特表 2024-534724 細胞外小胞を処理及び分析するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-25

(54)【発明の名称】細胞外小胞を処理及び分析するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/02 20060101AFI20240917BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240917BHJP

   C12N 5/071 20100101ALN20240917BHJP

【ＦＩ】

C12N1/02

C12Q1/02

C12N5/071

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024514086

(86)(22)【出願日】2022-09-28

(85)【翻訳文提出日】2024-02-29

(86)【国際出願番号】 US2022077134

(87)【国際公開番号】W WO2023056272

(87)【国際公開日】2023-04-06

(31)【優先権主張番号】63/249,705

(32)【優先日】2021-09-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524078778

【氏名又は名称】カプスゲル イタリー エス．アール．エル．

【氏名又は名称原語表記】ＣＡＰＳＵＧＥＬ ＩＴＡＬＹ Ｓ．Ｒ．Ｌ．

(71)【出願人】

【識別番号】524078789

【氏名又は名称】エクソソミクス エスピーエー

【氏名又は名称原語表記】ＥＸＯＳＯＭＩＣＳ ＳＰＡ

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】ゾッコ， ダヴィデ

(72)【発明者】

【氏名】クリスキュオリ， マッティア

(72)【発明者】

【氏名】パッサラックア， イラリア

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA20

4B063QQ08

4B063QR48

4B063QR66

4B063QS17

4B063QS40

4B063QX02

4B065AA90X

4B065AB10

4B065AC14

4B065BA30

4B065BD15

4B065BD17

4B065BD18

4B065BD39

4B065BD50

4B065CA60

(57)【要約】

本開示は、蛍光染色色素又は抗体と接触させることの前に、細胞外小胞が精製されない、細胞外小胞を処理するための方法を提供する。遠心分離フィルタを利用することによって、細胞外小胞の１つ以上の特徴の分析の前に、過剰の染色色素又は抗体を容易に除去することができる。方法は、細胞外小胞の高い濃度を維持しながら、迅速かつ単純な処理及び分析を提供する。
【選択図】図１－１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞外小胞を処理するための方法であって、
ａ．生体液中で細胞外小胞を濃縮することと、
ｂ．前記細胞外小胞の濃度を決定することと、
ｃ．前記細胞外小胞を、蛍光染色色素又は細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることと、
ｄ．前記接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、
ｅ．前記接触させた細胞外小胞を、２００～７５０ｋＤの分子量カットオフのポリエーテルスルホン濾材を含む遠心分離フィルタに通して、前記標識された細胞外小胞集団を過剰の蛍光染色色素又は過剰の抗体から分離することと、
ｆ．前記標識された細胞外小胞集団を回収することと、を含み、
ｃにおける前記接触させることの前に、前記細胞外小胞が精製されない、方法。

【請求項2】

前記濃縮することが、前記生体液をタンジェンシャルフローフィルタに通すことを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記タンジェンシャルフローフィルタが、約１００ｋＤ～約５００ｋＤの分子量カットオフを有する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記細胞外小胞を、前記蛍光染色色素６－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）と接触させる、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記細胞外小胞を、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び／又は抗ＩｇＧ１抗体と接触させる、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記細胞外小胞を、前記蛍光染色色素と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも１時間インキュベートする、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記細胞外小胞を、前記抗体と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも３０分間インキュベートする、請求項１～３又は５に記載の方法。

【請求項8】

前記細胞外小胞が、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記生体液中の細胞外小胞の前記濃度が、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

細胞外小胞の前記濃度が、ｃにおける前記接触させることの前に、少なくとも１×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであると決定される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記生体液が、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣ細胞の成長培地を含む調整培地である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記接触させた細胞外小胞を、前記遠心分離フィルタに少なくとも１０，０００×ｇの遠心力で少なくとも１０分間通す、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

細胞外小胞を分析するための方法であって、
ａ．タンジェンシャルフローフィルタを用いて、調整培地中で細胞外小胞を濃縮することと、
ｂ．前記細胞外小胞の濃度を決定することと、
ｃ．前記細胞外小胞を、蛍光染色色素又は細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることと、
ｄ．前記接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、
ｅ．前記接触させた細胞外小胞を３００ｋＤの分子量カットオフのポリエーテルスルホン濾材を含む遠心分離フィルタに通して、前記標識された細胞外小胞集団を過剰の蛍光染色色素又は過剰の抗体から分離することと、
ｆ．前記標識された細胞外小胞集団を回収することと、
ｇ．前記回収され、標識された細胞外小胞集団を、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して分析することと、を含み、
ｃにおける前記接触させることの前に、前記細胞外小胞がサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製されない、方法。

【請求項14】

前記細胞外小胞を、前記蛍光染色色素６－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）と接触させる、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記細胞外小胞を、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び／又は抗ＩｇＧ１抗体と接触させる、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記細胞外小胞を、前記蛍光染色色素と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも１時間インキュベートする、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項17】

前記細胞外小胞を、前記抗体と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも３０分間インキュベートする、請求項１３又は１５に記載の方法。

【請求項18】

前記細胞外小胞が、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記調整培地中の細胞外小胞の前記濃度が、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定される、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

細胞外小胞の前記濃度が、ｃにおける前記接触させることの前に、少なくとも１×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであると決定される、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記調整培地が、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣ細胞の成長培地を含み、前記細胞外小胞が、ｂにおいて、３００ｋＤの分子量カットオフのタンジェンシャルフローフィルタを使用して濃縮される、請求項１３～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記接触させた細胞外小胞を、前記遠心分離フィルタに少なくとも１０，０００×ｇの遠心力で少なくとも１０分間通す、請求項１３～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記回収され、標識された細胞外小胞集団を分析して、標識効率、細胞外小胞数、細胞外小胞濃度、及び細胞外小胞サイズのうちの１つ以上を決定する、請求項１３～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

細胞外小胞を処理するための方法であって、
ａ．生体液中で細胞外小胞を濃縮することと、
ｂ．前記細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、
ｃ．前記細胞外小胞を、細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることと、
ｄ．前記接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、
ｅ．前記標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、
ｆ．前記標識された細胞外小胞集団を回収することと、を含み、
ｃにおける前記接触させることの前に、前記細胞外小胞が精製されない、方法。

【請求項25】

前記細胞外小胞を、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び／又は抗ＩｇＧ１抗体と接触させる、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記細胞外小胞を、１×１０^８～１×１０^９個の抗体粒子と接触させる、請求項２４又は２５に記載の方法。

【請求項27】

前記細胞外小胞を前記抗体と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも３０分間インキュベートする、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記細胞外小胞が、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

細胞外小胞の前記濃度が、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定される、請求項２４～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記生体液が、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣ細胞の成長培地を含む調整培地であり、前記濃縮することが、前記生体液をタンジェンシャルフローフィルタに通すことを含む、請求項２４～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

細胞外小胞を分析するための方法であって、
ａ．タンジェンシャルフローフィルタを用いて、調整培地中で細胞外小胞を濃縮することと、
ｂ．前記細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、
ｃ．前記細胞外小胞を、細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることと、
ｄ．前記接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、
ｅ．前記標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、
ｆ．前記標識された細胞外小胞集団を回収することと、
ｇ．前記回収され、標識された細胞外小胞集団を、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して分析することと、を含み、
ｃにおける前記接触させることの前に、前記細胞外小胞がサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製されない、方法。

【請求項32】

前記細胞外小胞を、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び／又は抗ＩｇＧ１抗体と接触させる、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記細胞外小胞を、１×１０^８～１×１０^９個の抗体粒子と接触させる、請求項３１又は３２に記載の方法。

【請求項34】

前記細胞外小胞を前記抗体と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも３０分間インキュベートする、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記細胞外小胞が、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

細胞外小胞の前記濃度が、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定される、請求項３１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記調整培地が、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣ細胞の成長培地を含み、前記細胞外小胞が、ｂにおいて、３００ｋＤの分子量カットオフのタンジェンシャルフローフィルタを使用して濃縮される、請求項３１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記回収され、標識された細胞外小胞集団を分析して、標識効率、細胞外小胞数、細胞外小胞濃度、及び細胞外小胞サイズのうちの１つ以上を決定する、請求項３１～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

細胞外小胞を処理するための方法であって、
ａ．生体液中で細胞外小胞を濃縮することと、
ｂ．前記細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、
ｃ．前記細胞外小胞を、ＲＮＡ特異的色素と接触させることと、
ｄ．前記接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、
ｅ．前記標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、
ｆ．前記標識された細胞外小胞集団を回収することと、を含み、
ｃにおける前記接触させることの前に、前記細胞外小胞が精製されない、方法。

【請求項40】

前記細胞外小胞を、緑色蛍光ＲＮＡ染色剤又は赤色蛍光ＲＮＡ染色剤と接触させる、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記細胞外小胞を、前記ＲＮＡ特異的色素と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも２０分間インキュベートする、請求項３９又は４０に記載の方法。

【請求項42】

前記細胞外小胞が、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される、請求項３９～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

細胞外小胞の前記濃度が、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定される、請求項３９～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記生体液が、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣ細胞の成長培地を含む調整培地であり、前記濃縮することが、前記生体液をタンジェンシャルフローフィルタに通すことを含む、請求項３９～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

細胞外小胞を分析するための方法であって、
ａ．タンジェンシャルフローフィルタを用いて、調整培地中で細胞外小胞を濃縮することと、
ｂ．前記細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、
ｃ．前記細胞外小胞を、緑色蛍光ＲＮＡ染色剤又は赤色蛍光ＲＮＡ染色剤と接触させることと、
ｄ．前記接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、
ｅ．前記標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、
ｆ．前記標識された細胞外小胞集団を回収することと、
ｇ．前記回収され、標識された細胞外小胞集団を、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して分析することと、を含み、
ｃにおける前記接触させることの前に、前記細胞外小胞がサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製されない、方法。

【請求項46】

前記細胞外小胞を、前記緑色蛍光ＲＮＡ染色剤又は前記赤色蛍光ＲＮＡ染色剤と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも２０分間インキュベートする、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記細胞外小胞が、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される、請求項４５又は４６に記載の方法。

【請求項48】

細胞外小胞の前記濃度が、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定される、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

前記調整培地が、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣ細胞の成長培地を含み、前記細胞外小胞が、ｂにおいて、３００ｋＤの分子量カットオフのタンジェンシャルフローフィルタを使用して濃縮される、請求項４５～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

前記回収され、標識された細胞外小胞集団を分析して、標識効率、細胞外小胞数、細胞外小胞濃度、及び細胞外小胞サイズのうちの１つ以上を決定する、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【発明の詳細な説明】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年９月２９日出願の米国仮特許出願第６３／２４９，７０５号の利益を主張する。

【技術分野】

【0002】

本開示は、蛍光染色色素又は抗体と接触させることの前に、細胞外小胞が精製されない、細胞外小胞を処理するための方法を提供する。遠心分離フィルタを利用することによって、細胞外小胞の１つ以上の特徴の分析の前に、過剰の染色色素又は抗体を容易に除去することができる。方法は、細胞外小胞の高い濃度を維持しながら、迅速かつ単純な処理及び分析を提供する。

【背景技術】

【0003】

様々ながん及び他の状態のために、エクソソーム又は細胞外小胞を使用する用途及び治療の研究は、継続的に発展している。タンパク質、脂質、及び核酸（ｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸を含む）を含む様々なカーゴを送達するこれらの５０～１５０ｎｍの細胞由来の小胞の能力は、様々な異なる細胞型への送達のためにそれらを利用することへの関心をもたらしている。

【0004】

生成細胞集団及び関連するデブリから細胞外小胞を単離及び分析するために、様々な方法が開発されている。しかしながら、これらの従来のアプローチは、多くの場合、細胞外小胞の損失を生じるか、又は試料を顕著に希釈し、これが、一貫性がないか又は欠陥のある分析をもたらし得る。

【0005】

必要とされるのは、望ましくない希釈を伴わずに、細胞外小胞分離及び分析を提供する単純で迅速なプロセスである。本発明は、そのようなプロセスを提供する。

【発明の概要】

【0006】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞外小胞を処理するための方法であって、生体液中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度を決定することと、細胞外小胞を、蛍光染色色素又は細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして標識された細胞外小胞集団を生成することと、接触させた細胞外小胞を、２００～７５０ｋＤの分子量カットオフのポリエーテルスルホン濾材を含む遠心分離フィルタに通して、標識された細胞外小胞集団を過剰の蛍光染色色素又は過剰の抗体から分離することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、を含み、接触させることの前に、細胞外小胞が精製されない、方法である。

【0007】

更なる実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞外小胞を分析するための方法であって、タンジェンシャルフローフィルタを用いて、調整培地中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度を決定することと、細胞外小胞を、蛍光染色色素又は細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして標識された細胞外小胞集団を生成することと、接触させた細胞外小胞を、３００ｋＤの分子量カットオフのポリエーテルスルホン濾材を含む遠心分離フィルタに通して、標識された細胞外小胞集団を過剰の蛍光染色色素又は過剰の抗体から分離することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、回収され、標識された細胞外小胞集団を、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して分析することと、を含み、接触させることの前に、細胞外小胞がサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製されない、方法である。

【0008】

追加の実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞外小胞を処理するための方法であって、生体液中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、細胞外小胞を、細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、を含み、接触させることの前に、細胞外小胞が精製されない、方法である。

【0009】

なお更なる実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞外小胞を分析するための方法であって、タンジェンシャルフローフィルタを用いて、調整培地中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、細胞外小胞を、細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、回収され、標識された細胞外小胞集団を、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して分析することと、を含み、接触させることの前に、細胞外小胞がサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製されない、方法である。

【0010】

更なる実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞外小胞を処理するための方法であって、生体液中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、細胞外小胞をＲＮＡ特異的色素と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、を含み、接触させることの前に、細胞外小胞が精製されない、方法である。

【0011】

追加の実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞外小胞を分析するための方法であって、タンジェンシャルフローフィルタを用いて、調整培地中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、細胞外小胞を、緑色蛍光ＲＮＡ染色剤又は赤色蛍光ＲＮＡ染色剤と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、回収され、標識された細胞外小胞集団を、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して分析することと、を含み、接触させることの前に、細胞外小胞がサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製されない、方法である。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1-1】サイズ排除クロマトグラフィー及び濾過後のＥＶからの色素除去を示す。

【図1-2】図１－１の続きである。

【図2】蛍光色素除去のための異なる分子量カットオフフィルタの比較を示す。

【図3A】ＥＶサイズ分布に対するＮａｎｏＳｅｐ３００Ｋ濾過の効果を示す。

【図3B】ＥＶサイズ分布に対するＮａｎｏＳｅｐ３００Ｋ濾過の効果を示す。

【図4A】濾過及びサイズ排除クロマトグラフィーを介して過剰の抗体ＥＶを除去することによる、抗テトラスパニン抗体（ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１）を含む、精製されたＥＶの染色を示す。

【図4B】濾過によって過剰の抗体を除去した、抗テトラスパニン抗体（ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１）を含む調整培地及びプロセス中の試料の染色を示す。

【図4C】濾過によって過剰の抗体を除去した、抗テトラスパニン抗体（ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１）を含む調整培地及びプロセス中の試料の染色を示す。

【図5A】ＥＶの抗体標識を示す、粒径分布を示す。

【図5B】ＥＶの抗体標識を示す、粒径分布を示す。

【図5C】ＥＶの抗体標識を示す、粒径分布を示す。

【図5D】ＥＶの抗体標識を示す、粒径分布を示す。

【図5E】ＥＶの抗体標識を示す、粒径分布を示す。

【図5F】ＥＶの抗体標識を示す、粒径分布を示す。

【図6A】抗体標識の確認に対する希釈の効果を示す。

【図6B】抗体標識の確認に対する希釈の効果を示す。

【図7A】抗体標識及びＥＶサイズに対する希釈方法の効果を示す。

【図7B】ＭＳＣ由来及びＨＥＫ－２９３２９３由来の培養物からの調整培地を用いた抗体標識における希釈方法の効果を示す。

【図7C】ＭＳＣ由来及びＨＥＫ－２９３２９３由来の培養物からの調整培地を用いた抗体標識における希釈方法の効果を示す。

【図8A】ＲＮＡ染色及び希釈の結果を示す。

【図8B】ＲＮＡ染色及び希釈の結果を示す。

【図8C】ＲＮＡ染色及び希釈の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

「ａ」又は「ａｎ」という単語の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書において「含む」という用語とともに使用される場合、「１つ」を意味してもよいが、「１つ以上」、「少なくとも１つ」、及び「１つ又は１を超える」の意味とも一致してもよい。

【0014】

本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、該値を決定するために使用される方法／デバイスについての誤差の固有の変動を含むことを示すために使用される。典型的には、この用語は、状況に応じて、およそ１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、若しくは２０％、又は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、若しくは２０％未満の変動を含むことを意味する。

【0015】

特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されるか又はその代替物が互いに排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。

【0016】

本明細書及び特許請求の範囲で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（及び含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（及び有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（及び含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）、又は「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（及び含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」）という文言は、包括的又はオープンエンドであり、追加の、記載されていない、エレメント又は方法ステップを除外しない。

【0017】

実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞外小胞を処理するための方法である。「細胞外小胞」（ＥＶ）及び「エクソソーム」という用語は、本明細書で互換的に使用され、細胞活性化又はストレス下のいずれかで細胞から生成される、サブミクロンサイズ又はナノメートルサイズの膜小胞を指す。ＥＶは、その親細胞のから核酸、タンパク質、及び脂質を運び、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、又はｓｉＲＮＡを含む所望の核酸を運ぶように操作され得る。好適には、ＥＶは、約３０ｎｍ～約２００ｎｍ程度のサイズである。

【0018】

本明細書に記載の処理方法は、１つ以上の細胞型を介するそれらの産生に続いて、ＥＶを生体液から分離するために使用される。本明細書で使用される場合、「生体液」は、好適には、ＥＶの産生に使用される細胞、細胞デブリ、緩衝液、細胞成長培地などを含む溶液を指す。

【0019】

実施形態では、ＥＶを処理するための方法は、生体液中で細胞外小胞を濃縮すること、すなわち、生体液中に存在するＥＶを濃縮することを含む。ＥＶを濃縮する方法は、例えば、ＥＶを１つ以上のタンジェンシャルフローフィルタに通して、ＥＶを濃縮する（すなわち、試料中のＥＶの数を維持しながら、流体体積を減少させる）ことを含む。１つ以上のタンジェンシャルフローフィルタを介してＥＶを濃縮する前に、ＥＶは、約１０分間３００×ｇ、続いて約２０分間１２００×ｇ、続いて約３０分間１０，０００×ｇなどの１つ以上の遠心分離ステップを通じて処理され得る。追加の遠心分離ステップも使用され得る。加えて、遠心分離の速度及び持続時間は、例えば、約５～２０分間約２００×ｇ～５００×ｇ、続いて約１０～３０分間約８００×ｇ～１５００×ｇ、続いて約２０～４０分間約７，０００×ｇ～１５，０００×ｇまで改変させてもよい。

【0020】

本明細書に記載されるように、ＥＶの濃縮は、好適には、１つ以上のタンジェンシャルフローフィルタを使用して行われる。クロスフロー濾過としても知られるタンジェンシャルフロー濾過は、供給物流、入口流、又はインプット流体流は、膜面に対して平行に通りながら一部分が通過し、膜から出る（透過物流れ）一方で、残り（残留物流れ）は、膜内を通り、インプットへと戻されるように再循環され、濃縮され、最終的に貯蔵又は更なる処理のために通され得る、濾過システム又はプロセスである。タンジェンシャルフローフィルタは、好適には、溶液が供給される（単一の繊維が使用され得るが）一連の中空繊維膜で構成される。残留物流れは、中空繊維内を流れ、繊維膜内側の溶液内にＥＶが保持される一方で、過剰の体積は、繊維膜を通過して透過物流れへと出る。これによって、全試料の体積が低減され、ＥＶ試料の濃縮が生じる（体積当たりのＥＶの数が増加する）。タンジェンシャルフローフィルタで使用するための例示的な材料としては、限定されないが、ポリ（エーテルスルホン）、ポリ（アクリロニトリル）、及びポリ（二フッ化ビニリデン）、セルロースエステル、及びポリ（スルホン）を含む、ポリマーが挙げられる。例示的なタンジェンシャルフローフィルタとしてはＭＩＣＲＯＫＲＯＳ（登録商標）及びＭＩＤＩＫＲＯＳ（登録商標）フィルタを含む、ＳＰＥＣＴＲＵＭ ＬＡＢＳ（登録商標）又はＲＥＰＬＩＧＥＮ（登録商標）から入手可能なもの、並びにそれらの改変版が挙げられる。実施形態では、タンジェンシャルフローフィルタの材料は、約１００ｋＤ（１００キロダルトン）～約７５０ｋＤの分子量カットオフ、より好適には、約１００ｋＤ～約５００ｋＤの分子量カットオフ、約２００ｋＤ～約４００ｋＤの分子量カットオフ、又は１００ｋＤ、２００ｋＤ、３００ｋＤ、４００ｋＤ、若しくは５００ｋＤの分子量カットオフを有する修飾ポリ（エーテルスルホン）（ＭＰＥＳ）フィルタである。

【0021】

処理する方法は、細胞外小胞の濃度を決定することを更に含む。細胞外小胞の濃度を決定するための様々な方法が当該技術分野で既知であり、例えば、動的光散乱、ナノ粒子分析のためのフローサイトメトリー（ナノスケールフローサイトメトリー）（例えば、ＮａｎｏＦＣＭ（Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）、及びナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＶｉｅｗＳｉｚｅｒ、Ｈｏｒｉｂａ）などが挙げられる。

【0022】

本明細書に記載されるように、好適には、細胞外小胞の濃度は、処理方法を継続する前に、少なくとも約０．５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであると決定される。より好適には、細胞外小胞の濃度は、処理方法を継続する前に、少なくとも１×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬ、より好適には、少なくとも０．８×１０^１０、少なくとも０．９×１０^１０、少なくとも１．１×１０^１０、少なくとも１．２×１０^１０、少なくとも１．３×１０^１０、少なくとも１．４×１０^１０、又は少なくとも１．５×１０^１０であると決定される。本明細書に記載されるように、少なくとも約１×１０^１０のＥＶの濃度を達成することによって、プロセスの標識付け、清浄化／分離／洗浄要素の残り、及びＥＶの最終分析は、再現可能に、かつ全体的に廃棄を低減して行うことができることが決定されている。

【0023】

本明細書に記載されるように、方法は、細胞外小胞を、蛍光染色色素又は細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることを更に含む。次いで、接触させたＥＶをインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成する。好適な実施形態では、ＥＶの膜を透過し、１つ以上のＥＶ内分子を染色する蛍光染色色素と、ＥＶを接触させる。例えば、蛍光染色色素は、スクシンイミジル基を介して、ＥＶ内分子、特に細胞内リジン残基及び他のアミン源に結合する色素である、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（６－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル；５（６）－ＣＦＤＡ－ＳＥ）（ＣＦＳＥ）であり得る。ＥＶの標識付けに使用することができる蛍光染色色素を含む追加の色素としては、例えば、ＥｘｏＢｒｉｔｅ（商標）ＥＶ膜染色剤（Ｂｉｏｔｉｕｍ、Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）、ＥｘｏＧｌｏｗ（商標）ＥＶ染色剤（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、並びにＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）などの膜色素が挙げられる。ＲＮＡを染色する色素も利用することができる。例えば、ＳＹＴＯ（商標）ＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（商標）及びＱｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）などのＲＮＡ染色色素。また、追加の色素が当該技術分野で知られており、記載の方法でも同様に使用することができる。

【0024】

好適には、細胞外小胞を、蛍光染色色素と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも１時間インキュベートする。例えば、ＥＶは、約３０分間～約２時間、又は約３０分間～約１．５時間、又は約４５分間～約１．５時間、又は約１時間～約１．５時間、又は約１．５時間、約３５℃～４０℃、又は約３７℃の温度で、蛍光染色色素と接触させることができる。

【0025】

ＥＶが抗体で標識される方法において、１つ以上の抗体は、特定の細胞外小胞表面マーカに対して選択され得る。それは、ＥＶの表面にあると予想されるか、又は所望のカーゴ（例えば、タンパク質など）を含有するＥＶの表面にあることが望ましい表面マーカである。例示的な実施形態では、抗体は、抗テトラスパニン抗体、すなわち、ＥＶの表面上のテトラスパニン糖タンパク質に結合する抗体である。テトラスパニンは、複数のパートナータンパク質と、及び互いに横方向に相互作用して、いわゆるＴＥＭ（テトラスパニン濃縮マイクロドメイン）を形成する、小さい膜タンパク質（２００～３５０個のアミノ酸）である。例示的な抗体としては、限定されないが、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＩｇＧ１抗体が挙げられる。追加の抗体としては、抗ＣＤ１５１抗体、抗ＣＤ８２抗体、抗ＣＤ５３抗体、抗ＣＤ３７抗体などを挙げることができる。好適には、ＥＶは、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＩｇＧ１抗体の組み合わせなどの、そのような抗体の組み合わせで標識される。例えば、（ＣＤ９＋ＣＤ６３、ＣＤ９＋ＣＤ８１、ＣＤ８１＋ＣＤ６３）及びトリプル（ＣＤ９＋ＣＤ８１＋ＣＤ６３）の組み合わせが使用され得る。

【0026】

好適には、細胞外小胞を、抗体（複数可）と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも３０分間インキュベートする。例えば、ＥＶは、約３０分間～約２時間、又は約３０分間～約１．５時間、又は約４５分間～約１．５時間、又は約１時間～約１．５時間、又は約１時間、約３５℃～４０℃、又は約３７℃の温度で、抗体と接触させることができる。

【0027】

標識付けに続いて、（標識されたＥＶ並びに標識されていないＥＶの両方を含む）細胞外小胞を、２００～７５０ｋＤの分子量カットオフのポリエーテルスルホン濾材を含む遠心分離フィルタに通して、標識された細胞外小胞集団を過剰の蛍光染色色素又は過剰の抗体から分離する。次いで、標識された細胞外小胞集団が回収される。

【0028】

本明細書に記載されるように、標識された細胞外小胞集団を、約２００～７５０ｋＤの分子量のカットオフを有するポリエーテルスルホンフィルタに通すことによって、標識されたＥＶは、ＥＶを顕著に損失することなく、かつＥＶを顕著に希釈することなく、非常に多くの数で回収されることが、驚くべきことに見出された。好適な実施形態では、接触させた（色素又は抗体で標識された）細胞外小胞を、少なくとも１０，０００×ｇの遠心力で少なくとも１０分間遠心分離フィルタに通す。好適には、ポリエーテルスルホンフィルタの分子量カットオフは、約２００～５００ｋＤ、約２００～４００ｋＤ、又は２００ｋＤ、３００ｋＤ、４００ｋＤ、若しくは５００ｋＤである。例示的な３００ｋＤの分子量カットオフフィルタは、ＰＡＬＬ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｏｒｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）からのＯＭＥＧＡ（登録商標）３００Ｋポリエーテルスルホン膜を備えたＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）遠心分離フィルタである。

【0029】

本明細書に記載されるように、ＥＶを標識するために、蛍光色素又は抗体と接触させることの前に、細胞外小胞を精製する必要がないことが、驚くべきことに見出された。従来、ＥＶは、標識付けの前に、細胞成長培地溶液から精製されなければならなかった。しかしながら、本明細書に記載されるように、精製することなく、ＥＶを（例えば、遠心分離又はタンジェンシャルフロー濾過、又はそれらの組み合わせを介して）単純に濃縮することによって、標識し、次いで後に精製、回収、及び分析することができるＥＶ試料がもたらされ、分析のために高濃度のＥＶが生じ、ＥＶ特徴の再現可能な分析結果が提供されることが決定された。本明細書で使用される場合、「細胞外小胞を精製する」という用語は、調整培地に存在する細胞構成成分、デブリなどをＥＶから分離し、精製されたＥＶを生じさせる、サイズ排除クロマトグラフィーカラム又は他の濾材の使用を指す。本明細書に記載されるように、本方法は、精製されたＥＶの使用を必要としないので、そのようなステップ及びカラムは、本明細書に記載の処理及び分析方法から具体的に除外され、実施形態では具体的に除外しない。

【0030】

当技術分野で既知であるように、様々な細胞を使用して、細胞外小胞を産生することができる。例示的な実施形態では、ＥＶは、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞（ＨＥＫ－２９３細胞を含む）、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される。ＥＶを調製するために使用することができる追加の細胞としては、限定されないが、胚性幹細胞由来の心血管前駆細胞、内皮前駆細胞、未成熟樹状細胞（ＤＣ）などが挙げられる。更なる実施形態では、ＥＶは、様々ながん細胞株を含む、様々な疾患細胞株から産生することができる。そのような実施形態では、本明細書に記載の方法は、がん細胞などの様々な細胞型から排泄される、ＥＶに存在する疾患特徴を分析するのに有用である。

【0031】

例示的な実施形態では、ＥＶを含有する生体液は、調整培地である。本明細書で使用される場合、「調整培地」又は「複数の調整培地」は、１つ以上の成長因子で調整されている細胞成長培地を指し、その構成成分は、細胞によって分泌されたものであり、細胞デブリ（例えば、脂質、タンパク質、及びタンパク質凝集体、核酸など）を含み得るが、完全なそのままの細胞は含まない。例示的な実施形態では、調整培地は、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣの細胞成長培地を含むが、好適には無血清である。

【0032】

好適には、細胞及びその産生物ＥＶは、本明細書に記載の処理する方法で使用する前に、バイオリアクターで産生される。細胞は、限定されないが、撹拌タンク、エアリフト、繊維、マイクロファイバー、中空繊維、セラミックマトリックス、流動床、固定床、及び／又は噴流床（ｓｐｏｕｔｅｄ ｂｅｄ）バイオリアクターを含む、任意の好適なバイオリアクター（本明細書では反応器とも呼ばれる）で調製することができる。本明細書で使用される場合、「バイオリアクター」は、発酵器若しくは発酵ユニット、又は任意の他の反応容器を含み得、「バイオリアクター」及び「反応器」という用語は、「発酵器」と互換的に使用される。発酵器又は発酵という用語は、微生物培養物及び哺乳動物培養物の両方を指す。例えば、いくつかの態様では、例示的なバイオリアクターユニットは、栄養素及び／又は炭素源の供給、好適なガス（例えば、酸素）の注入、発酵又は細胞培養培地の入口及び出口の流れ、気相及び液相の分離、温度の維持、酸素及びＣＯ_２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、撹拌（ａｇｉｔａｔｉｏｎ）（例えば、撹拌（ｓｔｉｒｒｉｎｇ））、及び／又は洗浄／滅菌のうちの１つ以上、又は全てを行うことができる。発酵ユニット等の例示的な反応器ユニットは、ユニット内に複数の反応器を含んでもよく、例えば、ユニットは、各ユニット内に１個、２個、３個、４個、５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、若しくは１００個、又はそれ以上のバイオリアクターを有してもよく、かつ／あるいは施設は、施設内に単一又は複数の反応器を有する複数のユニットを含んでもよい。様々な実施形態では、バイオリアクターは、バッチ、半供給バッチ、供給バッチ、灌流、及び／又は連続発酵プロセスに好適であり得る。任意の好適な反応器直径が使用され得る。実施形態では、バイオリアクターは、約１００ｍＬ～約５０，０００Ｌの体積を有し得る。非限定的な例には、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル、及び／又は５０，０００リットルの体積が含まれる。更に、好適な反応器は、マルチユース、シングルユース、ディスポーザブル、又は非ディスポーザブルであり得、ステンレス鋼（例えば、３１６Ｌ又は任意の他の好適なステンレス鋼）並びにインコネル、プラスチック、及び／又はガラス等の金属合金を含む任意の好適な材料で形成することができる。

【0033】

更なる実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞外小胞を分析するための方法である。例示的な実施形態では、そのような方法は、タンジェンシャルフローフィルタを用いて、調整培地中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度を決定することと、細胞外小胞を、蛍光染色色素又は細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして標識された細胞外小胞集団を生成することと、接触させた細胞外小胞を、３００ｋＤの分子量カットオフのポリエーテルスルホン濾材を含む遠心分離フィルタに通して、標識された細胞外小胞集団を過剰の蛍光染色色素又は過剰の抗体から分離することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、回収され、標識された細胞外小胞集団を、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して分析することと、を含む。本明細書に記載されるように、好適には、細胞外小胞は、色素又は抗体と接触させることの前に、サイズ排除クロマトグラフィーを介して精製されない。

【0034】

本明細書に記載の分析の方法は、標識効率、細胞外小胞数、細胞外小胞濃度、及び細胞外小胞サイズのうちの１つ以上の決定を可能にする。例えば、様々な蛍光顕微鏡技術、液体クロマトグラフィー技術、質量分析法、ＮＭＲ分光法、マイクロ流体抵抗パルスセンシング（ＭＲＰＳ）などを含む、フローサイトメータの使用以外の他の分析技術も使用することができる。本明細書に記載の分析の方法は、好適には、産生中のＥＶの品質管理チェックのための製造プロセスの一部として使用され得る。そのような方法は、方法が所望のＥＶを産生しているかどうかを迅速かつ容易に決定することを可能にするので、更なる製造を継続するか、又は必要に応じて修正するか、又は望ましくないＥＶ若しくはＥＶ特徴に起因して停止させることができる。

【0035】

本明細書に記載されるように、例示的な実施形態では、細胞外小胞を、蛍光染色色素６－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）と接触させ、好適には、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも１時間インキュベートする。

【0036】

ＥＶを抗体と接触させる実施形態では、好適には、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び／又は抗ＩｇＧ１抗体のうちの１つ以上が利用される。好適には、細胞外小胞を、抗体と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも３０分間インキュベートする。

【0037】

ＥＶを調製するために、様々な細胞集団が利用され得る。本明細書に記載されるように、好適には、ＥＶは、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される。そのような実施形態では、調整培地は、それぞれ、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣ細胞の成長培地を含む。

【0038】

好適には、調整培地中の細胞外小胞の濃度は、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定され、好適には、蛍光色素又は抗体で標識する前に、少なくとも１×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬである。例示的な実施形態では、細胞外小胞は、ＥＶの濃度を決定する前に、３００ｋＤの分子量カットオフのタンジェンシャルフローフィルタを使用して濃縮される。

【0039】

本明細書に記載されるように、分析のためにＥＶの高い濃度を維持しながら、かつ濾過プロセス中に顕著な数のＥＶを損失することなく、少なくとも１０，０００×ｇの遠心力で少なくとも１０分間、接触させた細胞外小胞を（３００ｋＤの分子量カットオフのポリエーテルスルホン濾材を含む）遠心分離フィルタに通して、ＥＶを分離することができることが驚くべきことに見出された。

【0040】

なお更なる実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞外小胞を処理するための方法であって、生体液中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、細胞外小胞を、細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、を含む、方法である。本明細書に記載されるように、細胞外小胞は、接触させることの前に精製されない。

【0041】

そのような実施形態では、少なくとも５×１０^１０である細胞外小胞の濃度を確立し、次いでＥＶを少なくとも１：３００倍で希釈することによって、分析のための標識されたＥＶを回収するために、抗体によるＥＶの標識に続いて濾過を必要としないことが決定された。

【0042】

本明細書に記載されるように、そのような方法は、生体液中で細胞外小胞を濃縮することを含む。ＥＶを濃縮する方法は、本明細書に記載されており、例えば、ＥＶを遠心分離すること、並びにＥＶを１つ以上のタンジェンシャルフローフィルタに通してＥＶを濃縮することを含む。好適には、ＥＶを、約１００ｋＤ（１００キロダルトン）～約４００ｋＤの分子量カットオフ、より好適には約３００ｋＤの分子量カットオフを有する修飾ポリ（エーテルスルホン）（ＭＰＥＳ）フィルタであるタンジェンシャルフローフィルタに通す。

【0043】

細胞外小胞の濃度を決定するための方法が本明細書に記載されており、好適な実施形態では、ＥＶ濃度は、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定される。ＥＶ濃度は、好適には、少なくとも約１×１０^１０個のＥＶ／ｍＬ、より好適には、少なくとも約２×１０^１０個のＥＶ／ｍＬ、少なくとも約３×１０^１０個のＥＶ／ｍＬ、少なくとも約４×１０^１０個のＥＶ／ｍＬ、少なくとも約５×１０^１０個のＥＶ／ｍＬ、少なくとも約６×１０^１０個のＥＶ／ｍＬ、少なくとも約７×１０^１０個のＥＶ／ｍＬ、少なくとも約８×１０^１０個のＥＶ／ｍＬ、少なくとも約９×１０^１０個のＥＶ／ｍＬ、又は少なくとも約１０×１０^１０個のＥＶ／ｍＬである。

【0044】

少なくとも約５×１０^１０個のＥＶ／ｍＬのＥＶの濃度が達成されたら、ＥＶを、ＥＶ細胞表面マーカに対する抗体と接触させることができる。全体にわたって記載されるように、抗体は、好適には、抗テトラスパニン抗体であり、例示的な抗体としては、限定されないが、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び抗ＩｇＧ１抗体が挙げられる。

【0045】

抗体によって接触させるＥＶの数は、好適には、約１×１０^７～１×１０^１０個のＥＶ、より好適には、約１×１０^８～１×１０^９個のＥＶであるか、又は他の実施形態では、約１×１０^８個、約２×１０^８個、約３×１０^８個、約４×１０^８個、約５×１０^８個、約６×１０^８個、約７×１０^８個、約８×１０^８個、約９×１０^８個、若しくは約１×１０^９個のＥＶを、抗体と接触させる。抗体をＥＶに接触させるための条件は、当該技術分野で既知であり、好適なものとしては、抗体及びＥＶＳを、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも３０分間、好適には、約３５℃～４２℃又は約３７℃の温度で少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも１時間、少なくとも１．５時間、又は少なくとも２時間インキュベートすることが挙げられる。実施形態では、インキュベーションは、撹拌インキュベーター内で、例えば、約１，２００～１，５００ｒｐｍ、又は約１，４００ｒｐｍの回転速度で行われる。

【0046】

本明細書に記載されるように、ＥＶの回収及び潜在的な分析の前に、抗体でＥＶを標識するためのインキュベーションに続いて、ＥＶは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの好適な緩衝液を使用して、少なくとも約１：２００（体積：体積）まで好適に希釈される。更なる実施形態では、ＥＶは、ＥＶの更なる分析の前に、少なくとも約１：２５０、１：３００、１：３５０、１：４００、１：４５０。１：５００、１：５５０、１：６００、１：６５０、１：７００、１：７５０、１：８００、１：８５０、１：９００、１：９５０、又は少なくとも約１：１０００（体積：体積）まで希釈される。

【0047】

全体を通して記載されるように、ＥＶを産生するために様々な細胞型が利用され得、好適な実施形態では、細胞外小胞は、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される。そのような実施形態では、生体液は、好適には、ＨＥＫ－２９３又はＭＳＣ細胞の成長培地を含む調整培地である。

【0048】

なお更なる実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞外小胞を分析するための方法であって、タンジェンシャルフローフィルタを用いて、調整培地中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、細胞外小胞を、細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、回収され、標識された細胞外小胞集団を、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して分析することと、を含み、接触させることの前に、細胞外小胞がサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製されない、方法である。

【0049】

抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び／又は抗ＩｇＧ１抗体を含む、ＥＶを標識することにおける使用のための例示的な抗体が、全体にわたって記載されている。好適には、細胞外小胞を、１×１０^８～１×１０^９個の抗体粒子と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも３０分間インキュベートする。

【0050】

実施形態では、細胞外小胞は、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生され、好適には、調整培地は、ＨＥＫ－２９３又はＭＳＣ細胞の成長培地を含み、細胞外小胞は、３００ｋＤの分子量カットオフのタンジェンシャルフローフィルタを使用して濃縮される。ナノ粒子分析のためのフローサイトメータの使用を含む、細胞外小胞の濃度を決定する方法が、本明細書に記載されている。

【0051】

標識効率、細胞外小胞数、細胞外小胞濃度、及び細胞外小胞サイズのうちの１つ以上を決定するための分析を含む、回収されたＥＶを分析する様々な方法が、本明細書に記載されている。

【0052】

なお更なる実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞外小胞を処理するための方法であって、生体液中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、細胞外小胞をＲＮＡ特異的色素と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、を含み、ｃにおける接触させることの前に、細胞外小胞が精製されない、方法である。

【0053】

実施形態では、細胞外小胞を、緑色蛍光ＲＮＡ染色剤又は赤色蛍光ＲＮＡ染色剤と接触させる。好適には、ＲＮＡ染色剤としては、例えば、ＳＹＴＯ（商標）ＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（商標）及びＱｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）が挙げられる。例示的な実施形態では、細胞外小胞を、ＲＮＡ特異的色素と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも２０分間インキュベートする。

【0054】

本明細書に記載されるように、好適には、細胞外小胞は、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される。実施形態では、細胞外小胞の濃度は、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定される。本明細書に記載されるように、好適には、生体液は、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣ細胞の成長培地を含む調整培地であり、濃縮することが、生体液をタンジェンシャルフローフィルタに通すことを含む。

【0055】

更なる実施形態では、本明細書で提供されるのは、細胞外小胞を分析するための方法であって、タンジェンシャルフローフィルタを用いて、調整培地中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、細胞外小胞を、緑色蛍光ＲＮＡ染色剤又は赤色蛍光ＲＮＡ染色剤と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、回収され、標識された細胞外小胞集団を、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して分析することと、を含み、ｃにおける接触させることの前に、細胞外小胞がサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製されない、方法である。

【0056】

好適には、細胞外小胞を、緑色蛍光ＲＮＡ染色剤又は赤色蛍光ＲＮＡ染色剤（本明細書に記載の例示的な染色剤）と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも２０分間インキュベートする。好適には、細胞外小胞は、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される。実施形態では、細胞外小胞の濃度は、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定される。好適には、調整培地は、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣ細胞の成長培地を含み、細胞外小胞が、ｂにおいて、３００ｋＤの分子量カットオフのタンジェンシャルフローフィルタを使用して濃縮される。

【0057】

本明細書に記載されるように、好適には、回収され、標識された細胞外小胞集団を分析して、例えば、製造プロセスの品質管理ステップの一部として、標識効率、細胞外小胞数、細胞外小胞濃度、及び細胞外小胞サイズのうちの１つ以上を決定する。

【実施例】

【0058】

実施例１：ＮａｎｏＳｅｐ濾過を使用する分析のための蛍光及び抗体標識並びに細胞外小胞の処理
材料及び方法

【表1】

【表2】

この手順は、ＮａｎｏＦＣＭからのＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒによる更なる下流分析のための、ＣＦＳＥによる粒子の定量化及び染色、又は抗テトラスパニン抗体による標識、続いて濾過について説明している。

【0059】

ＭＳＣ及びＨＥＫ－２９３細胞から産生された細胞外小胞を含有する調整培地を、５×１０^１０（好適には、１×１０^１１個の粒子／ｍＬ）超に達するように、ＭｉｃｒｏＫｒｏｓ３００Ｋタンジェンシャルフローフィルタで濃縮した。ＥＶの濃度は、ＮａｎｏＦＣＭからのＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用して決定した。

【0060】

また、比較のために、製造業者の指示に従って、Ｉｚｏｎ（Ｉｚｏｎ ＳＥＣ ｑＥＶ１０ ３５ｎｍ、カタログ番号ｑＥＶ１０／３５ｎｍ）カラムを使用することによるサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、ＥＶをＭＳＣ及びＨＥＫ－２９３細胞から精製した。

【表3】

【0061】

４７５μｌの試料＊＋ｏｆ ＣＦＳＥ２００μＭ（最大１０μｌ）
染色反応物をボルテックスし、暗所での振盪条件下、３７℃のサーモミキサで１時間インキュベートする。

【0062】

インキュベーションの後、製造業者の指示に従って、３００ｋＤの分子量カットオフのポリエーテルスルホン濾材（ＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）３００ｋ）を含む遠心分離フィルタに通して濾過することによって、過剰のＣＦＳＥを除去し、プールされた画分をＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒ（ＮａｎｏＦＣＭ）で測定する。比較のために、第２の試料をサイズ除外カラムに通して濾過した。最良の濾材を決定するために、結果に示される追加の分離フィルタも調べた。

【表4】

【0063】

ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒで試料を測定して、粒子濃度が＞４Ｅ＋９であることを確認する。染色前の例示的な希釈。
ＭＳＣからのＥＶ：１～３００
ＨＥＫ－２９３からのＥＶ：１～５００

【0064】

以下のように反応チューブを準備する。
単一染色Ａｂ：９μｌの試料＋１μｌのＡｂ＊
染色されていない対照：９μｌの試料＋１μｌのＰＢＳ１×
Ａｂミックス：１μｌの各Ａｂ＊＋７～９μｌの試料（最大１０μｌ）
＊必要な場合中間希釈剤、すなわちアイソタイプＡｂを調製する
染色反応物をボルテックスし、暗所での振盪下、３７℃のサーモミキサで１時間インキュベートする、
インキュベーション時間が終了したら、試料を少なくとも１：３００に希釈し（又は必要な場合、より高い希釈を適用）、ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒで測定する。
結果及び考察

【0065】

図１－１及び図１－２のＡ～Ｈは、サイズ排除クロマトグラフィー（図１－１のＡ～Ｄ）及びＮａｎｏＳｅｐ濾過（図１－２のＥ～Ｈ）を使用する、色素除去の結果を示している。示されるように、両方の方法は、同等の染色効率及び過剰の蛍光色素の除去を提供したが、濾過に基づく方法は、ＳＥＣに基づく方法と比較して、分離の時間を顕著に低減し、ＥＶ濃度の全体的な増加を提供した。

【0066】

図２は、標識されたＥＶからＣＦＳＥ色素を除去することについての、異なる分子量カットオフ（３００Ｋ、１００Ｋ、及び５０Ｋ）フィルタを比較している結果を示す。図２はまた、（標識付けの前にサイズ排除クロマトグラフィーカラムに通して濾過した）精製したＥＶに対して、精製されていない濃縮したＥＶ（濃縮上清）を使用した濾過結果を比較した。示されるように、３００ｋＤの分子量カットオフのポリエーテルスルホン濾材（ＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）３００ｋ）は、調整培地（濃縮上清）並びに精製したＥＶの両方から過剰のＣＦＳＥを除去することについて、最良の結果を示した。ＮａｎｏＳｅｐ１００Ｋフィルタは、精製したＥＶから蛍光色素を効果的に除去したが、調整培地からは除去しなかった。

【0067】

また、ＮａｎｏＳｅｐ３００ＫフィルタがＥＶのサイズ分布を改変しないことを確認するための実験を行った。ＳＥＣ精製したＥＶのサイズを測定し（図３Ａ）、次いで、ＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）３００Ｋフィルタに通し、再び測定した（図３Ｂ）。示されるように、ＥＶの中央サイズ及び平均サイズは、顕著に変動しなかった。

【0068】

図４Ａは、従来のＳＥＣ方法と比較した、ＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）３００Ｋフィルタを使用したＥＶからの過剰の抗体の効果的な除去を示している。前述のように、３つの抗体全てについて、ＥＶの標識付け％は、両方の濾過方法を使用して同等であり、ＮａｎｏＳｅｐ３００Ｋ濾過が、依然としてＥＶの高い濃度を維持しながら、過剰の抗体を除去するための効果的な方式であることを実証している。図４Ｂ～４Ｃは、抗テトラスパニン抗体（ＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１）によるＥＶの染色を示しており、ＨＥＫ－２９３細胞（図４Ｂ）及びＭＳＣ（図４Ｃ）細胞培養物の調整培地及びプロセス中試料から過剰の標識抗体が効果的に除去されている。特に、方法は、そのままの調整培地（ＣＭ）、並びにＤＮＡｓｅ処理後（ＤＮａｓｅｄ）、清澄後（ＣＬＡＲ）、０．２μｍカットオフフィルタによるバイオバーデン濾過後（ＢＢ０．２）、タンジェンシャルフロー濾過前１（ＴＦＦ１－インプット）、体積低減後（ＴＦＦ１－ｖｏｌ ｒｅｄ）、高塩洗浄後（ＴＦＦ１－高塩）、ダイアフィルトレーション洗浄後（ＴＦＦ１－ＤＦＣ）、ダイアフィルトレーション洗浄した０．４５μｍカットオフによる濾過後（ＴＦＦ１－ＤＦＣ Ｆ４５）、陰イオン交換クロマトグラフィー前（ＣＨＲインプット）、陰イオン交換クロマトグラフィー通過（ＣＨＲ－ＦＴ）、陰イオン交換クロマトグラフィー洗浄（ＣＨＲ－Ｗ）、陰イオン交換クロマトグラフィー画分（ＣＨＲ－ＦＸ及びピーク）、陰イオン交換クロマトグラフィー高塩洗浄（ＣＨＲ－高塩）、タンジェンシャルフロー濾過前２（ＴＦＦ２－インプット）、脱塩洗浄後（ＴＦＦ２－脱塩）、及び０．２μｍカットオフフィルタによる最終滅菌濾過後を含む、ＥＶ精製プロセスのあらゆるステップからの試料に適用可能であった。図５Ａ～５Ｆは、効果的かつ偏りのない抗体結合を決定するための手段として粒径分布を使用した場合の、同様の結果を示している。

【0069】

実施例２：濾過を伴わない、分析のための細胞外小胞の抗体標識及び処理
ＥＶを含むＭＳＣ及びＨＥＫ－２９３細胞からの調整培地を、タンジェンシャルフロー濾過（３００ｋＤタンジェンシャルフローフィルタ）を使用して濃縮した。抗体標識プロセスを開始する前に、ＮａｎｏＦＣＭを使用して、ナノ粒子濃度を５×１０^１０個のＥＶ／ｍＬ超と決定した。

【0070】

約２×１０^８～１×１０^９個の抗体粒子で抗ＣＤ９、抗ＣＤ６３、及び抗ＣＤ８１抗体を添加し、約１４００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で１時間インキュベートした。

【0071】

試料を適切な緩衝液で１：３００超まで希釈し、次いで抗体標識についてＮａｎｏＦＣＭで分析した。図６Ａ～６Ｂは、抗体標識を測定するときに、１：３００超の希釈倍数を使用することが、依然として許容可能な蛍光閾値を可能にしたことを示している。

【0072】

分析前に濾過を使用しなかったことによって、濾過中に同じものからＥＶを除去する懸念が排除された。

【0073】

図７Ａは、従来のＳＥＣ濾過方法に対する、本明細書に記載の抗体染色及び分析のための希釈方法の比較を示している。示されるように、分析前に１：１０００に希釈することによって、ＳＥＣ濾過を介して達成されるものと同等の標識効率が生じた。

【0074】

図７Ｂは、ＭＳＣ培養物からの濃縮された（１５０×）調整培地を利用した、本明細書に記載の抗体染色及び分析のための希釈方法の結果を示している。分析前の１：１０００希釈によって、許容可能な閾値（＜２００）及び事象数（＞２０００）で、染色％、中央サイズ及び平均サイズ（ｎｍ）の効率的な標識付けが生じた。図７Ｃは、ＨＥＫ－２９３細胞培養物から濃縮した（３０×）調整培地からの結果を示している。分析前の１：１０００希釈によって、許容可能な閾値（＜２００）及び事象数（＞２０００）で、染色％、中央サイズ及び平均サイズ（ｎｍ）の効率的な標識付けが生じた。

【0075】

実施例３：濾過を伴わない、分析のための細胞外小胞のＲＮＡ染色及び処理
ＥＶを含むＭＳＣ及びＨＥＫ－２９３細胞からの調整培地を、タンジェンシャルフロー濾過（３００ｋＤタンジェンシャルフローフィルタ）を使用して濃縮した。ＲＮＡ染色プロセスを開始する前に、ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒ（ＮａｎｏＦＣＭ）を使用して、ナノ粒子濃度を５×１０^１０個のＥＶ／ｍＬ超と決定した。

【0076】

ＳＹＴＯ（商標）ＲＮＡＳｅｌｅｃｔ（商標）（Ｓｙｔｏ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及びＱｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をそれぞれ２５μＭで添加し、１：５０に希釈した。Ｓｙｔｏ及びＲｉｂｏＧｒｅｅｎについては、両方とも３７℃の振盪下で試料をそれぞれ２０分間及び３０分間インキュベートし、光から保護した。試料を適切な緩衝液で１：３００超まで希釈し、次いで抗体標識についてＮａｎｏＦＣＭで分析した。第２の試料をＮａｎｏＳｅｐ３００Ｋフィルタに通して、希釈に対して色素の濾過を比較した。

【0077】

図８Ａは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ及びＳｙｔｏの両方が、エクソソーム参照試料（ＥｘｏＲｅｆ）を効果的に標識することを示している。全てのグラフ（８Ａ～８Ｃ）では、ＱｕａｎｔＴ－ｉＴ ｍｉＲＮＡをＲＮＡ標識のための対照として示している。

【0078】

図８Ｂは、ＨＥＫ－２９３細胞から調製したＥＶが、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ及びＳｙｔｏの両方で効果的に標識され、希釈の使用によって、Ｎａｎｏｓｅｐ濾過と比較すると、ほぼ同じの決定された標識効率が生じることを示している。

【0079】

図８Ｃは、ＭＳＣ細胞から調製したＥＶが、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ及びＳｙｔｏの両方で効果的に標識され、希釈の使用によって、Ｎａｎｏｓｅｐ濾過と比較すると、ほぼ同じの決定された標識効率が生じることを示している。

【0080】

これらの結果は、希釈が、ＲＮＡ染色剤で標識されたＥＶを特徴評価するために効果的に使用することができること、及び分析前に非結合蛍光ＲＮＡ染色剤を分離するために濾過が必要ではないことを実証している。これは驚くべき予想外の結果であり、全体にわたって記載されているように、分析のためのＥＶを調製するための迅速かつ簡単な方法を提供する。

【0081】

ＥＶが精製されていない調整培地中のＥＶについて、本明細書で提供される実験データに基づいて、同様の結果が予想され得る。これらの方法は、過剰のＲＮＡ色素を濾過するためのタンジェンシャルフロー濾過（３００ｋＤのタンジェンシャルフローフィルタ）の使用、並びに過剰の色素を除去するための希釈方法を含む。調整培地中でのＥＶに翻訳すると、両方の方法は、精製されたＥＶで提供されるものと同様の結果をもたらすことが予想される。

【0082】

例示的な実施形態
実施形態１は、細胞外小胞を処理するための方法であって、生体液中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度を決定することと、細胞外小胞を、蛍光染色色素又は細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして標識された細胞外小胞集団を生成することと、接触させた細胞外小胞を、２００～７５０ｋＤの分子量カットオフのポリエーテルスルホン濾材を含む遠心分離フィルタに通して、標識された細胞外小胞集団を過剰の蛍光染色色素又は過剰の抗体から分離することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、を含み、接触させることの前に、細胞外小胞が精製されない、方法である。

【0083】

実施形態２は、濃縮することが、生体液をタンジェンシャルフローフィルタに通すことを含む、実施形態１に記載の方法を含む。

【0084】

実施形態３は、タンジェンシャルフローフィルタが、約１００ｋＤ～約５００ｋＤの分子量カットオフを有する、実施形態２に記載の方法を含む。

【0085】

実施形態４は、細胞外小胞を、蛍光染色色素６－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）と接触させる、実施形態１に記載の方法を含む。

【0086】

実施形態５は、細胞外小胞を、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び／又は抗ＩｇＧ１抗体と接触させる、実施形態１に記載の方法を含む。

【0087】

実施形態６は、細胞外小胞を、蛍光染色色素と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも１時間インキュベートする、実施形態１～４のいずれかに記載の方法を含む。

【0088】

実施形態７は、細胞外小胞を、抗体と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも３０分間インキュベートする、方法実施形態１～３又は実施形態５を含む。

【0089】

実施形態８は、細胞外小胞が、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される、実施形態１～７のいずれかに記載の方法を含む。

【0090】

実施形態９は、生体液中の細胞外小胞の濃度が、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定される、実施形態１～８のいずれかに記載の方法を含む。

【0091】

実施形態１０は、細胞外小胞の濃度が、接触させることの前に、少なくとも１×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであると決定される、実施形態１～９のいずれかに記載の方法を含む。

【0092】

実施形態１１は、生体液が、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣ細胞の成長培地を含む調整培地である、実施形態１～１０のいずれかに記載の方法を含む。

【0093】

実施形態１２は、接触させた細胞外小胞を、遠心分離フィルタに少なくとも１０，０００×ｇの遠心力で少なくとも１０分間通す、実施形態１～１１のいずれかに記載の方法を含む。

【0094】

実施形態１３は、細胞外小胞を分析するための方法であって、タンジェンシャルフローフィルタを用いて、調整培地中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度を決定することと、細胞外小胞を、蛍光染色色素又は細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして標識された細胞外小胞集団を生成することと、接触させた細胞外小胞を、３００ｋＤの分子量カットオフのポリエーテルスルホン濾材を含む遠心分離フィルタに通して、標識された細胞外小胞集団を過剰の蛍光染色色素又は過剰の抗体から分離することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、回収され、標識された細胞外小胞集団を、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して分析することと、を含み、接触させることの前に、細胞外小胞がサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製されない、方法である。

【0095】

実施形態１４は、細胞外小胞を、蛍光染色色素６－カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）と接触させる、実施形態１３に記載の方法を含む。

【0096】

実施形態１５は、細胞外小胞を、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び／又は抗ＩｇＧ１抗体と接触させる、実施形態１３に記載の方法を含む。

【0097】

実施形態１６は、細胞外小胞を、蛍光染色色素と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも１時間インキュベートする、実施形態１３又は実施形態１４に記載の方法を含む。

【0098】

実施形態１７は、細胞外小胞を、抗体と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも３０分間インキュベートする、実施形態１３又は実施形態１５に記載の方法を含む。

【0099】

実施形態１８は、細胞外小胞が、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される、実施形態１３～１７のいずれかに記載の方法を含む。

【0100】

実施形態１９は、調整培地中の細胞外小胞の濃度が、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定される、実施形態１３～１８のいずれかに記載の方法を含む。

【0101】

実施形態２０は、細胞外小胞の濃度が、ｃにおける接触させることの前に、少なくとも１×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであると決定される、実施形態１３～１９のいずれかに記載の方法を含む。

【0102】

実施形態２１は、調整培地が、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣ細胞の成長培地を含み、細胞外小胞が、ｂにおいて、３００ｋＤの分子量カットオフのタンジェンシャルフローフィルタを使用して濃縮される、実施形態１３～２０のいずれかに記載の方法を含む。

【0103】

実施形態２２は、接触させた細胞外小胞を、遠心分離フィルタに少なくとも１０，０００×ｇの遠心力で少なくとも１０分間通す、実施形態１３～２１のいずれかに記載の方法を含む。

【0104】

実施形態２３は、回収され、標識された細胞外小胞集団を分析して、標識効率、細胞外小胞数、細胞外小胞濃度、及び細胞外小胞サイズのうちの１つ以上を決定する、実施形態１３～２２のいずれかに記載の方法を含む。

【0105】

実施形態２４は、細胞外小胞を処理するための方法であって、生体液中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、細胞外小胞を、細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、を含み、接触させることの前に、細胞外小胞が精製されない、方法である。

【0106】

実施形態２５は、細胞外小胞を、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び／又は抗ＩｇＧ１抗体と接触させる、実施形態２４に記載の方法を含む。

【0107】

実施形態２６は、１×１０^８～１×１０^９個の細胞外小胞を、抗体粒子と接触させる、実施形態２４又は実施形態２５に記載の方法を含む。

【0108】

実施形態２７は、細胞外小胞を、抗体と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも３０分間インキュベートする、実施形態２４～２６のいずれかに記載の方法を含む。

【0109】

実施形態２８は、細胞外小胞が、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される、実施形態２４～２７のいずれかに記載の方法を含む。

【0110】

実施形態２９は、細胞外小胞の濃度が、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定される、実施形態２４～２８のいずれかに記載の方法を含む。

【0111】

実施形態３０は、生体液が、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣ細胞の成長培地を含む調整培地であり、濃縮することが、生体液をタンジェンシャルフローフィルタに通すことを含む、実施形態２４～２９のいずれかに記載の方法を含む。

【0112】

実施形態３１は、細胞外小胞を分析するための方法であって、タンジェンシャルフローフィルタを用いて、調整培地中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、細胞外小胞を、細胞外小胞表面マーカに対する抗体と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、回収され、標識された細胞外小胞集団を、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して分析することと、を含み、接触させることの前に、細胞外小胞がサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製されない、方法である。

【0113】

実施形態３２は、細胞外小胞を、抗ＣＤ９抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗ＣＤ８１抗体、及び／又は抗ＩｇＧ１抗体と接触させる、実施形態３１に記載の方法を含む。

【0114】

実施形態３３は、細胞外小胞を、１×１０^８～１×１０^９個の抗体粒子と接触させる、実施形態３１又は実施形態３２に記載の方法を含む。

【0115】

実施形態３４は、細胞外小胞を、抗体と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも３０分間インキュベートする、実施形態３１～３３のいずれかに記載の方法を含む。

【0116】

実施形態３５は、細胞外小胞が、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される、実施形態３１～３４のいずれかに記載の方法を含む。

【0117】

実施形態３６は、細胞外小胞の濃度が、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定される、実施形態３１～３５のいずれかに記載の方法を含む。

【0118】

実施形態３７は、調整培地が、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣ細胞の成長培地を含み、細胞外小胞が、ｂにおいて、３００ｋＤの分子量カットオフのタンジェンシャルフローフィルタを使用して濃縮される、実施形態３１～３６のいずれかに記載の方法を含む。

【0119】

実施形態３８は、回収され、標識された細胞外小胞集団を分析して、標識効率、細胞外小胞数、細胞外小胞濃度、及び細胞外小胞サイズのうちの１つ以上を決定する、実施形態３１～３７のいずれかに記載の方法を含む。

【0120】

実施形態３９は、細胞外小胞を処理するための方法であって、生体液中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、細胞外小胞をＲＮＡ特異的色素と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、を含み、接触させることの前に、細胞外小胞が精製されない、方法である。

【0121】

実施形態４０は、細胞外小胞を、緑色蛍光ＲＮＡ染色剤又は赤色蛍光ＲＮＡ染色剤と接触させる、実施形態３９に記載の方法を含む。

【0122】

実施形態４１は、細胞外小胞を、ＲＮＡ特異的色素と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも２０分間インキュベートする、実施形態３９又は４０に記載の方法を含む。

【0123】

実施形態４２は、細胞外小胞が、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される、実施形態３９～４１のいずれかに記載の方法を含む。

【0124】

実施形態４３は、細胞外小胞の濃度が、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定される、実施形態３９～４２のいずれかに記載の方法を含む。

【0125】

実施形態４４は、生体液が、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣ細胞の成長培地を含む調整培地であり、濃縮することが、生体液をタンジェンシャルフローフィルタに通すことを含む、実施形態３９～４３のいずれかに記載の方法を含む。

【0126】

実施形態４５は、細胞外小胞を分析するための方法であって、タンジェンシャルフローフィルタを用いて、調整培地中で細胞外小胞を濃縮することと、細胞外小胞の濃度が少なくとも５×１０^１０個の細胞外小胞／ｍＬであることを決定することと、細胞外小胞を、緑色蛍光ＲＮＡ染色剤又は赤色蛍光ＲＮＡ染色剤と接触させることと、接触させた細胞外小胞をインキュベートして、標識された細胞外小胞集団を生成することと、標識された細胞外小胞集団を少なくとも１：３００倍で希釈することと、標識された細胞外小胞集団を回収することと、回収され、標識された細胞外小胞集団を、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して分析することと、を含み、接触させることの前に、細胞外小胞がサイズ排除クロマトグラフィーを介して精製されない、方法である。

【0127】

実施形態４６は、細胞外小胞を、緑色蛍光ＲＮＡ染色剤又は赤色蛍光ＲＮＡ染色剤と接触させ、約３０℃～４０℃の温度で少なくとも２０分間インキュベートする、実施形態４５に記載の方法を含む。

【0128】

実施形態４７は、細胞外小胞が、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ－２９３）細胞、ヒト白人結腸腺がんＨＴ－２９細胞、又は間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から産生される、実施形態４５又は４６に記載の方法を含む。

【0129】

実施形態４８は、細胞外小胞の濃度が、ナノ粒子分析のためのフローサイトメータを使用して決定される、実施形態４５～４７のいずれかに記載の方法を含む。

【0130】

実施形態４９は、調整培地が、ＨＥＫ－２９３、ＨＴ－２９、又はＭＳＣ細胞の成長培地を含み、細胞外小胞が、ｂにおいて、３００ｋＤの分子量カットオフのタンジェンシャルフローフィルタを使用して濃縮される、実施形態４５～４８のいずれかに記載の方法を含む。

【0131】

実施形態５０は、回収され、標識された細胞外小胞集団を分析して、標識効率、細胞外小胞数、細胞外小胞濃度、及び細胞外小胞サイズのうちの１つ以上を決定する、実施形態４５～４９のいずれかに記載の方法を含む。

【0132】

本明細書では特定の実施形態を例示及び記載しているが、特許請求の範囲は、記載及び図示される部分の特定の形態又はアレンジメントに限定されるべきではないことが理解されるべきである。本明細書では、例示的な実施形態が開示され、特定の用語が用いられるが、それらは、限定の目的ではなく、一般的かつ説明的な意味でのみ使用される。上記の教示に照らして、実施形態の修正及び変形が可能である。したがって、実施形態は、具体的に記載される以外の方法で実施され得ると理解されるべきである。

【0133】

本明細書中に言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれると具体的かつ個別に示されるのと同程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【国際調査報告】