特表 2024-534772 同種異系細胞療法用の遺伝子改変細胞

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-26

(54)【発明の名称】同種異系細胞療法用の遺伝子改変細胞

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240918BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240918BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20240918BHJP

   A61K 35/39 20150101ALI20240918BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240918BHJP

   A61K 35/15 20150101ALI20240918BHJP

   A61K 35/36 20150101ALI20240918BHJP

   A61K 35/407 20150101ALI20240918BHJP

   A61K 35/55 20150101ALI20240918BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20240918BHJP

   A61K 35/34 20150101ALI20240918BHJP

   A61K 35/44 20150101ALI20240918BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20240918BHJP

   A61K 35/16 20150101ALI20240918BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 3/10 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 5/14 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 7/06 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 25/18 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 25/24 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240918BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240918BHJP

   C12N 15/867 20060101ALN20240918BHJP

   C12N 15/90 20060101ALN20240918BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

A61K35/12

A61K35/545

A61K35/39

A61K35/17

A61K35/15

A61K35/36

A61K35/407

A61K35/55

A61K35/30

A61K35/34

A61K35/44

A61K35/28

A61K35/16

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P17/06

A61P1/00

A61P1/04

A61P3/10

A61P5/14

A61P29/00

A61P37/06

A61P7/06

A61P35/02

A61P37/08

A61P9/00

A61P11/00

A61P13/12

A61P1/16

A61P21/04

A61P25/16

A61P25/14

A61P25/28

A61P25/18

A61P25/24

A61P25/00

A61P27/02

C12N15/09 110

C12N15/12 ZNA

C12N15/867 Z

C12N15/90 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024508658

(86)(22)【出願日】2022-08-11

(85)【翻訳文提出日】2024-04-11

(86)【国際出願番号】 US2022074873

(87)【国際公開番号】W WO2023019226

(87)【国際公開日】2023-02-16

(31)【優先権主張番号】63/232,163

(32)【優先日】2021-08-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/353,548

(32)【優先日】2022-06-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．パイレックス

(71)【出願人】

【識別番号】522043688

【氏名又は名称】サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】シュレプファー ソニア

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA23

4B065CA24

4B065CA44

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB34

4C087BB45

4C087BB47

4C087BB48

4C087BB51

4C087BB52

4C087BB56

4C087BB62

4C087BB63

4C087BB65

4C087CA04

4C087NA14

4C087ZA02

4C087ZA12

4C087ZA18

4C087ZA22

4C087ZA51

4C087ZA55

4C087ZA59

4C087ZA66

4C087ZA68

4C087ZA81

4C087ZA89

4C087ZA94

4C087ZA96

4C087ZB08

4C087ZB11

4C087ZB15

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC35

(57)【要約】

提供するのは、同種異系細胞療法で使用するために、遺伝子改変のような１つ以上の改変を含む操作細胞である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、低免疫原性細胞である。
【選択図】図４Ｂ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）及び／またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）の発現を低下させる改変、
（ｂ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる改変、ならびに
（ｃ）１つ以上の主要組織適合性複合体クラスＩ分子（ＭＨＣクラスＩ分子）及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる改変
を含む操作細胞であって、
発現の変化が、前記改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べたものである、
前記操作細胞。

【請求項2】

前記改変が、
（ｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、
（ｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または
（ｉｉｉ）前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子
の発現の低下を含む、請求項１に記載の操作細胞。

【請求項3】

前記改変が、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－ＢまたはＮＦＹ－Ｃのうち１つ以上の発現の低下を含む、請求項１または２に記載の操作細胞。

【請求項4】

前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない、請求項１～３のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項5】

Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－ＢまたはＮＦＹ－Ｃのうち１つ以上を発現しない、請求項１～４のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項6】

前記改変が、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を低下させることによって、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる、請求項１～５のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項7】

前記改変が、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を低下させることによって、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる、請求項１～６のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項8】

前記改変が、Ｂ２Ｍ遺伝子の活性を低下させることによって、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低下させる、請求項７に記載の操作細胞。

【請求項9】

前記改変が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊によって、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる、請求項７または８に記載の操作細胞。

【請求項10】

前記改変が、すべてのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊によって、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる、請求項７～９のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項11】

前記不活性化または破壊が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子におけるインデル、または前記Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域の欠失を含む、請求項９または１０に記載の操作細胞。

【請求項12】

前記インデルが、フレームシフト変異である、請求項１１に記載の操作細胞。

【請求項13】

前記Ｂ２Ｍ遺伝子が、ノックアウトされている、請求項１～１２のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項14】

前記改変が、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、プライム編集、または部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）によるものである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記改変が、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集によって、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低下させる、請求項１～１４のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項16】

前記ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、プライム編集、部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）、またはヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集が、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される１つ以上のタンパク質によって行われている、請求項１４または１５に記載の操作細胞。

【請求項17】

前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものである、請求項１５に記載の操作細胞。

【請求項18】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせのＣａｓが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される、請求項１７に記載の操作細胞。

【請求項19】

前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせが、前記Ｂ２Ｍ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項１８に記載の操作細胞。

【請求項20】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせが、前記ｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項１９に記載の操作細胞。

【請求項21】

前記改変が、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面発現を低下させることによって、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる、請求項１～２０のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項22】

前記改変が、ＣＩＩＴＡの発現を低下させることによって、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる、請求項１～２１のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項23】

前記改変が、ＣＩＩＴＡ遺伝子の活性を低下させることによって、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低下させる、請求項２２に記載の操作細胞。

【請求項24】

前記改変が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊によって、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる、請求項２２または２３に記載の操作細胞。

【請求項25】

前記改変が、すべてのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊によって、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項26】

前記不活性化または破壊が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子におけるインデル、または前記ＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域の欠失を含む、請求項２４または２５に記載の操作細胞。

【請求項27】

前記インデルが、フレームシフト変異である、請求項２６に記載の操作細胞。

【請求項28】

前記ＣＩＩＴＡ遺伝子が、ノックアウトされている、請求項２１～２７のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項29】

前記改変が、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集によって、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低下させる、請求項２１～２８のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項30】

前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものである、請求項２９に記載の操作細胞。

【請求項31】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせのＣａｓが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される、請求項３０に記載の操作細胞。

【請求項32】

前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせが、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項２９に記載の操作細胞。

【請求項33】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせが、前記ｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項３２に記載の操作細胞。

【請求項34】

前記改変が、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、プライム編集、または部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）によるものである、請求項２８に記載の操作細胞。

【請求項35】

前記ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、プライム編集、部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）、またはヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集が、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される１つ以上のタンパク質によって行われている、請求項３４に記載の操作細胞。

【請求項36】

（ａ）ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）及び／またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）の発現を低下させ、かつ
（ｂ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる、
１つ以上の改変を含む操作細胞であって、
発現の変化が、前記１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べたものである、
前記操作細胞。

【請求項37】

（ａ）ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）及び／またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）の発現を低下させ、かつ
（ｂ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる（ここで前記１つ以上の寛容原性因子は、ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の発現を増加させる）、
１つ以上の改変を含む操作細胞であって、
発現の変化が、前記１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べたものである、
前記操作細胞。

【請求項38】

前記１つ以上の改変が、
１つ以上の主要組織適合性複合体クラスＩ分子（ＭＨＣクラスＩ分子）及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させ、
ＣＤ４７、ならびに任意にＣＤ２４及び／またはＰＤ－Ｌ１の発現を増加させ、かつ／または
ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１の発現を増加させる、
請求項３６または３７に記載の操作細胞。

【請求項39】

前記細胞が、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢ、ならびにＴＸＮＩＰのいずれかのノックアウト、ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡＥのノックインを含む、請求項３８に記載の操作細胞。

【請求項40】

Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３及びＭＡＮＦのノックインを含む、請求項３９に記載の操作細胞。

【請求項41】

前記操作細胞が、前記ＭＩＣＡの発現を低下させるための１つ以上の改変を含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項42】

前記操作細胞上での前記ＭＩＣＡの表面発現の低下を含み、任意に、検出可能な表面発現が見られない、請求項１～４１のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項43】

前記ＭＩＣＡの発現を低下させる改変が、前記ＭＩＣＡのタンパク質発現を低下させる、請求項１～４２のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項44】

前記操作細胞上で、前記ＭＩＣＡの検出可能な細胞表面発現が見られない、請求項４２または４３に記載の操作細胞。

【請求項45】

前記ＭＩＣＡの発現を低下させる改変が、前記ＭＩＣＡをコードするｍＲＮＡの発現を低下させる、請求項１～４４いずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項46】

ＭＩＣＡ遺伝子の活性を消失させる１つ以上の改変を含む、請求項１～４５のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項47】

前記改変が、前記ＭＩＣＡ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む、請求項４６に記載の操作細胞。

【請求項48】

前記改変が、すべてのＭＩＣＡコード配列の不活性化または破壊を含む、請求項４６または４７に記載の操作細胞。

【請求項49】

前記不活性化または破壊が、前記ＭＩＣＡ遺伝子におけるインデルを含む、請求項４７または４８に記載の操作細胞。

【請求項50】

前記改変が、前記ＭＩＣＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域のフレームシフト変異または欠失を含む、請求項４７～４９のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項51】

前記改変が、ノックアウトを含む、請求項４７～５０のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項52】

前記改変が、前記ＭＩＣＡ遺伝子を標的とするヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集による改変である、請求項４７～５１のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項53】

前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集による改変が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の媒介による改変、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の媒介による改変、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介によるものである、請求項４８に記載の操作細胞。

【請求項54】

前記Ｃａｓが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される、請求項４９に記載の操作細胞。

【請求項55】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介による改変が、前記ＭＩＣＡ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の使用を含む、請求項４９または５０に記載の操作細胞。

【請求項56】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介による改変が、前記ｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の使用を含む、請求項５１に記載の操作細胞。

【請求項57】

前記改変が、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、プライム編集、または部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）によるものである、請求項５１に記載の操作細胞。

【請求項58】

前記ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、プライム編集、部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）、またはヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集が、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択される１つ以上のタンパク質によって行われている、請求項５７に記載の操作細胞。

【請求項59】

前記ＭＩＣＢの発現を低下させるための改変を含む、請求項１～５８のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項60】

前記操作細胞上での前記ＭＩＣＢの表面発現の低下を含み、任意に、検出可能な表面発現が見られない、請求項１～５９のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項61】

前記ＭＩＣＢの発現を低下させる改変が、前記ＭＩＣＢのタンパク質発現を低下させる、請求項１～６０いずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項62】

前記操作細胞上で、前記ＭＩＣＢの検出可能な細胞表面発現が見られない、請求項６０または６１に記載の操作細胞。

【請求項63】

前記ＭＩＣＢの発現を低下させる改変が、前記ＭＩＣＢをコードするｍＲＮＡの発現を低下させる、請求項１～６２のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項64】

ＭＩＣＢ遺伝子の活性を消失させる改変を含む、請求項１～６３のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項65】

前記改変が、前記ＭＩＣＢ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む、請求項６４に記載の操作細胞。

【請求項66】

前記改変が、すべてのＭＩＣＢコード配列の不活性化または破壊を含む、請求項６４または６５に記載の操作細胞。

【請求項67】

前記不活性化または破壊が、前記ＭＩＣＢ遺伝子におけるインデルを含む、請求項６５または６６に記載の操作細胞。

【請求項68】

前記改変が、前記ＭＩＣＢ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域のフレームシフト変異または欠失である、請求項６５～６７のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項69】

前記改変が、ノックアウトである、請求項６５～６８のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項70】

前記改変が、前記ＭＩＣＢ遺伝子を標的とするヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集による改変である、請求項６５～６９のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項71】

前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集による改変が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の媒介による改変、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の媒介による改変、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介によるものである、請求項７０に記載の操作細胞。

【請求項72】

前記Ｃａｓが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択される、請求項７１に記載の操作細胞。

【請求項73】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介による改変が、前記ＭＩＣＢ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の使用を含む、請求項７１または７２に記載の操作細胞。

【請求項74】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介による改変が、前記ｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の使用を含む、請求項７３に記載の操作細胞。

【請求項75】

前記改変が、ＮＬＲＣ５、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＣＤ１４２、ＡＢＯ、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＮＬＧＮ４Ｙ及びＲＨＤのいずれか１つ以上の発現を低下させる、請求項１～７４のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項76】

前記１つ以上の寛容原性因子のそれぞれが、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１インヒビター、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択される、請求項１～７５のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項77】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅを含む、請求項１～７６のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項78】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ２４を含む、請求項１～７７のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項79】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＰＤ－Ｌ１を含む、請求項１～７８のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項80】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４６を含む、請求項１～７９のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項81】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ５５を含む、請求項１～８０のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項82】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ５９を含む、請求項１～８１のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項83】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＲ１を含む、請求項１～８２のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項84】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＭＡＮＦを含む、請求項１～８３のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項85】

前記１つ以上の寛容原性因子が、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３を含む、請求項１～８４のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項86】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ及びＣＤ４７を含む、請求項１～７６のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項87】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ２４、ＣＤ４７またはＰＤ－Ｌ１の１つ以上（すべてを含む）を含む、請求項１～７６のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項88】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７またはＰＤ－Ｌ１の１つ以上（すべてを含む）を含む、請求項１～７６及び８７のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項89】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９またはＣＲ１の１つ以上（すべてを含む）を含む、請求項１～７６のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項90】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９またはＣＲ１の１つ以上（すべてを含む）を含む、請求項１～７６及び８９のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項91】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９またはＣＲ１の１つ以上（すべてを含む）を含む、請求項１～７６、８９及び９０のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項92】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－ＥまたはＰＤ－Ｌ１の１つ以上（すべてを含む）を含む、請求項１～７６のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項93】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤ－Ｌ１またはＡ２０／ＴＮＦＡＩＰの１つ以上（すべてを含む）、及び任意にＭＡＮＦを含む、請求項１～７６及び９２のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項94】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤ－Ｌ１またはＭＡＮＦの１つ以上（すべてを含む）、及び任意にＡ２０／ＴＮＦＡＩＰを含む、請求項１～７６、９２及び９３のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項95】

前記１つ以上の寛容原性因子のそれぞれが、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８からなる群から選択される、請求項１～７６のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項96】

（ｉ）
（ａ）１つ以上のＭＨＣ Ｉ分子及び／または１つ以上のＭＨＣ ＩＩ分子の発現を低下させ、かつ
（ｂ）ＣＤ４７の発現を増加させること、
（ｉｉ）
（ａ）１つ以上のＭＨＣ Ｉ分子及び／または１つ以上のＭＨＣ ＩＩ分子の発現を低下させ、
（ｂ）ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの発現を低下させ、
（ｃ）ＣＤ４７、ならびに任意にＣＤ２４及びＰＤ－Ｌ１の発現を増加させ、かつ
（ｄ）ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１の発現を増加させること、
（ｉｉｉ）
（ａ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させ、
（ｂ）ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの発現を低下させ、
（ｃ）ＴＸＮＩＰの発現を低下させ、
（ｄ）ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅの発現を増加させ、かつ
（ｅ）任意に、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３及びＭＡＮＦの発現を増加させること、
（ｉｖ）
（ａ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の発現を増加させ、かつ
（ｂ）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下させること、
（ｖ）
（ａ）標的の発現を増加または減少させる追加の編集をさらに含む上記（ｉ）～（ｉｖ）のいずれか
に従う改変を含む、請求項１～７６に記載の操作細胞。

【請求項97】

前記１つ以上の寛容原性因子の少なくとも１つが、ＣＤ４７である、請求項７５に記載の操作細胞。

【請求項98】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７である、請求項１～７５のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項99】

配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも一部との同一性が少なくとも約８５％であるアミノ酸配列をＣＤ４７が有する、請求項９７または９８に記載の操作細胞。

【請求項100】

前記１つ以上の寛容原性因子の発現の増加が、前記１つ以上の寛容原性因子の細胞表面発現の増加を含む、請求項１～９９のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項101】

前記１つ以上の寛容原性因子の１つが、外因性ポリペプチドである、請求項１００に記載の操作細胞。

【請求項102】

前記改変が、前記１つ以上の寛容原性因子をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１００または１０１に記載の操作細胞。

【請求項103】

前記１つ以上の寛容原性因子のそれぞれが、プロモーターに機能可能に連結されている、請求項１０２に記載の操作細胞。

【請求項104】

前記プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項１０３に記載の操作細胞。

【請求項105】

前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択される、請求項１０３または１０４に記載の操作細胞。

【請求項106】

前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが、１つ以上のゲノム遺伝子座に組み込まれている、請求項１０３～１０５のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項107】

前記組み込みが、非標的挿入である、請求項１０６に記載の操作細胞。

【請求項108】

前記非標的挿入が、レンチウイルスベクターを用いて前記外因性ポリヌクレオチドを前記細胞に導入することによるものである、請求項１０７に記載の操作細胞。

【請求項109】

前記組み込みが、標的挿入である、請求項１０６に記載の操作細胞。

【請求項110】

前記１つ以上のゲノム遺伝子座のそれぞれが、ＭＩＣＡ遺伝子座、ＭＩＣＢ遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座位、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、ＬＲＰ１遺伝子座、ＨＭＧＢ１遺伝子座、ＡＢＯ遺伝子座、ＲＨＤ遺伝子座、ＦＵＴ１遺伝子座及びＫＤＭ５Ｄ遺伝子座からなる群から選択される、請求項１０６～１０９のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項111】

前記１つ以上のゲノム遺伝子座のそれぞれが、Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、ＭＩＣ－Ａ座位、ＭＩＣ－Ｂ座位及びセーフハーバー座位からなる群から選択される、請求項１０６～１１０のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項112】

前記セーフハーバー座位が、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６及びＳＨＳ２３１の座位からなる群から選択される、請求項１０６に記載の操作細胞。

【請求項113】

前記１つ以上の寛容原性因子の発現の増加が、プロモーターを介して、内在性遺伝子の遺伝子活性を向上させる改変を含む、請求項１～１０７のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項114】

前記遺伝子活性を向上させる改変が、内在性プロモーターの改変、または異種プロモーターの導入を介したものである、請求項１１３に記載の操作細胞。

【請求項115】

ヒト細胞、または動物細胞、任意に、ブタ細胞、ウシ細胞もしくはヒツジ細胞であるか、または前記細胞に由来する、請求項１～１１４のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項116】

ヒト細胞であるか、またはヒト細胞に由来する、請求項１１５に記載の操作細胞。

【請求項117】

多能性幹細胞もしくはその子孫に由来する分化細胞であるか、または前記分化細胞に由来する、請求項１～１１６のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項118】

前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞であるか、または人工多能性幹細胞に由来する、請求項１１７に記載の操作細胞。

【請求項119】

ドナー対象から単離した初代細胞であるか、または前記初代細胞に由来する、請求項１～１１８のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項120】

前記ドナー対象が、前記初代細胞を前記ドナー対象から得る時点に、健常であるか、または疾患もしくは病態を有する疑いがない、請求項１１９に記載の操作細胞。

【請求項121】

膵島β細胞、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ細胞、網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、内皮細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、筋肉細胞、心臓細胞、血液細胞、膵臓の膵島細胞、平滑筋細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心筋細胞、視細胞、幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉幹細胞、胚性幹細胞及び多能性幹細胞（ＰＳＣ）から選択される、請求項１～１２０のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項122】

内皮細胞であるか、または内皮細胞に由来する、請求項１～１２１のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項123】

上皮細胞であるか、または上皮細胞に由来する、請求項１～１２１のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項124】

多能性幹細胞であるか、または多能性幹細胞に由来する、請求項１～１２１のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項125】

胚性幹細胞であるか、または胚性幹細胞に由来する、請求項１～１２１のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項126】

間葉系列の細胞であるか、または前記細胞に由来する、請求項１～１２１のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項127】

ＡＢＯ血液型Ｏ型、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）の１つ以上であり、機能型のＡＢＯ Ａアレル及び／または機能型のＡＢＯ Ｂアレル、あるいはＲｈ因子陽性（Ｒｈ＋）を含む、請求項１～１２６のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項128】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項１～１２７のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項129】

請求項１～１２８のいずれか１項に記載の操作細胞を含む、細胞集団。

【請求項130】

前記集団中の細胞の少なくとも約３０％が、請求項９１のいずれか１項に記載の操作細胞を含む、請求項１２９に記載の細胞集団。

【請求項131】

前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて前記改変を含む、請求項１２９または１３０に記載の細胞集団。

【請求項132】

前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかで、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が低下している、請求項１２９～１３１のいずれか１項に記載の細胞集団。

【請求項133】

前記操作細胞上での前記ＭＩＣＡポリペプチドの表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られない、請求項１２９～１３２のいずれか１項に記載の細胞集団。

【請求項134】

前記集団中の細胞の少なくとも約５０％で、前記ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が見られない、請求項１２９～１３３のいずれか１項に記載の細胞集団。

【請求項135】

前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかで、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が低下している、請求項１２９～１３４のいずれか１項に記載の細胞集団。

【請求項136】

前記操作細胞上での前記ＭＩＣＢポリペプチドの表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られない、請求項１２９～１３５のいずれか１項に記載の細胞集団。

【請求項137】

前記集団中の細胞の少なくとも約５０％で、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が見られない、請求項１２９～１３６のいずれか１項に記載の細胞集団。

【請求項138】

前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記１つ以上の寛容原性因子をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１２９～１３７のいずれか１項に記載の細胞集団。

【請求項139】

前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１２９～１３８のいずれか１項に記載の細胞集団。

【請求項140】

前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含む、請求項１２９～１３９のいずれか１項に記載の細胞集団。

【請求項141】

前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、Ｂ２Ｍ及び／またはＣＩＩＴＡの発現の低下を含む、請求項１２９～１４０のいずれか１項に記載の細胞集団。

【請求項142】

前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低下を含む、請求項１２９～１４１のいずれか１項に記載の細胞集団。

【請求項143】

前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルの両方を不活性化する１つ以上の変化を含む、請求項１２９～１４２のいずれか１項に記載の細胞集団。

【請求項144】

前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルの両方を不活性化する１つ以上の変化を含む、請求項１２９～１４３のいずれか１項に記載の細胞集団。

【請求項145】

請求項１２９～１４４のいずれか１項に記載の細胞集団を含む、組成物。

【請求項146】

請求項１２９～１４５のいずれか１項に記載の操作細胞集団を含む、組成物であって、
（ａ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかで、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、前記操作細胞上での前記ＭＩＣＡポリペプチドの表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られず、
（ｂ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、
（ｃ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含み、前記操作細胞上での前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られない、
前記組成物。

【請求項147】

請求項１２９～１４５のいずれか１項に記載の操作細胞集団を含む、組成物であって、
（ａ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかで、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、前記操作細胞上での前記ＭＩＣＢポリペプチドの表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られず、
（ｂ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、
（ｃ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含み、前記操作細胞上での前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られない、
前記組成物。

【請求項148】

請求項１２９～１４５のいずれか１項に記載の操作細胞集団を含む、組成物であって、
（ａ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかで、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、前記操作細胞上での前記ＭＩＣＡポリペプチドの表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られず、
（ｂ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかで、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、前記操作細胞上での前記ＭＩＣＢポリペプチドの表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られず、
（ｃ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、
（ｄ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含み、前記操作細胞上での前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られない、
前記組成物。

【請求項149】

操作した初代膵島β細胞の集団を含む組成物であって、
前記操作した初代膵島β細胞が、
（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊
を含む、前記組成物。

【請求項150】

操作した初代Ｔ細胞の集団を含む組成物であって、
前記操作した初代Ｔ細胞が、
（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、ならびに（ｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊
を含む、前記組成物。

【請求項151】

操作した初代甲状腺細胞の集団を含む組成物であって、
前記操作した初代甲状腺細胞が、
（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子（ＣＤ４７ｔｇ）、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊
を含む、前記組成物。

【請求項152】

操作した初代皮膚細胞の集団を含む組成物であって、
前記操作した初代皮膚細胞が、
（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子（ＣＤ４７ｔｇ）、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊
を含む、前記組成物。

【請求項153】

操作した初代内皮細胞の集団を含む組成物であって、
前記操作した初代内皮細胞が、
（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子（ＣＤ４７ｔｇ）、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊
を含む、前記組成物。

【請求項154】

操作した初代網膜色素上皮細胞の集団を含む組成物であって、
前記操作した初代網膜色素上皮細胞が、
（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子（ＣＤ４７ｔｇ）、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊
を含む、前記組成物。

【請求項155】

前記操作細胞集団の操作細胞が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべてにおけるインデルを含む、請求項１４９～１５４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項156】

前記操作細胞集団の操作細胞が、ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊をさらに含む、請求項１４９～１５５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項157】

前記操作細胞集団の操作細胞が、前記ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルのすべてにおけるインデルを含む、請求項１４９～１５６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項158】

前記操作細胞集団の操作細胞が、ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇという表現型を有する、請求項１４９～１５７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項159】

前記操作細胞集団の操作細胞が、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇという表現型を有する、請求項１４９～１５７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項160】

前記操作細胞集団の操作細胞が、ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇという表現型を有する、請求項１４９～１５７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項161】

前記操作細胞が、ヌクレアーゼベースの遺伝子編集を用いて操作されている、請求項１４５～１６０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項162】

医薬組成物である、請求項１４５～１６１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項163】

薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む、請求項１４５～１６２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項164】

凍結保護剤を含む、請求項１４５～１６３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項165】

前記凍結保護剤が、約５％～約１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）という濃度でＤＭＳＯを含む、請求項１６４に記載の組成物。

【請求項166】

請求項１４５～１６５のいずれか１項に記載の組成物を含む、容器。

【請求項167】

滅菌バッグである、請求項１６６に記載の容器。

【請求項168】

前記滅菌バッグが、凍結保存に適合している、請求項１６７に記載の容器。

【請求項169】

操作細胞を作製する方法であって、
（ａ）供給源細胞で、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または消失させること、
（ｂ）前記供給源細胞で、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させること、ならびに
（ｃ）前記供給源細胞で、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下または消失させること
を含む、前記方法。

【請求項170】

対象で使用するための操作細胞を作製する方法であって、前記対象が、自己免疫疾患を有すると疑われるか、または前記疾患を有し、前記方法が、
（ａ）供給源細胞で、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または消失させること、
（ｂ）前記供給源細胞で、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させること、ならびに
（ｃ）前記供給源細胞で、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下または消失させること
を含む、前記方法。

【請求項171】

対象で使用するための操作細胞を作製する方法であって、前記対象が、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体を有すると判断され、前記方法が、
（ａ）供給源細胞で、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または消失させること、
（ｂ）前記供給源細胞で、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させること、ならびに
（ｃ）前記供給源細胞で、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下または消失させること
を含む、前記方法。

【請求項172】

対象が抗ＭＩＣＡ抗体を有する場合に、ＭＩＣＡの発現を低下または消失させること、
任意にさらに、ＭＩＣＢの発現を低下または消失させること
を含む、請求項１６９～１７１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項173】

対象が抗ＭＩＣＢ抗体を有する場合に、ＭＩＣＢを低下または消失させること、
任意にさらに、ＭＩＣＡの発現を低下または消失させること
を含む、請求項１６９～１７１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項174】

対象が抗ＭＩＣＡ抗体及び抗ＭＩＣＢ抗体を有する場合に、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現を低下または消失させることを含む、請求項１６９～１７１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項175】

対象で使用するための操作細胞を作製する方法であって、
（ａ）供給源細胞で、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または消失させること、
（ｂ）前記供給源細胞で、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させること、ならびに
（ｃ）個体が、あるポリペプチドを特異的に認識する抗体を有すると判断されたら、前記供給源細胞で、前記ポリペプチドの表面発現を低下または消失させること
含む、前記方法。

【請求項176】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯｌ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１６９～１７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項177】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８、ならびにこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１６９～１７６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項178】

前記１つ以上の寛容原性因子の少なくとも１つが、ＣＤ４７である、請求項１６９～１７７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項179】

前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または消失させることを含む、請求項１６９～１７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項180】

操作細胞を作製する方法であって、
（ａ）供給源細胞で、ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の発現を増加させること、ならびに
（ｂ）前記供給源細胞で、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下させること
を含む、前記方法。

【請求項181】

操作細胞を作製する方法であって、
（ｉ）
（ａ）１つ以上のＭＨＣ Ｉ分子及び／または１つ以上のＭＨＣ ＩＩ分子の発現を低下させること、
（ｂ）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下させること、
（ｃ）ＣＤ４７、任意にＣＤ２４及びＰＤ－Ｌ１の発現を増加させること、ならびに
（ｄ）ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１の発現を増加させること、
（ｉｉ）
（ａ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させること、
（ｂ）ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの発現を低下させること、
（ｃ）ＴＸＮＩＰの発現を低下させること、
（ｄ）ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅの発現を増加させること、ならびに
（ｅ）任意に、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３及びＭＡＮＦの発現を増加させること、
（ｉｉｉ）
（ａ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の発現を増加させること、ならびに
（ｂ）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下させること、
（ｉｖ）
（ａ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させること、ならびに
（ｂ）ＣＤ４７の発現を増加させること、
（ｖ）
ある遺伝子の発現を増加または減少させる追加の編集をさらに含む（ｉ）～（ｉｖ）のいずれか、
という組み合わせのうちのいずれかの１つを含む、前記方法。

【請求項182】

操作細胞を作製する方法であって、
（ａ）１つ以上のＭＨＣ Ｉ分子をノックアウトすること、
（ｂ）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢをノックアウトすること、
（ｃ）ＴＸＮＩＰをノックアウトすること、ならびに
（ｄ）ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡＥをノックインすること
を含む、前記方法。

【請求項183】

Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３及びＭＡＮＦをノックインすることをさらに含む、請求項１８０～１８２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項184】

前記方法が、前記ＭＩＣＡの発現を低下または消失させることを含み、前記発現を低下または消失させることが、ＭＩＣＡタンパク質の発現を低下または消失させることを含む、請求項１６９～１８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項185】

前記方法が、前記ＭＩＣＢの発現を低下または消失させることを含み、前記発現を低下または消失させることが、ＭＩＣＢタンパク質の発現を低下または消失させることを含む、請求項１６９～１８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項186】

前記方法が、前記ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現を低下または消失させることを含み、前記発現を低下または消失させることが、ＭＩＣＡタンパク質及びＭＩＣＢタンパク質の発現を低下または消失させることを含む、請求項１６９～１８５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項187】

前記発現を低下または消失させることが、細胞表面発現を低下または消失させることを含む、請求項１６９～１８６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項188】

発現を低下または消失させることが、該当遺伝子の活性を低下または消失させる改変を導入することを含む、請求項１６９～１８７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項189】

前記改変が、遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊である、請求項１８８に記載の方法。

【請求項190】

前記不活性化または破壊が、インデルを含む、請求項１８９に記載の方法。

【請求項191】

前記インデルが、前記遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域のフレームシフト変異または欠失である、請求項１９０に記載の方法。

【請求項192】

該当遺伝子の活性をノックアウトすることを含む、請求項１８８～１９１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項193】

前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下または消失させる改変が、Ｂ２Ｍの改変である、請求項１８８～１９２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項194】

前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下または消失させる改変が、ＣＩＩＴＡの改変である、請求項１８８～１９３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項195】

ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集を介して、前記改変が行われる、請求項１８８～１９４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項196】

前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものである、請求項１９５に記載の方法。

【請求項197】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２からなる群から選択されるＣａｓを含む、請求項１９６に記載の方法。

【請求項198】

前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、請求項１９６または１９７に記載の方法。

【請求項199】

前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせが、ｇＲＮＡと前記Ｃａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、請求項１９８に記載の方法。

【請求項200】

前記１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる改変が、前記１つ以上の寛容原性因子をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを導入することを含む、請求項１８８～１９９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項201】

前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記寛容原性因子の２つ以上をコードするマルチシストロニックなベクターである、請求項２００に記載の方法。

【請求項202】

前記１つ以上の寛容原性因子の少なくとも１つが、ＣＤ４７である、請求項１６９～２０１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項203】

前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１８９～２０２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項204】

前記組み込みが、非標的挿入によるものである、請求項２０３に記載の方法。

【請求項205】

レンチウイルスベクターを介して、前記組み込みが行われる、請求項２０４に記載の方法。

【請求項206】

前記組み込みが、標的ゲノム遺伝子座への標的挿入によるものである、請求項２０３に記載の方法。

【請求項207】

ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集と相同配向型修復を介して、前記組み込みが行われる、請求項２０６に記載の方法。

【請求項208】

前記標的ゲノム遺伝子座が、ＭＩＣＡ遺伝子座、ＭＩＣＢ遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、ＴＲＢＣ遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座位、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、ＬＲＰ１遺伝子座、ＨＭＧＢ１遺伝子座、ＡＢＯ遺伝子座、ＲＨＤ遺伝子座、ＦＵＴ１遺伝子座及びＫＤＭ５Ｄ遺伝子座からなる群から選択される、請求項２０６または２０７に記載の方法。

【請求項209】

前記操作細胞が所望の細胞種に分化するように、細胞分化技法を行うことをさらに含む、請求項１６９～２０８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項210】

前記供給源細胞をドナー対象から単離する、請求項１６９～２０９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項211】

前記ドナー対象が、単離時点に、健常であるか、または疾患もしくは病態を有する疑いがない、請求項２１０に記載の方法。

【請求項212】

請求項１６９～２１１に記載のいずれか１項の方法を用いて作製した、操作細胞。

【請求項213】

同種異系療法を用いて個体の病態を治療する方法であって、前記個体に、請求項１～１２８のいずれか１項に記載の操作細胞、請求項１２９～１４４のいずれか１項に記載の操作細胞集団、または請求項１４５～１６５のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。

【請求項214】

前記病態が、疾患または細胞不全である、請求項２１３に記載の方法。

【請求項215】

前記疾患が、ループス、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、セリアック病、グレーブス病、乾癬、大腸炎、１型糖尿病、全身性ループスエリテマトーデス、炎症性腸疾患、アジソン病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性血管炎及び悪性貧血からなる群から選択される、請求項２１３または２１４に記載の方法。

【請求項216】

前記細胞不全が、造血系疾患もしくは造血系障害と関連するか、または前記疾患もしくは病態が、造血系疾患もしくは造血系障害である、請求項２１４に記載の方法。

【請求項217】

前記造血系疾患または造血系障害が、骨髄異形成、再生不良性貧血、ファンコニ貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、鎌状赤血球症、ダイアモンドブラックファン貧血、シュワッハマンダイアモンド障害、コストマン症候群、慢性肉芽腫性疾患、副腎白質ジストロフィー、白血球接着不全症、血友病、サラセミア、βサラセミア、白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（骨髄）白血病（ＡＭＬ）、成人リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及び若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、慢性肉芽腫性疾患、チェディアック・東症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）またはＡＩＤＳである、請求項２１６に記載の方法。

【請求項218】

前記細胞不全が、白血病もしくはミエローマと関連するか、または前記疾患もしくは病態が、白血病もしくはミエローマである、請求項２１３または２１４に記載の方法。

【請求項219】

前記細胞不全が、自己免疫疾患もしくは自己免疫病態と関連するか、または前記疾患もしくは病態が、自己免疫疾患または自己免疫病態である、請求項２１３または２１４に記載の方法。

【請求項220】

前記自己免疫疾患または自己免疫病態が、急性播種性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗合成酵素症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ぶどう膜炎、バロー病、バロー同心円硬化症、ベーチェット症候群、ベルジェ病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、がん、キャッスルマン病、セリアック病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体成分２欠損症、脳動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、デゴス病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、びまん皮膚硬化型全身性強皮症、ドレスラー症候群、円板状ループスエリテマトーデス、湿疹、付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維性肺胞炎、胃炎、胃腸類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、炎症性脱髄性多発神経障害、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート・イートン筋無力症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ルー・ゲーリック病、ルポイド肝炎、ループスエリテマトーデス、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、ミラー・フィッシャー症候群、混合性結合組織病、限局性強皮症、ムッカ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、視神経脊髄炎、ニューロミオトニア、眼瘢痕性類天疱瘡、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、オード甲状腺炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、パーソネージ・ターナー症候群、周辺部ぶどう膜炎、天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲性脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、再発性多発性軟骨炎、ライター症候群、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スチル病、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、スウィート症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患、未分化脊椎関節症、血管炎、白斑またはウェゲナー肉芽腫症である、請求項２１９に記載の方法。

【請求項221】

前記細胞集団が、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／またはその誘導体を含む集団である、請求項２１６～２２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項222】

前記細胞不全が、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、神経変性疾患もしくは神経変性病態、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、うつ病、神経精神障害発作、もしくは筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と関連するか、または前記疾患もしくは病態が、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、神経変性疾患もしくは神経変性病態、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、うつ病、神経精神障害発作、もしくは筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項２１４に記載の方法。

【請求項223】

前記細胞集団が、神経細胞及び／またはグリア細胞を含む集団である、請求項２２２に記載の方法。

【請求項224】

前記個体において、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体が循環血液中に存在する、請求項２１３～２２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項225】

前記個体において、前記抗ＭＩＣＡ抗体及び／または前記抗ＭＩＣＢ抗体が持続的に存在する、請求項２２４に記載の方法。

【請求項226】

前記個体が、前記抗ＭＩＣＡ抗体及び／または前記抗ＭＩＣＢ抗体の存在の原因となる自己免疫関連病態である、請求項２２４または２２５に記載の方法。

【請求項227】

前記自己免疫関連病態が、橋本病である、請求項２２６に記載の方法。

【請求項228】

前記自己免疫関連病態が、ループスである、請求項２２６に記載の方法。

【請求項229】

前記自己免疫関連病態が、多発性硬化症である、請求項２２６に記載の方法。

【請求項230】

前記個体が、前記抗ＭＩＣＡ抗体及び／または前記抗ＭＩＣＢ抗体の存在に基づき、前記治療のために選択された、請求項２１３～２２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項231】

前記抗ＭＩＣＡ抗体及び／または前記抗ＭＩＣＢ抗体の存在に基づき、前記個体を前記治療のために選択することをさらに含む、請求項２１３～２３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項232】

前記個体を選ぶことが、前記抗ＭＩＣＡ抗体及び／または前記抗ＭＩＣＢ抗体の存在を前記個体において測定することをさらに含む、請求項２３１に記載の方法。

【請求項233】

同種異系療法を用いて個体の病態を治療する方法であって、
（ａ）前記個体の抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を判断することであって、
抗ＭＩＣＡ抗体陽性の状態により、前記個体から得た血清試料に抗ＭＩＣＡ抗体が存在することが示され、
抗ＭＩＣＢ抗体陽性の状態により、前記個体から得た血清試料に抗ＭＩＣＢ抗体が存在することが示される、
前記判断することと、
（ｂ）前記抗ＭＩＣＡ抗体及び／または前記抗ＭＩＣＢ抗体の状態に基づき、前記個体に、１２９～１４４のいずれか１項に記載の操作細胞集団を含む組成物、または請求項１４５～１６５のいずれか１項に記載の組成物を投与することであって、
前記抗ＭＩＣＡ抗体の状態が陽性である場合には、前記集団の操作細胞が、ＭＩＣＡの発現の低下を含み、
前記抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、前記集団の操作細胞が、ＭＩＣＢの発現の低下を含み、
前記抗ＭＩＣＡ抗体の状態及び前記抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、前記集団の操作細胞が、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下を含む、
前記投与すること
を含む、前記方法。

【請求項234】

前記個体の抗ＭＩＣＡ抗体の状態及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態に基づき、前記個体を前記治療のために選択することをさらに含む、請求項２３３に記載の方法。

【請求項235】

前記個体の抗ＭＩＣＡ抗体の状態及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を測定することをさらに含む、請求項２３３または２３４に記載の方法。

【請求項236】

その必要がある個体での使用に適する同種異系療法を特定する方法であって、
前記同種異系療法が、請求項１２９～１４４のいずれか１項に記載の操作細胞集団を含む組成物、または請求項１４５～１６５のいずれか１項に記載の組成物を含み、
前記方法が、前記個体の抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を判断して、前記個体での使用に適する同種異系療法を特定することを含み、
前記抗ＭＩＣＡ抗体の状態が陽性である場合には、前記適する同種異系療法が、ＭＩＣＡの発現の低下を含む前記集団の操作細胞を含み、
前記抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、前記適する同種異系療法が、ＭＩＣＢの発現の低下を含む前記集団の操作細胞を含み、
前記抗ＭＩＣＡ抗体の状態及び前記抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、前記適する同種異系療法が、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下を含む前記集団の操作細胞を含む、
前記方法。

【請求項237】

１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に投与することをさらに含む、請求項２１３～２３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項238】

前記個体が、１つ以上の免疫抑制剤を投与されたことがある、請求項２１３～２３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項239】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、小分子または抗体である、請求項２３７または２３８に記載の方法。

【請求項240】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、副腎皮質ステロイド、プレドニゾン、メトトレキサート、金塩、スルファサラジン、抗マラリア剤、ブレキナル、レフルノミド、ミゾリビン、１５－デオキシスペルグアリン、６－メルカプトプリン、シクロホスファミド、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン、チモペンチン（チモシン－α）及び免疫抑制抗体からなる群から選択される、請求項２３７～２３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項241】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、シクロスポリンを含む、請求項２３７～２４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項242】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、ミコフェノール酸モフェチルを含む、請求項２３７～２４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項243】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、副腎皮質ステロイドを含む、請求項２３７～２４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項244】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、シクロホスファミドを含む、請求項２３７～２４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項245】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、ラパマイシンを含む、請求項２３７～２４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項246】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、タクロリムス（ＦＫ－５０６）を含む、請求項２３７～２４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項247】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、抗胸腺細胞グロブリンを含む、請求項２３７～２４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項248】

前記１つ以上の免疫抑制剤が、１つ以上の免疫調節剤である、請求項２３７～２４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項249】

前記１つ以上の免疫調節剤が、小分子または抗体である、請求項２４８に記載の方法。

【請求項250】

前記抗体が、ＩＬ－２受容体のｐ７５、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－６、ＩＧＦ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ５８、及びそれらのリガンドのいずれかに結合する抗体からなる群から選択される受容体またはリガンドの１つ以上に結合する、請求項２３９または請求項２４９に記載の方法。

【請求項251】

前記１つ以上の免疫抑制剤を、前記個体に、前記操作細胞の投与前に投与するかまたは投与したことがある、請求項２３７～２５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項252】

前記１つ以上の免疫抑制剤を、前記個体に、前記操作細胞の投与の少なくとも１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、７日前、８日前、９日前、１０日前、１１日前、１２日前、１３日前または１４日前に投与するかまたは投与したことがある、請求項２３７～２５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項253】

前記１つ以上の免疫抑制剤を、前記個体に、前記操作細胞の投与の少なくとも１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、７週間前、８週間前、９週間前、１０週間、またはそれ以上前に投与するかまたは投与したことがある、請求項２３７～２５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項254】

前記１つ以上の免疫抑制剤を、前記個体に、前記操作細胞の投与の少なくとも１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後または１４日後に投与するかまたは投与したことがある、請求項２３７～２５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項255】

前記１つ以上の免疫抑制剤を、前記個体に、前記操作細胞の投与の少なくとも１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後、１０週間、またはそれ以上後に投与するかまたは投与したことがある、請求項２３７～２５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項256】

前記１つ以上の免疫抑制剤を、前記個体に、前記操作細胞の１回目の投与と同じ日に投与するかまたは投与したことがある、請求項２３７～２５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項257】

前記１つ以上の免疫抑制剤を、前記個体に、前記操作細胞の投与後に投与するかまたは投与したことがある、請求項２３７～２５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項258】

前記１つ以上の免疫抑制剤を、前記個体に、前記操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の後に投与するかまたは投与したことがある、請求項２３７～２５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項259】

前記１つ以上の免疫抑制剤を、前記個体に、前記操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の前に投与するかまたは投与したことがある、請求項２３７～２５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項260】

前記１つ以上の免疫抑制剤を、前記個体に、前記操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の少なくとも１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、７日前、８日前、９日前、１０日前、１１日前、１２日前、１３日前または１４日前に投与するかまたは投与したことがある、請求項２３７～２５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項261】

前記１つ以上の免疫抑制剤を、前記個体に、前記操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の少なくとも１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、７週間前、８週間前、９週間前、１０週間、またはそれ以上前に投与するかまたは投与したことがある、請求項２３７～２５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項262】

前記１つ以上の免疫抑制剤を、前記個体に、前記操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の少なくとも１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後または１４日後に投与するかまたは投与したことがある、請求項２３７～２５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項263】

前記１つ以上の免疫抑制剤を、前記個体に、前記操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の少なくとも１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後、１０週間、またはそれ以上後に投与するかまたは投与したことがある、請求項２３７～２５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項264】

前記操作細胞の改変を含まない免疫原性細胞の免疫拒絶を軽減するために投与される１つ以上の免疫抑制剤の投与量よりも低い投与量で、前記１つ以上の免疫抑制剤が投与される、請求項２３７～２６３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項265】

前記操作細胞が、前記操作細胞の殺傷を制御できる、請求項２３７～２６４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項266】

前記操作細胞が、自殺遺伝子または自殺スイッチを含む、請求項２３７～２６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項267】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、薬物もしくはプロドラッグの存在下で、または選択的な外因性化合物によって活性化されると、制御細胞死を誘導する、請求項２６６に記載の方法。

【請求項268】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記操作細胞のアポトーシスを誘導できる誘導タンパク質である、請求項２６６または請求項２６７に記載の方法。

【請求項269】

前記操作細胞のアポトーシスを誘導できる前記誘導タンパク質が、カスパーゼタンパク質である、請求項２６８に記載の方法。

【請求項270】

前記カスパーゼタンパク質が、カスパーゼ９である、請求項２６９に記載の方法。

【請求項271】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチが、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシンによる活性化型のカスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、請求項２６６～２７０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項272】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に投与した後に活性化して、制御細胞死を誘導する、請求項２６６～２７１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項273】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に投与する前に活性化して、制御細胞死を誘導する、請求項２６６～２７１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項274】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記操作細胞を前記個体に投与した後に活性化して、制御細胞死を誘導する、請求項２６６～２７３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項275】

前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、細胞毒性または前記個体に対するその他の悪影響が生じた場合に活性化して、制御細胞死を誘導する、請求項２６６～２７４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項276】

前記操作細胞集団の操作細胞を枯渇させることが可能な薬剤を投与することを含む、請求項１８０～２７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項277】

前記操作細胞を枯渇させることが可能な薬剤が、前記操作細胞の表面に発現したタンパク質を認識する抗体である、請求項２７６に記載の方法。

【請求項278】

前記抗体が、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ及びＲＱＲ８を認識する抗体からなる群から選択される、請求項２７７に記載の方法。

【請求項278】

前記抗体が、モガムリズマブ、ＡＦＭ１３、ＭＯＲ２０８、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－Ｒｌｌｂ、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、Ｈｕｌ４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕｌ４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－Ｒｌｌｃ、及びこれらのバイオシミラーからなる群から選択される、請求項２７７に記載の方法。

【請求項279】

前記操作細胞の表面上の前記１つ以上の寛容原性因子を認識する薬剤を投与することを含む、請求項２１３～２３６及び２７６～２７８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項280】

前記操作細胞が、前記１つ以上の寛容原性因子を発現するように操作されている、請求項２７９に記載の方法。

【請求項281】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７である、請求項２７９または２８０に記載の方法。

【請求項282】

１つ以上の追加の治療剤を前記個体に投与することをさらに含む、請求項２１３～２８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項283】

前記個体が、１つ以上の追加の治療剤を投与されたことがある、請求項２１３～２８２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項284】

前記方法の治療有効性をモニタリングすることをさらに含む、請求項２１３～２８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項285】

前記方法の予防有効性をモニタリングすることをさらに含む、請求項２１３～２８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項286】

１つ以上の疾患症状が所望どおりに抑制されるまで繰り返される、請求項２１３～２８５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項287】

自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１～１２８のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項288】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチが、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシンによる活性化型のカスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、請求項２８７に記載の操作細胞。

【請求項289】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記自殺遺伝子またはセーフティスイッチと関連する遺伝子が、前記操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する、請求項２８７または請求項２８８に記載の操作細胞。

【請求項290】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記１つ以上の寛容原性因子が、前記操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する、請求項２８７または請求項２８８に記載の操作細胞。

【請求項291】

前記バイシストロニックなカセットが、前記操作細胞のゲノムに、任意にレンチウイルスベクターを用いて前記外因性ポリヌクレオチドを前記細胞に導入することによって、非標的挿入によって組み込まれている、請求項２８９または請求項２９０に記載の操作細胞。

【請求項292】

前記バイシストロニックなカセットが、前記細胞の標的ゲノム遺伝子座に、標的挿入によって組み込まれており、任意に、前記標的挿入が、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集と相同配向型修復によるものである、請求項２９１に記載の操作細胞。

【請求項293】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７である、請求項２８６～２９２のいずれか１項に記載の操作細胞。

【請求項294】

前記操作細胞が、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１６９～２１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項295】

前記自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシンによる活性化型のカスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、請求項２９４に記載の方法。

【請求項296】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記自殺遺伝子またはセーフティスイッチと関連する遺伝子が、前記操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する、請求項２９４または請求項２９５に記載の方法。

【請求項297】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記１つ以上の寛容原性因子が、前記操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する、請求項２９４または請求項２９５に記載の方法。

【請求項298】

前記バイシストロニックなカセットが、前記操作細胞のゲノムに、非標的挿入によって組み込まれている、請求項２９６または請求項２９７に記載の方法。

【請求項399】

前記バイシストロニックなカセットが、前記操作細胞の標的ゲノム遺伝子座に、標的挿入によって組み込まれている、請求項２９６または請求項２９７に記載の方法。

【請求項300】

前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７である、請求項２９４～２９９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項301】

前記操作細胞集団の操作細胞が、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１４５～１６５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項302】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチが、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシンによる活性化型のカスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択される、請求項３０１に記載の組成物。

【請求項303】

前記自殺遺伝子、及び前記自殺遺伝子またはセーフティスイッチと関連する遺伝子が、前記操作細胞集団の操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する、請求項３０１または請求項３０２に記載の組成物。

【請求項304】

前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記外因性ＣＤ４７が、前記操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する、請求項３０１または請求項３０３に記載の組成物。

【請求項305】

前記バイシストロニックなカセットが、任意に、レンチウイルスベクターを用いて前記外因性ポリヌクレオチドを前記操作細胞集団の操作細胞に導入することによって、前記ゲノムに、非標的挿入によって組み込まれている、請求項３０３または請求項３０４に記載の組成物。

【請求項306】

前記バイシストロニックなカセットが、前記操作細胞集団の操作細胞の標的ゲノム遺伝子座に、標的挿入によって組み込まれており、任意に、前記標的挿入が、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集と相同配向型修復によるものである、請求項３０３または請求項３０４に記載の組成物。

【請求項307】

前記操作細胞が、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させるための１つ以上の改変を含み、前記１つ以上の寛容原性因子のそれぞれが、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１インヒビター、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、またはＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択される、請求項１～１２８のいずれか１項に記載の操作細胞、請求項１２９～１４４のいずれか１項に記載の細胞集団、または請求項１６９～２８６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項308】

前記操作細胞が、自家細胞である、請求項１～１２８のいずれか１項に記載の操作細胞、または請求項１６９～２８６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項309】

前記操作細胞が、同種異系細胞である、請求項１～１２８のいずれか１項に記載の方法、または請求項１６９～２８６のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年８月１１日に出願した米国特許仮出願第６３／２３２，１６３号及び２０２２年６月１７日に出願した米国特許仮出願第６３／３５３，５４８号の優先権及び利益を主張するものであり、これらの各仮出願の内容は、参照により、その全体が、あらゆる目的で本明細書に援用される。

【0002】

電子形式の配列表の参照
電子形式の配列表（１８６１５２００５５４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｘｍｌ、サイズ：３４，１５８バイト、作成日：２０２２年８月１１日）の内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0003】

分野
ある特定の態様では、本開示は、同種異系細胞療法で使用するために、遺伝子改変のような改変を１つ以上含む操作細胞に対するものである。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、免疫機能低下細胞である。

【発明の概要】

【0004】

概要
ドナー同種異系抗原に対する、レシピエントの感作は、細胞療法を含めた臨床移植療法が直面している問題である。例えば、移植レシピエントの免疫系が同種異系材を拒絶する傾向は、移植療法の潜在的効力を大幅に低下させ、このような治療に関連する考え得るプラス効果を低下させる。レシピエントの免疫系による検出を回避する同種異系細胞ベースの療法を生み出すための新規のアプローチ、組成物及び方法を含め、数多くの障害及び病態を治療するための同種異系細胞の改善に対する必要性が依然として存在する。

【0005】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、（ａ）ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）及び／またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）の発現を低下させる改変、（ｂ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる改変、ならびに（ｃ）１つ以上の主要組織適合性複合体クラスＩ分子（ＭＨＣクラスＩ分子）及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる改変を含む操作細胞であり、その発現の変化は、これらの改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べたものである。

【0006】

いくつかの実施形態では、その改変は、（ｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、（ｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または（ｉｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、その改変は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－ＢまたはＮＦＹ－Ｃの１つ以上の発現の低下を含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない。

【0009】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－ＢまたはＮＦＹ－Ｃの１つ以上を発現しない。

【0010】

いくつかの実施形態では、その改変は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を低下させることによって、その１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる。

【0011】

いくつかの実施形態では、その改変は、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を低下させることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる。

【0012】

いくつかの実施形態では、その改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の活性を低下させることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低下させる。

【0013】

いくつかの実施形態では、その改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊によって、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる。

【0014】

いくつかの実施形態では、その改変は、すべてのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊によって、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる。

【0015】

いくつかの実施形態では、その不活性化または破壊は、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるインデル、またはＢ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域の欠失を含む。

【0016】

いくつかの実施形態では、そのインデルは、フレームシフト変異である。

【0017】

いくつかの実施形態では、そのＢ２Ｍ遺伝子は、ノックアウトされている。

【0018】

いくつかの実施形態では、その改変は、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、プライム編集、または部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）によるものである。

【0019】

いくつかの実施形態では、その改変は、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集によって、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低下させる。

【0020】

いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、プライム編集、部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）またはヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択した１つ以上のタンパク質によって行う。

【0021】

いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものである。

【0022】

いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせのＣａｓは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択されている。

【0023】

いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、Ｂ２Ｍ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。

【0024】

いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、そのｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。

【0025】

いくつかの実施形態では、その改変は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面発現を低下させることによって、その１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる。

【0026】

いくつかの実施形態では、その改変は、ＣＩＩＴＡの発現を低下させることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる。

【0027】

いくつかの実施形態では、その改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の活性を低下させることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低下させる。

【0028】

いくつかの実施形態では、その改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊によって、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる。

【0029】

いくつかの実施形態では、その改変は、すべてのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊によって、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる。

【0030】

いくつかの実施形態では、その不活性化または破壊は、ＣＩＩＴＡ遺伝子におけるインデル、またはＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域の欠失を含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、そのインデルは、フレームシフト変異である。

【0032】

いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡ遺伝子は、ノックアウトされている。

【0033】

いくつかの実施形態では、その改変は、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集によって、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低下させる。

【0034】

いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものである。

【0035】

いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせのＣａｓは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択されている。

【0036】

いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、ＣＩＩＴＡ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。

【0037】

いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、そのｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。

【0038】

いくつかの実施形態では、その改変は、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、プライム編集、または部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）によるものである。

【0039】

いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、プライム編集、部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）またはヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択した１つ以上のタンパク質によって行う。

【0040】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、（ａ）ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）及び／またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）の発現を低下させる改変、ならびに（ｂ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる改変を１つ以上含む操作細胞であり、その発現の変化は、その１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べたものである。

【0041】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、（ａ）ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）及び／またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）の発現を低下させる改変、ならびに（ｂ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる改変を１つ以上含む操作細胞であり、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の発現を増加させ、その発現の変化は、その１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べたものである。

【0042】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の改変は、１つ以上の主要組織適合性複合体クラスＩ分子（ＭＨＣクラスＩ分子）及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させ、ＣＤ４７及び任意にＣＤ２４、及び／またはＰＤ－Ｌ１の発現を増加させ、及び／またはＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１の発現を増加させる。

【0043】

いくつかの実施形態では、その細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢ、ならびにＴＸＮＩＰのいずれかのノックアウト、ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡＥのノックインを含む。

【0044】

いくつかの実施形態では、その細胞は、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３及びＭＡＮＦのノックインを含む。

【0045】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡの発現を低下させるための１つ以上の改変を含む。

【0046】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、その操作細胞上でのＭＩＣＡの表面発現の低下を含み、任意に、検出可能な表面発現が見られない。

【0047】

いくつかの実施形態では、ＭＩＣＡの発現を低下させる改変は、ＭＩＣＡのタンパク質発現を低下させる。

【0048】

いくつかの実施形態では、その操作細胞上で、ＭＩＣＡの検出可能な細胞表面発現が見られない。

【0049】

いくつかの実施形態では、ＭＩＣＡの発現を低下させる改変は、ＭＩＣＡをコードするｍＲＮＡの発現を低下させる。

【0050】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡ遺伝子の活性を消失させる１つ以上の改変を含む。

【0051】

いくつかの実施形態では、その改変は、ＭＩＣＡ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む。

【0052】

いくつかの実施形態では、その改変は、すべてのＭＩＣＡコード配列の不活性化または破壊を含む。

【0053】

いくつかの実施形態では、その不活性化または破壊は、ＭＩＣＡ遺伝子におけるインデルを含む。

【0054】

いくつかの実施形態では、その改変は、ＭＩＣＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域のフレームシフト変異または欠失を含む。

【0055】

いくつかの実施形態では、その改変は、ノックアウトを含む。

【0056】

いくつかの実施形態では、その改変は、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集による改変であって、ＭＩＣＡ遺伝子を標的とする改変である。

【0057】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集による改変は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の媒介による改変、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の媒介による改変、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介によるものである。

【0058】

いくつかの実施形態では、そのＣａｓは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択されている。

【0059】

いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介による改変は、ＭＩＣＡ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の使用を含む。

【0060】

いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介による改変は、そのｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の使用を含む。

【0061】

いくつかの実施形態では、その改変は、ＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、プライム編集、または部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）によるものである。

【0062】

いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼ、プライム編集、部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）またはヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｍａｄ７、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ及びＣＲＩＳＰＲ関連トランスポザーゼからなる群から選択した１つ以上のタンパク質によって行う。

【0063】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢの発現を低下させるための改変を含む。

【0064】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、その操作細胞上でのＭＩＣＢの表面発現の低下を含み、任意に、検出可能な表面発現が見られない。

【0065】

いくつかの実施形態では、ＭＩＣＢの発現を低下させる改変は、ＭＩＣＢのタンパク質発現を低下させる。

【0066】

いくつかの実施形態では、その操作細胞上で、ＭＩＣＢの検出可能な細胞表面発現が見られない。

【0067】

いくつかの実施形態では、ＭＩＣＢの発現を低下させる改変は、ＭＩＣＢをコードするｍＲＮＡの発現を低下させる。

【0068】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢ遺伝子の活性を消失させる改変を含む。

【0069】

いくつかの実施形態では、その改変は、ＭＩＣＢ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む。

【0070】

いくつかの実施形態では、その改変は、すべてのＭＩＣＢコード配列の不活性化または破壊を含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、その不活性化または破壊は、ＭＩＣＢ遺伝子におけるインデルを含む。

【0072】

いくつかの実施形態では、その改変は、ＭＩＣＢ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域のフレームシフト変異または欠失である。

【0073】

いくつかの実施形態では、その改変は、ノックアウトである。

【0074】

いくつかの実施形態では、その改変は、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集による改変であって、ＭＩＣＢ遺伝子を標的とする改変である。

【0075】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集による改変は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の媒介による改変、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の媒介による改変、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介によるものである。

【0076】

いくつかの実施形態では、そのＣａｓは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択されている。

【0077】

いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介による改変は、ＭＩＣＢ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の使用を含む。

【0078】

いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介による改変は、そのｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の使用を含む。

【0079】

いくつかの実施形態では、その改変は、ＮＬＲＣ５、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＣＤ１４２、ＡＢＯ、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＮＬＧＮ４Ｙ及びＲＨＤのいずれか１つ以上の発現を低下させる。

【0080】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子のそれぞれは、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１インヒビター、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されている。

【0081】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅを含む。

【0082】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ２４を含む。

【0083】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＰＤ－Ｌ１を含む。

【0084】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４６を含む。

【0085】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ５５を含む。

【0086】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ５９を含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＲ１を含む。

【0088】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＭＡＮＦを含む。

【0089】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３を含む。

【0090】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ及びＣＤ４７を含む。

【0091】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ２４、ＣＤ４７またはＰＤ－Ｌ１の１つ以上（すべてを含む）を含む。

【0092】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７またはＰＤ－Ｌ１の１つ以上（すべてを含む）を含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９またはＣＲ１の１つ以上（すべてを含む）を含む。

【0094】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９またはＣＲ１の１つ以上（すべてを含む）を含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９またはＣＲ１の１つ以上（すべてを含む）を含む。

【0096】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－ＥまたはＰＤ－Ｌ１の１つ以上（すべてを含む）を含む。

【0097】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤ－Ｌ１またはＡ２０／ＴＮＦＡＩＰの１つ以上（すべてを含む）、及び任意にＭＡＮＦを含む。

【0098】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤ－Ｌ１またはＭＡＮＦの１つ以上（すべてを含む）、及び任意にＡ２０／ＴＮＦＡＩＰを含む。

【0099】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子のそれぞれは、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８からなる群から選択されている。

【0100】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、（ｉ）（ａ）１つ以上のＭＨＣ Ｉ分子及び／または１つ以上のＭＨＣ ＩＩ分子の発現を低下させる改変、ならびに（ｂ）ＣＤ４７の発現を増加させる改変、（ｉｉ）（ａ）１つ以上のＭＨＣ Ｉ分子及び／または１つ以上のＭＨＣ ＩＩ分子の発現を低下させる改変、（ｂ）ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの発現を低下させる改変、（ｃ）ＣＤ４７、ならびに任意にＣＤ２４及びＰＤ－Ｌ１の発現を増加させる改変、ならびに（ｄ）ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１の発現を増加させる改変、（ｉｉｉ）（ａ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる改変、（ｂ）ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの発現を低下させる改変、（ｃ）ＴＸＮＩＰの発現を低下させる改変、（ｄ）ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅの発現を増加させる改変、ならびに（ｅ）任意に、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３及びＭＡＮＦの発現を増加させる改変、（ｉｖ）（ａ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の発現を増加させる改変、ならびに（ｂ）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下させる改変、（ｖ）（ａ）標的の発現を増減させる追加の編集をさらに含む上記（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかに従う改変を含む。

【0101】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子の少なくとも１つは、ＣＤ４７である。

【0102】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７である。

【0103】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７は、配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも一部との同一性が少なくとも約８５％であるアミノ酸配列を有する。

【0104】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子の発現の増加は、その１つ以上の寛容原性因子の細胞表面発現の増加を含む。

【0105】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子の１つは、外因性ポリペプチドである。

【0106】

いくつかの実施形態では、その改変は、その１つ以上の寛容原性因子をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0107】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子のそれぞれは、プロモーターに機能可能に連結されている。

【0108】

いくつかの実施形態では、そのプロモーターは、構成的プロモーターである。

【0109】

いくつかの実施形態では、そのプロモーターは、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択されている。

【0110】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、１つ以上のゲノム遺伝子座に組み込まれている。

【0111】

いくつかの実施形態では、その組み込みは、非標的挿入である。

【0112】

いくつかの実施形態では、その非標的挿入は、レンチウイルスベクターを用いて、その外因性ポリヌクレオチドをその細胞に導入することによる挿入である。

【0113】

いくつかの実施形態では、その組み込みは、標的挿入である。

【0114】

いくつかの実施形態では、その１つ以上のゲノム遺伝子座のそれぞれは、ＭＩＣＡ遺伝子座、ＭＩＣＢ遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座位、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、ＬＲＰ１遺伝子座、ＨＭＧＢ１遺伝子座、ＡＢＯ遺伝子座、ＲＨＤ遺伝子座、ＦＵＴ１遺伝子座及びＫＤＭ５Ｄ遺伝子座からなる群から選択されている。

【0115】

いくつかの実施形態では、その１つ以上のゲノム遺伝子座のそれぞれは、Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、ＭＩＣ－Ａ座位、ＭＩＣ－Ｂ座位及びセーフハーバー座位からなる群から選択されている。

【0116】

いくつかの実施形態では、そのセーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６及びＳＨＳ２３１の座位からなる群から選択されている。

【0117】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子の発現の増加は、プロモーターを介して、内在性遺伝子の遺伝子活性を向上させる改変を含む。

【0118】

いくつかの実施形態では、遺伝子活性を向上させる改変は、内在性プロモーターの改変、または異種プロモーターの導入を介したものである。

【0119】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ヒト細胞、もしくは動物細胞、任意に、ブタ細胞、ウシ細胞もしくはヒツジ細胞であるか、またはその細胞に由来する。

【0120】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞に由来する。

【0121】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、多能性幹細胞もしくはその子孫に由来する分化細胞であるか、またはその分化細胞に由来する。

【0122】

いくつかの実施形態では、その多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞であるか、または人工多能性幹細胞に由来する。

【0123】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ドナー対象から単離した初代細胞であるか、またはその初代細胞に由来する。

【0124】

いくつかの実施形態では、そのドナー対象は、その初代細胞をそのドナー対象から得る時点に、健常であるか、または疾患もしくは病態である疑いがない。

【0125】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、膵島β細胞、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ細胞、網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、内皮細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、筋肉細胞、心臓細胞、血液細胞、膵臓の膵島細胞、平滑筋細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心筋細胞、視細胞、幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉幹細胞、胚性幹細胞及び多能性幹細胞（ＰＳＣ）から選択されている。

【0126】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、内皮細胞であるか、または内皮細胞に由来する。

【0127】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、上皮細胞であるか、または上皮細胞に由来する。

【0128】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、多能性幹細胞であるか、または多能性幹細胞に由来する。

【0129】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、胚性幹細胞であるか、または胚性幹細胞に由来する。

【0130】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、間葉系列の細胞であるか、またはその細胞に由来する。

【0131】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｏ型ＡＢＯ血液型、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）の１つ以上であり、機能型のＡＢＯ Ａアレル及び／または機能型のＡＢＯ Ｂアレル、あるいはＲｈ因子陽性（Ｒｈ＋）を含む。

【0132】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。

【0133】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、本明細書に記載の細胞の集団のいずれかを含む細胞集団である。

【0134】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約３０％は、本明細書に記載の操作細胞を含む。

【0135】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて改変を含む。

【0136】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が低下している。

【0137】

いくつかの実施形態では、その操作細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの表面発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られない。

【0138】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が見られない。

【0139】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が低下している。

【0140】

いくつかの実施形態では、その操作細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの表面発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られない。

【0141】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が見られない。

【0142】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、１つ以上の寛容原性因子をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0143】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0144】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含む。

【0145】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、Ｂ２Ｍ及び／またはＣＩＩＴＡの発現の低下を含む。

【0146】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低下を含む。

【0147】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルの両方を不活性化する１つ以上の変化を含む。

【0148】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルの両方を不活性化する１つ以上の変化を含む。

【0149】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、本明細書に記載の細胞の集団のいずれかを含む組成物である。

【0150】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、本明細書に記載の細胞の集団のいずれかを含む組成物であり、（ａ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、その操作細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの表面発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られず、（ｂ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、（ｃ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含み、その操作細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られない。

【0151】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、本明細書に記載の細胞の集団のいずれかを含む組成物であり、（ａ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、その操作細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの表面発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られず、（ｂ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、（ｃ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含み、その操作細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られない。

【0152】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、本明細書に記載の細胞の集団のいずれかを含む組成物であり、（ａ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、その操作細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの表面発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られず、（ｂ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、その操作細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの表面発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られず、（ｃ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、（ｄ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含み、その操作細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、任意に、検出可能な表面発現が見られない。

【0153】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、操作した初代膵島β細胞の集団を含む組成物であり、その操作した初代膵島β細胞は、（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊を含む。

【0154】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、操作した初代Ｔ細胞の集団を含む組成物であり、その操作した初代Ｔ細胞は、（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊を含む。

【0155】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、操作した初代甲状腺細胞の集団を含む組成物であり、その操作した初代甲状腺細胞は、（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子（ＣＤ４７ｔｇ）、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊を含む。

【0156】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、操作した初代皮膚細胞の集団を含む組成物であり、その操作した初代皮膚細胞は、（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子（ＣＤ４７ｔｇ）、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊を含む。

【0157】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、操作した初代内皮細胞の集団を含む組成物であり、その操作した初代内皮細胞は、（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子（ＣＤ４７ｔｇ）、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊を含む。

【0158】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、操作した初代網膜色素上皮細胞の集団を含む組成物であり、その操作した初代網膜色素上皮細胞は、（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子（ＣＤ４７ｔｇ）、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊を含む。

【0159】

いくつかの実施形態では、その操作細胞集団の操作細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべてにおけるインデルを含む。

【0160】

いくつかの実施形態では、その操作細胞集団の操作細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊をさらに含む。

【0161】

いくつかの実施形態では、その操作細胞集団の操作細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルのすべてにおけるインデルを含む。

【0162】

いくつかの実施形態では、その操作細胞集団の操作細胞は、ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇという表現型を有する。

【0163】

いくつかの実施形態では、その操作細胞集団の操作細胞は、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇという表現型を有する。

【0164】

いくつかの実施形態では、その操作細胞集団の操作細胞は、ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇという表現型を有する。

【0165】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ヌクレアーゼベースの遺伝子編集を用いて操作されている。

【0166】

いくつかの実施形態では、その組成物は、医薬組成物である。

【0167】

いくつかの実施形態では、その組成物は、薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む。

【0168】

いくつかの実施形態では、その組成物は、凍結保護剤を含む。

【0169】

いくつかの実施形態では、その凍結保護剤は、ＤＭＳＯを約５％～約１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）という濃度で含む。

【0170】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、本明細書に記載の組成物のいずれかの組成物を含む容器である。

【0171】

いくつかの実施形態では、その容器は、滅菌バッグである。

【0172】

いくつかの実施形態では、その滅菌バッグは、凍結保存に適合している。

【0173】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、操作細胞を作製する方法であって、（ａ）供給源細胞で、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または消失させること、（ｂ）その供給源細胞で、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させること、ならびに（ｃ）その供給源細胞で、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下または消失させることを含む方法である。

【0174】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、対象で使用するための操作細胞を作製する方法であって、その対象が、自己免疫疾患であると疑われるか、または自己免疫疾患であり、その方法が、（ａ）供給源細胞で、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または消失させること、（ｂ）その供給源細胞で、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させること、ならびに（ｃ）その供給源細胞で、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下または消失させることを含む方法である。

【0175】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、対象で使用するための操作細胞を作製する方法であって、その対象が、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体を有すると判断され、その方法が、（ａ）供給源細胞で、ＭＨＣクラスＩ分子及び／またはＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または消失させること、（ｂ）その供給源細胞で、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させること、ならびに（ｃ）その供給源細胞で、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下または消失させることを含む方法である。

【0176】

いくつかの実施形態では、その方法は、対象が抗ＭＩＣＡ抗体を有する場合に、ＭＩＣＡの発現を低下または消失させること、任意にさらに、ＭＩＣＢの発現を低下または消失させることを含む。

【0177】

いくつかの実施形態では、その方法は、対象が抗ＭＩＣＢ抗体を有する場合に、ＭＩＣＢを低下または消失させること、任意にさらに、ＭＩＣＡの発現を低下または消失させることを含む。

【0178】

いくつかの実施形態では、その方法は、対象が抗ＭＩＣＡ抗体及び抗ＭＩＣＢ抗体を有する場合に、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現を低下または消失させることを含む。

【0179】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、対象で使用するための操作細胞を作製する方法であって、（ａ）供給源細胞で、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または消失させること、（ｂ）その供給源細胞で、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させること、ならびに（ｃ）個体が、あるポリペプチドを特異的に認識する抗体を有すると判断されたら、その供給源細胞で、そのポリペプチドの表面発現を低下または消失させることを含む方法である。

【0180】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯｌ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにこれらの組み合わせのいずれかからなる群から選択する。

【0181】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８、ならびにこれらの組み合わせのいずれかからなる群から選択する。

【0182】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子の少なくとも１つは、ＣＤ４７である。

【0183】

いくつかの実施形態では、その方法は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または消失させることを含む。

【0184】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、操作細胞を作製する方法であって、（ａ）供給源細胞で、ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の発現を増加させること、ならびに（ｂ）その供給源細胞で、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下させることを含む方法である。

【0185】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、操作細胞を作製する方法であって、（ｉ）（ａ）１つ以上のＭＨＣ Ｉ分子及び／または１つ以上のＭＨＣ ＩＩ分子の発現を低下させること、（ｂ）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下させること、（ｃ）ＣＤ４７、任意にＣＤ２４及びＰＤ－Ｌ１の発現を増加させること、ならびに（ｄ）ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＲ１の発現を増加させること、（ｉｉ）（ａ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させること、（ｂ）ＭＩＣ－Ａ及び／またはＭＩＣ－Ｂの発現を低下させること、（ｃ）ＴＸＮＩＰの発現を低下させること、（ｄ）ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡ－Ｅの発現を増加させること、ならびに（ｅ）任意に、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３及びＭＡＮＦの発現を増加させること、（ｉｉｉ）（ａ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の発現を増加させること、ならびに（ｂ）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下させること、（ｉｖ）（ａ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させること、ならびに（ｂ）ＣＤ４７の発現を増加させること、（ｖ）ある遺伝子の発現を増減させる追加の編集をさらに含む（ｉ）～（ｉｖ）のいずれかという組み合わせのいずれかの１つを含む方法である。

【0186】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、操作細胞を作製する方法であって、（ａ）１つ以上のＭＨＣ Ｉ分子をノックアウトすること、（ｂ）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢをノックアウトすること、（ｃ）ＴＸＮＩＰをノックアウトすること、ならびに（ｄ）ＰＤ－Ｌ１及びＨＬＡＥをノックインすることを含む方法である。

【0187】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているようないずれかの方法は、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３及びＭＡＮＦをノックインすることをさらに含む。

【0188】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているようないずれかの方法は、ＭＩＣＡの発現を低下または消失させることをさらに含み、その発現を低下または消失させることは、ＭＩＣＡタンパク質の発現を低下または消失させることを含む。

【0189】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているようないずれかの方法は、ＭＩＣＢの発現を低下または消失させることをさらに含み、その発現を低下または消失させることは、ＭＩＣＢタンパク質の発現を低下または消失させることを含む。

【0190】

いくつかの実施形態では、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現を低下または消失させることであり、その発現を低下または消失させることは、ＭＩＣＡタンパク質及びＭＩＣＢタンパク質の発現を低下または消失させることを含む。

【0191】

いくつかの実施形態では、発現を低下または消失させることは、細胞表面発現を低下または消失させることを含む。

【0192】

いくつかの実施形態では、発現を低下または消失させることは、該当遺伝子の活性を低下または消失させる改変を導入することを含む。

【0193】

いくつかの実施形態では、その改変は、遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊である。

【0194】

いくつかの実施形態では、その不活性化または破壊は、インデルを含む。

【0195】

いくつかの実施形態では、そのインデルは、その遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域のフレームシフト変異または欠失である。

【0196】

いくつかの実施形態では、その方法は、該当遺伝子の活性をノックアウトすることを含む。

【0197】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下または消失させる改変は、Ｂ２Ｍの改変である。

【0198】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下または消失させる改変は、ＣＩＩＴＡの改変である。

【0199】

いくつかの実施形態では、その改変は、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集を介して行う。

【0200】

いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものである。

【0201】

いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２からなる群から選択したＣａｓを含む。

【0202】

いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。

【0203】

いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、ｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。

【0204】

いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる改変は、その１つ以上の寛容原性因子をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを導入することを含む。

【0205】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリヌクレオチドは、その寛容原性因子の２つ以上をコードするマルチシストロニックなベクターである。

【0206】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子の少なくとも１つは、ＣＤ４７である。

【0207】

いくつかの実施形態では、その少なくとも１つのポリヌクレオチドは、その細胞のゲノムに組み込まれている。

【0208】

いくつかの実施形態では、その組み込みは、非標的挿入によるものである。

【0209】

いくつかの実施形態では、その組み込みは、レンチウイルスベクターを介して行う。

【0210】

いくつかの実施形態では、その組み込みは、標的ゲノム遺伝子座への標的挿入によるものである。

【0211】

いくつかの実施形態では、その組み込みは、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集と相同配向型修復を介して行う。

【0212】

いくつかの実施形態では、標的ゲノム遺伝子座は、ＭＩＣＡ遺伝子座、ＭＩＣＢ遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、ＴＲＢＣ遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座位、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、ＬＲＰ１遺伝子座、ＨＭＧＢ１遺伝子座、ＡＢＯ遺伝子座、ＲＨＤ遺伝子座、ＦＵＴ１遺伝子座及びＫＤＭ５Ｄ遺伝子座からなる群から選択する。

【0213】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているようないずれかの方法は、その操作細胞が所望の細胞種に分化するように、細胞分化技法を行うことをさらに含む。

【0214】

いくつかの実施形態では、その供給源細胞は、ドナー対象から単離する。

【0215】

いくつかの実施形態では、そのドナー対象は、単離時点に、健常であるか、または疾患もしくは病態である疑いがない。

【0216】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、本明細書に記載の方法を用いて作製した操作細胞である。

【0217】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、同種異系療法を用いて個体の病態を治療する方法であって、その個体に、本明細書に記載の操作細胞、本明細書に記載の操作細胞の集団、または本明細書に記載の組成物を投与することを含む方法である。

【0218】

いくつかの実施形態では、その病態は、疾患または細胞不全である。

【0219】

いくつかの実施形態では、その疾患は、ループス、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、セリアック病、グレーブス病、乾癬、大腸炎、１型糖尿病、全身性ループスエリテマトーデス、炎症性腸疾患、アジソン病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、自己免疫性血管炎及び悪性貧血からなる群から選択する。

【0220】

いくつかの実施形態では、その細胞不全は、造血系疾患もしくは造血系障害と関連するか、またはその疾患もしくは病態は、造血系の疾患もしくは障害である。

【0221】

いくつかの実施形態では、その造血系疾患または造血系障害は、骨髄異形成、再生不良性貧血、ファンコニ貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、鎌状赤血球症、ダイアモンドブラックファン貧血、シュワッハマンダイアモンド障害、コストマン症候群、慢性肉芽腫性疾患、副腎白質ジストロフィー、白血球接着不全症、血友病、サラセミア、βサラセミア、白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（骨髄）白血病（ＡＭＬ）、成人リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、慢性肉芽腫性疾患、チェディアック・東症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）またはＡＩＤＳである。

【0222】

いくつかの実施形態では、その細胞不全は、白血病もしくはミエローマと関連するか、またはその疾患もしくは病態は、白血病もしくはミエローマである。

【0223】

いくつかの実施形態では、その細胞不全は、自己免疫疾患もしくは自己免疫病態と関連するか、またはその疾患もしくは病態は、自己免疫疾患もしくは自己免疫病態である。

【0224】

いくつかの実施形態では、その自己免疫疾患または自己免疫病態は、急性播種性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗合成酵素症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ぶどう膜炎、バロー病、バロー同心円硬化症、ベーチェット症候群、ベルジェ病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、がん、キャッスルマン病、セリアック病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体成分２欠損症、脳動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、デゴス病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、びまん皮膚硬化型全身性強皮症、ドレスラー症候群、円板状ループスエリテマトーデス、湿疹、付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維性肺胞炎、胃炎、胃腸類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、炎症性脱髄性多発神経障害、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート・イートン筋無力症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ルー・ゲーリック病、ルポイド肝炎、ループスエリテマトーデス、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、ミラー・フィッシャー症候群、混合性結合組織病、限局性強皮症、ムッカ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、視神経脊髄炎、ニューロミオトニア、眼瘢痕性類天疱瘡、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、オード甲状腺炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、パーソネージ・ターナー症候群、周辺部ぶどう膜炎、天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲性脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、再発性多発性軟骨炎、ライター症候群、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スチル病、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、スウィート症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患、未分化脊椎関節症、血管炎、白斑またはウェゲナー肉芽腫症である。

【0225】

いくつかの実施形態では、その細胞集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／またはその誘導体を含む集団である。

【0226】

いくつかの実施形態では、その細胞不全は、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、神経変性疾患、神経変性病態、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、うつ病、神経精神障害発作もしくは筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と関連するか、またはその疾患または病態は、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、神経変性疾患、神経変性病態、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、うつ病、神経精神障害発作もしくは筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。

【0227】

いくつかの実施形態では、その細胞集団は、神経細胞及び／またはグリア細胞を含む集団である。

【0228】

いくつかの実施形態では、その個体は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体が循環血液中に存在する。

【0229】

いくつかの実施形態では、その個体は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体が持続的に存在する。

【0230】

いくつかの実施形態では、その個体は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在の原因となる自己免疫関連病態である。

【0231】

いくつかの実施形態では、その自己免疫関連病態は、橋本病である。

【0232】

いくつかの実施形態では、その自己免疫関連病態は、ループスである。

【0233】

いくつかの実施形態では、その自己免疫関連病態は、多発性硬化症である。

【0234】

いくつかの実施形態では、その個体は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在に基づき、その治療の対象に選ばれた。

【0235】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかの方法は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在に基づき、その個体をその治療の対象に選ぶことをさらに含む。

【0236】

いくつかの実施形態では、その個体を選ぶことは、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在をその個体において測定することをさらに含む。

【0237】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、同種異系療法を用いて個体の病態を治療する方法であって、（ａ）その個体の抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を判断すること（抗ＭＩＣＡ抗体陽性の状態により、その個体から得た血清試料に抗ＭＩＣＡ抗体が存在することが示され、抗ＭＩＣＢ抗体陽性の状態により、その個体から得た血清試料に抗ＭＩＣＢ抗体が存在することが示される）と、（ｂ）抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態に基づき、その個体に、本明細書に記載の操作細胞集団を含む組成物または本明細書に記載の組成物を投与することを含む方法であり、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態が陽性である場合には、その操作細胞集団は、ＭＩＣＡの発現の低下を含み、その抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その操作細胞集団は、ＭＩＣＢの発現の低下を含み、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態及びその抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その操作細胞集団は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下を含む。

【0238】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかの方法は、その個体の抗ＭＩＣＡ抗体の状態及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態に基づき、その個体をその治療の対象に選ぶことをさらに含む。

【0239】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかの方法は、その個体の抗ＭＩＣＡ抗体の状態及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を測定することをさらに含む。

【0240】

ある特定の態様では、本発明で提供するのは、同種異系療法を必要とする個体での使用に適する同種異系療法を特定する方法であって、その同種異系療法が、本明細書に記載の操作細胞集団を含む組成物または本明細書に記載の組成物を含み、その方法が、その個体の抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を判断して、その個体での使用に適する同種異系療法を特定することを含み、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態が陽性である場合には、その適する同種異系療法が、ＭＩＣＡの発現の低下を含む操作細胞集団を含み、その抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その適する同種異系療法が、ＭＩＣＢの発現の低下を含む操作細胞集団を含み、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態及びその抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その適する同種異系療法が、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下を含む操作細胞集団を含む方法である。

【0241】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のいずれかの方法は、１つ以上の免疫抑制剤をその個体に投与することをさらに含む。

【0242】

いくつかの実施形態では、その個体は、１つ以上の免疫抑制剤を投与されている。いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、小分子または抗体である。いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、副腎皮質ステロイド、プレドニゾン、メトトレキサート、金塩、スルファサラジン、抗マラリア剤、ブレキナル、レフルノミド、ミゾリビン、１５－デオキシスペルグアリン、６－メルカプトプリン、シクロホスファミド、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン、チモペンチン（チモシン－α）及び免疫抑制抗体からなる群から選択する。

【0243】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、シクロスポリンを含む。

【0244】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、ミコフェノール酸モフェチルを含む。

【0245】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、副腎皮質ステロイドを含む。

【0246】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、シクロホスファミドを含む。

【0247】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、ラパマイシンを含む。

【0248】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、タクロリムス（ＦＫ－５０６）を含む。

【0249】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、抗胸腺細胞グロブリンを含む。

【0250】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、１つ以上の免疫調節剤である。

【0251】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫調節剤は、小分子または抗体である。

【0252】

いくつかの実施形態では、その抗体は、ＩＬ－２受容体のｐ７５、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－６、ＩＧＦ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ５８、及びそれらのリガンドのいずれかに結合する抗体からなる群から選択した受容体またはリガンドの１つ以上に結合する。

【0253】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、その個体に、その操作細胞の投与前に投与するかまたは投与したことがある。

【0254】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、その個体に、その操作細胞の投与の少なくとも１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、７日前、８日前、９日前、１０日前、１１日前、１２日前、１３日前または１４日前に投与するかまたは投与したことがある。

【0255】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、その個体に、その操作細胞の投与の少なくとも１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、７週間前、８週間前、９週間前または１０週間以上前に投与するかまたは投与したことがある。

【0256】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、その個体に、その操作細胞の投与の少なくとも１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後または１４日後に投与するかまたは投与したことがある。

【0257】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、その個体に、その操作細胞の投与の少なくとも１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後または１０週間以上後に投与するかまたは投与したことがある。

【0258】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、その個体に、その操作細胞の１回目の投与と同じ日に投与するかまたは投与したことがある。

【0259】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、その個体に、その操作細胞の投与後に投与するかまたは投与したことがある。

【0260】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、その個体に、その操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の後に投与するかまたは投与したことがある。

【0261】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、その個体に、その操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の前に投与するかまたは投与したことがある。

【0262】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、その個体に、その操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の少なくとも１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、７日前、８日前、９日前、１０日前、１１日前、１２日前、１３日前または１４日前に投与するかまたは投与したことがある。

【0263】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、その個体に、その操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の少なくとも１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、７週間前、８週間前、９週間前または１０週間以上前に投与するかまたは投与したことがある。

【0264】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、その個体に、その操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の少なくとも１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後または１４日後に投与するかまたは投与したことがある。

【0265】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、その個体に、その操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の少なくとも１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後または１０週間以上後に投与するかまたは投与したことがある。

【0266】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の免疫抑制剤は、その操作細胞の改変を含まない免疫原性細胞の免疫拒絶を軽減する目的で投与される１つ以上の免疫抑制剤の投与量よりも低い投与量で投与する。

【0267】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、その操作細胞の殺傷を制御できる。

【0268】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチを含む。

【0269】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子または自殺スイッチは、薬物もしくはプロドラッグの存在下で、または選択的な外因性化合物によって活性化されると、制御細胞死を誘導する。

【0270】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子または自殺スイッチは、その操作細胞のアポトーシスを誘導できる誘導タンパク質である。

【0271】

いくつかの実施形態では、その操作細胞のアポトーシスを誘導できるその誘導タンパク質は、カスパーゼタンパク質である。

【0272】

いくつかの実施形態では、そのカスパーゼタンパク質は、カスパーゼ９である。

【0273】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子または自殺スイッチは、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシンによる活性化型のカスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択されている。

【0274】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子またはその自殺スイッチは、その１つ以上の免疫抑制剤をその個体に投与した後に活性化して、制御細胞死を誘導する。

【0275】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子またはその自殺スイッチは、その１つ以上の免疫抑制剤をその個体に投与する前に活性化して、制御細胞死を誘導する。

【0276】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子またはその自殺スイッチは、その操作細胞をその個体に投与した後に活性化して、制御細胞死を誘導する。

【0277】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子またはその自殺スイッチは、細胞毒性またはその個体に対するその他の悪影響が生じた場合に活性化して、制御細胞死を誘導する。

【0278】

いくつかの実施形態では、その方法は、その操作細胞集団の操作細胞を枯渇させる薬剤を投与することをさらに含む。

【0279】

いくつかの実施形態では、その操作細胞を枯渇させる薬剤は、その操作細胞の表面に発現したタンパク質を認識する抗体である。

【0280】

いくつかの実施形態では、その抗体は、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ及びＲＱＲ８を認識する抗体からなる群から選択する。

【0281】

いくつかの実施形態では、その抗体は、モガムリズマブ、ＡＦＭ１３、ＭＯＲ２０８、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－Ｒｌｌｂ、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、Ｈｕｌ４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕｌ４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－Ｒｌｌｃ及びこれらのバイオシミラーからなる群から選択する。

【0282】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかは、その操作細胞の表面上の１つ以上の寛容原性因子を認識する薬剤を投与することを含む。

【0283】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、その１つ以上の寛容原性因子を発現するように操作されている。

【0284】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７である。

【0285】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれかは、１つ以上の追加の治療剤をその個体に投与することをさらに含む。

【0286】

いくつかの実施形態では、その個体は、１つ以上の追加の治療剤を投与されたことがある。

【0287】

いくつかの実施形態では、その方法の治療有効性をモニタリングすることを含む。

【0288】

いくつかの実施形態では、その方法の予防有効性をモニタリングすることを含む。

【0289】

いくつかの実施形態では、その方法は、１つ以上の疾患症状が所望どおりに抑制されるまで繰り返す。

【0290】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているようないずれかの操作細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0291】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子または自殺スイッチは、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシンによる活性化型のカスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択されている。

【0292】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子または自殺スイッチ、及びその自殺遺伝子またはセーフティスイッチと関連する遺伝子は、その操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する。

【0293】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子または自殺スイッチ、及びその１つ以上の寛容原性因子は、その操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する。

【0294】

いくつかの実施形態では、そのバイシストロニックなカセットは、任意に、レンチウイルスベクターを用いてその外因性ポリヌクレオチドをその細胞に導入することによって、その操作細胞のゲノムに、非標的挿入によって組み込まれている。

【0295】

いくつかの実施形態では、そのバイシストロニックなカセットは、その細胞の標的ゲノム遺伝子座に、標的挿入によって組み込まれており、任意に、その標的挿入は、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集と相同配向型修復によるものである。

【0296】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７である。

【0297】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているような方法のいずれかは、本明細書に記載されているようないずれかの操作細胞を含み、その操作細胞は、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0298】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子は、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシンによる活性化型のカスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択されている。

【0299】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子または自殺スイッチ、及びその自殺遺伝子またはそのセーフティスイッチと関連する遺伝子は、その操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する。

【0300】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子または自殺スイッチ、及びその１つ以上の寛容原性因子は、その操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する。

【0301】

いくつかの実施形態では、そのバイシストロニックなカセットは、その操作細胞のゲノムに、非標的挿入によって組み込まれている。

【0302】

いくつかの実施形態では、そのバイシストロニックなカセットは、その操作細胞の標的ゲノム遺伝子座に、標的挿入によって組み込まれている。

【0303】

いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７である。

【0304】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているようないずれかの組成物は、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、操作細胞集団の操作細胞を含む。

【0305】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子または自殺スイッチは、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシンによる活性化型のカスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択されている。

【0306】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子、及びその自殺遺伝子またはそのセーフティスイッチと関連する遺伝子は、その操作細胞集団の操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する。

【0307】

いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子または自殺スイッチ、及びその外因性ＣＤ４７は、その操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する。

【0308】

いくつかの実施形態では、そのバイシストロニックなカセットは、任意に、レンチウイルスベクターを用いてその外因性ポリヌクレオチドをその操作細胞集団の操作細胞に導入することによって、そのゲノムに、非標的挿入によって組み込まれている。

【0309】

いくつかの実施形態では、そのバイシストロニックなカセットは、その操作細胞集団の操作細胞の標的ゲノム遺伝子座に、標的挿入によって組み込まれており、任意に、その標的挿入は、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集と相同配向型修復によるものである。

【0310】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているようないずれかの操作細胞、本明細書に記載されているような細胞の集団のいずれか、または本明細書に記載されているようないずれかの方法であって、その操作細胞が、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させるための１つ以上の改変を含み、その１つ以上の寛容原性因子のそれぞれが、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１インヒビター、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されているものである。

【0311】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、自家細胞である。

【0312】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、同種異系細胞である。

【図面の簡単な説明】

【0313】

【図1A】本明細書に記載の操作細胞の投与後に見られる可能性があるシナリオを示す。シナリオＩ、すなわち、１つ以上の細胞表面抗原（例えばＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢ）を発現するＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇの細胞であって、その１つ以上の細胞表面抗原に対する、宿主（レシピエント）内の既存の抗体（例えば、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体）の非存在下にある細胞を示している。

【図1B】本明細書に記載の操作細胞の投与後に見られる可能性があるシナリオを示す。シナリオＩＩ、すなわち、１つ以上の細胞表面抗原（例えばＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢ）を発現するＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇの細胞であって、その１つ以上の細胞表面抗原に対する、宿主（レシピエント）内の既存の抗体（例えば、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体）の存在下にある細胞を示している。

【図1C】本明細書に記載の操作細胞の投与後に見られる可能性があるシナリオを示す。シナリオＩＩＩ、すなわち、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現が低下しているＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇの細胞であって、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢに対する、宿主（レシピエント）内の既存の抗体（例えば、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体）の存在下にある細胞を示している。

【図2】未刺激状態及び刺激状態での未操作ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及びＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのヒトｉＰＳＣのＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現を示すフローサイトメトリープロットを示している。

【図3A】ヒト初代ＣＤ３＋ Ｔ細胞上のＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現を示すフローサイトメトリープロットを示している。

【図3B】初代膵島β細胞上のＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現を示すフローサイトメトリープロットを示している。

【図3C】ｉＰＳＣ由来膵島β細胞上のＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現を示すフローサイトメトリープロットを示している。

【図4A】図４Ａは、未操作のｉＰＳＣ由来間葉幹細胞（ＭＳＣ）及びＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのｉＰＳＣ由来ＭＳＣ上のＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現を示すフローサイトメトリープロットを示している。

【図4B】図４Ｂは、ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣ上のＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現を示すフローサイトメトリープロットを示している。

【図5】橋本病である個々のボランティア及び健常ボランティアから得た血清試料中の抗ＭＩＣＡ抗体の存在（Ａ）及び抗ＭＩＣＢ抗体の存在（Ｂ）を評価したウエスタンブロットを示している。（Ｍ）は、分子量マーカーを示している。

【図6A】橋本病である個々のボランティアから得た血清について、操作ＭＳＣを用いたドナー特異的抗体（ＤＳＡ）結合アッセイから得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）のプロットを示している。Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣ、及び橋本病である個々のボランティアから得た血清におけるＤＳＡの結果を示している。

【図6B】橋本病である個々のボランティアから得た血清において、操作ＭＳＣを用いたドナー特異的抗体（ＤＳＡ）結合アッセイから得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）のプロットを示している。ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣ及び橋本病である個々のボランティアから得た血清におけるＤＳＡの結果を示している。

【図6C】橋本病である個々のボランティアから得た血清において、操作ｉＰＳＣ細胞を用いたドナー特異的抗体（ＤＳＡ）結合アッセイから得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）のプロットを示している。ｉＰＳＣ（ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢの発現なし）及び橋本病である個々のボランティアから得た血清におけるＤＳＡの結果を示している。

【図6D】健常ボランティアから得た血清において、操作ＭＳＣを用いたドナー特異的抗体（ＤＳＡ）結合アッセイから得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）のプロットを示している。Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣ及び健常ボランティアから得た血清におけるＤＳＡの結果を示している。

【図6E】健常ボランティアから得た血清において、操作ＭＳＣを用いたドナー特異的抗体（ＤＳＡ）結合アッセイから得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）のプロットを示している。ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣ及び健常ボランティアから得た血清におけるＤＳＡの結果を示している。

【図7A】橋本病である個々のボランティアから得た血清における経時的な細胞溶解（正規化細胞指数によって記録したもの）のプロットを示している。

【図7B】健常ボランティアから得た血清における経時的な細胞溶解（正規化細胞指数によって記録したもの）のプロットを示している。

【図8】多発性硬化症である個々のボランティアから得た血清試料中の抗ＭＩＣＡ抗体の存在（Ａ）及び抗ＭＩＣＢ抗体の存在（Ｂ）を評価したウエスタンブロットを示している。（Ｍ）は、分子量マーカーを示している。

【図9A】多発性硬化症である個々のボランティアから得た血清について、操作ＭＳＣを用いたドナー特異的抗体（ＤＳＡ）結合アッセイから得た平均蛍光強度（ＭＦＩ）のプロットを示している。Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣ及び多発性硬化症である個々のボランティアから得た血清におけるＤＳＡの結果を示している。

【図9B】多発性硬化症である個々のボランティアから得た血清について、操作ＭＳＣ用いたドナー特異的抗体（ＤＳＡ）結合アッセイから得た平均蛍光強度（ＭＦＩ）のプロットを示している。ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣ及び多発性硬化症である個々のボランティアから得た血清におけるＤＳＡの結果を示している。

【図9C】多発性硬化症である個々のボランティアから得た血清について、操作ｉＰＳＣ細胞を用いたドナー特異的抗体（ＤＳＡ）結合アッセイから得た平均蛍光強度（ＭＦＩ）のプロットを示している。ｉＰＳＣ（ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢの発現なし）及び橋本病である個々のボランティアから得た血清におけるＤＳＡの結果を示している。

【図10A】多発性硬化症である個々のボランティアから得た血清における経時的な細胞溶解（正規化細胞指数によって記録したもの）のプロットを示している。

【図10B】多発性硬化症である個々のボランティアから得た血清における経時的な細胞溶解（正規化細胞指数によって記録したもの）のプロットを示している。

【図10C】多発性硬化症である個々のボランティアから得た血清及び健常ボランティアから得た血清における経時的な細胞溶解（正規化細胞指数によって記録したもの）のプロットを示している。

【図11】全身性ループスエリテマトーデスである個体から得た血清試料中の抗ＭＩＣＡ抗体の存在（Ａ）及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在（Ｂ）を評価したウエスタンブロットを示している。（Ｍ）は、分子量マーカーを示している。

【発明を実施するための形態】

【0314】

詳細な説明
本発明で提供するのは、いくつかの態様では、同種異系細胞療法のような同種異系移植に応答する免疫系反応の作用を緩和及び／または回避するための方法及び組成物である。本発明で開示するのは、細胞療法の免疫拒絶の問題を克服するために、免疫系を回避する能力を有する操作細胞（本明細書では、操作免疫回避細胞もしくは操作低免疫原性細胞ともいう）、その集団、またはその医薬組成物であって、いずれかの移植可能な細胞種の生存性供給源に当たるものである。本発明で提供する操作細胞の態様では、対象の遺伝子構成、あるいは１回以上の過去の同種異系移植、過去の自家キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔの拒絶、及び／または導入遺伝子を発現させる他の自家療法もしくは同種異系の療法に対する、その対象におけるいずれの既存の応答にもかかわらず、その操作細胞の投与後に、レシピエント対象の免疫系によるその細胞の拒絶を軽減するとともに、その操作細胞が、宿主において生着及び機能することができる。本明細書に記載の操作細胞は、いずれかの細胞に由来してよく、その細胞としては、膵島β細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、及び血液細胞（例えば、形質細胞または血小板）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、提供する操作初代細胞は、操作細胞（例えば、患者の生検標本など、生きた組織から直接採取した細胞）である。

【0315】

本明細書に教示されているように、ある特定の態様では、同種異系細胞療法は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢに対する改変を含め、低免疫原性多能性（ＨＩＰ）改変（複数可）の恩恵を受けることができる。本明細書に記載の細胞操作に有用な細胞の特徴付けに基づき、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現が特定されており、このような細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下させるような、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの改変（複数可）の恩恵を受けることになる。例えば、自己免疫障害である個体（または自己免疫障害と疑われる個体）は、本明細書に教示されている細胞療法から恩恵を受けることになる。本発明で提供する操作細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を変化（例えば低下または消失）させる改変（例えば遺伝子改変）、１つ以上の寛容原性因子（例えばＣＤ４７）の発現を変化（例えば過剰発現または増加）させる改変（例えば遺伝子改変）、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を変化（例えば低下または消失）させる改変（例えば遺伝子改変）を含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞に存在する改変は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの細胞表面発現を変化（例えば低下または消失）させ、１つ以上の寛容原性因子の細胞表面発現を変化（例えば増加または過剰発現）させ、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面発現を変化（例えば低下または消失）させ、例えば、その細胞表面上でのＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下、またはいくつかの事例では消失させ、その細胞表面上でのその１つ以上の寛容原性因子を増加または過剰発現させ、その細胞表面上での１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下、またはいくつかの事例では消失させる。提供する態様では、その発現の変化は、これらの改変を含まない同様の細胞、例えば、同じ細胞種の野生型もしくは未改変の細胞、または他の点では同じであるが、１つ以上の寛容原性因子、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を変化させるための本発明の改変が欠損している細胞と比べたものである。改変を細胞に導入して、発現を変化させる例示的な方法は、本明細書に記載されている。例えば、タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチド（すなわち導入遺伝子）の導入もしくは送達、または遺伝子を標的とするＤＮＡターゲティングドメインと転写活性化因子との融合タンパク質の導入もしくは送達などによって、遺伝子またはタンパク質を過剰発現させるか、またはその発現を増加させる様々な方法のいずれかを使用してよい。阻害性核酸（例えばＲＮＡｉ）の導入もしくは送達によるなど、遺伝子編集ではない方法、または標的化ヌクレアーゼシステム（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）の導入もしくは送達を伴う遺伝子編集方法を含め、遺伝子またはタンパク質の発現を低下または消失させる様々な方法のいずれかも使用してよい。いくつかの実施形態では、発現を低下または消失させる方法は、ヌクレアーゼベースの遺伝子編集技法を介したものである。

【0316】

いくつかの実施形態では、レアカッターエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼのシステム）を用いるゲノム編集技法を用いて、ヒト細胞内で、（例えば、重要な免疫遺伝子のゲノムＤＮＡを欠失させることによって）免疫遺伝子の発現を低下または消失させる。いくつかの実施形態では、そのゲノム編集技術は、ニッカーゼ、塩基編集、プライム編集及び遺伝子書き込みの使用を含む。ある特定の実施形態では、ゲノム編集技法または他の遺伝子調節技術を用いて、ヒト細胞内の寛容誘導（寛容原性）因子（例えばＣＤ４７）を挿入し、そのようにして、レシピエント対象に生着すると免疫認識を回避できる操作細胞を作製する。したがって、本発明で提供する操作細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢに影響を及ぼす１つ以上の遺伝子及び因子の発現が調節され（例えば、発現が低下または消失し）、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に影響を及ぼす１つ以上の遺伝子及び因子の発現が調節され（例えば、発現が低下または消失し）、ＣＤ４７のような寛容原性因子の発現が調節される（例えば、発現が増加または過剰発現する）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、レシピエント対象の免疫系を回避する。

【0317】

いくつかの態様では、本発明で提供する操作細胞は、自然免疫細胞による拒絶または適応免疫細胞による拒絶の対象ではない（例えば低免疫原性細胞）。例えば、いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＮＫ細胞の媒介による溶解、及びマクロファージによる貪食の作用を受けない。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、免疫抑制剤をあまりまたは全く必要とせずにレシピエント対象に移植されるユニバーサルに適合する細胞または組織（例えば、ユニバーサルドナー細胞またはユニバーサルドナー組織）の供給源として有用である。このような低免疫原性細胞は、移植時に、細胞特有の特性及び特徴を保持する。

【0318】

本開示は、少なくとも部分的に、その操作細胞上での１つ以上の細胞表面抗原に対する既存抗体（及び／または操作細胞の循環寿命中に、その操作細胞を投与されている個体で出現する抗体）を有する個体に投与するのに有用な細胞の操作に関する、本発明者の知見及び特有の見方に基づいている。具体的には、本発明で開示するのは、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）及び／またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）の発現、例えば細胞表面発現が低下（消失を含む）している操作細胞である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡの発現の低下、例えば消失を含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢの発現の低下、例えば消失を含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下、例えば消失を含む。このような操作は、その個体において、その操作細胞に対して免疫応答が誘発されるのを回避するのを助ける。さらに、これらの知見は、本発明で提供する追加の開示内容、例えば、患者及び／または治療の選択の土台となる。

【0319】

本発明で提供する操作細胞はさらに、寛容原性因子の過剰発現を利用するとともに、１つ以上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）分子もしくはその構成要素、及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（ＭＨＣクラスＩＩ）分子の発現（例えば表面発現）を調節する（例えば、低下または消失させる）ことができる。いくつかの実施形態では、レアカッターエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼのシステム）を用いるゲノム編集技法を用いて、ヒト細胞内で、（例えば、重要な免疫遺伝子のゲノムＤＮＡを欠失させることによって）免疫遺伝子の発現を低下または消失させる。ある特定の実施形態では、ゲノム編集技法または他の遺伝子調節技術を用いて、ヒト細胞内の寛容誘導（寛容原性）因子（例えばＣＤ４７）を挿入し、そのようにして、レシピエント対象に生着すると免疫認識を回避できる操作細胞を作製する。したがって、本発明で提供する操作細胞は、上記のＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの調節に加えて、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に影響を及ぼす１つ以上の遺伝子及び因子の発現が調節されて、レシピエント対象の免疫系を回避する。いくつかの事例では、その細胞は、Ｔ細胞であり、その細胞は、内在性ＴＣＲの発現を調節する（例えば、低下または消失させる）ようにも操作されている。

【0320】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、その細胞が免疫認識を回避可能になる機構を呈する。いくつかの実施形態では、提供する操作細胞は、低免疫原性である。いくつかの態様では、本発明で提供する操作細胞は、自然免疫細胞による拒絶の対象ではない。例えば、いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＮＫ細胞の媒介による溶解、及びマクロファージによる貪食の作用を受けない。いくつかの実施形態では、本発明の操作初代細胞は、免疫抑制剤をあまりまたは全く必要とせずにレシピエント対象に移植されるユニバーサルに適合する細胞または組織（例えば、ユニバーサルドナー細胞またはユニバーサルドナー組織）の供給源として有用である。このような低免疫原性細胞は、移植時に、細胞特有の特性及び特徴を保持する。

【0321】

すなわち、いくつかの態様では、本発明で提供するのは、（ａ）ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）ポリペプチドの細胞表面発現の低下、及び（ｂ）ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）ポリペプチドの細胞表面発現の低下のいずれか１つまたは両方を含む操作細胞であり、その操作細胞は、（ｃ）１つ以上の寛容原性因子（ＣＤ４７など）の発現（該当する場合には、細胞表面発現を含む）の増加をさらに含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）分子もしくはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面発現の低下、及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面発現の低下をさらに含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、寛容原性因子、例えば、ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の１つ以上の発現の増加をさらに含む。いくつかの実施形態では、発現の低下は、発現を低下させるように操作する前の発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、発現の低下は、参照細胞または参照細胞集団（免疫原性応答が低下または消失している同じ細胞種または細胞の細胞または集団）の発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、発現の低下は、測定した発現レベル（免疫原性応答が低下または消失していると分かっているレベルなど）の約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、発現の増加は、発現を増加させるように操作する前の発現レベルの約４０％以上であるレベルまで上昇する。いくつかの実施形態では、発現の増加は、参照細胞または参照細胞集団（免疫原性応答が低下または消失している同じ細胞種または細胞の細胞または集団など）の発現レベルの約４０％以上であるレベルまで上昇する。いくつかの実施形態では、発現の増加は、測定した発現レベル（免疫原性応答が低下または消失していると分かっているレベルなど）の約４０％以下であるレベルまで上昇する。

【0322】

別の態様では、本発明で提供するのは、（ａ）ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）及び／またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）の発現を低下させる改変、（ｂ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる改変、ならびに（ｃ）１つ以上の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子もしくはその構成要素、及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる改変の１つ以上を含む操作細胞であり、その発現の変化は、その１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べたものである。

【0323】

別の態様では、本発明で提供するのは、（ａ）ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）及び／またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）の発現を低下させる改変、ならびに（ｂ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の発現を増加させる改変の１つ以上を含む操作細胞であり、その発現の変化は、その１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べたものである。

【0324】

別の態様では、本発明で提供するのは、本明細書に記載のいずれかの操作細胞の集団である。いくつかの実施形態では、その集団は、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれが、その改変を有することを特徴とする。

【0325】

別の態様では、本発明で提供するのは、本明細書に記載のいずれかの操作細胞集団を含む組成物である。いくつかの実施形態では、その組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施形態では、その組成物は、凍結保護剤を含む。

【0326】

別の態様では、本発明で提供するのは、操作細胞を作製する方法であって、供給源細胞に、（ａ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または消失させる改変、（ｂ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる改変、ならびに（ｃ）ＭＩＣＡの発現を低下もしくは消失させる改変、及び／またはＭＩＣＢの発現を低下もしくは消失させる改変を導入することを含む方法である。

【0327】

別の態様では、本発明で提供するのは、同種異系療法を用いて、個体（本明細書では同義的に対象ともいう）の病態を治療する方法であって、その個体に、本明細書に記載のいずれかの操作細胞集団、または本明細書に記載のいずれかの組成物を投与することを含む方法である。いくつかの実施形態では、その個体は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体が循環血液中に存在する。いくつかの実施形態では、その個体は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在に基づき、その治療の対象に選ばれた。いくつかの実施形態では、その方法は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在に基づき、その個体をその治療の対象に選ぶことをさらに含む。

【0328】

別の態様では、本発明で提供するのは、同種異系療法を用いて個体の病態を治療する方法であって、（ａ）その個体の抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を判断すること（抗ＭＩＣＡ抗体陽性の状態により、その個体から得た血清試料に抗ＭＩＣＡ抗体が存在することが示され、抗ＭＩＣＢ抗体陽性の状態により、その個体から得た血清試料に抗ＭＩＣＢ抗体が存在することが示される）と、（ｂ）抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態に基づき、その個体に、本明細書に記載のいずれかの操作細胞集団を含む組成物、または本明細書に記載のいずれかの組成物を投与することを含む方法であり、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態が陽性である場合には、その操作細胞集団は、ＭＩＣＡの発現の低下を含み、その抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その操作細胞集団は、ＭＩＣＢの発現の低下を含み、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態及びその抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その操作細胞集団は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下を含む。

【0329】

別の態様では、本発明で提供するのは、同種異系療法を必要とする個体での使用に適する同種異系療法を特定する方法であって、その同種異系療法が、本明細書に記載のいずれかの操作細胞集団を含む組成物、または本明細書に記載のいずれかの組成物を含み、その方法が、その個体の抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を判断して、その個体での使用に適する同種異系療法を特定することを含み、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態が陽性である場合には、その適する同種異系療法が、ＭＩＣＡの発現の低下を含む操作細胞集団を含み、その抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その適する同種異系療法が、ＭＩＣＢの発現の低下を含む操作細胞集団を含み、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態及びその抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その適する同種異系療法が、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下を含む操作細胞集団を含む方法である。

【0330】

本発明で提供するのは、障害を治療する方法であって、ＭＨＣが一致しない同種異系レシピエントで免疫拒絶を回避する操作細胞（例えば操作初代細胞）を投与することを含む方法でもある。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法のいずれか１つから作製した操作細胞は、ＭＨＣが一致しない同種異系レシピエントに繰り返し投与した（例えば、移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ）または移植（ｇｒａｆｔｅｄ）した）ときに、免疫拒絶を回避する。

【0331】

特定の実施形態の実施では、特に反対の指示がない限り、当該技術分野の技術の範囲内である化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法、遺伝学、免疫学及び細胞生物学の従来の方法が用いられることになり、これらのうちの多くが、例示目的で下記に記載されている。このような技法は、文献で十分説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ Ｊｕｌｙ ２００８）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、及びＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの刊行物におけるモノグラフを参照されたい。

【0332】

本願で言及されている特許文献、科学記事及びデータベースを含むすべての刊行物は、それぞれの刊行物が参照により個別に援用される場合と同程度に、参照により、その全体があらゆる目的のために本明細書に援用される。本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に援用される特許、出願、公開出願及び他の刊行物に記載の定義に反するか、またはその定義と別段に矛盾する場合、本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に援用される定義よりも優先される。

【0333】

本明細書で使用されているセクション見出しは、単に構成目的のものであり、記載されている主題を限定するものと解釈すべきではない。当業者は、いくつかの実施形態が、本開示の範囲及び趣旨の中で可能であると認識するであろう。以下の説明は、本開示を例示するものであり、当然のことながら、いかなる形でも、本明細書に記載の本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。

【0334】

Ｉ．定義
別段の定義のない限り、本明細書で使用されている、当該技術分野の用語、表記、ならびに他の技術的及び科学的用語または専門用語はいずれも、請求する主題に関係する当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有するように意図されている。いくつかの事例では、一般的に理解される意味を有する用語は、明瞭化及び／または参照のしやすさのために本明細書で定義されており、このような定義が本明細書に含まれているのは、当技術分野において一般に理解されている意味と実質的に異なる意味を示すとは必ずしも解釈すべきではない。

【0335】

量または濃度などの測定可能な値に言及しているときに本明細書で使用されているような「約」という用語には、示されている量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％またはさらには０．１％の変動が含まれるように意図されている。添付の請求項を含め、本明細書で使用する場合、文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、「ａ」「ｏｒ」及び「ｔｈｅ」という単数形には、複数形の指示対象が含まれる。例えば、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。本明細書に記載の態様及び変形形態には、そのような態様及び変形形態「からなる」か、及び／またはそのような態様及び変形形態「から本質的になる」実施形態が含まれることが理解される。

【0336】

本明細書で使用する場合、「及び／または」という用語には、列挙されている関連項目の１つ以上からなるいずれかの組み合わせ及びあらゆる組み合わせが含まれる。

【0337】

本明細書で使用する場合、「外因性」という用語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関しては、指示対象の分子が、目的の細胞に導入されることを意味するように意図されている。外因性ポリヌクレオチドのような外因性分子は、例えば、外因性のコード核酸をその細胞の遺伝物質に導入することによって、例えば、染色体に組み込むことによって、またはプラスミドもしくは発現ベクターのような非染色体の遺伝物質として導入できる。したがって、コード核酸の発現に関して用いられているようなその用語は、そのコード核酸を発現可能な形態で細胞に導入することを指す。いくつかの事例では、「外因性」分子は、通常は細胞に存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法または他の方法によって細胞に導入できる分子、コンストラクト、因子などである。

【0338】

「内在性」という用語は、指示対象の分子、例えば、ポリヌクレオチド（例えば遺伝子）またはポリペプチドのうち、天然型または未改変の細胞に存在する分子を指す。例えば、内在性遺伝子の発現に関して用いられているときのその用語は、細胞内に含まれるとともに、外因性に導入されていない内在性核酸によってコードされる遺伝子の発現を指す。

【0339】

「遺伝子」には、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、及び遺伝子産物の産生を調節するすべてのＤＮＡ領域が含まれ、このような調節配列は、コード配列及び／または転写配列に隣接するか否かは問わない。したがって、必ずしも以下に限定されないが、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位及び座位制御領域が含まれる。遺伝子配列は典型的には、細胞内で、一定の染色体位置または染色体座位に存在する。

【0340】

「座位」という用語は、特定の遺伝子または遺伝子マーカーが位置している、染色体上の一定の位置を指す。「標的座位」という場合、所望の遺伝子の座位のうち、遺伝子改変、例えば、遺伝子編集または外因性ポリヌクレオチドの組み込みの標的とするのが望ましい特定の座位を指す。

【0341】

遺伝子に関する「発現」、または「遺伝子発現」という用語は、遺伝子に含まれる情報が遺伝子産物に変換されることを指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡもしくはいずれかの他の種類のＲＮＡ）であることもできるし、またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であることもできる。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化及び編集などのプロセスによって修飾されているＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリストイル化及び糖鎖付加によって修飾されたタンパク質も含まれる。すなわち、発現または遺伝子発現という場合には、タンパク質（もしくはポリペプチド）の発現、または遺伝子の転写可能な産物、例えばｍＲＮＡの発現が含まれる。タンパク質の発現には、タンパク質の細胞内発現または表面発現を含めてよい。典型的には、遺伝子産物、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質の発現は、細胞内で検出可能であるレベルでの発現である。

【0342】

本明細書で使用する場合、「検出可能な」発現レベルは、当業者に知られている標準的な技法によって検出可能であるレベルを意味し、その技法としては、例えば、ディファレンシャルディスプレイ、ＲＴ（逆転写酵素）－ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ノーザンブロット及び／またはＲＮａｓｅプロテクションによる解析、ならびにタンパク質の検出では、免疫親和性ベースの方法、例えば、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットが挙げられる。発現レベルの程度は、標準的な特性評価技法を介して可視化または測定するのに十分な大きさでありさえすればよい。

【0343】

本明細書で使用する場合、「発現の増加」、「発現の増強」または「過剰発現」という用語は、特定の遺伝子発現を調節するための改変を含まない元の細胞または供給源細胞での発現、例えば、野生型の発現レベル（発現が見られないか、または発現が測定不能であることもできる）に追加されたいずれかの形態の発現を意味する。本明細書で、「発現の増加」、「発現の増強」または「過剰発現」という場合には、改変を含まない細胞、例えば、改変を導入するために操作する前の元の供給源細胞、例えば、未改変細胞または野生型細胞のレベルと比べた場合の遺伝子発現の増加、及び／または、ポリペプチドについて言う場合に限っては、ポリペプチドレベルの上昇及び／またはポリペプチド活性の向上を意味するとみなす。発現の増加、ポリペプチドレベルの上昇、またはポリペプチド活性の向上は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％もしくは１００％、またはさらには１００％超であることができる。いくつかの事例では、発現の増加、ポリペプチドレベルの上昇、またはポリペプチド活性の向上は、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍または２００倍以上であることができる。

【0344】

「低免疫原性」という用語は、その細胞を移植される対象に免疫拒絶される傾向が低めである細胞を指す。このような低免疫原性細胞は、例えば、同じ細胞種であるが、改変を含まない同様の細胞、例えば、未変化または未改変の野生型細胞と比べて、その細胞を移植される対象に免疫拒絶される傾向が、約２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％または９９％以上低くてもよい。典型的には、その低免疫原性細胞は、その対象に対して同種異系であり、低免疫原性細胞は、ＭＨＣが一致しない同種異系レシピエントにおいて、免疫拒絶を回避する。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、Ｔ細胞の媒介による適応免疫からの拒絶及び／または自然免疫細胞からの拒絶から保護される。

【0345】

細胞の低免疫原性は、その細胞の免疫原性、例えば、細胞が、適応免疫応答及び自然免疫応答を誘発する能力を評価することによって求めることができる。このような免疫応答は、当業者に認識されているアッセイを用いて測定できる。

【0346】

本明細書で使用されているような「寛容原性因子」という用語には、細胞が、投与、移植または生着の際に、宿主またはレシピエント対象の免疫系によって認識される能力を調節するか、またはその能力に影響を及ぼす免疫抑制因子または免疫調節因子が含まれる。典型的には、寛容原性因子は、操作初代細胞に対して免疫寛容を誘導して、その操作初代細胞が、レシピエントの宿主免疫系の標的とならないように、例えば、その免疫系によって拒絶されないようにする因子である。すなわち、寛容原性因子は、低免疫因子であってよい。寛容原性因子の例としては、免疫細胞抑制受容体（例えばＣＤ４７）、免疫細胞抑制受容体に関与するタンパク質、チェックポイント阻害剤、及び自然免疫または適応免疫による認識を低減するその他の分子が挙げられる。

【0347】

「減少する」、「低下した」、「低下」及び「減少」という用語はいずれも、本明細書では概して、統計的に有意な量で減少することを意味する。しかしながら、疑問を避けるために、「減少する」、「低下した」、「低下」、「減少」は、参照レベルと比べて少なくとも１０％減少すること、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％もしくは少なくとも約９０％減少すること、または１００％以下減少すること（すなわち、参照試料と比べた場合の消失レベル）、あるいは、参照レベルと比べて、１０～１００％のいずれか減少することを意味する。

【0348】

「増加した」、「増加する」、「増強する」または「活性化する」という用語はいずれも、本明細書では概して、統計的に有意な量で増加することを意味し、いずれかの疑問を避けるために、「増加した」、「増加する」、「増強する」または「活性化する」という用語は、参照レベルと比べて少なくとも１０％増加すること、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％もしくは少なくとも約９０％増加すること、または１００％以下増加すること、あるいは参照レベルと比べて１０～１００％のいずれか増加すること、あるいは参照レベルと比べて、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍もしくは少なくとも約１０倍増加すること、または２倍～１０倍以上のいずれか増加することを意味する。

【0349】

本明細書で使用する場合、「改変」という用語は、細胞内での変更または変化のうち、その細胞内での遺伝子発現に影響を及ぼすいずれかの変更または変化を指す。いくつかの実施形態では、その改変は、遺伝子編集、変異誘発、または外因性ポリヌクレオチドもしくは導入遺伝子の遺伝子操作によるなどして、細胞内でタンパク質産物をコードする遺伝子またはその調節エレメントを直接変更する遺伝子改変である。

【0350】

本明細書で使用する場合、「インデル」とは、ゲノムでの、ヌクレオチド塩基の挿入、欠失またはそれらの組み合わせに起因する変異を指す。すなわち、インデルは典型的には、ヌクレオチドを配列に挿入するか、または配列から欠失させる。当業者には理解されるように、ゲノム配列のコード領域におけるインデルは、インデルの長さが３の倍数でない限り、フレームシフト変異をもたらすことになる。本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、標的ポリヌクレオチド配列に、いずれかの長さのインデルを誘導できる。

【0351】

いくつかの実施形態では、その変化は、点変異である。本明細書で使用する場合、「点変異」とは、ヌクレオチドの１つを置き換える置換を指す。本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、標的ポリヌクレオチド配列に、いずれかの長さのインデル、または点変異を誘導できる。

【0352】

本明細書で使用する場合、「ノックアウト」には、標的ポリヌクレオチド配列の機能を妨げる形で、その標的ポリヌクレオチド配列の全部または一部を欠失させることが含まれる。例えば、ノックアウトは、標的ポリヌクレオチド配列の機能ドメイン（例えばＤＮＡ結合ドメイン）内の標的ポリヌクレオチド配列にインデルを誘導することにより、標的ポリヌクレオチド配列を変化させることによって行うことができる。本明細書に記載の詳細に基づき、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトする方法を当業者は容易に理解するであろう。

【0353】

いくつかの実施形態では、その変化により、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部がノックアウトされる。本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、標的ポリヌクレオチド配列またはその一部をノックアウトすることは、様々な用途に有用であることがある。例えば、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、研究目的のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。ｅｘ ｖｉｖｏの目的では、細胞内の標的ポリヌクレオチド配列のノックアウトは、（例えば、細胞内の変異アレルをｅｘ ｖｉｖｏでノックアウトし、ノックアウトした変異アレルを含むそれらの細胞を対象に導入することによって、）その標的ポリヌクレオチド配列の発現と関連する障害を治療または予防するのに有用であることがある。

【0354】

本明細書における「ノックイン」とは、遺伝子機能を宿主細胞に追加するプロセスを意味する。これにより、ノックインされた遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはコードされるタンパク質のレベルが上昇する。当業者には理解されるように、これは、追加の遺伝子コピーを宿主細胞に１つ以上追加すること、または内在性遺伝子の調節構成要素を変化させることにより、産生されるタンパク質の発現を増加させることを含め、いくつかの方法で行うことができる。これは、プロモーターを改変すること、異なるプロモーターを付加すること、エンハンサーを付加すること、または他の遺伝子発現配列を改変することによって行ってもよい。

【0355】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変化または改変により、標的ポリヌクレオチド配列または選択したポリヌクレオチド配列の発現が低下する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変化または改変により、標的ポリペプチド配列または選択したポリペプチド配列の発現が低下する。

【0356】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変化または改変により、標的ポリヌクレオチド配列または選択したポリヌクレオチド配列の発現が増加する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変化または改変により、標的ポリペプチド配列または選択したポリペプチド配列の発現が増加する。

【0357】

遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の発現レベルの変更を指す。発現の調節としては、遺伝子の活性化及び遺伝子の抑制を挙げることができるが、これらに限定されない。調節は、完全な調節であってもよく、例えば、その場合、遺伝子発現は、完全に不活性化するか、もしくは野生型レベル以上に活性化し、または調節は、部分的な調節であってもよく、その場合、遺伝子発現は、部分的に低下するか、もしくは野生型レベルの数分の１だけ部分的に活性化する。

【0358】

「機能可能に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）連結された」または「機能可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）連結された」という用語は、２つ以上の構成要素（配列エレメントなど）の並置のうち、その両方の構成要素が正常に機能するとともに、それらの構成要素の少なくとも１つが、他方の構成要素の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介できるように、それらの構成要素が配列されている並置に関して同義的に用いられている。一例として、プロモーターなどの転写調節配列が、コード配列の転写レベルを、１つ以上の転写調節因子の有無に応じて制御する場合には、その転写調節配列は、そのコード配列に機能可能に連結されている。転写調節配列は概して、転写調節配列とシスで、機能可能に連結されているが、その配列と直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、コード配列に機能可能に連結されている転写調節配列であるが、それらの配列は連続していない。

【0359】

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、ペプチド結合によって結合した一連のアミノ酸残基（すなわち、アミノ酸残基からなるポリマー）を指す目的で同義的に用いてよく、最小長に限定されない。このようなポリマーは、天然もしくは非天然のアミノ酸残基、またはそれらの組み合わせを含んでよく、このポリマーとしては、アミノ酸残基からなるペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体及び多量体が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、タンパク質またはポリペプチドとしては、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化アミノ酸、糖化アミノ酸、糖鎖付加アミノ酸など）及びアミノ酸類似体を有するものが挙げられる。この定義には、完全長のポリペプチドまたはタンパク質、及びその断片が含まれる。これらの用語には、それらが修飾された種、例えば、１つ以上の残基の翻訳後修飾、例えば、メチル化、リン酸化、糖鎖付加、シアル化またはアセチル化も含まれる。

【0360】

本開示の全体を通じて、特許請求する主題の様々な態様が、様々な形式で示されている。様々な形式の説明は、便宜上及び簡略化のためのものに過ぎず、特許請求する主題の範囲に対して、柔軟性なく制限を加えるものとして解釈すべきではないことを理解すべきである。したがって、範囲の記載は、具体的に開示されているすべての考え得るサブ範囲、及びその範囲内の個々の数値を有するとみなすべきである。例えば、値の範囲が示されている場合には、その範囲の上限と下限との間にあるそれぞれの中間の値（文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、その下限の単位の１０分の１まで）、及びいずれかの他に示されている値またはその示されている範囲における中間の値が、本開示内に含まれ、ただし、示されている範囲内の限界値が具体的に除外される場合もあることが理解される。示されている範囲に、限界値の一方または両方が含まれる場合には、それらの含まれる限界値のいずれかまたは両方を除く範囲も、本開示に含まれる。いくつかの実施形態では、２つの対立するオープンエンドの範囲が、ある特徴に対して示されており、そのような説明においては、これらの２つの範囲の組み合わせが、本発明で提供されていると想定する。例えば、いくつかの実施形態では、ある特徴が、約１０単位超であると記載されており、その特徴が、約２０単位未満であると（別の文などで）記載されており、したがって、本明細書では、約１０単位～約２０単位の範囲が記載されている。

【0361】

本明細書で使用する場合、「対象」または「個体」は、同義的に用いられている用語であり、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、「哺乳動物」には、ヒト、非ヒト霊長類動物、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、スポーツまたはペットの動物、例えば、イヌ、ウマ、ウサギ、ウシ、ブタ、ハムスター、アレチネズミ、マウス、フェレット、ラット、ネコ、サルなどが含まれる。いくつかの実施形態では、その対象または個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、その対象は、疾患、障害または病態であると知られているか、それと疑われる患者である。

【0362】

本明細書で使用する場合、「治療すること」及び「治療」という用語には、対象に、本明細書に記載の細胞を有効量投与して、その対象で、その疾患の症状の少なくとも１つの軽減、またはその疾患の改善、例えば、有益な臨床結果または所望の臨床結果が見られるようにすることが含まれる。本技術の目的において、有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、検出可能か検出不能かにかかわらず、１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の低減、安定した（例えば、悪化していない）病状、疾患進行の遅延または減速、病状の改善または一時的緩和、及び寛解（部分寛解か完全寛解かにかかわらない）が挙げられるが、これらに限定されない。治療することは、治療を受けない場合に予想される生存期間と比べて、生存期間が延びることを指すことができる。したがって、治療は、病状を改善し得るが、その疾患の完全治癒ではないことがあることを当業者は認識している。いくつかの実施形態では、疾患または障害の症状の１つ以上は、その疾患の治療により、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％緩和される。

【0363】

本技術の目的において、疾患の治療の有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、検出可能か検出不能かにかかわらず、１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の低減、安定した（例えば、悪化していない）疾患状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または一時的緩和、及び寛解（部分寛解か完全寛解かにかかわらない）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0364】

「ベクター」または「コンストラクト」は、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる。典型的には、「ベクターコンストラクト」、「発現ベクター」及び「遺伝子移入ベクター」とは、目的の遺伝子の発現を誘導できるとともに、遺伝子配列を標的細胞に移入できるいずれかの核酸コンストラクトを意味する。したがって、この用語には、クローニング及び発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターが含まれる。ベクターまたはコンストラクトを細胞に導入するための方法は、当業者に知られており、脂質の媒介による移入（例えば、中性脂質及びカチオン性脂質を含むリポソーム）、エレクトロポレーション、直接注入、細胞融合、粒子ボンバードメント、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ－デキストランの媒介による移入、ならびにウイルスベクターの媒介による移入が挙げられるが、これらに限定されない。

【0365】

ＩＩ．操作細胞及び細胞の操作方法
本発明で提供するのは、ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）及び／またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）の発現を調節する１つ以上の改変（遺伝子改変など）を含む操作細胞である。いくつかの実施形態では、その改変は、ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現を低下させる（例えば消失させる）。いくつかの実施形態では、その改変は、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現を低下させる（例えば消失させる）。いくつかの実施形態では、その１つ以上の改変は、ＭＩＣＡポリペプチド及びＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現を低下させる（例えば消失させる）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、本明細書に記載されているような追加の改変を１つ以上含む。

【0366】

例示目的であり、本明細書に記載の範囲を限定するものと解釈すべきではないが、図１Ａ～１Ｃには、本明細書に記載の操作細胞を用いたときに見られると思われるシナリオが示されている。図１Ａには、シナリオＩ、すなわち、宿主（レシピエント）内の既存の抗体のうち、１つ以上の細胞表面抗原（例えば、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢ）に対する抗体（例えば、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体）の非存在下における、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇの細胞であって、その１つ以上の細胞表面抗原を発現している細胞が例示されている。Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}及びＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}は、その細胞表面上で、１つ以上の機能的なＭＨＣクラスＩ分子を低下させて（ブロックするなど）、ＭＨＣクラスＩ分子の媒介による免疫応答を阻止し、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させて（ブロックするなど）、ＭＨＣクラスＩＩ分子の媒介による免疫応答を阻止する。ＣＤ４７の発現の増加（過剰発現など）は、ＮＫ及びマクロファージの媒介による免疫応答を低下させる。いくつかの実施形態では、シナリオ１に示されているように、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢを発現するとともに、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇの改変を含む操作細胞の移植は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢに対する既存の抗体が欠損している患者に適する。図１Ｂには、シナリオＩＩ、すなわち、宿主（レシピエント）内の既存の抗体であって、１つ以上の細胞表面抗原（例えば、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢ）に対する抗体（例えば、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体）の存在下における、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇの細胞であって、その１つ以上の細胞表面抗原を発現する細胞が示されている。いくつかの実施形態では、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢに対する既存の抗体は、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇの細胞によって発現されたＭＩＣＡ抗原及び／またはＭＩＣＢ抗原に対して免疫応答を誘発し得る。このような状況では、同種異系療法の有用性が制限される。図１Ｃには、シナリオＩＩＩ、すなわち、宿主（レシピエント）内の既存の抗体であって、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢに対する抗体（例えば、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体）の存在下における、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇの細胞であって、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現が低下した細胞が例示されている。いくつかの実施形態では、患者が、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢに対する抗体を有するかまたはその抗体を有すると疑われる場合には、移植用細胞は、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇに加えて、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下または消失させるように改変して、その細胞が、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体を介した免疫応答の誘発を回避するようにする。いくつかの実施形態では、移植用細胞は、その細胞がＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢを発現するかに基づき、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇに加えて、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下または消失させるように改変し、例えば、ＭＩＣＡを発現しない細胞は、ＭＩＣＡの発現を低下させる改変を必要としない。

【0367】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、（ａ）ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現の低下、及び（ｂ）ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現の低下のいずれか１つまたは両方を含み、その操作細胞は、（ｃ）１つ以上の寛容原性因子（ＣＤ４７など）の発現（該当する場合には、細胞表面発現を含む）の増加をさらに含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子もしくはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面発現の低下、及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面発現の低下をさらに含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、（ａ）ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現の低下、及び（ｂ）ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現の低下のいずれか１つまたは両方を含み、その操作細胞は、（ｃ）１つ以上の寛容原性因子（ＣＤ４７など）の発現（該当する場合には、細胞表面発現を含む）の増加、（ｄ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現の低下、及び（ｅ）１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面発現の低下をさらに含む。

【0368】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、（ａ）ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現の低下、及び（ｂ）ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現の低下のいずれか１つまたは両方を含み、その操作細胞は、（ｃ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の１つ以上の発現の増加をさらに含む。

【0369】

いくつかの実施形態では、提供する操作細胞は、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させるための改変を含む。いくつかの実施形態では、その寛容原性因子は、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ３５、ＣＤ５２、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ及びＨ２－Ｍ３（これらの組み合わせのいずれかを含む）の１つ以上である。いくつかの実施形態では、その寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８（これらの組み合わせのいずれかを含む）の１つ以上である。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させるための改変は、ＣＤ４７の発現の増加であるか、またはその増加を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させるための改変は、ＰＤ－Ｌ１の発現の増加であるか、またはその増加を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させるための改変は、ＨＬＡ－Ｅの発現の増加であるか、またはその増加を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させるための改変は、ＨＬＡ－Ｇの発現の増加であるか、またはその増加を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させるための改変は、ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、Ｈ２－Ｍ３（ＨＬＡ－Ｇ）、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８の発現の増加であるか、またはその増加を含む。

【0370】

いくつかの実施形態では、その細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる１つ以上の改変、例えばゲノム改変、及びＣＤ４７の発現を増加させる改変を含む。換言すると、その操作細胞は、外因性ＣＤ４７タンパク質を含み、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面発現が低下またはサイレンシングされている。いくつかの実施形態では、その細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる１つ以上のゲノム改変、及びＣＤ４７の発現を増加させる改変を含む。いくつかの事例では、その操作細胞は、外因性ＣＤ４７の核酸及びタンパク質を含み、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面発現が低下またはサイレンシングされている。いくつかの実施形態では、その細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または消失させる１つ以上のゲノム改変、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または消失させる１つ以上のゲノム改変、及びＣＤ４７の発現を増加させる改変を含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、外因性ＣＤ４７タンパク質を含み、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面発現が低下またはサイレンシングされており、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現が低下または欠失している。多くの実施形態では、その細胞は、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇの細胞である。

【0371】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術のいずれかを用いて、本明細書に記載されているような１つ以上の標的ポリヌクレオチドまたは標的タンパク質の発現を低下させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術としては、ヌクレアーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、リコンビナーゼを伴うシステムを挙げることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、遺伝子のノックアウトまたはノックダウンに利用できる。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、ＤＮＡをゲノム領域にノックインするかまたは組み込むのに利用できる。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、一本鎖切断（ＳＳＢ）を媒介する。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を媒介し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同配向型修復（ＨＤＲ）と併せることを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、ＤＮＡベースの編集またはプライム編集を含むことができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）を含むことができる。

【0372】

いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、塩基編集と関連する。塩基エディター（ＢＥ）は典型的には、Ｃａｓ（「ＣＲＩＳＰＲ関連」）ドメインと核酸塩基改変ドメイン（例えば、天然または進化型のデアミナーゼ、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１（「アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド１」）、ＣＤＡ（「シチジンデアミナーゼ」）及びＡＩＤ（「活性化誘導シチジンデアミナーゼ」）を含むシチジンデアミナーゼ）ドメインとの融合体である。いくつかの事例では、塩基エディターは、細胞のＤＮＡ修復プロセスを変化させて、結果として生じる一塩基変化の効率及び／または安定性を高めるタンパク質またはドメインも含んでよい。

【0373】

いくつかの態様では、現在利用可能な塩基エディターとしては、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａへ変換するシチジン塩基エディター（例えばＢＥ４）、及び標的Ａ・ＴをＧ・Ｃへ変換するアデニン塩基エディター（例えばＡＢＥ７．１０）が挙げられる。いくつかの態様では、Ｃａｓ９による標的化を伴う脱アミノ化は、二本鎖ＤＮＡ切断を導入することなく、塩基変化を誘導するように設計された塩基エディター（ＢＥ）システムと併せるものと初めて示された。さらに、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）に融合したラットデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１）を用いて、ｓｇＲＮＡのＰＡＭの上流でシチジンをチミジンに変換するのに成功した。いくつかの態様では、ｄＣａｓ９を、脱アミノ化されたシチジンの反対側の鎖にニックを入れる「ニッカーゼ」Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａに変化させることによって、この最初のＢＥシステムを最適化した。理論に束縛されるものではないが、これにより、ロングパッチ塩基除去修復（ＢＥＲ）が開始されると予想される。この場合、脱アミノ化された鎖が修復のテンプレートとして優先的に使用されて、Ｕ：Ａ塩基対が生成され、次いで、この塩基対が、ＤＮＡ複製中にＴ：Ａに変換される。

【0374】

いくつかの実施形態では、その塩基エディターは、触媒活性を持たない第１のＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、塩基編集活性を持つドメイン、及びニッカーゼ活性を持つ第２のＤＮＡ結合タンパク質ドメインを含む核酸塩基エディターであり、これらのＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、１つの融合タンパク質上に発現するか、または別々に（例えば、別々の発現ベクター上で）発現する。いくつかの実施形態では、その塩基エディターは、塩基編集活性を持つドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ）、及び核酸をプログラム可能な２つのＤＮＡ結合タンパク質ドメイン（ｎａｐＤＮＡｂｐ）を含む融合タンパク質であり、その第１のｎａｐＤＮＡｂｐは、ニッカーゼ活性を含み、第２のｎａｐＤＮＡｂｐは、触媒活性を持たず、少なくとも、それらの２つのｎａｐＤＮＡｂｐは、リンカーによって結合されている。いくつかの実施形態では、その塩基エディターは、ニッカーゼ活性を持つ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えばＣａｓ９）のＤＮＡドメイン（ｎＣａｓ、ｎＣａｓ９）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）の、触媒活性を持たないドメインであって、核酸をプログラム可能なＤＮＡ結合活性を持つドメイン（ｄＣａｓ、例えばｄＣａｓ９）、及びデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質であり、そのｄＣａｓは、そのｎＣａｓにリンカーによって結合されているとともに、そのｄＣａｓは、そのデアミナーゼドメインに直接隣接している。いくつかの実施形態では、その塩基エディターは、アデニンからチミンへのトランスバージョン、すなわち「ＡＴＢＥ」トランスバージョン（またはチミンからアデニンへのトランスバージョン、すなわち「ＴＡＢＥ」トランスバージョン）塩基エディターである。例示的な塩基エディター及び塩基エディターシステムとしては、特許出願番号ＵＳ２０２２０１２７６２２、ＵＳ２０２１００７９３６６、ＵＳ２０２００２４８１６９、ＵＳ２０２１００９３６６７、ＵＳ２０２１００７１１６３、ＷＯ２０２０１８１２０２、ＷＯ２０２１１５８９２１、ＷＯ２０１９１２６７０９、ＷＯ２０２０１８１１７８、ＷＯ２０２０１８１１９５、ＷＯ２０２０２１４８４２、ＷＯ２０２０１８１１９３に記載されているようないずれかが挙げられ、これらの特許は、その全体が本明細書に援用される。

【0375】

いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、標的プライム逆転写（ＴＰＲＴ）、すなわち「プライム編集」である。いくつかの実施形態では、プライム編集は、ＤＳＢまたはドナーＤＮＡテンプレートを必要とせずに、ヒト細胞内で、標的挿入、欠失、１２個の考え得るすべての塩基間変換、及びそれらの組み合わせを媒介する。

【0376】

プライム編集は、核酸をプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質（「ｎａｐＤＮＡｂｐ」）であって、ポリメラーゼ（すなわち、融合タンパク質の形態のポリメラーゼ、またはｎａｐＤＮＡｂｐとトランスで別段に供給されたポリメラーゼ）と連携して機能するタンパク質を用いて、新たな遺伝子情報を所定のＤＮＡ部位に直接書き込むゲノム編集法であり、そのプライム編集システムでは、標的部位を指定するとともに、ガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡの５’末端もしくは３’末端、または内部部分）上に操作された伸長部（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）により、置換用ＤＮＡ鎖の形態での所望の編集部の合成のテンプレートとなるプライム編集（ＰＥ）ガイドＲＮＡ（「ＰＥｇＲＮＡ」）を用いてプログラムが行われる。所望の編集部（例えば一核酸塩基置換）を含む置換用鎖は、編集対象である標的部位の内在性の鎖と同じ配列を有する（ただし、所望の編集部を含むことを除く）。標的部位の内在性の鎖は、ＤＮＡ修復及び／または複製機構を通じて、所望の編集部を含む新たに合成された置換用鎖に置き換えられる。いくつかの事例では、プライム編集は、「検索及び置換」ゲノム編集技術と考えられる場合がある。プライムエディターは、編集対象である所望の標的部位を検索して、その位置を特定するとともに、標的部位の対応する内在性ＤＮＡ鎖の代わりに同時に導入される所望の編集部を含む置換用鎖をコードするからである。例えば、プライム編集は、二本鎖切断を回避するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの高精度なゲノム編集を行えるように適合させることができる。いくつかの実施形態では、その相同タンパク質は、所定のＤＮＡ配列をガイドＲＮＡで標的とし、その標的部位に一本鎖ニックを入れ、ニックの入ったＤＮＡを、ガイドＲＮＡとともに組み込まれた操作済みの逆転写酵素用テンプレートの逆転写時のプライマーとして使用するＣａｓタンパク質－逆転写酵素融合体もしくは関連システムであるか、またはその融合体もしくはシステムをコードする。いくつかの実施形態では、そのプライムエディタータンパク質は、ゲノムＤＮＡの対合鎖上で相補的なＤＮＡフラップ合成のテンプレートとなる２本のプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）と対になっており、その結果、ＰＥの誘導によるニック部位の間の内在性ＤＮＡ配列が、ｐｅｇＲＮＡによってコードされる配列に置き換えられる。

【0377】

いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、逆転写酵素または当該技術分野で知られているいずれかのＤＮＡポリメラーゼであるプライムエディターと関連する。したがって、一態様では、そのプライムエディターは、標的ＤＮＡ内の相補的なプロトスペーサーにアニーリングするスペーサー配列を含む特有のガイドＲＮＡ（すなわちＰＥｇＲＮＡ）と連携することによって、ＤＮＡ配列を標的とするようにプログラムされているＣａｓ９（または同等のｎａｐＤＮＡｂｐ）を含むことがある。このような方法としては、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－１７１１－４）、または国際公開番号ＷＯ２０２０１９１２４８号、ＷＯ２０２１２２６５５８号もしくはＷＯ２０２２０６７１３０号に開示されているいずれかが挙げられ、これらの文献は、その全体が本明細書に援用される。

【0378】

いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）である。いくつかの態様では、ＰＡＳＴＥは、逆転写酵素及びセリンインテグラーゼの両方に融合されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ニッカーゼを介して、ゲノム挿入を誘導するプラットフォームである。Ｉｏａｎｎｉｄｉ ｅｔ ａｌ．（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．１１．０１．４６６７８６）に記載されているように、ＰＡＳＴＥは、二本鎖切断を生じさせないが、約３６ｋｂほどの大きさの配列を組み込み可能にする。いくつかの実施形態では、そのセリンインテグラーゼは、当該技術分野で知られているいずれかであることができる。いくつかの実施形態では、ＰＡＳＴＥをマルチプレックス型の遺伝子組み込みに利用して、少なくとも２つの異なる遺伝子を少なくとも２つのゲノム遺伝子座に同時に組み込むことができるように、そのセリンインテグラーゼは、十分なオルソゴナル性を有する。いくつかの実施形態では、ＰＡＳＴＥは、編集効率が、相同組み換え修復または非相同末端結合ベースの組み込みの編集効率と同等であるか、またはそれよりも優れており、非分裂細胞でも活性があり、検出可能なオフターゲットイベントが少ない。

【0379】

いくつかの実施形態では、その１つ以上のゲノム遺伝子座のそれぞれは、Ｂ２Ｍ座位、ＴＡＰ１座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位、ＭＩＣ－Ａ座位、ＭＩＣ－Ｂ座位及びセーフハーバー座位からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、そのセーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１、ＡＢＯ、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＣＸＣＲ４、Ｆ３、ＦＵＴ１、ＨＭＧＢ１、ＫＤＭ５Ｄ、ＬＲＰ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＲＨＤ、ＲＯＳＡ２６及びＳＨＳ２３１の座位からなる群から選択されている。

【0380】

いくつかの実施形態では、記載の操作細胞集団は、レシピエント対象への投与時に、免疫活性化レベルの低下を誘発するか、または免疫活性化を誘発しない。いくつかの実施形態では、その細胞は、レシピエント対象において、全身性ＴＨ１の活性化レベルの低下を誘発するか、または全身性ＴＨ１の活性化を誘発しない。いくつかの実施形態では、その細胞は、レシピエント対象において、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の免疫活性化レベルの低下を誘発するか、またはＰＢＭＣの免疫活性化を誘発しない。いくつかの実施形態では、その細胞は、レシピエント対象への投与時に、その細胞に対するドナー特異的なＩｇＧ抗体のレベルの低下を誘発するか、またはドナー特異的なＩｇＧ抗体を誘発しない。いくつかの実施形態では、その細胞は、レシピエント対象において、その細胞に対するＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体の産生レベルの低下を誘発するか、またはＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体の産生を誘発しない。いくつかの実施形態では、その細胞は、レシピエント対象への投与時に、その細胞の細胞傷害性Ｔ細胞による殺傷レベルの低下を誘発する。

【0381】

いくつかの実施形態では、本発明で提供する操作細胞は、「自殺遺伝子」または「自殺スイッチ」を含む。自殺遺伝子または自殺スイッチを組み込んで、その操作細胞を対象に投与した後、ならびにその細胞が、望ましくない形で成長及び分裂したはずである場合などに、その操作細胞（例えば、初代操作細胞または操作多能性幹細胞から分化させた細胞）を死滅させることができる「セーフティスイッチ」として機能させることができる。「自殺遺伝子」という除去アプローチは、所定の化合物によって活性化された場合のみに細胞を殺傷させるタンパク質をコードする遺伝子移入ベクター内に自殺遺伝子を含む。自殺遺伝子は、無毒性化合物を毒性の高い代謝産物に選択的に変換する酵素をコードし得る。その結果、その酵素を発現する細胞が特異的に排除される。いくつかの実施形態では、その自殺遺伝子は、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）遺伝子であり、その誘発因子は、ガンシクロビルである。別の実施形態では、その自殺遺伝子は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）シトシンデアミナーゼ（ＥＣ－ＣＤ）遺伝子であり、その誘発因子は、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）である（Ｂａｒｅｓｅ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐ．２０（１０）：１９３２－１９４３（２０１２）、Ｘｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．８：７３－８（１９９８）（いずれの開示も、参照により、その全体が本明細書に援用される））。

【0382】

別の実施形態では、その自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼタンパク質である。誘導性カスパーゼタンパク質は、アポトーシスを誘導できるカスパーゼタンパク質の少なくとも一部を含む。好ましい実施形態では、その誘導性カスパーゼタンパク質は、ｉＣａｓｐ９である。そのタンパク質は、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質ＦＫＢＰ１２の配列であって、Ｆ３６Ｖ変異を有し、一連のアミノ酸を介して、ヒトカスパーゼ９をコードする遺伝子に連結された配列を含む。ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖは、小分子二量体化剤ＡＰＩ９０３に高い親和性で結合する。すなわち、本発明におけるｉＣａｓｐ９の自殺機能は、二量体化誘導化学物質（ＣＩＤ）の投与によって誘発される。いくつかの実施形態では、そのＣＩＤは、小分子薬ＡＰＩ９０３である。二量体化により、アポトーシスが速やかに誘導される。（ＷＯ２０１１１４６８６２、Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ ３６５；１８（２０１１）、Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３：９１３－９２４（２００７）を参照されたい。それぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される。）

【0383】

セーフティスイッチまたは自殺遺伝子を含めることで、細胞毒性またはレシピエントに対するその他の悪影響が見られた場合に、細胞の殺傷の制御が可能になるので、寛容原性因子を用いる療法を含む、細胞ベースの療法の安全性が高まる。

【0384】

いくつかの実施形態では、セーフティスイッチは、例えば、本発明で提供する操作細胞が、望ましくない形で成長及び分裂するか、または宿主に対して過度の毒性を示す場合に、そのセーフティスイッチを含む操作細胞の死滅またはアポトーシスを誘導する能力をもたらすために、その細胞に組み込むこと、例えば導入することができる。したがって、セーフティスイッチの使用により、異常な細胞を条件付きで、ｉｎ ｖｉｖｏで消失させることが可能となり、その使用は、臨床で細胞療法を適用する際の重要な工程となることがある。セーフティスイッチ及びその使用は、例えば、Ｄｕｚｇｕｎｅ§，Ｏｒｉｇｉｎｓ ｏｆ Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１９）、Ｄｕｚｇｕｎｅ§（ｅｄｓ），Ｓｕｉｃｉｄｅ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８９５（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）（ＨＳＶ－ｔｋ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼについて）、Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ４４（１１）：１０１３－１０１９（２０１６）（ｉカスパーゼ９について）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １８（５）：１２５５－１２６３（２００１）（ｈｕＥＧＦＲについて）、米国特許出願公開第２０１８０００２３９７号（ＨＥＲ１について）、ならびにＰｈｉｌｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ１２４（８）：１２７７－１２８７（２０１４）（ＲＱＲ８について）に記載されている。

【0385】

いくつかの実施形態では、そのセーフティスイッチは、制御した形で、例えば、薬物もしくはプロドラッグの存在下で、または選択的な外因性化合物によって活性化されると、細胞死させることができる。いくつかの実施形態では、そのセーフティスイッチは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、ラパマイシンによる活性化型のカスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ及びＲＱＲ８からなる群から選択されている。

【0386】

いくつかの実施形態では、そのセーフティスイッチは、薬物またはプロドラッグによって活性化されると、例えば、細胞内で、無毒性のプロドラッグを毒性の代謝産物に変換することによって、細胞殺傷能を持つ産物をコードする導入遺伝子であってよい。これらの実施形態では、細胞殺傷は、操作細胞をその薬物またはプロドラッグと接触させることによって活性化する。いくつかの事例では、そのセーフティスイッチは、ＨＳＶ－ｔｋであり、そのＨＳＶ－ｔｋは、ガンシクロビル（ＧＣＶ）をＧＣＶ三リン酸に変換することによって、ＤＮＡ合成を妨げ、分裂細胞を殺傷する。いくつかの事例では、そのセーフティスイッチは、ＣｙＤまたはそのバリアントであり、これらは、加水分解によりシトシンをウラシルに脱アミノ化するのを触媒することによって、抗真菌薬５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を細胞傷害性のある５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に変換する。５－ＦＵは、細胞酵素によって、強力な代謝拮抗剤（５－ＦｄＵＭＰ、５－ＦｄＵＴＰ、５－ＦＵＴＰ）にさらに変換される。これらの化合物は、チミジル酸合成酵素、ならびにＲＮＡ及びＤＮＡの産生を阻害して、細胞死をもたらす。いくつかの事例では、そのセーフティスイッチは、ＮＴＲまたはそのバリアントであり、これらは、ニトロ基を還元して、増殖性細胞及び非増殖性細胞で毒性を持つ反応性Ｎ－ヒドロキシルアミン中間体にすることを介して、プロドラッグＣＢ１９５４に作用できる。いくつかの事例では、そのセーフティスイッチは、ＰＮＰまたはそのバリアントであり、それらは、プロドラッグである６－メチルプリンデオキシリボシドまたはフルダラビンを、増殖性細胞及び非増殖性細胞の両方に対して毒性のある代謝産物に変換できる。いくつかの事例では、そのセーフティスイッチは、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはそのバリアントであり、これらは、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）を強力な細胞毒素に触媒できるので、細胞殺傷を行うことができる。

【0387】

いくつかの実施形態では、そのセーフティスイッチは、ｉＣａｓｐ９であってもよい。カスパーゼ９は、内在性のミトコンドリアアポトーシス経路の構成要素であり、生理的条件下で、障害ミトコンドリアからシトクロムＣが放出されることによって活性化される。その後、活性化カスパーゼ９はカスパーゼ３を活性化し、カスパーゼ３はターミナルエフェクター分子を始動させて、アポトーシスに導く。そのｉＣａｓｐ９は、ペプチドリンカーを介して、トランケート型カスパーゼ９（その生理的な二量体化ドメインまたはカスパーゼ活性化ドメインを有さない）をＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）ＦＫＢＰ１２－Ｆ３６Ｖに融合することによって生成してよい。そのｉＣａｓｐ９は、二量体非依存性の基礎活性が低く、宿主細胞（例えばヒトＴ細胞）内で、その表現型、機能または抗原特異性を損なうことなく、安定して発現できる。しかしながら、ｉＣａｓｐ９は、リミドゥシド（ＡＰ１９０３）、ＡＰ２０１８７及びラパマイシンのような二量体化誘導化学物質（ＣＩＤ）の存在下では、誘導性の二量体化を起こし、下流のカスパーゼ分子を活性化することができ、その結果、そのｉＣａｓｐ９を発現している細胞のアポトーシスが起こる。例えば、国際公開第ＷＯ２０１１／１４６８６２号、Ｓｔａｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５；１８（２０１１）、Ｔｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １３：９１３－９２４（２００７）を参照されたい。特に、ラパマイシン誘導性カスパーゼ９バリアントは、ｒａｐａＣａｓｐ９という。Ｓｔａｖｒｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．Ｔｈｅｒ．２６（５）：１２６６－１２７６（２０１８）を参照されたい。したがって、ｉＣａｓｐ９をセーフティスイッチとして用いて、宿主細胞の制御殺傷を行うことができる。

【0388】

いくつかの実施形態では、そのセーフティスイッチは、そのタンパク質に対する特異的な抗体の投与後に、細胞を枯渇させる膜発現タンパク質であってよい。このカテゴリーのセーフティスイッチとしては、例えば、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡまたはＲＱＲ８の表面発現のために、それらをコードする１つ以上の導入遺伝子を挙げてよい。これらのタンパク質は、特異的な抗体の標的とできる表面エピトープを有してよい。いくつかの実施形態では、そのセーフティスイッチは、ＣＣＲ４を含み、ＣＣＲ４は、抗ＣＣＲ４抗体によって認識できる。適切な抗ＣＣＲ４抗体の非限定的な例としては、モガムリズマブ及びそのバイオシミラーが挙げられる。いくつかの実施形態では、そのセーフティスイッチは、ＣＤ１６またはＣＤ３０を含み、これらは、抗ＣＤ１６抗体または抗ＣＤ３０抗体によって認識できる。このような抗ＣＤ１６抗体または抗ＣＤ３０抗体の非限定的な例としては、ＡＦＭ１３及びこれらのバイオシミラーが挙げられる。いくつかの実施形態では、そのセーフティスイッチは、ＣＤ１９を含み、ＣＤ１９は、抗ＣＤ１９抗体によって認識できる。このような抗ＣＤ１９抗体の非限定的な例としては、ＭＯＲ２０８及びそのバイオシミラーが挙げられる。いくつかの実施形態では、そのセーフティスイッチは、ＣＤ２０を含み、ＣＤ２０は、抗ＣＤ２０抗体によって認識できる。このような抗ＣＤ２０抗体の非限定的な例としては、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－Ｒｌｌｂ、及びこれらのバイオシミラーが挙げられる。すなわち、そのセーフティスイッチを発現する細胞は、ＣＤ２０陽性であり、記載されているような抗ＣＤ２０抗体の投与を通じて、殺傷の標的にできる。いくつかの実施形態では、そのセーフティスイッチは、ＥＧＦＲを含み、ＥＧＦＲは、抗ＥＧＦＲ抗体によって認識できる。このような抗ＥＧＦＲ抗体の非限定的な例としては、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、及びこれらのバイオシミラーが挙げられる。いくつかの実施形態では、そのセーフティスイッチは、ＧＤ２を含み、ＧＤ２は、抗ＧＤ２抗体によって認識できる。このような抗ＧＤ２抗体の非限定的な例としては、Ｈｕｌ４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕｌ４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－Ｒｌｌｃ、及びこれらのバイオシミラーが挙げられる。

【0389】

いくつかの実施形態では、そのセーフティスイッチは、体外から投与する薬剤であって、その操作細胞の表面上の１つ以上の寛容原性因子を認識する薬剤であってよい。いくつかの実施形態では、体外から投与するその薬剤は、寛容原性の作用物質に対して誘導されるか、またはその作用物質に特異的である抗体、例えば抗ＣＤ４７抗体である。体外から投与する抗体は、その操作細胞上の寛容原性因子を認識して、その因子をブロックすることによって、その寛容原性因子の免疫抑制機能をブロックすることによって、その免疫系をその操作細胞に対して再感作し得る。例えば、ＣＤ４７を過剰発現する操作細胞では、体外から投与する抗ＣＤ４７抗体をその対象に投与し、その結果、その操作細胞上のＣＤ４７をマスキングして、その操作細胞に対する免疫応答を誘発してよい。

【0390】

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、誘導性自殺スイッチを含む発現ベクターをその細胞に導入することをさらに含む。

【0391】

いくつかの実施形態では、その寛容原性因子は、ＣＤ４７であり、その細胞は、ＣＤ４７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、外因性のＣＤ４７ポリペプチドを発現する。

【0392】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法は、必要とする対象に、ＣＤ４７－ＳＩＲＰαブロック剤を投与することを含み、その対象は以前に、外因性のＣＤ４７ポリペプチドを発現するように操作された細胞集団を投与された者である。いくつかの実施形態では、そのＣＤ４７－ＳＩＲＰαブロック剤は、ＣＤ４７結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＤ４７結合ドメインは、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）またはその断片を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＤ４７－ＳＩＲＰαブロック剤は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＩｇＧのＦｃドメインは、ＩｇＧ１のＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＩｇＧ１のＦｃドメインは、ヒト抗体の断片を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＤ４７－ＳＩＲＰαブロック剤は、ＴＴＩ－６２１、ＴＴＩ－６２２及びＡＬＸ１４８からなる群から選択する。いくつかの実施形態では、そのＣＤ４７－ＳＩＲＰαブロック剤は、ＴＴＩ－６２１、ＴＴＩ－６２２及びＡＬＸ１４８である。いくつかの実施形態では、そのＣＤ４７－ＳＩＲＰαブロック剤は、ＴＴＩ－６２２である。いくつかの実施形態では、そのＣＤ４７－ＳＩＲＰαブロック剤は、ＡＬＸ１４８である。いくつかの実施形態では、そのＩｇＧのＦｃドメインは、ＩｇＧ４のＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＤ４７－ＳＩＲＰαブロック剤は、抗体である。いくつかの実施形態では、その抗体は、ＭＩＡＰ４１０、Ｂ６Ｈ１２及びマグロリマブからなる群から選択する。いくつかの実施形態では、その抗体は、ＭＩＡＰ４１０である。いくつかの実施形態では、その抗体は、Ｂ６Ｈ１２である。いくつかの実施形態では、その抗体は、マグロリマブである。いくつかの実施形態では、その抗体は、ＡＯ－１７６、ＩＢＩ１８８（レタプリマブ）、ＳＴＩ－６６４３及びＺＬ－１２０１からなる群から選択する。いくつかの実施形態では、その抗体は、ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ）である。いくつかの実施形態では、その抗体は、ＩＢＩ１８８（レタプリマブ）（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ）である。いくつかの実施形態では、その抗体は、ＳＴＩ－６６４３（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ）である。いくつかの実施形態では、その抗体は、ＺＬ－１２０１（Ｚａｉ）である。

【0393】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する有用な抗体またはその断片は、マグロリマブ（（Ｈｕ５Ｆ９－Ｇ４））（Ｆｏｒｔｙ Ｓｅｖｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）、ウラブレリマブ、ＣＣ－９０００２（Ｃｅｌｇｅｎｅ、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＩＢＩ－１８８（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＩＢＩ－３２２（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ＴＧ－１８０１（ＴＧ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＮＩ－１７０１としても知られる、Ｎｏｖｉｍｍｕｎｅ ＳＡ）、ＡＬＸ１４８（ＡＬＸ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＴＪ０１１１３３（ＴＪＣ４としても知られる、Ｉ－Ｍａｂ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）、ＦＡ３Ｍ３、ＺＬ－１２０１（Ｚａｉ Ｌａｂ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）、ＡＫ１１７（Ａｋｅｓｂｉｏ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ，Ｌｔｄ．）、ＡＯ－１７６（Ａｒｃｈ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＳＲＦ２３１（Ｓｕｒｆａｃｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、ＧｅｎＳｃｉ－０５９（ＧｅｎｅＳｃｉｅｎｃｅ）、Ｃ４７Ｂ１５７（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｃ４７Ｂ１６１（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｃ４７Ｂ１６７（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｃ４７Ｂ２２２（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｃ４７Ｂ２２７（Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、Ｖｘ－１００４（Ｃｏｒｖｕｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＨＭＢＤ００４（Ｈｕｍｍｉｎｇｂｉｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｔｅ Ｌｔｄ）、ＳＨＲ－１６０３（Ｈｅｎｇｒｕｉ）、ＡＭＭＳ４－Ｇ４（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＲＴＸ－ＣＤ４７（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ）及びＩＭＣ－００２（Ｓａｍｓｕｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、ＩｍｍｕｎｅＯｎｃｉａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）を含む群から選択できる。いくつかの実施形態では、その抗体またはその断片は、マグロリマブ、ウラブレリマブ、ＣＣ－９０００２、ＩＢＩ－１８８、ＩＢＩ－３２２、ＴＧ－１８０１（ＮＩ－１７０１）、ＡＬＸ１４８、ＴＪ０１１１３３、ＦＡ３Ｍ３、ＺＬ１２０１、ＡＫ１１７、ＡＯ－１７６、ＳＲＦ２３１、ＧｅｎＳｃｉ－０５９、Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ１６７、Ｃ４７Ｂ２２２、Ｃ４７Ｂ２２７、Ｖｘ－１００４、ＨＭＢＤ００４、ＳＨＲ－１６０３、ＡＭＭＳ４－Ｇ４、ＲＴＸ－ＣＤ４７及びＩＭＣ－００２を含む群から選択した抗体と、ＣＤ４７との結合に関して競合しない。いくつかの実施形態では、その抗体またはその断片は、マグロリマブ、ウラブレリマブ、ＣＣ－９０００２、ＩＢＩ－１８８、ＩＢＩ－３２２、ＴＧ－１８０１（ＮＩ－１７０１）、ＡＬＸ１４８、ＴＪ０１１１３３、ＦＡ３Ｍ３、ＺＬ１２０１、ＡＫ１１７、ＡＯ－１７６、ＳＲＦ２３１、ＧｅｎＳｃｉ－０５９、Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ１６７、Ｃ４７Ｂ２２２、Ｃ４７Ｂ２２７、Ｖｘ－１００４、ＨＭＢＤ００４、ＳＨＲ－１６０３、ＡＭＭＳ４－Ｇ４、ＲＴＸ－ＣＤ４７及びＩＭＣ－００２から選択した抗体と、ＣＤ４７との結合に関して競合する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に結合する抗体またはその断片は、ＣＤ４７に対する一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ＣＤ４７に対するＦａｂ、ＣＤ４７に対するＶＨＨナノボディ、ＣＤ４７に対するＤＡＲＰｉｎ、及びこれらのバリアントを含む群から選択する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７に対するｓｃＦｖ、ＣＤ４７に対するＦａｂ、及びこれらのバリアントは、マグロリマブ、ウラブレリマブ、ＣＣ－９０００２、ＩＢＩ－１８８、ＩＢＩ－３２２、ＴＧ－１８０１（ＮＩ－１７０１）、ＡＬＸ１４８、ＴＪ０１１１３３、ＦＡ３Ｍ３、ＺＬ１２０１、ＡＫ１１７、ＡＯ－１７６、ＳＲＦ２３１、ＧｅｎＳｃｉ－０５９、Ｃ４７Ｂ１５７、Ｃ４７Ｂ１６１、Ｃ４７Ｂ１６７、Ｃ４７Ｂ２２２、Ｃ４７Ｂ２２７、Ｖｘ－１００４、ＨＭＢＤ００４、ＳＨＲ－１６０３、ＡＭＭＳ４－Ｇ４、ＲＴＸ－ＣＤ４７及びＩＭＣ－００２を含む群から選択した抗体のうちのいずれかの抗原結合ドメインをベースとする。

【0394】

いくつかの実施形態では、そのＣＤ４７アンタゴニストは、ＣＤ４７を遮断ささせる。ＣＤ４７を遮断させる方法及び薬剤は、ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０５４３２６に記載されており、その開示は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0395】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、所望の改変の１つ以上をすでに含む供給源細胞に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に示されている教示に鑑みれば、所望の最終形態の操作細胞に至るために必要な改変をいかにして評価するか、及び積極的な操作を介して、標的成分レベルの増減が必ずしも実現するとは限らないことを当業者は容易に分かるであろう。いくつかの実施形態では、その操作細胞の改変は、いずれの順序であってもよく、必ずしも、本明細書に示されている記述言語で列挙されている順序でなくてもよい。

【0396】

本明細書に記載の分子のうちのいずれかの発現の存在は、変化させたら、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＦＡＣＳアッセイ、フローサイトメトリーなどのような既知の技法を用いてアッセイできる。

【0397】

Ａ．発現が低下している標的
いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下を含む。本明細書に記載されているように、その操作細胞は、最終的なタンパク質の発現及び標的の局在に生物学的に関わる発現が、いずれかの数のレベル（２つ以上のレベルを含む）で低下していてよい。例えば、いくつかの実施形態では、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢは、ゲノム物質（ゲノムＤＮＡなど）において内因的にコードされ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）に転写され、ポリペプチドに翻訳され、細胞膜内に組み込まれて、その一部が細胞外環境に露出するとともに、細胞内で、ある特定の寿命を持つようになる。すなわち、いくつかの実施形態では、発現は、遺伝子及び／またはその機能、ＲＮＡの発現及び機能、タンパク質の発現及び機能、局在（細胞表面発現など）、ならびに寿命を介して低下させることができる。

【0398】

いくつかの実施形態では、標的の発現の低下は、操作細胞内の発現が、標的の発現を低下させるように操作する前の供給源細胞内の標的の対応する発現のレベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）のレベルまで低下するような低下である（例えば、タンパク質発現とタンパク質発現とを比べる）。いくつかの実施形態では、標的の発現の低下は、操作細胞内の発現が、参照細胞または参照細胞集団（免疫原性応答が低下または消失している同じ細胞種または細胞の細胞または集団など）内の標的の対応する発現のレベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）のレベルまで低下するような低下である（例えば、タンパク質発現とタンパク質発現とを比べる）。いくつかの実施形態では、標的の発現の低下は、操作細胞内の発現が、測定した発現レベル（標的の存在により、免疫原性応答が低下または消失していると分かっているレベルなど）以下のレベルまで低下するような低下である。いくつかの実施形態では、標的のレベルは、刺激状態または未刺激状態の操作細胞、参照細胞または参照細胞集団で評価する。いくつかの実施形態では、標的のレベルは、その標的が発現しているように（または、細胞が刺激に応答する能力がそのレベルである場合には、その標的が発現するように）刺激した状態の操作細胞、参照細胞または参照細胞集団で評価する。いくつかの実施形態では、その刺激は、ｉｎ ｖｉｖｏ刺激に当たる。

【0399】

いくつかの実施形態では、提供する操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のうちのいずれかの発現を調節する（例えば、低下または消失させる）１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列（同義的に、標的遺伝子ともいう）の改変、例えば遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、ヒトのＭＨＣは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）ともいう。例えば、ヒトＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡクラスＩとしても知られ、ヒトＭＨＣクラスＩＩ分子は、ＨＬＡクラスＩＩ分子としても知られる。いくつかの実施形態では、改変または操作の対象である細胞は、その１つ以上の改変が以前に導入されたことがない未改変または未操作の細胞である。いくつかの実施形態では、遺伝子編集システムを用いて、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のうちのいずれかの発現を調節する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列を改変する。ある特定の実施形態では、その細胞のゲノムは、ＨＬＡの発現、例えば、その細胞の表面上での１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の促進に必要となるかまたは関与する構成要素を低減または欠失させるように変化している。例えば、いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の構成要素であるβ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を、その細胞内で低下または消失させることによって、その操作細胞による、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現（例えば細胞表面発現）を低下または消失させる。

【0400】

いくつかの実施形態では、その操作細胞における記載の改変のうち、その操作細胞内で、１つ以上の標的ポリヌクレオチドまたは標的タンパク質の発現を調節する（例えば、低下または消失させる）改変のいずれかは、本明細書に記載のポリヌクレオチド（例えば、ＣＤ４７のような寛容原性因子）を過剰発現する１つ以上の改変と組み合わせてもよい。

【0401】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下は、例えば、（１）多型のＨＬＡアレル（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子遺伝子を直接標的とすること、（２）Ｂ２Ｍの除去（これにより、すべてのＭＨＣクラスＩ分子の表面輸送が減少することになる）、及び／または（３）ＭＨＣエンハンセオソームの構成要素の１つ以上、例えば、ＨＬＡの発現に不可欠であるＬＲＣ５、ＲＦＸ－５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＩＲＦｌ、ＮＦ－Ｙ（ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃを含む）及びＣＩＩＴＡの欠失のうちの１つ以上によって実現できる。

【0402】

ある特定の実施形態では、ＨＬＡの発現が妨げられている。いくつかの実施形態では、ＨＬＡの発現は、個々のＨＬＡを標的とすること（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／またはＨＬＡ－Ｃの発現をノックアウトすること）、ＨＬＡ発現の転写調節因子を標的とすること（例えば、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ及び／またはＩＲＦ－１の発現をノックアウトすること）、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面輸送をブロックすること（例えば、Ｂ２Ｍ及び／またはＴＡＰ１の発現をノックアウトすること）、及び／またはＨＬＡ－Ｒａｚｏｒを標的とすることによって妨げられている（例えば、ＷＯ２０１６１８３０４１を参照されたい）。

【0403】

ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体は、ヒトＭＨＣと同義である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている操作細胞は、ヒト細胞である。ある特定の態様では、本明細書に開示されている操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子に当たる１つ以上のヒト白血球抗原（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及び／またはＨＬＡ－Ｃ）を発現しないので、低免疫原性であることを特徴とする。例えば、ある特定の態様では、本明細書に開示されている操作細胞は、改変されており、いずれかの幹細胞またはその幹細胞から調製した分化幹細胞を含め、その細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子、すなわちＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの１つ以上を発現しないか、またはその１つ以上の発現が低下するようになっている。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－Ｃの１つ以上は、細胞から「ノックアウト」されていてもよい。ＨＬＡ－Ａ遺伝子、ＨＬＡ－Ｂ遺伝子及び／またはＨＬＡ－Ｃ遺伝子がノックアウトされている細胞は、それぞれのノックアウト遺伝子の発現が低下または消失し得る。

【0404】

ある特定の実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現は、ゲノムＤＮＡの連続領域を標的として、これを欠失させることによって、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５からなる群から選択した標的遺伝子の発現を低下または消失させることによって調節する。

【0405】

いくつかの実施形態では、提供する操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子を調節する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の改変、例えば遺伝子改変を含む。１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる例示的な方法は、下記のセクションに記載されている。いくつかの実施形態では、標的とするポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍ及びＮＬＲＣ５の１つまたは両方である。いくつかの実施形態では、その細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子に対する遺伝子編集による改変を含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集による改変を含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子に対する遺伝子編集による改変を含む。

【0406】

いくつかの実施形態では、提供する操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を調節する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の改変、例えば遺伝子改変を含む。１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる例示的な方法は、下記のセクションに記載されている。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子に対する遺伝子編集による改変を含む。

【0407】

いくつかの実施形態では、提供する操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を調節する１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の改変、例えば遺伝子改変を含む。１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる例示的な方法は、下記のセクションに記載されている。いくつかの実施形態では、その細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子及びＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集による改変を含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子及びＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集による改変を含む。特定の実施形態では、その細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子及びＮＬＲＣ５遺伝子に対する遺伝子編集による改変を含む。

【0408】

いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５の発現を低下させる改変は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のｍＲＮＡ発現を低下させる。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のｍＲＮＡ発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比べたものである。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現は、約５％超低下し、例えば、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超または約９０％超以上のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のｍＲＮＡ発現は、最大約１００％低下し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％または最大約５％未満のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のｍＲＮＡ発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のｍＲＮＡ発現は消失する（例えば、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５ ｍＲＮＡの発現が０％である）。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５のｍＲＮＡ発現を低下させる改変は、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及び／またはＮＬＲＣ５の遺伝子活性を消失させる。

【0409】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡの発現の低下を含み、その低下は、本明細書に記載されているようなものであり、例えば、ＭＩＣＡの発現を低下させるように操作する前、参照細胞もしくは参照細胞集団（免疫原性応答が所望どおりに欠失している細胞など）、または測定値と比べたものである。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現を低下させるように操作されている。いくつかの実施形態では、その操作細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現は、ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面提示を減少させるように操作する前のＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現は、参照細胞または参照細胞集団上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベル（ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現の平均量など）の約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面提示が見られない（既知の技法、例えばフローサイトメトリーを用いて測定した場合を含め、検出可能な細胞表面発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡポリペプチドのタンパク質発現が低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞のＭＩＣＡポリペプチドのタンパク質発現は、ＭＩＣＡポリペプチドのタンパク質発現を低下させるように操作する前のＭＩＣＡポリペプチドのタンパク質発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞のＭＩＣＡポリペプチドのタンパク質発現は、ＭＩＣＡポリペプチドのタンパク質発現を低下させるように操作する前のＭＩＣＡポリペプチドのレベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡポリペプチドのタンパク質発現が見られない（既知の技法、例えば、ウエスタンブロットまたは質量分析を用いて測定した場合を含め、検出可能なタンパク質発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡポリペプチドを含まない（既知の技法、例えば、ウエスタンブロットまたは質量分析を用いて測定した場合を含め、検出可能なタンパク質が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現が低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞のＭＩＣＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現は、ＭＩＣＡポリペプチドのｍＲＮＡ発現を低下させるように操作する前のＭＩＣＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞のＭＩＣＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現は、参照細胞または参照細胞集団のｍＲＮＡ発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡを発現しない（既知の技法、例えば、シーケンシング技法またはＰＣＲを用いて測定した場合を含め、検出可能なｍＲＮＡ発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含まない（既知の技法、例えば、シーケンシング技法またはＰＣＲを用いて測定した場合を含め、検出可能なｍＲＮＡが見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡ遺伝子の遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡ遺伝子の遺伝子不活性化または遺伝子破壊を両方のアレルで含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡ遺伝子の遺伝子不活性化または遺伝子破壊をすべてのアレルで含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡノックアウトである。

【0410】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢの発現の低下を含み、その低下は、本明細書に記載されているようなものであり、例えば、ＭＩＣＢの発現を低下させるように操作する前、参照細胞もしくは参照細胞集団（免疫原性応答が所望どおりに欠失している細胞など）、または測定値と比べたものである。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現を低下させるように操作されている。いくつかの実施形態では、その操作細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現は、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面提示を減少させるように操作する前のＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現は、参照細胞または参照細胞集団上でのＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現レベル（ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現の平均量など）の約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面提示が見られない（既知の技法、例えばフローサイトメトリーを用いて測定した場合を含め、検出可能な細胞表面発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢポリペプチドのタンパク質発現が低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞のＭＩＣＢポリペプチドのタンパク質発現は、ＭＩＣＢポリペプチドのタンパク質発現を低下させるように操作する前のＭＩＣＢポリペプチドのタンパク質発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞のＭＩＣＢポリペプチドのタンパク質発現は、ＭＩＣＢポリペプチドのタンパク質発現を低下させるように操作する前のＭＩＣＢポリペプチドのレベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢポリペプチドのタンパク質発現が見られない（既知の技法、例えば、ウエスタンブロットまたは質量分析を用いて測定した場合を含め、検出可能なタンパク質発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢポリペプチドを含まない（既知の技法、例えば、ウエスタンブロットまたは質量分析を用いて測定した場合を含め、検出可能なタンパク質が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現が低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞のＭＩＣＢポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現は、ＭＩＣＢポリペプチドのｍＲＮＡ発現を低下させるように操作する前のＭＩＣＢポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞のＭＩＣＢポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現は、参照細胞または参照細胞集団のｍＲＮＡ発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢポリペプチドをコードするｍＲＮＡを発現しない（既知の技法、例えば、シーケンシング技法またはＰＣＲを用いて測定した場合を含め、検出可能なｍＲＮＡ発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含まない（既知の技法、例えば、シーケンシング技法またはＰＣＲを用いて測定した場合を含め、検出可能なｍＲＮＡが見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢ遺伝子の遺伝子不活性化または遺伝子破壊を含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢ遺伝子の遺伝子不活性化または遺伝子破壊を両方のアレルで含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢ遺伝子の遺伝子不活性化または遺伝子破壊をすべてのアレルで含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢノックアウトである。

【0411】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子またはその構成要素の発現の低下を含み、その低下は、本明細書に記載されているようなものであり、例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子またはその構成要素の発現を低下させるように操作する前、参照細胞もしくは参照細胞集団（免疫原性応答が所望どおりに欠失している細胞など）、または測定値と比べたものである。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面発現を低下させるように操作されている。いくつかの実施形態では、その操作細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面発現は、その１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面提示を減少させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面発現は、参照細胞または参照細胞集団上でのその１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面発現レベル（１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面発現の平均量など）の約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）の細胞表面提示が見られない（既知の技法、例えばフローサイトメトリーを用いて測定した場合を含め、検出可能な細胞表面発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）のタンパク質発現が低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）のタンパク質発現は、その１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）のタンパク質発現を低下させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）のタンパク質発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）のタンパク質発現は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）のタンパク質発現を低下させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）のレベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）のタンパク質発現が見られない（既知の技法、例えば、ウエスタンブロットまたは質量分析を用いて測定した場合を含め、検出可能なタンパク質発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）を含まない（既知の技法、例えば、ウエスタンブロットまたは質量分析を用いて測定した場合を含め、検出可能なタンパク質が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）をコードするｍＲＮＡの発現が低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）をコードするｍＲＮＡの発現は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）のｍＲＮＡ発現を低下させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）をコードするｍＲＮＡの発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素（Ｂ２Ｍなど）をコードするｍＲＮＡの発現は、参照細胞または参照細胞集団のｍＲＮＡ発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素をコードするｍＲＮＡを発現しない（既知の技法、例えば、シーケンシング技法またはＰＣＲを用いて測定した場合を含め、検出可能なｍＲＮＡ発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のポリペプチドまたはその構成要素をコードするｍＲＮＡを含まない（既知の技法、例えば、シーケンシング技法またはＰＣＲを用いて測定した場合を含め、検出可能なｍＲＮＡが見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子遺伝子の遺伝子不活性化または遺伝子破壊を含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子遺伝子の遺伝子不活性化または遺伝子破壊を両方のアレルで含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子の遺伝子の遺伝子不活性化または遺伝子破壊をすべてのアレルで含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子ノックアウトまたはＭＨＣクラスＩ分子構成要素（Ｂ２Ｍなど）ノックアウトである。

【0412】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含み、その低下は、本明細書に記載されているようなものであり、例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させるように操作する前、参照細胞もしくは参照細胞集団（免疫原性応答が所望どおりに欠失している細胞など）、または測定値と比べたものである。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドの細胞表面発現を低下させるように操作されている。いくつかの実施形態では、その操作細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドの細胞表面発現は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドの細胞表面提示を減少させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドの細胞表面発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドの細胞表面発現は、参照細胞または参照細胞集団上での１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドの細胞表面発現レベル（１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドの細胞表面発現の平均量など）の約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドの細胞表面提示が見られない（既知の技法、例えばフローサイトメトリーを用いて測定した場合を含め、検出可能な細胞表面発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドのタンパク質発現が低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドのタンパク質発現は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドのタンパク質発現を低下させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドのタンパク質発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドのタンパク質発現は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドのタンパク質発現を低下させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドのレベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドのタンパク質発現が見られない（既知の技法、例えば、ウエスタンブロットまたは質量分析を用いて測定した場合を含め、検出可能なタンパク質発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドを含まない（既知の技法、例えば、ウエスタンブロットまたは質量分析を用いて測定した場合を含め、検出可能なタンパク質が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現が低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドのｍＲＮＡ発現を低下させるように操作する前の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの発現は、参照細胞または参照細胞集団のｍＲＮＡ発現レベルの約６０％以下（約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下または約１％以下のいずれかなど）であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを発現しない（既知の技法、例えば、シーケンシング技法またはＰＣＲを用いて測定した場合を含め、検出可能なｍＲＮＡ発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含まない（既知の技法、例えば、シーケンシング技法またはＰＣＲを用いて測定した場合を含め、検出可能なｍＲＮＡが見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子遺伝子の遺伝子不活性化または遺伝子破壊を含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子遺伝子の遺伝子不活性化または遺伝子破壊を両方のアレルで含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子遺伝子の遺伝子不活性化または遺伝子破壊をすべてのアレルで含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子ノックアウトである。

【0413】

１．発現を低下させる方法
いくつかの実施形態では、本発明で提供する細胞は、本明細書に記載されているような１つ以上の標的ポリヌクレオチドの発現を低下させるように改変、例えば遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはタンパク質の発現を低下させる（例えば消失させる）１つ以上の改変を有するように操作する細胞は、本明細書に記載されているようないずれかの供給源細胞である。いくつかの実施形態では、その供給源細胞は、本明細書に記載のいずれかの細胞である。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、分化細胞、造血幹細胞、間葉細胞または初代細胞）は、１つ以上の標的ポリヌクレオチドの発現を低下させる１つ以上の改変、例えば遺伝子改変を含む。その１つ以上の標的ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、上記のようないずれか、例えば、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢ、ならびにＭＨＣクラスＩ分子またはその構成要素、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ、ＮＬＲＣ５、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＬＲＣ５、ＲＦＸ－ＡＮＫ、ＲＦＸ５、ＲＦＸ－ＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＩＲＦ１及びＴＡＰ１が挙げられる。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的ポリヌクレオチドの発現を低下させる１つ以上の改変、例えば遺伝子改変は、所望の導入遺伝子の発現を増加させる１つ以上の改変、例えば、本明細書に記載のいずれかと組み合わされている。いくつかの実施形態では、その１つ以上の改変、例えば遺伝子改変により、免疫特権細胞または低免疫原性細胞である操作細胞が作られる。標的ポリヌクレオチドのうちの１つまたは複数の発現を調節すること（例えば、低下または欠失させること）によって、このような細胞は、レシピエント対象に生着したときに、免疫活性化が低下している。いくつかの実施形態では、その細胞は、投与すると、例えば、レシピエント対象または患者において低免疫原性とみなされる。

【0414】

標的ポリヌクレオチドの発現を低下させるいずれの方法も使用してよい。いくつかの実施形態では、その改変は、遺伝子改変である。いくつかの実施形態では、その改変、例えば遺伝子改変により、標的ポリヌクレオチドの発現が永続的に消失または低下する。例えば、いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドまたは標的遺伝子は、ターゲティングエンドヌクレアーゼ用いるなどによって、標的ポリヌクレオチド内でＤＮＡ切断を導入することによって破壊されている。別の実施形態では、その改変、例えば遺伝子改変により、標的ポリヌクレオチドの発現が一過性に低下する。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子抑制は、例えばアンチセンス技法を用いて、例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ショートヘアピン（ｓｈＲＮＡ）及び／またはリボザイムによって、遺伝子の発現を選択的に抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）または抑制する（ｒｅｐｒｅｓｓ）ために、標的ポリヌクレオチドと相補的である阻害性核酸を用いて行う。

【0415】

いくつかの実施形態では、その標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、その標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム配列である。いくつかの実施形態では、その標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳動物ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、その標的ポリヌクレオチド配列は、脊椎動物ゲノム配列である。

【0416】

いくつかの実施形態では、遺伝子破壊は、その遺伝子で、典型的には標的を定めた形で、１つ以上の二本鎖切断及び／または１つ以上の一本鎖切断を誘導することによって行う。いくつかの実施形態では、二本鎖切断または一本鎖切断は、ヌクレアーゼ、例えば、遺伝子標的化ヌクレアーゼのようなエンドヌクレアーゼによって作り出す。いくつかの実施形態では、その標的化ヌクレアーゼは、遺伝子の配列またはその一部に標的化されるように特異的に設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）のようなＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼから選択されている。いくつかの実施形態では、その標的化ヌクレアーゼは、二本鎖切断または一本鎖切断を生じさせ、その後、その切断は、エラープローンな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、またはいくつかの事例では、テンプレートを使用する高精度な相同組み換え修復（ＨＤＲ）を通じて修復される。いくつかの実施形態では、その標的化ヌクレアーゼは、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせる。いくつかの実施形態では、切断を発生させ、修復するプロセスは典型的には、エラープローンであり、その結果、ＮＨＥＪによる修復から、ＤＮＡ塩基の挿入及び欠失（インデル）が生じる。いくつかの実施形態では、その遺伝子改変は、標的遺伝子のヌクレオチド配列の欠失、挿入または変異を誘導し得る。いくつかの事例では、その遺伝子改変により、フレームシフト変異を発生させてよく、その結果、未成熟終止コドンを出現させることができる。ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集の例では、その標的化編集は、遺伝子のアレルの両方で行われ、その結果、その遺伝子の両アレルの破壊または編集が行われる。いくつかの実施形態では、その遺伝子のアレルのすべてが、その遺伝子編集の標的となる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いるなど、標的化ヌクレアーゼによる遺伝子改変により、遺伝子の完全なノックアウトが行われる。

【0417】

いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼ、例えばレアカッターエンドヌクレアーゼは、標的ポリヌクレオチド配列を含む細胞に導入する。そのヌクレアーゼは、細胞に、そのヌクレアーゼをコードする核酸の形態で導入してもよい。その核酸を細胞に導入するプロセスは、いずれかの適切な技法によって行うことができる。適切な技法としては、リン酸カルシウムもしくは脂質の媒介によるトランスフェクション、エレクトロポレーション及びトランスダクション、またはウイルスベクターを用いた感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、その細胞に導入する核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼは、その細胞に、タンパク質の形態で導入する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの場合には、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）をその細胞に導入してもよい。

【0418】

いくつかの実施形態では、その遺伝子改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて行う。細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変化させることができるいずれかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用できる。このようなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、様々なＣａｓタンパク質を利用できる（Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．２００５；１（６）ｅ６０）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが細胞内の標的ポリヌクレオチド配列を変化させることを可能にするこのようなＣａｓタンパク質の分子機構には、ＲＮＡ結合タンパク質、エンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、ならびにポリメラーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｉ型のＣＲＩＳＰＲシステムである。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムである。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｖ型のＣＲＩＳＰＲシステムである。

【0419】

そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとしては、細胞内のいずれかの標的ポリヌクレオチド配列を変化させるために使用できる標的化システムが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明で提供するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質と、そのＣａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導するとともに、そのモチーフにハイブリダイズすることができる１つ以上、例えば少なくとも１～２個のリボ核酸（例えばガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））とを含む。

【0420】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１つ以上のアミノ酸の置換または改変を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。いくつかの事例では、置換及び／または改変は、細胞内で、そのポリペプチドのタンパク質分解を阻止もしくは低減したり、及び／または半減期を延長したりできる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、ペプチド結合の置換（例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート及びスルホニル尿素）を含むことができる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、天然アミノ酸を含むことができる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、代替のアミノ酸（例えば、Ｄ－アミノ酸、β－アミノ酸、ホモシステイン及びホスホセリン）を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ある部分を含めるための改変（例えば、ＰＥＧ化、糖鎖付加、脂質化、アセチル化及びエンドキャッピング）を含むことができる。

【0421】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓコアタンパク質を含む。例示的なＣａｓコアタンパク質としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓ１３が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）サブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ２としても知られる）を含む。大腸菌サブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４及びＣａｓ５ｅが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＹｐｅｓｔサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ３としても知られる）を含む。Ｙｐｅｓｔサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３及びＣｓｙ４が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＮｍｅｎｉサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ４としても知られる）を含む。Ｎｍｅｎｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｎ１及びＣｓｎ２が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＤｖｕｌｇサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ１としても知られる）を含む。Ｄｖｕｌｇサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２及びＣａｓ５ｄが挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＴｎｅａｐサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ７としても知られる）を含む。Ｔｎｅａｐサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃａｓ５ｔが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＨｍａｒｉサブタイプのＣａｓタンパク質を含む。Ｈｍａｒｉサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２及びＣａｓ５ｈが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＡｐｅｒｎサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ５としても知られる）を含む。Ａｐｅｒｎサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５及びＣａｓ５ａが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＭｔｕｂｅサブタイプのＣａｓタンパク質（ＣＡＳＳ６としても知られる）を含む。Ｍｔｕｂｅサブタイプの例示的なＣａｓタンパク質としては、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４及びＣｓｍ５が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質を含む。例示的なＲＡＭＰモジュールＣａｓタンパク質としては、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ２、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５及びＣｍｒ６が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｋｌｏｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ５７１，２１９－２２５（２０１９）、Ｓｔｒｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６５，４８－５３（２０１９）を参照されたい。

【0422】

いくつかの実施形態では、細胞を遺伝子改変して、１つ以上の遺伝子をノックアウト、ノックダウン、または別段に改変する方法は、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、トランスポザーゼ、及びクラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステムを含む部位特異的ヌクレアーゼを使用することを含む。

【0423】

ＺＦＮは、ジンクフィンガーを含む転写因子から改変した一連の部位特異的なＤＮＡ結合ドメインが、細菌制限酵素ＦｏｋＩのエンドヌクレアーゼドメインに結合したものを含む融合タンパク質である。ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメイン、すなわちジンクフィンガードメインを１つ以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個以上）有してよい。例えば、Ｃａｒｒｏｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（２０１１）１８８：７７３－７８２、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：１１５６－１１６０を参照されたい。各ジンクフィンガードメインは、１つ以上の亜鉛イオンによって安定化された小さなタンパク質構造モチーフであり、通常、３～４ｂｐのＤＮＡ配列を認識する。したがって、タンデムドメインが、細胞のゲノム内に固有の長いヌクレオチド配列に結合できる可能性がある。

【0424】

既知の特異性を持つ様々なジンクフィンガーを組み合わせて、約６ｂｐ、約９ｂｐ、約１２ｂｐ、約１５ｂｐまたは約１８ｂｐの配列を認識するマルチフィンガーポリペプチドを作製できる。所定の配列を認識するジンクフィンガー（及びそれらの組み合わせ）を生成するには、ファージディスプレイ、酵母ワンハイブリッドシステム、細菌ワンハイブリッドシステム、細菌ツーハイブリッドシステム及び哺乳動物細胞を含め、様々な選択技法及びモジュラーアセンブル技法が利用可能である。ジンクフィンガーは、所定の核酸配列に結合するように操作できる。所定の核酸配列に結合するジンクフィンガーを操作する基準は、当該技術分野で知られている。例えば、Ｓｅｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：７０７４－７０８１、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２００８）２４：１８５０－１８５７を参照されたい。

【0425】

ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたはその他の二量体ヌクレアーゼドメインを含むＺＦＮは、二量体として機能する。すなわち、回文性ではないＤＮＡ部位を標的とするには、一対のＺＦＮが必要となる。２つの個々のＺＦＮは、適切な間隔を置いて配置されたヌクレアーゼとともに、対向するＤＮＡ鎖に結合しなければならない。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）９５：１０５７０－１０５７５を参照されたい。ゲノム内の所定の部位を切断するために、一対のＺＦＮを設計して、その部位を挟み込む２つの配列、一方はフォワード鎖上の配列、もう一方はリバース鎖上の配列を認識するようにする。ＺＦＮが、いずれの側の部位にも結合したら、そのヌクレアーゼドメインは二量化して、その部位でＤＮＡを切断し、５′オーバーハングとともに、ＤＳＢを生じさせる。続いて、ホモロジーアームに挟まれた所望の変異を含む修復テンプレートの助けを借りて、ＨＤＲを用いて所定の変異を導入できる。その修復テンプレートは通常、その細胞に導入された外因性の二本鎖ＤＮＡベクターである。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：１４３－１４８、Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：７３１－７３４を参照されたい。

【0426】

ＴＡＬＥＮは、標的遺伝子を編集するのに使用できる人工ヌクレアーゼの別の例である。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥリピートというＤＮＡ結合ドメインに由来し、このドメインは通常、長いＤＮＡ配列に結合して、その配列を認識する１０～３０リピートのタンデムアレイを含む。各リピートは、３３～３５アミノ酸長であり、２つの隣接するアミノ酸（反復可変二残基またはＲＶＤという）により、４つのＤＮＡ塩基対のうちの１つに対する特異性が得られる。したがって、標的ＤＮＡ配列において、そのリピートと塩基対との間に１対１の対応関係が見られる。

【0427】

ＴＡＬＥＮは、１つ以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個以上）のＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼドメイン、例えばＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインに融合することによって、人工的に作製する。Ｚｈａｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１４９－１５３を参照されたい。ＦｏｋＩをＴＡＬＥＮで使用するために、ＦｏｋＩに対していくつかの変異が加えられており、これらの変異が、例えば、切断特異性または活性を改善する。Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１１）３９：ｅ８２、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１４３－１４８、Ｈｏｃｋｅｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：７３１－７３４、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１１）３３３：３０７、Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１０）８：７４－７９、Ｓｚｃｚｅｐｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００７）２５：７８６－７９３、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１０）２００：９６を参照されたい。ＦｏｋＩドメインは、二量体として機能し、標的ゲノム内の部位に特有のＤＮＡ結合ドメインを適切な向き及び間隔で有するコンストラクトが２つ必要となる。ＴＡＬＥ ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩヌクレアーゼドメインとの間のアミノ酸残基数、及び２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位間の塩基数の両方とも、高い活性レベルを得るために重要なパラメーターであると見られる。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１４３－１４８。

【0428】

操作したＴＡＬＥリピートをヌクレアーゼドメインと組み合わせることによって、いずれかの所望のＤＮＡ配列に特異的な部位特異的なヌクレアーゼを作製することができる。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮは、細胞に導入して、ゲノム内の所望の標的部位にＤＳＢを生じさせることができるため、ＴＡＬＥＮを使用して、ＨＤＲの媒介による同様の経路で、遺伝子をノックアウトしたり、または変異をノックインしたりできる。Ｂｏｃｈ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２０１１）２９：１３５－１３６、Ｂｏｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６：１５０９－１５１２、Ｍｏｓｃｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００９）３２６：３５０１を参照されたい。

【0429】

メガヌクレアーゼは、大きなＤＮＡ配列（１４～４０塩基対）を認識して、その配列を切断する能力を特徴とする、エンドヌクレアーゼファミリーの酵素である。メガヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性及び／またはＤＮＡ認識に影響を及ぼすその構造モチーフに基づいて、ファミリーにグループ分けする。最も普及し、最もよく知られたメガヌクレアーゼは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのタンパク質であり、その名称は、保存的アミノ酸配列から取られている。Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００１）２９（１８）：３７５７－３７７４を参照されたい。一方で、ＧＩＹ－ＹＩＧファミリーメンバーは、ＧＩＹ－ＹＩＧモジュールを有し、このモジュールは、７０～１００残基長であり、４つの不変残基を有する保存配列モチーフを４つまたは５つ含み、そのうちの２つは、活性に必須である。Ｖａｎ Ｒｏｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．（２００２）９：８０６－８１１を参照されたい。Ｈｉｓ－Ｃｙｓファミリーのメガヌクレアーゼは、数百個のアミノ酸残基を含む領域にわたって、高度に保存された一連のヒスチジン及びシステインを特徴とする。Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００１）２９（１８）：３７５７－３７７４を参照されたい。ＮＨＮファミリーのメンバーは、アスパラギン残基に囲まれた２対の保存されたヒスチジンを含むモチーフによって定義される。Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００１）２９（１８）：３７５７－３７７４を参照されたい。

【0430】

高い特異性が必要となるため、特定の標的ＤＮＡ配列に対する天然のメガヌクレアーゼを特定する可能性は低いので、特有の配列を認識するメガヌクレアーゼバリアントを作製するために、変異誘発及びハイスループットスクリーニング法を含む様々な方法が用いられている。例えば、所定の核酸配列に結合するように、ＤＮＡ結合特異性が変化したメガヌクレアーゼを操作する方策は、当該技術分野で知られている。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．（２００２）１０：８９５－９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００３）３１：２９５２－２９６２、Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００６）３６１：７４４－７５４、Ｓｅｌｉｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００２）３０：３８７０－３８７９、Ｓｕｓｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２００４）３４２：３１－４１、Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ（２００６）１２８：２４７７－２４８４、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ（２００９）２２：２４９－２５６、Ａｒｎｏｕｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（２００６）３５５：４４３－４５８、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００６）３６３（２）：２８３－２９４を参照されたい。

【0431】

ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮのように、メガヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡにＤＳＢを生じさせることができ、この切断により、例えばＮＨＥＪを介して不適切に修復されると、フレームシフト変異が起こることがあり、細胞内での標的遺伝子の発現が低下する。その代わりに、メガヌクレアーゼとともに、外来ＤＮＡを細胞に導入できる。外来ＤＮＡの配列及び染色体の配列に応じて、このプロセスを用いて、標的遺伝子を改変することができる。Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１１）１１：１１－２７を参照されたい。

【0432】

トランスポザーゼは、トランスポゾンの末端に結合して、トランスポゾンが、カットアンドペースト機構または複製型転移機構によって別のゲノム部分に移動するのを触媒する酵素である。トランスポザーゼをＣＲＩＳＰＥＲ／Ｃａｓシステムのような他のシステムに連結することによって、新たな遺伝子編集ツールを開発して、ゲノムＤＮＡの部位特異的な挿入または操作を可能にすることができる。トランスポゾンを用いた既知のＤＮＡ組み込み方法が２つ存在し、この方法では、触媒活性を持たないＣａｓエフェクタータンパク質及びＴｎ７様トランスポゾンを使用する。トランスポザーゼ依存性のＤＮＡ組み込みは、ゲノム内にＤＳＢを誘発せず、これにより、より安全で、より特異的なＤＮＡ組み込みを確保し得る。

【0433】

ＣＲＩＳＰＲシステムは元々、侵入するファージ及びプラスミドに対する防御に関与するシステムであって、獲得免疫の形態をもたらすシステムとして、原核生物（例えば、細菌及び古細菌）で発見された。今では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、研究及び臨床応用で、一般的な遺伝子編集ツールとして適応及び使用されている。

【0434】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは概して、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣａｓタンパク質という少なくとも２つの構成要素を含む。そのＣａｓタンパク質は、ＤＳＢを標的部位に導入するヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、２つの主なクラスに分類され、クラス１システムでは、核酸を分解するのに複数のＣａｓタンパク質の複合体を使用し、クラス２システムでは、同じ目的で、１つの大きなＣａｓタンパク質を使用する。クラス１は、Ｉ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型に分けられ、クラス２は、ＩＩ型、Ｖ型及びＶＩ型に分けられる。遺伝子編集用途に適応される様々なＣａｓタンパク質としては、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、Ｃｍｒ５、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｆ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｎ２、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３及びＭａｄ７が挙げられるが、これらに限定されない。最も広く使用されるＣａｓ９は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質であり、例示として本明細書に記載されている。これらのＣａｓタンパク質は、様々な供給源種に由来してよい。例えば、Ｃａｓ９は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）またはＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）から得ることができる。

【0435】

元の微生物のゲノムにおいて、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、侵入してきたＤＮＡの配列が、宿主ゲノム内のアレイとしてコードされるＣＲＩＳＰＲリピート配列の間に組み込まれている。ＣＲＩＳＰＲリピートアレイからの転写産物は、侵入してきたＤＮＡから転写された可変配列（「プロトスペーサー」配列として知られている）と、ＣＲＩＳＰＲリピートの一部とをそれぞれ有するＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）にプロセシングされる。それぞれのｃｒＲＮＡは、第２のトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とハイブリダイズし、これらの２つのＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと複合体を形成する。ｃｒＲＮＡのうち、プロトスペーサーによってコードされた部分は、標的ＤＮＡ配列が「プロトスペーサー隣接モチーフ」（ＰＡＭ）として知られる短い配列に隣接していることを条件として、相補的な標的ＤＮＡ配列を切断するようにＣａｓ９複合体を誘導する。

【0436】

その発見以来、ＣＲＩＳＰＲシステムは、細菌から、ヒト細胞を含む真核細胞までに及ぶ広範な細胞及び生物において、配列特異的なＤＳＢ及び標的ゲノム編集を誘導するのに適応されてきた。遺伝子編集用途でＣＲＩＳＰＲシステムを使用する際には、元のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、人工的に設計された合成ｇＲＮＡに置き換えられている。例えば、ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ、テトラループ及びｔｒａｃｒＲＮＡから構成されるシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であることができる。ｃｒＲＮＡは通常、目的の標的ＤＮＡを認識するようにユーザーが設計した相補的な領域（スペーサーともいう、通常は約２０ヌクレオチド長）を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、Ｃａｓヌクレアーゼ結合のためのスキャフォールド領域を含む。ｃｒＲＮＡ配列とｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、テトラループによって連結されており、それぞれ、相互にハイブリダイズするための短いリピート配列を有し、それにより、キメラｓｇＲＮＡが得られる。ｇＲＮＡに存在するスペーサーまたは相補的領域の配列を変更するだけで、Ｃａｓヌクレアーゼのゲノム標的を変更できる。その相補的領域は、標準的なＲＮＡ－ＤＮＡの相補的な塩基対合則を通じて、Ｃａｓヌクレアーゼを標的ＤＮＡ部位に誘導することになる。

【0437】

Ｃａｓヌクレアーゼが機能するためには、ゲノムＤＮＡ内の標的配列のすぐ下流にＰＡＭが存在しなければならない。ＰＡＭがＣａｓタンパク質により認識されると、隣接するゲノム配列が不安定化して、その配列がｇＲＮＡによってインタロゲーションされ、一致する配列が存在すると、ｇＲＮＡとＤＮＡの対合が行われると考えられている。ＰＡＭ特有の配列は、Ｃａｓ遺伝子の種に応じて様々である。例えば、Ｓ．ピオゲネスに由来する、最も一般的に使用されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、５’－ＮＧＧ－３’というＰＡＭ配列を認識するか、または、それよりも低い効率で５’－ＮＡＧ－３’（「Ｎ」は、いずれのヌクレオチドであることもできる）を認識する。代替的なＰＡＭを用いる他のＣａｓヌクレアーゼバリアントも特徴付けられており、ゲノム編集での使用で成果を収めており、これらのバリアントは、以下の表１ａにまとめられている。

【0438】

【表1a】

【0439】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、その活性、特異性、認識性及び／またはその他の特性を変化させるための１つ以上の変異を含んでよい。例えば、そのＣａｓヌクレアーゼは、オフターゲット効果を軽減するために、その忠実度を変化させる１つ以上の変異を有してよい（例えば、ｅＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＨｙｐａＳｐＣａｓ９、ＨｅＦＳｐＣａｓ９及びｅｖｏＳｐＣａｓ９は、忠実度の高いＳｐＣａｓ９バリアントである）。別の例として、そのＣａｓヌクレアーゼは、そのＰＡＭ特異性を変化させる１つ以上の変異を有してもよい。

【0440】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載のＣａｓタンパク質またはその機能的部分のいずれか１つを含む。本明細書で使用する場合、「機能的部分」とは、少なくとも１つのリボ核酸（例えばガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体を形成して、標的ポリヌクレオチド配列を切断する能力を保持しているペプチド部分を指す。いくつかの実施形態では、その機能的部分は、機能可能に連結されたＣａｓ９タンパク質機能的ドメインの組み合わせであって、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択した組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、その機能的部分は、機能可能に連結されたＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られる）タンパク質機能的ドメインの組み合わせであって、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択した組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、その機能的ドメインは、複合体を形成する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９タンパク質の機能的部分は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ１２ａタンパク質の機能的部分は、ＲｕｖＣ様ドメインの機能的部分を含む。

【0441】

いくつかの実施形態では、適切なＣａｓタンパク質としては、Ｃａｓ０、Ｃａｓ１２ａ（すなわちＣｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｉ、ＣａｓＸ及びＭａｄ７が挙げられるが、これらに限定されない。

【0442】

いくつかの実施形態では、外因性Ｃａｓタンパク質を細胞内に、ポリペプチドの形態で導入できる。ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、細胞透過ポリペプチドまたは細胞透過ペプチドにコンジュゲートまたは融合できる。本明細書で使用する場合、「細胞透過ポリペプチド」は、分子の細胞内への取り込みを促すポリペプチドを指し、「細胞透過ペプチド」は、分子の細胞内への取り込みを促すペプチドを指す。その細胞透過ポリペプチドは、検出可能な標識を含むことができる。

【0443】

ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、荷電タンパク質（例えば、正電荷、負電荷または全体的に中性の電荷を有するタンパク質）にコンジュゲートまたは融合できる。このような連結は、共有結合であってよい。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、正電荷の高いＧＦＰに融合して、そのＣａｓタンパク質が細胞を透過する能力を大幅に上昇させることができる（Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０１０；５（８）：７４７－５２）。ある特定の実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、タンパク質トランスダクションドメイン（ＰＴＤ）に融合して、そのタンパク質の細胞内への侵入を促すことができる。例示的なＰＴＤとしては、Ｔａｔ、オリゴアルギニン及びペネトラチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９タンパク質は、細胞透過ペプチドに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９タンパク質は、ＰＴＤに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９タンパク質は、ｔａｔドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９タンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９タンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９タンパク質は、正電荷の高いＧＦＰに融合されたＣａｓ９ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ１２ａタンパク質は、細胞透過ペプチドに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ１２ａタンパク質は、ＰＴＤに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ１２ａタンパク質は、ｔａｔドメインに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ１２ａタンパク質は、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ１２ａタンパク質は、ペネトラチンドメインに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ１２ａタンパク質は、正電荷の高いＧＦＰに融合されたＣａｓ１２ａポリペプチドを含む。

【0444】

いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、そのＣａｓタンパク質をコードする核酸の形態で、標的ポリヌクレオチド配列を含む細胞内に導入できる。その核酸を細胞内に導入するプロセスは、いずれかの適切な技法によって行うことができる。適切な技法としては、リン酸カルシウムまたは脂質の媒介によるトランスフェクション、エレクトロポレーション及びトランスダクション、またはウイルスベクターを用いた感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、その核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、その核酸は、本明細書に記載されているような改変ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、その核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、その核酸は、本明細書に記載されているような改変ｍＲＮＡ（例えば、合成の改変ｍＲＮＡ）を含む。

【0445】

いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、１～２個のリボ核酸（例えばガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、本明細書に記載されているような改変核酸（例えば、合成の改変ｍＲＮＡ）によってコードされる。

【0446】

提供する実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは概して、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣａｓタンパク質という２つの構成要素を含む。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、その１つ以上、例えば１～２個のリボ核酸（例えばガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ））と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、２つのリボ核酸と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、１つのリボ核酸と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓタンパク質は、本明細書に記載されているような改変核酸（例えば、合成の改変ｍＲＮＡ）によってコードされる。

【0447】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓが結合するためのスキャフォールド配列と、ユーザーが設計したスペーサー、すなわち相補的部分（ｃｒＲＮＡと称される）から構成される短い合成ＲＮＡである。そのｃＲＮＡは、ｃｒＲＮＡターゲティング配列（本明細書では、以下、ｇＲＮＡターゲティング配列ともいう。通常、約２０ヌクレオチド長）であって、改変対象であるゲノム標的を定める配列と、ｃｒＲＮＡリピートからなる領域（例えば、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ（配列番号２６））から構成される。ｇＲＮＡに存在する相補的部分の配列（例えばｇＲＮＡターゲティング配列）を変更するだけで、Ｃａｓタンパク質のゲノム標的を変更できる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ結合のためのスキャフォールド配列は、そのアンチリピート配列を通じてｃｒＲＮＡにハイブリダイズするｔｒａｃｒＲＮＡの配列（例えば、ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号２７））で構成されている。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体は、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）をリクルートし、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流を切断する。Ｃａｓタンパク質が機能するためには、ゲノムＤＮＡ内の標的配列のすぐ下流にＰＡＭがなければならない。ＰＡＭがＣａｓタンパク質により認識されると、隣接するゲノム配列が不安定化して、その配列がｇＲＮＡによってインタロゲーションされ、一致する配列が存在すると、ｇＲＮＡとＤＮＡの対合が行われると考えられている。ＰＡＭ特有の配列は、Ｃａｓ遺伝子の種に応じて様々である。例えば、Ｓ．ピオゲネスに由来する、最も一般的に使用されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、ＮＧＧというＰＡＭ配列を認識する。代替的なＰＡＭを用いる他のＣａｓ９バリアント及び他のヌクレアーゼも特徴付けられており、ゲノム編集での使用で成果を収めている。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、標的座位に合わせて設計されたｇＲＮＡと相補的である所定のゲノム遺伝子座に、狙ったＤＳＢを生じさせることができる。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、キメラシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ、Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．２０１３）であるｇＲＮＡを作製するために、ループ配列（例えばＧＡＡＡテトラループ）を用いて連結することができる。ｓｇＲＮＡは、ＤＮＡベースでの発現用に、または化学合成によって生成できる。

【0448】

いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡの相補的部分の配列（例えばｇＲＮＡターゲティング配列）は、目的の標的部位に応じて変動することになる。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、遺伝子に特異的な相補的部分の配列であって、表１ｂに示されている配列を含む。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡが標的とするゲノム遺伝子座は、記載されているような座位のいずれかから４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内または５００ｂｐ以内に位置する。

【0449】

本明細書に開示されている方法では、Ｃａｓタンパク質を標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導するとともに、そのモチーフにハイブリダイズすることができるいずれかのリボ核酸の使用が想定されている。いくつかの実施形態では、そのリボ核酸の少なくとも１つは、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、そのリボ核酸の少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、１本のリボ核酸が、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導するとともに、そのモチーフにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、リボ核酸の少なくとも１つが、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導するとともに、そのモチーフにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、その１～２本のリボ核酸の両方が、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導するとともに、そのモチーフにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。本発明で提供するリボ核酸は、当業者には理解されるように、使用する具体的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、及び標的ポリヌクレオチドの配列に応じて、多種多様な標的モチーフにハイブリダイズするように選択できる。１～２本のリボ核酸は、標的ポリヌクレオチド配列以外の核酸配列とのハイブリダイゼーションが最小限となるように選択することもできる。いくつかの実施形態では、１～２本のリボ核酸は、その細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときに、ミスマッチを少なくとも２つ含む標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１～２本のリボ核酸は、その細胞内のすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比べたときにミスマッチを少なくとも１つ含む標的モチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１～２本のリボ核酸は、Ｃａｓタンパク質に認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接した標的モチーフにハイブリダイズするように設計されている。いくつかの実施形態では、１～２本のリボ核酸のそれぞれは、Ｃａｓタンパク質に認識されるデオキシリボ核酸モチーフに直接隣接した標的モチーフにハイブリダイズするように設計されており、そのデオキシリボ核酸モチーフは、それらの標的モチーフ間にある変異アレルを挟み込んでいる。

【0450】

いくつかの実施形態では、１～２本のリボ核酸のそれぞれが、Ｃａｓタンパク質を細胞内の標的ポリヌクレオチド配列の標的モチーフに誘導するとともに、そのモチーフにハイブリダイズするガイドＲＮＡを含む。

【0451】

いくつかの実施形態では、１本または２本のリボ核酸（例えばガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の同じ鎖上の配列と相補的であり、及び／またはその配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１本または２本のリボ核酸（例えばガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の逆鎖上の配列と相補的であり、及び／またはその配列にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１本または２本のリボ核酸（例えばガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の逆鎖上の配列と相補的ではなく、及び／またはその配列にハイブリダイズしない。いくつかの実施形態では、１本または２本のリボ核酸（例えばガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列の重複する標的モチーフと相補的であり、及び／またはそのモチーフにハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、１本または２本のリボ核酸（例えばガイドＲＮＡ）は、標的ポリヌクレオチド配列のオフセット標的モチーフと相補的であり、及び／またはそのモチーフにハイブリダイズする。

【0452】

いくつかの実施形態では、ウイルストランスダクション（例えばレンチウイルストランスダクション）を介して、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、及び少なくとも１～２本のリボ核酸をコードする核酸を細胞内に導入する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１～２本のリボ核酸と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、２本のリボ核酸と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、１本のリボ核酸と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、本明細書に記載されているような改変核酸（例えば、合成の改変ｍＲＮＡ）によってコードされる。

【0453】

本明細書に記載の遺伝子をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースで標的とするのに有用な例示的なｇＲＮＡ配列は、表１ｂに示されている。その配列は、２０１６年５月９日に出願されたＷＯ２０１６１８３０４１に見ることができ、その開示は、表、付表及び配列表を含め、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0454】

【表1b】

【0455】

本明細書に記載の遺伝子をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースで標的とするのに有用な追加の例示的なＣａｓ９ガイドＲＮＡ配列は、表１ｃに示されている。

【0456】

【表2A】

【0457】

いくつかの実施形態では、記載されているような遺伝子の発現を低下または消失させるための遺伝子破壊法で使用するための新たな座位及び／またはｇＲＮＡターゲティング配列を特定することは、当業者の技能レベルの範囲内である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、特定の座位（例えば、例えば表１ｂに示されている標的遺伝子内の座位）に対して既存のｇＲＮＡターゲティング配列が知られているときには、「インチワーミング」アプローチを用いて、ＰＡＭ配列の座位の両側のフランキング領域をスキャニングすること（これは通常、ゲノム全体にわたり、約１００塩基対（ｂｐ）ごとに行う）によって、導入遺伝子の標的挿入用の追加の座位を特定できる。ＰＡＭ配列は、使用する具体的なＣａｓヌクレアーゼによって決まる。通常、ヌクレアーゼによって、対応するＰＡＭ配列が異なるからである。その座位の両側のフランキング領域は、約５００～４０００ｂｐ長、例えば、約５００ｂｐ長、約１０００ｂｐ長、約１５００ｂｐ長、約２０００ｂｐ長、約２５００ｂｐ長、約３０００ｂｐ長、約３５００ｂｐ長または約４０００ｂｐ長であることができる。その検索範囲内にＰＡＭ配列が特定されたら、遺伝子破壊法で用いるために、その座位の配列に従って新たなガイドを設計できる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、例示として記載されているが、新たな座位を特定するためのこの方法では、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ及びトランスポザーゼを用いるアプローチを含め、記載されているようないずれかの遺伝子編集アプローチを使用できる。

【0458】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の手法を用いて作製する。「ＴＡＬＥヌクレアーゼ」（ＴＡＬＥＮ）は、典型的には転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来する核酸結合ドメインと、核酸標的配列を切断するための１つのヌクレアーゼ触媒ドメインからなる融合タンパク質と意図されている。その触媒ドメインは、好ましくはヌクレアーゼドメイン、より好ましくは、例えば、Ｉ－ＴｅｖＩ、ＣｏｌＥ７、ＮｕｃＡ及びＦｏｋ－Ｉのような、エンドヌクレアーゼ活性を有するドメインである。特定の実施形態では、そのＴＡＬＥドメインは、例えば、Ｉ－ＣｒｅＩ及びＩ－ＯｎｕＩ、またはそれらの機能的バリアントのようなメガヌクレアーゼに融合されていることができる。いくつかの実施形態では、前記ヌクレアーゼは、単量体のＴＡＬＥ－ヌクレアーゼである。単量体のＴＡＬＥ－ヌクレアーゼは、ＷＯ２０１２１３８９２７に記載の、操作ＴＡＬリピートとＩ－ＴｅｖＩの触媒ドメインとの融合体のように、特異的な認識及び切断に二量体化を必要としないＴＡＬＥ－ヌクレアーゼである。転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの細菌種に由来するタンパク質であり、複数の反復配列を含み、それぞれのリピートは、核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に特異的である二残基（ＲＶＤ）を１２位及び１３位に含む。同様のモジュラー式の１塩基ごとの核酸結合特性（ＭＢＢＢＤ）を持つ結合ドメインは、異なる細菌種において、本出願人によって最近発見された新たなモジュラータンパク質からも得ることができる。この新たなモジュラータンパク質には、配列多様性がＴＡＬリピートよりも高いという利点がある。好ましくは、異なるヌクレオチドの認識に関連するＲＶＤは、Ｃを認識するためのＨＤ、Ｔを認識するためのＮＧ、Ａを認識するためのＮＩ、ＧまたはＡを認識するためのＮＮ、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴを認識するためのＮＳ、Ｔを認識するためのＨＧ、Ｔを認識するためのＩＧ、Ｇを認識するためのＮＫ、Ｃを認識するためのＨＡ、Ｃを認識するためのＮＤ、Ｃを認識するためのＨＩ、Ｇを認識するためのＨＮ、Ｇを認識するためのＮＡ、ＧまたはＡを認識するためのＳＮ、Ｔを認識するためのＹＧ、Ａを認識するためのＴＬ、ＡまたはＧを認識するためのＶＴ、及びＡを認識するためのＳＷである。別の実施形態では、１２及び１３番目の必要不可欠なアミノ酸は、ヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｃ及びＧに対するそれらの特異性を調節するため、ならびに特にこの特異性を強化するために、他のアミノ酸残基に変異させることができる。ＴＡＬＥＮキットは、市販されている。

【0459】

いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いて操作する。「ジンクフィンガー結合タンパク質」は、亜鉛イオンの配位を通じてタンパク質構造が安定化した結果、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／またはタンパク質に、好ましくは配列特異的な形で結合するタンパク質またはポリペプチドである。ジンクフィンガー結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと略称される場合が多い。個々のＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、「フィンガー」と称される。ＺＦＰは、少なくとも１つのフィンガー、典型的には２つのフィンガー、３つのフィンガーまたは６つのフィンガーを有する。各フィンガーは、２～４塩基対のＤＮＡ、典型的には３塩基対または４塩基対のＤＮＡに結合する。ＺＦＰは、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。各フィンガーは、典型的には、およそ３０アミノ酸の亜鉛キレート化ＤＮＡ結合サブドメインを含む。このクラスの単一のジンクフィンガーは、１つのβターンの２つのシステイン残基とともに亜鉛と配位結合した２つの不変ヒスチジン残基を含むαヘリックスからなることが研究により実証されている（例えば、Ｂｅｒｇ ＆ Ｓｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１０８１－１０８５（１９９６）を参照されたい）。

【0460】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞は、ホーミングエンドヌクレアーゼを用いて作製する。このようなホーミングエンドヌクレアーゼは、当該技術分野で周知である（Ｓｔｏｄｄａｒｄ ２００５）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ標的配列を認識し、一本鎖切断または二本鎖切断を生じさせる。ホーミングエンドヌクレアーゼは、高度に特異的であり、長さ１２～４５塩基対（ｂｐ）の範囲、通常は長さ１４～４０ｂｐの範囲のＤＮＡ標的部位を認識する。ホーミングエンドヌクレアーゼは、例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧエンドヌクレアーゼ、ＨＮＨエンドヌクレアーゼまたはＧＩＹ－ＹＩＧエンドヌクレアーゼに対応し得る。いくつかの実施形態では、ホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ－ＣｒｅＩバリアントであることができる。

【0461】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞は、メガヌクレアーゼを用いて作製する。メガヌクレアーゼは、定義によれば、大きな配列を認識する配列特異的エンドヌクレアーゼである（Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，Ｂ．Ｓ．ａｎｄ Ｂ．Ｌ．Ｓｔｏｄｄａｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２００１，２９，３７５７－３７７４）。メガヌクレアーゼは、生細胞内の特有の部位を切断することによって、その切断部位の近傍で、遺伝子ターゲティングを１０００倍以上増強できる（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９３，２１，５０３４－５０４０、Ｒｏｕｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９４，１４，８０９６－８１０６、Ｃｈｏｕｌｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９５，１５，１９６８－１９７３、Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３，５０５５－５０６０、Ｓａｒｇｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９７，１７，２６７－７７、Ｄｏｎｏｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ，１９９８，１８，４０７０－４０７８、Ｅｌｌｉｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，９３－１０１、Ｃｏｈｅｎ－Ｔａｎｎｏｕｄｊｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，１８，１４４４－１４４８）。

【0462】

いくつかの実施形態では、本発明で提供する細胞は、ポリペプチドの発現をノックダウンする（例えば、低下、消失または阻害させる）ためのＲＮＡサイレンシングまたはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて作製する。有用なＲＮＡｉ法としては、合成ＲＮＡｉ分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＰＩＷＩ相互作用ＮＲＡ（ｐｉＲＮＡ）、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び当業者に認識されている他の一過性ノックダウン法を用いる方法が挙げられる。配列特異的なｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを含むＲＮＡｉ用の試薬は、市販されている。例えば、上記のいずれか、例えば、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２ＭまたはＮＬＲＣ５のような標的ポリヌクレオチドは、その標的ポリヌクレオチドの標的モチーフと相補的な阻害性核酸、例えばｓｉＲＮＡを細胞内に導入することによるＲＮＡ干渉によって、その細胞内でノックダウンできる。いくつかの実施形態では、上記のいずれか、例えば、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２ＭまたはＮＬＲＣ５のような標的ポリヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡを発現するウイルスを細胞内にトランスダクションすることによって、その細胞内でノックダウンできる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ干渉を用いて、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ及びＮＬＲＣ５からなる群から選択した少なくとも１つの発現を低下または阻害させる。

【0463】

いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同配向型修復（ＨＤＲ）と併せることを含め、二本鎖切断（ＤＳＢ）を媒介する。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、ＤＮＡベースの編集またはプライム編集を含むことができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）を含むことができる。

【0464】

いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、塩基編集と関連するものである。塩基エディター（ＢＥ）は典型的には、Ｃａｓ（「ＣＲＩＳＰＲ関連」）ドメインと核酸塩基改変ドメイン（例えば、天然または進化型のデアミナーゼ、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１（「アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド１」）、ＣＤＡ（「シチジンデアミナーゼ」）及びＡＩＤ（「活性化誘導シチジンデアミナーゼ」）を含むシチジンデアミナーゼ）ドメインとの融合体である。いくつかの事例では、塩基エディターは、細胞のＤＮＡ修復プロセスを変化させて、結果として生じる一塩基変化の効率及び／または安定性を高めるタンパク質またはドメインも含んでよい。

【0465】

いくつかの態様では、現在利用可能な塩基エディターとしては、標的Ｃ・ＧをＴ・Ａへ変換するシチジン塩基エディター（例えばＢＥ４）、及び標的Ａ・ＴをＧ・Ｃへ変換するアデニン塩基エディター（例えばＡＢＥ７．１０）が挙げられる。いくつかの態様では、Ｃａｓ９による標的化を伴う脱アミノ化は、二本鎖ＤＮＡ切断を導入することなく、塩基変化を誘導するように設計された塩基エディター（ＢＥ）システムと併せるものと初めて示された。さらに、不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）に融合したラットデアミナーゼＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１）を用いて、ｓｇＲＮＡのＰＡＭの上流でシチジンをチミジンに変換するのに成功した。いくつかの態様では、ｄＣａｓ９を、脱アミノ化されたシチジンの反対側の鎖にニックを入れる「ニッカーゼ」Ｃａｓ９ Ｄ１０Ａに変化させることによって、この最初のＢＥシステムを最適化した。理論に束縛されるものではないが、これにより、ロングパッチ塩基除去修復（ＢＥＲ）が開始されると予想される。この場合、脱アミノ化された鎖が修復のテンプレートとして優先的に使用されて、Ｕ：Ａ塩基対が生成され、次いで、この塩基対が、ＤＮＡ複製中にＴ：Ａに変換される。

【0466】

いくつかの実施形態では、その塩基エディターは、触媒活性を持たない第１のＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、塩基編集活性を持つドメイン、及びニッカーゼ活性を持つ第２のＤＮＡ結合タンパク質ドメインを含む核酸塩基エディターであり、これらのＤＮＡ結合タンパク質ドメインは、１つの融合タンパク質上に発現するか、または別々に（例えば、別々の発現ベクター上に）発現する。いくつかの実施形態では、その塩基エディターは、塩基編集活性を持つドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼ）、及び核酸をプログラム可能な２つのＤＮＡ結合タンパク質ドメイン（ｎａｐＤＮＡｂｐ）を含む融合タンパク質であり、その第１のｎａｐＤＮＡｂｐは、ニッカーゼ活性を含み、第２のｎａｐＤＮＡｂｐは、触媒活性を持たず、少なくとも、それらの２つのｎａｐＤＮＡｂｐは、リンカーによって結合されている。いくつかの実施形態では、その塩基エディターは、ニッカーゼ活性を持つ、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えばＣａｓ９）のＤＮＡドメイン（ｎＣａｓ、ｎＣａｓ９）、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えばＣａｓ９）の、触媒活性を持たないドメインであって、核酸をプログラム可能なＤＮＡ結合活性を持つドメイン（ｄＣａｓ、例えばｄＣａｓ９）、及びデアミナーゼドメインを含む融合タンパク質であり、そのｄＣａｓは、そのｎＣａｓにリンカーによって結合されているとともに、そのｄＣａｓは、そのデアミナーゼドメインに直接隣接している。いくつかの実施形態では、その塩基エディターは、アデニンからチミンへのトランスバージョン、すなわち「ＡＴＢＥ」トランスバージョン（またはチミンからアデニンへのトランスバージョン、すなわち「ＴＡＢＥ」トランスバージョン）塩基エディターである。例示的な塩基エディター及び塩基エディターシステムとしては、特許出願番号ＵＳ２０２２０１２７６２２、ＵＳ２０２１００７９３６６、ＵＳ２０２００２４８１６９、ＵＳ２０２１００９３６６７、ＵＳ２０２１００７１１６３、ＷＯ２０２０１８１２０２、ＷＯ２０２１１５８９２１、ＷＯ２０１９１２６７０９、ＷＯ２０２０１８１１７８、ＷＯ２０２０１８１１９５、ＷＯ２０２０２１４８４２、ＷＯ２０２０１８１１９３に記載されているようないずれかが挙げられ、これらの特許は、その全体が本明細書に援用される。

【0467】

いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、標的プライム逆転写（ＴＰＲＴ）、すなわち「プライム編集」である。いくつかの実施形態では、プライム編集は、ＤＳＢまたはドナーＤＮＡテンプレートを必要とせずに、ヒト細胞内で、標的挿入、欠失、１２個の考え得るすべての塩基間変換、及びそれらの組み合わせを媒介する。

【0468】

プライム編集は、核酸をプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質（「ｎａｐＤＮＡｂｐ」）であって、ポリメラーゼ（すなわち、融合タンパク質の形態のポリメラーゼ、またはｎａｐＤＮＡｂｐとトランスで別段に供給されたポリメラーゼ）と連携して機能するタンパク質を用いて、新たな遺伝子情報を所定のＤＮＡ部位に直接書き込むゲノム編集法であり、そのプライム編集システムでは、標的部位を指定するとともに、ガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡの５’末端もしくは３’末端、または内部部分）上に操作された伸長部（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）により、置換用ＤＮＡ鎖の形態での所望の編集部の合成のテンプレートとなるプライム編集（ＰＥ）ガイドＲＮＡ（「ＰＥｇＲＮＡ」）を用いてプログラムが行われる。所望の編集部（例えば一核酸塩基置換）を含む置換用鎖は、編集対象である標的部位の内在性の鎖と同じ配列を有する（ただし、所望の編集部を含むことを除く）。ＤＮＡ修復及び／または複製機構を通じて、標的部位の内在性の鎖は、所望の編集部を含む新たに合成された置換用鎖に置き換えられる。いくつかの事例では、プライム編集は、「検索及び置換」ゲノム編集技術と考えられる場合がある。プライムエディターは、編集対象である所望の標的部位を検索して、その位置を特定するとともに、対応する、標的部位の内在性ＤＮＡ鎖の代わりに同時に導入される所望の編集部を含む置換用鎖をコードするからである。例えば、プライム編集は、二本鎖切断を回避するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの高精度なゲノム編集を行えるように適合させることができる。いくつかの実施形態では、その相同タンパク質は、所定のＤＮＡ配列をガイドＲＮＡで標的とし、その標的部位に一本鎖ニックを入れ、ニックの入ったＤＮＡを、ガイドＲＮＡとともに組み込まれた操作済みの逆転写酵素用テンプレートの逆転写時のプライマーとして使用するＣａｓタンパク質－逆転写酵素融合体もしくは関連システムであるか、またはその融合体もしくはシステムをコードする。いくつかの実施形態では、そのプライムエディタータンパク質は、ゲノムＤＮＡの対合鎖上で相補的なＤＮＡフラップ合成のテンプレートとなる２本のプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）と対になっており、その結果、ＰＥの誘導によるニック部位の間の内在性ＤＮＡ配列が、ｐｅｇＲＮＡによってコードされる配列に置き換えられる。

【0469】

いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、逆転写酵素または当該技術分野で知られているいずれかのＤＮＡポリメラーゼであるプライムエディターと関連する。したがって、一態様では、そのプライムエディターは、標的ＤＮＡ内の相補的なプロトスペーサーにアニーリングするスペーサー配列を含む特有のガイドＲＮＡ（すなわちＰＥｇＲＮＡ）と連携することによって、ＤＮＡ配列を標的とするようにプログラムされているＣａｓ９（または同等のｎａｐＤＮＡｂｐ）を含むことがある。このような方法としては、Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５８６－０１９－１７１１－４）、または国際公開番号ＷＯ２０２０１９１２４８号、ＷＯ２０２１２２６５５８号もしくはＷＯ２０２２０６７１３０号に開示されているいずれかが挙げられ、これらの文献は、その全体が本明細書に援用される。

【0470】

いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）である。いくつかの態様では、ＰＡＳＴＥは、逆転写酵素及びセリンインテグラーゼの両方に融合されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ニッカーゼを介して、ゲノム挿入を誘導するプラットフォームである。Ｉｏａｎｎｉｄｉ ｅｔ ａｌ．（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２１．１１．０１．４６６７８６）に記載されているように、ＰＡＳＴＥは、二本鎖切断を生じさせないが、約３６ｋｂほどの大きさの配列を組み込み可能にする。いくつかの実施形態では、そのセリンインテグラーゼは、当該技術分野で知られているいずれかであることができる。いくつかの実施形態では、ＰＡＳＴＥをマルチプレックス型の遺伝子組み込みに利用して、少なくとも２つの異なる遺伝子を少なくとも２つのゲノム遺伝子座に同時に組み込むことができるように、そのセリンインテグラーゼは、十分なオルソゴナル性を有する。いくつかの実施形態では、ＰＡＳＴＥは、編集効率が、相同組み換え修復または非相同末端結合ベースの組み込みの編集効率と同等であるか、またはそれよりも優れており、非分裂細胞でも活性があり、検出可能なオフターゲットイベントが少ない。

【0471】

２．例示的な標的ポリヌクレオチド、及び発現を低下させる方法
Ａ．ＭＩＣＡ
ある特定の実施形態では、その改変、例えば遺伝子改変により、ＭＩＣＡの発現を低下または消失、例えばノックアウトさせる。ＭＩＣＡは、既知のアイソフォーム及びバリアントを有するタンパク質であり（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ２９９８３（２０２１年８月９日にアクセスした）を参照されたい）、このようなあらゆる形態のＭＩＣＡは、本明細書に示されている開示内容に含まれる。いくつかの実施形態では、その遺伝子改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて行う。例えば、いくつかの実施形態では、ＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＣＡＴＡＴＣＡというターゲティング配列を有するｇＲＮＡを使用できる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、及びＭＩＣＡを標的とするｇＲＮＡ、例えば、ＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＣＡＴＡＴＣＡというターゲティング配列を有するｇＲＮＡを用いた遺伝子編集法により、細胞内で、ＭＩＣＡのアレルのすべてをノックアウトする。いくつかの実施形態では、その細胞は、投与すると、例えば、レシピエント対象または患者において低免疫原性とみなされ、その対象は、既存の抗ＭＩＣＡ抗体を有するか、または後に、その細胞が、その個体の体内でまだ循環している間に、抗ＭＩＣＡ抗体を発現する。ＭＩＣＡとＭＩＣＢとの配列類似性により、いくつかの実施形態では、１つの抗体が、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの両方に結合し得る。本明細書の目的では、両方の抗体に結合する抗体（すなわち、抗ＭＩＣＡかつ抗ＭＩＣＢの抗体）は、抗ＭＩＣＡ抗体として分類できる。抗ＭＩＣＡ抗体という用語の使用によっても、その抗体が、ＭＩＣＢにも特異的に結合する可能性は消失しない。

【0472】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＡ遺伝子を標的とする改変、例えば遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＣＡ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ＭＩＣＡ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸配列とを含む標的化ヌクレアーゼシステムを用いることによるものである。

【0473】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているようなポリペプチド（例えば、キメラ抗原受容体、ＣＤ４７、または本明細書に開示されている別の寛容原性因子）をコードする外因性の核酸または導入遺伝子をＭＩＣＡ遺伝子において挿入する。

【0474】

ＭＩＣＡ遺伝子が不活性化したか試験するアッセイは既知であり、例示的な説明は、本明細書に示されている。一実施形態では、その結果生じた、ＭＩＣＡ遺伝子の遺伝子改変は、ＰＣＲによって評価する。いくつかの実施形態では、その結果生じた、ＭＩＣＡの発現の低下は、フローサイトメトリーによって、例えばＦＡＣＳ解析によってアッセイできる。別の実施形態では、ＭＩＣＡのタンパク質発現は、Ｂ２Ｍタンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、不活性化する改変、例えば遺伝子改変の存在を確認する。いくつかの実施形態では、ＭＩＣＡの発現の低下は、免疫親和性法、例えば、免疫組織化学法または免疫細胞化学法を用いて評価する。

【0475】

いくつかの実施形態では、その操作細胞内のＭＩＣＡの発現または機能の低下は、当該技術分野で知られている技法、例えば、ＭＩＣＡに結合する標識抗体、例えば市販の抗ＭＩＣＡ抗体を用いるＦＡＣＳ法を用いて測定できる。加えて、その細胞を試験して、ＭＩＣＡ複合体が細胞表面上に発現していないことを確認できる。これは、ＦＡＣＳ解析、または他の既知の方法、例えば、上述のように、１つ以上のＭＩＣＡ細胞表面成分に対する抗体を用いる免疫化学的技法（例えば、ＩＨＣもしくはＩＣＣ）によってアッセイしてよい。本発明で提供する操作細胞は、ＭＩＣＡの低減に加えて、マクロファージの食作用及びＮＫ細胞による殺傷に対する感受性が低下している。その操作細胞の低免疫原性の表現型についてアッセイする方法は、下にさらに記載されている。

【0476】

Ｂ．ＭＩＣＢ
ある特定の実施形態では、その改変、例えば遺伝子改変により、ＭＩＣＢの発現を低下または消失、例えばノックアウトさせる。ＭＩＣＢは、既知のアイソフォーム及びバリアントを有するタンパク質であり（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ２９９８０（２０２１年８月９日にアクセスした）を参照されたい）、このようなあらゆる形態のＭＩＣＢは、本明細書に示されている開示内容に含まれる。いくつかの実施形態では、その遺伝子改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて行う。例えば、いくつかの実施形態では、ＧＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＴＡＧＣＧＣというターゲティング配列を有するｇＲＮＡを使用できる。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、及びＭＩＣＡを標的とするｇＲＮＡ、例えば、ＧＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＴＡＧＣＧＣというターゲティング配列を有するｇＲＮＡを用いた遺伝子編集法により、細胞内で、ＭＩＣＢのアレルのすべてをノックアウトする。いくつかの実施形態では、その細胞は、投与すると、例えば、レシピエント対象または患者において低免疫原性とみなされ、その対象は、既存の抗ＭＩＣＢ抗体を有するか、または後に、その細胞が、その個体の体内でまだ循環している間に、抗ＭＩＣＢ抗体を発現する。ＭＩＣＡとＭＩＣＢとの配列類似性により、いくつかの実施形態では、１つの抗体が、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの両方に結合し得る。本明細書の目的では、両方の抗体に結合する抗体（すなわち、抗ＭＩＣＡかつ抗ＭＩＣＢの抗体）は、抗ＭＩＣＢ抗体として分類できる。抗ＭＩＣＢ抗体という用語の使用によっても、その抗体が、ＭＩＣＡにも特異的に結合する可能性は消失しない。

【0477】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＩＣＢ遺伝子を標的とする改変、例えば遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＣＢ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ＭＩＣＢ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸配列とを含む標的化ヌクレアーゼシステムを用いることによるものである。

【0478】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているようなポリペプチド（例えば、キメラ抗原受容体、ＣＤ４７、または本明細書に開示されている別の寛容原性因子）をコードする外因性の核酸または導入遺伝子をＭＩＣＢ遺伝子において挿入する。

【0479】

ＭＩＣＢ遺伝子が不活性化されているかを試験するアッセイは、既知であるとともに、本明細書に記載されている。一実施形態では、その結果生じた、ＭＩＣＢ遺伝子の遺伝子改変は、ＰＣＲによって評価する。いくつかの実施形態では、その結果生じた、ＭＩＣＢの発現の低下は、フローサイトメトリーによって、例えばＦＡＣＳ解析によってアッセイできる。別の実施形態では、ＭＩＣＢのタンパク質発現は、Ｂ２Ｍタンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、不活性化する改変、例えば遺伝子改変の存在を確認する。いくつかの実施形態では、ＭＩＣＢの発現の低下は、免疫親和性法、例えば、免疫組織化学法または免疫細胞化学法を用いて評価する。

【0480】

いくつかの実施形態では、その操作細胞内のＭＩＣＢの発現または機能の低下は、当該技術分野で知られている技法、例えば、ＭＩＣＢに結合する標識抗体、例えば市販の抗ＭＩＣＢ抗体を用いるＦＡＣＳ法を用いて測定できる。加えて、その細胞を試験して、ＭＩＣＢ複合体が細胞表面上に発現していないことを確認できる。これは、ＦＡＣＳ解析、または他の既知の方法、例えば、上述のように、１つ以上のＭＩＣＢ細胞表面成分に対する抗体を用いる免疫化学的技法（例えば、ＩＨＣもしくはＩＣＣ）によってアッセイしてよい。本発明で提供する操作細胞は、ＭＩＣＢの低減に加えて、マクロファージの食作用及びＮＫ細胞による殺傷に対する感受性が低下している。その操作細胞の低免疫原性の表現型についてアッセイする方法は、下にさらに記載されている。

【0481】

Ｃ．ＭＨＣクラスＩ分子
ある特定の実施形態では、その改変、例えば遺伝子改変により、アクセサリー鎖Ｂ２Ｍを標的とすることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子遺伝子の発現を低下または消失、例えばノックアウトさせる。いくつかの実施形態では、その遺伝子改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて行う。Ｂ２Ｍの発現を低下または消失、例えばノックアウトさせることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の表面輸送がブロックされ、当該細胞が、レシピエント対象に生着したときに免疫寛容を示す。いくつかの実施形態では、その細胞は、投与すると、例えば、レシピエント対象または患者において低免疫原性とみなされる。

【0482】

いくつかの実施形態では、本発明で提供する標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのバリアントである。いくつかの実施形態では、その標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのホモログである。いくつかの実施形態では、その標的ポリヌクレオチド配列は、Ｂ２Ｍのオルソログである。

【0483】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現の低下または消失は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－ＣというＭＨＣクラスＩ分子のうちの１つ以上の発現を低下させる改変を介したものである。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現の低下または消失により、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－ＣというＭＨＣクラスＩ分子のうちの１つ以上の発現が低下または消失する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現の低下または消失により、ＨＬＡ－Ａタンパク質の発現が低下または消失する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現の低下または消失により、ＨＬＡ－Ｂタンパク質の発現が低下または消失する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現の低下または消失により、ＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現が低下または消失する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現の低下または消失により、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ及びＨＬＡ－ＣというＭＨＣクラスＩ分子のうちの１つ以上をコードする遺伝子をノックアウトすることによって、前記分子の発現が低下または消失する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ａタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトして、前記ＨＬＡ－Ａタンパク質の発現を低下または消失させる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｂタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトして、前記ＨＬＡ－Ｂタンパク質の発現を低下または消失させる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｃタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトして、前記ＨＬＡ－Ｃタンパク質の発現を低下または消失させる。

【0484】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする改変、例えば遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸配列とを含む標的化ヌクレアーゼシステムを用いることによるものである。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸配列（例えばｇＲＮＡターゲティング配列）は、ＷＯ２０１６／１８３０４１（その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）の付録２または表１５の配列番号８１２４０～８５６４４からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とするｇＲＮＡターゲティング配列は、ＣＧＵＧＡＧＵＡＡＡＣＣＵＧＡＡＵＣＵＵ（配列番号３３）である。

【0485】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているようなポリペプチド（例えば、キメラ抗原受容体、ＣＤ４７、または本明細書に開示されている別の寛容原性因子）をコードする外因性の核酸または導入遺伝子をＢ２Ｍ遺伝子において挿入する。Ｂ２Ｍ座位で標的挿入するための例示的な導入遺伝子としては、本明細書に記載されているようないずれかが挙げられる。

【0486】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しない細胞に由来し、このような実施形態では、その操作細胞は、Ｂ２Ｍのノックアウトを含む。例えば、いくつかの実施形態では、その操作細胞は、野生型ヒト初代膵島細胞に由来し、ＨＬＡクラスＩＩ細胞を発現せず、その操作細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させるために、Ｂ２Ｍのノックアウトを含む（そのノックアウトから本質的になることを含む）。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子に所望の調整を加えるには、別の改変は必要ない。

【0487】

Ｂ２Ｍ遺伝子が不活性化されているかを試験するアッセイは、既知であるとともに、本明細書に記載されている。一実施形態では、その結果生じた、Ｂ２Ｍ遺伝子の遺伝子改変は、ＰＣＲによって評価する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、例えばＨＬＡ－Ｉの発現の低下は、フローサイトメトリーによって、例えばＦＡＣＳ解析によってアッセイできる。別の実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現は、Ｂ２Ｍタンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、不活性化する改変、例えば遺伝子改変の存在を確認する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現の低下は、免疫親和性法、例えば、免疫組織化学法または免疫細胞化学法を用いて評価する。

【0488】

いくつかの実施形態では、その操作細胞内の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子（その細胞がヒト細胞に由来するときにはＨＬＡ Ｉ）の発現または機能の低下は、当該技術分野で知られている技法、例えば、ＨＬＡ複合体に結合する標識抗体を用いるＦＡＣＳ法、例えば、ヒト主要組織適合性ＨＬＡクラスＩ抗原のα鎖に結合する市販のＨＬＡ－Ａ抗体、ＨＬＡ－Ｂ抗体、ＨＬＡ－Ｃ抗体を用いるＦＡＣＳ法を用いて測定できる。加えて、その細胞を試験して、ＨＬＡ Ｉ複合体が細胞表面上に発現していないことを確認できる。これは、上述のように、１つ以上のＨＬＡ細胞表面の構成要素に対する抗体を用いるＦＡＣＳ解析によってアッセイしてよい。本発明で提供する操作細胞は、ＨＬＡ Ｉ（または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子）の低減に加えて、マクロファージの食作用及びＮＫ細胞による殺傷に対する感受性が低下している。その操作細胞の低免疫原性の表現型についてアッセイする方法は、下にさらに記載されている。

【0489】

いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現を低下させる改変は、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現を低下させる。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比べたものである。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現は、約５％超低下し、例えば、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超または約９０％超以上のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現は、最大約１００％低下し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％または最大約５％未満のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現は消失する（例えば、Ｂ２Ｍ ｍＲＮＡの発現が０％である）。いくつかの実施形態では、Ｂ２ＭのｍＲＮＡ発現を低下させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の活性を消失させる。

【0490】

いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現を低下させる改変は、Ｂ２Ｍタンパク質の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比べたものである。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現は、約５％超低下し、例えば、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超または約９０％超以上のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現は、最大約１００％低下し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％または最大約５％未満のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現は消失する（例えば、Ｂ２Ｍタンパク質の発現が０％である）。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍのタンパク質発現を低下させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の活性を消失させる。

【0491】

いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現を低下させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現を低下させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルの１つの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現を低下させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む。

【0492】

いくつかの実施形態では、その改変は、その細胞内の１つ以上のＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、その改変は、その細胞内のすべてのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、その改変は、不活性化または破壊を含み、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるインデルを含む。いくつかの実施形態では、その改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、その改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、その改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域の欠失である。いくつかの実施形態では、そのＢ２Ｍ遺伝子は、ノックアウトされている。

【0493】

Ｄ．ＭＨＣクラスＩＩ分子
ある特定の態様では、その改変、例えば遺伝子改変により、クラスＩＩ分子トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）の発現を標的とすることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子遺伝子の発現を低下または消失、例えばノックアウトさせる。いくつかの実施形態では、その遺伝子改変は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて行う。ＣＩＩＴＡは、ＬＲファミリーまたはヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのタンパク質のメンバーであり、ＭＨＣエンハンセオソームと関係することによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の転写を調節する。ＣＩＩＴＡの発現を低下または消失、例えばノックアウトさせることによって、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させることによって、表面発現も低下する。いくつかの事例では、このような細胞は、レシピエント対象に生着したときに、免疫寛容を示す。いくつかの実施形態では、その細胞は、投与すると、例えば、レシピエント対象または患者において低免疫原性とみなされる。

【0494】

いくつかの実施形態では、その標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのバリアントである。いくつかの実施形態では、その標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのホモログである。いくつかの実施形態では、その標的ポリヌクレオチド配列は、ＣＩＩＴＡのオルソログである。

【0495】

いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下または消失は、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲというＭＨＣクラスＩＩ分子のうちの１つ以上の発現を低下させる改変である。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の低下または消失により、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲというＭＨＣクラスＩＩ分子のうちの１つ以上の発現が低下または消失する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の低下または消失により、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質の発現が低下または消失する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の低下または消失により、ＨＬＡ－ＤＭタンパク質の発現が低下または消失する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の低下または消失により、ＨＬＡ－ＤＯＡタンパク質の発現が低下または消失する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の低下または消失により、ＨＬＡ－ＤＯＢタンパク質の発現が低下または消失する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の低下または消失により、ＨＬＡ－ＤＱタンパク質の発現が低下または消失する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の低下または消失により、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質の発現が低下または消失する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現の低下または消失により、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲというＭＨＣクラスＩＩ分子のうちの１つ以上をコードする遺伝子ノックアウトすることによって、前記分子の発現が低下または消失する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＤＰタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトして、前記ＨＬＡ－ＤＰタンパク質の発現を低下または消失させる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＤＭタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトして、前記ＨＬＡ－ＤＭタンパク質の発現を低下または消失させる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＤＯＡタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトして、前記ＨＬＡ－ＤＯＡタンパク質の発現を低下または消失させる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＤＯＢタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトして、前記ＨＬＡ－ＤＯＢタンパク質の発現を低下または消失させる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＤＱタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトして、前記ＨＬＡ－ＤＱタンパク質の発現を低下または消失させる。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－ＤＲタンパク質をコードする遺伝子をノックアウトして、前記ＨＬＡ－ＤＲタンパク質の発現を低下または消失させる。

【0496】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする改変、例えば遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸配列とを含む標的化ヌクレアーゼシステムによるものである。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸配列（例えばｇＲＮＡターゲティング配列）は、ＷＯ２０１６１８３０４１（その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）の付録１または表１２の配列番号５１８４～３６３５２からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とするｇＲＮＡターゲティング配列は、ＧＡＵＡＵＵＧＧＣＡＵＡＡＧＣＣＵＣＣＣ（配列番号３４）である。

【0497】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているようなポリペプチド（例えば、キメラ抗原受容体、ＣＤ４７、または本明細書に開示されている別の寛容原性因子）をコードする外因性の核酸または導入遺伝子をＣＩＩＴＡ遺伝子において挿入する。Ｂ２Ｍ座位で標的挿入するための例示的な導入遺伝子としては、本明細書に記載されているようないずれかが挙げられる。

【0498】

ＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化されているかを試験するアッセイは、既知であるとともに、本明細書に記載されている。一実施形態では、その結果生じた、ＣＩＩＴＡ遺伝子の遺伝子改変は、ＰＣＲによって評価する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、例えばＨＬＡ－ＩＩの発現の低下は、フローサイトメトリーによって、例えばＦＡＣＳ解析によってアッセイできる。別の実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現は、ＣＩＩＴＡタンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、不活性化する改変、例えば遺伝子改変の存在を確認する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下は、免疫親和性法、例えば、免疫組織化学法または免疫細胞化学法を用いて評価する。

【0499】

いくつかの実施形態では、その操作細胞内の１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（その細胞がヒト細胞に由来するときにはＨＬＡ ＩＩ）の機能の発現の低下は、当該技術分野で知られている技法、例えば、そのタンパク質に対する抗体を用いるウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ法及びＲＴ－ＰＣＲ法を用いて測定できる。いくつかの実施形態では、その細胞を試験して、ＨＬＡ ＩＩ複合体が細胞表面上に発現していないことを確認できる。表面発現を評価する方法としては、当該技術分野で知られている方法が挙げられ（例えば、ＷＯ２０１８１３２７８３の図２１を参照されたい）、概して、ヒトＨＬＡクラスＩＩ分子ＨＬＡ－ＤＲ抗原、ＨＬＡ－ＤＰ抗原及び大半のＨＬＡ－ＤＱ抗原に結合する市販の抗体をベースとして、ウエスタンブロットまたはＦＡＣＳ解析のいずれかを用いて行う。本発明で提供する操作細胞は、ＨＬＡ ＩＩ（または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子）の低減に加えて、マクロファージの食作用及びＮＫ細胞による殺傷に対する感受性が低下している。その操作細胞の低免疫原性の表現型についてアッセイする方法は、下にさらに記載されている。

【0500】

いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現を低下させる改変は、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比べたものである。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現は、約５％超低下し、例えば、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超または約９０％超以上のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現は、最大約１００％低下し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％または最大約５％未満のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現は消失する（例えば、ＣＩＩＴＡ ｍＲＮＡの発現が０％である）。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのｍＲＮＡ発現を低下させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の活性を消失させる。

【0501】

いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現を低下させる改変は、ＣＩＩＴＡタンパク質の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比べたものである。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現は、約５％超低下し、例えば、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超または約９０％超以上のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現は、最大約１００％低下し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％または最大約５％未満のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現は消失する（例えば、ＣＩＩＴＡタンパク質の発現が０％である）。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡのタンパク質発現を低下させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の活性を消失させる。

【0502】

いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現を低下させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現を低下させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルの１つの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現を低下させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む。

【0503】

いくつかの実施形態では、その改変は、その細胞内の１つ以上のＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、その改変は、その細胞内のすべてのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、その改変は、不活性化または破壊を含み、ＣＩＩＴＡ遺伝子におけるインデルを含む。いくつかの実施形態では、その改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、その改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、その改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域の欠失である。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡ遺伝子は、ノックアウトされている。

【0504】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｔ細胞受容体α定常（ＴＲＡＣ）遺伝子を標的とする改変を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする改変は、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ＴＲＡＣ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸配列とを含む標的化ヌクレアーゼシステムによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸ターゲティング配列は、ＵＳ２０１６０３４８０７３（その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）の配列番号５３２～６０９及び９１０２～９７９７からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を特異的に標的とするｇＲＮＡターゲティング配列は、ＡＧＡＧＵＣＵＣＵＣＡＧＣＵＧＧＵＡＣＡ（配列番号３５）である。

【0505】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているようなポリペプチド（例えば、キメラ抗原受容体、ＣＤ４７、または本明細書に開示されている別の寛容原性因子）をコードする外因性の核酸または導入遺伝子をＴＲＡＣ遺伝子において挿入する。ＴＲＡＣ座位で標的挿入するための例示的な導入遺伝子としては、本明細書に記載されているようないずれかが挙げられる。

【0506】

ＴＲＡＣ遺伝子が不活性化されているかを試験するアッセイは、既知であるとともに、本明細書に記載されている。一実施形態では、その結果生じた、ＰＣＲによるＴＲＡＣ遺伝子の改変、及びＨＬＡ－ＩＩの発現の低下は、フローサイトメトリーによって、例えばＦＡＣＳ解析によってアッセイできる。別の実施形態では、ＴＲＡＣのタンパク質発現は、ＴＲＡＣタンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、不活性化する改変の存在を確認する。

【0507】

いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣの発現を低下させる改変は、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比べたものである。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現は、約５％超低下し、例えば、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超または約９０％超以上のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現は、最大約１００％低下し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％または最大約５％未満のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現は消失する（例えば、ＴＲＡＣ ｍＲＮＡの発現が０％である）。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現を低下させる改変は、ＴＲＡＣ遺伝子の活性を消失させる。

【0508】

いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣの発現を低下させる改変は、ＴＲＡＣタンパク質の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのタンパク質発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比べたものである。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのタンパク質発現は、約５％超低下し、例えば、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超または約９０％超以上のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのタンパク質発現は、最大約１００％低下し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％または最大約５％未満のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのタンパク質発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのタンパク質発現は消失する（例えば、ＴＲＡＣタンパク質の発現が０％である）。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのタンパク質発現を低下させる改変は、ＴＲＡＣ遺伝子の活性を消失させる。

【0509】

いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣの発現を低下させる改変は、ＴＲＡＣ遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣの発現を低下させる改変は、ＴＲＡＣ遺伝子のアレルの１つの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣの発現を低下させる改変は、ＴＲＡＣ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む。

【0510】

いくつかの実施形態では、その改変は、その細胞内の１つ以上のＴＲＡＣコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、その改変は、その細胞内のすべてのＴＲＡＣコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、その改変は、不活性化または破壊を含み、ＴＲＡＣ遺伝子におけるインデルを含む。いくつかの実施形態では、その改変は、ＴＲＡＣ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、その改変は、ＴＲＡＣ遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、その改変は、ＴＲＡＣ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域の欠失である。いくつかの実施形態では、そのＴＲＡＣ遺伝子は、ノックアウトされている。

【0511】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｔ細胞受容体β定常（ＴＲＢＣ）遺伝子を標的とする改変を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子を標的とする改変は、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ＴＲＢＣ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸配列とを含む標的化ヌクレアーゼシステムによるものである。

【0512】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているようなポリペプチド（例えば、キメラ抗原受容体、ＣＤ４７、または本明細書に開示されている別の寛容原性因子）をコードする外因性の核酸または導入遺伝子をＴＲＢＣ遺伝子において挿入する。ＴＲＢＣ座位で標的挿入するための例示的な導入遺伝子としては、本明細書に記載されているようないずれかが挙げられる。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸ターゲティング配列は、ＵＳ２０１６０３４８０７３（その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）の配列番号６１０～７６５及び９７９８～１０５３２からなる群から選択されている。

【0513】

ＴＲＢＣ遺伝子が不活性化されているかを試験するアッセイは、既知であるとともに、本明細書に記載されている。一実施形態では、その結果生じた、ＰＣＲによるＴＲＢＣ遺伝子の改変、及びＨＬＡ－ＩＩの発現の低下は、フローサイトメトリーによって、例えばＦＡＣＳ解析によってアッセイできる。別の実施形態では、ＴＲＢＣのタンパク質発現は、ＴＲＢＣタンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、不活性化する改変の存在を確認する。

【0514】

いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣの発現を低下させる改変は、ＴＲＢＣのｍＲＮＡ発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのｍＲＮＡ発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比べたものである。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのｍＲＮＡ発現は、約５％超低下し、例えば、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超または約９０％超以上のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのｍＲＮＡ発現は、最大約１００％低下し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％または最大約５％未満のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのｍＲＮＡ発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのｍＲＮＡ発現は消失する（例えば、ＴＲＢＣ ｍＲＮＡの発現が０％である）。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのｍＲＮＡ発現を低下させる改変は、ＴＲＢＣ遺伝子の活性を消失させる。

【0515】

いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣの発現を低下させる改変は、ＴＲＢＣタンパク質の発現を低下させる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣのタンパク質発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の未改変細胞または野生型細胞と比べたものである。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのタンパク質発現現は、約５％超低下し、例えば、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超または約９０％超以上のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのタンパク質発現は、最大約１００％低下し、例えば、最大約９０％、最大約８０％、最大約７０％、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、最大約１０％または最大約５％未満のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのタンパク質発現は、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約１００％のいずれか低下する。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのタンパク質発現は消失する（例えば、ＴＲＢＣタンパク質の発現が０％である）。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣのタンパク質発現を低下させる改変は、ＴＲＢＣ遺伝子の活性を消失させる。

【0516】

いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣの発現を低下させる改変は、ＴＲＢＣ遺伝子の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣの発現を低下させる改変は、ＴＲＢＣ遺伝子のアレルの１つの不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣの発現を低下させる改変は、ＴＲＢＣ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む。

【0517】

いくつかの実施形態では、その改変は、その細胞内の１つ以上のＴＲＢＣコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、その改変は、その細胞内のすべてのＴＲＢＣコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、その改変は、不活性化または破壊を含み、ＴＲＢＣ遺伝子におけるインデルを含む。いくつかの実施形態では、その改変は、ＴＲＢＣ遺伝子のゲノムＤＮＡのフレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、その改変は、ＴＲＢＣ遺伝子のゲノムＤＮＡの欠失である。いくつかの実施形態では、その改変は、ＴＲＢＣ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域の欠失である。いくつかの実施形態では、そのＴＲＢＣ遺伝子は、ノックアウトされている。

【0518】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１つ以上の主要組織適合性複合体クラスＩ分子（ＭＨＣクラスＩ分子）及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる１つ以上の改変を含み、その改変は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－ＢまたはＮＦＹ－Ｃの１つ以上の発現の低下を含む。

【0519】

ある特定の態様では、本明細書で教示されている操作細胞は、Ｂ２Ｍ、ＴＡＰ Ｉ、ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯＡ、ＨＬＡ－ＤＯＢ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＮＫ、ＲＦＸＡＰ、ＮＦＹ－Ａ、ＮＦＹ－Ｂ、ＮＦＹ－Ｃ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＩＲＦ１、ＭＩＣ－Ａ、ＭＩＣ－Ｂ、酸化ストレスもしくはＥＲストレスに関与するタンパク質、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＣＤ１４２、ＡＢＯ、ＣＤ３８、ＰＣＤＨ１１Ｙ、ＮＬＧＮ４Ｙ及び／またはＲＨＤの発現を低下させる１つ以上のさらなる改変を含む。酸化ストレスもしくはＥＲストレスに関与する例示的なタンパク質としては、チオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）、ＰＫＲ様ＥＲキナーゼ（ＰＥＲＫ）、イノシトール要求性酵素１α（ＩＲＥ１α）及びＤＪ－１（ＰＡＲＫ７）が挙げられる。

【0520】

Ｂ．ポリヌクレオチドの過剰発現
いくつかの実施形態では、本発明で提供する操作細胞は、１つ以上の改変を細胞内に導入して、所望のポリヌクレオチドをその細胞内で過剰発現させることによるなどして、改変、例えば遺伝子改変または操作されている。いくつかの実施形態では、改変または操作する細胞は、その１つ以上の改変が以前に導入されたことのない未改変細胞または未操作細胞である。いくつかの実施形態では、操作前の細胞が、その寛容原性因子を検出可能な量で発現しない場合、その寛容原性因子をいずれかの検出可能な量で発現させるようにする改変は、その改変を含まない同様の細胞と比べて、発現が増加することであると理解される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作細胞は、外因性タンパク質をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチド（「導入遺伝子」という用語とも同義的に使用する）を含むように遺伝子改変されている。記載されているように、いくつかの実施形態では、その細胞は、レシピエントにおいて免疫の認識及び寛容性に影響を及ぼす寛容原性因子（例えば免疫因子）である特定の遺伝子の発現を増加させるように改変されている。いくつかの実施形態では、提供する操作細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）も発現する。その１つ以上のポリヌクレオチド、例えば、外因性ポリヌクレオチドは、その操作細胞内で、本明細書に記載されているような標的ポリヌクレオチド、例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢのいずれか１つ以上の発現を低下させる１つ以上の改変、例えば遺伝子改変とともに発現（例えば過剰発現）してよい。いくつかの実施形態では、提供する操作細胞は、レシピエント対象に投与すると、免疫応答を誘発または活性化しない。

【0521】

いくつかの実施形態では、標的の発現の増加は、操作細胞内での発現が、その標的の発現を増加させるように操作する前の供給源細胞内でのその標的の対応する発現レベルよりも約４０％以上（約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約１００％以上、約１５０％以上、約２００％以上、約２５０％以上または約５００％以上のいずれかなど）であるレベルまで上昇するような増加である（例えば、タンパク質発現とタンパク質発現とを比べる）。いくつかの実施形態では、標的の発現の増加は、操作細胞内での発現が、参照細胞または参照細胞集団（免疫原性応答が低下または消失している同じ細胞種または細胞の細胞または集団など）内でのその標的の対応する発現レベルよりも約４０％以上（約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約１００％以上、約１５０％以上、約２００％以上、約２５０％以上または約５００％以上のいずれかなど）であるレベルまで上昇するような増加である（例えば、タンパク質発現とタンパク質発現とを比べる）。いくつかの実施形態では、標的の発現の増加は、操作細胞での発現が、測定した発現レベル（その標的の存在により、免疫原性応答が低下または消失していると分かっているレベルなど）以上であるレベルまで上昇するような増加である。いくつかの実施形態では、標的のレベルは、刺激状態または未刺激状態の操作細胞、参照細胞または参照細胞集団で評価する。いくつかの実施形態では、標的のレベルは、その標的が発現しているように（または、細胞が刺激に応答する能力がそのレベルである場合には、その標的が発現するように）刺激した状態の操作細胞、参照細胞または参照細胞集団で評価する。いくつかの実施形態では、その刺激は、ｉｎ ｖｉｖｏ刺激に当たる。

【0522】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個以上の異なる過剰発現ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個以上の異なる過剰発現ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その過剰発現ポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個以上の異なる外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個以上の異なる外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その過剰発現ポリヌクレオチドは、その細胞内でエピソーマルに発現する外因性ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、その過剰発現ポリヌクレオチドは、その操作細胞のゲノム遺伝子座の１つ以上に挿入されているかまたは組み込まれている外因性ポリヌクレオチドである。

【0523】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡターゲティングドメイン及び転写活性化因子を含む融合タンパク質を用いて、ポリヌクレオチドの発現を増加させ、すなわち、そのポリヌクレオチドを過剰発現させる。転写活性化ドメインを用いて発現を増加させる標的化方法は、当業者に知られている。

【0524】

いくつかの実施形態では、操作細胞は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含み、その１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、非標的挿入方法によって、例えば、レンチウイルスベクターを用いたトランスダクションによって、その細胞のゲノム遺伝子座に挿入されているかまたは組み込まれている。いくつかの実施形態では、その１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、標的挿入法によって、例えば、相同組み換え修復（ＨＤＲ）を用いることによって、その細胞のゲノムに挿入されているかまたは組み込まれている。いずれか適切な方法を用いて、本明細書に記載の遺伝子編集法（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を含むＨＤＲによって、その外因性ポリヌクレオチドをその操作細胞のゲノム遺伝子座に挿入できる。いくつかの実施形態では、その１つ以上の外因性ポリヌクレオチドは、１つ以上のゲノム遺伝子座、例えば、本明細書（例えば、表１ｂまたは２）に記載のいずれかのゲノム遺伝子座に挿入されている。いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドは、同じゲノム遺伝子座に挿入されている。いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドは、異なるゲノム遺伝子座に挿入されている。いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドの２つ以上が、同じゲノム遺伝子座、例えば、本明細書（例えば、表１ｂまたは２）に記載のいずれかのゲノム遺伝子座に挿入されている。いくつかの実施形態では、２つ以上の外因性ポリヌクレオチドが、異なるゲノム遺伝子座、例えば、本明細書（例えば、表１ｂまたは２）に記載されているようなゲノム遺伝子座の２つ以上に挿入されている。

【0525】

いくつかの実施形態では、遺伝子編集技術のいずれかを用いて、記載されているような１つ以上の標的ポリヌクレオチドまたは標的タンパク質の発現を増加させることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、ヌクレアーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、リコンビナーゼを伴うシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、（例えば、遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターまたはエンハンサーを改変または活性化することによって、）内在性遺伝子の活性を向上させる改変に用いることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、ゲノムの領域にＤＮＡをノックインするかまたは組み込む（例えば、操作細胞内での発現の増加のために、標的ポリヌクレオチドまたは標的タンパク質をコードするコンストラクト、例えば、寛容原性因子、ＣＤ５５、ＣＤ４６、ＣＤ５９のいずれか、または本明細書に記載の他の分子のいずれかをコードするコンストラクトを導入する）のに用いることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、一本鎖切断（ＳＳＢ）を媒介する。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、二本鎖切断（ＤＳＢ）を媒介し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同配向型修復（ＨＤＲ）と併せることを含む。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、ＤＮＡベースの編集またはプライム編集を含むことができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子編集技術は、部位特異的ターゲティングエレメントによるプログラム可能な付加（ＰＡＳＴＥ）を含むことができる。例示的なポリヌクレオチドまたは過剰発現、及びそのポリヌクレオチドを過剰発現させる方法は、下記のサブセクションに記載されている。

【0526】

１．寛容原性因子
いくつかの実施形態では、その細胞内で、寛容原性因子の発現が過剰発現または増加している。操作前の細胞が、その寛容原性因子を検出可能な量で発現しない場合には、その寛容原性因子をいずれかの検出可能な量で発現させるようにする改変は、その改変を含まない細胞と比べて発現を増加させることであると理解される。

【0527】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、少なくとも１つの寛容原性因子の発現の増加、例えば過剰発現を含む。いくつかの実施形態では、その寛容原性因子は、その操作細胞に対する免疫系（例えば、自然免疫または適応免疫系）による寛容性を促進するか、またはその寛容性の促進もしくは誘導に寄与するいずれかの因子である。

【0528】

いくつかの実施形態では、操作細胞上の１つ以上の寛容原性因子のうちの各寛容原性因子は、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３、Ｃ１インヒビター、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＤ１６、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３５、ＣＤ３９、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２００、ＣＲ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、ＤＵＸ４、ＦａｓＬ、Ｈ２－Ｍ３、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＩＬ－１０、ＩＬ１５－ＲＦ、ＩＬ－３５、ＭＡＮＦ、Ｍｆｇｅ８、ＰＤ－１またはＳｅｒｐｉｎｂ９からなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子の少なくとも１つは、ＣＤ４７である。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４７である。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅを含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ２４を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＰＤ－Ｌ１を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４６を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ５５を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ５９を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＲ１を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＭＡＮＦを含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰ３を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ及びＣＤ４７を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ２４、ＣＤ４７またはＰＤ－Ｌ１の１つ以上（すべてを含む）を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７またはＰＤ－Ｌ１の１つ以上（すべてを含む）を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９またはＣＲ１の１つ以上（すべてを含む）を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９またはＣＲ１の１つ以上（すべてを含む）を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ２４、ＣＤ４７、ＰＤＬ１、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９またはＣＲ１の１つ以上（すべてを含む）を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－ＥまたはＰＤ－Ｌ１の１つ以上（すべてを含む）を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤ－Ｌ１またはＡ２０／ＴＮＦＡＩＰの１つ以上（すべてを含む）を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤ－Ｌ１またはＭＡＮＦの１つ以上（すべてを含む）を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子は、ＨＬＡ－Ｅ、ＰＤ－Ｌ１、Ａ２０／ＴＮＦＡＩＰまたはＭＡＮＦの１つ以上（すべてを含む）を含む。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子のそれぞれは、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８からなる群から選択されている。

【0529】

いくつかの実施形態では、その寛容原性因子は、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ３５、ＣＤ５２、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ及びＨ２－Ｍ３である。いくつかの実施形態では、その寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥもしくはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００もしくはＭｆｇｅ８、またはこれらの組み合わせのいずれかである。いくつかの実施形態では、その細胞は、寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを含む。例えば、いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドである。本発明で提供するのは、レシピエント対象への投与時に、免疫応答を誘発または活性化しない細胞である。上記のように、いくつかの実施形態では、その細胞は、レシピエントにおいて免疫の認識及び寛容性に影響を及ぼす遺伝子及び寛容原性因子（例えば免疫因子）の発現を増加させるように改変されている。

【0530】

いくつかの実施形態では、寛容原性因子の発現（例えば表面発現）は、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約１０％以上増加し、例えば、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約１５％超、約２０％超、約２５％超、約３０％超、約３５％超、約４０％超、約４５％超、約５０％超、約５５％超、約６０％超、約６５％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約１００％超、約１５０％超または約２００％超のいずれか増加する。いくつかの実施形態では、寛容原性因子の発現（例えば表面発現）は、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約２倍以上増加し、例えば、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約４倍以上、約６倍以上、約８倍以上、約１０倍以上、約１５倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約６０倍以上、約７０倍以上、約８０倍以上、約９０倍以上、約１００倍以上、約１５０倍以上または約２００倍以上のいずれか増加する。いくつかの実施形態では、寛容原性因子の発現は、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約２００倍以下増加し、例えば、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約１５０倍以下、約１００倍以下、約９０倍以下、約８０倍以下、約７０倍以下、約６０倍以下、約５０倍以下、約４０倍以下、約３０倍以下、約１５倍以下、約１０倍以下、約８倍以下、約６倍以下、約４倍以下または約２倍以下のいずれか増加する。いくつかの実施形態では、寛容原性因子の発現は、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約２倍～約２００倍増加し、例えば、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約２倍～約２０倍、約１０倍～約５０倍、約３０倍～約７０倍、約５０倍～約１００倍、約８０倍～約１５０倍、及び約１２０倍～約２００倍のいずれか増加する。

【0531】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、少なくとも１つの寛容原性因子の発現の増加、例えば過剰発現を含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ３５、ＣＤ５２、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ及びＨ２－Ｍ３（これらの組み合わせのいずれかを含む）である。いくつかの実施形態では、その寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８（これらの組み合わせのいずれかを含む）の１つ以上である。例えば、いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドである。

【0532】

いくつかの実施形態では、本開示は、寛容原性因子（例えば免疫調節ポリペプチド）、例えばＣＤ４７を発現するように改変されている細胞またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞ゲノムを変化させて、寛容原性因子（例えば免疫調節ポリペプチド）、例えばＣＤ４７を発現させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、外因性の寛容原性因子（例えば免疫調節ポリペプチド）、例えば外因性のＣＤ４７を発現する。いくつかの事例では、その外因性ポリヌクレオチドを過剰発現させるか、またはその発現を増加させることは、ヒトＣＤ４７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、その細胞に導入すること（例えば、その細胞にトランスダクションすること）によって行う。いくつかの実施形態では、その発現ベクターは、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターであってもよいし、または非ウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、その細胞は、１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含むように操作されており、その外因性ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、寛容原性因子をコードするポリヌクレオチドを含む。いずれかの実施形態のいくつかでは、その寛容原性因子は、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ３５、ＣＤ５２、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ及びＨ２－Ｍ３である。いくつかの実施形態では、その寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥもしくはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００もしくはＭｆｇｅ８、またはこれらの組み合わせのいずれかから選択されている。例えば、いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドの少なくとも１つは、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドである。

【0533】

いくつかの実施形態では、その寛容原性因子は、ＣＤ４７である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＣＤ４７、例えばヒトＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７は、その細胞内で過剰発現する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現は、その改変によって操作されていない同じ細胞種の同様の細胞、例えば、参照細胞または未改変細胞、例えば、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドで操作されていない細胞と比べて、その操作細胞内で過剰発現するか、または増加する。ＣＤ４７は、白血球表面抗原であり、インテグリンの細胞接着及び調節において役割を有する。ＣＤ４７は通常、細胞の表面上で発現し、循環マクロファージに、その細胞を食べないようにシグナルを伝達する。ヒトＣＤ４７に関するゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの有用な情報は、例えば、ＮＰ＿００１７６８．１、ＮＰ＿９４２０８８．１、ＮＭ＿００１７７７．３及びＮＭ＿１９８７９３．２に示されている。

【0534】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現（例えば表面発現）は、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約１０％以上増加し、例えば、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約１５％超、約２０％超、約２５％超、約３０％超、約３５％超、約４０％超、約４５％超、約５０％超、約５５％超、約６０％超、約６５％超、約７０％超、約７５％超、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９５％超、約１００％超、約１５０％超または約２００％超のいずれか増加する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現（例えば表面発現）は、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約２倍以上増加し、例えば、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約４倍以上、約６倍以上、約８倍以上、約１０倍以上、約１５倍以上、約２０倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約６０倍以上、約７０倍以上、約８０倍以上、約９０倍以上、約１００倍以上、約１５０倍以上または約２００倍以上のいずれか増加する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現は、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約２００倍以下増加し、例えば、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約１５０倍以下、約１００倍以下、約９０倍以下、約８０倍以下、約７０倍以下、約６０倍以下、約５０倍以下、約４０倍以下、約３０倍以下、約１５倍以下、約１０倍以下、約８倍以下、約６倍以下、約４倍以下または約２倍以下のいずれか増加する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現は、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約２倍～約２００倍増加し、例えば、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べて、約２倍～約２０倍、約１０倍～約５０倍、約３０倍～約７０倍、約５０倍～約１００倍、約８０倍～約１５０倍、及び約１２０倍～約２００倍のいずれか増加する。

【0535】

いくつかの実施形態では、本明細書に概説されている細胞は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ番号ＮＰ＿００１７６８．１及びＮＰ＿９４２０８８．１に示されているようなアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上）であるＣＤ４７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説されている細胞は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ番号ＮＰ＿００１７６８．１及びＮＰ＿９４２０８８．１に示されているようなアミノ酸配列を有するＣＤ４７ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ．番号ＮＭ＿００１７７７．３及びＮＭ＿１９８７９３．２に示されている配列との配列同一性が少なくとも８５％（例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上）である、ＣＤ４７のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ番号ＮＭ＿００１７７７．３及びＮＭ＿１９８７９３．２に示されているような、ＣＤ４７のヌクレオチド配列を含む。

【0536】

いくつかの実施形態では、その細胞は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ番号ＮＰ＿００１７６８．１及びＮＰ＿９４２０８８．１に示されているようなアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上）であるＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に概説されている細胞は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ番号ＮＰ＿００１７６８．１及びＮＰ＿９４２０８８．１に示されているようなアミノ酸配列を有するＣＤ４７ポリペプチドを含む。

【0537】

いくつかの実施形態では、その細胞は、配列番号１に示されているようなアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上）であるＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、配列番号１に示されているようなアミノ酸配列を有するＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、配列番号２に示されているようなアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上）であるＣＤ４７ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、配列番号２に示されているようなアミノ酸配列を有するＣＤ４７ポリペプチドを含む。

【0538】

ある特定の実施形態では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結されている。

【0539】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、下にさらに説明されているような標的挿入法または非標的挿入法によって、その細胞のゲノムに組み込まれている。いくつかの実施形態では、標的挿入は、標的座位への相同性依存型の挿入、例えば、表１ｂまたは２に示されている遺伝子座、例えば、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子、ＴＲＢＣ遺伝子のうちのいずれか１つへの挿入などによるものである。いくつかの実施形態では、標的挿入は、相同性非依存型の挿入、例えばセーフハーバー座位への挿入によるものである。いくつかの事例では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、以下に限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１から選択した遺伝子座のようなセーフハーバー座位に挿入する。特定の実施形態では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＭＩＣＡ遺伝子座またはＭＩＣＢ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｔ細胞であり、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、適切な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのいずれか）を用いて、ＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドの、その細胞のゲノム遺伝子座への挿入を促す。

【0540】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４７のタンパク質発現は、ＣＤ４７タンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、外因性ＣＤ４７のｍＲＮＡの存在を確認する。

【0541】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＣＤ２００、例えばヒトＣＤ２００をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２００は、その細胞内で過剰発現する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２００の発現は、その参照細胞または未改変細胞が、ＣＤ２００をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除き同様の参照細胞または未改変細胞（いずれかの他の改変、例えば遺伝子改変を有する細胞を含む）と比べて、その操作細胞内で増加する。ヒトＣＤ２００に関するゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの有用な情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＧＣ０３Ｐ１１２３３２、ＨＧＮＣ番号７２０３、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ４３４５、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ４１２１７、ならびにＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００１００４１９６．２、ＮＭ＿００１００４１９６．３、ＮＰ＿００１３０５７５７．１、ＮＭ＿００１３１８８２８．１、ＮＰ＿００５９３５．４、ＮＭ＿００５９４４．６、ＸＰ＿００５２４７５３９．１及びＸＭ＿００５２４７４８２．２に示されている。ある特定の実施形態では、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結されている。

【0542】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、表１ｂまたは２に示されている遺伝子座のいずれか１つに挿入する。いくつかの事例では、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、以下に限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１から選択した遺伝子座のようなセーフハーバー座位に挿入する。特定の実施形態では、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＭＩＣＡ遺伝子座またはＭＩＣＢ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｔ細胞であり、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、適切な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのいずれか）を用いて、ＣＤ２００をコードするポリヌクレオチドの、その細胞のゲノム遺伝子座への挿入を促す。

【0543】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２００のタンパク質発現は、ＣＤ２００タンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、外因性ＣＤ２００のｍＲＮＡの存在を確認する。

【0544】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＨＬＡ－Ｅ、例えばヒトＨＬＡ－Ｅをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅは、その細胞内で過剰発現する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅの発現は、その参照細胞または未改変細胞が、ＨＬＡ－Ｅをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除き同様の参照細胞または未改変細胞（いずれかの他の改変、例えば遺伝子改変を有する細胞を含む）と比べて、その操作細胞内で増加する。ヒトＨＬＡ－Ｅに関するゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの有用な情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＧＣ０６Ｐ０４７２８１、ＨＧＮＣ番号４９６２、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ３１３３、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１３７４７、ならびにＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００５５０７．３及びＮＭ＿００５５１６．５に示されている。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結されている。

【0545】

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、表１ｂまたは２に示されている遺伝子座のいずれか１つに挿入する。いくつかの事例では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、以下に限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１から選択した遺伝子座のようなセーフハーバー座位に挿入する。特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＭＩＣＡ遺伝子座またはＭＩＣＢ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｔ細胞であり、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、適切な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのいずれか）を用いて、ＨＬＡ－Ｅをコードするポリヌクレオチドの、その細胞のゲノム遺伝子座への挿入を促す。

【0546】

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｅのタンパク質発現は、ＨＬＡ－Ｅタンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、外因性ＨＬＡ－ＥのｍＲＮＡの存在を確認する。

【0547】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＨＬＡ－Ｇ、例えばヒトＨＬＡ－Ｇをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇは、その細胞内で過剰発現する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇの発現は、その参照細胞または未改変細胞が、ＨＬＡ－Ｇをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除き同様の参照細胞または未改変細胞（いずれかの他の改変、例えば遺伝子改変を有する細胞を含む）と比べて、その操作細胞内で増加する。ヒトＨＬＡ－Ｇに関するゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの有用な情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＧＣ０６Ｐ０４７２５６、ＨＧＮＣ番号４９６４、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ３１３５、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１７６９３、ならびにＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００２１１８．１及びＮＭ＿００２１２７．５に示されている。ある特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結されている。

【0548】

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、表１ｂまたは２に示されている遺伝子座のいずれか１つに挿入する。いくつかの事例では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、以下に限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１から選択した遺伝子座のようなセーフハーバー座位に挿入する。特定の実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＭＩＣＡ遺伝子座またはＭＩＣＢ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｔ細胞であり、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、適切な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのいずれか）を用いて、ＨＬＡ－Ｇをコードするポリヌクレオチドの、その細胞のゲノム遺伝子座への挿入を促す。

【0549】

いくつかの実施形態では、ＨＬＡ－Ｇのタンパク質発現は、ＨＬＡ－Ｇタンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、外因性ＨＬＡ－ＧのｍＲＮＡの存在を確認する。

【0550】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＰＤ－Ｌ１、例えばヒトＰＤ－Ｌ１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１は、その細胞内で過剰発現する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１の発現は、その参照細胞または未改変細胞が、ＰＤ－Ｌ１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除き同様の参照細胞または未改変細胞（いずれかの他の改変、例えば遺伝子改変を有する細胞を含む）と比べて、その操作細胞内で増加する。ヒトＰＤ－Ｌ１すなわちＣＤ２７４に関するゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの有用な情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＧＣ０９Ｐ００５４５０、ＨＧＮＣ番号１７６３５、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ２９１２６、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９ＮＺＱ７、ならびにＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００１２５４６３５．１、ＮＭ＿００１２６７７０６．１、ＮＰ＿０５４８６２．１及びＮＭ＿０１４１４３．３に示されている。ある特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結されている。

【0551】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、表１ｂまたは２に示されている遺伝子座のいずれか１つに挿入する。いくつかの事例では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、以下に限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１から選択した遺伝子座のようなセーフハーバー座位に挿入する。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＭＩＣＡ遺伝子座またはＭＩＣＢ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｔ細胞であり、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、適切な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのいずれか）を用いて、ＰＤ－Ｌ１をコードするポリヌクレオチドの、その細胞のゲノム遺伝子座への挿入を促す。

【0552】

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１のタンパク質発現は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、外因性ＰＤ－Ｌ１のｍＲＮＡの存在を確認する。

【0553】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＦａｓＬ、例えばヒトＦａｓＬをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＦａｓＬは、その細胞内で過剰発現する。いくつかの実施形態では、ＦａｓＬの発現は、その参照細胞または未改変細胞が、ＦａｓＬをコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除き同様の参照細胞または未改変細胞（いずれかの他の改変、例えば遺伝子改変を有する細胞を含む）と比べて、その操作細胞内で増加する。ヒトＦａｓリガンド（ＦａｓＬ、ＦＡＳＬＧ、ＣＤ１７８、ＴＮＦＳＦ６などとして知られている）に関するゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの有用な情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＧＣ０１Ｐ１７２６２８、ＨＧＮＣ番号１１９３６、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ３５６、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ４８０２３、ならびにＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿０００６３０．１、ＮＭ＿０００６３９．２、ＮＰ＿００１２８９６７５．１及びＮＭ＿００１３０２７４６．１に示されている。ある特定の実施形態では、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結されている。

【0554】

いくつかの実施形態では、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、表１ｂまたは２に示されている遺伝子座のいずれか１つに挿入する。いくつかの事例では、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、以下に限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１から選択した遺伝子座のようなセーフハーバー座位に挿入する。特定の実施形態では、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＭＩＣＡ遺伝子座またはＭＩＣＢ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｔ細胞であり、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、適切な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのいずれか）を用いて、Ｆａｓ－Ｌをコードするポリヌクレオチドの、その細胞のゲノム遺伝子座への挿入を促す。

【0555】

いくつかの実施形態では、Ｆａｓ－Ｌのタンパク質発現は、Ｆａｓ－Ｌタンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、外因性Ｆａｓ－ＬのｍＲＮＡの存在を確認する。

【0556】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＣＣＬ２１、例えばヒトＣＣＬ２１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２１は、その細胞内で過剰発現する。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２１の発現は、その参照細胞または未改変細胞が、ＣＣＬ２１をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除き同様の参照細胞または未改変細胞（いずれかの他の改変、例えば遺伝子改変を有する細胞を含む）と比べて、その操作細胞内で増加する。ヒトＣＣＬ２１に関するゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの有用な情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＧＣ０９Ｍ０３４７０９、ＨＧＮＣ番号１０６２０、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ６３６６、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｏ００５８５、ならびにＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００２９８０．１及びＮＭ＿００２９８９．３に示されている。ある特定の実施形態では、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結されている。

【0557】

いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、表１ｂまたは２に示されている遺伝子座のいずれか１つに挿入する。いくつかの事例では、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、以下に限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１から選択した遺伝子座のようなセーフハーバー座位に挿入する。特定の実施形態では、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＭＩＣＡ遺伝子座またはＭＩＣＢ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｔ細胞であり、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、適切な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのいずれか）を用いて、ＣＣＬ２１をコードするポリヌクレオチドの、その細胞のゲノム遺伝子座への挿入を促す。

【0558】

いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２１のタンパク質発現は、ＣＣＬ２１タンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、外因性ＣＣＬ２１のｍＲＮＡの存在を確認する。

【0559】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＣＣＬ２２、例えばヒトＣＣＬ２２をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２２は、その細胞内で過剰発現する。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２２の発現は、その参照細胞または未改変細胞が、ＣＣＬ２２をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除き同様の参照細胞または未改変細胞（いずれかの他の改変、例えば遺伝子改変を有する細胞を含む）と比べて、その操作細胞内で増加する。ヒトＣＣＬ２２に関するゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの有用な情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＧＣ１６Ｐ０５７３５９、ＨＧＮＣ番号１０６２１、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ６３６７、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｏ００６２６、ならびにＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００２９８１．２、ＮＭ＿００２９９０．４、ＸＰ＿０１６８７９０２０．１及びＸＭ＿０１７０２３５３１．１に示されている。ある特定の実施形態では、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結されている。

【0560】

いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、表１ｂまたは２に示されている遺伝子座のいずれか１つに挿入する。いくつかの事例では、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、以下に限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１から選択した遺伝子座のようなセーフハーバー座位に挿入する。特定の実施形態では、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＭＩＣＡ遺伝子座またはＭＩＣＢ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｔ細胞であり、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、適切な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのいずれか）を用いて、ＣＣＬ２２をコードするポリヌクレオチドの、その細胞のゲノム遺伝子座への挿入を促す。

【0561】

いくつかの実施形態では、ＣＣＬ２２のタンパク質発現は、ＣＣＬ２２タンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、外因性ＣＣＬ２２のｍＲＮＡの存在を確認する。

【0562】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｍｆｇｅ８、例えばヒトＭｆｇｅ８をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８は、その細胞内で過剰発現する。いくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８の発現は、その参照細胞または未改変細胞が、Ｍｆｇｅ８をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除き同様の参照細胞または未改変細胞（いずれかの他の改変、例えば遺伝子改変を有する細胞を含む）と比べて、その操作細胞内で増加する。ヒトＭｆｇｅ８に関するゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの有用な情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＧＣ１５Ｍ０８８８９８、ＨＧＮＣ番号７０３６、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ４２４０、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ０８４３１、ならびにＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００１１０８０８６．１、ＮＭ＿００１１１４６１４．２、ＮＰ＿００１２９７２４８．１、ＮＭ＿００１３１０３１９．１、ＮＰ＿００１２９７２４９．１、ＮＭ＿００１３１０３２０．１、ＮＰ＿００１２９７２５０．１、ＮＭ＿００１３１０３２１．１、ＮＰ＿００５９１９．２及びＮＭ＿００５９２８．３に示されている。ある特定の実施形態では、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結されている。

【0563】

いくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、表１ｂまたは２に示されている遺伝子座のいずれか１つに挿入する。いくつかの事例では、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、以下に限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１から選択した遺伝子座のようなセーフハーバー座位に挿入する。特定の実施形態では、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＭＩＣＡ遺伝子座またはＭＩＣＢ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｔ細胞であり、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、適切な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのいずれか）を用いて、Ｍｆｇｅ８をコードするポリヌクレオチドの、その細胞のゲノム遺伝子座への挿入を促す。

【0564】

いくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８のタンパク質発現は、Ｍｆｇｅ８タンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、外因性Ｍｆｇｅ８のｍＲＮＡの存在を確認する。

【0565】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＳｅｒｐｉｎＢ９、例えばヒトＳｅｒｐｉｎＢ９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９は、その細胞内で過剰発現する。いくつかの実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９の発現は、その参照細胞または未改変細胞が、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードする外因性ポリヌクレオチドを含まないことを除き同様の参照細胞または未改変細胞（いずれかの他の改変、例えば遺伝子改変を有する細胞を含む）と比べて、その操作細胞内で増加する。ヒトＳｅｒｐｉｎＢ９に関するゲノム、ポリヌクレオチド及びポリペプチドの有用な情報は、例えば、ＧｅｎｅＣａｒｄ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ＧＣ０６Ｍ００２８８７、ＨＧＮＣ番号８９５５、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ５２７２、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ５０４５３、ならびにＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ番号ＮＰ＿００４１４６．１、ＮＭ＿００４１５５．５、ＸＰ＿００５２４９２４１．１及びＸＭ＿００５２４９１８４．４に示されている。ある特定の実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、プロモーターに機能可能に連結されている。

【0566】

いくつかの実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、表１ｂまたは２に示されている遺伝子座のいずれか１つに挿入する。いくつかの事例では、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、以下に限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１から選択した遺伝子座のようなセーフハーバー座位に挿入する。特定の実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座またはＣＬＹＢＬ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＭＩＣＡ遺伝子座またはＭＩＣＢ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｔ細胞であり、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドは、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、適切な遺伝子編集システム（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、または本明細書に記載の遺伝子編集システムのいずれか）を用いて、ＳｅｒｐｉｎＢ９をコードするポリヌクレオチドの、その細胞のゲノム遺伝子座への挿入を促す。

【0567】

いくつかの実施形態では、ＳｅｒｐｉｎＢ９のタンパク質発現は、ＳｅｒｐｉｎＢ９タンパク質に対する抗体でプローブして細胞溶解液のウエスタンブロットを行うことを用いて検出する。別の実施形態では、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を用いて、外因性ＳｅｒｐｉｎＢ９のｍＲＮＡの存在を確認する。

【0568】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、寛容原性因子、例えばＣＤ４７の発現の増加を含み、その増加は、本明細書に記載されているようなものであり、例えば、その寛容原性因子の発現を増加させるように操作する前の状態、参照細胞もしくは参照細胞集団（免疫原性応答が所望どおりに欠失している細胞など）、または測定値と比べたものである。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、寛容原性因子、例えばＣＤ４７の細胞表面発現を増加させるように操作されている。いくつかの実施形態では、その操作細胞上での寛容原性因子、例えばＣＤ４７の細胞表面発現は、寛容原性因子、例えばＣＤ４７の細胞表面提示を増加させるように操作する前の寛容原性因子、例えばＣＤ４７の細胞表面発現レベルの約４０％以上（例えば、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約１００％以上、約１５０％以上、約２００％以上、約２５０％以上または約５００％以上のいずれか）であるレベルまで上昇する。いくつかの実施形態では、その操作細胞上での寛容原性因子、例えばＣＤ４７の細胞表面発現は、参照細胞または参照細胞集団上での寛容原性因子、例えばＣＤ４７の細胞表面発現レベル（寛容原性因子、例えばＣＤ４７の細胞表面発現の平均量など）の約４０％以上（例えば、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約１００％以上、約１５０％以上、約２００％以上、約２５０％以上または約５００％以上のいずれか）であるレベルまで上昇する。いくつかの実施形態では、その操作細胞上で、寛容原性因子、例えばＣＤ４７の細胞表面提示の存在が見られる（既知の技法、例えばフローサイトメトリーを用いて測定した場合を含め、多少の検出可能な細胞表面発現を含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、寛容原性因子、例えばＣＤ４７のタンパク質発現が増加している。いくつかの実施形態では、その操作細胞の寛容原性因子、例えばＣＤ４７のタンパク質発現は、寛容原性因子、例えばＣＤ４７のタンパク質発現を増加させるように操作する前の寛容原性因子、例えばＣＤ４７のタンパク質発現レベルの約４０％以上（例えば、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約１００％以上、約１５０％以上、約２００％以上、約２５０％以上または約５００％以上のいずれか）であるレベルまで上昇する。いくつかの実施形態では、その操作細胞の寛容原性因子、例えばＣＤ４７のタンパク質発現は、寛容原性因子、例えばＣＤ４７のタンパク質発現を増加させるように操作する前の寛容原性因子、例えばＣＤ４７のレベルの約４０％以上（例えば、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約１００％以上、約１５０％以上、約２００％以上、約２５０％以上または約５００％以上のいずれか）であるレベルまで上昇する。いくつかの実施形態では、その操作細胞では、寛容原性因子、例えばＣＤ４７のタンパク質発現が見られる（既知の技法、例えば、ウエスタンブロットまたは質量分析を用いて測定した場合を含め、検出可能なタンパク質の発現を含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、寛容原性因子、例えばＣＤ４７のタンパク質発現を含む（既知の技法、例えば、ウエスタンブロットまたは質量分析を用いて測定した場合を含め、検出可能なタンパク質を含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、寛容原性因子、例えばＣＤ４７をコードするｍＲＮＡの発現が増加している。いくつかの実施形態では、その操作細胞の寛容原性因子、例えばＣＤ４７をコードするｍＲＮＡの発現は、寛容原性因子、例えばＣＤ４７のｍＲＮＡの発現を増加させるように操作する前の寛容原性因子、例えばＣＤ４７をコードするｍＲＮＡの発現のレベルの４０％以上（例えば、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約１００％以上、約１５０％以上、約２００％以上、約２５０％以上または約５００％以上のいずれか）であるレベルまで上昇する。いくつかの実施形態では、その操作細胞の寛容原性因子、例えばＣＤ４７をコードするｍＲＮＡの発現は、参照細胞または参照細胞集団のｍＲＮＡの発現レベルの約４０％以上（例えば、約４５％以上、約５０％以上、約５５％以上、約６０％以上、約６５％以上、約７０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約１００％以上、約１５０％以上、約２００％以上、約２５０％以上または約５００％以上のいずれか）であるレベルまで上昇する。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、寛容原性因子、例えばＣＤ４７をコードするｍＲＮＡを発現する（既知の技法、例えば、シーケンシング技法またはＰＣＲを用いて測定した場合を含め、ｍＲＮＡの検出可能な発現を含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、寛容原性因子、例えばＣＤ４７をコードするｍＲＮＡを含む（既知の技法、例えば、シーケンシング技法またはＰＣＲを用いて測定した場合を含め、検出可能なｍＲＮＡを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、寛容原性因子、例えばＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、寛容原性因子、例えばＣＤ４７をコードするポリヌクレオチドは、その操作細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれている。

【0569】

２．キメラ抗原受容体
いくつかの実施形態では、提供する操作細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように、さらに改変されている。

【0570】

いくつかの実施形態では、提供する細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢ、ＭＨＣ Ｉ分子、ＭＨＣ ＩＩ分子、またはＭＨＣ Ｉ分子及びＭＨＣ ＩＩ分子の発現を調節し、本明細書に記載されているような寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＡＲを発現する、１つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢが低減または除去（例えばノックアウト）されており、Ｂ２Ｍが低減または除去（例えばノックアウト）されており、ＣＩＩＴＡが低減または除去（例えばノックアウト）されており、ＣＤ４７が過剰発現し、ＣＡＲが発現する細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＭＩＣＡ^－／－及び／またはＭＩＣＢ^－／－、Ｂ２Ｍ^－／－、ＣＩＩＴＡ^－／－、ＣＤ４７ｔｇ、ＣＡＲ＋である。いくつかの実施形態では、その細胞（例えばＴ細胞）はさらに、ＴＲＡＣが低減または除去（例えばノックアウト）されている細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、その細胞は、ＭＩＣＡ^－／－及び／またはＭＩＣＢ^－／－、Ｂ２Ｍ^－／－、ＣＩＩＴＡ^－／－、ＣＤ４７ｔｇ、ＴＲＡＣ^－／－、ＣＡＲ＋である。

【0571】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドが、その細胞に導入されている。いくつかの実施形態では、その細胞は、Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または多能性細胞（例えばｉＰＳＣ）から分化させたＴ細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、例えば、初代ＮＫ細胞、または多能性細胞（例えばｉＰＳＣ）から分化させたＮＫ細胞である。

【0572】

いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、第１世代ＣＡＲ、第２世代ＣＡＲ、第３世代ＣＡＲ及び第４世代ＣＡＲからなる群から選択されている。いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン（例えば、１つ、２つまたは３つのシグナル伝達ドメイン）を含む第１世代ＣＡＲであるか、またはそのＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも２つのシグナル伝達ドメインを含む第２世代ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む第３世代ＣＡＲを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、３つまたは４つのシグナル伝達ドメイン、及びＣＡＲのシグナル伝達が成功したら、サイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含む第４世代ＣＡＲ。いくつかの実施形態では、その抗原結合ドメインは、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖまたはＦａｂであるか、またはそれを含む。

【0573】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞のいずれか１つは、ＣＡＲすなわち第１世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第１世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及びシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化の際に、下流のシグナル伝達を媒介する。

【0574】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞のいずれか１つは、ＣＡＲすなわち第２世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第２世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び２つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化の際に、下流のシグナル伝達を媒介する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化の際に、サイトカインの産生、ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖、及び／またはＣＡＲ Ｔ細胞の存続性を増強する。

【0575】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞のいずれか１つは、ＣＡＲすなわち第３世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第３世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び少なくとも３つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化の際に、下流のシグナル伝達を媒介する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化の際に、サイトカインの産生、ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖、及びまたはＣＡＲ Ｔ細胞の存続性を増強する。いくつかの実施形態では、第３世代ＣＡＲは、少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つの共刺激ドメインは、同じではない。

【0576】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞のいずれか１つは、ＣＡＲすなわち第４世代ＣＡＲをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、第４世代ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び少なくとも２つ、３つまたは４つのシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞活性化の際に、下流のシグナル伝達を媒介する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、Ｔ細胞活性化の際に、サイトカインの産生、ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖、及びまたはＣＡＲ Ｔ細胞の存続性を増強する。

【0577】

いくつかの実施形態では、本発明で提供する操作細胞（例えば、初代Ｔ細胞もしくはｉＰＳＣ由来のＴ細胞、または初代ＮＫ細胞もしくはｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞）は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、ゲノム遺伝子座に挿入されている。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、セーフハーバー座位に挿入されており、その座位は、以下に限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１、Ｆ３（ＣＤ１４２としても知られる）、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＬＲＰ１（ＣＤ９１としても知られる）、ＨＭＧＢ１、ＡＢＯ、ＲＨＤ、ＦＵＴ１またはＫＤＭ５Ｄの遺伝子座などである。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＰＤ１またはＣＴＬＡ４の遺伝子に挿入されている。本明細書に記載の遺伝子編集法（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を含め、いずれか適切な方法を用いて、そのＣＡＲをその低免疫原性細胞のゲノム遺伝子座に挿入できる。

【0578】

いくつかの実施形態では、第１世代ＣＡＲ、第２世代ＣＡＲ、第３世代ＣＡＲまたは第４世代ＣＡＲは、ＣＡＲのシグナル伝達が成功すると、サイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、ＣＡＲのシグナル伝達が成功すると、サイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインを含むＣＡＲを含む標的細胞にとって、内在性または外因性である。いくつかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、炎症誘発性サイトカインをコードする。いくつかの実施形態では、サイトカイン遺伝子は、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－９、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＴＮＦもしくはＩＦＮ－γ、またはその機能的断片をコードする。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達が成功すると、サイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子、またはその機能ドメインもしくは断片であるか、あるいは転写因子、またはその機能ドメインもしくは断片を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲのシグナル伝達が成功すると、サイトカイン遺伝子の発現を誘導するドメインは、転写因子、またはその機能ドメインもしくは断片であるか、あるいは転写因子、またはその機能ドメインもしくは断片を含む。いくつかの実施形態では、転写因子、またはその機能ドメインもしくは断片は、活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦＡＴ）、ＮＦ－ｋＢ、またはその機能ドメインもしくは断片であるか、あるいは活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦＡＴ）、ＮＦ－ｋＢ、またはその機能ドメインもしくは断片を含む。例えば、Ｚｈａｎｇ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＣＡＲ－Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．５：２２（２０１７）、ＷＯ２０１６１２６６０８、Ｓｈａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｃｈｉｍａｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐ ｆｏｒ ｔｕｍｏｕｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔｓ Ｊａｎ ２７，２０１７，３７（１）を参照されたい。

【0579】

当業者は、ＣＡＲ及び様々な構成要素、ならびにＣＡＲの構成に精通している。いずれか既知のＣＡＲを、提供されている実施形態と併せて用いることができる。本明細書に記載のＣＡＲに加えて、様々なＣＡＲ、及び様々なＣＡＲをコードするヌクレオチド配列が当該技術分野で知られており、本明細書に記載されているように細胞を操作するのに適するであろう。例えば、ＷＯ２０１３０４０５５７、ＷＯ２０１２０７９０００、ＷＯ２０１６０３０４１４、Ｓｍｉｔｈ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１７．ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＮＡＮＯ．２０１７．５７（これらの開示内容は、参照により本明細書に援用される）を参照されたい。ＣＡＲの例示的な機構及び構成要素は、以下のサブセクションに説明されている。

【0580】

Ａ．抗原結合ドメイン
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）は、抗体もしくはその抗原結合部分であるか、または抗体もしくはその抗原結合部分を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）は、ｓｃＦｖもしくはＦａｂであるか、またはｓｃＦｖもしくはＦａｂを含む。

【0581】

いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、細胞の細胞表面抗原に結合する。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、特定の細胞種または特異的な細胞種に特有である（例えば、その細胞種によって発現される）。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原は、２つ以上の細胞種に特有である。

【0582】

いくつかの実施形態では、その抗原は、腫瘍細胞のみで、もしくは腫瘍細胞で優先的に発現する抗原、または自己免疫疾患もしくは炎症性疾患に特有である抗原であってよい。いくつかの実施形態では、その抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）は、腫瘍性細胞に特有な抗原を標的とする。例えば、その抗原結合ドメインは、腫瘍性細胞またはがん細胞によって発現される抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、そのＡＢＤは、腫瘍関連抗原に結合する。いくつかの実施形態では、腫瘍性細胞に特有である抗原（例えば、腫瘍性細胞もしくはがん細胞と関連する抗原）、または腫瘍関連抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル連結型受容体、酵素連結型受容体、Ｇタンパク質連結型受容体、受容体型チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ関連受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体型セリン／トレオニンキナーゼ、受容体型グアニル酸シクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ関連受容体から選択されている。

【0583】

いくつかの実施形態では、その標的抗原は、以下に限定されないが、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、ＥｒｂＢ３／ＨＥＲ３及びＥｒｂＢ４／ＨＥＲ４を含む）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）（ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ１８及びＦＧＦ２１を含む）、血管内皮細胞成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）（ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ及びＰＩＧＦを含む）、ＲＥＴ受容体及びＥｐｈ受容体のファミリー（ＥｐｈＡ１、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ３、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＡ５、ＥｐｈＡ６、ＥｐｈＡ７、ＥｐｈＡ８、ＥｐｈＡ９、ＥｐｈＡ１０、ＥｐｈＢ１、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ＥｐｈＢ４及びＥｐｈＢ６を含む）、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ８、ＣＦＴＲ、ＣＩＣ－１、ＣＩＣ－２、ＣＩＣ－４、ＣＩＣ－５、ＣＩＣ－７、ＣＩＣ－Ｋａ、ＣＩＣ－Ｋｂ、ベストロフィン、ＴＭＥＭ１６Ａ、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、ＡＢＣトランスポーター、ＮＡＶ１．１、ＮＡＶ１．２、ＮＡＶ１．３、ＮＡＶ１．４、ＮＡＶ１．５、ＮＡＶ１．６、ＮＡＶ１．７、ＮＡＶ１．８、ＮＡＶ１．９、スフィンゴシン－１－リン酸受容体（Ｓ１Ｐ１Ｒ）、ＮＭＤＡチャネル、膜貫通タンパク質、複数回膜貫通型タンパク質、Ｔ細胞受容体モチーフ、Ｔ細胞α鎖、Ｔ細胞β鎖、Ｔ細胞γ鎖、Ｔ細胞δ鎖、ＣＣＲ７、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ４０、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１６３、Ｆ４／８０、ＩＬ－４Ｒａ、Ｓｃａ－１、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、グランザイムＢ、ＬＦＡ－１、トランスフェリン受容体、ＮＫｐ４６、パーフォリン、ＣＤ４＋、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、Ｔｈ４０、Ｔｈ２２、Ｔｈ９、Ｔｆｈ、カノニカルなＴｒｅｇ、ＦｏｘＰ３＋、Ｔｒ１、Ｔｈ３、Ｔｒｅｇ１７、Ｔ_ＲＥＧ、ＣＤＣＰ、ＮＴ５Ｅ、ＥｐＣＡＭ、ＣＥＡ、ｇｐＡ３３、ムチン、ＴＡＧ－７２、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＳＭＡ、葉酸結合タンパク質、ガングリオシド（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＧＭ２）、ルイス－γ^２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ １／２／３、αＶβ３、α５β１、ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１／ＨＥＲ２、ＥｒＢ３、ｃ－ＭＥＴ、ＩＧＦ１Ｒ、ＥｐｈＡ３、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、ＲＡＮＫＬ、ＦＡＰ、テネイシン、ＰＤＬ－１、ＢＡＦＦ、ＨＤＡＣ、ＡＢＬ、ＦＬＴ３、ＫＩＴ、ＭＥＴ、ＲＥＴ、ＩＬ－１β、ＡＬＫ、ＲＡＮＫＬ、ｍＴＯＲ、ＣＴＬＡ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＪＡＫ３、ＢＲＡＦ、ＰＴＣＨ、スムーズンド、ＰＩＧＦ、ＡＮＰＥＰ、ＴＩＭＰ１、ＰＬＡＵＲ、ＰＴＰＲＪ、ＬＴＢＲ、または ＡＮＴＸＲ１、葉酸受容体α（ＦＲａ）、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＥｐｈＡ２、ＩＬ－１３Ｒａ２、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、メソセリン、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）、Ｌ１ＣＡＭ、ＬｅＹ、ＭＳＬＮ、ＩＬ１３Ｒα１、Ｌ１－ＣＡＭ、Ｔｎ Ａｇ、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、インターロイキン１１受容体ａ（ＩＬ－１１Ｒａ）、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＣＤ２４、血小板由来成長因子受容体－β（ＰＤＧＦＲ－β）、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＭＵＣ１、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－１受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣｌ、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、主要組織適合性複合体クラスＩ関連遺伝子タンパク質（ＭＲ１）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰＩＢ Ｉ、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ネオアンチゲン、ＣＤ１３３、ＣＤ１５、ＣＤ１８４、ＣＤ２４、ＣＤ５６、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ）、Ｈ２－Ｍ３、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ１５１、ＣＤ３４０、ＣＤ２００、ｔｋｒＡ、ｔｒｋＢもしくはｔｒｋＣ、またはその抗原断片もしくは抗原部分を含む抗原である。

【0584】

いくつかの実施形態では、例示的な標的抗原としては、ＣＤＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ７０、κ、λ、及びＢ細胞成熟因子（ＢＣＭＡ）（白血病と関連する抗原）、ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡ（骨髄腫と関連する抗原）、ＧＤ２、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｌｌｌ、Ｂ７Ｈ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＣＡＩＸ、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＲａ、ＩＬ－１３Ｒａ、メソセリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６及びＲＯＲ１（固形腫瘍と関連する抗原）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0585】

いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、ＣＤ１９ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、そのＣＤ１９ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＣＤ１９、例えばヒトＣＤ１９に特異的に結合する抗体を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＤ１９ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＦＭＣ６３モノクローナル抗体（ＦＭＣ６３）に由来するｓｃＦｖ抗体断片を含み、この断片は、ＦＭＣ６３の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）がリンカーペプチドによって連結されたものを含む。いくつかの実施形態では、そのリンカーペプチドは、「Ｗｈｉｔｌｏｗ」リンカーペプチドである。ＦＭＣ６３及びこれに由来するｓｃＦｖは、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｌ．ｌｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７－１１６５（１９９７）及び国際公開第ＷＯ２０１８／２１３３３７Ａ１号（その内容はそれぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される）に記載されている。

【0586】

いくつかの実施形態では、そのＣＤ１９ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、例えば、ＳＪ２５Ｃ１（Ｂｅｊｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：２３４６－２３５１（１９９５））、ＨＤ３７（Ｐｅｚｕｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１３８（９）：２７９３－２７９９（１９８７））、４Ｇ７（Ｍｅｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ３：３０５－３２０（１９８４））、Ｂ４３（Ｂｅｊｃｅｋ（１９９５））、ＢＬＹ３（Ｂｅｊｃｅｋ（１９９５））、Ｂ４（Ｆｒｅｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，７０：４１８－４２７（１９８７））、Ｂ４ ＨＢ１２ｂ（Ｋａｎｓａｓ ＆ Ｔｅｄｄｅｒ，Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１４７：４０９４－４１０２（１９９１）、Ｙａｚａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０２：１５１７８－１５１８３（２００５）、Ｈｅｒｂｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３３５：２１３－２２２（２０１０））、ＢＵ１２（Ｇａｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４８（１０）：２９８３－２９８７（１９９２））及びＣＬＢ－ＣＤ１９（Ｄｅ Ｒｉｅ Ｃｅｌｌ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１１８：３６８－３８１（１９８９））を含むＣＤ１９特異的抗体の１つに由来する抗体を含む。

【0587】

いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、ＣＤ２２ ＣＡＲである。ＣＤ２２は、成熟Ｂ細胞の表面で主に見られる膜貫通タンパク質であり、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）のシグナル伝達に対する阻害受容体として機能する。ＣＤ２２は、Ｂ細胞リンパ腫及びＢ細胞白血病（例えば、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）及びバーキットリンパ腫）の６０～７０％で発現し、Ｂ細胞発生の早期の細胞表面または幹細胞上には存在しない。いくつかの実施形態では、そのＣＤ２２ ＣＡＲは、ＣＤ２２に特異的に結合する細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン及び／または細胞内共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＤ２２ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ｍ９７１モノクローナル抗体（ｍ９７１）に由来するｓｃＦｖ抗体断片を含み、この断片は、ｍ９７１の重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）がリンカーによって連結されたものを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＤ２２ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ｍ９７１－Ｌ７に由来するｓｃＦｖ抗体断片を含み、このｍ９７１－Ｌ７は、ｍ９７１の親和性成熟バリアントであって、親抗体ｍ９７１と比べて、ＣＤ２２への結合親和性が有意に改善された（約２ｎＭから５０ｐＭ未満に改善された）バリアントである。いくつかの実施形態では、ｍ９７１－Ｌ７に由来するそのｓｃＦｖ抗体断片は、ｍ９７１－Ｌ７のＶＨとＶＬが３ｘＧ４Ｓリンカーによって連結されたものを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＤ２２ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、イムノトキシンＨＡ２２またはＢＬ２２を含む。イムノトキシンＢＬ２２及びＨＡ２２は、ＣＤ２２に特異的なｓｃＦｖが細菌毒素に融合されたものを含む治療剤であるので、ＣＤ２２を発現するがん細胞の表面に結合して、そのがん細胞を殺傷することができる。ＢＬ２２は、抗ＣＤ２２抗体のｄｓＦｖであるＲＦＢ４が、３８ｋＤａのトランケート型のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエクソトキシンＡに融合されたものを含む（Ｂａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１１：１５４５－５０（２００５））。ＨＡ２２（ＣＡＴ８０１５、モキセツモマブパスドトクス）は、変異型かつ高親和性型のＢＬ２２である（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８０（１）：６０７－１７（２００５））。ＣＤ２２に特異的なＨＡ２２及びＢＬ２２の抗原結合ドメインの適切な配列は、例えば、米国特許第７，５４１，０３４号、同第７，３５５，０１２号及び同第７，９８２，０１１号に開示されており、これらの内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0588】

いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、ＢＣＭＡ ＣＡＲである。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞系列の細胞上に発現する腫瘍壊死ファミリー受容体（ＴＮＦＲ）メンバーであり、最終分化したＢ細胞または成熟Ｂリンパ球上に最も高度に発現する。ＢＣＭＡは、長期の液性免疫を維持するための、形質細胞の生存の媒介に関与する。ＢＣＭＡの発現は最近、多くのがん、例えば、多発性骨髄腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、様々な白血病及びグリオブラストーマに関連付けられている。いくつかの実施形態では、そのＢＣＭＡ ＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的に結合する細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内シグナル伝達ドメイン及び／または細胞内共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、そのＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、ＢＣＭＡ、例えばヒトＢＣＭＡに特異的に結合する抗体を含む。ＢＣＭＡに誘導されるＣＡＲは、国際出願公開第ＷＯ２０１６／０１４７８９号、同第ＷＯ２０１６／０１４５６５号、同第ＷＯ２０１３／１５４７６０号及び同第ＷＯ２０１５／１２８６５３号に記載されている。ＢＣＭＡ結合抗体は、国際出願公開第ＷＯ２０１５／１６６０７３号及び同第ＷＯ２０１４／０６８０７９号にも開示されている。いくつかの実施形態では、そのＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９（８）：２０４８－２０６０（２０１３）に記載されているようなマウスモノクローナル抗体に由来するｓｃＦｖ抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、そのｓｃＦｖ抗体断片は、ヒト化型のマウスモノクローナル抗体である（Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３１：２１９１－２１９９（２０１７））。いくつかの実施形態では、そのＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｅａｌ．１１（１）：１４１（２０１８）に記載されているように、ＢＣＭＡのエピトープの２つに結合できる２本の重鎖（ＶＨＨ）からなる単一可変断片を含む。いくつかの実施形態では、そのＢＣＭＡ ＣＡＲの細胞外結合ドメインは、Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１（１）：２８３（２０２０）に記載されているように、完全ヒト重鎖可変ドメイン（ＦＨＶＨ）を含む。

【0589】

いくつかの実施形態では、その抗原結合ドメインは、自己免疫障害または炎症性障害に特有な抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、そのＡＢＤは、自己免疫障害または炎症性障害と関連する抗原に結合する。いくつかの事例では、その抗原は、自己免疫障害または炎症性障害と関連する細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、その自己免疫障害または炎症性障害は、慢性移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、ループス、関節炎、免疫複合体糸球体腎炎、グッドパスチャー、ブドウ膜炎、肝炎、全身性硬化症、すなわち強皮症、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、寒冷凝集素症、尋常性天疱瘡、グレーブス病、自己免疫性溶血性貧血、血友病Ａ、原発性シェーグレン症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、視神経脊髄炎、エバンス症候群、ＩｇＭ媒介性ニューロパチー、クリオグロブリン血症、皮膚筋炎、特発性血小板減少症、強直性脊椎炎、水疱性類天疱瘡、後天性血管性浮腫、慢性蕁麻疹、抗リン脂質脱髄性多発ニューロパチー、及び自己免疫性血小板減少症または自己免疫性好中球減少症または赤芽球癆から選択されている一方で、同種免疫疾患の例示的な非限定的例としては、造血細胞移植または固形臓器移植、輸血による同種感作（例えば、Ｂｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１５（４）：９３１－４１を参照されたい）または異種感作、胎児同種感作を伴う妊娠、新生児同種免疫性血小板減少症、新生児溶血性疾患、酵素補充療法またはタンパク質補充療法、血液製剤、及び遺伝子療法で治療する遺伝性欠損障害または後天性欠損障害への補充の際に起こることがある、外来抗原への感作が挙げられる。同種感作は、いくつかの事例では、レシピエント対象または妊娠している対象の免疫系が非自己抗原とみなすヒト白血球抗原に対する免疫応答（循環抗体など）の発生を指す。いくつかの実施形態では、自己免疫障害または炎症性障害に特有の抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル連結型受容体、酵素連結型受容体、Ｇタンパク質連結型受容体、受容体型チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ関連受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体型セリン／トレオニンキナーゼ、受容体型グアニル酸シクラーゼまたはヒスチジンキナーゼ関連受容体から選択されている。

【0590】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、Ｂ細胞上、形質細胞上または形質芽球上に発現するリガンドに結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ１３８、ＣＤ３１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ２８、ＴＮＦ、インターフェロン受容体、ＧＭ－ＣＳＦ、ＺＡＰ－７０、ＬＦＡ－１、ＣＤ３γ、ＣＤ５またはＣＤ２に結合する。ＵＳ２００３／００７７２４９、ＷＯ２０１７／０５８７５３、ＷＯ２０１７／０５８８５０（これらの内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、抗ＣＤ１９ ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲである。

【0591】

いくつかの実施形態では、その抗原結合ドメインは、老化細胞、例えばウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡＲ）に特有の抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、そのＡＢＤは、老化細胞と関連する抗原に結合する。いくつかの事例では、その抗原は、老化細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、老化細胞の異常な蓄積を特徴とする障害、例えば、肝線維症、肺線維症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病及び変形性関節症の治療または予防に用いてよい。

【0592】

いくつかの実施形態では、その抗原結合ドメインは、感染症に特有の抗原を標的とする。いくつかの実施形態では、そのＡＢＤは、感染症と関連する抗原に結合する。いくつかの事例では、その抗原は、感染症に罹患した細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、その感染症は、ＨＩＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒトヘルペスウイルス、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ））、ヒトＴリンパ球向性ウイルス－１（ＨＴＬＶ－１）、メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、エプスタイン－バーウイルス、ＣＭＶ、ヒトパピローマウイルスから選択されている。いくつかの実施形態では、感染症に特有の抗原は、細胞表面受容体、イオンチャネル連結型受容体、酵素連結型受容体、Ｇタンパク質連結型受容体、受容体型チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ関連受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体型セリン／トレオニンキナーゼ、受容体型グアニル酸シクラーゼ、ヒスチジンキナーゼ関連受容体、ＨＩＶ Ｅｎｖ、ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ上のｇｐ１２０またはＣＤ４誘導性エピトープから選択されている。

【0593】

これらの実施形態のいずれかでは、そのＣＡＲの細胞外結合ドメインは、宿主細胞内での発現に合わせてコドン最適化されているか、またはその細胞外結合ドメインの機能を増大させるバリアント配列を有することができる。

【0594】

いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、２つの標的抗原に二重特異性を有する。いくつかの実施形態では、その標的抗原は、異なる標的抗原である。いずれかのこのような実施形態のいくつかでは、その２つの異なる標的抗原は、上記のいずれかの２つの異なる抗原である。いくつかの実施形態では、その細胞外結合ドメインは、異なるものであり、（ｉ）ＣＤ１９及びＣＤ２０、（ｉｉ）ＣＤ２０及びＬ１－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ１－ＣＡＭ及びＧＤ２、（ｉｖ）ＥＧＦＲ及びＬ１－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ１９及びＣＤ２２、（ｖｉ）ＥＧＦＲ及びＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴ及びＨＥＲ２、または（ｉｘ）ＥＧＦＲ及びＲＯＲ１のうちの２つの異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、その２つの異なる抗原結合ドメインのそれぞれは、ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、第１のｓｃＦｖの一方の可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）のＣ末端は、第２のｓｃＦｖ（それぞれ、ＶＬまたはＶＨ）のＮ末端に、ポリペプチドリンカーを介して係留されている。いくつかの実施形態では、そのリンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と、またはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端と連結している。これらのｓｃＦｖは、天然型抗体の重鎖及び軽鎖に存在する定常領域（Ｆｃ）を欠損している。少なくとも２つの異なる抗原に特異的なｓｃＦｖは、タンデムに並んでおり、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに、膜貫通ドメインを介して連結している。一実施形態では、抗原特異的な結合領域と膜貫通ドメインとの間に、細胞外スペーサードメインが連結していてもよい。

【0595】

さらなる実施形態では、そのＣＡＲの抗原特異的なターゲティング領域のそれぞれは、二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）（または二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ））の一本鎖可変断片（ジｓｃＦｖ、バイｓｃＦｖ）を含む。ジｓｃＦＶを含むＣＡＲでは、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域で１本のペプチド鎖を作製して、タンデムｓｃＦｖをもたらすことによって、各抗原に特異的な２つのｓｃＦｖが連結されている（Ｘｉｏｎｇ，Ｃｈｅｎｇ－Ｙｉ；Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ａ；Ｓｈｉ，Ｘ Ｂ；Ｄｅｎａｒｄｏ，Ｇ Ｌ；Ｄｅｎａｒｄｏ，Ｓ Ｊ（２００６）．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉ－ＭＵＣ－１ ｍｕｌｔｉｍｅｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉ－ｓｃＦｖ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｎ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ”．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ １９（８）：３５９－３６７、Ｋｕｆｅｒ，Ｐｅｔｅｒ；Ｌｕｔｔｅｒｂｕｓｅ，Ｒａｌｆ；Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐａｔｒｉｃｋ Ａ．（２００４）．“Ａ ｒｅｖｉｖａｌ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８－２４４）。抗原特異的なターゲティング領域を少なくとも２つ含むＣＡＲは、２つの抗原のそれぞれに特異的な２つのｓｃＦｖを発現することになる。少なくとも２つの異なる抗原に特異的な、得られる抗原特異的なターゲティング領域は、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに、膜貫通ドメインを介して連結されている。一実施形態では、抗原特異的な結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に、細胞外スペーサードメインが連結されていてよい。

【0596】

追加の実施形態では、そのＣＡＲの抗原特異的なターゲティング領域のそれぞれは、ダイアボディを含む。ダイアボディでは、２つの可変領域を併せて折り畳むには非常に短いリンカーペプチドを用いてｓｃＦｖを作製して、ｓｃＦｖを二量化させている。さらに短いリンカー（１アミノ酸または２アミノ酸）によって、三量体、いわゆるトリアボディまたはトリボディが形成される。テトラボディも用いてよい。

【0597】

いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、２つ以上のＣＡＲ、例えば、２つの異なるＣＡＲを発現するように操作されており、この場合、それぞれのＣＡＲは、異なる標的抗原に誘導される抗原結合ドメインを有する。いずれかのこのような実施形態のいくつかでは、その２つの異なる標的抗原は、上記のいずれかの２つの異なる抗原である。いくつかの実施形態では、その細胞外結合ドメインは、異なるものであり、（ｉ）ＣＤ１９及びＣＤ２０、（ｉｉ）ＣＤ２０及びＬ１－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ１－ＣＡＭ及びＧＤ２、（ｉｖ）ＥＧＦＲ及びＬ１－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ１９及びＣＤ２２、（ｖｉ）ＥＧＦＲ及びＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴ及びＨＥＲ２、または（ｉｘ）ＥＧＦＲ及びＲＯＲ１のうちの２つの異なる抗原に結合する。

【0598】

いくつかの実施形態では、示されている改変を含む２つの異なる操作細胞であって、異なるＣＡＲを有するようにそれぞれ操作された細胞を調製する。いくつかの実施形態では、その２つの異なるＣＡＲのそれぞれは、異なる標的抗原に誘導される抗原結合ドメインを有する。いずれかのこのような実施形態のいくつかでは、その２つの異なる標的抗原は、上記のいずれかの２つの異なる抗原である。いくつかの実施形態では、その細胞外結合ドメインは、異なるものであり、（ｉ）ＣＤ１９及びＣＤ２０、（ｉｉ）ＣＤ２０及びＬ１－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ１－ＣＡＭ及びＧＤ２、（ｉｖ）ＥＧＦＲ及びＬ１－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ１９及びＣＤ２２、（ｖｉ）ＥＧＦＲ及びＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴ及びＨＥＲ２、または（ｉｘ）ＥＧＦＲ及びＲＯＲ１のうちの２つの異なる抗原に結合する。いくつかの実施形態では、第１の標的抗原に対して誘導される第１のＣＡＲを発現する操作細胞（例えば、低免疫原性細胞）の集団、及び第２の標的抗原に対して誘導される第２のＣＡＲを発現する操作細胞（例えば、低免疫原性細胞）の集団を別々に、その対象に投与する。いくつかの実施形態では、その第１の細胞集団及び第２の細胞集団をいずれかの順序で順次投与する。例えば、第１のＣＡＲを発現する細胞集団を投与した後に、第２のＣＡＲを発現する細胞集団を投与する。

【0599】

Ｂ．スペーサー
いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、１つ以上のスペーサーをさらに含み、例えば、そのスペーサーは、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間の第１のスペーサーである。いくつかの実施形態では、その第１のスペーサーは、免疫グロブリン定常領域、またはそのバリアントもしくは改変型の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態では、そのスペーサーは、膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの間の第２のスペーサーである。いくつかの実施形態では、その第２のスペーサーは、オリゴペプチドであり、例えば、そのオリゴペプチドは、グリシン残基及びセリン残基、例えば、以下に限定されないが、グリシン－セリンダブレットを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、２つ以上のスペーサー、例えば、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間のスペーサー、及び膜貫通ドメインとシグナル伝達ドメインとの間のスペーサーを含む。

【0600】

Ｃ．膜貫通ドメイン
いくつかの実施形態では、そのＣＡＲの膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖もしくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはこれらの機能的バリアントの少なくとも膜貫通領域を含む。いくつかの実施形態では、その膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ及びＦＧＦＲ２Ｂ、またはこれらの機能的バリアントの少なくとも膜貫通領域（複数可）を含む。

【0601】

Ｄ．シグナル伝達ドメイン（複数可）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、Ｂ７－１／ＣＤ８０、Ｂ７－２／ＣＤ８６、Ｂ７－Ｈ１／ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、Ｂ７－Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７－Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ２／Ｂ７－ＤＣ、ＰＤＣＤ６、４－１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４－１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン－α／ＴＮＦ－β、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ－１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ－３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ－Ａ／ＳＬＡＭＦ６、ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ－１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ－ＤＲ、イカロス、インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンα４β１、インテグリンα４ β７／ＬＰＡＭ－１、ＬＡＧ－３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン－１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ－１／ＫＩＭ－１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ－４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ Ｒ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ３ζドメイン、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはこれらの機能的断片の１つ以上から選択したシグナル伝達ドメインを１つまたは少なくとも１つを含む。

【0602】

いくつかの実施形態では、その少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはこれらの機能的バリアントを含む。

【0603】

いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメインであるシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、第２の共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも２つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも３つの共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ１３４／ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドの１つ以上から選択した共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲが、２つ以上の共刺激ドメインを含む場合、２つの共刺激ドメインは、異なるものである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲが、２つ以上の共刺激ドメインを含む場合、２つの共刺激ドメインは、同じである。

【0604】

別の実施形態では、その少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、及び（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインもしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアントを含む。さらに別の実施形態では、その少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、及び（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメインもしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメインもしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアント、及び（ｉｖ）サイトカイン導入遺伝子または共刺激リガンド導入遺伝子を含む。

【0605】

いくつかの実施形態では、その少なくとも２つのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアントを含む。別の実施形態では、その少なくとも２つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、及び（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインもしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアントを含む。さらに別の実施形態では、その少なくとも１つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、及び（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメインもしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも２つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメインもしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアント、及び（ｉｖ）サイトカイン導入遺伝子または共刺激リガンド導入遺伝子を含む。

【0606】

いくつかの実施形態では、その少なくとも３つのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアントを含む。別の実施形態では、その少なくとも３つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、及び（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインもしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアントを含む。さらに別の実施形態では、その少なくとも３つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、及び（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメインもしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、その少なくとも３つのシグナル伝達ドメインは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメインもしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアント、及び（ｉｖ）サイトカイン導入遺伝子または共刺激リガンド導入遺伝子を含む。

【0607】

いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアントを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、及び（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインもしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアントを含む。

【0608】

いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、及び（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメインもしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。

【0609】

いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインもしくは４－１ＢＢドメイン、またはその機能的バリアント、及び／または（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメインもしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアントを含む。

【0610】

いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、（ｉ）ＣＤ３ζドメインもしくは免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＣＤ２８ドメインまたはその機能的バリアント、（ｉｉｉ）４－１ＢＢドメインもしくはＣＤ１３４ドメイン、またはその機能的バリアント、及び（ｉｖ）サイトカイン導入遺伝子または共刺激リガンド導入遺伝子を含む。

【0611】

Ｅ．例示的なＣＡＲ
いくつかの実施形態では、そのＣＡＲは、抗原（例えば腫瘍抗原）に結合する細胞外抗原結合ドメイン（例えば、抗体またはｓｃＦｖのような抗体断片）、スペーサー（例えば、本明細書に記載されているようないずれかのようなヒンジドメインを含む）、膜貫通ドメイン（例えば、本明細書に記載されているようないずれか）、及び細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載されているような一次シグナル伝達ドメインまたは共刺激シグナル伝達ドメインのようないずれかの細胞内シグナル伝達ドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、その細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞質シグナル伝達ドメインであるか、または一次細胞質シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、その細胞内シグナル伝達ドメインは、加えて、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば共刺激ドメイン）を含む。このような構成要素のいずれかは、上記のようないずれかであることができる。

【0612】

ＣＡＲの例示的な構成要素の例は、表３に示されている。提供する態様では、ＣＡＲの各構成要素の配列は、表３に列挙されているいずれかの組み合わせを含むことができる。

【0613】

【表3】

【0614】

３．ポリヌクレオチドの発現を増加させる（例えば過剰発現させる）方法
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの発現の増加は、様々な技法のいずれかによって行ってよい。例えば、遺伝子及び因子（タンパク質）の発現を調節する方法としては、ゲノム編集技法、及びＲＮＡまたはタンパク質の発現技術などが挙げられる。これらの技術のいずれにおいても、周知の組み換え技法を用いて、本明細書に概説されているような組み換え核酸を生成する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを過剰発現させるかまたはその発現を増加させるための改変を１つ以上有するように操作する細胞は、本明細書に記載されているようないずれかの供給源細胞である。いくつかの実施形態では、その供給源細胞は、本明細書に記載のいずれかの細胞である。

【0615】

いくつかの実施形態では、遺伝子の発現は、内在性遺伝子の活性を向上させること（例えば、外因性遺伝子の転写を増大させること）によって増加させる。いくつかの事例では、内在性遺伝子の活性は、その内在性遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターまたはエンハンサーの活性を向上させることによって向上させる。いくつかの実施形態では、そのプロモーターまたはエンハンサーの活性の向上は、内在性のプロモーターまたはエンハンサーの活性を向上させる１つ以上の改変を内在性のプロモーターまたはエンハンサーに加えることを含む。いくつかの事例では、内在性遺伝子の遺伝子活性の向上は、その遺伝子の内在性プロモーターを改変することである。いくつかの実施形態では、内在性遺伝子の遺伝子活性の向上は、異種プロモーターを導入することを含む。いくつかの実施形態では、その異種プロモーターは、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター及びＵＢＣプロモーターからなる群から選択する。

【0616】

Ａ．ＤＮＡ結合融合タンパク質
いくつかの実施形態では、標的遺伝子（例えば、ＣＤ４７または別の寛容原性因子）の発現は、（１）内在性のＣＤ４７または他の遺伝子に特異的な部位特異的結合ドメインと、（２）転写活性化因子とを含む融合タンパク質またはタンパク質複合体の発現によって増加させる。

【0617】

いくつかの実施形態では、その調節因子は、部位特異的なＤＮＡ結合核酸分子、例えばガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）から構成されている。いくつかの実施形態では、その方法は、ＤＮＡに結合する部位特異的な標的化タンパク質、例えば、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、またはＺＦＰを含む融合タンパク質（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）としても知られる）によって行う。

【0618】

いくつかの実施形態では、その調節因子は、ＤＮＡ結合タンパク質またはＤＮＡ結合核酸を用いるような部位特異的な結合ドメインを含み、このドメインは、標的領域において、遺伝子に特異的に結合するかまたはハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、提供するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、部位特異的なヌクレアーゼ、例えば改変ヌクレアーゼに連結されているか、またはそのヌクレアーゼと複合体化されている。例えば、いくつかの実施形態では、その投与は、改変ヌクレアーゼ、例えばメガヌクレアーゼまたはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（クラスター化した規則的な配置の短い回文核酸（ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステム、例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムなど）のＤＮＡターゲティングタンパク質を含む融合体を用いて行う。いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性を欠損するように改変されている。いくつかの実施形態では、その改変ヌクレアーゼは、触媒性が消失したｄＣａｓ９である。

【0619】

いくつかの実施形態では、その部位特異的結合ドメインは、ヌクレアーゼに由来してもよい。例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＰＩ－Ｓｃｅ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＰａｎＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ及びＩ－ＴｅｖＩＩＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼ及びホーミングメガヌクレアーゼの認識配列。米国特許第５，４２０，０３２号、米国特許第６，８３３，２５２、Ｂｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８、Ｄｕｊｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｇｅｎｅ ８２：１１５－１１８、Ｐｅｒｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２，１１２５－１１２７、Ｊａｓｉｎ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１２：２２４－２２８、Ｇｉｍｂｌｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：１６３－１８０、Ａｒｇａｓｔ ｅｔ ａｌ，（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８０：３４５－３５３及びｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ ｃａｔａｌｏｇｕｅも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼ及びホーミングメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然の標的部位に結合するように操作できる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ，（２００２）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ １０：８９５－９０５、Ｅｐｉｎａｔ ｅｔ ａｌ，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－２９６２、Ａｓｈｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：６５６－６５９、Ｐａｑｕｅｓ ｅｔ ａｌ，（２００７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：４９－６６、米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号を参照されたい。

【0620】

ジンクフィンガー、ＴＡＬＥ及びＣＲＩＳＰＲシステムの結合ドメインは、例えば、天然のジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域を操作すること（１つ以上のアミノ酸を変化させること）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」できる。操作したＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。合理的な設計基準には、置換規則の適用、ならびに既存のＺＦＰ及び／またはＴＡＬＥの設計及び結合データの情報を格納しているデータベース内の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムが含まれる。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号、同第６，４５３，２４２号及び同第６，５３４，２６１を参照されたい。ＷＯ９８／５３０５８、ＷＯ９８／５３０５９、ＷＯ９８／５３０６０、ＷＯ０２／０１６５３６及びＷＯ０３／０１６４９６、ならびに米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号も参照されたい。

【0621】

いくつかの実施形態では、その部位特異的な結合ドメインは、ＤＮＡに配列特異的に結合する１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）またはそのドメインを含む。ＺＦＰまたはそのドメインは、その構造が亜鉛イオンの配位により安定化している結合ドメイン内のアミノ酸配列領域である１つ以上のジンクフィンガーを通じて、ＤＮＡに配列特異的に結合するタンパク質またはさらに大きいタンパク質内のドメインである。

【0622】

ＺＦＰの中には、典型的には９～１８ヌクレオチド長の特異的ＤＮＡ配列を標的とする人工ＺＦＰドメインがあり、このドメインは、個々のフィンガーをアセンブルすることによって生成する。ＺＦＰには、１つのフィンガードメインが、およそ３０アミノ酸長であるとともに、その１つのフィンガードメインに、不変のヒスチジン残基を２つ含むαヘリックスが、亜鉛を通じて、１つのβターンの２つのシステインと配位結合したものが含まれるＺＦＰであって、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのフィンガーを有するＺＦＰが含まれる。概して、ＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガーの認識ヘリックス上の４つのヘリックス位置（－１、２、３及び６）でアミノ酸置換を行うことによって変化させてよい。すなわち、いくつかの実施形態では、ＺＦＰまたはＺＦＰを含む分子は、天然には存在せず、例えば、所定の標的部位に結合するように操作されている。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１、Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７、Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６、米国特許第６，４５３，２４２号、同第６，５３４，２６１号、同第６，５９９，６９２号、同第６，５０３，７１７号、同第６，６８９，５５８号、同第７，０３０，２１５号、同第６，７９４，１３６号、同第７，０６７，３１７号、同第７，２６２，０５４号、同第７，０７０，９３４号、同第７，３６１，６３５号、同第７，２５３，２７３号、及び米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号、同第２００７／０２１８５２８号、同第２００５／０２６７０６１号（これらのいずれの内容も、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。

【0623】

遺伝子特異的な操作ジンクフィンガーの多くは、市販されている。例えば、Ｓａｎｇａｍｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）と協力して、ジンクフィンガー構築用のプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）を開発して、研究者が、ジンクフィンガーの構築及び検証を完全に省略できるようにしたとともに、何千ものタンパク質に対して特異的にターゲティングするジンクフィンガーを提供している（Ｇａｊ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３１（７），３９７－４０５）。いくつかの実施形態では、市販のジンクフィンガーを使用するか、またはカスタム設計する。

【0624】

いくつかの実施形態では、その部位特異的な結合ドメインは、天然または操作済み（非天然）の転写活性化因子様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、転写活性化因子様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質内のドメイン含む。例えば、米国特許出願公開第２０１１０３０１０７３号（その内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。

【0625】

いくつかの実施形態では、その部位特異的な結合ドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来する。概して、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡもしくは活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒメイト配列（「ダイレクトリピート」及び内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの関連では、ｔｒａｃｒＲＮＡによりプロセシングされた部分的ダイレクトリピートを含む）、ガイド配列（内在性ＣＲＩＳＰＲシステムの関連での「スペーサー」もしくは「ターゲティング配列」ともいう）、及び／またはＣＲＩＳＰＲ座位の他の配列及び転写産物を含め、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか、またはＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の活性を導く転写産物及び他のエレメントを合わせて指す。

【0626】

概して、ガイド配列には、標的配列とハイブリダイズして、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的な結合を導くために、標的ポリヌクレオチド配列との十分な相補性を有するポリヌクレオチド配列を含むターゲティングドメインが含まれる。いくつかの実施形態では、ガイド配列と、その対応する標的配列との相補性の程度は、適切なアライメントアルゴリズムを用いて最適にアライメントしたときに、約５０％以上、約６０％以上、約７５％以上、約８０％以上、約８５％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９７．５％以上、約９９％以上またはこれを超える値である。いくつかの例では、ｇＲＮＡのターゲティングドメインは、標的核酸上の標的配列と相補的であり、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％相補的であり、例えば、完全に相補的である。

【0627】

いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡは、本明細書に記載されているようないずれかであってよい。特定の実施形態では、そのｇＲＮＡは、ＣＤ４７の標的部位と相補的であるターゲティング配列、例えば、配列番号２００７８４～２３１８８５（ＷＯ２０１６１８３０４１の表２９、付録２２）のいずれか１つに示されている配列、ＨＬＡ－Ｅの標的部位と相補的であるターゲティング配列、例えば、配列番号１８９８５９～１９３１８３（ＷＯ２０１６１８３０４１の表１９、付録１２）のいずれか１つに示されている配列、ＨＬＡ－Ｆの標的部位と相補的であるターゲティング配列、例えば、配列番号６８８８０８～６９９７５４（ＷＯ２０１６１８３０４１の表４５、付録３８）のいずれか１つに示されている配列、ＨＬＡ－Ｇの標的部位と相補的であるターゲティング配列、例えば、配列番号１８８３７２～１８９８５８（ＷＯ２０１６１８３０４１の表１８、付録１１）のいずれか１つに示されている配列、またはＰＤ－Ｌ１の標的部位と相補的であるターゲティング配列、例えば、配列番号１９３１８４～２００７８３（ＷＯ２０１６１８３０４１の表２１、付録１４）のいずれか１つに示されている配列を有する。

【0628】

いくつかの実施形態では、その標的部位は、標的遺伝子の転写開始部位の上流にある。いくつかの実施形態では、その標的部位は、その遺伝子の転写開始部位に隣接している。いくつかの実施形態では、その標的部位は、その遺伝子の転写開始部位の下流のＲＮＡポリメラーゼ休止部位に隣接している。

【0629】

いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメインは、転写開始、１つ以上の転写エンハンサーもしくは転写活性化因子、及び／またはＲＮＡポリメラーゼの結合を促進するための、標的遺伝子のプロモーター領域を標的とするように構成されている。１つ以上のｇＲＮＡを用いて、その遺伝子のプロモーター領域を標的とすることができる。いくつかの実施形態では、その遺伝子の領域の１つ以上を標的とすることができる。ある特定の態様では、その標的部位は、その遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）のいずれかの側から６００塩基対以内にある。

【0630】

エクソン配列、ならびにプロモーター及び活性化因子を含む調節領域の配列を含め、遺伝子を標的とする配列であるか、またはその配列を含むｇＲＮＡ配列を設計または特定することは、当業者の技能レベルの範囲内である。ＣＲＩＳＰＲゲノム編集のためのゲノムワイドのｇＲＮＡデータベースは、公的に入手可能であり、このデータベースは、ヒトゲノムまたはマウスゲノム内の遺伝子の構成的エクソンにおける例示的なシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）標的配列を含む（例えば、ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ．ｃｏｍ／ｇＲＮＡ－ｄａｔａｂａｓｅ．ｈｔｍｌを参照されたい。Ｓａｎｊａｎａ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１：７８３－４、ｗｗｗ．ｅ－ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ－ＣＲＩＳＰ／、ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／も参照されたい）。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡ配列は、非標的遺伝子へのオフターゲット結合が最小限である配列であるか、またはその配列を含む。

【0631】

いくつかの実施形態では、その調節因子は、機能ドメイン、例えば転写活性化因子をさらに含む。

【0632】

いくつかの実施形態では、その転写活性化因子は、１つ以上の調節エレメント、例えば、標的遺伝子の１つ以上の転写制御エレメントであるか、またはそのエレメントを含み、それによって、上に示されているような部位特異的ドメインが認識されて、当該遺伝子の発現を駆動させる。いくつかの実施形態では、その転写活性化因子は、標的遺伝子の発現を駆動する。いくつかの事例では、その転写活性化因子は、異種のトランス活性化ドメインの全部または一部であるか、またはその全部または一部を含むことができる。例えば、いくつかの実施形態では、その転写活性化因子は、単純ヘルペス由来トランス活性化ドメイン、Ｄｎｍｔ３ａメチルトランスフェラーゼドメイン、ｐ６５、ＶＰ１６及びＶＰ６４から選択されている。

【0633】

いくつかの実施形態では、その調節因子は、ジンクフィンガー転写因子（ＺＦ－ＴＦ）である。いくつかの実施形態では、その調節因子は、ＶＰ６４－ｐ６５－Ｒｔａ（ＶＰＲ）である。

【0634】

ある特定の実施形態では、その調節因子は、転写調節ドメインをさらに含む。一般的なドメインとしては、例えば、転写因子ドメイン（活性化因子、抑制因子、共活性化因子、共抑制因子）、サイレンサー、がん遺伝子（例えば、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｆｏｓ、ｍｙｂ、ｍａｘ、ｍａｄ、ｒｅｌ、ｅｔｓ、ｂｃｌ、ｍｙｂ及びｍｏｓのファミリーメンバー）、ＤＮＡ修復酵素ならびにそれらの関連因子及び修飾因子、ＤＮＡ再構成酵素ならびにそれらの関連因子及び修飾因子、クロマチン関連タンパク質ならびにそれらの修飾因子（例えば、キナーゼ、アセチラーゼ及びデアセチラーゼ）、ならびにＤＮＡ修飾酵素（例えば、ＤＮＭＴファミリーのメンバーなどのメチルトランスフェラーゼ（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ及びＤＮＭＴ３Ｌ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）ならびにそれらの関連因子及び修飾因子が挙げられる。例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２５３０４０号（その内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）を参照されたい。

【0635】

活性化させるための適切なドメインとしては、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えば、Ｈａｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１，５９５２－５９６２（１ ９７）を参照されたい）、核ホルモン受容体（例えば、Ｔｏｒｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：３７３－３８３（１９９８）を参照されたい）、核因子κＢのｐ６５サブユニット（Ｂｉｔｋｏ ＆ Ｂａｎｋ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：５６１０－５６１８（１９９８）及びＤｏｙｌｅ ＆ Ｈｕｎｔ，Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ８：２９３７－２９４２（１９９７））、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３－２８（１９９８））、またはＶＰ６４などの人工キメラの機能的ドメイン（Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４６２３－３３）、及びデグロン（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊ．１８，６４３９－６４４７）が挙げられる。追加の例示的な活性化ドメインとしては、Ｏｃｔ１、Ｏｃｔ－２Ａ、Ｓｐｌ、ＡＰ－２及びＣＴＦ１（Ｓｅｉｐｅｌ ｅｔ ａｌ，ＥＭＢＯＪ．１１，４９６１－４９６８（１９９２））、ならびにｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ、ＡｔＨＤ２Ａ及びＥＲＦ－２が挙げられる。例えば、Ｒｏｂｙｒ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４：３２９－３４７、Ｃｏｌｌｉｎｇｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ ２３：２５５－２７５、Ｌｅｏ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：１－１１、Ｍａｎｔｅｕｆｆｅｌ－Ｃｙｍｂｏｒｏｗｓｋａ（１９９９）Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｐｏｌ．４６：７７－８９、ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６９：３－１２、Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２５：２７７－２８３及びＬｅｍｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．９：４９９－５０４を参照されたい。追加の例示的な活性化ドメインとしては、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ－１、Ｃｌ、ＡＰ１、ＡＲＦ－５、ＡＲＦ－６、ＡＲＦ－１、ＡＲＦ－８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ－ＲＰ／ＧＰ及びＴＲＡＢ１が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｏｇａｗａ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｇｅｎｅ ２４５：２１－２９、Ｏｋａｎａｍｉ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｃｅｌｌｓ １：８７－９９、Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ，（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：２９８－３０９、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０：４１９－４２９、Ｕｌｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：５８４４－５８４９、Ｓｐｒｅｎｇｅｒ－Ｈａｕｓｓｅｌｓ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１－８、Ｇｏｎｇ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４１：３３－４４及びＨｏｂｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１５，３４８－１５，３５３を参照されたい。

【0636】

遺伝子抑制因子を作製するのに使用できる例示的な抑制ドメインとしては、ＫＲＡＢ Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－β誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴファミリーのメンバー（例えば、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ及びＤＮＭＴ３Ｌ）、Ｒｂ、ならびにＭｅＣＰ２が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４５１－４５４、Ｔｙｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４３－４４６、Ｋｎｏｅｐｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ，（１９９９）Ｃｅｌｌ ９９：４４７－４５０及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２５：３３８－３４２を参照されたい。追加の例示的な抑制ドメインとしては、ＲＯＭ２及びＡｔＨＤ２Ａが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｃｈｅｍ ｅｔ ａｌ，（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ８：３０５－３２１及びＷｕ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２２：１９－２７を参照されたい。

【0637】

いくつかの事例では、そのドメインは、染色体のエピジェネティックな調節に関与する。いくつかの実施形態では、そのドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）、例えば核局在性のＡ型、例えば、ＭＹＳＴファミリーメンバーのＭＯＺ、Ｙｂｆ２／Ｓａｓ３、ＭＯＦ及びＴｉｐ６０、ＧＮＡＴファミリーメンバーのＧｃｎ５またはｐＣＡＦ、ｐ３００ファミリーメンバーのＣＢＰ、ｐ３００またはＲｔｔｌ０９である（Ｂｅｍｄｓｅｎ ａｎｄ Ｄｅｎｕ（２００８）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １８（６）：６８２－６８９）。他の事例では、そのドメインは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤ ＡＣ）、例えば、クラスＩ（ＨＤＡＣ－ｌ、ＨＤＡＣ－２、ＨＤＡＣ－３及びＨＤＡＣ－８）、クラスＩＩ分子（ＨＤＡＣ ＩＩＡ（ＨＤＡＣ－４、ＨＤＡＣ－５、ＨＤＡＣ－７及びＨＤＡＣ－９）、ＨＤ ＡＣ ＩＩＢ（ＨＤＡＣ６及びＨＤＡＣ１０））、クラスＩＶ（ＨＤＡＣ－ｌ１）、クラスＩＩＩ（サーチュイン（ＳＩＲＴ）としても知られる。ＳＩＲＴ１～７）である（Ｍｏｔｔａｍａｌ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２０（３）：３８９８－３９４ｌを参照されたい）。いくつかの実施形態で用いられている別のドメインは、ヒストンホスホリラーゼまたはヒストンキナーゼであり、その例としては、ＭＳＫ１、ＭＳＫ２、ＡＴＲ、ＡＴＭ、ＤＮＡ－ＰＫ、Ｂｕｂｌ、ＶｐｒＢＰ、ＩＫＫ－ａ、ＰＫＣｐｉ、Ｄｉｋ／Ｚｉｐ、ＪＡＫ２、ＰＫＣ５、ＷＳＴＦ及びＣＫ２が挙げられる。いくつかの実施形態では、メチル化ドメインが用いられており、そのドメインは、Ｅｚｈ２、ＰＲＭＴ１／６、ＰＲＭＴ５／７、ＰＲＭＴ ２／６、ＣＡＲＭ１、ｓｅｔ７／９、ＭＬＬ、ＡＬＬ－１、Ｓｕｖ ３９ｈ、Ｇ９ａ、ＳＥＴＤＢ１、Ｅｚｈ２、Ｓｅｔ２、Ｄｏｔｌ、ＰＲＭＴ １／６、ＰＲＭＴ ５／７、ＰＲ－Ｓｅｔ７及びＳｕｖ４－２０ｈなどの群から選択されていてよい。いくつかの実施形態では、ＳＵＭＯ化及びビオチン化に関与するドメイン（Ｌｙｓ９、Ｌｙｓ１３、Ｌｙｓ４、Ｌｙｓ１８及びＬｙｓ１２）も用いられていてもよい（Ｋｏｕｓａｒｉｄｅｓ（２００７）Ｃｅｌｌ １２８：６９３－７０５を参照されたい）。

【0638】

融合分子は、当業者に周知であるクローニング法及び生化学的コンジュゲーション法によって構築する。融合分子は、ＤＮＡ結合ドメイン及び機能ドメイン（例えば、転写活性化ドメインまたは転写抑制ドメイン）を含む。融合分子は、核局在化シグナル（例えば、ＳＶ４０中型Ｔ抗原に由来するシグナルなど）、ならびにエピトープタグ（例えば、ＦＬＡＧ及びヘマグルチニンなど）も任意に含む。融合タンパク質（及びそのタンパク質をコードする核酸）は、翻訳リーディングフレームが、その融合体の構成要素の間で保存されるように設計する。

【0639】

一方では、機能ドメイン（またはその機能的断片）のポリペプチド構成要素と、他方では、非タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（例えば、抗生物質、インターカレーター、マイナーグルーブバインダー、核酸）との融合体は、当業者に知られている生化学的コンジュゲーション法によって構築する。例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）Ｃａｔａｌｏｇｕｅを参照されたい。マイナーグルーブバインダーとポリペプチドとの融合体を作製する方法及び組成物は、Ｍａｐｐ ｅｔ ａｌ，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：３９３０－３９３５に記載されている。同様に、ポリペプチド構成要素である機能ドメインと連携するｓｇＲＮＡ核酸構成要素を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ＴＦ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼも、当業者に知られているとともに、本明細書に詳述されている。

【0640】

Ｂ．外因性ポリペプチド
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドの発現増加（例えば過剰発現）は、過剰発現させるポリヌクレオチドをコードする外因性ポリヌクレオチドをその細胞内に導入することによって媒介する。いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドは、組み換え核酸である。周知の組み換え技法を用いて、本明細書に概説されているような組み換え核酸を生成できる。

【0641】

ある特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチド、例えば、寛容原性因子またはキメラ抗原受容体をコードする組み換え核酸は、発現コンストラクト内で、１つ以上の調節ヌクレオチド配列に機能可能に連結してよい。調節ヌクレオチド配列は概して、治療する宿主細胞及びレシピエント対象に適するものとなる。適切な発現ベクター及び適切な調節配列は、数多くの種類が、様々な宿主細胞用として当該技術分野で知られている。典型的には、その１つ以上の調節ヌクレオチド配列としては、プロモーター配列、リーダー配列、シグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列、転写終結配列、翻訳開始配列、翻訳終結配列、及びエンハンサー配列または活性化因子配列を挙げてよいが、これらに限定されない。当該技術分野で知られているような構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターも想定されている。そのプロモーターは、天然のプロモーター、または２つ以上のプロモーターのエレメントが組み合わされているハイブリッドプロモーターのいずれかであってよい。発現コンストラクトは、細胞内で、プラスミドのようなエピソーム上に存在してもよいし、またはその発現コンストラクトは、染色体内に挿入されていてもよい。具体的な実施形態では、その発現ベクターは、トランスフォーメーションされた宿主細胞の選択を可能にするために、選択可能なマーカー遺伝子を含む。ある特定の実施形態は、少なくとも１つの調節配列に機能可能に連結されたバリアントポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。本発明で使用するための調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、及びその他の発現制御エレメントが挙げられる。ある特定の実施形態では、発現ベクターは、トランスフォーメーションする宿主細胞、発現するのが望ましい特定のバリアントポリペプチド、ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、及び／またはそのベクターによってコードされるいずれかの他のタンパク質、例えば抗生物質マーカーの発現の選定に合わせて設計されている。

【0642】

いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドは、その外因性ポリヌクレオチドがその操作細胞内で発現するように、プロモーターに機能可能に連結されている。適切な哺乳動物プロモーターの例としては、例えば、伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター、ハムスターのユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター（ＷＯ９７／１５６６４）、サル空胞形成ウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン－Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）の長鎖末端反復配列領域、マウス乳癌ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス長鎖末端反復配列領域、及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターという遺伝子に由来するプロモーターが挙げられる。他の異種の哺乳動物プロモーターの例は、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーターまたはヒートショックプロモーター（複数可）である。追加の実施形態では、哺乳動物宿主細胞で用いるためのプロモーターは、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開されたＵＫ２，２１１，５０４）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得ることができる。さらなる実施形態では、異種の哺乳動物プロモーターを使用する。例としては、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター及びヒートショックプロモーターが挙げられる。ＳＶ４０の初期プロモーター及び後期プロモーターは利便的にも、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むＳＶ４０制限断片として得られる（Ｆｉｅｒｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２７３：１１３－１２０（１９７８））。ヒトサイトメガロウイルスの前初期プロモーターは利便的にも、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素断片として得られる（Ｇｒｅｅｎａｗａｙ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ １８：３５５－３６０（１９８２））。上記の参照文献は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0643】

いくつかの実施形態では、その発現ベクターは、バイシストロニックまたはマルチシストロニックな発現ベクターである。バイシストロニックまたはマルチシストロニックな発現ベクターは、（１）オープンリーディングフレームのそれぞれに融合された複数のプロモーター、（２）遺伝子間へのスプライシングシグナルの挿入、（３）その発現が１つのプロモーターによって駆動される遺伝子の融合、及び（４）遺伝子間へのタンパク質切断部位の挿入（自己切断ペプチド）、または遺伝子間への内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の挿入を含んでよい。いくつかの事例では、外因性ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載の寛容原性因子または補体抑制因子をコードする外因性ポリヌクレオチド）は、マルチシストロニックな導入遺伝子によってコードされる外因性ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端で、切断可能なペプチドまたはリボソームスキップエレメント、例えばＴ２Ａをコードする。

【0644】

いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクターまたは発現コンストラクトは、マルチシストロニックなコンストラクトである。「マルチシストロニックなコンストラクト」及び「マルチシストロニックなベクター」という用語は、本明細書では同義的に用いられており、１つのｍＲＮＡ分子に転写される組み換えＤＮＡコンストラクトであって、その１つのｍＲＮＡ分子が、２つ以上の遺伝子（例えば、２つ以上の導入遺伝子）をコードする組み換えＤＮＡコンストラクトを指す。マルチシストロニックなコンストラクトは、２つの遺伝子をコードする場合には、バイシストロニックなコンストラクトといい、３つの遺伝子をコードする場合には、トリシストロニックなコンストラクトといい、４つの遺伝子をコードする場合には、クアドロシストロニックなコンストラクトというなどである。

【0645】

いくつかの実施形態では、ベクターまたはコンストラクトに含まれる２つ以上の外因性ポリヌクレオチド（例えば導入遺伝子）はそれぞれ、マルチシストロニックな分離エレメントによって隔てられている。いくつかの実施形態では、そのマルチシストロニックな分離エレメントは、ＩＲＥＳ、または切断可能なペプチドもしくはリボソームスキップエレメントをコードする配列である。いくつかの実施形態では、そのマルチシストロニックな分離エレメントは、ＩＲＥＳ、例えば脳心筋炎（ＥＭＣＶ）ウイルスＩＲＥＳである。いくつかの実施形態では、そのマルチシストロニックな分離エレメントは、切断可能なペプチド、例えば２Ａペプチドである。例示的な２Ａペプチドとしては、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチド、Ｅ２Ａペプチド及びＦ２Ａペプチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、その切断可能なペプチドは、Ｔ２Ａである。いくつかの実施形態では、その２つ以上の外因性ポリヌクレオチド（例えば、第１の外因性ポリヌクレオチド及び第２の外因性ポリヌクレオチド）は、プロモーターに機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、その第１の外因性ポリヌクレオチド及び第２の外因性ポリヌクレオチドはそれぞれ、プロモーターに機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、そのプロモーターは、同じプロモーターである。いくつかの実施形態では、そのプロモーターは、ＥＦ１プロモーターである。

【0646】

いくつかの事例では、外因性ポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載の寛容原性因子または補体抑制因子をコードする外因性ポリヌクレオチド）は、マルチシストロニックなベクターによってコードされる外因性ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端で、切断可能なペプチドまたはリボソームスキップエレメント、例えばＴ２Ａをコードする。いくつかの実施形態では、その切断可能なペプチドまたはリボソームスキップエレメントを含めることにより、１つの翻訳開始部位から、２つ以上のポリペプチドが発現可能になる。いくつかの実施形態では、その切断可能なペプチドは、Ｔ２Ａである。いくつかの実施形態では、そのＴ２Ａは、配列番号１５によって示されているアミノ酸配列であるか、またはそのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＴ２Ａは、配列番号１６によって示されているアミノ酸配列であるか、またはそのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＴ２Ａは、配列番号２１によって示されているアミノ酸配列であるか、またはそのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＴ２Ａは、配列番号２２によって示されているアミノ酸配列であるか、またはそのアミノ酸配列を含む。

【0647】

いくつかの実施形態では、そのベクターまたはコンストラクトは、外因性ポリヌクレオチドの１つ以上の転写ユニットの発現を駆動する１つのプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、このようなベクターまたはコンストラクトは、マルチシストロニックであることができる（バイシストロニックまたはトリシストロニックであることができる。例えば、米国特許第６，０６０，２７３号を参照されたい）。例えば、いくつかの実施形態では、転写ユニットは、ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）を含むバイシストロニックなユニットとして操作でき、これにより、１つのプロモーターから転写されたＲＮＡから、遺伝子産物（例えば、ＣＤ４７などの１つ以上の寛容原性因子）の共発現が可能になる。いくつかの実施形態では、本発明で提供するベクターまたはコンストラクトは、バイシストロニックであり、そのベクターまたはコンストラクトが、２つの別個のポリペプチドを発現できるようになっている。いくつかの事例では、そのベクターまたはコンストラクトによってコードされる２つの別個のポリペプチドは、寛容原性因子（例えば、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ３５、ＣＤ５２、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ及びＨ２－Ｍ３から選択した２つの因子（これらの組み合わせのいずれかを含む））である。いくつかの実施形態では、その寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８（これらの組み合わせのいずれかを含む）の２つ以上である。いくつかの実施形態では、そのベクターまたはコンストラクトによってコードされる２つの別個のポリペプチドは、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）である。いくつかの実施形態では、本発明で提供するベクターまたはコンストラクトは、トリシストロニックであり、そのベクターまたはコンストラクトが、３つの別個のポリペプチドを発現できるようになっている。いくつかの事例では、そのトリシストロニックなベクターまたはコンストラクトの３つの核酸配列は、ＣＤ４７などの寛容原性因子である。いくつかの事例では、そのトリシストロニックなベクターまたはコンストラクトの３つの核酸配列は、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ３５、ＣＤ５２、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ及びＨ２－Ｍ３（これらの組み合わせのいずれかを含む）から選択した３つの寛容原性因子である。いくつかの実施形態では、その３つの寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８（これらの組み合わせのいずれかを含む）から選択されている。いくつかの実施形態では、本発明で提供するベクターまたはコンストラクトは、クアドロシストロニックであり、そのベクターまたはコンストラクトが、４つの別個のポリペプチドを発現できるようになっている。いくつかの事例では、そのクアドロシストロニックなベクターまたはコンストラクトの４つの別個のポリペプチドは、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ３５、ＣＤ５２、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ及びＨ２－Ｍ３（これらの組み合わせのいずれかを含む）から選択した４つの寛容原性因子である。いくつかの実施形態では、その４つの寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８（これらの組み合わせのいずれかを含む）から選択されている。いくつかの実施形態では、その細胞は、１つ以上のベクターまたはコンストラクトを含み、そのそれぞれのベクターまたはコンストラクトは、上記のようなモノシストロニックまたはマルチシストロニックなコンストラクトであり、そのモノシストロニックまたはマルチシストロニックなコンストラクトは、１つ以上の寛容原性因子をいずれかの組み合わせまたは順序でコードする。

【0648】

いくつかの実施形態では、自己切断ペプチド（例えば２Ａ配列）またはプロテアーゼ認識部位（例えばフューリン）をコードする配列によって互いに隔てられた２つ、３つまたは４つの遺伝子を１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に含む（例えば、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）をコードする）ＲＮＡの発現を、１つのプロモーターが誘導する。すなわち、ＯＲＦは、１つのポリペプチドをコードし、翻訳中（２Ａの場合）または翻訳後のいずれかに、個別のタンパク質にプロセシングされる。いくつかの事例では、そのペプチド、例えばＴ２Ａは、リボソームに、２ＡエレメントのＣ末端でのペプチド結合の合成をスキップさせ（リボソームスキッピング）、その２Ａ配列の末端と次の下流のペプチドとを分離させることができる（例えば、ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒ．２：１３（２００４）及びｄｅＦｅｌｉｐｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｆｆｉｃ ５：６１６－６２６（２００４）を参照されたい）。数多くの２Ａエレメントが当該技術分野で知られている。本明細書に開示されている方法及び核酸で使用できる２Ａ配列の例としては、米国特許出願公開第２００７０１１６６９０号に記載されているように、口蹄疫ウイルス由来の２Ａ配列（Ｆ２Ａ、例えば配列番号２０）、ウマ鼻炎Ａウイルス由来の２Ａ配列（Ｅ２Ａ、例えば配列番号１９）、ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルス由来の２Ａ配列（Ｔ２Ａ、例えば、配列番号１５、１６、２１または２２）、及びブタテシオウイルス－１由来の２Ａ配列（Ｐ２Ａ、例えば、配列番号６３または６４）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0649】

そのベクターまたはコンストラクト（例えば導入遺伝子）が、タンパク質をコードする２つ以上の核酸配列、例えば、ＣＤ４７をコードする第１の外因性ポリヌクレオチド、及び第２の導入遺伝子をコードする第２の外因性ポリヌクレオチドを含む場合には、そのベクターまたはコンストラクト（例えば導入遺伝子）は、あるペプチドをコードする核酸配列を、第１の外因性ポリヌクレオチド配列と第２の外因性ポリヌクレオチド配列の間にさらに含んでもよい。いくつかの事例では、第１の外因性ポリヌクレオチドと第２の外因性ポリヌクレオチドの間に位置する核酸配列は、翻訳中または翻訳後に、第１の外因性ポリヌクレオチド及び第２の外因性ポリヌクレオチドの翻訳産物を分離するペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、そのペプチドは、自己切断ペプチド、またはリボソームスキッピングを引き起こすペプチド（リボソームスキップエレメント）、例えばＴ２Ａペプチドを含む。いくつかの実施形態では、その切断可能なペプチドまたはリボソームスキップエレメントを含めることにより、１つの翻訳開始部位から、２つ以上のポリペプチドが発現可能になる。いくつかの実施形態では、そのペプチドは、Ｔ２Ａペプチドである自己切断ペプチドである。いくつかの実施形態では、そのＴ２Ａは、配列番号１５によって示されているアミノ酸配列であるか、またはそのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＴ２Ａは、配列番号１６によって示されているアミノ酸配列であるか、またはそのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＴ２Ａは、配列番号２１によって示されているアミノ酸配列であるか、またはそのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのＴ２Ａは、配列番号２２によって示されているアミノ酸配列であるか、またはそのアミノ酸配列を含む。

【0650】

本明細書に記載のポリヌクレオチドを細胞内に導入するプロセスは、いずれかの適切な技法によって行うことができる。適切な技法としては、リン酸カルシウムまたは脂質の媒介によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスポザーゼの媒介による送達、及びトランスダクション、またはウイルスベクターを用いた感染が挙げられる。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ウイルストランスダクション（例えばレンチウイルストランスダクション）を介して細胞内に導入するか、またはウイルスベクターで別段に送達する（例えば、フソゲンの媒介による送達）。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドをパッケージングするベクターを用いて、そのパッケージングされたポリヌクレオチドを細胞または細胞集団に送達してよい。これらのベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクター、プラスミド、ウイルスベクター及び粒子を含むいずれかの種類のものであってよい。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子を用いて、外因性ポリヌクレオチドを細胞に送達できる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを用いて、外因性ポリヌクレオチドを細胞に送達できる。ウイルスベクター技術は、周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの文献（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されている。ベクターとして有用であるウイルスとしては、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、腫瘍溶解性ウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドのその細胞内への導入は、特異的導入（標的導入）であることもできるし、または非特異的導入（例えば非標的導入）であることもできる。いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドをその細胞内に導入することにより、その細胞のゲノムに組み込むか、または挿入することができる。別の実施形態では、導入したその外因性ポリヌクレオチドは、その細胞に組み込まれず、すなわち、その細胞でエピソーマルな状態であってよい。当業者は、本明細書に記載の例示的な方法のいずれかを含め、核酸導入遺伝子を細胞に導入する方法に精通しており、適切な方法を選択できる。

【0651】

１）非標的送達
いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、様々な非標的法のいずれかによって、細胞（例えば供給源細胞）内に導入する。いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドは、宿主細胞のランダムなゲノム遺伝子座に挿入する。当業者には知られているように、一般的に、例えば、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターを含むウイルスベクターを用いて、遺伝物質を宿主細胞に送達するとともに、その外来遺伝子または外因性遺伝子を宿主細胞ゲノムにランダムに挿入して、その遺伝子の安定な発現及び複製を促す。いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドのその細胞への非標的導入は、その外因性ポリヌクレオチドをその細胞内で安定に発現させるための条件下にある。いくつかの実施形態では、細胞内で安定に発現するように核酸を導入する方法は、その核酸をその細胞のゲノム内に安定的に組み込ませて、その核酸が組み込まれた細胞が分裂すると、その核酸が増殖できるようにするいずれかの方法を伴う。

【0652】

いくつかの実施形態では、そのウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターは、ウイルストランスダクションを成功させるために特に有用な手段である。レンチウイルスベクターは、送達された核酸の転写産物に含まれる遺伝子の安定な発現を可能にするからである。レンチウイルスベクターは、送達された核酸の転写産物に含まれる遺伝子の安定な発現に必要な２つの酵素である逆転写酵素及びインテグラーゼを発現する。逆転写酵素は、ＲＮＡ転写産物をＤＮＡに変換する一方で、インテグラーゼは、そのＤＮＡを標的細胞のゲノムに挿入し、組み込む。そのＤＮＡがそのゲノムに安定的に組み込まれると、そのＤＮＡは、宿主とともに分裂する。組み込まれたＤＮＡに含まれる目的の遺伝子は、構成的に発現してもよいし、または誘導性であってもよい。その宿主細胞ゲノムの一部として、その遺伝子は、標的細胞内の因子の宿主に応じて、活性化または抑制を含め、細胞の調節を受けることがある。

【0653】

レンチウイルスは、レトロウイルス科ファミリーのウイルスのサブクループであり、ウイルスＲＮＡゲノムがＤＮＡに逆転写されてから、宿主ゲノムに組み込まれる必要があることから名付けられた。したがって、レンチウイルスビヒクル／レンチウイルス粒子の最も重要な特徴は、その遺伝物質が標的細胞／宿主細胞のゲノムに組み込まれることである。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス、すなわちＨＩＶ－１及びＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ジェンブラナ病ウイルス（ＪＤＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、マエディ・ビスナ及びヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が挙げられる。

【0654】

典型的には、その遺伝子送達ビヒクルを構成するレンチウイルス粒子は、それ自体、複製能欠損性である（「自己不活性化性」ともいう）。レンチウイルスは、インタクトな宿主核膜を通る進入機構のおかげで、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染することができる（Ｎａｌｄｉｎｉ Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｉｅｃｋｎｏｌ，１９９８，９：４５７－４６３）。組み換えレンチウイルスのビヒクル／粒子は、ＨＩＶの病原性遺伝子を複数減弱することによって生成されており、例えば、Ｅｎｖ、Ｖｉｆ、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ、Ｎｅｆ及びＴａｔの遺伝子を欠失させて、そのベクターを生物学的に安全なものとする。それに応じて、レンチウイルスビヒクル、例えば、ＨＩＶ－１／ＨＩＶ－２に由来するビヒクルは、導入遺伝子の非分裂細胞への効率的な送達、組み込み及び長期発現を媒介できる。

【0655】

レンチウイルス粒子は、ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞のようなプロデューサー細胞内で、ウイルスパッケージングエレメント及びベクターゲノム自体を共発現させることによって生成してよい。これらのエレメントは通常、３つの別々のプラスミド（第２世代レンチウイルスシステムの場合）または４つの別々のプラスミド（第３世代レンチウイルスシステムの場合）に供給する。そのプロデューサー細胞には、ウイルスのコア（すなわち構造タンパク質）及び酵素成分、ならびにエンベロープタンパク質（複数可）（パッケージングシステムという）を含むレンチウイルス成分をコードするプラスミド、ならびに標的細胞に移入する外来導入遺伝子、すなわちビヒクル自体を含むゲノムをコードするプラスミド（トランスファーベクターともいう）をコトランスフェクションする。概して、そのプラスミドまたはベクターは、プロデューサー細胞株に含める。そのプラスミド／ベクターは、トランスフェクション、トランスダクションまたは感染を介して、プロデューサー細胞株に導入する。トランスフェクション方法、トランスダクション方法または感染方法は、当業者には周知である。非限定的な例として、パッケージングコンストラクト及びトランスファーコンストラクトは、概して優性選択マーカー、例えば、ネオマイシン（ｎｅｏ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、グルタミンシンテターゼまたはアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）と併せたリン酸カルシウムトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションの後に、適切な薬物の存在下で選択して、クローンを単離することによって、プロデューサー細胞株に導入できる。

【0656】

そのプロデューサー細胞は、外来遺伝子、例えば、外因性ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含む組み換えウイルス粒子を産生する。その組み換えウイルス粒子を培養培地から回収し、当業者によって用いられている標準的な方法によって滴定する。その組み換えレンチウイルスビヒクルを用いて、標的細胞、例えば、セクションＩＩ．Ｃに記載のいずれかを含む供給源細胞を感染させることができる。

【0657】

高力価のレンチウイルス粒子を産生させるのに用いることができる細胞としては、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、２９３Ｇ細胞、ＳＴＡＲ細胞（Ｒｅｌａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００５，１１：４５２－４５９）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、及びＨＥＫ２９３Ｔベースの他のプロデューサー細胞株（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．＿２０１１，２，２．（３）：３５７～３６９、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ，２０１２，１０９９６）：１５５１－１５６０、Ｔｈｒｏｍ ｅｔ ａｌ．．Ｂｌｏｏｄ．２００９，１１３（２１）：５１０４－５１１０）を挙げてよいが、これらに限定されない。

【0658】

レンチウイルス粒子内に供給される追加のエレメントは、５’末端または３’末端のいずれかのレトロウイルスＬＴＲ（長鎖末端反復配列）、レトロウイルス輸送エレメント、任意に、レンチウイルス逆転写応答エレメント（ＲＲＥ）、そのプロモーターまたは活性部分、及び座位制御領域（ＬＣＲ）またはその活性部分を含んでよい。他のエレメントとしては、非分裂細胞でのトランスダクション効率を改善させるためのセントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）配列、導入遺伝子の発現を増強するとともに、力価を向上させるウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）が挙げられる。

【0659】

組み換えレンチウイルス粒子を生成する方法は、当業者に知られており、例えば、米国特許第８，８４６，３８５号、同第７，７４５，１７９号、同第７，６２９，１５３号、同第７，５７５，９２４号、同第７，１７９，９０３号及び同第６，８０８，９０５号である。使用するレンチウイルスベクターは、ｐＬＶＸ、ｐＬｅｎｔｉ、ｐＬｅｎｔｉ６、ｐＬＪＭｌ、ＦＵＧＷ、ｐＷＰＸＬ、ｐＷＰＩ、ｐＬｅｎｔｉ ＣＭＶ ｐｕｒｏ ＤＥＳＴ、ｐＬＪＭｌ－ＥＧＦＰ、ｐＵＬＴＲＡ、ｐＩｎｄｕｃｅｒ２Ｑ、ｐＨＩＶ－ＥＧＦＰ、ｐＣＷ５７．１、ｐＴＲＰＥ、ｐＥＬＰＳ、ｐＲＲＬ、及びｐＬｉｏｎＩＩから選択してよいが、これらに限定されず、いずれかの既知のレンチウイルスビヒクルも用いてよい（米国特許第９，２６０，７２５号、同第９，０６８，１９９号、同第９，０２３，６４６号、同第８，９００，８５８号、同第８，７４８，１６９号、同第８，７０９，７９９号、同第８，４２０，１０４号、同第８，３２９，４６２号、同第８，０７６，１０６号、同第６，０１３，５１６号、及び同第５，９９４，１３６号、国際公開第ＷＯ２０１２０７９０００号を参照されたい）。

【0660】

いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドは、外因性ポリヌクレオチドをエピソーマルに送達させる方法によるなどして、その細胞内に、その細胞を一過性に発現させるための条件下で導入する。

【0661】

いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドは、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターにパッケージングしてよい。このようなベクターまたはウイルス粒子は、既知のセロタイプのカプシドまたはセロタイプのカプシドの組み合わせのいずれかを用いるように設計してよい。そのセロタイプのカプシドとしては、いずれかの特定されているＡＡＶセロタイプ及びそのバリアント、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４－４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２及びＡＡＶｒｈ１０に由来するカプシドを挙げてよい。いくつかの実施形態では、そのＡＡＶセロタイプは、米国特許出願公開第２００３０１３８７７２号、Ｐｕｌｉｃｈｅｒｌａ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１１，１９（６）：１０７０－１０７８、米国特許第６，１５６，３０３号、同第７，１９８，９５１号、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１７３号及び同第２０１４／０３５９７９９号、ならびに国際公開第ＷＯ１９９８／０１１２４４号、ＷＯ２００５／０３３３２１号及びＷＯ２０１４／１４４２２号に記載されているような配列であるか、またはそれらの配列を有してよい。

【0662】

ＡＡＶベクターには、一本鎖ベクターのみではなく、自己相補的なＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）も含まれる。ｓｃＡＡＶベクターは、アニーリングし合って、二本鎖のベクターゲノムを形成するＤＮＡを含む。ｓｃＡＡＶは、第２の鎖の合成をスキップすることによって、細胞内での迅速な発現が可能になる。そのｒＡＡＶベクターは、昆虫細胞ｓｆ９内またはＨＥＫ２９３細胞などのヒト細胞の懸濁細胞培養液中でのトリプルトランスフェクションによるなど、当該技術分野における標準的な方法によって製造してよい。

【0663】

いくつかの実施形態では、非ウイルスベースの方法を用いてもよい。例えば、いくつかの態様では、そのポリヌクレオチドを含むベクターは、物理的な方法、例えば、ニードル、エレクトロポレーション、ソノポレーション、ハイドロポレーション、化学担体、例えば無機粒子（例えば、リン酸カルシウム、シリカ、金）、及び／または化学的方法による非ウイルス法によって、細胞に移入してもよい。別の態様では、カチオン性脂質、脂質ナノエマルジョン、ナノ粒子、ペプチドベースのベクターまたはポリマーベースのベクターなど、合成または天然の生分解性作用物質を送達に用いてよい。

【0664】

２）標的送達
本発明の外因性ポリヌクレオチドは、本発明の細胞の適切な標的ゲノム遺伝子座のいずれかに挿入できる。いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドは、標的座位への標的組み込みによって、その細胞内に導入する。いくつかの実施形態では、標的組み込みは、相同性依存型または相同性非依存型の組み換えを伴うプロセスで、１つ以上のヌクレアーゼ及び／またはニッカーゼ、ならびにドナーテンプレートを用いて、遺伝子編集によって行うことができる。

【0665】

例えば、相同配向型修復（ＨＯＲ）、相同性媒介末端結合（ＨＭＥＪ）、相同性非依存型の標的組み込み（ＨＩＴＩ）、オブリゲートライゲーション依存性組み換え（ＯｂｌｉＧａＲｅ）、または標的染色体への高精度組み込み（ＰＩＴＣｈ）を含め、数多くの遺伝子編集方法を用いて、外因性ポリヌクレオチドを所定の特異的ゲノム遺伝子座に挿入できる。

【0666】

いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、ゲノム内の所望の位置（例えば標的部位）に、所定の二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り、その細胞の内在性の機構を利用して、誘導された切断を修復する。ニッカーゼは、ゲノム内の所望の位置に、所定の一本鎖切断を入れる。非限定的な一例では、２つのニッカーゼを用いて、標的ＤＮＡの対向鎖上に、２つの一本鎖切断を入れることができ、それによって、平滑末端または粘着末端を形成させる。いずれか適切なヌクレアーゼを細胞内に導入して、標的ＤＮＡ配列のゲノム編集を誘導でき、そのヌクレアーゼとしては、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、その他のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ、これらのバリアント、これらの断片、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、内在性のゲノム標的座位、例えばセーフハーバー座位の配列またはその近くの配列と相同的である相同配列（例えばホモロジーアーム）に挟まれた外因性ポリヌクレオチド配列（導入遺伝子ともいう）を含むドナーテンプレートとともに、ヌクレアーゼまたはニッカーゼを導入すると、ＤＮＡ損傷修復経路により、その導入遺伝子配列をその細胞内の標的部位に組み込むことができる。これは、相同性依存型のプロセスによって行うことができる。いくつかの実施形態では、そのドナーテンプレートは、環状二本鎖プラスミドＤＮＡ、一本鎖ドナーオリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）、直鎖二本鎖ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）断片またはインタクトな姉妹染色分体の相同配列である。そのドナーテンプレートの形態に応じて、所定のＤＮＡ修復経路、例えば、相同配向型修復（ＨＤＲ）、合成依存的一本鎖アニーリング（ＳＤＳＡ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）及び相同性媒介末端結合（ＨＭＥＪ）の経路を介して、相同性の媒介による遺伝子挿入及び遺伝子置換を行うことができる。

【0667】

例えば、ＤＮＡ修復機構は、ヌクレアーゼによって、（ｉ）２つのＳＳＢ（ＳＳＢは、それぞれの鎖上に存在する）によって、一本鎖オーバーハングを誘導するか、または（ｉｉ）両方の鎖で、同じ切断部位で生じたＤＳＢによって、平滑末端切断を誘導するかした後に誘導できる。これらの作用物質の１つによって切断されたら、ＳＳＢまたはＤＳＢを有する標的座位では、ＤＮＡ損傷修復のための２つの主要経路、すなわち、（１）エラープローンな非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路、または（２）忠実度の高い相同配向型修復（ＨＤＲ）経路のうちの１つが行われる。いくつかの実施形態では、ＳＳＢまたはＤＳＢが存在する細胞に導入したドナーテンプレート（例えば、環状プラスミドＤＮＡまたは直鎖状ＤＮＡ断片、例えばｓｓＯＤＮ）により、標的座位内にＨＤＲ及びドナーテンプレートの組み込みが行われることができる。概して、ドナーテンプレートの非存在下では、ＮＨＥＪプロセスにより、切断されたＤＮＡ鎖の末端をが再度ライゲーションされ、その結果、その切断部位で、ヌクレオチドの欠失及び挿入が高頻度で行われる。

【0668】

いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドの細胞内への部位特異的挿入は、ＨＤＲベースのアプローチを通じて行ってよい。ＨＤＲは、細胞がＤＮＡ内の二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復する機構であり、クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ及びトランスポザーゼを含む様々な遺伝子編集システムを利用する多くの生物において、ＨＤＲを用いて、ゲノムを改変できる。

【0669】

いくつかの実施形態では、その標的組み込みは、標的遺伝子の少なくとも１つの標的部位（複数可）配列にターゲティングされるように特異的に設計した１つ以上の配列特異的なヌクレアーゼ、すなわち標的化ヌクレアーゼ（ＤＮＡに結合する標的化ヌクレアーゼ及び遺伝子編集ヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ならびにＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）システムを含む）を導入することによって行う。例示的なＺＦＮ、ＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮは、例えば、Ｌｌｏｙｄ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４（２２１）：１－７（２０１３）に記載されている。特定の実施形態では、標的部位におけるか、または標的部位近くでの標的遺伝子破壊は、クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を用いて行う。Ｓａｎｄｅｒ ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ，（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３２（４）：３４７－３５５を参照されたい。

【0670】

セクションＩＩ．Ａ．１に記載されている遺伝子破壊用システムのいずれかを用いることができ、外因性ポリヌクレオチド、例えば導入遺伝子配列を有する適切なドナーテンプレートも導入するときには、そのシステムにより、遺伝子破壊の標的部位またはその標的部位の近くに、その外因性ポリヌクレオチドの標的組み込みを行うことができる。特定の実施形態では、遺伝子破壊は、１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及びＣａｓタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて媒介する。例示的なＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡは、上記のセクションＩＩ．Ａに記載されており、そのいずれかを用いて、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが特異的である標的座位に、ＨＤＲの媒介により、外因性ポリヌクレオチドを組み込むことができる。ＨＤＲによって、その外因性ポリヌクレオチドの切断及び組み込みを行うための特定の標的座位及び標的部位に応じるなどして、適切なＣａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを選択することは、当業者の技能レベルの範囲内である。さらに、当業者は、下にさらに記載されているようにするなどして、標的座位に応じて、適切なドナーテンプレートを容易に調製できる。

【0671】

いくつかの実施形態では、そのＤＮＡ編集システムは、ＲＮＡ誘導型のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（ＲＮＡベースのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなど）であり、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、標的座位（例えばセーフハーバー座位）に二本鎖切断を入れて、その標的座位内に導入遺伝子の挿入を誘導することができる。いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼシステムは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムである。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、プラスミドベースのＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ＲＮＡベースのＣａｓ９を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、タンパク質／ＲＮＡ複合体、プラスミド／ＲＮＡ複合体またはタンパク質／プラスミド複合体を含む。いくつかの実施形態では、操作細胞を生成する方法であって、供給源細胞（例えば、初代細胞または多能性幹細胞、例えばｉＰＳＣ）に、導入遺伝子または外因性ポリヌクレオチド配列を含むドナーテンプレート、ならびにＤＮＡヌクレアーゼシステム（例えばＣａｓ９）及び座位特異的なｇＲＮＡを含むＤＮＡヌクレアーゼシステムを導入することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９は、ｍＲＮＡとして導入する。いくつかの実施形態では、そのＣａｓ９は、ｇＲＮＡとのリボ核タンパク質複合体として導入する。

【0672】

概して、挿入するドナーテンプレートは、目的の外因性ポリヌクレオチド（例えば、寛容原性因子またはＣＡＲ）を含む導入遺伝子カセットを少なくとも含むことになるとともに、任意に、プロモーターも含むことになる。これらの実施形態のうちのある特定のものでは、挿入する外因性ポリヌクレオチド及び／またはプロモーターを含む導入遺伝子カセットは、ドナーテンプレートにおいて、標的切断部位のすぐ上流及びすぐ下流の配列と相同的な配列を有するホモロジーアーム、すなわち、左ホモロジーアーム（ＬＨＡ）及び右ホモロジーアーム（ＲＨＡ）に挟まれることになる。典型的には、そのドナーテンプレートのホモロジーアームは、ＨＤＲの際のテンプレートとして働くように、標的ゲノム遺伝子座に特異的に設計されている。各ホモロジーアームの長さは概して、導入するインサートのサイズによって決まり、インサートが大きいほど、長いホモロジーアームが必要となる。

【0673】

いくつかの実施形態では、ドナーテンプレート（例えば組み換えドナー修復テンプレート）は、（ｉ）外因性ポリヌクレオチド配列（例えば、プロモーター、例えば異種プロモーターに機能可能に連結された導入遺伝子）を含む導入遺伝子カセットと、（ｉｉ）その導入遺伝子カセットを挟み込むとともに、ＤＮＡヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９またはＣａｓ１２）の切断部位の両側で、標的座位（例えばセーフハーバー座位）の一部と相同である２本のホモロジーアームを含む。そのドナーテンプレートは、選択可能なマーカー、検出可能なマーカー及び／または精製マーカーをさらに含むことができる。

【0674】

いくつかの実施形態では、それらのホモロジーアームは、同じ長さである。別の実施形態では、それらのホモロジーアームは、異なる長さである。それらのホモロジーアームは、少なくとも約１０塩基対（ｂｐ）、例えば、少なくとも約１０ｂｐ、約１５ｂｐ、約２０ｂｐ、約２５ｂｐ、約３０ｂｐ、約３５ｂｐ、約４５ｂｐ、約５５ｂｐ、約６５ｂｐ、約７５ｂｐ、約８５ｂｐ、約９５ｂｐ、約１００ｂｐ、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約４５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約５５０ｂｐ、約６００ｂｐ、約６５０ｂｐ、約７００ｂｐ、約７５０ｂｐ、約８００ｂｐ、約８５０ｂｐ、約９００ｂｐ、約９５０ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１．１キロベース（ｋｂ）、約１．２ｋｂ、約１．３ｋｂ、約１．４ｋｂ、約１．５ｋｂ、約１．６ｋｂ、約１．７ｋｂ、約１．８ｋｂ、約１．９ｋｂ、約２．０ｋｂ、約２，１ｋｂ、約２，２ｋｂ、約２，３ｋｂ、約２，４ｋｂ、約２，５ｋｂ、約２，６ｋｂ、約２．７ｋｂ、約２．８ｋｂ、約２．９ｋｂ、約３．０ｋｂ、約３．１ｋｂ、約３．２ｋｂ、約３．３ｋｂ、約３．４ｋｂ、約３．５ｋｂ、約３．６ｋｂ、約３．７ｋｂ、約３．８ｋｂ、約３．９ｋｂまたは約４．０ｋｂ以上である。そのホモロジーアームは、約１０ｂｐ～約４ｋｂ、例えば、約１０ｂｐ～約２０ｂｐ、約１０ｂｐ～約５０ｂｐ、約１０ｂｐ～約１００ｂｐ、約１０ｂｐ～約２００ｂｐ、約１０ｂｐ～約５００ｂｐ、約１０ｂｐ～約１ｋｂ、約１０ｂｐ～約２ｋｂ、約１０ｂｐ～約４ｋｂ、約１００ｂｐ～約２００ｂｐ、約１００ｂｐ～約５００ｂｐ、約１００ｂｐ～約１ｋｂ、約１００ｂｐ～約２ｋｂ、約１００ｂｐ～約４ｋｂ、約５００ｂｐ～約１ｋｂ、約５００ｂｐ～約２ｋｂ、約５００ｂｐ～約４ｋｂ、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約２ｋｂ、約１ｋｂ～約４ｋｂまたは約２ｋｂ～約４ｋｂであることができる。

【0675】

いくつかの実施形態では、そのドナーテンプレートは、発現ベクターにクローニングできる。当業者に知られている従来のウイルスベース及び非ウイルスベースの発現ベクターを使用することができる。いくつかの実施形態では、組み込みの標的となる標的座位は、外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子の組み込みの標的とするのが許容されるかまたは望まれるいずれかの座位であってよい。標的座位の非限定的な例としては、ＣＸＣＲ４遺伝子、アルブミン遺伝子、ＳＨＳ２３１座位、Ｆ３遺伝子（ＣＤ１４２としても知られる）、ＭＩＣＡ遺伝子、ＭＩＣＢ遺伝子、ＬＲＰ１遺伝子（ＣＤ９１としても知られる）、ＨＭＧＢ１遺伝子、ＡＢＯ遺伝子、ＲＨＤ遺伝子、ＦＵＴ１遺伝子、ＫＤＭ５Ｄ遺伝子（ＨＹとしても知られる）、Ｂ２Ｍ遺伝子、ＣＩＩＴＡ遺伝子、ＴＲＡＣ遺伝子、ＴＲＢＣ遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、Ｆ３（すなわちＣＤ１４２）遺伝子、ＭＩＣＡ遺伝子、ＭＩＣＢ遺伝子、ＬＲＰ１遺伝子、ＨＭＧＢ１遺伝子、ＡＢＯ遺伝子、ＲＨＤ遺伝子、ＦＵＴ１遺伝子、ＫＤＭ５Ｄ（すなわちＨＹ）遺伝子、ＰＤＧＦＲａ遺伝子、ＯＬＩＧ２遺伝子及び／またはＧＦＡＰ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドは、例えば、イントロン、エクソン及び／または遺伝子コード領域（コード配列または「ＣＤＳ」としても知られる）を含め、標的座位（例えばセーフハーバー座位）の適切な領域に挿入できる。いくつかの実施形態では、その挿入は、標的ゲノム遺伝子座のアレルの１つで行う。いくつかの実施形態では、その挿入は、標的ゲノム遺伝子座のアレルの両方で行う。これらの実施形態のいずれかでは、その標的ゲノム遺伝子座に挿入する導入遺伝子の向きは、その座位の遺伝子の方向と同じまたは逆のいずれかであることができる。いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドは、セーフハーバー遺伝子座のイントロン、エクソンまたはコード配列領域に挿入する。いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドは、内在性遺伝子に挿入し、その挿入により、その内在性遺伝子がサイレンシングされるか、またはその発現が低下する。外因性ポリヌクレオチドの挿入のための例示的なゲノム遺伝子座は、表４に示されている。

【0676】

【表4】

【0677】

いくつかの実施形態では、その標的座位は、セーフハーバー座位である。いくつかの実施形態では、セーフハーバー座位は、近隣または隣接の内在性遺伝子、調節エレメントなどへの影響を最小限に抑えながら、組み込まれたＤＮＡの安定な発現が可能になるゲノム位置である。いくつかの事例では、セーフハーバー遺伝子は、初代細胞及び多能性幹細胞（その誘導体及びその分化細胞を含む）を含め、様々な細胞種において、遺伝子の持続的な発現を可能にするとともに、遺伝子改変の際に、操作ヌクレアーゼの標的とすることができる。セーフハーバー座位の非限定的な例としては、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座及び／またはＲｏｓａ遺伝子座（例えばＲＯＳＡ２６遺伝子座）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、そのセーフハーバー座位は、ＡＡＶＳ１座位、ＣＣＲ５座位及びＣＬＹＢＬ座位からなる群から選択する。いくつかの事例では、多くの細胞種では、ＳＨＳ２３１をセーフハーバー座位として標的とできる。いくつかの事例では、ある特定の座位は、ある特定の細胞種では、セーフハーバー座位として機能できる。例えば、ＰＤＧＦＲａは、グリア前駆細胞（ＧＰＣ）でのセーフハーバーであり、ＯＬＩＧ２は、オリゴデンドロサイトでのセーフハーバー座位であり、ＧＦＡＰは、アストロサイトでのセーフハーバー座位である。特定の操作細胞種に応じて、適切なセーフハーバー座位を選択することは、当業者の技能レベルの範囲内である。いくつかの事例では、２つ以上のセーフハーバー遺伝子を標的として、それによって、２つ以上の導入遺伝子をその遺伝子改変細胞に導入できる。

【0678】

いくつかの実施形態では、操作細胞を生成する方法であって、導入遺伝子または外因性ポリヌクレオチド配列を含むドナーテンプレートと、ＤＮＡヌクレアーゼシステム（例えばＣａｓ９）と、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座及び／またはＲｏｓａ遺伝子座（例えばＲＯＳＡ２６遺伝子座）に特異的な相補的部分（例えばｇＲＮＡターゲティング配列）を含む座位特異的なｇＲＮＡとを含むＤＮＡヌクレアーゼシステムとを、供給源細胞（例えば、初代細胞または多能性幹細胞、例えばｉＰＳＣ）に導入することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡが標的とするゲノム遺伝子座は、記載されているような座位のいずれかから４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内または５００ｂｐ以内に位置する。

【0679】

いくつかの実施形態では、ＨＤＲの媒介によって導入遺伝子を挿入するために本発明で使用するｇＲＮＡは、ＡＡＶＳ１内の標的配列を認識する相補的部分（例えばｇＲＮＡターゲティング配列）を含む。これらの実施形態のうちのある特定ものでは、その標的配列は、ＡＡＶＳ１のイントロン１に位置する。ＡＡＶＳ１は、１９番染色体の５５，０９０，９１８～５５，１１７，６３７番目のリバース鎖に位置し、ＡＡＶＳ１イントロン１（転写産物ＥＮＳＧ０００００１２５５０３に基づく）は、１９番染色体の５５，１１７，２２２～５５，１１２，７９６番目のリバース鎖に位置する。ある特定の実施形態では、そのｇＲＮＡは、１９番染色体の５５，１１７，２２２～５５，１１２，７９６番目から４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内または５００ｂｐ以内のゲノム遺伝子座を標的とする。ある特定の実施形態では、そのｇＲＮＡは、１９番染色体の５５，１１５，６７４番目から４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内または５００ｂｐ以内のゲノム遺伝子座を標的とする。ある特定の実施形態では、そのｇＲＮＡは、１９番染色体の５５，１１５，６７４番目、または１９番染色体の５５，１１５，６７４番目から５ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、４０ヌクレオチド以内もしくは５０ヌクレオチド以内の位置に、切断部位を入れるように構成されている。ある特定の実施形態では、そのｇＲＮＡは、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６：８６６－８６９（２０１９）に記載されているＧＥＴ００００４６（「ｓｇＡＡＶＳ１－１」としても知られる）である。このｇＲＮＡは、例えば表５に示されている核酸配列を有する相補的部分（例えばｇＲＮＡターゲティング配列）を含み、ＡＡＶＳ１（ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃとしても知られる）のイントロン１を標的とする。

【0680】

いくつかの実施形態では、ＨＤＲの媒介によって導入遺伝子を挿入するために本発明で使用するｇＲＮＡは、ＣＬＹＢＬ内の標的配列を認識する相補的部分（例えばｇＲＮＡターゲティング配列）を含む。これらの実施形態のうちのある特定ものでは、その標的配列は、ＣＬＹＢＬのイントロン２に位置する。ＣＬＹＢＬは、１３番染色体の９９，６０６，６６９～９９，８９７，１３４番目のフォワード鎖に位置し、ＣＬＹＢＬイントロン２（転写産物ＥＮＳＴ０００００３７６３５５．７に基づく）は、１３番染色体の９９，７７３，０１１～９９，８５８，８６０番目のフォワード鎖に位置する。ある特定の実施形態では、そのｇＲＮＡは、１３番染色体の９９，７７３，０１１～９９，８５８，８６０番目から４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内または５００ｂｐ以内のゲノム遺伝子座を標的とする。ある特定の実施形態では、そのｇＲＮＡは、１３番染色体の９９，８２２，９８０番目から４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内または５００ｂｐ以内のゲノム遺伝子座を標的とする。ある特定の実施形態では、そのｇＲＮＡは、１３番染色体の９９，８２２，９８０番目、または１３番染色体の９９，８２２，９８０番目から５ヌクレオチド以内、０ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、４０ヌクレオチド以内もしくは５０ヌクレオチド以内の位置に切断部位を入れるように構成されている。ある特定の実施形態では、そのｇＲＮＡは、ＧＥＴ００００４７であり、例えば表５に示されている核酸配列を有する相補的部分（例えばｇＲＮＡターゲティング配列）を含み、ＣＬＹＢＬのイントロン２を標的とする。その標的部位は、Ｃｅｒｂｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ １，１０（１）：ｅ０１１６０３２（２０１５）に記載されているようなＴＡＬＥＮの標的部位と同様の部位である。

【0681】

いくつかの実施形態では、ＨＤＲの媒介によって導入遺伝子を挿入するために本発明で使用するｇＲＮＡは、ＣＣＲ５内の標的配列を認識する相補的部分（例えばｇＲＮＡターゲティング配列）を含む。これらの実施形態のうちのある特定ものでは、その標的配列は、ＣＣＲ５のエクソン３に位置する。ＣＣＲ５は、３番染色体の４６，３７０，８５４～４６，３７６，２０６番目のフォワード鎖に位置し、ＣＣＲ５エクソン３（転写産物ＥＮＳＴ０００００２９２３０３．４に基づく）は、３番染色体の４６，３７２，８９２～４６，３７６，２０６のフォワード鎖に位置する。ある特定の実施形態では、そのｇＲＮＡは、３番染色体の４６，３７２，８９２～４６，３７６，２０６番目から４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内または５００ｂｐ以内のゲノム遺伝子座を標的とする。ある特定の実施形態では、そのｇＲＮＡは、３番染色体の４６，３７３，１８０番目から４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内または５００ｂｐ以内のゲノム遺伝子座を標的とする。ある特定の実施形態では、そのｇＲＮＡは、３番染色体の４６，３７３，１８０番目、または３番染色体の４６，３７３，１８０番目から５ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、４０ヌクレオチド以内もしくは５０ヌクレオチド以内の位置に切断部位を入れるように構成されている。ある特定の実施形態では、そのｇＲＮＡは、Ｍａｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ １５：６４３－６５２（２０１４）に記載されているＧＥＴ００００４８（「ｃｒＣＣＲ５＿Ｄ」としても知られる）である。このｇＲＮＡは、例えば表５に示されている核酸配列を有する相補的部分を含み、ＣＣＲ５のエクソン３（あるいは、Ｅｎｓｅｍｂｌのゲノムデータベースでは、エクソン２としてアノテーションされている）を標的とする。Ｇｏｍｅｚ－Ｏｓｐｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍ．１０（１）：４０４５（２０１９）を参照されたい。

【0682】

表５には、例示的なｇＲＮＡターゲティング配列が示されている。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡターゲティング配列は、表５に示されている相補的部分配列内の１つ以上のチミンがウラシルに置換されたものを含んでよい。リボ核酸における場合には、ウラシルについては「ｕ」、チミンについては「ｔ」とする代わりに、ウラシル及びチミンの両方とも「ｔ」とできることを当業者は分かるであろうし、別段に示されていない限り、「ｔ」を用いて、ウラシルを表すことができることは分かるであろう。

【0683】

【表5】

【0684】

いくつかの実施形態では、その標的座位は、その細胞内でノックアウトするのが望ましい座位である。このような実施形態では、この標的座位は、その細胞の表現型または機能を調節するためなどで、その細胞内で破壊または消失されるのが望ましいいずれかの標的座位である。例えば、セクションＩＩ．Ａに記載の遺伝子改変であって、標的遺伝子の発現を低下させる遺伝子改変のいずれも、外因性ポリヌクレオチドの標的組み込みに望ましい標的座位であることがあり、その際、標的遺伝子の遺伝子破壊または遺伝子ノックアウト、及び外因性ポリヌクレオチドの標的挿入による過剰発現を、その細胞内の同じ標的部位または同じ標的座位で行ってよい。例えば、ＨＤＲプロセスを用いて遺伝子破壊を行って、表１に示されているいずれかの標的遺伝子を消失させるか、またはその発現を低下（例えばノックアウト）させる一方で、その遺伝子破壊の標的部位またはその部位の近くの核酸配列と相同であるホモロジーアームに挟まれたドナーテンプレートを用いることによって、外因性ポリヌクレオチドをその標的遺伝子に組み込んでもよい（例えばノックインしてもよい）。

【0685】

いくつかの実施形態では、操作細胞を生成する方法であって、供給源細胞（例えば、初代細胞または多能性幹細胞、例えばｉＰＳＣ）に、導入遺伝子または外因性ポリヌクレオチド配列を含むドナーテンプレートと、ＤＮＡヌクレアーゼシステム（例えばＣａｓ９）と、Ｂ２Ｍ座位、ＣＩＩＴＡ座位、ＴＲＡＣ座位、ＴＲＢＣ座位に特異的な相補的部分を含む座位特異的なｇＲＮＡとを含むＤＮＡヌクレアーゼシステムとを導入することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのｇＲＮＡが標的とするゲノム遺伝子座は、記載されているような座位のいずれかから４０００ｂｐ以内、３５００ｂｐ以内、３０００ｂｐ以内、２５００ｂｐ以内、２０００ｂｐ以内、１５００ｂｐ以内、１０００ｂｐ以内または５００ｂｐ以内に位置する。

【0686】

特定の実施形態では、その標的座位は、Ｂ２Ｍである。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸配列とを含む標的化ヌクレアーゼシステムを用いることによるものである。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸（ｇＲＮＡ）配列は、ＷＯ２０１６／１８３０４１（その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）の付録２または表１５の配列番号８１２４０～８５６４４からなる群から選択する。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、そのｇＲＮＡが標的とする標的部位に隣接する配列と相同なホモロジーアームに挟まれた外因性ポリヌクレオチド配列を含むドナーテンプレートを導入することによって、破壊されたＢ２Ｍ座位に、ＨＤＲによって組み込まれる。

【0687】

特定の実施形態では、その標的座位は、ＣＩＩＴＡである。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸配列とを含む標的化ヌクレアーゼシステムによるものである。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸配列は、ＷＯ２０１６１８３０４１（その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）の付録１または表１２の配列番号５１８４～３６３５２からなる群から選択する。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、そのｇＲＮＡが標的とする標的部位に隣接する配列と相同なホモロジーアームに挟まれた外因性ポリヌクレオチド配列を含むドナーテンプレートを導入することによって、破壊されたＣＩＩＴＡ座位に、ＨＤＲによって組み込まれる。

【0688】

いくつかの実施形態では、その細胞はＴ細胞であり、内在性のＴＲＡＣ座位またはＴＲＢＣ座位の発現をその細胞内で、遺伝子編集法によって低下または消失させる。例えば、ＨＤＲプロセスを用いて遺伝子破壊を行って、ＴＲＡＣ遺伝子またはＴＲＢＣ遺伝子を消失させるか、またはその発現を低下（例えばノックアウト）させる一方で、その遺伝子破壊の標的部位またはその部位の近くの核酸配列と相同であるホモロジーアームに挟まれたドナーテンプレートを用いることによって、外因性ポリヌクレオチドを同じ座位に組み込んでもよい（例えばノックインしてもよい）。本明細書に記載の遺伝子をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースで標的とするのに有用な例示的なｇＲＮＡ配列は、表６に示されている。その配列は、ＵＳ２０１６０３４８０７３に見ることができ、その配列表を含む開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0689】

【表6】

【0690】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ＴＲＡＣ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸配列とを含む標的化ヌクレアーゼシステムによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸配列（例えばｇＲＮＡターゲティング配列）は、ＵＳ２０１６０３４８０７３（その開示内容は、参照により、その全体が援用される）の配列番号５３２～６０９及び９１０２～９７９７からなる群から選択する。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、そのｇＲＮＡが標的とする標的部位に隣接する配列と相同なホモロジーアームに挟まれた外因性ポリヌクレオチド配列を含むドナーテンプレートを導入することによって、破壊されたＴＲＡＣ座位に、ＨＤＲによって組み込まれる。

【0691】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ＴＲＢＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子を標的とする遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ＴＲＢＣ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸配列とを含む標的化ヌクレアーゼシステムによるものである。いくつかの実施形態では、ＴＲＢＣ遺伝子を特異的に標的とする少なくとも１つのガイドリボ核酸配列（例えばｇＲＮＡターゲティング配列）は、ＵＳ２０１６０３４８０７３（その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される）の配列番号６１０～７６５及び９７９８～１０５３２からなる群から選択する。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは、そのｇＲＮＡが標的とする標的部位に隣接する配列と相同なホモロジーアームに挟まれた外因性ポリヌクレオチド配列を含むドナーテンプレートを導入することによって、破壊されたＴＲＢＣ座位に、ＨＤＲによって組み込まれる。

【0692】

いくつかの実施形態では、記載されているような、ＨＤＲの媒介による組み込みアプローチで用いるための新たな座位及び／またはｇＲＮＡ配列を特定することは、当業者の技能レベルの範囲内である。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、特定の座位（例えば、例えば表１に示されている標的遺伝子内の座位）に対して既存のｇＲＮＡが知られているときには、「インチワーミング」アプローチを用いて、ＰＡＭ配列の座位の両側のフランキング領域をスキャニングすること（これは通常、ゲノム全体にわたり、約１００塩基対（ｂｐ）ごとに行う）によって、導入遺伝子の標的挿入用の追加の座位を特定できる。ＰＡＭ配列は、使用する具体的なＣａｓヌクレアーゼによって決まる。通常、ヌクレアーゼによって、対応するＰＡＭ配列が異なるからである。その座位の両側のフランキング領域は、長さが約５００～４０００ｂｐ、例えば、長さが約５００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２５００ｂｐ、約３０００ｂｐ、約３５００ｂｐまたは約４０００ｂｐであることができる。その検索範囲内にＰＡＭ配列が特定されたら、遺伝子破壊法で用いるために、その座位の配列に従って新たなガイドを設計できる。例示として、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムについて記載されているが、新たな座位を特定するこの方法では、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ及びトランスポザーゼを用いるアプローチを含め、記載されているような、ＨＤＲの媒介によるいずれかのアプローチを使用できる。

【0693】

いくつかの実施形態では、その外因性ポリヌクレオチドは、外因性のＣＤ４７ポリペプチド（例えば、ヒトＣＤ４７ポリペプチド）をコードし、その外因性ポリペプチドは、本明細書に開示されているようなセーフハーバー遺伝子座もしくはセーフハーバー部位、またはその内在性遺伝子をサイレンシングさせるか、もしくはその発現を低下させるゲノム遺伝子座に挿入する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、ＣＣＲ５遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、ＣＬＹＢＬ遺伝子座及び／またはＲｏｓａ遺伝子座（例えばＲＯＳＡ２６遺伝子座）に挿入する。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢ、ＰＤ１またはＣＴＬＡ４の遺伝子座に挿入する。

【0694】

Ｃ．細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、このような幹細胞、造血幹細胞、間葉細胞もしくは初代細胞に由来するか、またはその細胞から作られる分化細胞）、あるいはその集団であって、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えばＣＤ４７の発現の増加が見られる細胞またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、このような幹細胞、造血幹細胞、間葉細胞もしくは初代細胞に由来するか、またはその細胞から作られる分化細胞）、あるいはその集団であって、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えば、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８のいずれかの発現の増加が見られる細胞またはその集団を提供する。いくつかの実施形態では、提供するのは、細胞（例えば、幹細胞、人工多能性細胞、このような幹細胞、造血幹細胞、間葉細胞もしくは初代細胞に由来するか、またはその細胞から作られる分化細胞）、あるいはその集団であって、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢを低減または欠失させ、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子もしくはその構成要素、及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子を低減または欠失させ、寛容原性因子、例えばＣＤ４７を増加させる（過剰発現させるなど）ように操作（または改変）されている細胞またはその集団である。いくつかの実施形態では、提供するのは、細胞（例えば、幹細胞、人工多能性幹細胞、このような幹細胞、造血幹細胞、間葉細胞もしくは初代細胞に由来するか、またはその細胞から作られる分化細胞）、あるいはその集団であって、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢを低減または欠失させ、寛容原性因子、例えば、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８のいずれかを増加させる（過剰発現させるなど）ように操作（または改変）されている細胞またはその集団である。

【0695】

いくつかの実施形態では、本明細書に示されているようにして操作または改変する細胞は、多能性幹細胞であるか、または多能性幹細胞から分化させた細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に示されているようにして操作または改変する細胞は、初代細胞である。

【0696】

その細胞は、脊椎動物細胞、例えば、ヒト細胞またはマウス細胞のような哺乳動物細胞であってよい。その細胞は、脊椎動物幹細胞、例えば、ヒト幹細胞またはマウス幹細胞のような哺乳動物幹細胞であってもよい。好ましくは、その細胞または幹細胞は、改変、例えば遺伝子改変がしやすいものである。好ましくは、その細胞もしくは幹細胞、またはそのような幹細胞に由来する細胞は、治療的意義を有するか、または治療的意義を有すると考えられ、その結果、その細胞もしくは幹細胞、またはそのような幹細胞に由来するか、もしくはそのような幹細胞から分化させた細胞を用いて、疾患、障害、欠損または損傷の治療が必要な対象の疾患、障害、欠損または損傷を治療してよい。

【0697】

いくつかの実施形態では、その細胞は、幹細胞または前駆細胞（例えば、ｉＰＳＣ、胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞、脂肪前駆細胞、生殖系列幹細胞、肺幹細胞、肺前駆細胞、乳腺幹細胞、成体嗅細胞、毛包幹細胞、多分化能性幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞、神経幹細胞または神経前駆細胞）である。いくつかの実施形態では、その幹細胞は、成体幹細胞（例えば、体性幹細胞または組織特異的幹細胞）である。いくつかの実施形態では、その幹細胞または前駆細胞は、分化できる（例えば、その幹細胞は、全能性、多能性または多分化能性である）。いくつかの実施形態では、その細胞は、胚組織または新生児組織から単離する。いくつかの実施形態では、その細胞は、線維芽細胞、単球前駆体、Ｂ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、肝芽細胞、筋芽細胞、前駆脂肪細胞、前駆細胞、肝細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、Ｋ５６２ヒト赤白血病細胞株、骨細胞、滑膜細胞、腱細胞、靭帯細胞、半月板細胞、脂肪細胞、樹状細胞またはナチュラルキラー細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、筋肉細胞、赤血球－巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、導管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、肝細胞、胆管細胞、または褐色脂肪細胞に操作する（例えば、変換するかまたは分化させる）。いくつかの実施形態では、その細胞は、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞もしくは心筋細胞）、赤血球－巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞（例えば、赤血球細胞、白血球細胞もしくは血小板）、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、導管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、肝細胞、胆管細胞、白色脂肪細胞または褐色脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ホルモン分泌細胞（例えば、インスリン、オキシトシン、エンドルフィン、バソプレッシン、セロトニン、ソマトスタチン、ガストリン、セクレチン、グルカゴン、甲状腺ホルモン、ボンベシン、コレシストキニン、テストステロン、エストロゲンもしくはプロゲステロン、レニン、グレリン、アミリン、または膵臓ポリペプチドを分泌する細胞）、表皮角化細胞、上皮細胞（例えば、外分泌上皮細胞、甲状腺上皮細胞、角化上皮細胞、胆嚢上皮細胞、または角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道もしくは膣の表面上皮細胞）、腎臓細胞、胚細胞、骨格関節滑膜細胞、骨膜細胞、骨細胞（例えば、破骨細胞または骨芽細胞）、軟骨膜細胞（例えば、軟骨芽細胞または軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ））、軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）細胞（例えば軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ））、線維芽細胞、内皮細胞、心膜細胞、髄膜細胞、ケラチノサイト前駆細胞、ケラチノサイト幹細胞、周皮細胞、グリア細胞、上衣細胞、羊膜または胎盤膜から単離した細胞、あるいは漿膜細胞（例えば、体腔の内側を覆う漿膜細胞）である。

【0698】

いくつかの実施形態では、その細胞は、体細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、皮膚またはその他の器官、例えば、心臓、脳もしくは脊髄、肝臓、肺、腎臓、膵臓、膀胱、骨髄、脾臓、腸または胃に由来する。その細胞は、ヒトまたはその他の哺乳動物に由来のもの（例えば、齧歯動物、ヒト以外の霊長類動物、ウシまたはブタの細胞）であることができる。

【0699】

いくつかの実施形態では、その細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、膵島β細胞、内皮細胞、上皮細胞、例えば、ＲＰＥ、甲状腺、皮膚または肝細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、操作ｉＰＳＣから分化させたｉＰＳＣ由来細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、本明細書に示されている説明に従って、初代細胞から改変した操作細胞である。例えば、いくつかの実施形態では、その初代細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えばＣＤ４７の発現の増加が見られる。いくつかの実施形態では、その初代細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えば、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８のいずれかの発現の増加が見られる。

【0700】

いくつかの実施形態では、その細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むｉＰＳＣ由来Ｔ細胞、例えば、その改変を含むように操作されているｉＰＳＣ由来Ｔ細胞である。例えば、いくつかの実施形態では、そのｉＰＳＣ由来Ｔ細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えばＣＤ４７の発現の増加が見られる。いくつかの実施形態では、そのｉＰＳＣ由来Ｔ細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えば、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８のいずれかの発現の増加が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含む初代Ｔ細胞、例えば、その改変を含むように操作されている初代Ｔ細胞である。例えば、いくつかの実施形態では、その初代Ｔ細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えばＣＤ４７の発現の増加が見られる。いくつかの実施形態では、その初代Ｔ細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えば、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８のいずれかの発現の増加が見られる。

【0701】

いくつかの実施形態では、そのＴ細胞は、本明細書に記載されているようないずれかを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）によって操作できる。いくつかの実施形態では、その操作Ｔ細胞（例えば低免疫原性Ｔ細胞）を用いて、同種異系細胞療法によって、本明細書、例えばセクションＩＶに記載されているようないずれかを含む様々な適応症を治療できる。いくつかの実施形態では、その操作Ｔ細胞（例えば低免疫原性Ｔ細胞）を用いて、がんを治療できる。

【0702】

いくつかの実施形態では、その細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むように操作されているｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むように操作されている初代ＮＫ細胞である。例えば、いくつかの実施形態では、そのｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えばＣＤ４７の発現の増加が見られる。いくつかの実施形態では、そのｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えば、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８のいずれかの発現の増加が見られる。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞は、本明細書に記載されているようないずれかを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）によって操作できる。いくつかの実施形態では、その操作ＮＫ細胞（例えば低免疫原性ＮＫ細胞）を用いて、同種異系細胞療法によって、本明細書、例えばセクションＩＶに記載されているようないずれかを含む様々な適応症を治療できる。いくつかの実施形態では、その操作ＮＫ細胞（例えば低免疫原性ＮＫ細胞）を用いて、がんを治療できる。

【0703】

いくつかの実施形態では、その細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むように操作されているｉＰＳＣ由来膵島β細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むように操作されている初代膵島β細胞である。例えば、いくつかの実施形態では、そのｉＰＳＣ由来膵島β細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えばＣＤ４７の発現の増加が見られる。いくつかの実施形態では、そのｉＰＳＣ由来膵島β細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えば、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８のいずれかの発現の増加が見られる。いくつかの実施形態では、その操作膵島β細胞（例えば低免疫原性膵島β細胞）を用いて、同種異系細胞療法によって、本明細書、例えばセクションＩＶに記載されているようないずれかを含む様々な適応症を治療できる。いくつかの実施形態では、その操作膵島β細胞（例えば低免疫原性膵島β細胞）を用いて、糖尿病、例えばＩ型糖尿病を治療できる。

【0704】

いくつかの実施形態では、その細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むように操作されているｉＰＳＣ由来内皮細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むように操作されている初代内皮細胞である。例えば、いくつかの実施形態では、そのｉＰＳＣ由来内皮細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えばＣＤ４７の発現の増加が見られる。いくつかの実施形態では、そのｉＰＳＣ由来内皮細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えば、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８のいずれかの発現の増加が見られる。いくつかの実施形態では、その操作内皮細胞（例えば低免疫原性内皮細胞）を用いて、同種異系細胞療法によって、本明細書、例えばセクションＩＶに記載されているようないずれかを含む様々な適応症を治療できる。いくつかの実施形態では、その操作内皮細胞（例えば低免疫原性内皮細胞）を用いて、血管新生疾患または眼疾患を治療できる。

【0705】

いくつかの実施形態では、その細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むように操作されているｉＰＳＣ由来上皮細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むように操作されている初代上皮細胞である。いくつかの実施形態では、その上皮細胞は、ＲＰＥである。いくつかの実施形態では、その上皮細胞は、甲状腺細胞である。いくつかの実施形態では、その上皮細胞は、皮膚細胞である。例えば、いくつかの実施形態では、そのｉＰＳＣ由来上皮細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えばＣＤ４７の発現の増加が見られる。いくつかの実施形態では、そのｉＰＳＣ由来上皮細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えば、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８のいずれかの発現の増加が見られる。いくつかの実施形態では、その操作上皮細胞（例えば低免疫原性上皮細胞）を用いて、同種異系細胞療法によって、本明細書、例えばセクションＩＶに記載されているようないずれかを含む様々な適応症を治療できる。いくつかの実施形態では、その操作上皮細胞（例えば低免疫原性上皮細胞）を用いて、甲状腺疾患または皮膚疾患を治療できる。

【0706】

いくつかの実施形態では、その細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むように操作されているｉＰＳＣ由来肝細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むように操作されている初代肝細胞である。例えば、いくつかの実施形態では、そのｉＰＳＣ由来肝細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えばＣＤ４７の発現の増加が見られる。いくつかの実施形態では、そのｉＰＳＣ由来肝細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えば、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８のいずれかの発現の増加が見られる。いくつかの実施形態では、その操作上皮細胞（例えば低免疫原性上皮細胞）を用いて、同種異系細胞療法によって、本明細書、例えばセクションＩＶに記載されているようないずれかを含む様々な適応症を治療できる。いくつかの実施形態では、その操作肝細胞（例えば低免疫原性肝細胞）を用いて、肝疾患を治療できる。

【0707】

いくつかの実施形態では、本明細書に示されているようにして操作または改変する細胞は、健常な対象、例えば、治療すべき特定の疾患もしくは病態であると分かっていないか、またはその疾患もしくは病態である疑いのない対象に由来する細胞である。例えば、糖尿病を治療するためなどで、膵島β細胞をドナー対象から単離または取得する場合には、そのドナー対象が、糖尿病または別の疾患もしくは病態であることが分かっていないか、糖尿病または別の疾患もしくは病態に罹患している疑いのない場合には、その対象は、健常な対象である。

【0708】

いくつかの実施形態では、その操作細胞、またはその操作細胞に由来する子孫細胞もしくは分化細胞は、レシピエント患者に投与すると、ＮＫ細胞の媒介による細胞傷害を回避できる。いくつかの実施形態では、その操作細胞、またはその操作細胞に由来する子孫細胞もしくは分化細胞は、レシピエント患者に投与すると、成熟ＮＫ細胞による細胞溶解から保護される。いくつかの実施形態では、その操作細胞、またはその操作細胞に由来する子孫細胞もしくは分化細胞は、レシピエント患者に投与しても、その細胞に対する免疫応答を誘導しない。いくつかの実施形態では、その操作細胞、またはその操作細胞に由来する子孫細胞もしくは分化細胞は、レシピエント患者に投与しても、その細胞に対する全身性の炎症応答を誘導しない。いくつかの実施形態では、その操作細胞、またはその操作細胞に由来する子孫細胞もしくは分化細胞は、レシピエント患者に投与しても、その細胞に対する局所性の炎症応答を誘導しない。いくつかの実施形態では、その操作細胞、またはその操作細胞に由来する子孫細胞もしくは分化細胞は、レシピエント患者に投与しても、補体経路の活性化を誘導しない。いくつかの実施形態では、そのレシピエント患者には、細胞の表面に、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）依存性抗原に対する抗体が以前から存在している。

【0709】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、多能性幹細胞、例えば人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、操作多能性細胞であり、本発明の方法は、その操作細胞を所望の細胞種に分化させること（分化前に、所望の改変、例えば遺伝子改変を完了することなど）をさらに含む。いくつかの実施形態では、その所望の細胞種は、膵島β細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心臓細胞及び血液細胞から選択する。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ドナー対象から単離した初代細胞である。

【0710】

治療用途では、開示されている方法に従って調製した細胞は典型的には、等張賦形剤を含む医薬組成物の形態で供給でき、ヒトへの投与用に十分に滅菌される条件下で調製する。その細胞は、流通または臨床使用に適する器具または容器にパッケージできる。

【0711】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、膵島β細胞、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ細胞、網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、内皮細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、筋肉細胞、心臓細胞、血液細胞、膵臓の膵島細胞、平滑筋細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心筋細胞、視細胞、幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉幹細胞、胚性幹細胞及び多能性幹細胞（ＰＳＣ）から選択する。いくつかの実施形態では、その細胞は、膵臓の膵島細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、肝細胞、グリア前駆細胞、ドーパミン作動性ニューロン、網膜色素上皮細胞及び甲状腺細胞からなる群から選択する。

【0712】

いくつかの実施形態では、その標的細胞（操作に使用する細胞など）は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ＨＳＣは、すべての種類の血液細胞を補充するとともに、自己複製する幹細胞である。造血幹細胞は、具体的には、造血系が枯渇されているレシピエントマウスの循環血液に注射したときに、１６週間、骨髄細胞、Ｔ細胞及びＢ細胞のレベルを確実に検出可能なレベル（典型的には、末梢血細胞の１％超）に維持する細胞として定義し得る（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ（２０１０）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ６：２０３－２０７）。

【0713】

いくつかの実施形態では、その標的細胞（操作に使用する細胞など）は、造血系疾患または造血系障害である対象に由来する。いくつかの実施形態では、その造血障害は、血液疾患、特に、造血細胞が関与する疾患によるものであってよい。いくつかの実施形態では、その造血障害は、単一遺伝子の変異を原因とするような単一遺伝子性造血疾患である。いくつかの実施形態では、その造血障害は、骨髄異形成、再生不良性貧血、ファンコニ貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、鎌状赤血球症、ダイアモンドブラックファン貧血、シュワッハマンダイアモンド障害、コストマン症候群、慢性肉芽腫性疾患、副腎白質ジストロフィー、白血球接着不全症、血友病、サラセミア、βサラセミア、白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（骨髄）白血病（ＡＭＬ）、成人リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、慢性肉芽腫性疾患、チェディアック・東症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）またはＡＩＤＳである。

【0714】

いくつかの実施形態では、その標的細胞（操作に使用する細胞など）は、自己免疫疾患である対象に由来する。いくつかの実施形態では、その自己免疫疾患は、急性播種性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗合成酵素症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ぶどう膜炎、バロー病、バロー同心円硬化症、ベーチェット症候群、ベルジェ病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、がん、キャッスルマン病、セリアック病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体成分２欠損症、脳動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、デゴス病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、びまん皮膚硬化型全身性強皮症、ドレスラー症候群、円板状ループスエリテマトーデス、湿疹、付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維性肺胞炎、胃炎、胃腸類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、炎症性脱髄性多発神経障害、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート・イートン筋無力症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ルー・ゲーリック病、ルポイド肝炎、ループスエリテマトーデス、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、ミラー・フィッシャー症候群、混合性結合組織病、限局性強皮症、ムッカ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、視神経脊髄炎、ニューロミオトニア、眼瘢痕性類天疱瘡、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、オード甲状腺炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、パーソネージ・ターナー症候群、周辺部ぶどう膜炎、天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲性脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、再発性多発性軟骨炎、ライター症候群、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スチル病、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、スウィート症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患、未分化脊椎関節症、血管炎、白斑またはウェゲナー肉芽腫症である。

【0715】

いくつかの実施形態では、その標的細胞（操作に使用する細胞など）は、がんである対象に由来する。いくつかの実施形態では、そのがんは、白血病である。いくつかの実施形態では、その白血病は、Ｂ－ＣＬＬ、ＣＭＬ、またはＴ細胞ベースの白血病、例えばＡＬＴである。いくつかの実施形態では、そのがんは、メラノーマである。

【0716】

１．初代細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に示されているように操作されている細胞は、１人以上の個々の対象またはドナーから取得または単離した初代細胞に由来する細胞を含む。いくつかの実施形態では、その細胞は、１人以上（例えば、２人以上、３人以上、４人以上、５人以上、１０人以上、２０人以上、５０人以上または１００人以上）の異なるドナー対象から取得した単離初代細胞のプールに由来する。いくつかの実施形態では、複数の異なるドナー対象（例えば、２人以上、３人以上、４人以上、５人以上、１０人以上、２０人以上、５０人以上または１００人以上）から単離または取得した初代細胞を一緒にバッチでプールし、提供する方法に従って操作する。

【0717】

いくつかの実施形態では、その初代細胞は、レシピエント対象（例えば、その細胞を投与される患者）とは異なる１人以上のドナー対象に由来する初代細胞のプールに由来する。その初代細胞は、１人、２人、３人、４人、５人、６人、７人、８人、９人、１０人、２０人、５０人または１００人以上のドナー対象から取得して、一緒にプールすることができる。その初代細胞は、１人以上、２人以上、３人以上、４人以上、５人以上、６人以上、７人以上、８人以上、９人以上、１０人以上、２０人以上、５０人以上または１００人以上のドナー対象から取得して、一緒にプールすることができる。いくつかの実施形態では、その初代細胞は、１人または複数の個体から採取し、いくつかの事例では、その初代細胞または初代Ｔ細胞プールをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する。いくつかの実施形態では、その初代細胞または初代Ｔ細胞プールは、本発明で提供する方法に従って操作または改変する。

【0718】

いくつかの実施形態では、その方法は、所望の種類の初代細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞、膵島β細胞、肝細胞、または本明細書に記載されているような他の初代細胞）を個々のドナー対象から取得または単離することと、その細胞をプールして、その初代細胞種のバッチを得ることと、その細胞を、本発明で提供する方法によって操作することを含む。いくつかの実施形態では、その方法は、所望の種類の初代細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、内皮細胞、膵島β細胞、肝細胞、または本明細書に記載されているような他の初代細胞）を取得または単離することと、それぞれの個々のドナーの細胞を、本発明で提供する方法によって操作することと、少なくとも２つの個別試料の操作（改変）細胞をプールして、その初代細胞種の操作細胞のバッチを得ることを含む。

【0719】

いくつかの実施形態では、その初代細胞は、１人の個体から単離もしくは取得するか、または２人以上の個々のドナーから単離もしくは取得した初代細胞のプールに由来する。その初代細胞は、セクションＩＩ．Ｃ．３に記載のいずれかを含め、本明細書に記載のいずれかの種類の初代細胞であってよい。いくつかの実施形態では、その初代細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、膵島β細胞、内皮細胞、上皮細胞、例えばＲＰＥ、甲状腺、皮膚、または肝細胞から選択する。いくつかの実施形態では、１人の個別のドナーまたは個々のドナーのプールに由来する初代細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むように操作する。

【0720】

例えば、いくつかの実施形態では、その初代細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えばＣＤ４７の発現の増加が見られる。いくつかの実施形態では、その初代細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子、例えば、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８のいずれかの発現の増加が見られる。

【0721】

いくつかの実施形態では、その操作細胞は、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、平滑筋細胞もしくは心筋細胞）、赤血球－巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島細胞塊、膵島細胞、β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞（例えば、赤血球細胞、白血球細胞もしくは血小板）、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、導管細胞、腺房細胞、α細胞、膵島β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、肝細胞、胆管細胞、または白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、ホルモン分泌細胞（例えば、インスリン、オキシトシン、エンドルフィン、バソプレッシン、セロトニン、ソマトスタチン、ガストリン、セクレチン、グルカゴン、甲状腺ホルモン、ボンベシン、コレシストキニン、テストステロン、エストロゲンもしくはプロゲステロン、レニン、グレリン、アミリン、または膵臓ポリペプチドを分泌する細胞）、表皮角化細胞、上皮細胞（例えば、外分泌上皮細胞、甲状腺上皮細胞、角化上皮細胞、胆嚢上皮細胞、または角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道もしくは膣の表面上皮細胞）、腎臓細胞、胚細胞、骨格関節滑膜細胞、骨膜細胞、骨細胞（例えば、破骨細胞または骨芽細胞）、軟骨膜細胞（例えば、軟骨芽細胞または軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ））、軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）細胞（例えば、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ））、線維芽細胞、内皮細胞、心膜細胞、髄膜細胞、ケラチノサイト前駆細胞、ケラチノサイト幹細胞、周皮細胞、グリア細胞、上衣細胞、羊膜もしくは胎盤膜から単離した細胞、あるいは漿膜細胞（例えば、体腔の内側を覆う漿膜細胞）である。

【0722】

２．人工多能性幹細胞の生成
いくつかの実施形態では、本明細書で示されているにように操作されている細胞は、人工多能性幹細胞であるか、または人工多能性幹細胞に由来するかもしくは人工多能性幹細胞から分化されている操作細胞である。マウス多能性幹細胞及びヒト多能性幹細胞（概して、ｉＰＳＣ、マウス細胞ではｍｉＰＳＣ、またはヒト細胞ではｈｉＰＣＳという）の生成は概して、当該技術分野で知られている。当業者には理解されるように、多種多様なｉＰＣＳ生成法がある。起源からの誘導は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ及びＫｌｆ４という４つの転写因子のウイルス導入を用いて、マウス胎児線維芽細胞または成体線維芽細胞から行われた。Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｙａｍａｎａｋａ Ｃｅｌｌ １２６：６６３－６７６（２００６）を参照されたい。その開示内容は、参照により、その全体が、具体的には、その文献に概説されている技法について、本明細書に援用される。それ以降、多くの方法が開発された。論評についてのＳｅｋｉ ｅｔ ａｌ，Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ７（１）：１１６－１２５（２０１５）及びＬａｋｓｈｍｉｐａｔｈｙ ａｎｄ Ｖｅｒｍｕｒｉ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ２０１３を参照されたい。その両方の開示内容とも、参照により、その全体が、具体的には、ｈｉＰＳＣの生成法（例えば、後者の参照文献のＣｈａｐｔｅｒ３を参照されたい）について、本明細書に援用される。

【0723】

概して、ｉＰＳＣは、１つ以上のリプログラミング因子を宿主細胞内で一過性発現させることによって生成し、通常、エピソーマルなベクターを用いて導入する。これらの条件下では、ｉＰＳＣになるように誘導するのは、少量の細胞である（概して、この工程の効率は低い。選択マーカーを使用しないからである）。その細胞は、「リプログラムされて」多能性になると、エピソーマルなベクター（複数可）を消失し、内在性遺伝子を用いて、これらの因子を産生する。

【0724】

また、当業者には明らかなように、使用できるか、または使用されているリプログラミング因子の数は、変動し得る。一般に、使用するリプログラミング因子が少ないほど、「多能性」と同様に、その細胞を多能性状態に変化させる効率は低下し、例えば、リプログラミング因子が少ないほど、完全には多能性ではないうえに、少ない細胞種にしか分化できない場合がある細胞が生じることがある。

【0725】

いくつかの実施形態では、１つのリプログラミング因子、すなわちＯＣＴ４を使用する。別の実施形態では、２つのリプログラミング因子、すなわちＯＣＴ４及びＫＬＦ４を使用する。別の実施形態では、３つのリプログラミング因子、すなわちＯＣＴ４、ＫＬＦ４及びＳＯＸ２を使用する。別の実施形態では、４つのリプログラミング因子、すなわちＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２及びｃ－Ｍｙｃを使用する。別の実施形態では、ＳＯＫＭＮＬＴ、すなわち、ＳＯＸ２、ＯＣＴ４（ＰＯＵ５Ｆ１）、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、ＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８及びＳＶ４０Ｌ Ｔ抗原から選択した５つ、６つまたは７つのリプログラミング因子を使用できる。概して、これらのリプログラミング因子遺伝子は、当該技術分野で知られているとともに、市販されているようなエピソーマルなベクター上に供給する。

【0726】

いくつかの実施形態では、その１つ以上のリプログラミング因子をトランスフェクションするのに用いる宿主細胞は、非多能性幹細胞である。概して、当該技術分野で知られているように、ｉＰＳＣは、本明細書に記載されているようなリプログラミング因子を一過性に発現させることによって、非多能性細胞、例えば、以下に限定されないが、血液細胞及び線維芽細胞から作製する。いくつかの実施形態では、その非多能性細胞、例えば線維芽細胞は、その細胞のリプログラミング前に、１人以上の個別の対象またはドナーから取得または単離する。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、１人以上（例えば、２人以上、３人以上、４人以上、５人以上、１０人以上、２０人以上、５０人以上または１００人以上）の異なるドナー対象から取得した単離非多能性幹細胞、例えば単離線維芽細胞のプールから作製する。いくつかの実施形態では、その非多能性細胞、例えば線維芽細胞は、複数の異なるドナー対象（例えば、２人以上、３人以上、４人以上、５人以上、１０人以上、２０人以上、５０人以上または１００人以上）から単離または取得し、一緒にバッチでプールし、ｉＰＳＣとしてリプログラムし、提供する方法に従って操作する。

【0727】

いくつかの実施形態では、そのｉＰＳＣは、レシピエント対象（例えば、その細胞を投与される患者）とは異なる１人以上のドナー対象から得た非多能性細胞（例えば線維芽細胞）のプールに由来する細胞に、１つ以上のリプログラミング因子を一過性にトランスフェクションすることによるなどして得る。ｉＰＳＣに誘導する非多能性細胞（例えば線維芽細胞）は、１人、２人、３人、４人、５人、６人、７人、８人、９人、１０人、２０人、５０人または１００人以上のドナー対象から取得し、一緒にプールすることができる。その非多能性細胞（例えば線維芽細胞）は、１人以上、２人以上、３人以上、４人以上、５人以上、６人以上、７人以上、８人以上、９人以上、１０人以上、２０人以上、５０人以上、または１００人以上のドナー対象から取得し、一緒にプールすることができる。いくつかの実施形態では、その非多能性細胞（例えば線維芽細胞）は、１人または複数の個体から採取し、いくつかの事例では、その非多能性細胞（例えば線維芽細胞）または非多能性細胞（例えば線維芽細胞）のプールをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、１つ以上のリプログラミング因子をトランスフェクションして、ｉＰＳＣの生成を誘導する。いくつかの実施形態では、その非多能性細胞（例えば線維芽細胞）または非多能性細胞（例えば線維芽細胞）のプールは、本発明で提供する方法に従って操作または改変する。いくつかの実施形態では、続いて、その操作ｉＰＳＣまたは操作ｉＰＳＣのプールに対して、生物及び組織の細胞のいずれかに分化させるための分化プロセスを行う。

【0728】

操作ｉＰＳＣ細胞が生成されたら、ＷＯ２０１６１８３０４１及びＷＯ２０１８１３２７８３に記載されているように、それらの細胞の低免疫原性及び／または多能性保持についてアッセイしてよい。いくつかの実施形態では、低免疫原性は、ＷＯ２０１８１３２７８３の図１３及び図１５に例示されているような多くの技法を用いてアッセイする。これらの技法としては、同種異系宿主に移植し、宿主免疫系から逃避する低免疫原性多能性細胞の成長（例えばテラトーマ）についてモニタリングすることが挙げられる。いくつかの事例では、低免疫原性多能性細胞誘導体をトランスダクションして、ルシフェラーゼを発現させてから、生物発光イメージングを用いて追跡できる。同様に、このような細胞に対する宿主動物のＴ細胞応答及び／またはＢ細胞応答を試験して、その細胞が、その宿主動物において免疫反応を引き起こさないことを確認する。Ｔ細胞応答は、Ｅｌｉｓｐｏｔ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲまたはマスサイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）によって評価できる。Ｂ細胞応答または抗体応答は、ＦＡＣＳまたはＬｕｍｉｎｅｘを用いて評価する。これに加えて、またはこの代わりに、その細胞は、ＷＯ２０１８１３２７８３の図１４及び１５に概ね示されているように、自然免疫応答、例えば、ＮＫ細胞による殺傷をそれらが回避する能力についてアッセイしてもよい。

【0729】

いくつかの実施形態では、その細胞の免疫原性は、当業者に認識されている、Ｔ細胞のイムノアッセイ、例えば、Ｔ細胞増殖のアッセイ、Ｔ細胞活性化のアッセイ、及びＴ細胞による殺傷のアッセイを用いて評価する。いくつかの事例では、Ｔ細胞増殖のアッセイは、その細胞をインターフェロン－γで前処理し、その細胞を、標識したＴ細胞と共培養し、予め選択した期間の後に、そのＴ細胞集団（または増殖しているＴ細胞集団）の存在をアッセイすることを含む。いくつかの事例では、そのＴ細胞活性化のアッセイは、Ｔ細胞を、本明細書に概説されている細胞と共培養し、そのＴ細胞内のＴ細胞活性化マーカーの発現レベルを求めることを含む。

【0730】

ｉｎ ｖｉｖｏアッセイを行って、本明細書に概説されている細胞の免疫原性を評価することができる。いくつかの実施形態では、操作ｉＰＳＣまたは改変ｉＰＳＣの生存及び免疫原性は、同種異系のヒト化免疫不全マウスモデルを用いて求める。いくつかの事例では、その操作ｉＰＳＣまたは改変ｉＰＳＣは、同種異系のヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスに移植し、細胞の拒絶、細胞の生存及びテラトーマの形成についてアッセイする。いくつかの事例では、移植した操作ｉＰＳＣまたはその分化細胞では、そのマウスモデルにおいて長期生存が見られる。

【0731】

その細胞の低免疫原性を含む免疫原性を求める追加の技法は、例えば、Ｄｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１９，３７，２５２－２５８及びＨａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１９，１１６（２１），１０４４１－１０４４６に記載されており、その開示内容は、図、図の凡例、及びこのような方法の説明を含め、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0732】

同様に、多能性の保持は、多くの方法で試験する。一実施形態では、多能性は、本明細書に概ね記載されているとともに、ＷＯ２０１８１３２７８３の図２９に示されているように、多能性に特異的なある特定の因子の発現によってアッセイする。これに加えて、またはこの代わりに、その多能性細胞を、多能性の指標としての１つ以上の細胞種に分化させる。

【0733】

その操作多能性幹細胞（操作ｉＰＳＣ）が生成されたら、それらの細胞は、ｉＰＳＣを維持することで知られているようにして、未分化状態に維持できる。例えば、その細胞は、分化を防ぐとともに、多能性を維持する培養培地を用いて、マトリゲル上で培養できる。加えて、その細胞は、多能性を維持する条件下の培養培地中に置くことができる。

【0734】

本明細書に記載の多能性幹細胞のいずれも、生物及び組織の細胞のいずれかに分化させることができる。ある態様では、本発明で提供するのは、レシピエント対象に後で移植するために、ｉＰＳＣから様々な細胞種に分化されている操作細胞である。分化は、概して、細胞特異的なマーカーの存在を評価することによって、当該技術分野で知られているようにアッセイできる。当業者には理解されるように、分化させた操作（例えば低免疫原性）多能性細胞誘導体は、当該技術分野で知られている技法であって、細胞種及びこれらの細胞の最終的用途の両方によって決まる技法を用いて移植できる。分化細胞の例示的な種類、及びその細胞種を作製するための例示的な方法は、下に記載されている。いくつかの実施形態では、そのｉＰＳＣは、セクションＩＩ．Ｃ．３に記載のいずれかを含め、本明細書に記載の細胞の種類のいずれかに分化させてよい。いくつかの実施形態では、そのｉＰＳＣは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、膵島β細胞、内皮細胞、上皮細胞、例えば、ＲＰＥ、甲状腺、皮膚または肝細胞から選択した細胞種に分化させる。いくつかの実施形態では、その宿主細胞、例えば、個別のドナーから得た非多能性細胞（例えば線維芽細胞）または個別のドナーのプールを単離または取得し、ｉＰＳＣに生成し、続いて、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むように、そのｉＰＳＣを操作してから、所望の細胞種に分化させる。

【0735】

３．細胞種
Ａ．Ｔ細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に示されているようにして操作または改変する細胞は、Ｔリンパ球（Ｔ細胞ともいう）、例えば初代Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、そのＴリンパ球は、１人以上の個別のドナー対象、例えば、１人以上の個別の健常ドナー（疾患もしくは感染があることが分かっていないか、またはその疑いがない対象、例えば、疾患または感染の臨床徴候が見られない対象など）から単離または取得する。いくつかの事例では、そのＴ細胞は、１人以上の個体から得たＴ細胞の集団またはサブ集団である。当業者には理解されるように、Ｔリンパ球を個体から単離または取得する方法は、既知の技法を用いて行うことができる。本発明で提供するのは、後で対象（例えばレシピエント）に移植するか、または生着させるために、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含む操作Ｔリンパ球である。

【0736】

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、対象または個体から取得する（例えば、採取するか、摘出するか、除去するか、または取り出す）。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞プールから作製して、そのＴ細胞が、１人以上の対象（例えば、１人以上の健常なヒトを含む１人以上のヒト）に由来するようにする。いくつかの実施形態では、そのＴ細胞プールは、１～１００人、１～５０人、１～２０人、１～１０人、１人以上、２人以上、３人以上、４人以上、５人以上、１０人以上、２０人以上、３０人以上、４０人以上、５０人以上または１００人以上の対象に由来する。いくつかの実施形態では、そのドナー対象は、患者（例えば、その治療用細胞を投与されるレシピエント）とは異なる者である。いくつかの実施形態では、そのＴ細胞プールは、その患者由来の細胞を含まない。いくつかの実施形態では、そのＴ細胞プールの取得元であるドナー対象の１人以上は、その患者とは異なる者である。

【0737】

いくつかの実施形態では、本発明で提供するような細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むとともに、Ｔリンパ球に分化している操作多能性細胞から分化させたＴリンパ球である。当業者には理解されるように、その分化方法は、既知の技法を用いて、所望の細胞種によって決まる。いくつかの実施形態では、Ｔリンパ球に分化させる細胞は、後で対象（例えばレシピエント）に移植するか、または生着させるのに使用してよい。

【0738】

Ｔ細胞を多能性幹細胞（例えばｉＰＳＣ）から生成する方法は、例えば、Ｉｒｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １２，４３０（２０２１）、Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．１６（４）：３５７－３６６（２０１５）、Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１：９２８－９３３（２０１３）に記載されている。

【0739】

初代Ｔ細胞の非限定的な例としては、ＣＤ３＋ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、非制御性Ｔ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ１７細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞（Ｔｆｈ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、エフェクターＴ（Ｔｅｆｆ）細胞、セントラルメモリーＴ（Ｔｃｍ）細胞、エフェクターメモリーＴ（Ｔｅｍ）細胞、ＣＤ４５ＲＡを発現するエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭＲＡ細胞）、組織常在性メモリー（Ｔｒｍ）細胞、バーチャルメモリーＴ細胞、自然免疫メモリーＴ細胞、メモリー幹細胞（Ｔｓｃ）、γδＴ細胞及びいずれかの他のサブタイプのＴ細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、その初代Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球及びこれらの組み合わせを含む群から選択されている。

【0740】

本開示の例示的なＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＲＡ Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、組織浸潤リンパ球及びこれらの組み合わせからなる群から選択されている。多くの実施形態では、そのＴ細胞は、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＤ４５ＲＡを発現する。いくつかの実施形態では、そのセントラルＴ細胞は、ＣＣＲ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＤ４５ＲＯを発現する。別の実施形態では、そのエフェクターメモリーＴ細胞は、ＰＤ－１、ＣＤ２７、ＣＤ２８及びＣＤ４５ＲＯを発現する。別の実施形態では、そのエフェクターメモリーＲＡ Ｔ細胞は、ＰＤ－１、ＣＤ５７及びＣＤ４５ＲＡを発現する。

【0741】

いくつかの実施形態では、そのＴ細胞、例えば、単離初代Ｔ細胞または分化Ｔ細胞には、本明細書に記載されているような操作の前に、１つ以上の増加行程または活性化工程を行ってもよい。いくつかの実施形態では、操作するＴ細胞集団は、抗ＣＤ３抗体試薬及び抗ＣＤ２８抗体試薬とのインキュベーションによって刺激または活性化する。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８は、これらの試薬の混合物をコートしたビーズの形態で適切に供給してよい。抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８のビーズは、１：１の比率で、操作するＴ細胞集団に適切に供給してよい。いくつかの実施形態では、インキュベーション中の培地は、１つ以上の組み換えサイトカイン、例えば、組み換えＩＬ－２または組み換えＩＬ－１５も含んでよい。

【0742】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作Ｔ細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代Ｔ細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させたＴ細胞は、キメラ抗原受容体（本明細書に記載のキメラ抗原受容体が挙げられるが、これに限定されない）を発現するように操作（例えば改変）したＴ細胞を含む。本明細書に記載のＣＡＲを含め、いずれかの適切なＣＡＲをそのＴ細胞に含めることができる。いくつかの実施形態では、その操作Ｔ細胞は、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、変異細胞及びこれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上に発現した該当の抗原またはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのキメラ抗原受容体を発現する。別の事例では、その操作Ｔ細胞は、その細胞が、隣接する細胞、組織または器官に近接しているときに、その隣接する細胞、組織または器官での該当の生体作用を調節する少なくとも１つのタンパク質をその細胞が発現するようになる改変を含む。初代Ｔ細胞を含むＴ細胞に対する有用な改変は、ＵＳ２０１６／０３４８０７３及びＷＯ２０２０／０１８６２０に詳細に記載されており、これらの開示内容は、その全体が本明細書に援用される。

【0743】

いくつかの実施形態では、そのＴ細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、ゲノム遺伝子座に挿入されている。本明細書に記載の、レンチウイルスベースのトランスダクション方法または遺伝子編集方法（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を含め、いずれかの適切な方法を用いて、そのＣＡＲをそのＴ細胞のゲノム遺伝子座に挿入できる。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、セーフハーバー座位に挿入されており、その座位は、以下に限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１、Ｆ３（ＣＤ１４２としても知られる）、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＬＲＰ１（ＣＤ９１としても知られる）、ＨＭＧＢ１、ＡＢＯ、ＲＨＤ、ＦＵＴ１またはＫＤＭ５Ｄの遺伝子座などである。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＰＤ１またはＣＴＬＡ４の遺伝子に挿入されている。

【0744】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴ細胞、例えば操作Ｔ細胞または改変Ｔ細胞は、内在性のＴ細胞受容体の発現の低下を含む。いくつかの実施形態では、そのＴＲＡＣ座位またはＴＲＢＣ座位が、本明細書に記載の遺伝子編集方法（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）によるなどして、その細胞内で破壊または消失されている。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子、例えば、記載されているような、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたはその他のポリヌクレオチドが、破壊されたＴＲＡＣ座位またはＴＲＢＣ座位に挿入されている。

【0745】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＴ細胞、例えば、操作Ｔ細胞または改変Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ４）の発現の低下を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＴＬＡ－４座位は、本明細書に記載の遺伝子編集方法（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）によるなどして、その細胞内で破壊または消失されている。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子、例えば、記載されているような、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたはその他のポリヌクレオチドは、破壊されたＣＴＬＡ－４座位に挿入されている。

【0746】

別の実施形態では、本明細書に記載のＴ細胞、例えば、操作Ｔ細胞または改変Ｔ細胞は、プログラム細胞死（ＰＤ１）の発現の低下を含む。いくつかの実施形態では、そのＰＤ１座位は、本明細書に記載の遺伝子編集方法（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）によるなどして、その細胞内で破壊または消失されている。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子、例えば、記載されているような、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたはその他のポリヌクレオチドは、破壊されたＰＤ１座位に挿入されている。ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＴ細胞、例えば、操作Ｔ細胞または改変Ｔ細胞は、ＣＴＬＡ４及びＰＤ１の発現の低下を含む。

【0747】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載のＴ細胞、例えば、操作Ｔ細胞または改変Ｔ細胞は、ＰＤ－Ｌ１の発現の増強を含む。いくつかの実施形態では、そのＰＤ－Ｌ１座位は、本明細書に記載の遺伝子編集方法（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）によるなどして、その細胞内で破壊または消失されている。いくつかの実施形態では、外因性ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子、例えば、記載されているような、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドまたはその他のポリヌクレオチドは、破壊されたＰＤ－Ｌ１座位に挿入されている。

【0748】

いくつかの実施形態では、本発明の技術は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現するとともに、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原）の発現の低下または発現の欠失が見られ、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる操作Ｔ細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代Ｔ細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させたＴ細胞を操作したものに対するものである。ある特定の実施形態では、その操作Ｔ細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その操作Ｔ細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その操作Ｔ細胞はまた、ＣＡＲを発現するようにも操作されている。いくつかの実施形態では、その操作Ｔ細胞は、ＴＲＡＣ遺伝子またはＴＲＢＣ遺伝子内のゲノム改変（例えば遺伝子破壊）によるなどして、ＴＣＲ複合体分子の発現の低下または発現の欠失が見られる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）及びＣＡＲを過剰発現し、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣの遺伝子という遺伝子のうちの１つ以上を破壊するゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。

【0749】

いくつかの実施形態では、提供する操作Ｔ細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作Ｔ細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代Ｔ細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させたＴ細胞を操作したものは、患者（例えば、投与されたレシピエント）において免疫応答を活性化しない。提供するのは、本明細書に記載の操作Ｔ細胞の集団を、その治療が必要な対象（例えばレシピエント）または患者に投与することによって、疾患を治療する方法である。

【0750】

本発明で提供するＴ細胞は、適合するがんの治療に有用であり、そのがんとしては、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、グリオブラストーマ、神経芽腫、肺扁平上皮細胞癌、肝細胞癌及び膀胱癌が挙げられるが、これらに限定されない。

【0751】

Ｂ．ナチュラルキラー細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に示されているようにして操作または改変する細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、例えば初代ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、その初代ＮＫ細胞は、１人以上の個別のドナー対象、例えば１人以上の個別の健常ドナー（例えば、疾患もしくは感染があることが分かっていないか、またはその疑いがない対象、例えば、疾患または感染の臨床徴候が見られない対象など）から単離または取得する。いくつかの事例では、そのＮＫ細胞は、１人以上の個体に由来する初代ＮＫ細胞の集団またはサブ集団である。当業者には理解されるように、ＮＫ細胞を個体から単離または取得する方法は、既知の技法を用いて行うことができる。本発明で提供するのは、対象（例えばレシピエント）に後で移植するか、または生着させるために、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含む操作初代ＮＫ細胞である。例えば、その操作Ｔ細胞は、その操作ＮＫ細胞を対象（例えば、患者などのレシピエント）に注入することによって、その対象に投与する。

【0752】

いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、対象または個体から取得する（例えば、採取するか、摘出するか、除去するか、または取り出す）。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞プールから作製して、そのＮＫ細胞が、１人以上の対象（例えば、１人以上の健常なヒトを含む１人以上のヒト）に由来するようにする。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞プールは、１～１００人、１～５０人、１～２０人、１～１０人、１人以上、２人以上、３人以上、４人以上、５人以上、１０人以上、２０人以上、３０人以上、４０人以上、５０人以上または１００人以上の対象に由来する。いくつかの実施形態では、そのドナー対象は、患者（例えば、その操作ＮＫ細胞を投与されるレシピエント）とは異なる者である。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞プールは、患者由来の細胞を含まない。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞プールの取得元であるドナー対象の１人以上は、その患者とは異なる者である。

【0753】

いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞は、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代ＮＫ細胞を含め、ＣＤ５６を発現し（例えば、ＣＤ５６^ｄｉｍまたはＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}）、ＣＤ３を欠失する（例えばＣＤ３^ｎｅｇ）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているようなＮＫ細胞は、低親和性Ｆｃγ受容体であるＣＤ１６を発現してもよく、この受容体は、ＡＤＣＣを媒介する。いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞は、１つ以上のナチュラルキラー細胞受容体ＮＫＧ２Ａ及びＮＫＧ２Ｄ、または１つ以上の天然の細胞傷害性受容体ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０も発現する。例えば、初代ＮＫ細胞の場合、その初代細胞は、具体的な事例では、ＮＫ細胞の出発原料、例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を含む試料から、ＣＤ３、ＣＤ１４及び／またはＣＤ１９が陽性である細胞を枯渇させることによって単離してよい。例えば、その細胞に対しては、それぞれＣＤ３、ＣＤ１４及び／またはＣＤ１９に対する抗体を結合させた免疫磁気ビーズを用いて枯渇を行い、それによって、濃縮ＮＫ細胞集団を作製する。別の事例では、初代ＮＫ細胞は、混合集団である出発原料（例えばＰＢＭＣ）から、ＮＫ細胞上の１つ以上のマーカー、例えばＣＤ５６、ＣＤ１６、ＮＫｐ４６及び／またはＮＫＧ２Ｄの存在について細胞を選択することによって単離してもよい。

【0754】

いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞、例えば単離初代ＮＫ細胞には、本明細書に記載されているような操作の前に、１つ以上の増加行程または活性化工程を行ってもよい。いくつかの実施形態では、増加は、ＮＫ細胞をフィーダー細胞、例えば、放射線照射されていてもされていなくてもよい抗原提示細胞とともに培養することによって行ってよい。増加工程におけるＮＫ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との比率は、ある特定の数値、例えば、１：１、１：１．５、１：２または１：３などの比率であってよい。ある特定の態様では、そのＡＰＣは、膜結合型ＩＬ－２１（ｍｂｌＬ－２１）を発現するように操作する。特定の態様では、そのＡＰＣは、この代わりに、またはこれに加えて、ＩＬ－２１、ＩＬ－１５及び／またはＩＬ－２を発現するように操作する。特定の実施形態では、その増加工程（複数可）を行う培地は、増加を促すための１つ以上の作用物質、例えば１つ以上の組み換えサイトカインを含む。具体的な実施形態では、その培地は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８及び／またはＩＬ－２１からの１つ以上の組み換えサイトカインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているような改変を導入することによって、そのＮＫ細胞を操作する行程は、その増加の開始から２～１２日後、例えば、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目もしくは１２日目、または約２日目、約３日目、約４日目、約５日目、約６日目、約７日目、約８日目、約９日目、約１０日目、約１１日目もしくは約１２日目に行う。

【0755】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作ＮＫ細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代ＮＫ細胞は、キメラ抗原受容体（本明細書に記載のキメラ抗原受容体が挙げられるが、これに限定されない）を発現するように操作（例えば改変）したＮＫ細胞を含む。本明細書に記載のＣＡＲを含め、いずれかの適切なＣＡＲをそのＮＫ細胞に含めることができる。いくつかの実施形態では、その操作ＮＫ細胞は、損傷細胞、異形成細胞、感染細胞、免疫原性細胞、炎症細胞、悪性細胞、化生細胞、変異細胞及びこれらの組み合わせの少なくとも１つの表面上に発現した該当の抗原またはエピトープに特異的に結合する少なくとも１つのキメラ抗原受容体を発現する。別の事例では、その操作ＮＫ細胞は、その細胞が、隣接する細胞、組織または器官に近接しているときに、その隣接する細胞、組織または器官での該当の生体作用を調節する少なくとも１つのタンパク質をその細胞が発現するようになる改変を含む。

【0756】

いくつかの実施形態では、そのＮＫ細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含み、そのポリヌクレオチドは、ゲノム遺伝子座に挿入されている。本明細書に記載の、レンチウイルスベースのトランスダクション方法または遺伝子編集方法（例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を含め、いずれかの適切な方法を用いて、そのＣＡＲをそのＮＫ細胞のゲノム遺伝子座に挿入できる。いくつかの実施形態では、そのポリヌクレオチドは、セーフハーバー座位に挿入されており、その座位は、以下に限定されないが、ＡＡＶＳ１、ＣＣＲ５、ＣＬＹＢＬ、ＲＯＳＡ２６、ＳＨＳ２３１、Ｆ３（ＣＤ１４２としても知られる）、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＬＲＰ１（ＣＤ９１としても知られる）、ＨＭＧＢ１、ＡＢＯ、ＲＨＤ、ＦＵＴ１またはＫＤＭ５Ｄの遺伝子座などである。

【0757】

いくつかの実施形態では、本発明の技術は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現するとともに、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原）の発現の低下または発現の欠失が見られる操作ＮＫ細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代ＮＫ細胞を操作したものに対するものである。ある特定の実施形態では、その操作ＮＫ細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を有する。いくつかの実施形態では、その操作ＮＫ細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を有する。いくつかの実施形態では、その操作ＮＫ細胞はまた、ＣＡＲを発現するようにも操作されている。

【0758】

いくつかの実施形態では、提供する操作ＮＫ細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作ＮＫ細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代ＮＫ細胞を操作したものは、患者（例えば、投与されたレシピエント）において免疫応答を活性化しない。提供するのは、本明細書に記載の操作ＮＫ細胞の集団を、その治療が必要な対象（例えばレシピエント）または患者に投与することによって、疾患を治療する方法である。

【0759】

本発明で提供するＮＫ細胞は、適合するがんの治療に有用であり、そのがんとしては、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、グリオブラストーマ、神経芽腫、肺扁平上皮細胞癌、肝細胞癌及び膀胱癌が挙げられるが、これらに限定されない。

【0760】

Ｃ．膵島β細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に示されているようにして操作または改変する細胞は、初代膵島β細胞（膵臓の膵島細胞または膵臓のβ細胞ともいう）である。いくつかの実施形態では、その初代膵島β細胞は、１人以上の個別のドナー対象、例えば１人以上の個別の健常ドナー（例えば、疾患もしくは感染があることが分かっていないか、またはその疑いがない対象、例えば、疾患または感染の臨床徴候が見られない対象など）から単離または取得する。当業者には理解されるように、膵島β細胞を個体から単離または取得する方法は、既知の技法を用いて行うことができる。本発明で提供するのは、対象（例えばレシピエント）に後で移植するか、または生着させるために、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含む操作初代膵島β細胞である。

【0761】

いくつかの実施形態では、膵島β細胞は、対象または個体から取得する（例えば、採取するか、摘出するか、除去するか、または取り出す）。いくつかの実施形態では、初代膵島β細胞は、膵島β細胞プールから作製して、その膵島β細胞が、１人以上の対象（例えば、１人以上の健常なヒトを含む１人以上のヒト）に由来するようにする。いくつかの実施形態では、その初代膵島β細胞プールは、１～１００人、１～５０人、１～２０人、１～１０人、１人以上、２人以上、３人以上、４人以上、５人以上、１０人以上、２０人以上、３０人以上、４０人以上、５０人以上または１００人以上の対象に由来する。いくつかの実施形態では、そのドナー対象は、患者（例えば、その治療用細胞を投与されるレシピエント）とは異なる者である。いくつかの実施形態では、その膵島β細胞プールは、その患者由来の細胞を含まない。いくつかの実施形態では、その膵島β細胞プールの取得元であるドナー対象の１人以上は、その患者とは異なる者である。

【0762】

いくつかの実施形態では、本発明で提供するような細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むとともに、膵島β細胞に分化している操作ｉＰＳＣに由来する膵島β細胞である。当業者には理解されるように、その分化方法は、既知の技法を用いて、所望の細胞種によって決まる。いくつかの実施形態では、様々な膵島β細胞に分化させた細胞は、後で対象（例えばレシピエント）に移植または生着させるのに用いてよい。いくつかの実施形態では、膵臓の膵島細胞は、本明細書に記載の操作多能性細胞に由来する。多能性幹細胞を膵臓の膵島細胞に分化させる有用な方法は、例えば、ＵＳ９，６８３，２１５、ＵＳ９，１５７，０６２及びＵＳ８，９２７，２８０に記載されている。

【0763】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作多能性細胞は、Ｉ型糖尿病（Ｔ１ＤＭ）に対処するための移植用に、β様細胞または膵島オルガノイドに分化させる。細胞システムは、Ｔ１ＤＭに対処するための有望な方法である。例えば、Ｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１７ Ｏｃｔ；１４（１０）：６１２－６２８（その開示内容は、参照により本明細書に援用される）を参照されたい。加えて、Ｐａｇｌｉｕｃａらの文献（Ｃｅｌｌ，２０１４，１５９（２）：４２８－３９）には、ｈｉＰＳＣからのβ細胞への分化の成功について報告されており、その内容は、その全体が、特に、ヒト多能性幹細胞から機能的なヒトβ細胞を大規模に作製することについて概説されている方法及び試薬について、本明細書に援用される。さらに、Ｖｅｇａｓらの文献には、ヒト多能性幹細胞からヒトβ細胞を作製してからカプセル化して、宿主による免疫拒絶を回避することが示されており（Ｖｅｇａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２０１６，２２（３）：３０６－１１）、その内容は、参照により、その全体が、特に、ヒト多能性幹細胞から機能的なヒトβ細胞を大規模に作製することについて概説されている方法及び試薬について本明細書に援用される。

【0764】

いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化によって、膵臓の操作膵島細胞集団を操作多能性細胞集団から作製する方法は、（ａ）インスリン様成長因子、トランスフォーミング成長因子、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＨＧＦ、ＳＨＨ、ＶＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子－ｂスーパーファミリー、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＧＳＫ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＢＭＰ１型受容体阻害剤及びレチノイン酸からなる群から選択した１つ以上の因子を含む第１の培養培地中で、操作ｉＰＳＣ集団を培養して、膵臓の未成熟膵島細胞集団を作製することと、（ｂ）第１の培養培地とは異なる第２の培養培地中で、膵臓の未成熟膵島細胞集団を培養して、膵臓の操作膵島細胞集団を作製することを含む。いくつかの実施形態では、そのＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体またはそのバリアントである。いくつかの事例では、そのＧＳＫ阻害剤は、約２ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、そのＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体またはそのバリアントである。いくつかの事例では、そのＡＬＫ阻害剤は、約１ｐＭ～約１０ｐＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、その第１の培養培地及び／または第２の培養培地は、動物血清を含まない。

【0765】

分化は、当該技術分野で知られているように、概して、β細胞関連マーカーまたはβ細胞特異的マーカー（インスリンが挙げられるが、これに限定されない）の存在を評価することによってアッセイする。分化は、機能によって測定すること、例えばグルコース代謝を測定することもできる。概して、Ｍｕｒａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ．２０１６ Ｏｃｔ ２６；３（４）：３８５－３９４．ｅ３（その内容は、参照により、その全体が、具体的にはその文献に概説されているバイオマーカーについて、本明細書に援用される）を参照されたい。β細胞が生成されたら、それらの細胞を（本明細書に論じられているように、細胞懸濁液として、またはゲルマトリックス内のいずれかで）門脈／肝臓、大網、胃腸粘膜、骨髄、筋肉または皮下嚢に移植できる。

【0766】

本発明の技術での用途を含め、膵臓の膵島細胞の追加の説明は、ＷＯ２０２０／０１８６１５に見ることができ、その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0767】

いくつかの実施形態では、操作膵島β細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代膵島β細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた内皮細胞を操作したものの集団は、培養下で維持し、いくつかの事例では、投与の前に増加させる。ある特定の実施形態では、操作膵島β細胞集団は、投与前に凍結保存する。

【0768】

例示的な種類の膵臓の膵島細胞としては、膵臓の膵島前駆細胞、膵臓の未成熟膵島細胞、膵臓の成熟膵島細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の膵臓の膵臓細胞は、糖尿病を治療するために対象に投与する。

【0769】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているように操作した膵島細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代膵島β細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた膵島β細胞を操作したものは、インスリンを分泌する。いくつかの実施形態では、膵臓の膵島細胞では、膵臓の内在性の膵島細胞の少なくとも２つの特性が見られ、その特性は、例えば、グルコースに応じたインスリン分泌、β細胞マーカーの発現であるが、これらに限定されない。

【0770】

例示的なβ細胞マーカーまたは前駆β細胞マーカーとしては、ｃ－ペプチド、Ｐｄｘｌ、グルコーストランスポーター２（Ｇｌｕｔ２）、ＨＮＦ６、ＶＥＧＦ、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）、プロホルモンコンバターゼ（ＰＣ １／３）、Ｃｄｃｐｌ、ＮｅｕｒｏＤ、Ｎｇｎ３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．ｌ、Ｎｋｘ６．２、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、Ｐｔｆｌａ、Ｉｓｌｌ、Ｓｏｘ９、Ｓｏｘｌ７及びＦｏｘＡ２が挙げられるが、これらに限定されない。

【0771】

いくつかの実施形態では、その膵臓の膵島細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代膵島β細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた膵島β細胞は、グルコースの増加に応じてインスリンを産生する。様々な実施形態では、その膵臓の膵島細胞は、グルコースの増加に応じてインスリンを分泌する。いくつかの実施形態では、その細胞は、独特の形態、例えば敷石状細胞形態を有し、及び／または直径が約１７ｐｍ～約２５ｐｍである。

【0772】

いくつかの実施形態では、本発明の技術は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現するとともに、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原）の発現の低下または発現の欠失が見られ、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる操作膵島β細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代膵島β細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた膵島β細胞を操作したものに対するものである。ある特定の実施形態では、その操作膵島β細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その操作膵島β細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、膵島β細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子という遺伝子のうちの１つ以上を破壊するゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。

【0773】

いくつかの実施形態では、提供する操作膵島β細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作膵島β細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代膵島β細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた膵島β細胞を操作したものは、患者（例えば、投与されたレシピエント）において免疫応答を活性化しない。提供するのは、本明細書に記載の操作膵島β細胞の集団を、その治療が必要な対象（例えばレシピエント）または患者に投与することによって、疾患を治療する方法である。

【0774】

Ｄ．内皮細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に示されているようにして操作または改変する細胞は、初代内皮細胞である。いくつかの実施形態では、その初代内皮細胞は、１人以上の個別のドナー対象、例えば１人以上の個別の健常ドナー（例えば、疾患もしくは感染があることが分かっていないか、またはその疑いがない対象、例えば、疾患または感染の臨床徴候が見られない対象など）から単離または取得する。当業者には理解されるように、内皮細胞を個体から単離または取得する方法は、既知の技法を用いて行うことができる。本発明で提供するのは、対象（例えばレシピエント）に後で移植するか、または生着させるために、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含む操作初代内皮細胞種である。

【0775】

いくつかの実施形態では、初代内皮細胞は、対象または個体から取得する（例えば、採取するか、摘出するか、除去するか、または取り出す）。いくつかの実施形態では、初代内皮細胞は、内皮細胞プールから作製して、その内皮細胞が、１人以上の対象（例えば、１人以上の健常なヒトを含む１人以上のヒト）に由来するようにする。いくつかの実施形態では、その初代内皮細胞プールは、１～１００人、１～５０人、１～２０人、１～１０人、１人以上、２人以上、３人以上、４人以上、５人以上、１０人以上、２０人以上、３０人以上、４０人以上、５０人以上または１００人以上の対象に由来する。いくつかの実施形態では、そのドナー対象は、患者（例えば、その治療用細胞を投与されるレシピエント）とは異なる者である。いくつかの実施形態では、その内皮細胞プールは、患者由来の細胞を含まない。いくつかの実施形態では、その内皮細胞プールの取得元であるドナー対象の１人以上は、その患者とは異なる者である。

【0776】

いくつかの実施形態では、本発明で提供するような細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むとともに、内皮細胞種に分化している操作ｉＰＳＣから分化させた内皮細胞である。当業者には理解されるように、その分化方法は、既知の技法を用いて、所望の細胞種によって決まる。いくつかの実施形態では、様々な内皮細胞種に分化させた細胞は、後で対象（例えばレシピエント）に移植または生着させるのに用いてよい。

【0777】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作多能性細胞は、末梢動脈疾患に対処するために、内皮コロニー形成細胞（ＥＣＦＣ）に分化させて、新たな血管を形成させる。内皮細胞に分化させる技法は、既知である。例えば、Ｐｒａｓａｉｎ ｅｔ ａｌ．，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０４８を参照されたい。その開示内容は、参照により、その全体が、具体的には、内皮細胞をヒト多能性幹細胞から生成する方法及び試薬、ならびに移植技法について、本明細書に援用される。分化は、当該技術分野で知られているように、概して、内皮細胞関連マーカーもしくは内皮細胞特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能によって測定することによってアッセイできる。

【0778】

いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化によって、操作内皮細胞集団を操作多能性細胞集団から作製する方法は、（ａ）ＧＳＫ阻害剤を含む第１の培養培地中で、操作ｉＰＳＣ細胞集団を培養することと、（ｂ）ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを含む第２の培養培地中で、操作ｉＰＳＣ細胞集団を培養して、前駆内皮細胞集団を作製することと、（ｃ）ＲＯＣＫ阻害剤及びＡＬＫ阻害剤を含む第３の培養培地中で、前駆内皮細胞集団を培養して、本明細書に記載の改変を含むように操作されている分化内皮細胞集団を作製することを含む。

【0779】

いくつかの実施形態では、そのＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体またはそのバリアントである。いくつかの事例では、そのＧＳＫ阻害剤は、約１ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、そのＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２、その誘導体またはそのバリアントである。いくつかの事例では、そのＲＯＣＫ阻害剤は、約１ｐＭ～約２０ｐＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、そのＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体またはそのバリアントである。いくつかの事例では、そのＡＬＫ阻害剤は、約０．５ｐＭ～約１０ｐＭの範囲の濃度である。

【0780】

いくつかの実施形態では、その第１の培養培地は、２ｐＭ～約１０ｐＭのＣＨＩＲ－９９０２１を含む。いくつかの実施形態では、その第２の培養培地は、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを含む。別の実施形態では、その第２の培養培地は、Ｙ－２７６３２及びＳＢ－４３１５４２をさらに含む。様々な実施形態では、その第３の培養培地は、１０ｐＭのＹ－２７６３２及び１ｐＭのＳＢ－４３１５４２を含む。ある特定の実施形態では、その第３の培養培地は、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦをさらに含む。特定の事例では、その第１の培養培地及び／または第２の培地は、インスリンを含まない。

【0781】

本発明で提供する細胞は、多能性細胞の内皮細胞への分化を支持及び／または促進するために、表面上、例えば合成表面上で培養できる。いくつかの実施形態では、その表面は、ポリマー材を含み、そのポリマー材としては、所定の１つ以上のアクリレートモノマーからなるホモポリマーまたはコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。アクリレートモノマー及びメタクリレートモノマーの非限定的な例としては、テトラ（エチレングリコール）ジアクリレート、グリセロールジメタクリレート、１，４－ブタンジオールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ジ（エチレングリコール）ジメタクリレート、テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、１，６－ヘキサンジオールプロポキシレートジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、トリメチロールプロパンベンゾエートジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレート（１ＥＯ／ＱＨ）メチル、トリシクロ［５．２．１．０^２，６］デカンジメタノールジアクリレート、ネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート及びトリメチロールプロパントリアクリレートが挙げられる。アクリレートは、当該技術分野で知られているように合成するか、またはＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．及びＳａｒｔｏｍｅｒ，Ｉｎｃ．などの供給業者から取得する。

【0782】

いくつかの実施形態では、その内皮細胞は、ポリマーマトリックス上に播種してもよい。いくつかの事例では、そのポリマーマトリックスは、生分解性である。適切な生分解性マトリックスは、当該技術分野で周知であり、コラーゲン－ＧＡＧ、コラーゲン、フィブリン、ＰＬＡ、ＰＧＡ、及びＰＬＡ／ＰＧＡコポリマーが挙げられる。追加の生分解性の材料としては、ポリ（無水物）、ポリ（ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（プロピルフマレート）、ポリ（カプロラクトン）、ポリアミド、ポリアミノ酸、ポリアセタール、生分解性ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン及び多糖類が挙げられる。

【0783】

非生分解性ポリマーも、同様に使用してもよい。非生分解性ではあるが、生体適合性である他のポリマーとしては、ポリピロール、ポリアニリン、ポリチオフェン、ポリスチレン、ポリエステル、非生分解性ポリウレタン、ポリ尿素、ポリ（エチレン酢酸ビニル）、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリカーボネート及びポリ（エチレンオキシド）が挙げられる。そのポリマーマトリックスは、いずれかの形状、例えば、粒子、スポンジ、チューブ、球、ストランド、コイル状ストランド、毛状の網目構造、フィルム、繊維、メッシュまたはシートとして形成されていてよい。そのポリマーマトリックスは、天然または合成の細胞外マトリックスの材料及び因子を含むように改変できる。

【0784】

そのポリマー材は、支持材の表面に分散させることができる。細胞を培養するのに適する有用な支持材としては、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマーもしくはコポリマー、これらの組み合わせのいずれか、または一方の材料を別の材料にコーティングしたものが挙げられる。いくつかの事例では、ガラスとしては、ソーダ石灰ガラス、パイレックスガラス、バイコールガラス、石英ガラス、シリコンまたはこれらの誘導体などが挙げられる。

【0785】

いくつかの事例では、プラスチック、または樹枝状ポリマーを含むポリマーとしては、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（酢酸ビニル－無水マレイン酸）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミン、またはこれらの誘導体などが挙げられる。いくつかの事例では、コポリマーとしては、ポリ（酢酸ビニル－ｃｏ－無水マレイン酸）、ポリ（スチレン－ｃｏ－無水マレイン酸）、ポリ（エチレン－ｃｏ－アクリル酸）、またはこれらの誘導体などが挙げられる。

【0786】

本明細書に示されている方法で使用する内皮細胞及びその分化の追加の説明は、ＷＯ２０２０／０１８６１５で見ることができ、その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0787】

いくつかの実施形態では、操作内皮細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代内皮細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた内皮細胞を操作したものの集団は、培養下で維持し、いくつかの事例では、投与の前に増加させる。ある特定の実施形態では、その内皮細胞集団は、投与の前に凍結保存する。

【0788】

いくつかの実施形態では、本発明の技術は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下または発現の欠失が見られ、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる操作内皮細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代内皮細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた内皮細胞を操作したものに対するものであるある特定の実施形態では、その操作内皮細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その操作内皮細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、操作内皮細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子という遺伝子のうちの１つ以上を破壊するゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。

【0789】

いくつかの実施形態では、提供する操作内皮細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作内皮細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代内皮細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた内皮細胞を操作したものは、患者（例えば、投与されたレシピエント）において免疫応答を活性化しない。提供するのは、本明細書に記載の操作内皮細胞の集団を、その治療が必要な対象（例えばレシピエント）または患者に投与することによって、疾患を治療する方法である。

【0790】

いくつかの実施形態では、その操作内皮細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代内皮細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた内皮細胞を操作したものは、その細胞を必要とする患者、例えばヒト患者に投与する。その操作内皮細胞は、以下に限定されないが、心血管疾患、血管疾患、末梢血管疾患、虚血性疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、脳卒中、再灌流障害、肢虚血、神経障害（例えば、末梢神経障害または糖尿病性神経障害）、臓器不全（例えば、肝不全、腎不全など）、糖尿病、関節リウマチ、骨粗鬆症、血管損傷、組織損傷、高血圧、冠動脈疾患に起因する狭心症及び心筋梗塞、腎血管性高血圧症、腎動脈狭窄に起因する腎不全、下肢跛行などのような疾患または病態を罹患している患者に投与できる。ある特定の実施形態では、その患者は、一過性の虚血性発作または脳卒中に罹患したことがあるか、またはその疾患に罹患しており、いくつかの事例では、その疾患は、脳血管疾患に起因し得る。いくつかの実施形態では、その操作内皮細胞は、例えば、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞及び肢虚血で見られるような組織虚血を治療するため、ならびに損傷血管を修復するために投与する。いくつかの事例では、その細胞は、移植片のバイオエンジニアリングで使用する。

【0791】

例えば、その操作内皮細胞は、虚血組織の修復、血管及び心臓弁の形成、人工血管の工学設計、損傷血管の修復、及び（例えば移植前の）操作組織内での血管形成の誘導のための細胞療法で使用できる。加えて、その内皮細胞は、腫瘍を標的として治療する薬剤を送達するようにさらに改変することができる。

【0792】

多くの実施形態では、本発明で提供するのは、血管細胞または血管新生が必要な組織を修復または補充する方法である。その方法は、このような治療を必要とするヒト患者に、その操作内皮細胞、例えば、単離初代内皮細胞または分化内皮細胞を含む組成物を投与して、当該組織内で血管新生を促すことを伴う。血管細胞または血管新生が必要な組織は、心臓組織、肝臓組織、膵臓組織、腎組織、筋肉組織、神経組織、骨組織などであることができ、その組織は、損傷しているとともに、過剰細胞死、損傷リスクのある組織、または人為的に操作した組織を特徴とする組織であることができる。

【0793】

いくつかの実施形態では、心疾患または心臓障害と関連し得る血管疾患は、内皮細胞、例えば、以下に限定されないが、本明細書に記載されているようにして得た最終的な血管内皮細胞及び心内膜内皮細胞を投与することによって治療することができる。このような血管疾患としては、冠動脈疾患、脳血管疾患、大動脈狭窄、大動脈瘤、末梢動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、静脈瘤、血管障害、冠動脈灌流欠損をきたした心臓の梗塞領域、非治癒性創傷、糖尿病性潰瘍、非糖尿病性潰瘍、または血管の形成を誘導するのが望ましいいずれかの他の疾患もしくは障害が挙げられるが、これらに限定されない。

【0794】

ある特定の実施形態では、その内皮細胞は、血管再建手術で使用する補綴用インプラント（例えば、Ｄａｃｒｏｎ及びＧｏｒｔｅｘなどの合成材料で作られた血管）を改善するのに使用する。例えば、補綴用動脈移植片は、重要器官または手足に灌流させる動脈の患部を補充するのに用いる場合が多い。別の実施形態では、その操作内皮細胞を用いて、人工心臓弁の表面を覆って、その弁表面での血栓形成性を低くすることによって、塞栓形成のリスクを低下させる。

【0795】

概説されている内皮細胞は、組織及び／または単離細胞を血管に移植するための周知の手術技法を用いて、患者に移植することができる。いくつかの実施形態では、その細胞は、注射（例えば、心筋内注射、冠動脈内注射、経心内膜注射、経心外膜注射、経皮注射）、注入、移植及び埋入によって、患者の心臓組織に導入する。

【0796】

その内皮細胞の投与（送達）としては、静脈内投与、動脈内（例えば冠動脈内）投与、筋肉内投与、腹腔内投与、心筋内投与、経心内膜投与、経心外膜投与、鼻腔内投与及び髄腔内投与を含む皮下投与または非経口投与、ならびに注入技法が挙げられるが、これらに限定されない。

【0797】

当業者には理解されるように、その細胞は、当該技術分野で知られている技法のうち、細胞種及びこれらの細胞の最終用途の両方によって決まる技法を用いて移植する。いくつかの実施形態では、本発明で提供する細胞は、患者に、静脈内移植または特定の部位での注射のいずれかによって移植する。特定の部位に移植するときには、その細胞は、ゲルマトリックスに懸濁して、その細胞が定着する間の分散を防止してよい。

【0798】

例示的な内皮細胞種としては、毛細血管内皮細胞、血管内皮細胞、大動脈内皮細胞、動脈内皮細胞、静脈内皮細胞、腎臓内皮細胞、脳内皮細胞、肝臓内皮細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0799】

本明細書に概説されている内皮細胞、例えば、単離初代内皮細胞または分化内皮細胞は、１つ以上の内皮細胞マーカーを発現することができる。このようなマーカーの非限定的な例としては、ＶＥ－カドヘリン（ＣＤ１４４）、ＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵素）（ＣＤ１４３）、ＢＮＨ９／ＢＮＦ１３、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－ｌ）、ＣＤ６２Ｅ（Ｅ－セレクチン）、ＣＤ１０５（エンドグリン）、ＣＤ１４６、エンドカン（ＥＳＭ－ｌ）、エンドグリックス－ｌ、エンドムチン、エオタキシン－３、ＥＰＡＳ１（内皮ＰＡＳドメインタンパク質１）、第ＶＩＩＩ因子関連抗原、ＦＬＩ－ｌ、Ｆｌｋ－ｌ（ＫＤＲ、ＶＥＧＦＲ－２）、ＦＬＴ－ｌ（ＶＥＧＦＲ－ｌ）、ＧＡＴＡ２、ＧＢＰ－ｌ（グアニル酸結合タンパク質－ｌ）、ＧＲＯ－α、ＨＥＸ、ＩＣＡＭ－２（細胞間接着分子２）、ＬＭ０２、ＬＹＶＥ－ｌ、ＭＲＢ（マジックラウンドアバウト）、ヌクレオリン、ＰＡＬ－Ｅ（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｃｈｅ ａｎａｔｏｍｉｅ Ｌｅｉｄｅｎ－ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）、ＲＴＫ、ｓＶＣＡＭ－ｌ、ＴＡＬＩ、ＴＥＭ１（腫瘍内皮マーカー１）、ＴＥＭ５（腫瘍内皮マーカー５）、ＴＥＭ７（腫瘍内皮マーカー７）、トロンボモジュリン（ＴＭ、ＣＤ１４１）、ＶＣＡＭ－ｌ（血管細胞接着分子－１）（ＣＤ１０６）、ＶＥＧＦ、ｖＷＦ（フォン・ヴィレブランド因子）、ＺＯ－ｌ、内皮細胞選択的接着分子（ＥＳＡＭ）、ＣＤ１０２、ＣＤ９３、ＣＤ１８４、ＣＤ３０４及びＤＬＬ４が挙げられる。

【0800】

いくつかの実施形態では、その内皮細胞は、目的のタンパク質、例えば、障害／病態を治療するか、または障害／病態の症状を改善するのに有用である酵素、ホルモン、受容体、リガンドまたは薬物（ただし、これらに限定されない）をコードする外因性遺伝子を発現するようにさらに遺伝子改変されている。内皮細胞を遺伝子改変する標準的な方法は、例えばＵＳ５，６７４，７２２に記載されている。

【0801】

このような内皮細胞を用いて、疾患の予防または治療に有用であるポリペプチドまたはタンパク質を構成的に合成及び送達させることができる。この方式では、そのポリペプチドは、その個体の血流または身体のその他の領域（例えば中枢神経系）に直接分泌される。いくつかの実施形態では、その内皮細胞は、インスリン、血液凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子またはフォン・ヴィレブランド因子）、α－ｌアンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、インターロイキン（例えば、ＩＬ－ｌ、ＩＬ－２、ＩＬ－３）などを分泌するように改変できる。

【0802】

ある特定の実施形態では、その内皮細胞は、埋め込む移植細胞との関連では、その細胞の性能を改善させる形で改変できる。非限定的な例示としては、血栓溶解剤を分泌または発現させて、管内血栓の形成を予防すること、平滑筋増殖阻害剤を分泌させて、平滑筋肥大による管腔狭窄を予防すること、ならびに内皮細胞の分裂促進因子または自己分泌因子を発現及び／または分泌させて、内皮細胞の増殖を刺激するとともに、移植細胞管腔の内皮細胞内膜の程度または期間を改善することが挙げられる。

【0803】

いくつかの実施形態では、その操作内皮細胞は、治療的レベルの分泌産物を所定の器官または手足に送達するのに使用する。例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで操作（トランスダクション）した内皮細胞で裏打ちされた血管インプラントを所定の器官または手足に移植できる。トランスダクションした内皮細胞の分泌産物は、高濃度で灌流組織に送達され、それによって、標的とする解剖学的部位に対して所望の作用が発揮されることになる。

【0804】

別の実施形態では、その内皮細胞は、血管新生を起こしている腫瘍において内皮細胞によって発現されると、血管新生を阻止または阻害する遺伝子を含むように、さらに遺伝子改変する。いくつかの事例では、その内皮細胞は、本明細書に記載の選択可能な自殺遺伝子のうちのいずれか１つを発現するように遺伝子改変することもでき、その遺伝子は、腫瘍の治療が完了したら、移植内皮細胞のネガティブ選択が可能である。

【0805】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の内皮細胞、例えば、単離初代内皮細胞または分化内皮細胞は、血管損傷、心血管疾患、血管疾患、末梢血管疾患、虚血性疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、末梢血管閉塞性疾患、高血圧、虚血性組織損傷、再灌流障害、肢虚血、脳卒中、神経障害（例えば、末梢神経障害または糖尿病性神経障害）、臓器不全（例えば、肝不全、腎不全など）、糖尿病、関節リウマチ、骨粗鬆症、脳血管疾患、高血圧、冠動脈疾患に起因する狭心症及び心筋梗塞、腎血管性高血圧症、腎動脈狭窄に起因する腎不全、下肢跛行、その他の血管の病態または血管疾患からなる群から選択した血管障害を治療するために、レシピエント対象に投与する。

【0806】

Ｅ．上皮細胞
３）網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に示されているようにして操作または改変する細胞は、初代網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である。いくつかの実施形態では、その初代ＲＰＥ細胞は、１人以上の個別のドナー対象、例えば１人以上の個別の健常ドナー（例えば、疾患もしくは感染があることが分かっていないか、またはその疑いがない対象、例えば、疾患または感染の臨床徴候が見られない対象など）から単離または取得する。当業者には理解されるように、ＲＰＥ細胞を個体から単離または取得する方法は、既知の技法を用いて行うことができる。本発明で提供するのは、対象（例えばレシピエント）に後で移植するか、または生着させるために、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含む操作初代ＲＰＥ細胞である。

【0807】

いくつかの実施形態では、初代ＲＰＥ細胞は、対象または個体から取得する（例えば、採取するか、摘出するか、除去するか、または取り出す）。いくつかの実施形態では、初代ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ細胞プールから作製して、そのＲＰＥ細胞が、１人以上の対象（例えば、１人以上の健常なヒトを含む１人以上のヒト）に由来するようにする。いくつかの実施形態では、その初代ＲＰＥ細胞プールは、１～１００人、１～５０人、１～２０人、１～１０人、１人以上、２人以上、３人以上、４人以上、５人以上、１０人以上、２０人以上、３０人以上、４０人以上、５０人以上または１００人以上の対象に由来する。いくつかの実施形態では、そのドナー対象は、患者（例えば、その治療用細胞を投与されるレシピエント）とは異なる者である。いくつかの実施形態では、そのＲＰＥ細胞プールは、その患者由来の細胞を含まない。いくつかの実施形態では、そのＲＰＥ細胞プールの取得元であるドナー対象の１人以上は、その患者とは異なる者である。

【0808】

いくつかの実施形態では、本発明で提供するような細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むとともに、ＲＰＥ細胞に分化している操作ｉＰＳＣから分化させたＲＰＥ細胞である。当業者には理解されるように、その分化方法は、既知の技法を用いて、所望の細胞種によって決まる。いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞に分化させた細胞は、後で対象（例えばレシピエント）に移植または生着させるのに用いてよい。

【0809】

多能性幹細胞をＲＰＥ細胞に分化させるのに有用な方法は、例えば、ＵＳ９，４５８，４２８及びＵＳ９，８５０，４６３に記載されており、その開示内容は、参照により、明細書を含め、その全体が本明細書に援用される。ＲＰＥ細胞をヒト人工多能性幹細胞から作製する追加の方法は、例えば、Ｌａｍｂａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００６，１０３（３４）：１２７６９－１２７７４、Ｍｅｌｌｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０１２，３０（４）：６７３－６８６、Ｉｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２００９，５（４）：３９６－４０８、Ｒｏｗｌａｎｄ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１２，２２７（２）：４５７－４６６，Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓ Ｍｅｄ，２０１３，２（５）：３８４－３９３及びｄａ Ｃｒｕｚ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０１８，３６：３２８－３３７に見ることができる。

【0810】

ヒト多能性幹細胞は、Ｋａｍａｏ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１４：２：２０５－１８（その開示内容は、参照により、その全体が、特に、分化技法及び試薬についてその文献で概説されている方法及び試薬について本明細書に援用される）に概説されている技法を用いて、ＲＰＥ細胞に分化されている。また、Ｍａｎｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，２０１７，３７６：１０３８－１０４６（その内容は、参照により、その全体が、ＲＰＥ細胞のシートを生成して、患者に移植する技法について、本明細書に援用される）も参照されたい。分化は、当該技術分野で知られているように、概して、ＲＰＥ関連マーカー及び／またはＲＰＥ特異的マーカーの存在を評価することによって、あるいは機能によって測定することによってアッセイできる。例えば、Ｋａｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２（２）：２０５－１８を参照されたい。その内容は、参照により、その全体が、具体的には、結果のセクションの第１段落に概説されているマーカーについて、本明細書に援用される。

【0811】

いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化によって、操作網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞集団を操作多能性細胞集団から作製する方法は、（ａ）アクチビンＡ、ｂＦＧＦ、ＢＭＰ４／７、ＤＫＫ１、ＩＧＦ１、ノギン、ＢＭＰ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤及びＶＥＧＦＲ阻害剤からなる群から選択した因子のいずれか１つを含む第１の培養培地中で、操作多能性細胞集団を培養して、前駆ＲＰＥ細胞集団を作製することと、（ｂ）第１の培養培地とは異なる第２の培養培地中で、前駆ＲＰＥ細胞の集団を培養して、操作ＲＰＥ細胞集団を作製することを含む。いくつかの実施形態では、そのＡＬＫ阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２、その誘導体またはそのバリアントである。いくつかの事例では、そのＡＬＫ阻害剤は、約２ｍＭ～約１０ｐＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、そのＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ－２７６３２、その誘導体またはそのバリアントである。いくつかの事例では、そのＲＯＣＫ阻害剤は、約１ｐＭ～約１０ｐＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、その第１の培養培地及び／または第２の培養培地は、動物血清を含まない。

【0812】

分化は、当該技術分野で知られているように、概して、ＲＰＥ関連マーカー及び／またはＲＰＥ特異的マーカーの存在を評価することによって、あるいは機能によって測定することによってアッセイできる。例えば、Ｋａｍａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２（２）：２０５－１８を参照されたい。その内容は、参照により、その全体が、具体的には結果のセクションについて、本明細書に援用される。

【0813】

ＲＰＥ細胞の追加の説明は、その分化方法及び本発明の技術での用途を含め、ＷＯ２０２０／０１８６１５に見られ、その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0814】

いくつかの実施形態では、操作ＲＰＥ細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代ＲＰＥ細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させたＲＰＥ細胞を操作したものの集団は、培養下で維持し、いくつかの事例では、投与の前に増加させる。ある特定の実施形態では、そのＲＰＥ細胞集団は、投与の前に凍結保存する。

【0815】

例示的なＲＰＥ細胞種としては、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、ＲＰＥ前駆細胞、未成熟ＲＰＥ細胞、成熟ＲＰＥ細胞、機能的ＲＰＥ細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0816】

いくつかの実施形態では、ＲＰＥ細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代ＲＰＥ細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させたＲＰＥ細胞は、遺伝子発現プロファイルが、天然型ＲＰＥ細胞の遺伝子発現プロファイルと同様であるか、または実質的に同様である。このようなＲＰＥ細胞は、平面状基材上でコンフルエントになるまで成長させたときに、天然型ＲＰＥ細胞の多角形平面状シート形態を有することができる。

【0817】

いくつかの実施形態では、本発明の技術は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原）の発現の低下または発現の欠失が見られ、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる操作ＲＰＥ細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代ＲＰＥ細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させたＲＰＥ細胞を操作したものに対するものである。ある特定の実施形態では、その操作ＲＰＥ細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その操作ＲＰＥ細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、操作ＲＰＥ細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子という遺伝子のうちの１つ以上を破壊するゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。

【0818】

いくつかの実施形態では、提供する操作ＲＰＥ細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作ＲＰＥ細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代ＲＰＥ細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させたＲＰＥ細胞を操作したものは、患者（例えば、投与されたレシピエント）において免疫応答を活性化しない。提供するのは、本明細書に記載の操作ＲＰＥ細胞の集団を、その治療が必要な対象（例えばレシピエント）または患者に投与することによって、疾患を治療する方法である。

【0819】

そのＲＰＥ細胞は、黄斑変性に罹患している患者、またはＲＰＥ細胞が損傷している患者に埋入できる。いくつかの実施形態では、その患者は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、初期ＡＭＤ、中期ＡＭＤ、後期ＡＭＤ、非新生血管型加齢黄斑変性、ドライ型黄斑変性（ドライ型加齢黄斑変性）、滲出型黄斑変性（滲出型加齢黄斑変性）、若年性黄斑変性（ＪＭＤ）（例えば、シュタルガルト病、ベスト病及び若年性網膜分離症）、レーバー先天性黒内障または網膜色素変性症である。別の実施形態では、その患者は、網膜剥離を罹患する。

【0820】

治療用途では、開示されている方法に従って調製した細胞は、典型的には、等張賦形剤を含む医薬組成物の形態で供給でき、ヒトへの投与用に十分に滅菌される条件下で調製する。細胞組成物の医薬製剤における一般的原理については、“Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，”ｂｙ Ｍｏｒｓｔｙｎ ＆ Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６及び“Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ ＆ Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００を参照されたい。その細胞は、流通または臨床使用に適する器具または容器にパッケージできる。

【0821】

４）甲状腺細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に示されているようにして操作または改変する細胞は、初代甲状腺細胞である。いくつかの実施形態では、その初代甲状腺細胞は、１人以上の個別のドナー対象、例えば１人以上の個別の健常ドナー（例えば、疾患もしくは感染があることが分かっていないか、またはその疑いがない対象、例えば、疾患または感染の臨床徴候が見られない対象など）から単離または取得する。当業者には理解されるように、甲状腺細胞を個体から単離または取得する方法は、既知の技法を用いて行うことができる。本発明で提供するのは、対象（例えばレシピエント）に後で移植するか、または生着させるために、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含む操作初代甲状腺細胞である。

【0822】

いくつかの実施形態では、初代甲状腺細胞は、対象または個体から取得する（例えば、採取するか、摘出するか、除去するか、または取り出す）。いくつかの実施形態では、初代甲状腺細胞は、甲状腺細胞プールから作製して、その甲状腺細胞が、１人以上の対象（例えば、１人以上の健常なヒトを含む１人以上のヒト）に由来するようにする。いくつかの実施形態では、その初代甲状腺細胞プールは、１～１００人、１～５０人、１～２０人、１～１０人、１人以上、２人以上、３人以上、４人以上、５人以上、１０人以上、２０人以上、３０人以上、４０人以上、５０人以上または１００人以上の対象に由来する。いくつかの実施形態では、そのドナー対象は、患者（例えば、その治療用細胞を投与されるレシピエント）とは異なる者である。いくつかの実施形態では、その甲状腺細胞プールは、その患者由来の細胞を含まない。いくつかの実施形態では、その甲状腺細胞プールの取得元であるドナー対象の１人以上は、その患者とは異なる者である。

【0823】

いくつかの実施形態では、本発明で提供するような細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むとともに、甲状腺細胞に分化している操作ｉＰＳＣから分化させた甲状腺細胞である。当業者には理解されるように、その分化方法は、既知の技法を用いて、所望の細胞種によって決まる。いくつかの実施形態では、甲状腺細胞に分化させた細胞は、後で対象（例えばレシピエント）に移植または生着させるのに用いてよい。

【0824】

いくつかの実施形態では、甲状腺ホルモンを分泌できる甲状腺前駆細胞及び甲状腺濾胞オルガノイドに、本明細書に記載の改変を含む操作多能性細胞を分化させて、自己免疫性甲状腺炎に対処する。甲状腺細胞に分化させる技法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｋｕｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１５ Ｎｏｖ ５；１７（５）：５２７－４２を参照されたい。その開示内容は、参照により、その全体が、具体的には、甲状腺細胞をヒト多能性幹細胞から作製する方法及び試薬について、ならびに移植技法についても、本明細書に援用される。分化は、当該技術分野で知られているように、概して、甲状腺細胞関連もしくは特異的マーカーの存在を評価することによって、または機能によって測定することによってアッセイできる。

【0825】

いくつかの実施形態では、操作甲状腺細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代甲状腺細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた甲状腺細胞を操作したものの集団は、培養下で維持し、いくつかの事例では、投与の前に増加させる。ある特定の実施形態では、その甲状腺細胞集団は、投与の前に凍結保存する。

【0826】

いくつかの実施形態では、本発明の技術は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原）の発現の低下または発現の欠失が見られ、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる操作甲状腺細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代甲状腺細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた甲状腺細胞を操作したものに対するものである。ある特定の実施形態では、その操作甲状腺細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その操作甲状腺細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、操作甲状腺細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子という遺伝子のうちの１つ以上を破壊するゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。

【0827】

いくつかの実施形態では、提供する操作甲状腺細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作甲状腺細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代甲状腺細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた甲状腺細胞を操作したものは、患者（例えば、投与されたレシピエント）において免疫応答を活性化しない。提供するのは、本明細書に記載の操作内皮細胞の集団を、その治療が必要な対象（例えばレシピエント）または患者に投与することによって、疾患を治療する方法である。

【0828】

Ｆ．肝細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に示されているようにして操作または改変する細胞は、初代肝細胞である。いくつかの実施形態では、その初代肝細胞は、１人以上の個別のドナー対象、例えば１人以上の個別の健常ドナー（例えば、疾患もしくは感染があることが分かっていないか、またはその疑いがない対象、例えば、疾患または感染の臨床徴候が見られない対象など）から単離または取得する。当業者には理解されるように、肝細胞を個体から単離または取得する方法は、既知の技法を用いて行うことができる。本発明で提供するのは、対象（例えばレシピエント）に後で移植するか、または生着させるために、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含む操作初代肝細胞である。いくつかの実施形態では、操作初代肝細胞を細胞療法として投与して、肝細胞機能の喪失または肝硬変に対処できる。

【0829】

いくつかの実施形態では、初代肝細胞は、対象または個体から取得する（例えば、採取するか、摘出するか、除去するか、または取り出す）。いくつかの実施形態では、初代肝細胞は、肝細胞プールから作製して、その肝細胞が、１人以上の対象（例えば、１人以上の健常なヒトを含む１人以上のヒト）に由来するようにする。いくつかの実施形態では、その初代肝細胞プールは、１～１００人、１～５０人、１～２０人、１～１０人、１人以上、２人以上、３人以上、４人以上、５人以上、１０人以上、２０人以上、３０人以上、４０人以上、５０人以上または１００人以上の対象に由来する。いくつかの実施形態では、そのドナー対象は、患者（例えば、その治療用細胞を投与されるレシピエント）とは異なる者である。いくつかの実施形態では、その肝細胞プールは、患者由来の細胞を含まない。いくつかの実施形態では、その肝細胞プールの取得元であるドナー対象の１人以上は、その患者とは異なる者である。

【0830】

いくつかの実施形態では、本発明で提供するような細胞は、本明細書に記載の改変（例えば遺伝子改変）を含むとともに、肝細胞に分化している操作ｉＰＳＣから分化させた肝細胞である。当業者には理解されるように、その分化方法は、既知の技法を用いて、所望の細胞種によって決まる。いくつかの実施形態では、肝細胞に分化させた細胞は、後で対象（例えばレシピエント）に移植または生着させるのに用いてよい。いくつかの実施形態では、多能性幹細胞から分化させた操作肝細胞を細胞療法として投与して、肝細胞機能の喪失または肝硬変に対処できる。

【0831】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の改変を含む操作多能性細胞を肝細胞に分化させる。操作多能性細胞を肝細胞に分化させるのに使用できる技法は、数多く存在する。例えば、Ｐｅｔｔｉｎａｔｏ ｅｔ ａｌ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｐｒｅ３２８８８、Ｓｎｙｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２０１１ ６９８：３０５－３１４、Ｓｉ－Ｔａｙｅｂ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１０，５１：２９７－３０５及びＡｓｇａｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ，２０１３，９（４）：４９３－５０４（いずれの文献も、参照により、その全体が、具体的には、分化のための手法及び試薬について、本明細書に援用される）を参照されたい。分化は、当該技術分野で知られているように、概して、肝細胞関連マーカー及び／または幹細胞特異的マーカー（アルブミン、αフェトプロテイン及びフィブリノゲンが挙げられるが、これらに限定されない）の存在を評価することによってアッセイできる。分化は、アンモニアの代謝、ＬＤＬの貯蔵及び取り込み、ＩＣＧの取り込み及び放出、ならびにグリコーゲンの貯蔵などの機能によって測定することもできる。

【0832】

いくつかの実施形態では、操作肝細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代肝細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた肝細胞を操作したものの集団は、培養下で維持し、いくつかの事例では、投与の前に増加させる。ある特定の実施形態では、その肝細胞集団は、投与の前に凍結保存する。

【0833】

いくつかの実施形態では、本発明の技術は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原）の発現の低下または発現の欠失が見られ、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる操作肝細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代肝細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた肝細胞を操作したものに対するものである。ある特定の実施形態では、その操作肝細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その操作肝細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、操作肝細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡという遺伝子のうちの１つ以上を破壊するゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。

【0834】

いくつかの実施形態では、提供する操作肝細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作肝細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）から単離した初代肝細胞、または１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた肝細胞を操作したものは、患者（例えば、投与されたレシピエント）において免疫応答を活性化しない。提供するのは、本明細書に記載の操作肝細胞の集団を、その治療が必要な対象（例えばレシピエント）または患者に投与することによって、疾患を治療する方法である。

【0835】

Ｇ．心臓細胞
本発明で提供するのは、後で対象（例えばレシピエント）に移植または生着させるために、ＨＩＰ細胞から分化させた心臓細胞種である。当業者には理解されるように、その分化方法は、既知の技法を用いて、所望の細胞種によって決まる。例示的な心臓細胞種としては、心筋細胞、結節心筋細胞、刺激伝導心筋細胞、作業心筋細胞、心筋細胞前駆体、心筋細胞前駆細胞、心臓幹細胞、心筋細胞、心房幹細胞、心室幹細胞、心外膜細胞、造血細胞、血管内皮細胞、心内膜内皮細胞、心臓弁間質細胞、心臓ペースメーカー細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0836】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の心臓細胞は、小児期心筋症、加齢性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症、慢性虚血性心筋症、周産期心筋症、炎症性心筋症、特発性心筋症、他の心筋症、心筋虚血再灌流傷害、心室機能不全、心不全、うっ血性心不全、冠動脈疾患、末期心疾患、アテローム性動脈硬化症、虚血、高血圧、再狭窄、狭心症、リウマチ性心臓、動脈炎、心血管疾患、心筋梗塞、心筋虚血、うっ血性心不全、心筋梗塞、心虚血、心外傷、心筋虚血、血管疾患、後天性心疾患、先天性心疾患、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、刺激伝導系機能障害、冠状動脈機能障害、肺高血圧症、心不整脈、筋ジストロフィー、筋肉量異常、筋肉変性、心筋炎、感染性心筋炎、薬物誘発性または毒物誘発性の筋肉異常、過敏性心筋炎及び自己免疫性心内膜炎からなる群から選択した心障害を治療するために、レシピエント対象に投与する。

【0837】

したがって、本発明で提供するのは、その治療及び予防の必要な対象において、心外傷または心疾患もしくは心障害を治療及び予防する方法である。本明細書に記載の方法を用いて、数多くの心疾患またはその症状、例えば、心臓の構造及び／または機能に病理学的損傷をもたらすものを治療、改善、予防するか、またはその進行を遅らせることができる。「心疾患」、「心障害」及び「心外傷」という用語は、本明細書で同義的に用いられており、弁、内皮、梗塞領域、または心臓の他の構成要素もしくは構造を含め、心臓に関連する病態及び／または障害を指す。このような心疾患または心臓関連疾患としては、心筋梗塞、心不全、心筋症、先天性心臓欠陥、心臓弁の疾患または機能障害、心内膜炎、リウマチ熱、僧帽弁逸脱、感染性心内膜炎、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎、心肥大及び／または僧帽弁閉鎖不全症などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0838】

いくつかの実施形態では、その心筋細胞前駆体には、成熟した（最終段階の）心筋細胞を含む子孫を生み出すことができる細胞が含まれる。心筋細胞前駆細胞は、ＧＡＴＡ－４、Ｎｋｘ２．５及びＭＥＦ－２ファミリーの転写因子から選択した１つ以上のマーカーを用いて特定できる。いくつかの事例では、心筋細胞は、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎｌ）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、サルコメアミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＧＡＴＡ－４、Ｎｋｘ２．５、Ｎ－カドヘリン、β２－アドレナリン受容体、ＡＮＦ、ＭＥＦ－２ファミリーの転写因子、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ－ＭＢ）、ミオグロビン及び心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）というリストのうちの１つ以上のマーカー（場合によっては、少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つのマーカー）を発現する未成熟心筋細胞または成熟心筋細胞を指す。いくつかの実施形態では、その心臓細胞は、自発的な周期的収縮活性を示す。いくつかの事例では、その心臓細胞を、Ｃａ^２＋濃度及び電解質バランスが適切である適合した組織培養環境で培養するときには、その細胞は、その培養培地にいずれの追加の成分も添加されていなくても、その細胞の一軸方向で周期的に収縮してから、収縮から解放されるのを観察できる。いくつかの実施形態では、その心臓細胞は、低免疫原性心臓細胞である。

【0839】

いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化によって、低免疫原性心臓細胞集団を低免疫原性多能性（ＨＩＰ）細胞集団から作製する方法は、（ａ）ＧＳＫ阻害剤を含む培養培地中で、ＨＩＰ細胞集団を培養することと、（ｂ）ＷＮＴアンタゴニストを含む培養培地中で、ＨＩＰ細胞集団を培養して、前駆心臓細胞集団を作製することと、（ｃ）インスリンを含む培養培地中で、その前駆心臓細胞集団を培養して、免疫機能低下心臓細胞集団を作製することを含む。いくつかの実施形態では、そのＧＳＫ阻害剤は、ＣＨＩＲ－９９０２１、その誘導体またはそのバリアントである。いくつかの事例では、そのＧＳＫ阻害剤は、約２ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の濃度である。いくつかの実施形態では、そのＷＮＴアンタゴニストは、ＩＷＲ１、その誘導体またはそのバリアントである。いくつかの事例では、そのＷＮＴアンタゴニストは、約２ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の濃度である。

【0840】

いくつかの実施形態では、その低免疫原性心臓細胞集団は、非心臓細胞から単離したものでる。いくつかの実施形態では、その単離した低免疫原性心臓細胞集団は、投与の前に増加させる。ある特定の実施形態では、その単離した低免疫原性心臓細胞集団は、投与の前に増加させて、凍結保存する。

【0841】

人工多能性幹細胞または多能性幹細胞を心臓細胞に分化させる他の有用な方法は、例えば、ＵＳ２０１７／０１５２４８５、ＵＳ２０１７／００５８２６３、ＵＳ２０１７／０００２３２５、ＵＳ２０１６／０３６２６６１、ＵＳ２０１６／００６８８１４、ＵＳ９，０６２，２８９、ＵＳ７，８９７，３８９及びＵＳ７，４５２，７１８に記載されている。心臓細胞を人工多能性幹細胞または多能性幹細胞から作製する追加の方法は、例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００６，１５（５）：６３１－９、Ｂｕｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１２，１０：１６－２８及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ，２０１５，ｌ５（２）：３６５－３７５に記載されている。

【0842】

様々な実施形態では、低免疫原性心臓細胞は、ＢＭＰ経路阻害剤、ＷＮＴシグナル伝達活性化剤、ＷＮＴシグナル伝達阻害剤、ＷＮＴアゴニスト、ＷＮＴアンタゴニスト、Ｓｒｃ阻害剤、ＥＧＦＲ阻害剤、ＰＣＫ活性化剤、サイトカイン、成長因子、心臓作用性薬剤、化合物などを含む培養培地中で培養できる。

【0843】

そのＷＮＴシグナル伝達活性化剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１が挙げられるが、これに限定されない。そのＰＣＫ活性化剤としては、ＰＭＡが挙げられるが、これに限定されない。そのＷＮＴシグナル伝達阻害剤としては、ＫＹ０２１１１、ＳＯ３０３１（ＫＹ０１－Ｉ）、ＳＯ２０３１（ＫＹ０２－Ｉ）及びＳＯ３０４２（ＫＹ０３－Ｉ）、ならびにＸＡＶ９３９から選択した化合物が挙げられるが、これらに限定されない。そのＳｒｃ阻害剤としては、Ａ４１９２５９が挙げられるが、これに限定されない。そのＥＧＦＲ阻害剤としては、ＡＧ１４７８が挙げられるが、これに限定されない。

【0844】

心臓細胞をｉＰＳＣから生成する作用物質の非限定的な例としては、アクチビンＡ、ＢＭＰ４、Ｗｎｔ３ａ、ＶＥＧＦ、可溶性フリズルドタンパク質、シクロスポリンＡ、アンジオテンシンＩＩ、フェニレフリン、アスコルビン酸、ジメチルスルホキシド、５－アザ－２’－デオキシシチジンなどが挙げられる。

【0845】

本発明で提供する細胞は、低免疫原性多能性細胞の心臓細胞への分化を支持及び／または促進するために、表面上、例えば合成表面上で培養できる。いくつかの実施形態では、その表面は、ポリマー材を含み、そのポリマー材としては、所定の１つ以上のアクリレートモノマーからなるホモポリマーまたはコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。アクリレートモノマー及びメタクリレートモノマーの非限定的な例としては、テトラ（エチレングリコール）ジアクリレート、グリセロールジメタクリレート、１，４－ブタンジオールジメタクリレート、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ジ（エチレングリコール）ジメタクリレート、テトラ（エチレングリコール）ジメタクリレート、１，６－ヘキサンジオールプロポキシレートジアクリレート、ネオペンチルグリコールジアクリレート、トリメチロールプロパンベンゾエートジアクリレート、トリメチロールプロパンエトキシレート（１ＥＯ／ＱＨ）メチル、トリシクロ［５．２．１．０^２，６］デカンジメタノールジアクリレート、ネオペンチルグリコールエトキシレートジアクリレート及びトリメチロールプロパントリアクリレートが挙げられる。アクリレートは、当該技術分野で知られているように合成するか、またはＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ．及びＳａｒｔｏｍｅｒ，Ｉｎｃ．などの供給業者から取得する。

【0846】

そのポリマー材は、支持材の表面に分散させることができる。細胞を培養するのに適する有用な支持材としては、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマーもしくはコポリマー、これらの組み合わせのいずれか、または一方の材料を別の材料にコーティングしたものが挙げられる。いくつかの事例では、ガラスとしては、ソーダ石灰ガラス、パイレックスガラス、バイコールガラス、石英ガラス、シリコンまたはこれらの誘導体などが挙げられる。

【0847】

いくつかの事例では、プラスチック、または樹枝状ポリマーを含むポリマーとしては、ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（酢酸ビニル－無水マレイン酸）、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンイミン、またはこれらの誘導体などが挙げられる。いくつかの事例では、コポリマーとしては、ポリ（酢酸ビニル－ｃｏ－無水マレイン酸）、ポリ（スチレン－ｃｏ－無水マレイン酸）、ポリ（エチレン－ｃｏ－アクリル酸）、またはこれらの誘導体などが挙げられる。

【0848】

本明細書に記載されているようにして調製した心臓細胞の有効性は、動物モデルにおいて心臓凍結障害について評価でき、この凍結障害により、治療しなければ、左心室壁組織の５５％が瘢痕組織となる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６２：６５４，１９９６、Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ，Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．８：２０７４，１９９９、Ｓａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１８：７１５，１９９９）。治療の成功により、瘢痕の面積が低減し、瘢痕の拡大が限定され、収縮期圧、拡張期圧及び最大圧によって求めた場合の心臓機能が改善することができる。心外傷は、左前下行枝の遠位部において塞栓コイルを用いてモデル化することもでき（Ｗａｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．７：２３９，１９９８）、治療の有効性は、組織学的検査及び心臓機能によって評価することができる。

【0849】

いくつかの実施形態では、操作心臓細胞集団、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた心臓細胞を操作したものを培養下で維持し、いくつかの事例では、投与の前に増加させる。ある特定の実施形態では、その心臓細胞集団は、投与の前に凍結保存する。

【0850】

いくつかの実施形態では、本発明の技術は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原）の発現の低下または発現の欠失が見られ、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる操作心臓細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた心臓細胞を操作したものに対するものである。ある特定の実施形態では、その操作心臓細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その操作心臓細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、操作心臓細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子という遺伝子のうちの１つ以上を破壊するゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。

【0851】

いくつかの実施形態では、提供する操作心臓細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作心臓細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた心臓細胞を操作したものは、患者（例えば、投与されたレシピエント）において免疫応答を活性化しない。提供するのは、本明細書に記載の操作心臓細胞の集団を、その治療が必要な対象（例えばレシピエント）または患者に投与することによって、疾患を治療する方法である。

【0852】

いくつかの実施形態では、その投与は、その対象の心臓組織への埋入、静脈内注射、動脈内注射、冠動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、心筋内注射、経心内膜注射、経心外膜注射または注入を含む。

【0853】

いくつかの実施形態では、その操作心臓細胞を投与される患者に、心臓薬も投与する。併用療法で用いるのに適する心臓薬の例示的な例としては、成長因子、成長因子をコードするポリヌクレオチド、血管新生剤、カルシウムチャネル遮断薬、血圧降下剤、有糸分裂阻害剤、強心剤、抗動脈硬化剤、抗凝固剤、β遮断薬、抗不整脈剤、抗炎症剤、血管拡張剤、血栓溶解剤、強心配糖体、抗生物質、抗ウイルス剤、抗真菌剤、原虫を阻害する薬剤、硝酸塩、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、抗新生物剤、ステロイドなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0854】

本発明で提供する方法による療法の効果は、様々な方法でモニタリングできる。例えば、心電図（ＥＣＧ）またはホルターモニターを利用して、治療の有効性を求めることができる。ＥＣＧは、心臓のリズム及び電気インパルスの尺度であり、療法により、対象の心臓における電気伝導が改善もしくは維持されるか、抑えられるか、またはその電気伝導の低下が遅くなるかを求めるのに非常に有効かつ非侵襲的な方法である。心臓の異常、不整脈障害などをモニタリングするために、長時間にわたって装着できる携帯型ＥＣＧであるホルターモニターの使用も、療法の有効性を評価するための確実な方法である。ＥＣＧまたは核医学検査を用いて、心室機能の改善を判断することができる。

【0855】

Ｈ．神経細胞
本発明で提供するのは、記載されているように、操作多能性細胞（例えばｉＰＳＣ）から分化させた様々な神経細胞種であって、後でレシピエント対象に移植または生着させるのに有用である神経細胞種である。当業者には理解されるように、その分化方法は、既知の技法を用いて、所望の細胞種によって決まる。例示的な神経細胞種としては、脳内皮細胞、ニューロン（例えばドーパミン作動性ニューロン）、グリア細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0856】

いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞の分化は、所定の細胞系列（複数可）を生み出すことが知られている所定の因子に細胞を暴露または接触させることによって行って、その分化により、目的とする所定の望ましい系列及び／または細胞種が得られるようにする。いくつかの実施形態では、最終分化細胞では、特有の表現型の特性または特徴が見られる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の幹細胞は、神経外胚葉細胞、ニューロン、神経内分泌細胞、ドーパミン作動性細胞、コリン作動性細胞、セロトニン作動性（５－ＨＴ）細胞、グルタミン酸作動性細胞、ＧＡＢＡ作動性細胞、アドレナリン作動性細胞、ノルアドレナリン作動性細胞、交感神経細胞、副交感神経細胞、末梢交感神経細胞またはグリア細胞の集団に分化させる。いくつかの事例では、そのグリア細胞集団としては、ミクログリア（例えば、アメーバ状細胞、分岐状細胞、活性化食細胞及び活性化非食細胞）の集団、またはマクログリア（中枢神経系細胞、すなわち、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞及び放射状グリア、ならびに末梢神経系細胞、すなわち、シュワン細胞及び衛星細胞）の集団、あるいは上記細胞のうちのいずれかの前駆体及び前駆細胞が挙げられる。

【0857】

様々な種類の神経細胞を生成するためのプロトコルは、国際公開第ＷＯ２０１０１４４６９６号、米国特許第９，０５７，０５３号、同第９，３７６，６６４号及び同第１０，２３３，４２２号に記載されている。低免疫原性多能性細胞を分化させる方法の追加の説明は、例えば、Ｄｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１９，３７，２５２－２５８及びＨａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１９，１１６（２１），１０４４１－１０４４６に見ることができる。神経障害または神経病態の動物モデルで神経細胞移植の効果を求める方法は、脊髄損傷についてはＣｕｒｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０１８，２２，９４１－９５０、パーキンソン病についてはＫｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５４８：５９２－５９６、ＡＬＳについてはＩｚｒａｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１８，９（１）：１５２及びＩｚｒａｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＩｎｔｅｃｈＯｐｅｎ，ＤＯＩ：１０．５７７２／ｉｎｔｅｃｈｏｐｅｎ．７２８６２、てんかんについてはＵｐａｄｈｙａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，２０１９，１１６（１）：２８７－２９６という参照文献に記載されている。

【0858】

いくつかの実施形態では、操作神経細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた神経細胞を操作したものの集団は、培養下で維持し、いくつかの事例では、投与の前に増加させる。ある特定の実施形態では、その神経細胞集団は、投与の前に凍結保存する。

【0859】

いくつかの実施形態では、本発明の技術は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原）の発現の低下または発現の欠失が見られ、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる操作神経細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた神経細胞を操作したものに対するものである。ある特定の実施形態では、その操作神経細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その操作神経細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、ＣＩＩＴＡ遺伝子にゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、操作神経細胞は、寛容原性因子（例えばＣＤ４７）を過剰発現し、Ｂ２Ｍ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子という遺伝子のうちの１つ以上を破壊するゲノム改変を有し、（ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢにゲノム改変を有することを介するなどして）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下が見られる。

【0860】

いくつかの実施形態では、提供する操作神経細胞は、免疫認識を回避する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作神経細胞、例えば、１人以上の個別のドナー（例えば健常ドナー）に由来するｉＰＳＣから分化させた神経細胞を操作したものは、患者（例えば、投与されたレシピエント）において免疫応答を活性化しない。提供するのは、本明細書に記載の操作神経細胞の集団を、その治療が必要な対象（例えばレシピエント）または患者に投与することによって、疾患を治療する方法である。

【0861】

いくつかの実施形態では、神経細胞は、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、他の神経変性疾患または神経変性病態、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、うつ病、他の神経精神障害を治療するために、対象に投与する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の神経細胞は、脳卒中を治療または改善するために、対象に投与する。いくつかの実施形態では、そのニューロン及びグリア細胞は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である対象に投与する。

【0862】

１）脳内皮細胞
いくつかの実施形態では、脳内皮細胞（ＥＣ）、その前駆体及び前駆細胞は、脳ＥＣまたは神経細胞の生成を促す１つ以上の因子を含む培地中で、多能性幹細胞（例えば人工多能性幹細胞）を培養することによって、その多能性幹細胞から表面上で分化させる。いくつかの事例では、その培地は、ＣＨＩＲ－９９０２１、ＶＥＧＦ、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）及びＹ－２７６３２のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、その培地は、神経細胞の生存及び機能を促すように設計された補助剤を含む。

【0863】

いくつかの実施形態では、脳内皮細胞（ＥＣ）、その前駆体及び前駆細胞は、多能性幹細胞を非馴化培地または馴化培地中で培養することによって、その多能性幹細胞から表面上で分化させる。いくつかの事例では、その培地は、分化を促進または助長する因子または小分子を含む。いくつかの実施形態では、その培地は、ＶＥＧＲ、ＦＧＦ、ＳＤＦ－１、ＣＨＩＲ－９９０２１、Ｙ－２７６３２、ＳＢ４３１５４２及びこれらの組み合わせのいずれかからなる群から選択した１つ以上の因子または小分子を含む。いくつかの実施形態では、分化用の表面は、１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質を含む。その表面は、その１つ以上の細胞外マトリックスタンパク質でコーティングできる。その細胞は、懸濁液中で分化させてから、ゲルマトリックス形態、例えば、マトリゲル、ゼラチンまたはフィブリン／トロンビンの形態に投入して、細胞の生存を促すことができる。いくつかの事例では、分化は、当該技術分野で知られているように、概して、細胞特異的マーカーの存在を評価することによってアッセイする。

【0864】

いくつかの実施形態では、その脳内皮細胞は、ＣＤ３１、ＶＥカドヘリン及びそれらの組み合わせからなる群から選択した因子を発現または分泌する。ある特定の実施形態では、その脳内皮細胞は、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）、ＣＤ１４６、ＣＸＣＲ４、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ－１、ＰＤＧＦ、ＧＬＵＴ－１、ＰＥＣＡＭ－１、ｅＮＯＳ、クローディン－５、オクルディン、ＺＯ－１、ｐ－糖タンパク質、フォン・ヴィレブランド因子、ＶＥ－カドヘリン、低密度リポタンパク質受容体ＬＤＬＲ、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１、ＬＲＰ１、インスリン受容体ＩＮＳＲ、レプチン受容体ＬＥＰＲ、基底細胞接着分子ＢＣＡＭ、トランスフェリン受容体ＴＦＲＣ、最終糖化産物特異的受容体ＡＧＥＲ、レチノール取り込み受容体ＳＴＲＡ６、大型中性アミノ酸トランスポーター小サブユニット１ ＳＬＣ７Ａ５、興奮性アミノ酸トランスポーター３ ＳＬＣ１Ａ１、ナトリウム共役型中性アミノ酸トランスポーター５ ＳＬＣ３８Ａ５、溶質キャリアファミリー１６メンバー１ ＳＬＣ１６Ａ１、ＡＴＰ依存性トランスロカーゼＡＢＣＢ１、ＡＴＰ－ＡＢＣＣ２結合カセットトランスポーターＡＢＣＧ２、多剤耐性関連タンパク質１ ＡＢＣＣ１、小管多特異性有機アニオントランスポーター１ ＡＢＣＣ２、多剤耐性関連タンパク質４ ＡＢＣＣ４及び多剤耐性関連タンパク質５ ＡＢＣＣ５からなる群から選択した因子の１つ以上を発現または分泌する。

【0865】

いくつかの実施形態では、その脳ＥＣは、タイトジャンクションの高発現、高電気抵抗、窓形成の低さ、小さな血管周囲腔、インスリン受容体及びトランスフェリン受容体の高分布率、ならびに多数のミトコンドリアからなる群から選択した特徴のうちの１つ以上を特徴とする。

【0866】

いくつかの実施形態では、脳ＥＣは、ポジティブ選択の方策を用いて選択または精製する。いくつかの事例では、その脳ＥＣは、内皮細胞マーカー（ＣＤ３１などであるが、これに限定されない）によって選別する。換言すると、ＣＤ３１陽性の脳ＥＣを単離する。いくつかの実施形態では、脳ＥＣは、ネガティブ選択の方策を用いて選択または精製する。いくつかの実施形態では、多能性マーカー（ＴＲＡ－１－６０及びＳＳＥＡ－１が挙げられるが、これらに限定されない）を発現する細胞について選択することによって、未分化細胞または多能性幹細胞を除去する。

【0867】

いくつかの実施形態では、脳内皮細胞を投与して、脳出血の症状または影響を緩和する。いくつかの実施形態では、ドーパミン作動性ニューロンをパーキンソン病患者に投与する。いくつかの実施形態では、ノルアドレナリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性介在ニューロンを、てんかん発作歴のある患者に投与する。いくつかの実施形態では、運動ニューロン、介在ニューロン、シュワン細胞、オリゴデンドロサイト及びミクログリアを、脊髄損傷歴のある患者に投与する。

【0868】

２）ドーパミン作動性ニューロン
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＨＩＰ細胞は、ニューロン幹細胞、ニューロン前駆細胞、未成熟ドーパミン作動性ニューロン及び成熟ドーパミン作動性ニューロンを含むドーパミン作動性ニューロンに分化させる。

【0869】

いくつかの事例では、「ドーパミン作動性ニューロン」という用語には、ドーパミン合成のための律速酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現する神経細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、ドーパミン作動性ニューロンは、神経伝達物質ドーパミンを分泌し、ドーパミンヒドロキシラーゼをほとんどまたは全く発現しない。ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンは、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、１－芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ、小胞モノアミントランスポーター２、ドーパミントランスポーター、Ｎｕｒｒ－ｌ及びドーパミン－２受容体（Ｄ２受容体）というマーカーのうちの１つ以上を発現することができる。ある特定の事例では、「神経幹細胞」という用語には、神経細胞経路に沿って部分的に分化しているとともに、例えばネスチンを含む１つ以上の神経マーカーを発現する多能性細胞の集団が含まれる。神経幹細胞は、ニューロンまたはグリア細胞（例えば、アストロサイト及びオリゴデンドロサイト）に分化させてよい。「神経前駆細胞」という用語には、ＦＯＸＡ２及び低レベルのｂ－チューブリンは発現するが、チロシンヒドロキシラーゼは発現しない培養細胞が含まれる。このような神経前駆細胞には、適切な因子、例えば、本明細書に記載の因子を培養すると、様々なニューロンサブタイプ、特に、様々なドーパミン作動性のニューロンサブタイプに分化する能力がある。

【0870】

いくつかの実施形態では、ＨＩＰ細胞に由来するＤＡニューロンを、患者、例えば、ヒト患者に投与して、神経変性疾患または神経変性病態を治療する。いくつかの事例では、その神経変性疾患または神経変性病態は、パーキンソン病、ハンチントン病及び多発性硬化症からなる群から選択する。別の実施形態では、そのＤＡニューロンを用いて、神経精神障害、例えば、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病及びうつ病の症状の１つ以上を治療または改善する。さらに別の実施形態では、そのＤＡニューロンを用いて、ＤＡニューロン障害患者を治療する。

【0871】

いくつかの実施形態では、ＤＡニューロン、その前駆体及び前駆細胞は、１つ以上の因子または添加剤を含む培地中で、多能性幹細胞を培養することによって、その幹細胞から分化させる。ＤＡニューロンの分化、成長、増加、維持及び／または成熟を促す有用な因子及び添加剤としては、Ｗｎｔｌ、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８、ＦＧＦ８ａ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、トランスフォーミング成長因子ａ（ＴＧＦ－ａ）、ＴＧＦ－ｂ、インターロイキン１β、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧＳＫ－３阻害剤（例えばＣＨＩＲ－９９０２１）、ＴＧＦ－ｂ阻害剤（例えばＳＢ－４３１５４２）、Ｂ－２７サプリメント、ドルソモルフィン、プルモルファミン、ノギン、レチノイン酸、ｃＡＭＰ、アスコルビン酸、ニュールツリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、Ｎ－アセチルシステイン、ｃ－ｋｉｔリガンド、これらの改変形態、これらの模倣体、これらの類似体及びこれらのバリアントが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、そのＤＡニューロンは、ＷＮＴ経路、ＮＯＴＣＨ経路、ＳＨＨ経路、ＢＭＰ経路、ＦＧＦ経路などを活性化または阻害する１つ以上の因子の存在下で分化させる。分化プロトコル及びその詳細な説明は、例えば、ＵＳ９，９６８，６３７、ＵＳ７，６７４，６２０、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８，５０－５６、Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，２００２，９９（４），２３４４－２３４９、Ｇｒｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１６，５（９）：１１３３－４４及びＣｈｏ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，２００８，１０５：３３９２－３３９７に示されており、これらの開示内容は、その全体が、実施例、方法、図及び結果の詳細な説明を含め、参照により本明細書に援用される。

【0872】

いくつかの実施形態では、低免疫原性ドーパミン作動性ニューロン集団は、非神経細胞から単離する。いくつかの実施形態では、単離した低免疫原性ドーパミン作動性ニューロン集団は、投与の前に増加させる。ある特定の実施形態では、単離した低免疫原性ドーパミン作動性ニューロン集団は、投与の前に増加させて、凍結保存する。

【0873】

ＤＡの分化の特徴付け及びモニタリングを行い、そのＤＡの表現型を評価するために、いずれかの数の分子マーカー及び遺伝子マーカーの発現を評価できる。例えば、遺伝子マーカーの存在は、当業者に知られている様々な方法によって求めることができる。分子マーカーの発現は、以下に限定されないが、ｑＰＣＲベースのアッセイ、イムノアッセイ、免疫細胞化学アッセイ、イムノブロッティングアッセイなどの定量法によって求めることができる。ＤＡニューロンに対する例示的なマーカーとしては、ＴＨ、ｂ－チューブリン、ペアードボックスタンパク質（Ｐａｘ６）、インスリン遺伝子エンハンサータンパク質（Ｉｓｌ１）、ネスチン、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、Ｇタンパク質活性化型内向き整流カリウムチャネル２（ＧＩＲＫ２）、微小管関連タンパク質２（ＭＡＰ－２）、ＮＵＲＲ１、ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＦＯＸ３、ダブルコルチン及びＬＩＭホメオボックス転写因子ｌ－β（ＬＭＸ１Ｂ）などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、そのＤＡニューロンは、コリン、ＦＯＸＡ２、ＴｕＪ１、ＮＵＲＲ１及びこれらの組み合わせのいずれかから選択したマーカーの１つ以上を発現する。

【0874】

いくつかの実施形態では、ＤＡニューロンは、細胞の電気生理学的活性に従って評価する。その細胞の電気生理学的性質は、当業者に知られているアッセイを用いることによって評価できる。例えば、全細胞及び穿孔パッチクランプ法、細胞の電気生理学的活性を検出するためのアッセイ、細胞の活動電位の大きさ及び持続期間を測定するためのアッセイ、ならびにＤＡ細胞のドーパミン産生を検出するための機能アッセイである。

【0875】

いくつかの実施形態では、ＤＡニューロンの分化は、自発的かつ律動的な活動電位、及び脱分極性電流を加えると、スパイク頻度順応を伴う高頻度の活動電位を特徴とする。別の実施形態では、ＤＡの分化は、ドーパミンの産生を特徴とする。ドーパミンの産生レベルは、活動電位が最大振幅の半分に達した時点での活動電位の幅（スパイク半値幅）を測定することによって算出する。

【0876】

いくつかの実施形態では、その分化させたＤＡニューロンは、患者において、静脈内移植または特定の部位での注射によるかのいずれかで移植する。いくつかの実施形態では、その分化させたＤＡ細胞は、脳の黒質（特に、その緻密部内もしくはその緻密部の隣接部）、腹側被蓋野（ＶＴＡ）、尾状核、被殻、側坐核、視床下核またはこれらの組み合わせのいずれかに移植して、パーキンソン病をもたらした変性が見られるＤＡニューロンを補充する。その分化させたＤＡ細胞は、細胞懸濁液として標的領域に注射できる。あるいは、その分化させたＤＡ細胞は、支持マトリックスまたは足場に含めるときには、そのような送達デバイスに埋め込むことができる。いくつかの実施形態では、その足場は、生分解性である。別の実施形態では、その足場は、生分解性ではない。その足場は、天然または合成（人工）の材料を含むことができる。

【0877】

そのＤＡニューロンの送達は、適切なビヒクル（リポソーム、微粒子またはマイクロカプセルなどであるが、これらに限定されない）を用いることによって行うことができる。別の実施形態では、その分化させたＤＡニューロンは、等張賦形剤を含む医薬組成物で投与する。その医薬組成物は、ヒトへ投与するのに十分に滅菌される条件下で調製する。いくつかの実施形態では、ＨＩＰ細胞から分化させたＤＡニューロンは、医薬組成物の形態で供給する。細胞組成物の治療用製剤の一般的原理は、Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ ＆ Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ ｅｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６及びＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ ＆ Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００に見られ、これらの開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0878】

幹細胞に由来するニューロンの有用な説明及びその作製方法は、例えば、Ｋｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ，２０１２，１：７０３－７１４、Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４８０：５４７－５５１、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１８，１１（１）：１７１－１８２、Ｌｏｒｅｎｚ Ｓｔｕｄｅｒ，“Ｃｈａｐｔｅｒ ８－Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｂｒｉｎｇｉｎｇ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｄｏｐａｍｉｎｅ Ｎｅｕｒｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃ－Ｔｈｅ ＮＹＳＴＥＭ Ｔｒｉａｌ”ｉｎ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１７，ｖｏｌｕｍｅ ２３０，ｐｇ．１９１－２１２、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２０１３，８：１６７０－１６７９、Ｕｐａｄｈｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，３８，２Ｄ．７．１－２Ｄ．７．４７、米国特許出願公開第２０１６０１１５４４８号、ならびにＵＳ８，２５２，５８６、ＵＳ８，２７３，５７０、ＵＳ９，４８７，７５２及びＵＳ１０，０９３，８９７に見ることができ、これらの内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0879】

ＤＡニューロンに加えて、他の神経細胞、その前駆体及び前駆細胞は、１つ以上の因子または添加剤を含む培地中で、本明細書に概説されているＨＩＰ細胞を培養することによって、その細胞から分化させることができる。因子及び添加剤の非限定的な例としては、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、Ｂ２７、塩基性ＦＧＦ、塩基性ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＣＮＴＦ、ＳＭＡＤ阻害剤、Ｗｎｔアンタゴニスト、ＳＨＨシグナル伝達活性化剤及びこれらの組み合わせのいずれかが挙げられる。いくつかの実施形態では、そのＳＭＡＤ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ－１９３１８９、ノギンＰＤ１６９３１６、ＳＢ２０３５８０、ＬＹ３６４９４７、Ａ７７－０１、Ａ－８３－０１、ＢＭＰ４、ＧＷ７８８３８８、ＧＷ６６０４、ＳＢ－５０５１２４、レルデリムマブ、メテリムマブ、ＧＣ－Ｉ００８、ＡＰ－１２００９、ＡＰ－１１０Ｉ４、ＬＹ５５０４１０、ＬＹ５８０２７６、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ２１０９７６１、ＳＢ－５０５１２４、Ｅ－６１６４５２（ＲｅｐＳｏｘ ＡＬＫ阻害剤）、ＳＤ－２０８、ＳＭＩ６、ＮＰＣ－３０３４５、Ｋ２６８９４、ＳＢ－２０３５８０、ＳＤ－０９３、アクチビン－Ｍ１０８Ａ、Ｐ１４４、可溶性ＴＢＲ２－Ｆｃ、ＤＭＨ－１、ドルソモルフィン二塩酸塩及びこれらの誘導体からなる群から選択する。いくつかの実施形態では、そのＷｎｔアンタゴニストは、ＸＡＶ９３９、ＤＫＫ１、ＤＫＫ－２、ＤＫＫ－３、ＤＫＫ－４、ＳＦＲＰ－１、ＳＦＲＰ－２、ＳＦＲＰ－３、ＳＦＲＰ－４、ＳＦＲＰ－５、ＷＩＦ－１、Ｓｏｇｇｙ、ＩＷＰ－２、ＩＷＲ１、ＩＣＧ－００１、ＫＹ０２１１、Ｗｎｔ－０５９、ＬＧＫ９７４、ＩＷＰ－Ｌ６及びこれらの誘導体からなる群から選択する。いくつかの実施形態では、そのＳＨＨシグナル伝達活性化剤は、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）、ＳＡＧ類似体、ＳＨＨ、Ｃ２５－ＳＨＨ、Ｃ２４－ＳＨＨ、プルモルファミン、Ｈｇ－Ａｇ及び／またはこれらの誘導体からなる群から選択する。

【0880】

いくつかの実施形態では、そのニューロンは、グルタミン酸イオンチャネル型受容体ＮＭＤＡ型サブユニット１ ＧＲＩＮ１、グルタミン酸デカルボキシラーゼ１ ＧＡＤ１、γ－アミノ酪酸ＧＡＢＡ、チロシンヒドロキシラーゼＴＨ、ＬＩＭホメオボックス転写因子１－α ＬＭＸ１Ａ、フォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１ ＦＯＸＯ１、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２ ＦＯＸＡ２、フォークヘッドボックスタンパク質Ｏ４ ＦＯＸＯ４、ＦＯＸＧ１、２’，３’－環状ヌクレオチド３’－ホスホジエステラーゼＣＮＰ、ミエリン塩基性タンパク質ＭＢＰ、チューブリンβ鎖３ ＴＵＢ３、チューブリンβ鎖３ ＮＥＵＮ、溶質キャリアファミリー１メンバー６ ＳＬＣ１Ａ６、ＳＳＴ、ＰＶ、カルビンジン、ＲＡＸ、ＬＨＸ６、ＬＨＸ８、ＤＬＸ１、ＤＬＸ２、ＤＬＸ５、ＤＬＸ６、ＳＯＸ６、ＭＡＦＢ、ＮＰＡＳ１、ＡＳＣＬ１、ＳＩＸ６、ＯＬＩＧ２、ＮＫＸ２．１、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．２、ＶＧＬＵＴ１、ＭＡＰ２、ＣＴＩＰ２、ＳＡＴＢ２、ＴＢＲ１、ＤＬＸ２、ＡＳＣＬ１、ＣｈＡＴ、ＮＧＦＩ－Ｂ、ｃ－ｆｏｓ、ＣＲＦ、ＲＡＸ、ＰＯＭＣ、ヒポクレチン、ＮＡＤＰＨ、ＮＧＦ、Ａｃｈ、ＶＡＣｈＴ、ＰＡＸ６、ＥＭＸ２ｐ７５、ＣＯＲＩＮ、ＴＵＪ１、ＮＵＲＲ１及び／またはこれらの組み合わせのいずれかからなる群から選択したマーカーの１つ以上を発現する。

【0881】

３）グリア細胞
いくつかの実施形態では、記載されている神経細胞としては、以下に限定されないが、ミクログリア、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、上衣細胞及びシュワン細胞、そのグリア前駆体及びグリア前駆細胞などのグリア細胞が挙げられ、その神経細胞は、多能性幹細胞を治療上有効なグリア細胞などに分化させることによって作製する。低免疫原性多能性幹細胞の分化により、低免疫原性グリア細胞などの低免疫原性神経細胞を作製する。

【0882】

いくつかの実施形態では、グリア細胞、その前駆体及び前駆細胞は、レチノイン酸、ＩＬ－３４、Ｍ－ＣＳＦ、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＣＣＬ２、ＴＧＦβ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達阻害剤、ＳＨＨシグナル伝達活性化剤、ＦＧＦ、血小板由来成長因子ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦＲ－α、ＨＧＦ、ＩＧＦ１、ノギン、ＳＨＨ、ドルソモルフィン、ノギン及びこれらの組み合わせのいずれかからなる群から選択した１つ以上の作用物質を含む培地中で、多能性幹細胞を培養することによって生成する。ある特定の事例では、そのＢＭＰシグナル伝達阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、そのグリア細胞は、ＮＫＸ２．２、ＰＡＸ６、ＳＯＸ１０、脳由来神経栄養因子ＢＤＮＦ、ニューロトロフィン－３ ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＥＧＦ、毛様体神経栄養因子ＣＮＴＦ、神経成長因子ＮＧＦ、ＦＧＦ８、ＥＧＦＲ、ＯＬＩＧ１、ＯＬＩＧ２、ミエリン塩基性タンパク質ＭＢＰ、ＧＡＰ－４３、ＬＮＧＦＲ、ネスチン、ＧＦＡＰ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＸ３ＣＲ１、Ｐ２ＲＹ１２、ＩＢＡ－１、ＴＭＥＭ１１９、ＣＤ４５及びこれらの組み合わせのいずれかを発現する。例示的な分化培地は、当業者によって認識されているように、グリア細胞種の生成を容易または可能にし得るいずれかの所定の因子及び／または小分子を含むことができる。

【0883】

ｉｎ ｖｉｔｒｏ分化プロトコルに従って生成した細胞が、グリア細胞の特性及び特徴を示すかを判断するために、その細胞を動物モデルに移植できる。いくつかの実施形態では、そのグリア細胞は、免疫不全マウス、例えば免疫不全シバラーマウスに注射する。そのグリア細胞は、そのマウスの脳に投与し、あらかじめ選択した期間の後に、その生着細胞を評価する。いくつかの事例では、その脳内の生着細胞は、免疫染色法及びイメージング法を用いることによって可視化する。いくつかの実施形態では、そのグリア細胞が、既知のグリア細胞バイオマーカーを発現することを判断する。

【0884】

グリア細胞、その前駆体及び前駆細胞を幹細胞から生成する有用な方法は、例えば、ＵＳ７，５７９，１８８、ＵＳ７，５９５，１９４、ＵＳ８，２６３，４０２、ＵＳ８，２０６，６９９、ＵＳ８，２５２，５８６、ＵＳ９，１９３，９５１、ＵＳ９，８６２，９２５、ＵＳ８，２２７，２４７、ＵＳ９，７０９，５５３、ＵＳ２０１８／０１８７１４８、ＵＳ２０１７／０１９８２５５、ＵＳ２０１７／０１８３６２７、ＵＳ２０１７／０１８２０９７、ＵＳ２０１７／２５３８５６、ＵＳ２０１８／０２３６００４、ＷＯ２０１７／１７２９７６及びＷＯ２０１８／０９３６８１に見られる。多能性幹細胞を分化させる方法は、例えば、Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７，５４８，５９２－５９６、Ｋｒｉｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，５４７－５５１、Ｄｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１４，２，３３７－５０、Ｐｅｒｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２００４，１０１，１２５４３－１２５４８、Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００９，２７，２７５－２８０及びＫｉｒｋｅｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１２，１，７０３－７１４に記載されている。

【0885】

脊髄損傷に対する神経細胞移植の有効性は、ＭｃＤｏｎａｌｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９９，５：１４１０及びＫｉｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００２，４１８：５０によって記載されているように、例えば、急性脊髄損傷のラットモデルで評価できる。例えば、移植が成功すると、２～５週間後、病変に存在する移植由来細胞が見られ、その細胞は、アストロサイト、オリゴデンドロサイト及び／またはニューロンに分化し、病変端部から脊髄に沿って移動し、歩行、協調性及び体重負荷が改善することがある。具体的な動物モデルは、治療対象の神経細胞種及び神経疾患または神経病態に基づいて選択する。

【0886】

その神経細胞は、意図した組織部位にそれらの細胞を生着させるとともに、機能不全の領域を再構成または再生させる方式で投与できる。例えば、神経細胞は、治療している疾患に従って、中枢神経系の実質部位または髄腔内部位に直接移植できる。いくつかの実施形態では、脳内皮細胞、ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、上衣細胞、アストロサイト、ミクログリア細胞、オリゴデンドロサイト及びシュワン細胞を含め、本明細書に記載の神経細胞のいずれかを、患者に、静脈内注射、脊髄内注射、脳室内注射、髄腔内注射、動脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹部内注射、眼内注射、眼球後注射及びこれらの組み合わせによって注射する。いくつかの実施形態では、その細胞は、ボーラス注射または持続注入の形態で注射するか、または堆積させる。ある特定の実施形態では、その神経細胞は、注射によって、脳、脳に適する部分及びそれらの組み合わせに投与する。その注射は、例えば、その対象の頭蓋に形成した穿頭孔を通じて行うことができる。神経細胞を脳に投与するのに適する部位としては、脳の脳室、側脳室、大槽、被殻、基底核、海馬皮質、線条体、尾状核部及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0887】

ドーパミン作動性ニューロンを含め、本発明の技術で用いるための神経細胞の追加の説明は、ＷＯ２０２０／０１８６１５に見られ、その開示内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0888】

４．ＡＢＯ血液型及びＲＨ抗原発現
血液製剤は、ヒトの体内のすべての赤血球細胞の表面上の抗原の有無に従って、異なる型に分類できる（ＡＢＯ血液型）。Ａ抗原、Ｂ抗原、ＡＢ抗原及びＡｌ抗原は、赤血球の糖タンパク質上の糖鎖の配列によって判断する。血液型抗原群の遺伝子により、抗原タンパク質産生のための指示が与えられる。血液型抗原タンパク質は、赤血球細胞の細胞膜内で様々な機能を果たす。これらのタンパク質の機能としては、他のタンパク質及び分子を細胞の内外に輸送すること、細胞の構造を維持すること、他の細胞及び分子に結合すること、ならびに化学反応に関与することが挙げられる。

【0889】

Ｒｈ因子（Ｒｈ）血液型は、ＡＢＯ血液型システムに続き、２番目に重要な血液型システムである。Ｒｈ血液型システムは、確定した４９個の血液型抗原からなり、その中でも、Ｄ、Ｃ、ｃ、Ｅ及びｅという５つの抗原が特に重要である。通常、個体のＲｈ（Ｄ）の状態は、ＡＢＯ型の後にプラスまたはマイナスという添え字で記載する。「Ｒｈ因子」、「Ｒｈプラス」及び「Ｒｈマイナス」という用語は、Ｒｈ（Ｄ）抗原のみを指す。Ｒｈ抗原に対する抗体は、溶血性輸血反応に関与し得るとともに、Ｒｈ（Ｄ）抗原及びＲｈ（ｃ）抗原に対する抗体により、胎児・新生児溶血性疾患のリスクが大きくなる。ＡＢＯ抗体は、いずれのヒトにおいても幼少期に発生する。しかしながら、Ｒｈ－のヒトにおけるｒｈ抗体は典型的には、そのヒトが感作を受けるた場合のみに発生する。ｒｈ抗体は、例えば、Ｒｈ＋の新生児を出産するか、またはＲｈ＋の血液の輸血を受けることによって発生し得る。

【0890】

Ａ抗原、Ｂ抗原、Ｈ抗原及びＲｈ抗原は、血液移植、組織移植及び細胞移植の際の、ドナーとレシピエントとの組織適合性の主要な決定因子である。ＡＢＯ遺伝子によってコードされる糖転移酵素の活性は、Ａ型、Ｂ型、ＡＢ型、Ｏ型の組織血液型抗原の産生に関与しており、この酵素は、細胞表面に提示される。Ａ型の個体は、ａ（１，３）Ｎ－アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性をもたらすＡＢＯ遺伝子産物を特異的にコードし、Ｂ型の個体は、ａ（ｌ，３）ガラクトサミニルトランスフェラーゼ活性をもたらすＡＢＯ遺伝子産物を特異的にコードする。Ｏ型の個体は、機能的なガラクトサミニルトランスフェラーゼをまったく産生しないので、いずれの修飾も行われない。ＡＢ型の個体は、それぞれを１コピー有し、両方の種類の修飾が行われる。ＡＢＯ遺伝子の酵素産物は、基質としてのＨ抗原に対して作用するので、ＡＢＯ活性を欠失しているＯ型の個体は、未修飾のＨ抗原を呈し、したがって、Ｏ（Ｈ）型と称される場合が多い。

【0891】

Ｈ抗原自体は、ａ（ｌ，２）フコシルトランスフェラーゼという酵素の産物であり、この酵素は、ＦＵＴＩ遺伝子によってコードされる。非常に稀な個体では、ＦＵＴＩ遺伝子が破壊されている結果、Ｈ抗原をまったく有さず、ＡＢＯ式においては、Ａ型またはＢ型の組織血液型をもたらす基質が存在しなくなる。これらの個体は、ボンベイ型の組織血液型と言われる。Ｒｈ抗原は、ＲＨＤ遺伝子によってコードされ、Ｒｈマイナスである個体は、ＲＨＤ遺伝子が欠失または破壊されている。

【0892】

いくつかの実施形態では、本発明で提供する細胞または細胞集団は、Ｏ型ＡＢＯ型かつＲｈ因子陰性である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、Ｏ型ＡＢＯ型かつＲｈ因子陰性の細胞は、Ｏ型ＡＢＯ型かつＲｈ因子陰性のドナーに由来する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている、Ｏ型ＡＢＯ型かつＲｈ因子陰性の細胞は、Ａ型ＡＢＯ型、Ｂ型ＡＢＯ型またはＲｈ因子の抗原の提示が行われないように操作されている。いくつかの実施形態では、Ｏ型ＡＢＯ型及び／またはＲｈマイナスの細胞は、（例えば、ＡＢＯ遺伝子の有害な変異によって、もしくはＡＢＯ遺伝子のエクソン６に２５８ｄｅｌＧという変異を挿入することによって）ＡＢＯ遺伝子の部分的不活性化もしくは完全不活性化を含み、及び／またはＲＨＤ遺伝子の発現が、ＲＨＤ遺伝子の有害変異によって部分的または完全に不活性化されている。いくつかの実施形態では、Ｏ型ＡＢＯ型かつＲｈマイナスの細胞は、ＦＵＴ１遺伝子の部分的不活性化もしくは完全不活性化を含み、及び／またはＲＨＤ遺伝子の発現が、ＲＨＤ遺伝子の有害変異によって部分的または完全に不活性化されている。いくつかの実施形態では、Ｏ型ＡＢＯ型及び／またはＲｈ因子陰性の操作細胞は、例えば、Ａ型細胞をＯ型細胞に、Ｂ型細胞をＯ型細胞に、ＡＢ型細胞をＯ型細胞に、Ａ＋型細胞をＯ－型細胞に、Ａ－型細胞をＯ－型細胞に、ＡＢ＋型細胞をＯ－型細胞に、ＡＢ－型細胞をＯ－型細胞に、Ｂ＋細胞をＯ－型細胞に、及びＢ－型細胞をＯ－型細胞に改変する遺伝子編集を用いて生成する。例示的なＯ型ＡＢＯ型かつＲｈ因子陰性の操作細胞及びその細胞の生成方法は、ＷＯ２０２１／１４６２２２に記載されており、その内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0893】

５．性染色体
ある特定の態様では、性染色体を有する細胞は、ある特定の抗原（例えばＹ抗原）を発現でき、レシピエントは、このような抗原に対して既存の感受性を有する。例えば、いくつかの実施形態では、男児を妊娠している女性は、男性ドナー由来の細胞を拒絶し得る。したがって、いくつかの実施形態では、そのドナーは男性であり、そのレシピエントは男性である。いくつかの実施形態では、そのドナーは女性であり、そのレシピエントは女性である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、プロトカドヘリンＹ及び／またはニューロリギンＹなどの抗原の発現を低下させる改変を含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞において、プロトカドヘリンＹをコードする遺伝子（ＰＣＤＨ１１Ｙ、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＧ００００００９９７１５）が、減少または除去、例えばノックアウトされている。いくつかの実施形態では、その操作細胞において、ニューロリギンＹをコードする遺伝子（ＮＬＧＮ４Ｙ、Ｅｎｓｅｍｂｌ ＩＤ ＥＮＳＧ０００００１６５２４６）が、減少または除去、例えばノックアウトされている。遺伝子の発現を低下または消失させるいずれかの方法、例えば、本明細書に記載のいずれかを用いることができる。いくつかの実施形態では、ＰＣＤＨ１１Ｙ及び／またはＮＬＧＮ４Ｙは、その操作細胞において、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集方法によって、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、減少または除去されている。

【0894】

Ｄ．操作細胞の例示的な実施形態
いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７の発現の増加、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７の発現の増加、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７の発現の増加、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その操作初代細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。

【0895】

いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７の発現の増加、ならびにＢ２Ｍの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７の発現の増加、ならびにＣＩＩＴＡの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７の発現の増加、ならびにＮＬＲＣ５の発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのうちの１つ以上の分子の発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ及びＮＬＲＣ５のうちの１つ以上の分子の発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７の発現の増加、ならびにＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５のうちの１つ以上の分子の発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５のうちの１つ以上の分子の発現の低下が見られる。本明細書に記載の細胞のいずれかは、以下に限定されないが、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ３５、ＣＤ５２、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ及びＨ２－Ｍ３（これらの組み合わせのいずれかを含む）を含む群から選択した１つ以上の因子の発現も増加していることができる。いくつかの実施形態では、その因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８（これらの組み合わせのいずれかを含む）のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その操作初代細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。

【0896】

いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７及び少なくとも１つの他の寛容原性因子の発現の増加、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７及び少なくとも１つの他の寛容原性因子の発現の増加、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７及び少なくとも１つの他の寛容原性因子の発現の増加、ならびに１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７及び少なくとも１つの他の寛容原性因子の発現の増加、ならびにＢ２Ｍの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７及び少なくとも１つの他の寛容原性因子の発現の増加、ならびにＣＩＩＴＡの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７及び少なくとも１つの他の寛容原性因子の発現の増加、ならびにＮＬＲＣ５の発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７及び少なくとも１つの他の寛容原性因子の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ及びＣＩＩＴＡのうちの１つ以上の分子の発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７及び少なくとも１つの他の寛容原性因子の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ及びＮＬＲＣ５のうちの１つ以上の分子の発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７及び少なくとも１つの他の寛容原性因子の発現の増加、ならびにＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５のうちの１つ以上の分子の発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現の低下、ＣＤ４７及び少なくとも１つの他の寛容原性因子の発現の増加、ならびにＢ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＮＬＲＣ５のうちの１つ以上の分子の発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、寛容原性因子としては、以下に限定されないが、ＤＵＸ４、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ３５、ＣＤ５２、ＣＤ１６、ＣＤ５２、ＣＤ４７、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯ１、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ３５、ＩＬ－３９、ＣＤ１６ Ｆｃ受容体、ＩＬ１５－ＲＦ及びＨ２－Ｍ３（これらの組み合わせのいずれかを含む）を含む群からのいずれかが挙げられる。いくつかの実施形態では、その寛容原性因子は、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦａｓＬ、Ｓｅｒｐｉｎｂ９、ＣＤ２００及びＭｆｇｅ８（これらの組み合わせのいずれかを含む）の１つ以上である。いくつかの実施形態では、その細胞及びその集団は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下が見られる。いくつかの実施形態では、その操作初代細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。

【0897】

当業者であれば、発現レベル、例えば、遺伝子、タンパク質または分子の発現の増加または低下は、同等の細胞を基準とするか、または同等の細胞と比較することができることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現の増加が見られる操作幹細胞は、ＣＤ４７タンパク質レベルが、未改変の幹細胞と比べて高い改変幹細胞を指す。

【0898】

一実施形態では、本発明で提供するのは、外因性のＣＤ４７ポリペプチドを発現するとともに、いずれか１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子、または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のいずれかの組み合わせの発現の低下が見られる操作細胞（例えば初代細胞）である。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の構成要素、例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のＢ２Ｍを減少させる。別の実施形態では、その細胞は、外因性のＣＤ４７ポリペプチドを発現するとともに、Ｂ２Ｍポリペプチド及びＣＩＩＴＡポリペプチドの発現レベルが低下している。いくつかの実施形態では、その細胞は、外因性のＣＤ４７ポリペプチドを発現するとともに、Ｂ２Ｍ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子の改変、例えば遺伝子改変を有する。いくつかの事例では、その改変、例えば遺伝子改変により、Ｂ２Ｍ遺伝子及びＣＩＩＴＡ遺伝子が不活性化する。いくつかの実施形態では、その操作初代細胞は、Ｏ型ＡＢＯ血液型である。いくつかの実施形態では、その操作初代細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。

【0899】

いくつかの実施形態では、本発明で提供するのは、操作細胞を生成する方法であって、その細胞内で、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下または消失させることと、Ｂ２Ｍの発現を低下または消失させることと、ＣＤ４７の発現を増加させること（例えば過剰発現させること）を含む方法である。いくつかの実施形態では、その方法は、ＭＩＣＡの発現を低下または消失させる改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＣＡの発現を低下または消失させる改変は、ＭＩＣＡ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＣＡを低下または消失させる改変は、その細胞内のすべてのＭＩＣＡコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、その不活性化または破壊は、ＭＩＣＡ遺伝子におけるインデル、またはＭＩＣＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域の欠失を含む。いくつかの実施形態では、そのインデルは、フレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、そのＭＩＣＡ遺伝子は、ノックアウトされている。いくつかの実施形態では、ＭＩＣＡの発現を低下または消失させる改変は、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集によって、ＭＩＣＡタンパク質の発現を低下または消失させることを含む。いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、ＭＩＣＡ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意に、そのＣａｓはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、ＭＩＣＡ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、そのｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。いくつかの実施形態では、その方法は、ＭＩＣＢの発現を低下または消失させる改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＣＢの発現を低下または消失させる改変は、ＭＩＣＢ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＭＩＣＢを低下または消失させる改変は、その細胞内のすべてのＭＩＣＢコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、その不活性化または破壊は、ＭＩＣＢ遺伝子におけるインデル、またはＭＩＣＢ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域の欠失を含む。いくつかの実施形態では、そのインデルは、フレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、そのＭＩＣＢ遺伝子は、ノックアウトされている。いくつかの実施形態では、ＭＩＣＢの発現を低下または消失させる改変は、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集によって、ＭＩＣＢタンパク質の発現を低下または消失させることを含む。いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、ＭＩＣＢ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意に、そのＣａｓはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、ＭＩＣＢ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、そのｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。いくつかの実施形態では、その方法は、Ｂ２Ｍの発現を低下または消失させる改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現を低下または消失させる改変は、Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍを低下または消失させる改変は、その細胞内のすべてのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、その不活性化または破壊は、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるインデル、またはＢ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域の欠失を含む。いくつかの実施形態では、そのインデルは、フレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、そのＢ２Ｍ遺伝子は、ノックアウトされている。いくつかの実施形態では、Ｂ２Ｍの発現を低下または消失させる改変は、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集によって、Ｂ２Ｍタンパク質の発現を低下または消失させることを含む。いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意に、そのＣａｓはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、Ｂ２Ｍ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、そのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせは、そのｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である。いくつかの実施形態では、その方法は、その細胞内のＣＩＩＴＡの発現を低下または消失させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、その方法は、ＣＩＩＴＡの発現を低下または消失させる改変を導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡの発現を低下または消失させる改変は、ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、ＣＩＩＴＡを低下または消失させる改変は、その細胞内のすべてのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む。いくつかの実施形態では、その不活性化または破壊は、ＣＩＩＴＡ遺伝子におけるインデル、またはＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域の欠失を含む。いくつかの実施形態では、そのインデルは、フレームシフト変異である。いくつかの実施形態では、そのＣＩＩＴＡ遺伝子は、ノックアウトされている。いくつかの実施形態では、ＣＤ４７の発現を増加させる改変は、ＣＤ４７タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドであって、プロモーターに連結されている外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、そのＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドは、その操作細胞のゲノムに組み込まれている。いくつかの実施形態では、その組み込みは、その細胞の標的ゲノム遺伝子座への標的挿入によるものであり、任意に、その標的挿入は、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集と相同配向型修復によるものである。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低下させる改変は、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集によるものである。いくつかの実施形態では、そのヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集は、標的ゲノム遺伝子座を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、任意に、そのＣａｓはＣａｓ９である。いくつかの実施形態では、発現を増加させる改変（複数可）は、表面発現の増加を含み、及び／または発現を低下させる改変は、表面発現の低下を含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、低免疫原性細胞である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、膵島β細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、網膜色素上皮細胞、グリア前駆細胞、内皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞及び血液細胞（例えば、形質細胞または血小板）から選択されている。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞から選択されており、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｏ型ＡＢＯ血液型である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）である。

【0900】

Ｅ．低免疫原性表現型のアッセイ
いくつかの実施形態では、提供する操作細胞は、患者（例えばレシピエント対象）に投与すると、免疫認識及び免疫応答を回避できるように改変されている。その細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで、免疫細胞による殺傷を回避できる。いくつかの実施形態では、その細胞は、マクロファージ及びＮＫ細胞による殺傷を回避する。いくつかの実施形態では、その細胞は、免疫細胞または対象の免疫系に無視される。換言すると、本明細書に記載の方法に従って投与された細胞は、免疫系の免疫細胞によって検出不可能である。いくつかの実施形態では、その細胞は、覆い隠されるので、免疫拒絶を回避する。

【0901】

本発明で提供する操作細胞が免疫認識を回避するのかを判断する方法としては、ＩＦＮ－γ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、ミクログリア殺傷アッセイ、細胞生着動物モデル、サイトカイン放出アッセイ、ＥＬＩＳＡ、生物発光イメージング、クロム放出アッセイまたはＸｃｅｌｌｉｇｅｎｃｅ解析を用いた殺傷アッセイ、混合リンパ球反応、及び免疫蛍光解析が挙げられるが、これらに限定されない。

【0902】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているように、操作細胞を改変または生成したら、それらの細胞の低免疫原性についてアッセイしてよい。様々なアッセイのいずれかを用いて、その細胞が、低免疫原性であるか、または免疫系を回避できるかを評価できる。例示的なアッセイとしては、ＷＯ２０１６１８３０４１及びＷＯ２０１８１３２７８３に記載されているようないずれかが挙げられる。

【0903】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作細胞は、宿主の免疫応答を刺激することなく、宿主内で、１週間以上（例えば、１週間、２週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、１年、２年、３年、４年、５年以上、例えば、細胞及び／またはその子孫の寿命にわたって）生存する。その細胞は、宿主内で生存する限り、その導入遺伝子の発現を維持し、及び／または標的遺伝子の発現が欠失もしくは低下する。いくつかの態様では、その導入遺伝子が発現しなくなった場合、及び／または標的遺伝子が発現する場合には、その操作細胞を宿主の免疫系によって除去し得る。いくつかの実施形態では、その操作細胞をレシピエントに投与後、その細胞をｉｎ ｖｉｖｏで検出可能にするタンパク質（例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質、トランケート型受容体、またはその他のサロゲートマーカーもしくは他の検出可能なマーカー）をコードする導入遺伝子をさらに発現させることによって、その細胞の持続性または生存をモニタリングしてよい。

【0904】

その低免疫原性細胞が生成されたら、ＷＯ２０１６１８３０４１及びＷＯ２０１８１３２７８３に記載されているように、それらの細胞の低免疫原性、生着及び機能についてアッセイしてよい。

【0905】

その低免疫原性細胞は、それらの細胞を、意図した組織部位に生着させるとともに、機能不全の領域を再構成または再生させる方式で投与する。いくつかの実施形態では、その低免疫原性細胞は、生着（例えば生着の成功）についてアッセイする。いくつかの実施形態では、その低免疫原性細胞の生着は、あらかじめ選択した期間の後に評価する。いくつかの実施形態では、その生着細胞は、細胞の生存についてモニタリングする。例えば、その細胞の生存は、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によってモニタリングしてよく、この場合、その細胞の生存をモニタリングするために、その細胞にルシフェラーゼ発現コンストラクトをトランスダクションする。いくつかの実施形態では、その生着細胞は、当該技術分野において知られている免疫染色法及びイメージング法によって可視化する。いくつかの実施形態では、その生着細胞は、生着の成功を判断するために検出し得る既知のバイオマーカーを発現する。例えば、フローサイトメトリーを用いて、特定のバイオマーカーの表面発現を判断し得る。いくつかの実施形態では、その低免疫原性細胞は、予想どおりに、意図した組織部位に生着する（例えば、その低免疫原性細胞の生着の成功）。いくつかの実施形態では、その低免疫原性細胞は、必要に応じて、意図した組織部位、例えば、細胞不全部位に生着する。いくつかの実施形態では、その低免疫原性細胞は、非操作細胞（例えば、改変（複数可）を含まない細胞）が、意図した組織部位に生着するのと同じように、意図した組織部位に生着する。いくつかの実施形態では、その低免疫原性細胞の機能についてアッセイする。いくつかの実施形態では、その低免疫原性細胞は、意図した組織部位に生着する前の機能についてアッセイする。いくつかの実施形態では、その低免疫原性細胞は、意図した組織部位に生着した後の機能についてアッセイする。いくつかの実施形態では、あらかじめ選択した量の後に、その低免疫原性細胞の機能を評価する。いくつかの実施形態では、その生着細胞の機能は、その細胞が検出可能な表現型を示す能力によって評価する。例えば、生着膵島β細胞の機能は、糖尿病による、グルコース調節の消失の回復に基づき評価してよい。いくつかの実施形態では、その低免疫原性細胞の機能は、予想どおりである（例えば、その低免疫原性細胞の機能が有効である一方で、抗体の媒介による拒絶は回避される）。いくつかの実施形態では、その低免疫原性細胞の機能は、必要に応じたものであり、例えば、細胞不全部位において十分な機能を持つ一方で、抗体の媒介による拒絶は回避される。いくつかの実施形態では、その低免疫原性細胞は、非操作細胞（例えば、改変（複数可）を含まない細胞）が機能するのと同じように機能する一方で、抗体の媒介による拒絶は回避される。

【0906】

いくつかの実施形態では、低免疫原性は、ＷＯ２０１８１３２７８３の図１３及び図１５に例示されているような多くの技法を用いてアッセイする。これらの技法には、同種異系宿主へ移植して、その宿主の免疫系から逃避する低免疫原性多能性細胞の成長（例えばテラトーマ）についてモニタリングすることが含まれる。いくつかの事例では、低免疫原性多能性細胞誘導体をトランスダクションして、ルシフェラーゼを発現させ、その後に、生物発光イメージングを使用することができる。同様に、このような細胞に対する宿主動物のＴ細胞応答及び／またはＢ細胞応答を試験して、その細胞が、その宿主動物において免疫反応を起こさないことを確認する。Ｔ細胞応答は、Ｅｌｉｓｐｏｔ、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、ＰＣＲまたはマスサイトメトリー（ＣＹＴＯＦ）によって評価できる。Ｂ細胞応答または抗体応答は、ＦＡＣＳまたはＬｕｍｉｎｅｘを用いて評価する。これに加えて、またはこの代わりに、その細胞は、ＷＯ２０１８１３２７８３の図１４及び１５に概ね示されているように、自然免疫応答、例えば、ＮＫ細胞による殺傷をそれらが回避する能力についてアッセイしてもよい。

【0907】

いくつかの実施形態では、その細胞の免疫原性は、当業者に認識されている、Ｔ細胞のイムノアッセイ、例えば、Ｔ細胞増殖のアッセイ、Ｔ細胞活性化のアッセイ、及びＴ細胞による殺傷のアッセイを用いて評価する。いくつかの事例では、Ｔ細胞増殖のアッセイは、その細胞をインターフェロン－γで前処理し、その細胞を、標識したＴ細胞と共培養し、予め選択した期間の後に、そのＴ細胞集団（または増殖しているＴ細胞集団）の存在をアッセイすることを含む。いくつかの事例では、そのＴ細胞活性化のアッセイは、Ｔ細胞を、本明細書に概説されている細胞と共培養し、そのＴ細胞内のＴ細胞活性化マーカーの発現レベルを求めることを含む。

【0908】

ｉｎ ｖｉｖｏアッセイを行って、本明細書に概説されている細胞の免疫原性を評価することができる。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞の生存及び免疫原性は、同種異系ヒト化免疫不全マウスモデルを用いて求める。いくつかの事例では、その低免疫原性細胞は、同種異系ヒト化ＮＳＧ－ＳＧＭ３マウスに移植して、細胞の拒絶、細胞の生存、及びテラトーマの形成についてアッセイする。いくつかの事例では、移植した低免疫原性細胞は、そのマウスモデルにおいて長期生存する。

【0909】

その細胞の低免疫原性を含む免疫原性を求める追加の技法は、例えば、Ｄｅｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１９，３７，２５２－２５８及びＨａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，２０１９，１１６（２１），１０４４１－１０４４６に記載されており、その開示内容は、図、図の凡例、及び方法の説明を含め、参照により、その全体が本明細書に援用される。

【0910】

当業者には理解されるように、その多能性細胞内で、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子（その細胞がヒト細胞に由来するときにはＨＬＡ Ｉ）の機能がうまく低下しているかは、当該技術分野で知られている技法を用いて、及び下に記載されているように、例えば、ＨＬＡ複合体に結合する標識抗体を用いたＦＡＣＳ法、例えば、ヒト主要組織適合性ＨＬＡクラスＩ抗原のα鎖に結合する市販のＨＬＡ－Ａ抗体、ＨＬＡ－Ｂ抗体、ＨＬＡ－Ｃ抗体を用いたＦＡＣＳ法を用いて測定できる。

【0911】

加えて、その細胞を試験して、ＨＬＡ Ｉ複合体が細胞表面上に発現していないことを確認できる。これは、上述のように、１つ以上のＨＬＡ細胞表面の構成要素に対する抗体を用いるＦＡＣＳ解析によってアッセイしてよい。

【0912】

その多能性細胞またはその誘導体内で、１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（その細胞がヒト細胞に由来するときにはＨＬＡ ＩＩ）の機能がうまく低下しているかは、当該技術分野で知られている技法、例えば、そのタンパク質に対する抗体を用いるウエスタンブロッティング、ＦＡＣＳ法、ＲＴ－ＰＣＲ技法などを用いて測定できる。

【0913】

加えて、その細胞を試験して、ＨＬＡ ＩＩ複合体がその細胞表面上で発現しないことを確認できる。また、このアッセイは、当該技術分野で知られているように行い（例えば、ＷＯ２０１８１３２７８３の図２１を参照されたい）、概して、ヒトＨＬＡクラスＩＩ分子ＨＬＡ－ＤＲ抗原、ＨＬＡ－ＤＰ抗原及び大半のＨＬＡ－ＤＱ抗原に結合する市販の抗体に基づき、ウエスタンブロットまたはＦＡＣＳ解析のいずれかを用いて行う。

【0914】

本発明で提供する低免疫原性細胞は、ＨＬＡ Ｉ及びＨＬＡ ＩＩ（または１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子）の低減に加えて、マクロファージの食作用及びＮＫ細胞による殺傷に対する感受性が低下している。得られる低免疫原性細胞は、１つ以上のＣＤ２４導入遺伝子の発現により、免疫マクロファージ及び自然免疫経路から「逃避する」。

【0915】

Ｄ．操作細胞集団、及び医薬組成物などの組成物
本発明で提供するのは、本明細書に記載の操作細胞のいずれかを複数を含む操作細胞集団である。いくつかの事例では、その細胞集団は、細胞の混合物を含む。いくつかの事例では、その集団中の細胞の少なくとも約３０％は、本明細書に記載の一連の改変を含む。いくつかの事例では、その細胞集団は、１つ以上の様々な細胞種を含む。

【0916】

いくつかの実施形態では、その集団は、膵島細胞の混合物を含む。いくつかの実施形態では、その集団は、膵臓のβ細胞、膵臓のα細胞及び膵臓のγ細胞からなる群から選択した２つ以上の様々な細胞種を含め、膵臓の膵島細胞の混合物を含む。いくつかの事例では、その集団は、膵臓のα、β及びγ細胞を含む。いくつかの事例では、その集団は、初代細胞を含む。いくつかの実施形態では、その集団は、幹細胞または前駆細胞から分化させた細胞（例えば、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞、生殖系列幹細胞、肺幹細胞、臍帯血幹細胞、多能性幹細胞（ＰＳＣ）及び多分化能性幹細胞から分化させた細胞）を含む。

【0917】

いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて１つ以上の改変を含む。いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの表面発現の低下は、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上のＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が見られない。

【0918】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの表面発現の低下は、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％は、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が見られない。

【0919】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、１つ以上の寛容原性因子をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0920】

いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含む。いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、Ｂ２Ｍ及び／またはＣＩＩＴＡの発現の低下を含む。いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低下を含む。いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルの両方を不活性化する１つ以上の変化を含む。いくつかの実施形態では、その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルの両方を不活性化する１つ以上の変化を含む。

【0921】

いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡの細胞表面発現が低下しており、その操作細胞上のＭＩＣＡの細胞表面発現が、ＭＩＣＡの細胞表面発現を低下させるように操作する前のＭＩＣＡの細胞表面発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下するようになっている。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡの細胞表面発現が低下しており、その操作細胞上のＭＩＣＡの細胞表面発現が、参照細胞上または参照細胞集団上のＭＩＣＡの細胞表面発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下するようになっている。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡの細胞表面発現が見られない（検出可能な細胞表面発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡタンパク質の発現が、ＭＩＣＡタンパク質の発現を低下させるように操作する前のＭＩＣＡタンパク質の発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡタンパク質の発現が、参照細胞または参照細胞集団のＭＩＣＡタンパク質の発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡタンパク質の発現が見られない（検出可能なタンパク質発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡタンパク質を含まない（検出可能なＭＩＣＡタンパク質が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡのｍＲＮＡ発現が、ＭＩＣＡのｍＲＮＡ発現を低下させるように操作する前のＭＩＣＡのｍＲＮＡ発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡのｍＲＮＡ発現が、参照細胞または参照細胞集団のＭＩＣＡのｍＲＮＡ発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡのｍＲＮＡ発現が見られない（検出可能なｍＲＮＡ発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡのｍＲＮＡを含まない（検出可能なＭＩＣＡのｍＲＮＡが見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞集団は、本明細書に記載されているように、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子の発現の増加を含む。

【0922】

いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＢの細胞表面発現が低下しており、その操作細胞上のＭＩＣＢの細胞表面発現が、ＭＩＣＢの細胞表面発現を低下させるように操作する前のＭＩＣＢの細胞表面発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下するようになっている。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＢの細胞表面発現が低下しており、その操作細胞上のＭＩＣＢの細胞表面発現が、参照細胞上または参照細胞集団上のＭＩＣＢの細胞表面発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下するようになっている。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＢの細胞表面発現が見られない（検出可能な細胞表面発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＢタンパク質の発現が、ＭＩＣＢタンパク質の発現を低下させるように操作する前のＭＩＣＢタンパク質の発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＢタンパク質の発現が、参照細胞または参照細胞集団のＭＩＣＢタンパク質の発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＢタンパク質の発現が見られない（検出可能なタンパク質発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＢタンパク質を含まない（検出可能なＭＩＣＢタンパク質が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＢのｍＲＮＡ発現が、ＭＩＣＢのｍＲＮＡ発現を低下させるように操作する前のＭＩＣＢのｍＲＮＡ発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＢのｍＲＮＡ発現が、参照細胞または参照細胞集団のＭＩＣＢのｍＲＮＡ発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＢのｍＲＮＡ発現が見られない（検出可能なｍＲＮＡ発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＢのｍＲＮＡを含まない（検出可能なＭＩＣＢのｍＲＮＡが見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞集団は、本明細書に記載されているように、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子の発現の増加を含む。

【0923】

いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの細胞表面発現が低下しており、その操作細胞上のＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの細胞表面発現が、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの細胞表面発現を低下させるように操作する前のＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの細胞表面発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下するようになっている。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの細胞表面発現が低下しており、その操作細胞上のＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの細胞表面発現が、参照細胞上または参照細胞集団上のＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの細胞表面発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下するようになっている。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの細胞表面発現が見られない（検出可能な細胞表面発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのタンパク質発現が、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのタンパク質発現を低下させるように操作する前のＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのタンパク質発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのタンパク質発現が、参照細胞または参照細胞集団のＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのタンパク質発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのタンパク質発現が見られない（検出可能なタンパク質発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡタンパク質及びＭＩＣＢタンパク質を含まない（検出可能なＭＩＣＡタンパク質及びＭＩＣＢタンパク質が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのｍＲＮＡ発現が、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのｍＲＮＡ発現を低下させるように操作する前のＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのｍＲＮＡ発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのｍＲＮＡ発現が、参照細胞または参照細胞集団のＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのｍＲＮＡ発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのｍＲＮＡ発現が見られない（検出可能なｍＲＮＡ発現が見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その集団中の操作細胞の少なくとも約５０％は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのｍＲＮＡを含まない（検出可能なＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのｍＲＮＡが見られないことを含む）。いくつかの実施形態では、その操作細胞集団は、本明細書に記載されているように、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下、ならびに１つ以上の寛容原性因子の発現の増加を含む。

【0924】

本発明で提供するのは、その操作細胞または操作細胞集団を含む組成物でもある。いくつかの実施形態では、その組成物は、医薬組成物である。

【0925】

いくつかの実施形態では、本発明で提供する医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む。許容可能な担体、賦形剤または安定剤は、レシピエントにとって、用いる投与量及び濃度において無毒であり、これらとしては、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸、アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤、保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルパラベンもしくはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン、親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジン、グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖、二糖及び他の炭水化物、キレート剤、例えばＥＤＴＡ、糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール、塩形成対イオン、例えばナトリウム、金属複合体（例えばＺｎ－タンパク質複合体）、及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート（ＴＷＥＥＮ（商標））、ポロキサマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標））もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、薬学的に許容される緩衝剤（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、例えば、その組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明性、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解速度、放出速度、吸着性または透過性を改変、維持または保存するための１つ以上の賦形剤を含むことができる。いくつかの態様では、細胞を含む医薬組成物は、タンパク質を含む医薬組成物とは異なる場合があることを当業者は理解する。

【0926】

「医薬製剤」という用語は、その製剤に含まれる活性成分の生物学的活性を有効なものとするとともに、その製剤を投与されることになる対象にとって許容できない毒性がある追加の成分を含まないような形態である調製物を指す。

【0927】

「薬学的に許容される担体」とは、医薬製剤中の成分のうち、活性成分以外の成分であって、対象にとって無毒である成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤または保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、その薬学的に許容される担体は、通常の生理食塩水、例えば、ヒトへの投与に適する通常の生理食塩水などの緩衝液である。

【0928】

いくつかの実施形態での医薬組成物は、疾患または病態を治療または予防するのに有効な量、例えば、治療有効量または予防有効量で、本明細書に記載されているような操作細胞を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、疾患または病態を治療または予防するのに有効な量、例えば、治療有効量または予防有効量で、本明細書に記載されているような操作細胞を含む。いくつかの実施形態での治療有効性または予防有効性は、治療を受けている対象の定期的な評価によってモニタリングする。その病態に応じて、数日以上、反復投与する際には、疾患の症状が所望どおりに抑制されるまで治療を繰り返す。しかしながら、他の投与レジメンが有用な場合もあり、他の投与レジメンを定めることもできる。所望の投与量は、その組成物の１回のボーラス投与、その組成物の複数回のボーラス投与、またはその組成物の持続注入による投与によって送達できる。

【0929】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているような操作細胞は、標準的な投与技法、製剤及び／または器具を用いて投与する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているような操作細胞は、標準的な投与技法、製剤及び／または器具を用いて投与する。提供するのは、その組成物を保存及び投与するための製剤及び器具、例えば、シリンジ及びバイアルである。操作細胞は、カテーテルによる投与、全身注射、局所注射、静脈内注射または非経口投与を含む局所注射によって投与できる。治療用組成物（例えば、操作細胞を含む医薬組成物）を投与するときには、概して、注射可能な単位投与形態（溶液、懸濁液、乳濁液）で調合することになる。

【0930】

製剤としては、静脈内投与、腹腔内投与または皮下投与用の製剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、非経口投与する。本明細書で使用する場合、「非経口」という用語には、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、膣投与及び腹腔内投与が含まれる。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、静脈内注射、腹腔内注射または皮下注射による全身末梢送達を用いて、対象に投与する。

【0931】

いくつかの実施形態での組成物は、滅菌液体調製液、例えば、等張水溶液、等張懸濁液、等張乳濁液または等張分散液として供給し、この調製液は、いくつかの態様では、所定のｐＨまで緩衝する。液体組成物を、特に注射によって投与する方が多少利便的である。液体組成物は、担体を含むことができ、その担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）及びこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であることができる。注射可能な滅菌溶液は、溶媒に、例えば、適切な担体、希釈剤または賦形剤、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどとの混合物に、その細胞を組み込むことによって調製できる。

【0932】

いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体には、医薬の投与と適合するすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤、抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤などを含めることができる（Ｇｅｎｎａｒｏ，２０００，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）。このような担体または希釈剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。リポソーム及び非水性ビヒクル、例えば固定油も使用してよい。その組成物には、補助的な活性化合物も組み込むことができる。その医薬用担体は、その操作細胞に適する担体、例えば、生理食塩水、デキストロース溶液、またはヒト血清アルブミンを含む溶液でなければならない。いくつかの実施形態では、このような組成物用の薬学的に許容される担体またはビヒクルは、生きた細胞を投与可能にするのに十分な時間、その操作細胞を維持したり、またはその生存を維持したりできるいずれかの無毒の水溶液である。例えば、その薬学的に許容される担体またはビヒクルは、生理食塩水または緩衝生理食塩水であることができる。

【0933】

いくつかの実施形態では、その組成物は、医薬組成物を含め、滅菌組成物である。いくつかの実施形態では、その細胞の単離、濃縮または培養は、例えば、閉鎖環境または滅菌環境、例えば滅菌培養バッグで行って、エラー、ユーザーによる操作及び／またはコンタミを最小限に抑える。いくつかの実施形態では、無菌性は、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって容易に実現し得る。いくつかの実施形態では、培養は、気体透過性の培養容器を用いて行う。いくつかの実施形態では、培養は、バイオリアクターを用いて行う。

【0934】

本発明で提供するのは、提供する操作細胞の凍結保存に適する組成物でもある。いくつかの実施形態では、提供する操作細胞は、凍結保存用培地で凍結保存する。いくつかの実施形態では、その凍結保存用培地は、無血清の凍結保存用培地である。いくつかの実施形態では、その組成物は、凍結保護剤を含む。いくつかの実施形態では、その凍結保護剤は、ＤＭＳＯ及び／またはグリセロールであるか、またはＤＭＳＯ及び／またはグリセロールを含む。いくつかの実施形態では、その凍結保存用培地は、５％（ｖ／ｖ）もしくは約５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯであるか、または１０％（ｖ／ｖ）もしくは約１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯである。いくつかの実施形態では、その凍結保存用培地は、５％（ｖ／ｖ）または約５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯである。いくつかの実施形態では、その凍結保存用培地は、６％（ｖ／ｖ）または約６％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯである。いくつかの実施形態では、その凍結保存用培地は、７％（ｖ／ｖ）または約７％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯである。いくつかの実施形態では、その凍結保存用培地は、７．５％（ｖ／ｖ）または約７．５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯである。いくつかの実施形態では、その凍結保存用培地は、８％（ｖ／ｖ）または約８％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯである。いくつかの実施形態では、その凍結保存用培地は、９％（ｖ／ｖ）または約９％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯである。いくつかの実施形態では、その凍結保存用培地は、１０％（ｖ／ｖ）または約１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯである。いくつかの実施形態では、その凍結保存用培地は、市販の凍結保存溶液（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０）を含む。ＣｒｙｏＳｔｏｒ（商標）ＣＳ１０は、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む凍結保存用培地である。いくつかの実施形態では、凍結保存用に調合した組成物は、低温、例えば超低温で保存でき、例えば、－４０℃～－１５０℃、例えば、８０℃または約８０℃±６．０℃の範囲の温度で保存できる。

【0935】

いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、本明細書に記載の操作細胞と、Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ Ａを３１．２５％（ｖ／ｖ）、５％デキストロース／０．４５％塩化ナトリウムを３１．２５％（ｖ／ｖ）、１０％デキストラン４０（ＬＭＤ）／５％デキストロース、２５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を２０％（ｖ／ｖ）、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を７．５％（ｖ／ｖ）含む薬学的に許容される担体とを含む。

【0936】

いくつかの実施形態では、その凍結保存操作細胞は、投与の際、解凍によって調製する。いくつかの事例では、その操作細胞は、解凍直後に、対象に投与できる。このような実施形態では、その組成物は、いずれものさらなる処理も行わないＲｅａｄｙ－ｔｏ－Ｕｓｅ型である。別の事例では、その操作細胞は、解凍後に、薬学的に許容される担体での再懸濁、活性化剤または刺激剤とのインキュベーションなどによって、さらに処理を行うか、または対象への投与前に、薬学的に許容される緩衝液中での活性化、洗浄及び再懸濁を行う。

【0937】

いくつかの実施形態では、その組成物は、本明細書に記載の操作細胞の集団のいずれかを含み、（ａ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、その操作細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの表面発現の低下は、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上のＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、（ｂ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、（ｃ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含み、その操作細胞上の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現の低下は、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上のＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ヌクレアーゼベースの遺伝子編集によって操作されている。

【0938】

いくつかの実施形態では、その組成物は、本明細書に記載の操作細胞の集団のいずれかを含み、（ａ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、その操作細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの表面発現の低下は、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上のＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、（ｂ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、（ｃ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含み、その操作細胞上の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現の低下は、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上のＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ヌクレアーゼベースの遺伝子編集によって操作されている。

【0939】

いくつかの実施形態では、その組成物は、本明細書に記載の操作細胞の集団のいずれかを含み、（ａ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、その操作細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの表面発現の低下は、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上のＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、（ｂ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、その操作細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの表面発現の低下は、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上のＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、（ｃ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、（ｄ）その集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかは、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含み、その操作細胞上の１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現の低下は、１つ以上の改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上のＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下している。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、ヌクレアーゼベースの遺伝子編集によって操作されている。

【0940】

いくつかの実施形態では、その細胞集団またはその組成物は、２人以上のドナー対象に由来する細胞、または２つ以上の採取試料（同じドナー対象における採取試料など）に由来する細胞を含む。いくつかの実施形態では、得られた操作細胞は、２つ以上の供給源からプールして、その細胞集団またはその組成物を作製する。いくつかの実施形態では、２人以上のドナー対象のそれぞれは、そのドナー試料をそのドナー対象から得る時点に、健常な対象であるか、または疾患または病態である疑いがない。

【0941】

Ｅ．キット、成分及び製品
いくつかの態様では、本発明で提供するのは、本明細書に記載の方法、器具及びシステムのキット、構成要素及び組成物（消耗品など）である。いくつかの実施形態では、そのキットは、本発明の開示に従って使用するための説明書を含む。

【0942】

いくつかの実施形態では、本発明で提供するのは、本明細書に記載の操作細胞の集団を含むキットまたは組成物である。いくつかの実施形態では、本発明で提供するのは、複数の操作細胞を含む細胞の集団を含むキットまたは組み合わせであり、その操作細胞は、（ｉ）ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下させる改変、（ｉｉ）ＣＤ４７の発現を増加させる改変、ならびに（ｉｉｉ）１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子（例えば、１つ以上のＭＨＣクラスＩヒト白血球抗原及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩヒト白血球抗原）の発現を低下させる改変を含み、その発現の増加及び発現の低下は、その改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べたものである。いくつかの実施形態では、そのキットの成分は、同時に投与してよい。いくつかの実施形態では、そのキットの成分は、順次投与してよい。

【0943】

本発明のいくつかの実施形態では、細胞療法を含め、臨床移植療法に有用な物質を含む製品を提供する。いくつかの実施形態では、その製品は、細胞不全の治療に有用な物質を含み、その不全は、糖尿病（例えばＩ型糖尿病）、血管の病態または血管疾患、自己免疫性甲状腺炎、肝疾患（例えば肝硬変）、角膜疾患（例えば、フックスジストロフィーまたは先天性遺伝性内皮ジストロフィー）、腎疾患、ならびにがん（例えば、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、グリオブラストーマ、神経芽腫、肺扁平上皮細胞癌、肝細胞癌及び膀胱癌）などであるが、これらに限定されない。その製品は、容器、及びその容器上にあるかまたはその容器に付随するラベルもしくは添付文書を含むことができる。適切な容器としては、例えば、ビン、バイアル、シリンジなど（例えば、ガラス製またはプラスチック製の容器）が挙げられる。概して、その容器には、同種異系細胞療法に有効である組成物が収容され、滅菌アクセスポートがある場合がある（例えば、その容器は、皮下用注射針で穿刺可能なストッパーを備える静脈内輸液バッグまたはバイアルであってよい）。少なくとも、その医薬組成物中の成分は、操作細胞、例えば、本発明で提供する操作細胞のいずれかの集団である。そのラベルまたは添付文書には、その組成物が、特定の病態の治療のために用いるものであることが示されている。そのラベルまたは添付文書は、その医薬組成物を患者に投与するための説明をさらに含むことになる。いくつかの実施形態では、その製品は、併用治療を含む。

【0944】

その製品及び／またはキットは、添付文書をさらに含んでもよい。その添付文書は、治療用製品の商用パッケージに通常含まれる説明書であって、適応症、用法、投与量、投与法、禁忌及び／またはそのような治療用製品の使用に関する警告に関する情報を含む説明書を指す。

【0945】

Ｆ．治療方法
本発明で提供するのは、提供する細胞組成物であって、本明細書に記載の操作細胞の集団を含み、対象の疾患または病態の治療で使用するたの細胞組成物に関する組成物及び方法である。本発明で提供するのは、本明細書に記載の操作細胞の集団を投与することによって、患者を治療する方法である。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、医薬組成物で、例えば、本明細書に記載のいずれかで投与するように調合されている。上記のような方法及び用途としては、例えば、疾患、病態または障害である対象に、操作細胞集団、またはその集団を含む組成物を投与することを伴う治療方法及び用途が挙げられる。特定の適応疾患用に、本発明で提供するような適切な操作細胞を選択することは、当業者の技能レベルの範囲内である。いくつかの実施形態では、その細胞またはその医薬組成物は、その疾患または障害の治療を果たすために有効な量で投与する。用途としては、このような方法及び治療、ならびにこのような治療方法を行うための医薬の調製で、その操作細胞またはその医薬組成物を使用することが挙げられる。いくつかの実施形態では、その方法によって、その対象の疾患もしくは病態、または障害を治療する。

【0946】

本発明で提供する操作細胞は、例えば、疾患または障害を治療するための細胞療法の候補者を含め、いずれかの適する患者に投与できる。細胞療法の候補者としては、本発明で提供する該当の操作細胞の治療効果の恩恵を受ける可能性があると見られる疾患または病態を持ついずれかの患者が挙げられる。いくつかの実施形態では、その患者は、投与を受ける細胞の同種異系のレシピエントである。いくつかの実施形態では、提供する操作細胞は、同種異系細胞療法での使用に有効である。本発明で提供する該当の操作細胞の治療効果の恩恵を受ける候補者は、疾患または病態の消失、軽減または改善が見られる。

【0947】

いくつかの実施形態では、本発明で提供するような操作細胞は、本発明で提供する方法のいずれかによって作製される細胞を含め、細胞療法で使用できる。本明細書に概説されている治療用細胞は、以下に限定されないが、がん、遺伝子障害、慢性感染症、自己免疫障害、神経障害などのような障害を治療するのに有用である。

【0948】

いくつかの実施形態では、その患者は、細胞不全である。本明細書で使用する場合、「細胞不全」とは、その患者において機能障害または細胞集団の消失を引き起こすいずれかの疾患または病態を指し、その患者は、その細胞集団を自然に補充または再生できない。例示的な細胞不全としては、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、重症筋無力症、関節リウマチ、糖尿病及び全身性ループスエリテマトーデス）、神経変性疾患（例えば、ハンチントン病及びパーキンソン病）、心血管病態及び心血管疾患、血管病態及び血管疾患、角膜病態及び角膜疾患、肝病態及び肝疾患、甲状腺病態及び甲状腺疾患、ならびに腎病態及び腎疾患が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、その操作細胞を投与される患者は、がんである。本発明で提供する操作細胞によって治療できる例示的ながんとしては、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、グリオブラストーマ、神経芽腫、肺扁平上皮細胞癌、肝細胞癌及び膀胱癌が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、そのがん患者は、本発明で提供する操作ＣＡＲ Ｔ細胞の投与によって治療する。

【0949】

いくつかの実施形態では、その疾患または病態は、全身性ループスエリテマトーデス、１型糖尿病、脱毛症、セリアック病、関節リウマチ、シェーグレン病、合併症を伴うかまたは伴わない多胎妊娠を含む多胎妊娠を含む妊娠からなる群から選択する。

【0950】

いくつかの実施形態では、本発明で提供する操作細胞またはその細胞を含む組成物は、過去の移植、例えば、細胞移植、輸血、組織移植または器官移植の際に存在した１つ以上の抗原の感作を受けた患者の治療に有用である。ある特定の実施形態では、その過去の移植は、同種異系移植であり、その患者は、同種異系移植に由来する１つ以上の同種抗原の感作を受けている。同種異系移植としては、同種異系細胞移植、同種異系輸血、同種異系組織移植または同種異系器官移植が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、その患者は、妊婦であるか、または妊娠したことがある感作患者（例えば、多胎妊娠、及び一般に妊娠と関連するいずれかの病態（子癇前症が挙げられる）を含め、妊娠で同種免疫を受けているか、または同種免疫を受けていた患者）である。ある特定の実施形態では、その患者は、過去の移植の際に含まれた１つ以上の抗原の感作を受けており、その過去の移植物は、改変ヒト細胞、改変ヒト組織または改変ヒト器官である。いくつかの実施形態では、その改変ヒト細胞、改変ヒト組織または改変ヒト器官は、改変自家ヒト細胞、改変自家ヒト組織または改変自家ヒト器官である。いくつかの実施形態では、その過去の移植物は、非ヒト細胞、非ヒト組織または非ヒト器官である。例示的な実施形態では、その過去の移植物は、改変非ヒト細胞、改変非ヒト組織または改変非ヒト器官である。ある特定の実施形態では、その過去の移植物は、ヒト成分を含むキメラである。ある特定の実施形態では、その過去の移植物は、ＣＡＲ Ｔ細胞である。ある特定の実施形態では、その過去の移植物は、自家移植物であり、その患者は、その自家移植物に由来する１つ以上の自家抗原の感作を受けている。ある特定の実施形態では、その過去の移植物は、自家細胞、自家組織または自家器官である。ある特定の実施形態では、その感作を受けた患者は、アレルギーがあり、１つ以上のアレルゲンに感作されている。例示的な実施形態では、その患者は、花粉症、食物アレルギー、昆虫アレルギー、薬物アレルギーまたはアトピー性皮膚炎である。

【0951】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の実施形態は、自家の設定において有用であり、例えば、その操作細胞（及びその使用方法）は、自家細胞である。いくつかの実施形態では、その細胞は、同種異系細胞である。

【0952】

いくつかの実施形態では、提供する操作細胞、またはその細胞を含む組成物を用いた治療を受ける患者は、以前に治療を受けている。いくつかの実施形態では、その操作細胞、またはその細胞を含む組成物を用いて、その以前の治療の際と同じ病態を治療する。ある特定の実施形態では、その操作細胞、またはその細胞を含む組成物を用いて、その以前の治療の際とは異なる病態を治療する。いくつかの実施形態では、その患者に投与する操作細胞、またはその細胞を含む組成物は、その以前の治療によって治療したものと同じ病態または疾患の治療のための治療効果の増強が見られる。ある特定の実施形態では、投与したその操作細胞、またはその細胞を含む組成物は、その以前の治療と比べて、その患者の病態または疾患の治療のための治療効果が長い。例示的な実施形態では、投与したその細胞は、その以前の治療と比べて、がん細胞に対する効力、有効性及び／または特異性の増強が見られる。特定の実施形態では、その操作細胞は、がんの治療のためのＣＡＲ Ｔ細胞である。

【0953】

本発明で提供する方法は、特定の病態または疾患に対して、一次治療の失敗後に、二次治療として使用できる。いくつかの実施形態では、その以前の治療は、治療効果のない治療である。本明細書で使用する場合、「治療効果のない」治療とは、患者において望ましい臨床転帰を下回る治療を指す。例えば、細胞不全に対する治療に関しては、治療効果のない治療とは、患者において不全細胞を補うために所望される機能的細胞レベル及び／または細胞活性レベルをもたらさない治療、及び／または治療の持続性を欠いた治療を指す場合がある。がんの治療に関しては、治療効果のない治療とは、所望の効力レベル、有効性レベル及び／または特異性レベルをもたらさない治療を指す。治療有効性は、当該技術分野で知られているいずれかの適切な技法を用いて測定できる。いくつかの実施形態では、その患者は、その以前の治療に対して免疫応答を示す。いくつかの実施形態では、その以前の治療は、その患者に拒絶される細胞移植片、組織移植片または器官移植片である。いくつかの実施形態では、その以前の治療には、機械的な補助による治療が含まれていた。いくつかの実施形態では、その機械的な補助による治療には、血液透析または補助人工心臓が含まれていた。いくつかの実施形態では、その患者は、その機械的な補助による治療に対して免疫応答を示した。いくつかの実施形態では、その以前の治療には、その治療用細胞が、望ましくない形で成長及び分裂するようなことがあれば、その治療用細胞を死滅させることができるセーフティスイッチを含む治療用細胞の集団が含まれていた。ある特定の実施形態では、その患者は、そのセーフティスイッチの誘導により、治療用細胞が死滅すると、免疫応答を示す。ある特定の実施形態では、その患者は、その以前の治療の感作を受けている。例示的な実施形態では、その患者は、本発明で提供するような操作細胞の投与によっては、感作を受けない。

【0954】

いくつかの実施形態では、提供する操作細胞、またはその細胞を含む組成物は、組織、器官または器官の一部の移植が必要な患者に、その移植を行う前に投与する。特定の実施形態では、その患者は、その操作細胞に対して免疫応答を示さない。ある特定の実施形態では、その操作細胞は、特定の組織または器官の細胞不全の治療のために、患者に投与し、その後、その患者は、同じ特定の組織または器官について組織または器官の移植を受ける。このような実施形態では、その操作細胞による治療は、やがて行われる組織置換または器官置換までのブリッジ療法として機能する。例えば、いくつかの実施形態では、その患者は、肝障害であり、肝移植を受ける前に、本発明で提供するような操作肝細胞による治療を受ける。ある特定の実施形態では、その操作細胞は、特定の組織または器官の細胞不全の治療のために、患者に投与し、その後で、その患者は、異なる組織または器官について組織移植または器官移植を受ける。例えば、いくつかの実施形態では、その患者は、腎移植を受ける前に、本発明で提供する膵臓の操作β細胞で治療されている糖尿病患者である。いくつかの実施形態では、その方法は、細胞不全の治療のためのものである。例示的な実施形態では、その組織移植または器官移植は、心臓移植、肺移植、腎移植、肝移植、膵臓移植、腸移植、胃移植、角膜移植、骨髄移植、血管移植、心臓弁移植または骨移植である。

【0955】

患者を治療する方法は概して、本発明で提供するような操作細胞、またはその細胞を含む組成物の投与によるものである。明らかであろうが、細胞及び／または治療タイミングに関して本明細書に記載の複数の実施形態のいずれも、その細胞の投与は、所望の部位の導入細胞を少なくとも部分的に局在させる方法または経路によって行う。その細胞は、所望の部位に直接移植することもできるし、またはその代わりに、その対象の所望の位置に送達させるいずれかの適切な経路によって投与することもでき、その際、その移植細胞またはその細胞の成分の少なくとも一部が、生存し続ける。いくつかの実施形態では、その細胞は、疾患または障害、例えば、細胞療法によって緩和できるいずれかの疾患、障害、病態またはその症状を治療するために投与する。

【0956】

いくつかの実施形態では、その操作細胞集団、またはその集団を含む組成物は、その患者が感作を受けてから少なくとも１日後、少なくとも２日後、少なくとも３日後、少なくとも４日後、少なくとも５日後、少なくとも６日後、少なくとも１週間後または少なくとも１カ月以上後に投与する。いくつかの実施形態では、その操作細胞集団、またはその集団を含む組成物は、その患者が感作を受けたか、またはその患者で、感作の特性または特徴が見られてから少なくとも１週間以上後に（例えば、１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後、１０週間後、１１週間後、１２週間後、１３週間後、１４週間後、１５週間後、１６週間後、１７週間後、１８週間後、１９週間後または２０週間以上後に）投与する。いくつかの実施形態では、その操作細胞集団、またはその集団を含む組成物は、その患者が移植（例えば同種異系移植）を受けたか、妊娠したか（例えば、妊娠で同種免疫を示しているか、もしくは同種免疫を示したことがあるか）、感作を受けたか、またはその患者で、感作の特性もしくは特徴が見られてから少なくとも１カ月以上後に（例えば、１カ月後、２カ月後、３カ月後、４カ月後、５カ月後、６カ月後、７カ月後、８カ月後、９カ月後、１０カ月後、１１カ月後、１２カ月後、１３カ月後、１４カ月後、１５カ月後、１６カ月後、１７カ月後、１８カ月後、１９カ月後または２０カ月以上後に）投与する。

【0957】

いくつかの実施形態では、移植を受けたことがあるか、妊娠したことがあるか（例えば、妊娠で同種免疫を示しているか、もしくは同種免疫を示したことがあるか）、及び／または抗原（例えば同種抗原）の感作を受けた患者には、本明細書に記載の操作細胞集団の１回目の用量の投与、１回目の用量の後の回復期間、及び記載されている操作細胞集団の２回目の用量の投与を含む投与レジメンを行う。いくつかの実施形態では、第１の細胞集団及び第２の細胞集団中に存在する細胞種の混成は異なる。ある特定の実施形態では、第１の操作細胞集団及び第２の操作細胞集団に存在する細胞種の混成は、同じであるか、または実質的に同等である。多くの実施形態では、第１の操作細胞集団及び第２の操作細胞集団は、同じ細胞種を含む。いくつかの実施形態では、第１の操作細胞集団及び第２の操作細胞集団は、異なる細胞種を含む。いくつかの実施形態では、第１の操作細胞集団及び第２の操作細胞集団は、同じパーセンテージの細胞種を含む。別の実施形態では、第１の操作細胞集団及び第２の細胞集団は、異なるパーセンテージの細胞種を含む。

【0958】

いくつかの実施形態では、その回復期間は、操作細胞集団またはその集団を含む組成物の１回目の投与後に開始し、そのような細胞が、患者に存在しなくなるか、または検出不能になったら終了する。いくつかの実施形態では、その回復期間の持続期間は、その細胞の最初の投与から少なくとも１週間以上（例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間または２０週間以上）である。いくつかの実施形態では、その回復期間の持続期間は、その細胞の最初の投与から少なくとも１カ月以上（例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１３カ月、１４カ月、１５カ月、１６カ月、１７カ月、１８カ月、１９カ月または２０カ月以上）である。

【0959】

いくつかの実施形態では、投与する操作細胞集団、またはその集団を含む組成物は、その対象に投与するとき、低免疫原性である。いくつかの実施形態では、その操作細胞は、免疫機能低下細胞である。いくつかの実施形態では、その操作細胞に対する免疫応答は、免疫原性細胞（例えば、同じまたは同様の細胞種または表現型の細胞であるが、その操作細胞の改変、例えば遺伝子改変を含まない細胞の集団）の投与によって見られる免疫応答レベルと比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％低下するか、または少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％低い。いくつかの実施形態では、投与したその操作細胞集団、またはその集団を含む組成物は、その患者において、その操作細胞に対する免疫応答を誘発しない。

【0960】

いくつかの実施形態では、投与したその操作細胞集団、またはその集団を含む組成物は、その患者において、全身性ＴＨ１活性化レベルの低下、またはさらに低いレベルの全身性ＴＨ１活性化を誘発する。いくつかの事例では、その細胞によって誘発される全身性ＴＨ１活性化レベルは、免疫原性細胞（例えば、同じまたは同様の細胞種または表現型の細胞であるが、その操作細胞の改変、例えば遺伝子改変を含まない細胞の集団）の投与によって見られる全身性ＴＨ１活性化レベルと比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％低い。いくつかの実施形態では、投与したその操作細胞集団、またはその集団を含む組成物は、その患者において、全身性ＴＨ１の活性化を誘発しない。

【0961】

いくつかの実施形態では、投与したその操作細胞集団、またはその集団を含む組成物は、その患者において、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の低下、またはさらに低いレベルの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を誘発する。いくつかの事例では、その細胞によって誘発されるＰＢＭＣの免疫活性化レベルは、免疫原性細胞（例えば、同じまたは同様の細胞種または表現型の細胞であるが、その操作細胞の改変、例えば遺伝子改変を含まない細胞の集団）の投与によって見られるＰＢＭＣの免疫活性化レベルと比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％低い。いくつかの実施形態では、投与したその操作細胞集団、またはその集団を含む組成物は、その患者において、ＰＢＭＣの免疫活性化を誘発しない。

【0962】

いくつかの実施形態では、投与したその操作細胞集団、またはその集団を含む組成物は、その患者において、ドナー特異的なＩｇＧ抗体のレベルの低下、またはさらに低いレベルのドナー特異的なＩｇＧ抗体を誘発する。いくつかの事例では、その細胞によって誘発されるドナー特異的なＩｇＧ抗体のレベルは、免疫原性細胞（例えば、同じまたは同様の細胞種または表現型の細胞であるが、その操作細胞の改変、例えば遺伝子改変を含まない細胞の集団）の投与によって見られるドナー特異的なＩｇＧ抗体のレベルと比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％低い。いくつかの実施形態では、投与したその操作細胞集団は、その患者において、ドナー特異的なＩｇＧ抗体を誘発しない。

【0963】

いくつかの実施形態では、投与したその操作細胞集団、またはその集団を含む組成物は、その患者において、ＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体の産生レベルの低下、またはさらに低いレベルのＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体の産生を誘発する。いくつかの事例では、その細胞によって誘発されるＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体の産生レベルは、免疫原性細胞（例えば、同じまたは同様の細胞種または表現型の細胞であるが、その操作細胞の改変、例えば遺伝子改変を含まない細胞の集団）の投与によって見られるＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体の産生レベルと比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％低い。いくつかの実施形態では、投与したその操作細胞集団、またはその集団を含む組成物は、その患者において、ＩｇＭ抗体及びＩｇＧ抗体の産生を誘発しない。

【0964】

いくつかの実施形態では、投与したその操作細胞集団、またはその集団を含む組成物は、その患者において、細胞傷害性Ｔ細胞による殺傷レベルの低下、または細胞傷害性Ｔ細胞によるさらに低い殺傷レベルを誘発する。いくつかの事例では、その細胞によって誘発される、細胞傷害性Ｔ細胞による殺傷レベルは、免疫原性細胞（例えば、同じまたは同様の細胞種または表現型の細胞であるが、その操作細胞の改変、例えば遺伝子改変を含まない細胞の集団）の投与によって見られる、細胞傷害性Ｔ細胞による殺傷レベルと比べて、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％低い。いくつかの実施形態では、投与したその操作細胞集団、またはその集団を含む組成物は、その患者において、細胞傷害性Ｔ細胞による殺傷を誘発しない。

【0965】

上述のように、本発明で提供するのは、ある特定の実施形態では、同種抗原、例えばヒト白血球抗原の感作を受けた患者に投与できる細胞である。いくつかの実施形態では、その患者は、妊娠しているか、または妊娠したことがあり、例えば、妊娠中の同種免疫を伴う（例えば、胎児・新生児溶血性疾患（ＨＤＦＮ）、新生児同種免疫性好中球減少症（ＮＡＮ）または胎児・新生児同種免疫性血小板減少症（ＦＮＡＩＴ））。換言すると、その患者は、以下に限定されないが、胎児・新生児溶血性疾患（ＨＤＦＮ）、新生児同種免疫性好中球減少症（ＮＡＮ）及び胎児・新生児同種免疫性血小板減少症（ＦＮＡＩＴ）など、妊娠中の同種免疫と関連する障害もしくは病態であるか、またはその障害もしくは病態であったことがある。いくつかの実施形態では、その患者は、以下に限定されないが、同種異系細胞移植、同種異系輸血、同種異系組織移植または同種異系器官移植などの同種異系移植を受けたことがある。いくつかの実施形態では、その患者は、同種抗原に対するメモリーＢ細胞が見られる。いくつかの実施形態では、その患者は、同種抗原に対するメモリーＴ細胞が見られる。このような患者は、同種抗原に対するメモリーＢ細胞及びメモリーＴ細胞の両方が見られることもある。

【0966】

その患者は、記載されている細胞の投与を受けると、全身性免疫応答が見られないか、または低免疫原性ではない細胞に対する応答と比べて、全身性免疫応答レベルが低下する。いくつかの実施形態では、その患者は、適応免疫応答が見られないか、または低免疫原性ではない細胞に対する応答と比べて、適応免疫応答レベルが低下する。いくつかの実施形態では、その患者は、自然免疫応答が見られないか、または低免疫原性ではない細胞に対する応答と比べて、自然免疫応答レベルが低下する。いくつかの実施形態では、その患者は、Ｔ細胞応答が見られないか、または低免疫原性ではない細胞に対する応答と比べて、Ｔ細胞応答レベルが低下する。いくつかの実施形態では、その患者は、Ｂ細胞応答が見られないか、または低免疫原性ではない細胞に対する応答と比べて、Ｂ細胞応答レベルが低下する。

【0967】

いくつかの実施形態では、提供するのは、同種異系療法を用いて個体の病態を治療する方法であって、その個体に、本明細書に記載の操作細胞の集団または本明細書に記載の組成物を投与することを含む方法である。いくつかの実施形態では、その病態は、疾患または細胞不全である。いくつかの実施形態では、その疾患は、ループス、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、セリアック病、グレーブス病、乾癬及び大腸炎からなる群から選択する。いくつかの実施形態では、その疾患は、ループス（全身性ループスエリテマトーデスなど）である。いくつかの実施形態では、その疾患は、多発性硬化症である。いくつかの実施形態では、その疾患は、橋本病である。いくつかの実施形態では、その個体は、疾患または病態に対する治療を受けており、その個体は、ループス（全身性ループスエリテマトーデスなど）でもある。いくつかの実施形態では、その個体は、疾患または病態に対する治療を受けており、その個体は、多発性硬化症でもある。いくつかの実施形態では、その個体は、疾患または病態に対する治療を受けており、その個体は、橋本病でもある。いくつかの実施形態では、その個体は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体が循環血液中に存在する。いくつかの実施形態では、その個体は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体が持続的に存在する。いくつかの実施形態では、その個体は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在の原因となる自己免疫関連病態である。いくつかの実施形態では、その自己免疫関連病態は、橋本病である。

【0968】

いくつかの実施形態では、その個体は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在に基づき、その治療の対象に選ばれた。いくつかの実施形態では、その方法は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在に基づき、その個体をその治療の対象に選ぶことをさらに含む。いくつかの実施形態では、その個体を選ぶことは、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在をその個体において測定することをさらに含む。

【0969】

いくつかの実施形態では、本発明で提供するのは、同種異系療法を用いて個体の病態を治療する方法であって、（ａ）その個体の抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を判断すること（抗ＭＩＣＡ抗体陽性の状態により、その個体から得た血清試料に抗ＭＩＣＡ抗体が存在することが示され、抗ＭＩＣＢ抗体陽性の状態により、その個体から得た血清試料に抗ＭＩＣＢ抗体が存在することが示される）と、（ｂ）抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態に基づき、その個体に、本明細書に記載の操作細胞の集団を含む組成物、または本明細書に記載の組成物を投与することを含む方法であり、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態が陽性である場合には、その操作細胞集団は、ＭＩＣＡの発現の低下を含み、その抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その操作細胞集団は、ＭＩＣＢの発現の低下を含み、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態及びその抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その操作細胞集団は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下を含む。いくつかの実施形態では、その方法は、その個体の抗ＭＩＣＡ抗体の状態及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態に基づき、その個体をその治療の対象に選ぶことをさらに含む。いくつかの実施形態では、その方法は、その個体の抗ＭＩＣＡ抗体の状態及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を測定することをさらに含む。

【0970】

いくつかの実施形態では、提供するのは、同種異系療法を必要とする個体での使用に適する同種異系療法を特定する方法であり、その同種異系療法は、本明細書に記載の操作細胞集団を含む組成物または本明細書に記載の組成物を含み、その方法は、その個体の抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を判断して、その個体での使用に適する同種異系療法を特定することを含み、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態が陽性である場合には、その適する同種異系療法は、ＭＩＣＡの発現の低下を含む操作細胞集団を含み、その抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その適する同種異系療法は、ＭＩＣＢの発現の低下を含む操作細胞集団を含み、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態及びその抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その適する同種異系療法は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下を含む操作細胞集団を含む。

【0971】

いくつかの実施形態では、その細胞不全は、造血系疾患もしくは造血系障害と関連するか、またはその疾患もしくは病態は、造血系疾患もしくは造血系障害である。

【0972】

いくつかの実施形態では、その造血系疾患または造血系障害は、骨髄異形成、再生不良性貧血、ファンコニ貧血、発作性夜間ヘモグロビン尿症、鎌状赤血球症、ダイアモンドブラックファン貧血、シュワッハマンダイアモンド障害、コストマン症候群、慢性肉芽腫性疾患、副腎白質ジストロフィー、白血球接着不全症、血友病、サラセミア、βサラセミア、白血病、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（骨髄）白血病（ＡＭＬ）、成人リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞性慢性リンパ性白血病（Ｂ－ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、若年性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）及び若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損症、慢性肉芽腫性疾患、チェディアック・東症候群、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）またはＡＩＤＳである。

【0973】

いくつかの実施形態では、その細胞不全は、白血病もしくはミエローマと関連するか、またはその疾患もしくは病態は、白血病もしくはミエローマである。

【0974】

いくつかの実施形態では、その細胞不全は、自己免疫疾患もしくは自己免疫病態と関連するか、またはその疾患もしくは病態は、自己免疫疾患もしくは自己免疫病態である。

【0975】

いくつかの実施形態では、その自己免疫疾患または自己免疫病態は、急性播種性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗合成酵素症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖症候群、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ぶどう膜炎、バロー病、バロー同心円硬化症、ベーチェット症候群、ベルジェ病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、がん、キャッスルマン病、セリアック病、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、補体成分２欠損症、脳動脈炎、ＣＲＥＳＴ症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、デゴス病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、１型糖尿病、びまん皮膚硬化型全身性強皮症、ドレスラー症候群、円板状ループスエリテマトーデス、湿疹、付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、本態性混合型クリオグロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維異形成症、線維性肺胞炎、胃炎、胃腸類天疱瘡、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、炎症性脱髄性多発神経障害、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、若年性関節リウマチ、川崎病、ランバート・イートン筋無力症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ルー・ゲーリック病、ルポイド肝炎、ループスエリテマトーデス、マジード症候群、メニエール病、顕微鏡的多発性血管炎、ミラー・フィッシャー症候群、混合性結合組織病、限局性強皮症、ムッカ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、視神経脊髄炎、ニューロミオトニア、眼瘢痕性類天疱瘡、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、オード甲状腺炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、パーソネージ・ターナー症候群、周辺部ぶどう膜炎、天疱瘡、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲性脳脊髄炎、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、再発性多発性軟骨炎、ライター症候群、むずむず脚症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スチル病、スティッフパーソン症候群、亜急性細菌性心内膜炎、スザック症候群、スウィート症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患、未分化脊椎関節症、血管炎白斑またはウェゲナー肉芽腫症である。

【0976】

いくつかの実施形態では、その細胞集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／またはその誘導体を含む集団である。

【0977】

いくつかの実施形態では、その細胞不全は、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、神経変性疾患、神経変性病態、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、うつ病、神経精神障害発作、もしくは筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と関連するか、またはその疾患もしくは病態は、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症、神経変性疾患、神経変性病態、注意欠陥・多動性障害（ＡＤＨＤ）、トゥレット症候群（ＴＳ）、統合失調症、精神病、うつ病、神経精神障害発作、もしくは筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。

【0978】

いくつかの実施形態では、その細胞集団は、神経細胞及び／またはグリア細胞を含む集団である。

【0979】

いくつかの実施形態では、その細胞不全は、糖尿病と関連するか、またはその細胞療法は、糖尿病（Ｉ型糖尿病など）の治療のためのものであり、その細胞集団は、膵島β細胞を含む膵島細胞の集団である。いくつかの実施形態では、その膵島細胞は、膵島前駆細胞、未成熟膵島細胞及び成熟膵島細胞からなる群から選択されている。

【0980】

いくつかの実施形態では、その細胞不全は、血管の病態もしくは血管疾患と関連するか、またはその細胞療法は、血管の病態もしくは血管疾患の治療のためのものであり、その細胞集団は、内皮細胞集団である。

【0981】

いくつかの実施形態では、その細胞不全は、自己免疫性甲状腺炎と関連するか、またはその細胞療法は、自己免疫性甲状腺炎の治療のためのものであり、その細胞集団は、甲状腺前駆細胞集団である。

【0982】

いくつかの実施形態では、その細胞不全は、肝疾患と関連するか、またはその細胞療法は、肝疾患の治療のためのものであり、その肝疾患は、肝硬変を含む。いくつかの実施形態では、その細胞集団は、肝細胞または肝前駆細胞の集団である。

【0983】

いくつかの実施形態では、その細胞不全は、角膜疾患と関連するか、またはその細胞療法は、角膜疾患（フックスジストロフィーもしくは先天性遺伝性内皮ジストロフィーなど）の治療のためのもであり、その細胞集団は、角膜内皮前駆細胞または角膜内皮細胞の集団である。

【0984】

いくつかの実施形態では、その細胞不全は、腎疾患と関連するか、またはその細胞療法は、腎疾患の治療のためのもであり、その細胞集団は、腎前駆細胞または腎細胞の集団である。

【0985】

いくつかの実施形態では、その細胞療法は、がん（Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、肝臓癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、急性骨髄性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、胃癌、胃腺癌、膵臓腺癌、グリオブラストーマ、神経芽腫、肺扁平上皮細胞癌、肝細胞癌または膀胱癌のいずれかなど）の治療のためのものであり、その細胞集団は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の集団である。

【0986】

１．用量及び投与レジメン
その医薬組成物には、治療する適応症に応じて、本明細書に記載の細胞をいずれかの治療有効量で含めることができる。その細胞の非限定的な例としては、初代細胞（例えば初代Ｔ細胞）、及び記載されているように、操作した人工多能性幹細胞から分化させた細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、少なくとも約１×１０^２個、５×１０^２個、１×１０^３個、５×１０^３個、１×１０^４個、５×１０^４個、１×１０^５個、５×１０^５個、１×１０^６個、５×１０^６個、１×１０^７個、５×１０^７個、１×１０^８個、５×１０^８個、１×１０^９個、５×１０^９個、１×１０^１０個または５×１０^１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、最大で約１×１０^２個、５×１０^２個、１×１０^３個、５×１０^３個、１×１０^４個、５×１０^４個、１×１０^５個、５×１０^５個、１×１０^６個、５×１０^６個、１×１０^７個、５×１０^７個、１×１０^８個、５×１０^８個、１×１０^９個、５×１０^９個、１×１０^１０個または５×１０^１０個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、最大で約６．０×１０^８個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、最大で約８．０×１０^８個の細胞を含む。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、少なくとも約１×１０^２～５×１０^２個、５×１０^２～１×１０^３個、１×１０^３～５×１０^３個、５×１０^３～１×１０^４個、１×１０^４～５×１０^４個、５×１０^４～１×１０^５個、１×１０^５～５×１０^５個、５×１０^５～１×１０^６個、１×１０^６～５×１０^６個、５×１０^６～１×１０^７個、１×１０^７～５×１０^７個、５×１０^７～１×１０^８個、１×１０^８～５×１０^８個、５×１０^８～１×１０^９個、１×１０^９～５×１０^９個、５×１０^９～１×１０^１０個または１×１０^１０～５×１０^１０個の細胞を含む。例示的な実施形態では、その医薬組成物は、約１．０×１０^６～約２．５×１０^８個の細胞を含む。

【0987】

いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、体積が少なくとも５ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌ、２０ｍｌ、２５ｍｌ、３０ｍｌ、３５ｍｌ、４０ｍｌ、４５ｍｌ、５０ｍｌ、５５ｍｌ、６０ｍｌ、６５ｍｌ、７０ｍｌ、７５ｍｌ、８０ｍｌ、８５ｍｌ、９０ｍｌ、９５ｍｌ、１００ｍｌ、１１０ｍｌ、１２０ｍｌ、１３０ｍｌ、１４０ｍｌ、１５０ｍｌ、１６０ｍｌ、１７０ｍｌ、１８０ｍｌ、１９０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌまたは５００ｍｌである。例示的な実施形態では、その医薬組成物は、体積が最大で約５ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌ、２０ｍｌ、２５ｍｌ、３０ｍｌ、３５ｍｌ、４０ｍｌ、４５ｍｌ、５０ｍｌ、５５ｍｌ、６０ｍｌ、６５ｍｌ、７０ｍｌ、７５ｍｌ、８０ｍｌ、８５ｍｌ、９０ｍｌ、９５ｍｌ、１００ｍｌ、１１０ｍｌ、１２０ｍｌ、１３０ｍｌ、１４０ｍｌ、１５０ｍｌ、１６０ｍｌ、１７０ｍｌ、１８０ｍｌ、１９０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌまたは５００ｍｌである。例示的な実施形態では、その医薬組成物は、体積が約５ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌ、２０ｍｌ、２５ｍｌ、３０ｍｌ、３５ｍｌ、４０ｍｌ、４５ｍｌ、５０ｍｌ、５５ｍｌ、６０ｍｌ、６５ｍｌ、７０ｍｌ、７５ｍｌ、８０ｍｌ、８５ｍｌ、９０ｍｌ、９５ｍｌ、１００ｍｌ、１１０ｍｌ、１２０ｍｌ、１３０ｍｌ、１４０ｍｌ、１５０ｍｌ、１６０ｍｌ、１７０ｍｌ、１８０ｍｌ、１９０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌまたは５００ｍｌである。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、体積が約１～５０ｍｌ、５０～１００ｍｌ、１００～１５０ｍｌ、１５０～２００ｍｌ、２００～２５０ｍｌ、２５０～３００ｍｌ、３００～３５０ｍｌ、３５０～４００ｍｌ、４００～４５０ｍｌまたは４５０～５００ｍｌである。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、体積が約１～５０ｍｌ、５０～１００ｍｌ、１００～１５０ｍｌ、１５０～２００ｍｌ、２００～２５０ｍｌ、２５０～３００ｍｌ、３００～３５０ｍｌ、３５０～４００ｍｌ、４００～４５０ｍｌまたは４５０～５００ｍｌである。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、体積が約１～１０ｍｌ、１０～２０ｍｌ、２０～３０ｍｌ、３０～４０ｍｌ、４０～５０ｍｌ、５０～６０ｍｌ、６０～７０ｍｌ、７０～８０ｍｌ、７０～８０ｍｌ、８０～９０ｍｌまたは９０～１００ｍｌである。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、体積が約５ｍｌ～約８０ｍｌの範囲である。例示的な実施形態では、その医薬組成物は、体積が約１０ｍｌ～約７０ｍｌの範囲である。多くの実施形態では、その医薬組成物は、体積が約１０ｍｌ～約５０ｍｌの範囲である。

【0988】

具体的な量／投与レジメンは、その個体の体重、性別、年齢及び健康状態、その細胞の配合、生化学的性質、生物活性、バイオアベイラビリティ及び副作用、ならびに完全な治療レジメンにおける細胞の数及び本質に応じて変動することになる。

【0989】

いくつかの実施形態では、その医薬組成物の用量は、約１０ｍＬ～５０ｍＬの体積で、細胞を約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個含み、その医薬組成物は、１回用量として投与する。

【0990】

多くの実施形態では、その細胞は、Ｔ細胞であり、その医薬組成物は、約２．０×１０^６～約２．０×１０^８個の細胞を含み、例えば、初代Ｔ細胞、操作人工多能性幹細胞から分化させたＴ細胞であるが、これらに限定されない。いくつかの事例では、その用量は、約１０ｍｌ～５０ｍｌの体積で、本明細書に記載の初代Ｔ細胞を約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個含む。いくつかの事例では、その用量は、約１０ｍｌ～５０ｍｌの体積で、上述した初代Ｔ細胞を約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個含む。様々な事例では、その用量は、約１０ｍｌ～５０ｍｌの体積で、本明細書に記載の操作人工多能性幹細胞から分化させたＴ細胞を約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個含む。別の事例では、その用量は、約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個のＴ細胞（初代Ｔ細胞、または操作人工多能性幹細胞から分化させたＴ細胞を含む）よりも少ない範囲である。さらに別の事例では、その用量は、約１．０×１０^５～約２．５×１０^８個のＴ細胞（初代Ｔ細胞、及び操作人工多能性幹細胞から分化させたＴ細胞を含む）よりも多い範囲である。

【0991】

いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、５０ｋｇ以下の対象の体重１ｋｇ当たりに約１．０×１０^５～約１．０×１０^７個の操作細胞（初代細胞、または操作人工多能性幹細胞から分化させた細胞など）という１回用量として投与する。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、５０ｋｇ以下の対象の体重１ｋｇ当たりに約０．５×１０^５～約１．０×１０^７個、約１．０×１０^５～約１．０×１０^７個、約１．０×１０^５～約１．０×１０^７個、約５．０×１０^５～約１×１０^７個、約１．０×１０^６～約１×１０^７個、約５．０×１０^６～約１．０×１０^７個、約１．０×１０^５～約５．０×１０^６個、約１．０×１０^５～約１．０×１０^６個、約１．０×１０^５～約５．０×１０^５個、約１．０×１０^５～約５．０×１０^６個、約２．０×１０^５～約５．０×１０^６個、約３．０×１０^５～約５．０×１０^６個、約４．０×１０^５～約５．０×１０^６個、約５．０×１０^５～約５．０×１０^６個、約６．０×１０^５～約５．０×１０^６個、約７．０×１０^５～約５．０×１０^６個、約８．０×１０^５～約５．０×１０^６個または約９．０×１０^５～約５．０×１０^６個の細胞という１回用量として投与する。いくつかの実施形態では、その用量は、５０ｋｇ以下の対象の体重１ｋｇ当たりに約０．２×１０^６～約５．０×１０^６個の細胞である。多くの実施形態では、その用量は、５０ｋｇ以下の対象の体重１ｋｇ当たりに約０．２×１０^６～約５．０×１０^６個の細胞よりも少ない範囲である。多くの実施形態では、その用量は、５０ｋｇ以下の対象の体重１ｋｇ当たりに約０．２×１０^６～約５．０×１０^６個の細胞よりも多い範囲である。例示的な実施形態では、その１回用量は、約１０ｍｌ～５０ｍｌの体積である。いくつかの実施形態では、その用量は、静脈内投与する。

【0992】

例示的な実施形態では、その細胞は、５０ｋｇ超の対象の場合には、約１．０×１０^６～約５．０×１０^８個の細胞（初代細胞、及び操作人工多能性幹細胞から分化させた細胞）という１回用量で投与する。いくつかの実施形態では、その医薬組成物は、５０ｋｇ以下の対象の体重１ｋｇ当たりに約０．５×１０^６～約１．０×１０^９個、約１．０×１０^６～約１．０×１０^９個、約１．０×１０^６～約１．０×１０^９個、約５．０×１０^６～約１．０×１０^９個、約１．０×１０^７～約１．０×１０^９個、約５．０×１０^７～約１．０×１０^９個、約１．０×１０^６～約５．０×１０^７個、約１．０×１０^６～約１．０×１０^７個、約１．０×１０^６～約５．０×１０^７個、約１．０×１０^７～約５．０×１０^８個、約２．０×１０^７～約５．０×１０^８個、約３．０×１０^７～約５．０×１０^８個、約４．０×１０^７～約５．０×１０^８個、約５．０×１０^７～約５．０×１０^８個、約６．０×１０^７～約５．０×１０^８個、約７．０×１０^７～約５．０×１０^８個、約８．０×１０^７～約５．０×１０^８個または約９．０×１０^７～約５．０×１０^８個の細胞という１回用量として投与する。多くの実施形態では、その細胞は、５０ｋｇ超の対象の場合には、約１．０×１０^７～約２．５×１０^８個の細胞という１回用量で投与する。いくつかの実施形態では、その細胞は、５０ｋｇ超の対象の場合には、約１．０×１０^７～約２．５×１０^８個の細胞よりも少ない範囲の１回用量で投与する。いくつかの実施形態では、その細胞は、５０ｋｇ超の対象の場合には、約１．０×１０^７～約２．５×１０^８個の細胞よりも多い範囲の１回用量で投与する。いくつかの実施形態では、その用量を静脈内投与する。例示的な実施形態では、その１回用量は、約１０ｍｌ～５０ｍｌの体積である。いくつかの実施形態では、その用量を静脈内投与する。

【0993】

例示的な実施形態では、その用量は、毎分約１～５０ｍｌ、毎分１～４０ｍｌ、毎分１～３０ｍｌ、毎分１～２０ｍｌ、毎分１０～２０ｍｌ、毎分１０～３０ｍｌ、毎分１０～４０ｍｌ、毎分１０～５０ｍｌ、毎分２０～５０ｍｌ、毎分３０～５０ｍｌ、毎分４０～５０ｍｌの速度で静脈内投与する。多くの実施形態では、その医薬組成物は、静脈内投与用の１つ以上の輸液バッグで保管する。いくつかの実施形態では、その用量は、１０分以内、１５分以内、２０分以内、２５分以内、３０分以内、３５分以内、４０分以内、４５分以内、５０分以内、５５分以内、６０分以内、７０分以内、８０分以内、９０分以内、１２０分以内、１５０分以内、１８０分以内、２４０分以内または３００分以内で完全に投与する。

【0994】

いくつかの実施形態では、その医薬組成物の１回用量は、１つの輸液バッグ中に入っている。別の実施形態では、その医薬組成物の１回用量は、２個、３個、４個または５個の別々の輸液バッグに分けられている。

【0995】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞は、複数回、例えば、２回、３回、４回、５回、６回以上で投与する。いくつかの実施形態では、複数回投与量の各用量は、その対象に、１～２４時間の範囲の間隔を空けて投与する。いくつかの事例では、２回目以降の用量は、１回目または前回の投与から約１時間～約２４時間後（例えば、約１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１１時間後、１２時間後、１３時間後、１４時間後、１５時間後、１６時間後、１７時間後、１８時間後、１９時間後、２０時間後、２１時間後、２２時間後、２３時間後または約２４時間後）に投与する。いくつかの実施形態では、複数回投与量の各用量は、その対象に、約１日～２８日の範囲の間隔を空けて投与する。いくつかの事例では、２回目以降の用量は、１回目または前回の投与から約１日～約２８日後（例えば、約１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、１４日後、１５日後、１６日後、１７日後、１８日後、１９日後、２０日後、２１日後、２２日後、２３日後、２４日後、２５日後、２６日後、２７日後または約２８日後）に投与する。多くの実施形態では、複数回投与量の各用量は、その対象に、１週間～約６週間の範囲の間隔を空けて投与する。ある特定の事例では、２回目以降の用量は、１回目または前回の投与から約１週間～約６週間後（例えば、約１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後または６週間後）に投与する。いくつかの実施形態では、複数回投与量の各用量は、その対象に、約１カ月～約１２カ月の範囲の間隔を空けて投与する。いくつかの事例では、２回目以降の用量は、１回目または前回の投与から約１カ月～約１２カ月後（例えば、約１カ月後、２カ月後、３カ月後、４カ月後、５カ月後、６カ月後、７カ月後、８カ月後、９カ月後、１０カ月後、１１カ月後または１２カ月後）に投与する。

【0996】

いくつかの実施形態では、対象には、第１の投与レジメンを第１の時点に投与してから、その後、第２の投与レジメンを第２の時点に投与する。いくつかの実施形態では、第１の投与レジメンは、第２の投与レジメンと同じである。別の実施形態では、第１の投与レジメンは、第２の投与レジメンとは異なる。いくつかの事例では、第１の投与レジメンと第２の投与レジメンの細胞数は同じである。いくつかの事例では、第１の投与レジメンと第２の投与レジメンの細胞数は異なる。いくつかの事例では、第１の投与レジメンと第２の投与レジメンの投与回数は同じである。いくつかの事例では、第１の投与レジメンと第２の投与レジメンの投与回数は異なる。

【0997】

いくつかの実施形態では、その細胞は、操作Ｔ細胞（例えば、初代Ｔ細胞、または操作人工多能性幹細胞から分化させたＴ細胞）であり、第１の投与レジメンは、第１のＣＡＲを発現する操作Ｔ細胞を含み、第２の投与レジメンは、第２のＣＡＲを発現する操作Ｔ細胞を含み、その第１のＣＡＲと第２のＣＡＲは異なるようになっている。例えば、第１のＣＡＲと第２のＣＡＲは、異なる標的抗原に結合する。いくつかの事例では、第１のＣＡＲは、ある抗原に結合するｓｃＦｖを含み、第２のＣＡＲは、異なる抗原に結合するｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、第１の投与レジメンは、第１のＣＡＲを発現する操作Ｔ細胞を含み、第２の投与レジメンは、第２のＣＡＲを発現する操作Ｔ細胞または初代Ｔ細胞を含み、その第１のＣＡＲと第２のＣＡＲは同じであるようになっている。第１の投与レジメンは、その対象に、第２の投与レジメンから少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１～３カ月、１～６カ月、４～６カ月、３～９カ月、３～１２カ月またはこれよりも長い月数を空けて投与できる。いくつかの実施形態では、対象に、疾患（例えば、がん）の経過中に複数の投与レジメンを実施し、その投与レジメンの少なくとも２つは、本明細書に記載の操作Ｔ細胞のうちの同じ種類を含む。別の実施形態では、その複数の投与レジメンの少なくとも２つは、本明細書に記載の操作Ｔ細胞のうちの異なる種類を含む。

【0998】

２．免疫抑制剤
いくつかの実施形態では、その操作細胞集団、またはその集団を含む組成物の１回目の投与前には、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤を患者に投与しない。

【0999】

いくつかの実施形態では、操作細胞の投与を受ける患者に、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤を投与してもよい。いくつかの実施形態では、その免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、その操作細胞の投与前に投与する。いくつかの実施形態では、その免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、操作細胞の１回目及び／または２回目の投与前に投与する。

【1000】

免疫抑制剤及び／または免疫調節剤の非限定的な例としては、シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、副腎皮質ステロイド、例えば、プレドニゾン、メトトレキサート、金塩、スルファサラジン、抗マラリア剤、ブレキナル、レフルノミド、ミゾリビン、１５－デオキシスペルグアリン、６－メルカプトプリン、シクロホスファミド、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン、チモペンチン、チモシン－α、及び同様の薬剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、その免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、ＩＬ－２受容体のｐ７５に結合する抗体、例えば、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－６、ＩＧＦ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＤ１１ａまたはＣＤ５８に結合する抗体、及びこれらのリガンドのいずれかに結合する抗体からなる免疫抑制抗体の群から選択する。いくつかの実施形態では、その細胞の１回目の投与前または投与後に、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤を患者に投与する場合、その投与は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現が見られるとともに、ＣＤ４７の外因性発現が見られない細胞で必要となる投与量よりも少ない投与量での投与である。

【1001】

一実施形態では、このような免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、可溶性ＩＬ－１５Ｒ、ＩＬ－１０、Ｂ７分子（例えば、Ｂ７－１、Ｂ７－２、そのバリアント及びその断片）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、負のＴ細胞調節因子阻害剤（ＣＴＬＡ－４に対する抗体など）、ならびに同様の薬剤から選択してよい。

【1002】

いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、その操作細胞集団の１回目の投与前に患者に投与できる。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、その細胞の１回目の投与の少なくとも１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、７日前、８日前、９日前、１０日前、１１日前、１２日前、１３日前または１４日以上前に投与する。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、その細胞の１回目の投与の少なくとも１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、７週間前、８週間前、９週間前、１０週間以上前に投与する。

【1003】

特定の実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、その細胞の１回目の投与後に、その患者に投与しないか、またはその細胞の１回目の投与の少なくとも１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、１４日以上後に投与する。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、その細胞の１回目の投与の少なくとも１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後または１０週間以上後に投与する。

【1004】

いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、その操作細胞集団の投与前には患者に投与しない。多くの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、その操作細胞集団の１回目及び／または２回目の投与前に患者に投与する。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、その細胞の投与の少なくとも１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、７日前、８日前、９日前、１０日前、１１日前、１２日前、１３日前または１４日以上前に投与する。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、その細胞の１回目及び／または２回目の投与の少なくとも１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、７週間前、８週間前、９週間前または１０週間以上前に投与する。特定の実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、その細胞の投与の少なくとも１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後または１４日以上後に投与する。いくつかの実施形態では、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤は、その細胞の１回目及び／または２回目の投与の少なくとも１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後または１０週間以上後に投与する。

【1005】

いくつかの実施形態では、その細胞の投与前または投与後に、免疫抑制剤及び／または免疫調節剤を患者に投与する場合、その投与は、免疫原性細胞（例えば、同じまたは同様の細胞種または表現型の細胞であるが、その操作細胞の改変、例えば遺伝子改変を含まない細胞の集団、例えば、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現が見られ、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現が見られ、ＣＤ４７の外因性発現が見られない細胞集団）で必要となる投与量よりも少ない投与量での投与である。

【1006】

３．治療対象の患者の選択
本明細書に記載されているように、いくつかの実施形態では、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現が低下及び／または消失している操作細胞には、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢに対する既存の抗体を有する個体において特定の用途がある。したがって、いくつかの態様では、患者と具体的な治療とを適合させるための選択ベースのアプローチが本発明に含まれる。例えば、いくつかの実施形態では、その個体は、ＭＩＣＡに対して既存の抗体を有し、このような患者への投与に適する操作細胞は、ＭＩＣＡの発現が低下している。いくつかの実施形態では、その個体は、ＭＩＣＢに対して既存の抗体を有し、このような患者への投与に適する操作細胞は、ＭＩＣＢの発現が低下している。いくつかの実施形態では、その個体は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢに対して既存の抗体を有し、このような患者への投与に適する操作細胞は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現が低下している。いくつかの実施形態では、抗体、例えば、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の有無は、ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）結合法を用いて判断する。いくつかの実施形態では、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の有無は、本明細書に記載の操作細胞の移植前に判断する。いくつかの実施形態では、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の有無は、本明細書に記載の操作細胞を少なくとも１回移植後（例えば、１回目の投与（またはいずれかの過去の投与）後、かつその次の投与前）に判断する。いくつかの実施形態では、操作細胞の１回目の投与（またはいずれかの過去の投与）は、異なる細胞による投与であり、次の投与は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの低下を含む操作細胞による投与である。

【1007】

いくつかの実施形態では、その個体は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在に基づき、その治療の対象に選ばれた。いくつかの実施形態では、その方法は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在に基づき、その個体をその治療の対象に選ぶことをさらに含む。いくつかの実施形態では、その個体を選ぶことは、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在をその個体において測定することをさらに含む。

【1008】

いくつかの実施形態では、本発明で提供するのは、同種異系療法を用いて個体の病態を治療する方法であって、（ａ）その個体の抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を判断すること（抗ＭＩＣＡ抗体陽性の状態により、その個体から得た血清試料に抗ＭＩＣＡ抗体が存在することが示され、抗ＭＩＣＢ抗体陽性の状態により、その個体から得た血清試料に抗ＭＩＣＢ抗体が存在することが示される）と、（ｂ）抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態に基づき、その個体に、本明細書に記載の操作細胞の集団を含む組成物、または本明細書に記載の組成物を投与することを含む方法であり、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態が陽性である場合には、その操作細胞集団は、ＭＩＣＡの発現の低下を含み、その抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その操作細胞集団は、ＭＩＣＢの発現の低下を含み、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態及びその抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その操作細胞集団は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下を含む。いくつかの実施形態では、その方法は、その個体の抗ＭＩＣＡ抗体の状態及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態に基づき、その個体をその治療の対象に選ぶことをさらに含む。いくつかの実施形態では、その方法は、その個体の抗ＭＩＣＡ抗体の状態及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を測定することをさらに含む。

【1009】

いくつかの実施形態では、提供するのは、同種異系療法を必要とする個体での使用に適する同種異系療法を特定する方法であり、その同種異系療法は、本明細書に記載の操作細胞集団を含む組成物または本明細書に記載の組成物を含み、その方法は、その個体の抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を判断して、その個体での使用に適する同種異系療法を特定することを含み、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態が陽性である場合には、その適する同種異系療法は、ＭＩＣＡの発現の低下を含む操作細胞集団を含み、その抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その適する同種異系療法は、ＭＩＣＢの発現の低下を含む操作細胞集団を含み、その抗ＭＩＣＡ抗体の状態及びその抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、その適する同種異系療法は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下を含む操作細胞集団を含む。

【1010】

個体の抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態（有無の測定）を評価する方法は知られている。いくつかの実施形態では、その方法は、試料を個体から得ることを含む。いくつかの実施形態では、その試料は、血清試料などの血液試料である。いくつかの実施形態では、その方法は、血清試料を、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の有無について評価することを含む。いくつかの実施形態では、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の有無は、ウエスタンブロット技法を用いて評価する。いくつかの実施形態では、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の有無は、所定の細胞、例えば、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢを発現する細胞への抗体の結合を測定することによって評価する。いくつかの実施形態では、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の有無は、所定の細胞、例えば、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢを発現する細胞が、抗体の媒介（補体依存性細胞傷害など）により細胞死したことを測定することによって評価する。いくつかの実施形態では、その個体の血清中の抗体は、ＭＩＣＡに特異的に結合し、ＭＩＣＢには結合しない。いくつかの実施形態では、その個体の血清中の抗体は、ＭＩＣＢに特異的に結合し、ＭＩＣＡには結合しない。いくつかの実施形態では、その個体の血清中の抗体は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢに特異的に結合する。

【1011】

ＩＩＩ．例示的な実施形態
実施形態１．（ａ）ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）及び／またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）の発現を低下させる改変、（ｂ）１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる改変、ならびに（ｃ）１つ以上の主要組織適合性複合体クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる改変を含む操作細胞であって、その発現の変化が、前記改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べたものである前記操作細胞。

【1012】

実施形態２．前記改変が、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる、実施形態１に記載の操作細胞。

【1013】

実施形態３．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯｌ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにこれらの組み合わせのいずれかからなる群から選択されている、実施形態１または２に記載の操作細胞。

【1014】

実施形態４．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８、ならびにこれらの組み合わせのいずれかからなる群から選択されている、実施形態３に記載の操作細胞。

【1015】

実施形態５．前記１つ以上の寛容原性因子の少なくとも１つが、ＣＤ４７である、実施形態３に記載の操作細胞。

【1016】

実施形態６．（ａ）ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ａ（ＭＩＣＡ）及び／またはＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質Ｂ（ＭＩＣＢ）の発現を低下させる改変、ならびに（ｂ）ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の発現を増加させる改変を含む操作細胞であって、その発現の変化が、前記改変を含まない同じ細胞種の細胞と比べたものである前記操作細胞。

【1017】

実施形態７．ＭＩＣＡの発現を低下させるための改変を含む、実施形態１～６のいずれか１項に記載の操作細胞。

【1018】

実施形態８．前記操作細胞上でのＭＩＣＡの表面発現の低下を含む、実施形態１～７のいずれか１項に記載の操作細胞。

【1019】

実施形態９．ＭＩＣＡの発現を低下させる改変が、ＭＩＣＡのタンパク質発現を低下させる、実施形態１～８のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1020】

実施形態１０．前記操作細胞上で、ＭＩＣＡの検出可能な細胞表面発現が見られない、実施形態８または９に記載の操作細胞。

【1021】

実施形態１１．ＭＩＣＡの発現を低下させる改変が、ＭＩＣＡをコードするｍＲＮＡの発現を低下させる、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1022】

実施形態１２．ＭＩＣＡ遺伝子の活性を消失させる改変を含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1023】

実施形態１３．前記改変が、ＭＩＣＡ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む、実施形態１２に記載の操作細胞。

【1024】

実施形態１４．前記改変が、すべてのＭＩＣＡコード配列の不活性化または破壊を含む、実施形態１２または１３に記載の操作細胞。

【1025】

実施形態１５．前記不活性化または破壊が、ＭＩＣＡ遺伝子におけるインデルを含む、実施形態１３または１４に記載の操作細胞。

【1026】

実施形態１６．前記改変が、ＭＩＣＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域のフレームシフト変異または欠失である、実施形態１３～１５のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1027】

実施形態１７．前記改変が、ノックアウトである、実施形態１３～１６のいずれかに記載の操作細胞。

【1028】

実施形態１８．前記改変が、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集による改変であって、ＭＩＣＡ遺伝子を標的とする前記改変である、実施形態１３～１７のいずれかに記載の操作細胞。

【1029】

実施形態１９．前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集による改変が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の媒介による改変、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の媒介による改変、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介によるものである、実施形態１８に記載の操作細胞。

【1030】

実施形態２０．前記Ｃａｓが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択されている、実施形態１９に記載の操作細胞。

【1031】

実施形態２１．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介による改変が、ＭＩＣＡ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の使用を含む、実施形態１９または２０に記載の操作細胞。

【1032】

実施形態２２．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介による改変が、前記ｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の使用を含む、実施形態２４に記載の操作細胞。

【1033】

実施形態２３．ＭＩＣＢの発現を低下させるための改変を含む、実施形態１～２２のいずれかに記載の操作細胞。

【1034】

実施形態２４．前記操作細胞上でのＭＩＣＢの表面発現の低下を含む、実施形態１～２３のいずれかに記載の操作細胞。

【1035】

実施形態２５．ＭＩＣＢの発現を低下させる改変が、ＭＩＣＢのタンパク質発現を低下させる、実施形態１～２４のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1036】

実施形態２６．前記操作細胞上で、ＭＩＣＢの検出可能な細胞表面発現が見られない、実施形態２４または２５に記載の操作細胞。

【1037】

実施形態２７．ＭＩＣＢの発現を低下させる改変が、ＭＩＣＢをコードするｍＲＮＡの発現を低下させる、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1038】

実施形態２８．ＭＩＣＢ遺伝子の活性を消失させる改変を含む、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1039】

実施形態２９．前記改変が、ＭＩＣＢ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む、実施形態２８に記載の操作細胞。

【1040】

実施形態３０．前記改変が、すべてのＭＩＣＢコード配列の不活性化または破壊を含む、実施形態２８または２９に記載の操作細胞。

【1041】

実施形態３１．前記不活性化または破壊が、ＭＩＣＢ遺伝子におけるインデルを含む、実施形態２９または３０に記載の操作細胞。

【1042】

実施形態３２．前記改変が、ＭＩＣＢ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域のフレームシフト変異または欠失である、実施形態２９～３１のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1043】

実施形態３３．前記改変が、ノックアウトである、実施形態２９～３２のいずれかに記載の操作細胞。

【1044】

実施形態３４．前記改変が、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集による改変であって、ＭＩＣＢ遺伝子を標的とする前記改変である、実施形態２９～３３のいずれかに記載の操作細胞。

【1045】

実施形態３５．前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集による改変が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）の媒介による改変、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の媒介による改変、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介によるものである、実施形態３４に記載の操作細胞。

【1046】

実施形態３６．前記Ｃａｓが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択されている、実施形態３５に記載の操作細胞。

【1047】

実施形態３７．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介による改変が、ＭＩＣＢ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の使用を含む、実施形態３５または３６に記載の操作細胞。

【1048】

実施形態３８．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせの媒介による改変が、前記ｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の使用を含む、実施形態３７に記載の操作細胞。

【1049】

実施形態３９．前記１つ以上の寛容原性因子の発現の増加が、前記１つ以上の寛容原性因子の細胞表面発現の増加を含む、実施形態１～３８のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1050】

実施形態４０．前記１つ以上の寛容原性因子の１つが、外因性ポリペプチドである、実施形態３９に記載の操作細胞。

【1051】

実施形態４１．前記改変が、前記１つ以上の寛容原性因子をコードする１つ以上の外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態３９または４０に記載の操作細胞。

【1052】

実施形態４２．前記１つ以上の寛容原性因子のそれぞれが、プロモーターに機能可能に連結されている、実施形態４１に記載の操作細胞。

【1053】

実施形態４３．前記プロモーターが、構成的プロモーターである、実施形態４２に記載の操作細胞。

【1054】

実施形態４４．前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＰＧＫプロモーター、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターからなる群から選択されている、実施形態４６または４７に記載の操作細胞。

【1055】

実施形態４５．前記１つ以上の外因性ポリヌクレオチドが、１つ以上のゲノム遺伝子座に組み込まれている、実施形態４２～４４のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1056】

実施形態４６．前記組み込みが、非標的挿入である、実施形態４５に記載の操作細胞。

【1057】

実施形態４７．前記非標的挿入が、レンチウイルスベクターを用いて、前記外因性ポリヌクレオチドを前記細胞に導入することによるものである、実施形態４６に記載の操作細胞。

【1058】

実施形態４８．前記組み込みが、標的挿入である、実施形態４５に記載の操作細胞。

【1059】

実施形態４９．前記１つ以上のゲノム遺伝子座のそれぞれが、ＭＩＣＡ遺伝子座、ＭＩＣＢ遺伝子座、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座またはＴＲＢＣ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子座、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座位、ＣＬＹＢＬ遺伝子座、ＲＯＳＡ２６遺伝子座、ＬＲＰ１遺伝子座、ＨＭＧＢ１遺伝子座、ＡＢＯ遺伝子座、ＲＨＤ遺伝子座、ＦＵＴ１遺伝子座、ＫＤＭ５Ｄ遺伝子座からなる群から選択されている、実施形態５０～５２のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1060】

実施形態５０．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７を含む、実施形態３８～４９のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1061】

実施形態５１．配列番号１のアミノ酸配列の少なくとも一部との同一性が少なくとも約８５％であるアミノ酸配列をＣＤ４７が有する、実施形態５０に記載の操作細胞。

【1062】

実施形態５２．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる改変が、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を低下させる、実施形態１～５１のいずれかに記載の操作細胞。

【1063】

実施形態５３．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる改変が、β－２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現を低下させる、実施形態１～５２のいずれかに記載の操作細胞。

【1064】

実施形態５４．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低下させる改変が、Ｂ２Ｍ遺伝子の活性を低下させる、実施形態５３に記載の操作細胞。

【1065】

実施形態５５．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる改変が、Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む、実施形態５３または５４に記載の操作細胞。

【1066】

実施形態５６．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下させる改変が、すべてのＢ２Ｍコード配列の不活性化または破壊を含む、実施形態５３～５５のいずれかに記載の操作細胞。

【1067】

実施形態５７．前記不活性化または破壊が、Ｂ２Ｍ遺伝子におけるインデル、またはＢ２Ｍ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域の欠失を含む、実施形態５５または５６に記載の操作細胞。

【1068】

実施形態５８．前記インデルが、フレームシフト変異である、実施形態５７に記載の操作細胞。

【1069】

実施形態５９．前記Ｂ２Ｍ遺伝子が、ノックアウトされている、実施形態５２～５８のいずれかに記載の操作細胞。

【1070】

実施形態６０．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子のタンパク質発現を低下させる改変が、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集によるものである、実施形態５２～５９のいずれかに記載の操作細胞。

【1071】

実施形態６１．前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集が、Ｂ２Ｍ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものである、実施形態６４に記載の操作細胞。

【1072】

実施形態６２．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせのＣａｓが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択されている、実施形態６１に記載の操作細胞。

【1073】

実施形態６３．前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせが、Ｂ２Ｍ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態６２に記載の操作細胞。

【1074】

実施形態６４．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせが、前記ｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、実施形態６３に記載の操作細胞。

【1075】

実施形態６５．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる改変が、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の細胞表面発現を低下させる、実施形態１～６４のいずれかに記載の操作細胞。

【1076】

実施形態６６．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる改変が、ＣＩＩＴＡの発現を低下させる、実施形態１～６５のいずれかに記載の操作細胞。

【1077】

実施形態６７．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低下させる改変が、ＣＩＩＴＡ遺伝子の活性を低下させる、実施形態６６に記載の操作細胞。

【1078】

実施形態６８．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる改変が、ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊を含む、実施形態６６または６７に記載の操作細胞。

【1079】

実施形態６９．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下させる改変が、すべてのＣＩＩＴＡコード配列の不活性化または破壊を含む、実施形態６５～６８のいずれかに記載の操作細胞。

【1080】

実施形態７０．前記不活性化または破壊が、ＣＩＩＴＡ遺伝子におけるインデル、またはＣＩＩＴＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域の欠失を含む、実施形態６８または６９に記載の操作細胞。

【1081】

実施形態７１．前記インデルが、フレームシフト変異である、実施形態７０に記載の操作細胞。

【1082】

実施形態７２．前記ＣＩＩＴＡ遺伝子が、ノックアウトされている、実施形態６５～７１のいずれかに記載の操作細胞。

【1083】

実施形態７３．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子のタンパク質発現を低下させる改変が、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集によるものである、実施形態６５～７２のいずれかに記載の操作細胞。

【1084】

実施形態７４．前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集が、ＣＩＩＴＡ遺伝子を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものである、実施形態７３に記載の操作細胞。

【1085】

実施形態７５．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせのＣａｓが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２から選択されている、実施形態７４に記載の操作細胞。

【1086】

実施形態７６．前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせが、ＣＩＩＴＡ遺伝子内の少なくとも１つの標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態７５に記載の操作細胞。

【1087】

実施形態７７．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせが、前記ｇＲＮＡとＣａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、実施形態７６に記載の操作細胞。

【1088】

７８．ヒト細胞または動物細胞であるか、または前記細胞に由来する、実施形態１～７７のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1089】

実施形態７９．ヒト細胞であるか、またはヒト細胞に由来する、実施形態７８に記載の操作細胞。

【1090】

実施形態８０．多能性幹細胞もしくはその子孫に由来する分化細胞であるか、または前記分化細胞に由来する、実施形態１～７９のいずれかに記載の操作細胞。

【1091】

実施形態８１．前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞であるか、または人工多能性幹細胞に由来する、実施形態８０に記載の操作細胞。

【1092】

実施形態８２．ドナー対象から単離した初代細胞であるか、または前記初代細胞に由来する、実施形態１～８１のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1093】

実施形態８３．前記ドナー対象が、前記初代細胞を前記ドナー対象から得る時点に、健常であるか、または疾患もしくは病態である疑いがない、実施形態８２に記載の操作細胞。

【1094】

実施形態８４．膵島β細胞、Ｂ細胞、網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心臓細胞及び血液細胞から選択されている、実施形態１～８３のいずれかに記載の操作細胞。

【1095】

実施形態８５．内皮細胞であるか、または内皮細胞に由来する、実施形態１～８４のいずれかに記載の操作細胞。

【1096】

実施形態８６．上皮細胞であるか、または上皮細胞に由来する、実施形態１～８４のいずれかに記載の操作細胞。

【1097】

実施形態８７．多能性幹細胞であるか、または多能性幹細胞に由来する、実施形態１～８４のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1098】

実施形態８８．胚性幹細胞であるか、または胚性幹細胞に由来する、実施形態１～８４のいずれかに記載の操作細胞。

【1099】

実施形態８９．間葉系列の細胞であるか、または前記細胞に由来する、実施形態１～８４のいずれかに記載の操作細胞。

【1100】

実施形態９０．Ｏ型ＡＢＯ血液型、Ｒｈ因子陰性（Ｒｈ－）の１つ以上であり、機能型のＡＢＯ Ａアレル及び／または機能型のＡＢＯ Ｂアレル、あるいはＲｈ因子陽性（Ｒｈ＋）を含む、実施形態１～８９のいずれかに記載の操作細胞。

【1101】

実施形態９１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、実施形態１～２０７のいずれか１つに記載の操作細胞。

【1102】

実施形態９２．実施形態１～９１のいずれか１つに記載の操作細胞の集団。

【1103】

実施形態９３．前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて改変を含む、実施形態９２に記載の操作細胞集団。

【1104】

実施形態９４．前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかで、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が低下している、実施形態９２または９３に記載の集団。

【1105】

実施形態９５．前記操作細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下している、実施形態９２～９４のいずれか１つに記載の集団。

【1106】

実施形態９６．前記集団中の細胞の少なくとも約５０％で、ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が見られない、実施形態９２～９５のいずれか１つに記載の集団。

【1107】

実施形態９７．前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかで、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が低下している、実施形態９２～９６のいずれか１つに記載の集団。

【1108】

実施形態９８．前記操作細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現レベルの約６０％以下であるレベルまで低下している、実施形態９２～９７のいずれか１つに記載の集団。

【1109】

実施形態９９．前記集団中の細胞の少なくとも約５０％で、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が見られない、実施形態９２～９８のいずれか１つに記載の集団。

【1110】

実施形態１００．前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記１つ以上の寛容原性因子をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態９２～９９のいずれか１つに記載の集団。

【1111】

実施形態１０１．前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態９２～１００のいずれかに記載の集団。

【1112】

実施形態１０２．前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含む、実施形態９２～１０１のいずれかに記載の集団。

【1113】

実施形態１０３．前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、Ｂ２Ｍ及び／またはＣＩＩＴＡの発現の低下を含む、実施形態９２～１０２のいずれかに記載の集団。

【1114】

実施形態１０４．前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現の低下を含む、実施形態９２～１０３のいずれかに記載の集団。

【1115】

実施形態１０５．前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルの両方を不活性化する１つ以上の変化を含む、実施形態９２～１０４のいずれかに記載の集団。

【1116】

実施形態１０６．前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルの両方を不活性化する１つ以上の変化を含む、実施形態９２～１０５のいずれかに記載の集団。

【1117】

実施形態１０７．実施形態９２～１０６のいずれかに記載の集団を含む組成物。

【1118】

実施形態１０８．（ａ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかで、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、前記操作細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、（ｂ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、ならびに（ｃ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含み、前記操作細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下している、実施形態９２～１０７のいずれか１つに記載の操作細胞の集団を含む組成物。

【1119】

実施形態１０９．（ａ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかで、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、前記操作細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、（ｂ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、（ｃ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含み、前記操作細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下している、実施形態９２～１０７のいずれか１つに記載の操作細胞の集団を含む組成物。

【1120】

実施形態１１０．（ａ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかで、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、前記操作細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、（ｂ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかで、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現が低下しており、前記操作細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＢポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下しており、（ｃ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含み、ならびに（ｄ）前記集団中の細胞の少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．９％または約９９．９９％のいずれかが、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞と比べて、前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現の低下を含み、前記操作細胞上での１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の表面発現の低下が、前記改変を含まない同じ細胞種の未改変または未変化の細胞上でのＭＩＣＡポリペプチドの細胞表面発現レベルの６０％以下であるレベルまで低下している、実施形態９２～１０７のいずれか１つに記載の操作細胞の集団を含む組成物。

【1121】

実施形態１１１．操作した初代膵島β細胞の集団を含む組成物であって、前記操作した初代膵島β細胞が、（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊を含む前記組成物。

【1122】

実施形態１１２．操作した初代Ｔ細胞の集団を含む組成物であって、前記操作した初代Ｔ細胞が、（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊を含む前記組成物。

【1123】

実施形態１１３．操作した初代甲状腺細胞の集団を含む組成物であって、前記操作した初代甲状腺細胞が、（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子（ＣＤ４７ｔｇ）、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊を含む前記組成物。

【1124】

実施形態１１４．操作した初代皮膚細胞の集団を含む組成物であって、前記操作した初代皮膚細胞が、（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子（ＣＤ４７ｔｇ）、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊を含む前記組成物。

【1125】

実施形態１１５．操作した初代内皮細胞の集団を含む組成物であって、前記操作した初代内皮細胞が、（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子（ＣＤ４７ｔｇ）、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊を含む前記組成物。

【1126】

実施形態１１６．操作した初代網膜色素上皮細胞の集団を含む組成物であって、前記操作した初代網膜色素上皮細胞が、（ｉ）ＭＩＣＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、及び／またはＭＩＣＢ遺伝子のアレルのすべての不活性化もしくは破壊、（ｉｉ）ＣＤ４７をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む導入遺伝子（ＣＤ４７ｔｇ）、ならびに（ｉｉｉ）Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊を含む前記組成物。

【1127】

実施形態１１７．前記操作細胞集団の操作細胞が、Ｂ２Ｍ遺伝子のアレルのすべてにおけるインデルを含む、実施形態１１１～１１６のいずれかに記載の組成物。

【1128】

実施形態１１８．前記操作細胞集団の操作細胞が、ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルのすべての不活性化または破壊をさらに含む、実施形態１１１～１１７のいずれかに記載の組成物。

【1129】

実施形態１１９．前記操作細胞集団の操作細胞が、ＣＩＩＴＡ遺伝子のアレルのすべてにおけるインデルを含む、実施形態１１１～１１８のいずれかに記載の組成物。

【1130】

実施形態１２０．前記操作細胞集団の操作細胞が、ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇという表現型を有する、実施形態１１１～１１９のいずれかに記載の組成物。

【1131】

実施形態１２１．前記操作細胞集団の操作細胞が、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇという表現型を有する、実施形態１１１～１１９のいずれかに記載の組成物。

【1132】

実施形態１２２．前記操作細胞集団の操作細胞が、ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇという表現型を有する、実施形態１１１～１１９のいずれかに記載の組成物。

【1133】

実施形態１２３．前記操作細胞が、ヌクレアーゼベースの遺伝子編集を用いて操作されている、実施形態１０７～１２２のいずれか１つに記載の組成物。

【1134】

実施形態１２４．前記組成物が、医薬組成物である、実施形態１０７～１２３のいずれか１つに記載の組成物。

【1135】

実施形態１２５．薬学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む、実施形態１０７～１２４のいずれかに記載の組成物。

【1136】

実施形態１２６．凍結保護剤を含む、実施形態１０７～１２５のいずれかに記載の組成物。

【1137】

実施形態１２７．前記凍結保護剤が、ＤＭＳＯを約５％～約１０％のＤＭＳＯ（ｖ／ｖ）という濃度で含む、実施形態１２６に記載の組成物。

【1138】

実施形態１２８．実施形態１０７～１２７のいずれかに記載の組成物を含む容器。

【1139】

実施形態１２９．滅菌バッグである、実施形態１２８に記載の容器。

【1140】

実施形態１３０．前記滅菌バッグが、凍結保存に適合している、実施形態１２９に記載の容器。

【1141】

実施形態１３１．操作細胞を作製する方法であって、（ａ）供給源細胞で、１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び／または１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または消失させること、（ｂ）前記供給源細胞で、１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させること、ならびに（ｃ）前記供給源細胞で、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下または消失させることを含む前記方法。

【1142】

実施形態１３２．前記１つ以上の寛容原性因子を、ＣＤ４７、ＣＤ２７、ＣＤ２００、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｅ重鎖、ＨＬＡ－Ｇ、ＰＤ－Ｌ１、ＩＤＯｌ、ＣＴＬＡ４－Ｉｇ、Ｃ１インヒビター、ＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＦＡＳＬ、ＣＣＬ２１、ＭＦＧＥ８及びＳＥＲＰＩＮＢ９、ならびにこれらの組み合わせのいずれかからなる群から選択する、実施形態１３１に記載の方法。

【1143】

実施形態１３３．前記１つ以上の寛容原性因子を、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１、ＨＬＡ－ＥまたはＨＬＡ－Ｇ、ＣＣＬ２１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８、ならびにこれらの組み合わせのいずれかからなる群から選択する、実施形態１３１または１３２に記載の方法。

【1144】

実施形態１３４．前記１つ以上の寛容原性因子の少なくとも１つが、ＣＤ４７である、実施形態１３１～１３３のいずれかに記載の方法。

【1145】

実施形態１３５．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子及び１つ以上のＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を低下または消失させることを含む、実施形態１３１～１３４のいずれかに記載の方法。

【1146】

実施形態１３６．操作細胞を作製する方法であって、（ａ）供給源細胞で、ＣＣＬ２１、ＰＤ－Ｌ１、ＦＡＳＬ、ＳＥＲＰＩＮＢ９、ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ４７、ＣＤ２００及びＭＦＧＥ８の発現を増加させること、ならびに（ｂ）前記供給源細胞で、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下させることを含む前記方法。

【1147】

実施形態１３７．前記方法が、ＭＩＣＡの発現を低下または消失させることを含み、前記発現を低下または消失させることが、ＭＩＣＡタンパク質の発現を低下または消失させることを含む、実施形態１３１～１３６のいずれか１つに記載の方法。

【1148】

実施形態１３８．前記方法が、ＭＩＣＢの発現を低下または消失させることを含み、前記発現を低下または消失させることが、ＭＩＣＢタンパク質の発現を低下または消失させることを含む、実施形態１３１～１３７のいずれか１つに記載の方法。

【1149】

実施形態１３９．前記方法が、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現を低下または消失させることを含み、前記発現を低下または消失させることが、ＭＩＣＡタンパク質及びＭＩＣＢタンパク質の発現を低下または消失させることを含む、実施形態１３１～１３８のいずれか１つに記載の方法。

【1150】

実施形態１４０．前記発現を低下または消失させることが、細胞表面発現を低下または消失させることを含む、実施形態１３１～１３９のいずれか１つに記載の方法。

【1151】

実施形態１４１．発現を低下または消失させることが、該当遺伝子の活性を低下または消失させる改変を導入することを含む、実施形態１３１～１４０のいずれか１つに記載の方法。

【1152】

実施形態１４２．前記改変が、遺伝子のアレルの両方の不活性化または破壊である、実施形態１４１に記載の方法。

【1153】

実施形態１４３．前記不活性化または破壊が、インデルを含む、実施形態１４２に記載の方法。

【1154】

実施形態１４４．前記インデルが、前記遺伝子のゲノムＤＮＡの連続領域のフレームシフト変異または欠失である、実施形態１４３に記載の方法。

【1155】

実施形態１４５．該当遺伝子の活性をノックアウトすることを含む、実施形態１４１～１４４のいずれか１つに記載の方法。

【1156】

実施形態１４６．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下または消失させる改変が、Ｂ２Ｍの改変である、実施形態１４１～１４５のいずれか１つに記載の方法。

【1157】

実施形態１４７．前記１つ以上のＭＨＣクラスＩ分子の発現を低下または消失させる改変が、ＣＩＩＴＡの改変である、実施形態１４１～１４６のいずれか１つに記載の方法。

【1158】

実施形態１４８．ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集を介して、前記改変を行う、実施形態１４１～１４７のいずれか１つに記載の方法。

【1159】

実施形態１４９．前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集が、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものである、実施形態１４８に記載の方法。

【1160】

実施形態１５０．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせが、Ｃａｓ９またはＣａｓ１２からなる群から選択したＣａｓを含む、実施形態１４９に記載の方法。

【1161】

実施形態１５１．前記ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせによるものであり、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせが、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、実施形態１４９または１５０に記載の方法。

【1162】

実施形態１５２．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓの組み合わせが、ｇＲＮＡと前記Ｃａｓタンパク質とを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体である、実施形態１５１に記載の方法。

【1163】

実施形態１５３．前記１つ以上の寛容原性因子の発現を増加させる改変が、前記１つ以上の寛容原性因子をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを導入することを含む、実施形態１４１～１５２のいずれか１つに記載の方法。

【1164】

実施形態１５４．前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記寛容原性因子の２つ以上をコードするマルチシストロニックなベクターである、実施形態１５３に記載の方法。

【1165】

実施形態１５５．前記１つ以上の寛容原性因子の少なくとも１つが、ＣＤ４７である、実施形態１３１～１５４のいずれか１つに記載の方法。

【1166】

実施形態１５６．前記少なくとも１つのポリヌクレオチドを、前記細胞のゲノムに組み込む、実施形態１４２～１５５のいずれか１つに記載の方法。

【1167】

実施形態１５７．前記組み込みが、非標的挿入によるものである、実施形態１５６に記載の方法。

【1168】

実施形態１５８．前記組み込みをレンチウイルスベクターによって行う、実施形態１５７に記載の方法。

【1169】

実施形態１５９．前記組み込みが、標的ゲノム遺伝子座への標的挿入によるものである、実施形態１５６に記載の方法。

【1170】

実施形態１６０．前記組み込みを、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集と相同配向型修復によって行う、実施形態１５９に記載の方法。

【1171】

実施形態１６１．前記標的ゲノム遺伝子座を、Ｂ２Ｍ遺伝子座、ＣＩＩＴＡ遺伝子座、ＣＤ１４２遺伝子座、ＴＲＡＣ遺伝子座、ＴＲＢＣ遺伝子座、ＣＣＲ５遺伝子座、ＣＸＣＲ４遺伝子座、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１としても知られる）遺伝子、アルブミン遺伝子座、ＳＨＳ２３１座位、ＣＬＹＢＬ遺伝子座及びＲＯＳＡ２６遺伝子座からなる群から選択する、実施形態１５９または１６０に記載の方法。

【1172】

実施形態１６２．前記操作細胞が所望の細胞種に分化するように、細胞分化技法を行うことをさらに含む、実施形態１３１～１６１のいずれか１つに記載の方法。

【1173】

実施形態１６３．前記供給源細胞をドナー対象から単離する、実施形態１３１～１６２のいずれか１つに記載の方法。

【1174】

実施形態１６４．前記ドナー対象が、単離時点に、健常であるか、または疾患もしくは病態である疑いがない実施形態１６３に記載の方法。

【1175】

実施形態１６５．実施形態１３１～１６４のいずれか１つに記載の方法を用いて作製した操作細胞。

【1176】

実施形態１６６．同種異系療法を用いて個体の病態を治療する方法であって、前記個体に、実施形態９２～１０６のいずれか１つに記載の操作細胞集団、または実施形態１０７～１１５のいずれか１つに記載の組成物を投与することを含む前記方法。

【1177】

実施形態１６７．前記病態が、疾患または細胞不全である、実施形態１６６に記載の方法。

【1178】

実施形態１６８．前記疾患を、ループス、関節リウマチ、クローン病、多発性硬化症、セリアック病、グレーブス病、乾癬及び大腸炎からなる群から選択する、実施形態１６６または１６７に記載の方法。

【1179】

実施形態１６９．前記個体において、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体が循環血液中に存在する、実施形態１６６～１６８のいずれか１つに記載の方法。

【1180】

実施形態１７０．前記個体において、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体が持続的に存在する、実施形態１６９に記載の方法。

【1181】

実施形態１７１．前記個体が、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在の原因となる自己免疫関連病態である、実施形態１６９または１７０に記載の方法。

【1182】

実施形態１７２．前記自己免疫関連病態が、橋本病である、実施形態１７１に記載の方法。

【1183】

実施形態１７３．前記個体が、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在に基づき、前記治療の対象に選ばれた、実施形態１６６～１７２のいずれか１つに記載の方法。

【1184】

実施形態１７４．抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在に基づき、前記個体を前記治療の対象に選ぶことをさらに含む、実施形態１６６～１７３のいずれか１つに記載の方法。

【1185】

実施形態１７５．前記個体を選ぶことが、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の存在を前記個体において測定することをさらに含む、実施形態１７４に記載の方法。

【1186】

実施形態１７６．同種異系療法を用いて個体の病態を治療する方法であって、（ａ）前記個体の抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を判断することであって、抗ＭＩＣＡ抗体陽性の状態により、前記個体から得た血清試料に抗ＭＩＣＡ抗体が存在することが示され、抗ＭＩＣＢ抗体陽性の状態により、前記個体から得た血清試料に抗ＭＩＣＢ抗体が存在することが示される、前記判断することと、（ｂ）抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態に基づき、前記個体に、９２～１０６のいずれか１つに記載の操作細胞集団を含む組成物、または実施形態１０７～１１５のいずれか１つに記載の組成物を投与することであって、前記抗ＭＩＣＡ抗体の状態が陽性である場合には、前記操作細胞集団は、ＭＩＣＡの発現の低下を含み、前記抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、前記操作細胞集団は、ＭＩＣＢの発現の低下を含み、前記抗ＭＩＣＡ抗体の状態及び前記抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、前記操作細胞集団は、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下を含む、前記投与することを含む前記方法。

【1187】

実施形態１７７．前記個体の抗ＭＩＣＡ抗体の状態及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態に基づき、前記個体を前記治療の対象に選ぶことをさらに含む、実施形態１７６に記載の方法。

【1188】

実施形態１７８．前記個体の抗ＭＩＣＡ抗体の状態及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を測定することをさらに含む、実施形態１７６または１７７に記載の方法。

【1189】

実施形態１７９．同種異系療法を必要とする個体での使用に適する同種異系療法を特定する方法であって、前記同種異系療法が、実施形態９２～１０６のいずれか１つに記載の操作細胞集団を含む組成物、または実施形態１０７～１１５のいずれか１つに記載の組成物を含み、前記方法が、前記個体の抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体の状態を判断して、前記個体での使用に適する同種異系療法を特定することを含み、前記抗ＭＩＣＡ抗体の状態が陽性である場合には、前記適する同種異系療法が、ＭＩＣＡの発現の低下を含む操作細胞集団を含み、前記抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、前記適する同種異系療法が、ＭＩＣＢの発現の低下を含む操作細胞集団を含み、前記抗ＭＩＣＡ抗体の状態及び前記抗ＭＩＣＢ抗体の状態が陽性である場合には、前記適する同種異系療法が、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現の低下を含む操作細胞集団を含む前記方法。

【1190】

実施形態１８０．１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に投与することをさらに含む、実施形態１６６～１７８のいずれかに記載の方法。

【1191】

実施形態１８１．前記個体が、１つ以上の免疫抑制剤を投与されている、実施形態１６６～１７８のいずれかに記載の方法。

【1192】

実施形態１８２．前記１つ以上の免疫抑制剤が、小分子または抗体である、実施形態１８０または１８１に記載の方法。

【1193】

実施形態１８３．前記１つ以上の免疫抑制剤を、シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸、ミコフェノール酸モフェチル、副腎皮質ステロイド、プレドニゾン、メトトレキサート、金塩、スルファサラジン、抗マラリア剤、ブレキナル、レフルノミド、ミゾリビン、１５－デオキシスペルグアリン、６－メルカプトプリン、シクロホスファミド、ラパマイシン、タクロリムス（ＦＫ－５０６）、ＯＫＴ３、抗胸腺細胞グロブリン、チモペンチン（チモシン－α）及び免疫抑制抗体からなる群から選択する、実施形態１８０～１８３のいずれかに記載の方法。

【1194】

実施形態１８４．前記１つ以上の免疫抑制剤が、シクロスポリンを含む、実施形態１８０～１８３のいずれかに記載の方法。

【1195】

実施形態１８５．前記１つ以上の免疫抑制剤が、ミコフェノール酸モフェチルを含む、実施形態１８０～１８３のいずれかに記載の方法。

【1196】

実施形態１８６．前記１つ以上の免疫抑制剤が、副腎皮質ステロイドを含む、実施形態１８０～１８３のいずれかに記載の方法。

【1197】

実施形態１８７．前記１つ以上の免疫抑制剤が、シクロホスファミドを含む、実施形態１８０～１８３のいずれかに記載の方法。

【1198】

実施形態１８８．前記１つ以上の免疫抑制剤が、ラパマイシンを含む、実施形態１８０～１８３のいずれかに記載の方法。

【1199】

実施形態１８９．前記１つ以上の免疫抑制剤が、タクロリムス（ＦＫ－５０６）を含む、実施形態１８０～１８３のいずれかに記載の方法。

【1200】

実施形態１９０．前記１つ以上の免疫抑制剤が、抗胸腺細胞グロブリンを含む、実施形態１８０～１８３のいずれかに記載の方法。

【1201】

実施形態１９１．前記１つ以上の免疫抑制剤が、１つ以上の免疫調節剤である、実施形態１８０～１８３のいずれかに記載の方法。

【1202】

実施形態１９２．前記１つ以上の免疫調節剤が、小分子または抗体である、実施形態１９１に記載の方法。

【1203】

実施形態１９３．前記抗体が、ＩＬ－２受容体のｐ７５、ＭＨＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－６、ＩＧＦ、ＩＧＦＲ１、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ５８、及びそれらのリガンドのいずれかに結合する抗体からなる群から選択した受容体またはリガンドの１つ以上に結合する、実施形態１８２または実施形態１９２に記載の方法。

【1204】

実施形態１９４．前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に、前記操作細胞の投与前に投与するかまたは投与したことがある、実施形態１８０～１９３のいずれかに記載の方法。

【1205】

実施形態１９５．前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に、前記操作細胞の投与の少なくとも１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、７日前、８日前、９日前、１０日前、１１日前、１２日前、１３日前または１４日前に投与するかまたは投与したことがある、実施形態１８０～１９４のいずれかに記載の方法。

【1206】

実施形態１９６．前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に、前記操作細胞の投与の少なくとも１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、７週間前、８週間前、９週間前または１０週間以上前に投与するかまたは投与したことがある、実施形態１８０～１９４のいずれかに記載の方法。

【1207】

実施形態１９７．前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に、前記操作細胞の投与の少なくとも１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後または１４日後に投与するかまたは投与したことがある、実施形態１８０～１９４のいずれかに記載の方法。

【1208】

実施形態１９８．前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に、前記操作細胞の投与の少なくとも１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後または１０週間以上後に投与するかまたは投与したことがある、実施形態１８０～１９４のいずれかに記載の方法。

【1209】

実施形態１９９．前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に、前記操作細胞の１回目の投与と同じ日に投与するかまたは投与したことがある、実施形態１８０～１９４のいずれかに記載の方法。

【1210】

実施形態２００．前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に、前記操作細胞の投与後に投与するかまたは投与したことがある、実施形態１８０～１９４のいずれかに記載の方法。

【1211】

実施形態２０１．前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に、前記操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の後に投与するかまたは投与したことがある、実施形態１８０～１９４のいずれかに記載の方法。

【1212】

実施形態２０２．前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に、前記操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の前に投与するかまたは投与したことがある、実施形態１８０～１９４のいずれかに記載の方法。

【1213】

実施形態２０３．前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に、前記操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の少なくとも１日前、２日前、３日前、４日前、５日前、６日前、７日前、８日前、９日前、１０日前、１１日前、１２日前、１３日前または１４日前に投与するかまたは投与したことがある、実施形態１８０～１９４のいずれかに記載の方法。

【1214】

実施形態２０４．前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に、前記操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の少なくとも１週間前、２週間前、３週間前、４週間前、５週間前、６週間前、７週間前、８週間前、９週間前または１０週間以上前に投与するかまたは投与したことがある、実施形態１８０～１９４のいずれかに記載の方法。

【1215】

実施形態２０５．前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に、前記操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の少なくとも１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後または１４日後に投与するかまたは投与したことがある、実施形態１８０～１９４のいずれかに記載の方法。

【1216】

実施形態２０６．前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に、前記操作細胞の１回目及び／または２回目の投与の少なくとも１週間後、２週間後、３週間後、４週間後、５週間後、６週間後、７週間後、８週間後、９週間後または１０週間以上後に投与するかまたは投与したことがある、実施形態１８０～１９４のいずれかに記載の方法。

【1217】

実施形態２０７．前記操作細胞の改変を含まない免疫原性細胞の免疫拒絶を軽減する目的で投与される１つ以上の免疫抑制剤の投与量よりも低い投与量で、前記１つ以上の免疫抑制剤を投与する、実施形態１８０～２０６のいずれかに記載の方法。

【1218】

実施形態２０８．前記操作細胞が、前記操作細胞の殺傷を制御できる、実施形態１８０～２０７のいずれかに記載の方法。

【1219】

実施形態２０９．前記操作細胞が、自殺遺伝子または自殺スイッチを含む、実施形態１８０～２０８のいずれかに記載の方法。

【1220】

実施形態２１０．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、薬物もしくはプロドラッグの存在下で、または選択的な外因性化合物によって活性化されると、制御細胞死を誘導する、実施形態２０９に記載の方法。

【1221】

実施形態２１１．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記操作細胞のアポトーシスを誘導できる誘導タンパク質である、実施形態２０９または実施形態２１０に記載の方法。

【1222】

実施形態２１２．前記操作細胞のアポトーシスを誘導できる前記誘導タンパク質が、カスパーゼタンパク質である、実施形態２１１に記載の方法。

【1223】

実施形態２１３．前記カスパーゼタンパク質が、カスパーゼ９である、実施形態２１２に記載の方法。

【1224】

実施形態２１４．前記自殺遺伝子または自殺スイッチが、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシンによる活性化型のカスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択されている、実施形態２０９～２１３のいずれかに記載の方法。

【1225】

実施形態２１５．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に投与した後に活性化して、制御細胞死を誘導する、実施形態２０９～２１４のいずれかに記載の方法。

【1226】

実施形態２１６．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記１つ以上の免疫抑制剤を前記個体に投与する前に活性化して、制御細胞死を誘導する、実施形態２０９～２１４のいずれかに記載の方法。

【1227】

実施形態２１７．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、前記操作細胞を前記個体に投与した後に活性化して、制御細胞死を誘導する、実施形態２０９～２１６のいずれかに記載の方法。

【1228】

実施形態２１８．前記自殺遺伝子または前記自殺スイッチが、細胞毒性または前記個体に対するその他の悪影響が生じた場合に活性化して、制御細胞死を誘導する、実施形態２０９～２１７のいずれかに記載の方法。

【1229】

実施形態２１９．前記操作細胞集団の操作細胞を枯渇させる薬剤を投与することを含む、実施形態１８０～２１８のいずれかに記載の方法。

【1230】

実施形態２２０．前記操作細胞を枯渇させる薬剤が、前記操作細胞の表面に発現したタンパク質を認識する抗体である、実施形態２１９に記載の方法。

【1231】

実施形態２２１．前記抗体を、ＣＣＲ４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＧＤ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＭＵＣ１、ＰＳＭＡ及びＲＱＲ８を認識する抗体からなる群から選択する、実施形態２２０に記載の方法。

【1232】

実施形態２２２．前記抗体が、モガムリズマブ、ＡＦＭ１３、ＭＯＲ２０８、オビヌツズマブ、ウブリツキシマブ、オカラツズマブ、リツキシマブ、リツキシマブ－Ｒｌｌｂ、トムゾツキシマブ、ＲＯ５０８３９４５（ＧＡ２０１）、セツキシマブ、Ｈｕｌ４．１８Ｋ３２２Ａ、Ｈｕｌ４．１８－ＩＬ２、Ｈｕ３Ｆ８、ジヌツキシマブ、ｃ．６０Ｃ３－Ｒｌｌｃ、及びこれらのバイオシミラーからなる群から選択されている、実施形態２２０または実施形態２２１に記載の方法。

【1233】

実施形態２２３．前記操作細胞の表面上の１つ以上の寛容原性因子を認識する薬剤を投与することを含む、実施形態１６６～１７８及び２１９～２２２のいずれかに記載の方法。

【1234】

実施形態２２４．前記操作細胞が、前記１つ以上の寛容原性因子を発現するように操作されている、実施形態２２３に記載の方法。

【1235】

実施形態２２５．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７である、実施形態２２３または２２４に記載の方法。

【1236】

実施形態２２６．１つ以上の追加の治療剤を前記個体に投与することをさらに含む、実施形態１６６～２２５のいずれかに記載の方法。

【1237】

実施形態２２７．前記個体が、１つ以上の追加の治療剤を投与されたことがある、実施形態１６６～２２６のいずれかに記載の方法。

【1238】

実施形態２２８．前記方法の治療有効性をモニタリングすることをさらに含む、実施形態１６６～２２７のいずれかに記載の方法。

【1239】

実施形態２２９．前記方法の予防有効性をモニタリングすることをさらに含む、実施形態１６６～２２８のいずれかに記載の方法。

【1240】

実施形態２３０．１つ以上の疾患症状が所望どおりに抑制されるまで繰り返す、実施形態１６６～２２９のいずれかに記載の方法。

【1241】

実施形態２３１．自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態１～９１のいずれかに記載の操作細胞。

【1242】

実施形態２３２．前記自殺遺伝子または自殺スイッチが、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシンによる活性化型のカスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択されている、実施形態２３１に記載の操作細胞。

【1243】

実施形態２３３．前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記自殺遺伝子またはそのセーフティスイッチと関連する遺伝子が、前記操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する、実施形態２３１または実施形態２３２に記載の操作細胞。

【1244】

実施形態２３４．前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記１つ以上の寛容原性因子が、前記操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する、実施形態２３１または実施形態２３２に記載の操作細胞。

【1245】

実施形態２３５．前記バイシストロニックなカセットが、任意に、レンチウイルスベクターを用いて前記外因性ポリヌクレオチドを前記細胞に導入することによって、前記操作細胞のゲノムに、非標的挿入によって組み込まれている、実施形態２３３または実施形態２３４に記載の操作細胞。

【1246】

実施形態２３６．前記バイシストロニックなカセットが、前記細胞の標的ゲノム遺伝子座に、標的挿入によって組み込まれており、任意に、前記標的挿入が、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集と相同配向型修復によるものである、実施形態２３５に記載の操作細胞。

【1247】

実施形態２３７．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７である、実施形態２３０～２３６のいずれかに記載の操作細胞。

【1248】

実施形態２３８．前記操作細胞が、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態１３１～１６４のいずれかに記載の方法。

【1249】

実施形態２３９．前記自殺遺伝子が、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシンによる活性化型のカスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択されている、実施形態２３８に記載の方法。

【1250】

実施形態２４０．前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記自殺遺伝子またはそのセーフティスイッチと関連する遺伝子が、前記操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する、実施形態２３８または実施形態２３９に記載の方法。

【1251】

実施形態２４１．前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記１つ以上の寛容原性因子が、前記操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する、実施形態２３８または実施形態２３９に記載の方法。

【1252】

実施形態２４２．前記バイシストロニックなカセットが、前記操作細胞のゲノムに、非標的挿入によって組み込まれている、実施形態２４０または実施形態２４１に記載の方法。

【1253】

実施形態２４３．前記バイシストロニックなカセットが、前記操作細胞の標的ゲノム遺伝子座に、標的挿入によって組み込まれている、実施形態２４０または実施形態２４１に記載の方法。

【1254】

実施形態２４４．前記１つ以上の寛容原性因子が、ＣＤ４７である、実施形態２３８～２４３のいずれかに記載の方法。

【1255】

実施形態２４５．前記操作細胞集団の操作細胞が、自殺遺伝子または自殺スイッチをコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、実施形態１０７～１２７のいずれかに記載の組成物。

【1256】

実施形態２４６．前記自殺遺伝子または自殺スイッチが、シトシンデアミナーゼ（ＣｙＤ）、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－Ｔｋ）、誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐａｓｅ９）、及びラパマイシンによる活性化型のカスパーゼ９（ｒａｐａＣａｓｐ９）からなる群から選択されている、実施形態２４５に記載の組成物。

【1257】

実施形態２４７．前記自殺遺伝子、及び前記自殺遺伝子またはそのセーフティスイッチと関連する遺伝子が、前記操作細胞集団の操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する、実施形態２４５または実施形態２４６に記載の組成物。

【1258】

実施形態２４８．前記自殺遺伝子または自殺スイッチ、及び前記外因性ＣＤ４７が、前記操作細胞のゲノムに組み込まれたバイシストロニックなカセットから発現する、実施形態２４５または実施形態２４７に記載の組成物。

【1259】

実施形態２４９．前記バイシストロニックなカセットが、任意に、レンチウイルスベクターを用いて前記外因性ポリヌクレオチドを前記操作細胞集団の操作細胞に導入することによって、前記ゲノムに、非標的挿入によって組み込まれている、実施形態２４７または実施形態２４８に記載の組成物。

【1260】

実施形態２５０．前記バイシストロニックなカセットが、前記操作細胞集団の操作細胞の標的ゲノム遺伝子座に、標的挿入によって組み込まれており、任意に、前記標的挿入が、ヌクレアーゼの媒介による遺伝子編集と相同配向型修復によるものである、実施形態２４７または実施形態２４８に記載の組成物。

【1261】

本発明は、その範囲が、開示されている特定の実施形態に限定されるようには意図されておらず、それらの実施形態は、例えば、本発明の様々な態様を例示する目的で示されている。記載されている組成物及び方法に対する様々な修正は、本明細書の説明及び教示から明らかになるであろう。このような変形形態は、本開示の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく実施することができ、本開示の範囲内に含まれるように意図されている。

【実施例】

【1262】

以下の実施例は、例示の目的のために含まれているに過ぎず、本発明の範囲を限定するようには意図されていない。

【1263】

実施例１
この実施例は、マイナー組織適合性抗原ＭＨＣクラスＩ分子ポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）及び／またはＭＨＣクラスＩ分子ポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）の発現が低下している細胞の調製を説明するものである。操作細胞（例えば、細胞療法用の細胞）は、低免疫原性かつ多能性（ＨＩＰ）の改変を行うため、及び／またはその改変をさらに改善させるために、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの低下の恩恵を受けることになる。

【1264】

細胞は、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下させるように操作する。具体的には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集法を用いて、膵島β細胞、免疫細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マクロファージ細胞、網膜色素上皮細胞、肝細胞、甲状腺細胞、内皮細胞、皮膚細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、筋肉細胞、心臓細胞、血液細胞、膵臓の膵島細胞、平滑筋細胞、グリア前駆細胞、神経細胞、心筋細胞、幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉幹細胞、胚性幹細胞及び多能性幹細胞（ＰＳＣ）内のＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢをノックアウトする。ｇＲＮＡ配列を用いて、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのアレルのすべてをノックアウトでき、その配列は、ＭＩＣＡの場合にはＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＣＡＴＡＴＣＡ（配列番号３６）、ＭＩＣＢの場合にはＧＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＴＡＧＣＧＣ（配列番号３７）である。リボ核酸における場合には、ウラシルについては「ｕ」、チミンについては「ｔ」とする代わりに、ウラシル及びチミンの両方とも「ｔ」とできることを当業者は分かるであろうし、別段に示されていない限り、「ｔ」を用いて、ウラシルを表すことができることは分かるであろう。得られた細胞は、ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}及び／またはＭＩＣＢ^{インデル／インデル}と称することができる。

【1265】

Ｂ２Ｍのノックアウト（例えばＢ２Ｍ^{インデル／インデル}という）及び／またはＣＩＩＴＡのノックアウト（例えばＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}という）及び／または１つ以上の寛容原性因子、例えばＣＤ４７の発現の増加（例えばＣＤ４７ｔｇという）を含め、追加の改変が想定されている。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子の少なくとも１つは、異種のポリペプチドである。いくつかの実施形態では、その１つ以上の寛容原性因子の少なくとも１つは、内在性ポリペプチドであり、その内在性ポリペプチドの発現は、プロモーターの改変または導入によって増加させる。

【1266】

実施例２．様々なヒト細胞種におけるＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現、ならびにＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ＴＧの細胞の生成
この実施例は、ヒトｉＰＳＣ及びその誘導体、例えばＭＳＣ、ならびに初代Ｔ細胞及び初代膵島β細胞でのマイナー組織適合性抗原ＭＨＣクラスＩ分子ポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）及びＭＨＣクラスＩ分子ポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）の発現を解析した試験を説明するものである。

【1267】

Ａ．方法
細胞の操作及びｉＰＳＣの刺激：標準的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技法を用いて、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}の誘導ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を操作し、外因性のＣＤ４７タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターのトランスダクションによって、外因性ＣＤ４７をコードする導入遺伝子（ｔｇ）をその細胞に導入した（いくつかの実施形態では、得られる細胞は、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのｈｉＰＳＣという）。該当する場合には、標準的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集技法を用いて、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢをノックアウトした（いくつかの実施形態では、得られる操作細胞は、ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのｈｉＰＳＣという）。ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢのアレルのすべてをノックアウトするのに用いるｇＲＮＡ配列は、ＭＩＣＡの場合にはＧＡＴＧＡＣＣＣＴＧＧＣＴＣＡＴＡＴＣＡ（配列番号３６）、ＭＩＣＢの場合にはＧＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＴＣＡＴＡＧＣＧＣ（配列番号３７）である。リボ核酸における場合には、ウラシルについては「ｕ」、チミンについては「ｔ」とする代わりに、ウラシル及びチミンの両方とも「ｔ」とできることを当業者は分かるであろうし、別段に示されていない限り、「ｔ」を用いて、ウラシルを表すことができることは分かるであろう。

【1268】

示されている場合には、万が一、ＭＩＣＡ抗原及び／またはＭＩＣＢ抗原が、その細胞に存在するか、及び／またはその細胞によって産生されるのに備えて、ある濃度のＩＦＮ－γ及び／またはＴＮＦ－αとともにインキュベーションして、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの細胞表面発現を刺激することによって、ｉＰＳＣを刺激した。

【1269】

初代Ｔ細胞及び初代膵島β細胞の単離：初代ヒトＴ細胞は、健常ドナーの末梢血単核球（ＰＢＭＣ）試料から取得した。具体的には、その試料を解凍し、ＣＤ３による選別によって濃縮した。初代ヒト膵島β細胞は、標準的な技法を用いて、健常ドナーから単離した。このような技法は、Ｊ．Ｋｅｒｒ－Ｃｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，８９，２０１０に記載されているような技法を含め、当該技術分野で知られている。

【1270】

間葉細胞の分化及び操作：ｈｉＰＳＣ細胞を間葉細胞誘導培地中で培養してから、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ培地で（４日目に）培養した。その後、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＳＦ Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅをコートした新たなシャーレ上に、細胞を継代する。ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ Ｐｌｕｓ培地中で、ＭＳＣ様になるまで細胞を２１日間培養してから、さらに７日間培養して、ＭＳＣにした。上述のように、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ及びＣＤ４７の改変を行った。

【1271】

フローサイトメトリー： ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの両方を認識する抗ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ抗体を用いたフローサイトメトリーによって、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの表面発現レベルを評価した。アイソタイプ抗体をコントロールとして使用した。

【1272】

Ｂ．結果
未操作ｈｉＰＳＣ、またはＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのｈｉＰＳＣ上のＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの表面発現の解析により、これらの細胞種が、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αによる刺激に応じても、その細胞表面上でＭＩＣＡまたはＭＩＣＢを発現しないことが実証された（図２）。図３Ａ及び３Ｂに示されているように、初代ヒトＴ細胞（図３Ａ）、膵島β細胞（図３Ｂ）、またはｉＰＳＣ由来の膵島細胞（図３Ｃ）上で、ＭＩＣＡもＭＩＣＢも発現しなかった。

【1273】

これに対して、ヒトｉＰＳＣから分化させたＭＳＣ上では、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢが発現した（図４Ａ）。未操作のｉＰＳＣ由来ＭＳＣは、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現が、アイソタイプ（Ｉ）コントロールと比べて１６．７倍増加した。Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇは、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現が、アイソタイプ（Ｉ）コントロールと比べて１９．６倍増加した。これにより、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現を低下させる改変、ならびにＣＤ４７の発現を増加させる改変によっても、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現が低下しないことが示されている。ＭＳＣ由来のＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのｈｉＰＳＣにおいて、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの表面発現を消失しさせて、ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのｈｉＰＳＣを生成した（図４Ｂ）。特に、ある特定の自己免疫疾患である対象では、ＭＩＣＡ及びＭＩＣＢの発現により、細胞性及び／または液性の応答が誘導されることがあるので、この結果により、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの発現を低下させることで、例えば自己免疫疾患である患者に、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢを発現するある特定の細胞種、例えばＭＳＣまたはｉＰＳＣ由来のＭＳＣを同種異系移植する際に、恩恵をもたらす可能性があることが示されている。

【1274】

実施例３．橋本病の自己免疫障害である患者の血清は、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体を含む
ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢに対する抗体が、甲状腺の自己免疫疾患である橋本病の患者に存在するかを評価するために、橋本病患者の血清において、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢに対する既存抗体が存在するかを試験した。

【1275】

橋本病である５人のボランティア及び１人の健常ボランティアから、血清を採取した。１．５ｍＬの血清を１．５ｍＬのミルク及び７μｇの組み換えタンパク質（ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢ）と一晩インキュベートした。次に、各試料をヒトＩｇＧ抗体と１時間インキュベートして、ウエスタンブロットを用いて、ＭＩＣＡまたはＭＩＣＢに結合した抗体を検出した。

【1276】

図５に示されているように、橋本病患者の血清中では、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢに対する抗体が検出されたが、健常ボランティアの血清中では検出されなかった。

【1277】

さらなる解析を行って、橋本病であるボランティア及び健常ボランティアから得た血清を用いて、操作細胞（Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣ、ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣ、またはＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのｉＰＳＣ）に結合しているドナー特異的抗体（ＤＳＡ）を測定した。Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣへの結合によって立証されたように、橋本病のボランティアから得た血清には、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体が含まれており（図６Ａ）、この血清では、ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣへの結合は観察されなかった（図６Ｂ）。橋本病のボランティアから得た血清でも、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのｉＰＳＣに結合している検出可能なＤＳＡは見られなかった（図６Ｃ）。

【1278】

予想どおり、健常ボランティアから得た血清には、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣ（図６Ｄ）、またはＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣ（図６Ｅ）に結合している検出可能なＤＳＡが見られなかったことよって示されたように、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体は含まれなかった。

【1279】

細胞の増殖及び細胞の生存能を無標識でモニタリングして、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を測定するｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）ＭＰプラットフォームを用いて、さらなる解析を行った。Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}（ｄＫＯ）のＭＳＣ、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣ、またはＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣを、橋本病ボランティアから得た血清と、抗ＭＩＣＡ／Ｂブロッキング抗体の存在下（右の列）または非存在下（左の列）でインキュベートした。インキュベーション経過時間に伴って、細胞溶解（正規化細胞指数として記録したインピーダンスの変化によって求めた）を測定することによってＣＤＣを解析した（正規化細胞指数の低下は、細胞の溶解または殺傷の増加を示す）。橋本病である１人のボランティアの代表的な結果は、図７Ａに示されており、ｄＫＯ及びＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣがＣＤＣにより殺傷されたことが実証され、この殺傷は、抗ＭＩＣＡ／Ｂ抗体の存在下でブロックし得る（（ａ）及び（ｂ）の列を参照されたい）。これに対して、ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣでは、抗ＭＩＣＡ／Ｂブロッキング抗体の有無にかかわらず、ＣＤＣによる細胞死は観察されなかった（（ｃ）の列を参照されたい）。橋本病である他のボランティアから得た血清でも、同様の結果が観察された。その操作細胞のいずれでも、健常ボランティアから得た血清とインキュベーション後、ＣＤＣの媒介による細胞殺傷は観察されなかった（図７Ｂ）。

【1280】

この試験結果から、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体が、ある特定の自己免疫疾患、例えば橋本病の患者の血清中に存在することがある一方で、これらの抗体が典型的には、健常ドナーから得た血清中に存在しないことが示されている。これらの結果から、いくつかの態様では、血清抗体検査を用いて、細胞の移植を必要とする患者が、その細胞の表面上のＭＩＣＡまたはＭＩＣＢを認識し得る抗ＭＩＣＡ抗体または抗ＭＩＣＢ抗体の存在により、その細胞に対して免疫応答を引き起こして、その結果、非操作細胞の殺傷が発生しやすい可能性があるか判断できることが裏付けられている。さらに、これらの結果により、同種異系細胞療法、特に、ＭＩＣＡもしくはＭＩＣＢを発現もしくはアップレギュレートするか、またはＭＩＣＡもしくはＭＩＣＢに対する抗体が血清に存在する対象に投与するためのものであるある特定の細胞種を伴う細胞療法で、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの追加のノックアウトも含む操作細胞、例えば、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇの改変を含む細胞を使用することにも裏付けが与えられている。

【1281】

実施例４．多発性硬化症患者の血清は、抗ＭＩＣＢ抗体を含む
この実施例には、抗ＭＩＣＡ抗体及び／または抗ＭＩＣＢ抗体が、多発性硬化症である個々のボランティアから得た血清に存在することを示す解析結果が説明されている。加えて、その血清試料のＣＤＣの機能を評価した。

【1282】

図８に示されているように、多発性硬化症の患者の血清中で、ＭＩＣＢに対する抗体が検出された。すでに述べたように、抗ＭＩＣＡ抗体及び抗ＭＩＣＢ抗体は、健常ボランティアの血清中では見られなかった。

【1283】

さらなる解析を行って、多発性硬化症であるボランティアから得た血清を用いて、操作細胞（ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣ、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣ、もしくはＣＤ４７ｔｇのＭＳＣ、またはＢ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのｉＰＳＣ）に結合しているＤＳＡを測定した。図９Ａに示されているように、多発性硬化症であるボランティアから得た血清は、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣに結合している抗ＭＩＣＢ抗体を含む。図９Ｂに示されているように、多発性硬化症ボランティアから得た血清は、ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣに結合していない抗ＭＩＣＢ抗体を含む。図９Ｃに示されているように、多発性硬化症であるボランティアから得た血清は、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのｉＰＳＣに結合する抗体を含まず、このｉＰＳＣは、ＭＩＣＡ及び／またはＭＩＣＢの細胞表面発現が見られない。

【1284】

図１０Ａ～１０Ｃに示されているように、多発性硬化症ボランティアの血清中の既存のＭＩＣＢ抗体は、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣのＣＤＣを誘導する。これに対して、ＭＩＣＡ^{インデル／インデル}、ＭＩＣＢ^{インデル／インデル}、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇのＭＳＣでは、ＣＤＣによる細胞死は観察されなかった。健常ボランティアから得た血清の解析結果は、コントロールとして示されている（図１０Ｃの一部）。

【1285】

この試験結果から、抗ＭＩＣＢ抗体が、多発性硬化症の患者の血清中に存在することがある一方で、このような抗体は典型的には、健常ドナーから得た血清中には存在しないことが示されている。これらの結果から、いくつかの態様では、血清抗体検査を用いて、細胞移植を必要とする患者が、その細胞の表面上のＭＩＣＢを認識し得る抗ＭＩＣＢ抗体の存在により、その細胞に対して免疫応答を引き起こしやすい可能性があるかを判断できることが裏付けられている。さらに、これらの結果により、同種異系細胞療法、特に、ＭＩＣＢを発現もしくはアップレギュレートするか、またはＭＩＣＢに対する抗体が血清中に存在する対象に投与するためのものであるある特定の細胞種を伴う細胞療法で、ＭＩＣＢの追加のノックアウトも含む操作細胞、例えば、Ｂ２Ｍ^{インデル／インデル}、ＣＩＩＴＡ^{インデル／インデル}、ＣＤ４７ｔｇの改変を含む細胞を使用することにも裏付けが与えられている。

【1286】

実施例５．抗ＭＩＣＡ抗体及び抗ＭＩＣＢ抗体の状態及び種の解析
この実施例には、様々な血清供給源における抗ＭＩＣＡ抗体及び抗ＭＩＣＢ抗体の存在についての解析結果が説明されている。

【1287】

図１１に示されているように、全身性ループスエリテマトーデスである２人のボランティアから得た血清中で、抗ＭＩＣＢ抗体が検出された。

【1288】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【配列表】

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【国際調査報告】