆｅ＠ＭＯＦ、ＦＥ＠ＺＩＦ－８とも称する）の熱分解によって調製した。Ｚｎ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ（１１６０ｍｇ）及びＦｅ（ａｃａｃ）＿ＥＮＲＥＦ＿２３：Ｆｅ（ａｃａｃ）３（３５ｍｇ）の均一なメタノール溶液３０ｍＬを２－メチルイミダゾール（２－ＭＩ）（１３１４ｍｇ）メタノール溶液３０ｍＬと穏やかに撹拌しながら２時間混合した。その後、Ｆｅ＠ＭＯＦを遠心分離によって集め、リンスし、真空オーブン中、７０℃で一晩乾燥させた。最後に、得られた乾燥Ｆｅ＠ＭＯＦを粉砕して粉末にし、磁器ボートに装填して、９００℃で３時間、５℃／分の加熱速度で熱分解した。冷却後、得られたＦｅＳＡを集めた。
単原子ナノザイム（ＦｅＳＡ）は、不活性窒素（Ｎ２）環境でのＦｅ（ａｃａｃ）＿ＥＮＲＥＦ＿２３：Ｆｅ（ａｃａｃ）３カプセル化金属有機フレームワーク（ＭＯＦ）（Ｆｅ＠ＭＯＦ、ＦＥ＠ＺＩＦ－８とも称する）の熱分解によって調製した。Ｚｎ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ（１１６０ｍｇ）及びＦｅ（ａｃａｃ）＿ＥＮＲＥＦ＿２３：Ｆｅ（ａｃａｃ）３（３５ｍｇ）の均一なメタノール溶液３０ｍＬを２－メチルイミダゾール（２－ＭＩ）（１３１４ｍｇ）メタノール溶液３０ｍＬと穏やかに撹拌しながら２時間混合した。その後、Ｆｅ＠ＭＯＦを遠心分離によって集め、リンスし、真空オーブン中、７０℃で一晩乾燥させた。最後に、得られた乾燥Ｆｅ＠ＭＯＦを粉砕して粉末にし、磁器ボートに装填して、９００℃で３時間、５℃／分の加熱速度で熱分解した。冷却後、得られたＦｅＳＡを集めた。
【0071】
Ｃ１８－ＰＥＧ－Ｂ修飾単原子触媒（Ｂ－ＳＡ）の合成
ＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）及びリンカーボロン酸－Ｃ１８－ポリ（エチレングリコール）（Ｃ１８－ＰＥＧ－Ｂ）（１ｍｇ／ｍＬ）の均質溶液１００ｍＬを暗所で４時間撹拌して、Ｃ１８－ＰＥＧ－Ｂ修飾単原子触媒（Ｂ－ＳＡ）を得た。Ｂ－ＳＡを遠心分離によって集め、リンスし、１００ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再分散させ、暗所で４℃にて保存した。
ＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）及びリンカーボロン酸－Ｃ１８－ポリ（エチレングリコール）（Ｃ１８－ＰＥＧ－Ｂ）（１ｍｇ／ｍＬ）の均質溶液１００ｍＬを暗所で４時間撹拌して、Ｃ１８－ＰＥＧ－Ｂ修飾単原子触媒（Ｂ－ＳＡ）を得た。Ｂ－ＳＡを遠心分離によって集め、リンスし、１００ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再分散させ、暗所で４℃にて保存した。
【0072】
人工酵素武装プロバイオティクス（ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ）の合成
Bifidobacterium longum（ＢＬ）を３７℃で１８時間振盪しながら＃１４９０ブロスのチューブ中で嫌気的に培養した。ＢＬをブルセラ血液プレート上で嫌気的に３７℃にてインキュベートして、汚染及び濃度をチェックした。等量のＢ－ＳＡ（５００μｇ／ｍＬ）をＢＬ（１×ｌ０８ＣＦＵ／ｍＬ）と共に振盪しながらインキュベートすることによってＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の人工酵素・プロバイオティクスプラットフォームを調製した。３０分後、混合物を遠心分離し、洗浄し、培地を含む嫌気性チューブ中に再分散させた。結果として得られたＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０を暗所で４℃にて保存した。ＢＬ及びＢ－ＳＡの濃度を変えることによって、異なる比率のＢＬ＠Ｂ－ＳＡＸを合成した。
Bifidobacterium longum（ＢＬ）を３７℃で１８時間振盪しながら＃１４９０ブロスのチューブ中で嫌気的に培養した。ＢＬをブルセラ血液プレート上で嫌気的に３７℃にてインキュベートして、汚染及び濃度をチェックした。等量のＢ－ＳＡ（５００μｇ／ｍＬ）をＢＬ（１×ｌ０８ＣＦＵ／ｍＬ）と共に振盪しながらインキュベートすることによってＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の人工酵素・プロバイオティクスプラットフォームを調製した。３０分後、混合物を遠心分離し、洗浄し、培地を含む嫌気性チューブ中に再分散させた。結果として得られたＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０を暗所で４℃にて保存した。ＢＬ及びＢ－ＳＡの濃度を変えることによって、異なる比率のＢＬ＠Ｂ－ＳＡＸを合成した。
【0073】
蛍光Ｃ１８－ＰＥＧ－Ｂ修飾リポソーム（ＤＩＲ－Ｂ－Ｌｉｐ）の合成
レシチン（３６．２７ｍｇ）、コレステロール（５ｍｇ）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（７．７６ｍｇ）を４．９ｍＬのエタノール中で混合することによって、リン脂質エタノール溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）をまず調製した。１．０８ｍＬのリン脂質エタノール溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）、０．３ｍＬのＣ１８－ＰＥＧ－Ｂエタノール溶液（４ｍｇ／ｍＬ）及び０．１２ｍＬのＤｉＩＣ１８（７）；１，１’－ジオクタデシル１－３，３，３’，３’－テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物（ＤＩＲ）エタノール溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を丸底フラスコ中の４．５ｍＬのクロロホルムに添加し、クロロホルムを低圧下で蒸発させ、その結果、フラスコの底に透明フィルムが形成された。フィルムを１２ｍＬのＰＢＳで水和させ、超音波処理して、蛍光Ｃ１８－ＰＥＧ－Ｂ修飾リポソーム（ＤＩＲ－Ｂ－Ｌｉｐ）の透明懸濁液を形成した。
レシチン（３６．２７ｍｇ）、コレステロール（５ｍｇ）、及び１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）（ＤＳＰＥ－ＰＥＧ）（７．７６ｍｇ）を４．９ｍＬのエタノール中で混合することによって、リン脂質エタノール溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）をまず調製した。１．０８ｍＬのリン脂質エタノール溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）、０．３ｍＬのＣ１８－ＰＥＧ－Ｂエタノール溶液（４ｍｇ／ｍＬ）及び０．１２ｍＬのＤｉＩＣ１８（７）；１，１’－ジオクタデシル１－３，３，３’，３’－テトラメチルインドトリカルボシアニンヨウ化物（ＤＩＲ）エタノール溶液（５ｍｇ／ｍＬ）を丸底フラスコ中の４．５ｍＬのクロロホルムに添加し、クロロホルムを低圧下で蒸発させ、その結果、フラスコの底に透明フィルムが形成された。フィルムを１２ｍＬのＰＢＳで水和させ、超音波処理して、蛍光Ｃ１８－ＰＥＧ－Ｂ修飾リポソーム（ＤＩＲ－Ｂ－Ｌｉｐ）の透明懸濁液を形成した。
【0074】
蛍光リポソーム－プロバイオティクス系（ＢＬ＠ＤＩＲ－Ｂ－Ｌｉｐ）の合成
Ｂ－ＳＡをＤＩＲ－Ｂ－Ｌｉｐで置換する以外は、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０を合成する場合と類似したプロセスにより、蛍光リポソーム・プロバイオティクス系（ＢＬ＠ＤＩＲ－Ｂ－Ｌｉｐ）を調製した。
Ｂ－ＳＡをＤＩＲ－Ｂ－Ｌｉｐで置換する以外は、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０を合成する場合と類似したプロセスにより、蛍光リポソーム・プロバイオティクス系（ＢＬ＠ＤＩＲ－Ｂ－Ｌｉｐ）を調製した。
【0075】
酸化的ストレス下での細菌生存率
天然ＢＬ（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ）、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ３．１２５（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ及び３．１２５μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡ）、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ６．２５（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ及び６．２５μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡ）、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ１２．５（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ及び１２．５μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡ）、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ２５（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ及び２５μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡ）、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ及び５０μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡ）及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡ１００（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ及び１００μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡ）を、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）（２００μＭ）を含有するＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、１０ｍＭ）と共に３７℃で２時間インキュベートした後、それぞれ生存率分析を行った。細菌生存率を血小板計数によってモニタリングした。Ｈ２Ｏ２処理をしていない天然ＢＬ（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ）を対照として使用し、それらの生存率レベルを１００％とした。
天然ＢＬ（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ）、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ３．１２５（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ及び３．１２５μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡ）、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ６．２５（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ及び６．２５μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡ）、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ１２．５（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ及び１２．５μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡ）、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ２５（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ及び２５μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡ）、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ及び５０μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡ）及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡ１００（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ及び１００μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡ）を、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）（２００μＭ）を含有するＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、１０ｍＭ）と共に３７℃で２時間インキュベートした後、それぞれ生存率分析を行った。細菌生存率を血小板計数によってモニタリングした。Ｈ２Ｏ２処理をしていない天然ＢＬ（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ）を対照として使用し、それらの生存率レベルを１００％とした。
【0076】
ＢＬ及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡの成長曲線の評価
嫌気性条件下での天然のＢＬ及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡの成長曲線を試験した。具体的には、２００μｌの天然のＢＬ（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ）及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ及び５０μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡ）をそれぞれ１０ｍＬの＃１４９０ブロスのチューブ中に注入した。１２時間、２４時間、３６時間、及び４８時間インキュベーションした後、１００μｌの混合物を各チューブから集め、血液プレート計数法によって細菌数を測定した。
嫌気性条件下での天然のＢＬ及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡの成長曲線を試験した。具体的には、２００μｌの天然のＢＬ（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ）及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（１×１０７ＣＦＵ／ｍＬのＢＬ及び５０μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡ）をそれぞれ１０ｍＬの＃１４９０ブロスのチューブ中に注入した。１２時間、２４時間、３６時間、及び４８時間インキュベーションした後、１００μｌの混合物を各チューブから集め、血液プレート計数法によって細菌数を測定した。
【0077】
ＢＬ＠Ｂ－ＳＡのインビトロＲＯＳ除去活性
Ｈ２Ｏ２誘導性酸化的ストレスから細胞を保護するために、異なる濃度のＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０をＨ２Ｏ２（２００μＭ）の非存在下又は存在下で２４時間ＨＴ－２９細胞と共に培養した。相対的細胞生存率を３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイにより試験した。
Ｈ２Ｏ２誘導性酸化的ストレスから細胞を保護するために、異なる濃度のＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０をＨ２Ｏ２（２００μＭ）の非存在下又は存在下で２４時間ＨＴ－２９細胞と共に培養した。相対的細胞生存率を３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイにより試験した。
【0078】
共焦点イメージング及びフローサイトメトリアッセイのために、ＨＴ－２９細胞をＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（０、２．５、５、及び１０μｇ／ｍＬ）と共にＨ２Ｏ２（４００μＭ）の非存在下又は存在下で培養した。２時間後、２０μＭの２’－７’ジクロロフルオレシン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）ジアセタート（ＤＣＦＨ－ＤＡ）を添加して、細胞間ＲＯＳ生成を検出した。ＰＢＳで３回洗浄した後、細胞を共焦点顕微鏡法で定性的に観察し、活性酸素種（ＲＯＳ）含量をフローサイトメトリにより定量的に分析した。
【0079】
インビトロＲＯＳ除去能の比較
ＢＬ、Ｂ－ＳＡ、ＢＬ＋Ｂ－ＳＡ、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０のインビトロＲＯＳ除去活性を、ＭＴＴアッセイ、共焦点顕微鏡法、及びフローサイトメトリによって等しい濃度で評価した。ＭＴＴアッセイの異なる測定におけるナノマテリアル濃度は０．６２５μｇ／ｍＬであり、共焦点顕微鏡法及びフローサイトメトリではどちらも２．５μｇ／ｍＬであった。処理していないＨＴ－２９細胞の生存率を１００％とし、処理していないＨＴ－２９細胞のＲＯＳ含量を１とした。
ＢＬ、Ｂ－ＳＡ、ＢＬ＋Ｂ－ＳＡ、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０のインビトロＲＯＳ除去活性を、ＭＴＴアッセイ、共焦点顕微鏡法、及びフローサイトメトリによって等しい濃度で評価した。ＭＴＴアッセイの異なる測定におけるナノマテリアル濃度は０．６２５μｇ／ｍＬであり、共焦点顕微鏡法及びフローサイトメトリではどちらも２．５μｇ／ｍＬであった。処理していないＨＴ－２９細胞の生存率を１００％とし、処理していないＨＴ－２９細胞のＲＯＳ含量を１とした。
【0080】
胃腸管におけるＢＬ＠Ｂ－ＳＡの触媒活性及び細菌生存率
胃腸管におけるＢＬ＠Ｂ－ＳＡの安定性を調査するために、３００μｌの等量のＢＬ（１×１０７ＣＦＵ）及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（１×１０７ＣＦＵのＢＬ及び５０μｇのＢ－ＳＡを含有する）を、ペプシンを含有する模擬胃液（ＳＧＦ）（ｐＨ１．２）、トリプシンを含有する模擬腸液（ＳＩＦ）（ｐＨ６．８）又は２００μＭのＨ２Ｏ２を含有する模擬炎症結腸液（ＳＩＣＦ）（ｐＨ７．８）のいずれかを追加した７００μｌの培地に添加し、３７℃にて穏やかに振盪しながらインキュベートした。所定の時点で、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡの触媒活性及び細菌生存率の両方を測定した。
胃腸管におけるＢＬ＠Ｂ－ＳＡの安定性を調査するために、３００μｌの等量のＢＬ（１×１０７ＣＦＵ）及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（１×１０７ＣＦＵのＢＬ及び５０μｇのＢ－ＳＡを含有する）を、ペプシンを含有する模擬胃液（ＳＧＦ）（ｐＨ１．２）、トリプシンを含有する模擬腸液（ＳＩＦ）（ｐＨ６．８）又は２００μＭのＨ２Ｏ２を含有する模擬炎症結腸液（ＳＩＣＦ）（ｐＨ７．８）のいずれかを追加した７００μｌの培地に添加し、３７℃にて穏やかに振盪しながらインキュベートした。所定の時点で、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡの触媒活性及び細菌生存率の両方を測定した。
【0081】
触媒活性を評価するために、サンプルを遠心分離し、洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁させて、５００μｇ／ｍＬのＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０又はＢＬを得た。最終濃度を５０μｇ／ｍＬとしたものを使用して、ＷＳＴ－８を用いたトータルスーパーオキシドジスムターゼキット、カタラーゼアッセイキット及びＴＡプローブによってＲＯＳ除去能を測定した。
【0082】
細菌生存率を測定するために、１００μｌの希釈サンプルを採取し、血液プレート上に広げた。３７℃で４８時間インキュベーションした後にコロニーを計数した。
【0083】
インビボターゲティング
プロバイオティクスが生体適合性人工酵素のターゲティングとコロニー形成とを促進できることを証明するために、光音響（ＰＡ）イメージングを実施した。５００μＬのＢ－ＳＡ又はＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（各々、５００μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡを含有する）を潰瘍性大腸炎（ＵＣ）マウスに経口投与した。６時間後、マウスをイソフルランで麻酔し、３７℃で維持した。Ｖｅｖｏ ＬＡＺＲシステムを用いて仰臥位で画像を取得し、画像は８０８ｎｍで集めた。
プロバイオティクスが生体適合性人工酵素のターゲティングとコロニー形成とを促進できることを証明するために、光音響（ＰＡ）イメージングを実施した。５００μＬのＢ－ＳＡ又はＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（各々、５００μｇ／ｍＬのＢ－ＳＡを含有する）を潰瘍性大腸炎（ＵＣ）マウスに経口投与した。６時間後、マウスをイソフルランで麻酔し、３７℃で維持した。Ｖｅｖｏ ＬＡＺＲシステムを用いて仰臥位で画像を取得し、画像は８０８ｎｍで集めた。
【0084】
プロバイオティクスがナノマテリアルの保持を促進できることをさらに検証するために、Ｂ－ＳＡ及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の代わりに蛍光ＤｉＲ－Ｂ－Ｌｉｐ及びＢＬ＠ＤｉＲ－Ｂ－Ｌｉｐを採用した。６時間後、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）マウスを安楽死させ、腸を切除した。各群からの腸における蛍光強度を、Ｃｙ５．５フィルターチャネルを備えたＩＶＩＳルミナシリーズＩＩＩインビボイメージングシステムを用いて曝露時間１秒で分析した。
【0085】
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）で誘導したマウスの潰瘍性大腸炎（ＵＣ）
６週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスを１ケージあたり５匹の群で収容し、実験に加える前に１週間馴化させた。潰瘍性大腸炎（ＵＣ）モデルを誘導するために、飲料水に添加した３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）をマウスに４日間与え、続いて標準水を与えた。対照健常マウスには標準水のみを与えた。その後、異なる比率のＢＬ＠Ｂ－ＳＡＸ（ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ２５、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ１００）、１．２５ｍｇ／ｋｇのＢ－ＳＡ、ＢＬ、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０、ＢＬ＋Ｂ－ＳＡ混合物（等用量のＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０のＢＬ及びＢ－ＳＡ）、１ｍｇ／ｋｇのＭＰＳ、１ｍｇ／ｋｇのＤＥＸ、４０ｍｇ／ｋｇの５－ＡＳＡ又はＰＢＳ、並びに０．６２５、１．２５、２．５及び５ｍｇ／ｋｇのＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０を所定の日にマウスに経口経路で投与した。体重の変化を９日の実験期間にわたって毎日評価した。マイクロバイオーム分析のために所定の日に便を集めた。実験の最終日に、マウスを犠牲死させ、結腸全体を切除した。結腸の長さを測定し、生理食塩水でやさしく洗浄した。２片の結腸を組織学的評価及び免疫蛍光染色に使用した。残りの結腸組織サンプルを酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）分析及び活性酸素種（ＲＯＳ）評価に使用した。
６週齢のメスＣ５７ＢＬ／６マウスを１ケージあたり５匹の群で収容し、実験に加える前に１週間馴化させた。潰瘍性大腸炎（ＵＣ）モデルを誘導するために、飲料水に添加した３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）をマウスに４日間与え、続いて標準水を与えた。対照健常マウスには標準水のみを与えた。その後、異なる比率のＢＬ＠Ｂ－ＳＡＸ（ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ２５、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ１００）、１．２５ｍｇ／ｋｇのＢ－ＳＡ、ＢＬ、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０、ＢＬ＋Ｂ－ＳＡ混合物（等用量のＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０のＢＬ及びＢ－ＳＡ）、１ｍｇ／ｋｇのＭＰＳ、１ｍｇ／ｋｇのＤＥＸ、４０ｍｇ／ｋｇの５－ＡＳＡ又はＰＢＳ、並びに０．６２５、１．２５、２．５及び５ｍｇ／ｋｇのＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０を所定の日にマウスに経口経路で投与した。体重の変化を９日の実験期間にわたって毎日評価した。マイクロバイオーム分析のために所定の日に便を集めた。実験の最終日に、マウスを犠牲死させ、結腸全体を切除した。結腸の長さを測定し、生理食塩水でやさしく洗浄した。２片の結腸を組織学的評価及び免疫蛍光染色に使用した。残りの結腸組織サンプルを酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）分析及び活性酸素種（ＲＯＳ）評価に使用した。
【0086】
マウスの２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）誘導性クローン病（ＣＤ）
メスＣ５７ＢＬ／６マウスを７日間馴化させ、１群あたり５匹で様々な群にランダムに分けた。ＴＮＢＳ誘導マウスを１重量％の２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）で前感作させ、７日間保持した。マウスを第８日に２．５重量％ＴＮＢＳ浣腸でさらに処置した。最後に、Ｂ－ＳＡ、ＢＬ、ＢＬ＋Ｂ－ＳＡ、及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡを、上記のＤＳＳモデルと同じプロトコルを使用して処理した。
メスＣ５７ＢＬ／６マウスを７日間馴化させ、１群あたり５匹で様々な群にランダムに分けた。ＴＮＢＳ誘導マウスを１重量％の２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）で前感作させ、７日間保持した。マウスを第８日に２．５重量％ＴＮＢＳ浣腸でさらに処置した。最後に、Ｂ－ＳＡ、ＢＬ、ＢＬ＋Ｂ－ＳＡ、及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡを、上記のＤＳＳモデルと同じプロトコルを使用して処理した。
【0087】
酢酸で誘導したイヌの潰瘍性大腸炎（ＵＣ）
９匹のビーグル犬を実験に加える前に１週間馴化させた。イヌのＵＣモデルを構築する前に、浣腸を用いてイヌの腸をまずきれいにした。麻酔後、ポリエチレンカテーテルを肛門から結腸内に２０ｃｍ挿入し、７％酢酸溶液（２ｍＬ／ｋｇ）をゆっくりと注入した。注入直後は、頭を低く、尾を高く保ち、結腸を酢酸で溶かしてＵＣモデルを構築した。最後に、イヌの結腸を１００ｍＬ生理食塩水で２回フラッシュし、イヌを安静にさせた。各群のイヌの状態と糞便の特徴を覚醒後に観察した。一日後、ＵＣイヌを二群に分けた。３匹のＵＣイヌを含む対照群には培地を投与し、一方、３匹のＵＣイヌを含むＢＬ＠Ｂ－ＳＡ群にはＢＬ＠Ｂ－ＳＡを連続して５日間経口投与した。健常群については、３匹の健常なイヌには、７％酢酸を生理食塩水に代えて毎日培地を投与する以外、対照群と同様のプロセスを受けさせた。体重の変化を８日の実験期間にわたって毎日評価した。０日、１日、２日、４日、及び７日に、イヌを内視鏡検査のために麻酔した。最終日に、イヌの血液サンプルを集めて、全血パネル分析を実施しつつ、結腸及び主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓）、並びに消化管（食道、胃、小腸、空腸、及び回腸）を組織学的評価及び免疫蛍光染色のために切除した。
９匹のビーグル犬を実験に加える前に１週間馴化させた。イヌのＵＣモデルを構築する前に、浣腸を用いてイヌの腸をまずきれいにした。麻酔後、ポリエチレンカテーテルを肛門から結腸内に２０ｃｍ挿入し、７％酢酸溶液（２ｍＬ／ｋｇ）をゆっくりと注入した。注入直後は、頭を低く、尾を高く保ち、結腸を酢酸で溶かしてＵＣモデルを構築した。最後に、イヌの結腸を１００ｍＬ生理食塩水で２回フラッシュし、イヌを安静にさせた。各群のイヌの状態と糞便の特徴を覚醒後に観察した。一日後、ＵＣイヌを二群に分けた。３匹のＵＣイヌを含む対照群には培地を投与し、一方、３匹のＵＣイヌを含むＢＬ＠Ｂ－ＳＡ群にはＢＬ＠Ｂ－ＳＡを連続して５日間経口投与した。健常群については、３匹の健常なイヌには、７％酢酸を生理食塩水に代えて毎日培地を投与する以外、対照群と同様のプロセスを受けさせた。体重の変化を８日の実験期間にわたって毎日評価した。０日、１日、２日、４日、及び７日に、イヌを内視鏡検査のために麻酔した。最終日に、イヌの血液サンプルを集めて、全血パネル分析を実施しつつ、結腸及び主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓）、並びに消化管（食道、胃、小腸、空腸、及び回腸）を組織学的評価及び免疫蛍光染色のために切除した。
【0088】
実験結果
プロバイオティクス細菌がＳＡｚｙｍｅｓの標的化及びコロニー形成を促進して、増加した活性酸素種（ＲＯＳ）及び炎症性因子を除去できる、人工酵素・プロバイオティクス細菌系を開発した。これにより炎症が軽減され、それによって細菌生存率が改善され、腸バリア機能及び腸微生物叢が再形成される。この系は、フェニルボロン酸官能基と含むリンカー、例えばＣ１８－ＰＥＧ－Ｂリンカーを介してBifidobacterium longum（ＢＬ）と単原子ナノザイム（ＳＡｚｙｍｅ）とを組み合わせることによって、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）治療に適用できる（図１ｃ）。開発された人工酵素・プロバイオティクス細菌系は、Bifidobacterium longum（ＢＬ）がＳＡｚｙｍｅのターゲティングとコロニー形成を改善して、炎症を低減する一方で、ＳＡｚｙｍｅは抗酸化酵素を模倣して、過酷な酸化条件下でも高い細菌生存率を維持することができることを示す（）。最終的に、結果として得られるプロバイオティクス・ＳＡｚｙｍｅ（ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ）系は、過剰なＲＯＳレベルを低下させ、炎症誘発性サイトカイン産生を阻害し、腸バリア機能を回復させ、また腸微生物叢の豊富さや多様性を増大させ、マウスの潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）モデル並びにビーグル犬の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）モデルにおいて顕著なインビボ治療効果を示す。この人工酵素・プロバイオティクス細菌系は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療するための新たな戦略を提示し、またプロバイオティクス及び人工酵素を統合することによって疾患治療への新たな見識を提供する。
プロバイオティクス細菌がＳＡｚｙｍｅｓの標的化及びコロニー形成を促進して、増加した活性酸素種（ＲＯＳ）及び炎症性因子を除去できる、人工酵素・プロバイオティクス細菌系を開発した。これにより炎症が軽減され、それによって細菌生存率が改善され、腸バリア機能及び腸微生物叢が再形成される。この系は、フェニルボロン酸官能基と含むリンカー、例えばＣ１８－ＰＥＧ－Ｂリンカーを介してBifidobacterium longum（ＢＬ）と単原子ナノザイム（ＳＡｚｙｍｅ）とを組み合わせることによって、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）治療に適用できる（図１ｃ）。開発された人工酵素・プロバイオティクス細菌系は、Bifidobacterium longum（ＢＬ）がＳＡｚｙｍｅのターゲティングとコロニー形成を改善して、炎症を低減する一方で、ＳＡｚｙｍｅは抗酸化酵素を模倣して、過酷な酸化条件下でも高い細菌生存率を維持することができることを示す（）。最終的に、結果として得られるプロバイオティクス・ＳＡｚｙｍｅ（ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ）系は、過剰なＲＯＳレベルを低下させ、炎症誘発性サイトカイン産生を阻害し、腸バリア機能を回復させ、また腸微生物叢の豊富さや多様性を増大させ、マウスの潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）モデル並びにビーグル犬の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）モデルにおいて顕著なインビボ治療効果を示す。この人工酵素・プロバイオティクス細菌系は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治療するための新たな戦略を提示し、またプロバイオティクス及び人工酵素を統合することによって疾患治療への新たな見識を提供する。
【0089】
ＢＬ＠Ｂ－ＳＡの設計及び特性決定
単原子ナノザイム（ＦｅＳＡ）は、走査型電子顕微鏡及び透過型電子顕微鏡によって特徴づけられるような、金属有機フレームワークカプセル化鉄（Ｆｅ）前駆体（Ｆｅ＠ＭＯＦ、Ｆｅ＠ＺＩＦ－８としても知られる）（図２ａ）の熱分解によって調製した。鉄含有ナノ粒子が存在しないことは、高解像度透過型電子顕微鏡（ＨＲＴＥＭ）画像（図３ａ）及び粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）試験によって明らかになった。一方、原子的に分散したＦｅ単原子を、収差補正型原子分解能高角度環状暗視野走査型透過電子顕微鏡法（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）（図３ｂ及びｃ）及びエネルギー分散スペクトル（ＥＤＳ）（図３ｄ）によって確認した。さらに、ＦｅＳＡの構造をラマン分光法及びＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）スペクトルによって分析すると、Ｆｅ－Ｎｘの配位と黒鉛状炭素の存在とが示唆された。さらに、ＦｅＳＡ中のＦｅ原子の正確な構造は、シンクロトロン放射ベースのＸ線吸収端近傍構造（ＸＡＮＥＳ）及び拡張Ｘ線吸収微細構造（ＥＸＡＦＳ）測定によってさらに明らかになった。正に荷電したＦｅδ＋をＮ原子によって安定化させ、ＦｅＫエッジＸＡＮＥＳスペクトル（図３ｅ）及びフーリエ変換κ３加重ＥＸＡＦＳスペクトル（図３ｆ）で示されるように、ＦｅＳＡ３８全体に亘って原子的に分散させた。定量的には、原子Ｆｅ部位は、ＥＸＡＦＳフィッティングにより窒素種によって５配位であることが確認され（図３ｇ～ｈ及び表１）、Ｆｅ原子ローディングは誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）によって１．３１重量％であると決定された。
単原子ナノザイム（ＦｅＳＡ）は、走査型電子顕微鏡及び透過型電子顕微鏡によって特徴づけられるような、金属有機フレームワークカプセル化鉄（Ｆｅ）前駆体（Ｆｅ＠ＭＯＦ、Ｆｅ＠ＺＩＦ－８としても知られる）（図２ａ）の熱分解によって調製した。鉄含有ナノ粒子が存在しないことは、高解像度透過型電子顕微鏡（ＨＲＴＥＭ）画像（図３ａ）及び粉末Ｘ線回折（ＸＲＤ）試験によって明らかになった。一方、原子的に分散したＦｅ単原子を、収差補正型原子分解能高角度環状暗視野走査型透過電子顕微鏡法（ＨＡＡＤＦ－ＳＴＥＭ）（図３ｂ及びｃ）及びエネルギー分散スペクトル（ＥＤＳ）（図３ｄ）によって確認した。さらに、ＦｅＳＡの構造をラマン分光法及びＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）スペクトルによって分析すると、Ｆｅ－Ｎｘの配位と黒鉛状炭素の存在とが示唆された。さらに、ＦｅＳＡ中のＦｅ原子の正確な構造は、シンクロトロン放射ベースのＸ線吸収端近傍構造（ＸＡＮＥＳ）及び拡張Ｘ線吸収微細構造（ＥＸＡＦＳ）測定によってさらに明らかになった。正に荷電したＦｅδ＋をＮ原子によって安定化させ、ＦｅＫエッジＸＡＮＥＳスペクトル（図３ｅ）及びフーリエ変換κ３加重ＥＸＡＦＳスペクトル（図３ｆ）で示されるように、ＦｅＳＡ３８全体に亘って原子的に分散させた。定量的には、原子Ｆｅ部位は、ＥＸＡＦＳフィッティングにより窒素種によって５配位であることが確認され（図３ｇ～ｈ及び表１）、Ｆｅ原子ローディングは誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ－ＭＳ）によって１．３１重量％であると決定された。
【0090】
【表1】
【0091】
Ｎ：配位数；Ｒ：結合距離；σ２：デバイワラー因子；ΔＥ０：内部電位補正。Ｒ因子：適合度、Ｓ０
２、０．８は、Ｆｅ２Ｏ３の実験的ＥＸＡＦＳフィットから得た。ＥＸＡＦＳ分光法によって得られた構造パラメータを特徴づける誤差範囲は、Ｎ±２０％；Ｒ±１％；σ２±２０％；ΔＥ０±２０と推定された。
【0092】
人工酵素をプロバイオティクスとさらに統合するために、ボロン酸－ポリ（エチレングリコール）（Ｃ１８－ＰＥＧ－Ｂ）のリンカーを採用した。Ｃ１８－ＰＥＧ－Ｂは、ボロン酸隣接ジオールベースのクリック反応により細菌の細胞壁からの多糖類と可逆的に結合できるだけでなく、疎水性Ｃ１８基と黒鉛状炭素との非共有相互作用によりＦｅＳＡ表面上で修飾することができる。ＦｅＳＡをＣ１８－ＰＥＧ－Ｂで官能化することによってＢ－ＳＡの作製に成功し、ＦｅＳＡのエッジがぼやけ（図３ｉ及びｊ）、ゼータ電位は負から中性に変化した。最後に、異なる割合のＢ－ＳＡとＢＬを単に混合することで、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡＸ（ｘは１×１０７ＣＦＵのＢＬに対するＢ－ＳＡの含量（μｇ）を意味する）のプロバイオティクス・人工酵素系を構築でき、インビトロ又はインビボで使用できる。インビボで使用する場合、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡＸを算出する際には対象の体重を考慮する。例えば、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０は、体重１ｋｇあたり２．５×１０８ＣＦＵのプロバイオティクス細菌（例えば、Bifidobacterium longum）、並びに体重１ｋｇあたり１．２５ｍｇの人工酵素及びリンカー（例えば、Ｂ－ＳＡ）を指す。これは、１×１０７ＣＦＵのプロバイオティクス細菌中の５０μｇの人工酵素及びリンカーに相当する。別の例では、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ１００は、１ｋｇあたり２．５×１０８ＣＦＵのプロバイオティクス細菌及び体重１ｋｇあたり２．５ｍｇの人工酵素及びリンカーを指す。これは、１×１０７ＣＦＵのプロバイオティクス細菌中１００μｇの人工酵素及びリンカーに相当する。ＴＥＭ画像によって明らかになるように、Ｂ－ＳＡはＢＬの表面上に位置し、このプロセス中にＢＬの形態変化は起こらなかった（図３ｋ及び１）。次に、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０を詳細に調査して、それらの最適細菌保護能力とＩＢＤ治療効果とを特定した（図４ｇ及び図８）。
【0093】
ＢＬ＠Ｂ－ＳＡのＲＯＳ除去能
ＩＢＤに関与する代表的ＲＯＳである、Ｏ２ ・－、Ｈ２Ｏ２、及び・ＯＨに対するＢ－ＳＡのＲＯＳ除去能をモニタリングした（図４ａ～ｃ）。まず、Ｏ２ ・－除去についてのＳＯＤ様活性を、ＷＳＴ－８を用いたＯ２特異的トータルスーパーオキシドジスムターゼアッセイキットを用いて調査した。図４ａに示すように、Ｂ－ＳＡは、Ｏ２ ・－のＨ２Ｏ２及びＯ２への不均化を触媒することで顕著なＳＯＤ様活性を有していた。産生したＨ２Ｏ２は、Ｂ－ＳＡのＣＡＴ様特性によってさらに除去することができ、これは生成したＯ２（図４ｂ）と２４０ｎｍでのＨ２Ｏ２吸光度の顕著な減少によって示される。Ｈ２Ｏ２除去能をカタラーゼアッセイキットによってさらに定量化した。さらに、Ｂ－ＳＡの・ＯＨ除去活性は、それぞれ５，５’－ジメチル－１－ピロリン－Ｎ－オキシド（ＤＭＰＯ）プローブ（図４ｃ）及びテレフタル酸（ＴＡ）プローブによって検出された。これらの明らかに減少したシグナル強度は、Ｂ－ＳＡが・ＯＨを効果的に除去できることを裏付けた。全体として、Ｂ－ＳＡは三つの代表的なＲＯＳに対して高い除去活性を示し、これらの性能は、Ｂ－ＳＡの濃度が増加するにつれて強化され、プロバイオティクス及び細胞を酸化的ストレスから保護する可能性を示唆する。
ＩＢＤに関与する代表的ＲＯＳである、Ｏ２ ・－、Ｈ２Ｏ２、及び・ＯＨに対するＢ－ＳＡのＲＯＳ除去能をモニタリングした（図４ａ～ｃ）。まず、Ｏ２ ・－除去についてのＳＯＤ様活性を、ＷＳＴ－８を用いたＯ２特異的トータルスーパーオキシドジスムターゼアッセイキットを用いて調査した。図４ａに示すように、Ｂ－ＳＡは、Ｏ２ ・－のＨ２Ｏ２及びＯ２への不均化を触媒することで顕著なＳＯＤ様活性を有していた。産生したＨ２Ｏ２は、Ｂ－ＳＡのＣＡＴ様特性によってさらに除去することができ、これは生成したＯ２（図４ｂ）と２４０ｎｍでのＨ２Ｏ２吸光度の顕著な減少によって示される。Ｈ２Ｏ２除去能をカタラーゼアッセイキットによってさらに定量化した。さらに、Ｂ－ＳＡの・ＯＨ除去活性は、それぞれ５，５’－ジメチル－１－ピロリン－Ｎ－オキシド（ＤＭＰＯ）プローブ（図４ｃ）及びテレフタル酸（ＴＡ）プローブによって検出された。これらの明らかに減少したシグナル強度は、Ｂ－ＳＡが・ＯＨを効果的に除去できることを裏付けた。全体として、Ｂ－ＳＡは三つの代表的なＲＯＳに対して高い除去活性を示し、これらの性能は、Ｂ－ＳＡの濃度が増加するにつれて強化され、プロバイオティクス及び細胞を酸化的ストレスから保護する可能性を示唆する。
【0094】
Ｂ－ＳＡの組込みによりBifidobacterium longum（ＢＬ）の抗酸化能力が増強されるか否かを明らかにするために、次に、素のＢＬ、Ｂ－ＳＡ、ＢＬ＋Ｂ－ＳＡ、及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０のＲＯＳ除去能を比較した。Ｂ－ＳＡで武装することにより、ＢＬは、天然のＢＬよりも有意に増強されたＲＯＳ除去活性を示し（図４ｄ～ｆ）、過酷な（ｈａｓｈ）酸化的微小環境での耐性を確保した。ＲＯＳに対するＢ－ＳＡ封入の防御は、操作されたプロバイオティクスに毒性Ｈ２Ｏ２を供給することによって分析した。ＢＬに対して様々な濃度のＢ－ＳＡは細菌生存率を有意に高め、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０は最良の保護効果を達成した（図４ｇ）。次に、Ｈ２Ｏ２の非存在下又は存在下でのＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の長期的結果を調査した。驚くべきことに、Ｂ－ＳＡでの操作は、通常の条件下ではＢＬの代謝を変化させない（図４ｈ）だけでなく、Ｈ２Ｏ２培地中で定常期に達するまでそれらの増殖を保護した（図４ｉ）。
【0095】
プロバイオティクスに対する人工酵素の細胞保護能力を検証して、ＨＴ２９細胞株をモデルとして使用することにより、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０アンサンブルのインビトロ抗酸化能力をさらに調査した（ＢＬ、Ｂ－ＳＡ、ＢＬ＋Ｂ－ＳＡも比較として検討した）。細胞毒性の結果から、単一Ｂ－ＳＡがＨＴ２９に対して無毒であることが実証され、生物学的応用が容易になった。一方、天然のＢＬはＨＴ２９の成長を促進でき、これは分泌された生物活性因子に起因する可能性がある（図４ｊ）。組み合わせた後でも、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０はＨＴ２９の成長を高めることができ、腸粘膜組織の修復が期待される。２００μＭのＨ２Ｏ２に曝露されると、ＨＴ２９細胞の生存率は約２０％まで急激に減少し（図４ｋ）、明らかな酸化的損傷を示す。しかしながら、Ｂ－ＳＡ、ＢＬ＋Ｂ－ＳＡ、及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の保護下で、Ｂ－ＳＡの細胞保護能力に起因して、生存率が有意に改善された。注目すべきことに、ＢＬの菌体外多糖類（ＥＰＳ）の抗酸化活性のために、ＢＬ処置群の生存率も上昇した。フローサイトメトリと蛍光顕微鏡法を用いて抗酸化機構を分析した。明らかに、ＲＯＳはＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０によって効果的に除去でき、効力はＢＬ単独よりも高かった（図４ｌ及びｍ）。まとめると、インビトロの結果から、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０がＨＴ２９細胞の成長を促進でき、ＲＯＳの攻撃からそれらを保護できることを示された。
【0096】
胃腸管におけるＢＬ＠Ｂ－ＳＡの触媒活性及び細菌生存率
ＢＬ＠Ｂ－ＳＡは、炎症を起こした腸に到達する前に、胃酸、胆汁酸塩及び炎症などの、経口摂取後の過酷な胃腸環境にさらされる可能性が高く、これにより人工酵素が不安定になる可能性があり、細菌が不活化される可能性さえある。ＢＬ及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０のＲＯＳ除去能を模擬胃液（ＳＧＦ）、模擬腸液（ＳＩＦ）及び模擬炎症性結腸液（ＳＩＣＦ）中で測定して、不利な条件により触媒活性が低下する可能性があるか否かを評価した。図５ａ～ｃに示すように、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０のＲＯＳ除去能は、表示された時点でＳＧＦ、ＳＩＦ、及びＳＩＣＦの全てにおいて一貫したままであり、ＢＬのＲＯＳ除去能よりも明らかに高く、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の並外れた安定性が示唆される。次に、ＢＬの生存率を上記模擬胃腸環境中で測定した。注目すべきことに、Ｂ－ＳＡで武装することで、炎症性腸管におけるＢＬの生存率を向上させることができ、酸性の胃やアルカリ性の腸におけるそれらの耐容性は損なわれない（図５ｄ～ｆ）。ＢＬ＠Ｂ－ＳＡは、炎症に対するＢＬの抵抗性を高めるだけでなく、ＲＯＳ除去能も維持し、炎症性環境を軽減し、腸微生物叢を調節することが期待される。
ＢＬ＠Ｂ－ＳＡは、炎症を起こした腸に到達する前に、胃酸、胆汁酸塩及び炎症などの、経口摂取後の過酷な胃腸環境にさらされる可能性が高く、これにより人工酵素が不安定になる可能性があり、細菌が不活化される可能性さえある。ＢＬ及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０のＲＯＳ除去能を模擬胃液（ＳＧＦ）、模擬腸液（ＳＩＦ）及び模擬炎症性結腸液（ＳＩＣＦ）中で測定して、不利な条件により触媒活性が低下する可能性があるか否かを評価した。図５ａ～ｃに示すように、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０のＲＯＳ除去能は、表示された時点でＳＧＦ、ＳＩＦ、及びＳＩＣＦの全てにおいて一貫したままであり、ＢＬのＲＯＳ除去能よりも明らかに高く、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の並外れた安定性が示唆される。次に、ＢＬの生存率を上記模擬胃腸環境中で測定した。注目すべきことに、Ｂ－ＳＡで武装することで、炎症性腸管におけるＢＬの生存率を向上させることができ、酸性の胃やアルカリ性の腸におけるそれらの耐容性は損なわれない（図５ｄ～ｆ）。ＢＬ＠Ｂ－ＳＡは、炎症に対するＢＬの抵抗性を高めるだけでなく、ＲＯＳ除去能も維持し、炎症性環境を軽減し、腸微生物叢を調節することが期待される。
【0097】
プロバイオティクスが腸内での人工酵素のターゲティングと保持を増強できるか否かをさらに試験した。近赤外領域におけるＢ－ＳＡの吸収から、その光音響（ＰＡ）シグナルを調査した。８０８ｎｍでのパルスレーザ励起下で、Ｂ－ＳＡは強力なＰＡコントラストを提供し、これは２５～１００μｇ／ｍＬの範囲内で濃度の関数として直線的に増加した。次に、大腸炎マウスに等量のＢ－ＳＡとＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０とを経口投与した。図５ｇに示すように、８０８ｎｍでのＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０群のＰＡシグナルは、Ｂ－ＳＡ群のＰＡシグナルよりも有意に高く、ＢＬの固有の腸コロニー形成能力の結果として、６時間で、ＤＳＳで炎症を起こした腸にＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０がより多く蓄積したことを示す。ＢＬのターゲティング能力の向上をさらに実証するために、投与後６時間でインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を使用してナノマテリアルの存在を可視化した。ＮＩＲ領域におけるＢ－ＳＡの広いスペクトル吸収のために、ＤＩＲの蛍光は完全に消光される。この問題に対処するために、Ｂ－ＳＡを、Ｃ１８－Ｂ－ＰＥＧのターゲティング基とＤＩＲの蛍光分子とからなる蛍光ＤＩＲ－Ｂ－Ｌｉｐで置換した。すると、ＤＩＲ－Ｂ－ＬｉｐをＢＬ上で容易に組み立てて、ＢＬ＠ＤＩＲ－Ｂ－Ｌｉｐを形成でき、蛍光変化は無視できるほどであった。ＰＡイメージング結果と一致して、経口投与されたＢＬ＠ＤＩＲ－Ｂ－Ｌｉｐはまた、ＤＳＳで炎症を起こした結腸において、ＤＩＲ－Ｂ－Ｌｉｐよりも効果的に蓄積する可能性があり、ＢＬの腸コロニー形成能力の恩恵を受けることができる。まとめると、ＢＬの修飾は、ナノマテリアルの滞留時間を延長して、持続可能なＲＯＳ除去及び炎症軽減性能を達成できる。
【0098】
ＢＬ＠Ｂ－ＳＡのインビボ毒性
安全なバイオアプリケーションを確実にするために、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０のインビボ毒物学を体系的に評価した。健常マウスにＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０を２８日間毎日経口投与するか又は経口投与しなかった。その後、それらの生化学及び血液学的パラメータ、体重変化、並びに主要臓器のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を分析した（図６ａ～ｅ）。ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ処置群と対照群との間に明確な差はなく、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の毒性は無視できることが示唆された。
安全なバイオアプリケーションを確実にするために、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０のインビボ毒物学を体系的に評価した。健常マウスにＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０を２８日間毎日経口投与するか又は経口投与しなかった。その後、それらの生化学及び血液学的パラメータ、体重変化、並びに主要臓器のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を分析した（図６ａ～ｅ）。ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ処置群と対照群との間に明確な差はなく、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の毒性は無視できることが示唆された。
【0099】
ＵＣに対するＢＬ＠Ｂ－ＳＡの効力
次に、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡの治療可能性をインビボで評価した。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）は基底腺窩（ｂａｓａｌ ｃｒｙｐｔ）の腸上皮細胞にとって有毒であり、粘膜バリアの完全性に影響を及ぼす。マウスに飲料水中３％（ｗ／ｖ）ＤＳＳを４日連続して投与して、大腸炎を誘導した。ＢＬとＢ－ＳＡとの割合がＢＬ＠Ｂ－ＳＡの治療結果に影響を及ぼすか否かを調べるために、大腸炎の初期段階で、マウスに様々なＢＬ＠Ｂ－ＳＡ処方を４日間毎日経口投与した。ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇのＢＬ及び１．２５ｍｇ／ｋｇのＢ－ＳＡを含む）及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡ１００（２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇのＢＬ及び２．５ｍｇ／ｋｇのＢ－ＳＡを含む）は、ＤＳＳで誘導された体重減少、疾患活動指数の増加、また結腸の長さの短縮から動物をよりよく保護した（図８）。副作用を最小限に抑えつつ用量の節約を達成するために、低処方のＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の投与量も調査した（図９）。最終的に、１．２５ｍｇ／ｋｇのＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０が大腸炎に対して強固な治療効果を発揮し、さらなる研究のために選択された。
次に、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡの治療可能性をインビボで評価した。デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）は基底腺窩（ｂａｓａｌ ｃｒｙｐｔ）の腸上皮細胞にとって有毒であり、粘膜バリアの完全性に影響を及ぼす。マウスに飲料水中３％（ｗ／ｖ）ＤＳＳを４日連続して投与して、大腸炎を誘導した。ＢＬとＢ－ＳＡとの割合がＢＬ＠Ｂ－ＳＡの治療結果に影響を及ぼすか否かを調べるために、大腸炎の初期段階で、マウスに様々なＢＬ＠Ｂ－ＳＡ処方を４日間毎日経口投与した。ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０（２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇのＢＬ及び１．２５ｍｇ／ｋｇのＢ－ＳＡを含む）及びＢＬ＠Ｂ－ＳＡ１００（２．５×１０８ＣＦＵ／ｋｇのＢＬ及び２．５ｍｇ／ｋｇのＢ－ＳＡを含む）は、ＤＳＳで誘導された体重減少、疾患活動指数の増加、また結腸の長さの短縮から動物をよりよく保護した（図８）。副作用を最小限に抑えつつ用量の節約を達成するために、低処方のＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の投与量も調査した（図９）。最終的に、１．２５ｍｇ／ｋｇのＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０が大腸炎に対して強固な治療効果を発揮し、さらなる研究のために選択された。
【0100】
その後、他の治療に対するＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の有効性も評価した（図７）。経口強制飼養後、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０は、ＤＳＳで誘導された大腸炎に関連した体重減少、ＤＡＩ増加、及び結腸の長さの短縮を主に妨害することができ、他の処方は、抗ＩＢＤ結果の低下を示した（図７ｂ～ｄ及び７ｌ）。さらに、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０で処置した大腸炎マウスは正常な糞便であったが、他の処置を施した大腸炎マウスは、下痢や血便をはじめとする症状を発現した（図７ｌ）。重要なことに、Ｈ＆Ｅ染色及び免疫組織化学的分析により、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０治療が結腸上皮を病的損傷から保護でき、ＩＬ－６、ＴＮＦα、及びＣＤ４５の発現を抑制できることが検証された（図７ｅ）。同様に、ＲＯＳ実験及びＥＬＩＳＡ分析でも、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０がＲＯＳ並びにＩＬ－６、ＩＦＮγ及びＭＰＯをはじめとする炎症誘発性因子のレベルを低下させることができ、その一方で、ＩＬ－１０などの抗炎症性因子のレベルを増加させることができることが確認された（図７ｆ及びｇ）。最後に、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０処置は、全身毒性、自己免疫、又は主要臓器における病態の明白な兆候を引き起こすことなく、ＵＣマウスの生存率を劇的に向上させることができた（図７ｈ）。まとめると、これらの結果はすべて、プロバイオティクス療法の人工酵素に媒介された増強により、大腸炎療法についてＢＬ、Ｂ－ＳＡ、及びＢＬ＋Ｂ－ＳＡよりも優れたＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の有効性を実証した。
【0101】
腸マイクロバイオームの調節
ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０を使用したＵＣマウスにおける腸微生物叢の組成の調節を療法の一形態として調査した。Ｖ４領域における１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子発現決定による便サンプルの分析により、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０処置が、他の群と比較したα多様性のシャノンエントロピー指数の増加によって示されるように、ＤＳＳ大腸炎マウスにおける細菌多様性を劇的に改善したことが明らかになった（図７ｉ）。非計量的多次元尺度法（ＮＭＤＳ）プロットにより、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０で処置されたＵＣマウスは、他の処置群と比べて異なる腸微生物叢プロファイルを有することが明らかになった（図７ｊ）。門／科レベルでのさらなる分析により、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０処置によりVerrucomicrobiotaの相対的存在量が劇的に減少し、Firmicutesの相対的存在量が増大し、Firmicutes／Bacteroidota比が改善され、健常な腸微生物叢が再形成されることが明らかになった（図７ｋ）。興味深いことに、ClostridiumクラスターＸｌＶａに含まれ、Ｔｒｅｇ細胞を誘導することが知られているLachnospiraceaeの相対的存在量は、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０での処置後に有意に増加し（図７ｋ）、それによって炎症が軽減された。まとめると、ＳＡｚｙｍｅ武装プロバイオティクスＢＬ＠Ｂ－ＳＡの経口投与により、腸微生物叢の豊富さと多様性を増加させて、ＩＢＤを効率的に治療できる。
ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０を使用したＵＣマウスにおける腸微生物叢の組成の調節を療法の一形態として調査した。Ｖ４領域における１６ＳリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子発現決定による便サンプルの分析により、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０処置が、他の群と比較したα多様性のシャノンエントロピー指数の増加によって示されるように、ＤＳＳ大腸炎マウスにおける細菌多様性を劇的に改善したことが明らかになった（図７ｉ）。非計量的多次元尺度法（ＮＭＤＳ）プロットにより、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０で処置されたＵＣマウスは、他の処置群と比べて異なる腸微生物叢プロファイルを有することが明らかになった（図７ｊ）。門／科レベルでのさらなる分析により、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０処置によりVerrucomicrobiotaの相対的存在量が劇的に減少し、Firmicutesの相対的存在量が増大し、Firmicutes／Bacteroidota比が改善され、健常な腸微生物叢が再形成されることが明らかになった（図７ｋ）。興味深いことに、ClostridiumクラスターＸｌＶａに含まれ、Ｔｒｅｇ細胞を誘導することが知られているLachnospiraceaeの相対的存在量は、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０での処置後に有意に増加し（図７ｋ）、それによって炎症が軽減された。まとめると、ＳＡｚｙｍｅ武装プロバイオティクスＢＬ＠Ｂ－ＳＡの経口投与により、腸微生物叢の豊富さと多様性を増加させて、ＩＢＤを効率的に治療できる。
【0102】
臨床ＩＢＤ薬との比較
ＢＬ＠Ｂ－ＳＡの有効性を、５－アミノサリチル酸（５－ＡＳＡ）、デキサメタゾン（ＤＥＸ）、メチルプレドニゾロン（ＭＰＳ）をはじめとする、臨床で広く使用されている他の従来型ＩＢＤ治療薬と比較した。ＢＬ＠Ｂ－ＳＡは、臨床用量で使用された５－ＡＳＡ、ＭＰＳ、及びＤＥＸよりも優れ、ＤＳＳ誘導性急性大腸炎に対して有効性が有意に増大し、体重回復、ＤＡＩ減少、及び結腸の長さの維持が達成された（図１０）。したがって、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０はＩＢＤ治療の臨床薬に代わる有望な候補である。
ＢＬ＠Ｂ－ＳＡの有効性を、５－アミノサリチル酸（５－ＡＳＡ）、デキサメタゾン（ＤＥＸ）、メチルプレドニゾロン（ＭＰＳ）をはじめとする、臨床で広く使用されている他の従来型ＩＢＤ治療薬と比較した。ＢＬ＠Ｂ－ＳＡは、臨床用量で使用された５－ＡＳＡ、ＭＰＳ、及びＤＥＸよりも優れ、ＤＳＳ誘導性急性大腸炎に対して有効性が有意に増大し、体重回復、ＤＡＩ減少、及び結腸の長さの維持が達成された（図１０）。したがって、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０はＩＢＤ治療の臨床薬に代わる有望な候補である。
【0103】
マウスのクローン（Ｃｈｒｏｎ’ｓ）病（ＣＤ）に対するＢＬ＠Ｂ－ＳＡの効力
クローン（Ｃｈｒｏｎ’ｓ）病（ＣＤ）はヒトにおける炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の別の主要な形態である。プロバイオティクス・ＳＡｚｙｍｅの治療適用範囲を探索するために、その有効性をクローン（Ｃｈｒｏｎ’ｓ）病（ＣＤ）の治療として評価した。クローン（Ｃｈｒｏｎ’ｓ）病（ＣＤ）は、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の直腸内投与によって誘導され、これによって、ハプテン修飾オートローガスタンパク質／内腔抗原に対するＴ細胞媒介性応答が誘導される（図１１ａ）。第９日に明らかな体重減少と出血が観察され、マウスにおいてクローン病（ＣＤ）の誘導に成功したことが示唆される（図１１ｂ、ｃ）。その後、クローン病（ＣＤ）マウスに様々な物質を４日間経口投与した。体重変化、疾患活動指数（ＤＡＩ）、及び結腸の長さを比較すると、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡのかなりの治療有効性が示され（図１１ｂ～ｅ）、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡが他の処方よりも有効性が高いことが示された。
クローン（Ｃｈｒｏｎ’ｓ）病（ＣＤ）はヒトにおける炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の別の主要な形態である。プロバイオティクス・ＳＡｚｙｍｅの治療適用範囲を探索するために、その有効性をクローン（Ｃｈｒｏｎ’ｓ）病（ＣＤ）の治療として評価した。クローン（Ｃｈｒｏｎ’ｓ）病（ＣＤ）は、２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）の直腸内投与によって誘導され、これによって、ハプテン修飾オートローガスタンパク質／内腔抗原に対するＴ細胞媒介性応答が誘導される（図１１ａ）。第９日に明らかな体重減少と出血が観察され、マウスにおいてクローン病（ＣＤ）の誘導に成功したことが示唆される（図１１ｂ、ｃ）。その後、クローン病（ＣＤ）マウスに様々な物質を４日間経口投与した。体重変化、疾患活動指数（ＤＡＩ）、及び結腸の長さを比較すると、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡのかなりの治療有効性が示され（図１１ｂ～ｅ）、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡが他の処方よりも有効性が高いことが示された。
【0104】
イヌの潰瘍性大腸炎（ＵＣ）に対する効力
人工酵素武装プロバイオティクスの臨床応用を促進するために、大腸炎に罹った大型動物で治療可能性をさらに評価した。ビーグル犬の結腸内腔に７％酢酸を投与することによってイヌＵＣモデルを構築した（図１２ａ）。酢酸は腸管に損傷を与え、炎症性因子の産生を引き起こす可能性があり、このことは、ヒト大腸炎における炎症の伝播及び種類と類似している。一日後、健常なイヌの平滑でピンク色の結腸と比較して、酢酸で処置したイヌの結腸では内視鏡により明らかな出血と傷が観察され、ＵＣモデルの確立に成功したことが明らかになった（図１２ｃ）。療法中、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の経口投与は、損傷した結腸の治癒を有意に促進したが、未処置のＵＣイヌでは依然として傷と出血が見られた（図１２ｃ及びｄ）。最後に、対照群と比較して、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０処置群のＷＢＣレベルは、処置後に正常に戻り、潜在的有効性が示された（図１２ｂ）。一方、Ｈ＆Ｅ分析でも、未処置のイヌで、粘膜固有層における炎症細胞浸潤、腺破壊、杯細胞枯渇をはじめとする重度の炎症が明らかになった（図１２ｅ）。しかしながら、炎症反応は、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０処置後に低減し、このことは、免疫組織化学的染色によってもさらに確認された（図１２ｅ）。炎症レベルを画像Ｊによってさらに定量化すると、以前の結果と一致していた（図１２ｆ）。全体的に、これらの結果は、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡがイヌのＩＢＤに対して有効であることを示し、ヒトでの使用可能性が期待される。
人工酵素武装プロバイオティクスの臨床応用を促進するために、大腸炎に罹った大型動物で治療可能性をさらに評価した。ビーグル犬の結腸内腔に７％酢酸を投与することによってイヌＵＣモデルを構築した（図１２ａ）。酢酸は腸管に損傷を与え、炎症性因子の産生を引き起こす可能性があり、このことは、ヒト大腸炎における炎症の伝播及び種類と類似している。一日後、健常なイヌの平滑でピンク色の結腸と比較して、酢酸で処置したイヌの結腸では内視鏡により明らかな出血と傷が観察され、ＵＣモデルの確立に成功したことが明らかになった（図１２ｃ）。療法中、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０の経口投与は、損傷した結腸の治癒を有意に促進したが、未処置のＵＣイヌでは依然として傷と出血が見られた（図１２ｃ及びｄ）。最後に、対照群と比較して、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０処置群のＷＢＣレベルは、処置後に正常に戻り、潜在的有効性が示された（図１２ｂ）。一方、Ｈ＆Ｅ分析でも、未処置のイヌで、粘膜固有層における炎症細胞浸潤、腺破壊、杯細胞枯渇をはじめとする重度の炎症が明らかになった（図１２ｅ）。しかしながら、炎症反応は、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０処置後に低減し、このことは、免疫組織化学的染色によってもさらに確認された（図１２ｅ）。炎症レベルを画像Ｊによってさらに定量化すると、以前の結果と一致していた（図１２ｆ）。全体的に、これらの結果は、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡがイヌのＩＢＤに対して有効であることを示し、ヒトでの使用可能性が期待される。
【0105】
イヌに対するＢＬ＠Ｂ－ＳＡのバイオセイフティー。
最後に、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡのバイオセイフティーを処置後のイヌに関して評価した（図１３）。処置中、イヌの有意な体重変化はなく、処置の安全性が示される（）。さらに、Ｈ＆Ｅ染色した主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓）並びに消化管（食道、胃、小腸、空腸、及び回腸）は、健常群とＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０処置群（図１３）との間でごくわずかな違いしか示さず、処方が大型動物や人に適していることが示される。
最後に、ＢＬ＠Ｂ－ＳＡのバイオセイフティーを処置後のイヌに関して評価した（図１３）。処置中、イヌの有意な体重変化はなく、処置の安全性が示される（）。さらに、Ｈ＆Ｅ染色した主要臓器（心臓、肝臓、脾臓、肺、及び腎臓）並びに消化管（食道、胃、小腸、空腸、及び回腸）は、健常群とＢＬ＠Ｂ－ＳＡ５０処置群（図１３）との間でごくわずかな違いしか示さず、処方が大型動物や人に適していることが示される。
【0106】
結論
炎症の急速な寛解と腸マイクロバイオームのバランスの回復は、限定されるものではないが、潰瘍性大腸炎の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）又はディスバイオシスなどの胃腸管障害の治療で極めて重要である。しかしながら、抗炎症薬及び／又はプロバイオティクスの使用などの従来の治療では満足できる結果は得られない。さらに、このような抗炎症薬及び／又はプロバイオティクスの長期使用は、患者の生活の質を低下させ、結腸がんなどのより重篤な疾患のリスクを高める潜在的な健康被害をもたらす可能性がある。
炎症の急速な寛解と腸マイクロバイオームのバランスの回復は、限定されるものではないが、潰瘍性大腸炎の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）又はディスバイオシスなどの胃腸管障害の治療で極めて重要である。しかしながら、抗炎症薬及び／又はプロバイオティクスの使用などの従来の治療では満足できる結果は得られない。さらに、このような抗炎症薬及び／又はプロバイオティクスの長期使用は、患者の生活の質を低下させ、結腸がんなどのより重篤な疾患のリスクを高める潜在的な健康被害をもたらす可能性がある。
【0107】
本願は、ＩＢＤの微小環境を迅速かつ効率的に調節する抗酸化能力を有する人工酵素に対するプロバイオティクス細菌リンカーを含む操作された系を提示する（図２）。この系では、臨床的に使用されている抗炎症薬の代わりに、天然の抗酸化防御系を模倣するために人工酵素を使用した。これらはＲＯＳを除去して炎症を軽減し（図４）、臨床薬よりも優れた持続的カスケード触媒作用とバイオセイフティーの利点がある。そして、炎症環境が緩和されると、細菌生存率が向上し、腸バリア機能と腸微生物叢が急速に再形成される（図４ｇ及び図７）。
【0108】
さらに、ナノマテリアルの保持時間は延長され（図５ｇ）、これは、プロバイオティクスの固有のコロニー形成能力によるものである。したがって、本明細書で記載するようなＢＬ＠Ｂ－ＳＡなどの本明細書中で開示する系は、（ｉ）活性酸素種（ＲＯＳ）のレベル及び炎症の抑制；（ｉｉ）損傷した腸バリアの修復；及び（ｉｉｉ）局所組織における腸マイクロバイオームの調節という利点を提供する。ＤＳＳ誘導性潰瘍性大腸炎（ＵＣ）で治療可能性が実証され（図７）、これは、５－ＡＳＡ、ＭＰＳ、及びＤＥＸなどの臨床で使用される他の従来型治療薬を上回った（図１０）。さらに、例示的な系ＢＬ＠Ｂ－ＳＡは、ＴＮＢＳ誘発性クローン病（ＣＤ）の症状を軽減することも示されている（図１１）。最後に、例示的系ＢＬ＠Ｂ－ＳＡは、ビーグル犬の酢酸関連ＵＣにも有効であることが示され（図１２）、これはヒト大腸炎における炎症の伝播と種類に類似している。処置中、例示的系ＢＬ＠Ｂ－ＳＡを使用した反復処置後のマウス及びイヌでは、日和見感染、自己免疫、肝毒性などの有害事象は観察されなかった（図６及び１３）。これらの結果は、本願の系が、様々な胃腸管障害を治療するための治療薬として使用できることを示す。
【0109】
まとめると、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの胃腸管障害の微小環境を調節するために人工酵素・プロバイオティクス細菌系を開発した。この系は炎症を起こした結腸を効果的に標的とすることができ、活性酸素種（ＲＯＳ）の発現及び炎症を抑制でき、損傷した腸バリアを修復でき、局所組織における腸マイクロバイオームを調節できる。この研究によって、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）などの胃腸管障害を効果的に治療するための新規方策が開発されるだけでなく、炎症を軽減し、微生物叢のディスバイオシスを管理する新規抗炎症プロバイオティクスも提供される。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図6-5】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図7-5】
【図7-6】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図12-3】
【図12-4】
【図13】
【国際調査報告】