特表 2024-534750 神経脱髄疾患の治療用薬物を調製するためのインシュリン様成長因子結合タンパク質２の応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-26

(54)【発明の名称】神経脱髄疾患の治療用薬物を調製するためのインシュリン様成長因子結合タンパク質２の応用

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/30 20060101AFI20240918BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 25/18 20060101ALI20240918BHJP

【ＦＩ】

A61K38/30

A61P25/00

A61P25/18

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024502707

(86)(22)【出願日】2022-12-27

(85)【翻訳文提出日】2024-01-17

(86)【国際出願番号】 CN2022142411

(87)【国際公開番号】W WO2023138320

(87)【国際公開日】2023-07-27

(31)【優先権主張番号】202210074291.3

(32)【優先日】2022-01-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】521235017

【氏名又は名称】シャンハイ メンタル ヘルス センター （シャンハイ サイコロジカル カウンセリング トレーニング センター）

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＭＥＮＴＡＬ ＨＥＡＬＴＨ ＣＥＮＴＥＲ （ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＰＳＹＣＨＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＯＵＮＳＥＬＬＩＮＧ ＴＲＡＩＮＩＮＧ ＣＥＮＴＥＲ）

【住所又は居所原語表記】６００ Ｗａｎ Ｐｉｎｇ Ｎａｎ Ｒｏａｄ， Ｘｕｈｕｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００３０ Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002251

【氏名又は名称】弁理士法人眞久特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ジェン

(72)【発明者】

【氏名】シー，ドンドン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン，インダン

【テーマコード（参考）】

4C084

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084BA01

4C084DB58

4C084DC50

4C084NA14

4C084ZA021

4C084ZA022

4C084ZA181

4C084ZA182

(57)【要約】

【要約】
本発明は、神経脱髄疾患の治療用薬物を調製するためのインシュリン様成長因子結合タンパク質２の応用に関する。ＩＧＦＢＰ２介入は、髄鞘形成量レベルを著しく増強し、且つストレス脱髄によって引き起こされる精神症状を改善できる。
【選択図】図１ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

神経脱髄疾患の治療用薬物を調製するためのインシュリン様成長因子結合タンパク質２の応用。

【請求項2】

髄鞘形成量レベルの増強用薬物を調製するためのインシュリン様成長因子結合タンパク質２の応用を特徴とする請求項１に記載の応用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２２年１月２１日の中国発明特許出願の２０２２１００７４２９１．３号の優先権を主張し、これらの全ては、参照により本出願に組み込まれる。

【0002】

本発明は、医薬技術の分野に関し、特に、神経脱髄疾患の治療用薬物を調製するためのインシュリン様成長因子結合タンパク質２の応用に関する。

【背景技術】

【0003】

髄鞘は、神経細胞軸索の外側を包む膜であり、言い換えれば、髄鞘は、数万個の細胞と髄鞘細胞膜から構成されるものである。髄鞘は、ニューロンの軸索から別のニューロンの軸索への神経電気インパルスの伝導を防ぐという絶縁の役割を果たす。脱髄は、髄鞘の形成後に生じる髄鞘の損傷を指す。脱髄性疾患は、病因と臨床症状が異なるが、類似した特徴を有する後天性疾患であり、それの特徴的な病理学的変化は、神経線維の髄鞘が脱離したが、神経細胞が比較的に整え続けることである。神経インパルスの正常な伝導は、軸索周囲にある髄鞘の絶縁特性に依存するため、髄鞘の機能障害又は髄鞘の変化は、学習及び適応行動を損なう可能性がある。研究データによると、生涯過程全般においては、髄鞘の小さな変化でさえ、認知と行動に関与する回路と系統におけるメカニズムに影響を与える可能性がある。髄鞘の機能は、以前に想定されていたよりも広い可能性がある：機能不全又は不適応な髄鞘形成量レベルは、神経変性病及び精神神経疾患の原因となる可能性がある。これらの疾患は、これまでニューロンに基づくものと考えられてきた。

【0004】

多くのヒトと動物についての研究によると、中枢神経系の特定の脳領域における白質脱髄は、精神疾患の重要な病態生理学的特徴である可能性がある。白質は、分散型脳システムをつなぐ重要な神経基質として機能する。神経画像研究は、ストレスにさらされたヒト白質の異常な微細構造を明らかにする。報告によると、白質脱髄の変化は、ストレスの不適応及び回復力と関連する。その上、不安障害患者からの証拠は、前頭葉前部皮質に関係した経路の白質脱髄が特性不安スコアと逆相関することを強く明らかにする。その上、ｍＰＦＣ中の髄鞘の脱離は、不安様及び抑鬱様の行動を伴う様々な動物のストレスモデルにおいても観察されていた。我々の推測によると、髄鞘損傷が速やか且つ有効的に修復されると、不安や抑鬱や認知障害などの精神障害を発症するリスクは減少するようになる。

【0005】

インスリン成長因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）は、ＩＧＦ結合タンパク質の６つの主要メンバーの１つとして自己分泌と傍分泌を備える成長因子である。研究によると、ＩＧＦＢＰ２は脳の成長と発育だけでなく、ニューロンの可塑性の調節や空間学習と記憶の調節や情報処理等の高級な認知機能にも関与する。更に、ＩＧＦＢＰ２は中枢系に広く存在し、発育中の脳で高度に発現され、初代星状膠細胞とニューロンで分泌される。ＩＧＦＢＰ２は、末梢における濃度が低く、分子量が３６ｋＤであり、そして血液脳関門（ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ，ＢＢＢ）を通過することができる。しかし、ＩＧＦＢＰ２が脱髄後の精神障害を治療できることを証明する研究はない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、上記従来技術の欠点を克服し、神経脱髄疾患の治療用薬物を調製するためのインシュリン様成長因子結合タンパク質２の応用を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、神経脱髄疾患の治療用薬物を調製するためのインシュリン様成長因子結合タンパク質２の応用という技術的解決策を具体的に提供する。

【0008】

好ましくは、髄鞘形成量レベルの増強用薬物を調製するためのインシュリン様成長因子結合タンパク質２の応用。ここで、髄鞘形成量レベルの増強は、髄鞘形成の状態と髄鞘形成量レベルという両方面に関する。

【0009】

或いは、神経脱髄疾患の治療用薬物を調製するためのインシュリン様成長因子結合タンパク質２の応用に関する。

【0010】

好ましくは、神経脱髄疾患（脱髄疾患）は不安鬱病と認識機能障害とを含む。

【0011】

本発明は、神経脱髄疾患の治療用薬物を調製するためのインシュリン様成長因子結合タンパク質２の応用の評価方法を提供し、当該方法は次のステップを含む。
Ｓ１：脱髄モデルを構築する。
Ｓ２：評価基準を選択する。
Ｓ３：ＩＧＦＢＰ２の介入効果を評価する。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1a】図１ａは、薬物脱髄モデリング及びＩＧＦＢＰ２介入のフローチャートを示す。

【図1b】図１ｂは、ストレス脱髄モデリング及びＩＧＦＢＰ２介入のフローチャートを示す。

【図2a】図２ａは、薬物脱髄により動物の髄鞘形成量レベルに対するＩＧＦＢＰ２介入の効果を検証することを示す。

【図2b】図２ｂは、薬物脱髄により動物の髄鞘形成量レベルに対するＩＧＦＢＰ２介入の効果を検証することを示す。

【図3a】図３ａは、ストレス脱髄により動物の髄鞘形成量レベルに対するＩＧＦＢＰ２介入の効果を検証することを示す。

【図3b】図３ｂは、ストレス脱髄により動物の髄鞘形成量レベルに対するＩＧＦＢＰ２介入の効果を検証することを示す。

【図3c】図３ｃは、ストレス脱髄により動物の髄鞘形成量レベルに対するＩＧＦＢＰ２介入の効果を検証することを示す。

【図3d】図３ｄは、ストレス脱髄により動物の髄鞘形成量レベルに対するＩＧＦＢＰ２介入の効果を検証することを示す。

【図3e】図３ｅは、ストレス脱髄により動物の髄鞘形成量レベルに対するＩＧＦＢＰ２介入の効果を検証することを示す。

【図4a】図４ａは、薬物脱髄により動物のストレス脱髄後習性に対するＩＧＦＢＰ２介入の影響を検証することを示す。

【図4b】図４ｂは、薬物脱髄により動物のストレス脱髄後習性に対するＩＧＦＢＰ２介入の影響を検証することを示す。

【図4c】図４ｃは、薬物脱髄により動物のストレス脱髄後習性に対するＩＧＦＢＰ２介入の影響を検証することを示す。

【図4d】図４ｄは、薬物脱髄により動物のストレス脱髄後習性に対するＩＧＦＢＰ２介入の影響を検証することを示す。

【図4e】図４ｅは、薬物脱髄により動物のストレス脱髄後習性に対するＩＧＦＢＰ２介入の影響を検証することを示す。

【図4f】図４ｆは、薬物脱髄により動物のストレス脱髄後習性に対するＩＧＦＢＰ２介入の影響を検証することを示す。

【図5a】図５ａは、ストレス脱髄により動物のストレス脱髄後習性に対するＩＧＦＢＰ２介入の影響を検証することを示す。

【図5b】図５ｂは、ストレス脱髄により動物のストレス脱髄後習性に対するＩＧＦＢＰ２介入の影響を検証することを示す。

【図5c】図５ｃは、ストレス脱髄により動物のストレス脱髄後習性に対するＩＧＦＢＰ２介入の影響を検証することを示す。

【図5d】図５ｄは、ストレス脱髄により動物のストレス脱髄後習性に対するＩＧＦＢＰ２介入の影響を検証することを示す。

【図5e】図５ｅは、ストレス脱髄により動物のストレス脱髄後習性に対するＩＧＦＢＰ２介入の影響を検証することを示す。

【図5f】図５ｆは、ストレス脱髄により動物のストレス脱髄後習性に対するＩＧＦＢＰ２介入の影響を検証することを示す。

【図5g】図５ｇは、ストレス脱髄により動物のストレス脱髄後習性に対するＩＧＦＢＰ２介入の影響を検証することを示す。

【図5h】図５ｈは、ストレス脱髄により動物のストレス脱髄後習性に対するＩＧＦＢＰ２介入の影響を検証することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明の技術的内容をより明確に記述でき、神経脱髄疾患の治療におけるＩＧＦＢＰ２の役割を検証するためには、次に具体的な実施例と組み合わせて更なる説明を行う。

【実施例】

【0014】

脱髄の起こるＳＤラットのモデルを構築する。

【0015】

ＳＤラットは、水と食物を自由に獲得できる１２時間の明暗調律環境において飼養されている。全部の習性検出は動物の明暗調律環境において行われる。

【0016】

薬物で脱髄を行う。

【0017】

まず、ＳＤラットは、モデリングを行うために用いられ、イソフルラン（Ｒ５１０－２２、ＲＷＤ Ｃｈｉｎａ、４～５％誘導、１～２％維持）で麻酔を誘導する。深麻酔後、実験群には、次の立体的な座標により３３型注射器針（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）で外科的な方法を通して注射を行い、ここで１μＬの１％溶血性レシチン（ＬＰＣ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を生理食塩水に溶解して注射液を得るが、対照群には前記溶血性レシチンを同量の生理食塩水に溶解して注射液も得る。注射液をｍＰＦＣの両側にある＋２．７ｍｍ、大泉門の中央側にある０．４ｍｍ、及び背側－硬膜面の以下にある３．３ｍｍの位置に注射する。リゾレシチンの体積は１μＬであり、片側の注射時間は１５分間である。注射後、針を５分間放置して液体を完全に吸収させる。Ｚ軸ノブをゆっくりと調節し、針を引き上げる。皮膚を縫合して脳局注を完了する。

【0018】

ストレスモードで脱髄を行う。

【0019】

ストレスモードは、長期予測不可能な慢性ストレス（ＣＵＭＳ）を利用し、即ち様々なストレスモードで５週間に亘る慢性ストレスを毎日に１回行う。具体的なストレスモードを表１に示す。

【0020】

【表1】

【0021】

ＩＧＦＢＰ２介入
薬物で脱髄を行ったラットに対してＩＧＦＢＰ２介入を行う。ＬＰＣ注射手術の４日後に脱髄が完了してＩＧＦＢＰ２介入を行う。手術の８日後に習性検出を行う。実験手順を図１ａに示す。

【0022】

ストレスモードで脱髄を行ったラットに対してＩＧＦＢＰ２介入を行う。ストレス終了の１日目に、ＩＧＦＢＰ２介入を行う。２日目に、習性検出を行う。実験手順を図１ｂに示す。

【0023】

ＩＧＦＢＰ２の介入効果を評価する
まず、免疫組織化学的分析と電子顕微鏡実験を通して髄鞘の形態を観察し、ＩＧＣＢＰ２が薬物やストレスによる脱髄現象を逆転させるかどうかを調べる。
免疫組織化学的実験：ラットを単独の解剖板に固定し、先ず１ｘＰＢＳで灌流を行い、次に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で灌流を行い、その後４℃でラットを一晩４％ＰＦＡに固定する。次に、脳組織が５０ｍＬチューブの底に完全に沈むまで、３０％スクロースで脱水を行う。ＯＣＴ包埋後、脳を－８０℃の冷凍庫に保管する。凍結ミクロトームでは３０μｍの冠状切片を切り取る。ｍＰＦＣ領域切片は、ＰＢＳでそれぞれ５分間毎に３回洗浄され、４％ヤギ血清及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含むＰＢＳにおいて室温で１時間密閉培養を行い、続いて二次抗体とするＭＢＰ抗体（１：５００）を培養し４°Ｃで一晩置く。ＰＢＳと０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（ＰＢＳＴ）においては室温で５回洗浄を行い、５分間に亙り、室温で蛍光二次抗体とする１：１０００により希釈されたＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ヤギ抗ウサギ抗体を培養し、続いて暗室でＰＢＳＴにおいて５回洗浄を行い、毎回に５分間を亙る。切片はＤＡＰＩで対比染色され、切片密封を行う。すべての画像は共焦点顕微鏡（オリンパス）で得られ、且つＦｕｊｉ（ＮＩＭＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ、ＵＳＡ）で分析を行う。

【0024】

電子顕微鏡実験：当該実験は、髄鞘の厚さ、及びｍＰＦＣ領域中のシナプス後濃密体（ＰＳＤ）の厚さと長さを測定することを目的とする。１ｍｍ^３領域を含めるようにｍＰＦＣ脳領域を切り整える。超ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ ＥＭ ＵＣ７）において切片を６０ｎｍで切り取り、続いて酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色を行う。透過型電子顕微鏡（Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２ ＳｐｉｒｉｔＢｉｏｔｗｉｎ）では各ラットの画像を収集する。軸索の直径を有髄神経線維全体の直径で割ることによりは、Ｇ比を確定する。ＦＵＪＩ（ＮＩＭＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ、ＵＳＡ）は、軸索口径、髄鞘線維の直径及びＰＳＤの厚さと長さを測定するために用いられる。

【0025】

図２ａ及び２ｂに示されたように、ＩＧＦＢＰ２の介入効果は、脱髄後、免疫組織化学的分析を通して観察される。図２ａ及び２ｂは、ｍＰＦＣ脳領域における髄鞘形成量レベルを示し、髄鞘形成量レベルは、薬物で脱髄を行った後、ＭＢＰの発現が著しく減少するとともに著しく減少し、ＩＧＦＢＰ２介入後、著しく増加する。二元配置分散分析によると、＊＊＊はＰ＜０．００１を表し、＊＊はＰ＜０．００１を表し、＊はＰ＜０．０５を表す。

【0026】

図３ａ～３ｅに示されたように、ストレスで脱髄を行った後、電子顕微鏡実験の結果は、ストレスが脱髄の原因となり、ＩＧＦＢＰ２介入後に髄鞘形成を改善することを示す。免疫蛍光実験の結果は、ストレスがＭＢＰの蛍光強度の著しい減少の原因となり、ＩＧＦＢＰ２介入が蛍光強度を回復させることを示す。ここで、＊＊＊はＰ＜０．００１を表し、＊＊はＰ＜０．００１を表し、＊はＰ＜０．０５を表し、＊は対照群ｖｓストレス群を表し、＃は対照群ｖｓ ＩＧＦＢＰ２介入群を表す。

【0027】

上記実験データは、ＩＧＦＢＰ２介入が髄鞘形成を明らかに改善し、脱髄疾患における髄鞘形成量レベルを高めることを検証する。

【0028】

更に、行動実験では、ＩＧＦＢＰ２介入による脱髄疾患の精神症状の改善を観察する。

【0029】

習性検出は、脱髄後の精神症状に対するＩＧＦＢＰ２の介入効果を検証するのに用いられる。全部の習性検出は、ラットを明時間中で実施される。習性検出の前に、ラットは習性検出室に入れられて２時間適応する。各実験中、次のラットへの臭いの影響を避けるように毎度実験の完了したラットを７０％アルコールで拭く。習性検出の前は、少なくとも４日間適応するように数分間ラットを毎日扱う。習性検出は、抑鬱様行動の評価のための糖水偏好実験、尾懸垂実験及び強制水泳実験、不安様行動の評価のための広所実験及び高架十字迷路実験、及び認知行動の評価のための新物識別実験及びＢａｒｎｅｓ迷路実験を採用する。

【0030】

糖水偏好実験：実験動物は２日前に２本の瓶に適応し、一本の瓶には飲料水があり、他の本の瓶には１％庶糖がある。検知は３日目に行い、検知前に動物に対して飲料水供給を６時間断ち切り、ここで糖水偏好値％＝糖水消費量／（糖水消費量＋水消費量）×１００がある。

【0031】

広所実験：実験動物を５０ｃｍ ｘ ５０ｃｍの箱に入れ、１０分間録画し、動物が中央区域で止まった時間を計算する。

【0032】

高架十字迷路実験：ラットは、中央個室から開放アームに向かってクロス迷路に入れられ、それぞれラットが開放アームに入った回数と止まった時間、及びラットが閉合アームに入った回数と止まった時間を５分間記録する。

【0033】

水迷路実験：ラットは４日間の訓練を受け、ラットが壇を見つけた時間を記録し、最終日に動物が目的象限に居る時間を記録する。

【0034】

薬物で脱髄を行った実験動物に対して、図４ａ～４ｄは広所実験の結果を示し、図４ｅ及び４ｆは高架十字迷路実験の結果を示し、ここで実験動物が開放アームに止まった時間の比率は、開放アームでの滞在時間／（開放アームでの滞在時間＋閉合アームでの滞在時間）である。二元配置分散分析によると、＊＊＊はＰ＜０．００１を表し、＊＊はＰ＜０．００１を表し、＊はＰ＜０．０５を表す。

【0035】

広所実験の結果は、脱髄群（ＬＰＣ群）の動物の中央区域での滞在時間が対照群よりも著しく低くなるが、ＩＧＦＢＰ２介入後、脱髄群（ＩＧＦＢＰ２介入群）の動物の中央区域での滞在時間が著しく高くなることを示す。

【0036】

高架十字迷路実験の結果は、脱髄群（ＬＰＣ群）の動物の開放アームでの滞在時間が対照群よりも著しく低くなるが、ＩＧＦＢＰ２介入が脱髄群（ＩＧＦＢＰ２介入群）の動物の開放アームでの滞在時間を著しく増やすことを示す。

【0037】

ストレスで脱髄を行った実験動物に対して、ストレスは、ｍＰＦＣ脳領域の脱髄の原因となり、図５ａ～５ｃは広所実験の結果を示し、図５ｄ及び５ｅは高架十字迷路実験の結果を示し、ここで実験動物が開放アームに止まった時間の比率は、開放アームでの滞在時間／（開放アームでの滞在時間＋閉合アームでの滞在時間）であり、図５ｆは糖水偏好実験の結果を示し、ここで動物の糖水偏好比率＝糖水消費量／（糖水消費量＋水消費量）があり、図５ｇ及び５ｈは、水迷路実験の結果を示し、ここで訓練中動物が壇を見つけた時間がある。二元配置分散分析によると、＊＊＊はＰ＜０．００１を表し、＊＊はＰ＜０．００１を表し、＊はＰ＜０．０５を表す。

【0038】

広所実験の結果は、ＩＧＦＢＰ２の介入が対照群の動物の中央区域での滞在時間に影響しないことを示す。ストレス群の動物の中央区域での滞在時間は、対照群よりも著しく低くなるが、ＩＧＦＢＰ２介入後、ストレス群の動物の中央区域での滞在時間は著しく高（Ｐ＜０．００１）くなる。

【0039】

高架十字迷路実験の結果は、ストレス群の動物の開放アームでの滞在時間が対照群よりも著しく低くなることを示す。ＩＧＦＢＰ２介入は、対照群の動物の開放アームでの滞在時間に影響しない。しかし、ＩＧＦＢＰ２介入は、ストレス群の動物の開放アームでの滞在時間を著しく増やす。

【0040】

糖水偏好実験の結果は、ストレス群の動物の糖水偏好値が対照群よりも著しく低くなり、顕著な無快感行動を示す。ＩＧＦＢＰ２介入は、対照群の動物の糖水偏好値に影響しないが、ストレス群の動物の糖水偏好値を著しく増やす。

【0041】

水迷路実験の結果は、ストレス群の動物が訓練中壇を見つけるのにより多くの時間を費やすが、ＩＧＦＢＰ２介入後、ストレス群の動物が壇を見つける時間を著しく短縮することを示す。

【0042】

広所実験と高架十字迷路実験の結果は、ＩＧＦＢＰ２が脱髄によって引き起こされる不安様行動を有効的に改善できることを示す。糖水偏好実験の結果は、ＩＧＦＢＰ２介入が脱髄によって引き起こされる抑鬱様行動を有効的に改善できることを示す。水迷路実験の結果は、ＩＧＦＢＰ２介入が脱髄によって引き起こされる認知機能障害を有効的に改善できることを示す。

【0043】

要約すると、ＩＧＦＢＰ２介入が髄鞘形成量レベルを著しく増強し、且つストレス脱髄によって引き起こされる精神症状を改善できることは検証される。

【産業上の利用可能性】

【0044】

本明細書において、本発明はそれの特定の実施例を参照して説明される。しかしながら、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な修正と変換を依然として行われることは明らかである。したがって、本明細書は制限的ではなく例示的と見なされる。

【図1a】

【図1b】

【図2a】

【図2b】

【図3a】

【図3b】

【図3c】

【図3d】

【図3e】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図4e】

【図4f】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図5e】

【図5f】

【図5g】

【図5h】

【国際調査報告】