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特表2024-534764ＭＳＨ２またはＭＳＨ６抑制剤を有効成分として含む癌予防または治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-26
(54)【発明の名称】ＭＳＨ２またはＭＳＨ６抑制剤を有効成分として含む癌予防または治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240918BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240918BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240918BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20240918BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20240918BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240918BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240918BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240918BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240918BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240918BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20240918BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20240918BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240918BHJP
G01N 33/50 20060101ALI20240918BHJP
G01N 33/15 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240918BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00 ZNA
A61P35/00
A61P43/00 111
A61P35/04
A61P1/00
A61P1/16
A61P11/00
A61K48/00
A61K31/713
A61K31/7088
A61K39/395 N
C12N15/115 Z
C12Q1/6886 Z
C12Q1/02
G01N33/50 Z
G01N33/15 Z
A61K39/395 D
C12N15/113 110Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024508093
(86)(22)【出願日】2022-08-09
(85)【翻訳文提出日】2024-04-03
(86)【国際出願番号】 KR2022011831
(87)【国際公開番号】W WO2023018168
(87)【国際公開日】2023-02-16
(31)【優先権主張番号】10-2021-0104655
(32)【優先日】2021-08-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0104656
(32)【優先日】2021-08-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0070947
(32)【優先日】2022-06-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0070948
(32)【優先日】2022-06-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
３．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ
(71)【出願人】
【識別番号】524049169
【氏名又は名称】ネオナ
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】ナム，ソク－ウ
(72)【発明者】
【氏名】ナ，ミン ジョン
【テーマコード（参考）】
2G045
4B063
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
2G045AA24
2G045AA40
2G045CB01
2G045DA14
2G045DA36
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ53
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QS36
4C084AA13
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA591
4C084ZA592
4C084ZA661
4C084ZA662
4C084ZA751
4C084ZA752
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA59
4C086ZA66
4C086ZA75
4C086ZB21
4C086ZB26
4C086ZC41
(57)【要約】
本発明は、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６抑制剤を有効成分として含む癌予防または治療用組成物に関し、本発明によるＭＳＨ２またはＭＳＨ６抑制剤は、肝細胞癌腫を含む様々な癌腫細胞において腫瘍細胞成長、増殖を抑制し、特に、肝細胞癌腫においては移動および侵襲、腫瘍形成活性を抑制し、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６の発現を増加させる場合、ＤＮＭＴ１の発現を増加させ、ＫＬＦ４の発現を減少させることを確認することで、これを癌の予防および治療用薬学的組成物として利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＭＳＨ２（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ２）の遺伝子またはタンパク質に対する抑制剤；またはＭＳＨ６（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ６）の遺伝子またはタンパク質に対する抑制剤；を有効成分として含む、癌予防または治療用薬学的組成物。
【請求項2】
前記抑制剤は、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６に特異的なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、抗体およびこれらの組み合わせからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載の癌予防または治療用薬学的組成物。
【請求項3】
前記ＭＳＨ２に特異的なｓｉＲＮＡは、配列番号１の塩基配列で表されることを特徴とする、請求項２に記載の癌予防または治療用薬学的組成物。
【請求項4】
前記ＭＳＨ６に特異的なｓｉＲＮＡは、配列番号２の塩基配列で表されることを特徴とする、請求項２に記載の癌予防または治療用薬学的組成物。
【請求項5】
前記癌は、肝臓癌、肺癌、頭頚部癌、結腸癌、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、胃癌および胆管癌からなる群より選択されたものである、請求項１に記載の癌予防または治療用薬学的組成物。
【請求項6】
前記癌は、ＫＬＦ６（Ｋｒｕｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ６）、ＨＤＡＣ６（Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ６）またはＫＬＦ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４）の発現が阻害されるか、ＨＤＡＣ２（Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ２）、ＭＳＨ２（ｍｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ ２）またはＤＮＭＴ１（ＤＮＡ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ－５）－Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）の発現が増加した患者の癌であることを特徴とする、請求項１に記載の癌予防または治療用薬学的組成物。
【請求項7】
前記組成物は、ＤＮＭＴ１の発現を抑制するか、ＫＬＦ４の発現を増加させることを特徴とする、請求項１に記載の癌予防または治療用薬学的組成物。
【請求項8】
前記組成物は、腫瘍細胞の成長、増殖、移動および侵襲を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の癌予防または治療用薬学的組成物。
【請求項9】
ＭＳＨ２またはＭＳＨ６の遺伝子、そのタンパク質または前記タンパク質を構成するペプチド水準を測定する製剤を含む、肝臓癌、肺癌、頭頚部癌、結腸癌、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、胃癌および胆管癌からなる群より選択されたいずれか一つの癌診断用組成物。
【請求項10】
前記遺伝子水準を測定する製剤は、遺伝子に特異的に結合するプライマーまたはプローブを含むものである、請求項９に記載の癌診断用組成物。
【請求項11】
前記タンパク質水準を測定する製剤は、前記タンパク質または断片ペプチドに特異的な抗体、アンチセンスＲＮＡ、アプタマーおよび化合物からなる群より選択されたいずれか一つを含むものである、請求項９に記載の癌診断用組成物。
【請求項12】
（ａ）ＭＳＨ２遺伝子またはそのタンパク質；またはＭＳＨ６遺伝子またはそのタンパク質；を含む細胞に分析しようとする試料を接触させるステップ；（ｂ）前記ＭＳＨ２またはＭＳＨ６遺伝子の発現量、タンパク質の発現量またはタンパク質の活性を測定するステップ；および
（ｃ）前記（ｂ）ステップの測定結果、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６遺伝子の発現量、タンパク質の発現量またはタンパク質の活性が減少する場合に、前記試料は、癌の予防または治療用物質と判定するステップ；を含む、
肝臓癌、肺癌、頭頚部癌、結腸癌、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、胃癌および胆管癌からなる群より選択されたいずれか一つの癌予防または治療用物質スクリーニング方法。
【請求項13】
請求項１に記載の薬学的組成物を個体に投与するステップを含む、肝臓癌を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６抑制剤を有効成分として含む癌予防または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ＭＳＨ２（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ２）は、ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒタンパク質としてよく知られている。ＨＮＰＣＣ（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｎｏｎｐｏｌｙｐｏｓｉｓ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ、Ｌｙｎｃｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）では、ＭＳＨ２の突然変異が４０％以上確認され、ＭＬＨ１突然変異とともにＨＮＰＣＣの主要原因として知られている。このような突然変異が起きると、様々な遺伝子にｍｉｓｍａｔｃｈが矯正されず、突然変異状態で存在して蓄積され、癌化過程で重要な役割をすることになる。
【0003】
ＭＳＨ６（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ６、ＧＴＢＰ）は、ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒタンパク質としてよく知られている。ＭＳＨ６は、ＭＳＨ２（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ２）とｈｅｔｅｒｏ ｄｉｍｅｒを成すようになり、これは、ＤＮＡの複製過程中にｍｉｓｍａｔｃｈ部分を認識して矯正を始めさせる因子の役割をすることになる。
【0004】
ＭＳＨ２は、ＭＳＨ６（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ６、ＧＴＢＰ）とｈｅｔｅｒｏ ｄｉｍｅｒを成すようになり、これは、ＤＮＡの複製過程中にｍｉｓｍａｔｃｈ部分を認識して矯正を始めさせる因子の役割をすることになる。
【0005】
ＨＤＡＣｓ（Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅｓ）は、しばしば補助抑制因子（ｃｏｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ）や多重－タンパク質転写複合体（ｍｕｌｔｉ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）によって遺伝子プロモーターに付くことができ、そこで、ＤＮＡに直接結合せずにクロマチン（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ）変形を通じて転写を調節する。暗号化したヒトＨＤＡＣｓは１８個があり、これらは、クラスＩ（ＨＤＡＣ １、２、３および８）、クラスＩＩ（ＨＤＡＣ ４、５、６、７、９および１０）、クラスＩＩＩ（ＳＩＲＴ １－７）、およびクラスＩＶ（ＨＤＡＣ１１）酵素に分類される。ヒストンアセチル化酵素（ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ）およびＨＤＡＣｓのいずれも細胞増殖、分化および細胞周期調節に関与するという事実が知られている。また、ＨＤＡＣｓの病理学的活性および調節減少（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）が癌、免疫疾患、および筋萎縮症（ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）のような様々な疾病を引き起こす可能性があるという事実が報告された。ＨＤＡＣ６は、ＨＤＡＣｓのクラスＩＩｂファミリーメンバーであり、微小管（ＭＴｓ）と関連のある細胞質内脱アセチル化酵素（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）として作用し、アルファ－チューブリン（α－ｔｕｂｕｌｉｎ）を脱アセチル化させる。
【0006】
ＤＮＭＴ１（ＤＮＡ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ－５）－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）は、ＤＮＡの特異的なＣｐＧ構造にｍｅｔｈｙｌ基を伝達する酵素である。Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ ＡｔｌａｓプロジェクトでＤＮＭＴ ｆａｍｉｌｙは、癌で確認された１２７個の突然変異した遺伝子のうち一つである。ＤＮＭＴ１は、様々な癌で過発現しており、これは、治療的ターゲットになり得ることが研究されている。
【0007】
ＫＬＦ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４）は、細胞増殖、分化、死滅と関連した遺伝子の転写活性または阻害の両方向にすべて作用できるｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒタンパク質である。ＫＬＦ４は、粘膜上皮細胞の細胞分裂後に細胞の成長抑制と分化に関与して、主に成長が抑制される細胞の核で過発現し、ｐ５３依存性でｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒであるｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１を活性化させてＧ１／Ｓで細胞周期を抑制する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明の目的は、ＭＳＨ２（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ２）の遺伝子またはタンパク質に対する抑制剤；またはＭＳＨ６（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ６）の遺伝子またはタンパク質に対する抑制剤；を有効成分として含む癌予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
【0009】
また、本発明の他の目的は、前記薬学的組成物を個体に投与するステップを含む、肝臓癌を治療する方法を提供することにある。
【0010】
また、本発明の他の目的は、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６の遺伝子、そのタンパク質または前記タンパク質を構成するペプチド水準を測定する製剤を含む癌診断用組成物を提供することにある。
【0011】
また、本発明の他の目的は、癌予防または治療用物質スクリーニング方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0012】
前記のような目的を達成するために、本発明は、ＭＳＨ２（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ２）の遺伝子またはタンパク質に対する抑制剤；またはＭＳＨ６（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ６）の遺伝子またはタンパク質に対する抑制剤；を有効成分として含む癌予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0013】
さらに、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与するステップを含む、肝臓癌を治療する方法を提供する。
【0014】
次いで、本発明は、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６の遺伝子、そのタンパク質または前記タンパク質を構成するペプチド水準を測定する製剤を含む癌診断用組成物を提供する。
【0015】
最後に、本発明は、（ａ）ＭＳＨ２遺伝子またはそのタンパク質；またはＭＳＨ６遺伝子またはそのタンパク質；を含む細胞に分析しようとする試料を接触させるステップ；（ｂ）前記ＭＳＨ２またはＭＳＨ６遺伝子の発現量、タンパク質の発現量またはタンパク質の活性を測定するステップ；および（ｃ）前記（ｂ）ステップの測定結果、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６遺伝子の発現量、タンパク質の発現量またはタンパク質の活性が減少する場合に、前記試料は、癌の予防または治療用物質と判定するステップ；を含む癌予防または治療用物質スクリーニング方法を提供する。
【発明の効果】
【0016】
本発明によるＭＳＨ２またはＭＳＨ６抑制剤は、肝細胞癌腫を含む様々な癌腫細胞において腫瘍細胞成長、増殖を抑制し、特に、肝細胞癌腫においては、移動および侵襲、腫瘍形成活性を抑制し、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６の発現を増加させる場合、ＤＮＭＴ１の発現を増加させ、ＫＬＦ４の発現を減少させることを確認することで、これを癌の予防および治療用薬学的組成物として利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1a】本発明の一実施例において、ＴＣＧＡの３３個種類の癌腫でＭＳＨ２またはＭＳＨ６の発現が高い癌腫を識別過程を簡単に示した図である。
【図1b】本発明の一実施例において、ＴＣＧＡの３３個種類の癌腫でＭＳＨ２またはＭＳＨ６の発現が高い癌腫を識別過程を簡単に示した図である。
【図1c】本発明の一実施例において、ＴＣＧＡの３３個種類の癌腫でＭＳＨ２またはＭＳＨ６の発現が高い癌腫を識別過程を簡単に示した図である。
【図2a】本発明の一実施例において、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６の発現が高い癌腫でＭＳＨ２抑制による細胞毒性評価結果を示した図である。
【図2b】本発明の一実施例において、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６の発現が高い癌腫でＭＳＨ２抑制による細胞毒性評価結果を示した図である。
【図3a】本発明の一実施例において、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６の発現が高い癌腫でＭＳＨ２抑制による細胞増殖能力評価結果を示した図である。
【図3b】本発明の一実施例において、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６の発現が高い癌腫でＭＳＨ２抑制による細胞増殖能力評価結果を示した図である。
【図4】本発明の一実施例において、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６の発現が高い癌腫でＭＳＨ２抑制による細胞生存力評価結果を示した図である。
【図5a】本発明の一実施例において、肝臓癌における正常対比ＭＳＨ２発現水準比較分析結果を示した図である。
【図5b】本発明の一実施例において、肝臓癌における正常対比ＭＳＨ２発現水準比較分析結果を示した図である。
【図5c】本発明の一実施例において、肝臓癌における正常対比ＭＳＨ２発現水準比較分析結果を示した図である。
【図5d】本発明の一実施例において、肝臓癌における正常対比ＭＳＨ２発現水準比較分析結果を示した図である。
【図5e】本発明の一実施例において、肝臓癌における正常対比ＭＳＨ２発現水準比較分析結果を示した図である。
【図5f】本発明の一実施例において、肝臓癌における正常対比ＭＳＨ２発現水準比較分析結果を示した図である。
【図5g】本発明の一実施例において、肝臓癌における正常対比ＭＳＨ２発現水準比較分析結果を示した図である。
【図6】本発明の一実施例において、ＭＳＨ２の発現が増加した肝臓癌細胞株でＭＳＨ２抑制による腫瘍細胞の成長、死滅、増殖、移動および侵襲分析結果を示した図である。
【図7】本発明の一実施例において、ＭＳＨ２の発現が増加した肝臓癌細胞株でＭＳＨ２抑制による細胞周期変化分析結果を示した図である。
【図8】本発明の一実施例において、ＭＳＨ２の発現が減少した正常細胞および肝臓癌細胞株でＭＳＨ２過発現による細胞毒性および細胞増殖能力評価結果を示した図である。
【図9】本発明の一実施例において、ＭＳＨ２とＤＮＭＴ１の相関関係分析結果を示した図である。
【図10a】本発明の一実施例において、肝臓癌における正常対比ＭＳＨ６発現水準比較分析結果を示した図である。
【図10b】本発明の一実施例において、肝臓癌における正常対比ＭＳＨ６発現水準比較分析結果を示した図である。
【図10c】本発明の一実施例において、肝臓癌における正常対比ＭＳＨ６発現水準比較分析結果を示した図である。
【図10d】本発明の一実施例において、肝臓癌における正常対比ＭＳＨ６発現水準比較分析結果を示した図である。
【図10e】本発明の一実施例において、肝臓癌における正常対比ＭＳＨ６発現水準比較分析結果を示した図である。
【図10f】本発明の一実施例において、肝臓癌における正常対比ＭＳＨ６発現水準比較分析結果を示した図である。
【図10g】本発明の一実施例において、肝臓癌における正常対比ＭＳＨ６発現水準比較分析結果を示した図である。
【図11】本発明の一実施例において、ＭＳＨ６の発現が増加した肝臓癌細胞株でＭＳＨ６抑制による腫瘍細胞の成長、死滅、増殖、移動および侵襲分析結果を示した図である。
【図12】本発明の一実施例において、ＭＳＨ６の発現が増加した肝臓癌細胞株でＭＳＨ６抑制による細胞周期変化分析結果を示した図である。
【図13】本発明の一実施例において、ＭＳＨ６の発現が減少した正常細胞および肝臓癌細胞株でＭＳＨ６過発現による細胞毒性および細胞増殖能力評価結果を示した図である。
【図14】本発明の一実施例において、ＭＳＨ６とＤＮＭＴ１の相関関係分析結果を示した図である。
【図15】本発明の一実施例において、ＤＮＭＴ１とＫＬＦ４の相関関係分析結果を示した図である。
【図16】本発明の一実施例において、ＨＤＡＣ６とＭＳＨ２の相関関係分析結果を示した図である。
【図17】本発明の一実施例において、ＨＤＡＣ６とＭＳＨ６の相関関係分析結果を示した図である。
【図18a】本発明の一実施例において、ＨＤＡＣ２またはＫＬＦ６とＨＤＡＣ６の相関関係分析結果を示した図である。
【図18b】本発明の一実施例において、ＨＤＡＣ２またはＫＬＦ６とＨＤＡＣ６の相関関係分析結果を示した図である。
【図18c】本発明の一実施例において、ＨＤＡＣ２またはＫＬＦ６とＨＤＡＣ６の相関関係分析結果を示した図である。
【図18d】本発明の一実施例において、ＨＤＡＣ２またはＫＬＦ６とＨＤＡＣ６の相関関係分析結果を示した図である。
【図18e】本発明の一実施例において、ＨＤＡＣ２またはＫＬＦ６とＨＤＡＣ６の相関関係分析結果を示した図である。
【図18f】本発明の一実施例において、ＨＤＡＣ２またはＫＬＦ６とＨＤＡＣ６の相関関係分析結果を示した図である。
【図18g】本発明の一実施例において、ＨＤＡＣ２またはＫＬＦ６とＨＤＡＣ６の相関関係分析結果を示した図である。
【図19a】本発明の一実施例において、ＨＤＡＣ２またはＫＬＦ６のＨＤＡＣ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒに対する競争的結合分析結果を示した図である。
【図19b】本発明の一実施例において、ＨＤＡＣ２またはＫＬＦ６のＨＤＡＣ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒに対する競争的結合分析結果を示した図である。
【図20】本発明の一実施例において、ＨＤＡＣ６－ＭＳＨ２／ＭＳＨ６－ＤＮＭＴ１－ＫＬＦ４軸がＨＣＣ腫瘍形成を調節することをｉｎ ｖｉｖｏで確認した図である。
【図21】本発明の一実施例において、ＨＤＡＣ６－ＭＳＨ２／ＭＳＨ６－ＤＮＭＴ１－ＫＬＦ４軸がＨＣＣ腫瘍形成を調節することをＭｏｕｓｅ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルから確認した図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
以下、添付の図面を参照して、本発明の具現例として本発明を詳しく説明することにする。ただし、下記の具現例は、本発明に対する例示として提示されるものであって、当業者に周知著名な技術または構成に対する具体的な説明が本発明の要旨を不明確にすることができるものと判断される場合には、その詳細な説明を省略することができ、これにより本発明が制限されることはない。本発明は、後述する特許請求の範囲の記載およびそれから解析される均等範疇内で様々な変形および応用が可能である。
【0019】
また、本明細書において使用される用語（ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ）は、本発明の好ましい実施例を適切に表現するために使用された用語であって、これは、使用者、運用者の意図または本発明の属する分野の慣例などによって変わることがある。したがって、本用語に対する定義は、本明細書の全般にわたった内容に基づいて下されなければならない。明細書の全体において、ある部分がある構成要素を「含む」とするとき、これは、特に反対される記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。
【0020】
本発明は、ＭＳＨ２（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ２）の遺伝子またはタンパク質に対する抑制剤；またはＭＳＨ６（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ６）の遺伝子またはタンパク質に対する抑制剤；を有効成分として含む癌予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【0021】
また、前記ＭＳＨ２遺伝子は、ヒト２番染色体上に存在するものであってよく、好ましくは、ヒト２番染色体４７、４０３、０６７－４７、６３４、５０１に位置するものであってよい（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ：ＧＲＣｈ３８．ｐ１３、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿０００００２．１２、Ｇｅｎｅ ＩＤ：４４３６）。
【0022】
また、前記ＭＳＨ６遺伝子は、ヒト２番染色体上に存在するものであってよく、好ましくは、ヒト２番染色体４７、７８３、１４５－４７、８０６、９５４に位置するものであってよい（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ：ＧＲＣｈ３８．ｐ１３、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿０００００２．１２、Ｇｅｎｅ ＩＤ：２９５６）。
【0023】
本発明において使用される用語「ＭＳＨ２（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ２）」は、ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒタンパク質であって、ＭＳＨ6（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ６）とｈｅｔｅｒｏ ｄｉｍｅｒを成すことになり、ＤＮＡのミスセンス塩基対修復に関与する複合体を形成するタンパク質のうち一つである。
【0024】
本発明において使用される用語「ＭＳＨ６（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ６）」は、ＤＮＡ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｒｅｐａｉｒタンパク質であって、ＭＳＨ２（ＭｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ２）とｈｅｔｅｒｏ ｄｉｍｅｒを成すことになり、ＤＮＡのミスセンス塩基対修復に関与する複合体を形成するタンパク質のうち一つである。
【0025】
また、前記抑制剤は、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６に特異的なｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、抗体およびこれらの組み合わせから選択されるものであってよいが、これに制限されるものではない。
【0026】
また、前記ＭＳＨ２に特異的なｓｉＲＮＡは、配列番号１に塩基配列で表されるものであってよいが、これに制限されるものではない。
【0027】
また、前記ＭＳＨ６に特異的なｓｉＲＮＡは、配列番号２の塩基配列で表されるものであってよいが、これに制限されるものではない。
【0028】
また、前記組成物は、ＤＮＭＴ１の発現を抑制させるか、ＫＬＦ４の発現を増加させるものであってよい。
【0029】
本発明において使用される用語「ＤＮＭＴ（ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）」は、ＤＮＡにメチル基（－ＣＨ３）を伝達して結合させる役割をする酵素である。異常なＤＮＡ過メチル化（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）は、大部分の癌細胞で起こる共通した現象と知られており、よって、ＤＮＭＴの活性を阻害すれば、癌抑制遺伝子に対する過メチル化を抑制して癌抑制遺伝子が正常に再発現し、癌細胞の増殖を抑制することができる。
【0030】
本発明において使用される用語「ＤＮＭＴ１（ＤＮＡ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ－５）－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）」は、ＤＮＡ複製後にメチル化パターンを維持する主要酵素であって、ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡのシトシンヌクレオチドにメチル基を伝達する役割をする。本発明においては、癌細胞でＫＬＦ４プロモーターのメチル化を誘導して、ＫＬＦ４の発現を抑制する役割をする。
【0031】
一具現例において、ＤＮＭＴ１は、ＤＮＭＴ ｆａｍｉｌｙのうちＤＮＭＴ３ＡとＤＮＭＴ３Ｂと相互作用することができる。
【0032】
本発明において使用される用語「ＫＬＦ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４）は、特定転写因子と相互作用して転写を活性化することができ、腫瘍抑制剤としてよく知られている。
【0033】
一具現例において、ＫＬＦ４は、ＭＳＨ２、ＤＮＭＴ１と相互作用することができる。
本発明において使用される用語「発現抑制」とは、標的遺伝子の（ｍＲＮＡへの）発現または（タンパク質への）翻訳低下を引き起こすことを意味し、好ましくは、これにより標的遺伝子発現が探知不能になるか、無意味な水準で存在することになることを意味する。
本発明において使用される用語「発現抑制」とは、標的遺伝子の（ｍＲＮＡへの）発現または（タンパク質への）翻訳低下を引き起こすことを意味し、好ましくは、これにより標的遺伝子発現が探知不能になるか、無意味な水準で存在することになることを意味する。
【0034】
また、前記組成物は、腫瘍細胞の成長、増殖、移動および侵襲を抑制するものであってよいが、これに制限されるものではない。
【0035】
また、前記癌は、肝臓癌、肺癌、頭頚部癌、結腸癌、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、胃癌および胆管癌からなる群より選択されたものであってよく、好ましくは、肝臓癌、さらに好ましくは、肝細胞癌腫（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）と言えるが、これに制限されるものではない。
【0036】
また、前記癌は、ＫＬＦ６（Ｋｒｕｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ６）、ＨＤＡＣ６（Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ６）またはＫＬＦ４（Ｋｒｕｐｐｅｌ－ｌｉｋｅ ｆａｃｔｏｒ ４）の発現が阻害されるか、ＨＤＡＣ２（Ｈｉｓｔｏｎｅ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ２）、ＭＳＨ２（ｍｕｔＳ ｈｏｍｏｌｏｇ ２）またはＤＮＭＴ１（ＤＮＡ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ－５）－Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ １）の発現が増加した患者の肝臓癌であってよく、前記肝臓癌は、肝細胞癌腫であってよく、好ましくは、ｓｔａｇｅ Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶＡまたはＩＶＢ病期（ｐｈａｓｅ）の肝細胞癌腫であってよく、さらに好ましくは、初期病期より治療が難しいｓｔａｇｅＩＩＩ～ＩＶ病期の肝細胞癌腫であってよいが、これに制限されるものではない。
【0037】
本発明において使用される用語「癌」は、細胞自体の調節機能に問題が生じて正常には死滅すべき異常細胞が過多増殖して周囲組織および臓器に侵入して塊を形成し、既存の構造を破壊するか変形させる状態を意味し、悪性腫瘍と同一の意味で使用される。
【0038】
本発明において使用された用語「予防」とは、本発明による組成物の投与によって癌の発生、発達および再発を抑制または遅延させるすべての行為を意味する。
【0039】
本発明において使用された用語「治療」とは、本発明による組成物の投与によって、癌およびこれによる合併症の症状を好転させるか、または良く変更するすべての行為を意味する。本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者であれば、大韓医学協会などで提示された資料を参照して、本願の組成物が効果がある疾患の正確な基準を知って、改善、向上および治療された程度を判断することができるはずである。
【0040】
本発明による組成物は、薬学的に有効な量のＭＳＨ２抑制剤またはＭＳＨ６抑制剤を単独で含むか、一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含むことができる。前記において薬学的に有効な量とは、免疫疾患の症状を予防、改善および治療するに十分な量を言う。前記において「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与されるとき、通常的に胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれと類似した反応を起こさない組成物を言う。
【0041】
また、薬学に許容可能な担体を含む組成物は、経口または非経口の様々な剤形であってよい。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤されることができる。前記担体、賦形剤および希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、生理食塩水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油、デキストリン、炭酸カルシウム、プロピレングリコールおよびリキッドパラフィンからなる群より選択された一つ以上であってよいが、これに限定されるものではなく、通常の担体、賦形剤または希釈剤のすべてを使用可能である。前記成分は、前記有効性分であるＭＳＨ２抑制剤に独立して、または組み合わせて追加されることができる。
【0042】
また、経口投与のための固形製剤には、錠剤丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれることができ、このような固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混合して調剤されることができる。また、単なる賦形剤の以外に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も使用されることができる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁液剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、通常使用される単なる希釈剤である水、リキッドパラフィンの以外にも様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。
【0043】
非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁用剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などが含まれる。非水性溶剤、懸濁用剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されることができる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが使用されることができる。
【0044】
また、本発明の薬学組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁液剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁液剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤からなる群より選択されるいずれか一つの剤形を有することができる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが使用されることができる。
【0045】
本発明の薬学的組成物は、目的とする方法によって経口投与するか、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができ、投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排出割合および疾患の重症度などによってその範囲が多様である。
【0046】
本発明の薬学的組成物は、癌の予防または治療効果のために単独で、または手術、ホルモン治療、薬物治療および生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【0047】
さらに、本発明は、前記薬学的組成物を個体に投与するステップを含む、肝臓癌を治療する方法を提供する。
【0048】
本発明において「個体」とは、癌を予防または治療を目的とする個体であれば特に限定されず、ヒトを含む動物、例えば、非－霊長類（例えば、牛、豚、馬、猫、犬、ラットおよびマウス）および霊長類（例えば、サル、例えば、カニクイ（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ）ザルおよびチンパンジー）を始めとした哺乳動物を示す。
【0049】
本発明の薬学的組成物は、治療学的に有効な量、または薬学的に有効な量で投与されることができる。
【0050】
本発明において、用語「治療学的に有効な量」は、対象疾患を予防または治療するのに有効な組成物の薬学的に許容可能な塩の量を意味し、本発明の組成物の治療的に有効な量は、様々な要素、例えば、投与方法、目的部位、患者の状態などによって変わる。よって、人体に使用時に投与量は、安全性および効率性を共に考慮して適正量に決定されなければならない。動物実験を通じて決定した有効量からヒトに使用される量を推定することも可能である。有効な量の決定時に考慮すべきこのような事項は、例えば、Ｈａｒｄｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｍｂｉｒｄ、ｅｄｓ．、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１０ｔｈ ｅｄ．（２００１）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；およびＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ ｅｄ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ ｅｄ．（１９９０）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．に記述されている。
【0051】
本発明において、用語「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受益／危険割合で疾患を治療するのに十分であり、副作用を引き起こさない程度の量を意味し、有効用量水準は、患者の健康状態、疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与方法、投与時間、投与経路および排出割合、治療期間、配合または同時使用される薬物を含む要素およびその他の医学分野によく知られている要素によって決定されることができる。本発明の組成物は、個別治療剤で投与するか、他の治療剤と併用して投与されることができ、従来の治療剤と順次にまたは同時に投与されることができ、単一または多重投与されることができる。上記の要素をすべて考慮して、副作用なしに最小限の量で最大効果を得ることができる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定されることができる。
【0052】
次いで、本発明は、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６遺伝子、そのタンパク質または前記タンパク質を構成するペプチド水準を測定する製剤を含む癌診断用組成物を提供する。
【0053】
また、前記癌は、肝臓癌、肺癌、頭頚部癌、結腸癌、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、胃癌および胆管癌からなる群より選択されたものであってよく、好ましくは、肝臓癌、さらに好ましくは、肝細胞癌腫（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）であってよいが、これに制限されるものではない。
【0054】
本発明において使用される用語「診断」は、特定疾病または疾患に対する一客体の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を判定すること、一客体が特定疾病または疾患を現在有しているか否かを判定すること、特定疾病または疾患を有している一客体の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）（例えば、前－転移性または転移性癌状態の同定、癌のステップ決定または治療に対する癌の反応性決定）を判定すること、またはテラメトリクス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、治療効能に対する情報を提供するために客体の状態をモニタリングすること）を含む。
【0055】
また、前記遺伝子水準を測定する製剤は、遺伝子に特異的に結合するプライマーまたはプローブであってよいが、これに制限されるものではない。
また、前記遺伝子水準の測定は、逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競争的重合酵素連鎖反応、リアルタイム重合酵素連鎖反応、Ｎｕｃｌｅａｓｅ保護分析（ＲＮａｓｅ、Ｓ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ）、ｉｎ ｓｉｔｕ交雑法、ＤＮＡマイクロアレイ利用法、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）、放射線免疫分析法、免疫拡散法、免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ、質量分析法（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）およびタンパク質マイクロアレイ利用法からなる群より選択された１種以上の方法で遂行されるものであってよいが、これに制限されない。
また、前記遺伝子水準の測定は、逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、競争的重合酵素連鎖反応、リアルタイム重合酵素連鎖反応、Ｎｕｃｌｅａｓｅ保護分析（ＲＮａｓｅ、Ｓ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｓｓａｙ）、ｉｎ ｓｉｔｕ交雑法、ＤＮＡマイクロアレイ利用法、ノーザンブロット、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ Ｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）、放射線免疫分析法、免疫拡散法、免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ、質量分析法（Ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）およびタンパク質マイクロアレイ利用法からなる群より選択された１種以上の方法で遂行されるものであってよいが、これに制限されない。
【0056】
前記ＭＳＨ２タンパク質は、ヒト２番染色体４７、４０３、０６７－４７、６３４、５０１に位置する核酸配列で翻訳されるアミノ酸からなる全体または一部ペプチドで構成されることができ、前記ＭＳＨ２タンパク質の機能的同等物および変異体を含む。また、前記ＭＳＨ２タンパク質を構成するペプチドは、ＭＳＨ２タンパク質の断片を意味するものであって、ＭＳＨ２タンパク質を構成するペプチドであれば、制限されずに含まれる。
【0057】
前記ＭＳＨ６タンパク質は、ヒト２番染色体４７、７８３、１４５－４７、８０６、９５４に位置する核酸配列で翻訳されるアミノ酸からなる全体または一部ペプチドで構成されることができ、前記ＭＳＨ６タンパク質の機能的同等物および変異体を含む。また、前記ＭＳＨ６タンパク質を構成するペプチドは、ＭＳＨ６タンパク質の断片を意味するものであって、ＭＳＨ６タンパク質を構成するペプチドであれば、制限されずに含まれる。
【0058】
前記タンパク質の機能的同等物とは、タンパク質分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびポリペプチドを含むものであって、機能的に同じ作用をすることができるタンパク質が本発明の範囲に含まれる。前記変異体とは、ＭＳＨ２天然アミノ酸配列と一つ以上のアミノ酸残基が結実、挿入、非保全的または保全的置換またはこれらの組み合わせにより異なる配列を有するタンパク質を意味する。例えば、前記アミノ酸配列で一つまたは数個のアミノ酸が結実、置換または付加されたこと、前記アミノ酸配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有することなどを言う。ここで「同一性」とは、２個のアミノ酸配列にギャップを取り入れるか、取り入れずに最も高い一致度になるように整列させたとき、前記ギャップの数を含む、一方のアミノ酸配列の全体アミノ酸残基数に対する他方のアミノ酸配列の同じアミノ酸残基数の割合（％）を言う。また、「数個」とは、２～１０の整数、例えば、２～７、２～５、２～４、２～３の整数を言う。天然変異体の具体例としては、ＳＮＰ（一塩基多型）などの多型に基づく変異体やスプライス変異体などを挙げることができる。前記置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。保存的アミノ酸置換であれば、前記アミノ酸配列を有するＭＳＨ２またはＭＳＨ６と実質的に同等な構造または性質を有することができるためである。保存的アミノ酸とは、互いに非極性アミノ酸（グリシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、トリプトファン）および極性アミノ酸（非極性アミノ酸以外のアミノ酸）、荷電アミノ酸（酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）および塩基性アミノ酸（アルギニン、ヒスチジン、リシン））および非荷電アミノ酸（荷電アミノ酸以外のアミノ酸）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、分枝状アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、バリン）および脂肪族アミノ酸（グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン）などが知られている。
【0059】
また、アミノ酸配列上の変異または修飾によってタンパク質の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性が増加するか、タンパク質活性が増加したタンパク質を含むことができる。
また、前記タンパク質またはタンパク質を構成するペプチド水準を測定する製剤は、前記タンパク質または断片ペプチドに特異的な抗体、アンチセンスＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）、アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒ）および化合物からなる群より選択されたいずれか一つであってよいが、これに制限されない。
また、前記タンパク質またはタンパク質を構成するペプチド水準を測定する製剤は、前記タンパク質または断片ペプチドに特異的な抗体、アンチセンスＲＮＡ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ）、アプタマー（Ａｐｔａｍｅｒ）および化合物からなる群より選択されたいずれか一つであってよいが、これに制限されない。
【0060】
本発明において使用される用語「抗体」は、抗原性部位に対して指示される特異的なタンパク質分子を意味する。本発明の目的上、抗体は、ＭＳＨ２タンパク質またはＭＳＨ６タンパク質に対して特異的に結合する抗体を意味し、多クローン抗体、単クローン抗体および組換え抗体をすべて含む。
【0061】
また、前記抗体は、２個の全長さの軽鎖および２個の全長さの重鎖を有する完全な形態だけでなく、抗体分子の機能的な断片を含む。抗体分子の機能的な断片とは、少なくとも抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどがある。
【0062】
また、前記多クローン抗体は、当業者に知られている方法によって免疫原で前記遺伝子によって発現したタンパク質またはその断片を外部宿主に注射することで製造することができる。外部宿主は、マウス、レット、羊またはウサギのような哺乳動物を含む。免疫原は、筋内、腹腔内または皮下注射方法で注射され、一般的に抗原性を増加させるための補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）とともに投与される。外部宿主から定期的に血清を採取して向上した力価および抗原に対する特異性を見せる血清を回収するか、これから抗体を分離精製する。
【0063】
また、前記単一クローン抗体は、当業者に知られている融合による不死化した細胞株生成技術によって製造されることができる。例えば、前記遺伝子によって発現したタンパク質をマウスに免疫化させるか、ペプチドを合成してウシ血清アルブミンと結合させてマウスに免疫化させる。マウスから分離した抗原－生産Ｂリンパ球をヒトまたはマウスの骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）と融合して不死化したハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を生成し、前記ハイブリドーマ細胞を持って間接的な酵素結合免疫吸着分析法（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ、ＥＬＩＳＡ）を使用してモノクロナール抗体の生成有無を確認し、陽性クローンを取って培養した後、抗体を分離精製するか、レットの腹腔に注入した後に腹水を採取することで、単一クローン抗体を製造することができる。
【0064】
また、前記タンパク質水準の測定は、ウェスタンブロット、エライザ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）、放射線免疫分析（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＲＩＡ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免役電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、柔細胞分析（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、ＦＡＣＳ）、タンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）からなる群より選択された１種以上の方法で遂行されるものであってよいが、これに制限されない。
【0065】
さらに、本発明は、生物学的試料でＭＳＨ２またはＭＳＨ６の発現水準を確認するステップ；および正常試料とＭＳＨ２またはＭＳＨ６の発現水準を比較するステップ；を含む肝臓癌の診断または予後予測のための情報提供方法を提供する。
【0066】
また、前記方法は、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６が正常試料に比べて１．５倍以上過発現している場合、肝臓癌にかかる危険が高いものと判断するステップ；をさらに含むことができる。
【0067】
また、前記生物学的試料は、組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、痰、脳脊髄液または尿のような試料などを含むことができる。
【0068】
最後に、本発明は、（ａ）ＭＳＨ２遺伝子またはそのタンパク質；またはＭＳＨ６遺伝子またはそのタンパク質；を含む細胞に分析しようとする試料を接触させるステップ；（ｂ）前記ＭＳＨ２またはＭＳＨ６遺伝子の発現量、タンパク質の発現量またはタンパク質の活性を測定するステップ；および（ｃ）前記（ｂ）ステップの測定結果、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６遺伝子の発現量、タンパク質の発現量またはタンパク質の活性が減少する場合に、前記試料は、癌の予防または治療用物質と判定するステップ；を含む癌予防または治療用物質スクリーニング方法を提供する。
【0069】
また、前記癌は、肝臓癌、肺癌、頭頚部癌、結腸癌、肉腫（ｓａｒｃｏｍａ）、胃癌および胆管癌からなる群より選択されるものであってよいが、これに制限されるものではない。
【0070】
本発明において使用される用語「候補物質」は、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６遺伝子の発現；またはＭＳＨ２またはＭＳＨ６タンパク質の活性；に影響を及ぼすか否かを検査するためにスクリーニングで利用される未知の物質を意味する。前記候補物質は、これに制限されるものではないが、化学物質、ペプチドおよび天然抽出物を含むことができる。本発明のスクリーニング方法によって分析される候補物質は、単一化合物または化合物の混合物であってよく、合成または天然化合物のライブラリから得ることができる。
【0071】
また、前記（ｂ）ステップは、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６遺伝子発現量、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６タンパク質発現量、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６タンパク質の作用を受けた他のタンパク質、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６タンパク質と他のタンパク質との相互作用、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６タンパク質と他のタンパク質との複合体およびＭＳＨ２またはＭＳＨ６タンパク質の作用を受けた他のタンパク質の複合体からなる群より選択されたいずれか一つ以上を検出または測定することができるが、これに制限されない。
【0072】
また、前記ＭＳＨ２またはＭＳＨ６の遺伝子またはタンパク質の発現量測定は、ｍＲＮＡの発現水準または遺伝子によってコードされるタンパク質水準を確認することから分かる。ｍＲＮＡの量は、プライマー対またはプローブを利用して確認することができ、このための分析方法としては、ＲＴ－ＰＣＲ、競争的ＲＴ－ＰＣＲ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ
【0073】
ＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ）、ＲＮａｓｅ保護分析法（ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ、ＲＰＡ）、ノーザンブロッティング（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＤＮＡチップなどがあるが、これに制限されるものではない。前記遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、前記タンパク質に対して特異的に結合する抗体を利用してタンパク質の量を確認することができ、このための分析方法としては、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）、放射線免疫分析（ＲＩＡ：Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射免疫拡散法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）免疫拡散法、ロケット（ｒｏｃｋｅｔ）免役電気泳動、組織免疫染色、免疫沈殿分析法（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ、タンパク質チップ（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ）などがあるが、これに制限されるものではない。
【0074】
また、前記（ｃ）ステップは、前記測定結果、前記候補物質のうちからＭＳＨ２またはＭＳＨ６タンパク質の発現または活性を減少させる候補物質を選択するステップであって、前記候補物質によってＭＳＨ２またはＭＳＨ６遺伝子の発現またはＭＳＨ２またはＭＳＨ６タンパク質の活性が下向き調節（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）されることを測定して、癌の予防または治療用物質と判定することができる。
【0075】
本発明のスクリーニング方法は、様々な方式で実施することができ、特に、当業界に公知になっている様々な結合分析（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）によって高性能（ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）方式で実施することができる。本発明のスクリーニング方法において、候補物質またはＭＳＨ２タンパク質は、検出可能な標識（ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｌａｂｅｌ）で標識されることができる。例えば、前記検出可能な標識は、化学的標識（例えば、ビオチン）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼおよびβ－グルコシダーゼ）、放射能標識（例えば、Ｃ１４、Ｉ１２５、Ｐ３２およびＳ３５）、蛍光標識（例えば、クマリン、フルオレセイン、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｅｉｎ Ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ローダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）６Ｇ、ローダミンＢ、ＴＡＭＲＡ（６－ｃａｒｂｏｘｙ－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、Ｃｙ－３、Ｃｙ－５、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、ＤＡＰＩ（４，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＤａｂｓｙｌおよびＦＡＭ）、発光標識、化学発光（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）標識、ＦＲＥＴ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識または金属標識（例えば、金および銀）である。検出可能な標識が標識されたＭＳＨ２タンパク質または候補物質を利用する場合、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６タンパク質と候補物質との間の結合発生有無は、標識から出るシグナルを検出して分析することができる。例えば、標識としてアルカリンホスファターゼが利用される場合には、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ナフトール－ＡＳ－Ｂ１－ホスフェート（ｎａｐｈｔｈｏｌ－ＡＳ－Ｂ１－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）およびＥＣＦ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）のような発色反応基質を利用してシグナルを検出する。標識としてホースラディッシュペルオキシダーゼが利用される場合には、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ－ルシフェリン、ルシゲニン（ビス－Ｎ－メチルアクリジニウムナイトレート）、レゾルフィンベンジルエーテル、ルミノール、アンプレックスレッド試薬（１０－アセチル－３，７－ジヒドロキシフェノキサジン）、ＹＲ（ｐ－ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ－ＨＣｌおよびｐｙｒｏｃａｔｅｃｈｏｌ）、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＡＢＴＳ（２，２－Ａｚｉｎｅ－ｄｉ［３－ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ］）、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）およびナフトール／パイロニンのような基質を利用してシグナルを検出する。択一的に、候補物質のＭＳＨ２タンパク質への結合の有無は、相互作用物（ｉｎｔｅｒａｃｔａｎｔｓ）の標識なしに分析することもできる。例えば、マイクロフィジオメーター（ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を利用して候補物質がＭＳＨ２タンパク質に結合するか否かを分析することができる。マイクロフィジオメーターは、ＬＡＰＳ（ｌｉｇｈｔ－ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃ ｓｅｎｓｏｒ）を利用して細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析道具である。酸性化速度の変化は、候補物質とＭＳＨ２またはＭＳＨ６タンパク質との間の結合に対する指示者として利用されることができる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：１９０６１９１２（１９９２））。
【0076】
発明を実施するための形態
以下、本発明を実施例を通じてより詳しく説明することにする。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
以下、本発明を実施例を通じてより詳しく説明することにする。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【0077】
実施例１．癌抑制遺伝子であるＭＳＨ２またはＭＳＨ６の発現をｌａｒｇｅ ｃｏｈｏｒｔ ＲＮＡ ｓｅｑ ｄａｔａで確認
１－１．癌抑制遺伝子であるＭＳＨ２またはＭＳＨ６の発現をｌａｒｇｅ ｃｏｈｏｒｔ ＲＮＡ ｓｅｑ ｄａｔａで確認
１－１．癌抑制遺伝子であるＭＳＨ２またはＭＳＨ６の発現をｌａｒｇｅ ｃｏｈｏｒｔ ＲＮＡ ｓｅｑ ｄａｔａで確認
【0078】
ＴＣＧＡ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）から得ることができるＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇデータで３３個の癌腫のうちＭＳＨ２、ＭＳＨ６の発現が正常患者に比べて癌患者で１．５倍以上増加した癌腫およびｃｌｉｎｉｃａｌ ｒｅｌｅｖａｎｃｅを有している癌腫を確認した。
【0079】
その結果、ＭＳＨ２の場合、１２個の癌腫（ＬＩＨＣ、ＳＡＲＣ、ＵＣＥＣ、ＣＨＯＬ、ＣＥＳＣ、ＬＵＳＣ、ＳＴＡＤ、ＥＳＣＡ、ＢＬＣＡ、ＬＵＡＤ、ＣＯＡＤ、ＨＮＳＣ）で正常患者に比べて癌患者で発現量が１．５倍増加し、そのうちＬＩＨＣ、ＳＡＲＣ、ＵＣＥＣは、ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄされたとき、ｓｕｒｖｉｖａｌに影響を与えることが示された（図１ａおよび表１）。
【0080】
ＭＳＨ６の場合、１０個の癌腫（ＬＩＨＣ、ＬＵＡＤ、ＬＵＳＣ、ＣＨＯＬ、ＥＳＣＡ、ＨＮＳＣ、ＳＡＲＣ、ＳＴＡＤ、ＣＯＡＤ、ＧＢＭ）で正常患者に比べて癌患者で発現量が１．５倍増加し、そのうち、ＬＩＨＣ、ＬＵＡＤは、ＭＳＨ６がｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄされたとき、ｓｕｒｖｉｖａｌに影響を与えることが示された（図１ａおよび表２）。
【0081】
また、ＧＥＮＴ２を活用したａｒｒａｙ ｄａｔａ分析結果、ＭＳＨ２の発現が１３個の癌腫で増加していることを確認し、ＭＳＨ６の発現が１４個の癌腫で増加していることを確認した（図１ｂ、ｃ）。
【表1】
【表2】
【0082】
実施例２．様々な癌腫でＭＳＨ２およびＭＳＨ６の腫瘍形成に対する特性確認
様々な癌腫でｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍形成（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ）を確認するために、ｓｉ－ＭＳＨ２（配列番号１）およびｓｉ－ＭＳＨ６（配列番号２）を利用して、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６の発現が高い癌腫のうちＬＩＨＣ、ＬＵＡＤ、ＬＵＳＣ、ＣＨＯＬ、ＥＳＣＡ、ＨＮＳＣ、ＳＡＲＣ、ＳＴＡＤ、ＣＯＡＤに対するＭＴＴ ａｓｓａｙ、ＢｒｄＵ ａｓｓａｙおよびｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙを遂行した。
様々な癌腫でｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍形成（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ）を確認するために、ｓｉ－ＭＳＨ２（配列番号１）およびｓｉ－ＭＳＨ６（配列番号２）を利用して、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６の発現が高い癌腫のうちＬＩＨＣ、ＬＵＡＤ、ＬＵＳＣ、ＣＨＯＬ、ＥＳＣＡ、ＨＮＳＣ、ＳＡＲＣ、ＳＴＡＤ、ＣＯＡＤに対するＭＴＴ ａｓｓａｙ、ＢｒｄＵ ａｓｓａｙおよびｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙを遂行した。
【0083】
具体的に、様々な癌細胞株にｓｉ－ＭＳＨ２またはｓｉ－ＭＳＨ６の形質転換のために１２－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに４０％ ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙでシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、ｓｉ－ＭＳＨ２またはｓｉ－ＭＳＨ６を形質転換してＭＳＨ２またはＭＳＨ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎした。
【0084】
ＭＴＴ ａｓｓａｙのために、細胞を１２－ウェルプレートに分注し、ｓｉ－ＭＳＨ２またはｓｉ－ＭＳＨ６をトランスフェクションした後、ＭＴＴ［３－ （４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ］溶液（Ｓｉｇｍａ）０．５ ｍｇ／ｍｌと５％ ＣＯ２、３７℃で１時間の間インキュベーションした後、ＶＩＣＴＯＲ３ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌプレートリーダー機（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を利用して吸光度を測定した。その結果、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、ｇｒｏｗｔｈが阻害されることを確認した（図２ａ、ｂ）。
【0085】
また、ＢｒｄＵ ａｓｓａｙのためにｓｉ－ＭＳＨ２またはｓｉ－ＭＳＨ６が形質転換された様々な癌細胞株に５－ｂｒｏｍｏ－２’－ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）試薬を６時間の間処理し、製造企業のプロトコルによってＢｒｄＵ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して遂行した。その結果、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎが阻害されることを確認した（図３ａ、ｂ）。
【0086】
また、ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙのために、ｓｉ－ＭＳＨ２またはｓｉ－ＭＳＨ６が形質転換された様々な細胞を６－ウェルプレートに分注し、７２時間の間培養した後、トリプシンで細胞を修得した後、トリパンブルー溶液（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で染色した。染色した後、細胞をヘモサイトメーター（Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ Ｓｕｐｅｒｉｏｒ、Ｌａｕｄａ－Ｋｏｏｎｉｇｓｈｏｆｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で計数して細胞生存を確認した。その結果、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、Ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒが減ることを確認した（図４）。ここで、ＤＬＤ１ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅの場合、細胞数が減らなかったが、ＭＳＨ２ ｎｕｌｌ ｃｅｌｌであるため有意でない。
【0087】
実施例３．肝臓癌で発現が増加したＭＳＨ２検証
３－１．ＨＣＣにおけるＭＳＨ２発現確認
多くの癌腫のうち死亡率３位に該当する肝臓癌でＭＳＨ２の発現を追加で分析するために、ＴＣＧＡ、ＩＣＧＣ、ＧＳＥ７７３１４、Ｃａｔｈｏｌｉｃ＿ｍＬＩＨＣ（ＧＳＥ１１４５６４）ｄａｔａを分析した。
３－１．ＨＣＣにおけるＭＳＨ２発現確認
多くの癌腫のうち死亡率３位に該当する肝臓癌でＭＳＨ２の発現を追加で分析するために、ＴＣＧＡ、ＩＣＧＣ、ＧＳＥ７７３１４、Ｃａｔｈｏｌｉｃ＿ｍＬＩＨＣ（ＧＳＥ１１４５６４）ｄａｔａを分析した。
【0088】
ＨＣＣ（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）でサブユニット遺伝子の発現水準を確認するために、ＴＣＧＡ＿ＬＩＨＣ（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ ｌｉｖｅｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐｒｏｊｅｃｔ）、ＩＣＧＣ＿ＬＩＲＩ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｌｉｖｅｒ ＣａｎｃｅｒＲＩＫＥＮ、ＪＰ）およびＮＣＢＩのＧＥＯ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ）データベース（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒｓ：ＧＳＥ７７３１４およびＧＳＥ１１４５６４）でデータを得た。ＴＣＧＡ ｄａｔａｓｅｔｓ ＨＴＳｅｑ－ＦＰＫＭのレベル３ ｍＲＮＡ発現データは、［ｌｏｇ２（ｆｐｋｍ＋１）］値で遺伝子発現水準を評価するのに使用した。
【0089】
その結果、ＭＳＨ２の発現がＮｏｎ ｔｕｍｏｒ対比ｔｕｍｏｒで増加したことを確認し、そのうちＴＣＧＡ、ＩＣＧＣ、ＧＳＥ７７３１４ ｄａｔａ ｓｅｔのＰａｉｒｅｄ ｓａｍｐｌｅでも発現が上がっていることを確認した（図５ａ）。
次いで、ＴＣＧＡ ｄａｔａ ｓｅｔでｓｕｒｖｉｖａｌ分析（カプラン・マイヤー生存分析）を進行したとき、ＭＳＨ２の発現が高い患者の場合、ｓｕｒｖｉｖａｌが良くないことを確認した（図５ｂ）。
次いで、ＴＣＧＡ ｄａｔａ ｓｅｔでｓｕｒｖｉｖａｌ分析（カプラン・マイヤー生存分析）を進行したとき、ＭＳＨ２の発現が高い患者の場合、ｓｕｒｖｉｖａｌが良くないことを確認した（図５ｂ）。
【0090】
３－２．４０ ｍａｔｃｈｅｄ－ｐａｉｒ分析
ＨＣＣでＭＳＨ２の異常な発現を確認するために、４０比較－対（ｍａｔｃｈｅｄ－ｐａｉｒ）（ＨＣＣ組織ｖｓ非癌性周辺肝組織）のＨＣＣ組織と１３種のＨＣＣ細胞株（ＭＩＨＡ、Ｌ－０２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ３５４、ＳＮＵ３６８、ＳＮＵ３８７、ＳＮＵ３９８、ＳＮＵ４２３、ＳＮＵ４４９、ＳＮＵ４７５）で総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を利用して分離した後、ｃＤＮＡをＴｅｔｒｏ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）を利用して合成した。合成したｃＤＮＡを持ってｑＲＴ－ＰＣＲを進行した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＳｅｎｓｉＦＡＳＴＴＭ ＮｏＲＯＸ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）で遂行された。また同じＨＣＣ組織とＨＣＣ細胞株で総タンパク質を抽出してＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを施行して、ＭＳＨ２の発現も確認した。
ＨＣＣでＭＳＨ２の異常な発現を確認するために、４０比較－対（ｍａｔｃｈｅｄ－ｐａｉｒ）（ＨＣＣ組織ｖｓ非癌性周辺肝組織）のＨＣＣ組織と１３種のＨＣＣ細胞株（ＭＩＨＡ、Ｌ－０２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ３５４、ＳＮＵ３６８、ＳＮＵ３８７、ＳＮＵ３９８、ＳＮＵ４２３、ＳＮＵ４４９、ＳＮＵ４７５）で総ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を利用して分離した後、ｃＤＮＡをＴｅｔｒｏ ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｌｉｎｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）を利用して合成した。合成したｃＤＮＡを持ってｑＲＴ－ＰＣＲを進行した。ｑＲＴ－ＰＣＲは、ＳｅｎｓｉＦＡＳＴＴＭ ＮｏＲＯＸ Ｋｉｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ）で遂行された。また同じＨＣＣ組織とＨＣＣ細胞株で総タンパク質を抽出してＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを施行して、ＭＳＨ２の発現も確認した。
【0091】
前記４０比較－対のＨＣＣ組織およびこれに相応する非癌性周辺肝組織は、韓国人体由来資源銀行（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｂａｎｋ）から得、ヘルシンキ宣言によって各被験者から書面同意を得て、カトリック大学医科大学の誠意キャンパスのＩＲＢ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｏａｒｄ）から承認を受けた（承認番号：ＭＣ１９ＴＥＳＩ００１６）。その結果、４０人のＨＣＣ患者のうち２５人（６２．５％）から非－癌性肝組織に比べてＭＳＨ２の顕著な過発現が示されることをｑＲＴ－ＰＣＲを通じて確認した（図５ｃ）。
【0092】
また、人体由来資源銀行から分譲された肝臓癌患者の正常肝組織、肝臓癌組織のＰｒｏｔｅｉｎを抽出して、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを通じてＭＳＨ２タンパク質の発現を確認したとき、Ｔｕｍｏｒ組織で発現が増加していることを確認した（図５ｇ）。
【0093】
３－３．肝臓癌細胞株でＭＳＨ２発現確認
様々な肝臓癌細胞株でＭＳＨ２発現水準を確認するために、ＭＳＨ２に対するｑＲＴ－ＰＣＲおよびＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを遂行した。その結果、正常肝細胞（ＭＩＨＡ）に比べてＭＳＨ２ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現が増加していることを確認した（図５ｄ、ｅ）。
様々な肝臓癌細胞株でＭＳＨ２発現水準を確認するために、ＭＳＨ２に対するｑＲＴ－ＰＣＲおよびＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを遂行した。その結果、正常肝細胞（ＭＩＨＡ）に比べてＭＳＨ２ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現が増加していることを確認した（図５ｄ、ｅ）。
【0094】
追加的に、ＭＳＨ２発現が増加した肝臓癌でＭＳＨ２抑制による効果を確認するために、ＭＳＨ２の発現が高い肝臓癌細胞株（ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ４７５）でＭＳＨ２をｋｎｏｃｋｄｏｗｎした後、ＭＴＴ ａｓｓａｙとＢｒｄＵ ａｓｓａｙを遂行した。その結果、ＭＳＨ２が増加した肝臓癌細胞株でＭＳＨ２を抑制する場合、Ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈおよびＣｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎが減少することを確認した（図５ｆ）。
【0095】
実施例４．ＭＳＨ２の発癌過程に対する特性確認
４－１．腫瘍細胞増殖に対する効果確認
肝臓癌におけるＭＳＨ２の腫瘍形成特性を確認するために、ｓｉ－ＭＳＨ２が形質転換されたＳＮＵ１８２およびＳＮＵ４７５に対してＣｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙを遂行した。
４－１．腫瘍細胞増殖に対する効果確認
肝臓癌におけるＭＳＨ２の腫瘍形成特性を確認するために、ｓｉ－ＭＳＨ２が形質転換されたＳＮＵ１８２およびＳＮＵ４７５に対してＣｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙを遂行した。
【0096】
Ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ分析は、陰性対照群ｓｉＲＮＡ（ｓｉ－Ｃｏｎｔ）とｓｉ－ＭＳＨ２ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ細胞を６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（１０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）にシードした。１２日後、コロニーを常温で１％パラホルムアルデヒドで３０分間固定し、常温で０．５％クリスタルバイオレットで１時間の間染色した。染色されたコロニーは、商業用ソフトウェア（Ｃｌｏｎｏカウンター）を使用して計算された。
【0097】
その結果、ＭＳＨ２の発現が増加している肝臓癌細胞株（ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ４７５）でＭＳＨ２をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、Ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎが減ることを確認した（図６ａ）。
【0098】
４－２．腫瘍細胞の細胞死滅に対する効果確認
ｓｉ－ＭＳＨ２トランスフェクションによる細胞死滅および細胞周期調節の変化を確認した。細胞死滅は、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣアポトシス検出キットＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ水準を測定した。具体的に、ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ４７５細胞をｓｉ－ＭＳＨ２でトランスフェクションし、４８時間培養後、トリプシン－ＥＤＴＡで細胞を分離し、ＰＢＳで洗浄した。１×ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで再浮遊し、１×１０５個の細胞を含有するように１００μｌを５ｍｌ培養チューブに移した。その後、５μｌ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣおよび５μｌ ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）溶液を添加し、細胞を常温で暗条件で１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、１ｘバインディングバッファー４００μｌを各チューブに添加し、死滅分画をＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＴＭｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。また、前記ｓｉ－ＭＳＨ２が形質転換されたＳＮＵ１８２、ＳＮＵ４７５細胞でＡｐｏｐｔｏｓｉｓ
ｓｉ－ＭＳＨ２トランスフェクションによる細胞死滅および細胞周期調節の変化を確認した。細胞死滅は、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣアポトシス検出キットＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ水準を測定した。具体的に、ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ４７５細胞をｓｉ－ＭＳＨ２でトランスフェクションし、４８時間培養後、トリプシン－ＥＤＴＡで細胞を分離し、ＰＢＳで洗浄した。１×ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで再浮遊し、１×１０５個の細胞を含有するように１００μｌを５ｍｌ培養チューブに移した。その後、５μｌ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ－ＦＩＴＣおよび５μｌ ＰＩ（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）溶液を添加し、細胞を常温で暗条件で１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、１ｘバインディングバッファー４００μｌを各チューブに添加し、死滅分画をＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＴＭｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。また、前記ｓｉ－ＭＳＨ２が形質転換されたＳＮＵ１８２、ＳＮＵ４７５細胞でＡｐｏｐｔｏｓｉｓ
【0099】
ｍａｒｋｅｒであるＣａｓｐａｓｅ－３およびＣｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰの発現水準を確認した。
その結果、ＭＳＨ２をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓが増加することをＦＡＣＳ ａｎａｌｙｓｉｓを通じて確認し（図６ｂ）、同様にタンパク質発現分析結果、ＰＡＲＰおよびｃａｓｐａｓｅ－３は減少し、Ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰが増加することが示され、これを通じて細胞死滅に関与するＰＡＲＰおよびｃａｓｐａｓｅ－３が活性化することを確認した（図６ｃ）。
その結果、ＭＳＨ２をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓが増加することをＦＡＣＳ ａｎａｌｙｓｉｓを通じて確認し（図６ｂ）、同様にタンパク質発現分析結果、ＰＡＲＰおよびｃａｓｐａｓｅ－３は減少し、Ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰが増加することが示され、これを通じて細胞死滅に関与するＰＡＲＰおよびｃａｓｐａｓｅ－３が活性化することを確認した（図６ｃ）。
【0100】
４－３．腫瘍細胞移動および侵襲に対する効果確認
上皮－肝葉転移（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｔｏｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）が細胞成長と併せて癌進行の核心過程として提示されてきたので、ＨＣＣ細胞でＭＳＨ２を抑制し、スクラッチ傷治癒分析を遂行した。具体的に、ＳＮＵ１８２およびＳＮＵ４７５細胞をｓｉ－ＭＳＨ２でトランスフェクションした後、２４時間の間インキュベーションし、トリプシン－ＥＤＴＡで細胞を取り外して、６－ウェルプレートにウェル当たり１×１０６個で分注した。翌日、細胞単一層を滅菌されたマイクロピペットチップで掻き取った。スクラッチ直後、初期スクラッチの間隔と２４時間後の間隔をＩＸ７１ ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を利用して撮影した。
上皮－肝葉転移（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｔｏｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）が細胞成長と併せて癌進行の核心過程として提示されてきたので、ＨＣＣ細胞でＭＳＨ２を抑制し、スクラッチ傷治癒分析を遂行した。具体的に、ＳＮＵ１８２およびＳＮＵ４７５細胞をｓｉ－ＭＳＨ２でトランスフェクションした後、２４時間の間インキュベーションし、トリプシン－ＥＤＴＡで細胞を取り外して、６－ウェルプレートにウェル当たり１×１０６個で分注した。翌日、細胞単一層を滅菌されたマイクロピペットチップで掻き取った。スクラッチ直後、初期スクラッチの間隔と２４時間後の間隔をＩＸ７１ ｐｈｏｔｏｍｉｃｒｏｇｒａｐｈ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を利用して撮影した。
【0101】
その結果、ＳＮＵ１８２およびＳＮＵ４７５細胞のすべてでＭＳＨ２をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、傷治癒効果が顕著に減少したことが分かった（図６ｄ）。
【0102】
また、変形したＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ ａｓｓａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙを通じて癌細胞の移動および侵襲特性を確認した。ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙは、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｐｌａｔｅおよび細胞培養インサート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。具体的に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）は、ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．０１ Ｍ Ｔｒｉｓ、０．７％ ＮａＣｌ、ｐＨ ８．０）とともに０．３ｍｇ／ｍｌ濃度で希釈され、１００ μｌ Ｍａｔｒｉｇｅｌは、細胞培養インサート上部にコーティングされた。３７℃で１時間の間インキュベーションした後、インサートの表面にウェル当たり１．５×１０５ ｃｅｌｌ（ｍｏｔｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ）または１．０×１０５ ｃｅｌｌ（ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）をｓｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍとともにシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、ｌｏｗｅｒ ｔｒａｎｓｗｅｌｌは、ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔとして２％ ＦＢＳを含むようにした。プレートを３７℃で１２時間の間インキュベーションした後、Ｄｉｆｆ－Ｑｕｉｋ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｓｙｓｍｅｘ、Ｋｏｂｅ、Ｊａｐａｎ）．を利用して染色した。細胞イメージは、Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）でＸ２００倍率で確認した。
【0103】
その結果、ＳＮＵ１８２およびＳＮＵ４７５細胞のすべてでＭＳＨ２をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｖａｓｉｏｎが顕著に減少することが示された（図６ｅ）。
【0104】
前記結果をさらに検証するために、ＥＭＴ ｍａｒｋｅｒに対するウェスタンブロットを遂行し、その結果、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｓｌｕｇが減少することを確認した（図６ｆ）。
【0105】
４－４．腫瘍細胞の細胞周期調節変化効果確認
細胞周期調節の変化を確認するために、細胞をｓｉ－ＭＳＨ２でトランスフェクションし、４８時間培養後、トリプシン－ＥＤＴＡで細胞を分離した。分離した細胞は、７０％エタノールに固定されたＰＢＳで洗浄され、３ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ、５０μｇ／ｍｌ ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ）および１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む２００μｌ ＰＢＳで再浮遊された。細胞は、３７℃で暗条件で４５分間インキュベーションした。インキュベーション後、染色された細胞分画は、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＴＭ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を利用して検出した。
細胞周期調節の変化を確認するために、細胞をｓｉ－ＭＳＨ２でトランスフェクションし、４８時間培養後、トリプシン－ＥＤＴＡで細胞を分離した。分離した細胞は、７０％エタノールに固定されたＰＢＳで洗浄され、３ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ Ａ、５０μｇ／ｍｌ ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ）および１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む２００μｌ ＰＢＳで再浮遊された。細胞は、３７℃で暗条件で４５分間インキュベーションした。インキュベーション後、染色された細胞分画は、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＴＭ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を利用して検出した。
【0106】
その結果、ＭＳＨ２の発現が増加している肝臓癌細胞株（ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ４７５）でＭＳＨ２をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、Ｇ１／Ｓ ａｒｒｅｓｔをＦＡＣＳ ａｎａｌｙｓｉｓを通じて確認した（図７ａ）。
【0107】
前記結果をさらに検証するために、Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｍａｒｋｅｒに対するウェスタンブロットを遂行し、その結果、ｐ２７の増加とＣＤＫ４、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ＣＤＫ２、Ｃｙｃｌｉｎ Ｅの減少を確認した（図７ｂ）。
【0108】
前記結果を通じて、ＭＳＨ２の異常な発現がＨＣＣの抗－死滅および転移特性に寄与することが分かった。
【0109】
実施例５．ＭＳＨ２の腫瘍遺伝子特性確認
ＭＳＨ２のｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎを確認するために、ＭＳＨ２の発現が減少している正常肝細胞株（ＭＩＨＡ）と肝臓癌細胞株（Ｈｕｈ７）でＴｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを通じてＭＳＨ２をＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎした後、ＭＴＴ ａｓｓａｙおよびＢｒｄＵ ａｓｓａｙを遂行した。
ＭＳＨ２のｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎを確認するために、ＭＳＨ２の発現が減少している正常肝細胞株（ＭＩＨＡ）と肝臓癌細胞株（Ｈｕｈ７）でＴｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを通じてＭＳＨ２をＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎした後、ＭＴＴ ａｓｓａｙおよびＢｒｄＵ ａｓｓａｙを遂行した。
【0110】
その結果、ＭＳＨ２が減少した正常肝細胞株および肝臓癌細胞株でＭＳＨ２を過発現させる場合、Ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈおよびＣｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎが増加することを確認した（図８ａ）。
【0111】
次いで、ＭＳＨ２の発現が減少している正常肝細胞株（ＭＩＨＡ）と肝臓癌細胞株（Ｈｕｈ７）にＭＳＨ２を持続的に過発現するＳｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅを製作した。
【0112】
具体的に、「Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ」薬物に耐性があって、ｓｅｌｅｃｔｉｏｎが可能なＭＳＨ２プラスミドをＭＳＨ２の発現が減少している正常肝細胞株（ＭＩＨＡ）と肝臓癌細胞株（Ｈｕｈ７）にｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎしてＳｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅを製作した。Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ後、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ薬物を処理するようになれば、プラスミドが導入されたｃｅｌｌだけ生き残るようになってｓｅｌｅｃｔｉｏｎすることができ、生き残ったｃｅｌｌのみを継代培養してプラスミドが導入されたｃｅｌｌだけ培養することができるようにした。このようにｓｅｌｅｃｔｉｏｎされた細胞は、持続的にＭＳＨ２を発現するようになる。
【0113】
その結果、前記結果と同様にＣｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈおよびＣｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎが増加することを確認した（図８ｂ）。
【0114】
実施例６．ＭＳＨ２の標的分子探索
６－１．ＭＳＨ２の標的分子探索
Ｌｙｎｃｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅでＭＳＨ２は、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ部分にｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎされていると知られている。これを肝臓癌でも確認をするために、ＴＣＧＡ、ＩＣＧＣ ｄａｔａ ｓｅｔでＭＳＨ２とＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎに関与するＤＮＭＴ ｆａｍｉｌｙとのｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎを確認した。
６－１．ＭＳＨ２の標的分子探索
Ｌｙｎｃｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅでＭＳＨ２は、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ部分にｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎされていると知られている。これを肝臓癌でも確認をするために、ＴＣＧＡ、ＩＣＧＣ ｄａｔａ ｓｅｔでＭＳＨ２とＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎに関与するＤＮＭＴ ｆａｍｉｌｙとのｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎを確認した。
【0115】
その結果、ＴＣＧＡ＿ＬＩＨＣでＭＳＨ２とＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂは有意な量の相関関係（ｒ＝０．８３９、ｒ＝０．７０２、ｒ＝０．７００、Ｐ＜０．０００１）を有しており、これは、ＩＣＧＣ＿ＬＩＲＩ＿ＪＰのＲＮＡ ｓｅｑデータでも同じ結果（ｒ＝０．７３２、ｒ＝０．６６１、ｒ＝０．５７０、Ｐ＜０．０００１）を示して、ＭＳＨ２はＤＮＭＴ ｆａｍｉｌｙであるＤＮＭＴ１、ＤＮＭＡ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂと強いｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎを有していることを確認することができた（図９ａ）。同様に、ＭＳＨ２をｋｎｏｃｋｄｏｗｎした際にも、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂのタンパク質発現が減ることを確認した（図９ｂ）。
【0116】
しかし、ＭＳＨ２のｐｒｏｍｏｔｅｒ部分のｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎをＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲを通じて確認した結果、ＨＣＣ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（Ｌ－０２、ＭＩＨＡ、ＳＮＵ－１８２、ＨｅｐＧ２、ＳＮＵ３８７）ではＭＳＨ２のｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎが確認されていない（図９ｃ）。
【0117】
よって、他の機序でＭＳＨ２がＤＮＭＴ ｆａｍｉｌｙの発現を調節すると仮定して、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３ＢのｐｒｏｍｏｔｅｒにＭＳＨ２がｂｉｎｄｉｎｇするかを確認するために、ＣｈＩＰ ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ Ａｇａｒｏｓｅ ＣｈＩＰ ｋｉｔ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を進行した。Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ＤＮＡは、ＩｇＧコントロールでｎｏｒｍａｌｉｚｅしてＭＳＨ２抗体を利用して測定した。ＤＮＭＴ ｆａｍｉｌｙのｐｒｏｍｏｔｅｒを確認することができるプライマーを製作してバインディングを確認した。その結果、ＤＮＭＴ１のプロモーター部分にだけＭＳＨ２がバインディングすることを確認することができた（図９ｄ）。
【0118】
６－２．ＭＳＨ２抑制剤のＤＮＭＴ抑制活性確認
ＭＳＨ２とＤＮＭＴ１のｐｒｏｍｏｔｅｒ位置にｂｉｎｄｉｎｇすることを確認したため、ＭＳＨ２がＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒとして作用してＤＮＭＴ１の発現を調節するということを類推することができた。したがって、ＭＳＨ２によってＤＮＭＴ１の転写が調節されるかを確認するために、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙを進行した。ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ４７５細胞株のｃＤＮＡからＤＮＭＴ１のプロモーターをＰＣＲで増幅した後、ｐＧＬ３＿ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＸｈｏ１／Ｂｇｌ２位置にクローニングしてレポーターベクターｐＧＬ３＿ｂａｓｉｃ＿ＤＮＭＴ１を製作した。その後、ｐＧＬ３＿ｂａｓｉｃ＿ＤＮＭＴ１とｓｉ－ＭＳＨ２（配列番号１）をトランスフェクションして、ルシフェラーゼレポーター分析を進行し、その結果を陰性対照群である対照群ｓｉＲＮＡ処理群（ｓｉ－Ｎ．Ｃ）の結果と比較した。その結果、ＳＮＵ－１８２、ＳＮＵ－４７５細胞株のすべてでｓｉ－ＭＳＨ２処理によって対照群に比べてルシフェラーゼ活性が顕著に減少したことを確認することができた（図９ｅ）。
ＭＳＨ２とＤＮＭＴ１のｐｒｏｍｏｔｅｒ位置にｂｉｎｄｉｎｇすることを確認したため、ＭＳＨ２がＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒとして作用してＤＮＭＴ１の発現を調節するということを類推することができた。したがって、ＭＳＨ２によってＤＮＭＴ１の転写が調節されるかを確認するために、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙを進行した。ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ４７５細胞株のｃＤＮＡからＤＮＭＴ１のプロモーターをＰＣＲで増幅した後、ｐＧＬ３＿ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のＸｈｏ１／Ｂｇｌ２位置にクローニングしてレポーターベクターｐＧＬ３＿ｂａｓｉｃ＿ＤＮＭＴ１を製作した。その後、ｐＧＬ３＿ｂａｓｉｃ＿ＤＮＭＴ１とｓｉ－ＭＳＨ２（配列番号１）をトランスフェクションして、ルシフェラーゼレポーター分析を進行し、その結果を陰性対照群である対照群ｓｉＲＮＡ処理群（ｓｉ－Ｎ．Ｃ）の結果と比較した。その結果、ＳＮＵ－１８２、ＳＮＵ－４７５細胞株のすべてでｓｉ－ＭＳＨ２処理によって対照群に比べてルシフェラーゼ活性が顕著に減少したことを確認することができた（図９ｅ）。
【0119】
実施例７．肝臓癌で発現が増加したＭＳＨ６検証
７－１．ＨＣＣにおけるＭＳＨ６発現確認
多くの癌腫のうち死亡率３位に該当する肝臓癌でＭＳＨ６の発現を追加で分析するために、ＴＣＧＡ、ＩＣＧＣ、ＧＳＥ７７３１４、Ｃａｔｈｏｌｉｃ＿ｍＬＩＨＣ（ＧＳＥ１１４５６４）ｄａｔａを分析した。実験は実施例３－１と同じ方法で遂行した。
その結果、ＭＳＨ６の発現がＮｏｎ ｔｕｍｏｒ対比ｔｕｍｏｒで増加したことを確認し、そのうちＴＣＧＡ、ＩＣＧＣ、ＧＳＥ７７３１４ ｄａｔａ ｓｅｔのＰａｉｒｅｄ
７－１．ＨＣＣにおけるＭＳＨ６発現確認
多くの癌腫のうち死亡率３位に該当する肝臓癌でＭＳＨ６の発現を追加で分析するために、ＴＣＧＡ、ＩＣＧＣ、ＧＳＥ７７３１４、Ｃａｔｈｏｌｉｃ＿ｍＬＩＨＣ（ＧＳＥ１１４５６４）ｄａｔａを分析した。実験は実施例３－１と同じ方法で遂行した。
その結果、ＭＳＨ６の発現がＮｏｎ ｔｕｍｏｒ対比ｔｕｍｏｒで増加したことを確認し、そのうちＴＣＧＡ、ＩＣＧＣ、ＧＳＥ７７３１４ ｄａｔａ ｓｅｔのＰａｉｒｅｄ
【0120】
ｓａｍｐｌｅでも発現が上がっていることを確認した（図１０ａ）。
次いで、ＴＣＧＡ ｄａｔａ ｓｅｔでｓｕｒｖｉｖａｌ分析（カプラン・マイヤー生存分析）を進行したとき、ＭＳＨ６の発現が高い患者の場合、ｓｕｒｖｉｖａｌが良くないことを確認した（図１０ｂ）。
次いで、ＴＣＧＡ ｄａｔａ ｓｅｔでｓｕｒｖｉｖａｌ分析（カプラン・マイヤー生存分析）を進行したとき、ＭＳＨ６の発現が高い患者の場合、ｓｕｒｖｉｖａｌが良くないことを確認した（図１０ｂ）。
【0121】
７－２．４０ ｍａｔｃｈｅｄ－ｐａｉｒ分析
ＨＣＣでＭＳＨ６の異常な発現を確認するために、４０比較－対（ｍａｔｃｈｅｄ－ｐａｉｒ）（ＨＣＣ組織ｖｓ非癌性周辺肝組織）のＨＣＣ組織と１３種のＨＣＣ細胞株（ＭＩＨＡ、Ｌ－０２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ３５４、ＳＮＵ３６８、ＳＮＵ３８７、ＳＮＵ３９８、ＳＮＵ４２３、ＳＮＵ４４９、ＳＮＵ４７５）を使用して４０ ｍａｔｃｈｅｄ－ｐａｉｒ分析を遂行し、実験は実施例３－２と同じ方法で遂行した。
ＨＣＣでＭＳＨ６の異常な発現を確認するために、４０比較－対（ｍａｔｃｈｅｄ－ｐａｉｒ）（ＨＣＣ組織ｖｓ非癌性周辺肝組織）のＨＣＣ組織と１３種のＨＣＣ細胞株（ＭＩＨＡ、Ｌ－０２、Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈｕｈ７、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５、ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ３５４、ＳＮＵ３６８、ＳＮＵ３８７、ＳＮＵ３９８、ＳＮＵ４２３、ＳＮＵ４４９、ＳＮＵ４７５）を使用して４０ ｍａｔｃｈｅｄ－ｐａｉｒ分析を遂行し、実験は実施例３－２と同じ方法で遂行した。
【0122】
その結果、４０人のＨＣＣ患者のうち２４人（６０．０％）から非－癌性肝組織に比べてＭＳＨ６の顕著な過発現が現れることをｑＲＴ－ＰＣＲを通じて確認した（図１０ｃ）。
【0123】
また、人体由来資源銀行で分譲された肝臓癌患者の正常肝組織、肝臓癌組織のＰｒｏｔｅｉｎを抽出して、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを通じてＭＳＨ６タンパク質の発現を確認したとき、Ｔｕｍｏｒ組織で発現が増加していることを確認した（図１０ｇ）。
【0124】
７－３．肝臓癌細胞株でＭＳＨ６発現確認
様々な肝臓癌細胞株でＭＳＨ６発現水準を確認するために、ＭＳＨ６に対するｑＲＴ－ＰＣＲおよびＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを遂行した。その結果、正常肝細胞（ＭＩＨＡ）に比べてＭＳＨ６ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現が増加していることを確認した（図１０ｄ、ｅ）。
様々な肝臓癌細胞株でＭＳＨ６発現水準を確認するために、ＭＳＨ６に対するｑＲＴ－ＰＣＲおよびＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを遂行した。その結果、正常肝細胞（ＭＩＨＡ）に比べてＭＳＨ６ ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現が増加していることを確認した（図１０ｄ、ｅ）。
【0125】
追加的に、ＭＳＨ６発現が増加した肝臓癌でＭＳＨ６抑制による効果を確認するために、ＭＳＨ６の発現が高い肝臓癌細胞株（ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ４７５）でＭＳＨ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎした後、ＭＴＴ ａｓｓａｙとＢｒｄＵ ａｓｓａｙを遂行した。その結果、ＭＳＨ６が増加した肝臓癌細胞株でＭＳＨ６を抑制する場合、Ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈおよびＣｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎが減少することを確認した（図１０ｆ）。
【0126】
実施例８．ＭＳＨ６の発癌過程に対する特性確認
８－１．腫瘍細胞増殖に対する効果確認
肝臓癌におけるＭＳＨ６の腫瘍形成特性を確認するために、ｓｉ－ＭＳＨ６が形質転換されたＳＮＵ１８２およびＳＮＵ４７５に対してＣｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙを遂行し、実験は実施例４－１と同じ方法で遂行した。
８－１．腫瘍細胞増殖に対する効果確認
肝臓癌におけるＭＳＨ６の腫瘍形成特性を確認するために、ｓｉ－ＭＳＨ６が形質転換されたＳＮＵ１８２およびＳＮＵ４７５に対してＣｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙを遂行し、実験は実施例４－１と同じ方法で遂行した。
【0127】
その結果、ＭＳＨ６の発現が増加している肝臓癌細胞株（ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ４７５）でＭＳＨ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、Ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍａｔｉｏｎが減ることを確認した（図１１ａ）。
【0128】
８－２．腫瘍細胞の細胞死滅に対する効果確認
ｓｉ－ＭＳＨ６トランスフェクションによる細胞死滅および細胞周期調節の変化を確認し、実験は実施例４－２と同じ方法で遂行した。
ｓｉ－ＭＳＨ６トランスフェクションによる細胞死滅および細胞周期調節の変化を確認し、実験は実施例４－２と同じ方法で遂行した。
【0129】
その結果、ＭＳＨ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓが増加することをＦＡＣＳ ａｎａｌｙｓｉｓを通じて確認し（図１１ｂ）、同様にタンパク質発現分析結果、ＰＡＲＰおよびｃａｓｐａｓｅ－３は減少し、Ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰが増加することが示され、これを通じて細胞死滅に関与するＰＡＲＰおよびｃａｓｐａｓｅ－３が活性化することを確認した（図１１ｃ）。
【0130】
８－３．腫瘍細胞移動および侵襲に対する効果確認
上皮－肝葉転移（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｔｏｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）が細胞成長と併せて癌進行の核心過程として提示されてきたので、ＨＣＣ細胞でＭＳＨ６を抑制し、スクラッチ傷治癒分析を遂行し、変形したＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ ａｓｓａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙを通じて癌細胞の移動および侵襲特性を確認した。実験は実施例４－３と同じ方法で遂行した。
上皮－肝葉転移（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ－ｔｏｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ、ＥＭＴ）が細胞成長と併せて癌進行の核心過程として提示されてきたので、ＨＣＣ細胞でＭＳＨ６を抑制し、スクラッチ傷治癒分析を遂行し、変形したＢｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ ａｓｓａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびｔｒａｎｓｗｅｌｌ ｉｎｖａｓｉｏｎ ａｓｓａｙを通じて癌細胞の移動および侵襲特性を確認した。実験は実施例４－３と同じ方法で遂行した。
【0131】
その結果、ＳＮＵ１８２およびＳＮＵ４７５細胞のすべてでＭＳＨ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、傷治癒効果が顕著に減少したことが分かった（図１１ｄ）。また、ＳＮＵ１８２およびＳＮＵ４７５細胞のすべてでＭＳＨ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｖａｓｉｏｎが顕著に減少することが示された（図１１ｅ）。
【0132】
前記結果をさらに検証するために、ＥＭＴ ｍａｒｋｅｒに対するウェスタンブロットを遂行し、その結果、Ｎ－Ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、Ｓｌｕｇが減少することを確認した（図１１ｆ）。
【0133】
８－４．腫瘍細胞の細胞周期調節変化効果確認
ＭＳＨ６の発現が増加している肝臓癌細胞株（ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ４７５）をＭＳＨ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎさせたとき、細胞周期調節の変化を確認し、実験は実施例４－４と同じ方法で遂行した。
ＭＳＨ６の発現が増加している肝臓癌細胞株（ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ４７５）をＭＳＨ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎさせたとき、細胞周期調節の変化を確認し、実験は実施例４－４と同じ方法で遂行した。
【0134】
その結果、ＭＳＨ６の発現が増加している肝臓癌細胞株（ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ４７５）でＭＳＨ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、Ｇ１／Ｓ ａｒｒｅｓｔをＦＡＣＳ ａｎａｌｙｓｉｓを通じて確認した（図１２ａ）。
【0135】
前記結果をさらに検証するために、Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｍａｒｋｅｒに対するウェスタンブロットを遂行し、その結果、ｐ２７の増加とＣＤＫ４、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、ＣＤＫ２、Ｃｙｃｌｉｎ Ｅの減少を確認した（図１２ｂ）。
【0136】
前記結果を通じて、ＭＳＨ６の異常な発現がＨＣＣの抗－死滅および転移特性に寄与することが分かった。
【0137】
実施例９．ＭＳＨ６の腫瘍遺伝子特性確認
ＭＳＨ６のｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎを確認するために、ＭＳＨ６の発現が減少している正常肝細胞株（ＭＩＨＡ）と肝臓癌細胞株（Ｈｕｈ７）でＴｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを通じてＭＳＨ６をＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎした後、ＭＴＴ ａｓｓａｙおよびＢｒｄＵ ａｓｓａｙを遂行した。
ＭＳＨ６のｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎを確認するために、ＭＳＨ６の発現が減少している正常肝細胞株（ＭＩＨＡ）と肝臓癌細胞株（Ｈｕｈ７）でＴｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎを通じてＭＳＨ６をＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎした後、ＭＴＴ ａｓｓａｙおよびＢｒｄＵ ａｓｓａｙを遂行した。
【0138】
その結果、ＭＳＨ６が減少した正常肝細胞株および肝臓癌細胞株でＭＳＨ６を過発現させる場合、Ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈおよびＣｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎが増加することを確認した（図１３ａ）。
【0139】
次いで、ＭＳＨ６の発現が減少している正常肝細胞株（ＭＩＨＡ）と肝臓癌細胞株（Ｈｕｈ７）にＭＳＨ６を持続的に過発現するＳｔａｂｌｅ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅを製作し、前記ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ製作は実施例５と同じ方法で遂行した。
【0140】
その結果、前記結果と同様にＣｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈおよびＣｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎが増加することを確認した（図１３ｂ）。
【0141】
実施例１０．ＭＳＨ６の標的分子探索
１０－１．ＭＳＨ６の標的分子探索
Ｌｙｎｃｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅでＭＳＨ６とｈｅｔｅｒｏ ｄｉｍｅｒを成すＭＳＨ２は、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ部分にｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎされていると知られている。これを肝臓癌でも確認をするために、ＴＣＧＡ、ＩＣＧＣ ｄａｔａ ｓｅｔでＭＳＨ６とＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎに関与するＤＮＭＴ ｆａｍｉｌｙとのｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎを確認した。
１０－１．ＭＳＨ６の標的分子探索
Ｌｙｎｃｈ ｓｙｎｄｒｏｍｅでＭＳＨ６とｈｅｔｅｒｏ ｄｉｍｅｒを成すＭＳＨ２は、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ部分にｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎされていると知られている。これを肝臓癌でも確認をするために、ＴＣＧＡ、ＩＣＧＣ ｄａｔａ ｓｅｔでＭＳＨ６とＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎに関与するＤＮＭＴ ｆａｍｉｌｙとのｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎを確認した。
【0142】
その結果、ＴＣＧＡ＿ＬＩＨＣでＭＳＨ６とＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂは、有意な量の相関関係（ｒ＝０．７２４、ｒ＝０．５９４、ｒ＝０．４６０、Ｐ＜０．０００１）を有しており、これは、ＩＣＧＣ＿ＬＩＲＩ＿ＪＰのＲＮＡ ｓｅｑデータでも同じ結果（ｒ＝０．５８６、ｒ＝０．４７９、ｒ＝０．３３７、Ｐ＜０．０００１）を示し、ＭＳＨ６は、ＤＮＭＴ ｆａｍｉｌｙであるＤＮＭＴ１、ＤＮＭＡ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂと強いｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎを有していることを確認することができた（図１４ａ）。同様に、ＭＳＨ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたときにも、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂのタンパク質発現が減ることを確認した（図１４ｂ）。
【0143】
しかし、ＭＳＨ６のｐｒｏｍｏｔｅｒ部分のｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎをＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲを通じて確認した結果、ＨＣＣ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（Ｌ－０２、ＭＩＨＡ、ＳＮＵ－１８２、ＨｅｐＧ２、ＳＮＵ３８７）ではＭＳＨ６のｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎが確認されていない（図１４ｃ）。
【0144】
したがって、他の機序でＭＳＨ６がＤＮＭＴ ｆａｍｉｌｙの発現を調節すると仮定して、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３ＢのｐｒｏｍｏｔｅｒにＭＳＨ６がｂｉｎｄｉｎｇするかを確認するために、ＣｈＩＰ ａｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ Ａｇａｒｏｓｅ ＣｈＩＰ ｋｉｔ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を進行した。Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ ＤＮＡは、ＩｇＧコントロールでｎｏｒｍａｌｉｚｅしてＭＳＨ６抗体を利用して測定した。ＤＮＭＴ ｆａｍｉｌｙのｐｒｏｍｏｔｅｒを確認することができるプライマーを製作してバインディングを確認した。その結果、ＤＮＭＴ１のプロモーター部分にだけＭＳＨ６がバインディングすることを確認することができた（図１４ｄ）。
【0145】
１０－２．ＭＳＨ６抑制剤のＤＮＭＴ抑制活性確認
ＭＳＨ６とＤＮＭＴ１のｐｒｏｍｏｔｅｒ位置にｂｉｎｄｉｎｇすることを確認したため、ＭＳＨ６がＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒとして作用してＤＮＭＴ１の発現を調節するということを類推することができた。したがって、ＭＳＨ６によってＤＮＭＴ１の転写が調節されるかを確認するために、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙを進行し、実験は実施例６－２と同じ方法で遂行した。
その結果、ＳＮＵ－１８２、ＳＮＵ－４７５細胞株のすべてでｓｉ－ＭＳＨ６処理によって対照群に比べてルシフェラーゼ活性が顕著に減少したことを確認することができた（図１４ｅ）。
ＭＳＨ６とＤＮＭＴ１のｐｒｏｍｏｔｅｒ位置にｂｉｎｄｉｎｇすることを確認したため、ＭＳＨ６がＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒとして作用してＤＮＭＴ１の発現を調節するということを類推することができた。したがって、ＭＳＨ６によってＤＮＭＴ１の転写が調節されるかを確認するために、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙを進行し、実験は実施例６－２と同じ方法で遂行した。
その結果、ＳＮＵ－１８２、ＳＮＵ－４７５細胞株のすべてでｓｉ－ＭＳＨ６処理によって対照群に比べてルシフェラーゼ活性が顕著に減少したことを確認することができた（図１４ｅ）。
【0146】
実施例１１．肝臓癌でＭＳＨ２／ＭＳＨ６－ＤＮＭＴ１－ＫＬＦ４相関関係確認
ＤＮＭＴ１がＫＬＦ４のｐｒｏｍｏｔｅｒをメチル化して発現を抑制すると知られている。よって、肝臓癌でもＤＮＭＴ１とＫＬＦ４の相関関係を確認するために、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６を過発現または抑制した後、ＫＬＦ４ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲを進行して確認した。
ＤＮＭＴ１がＫＬＦ４のｐｒｏｍｏｔｅｒをメチル化して発現を抑制すると知られている。よって、肝臓癌でもＤＮＭＴ１とＫＬＦ４の相関関係を確認するために、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６を過発現または抑制した後、ＫＬＦ４ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲを進行して確認した。
【0147】
その結果、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６をｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎしたとき、ＤＮＭＴ１が増加するようになるとともに、ＫＬＦ４のｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎが増加することを確認したが（図１５ａ）、逆にＭＳＨ２またはＭＳＨ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６が減少してＤＮＭＴ１の発現が減少するようになり、ＫＬＦ４のｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎが減少することを確認した（図１５ｂ）。
【0148】
また、ＭＳＨ２およびＭＳＨ６によるＤＮＭＴ１、ＫＬＦ４の発現変化をタンパク質水準で確認するために、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６を過発現または抑制した後、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＤＮＭＴ１およびＫＬＦ４に対するｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを遂行してタンパク質発現水準を評価した。
【0149】
その結果、前記図１５ａ、ｂと同様にＭＳＨ２またはＭＳＨ６をｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎしたとき、ＤＮＭＴ１の発現が増加するようになるとともに、ＫＬＦ４のｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎが増加するようになり、それによってＫＬＦ４のタンパク質発現が増加することを確認した（図１５ｃ）。逆にＭＳＨ２をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、ＭＳＨ２またはＭＳＨ６が減少してＤＮＭＴ１の発現が減少するようになり、ＫＬＦ４ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎが減少してＫＬＦ４のタンパク質発現が増加することを確認した（図１５ｄ）。
【0150】
実施例１２．肝臓癌でＨＤＡＣ２／ＫＬＦ６－ＨＤＡＣ６－ＭＳＨ２／ＭＳＨ６相関関係確認
１２－１．ＨＤＡＣ６水準によるＭＳＨ２またはＭＳＨ６の発現変化
肝臓癌でＭＳＨ２またはＭＳＨ６がＨＤＡＣ６によってｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎされるとともに、発現が減少するかを確認するために、ＴＣＧＡ、ＩＣＧＣ、ＧＳＥ７７３１４ ｄａｔａでＨＤＡＣ６の発現変化によるＭＳＨ６と互いにｄｉｍｅｒ役割をするＭＳＨ２およびＭＳＨ６の発現を確認した。
１２－１．ＨＤＡＣ６水準によるＭＳＨ２またはＭＳＨ６の発現変化
肝臓癌でＭＳＨ２またはＭＳＨ６がＨＤＡＣ６によってｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎされるとともに、発現が減少するかを確認するために、ＴＣＧＡ、ＩＣＧＣ、ＧＳＥ７７３１４ ｄａｔａでＨＤＡＣ６の発現変化によるＭＳＨ６と互いにｄｉｍｅｒ役割をするＭＳＨ２およびＭＳＨ６の発現を確認した。
【0151】
その結果、ＨＤＡＣ６の発現が低下したｓｕｂ－ｇｒｏｕｐ（ＴＧＣＡ ｎ＝３４、ＩＣＧＣ ｎ＝９８、ＧＳＥ７７３１４ ｎ＝３４）でＭＳＨ２およびＭＳＨ６の発現はｔｕｍｏｒですべて上がっていることを確認した（図１６ａ、図１７ａ）。
【0152】
また、ＨＣＣ細胞株（ＳＮＵ１８２、ＳＮＵ３８７、ＳＮＵ４７５）でＨＤＡＣ６を過発現または抑制した後、ＨＤＡＣ６およびＭＳＨ２に対するｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを遂行してタンパク質発現水準を評価した。
【0153】
その結果、ＨＤＡＣ６を過発現する場合、ＭＳＨ２タンパク質およびＭＳＨ６タンパク質発現が減少し、逆にＨＤＡＣ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎする場合、ＭＳＨ２タンパク質発現が増加することを確認した（図１６ｂ、ｃおよび図１７ｂ、ｃ）。
このような結果は、ＨＤＡＣ６－ＭＳＨ２およびＨＤＡＣ６－ＭＳＨ６は負の相関関係を有し、ＨＤＡＣ６水準によってＭＳＨ２およびＭＳＨ６の発現が調節されるということを意味する。
このような結果は、ＨＤＡＣ６－ＭＳＨ２およびＨＤＡＣ６－ＭＳＨ６は負の相関関係を有し、ＨＤＡＣ６水準によってＭＳＨ２およびＭＳＨ６の発現が調節されるということを意味する。
【0154】
１２－２．ＨＤＡＣ２／ＫＬＦ６－ＨＤＡＣ６相関関係確認
ＨＤＡＣ６はｐｒｏｍｏｔｅｒ部分にＧｃｂｏｘを有しているが、Ｇｃｂｏｘはｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒがｂｉｎｄｉｎｇできる部位であり、ＨＤＡＣ２、ＫＬＦ６がｂｉｎｄｉｎｇできると知られている。したがって、ＨＣＣ（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）患者からＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ６およびＫＬＦ６遺伝子の発現水準を確認してＨＤＡＣ２－ＨＤＡＣ６、ＫＬＦ６－ＨＤＡＣ６、ＫＬＦ６－ＨＤＡＣ２ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎを分析した。
ＨＤＡＣ６はｐｒｏｍｏｔｅｒ部分にＧｃｂｏｘを有しているが、Ｇｃｂｏｘはｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒがｂｉｎｄｉｎｇできる部位であり、ＨＤＡＣ２、ＫＬＦ６がｂｉｎｄｉｎｇできると知られている。したがって、ＨＣＣ（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）患者からＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ６およびＫＬＦ６遺伝子の発現水準を確認してＨＤＡＣ２－ＨＤＡＣ６、ＫＬＦ６－ＨＤＡＣ６、ＫＬＦ６－ＨＤＡＣ２ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎを分析した。
【0155】
その結果、ＨＤＡＣ６とＨＤＡＣ２、ＫＬＦ６とＨＤＡＣ２はｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ、ＨＤＡＣ６とＫＬＦ６はｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎを有していることを確認した（図１８ａ）。
【0156】
ＨＤＡＣ２－ＨＤＡＣ６およびＫＬＦ６－ＨＤＡＣ６相関関係をさらに検証するために、ＨＤＡＣ２の発現が少なくＨＤＡＣ６、ＫＬＦ６の発現が高い正常肝細胞株（ＭＩＨＡ）と、ＨＤＡＣ２の発現が高くＨＤＡＣ６、ＫＬＦ６の発現が低い肝臓癌細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ）でＨＤＡＣ２またはＫＬＦ６発現を調節してタンパク質およびｍＲＮＡ発現水準変化を確認した。
【0157】
その結果、ＨＤＡＣ２が過発現する場合、ＨＤＡＣ６の発現が減少し、ＨＤＡＣ２がｋｎｏｃｋｄｏｗｎされる場合、ＨＤＡＣ６の発現が増加することが示された（図１８ｂ、ｄ）。また、ＫＬＦ６が過発現する場合、ＨＤＡＣ２の発現が減少し、ＨＤＡＣ６の発現が増加し、ＫＬＦ６がｋｎｃｋｄｏｗｎされる場合、ＨＤＡＣ２の発現が増加し、ＨＤＡＣ６の発現が減少することが示された（図１８ｃ、ｅ）。
【0158】
１２－３．ＫＬＦ６またはＨＤＡＣ２抑制剤のＨＤＡＣ６抑制活性確認
ＫＬＦ６またはＨＤＡＣ２によってＨＤＡＣ６の転写が調節されるかを確認するために、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙを進行した。図１８ｆは、ＨＤＡＣ６のｐｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙのためのベクター構造を簡単に示したものである。
ＫＬＦ６またはＨＤＡＣ２によってＨＤＡＣ６の転写が調節されるかを確認するために、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙを進行した。図１８ｆは、ＨＤＡＣ６のｐｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙのためのベクター構造を簡単に示したものである。
【0159】
その結果、正常細胞であるＭＩＨＡ細胞株でＫＬＦ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎするか、ＨＤＡＣ２を過発現させたとき、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒのルシフェラーゼ活性が減ることを確認し、肝臓癌細胞であるＨｅｐ３Ｂ細胞株でＫＬＦ６を過発現させるか、ＨＤＡＣ２をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたとき、Ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｖｅｃｔｏｒのｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙが増加することを確認した（図１８ｇ）。
【0160】
１２－４．ＨＤＡＣ２およびＫＬＦ６の競争的結合確認
ＨＤＡＣ２とＫＬＦ６がＨＤＡＣ６のｐｒｏｍｏｔｅｒに競争的にｂｉｎｄｉｎｇするかを確認するために、ＨＤＡＣ２の発現が低くＨＤＡＣ６、ＫＬＦ６の発現が高い正常肝細胞株ＭＩＨＡでＨＤＡＣ２をｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎし、ＫＬＦ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎした後、ＨＤＡＣ２とＫＬＦ６をそれぞれＩｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎを進行して、ＨＤＡＣ２とＫＬＦ６にｂｉｎｄｉｎｇされているＨＤＡＣ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒの量を相対的に計算した。
ＨＤＡＣ２とＫＬＦ６がＨＤＡＣ６のｐｒｏｍｏｔｅｒに競争的にｂｉｎｄｉｎｇするかを確認するために、ＨＤＡＣ２の発現が低くＨＤＡＣ６、ＫＬＦ６の発現が高い正常肝細胞株ＭＩＨＡでＨＤＡＣ２をｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎし、ＫＬＦ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎした後、ＨＤＡＣ２とＫＬＦ６をそれぞれＩｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎを進行して、ＨＤＡＣ２とＫＬＦ６にｂｉｎｄｉｎｇされているＨＤＡＣ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒの量を相対的に計算した。
【0161】
その結果、ＨＤＡＣ６のｐｒｏｍｏｔｅｒに存在する３個のＧｃｂｏｘ ｒｅｇｉｏｎをそれぞれ見たとき、共通してＨＤＡＣ２を過発現するか、ＫＬＦ６をｋｎｏｃｋｄｏｗｎしたときには、ＨＤＡＣ２にｂｉｎｄｉｎｇするＨＤＡＣ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒの量は増加し、ＫＬＦ６にｂｉｎｄｉｎｇするＨＤＡＣ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒの量は減少することを確認した（図１９ａ）。
【0162】
次いで、ＨＤＡＣ２の発現が高くＨＤＡＣ６、ＫＬＦ６の発現が低い肝臓癌細胞株Ｈｅｐ３ＢでＫＬＦ６をｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎし、ＨＤＡＣ２をｋｎｏｃｋｄｏｗｎした後、ＨＤＡＣ２とＫＬＦ６をそれぞれＩｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎを進行して、ＨＤＡＣ２とＫＬＦ６にｂｉｎｄｉｎｇされているＨＤＡＣ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒの量を相対的に計算した。
【0163】
その結果、前記図１９ａの結果とは逆にＨＤＡＣ２をｋｎｏｃｋｄｏｗｎするか、ＫＬＦ６を過発現したときには、ＨＤＡＣ２にｂｉｎｄｉｎｇするＨＤＡＣ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒの量は減少し、ＫＬＦ６にｂｉｎｄｉｎｇするＨＤＡＣ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒの量は増加することを確認した（図１９ｂ）。
【0164】
このような結果は、ＫＬＦ６およびＨＤＡＣ２がそれぞれ発現を調節したとき、ｂｉｎｄｉｎｇするＨＤＡＣ６ ｐｒｏｍｏｔｅｒの量が変わることから見て、ＫＬＦ６とＨＤＡＣ２がＨＤＡＣ６のｐｒｏｍｏｔｅｒに競争的に結合するということを意味する。
【0165】
また、以前のＰｒｏｍｏｔｅｒ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ結果を通じてＫＬＦ６とＨＤＡＣ２がＨＤＡＣ６の発現調節を確認したため、ＫＬＦ６およびＨＤＡＣ２が競争的にＨＤＡＣ６のｐｒｏｍｏｔｅｒにｂｉｎｄｉｎｇして、ＨＤＡＣ６の発現を調節するということを意味する。
【0166】
実施例１３．ＨＤＡＣ６－ＭＳＨ２－ＤＮＭＴ１－ＫＬＦ４シグナル伝達活性化の癌－予防効果確認
１３－１．ＨＤＡＣ６－ＭＳＨ２－ＤＮＭＴ１－ＫＬＦ４シグナル伝達活性化の癌－予防効果のｉｎ ｖｉｖｏ確認
１３－１．ＨＤＡＣ６－ＭＳＨ２－ＤＮＭＴ１－ＫＬＦ４シグナル伝達活性化の癌－予防効果のｉｎ ｖｉｖｏ確認
【0167】
前記の内容をｉｎ ｖｉｖｏで確認するために、Ｈ－ｒａｓ形質転換マウス（Ｒａｓ－Ｔｇマウス）（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）に１４週齢であるときから毎週ｐｃＤＮＡ３．１＿ＨＤＡＣ６ ５０ ｕｇ（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ ｉｎ ｖｉｖｏ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で静脈注射）、ｓｉ－ＭＳＨ２（配列番号１）、ｓｉ－ＭＳＨ６（配列番号２）またはｓｉ－ＤＮＭＴ１を０．２５ｍｇ／ｋｇ（Ｉｎｖｉｖｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３．０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で静脈注射）に肝特異的に伝達した。その後、１６週、１８週、２０週および２２週齢にｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｍａｃｈｉｎｅ（Ｐｈｉｌｉｐｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｅｄｅｒｌａｎｄ）で超音波映像を撮り、２３週齢目に肝を修得してＨＣＣを確認した。陰性対照群（Ｎ．Ｃ）マウス肝のＨＣＣは１６週齢から超音波で感知され、５匹のうち５匹すべて大型および多重ＨＣＣで発達された。しかし、ＨＤＡＣ６を過発現したマウスでは２０週齢にＨＣＣが検出され（１匹）、ＭＳＨ２抑制群（ｓｉ－ＭＳＨ２）およびＤＮＭＴ１抑制群（ｓｉ－ＤＮＭＴ１）は５匹のうち２匹～３匹で小さいＨＣＣが発達された（図２０ａ）。
【0168】
また、ウェスタンブロット分析結果、ｓｉ－ＭＳＨ２群の隣接正常肝でＤＮＭＴ ｆａｍｉｌｙ発現が減少し、ＫＬＦ４発現が増加したことを確認した（図２０ｂ）。
【0169】
これをＭｏｕｓｅ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルでも同一に確認した（図２１ａ）。Ｘｅｎｏｇｒａｆｔモデルは、免疫が抑制されたＮｕｄｅ ｍｏｕｓｅにｍｏｕｓｅ ＨＣＣ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ（Ｈｅｐａ１－６）を１×１０６個ずつ２０％ ｍａｔｒｉｇｅｌとともにわき腹に皮下注射した。Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ後、２日間隔で確認してそのサイズを確認し（図２１ｂ）、２週後にその重さを量って確認した（図２１ｃ）。
その結果、ｓｉ－ＭＳＨ２群は、対照群（Ｎ．Ｃ）と比較してｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈが顕著に減ることを確認した。
その結果、ｓｉ－ＭＳＨ２群は、対照群（Ｎ．Ｃ）と比較してｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈが顕著に減ることを確認した。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図2a】
【図2b】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図5e】
【図5f】
【図5g】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10a】
【図10b】
【図10c】
【図10d】
【図10e】
【図10f】
【図10g】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18a】
【図18b】
【図18c】
【図18d】
【図18e】
【図18f】
【図18g】
【図19a】
【図19b】
【図20】
【図21】
【配列表】
【国際調査報告】