特表 2024-534788 抗Ｂ７－Ｈ４抗体及びその調製方法と使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-26

(54)【発明の名称】抗Ｂ７－Ｈ４抗体及びその調製方法と使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/30 20060101AFI20240918BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240918BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240918BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240918BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240918BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240918BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 9/10 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 9/48 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 9/12 20060101ALI20240918BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20240918BHJP

【ＦＩ】

C07K16/30 ZNA

C07K16/46

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/21

C12N5/10

C07K19/00

C12P21/08

C12P21/02 C

A61K35/17

A61P35/00

A61K39/395 T

A61K39/395 L

A61K45/00

A61K47/68

A61K9/08

A61K9/10

A61K9/20

A61K9/48

A61K9/14

A61K9/12

G01N33/574 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024509326

(86)(22)【出願日】2022-08-16

(85)【翻訳文提出日】2024-04-16

(86)【国際出願番号】 CN2022112864

(87)【国際公開番号】W WO2023020507

(87)【国際公開日】2023-02-23

(31)【優先権主張番号】202110951949.X

(32)【優先日】2021-08-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520223321

【氏名又は名称】ハーバー・バイオメド・（シャンハイ）・カンパニー・リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＨＡＲＢＯＵＲ ＢＩＯＭＥＤ （ＳＨＡＮＧＨＡＩ） ＣＯ．， ＬＴＤ

(74)【代理人】

【識別番号】110001818

【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ

(72)【発明者】

【氏名】▲呉▼ ▲暁▼▲東▼

(72)【発明者】

【氏名】王 永▲強▼

(72)【発明者】

【氏名】▲賈▼ ▲鴿▼子

(72)【発明者】

【氏名】▲趙▼ 楚楚

(72)【発明者】

【氏名】▲陳▼ ▲飛▼

(72)【発明者】

【氏名】何 云

(72)【発明者】

【氏名】戎 一平

(72)【発明者】

【氏名】丁 翌

(72)【発明者】

【氏名】李 ▲鶴▼

(72)【発明者】

【氏名】牛 磊

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA02

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA26X

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA11

4C076AA12

4C076AA13

4C076AA22

4C076AA24

4C076AA31

4C076AA36

4C076AA53

4C076AA93

4C076AA95

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB21

4C076BB25

4C076BB31

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C076FF70

4C084AA19

4C084MA12

4C084MA16

4C084MA34

4C084MA52

4C084MA56

4C084MA59

4C084MA63

4C084MA66

4C084NA05

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC752

4C085AA14

4C085AA21

4C085BB01

4C085CC23

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C085GG01

4C085GG08

4C085GG10

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087CA03

4C087CA12

4C087MA12

4C087MA16

4C087MA34

4C087MA52

4C087MA56

4C087MA59

4C087MA63

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA21

4H045GA22

(57)【要約】

ＶＨを含む抗Ｂ７－Ｈ４抗体を提供し、前記ＶＨは、下記のＣＤＲ又はその突然変異：配列番号４又は５のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ２、及び、配列番号２４又は２５のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ３を含み、ここで、前記突然変異は、前記ＣＤＲのアミノ酸配列における３、２又は１個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換である。前記抗体は、ヒトＢ７－Ｈ４及びカニクイザルＢ７－Ｈ４に結合する活性を有する。前記抗体をＢ７－Ｈ４×ＣＤ３二重特異性抗体として調製した場合、ヒトＢ７－Ｈ４及びカニクイザルＢ７－Ｈ４に結合する活性を依然として保持し、腫瘍細胞に対して強い殺傷効果を有し、誘導されたＩＬ－６やＩＦＮ－γなどの非特異的サイトカインの発現は非常に低く、ｉｎ ｖｉｖｏで強い抗腫瘍活性を示す。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ここで、
前記ＶＨは、下記の相補性決定領域（ＣＤＲ）又はその突然変異：配列番号４又は５のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ２、及び、配列番号２４又は２５のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ３を含み、
ここで、前記突然変異は、前記ＣＤＲのアミノ酸配列における３、２又は１個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換であることを特徴とする、抗Ｂ７－Ｈ４抗体。

【請求項2】

前記ＣＤＲ２上の突然変異は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列にＧ２Ｐ、Ｓ４Ｇ、及びＳ５Ｒ／Ｄ／Ｅ／Ｔのうちの２又は１個のアミノ酸の置換を有するものであり、前記ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、好ましくは配列番号１１～１４、配列番号１６～１８のいずれか一つに示されることを特徴とする、請求項１に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体。

【請求項3】

前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１１及び２４に示され、或いは
前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５、１２、及び２５に示され、或いは
前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１７、及び２４に示され、或いは
前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５、１８及び２５に示され、或いは
前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１３、及び２４に示され、或いは
前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１４及び２４に示され、或いは
前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１５及び２４に示され、或いは
前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１６及び２４に示されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体。

【請求項4】

前記ＶＨのフレームワーク領域はヒトＶＨのフレームワーク領域であり、
好ましくは、前記ヒトＶＨのフレームワーク領域は、アミノ酸配列が配列番号２に示されるＦＷＲ１、アミノ酸配列が配列番号７～９のいずれか一つに示されるＦＷＲ２、アミノ酸配列が配列番号２０～２２のいずれか一つに示されるＦＷＲ３、及びアミノ酸配列が配列番号２６又は２７に示されるＦＷＲ４を含み、
より好ましくは、前記ＶＨは、配列番号３６～４５のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体。

【請求項5】

前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ好ましくはｓｃＦｖ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、重鎖抗体又は単一ドメイン抗体であり、好ましくは、前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体が重鎖抗体である場合、前記重鎖抗体は、配列番号４８～５７のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体。

【請求項6】

Ｂ７－Ｈ４を標的とするタンパク質機能領域Ｂ、及び非Ｂ７－Ｈ４を標的とするタンパク質機能領域Ａを含み、
ａ）前記タンパク質機能領域Ｂは、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体から選択され、
好ましくは、構造が、式：Ｎ’－ＶＬ＿Ａ－ＣＬ－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖１、式：Ｎ’－ＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖２、式：Ｎ’－ＶＨ＿Ｂ１－リンカー－ＶＨ＿Ｂ２－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ’、又は式：Ｎ’－ＶＨ＿Ｂ－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖３を含み、ここで、前記ＶＬ＿Ａ及びＶＨ＿Ａは、それぞれ前記タンパク質機能領域ＡのＶＬ及びＶＨであり、前記ＶＨ＿Ｂ１及びＶＨ＿Ｂ２は、前記タンパク質機能領域ＢのＶＨであり、且つＶＨ＿Ｂ１及びＶＨ＿Ｂ２は、同じであっても異なってもよい、又は、
ｂ）前記タンパク質機能領域Ｂは、配列番号７２に示されるＨＣＤＲ１、配列番号７４に示されるＨＣＤＲ２、配列番号７６に示されるＨＣＤＲ３、配列番号７８に示されるＬＣＤＲ１、配列番号８０に示されるＬＣＤＲ２、配列番号８２に示されるＬＣＤＲ３を含み、
好ましくは、構造が、式：Ｎ’－ＶＬ＿Ａ－ＣＬ－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖１、式：Ｎ’－ＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖２、式：Ｎ’－ＶＬ＿Ｂ－リンカー－ＶＨ＿Ｂ－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖３を含み、ここで、前記ＶＬ＿Ａ及びＶＨ＿Ａは、それぞれ前記タンパク質機能領域ＡのＶＬ及びＶＨであり、前記ＶＬ＿Ｂ及びＶＨ＿Ｂは、前記タンパク質機能領域ＢのＶＬ及びＶＨである、
から選択されることを特徴とする、二重特異性抗体。

【請求項7】

前記タンパク質機能領域Ａは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＣＤ３抗体であり、前記ＶＨは、アミノ酸配列が配列番号３に示されるＶＨ ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号１０に示されるＶＨ ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列が配列番号２３に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、アミノ酸配列が配列番号２９に示されるＶＬ ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号３１に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列が配列番号３３に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含み、
好ましくは、前記抗ＣＤ３抗体は、アミノ酸配列が配列番号３５に示されるＶＨ、及びアミノ酸配列が配列番号４６に示されるＶＬを含み、
より好ましくは、前記抗ＣＤ３抗体は、アミノ酸配列が配列番号４７に示される重鎖、及びアミノ酸配列が配列番号５８に示される軽鎖を含むことを特徴とする、請求項６に記載の二重特異性抗体。

【請求項8】

前記二重特異性抗体は、
アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６０に示されるポリペプチド鎖３、
或いは、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６１に示されるポリペプチド鎖３、
或いは、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６２に示されるポリペプチド鎖３、
或いは、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６３に示されるポリペプチド鎖３、
或いは、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６４に示されるポリペプチド鎖３、
或いは、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６５に示されるポリペプチド鎖３、
或いは、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６９に示されるポリペプチド鎖３、
或いは、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号７０に示されるポリペプチド鎖３を含み、
或いは、前記二重特異性抗体は、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号８６に示されるポリペプチド鎖３を含むことを特徴とする、請求項６又は７に記載の二重特異性抗体。

【請求項9】

請求項１～５のいずれか一項に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、又は請求項６～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体をコードする単離された核酸。

【請求項10】

請求項９に記載の単離された核酸を含み、
好ましくは、真核細胞発現ベクター及び／又は原核細胞発現ベクターを含む、組換え発現ベクター。

【請求項11】

請求項１０に記載の組換え発現ベクターを含み、
好ましくは、宿主細胞は、原核細胞及び／又は真核細胞であり、前記原核細胞は、好ましくはＴＧ１、ＢＬ２１細胞などの大腸菌細胞であり、前記真核細胞は、好ましくはＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞である、形質転換体。

【請求項12】

請求項１～５のいずれか一項に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、又は請求項６～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含む、キメラ抗原受容体。

【請求項13】

請求項１２に記載のキメラ抗原受容体を含み、
好ましくは、真核細胞であり、好ましくは単離されたヒト細胞であり、より好ましくは免疫細胞であるＴ細胞、又はＮＫ細胞であることを特徴とする、遺伝子改変細胞。

【請求項14】

請求項１１に記載の形質転換体を培養し、培養物から抗Ｂ７－Ｈ４抗体又は二重特異性抗体を得るステップを含む、抗Ｂ７－Ｈ４抗体又は二重特異性抗体の調製方法。

【請求項15】

抗体部分及び複合体部分を含み、前記抗体部分は、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体又は請求項６～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を含み、前記複合体部分は、検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、又はそれらの組み合わせを含み、前記抗体部分と複合体部分とが、化学結合又はリンカーを介して結合する、抗体薬物複合体。

【請求項16】

請求項１～５のいずれか一項に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、請求項６～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体、請求項１３に記載の遺伝子改変細胞及び／又は請求項１５に記載の抗体薬物複合体を含み、
好ましくは、液体剤形、気体剤形、固体剤形及び半固体剤形であり、及び／又は、経口、注射、経鼻、経皮又は粘膜投与することができ、
さらに好ましくは、化学治療剤、放射線治療剤、免疫阻害剤及び／又は細胞傷害性薬物を含む併用治療剤をさらに含む、医薬組成物。

【請求項17】

がんを治療及び／又は予防するための医薬、キット及び／又は薬物送達システムの調製における、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、請求項６～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体、請求項１３に記載の遺伝子改変細胞、請求項１５に記載の抗体薬物複合体及び／又は請求項１６に記載の医薬組成物の使用であって、
好ましくは、前記がんは、肺がん、トリプルネガティブ乳がんなどの乳がん、卵巣がん、子宮内膜腫、胃がん、小腸がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん及び骨肉腫からなる群より選択される、使用。

【請求項18】

請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体、請求項６～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体、請求項１３に記載の遺伝子改変細胞、請求項１５に記載の抗体薬物複合体及び／又は請求項１６に記載の医薬組成物、並びに任意選択の説明書を含む、キット。

【請求項19】

（１）請求項１６に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与するための注入モジュール、及び（２）任意選択の薬効モニタリングモジュールを含むことを特徴とする、薬物送達システム。

【請求項20】

請求項１～５のいずれか一項に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体及び／又は請求項６～８のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を使用して検出するステップを含み、好ましくは、非診断及び／又は治療目的であることを特徴とする、Ｂ７－Ｈ４を検出する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生物医学の分野に関し、特に抗Ｂ７－Ｈ４抗体及びその調製方法と使用に関し、さらに前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体を含む二重特異性抗体に関する。

【背景技術】

【0002】

乳がん、卵巣がん、及び子宮内膜腫は女性によく見られる悪性腫瘍であり、その中で、乳がんは女性のがんの中で発生率が第１位であり、２０１８年の国際がん研究機関ＩＡＲＣのデータにより、世界中の女性のがんにおける乳がんの発生率は２４．２％であることが示されている。これらのがんの治療では、免疫療法と標的療法が現在のホットスポットである。例えば、Ｈｅｒ２を標的とするハーセプチンは、Ｈｅｒ２陽性乳がんに対して良好な治療効果を有する。トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）に対しては、対応する標的がないため、現在治療法はほとんどなく、主に化学療法が行われている。２０１９年３月、米国ＦＤＡは、転移性トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）の治療薬として、ＰＤ－Ｌ１阻害剤アテゾリズマブ（Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）とアルブミン結合パクリタキセルの併用を承認したが、ＰＤ－Ｌ１はトリプルネガティブ乳がんではあまり発現されていない。卵巣がんや子宮内膜腫の治療は、主に手術と補助療法である放射線化学療法を中心とするが、再発性又は転移性腫瘍に対して、上記の手段に加えて、他の利用可能な標的は主にエストロゲン受容体、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦ、及びＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１などを含むが、治療効果は限定的である。

【0003】

Ｂ７－Ｈ４はＢ７ファミリーの比較的新しいメンバーであり、そのタンパク質は正常組織での発現が非常に限られており、乳管や小葉、卵管上皮、子宮内膜腺などの組織など、生体の一部の乳管上皮細胞でのみ低レベルで発現される。対照的に、Ｂ７－Ｈ４は、乳がん細胞、特にトリプルネガティブ乳がん細胞、卵巣がん細胞、子宮内膜腫細胞など、様々な腫瘍組織で豊富に発現され、腫瘍の半数近くがＢ７－Ｈ４を高発現している。発現プロファイルの観点から、Ｂ７－Ｈ４は特異性の高い腫瘍関連抗原と見なすことができる。一方、Ｂ７－Ｈ４は新しい免疫チェックポイント分子であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験により、Ｂ７－Ｈ４が未知のＴ細胞表面受容体と相互作用することにより、Ｔ細胞の増殖、活性化、サイトカイン産生を阻害することが証明された。腫瘍細胞は、Ｂ７－Ｈ４分子を高発現し、腫瘍微小環境下でＢ７－Ｈ４分子を高発現する抑制性マクロファージにより、Ｔ細胞の活性化を阻害し、それによって免疫回避を実現する。腫瘍におけるＢ７－Ｈ４の発現プロファイルはＰＤ－Ｌ１と重複しない。Ｂ７－Ｈ４を標的とする抗体による治療は、Ｂ７－Ｈ４発現陽性腫瘍を治療するための有望な手段である。

【0004】

現在、多くの製薬会社は、Ｂ７－Ｈ４に対するモノクローナル抗体、又は抗体薬物複合体、又は二重特異性抗体を開発している。Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＢＭＳ、Ｊｏｕｎｃｅ、Ｊｉａｎｇｓｕ Ｈａｎｓｏｈなどは、前臨床開発段階にあり、現在最も急速に進んでいるのは、ＦｉｖｅＰｒｉｍｅとＮｅｘｔｃｕｒｅの抗Ｂ７－Ｈ４モノクローナル抗体であり、現在臨床第Ｉ相段階にあり、その機序は主にＡＤＣＣと免疫チェックポイントの阻害を介してＴ細胞を活性化することである。抗腫瘍関連抗原と抗ＣＤ３を含む二重特異性抗体の構築は、Ｔ細胞エンゲージャーと呼ばれ、強い腫瘍関連抗原依存性のＴ細胞活性化及び腫瘍殺傷効果を有し、通常のモノクローナル抗体よりもさらに強力な治療効果を有する可能性がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明が解決しようとする技術的課題は、従来技術における抗Ｂ７－Ｈ４抗体の欠点を克服するために、抗Ｂ７－Ｈ４抗体及びその調製方法と使用を提供し、さらに前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体を含む二重特異性抗体を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

上記の技術的課題を解決するために、本発明の第１の態様は、重鎖可変領域（ＶＨ）を含む抗Ｂ７－Ｈ４抗体を提供し、ここで、
前記ＶＨは、下記の相補性決定領域（ＣＤＲ）又はその突然変異：配列番号４又は５のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ２、及び、配列番号２４又は２５のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ３を含み、
ここで、前記突然変異は、前記ＣＤＲのアミノ酸配列における３、２又は１個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換である。

【0007】

本出願において、「３、２又は１個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換」と類似の用語における「アミノ酸の突然変異」とは、元のアミノ酸配列に基づくアミノ酸の挿入、欠失又は置換を含む、元のアミノ酸配列と比較した、変異体におけるアミノ酸の突然変異を指す。例示的な説明は、ＣＤＲへの突然変異は、３、２又は１個のアミノ酸の突然変異を含んでもよく、これらのＣＤＲ間の突然変異は、同じ又は異なる数のアミノ酸残基を任意選択で選択することができ、例えば、ＣＤＲ１に対して１個のアミノ酸の突然変異は行われるが、ＣＤＲ２とＣＤＲ３へのアミノ酸の突然変異は行われないことである。

【0008】

本出願において、前記突然変異は、現在当業者に周知の突然変異を含んでもよく、例えば、抗体の産生又は適用中に抗体に対して行われ得る突然変異、例えば、存在し得る部位、特にＣＤＲ領域における翻訳後修飾（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、ＰＴＭｓ）を受ける部位に対する突然変異であり、抗体の凝集、アスパラギン脱アミド化（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）感受性部位（ＮＧ、ＮＳ、ＮＨなど）、アスパラギン酸異性化（ＤＧ、ＤＰ）感受性部位、Ｎ－グリコシル化（Ｎ－｛Ｐ｝Ｓ／Ｔ）感受性部位、及び酸化感受性部位などの関連突然変異、又は等電点の低下に関連する突然変異を含む。

【0009】

好ましくは、前記ＣＤＲ２上の突然変異は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列にＧ２Ｐ、Ｓ４Ｇ、及びＳ５Ｒ／Ｄ／Ｅ／Ｔのうちの２又は１個のアミノ酸置換を有するものであり、そのアミノ酸配列は、好ましくは配列番号１１～１４、配列番号１６～１８のいずれか一つに示される。

【0010】

上記のＧ２Ｐは、一般に、配列番号１５に示されるアミノ酸配列の２位のアミノ酸ＧがＰに突然変異することを指し、Ｓ４Ｇ、Ｓ５Ｒ／Ｄ／Ｅ／Ｔなどの他のアミノ酸置換がこのように類推できることは当業者には理解されるべきである。

【0011】

好ましくは、前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体は重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ここで、前記ＶＨは、下記の相補性決定領域（ＣＤＲ）又はその突然変異：配列番号４又は５のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ１、配列番号１１～１８のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ２、及び、配列番号２４又は２５のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ３を含む。

【0012】

ある実施形態において、前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体の前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１１、及び２４に示される。

【0013】

ある実施形態において、前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体の前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５、１２、及び２５に示される。

【0014】

ある実施形態において、前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体の前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１７、及び２４に示される。

【0015】

ある実施形態において、前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体の前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５、１８、及び２５に示される。

【0016】

ある実施形態において、前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体の前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１３、及び２４に示される。

【0017】

ある実施形態において、前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体の前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１４、及び２４に示される。

【0018】

ある実施形態において、前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体の前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１５、及び２４に示される。

【0019】

ある実施形態において、前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体の前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１６、及び２４に示される。

【0020】

好ましくは、前記ＶＨのフレームワーク領域はヒトＶＨのフレームワーク領域である。ある実施形態において、前記ヒトＶＨのフレームワーク領域は、アミノ酸配列が配列番号２に示されるＦＷＲ１、アミノ酸配列が配列番号７～９のいずれか一つに示されるＦＷＲ２、アミノ酸配列が配列番号２０～２２のいずれか一つに示されるＦＷＲ３、及びアミノ酸配列が配列番号２６又は２７に示されるＦＷＲ４を含む。ある実施形態において、前記ＶＨは、配列番号３６～４５のいずれか一つに示されるアミノ酸配列又はその突然変異を含み、前記突然変異は、前記ＶＨのアミノ酸配列における一つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加であり、且つ前記突然変異を有するアミノ酸配列は、前記ＶＨのアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有し、前記抗体のＢ７－Ｈ４への結合を維持又は改善する。前記少なくとも８５％の配列同一性は、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性であり、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性であり、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性である。

【0021】

ある好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域ＶＨは、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域ＶＨは、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域ＶＨは、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域ＶＨは、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域ＶＨは、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖可変領域ＶＨは、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含む。

【0022】

本願では、上記のＣＤＲのアミノ酸配列は全てＣｈｏｔｈｉａ定義方式で示される（本発明の請求項に記載の配列もＣｈｏｔｈｉａ定義方式で示される）。当業者が知っているように、本分野では、例えば、配列可変性に基づくＫａｂａｔ定義方式（Ｋａｂａｔ，ｅｔ．ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ（１９９１）参照）、構造ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｈｉａ定義方式（ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７～４８，１９９７参照）など、様々な方式で抗体のＣＤＲを定義することができる。本願では、Ｋａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義を組み合わせた（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ）定義方式を採用して可変ドメイン配列のアミノ酸残基を決定することもできる。組み合わせた（Ｃｏｍｂｉｎｅｄ）定義方式はＫａｂａｔ定義とＣｈｏｔｈｉａ定義の範囲を合わせたものであるため、範囲が拡大しており、その詳細は表１－１を参照する。当業者が理解しているように、他に規定がある場合を除いて、特定の抗体又はその領域（例えば、可変領域）の「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は本発明で説明した前記実施形態のいずれかにおいて限定された相補性決定領域を含むものと理解される。本発明の請求項で保護を求める範囲はＣｈｏｔｈｉａ定義方式で配列を示しているが、他のＣＤＲ定義方式に基づく対応するアミノ酸配列も本発明の保護範囲に含まれる。

【0023】

従って、本発明で定義される具体的なＣＤＲ配列を有する抗体を定義する場合、前記抗体の範囲は、その可変領域配列が前記具体的なＣＤＲ配列を含むが、異なるスキームの適用（例えば、異なる割り当てシステム規則又は組み合わせ）により、その主張されるＣＤＲ境界が本発明で定義される具体的なＣＤＲ境界と異なる抗体をさらに包含する。

【0024】

好ましくは、前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ好ましくはｓｃＦｖ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、重鎖抗体若しくは単一ドメイン抗体、又は抗原と特異的に結合する抗体の能力（抗原と特異的に結合する抗体の能力の一部を保持してもよい）を保持する他の抗体、又は上記の抗体から調製されたモノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体である。

【0025】

好ましくは、前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体は重鎖抗体である。ある実施形態において、前記重鎖抗体は、配列番号４８～５７のいずれか一つに示されるアミノ酸配列又はその突然変異を含む。前記突然変異は、前記アミノ酸配列における一つ又は複数のアミノ酸残基の欠失、置換又は付加であり、且つ前記突然変異を有するアミノ酸配列は、前記アミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有し、前記抗体のＢ７－Ｈ４への結合を維持又は改善する。前記少なくとも８５％の配列同一性は、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性であり、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性であり、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性である。ある好ましい実施形態において、前記重鎖抗体は、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖抗体は、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖抗体は、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖抗体は、配列番号５７に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖抗体は、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖抗体は、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖抗体は、配列番号５２に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖抗体は、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖抗体は、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記重鎖抗体は、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含む。

【0026】

本出願において、前記「Ｆａｂフラグメント」は、一つの軽鎖と一つの重鎖のＣＨ１及び可変領域から構成される。Ｆａｂフラグメントの重鎖は、他の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。「Ｆｃ」領域は、抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む２つの重鎖フラグメントである。２つの重鎖フラグメントは、２つ以上のジスルフィド結合とＣＨ３ドメインの疎水性相互作用によって一体的に保持されている。前記「Ｆａｂ´フラグメント」は、一つの軽鎖と、ＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、及びＣＨ１とＣＨ２ドメインの間の領域を含み、それによって、２つのＦａｂ´フラグメントの２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成されてＦ（ａｂ´）_２フラグメントを形成することができる。前記「Ｆ（ａｂ´）_２フラグメント」は、２つの軽鎖と、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインの間の定常領域の一部を含む２つの重鎖とを含み、それによって、２つの重鎖の間に鎖間ジスルフィド結合が形成される。従って、Ｆ（ａｂ´）_２フラグメントは、２つの重鎖間のジスルフィド結合によって一体的に保持された２つのＦａｂ´フラグメントから構成される。前記「Ｆｖ」という用語は、抗体のシングルアームのＶＬ及びＶＨドメインからなるが、定常領域を欠く抗体フラグメントを指すことを意図している。

【0027】

本出願において、前記ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ、一本鎖抗体）は、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、及び１５～２０アミノ酸の短いペプチドリンカーを含む、当技術分野における通常の一本鎖抗体であってもよい。その中で、ＶＬ及びＶＨドメインは、それらが単一のポリペプチド鎖の生成を可能にするリンカーを介してペアリングされて一価の分子を形成する［例えば、Ｂｉｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６（１９８８）及びＨｕｓｔｏｎら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３（１９８８）を参照］。このようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ_２－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ、又はＮＨ_２－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを有することができる。適切な従来技術のリンカーは、反復されたＧ_４Ｓアミノ酸配列又はその変異体から構成される。例えば、アミノ酸配列（Ｇ_４Ｓ）_４（即ち、配列番号８８）又は（Ｇ_４Ｓ）_３を有するリンカーを使用することができるが、それらの変異体を使用することもできる。

【0028】

本出願において、「多重特異性抗体」という用語は、マルチエピトープ特異性を有する抗体を包含する最も広い意味で使用される。これらの多重特異性抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、当該ＶＨ－ＶＬユニットがマルチエピトープ特異性を有する抗体、２つ以上のＶＬ及びＶＨ領域を有し、各ＶＨ－ＶＬユニットが異なる標的又は同じ標的の異なるエピトープに結合する抗体、２つ以上の単一可変領域を有し、各単一可変領域が異なる標的又は同じ標的の異なるエピトープに結合する抗体、完全長抗体、抗体フラグメント、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）、共有結合又は非共有結合で連結された抗体フラグメントなどを含むが、これらに限定されない。

【0029】

本出願において、前記モノクローナル抗体又はｍＡｂ又はＡｂは、単一のクローン細胞株から得られる単一の抗原エピトープを標的とする抗体を指し、前記細胞株は真核生物、原核生物又はファージのクローン化細胞株に限定されない。

【0030】

本出願において、前記単一ドメイン抗体は「ナノ抗体」とも呼ばれ、重鎖抗体からクローン化されたＶＨＨ構造を指し、標的抗原に結合できる既知の最小単位である。

【0031】

本出願において、前記「重鎖抗体」は、ＨＣＡｂとも呼ばれ、１つの重鎖可変領域（ＶＨＨ）と２つの通常のＣＨ２及びＣＨ３ドメインのみを含む抗体を指す。

【0032】

上記の技術的課題を解決するために、本発明の第２の態様は、タンパク質機能領域Ａ及びタンパク質機能領域Ｂを含む二重特異性抗体を提供し、前記タンパク質機能領域Ａ及び前記タンパク質機能領域Ｂは異なる抗原を標的とし、ここで、前記タンパク質機能領域ＢはＢ７－Ｈ４を標的とし、前記タンパク質機能領域Ａは非Ｂ７－Ｈ４を標的とし、前記二重特異性抗体は、下記のａ）又はｂ）から選択される。

【0033】

ａ）前記タンパク質機能領域Ｂは、本発明の第１の態様に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体から選択されるか、又は前記タンパク質機能領域Ｂは、配列番号７２に示されるＨＣＤＲ１、配列番号７４に示されるＨＣＤＲ２、配列番号７６に示されるＨＣＤＲ３、配列番号７８に示されるＬＣＤＲ１、配列番号８０に示されるＬＣＤＲ２、配列番号８２に示されるＬＣＤＲ３を含む。

【0034】

好ましくは、前記二重特異性抗体の構造は、式：Ｎ’－ＶＬ＿Ａ－ＣＬ－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖１、式：Ｎ’－ＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖２、式：Ｎ’－ＶＨ＿Ｂ１－リンカー－ＶＨ＿Ｂ２－ヒンジ領域（リンカーペプチドであってもよい）－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ’、又は式：Ｎ’－ＶＨ＿Ｂ－ヒンジ領域（リンカーペプチドであってもよい）－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖３を含み、ここで、前記ＶＬ＿Ａ及びＶＨ＿Ａは、それぞれ前記タンパク質機能領域ＡのＶＬ及びＶＨであり、前記ＶＨ＿Ｂ１及びＶＨ＿Ｂ２は、前記タンパク質機能領域ＢのＶＨであり、且つＶＨ＿Ｂ１及びＶＨ＿Ｂ２の配列は、同じであっても異なってもよく、ＶＨ＿Ｂ１及びＶＨ＿Ｂ２の間は、リンカーペプチドによって連結されてもよい。ここで、ＶＨ＿Ａ及びＶＬ＿Ａは、それぞれタンパク質機能領域Ａの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であり、ＶＨ＿Ｂ及びＶＬ＿Ｂは、タンパク質機能領域Ｂの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であり、ＣＬは軽鎖定常領域のドメインであり、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３は、それぞれ重鎖定常領域の第１、第２及び第３ドメインである。

【0035】

ｂ）前記タンパク質機能領域Ｂは、配列番号７２に示されるＨＣＤＲ１、配列番号７４に示されるＨＣＤＲ２、配列番号７６に示されるＨＣＤＲ３、配列番号７８に示されるＬＣＤＲ１、配列番号８０に示されるＬＣＤＲ２、配列番号８２に示されるＬＣＤＲ３を含む。
好ましくは、前記二重特異性抗体の構造は、式：Ｎ’－ＶＬ＿Ａ－ＣＬ－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖１、式：Ｎ’－ＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖２、式：Ｎ’－ＶＬ＿Ｂ－リンカー－ＶＨ＿Ｂ－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖３を含み、ここで、前記ＶＬ＿Ａ及びＶＨ＿Ａは、それぞれ前記タンパク質機能領域ＡのＶＬ及びＶＨであり、前記ＶＬ＿Ｂ及びＶＨ＿Ｂは、前記タンパク質機能領域ＢのＶＬ及びＶＨである。

【0036】

いくつかの好ましい実施形態において、前記タンパク質機能領域Ａは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＣＤ３抗体であり、前記ＶＨは、アミノ酸配列が配列番号３に示されるＶＨ ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号１０に示されるＶＨ ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列が配列番号２３に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、アミノ酸配列が配列番号２９に示されるＶＬ ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号３１に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列が配列番号３３に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。ある実施形態において、前記抗ＣＤ３抗体は、アミノ酸配列が配列番号３５に示されるＶＨ、及びアミノ酸配列が配列番号４６に示されるＶＬを含む。ある実施形態において、前記抗ＣＤ３抗体は、アミノ酸配列が配列番号４７に示される重鎖、及びアミノ酸配列が配列番号５８に示される軽鎖を含む。

【0037】

ある好ましい実施形態において、前記タンパク質機能領域Ａは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、その軽鎖可変領域ＶＬは、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号２９、３１及び３３に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号３、１０及び２３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。前記タンパク質機能領域Ｂは、重鎖可変領域を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号４、１７及び２４に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。列挙されたＣＤＲのアミノ酸配列はＣｈｏｔｈｉａ定義に従って示されている。ある好ましい実施形態において、前記タンパク質機能領域Ａは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、その軽鎖可変領域ＶＬは、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号２９、３１及び３３に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号３、１０及び２３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。前記タンパク質機能領域Ｂは、重鎖可変領域を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号５、１８及び２５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。列挙されたＣＤＲのアミノ酸配列はＣｈｏｔｈｉａ定義に従って示されている。ある好ましい実施形態において、前記タンパク質機能領域Ａは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、その軽鎖可変領域ＶＬは、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号２９、３１及び３３に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号３、１０及び２３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。前記タンパク質機能領域Ｂは、第１の重鎖可変領域及び第２の重鎖可変領域を含み、前記第１の重鎖可変領域ＶＨは、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号４、１７及び２４に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記第２の重鎖可変領域ＶＨは、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号５、１８及び２５に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。列挙されたＣＤＲのアミノ酸配列はＣｈｏｔｈｉａ定義に従って示されている。ある好ましい実施形態において、前記タンパク質機能領域Ａは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、その軽鎖可変領域ＶＬは、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号２９、３１及び３３に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号３、１０及び２３に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む。前記タンパク質機能領域Ｂは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域ＶＨは、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号７２、７４及び７６に示されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域ＶＬは、アミノ酸配列がそれぞれ配列番号７８、８０及び８２に示されるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む。列挙されたＣＤＲのアミノ酸配列はＣｈｏｔｈｉａ定義に従って示されている。

【0038】

ある好ましい実施形態において、前記タンパク質機能領域Ａは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、その軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。前記タンパク質機能領域Ｂは、重鎖可変領域を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記タンパク質機能領域Ａは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、その軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。前記タンパク質機能領域Ｂは、重鎖可変領域を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記タンパク質機能領域Ａは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、その軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。前記タンパク質機能領域Ｂは、第１の重鎖可変領域及び第２の重鎖可変領域を含み、前記第１の重鎖可変領域ＶＨは、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の重鎖可変領域ＶＨは、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記タンパク質機能領域Ａは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、その軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。前記タンパク質機能領域Ｂは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域ＶＨは、配列番号８４に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の重鎖可変領域ＶＨは、配列番号８５に示されるアミノ酸配列を含む。

【0039】

ある好ましい実施形態において、前記二重特異性抗体は、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６０に示されるポリペプチド鎖３を含む。

【0040】

ある好ましい実施形態において、前記二重特異性抗体は、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６１に示されるポリペプチド鎖３を含む。

【0041】

ある好ましい実施形態において、前記二重特異性抗体は、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６２に示されるポリペプチド鎖３を含む。

【0042】

ある好ましい実施形態において、前記二重特異性抗体は、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６３に示されるポリペプチド鎖３を含む。

【0043】

ある好ましい実施形態において、前記二重特異性抗体は、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６４に示されるポリペプチド鎖３を含む。

【0044】

ある好ましい実施形態において、前記二重特異性抗体は、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６５に示されるポリペプチド鎖３を含む。

【0045】

ある好ましい実施形態において、前記二重特異性抗体は、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６９に示されるポリペプチド鎖３を含む。

【0046】

ある好ましい実施形態において、前記二重特異性抗体は、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号７０に示されるポリペプチド鎖３を含む。

【0047】

ある好ましい実施形態において、前記二重特異性抗体は、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号８６に示されるポリペプチド鎖３を含む。

【0048】

上記の技術的課題を解決するために、本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、又は本発明の第２の態様に記載の二重特異性抗体をコードする単離された核酸を提供する。

【0049】

前記核酸の調製方法は、当技術分野における通常の調製方法であり、好ましくは、遺伝子クローニング技術により上記の抗体をコードする核酸分子を得るステップ、又は人工完全配列合成により上記の抗体をコードする核酸分子を得るステップを含む。

【0050】

ポリヌクレオチドの相同体を提供するために、上記の抗体のアミノ酸配列をコードする塩基配列に置換、欠失、改変、挿入、又は付加を適切に導入し得ることが当業者に知られている。本発明のポリヌクレオチドの相同体は、抗体の活性を維持する範囲で、抗体配列をコードする遺伝子の一つ又は複数の塩基を置換、欠失、又は付加することにより調製することができる。

【0051】

上記の技術的課題を解決するために、本発明の第４の態様は、本発明の第３の態様に記載の単離された核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。

【0052】

前記組換え発現ベクターは、当技術分野における通常の方法によって得ることができ、即ち、本出願に記載の核酸分子を様々な発現ベクターに連結することによって構築される。前記発現ベクターは、上記の核酸分子を収容できる限り、当技術分野における通常の様々なベクターである。

【0053】

好ましくは、前記発現ベクターは、真核細胞発現ベクター及び／又は原核細胞発現ベクターを含む。

【0054】

上記の技術的課題を解決するために、本発明の第５の態様は、本発明の第４の態様に記載の組換え発現ベクターを含む形質転換体を提供する。

【0055】

前記形質転換体の調製方法は、例えば、上記の組換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換することにより調製される、当技術分野における通常の調製方法であってもよい。前記形質転換体の宿主細胞は、上記の組換え発現ベクターがそれ自体で安定に複製でき、且つ担持された前記核酸が効果的に発現され得る要件を満たすことができる限り、当技術分野における通常の様々な宿主細胞である。好ましくは、前記宿主細胞は、原核細胞及び／又は真核細胞であり、前記原核細胞は、好ましくはＴＧ１、ＢＬ２１（一本鎖抗体又はＦａｂ抗体を発現する）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞であり、前記真核細胞は、好ましくはＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞（完全長ＩｇＧ抗体を発現する）である。本発明の好ましい組換え発現形質転換体は、上記の組換え発現プラスミドを宿主細胞に形質転換することにより得ることができる。ここで、前記形質転換方法は、当技術分野における通常の形質転換方法であり、好ましくは、化学形質転換法、熱ショック法、又はエレクトロポレーション法である。

【0056】

上記の技術的課題を解決するために、本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、又は本発明の第２の態様に記載の二重特異性抗体を含むキメラ抗原受容体を提供する。

【0057】

上記の技術的課題を解決するために、本発明の第７の態様は、本発明の第６の態様に記載のキメラ抗原受容体を含むことを特徴とする遺伝子改変細胞を提供する。

【0058】

好ましくは、前記遺伝子改変細胞は真核細胞であり、好ましくは単離されたヒト細胞であり、より好ましくは免疫細胞であるＴ細胞、又はＮＫ細胞である。

【0059】

上記の技術的課題を解決するために、本発明の第８の態様は、本発明の第５の態様に記載の形質転換体を培養し、培養物から抗Ｂ７－Ｈ４抗体又は二重特異性抗体を得るステップを含む、抗Ｂ７－Ｈ４抗体又は二重特異性抗体の調製方法を提供する。

【0060】

上記の技術的課題を解決するために、本発明の第９の態様は、抗体部分及び複合体部分を含む抗体薬物複合体を提供し、前記抗体部分は、本発明の第１の態様に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体又は本発明の第２の態様に記載の二重特異性抗体を含み、前記複合体部分は、検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、又はそれらの組み合わせを含んでもよく、前記抗体部分及び複合体部分は、化学結合又はリンカーを介して結合する。

【0061】

上記の技術的課題を解決するために、本発明の第１０の態様は、本発明の第１の態様に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、本発明の第２の態様に記載の二重特異性抗体、本発明の第６の態様に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第７の態様に記載の遺伝子改変細胞及び／又は本発明の第９の態様に記載の抗体薬物複合体を含む医薬組成物を提供する。

【0062】

好ましくは、前記医薬組成物は薬学的に許容される担体をさらに含む。

【0063】

より好ましくは、前記医薬組成物は、０．０１～９９．９９％の上記のタンパク質及び／又は上記の抗体薬物複合体と、０．０１～９９．９９％の担体とを含み、前記百分比は、前記医薬組成物に占める質量百分比である。

【0064】

本発明に記載の医薬組成物の投与経路は、好ましくは非経口投与、注射投与又は経口投与である。前記注射投与は、好ましくは静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射又は皮下注射などの経路を含む。前記医薬組成物は、当技術分野における通常の様々な剤形であり、好ましくは、液体剤形、気体剤形、固体剤形又は半固体剤形の形態であり、即ち、水溶液、非水溶液又は懸濁液であってもよく、より好ましくは、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、注射剤又は点滴剤などである。より好ましくは、血管内、皮下、腹腔内又は筋肉内を介して投与される。好ましくは、前記医薬組成物は、エアロゾル又はスプレーとして、即ち、経鼻投与されることもでき、或いはくも膜下腔内、髄内又は心室内に投与されることもできる。より好ましくは、前記医薬組成物は、経口、注射、経鼻、経皮又は粘膜投与であってもよい。本発明の医薬組成物は、必要に応じて様々な剤形とすることができ、患者の種類、年齢、体重及びおおよその疾病の状態、投与方法などの因子に基づいて、医師により患者にとって有益な投与量を決定して投与することができる。投与方法は、例えば、注射又は他の治療方法を使用することができる。

【0065】

本発明に記載の医薬組成物の投与量レベルは、所望の診断又は治療結果を達成する組成物の量に応じて調節することができる。投与レジメンは、単回注射又は複数回注射であってもよく、或いは調節されてもよい。選択される投与量レベル及びレジメンは、前記医薬組成物の活性及び安定性（即ち、半減期）、製剤、投与経路、他の薬物又は治療法との組み合わせ、検出及び／又は治療される疾患又は症状、並びに治療される対象の健康状態及び既往歴を含む様々な要因に依存して、合理的に調節される。

【0066】

好ましくは、前記医薬組成物は、化学治療剤、放射線治療剤、免疫阻害剤及び／又は細胞傷害性薬物を含む、併用療法のための併用治療剤をさらに含んでもよい。併用療法の場合、上記抗体、上記の抗体薬物複合体、及び／又は追加の治療薬若しくは診断剤は、それぞれ単一の薬剤として、意図する治療又は診断を実施するのに適した任意の時間範囲内で投与することができる。従って、これらの単一の薬剤は、実質的に同時に（即ち、単一の製剤として、又は数分若しくは数時間以内に）、又は順番に連続的に投与することができる。

【0067】

製剤、投与量、投与レジメン、及び測定可能な治療結果に関する追加のガイダンスについては、Ｂｅｒｋｏｗら（２０００）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（Ｍｅｒｃｋ医学情報ハンドブック）及びＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．， Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ； Ｅｂａｄｉ （１９９８） ＣＲＣ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（臨床薬理学ハンドブック）などの著作を参照されたい。

【0068】

上記の技術的課題を解決するために、本発明の第１１の態様は、がんを治療及び／又は予防するための医薬、キット及び／又は薬物送達システムの調製における、本発明の第１の態様に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、本発明の第２の態様に記載の二重特異性抗体、本発明の第６の態様に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第７の態様に記載の遺伝子改変細胞、本発明の第９の態様に記載の抗体薬物複合体及び／又は本発明の第１０の態様に記載の医薬組成物の使用を提供し、或いはがんの治療及び／又は予防における、本発明の第１の態様に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、本発明の第２の態様に記載の二重特異性抗体、本発明の第６の態様に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第７の態様に記載の遺伝子改変細胞、本発明の第９の態様に記載の抗体薬物複合体及び／又は本発明の第１０の態様に記載の医薬組成物の使用を提供する。

【0069】

好ましくは、前記がんは、肺がん、トリプルネガティブ乳がんなどの乳がん、卵巣がん、子宮内膜腫、胃がん、小腸がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん及び骨肉腫などからなる群より選択される。

【0070】

上記の技術的課題を解決するために、本発明の第１２の態様は、本発明の第１の態様に記載の抗体、本発明の第２の態様に記載の二重特異性抗体、本発明の第６の態様に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第７の態様に記載の遺伝子改変細胞、本発明の第９の態様に記載の抗体薬物複合体及び／又は本発明の第１０の態様に記載の医薬組成物、並びに任意選択の説明書を含むキットを提供する。

【0071】

上記の技術的課題を解決するために、本発明の第１３の態様は、（１）本発明の第１０の態様に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与するための注入モジュール、及び（２）任意選択の薬効モニタリングモジュールを含む薬物送達システムを提供する。

【0072】

上記の技術的課題を解決するために、本発明の第１４の態様は、本発明の第１の態様に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体及び／又は本発明の第２の態様に記載の二重特異性抗体を使用して検出するステップを含む、Ｂ７－Ｈ４を検出する方法を提供する。

【0073】

好ましくは、前記方法は、非診断及び／又は治療目的である。非診断、治療目的は、例えば、実験室で試料に含まれるＢ７－Ｈ４を検出すること、又は研究開発でＢ７－Ｈ４を使用して薬物をスクリーニングする前に当該Ｂ７－Ｈ４を確認することを含む。

【0074】

上記の技術的課題を解決するために、本発明は、本発明の第１の態様に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、本発明の第２の態様に記載の二重特異性抗体、本発明の第６の態様に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第７の態様に記載の遺伝子改変細胞、本発明の第９の態様に記載の抗体薬物複合体及び／又は本発明の第１０の態様に記載の医薬組成物の治療有効量をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、腫瘍を治療及び／又は予防する方法をさらに提供する。

【0075】

本発明に記載の医薬組成物の治療有効量は、細胞培養実験、或いはげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ及び／又は霊長類などの動物モデルにおいて最初に推定することができる。動物モデルは、適切な濃度範囲と投与経路を決定するためにも使用することができる。そして、ヒトにおける有用な投与量と投与経路を決定するために使用することができる。一般に、投与の有効量又は投与量の決定及び調節、ならびにそのような調節をいつどのように行うかの評価は、当業者に知られている。

【0076】

上記の課題を解決するために、本発明は、治療有効量の医薬組成物及び併用療法剤をそれを必要とする患者に投与するステップを含む、がんを治療するための併用療法をさらに提供し、前記医薬組成物は、本発明の第１０の態様に記載された通りである。

【0077】

好ましくは、前記併用療法剤は、本発明の第１０の態様に記載された通りである。

【0078】

本出願において、特に明記しない限り、本出願で使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有する。さらに、本出願で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、免疫学の実験手順はすべて、対応する分野で広く使用されている通常の手順である。また、本発明をよりよく理解するために、以下では関連用語の定義と説明を提供する。

【0079】

本出願において、「可変」という用語は一般に、抗体の可変ドメインの配列の特定の部分が大きく変化し、特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合及び特異性を形成するという事実を指す。しかし、可変性は抗体の可変領域全体に均一に分布しているわけではない。それは、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる、軽鎖及び重鎖の可変領域の３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＷＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ４つのＦＷＲ領域を含み、そのほとんどはβシート構成であり、３つのＣＤＲによって接続されてループ接続を形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。各鎖のＣＤＲはＦＷＲ領域を介して密接に結合され、もう一方の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位を形成し、定常領域は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞傷害性に関与するなど、異なるエフェクター機能を示す。

【0080】

本出願で使用されるアミノ酸の３文字コード及び１文字コードは当業者に公知であるか、又はＪ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ， ２４３， ｐ３５５８（１９６８）に記載された通りである。

【0081】

本明細書で使用される場合、「含む」又は「包含する」という用語は、組成物及び方法が前記要素を含むが、他の要素を排除しないことを意味することを意図しているが、文脈から理解されるように、「．．．からなる」という場合も含む。

【0082】

本出願において、前記ＨＣＡｂは、ヒト免疫グロブリンの免疫レパートリーを有するトランスジェニックマウスであるＨａｒｂｏｕｒＨＣＡｂマウス（Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＢＶ、ＷＯ２００２／０８５９４５Ａ３）から産生された、「重鎖」のみを含む完全ヒト抗体（Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ Ｏｎｌｙ Ａｎｔｉｂｏｄｙ）であり得、当該抗体は従来のＩｇＧ抗体の半分のサイズであり、一般にヒト抗体の「重鎖」可変ドメイン及びマウスＦｃ定常ドメインのみを有する。

【0083】

本出願で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリンを含んでもよく、鎖間ジスルフィド結合によって連結された２つの同じ重鎖と２つの同じ軽鎖からなるテトラペプチド鎖構造である。免疫グロブリン重鎖定常領域のアミノ酸構成と配列が異なるため、抗原性も異なる。従って、免疫グロブリンは、免疫グロブリンの５つのカテゴリー又はアイソタイプ、即ちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥに分類することができ、それらに対応する重鎖はそれぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖及びε鎖である。同じ種類のＩｇは、そのヒンジ領域のアミノ酸構成、重鎖ジスルフィド結合の数と位置の違いに基づいて、異なるサブクラスに分類することもでき、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に分類することができる。軽鎖は定常領域の違いによってκ鎖又はλ鎖に分類される。５種類のＩｇはそれぞれ、κ鎖又はλ鎖を持つことができる。

【0084】

本出願において、本出願に記載の抗体軽鎖可変領域は、軽鎖定常領域をさらに含んでもよく、前記軽鎖定常領域は、ヒト由来κ鎖、λ鎖、又はそれらの変異体を含む。本出願において、本出願に記載の抗体重鎖可変領域は、重鎖定常領域をさらに含んでもよく、前記重鎖定常領域は、ヒト由来ＩｇＧ１、２、３、４又はそれらの変異体を含む。

【0085】

軽鎖及び重鎖内で、可変領域と定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって連結され、重鎖は約３個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をさらに含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）から構成される。重鎖定常領域は３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬから構成される。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）の古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への結合を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。抗体の重鎖と軽鎖のＮ末端付近の約１１０個のアミノ酸の配列は大きく変化し、可変領域（Ｖ領域）であり、Ｃ末端付近の残りのアミノ酸の配列は比較的安定であり、定常領域（Ｃ領域）である。可変領域は、３つの超可変領域（ＨＶＲ）及び比較的保存された配列を持つ４つのフレームワーク領域（ＦＷＲ）を含む。３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれ、抗体の特異性を決定する。各軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖可変領域（ＶＨ）は３つのＣＤＲ領域と４つのＦＷＲ領域から構成され、アミノ末端からカルボキシル末端までＦＷＲ１、ＣＤＲ１、ＦＷＲ２、ＣＤＲ２、ＦＷＲ３、ＣＤＲ３、ＦＷＲ４の順で配置される。軽鎖の３つのＣＤＲ領域はＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２及びＶＬＣＤＲ３を指し、重鎖の３つのＣＤＲ領域はＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２及びＶＨＣＤＲ３を指す。

【0086】

「ヒト由来抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列の可変領域及び定常領域を有する抗体を含む。本出願のヒト由来抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基を含んでもよい（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのランダム又は部位特異的突然変異誘発、又はｉｎ ｖｉｖｏでの体細胞突然変異により導入された突然変異）。しかし、「ヒト由来抗体」という用語には、別の哺乳動物種（マウスなど）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列をヒトの骨格配列に移植した抗体（即ち、「ヒト化抗体」）は含まれない。

【0087】

本出願で使用される場合、抗体に関する「特異性」という用語は、特異的抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識又は結合しない抗体を意味する。例えば、１つの種からの抗原に特異的に結合する抗体は、一つ又は複数の種からのその抗原にも結合することができる。しかし、この種間の交差反応性自体は、特異性に応じた抗体の分類を変更するものではない。別の実例では、抗原に特異的に結合する抗体は、その抗原の異なる対立遺伝子型にも結合することができる。しかし、この交差反応性自体は、特異性に応じた抗体の分類を変更するものではない。場合によっては、「特異性」又は「特異的結合」という用語は、抗体、タンパク質、又はペプチドと第２の化学物質との相互作用を指すために使用されることがあり、これは、当該相互作用が化学物質の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味し、例えば、抗体は一般に、タンパク質ではなく、特定のタンパク質構造を認識して結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識「Ａ」と抗体を含む反応では、エピトープＡ（又は遊離の標識されていないＡ）を含む分子の存在により、抗体に結合する標識Ａの量を減少させる。

【0088】

本出願において、「抗原結合フラグメント」という用語は、抗体の抗原結合フラグメント及び抗体類似体を指し、通常、親抗体（ｐａｒｅｎｔａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の抗原結合領域又は可変領域（例えば、１つ又は複数のＣＤＲ）の少なくとも一部を含む。抗原結合フラグメントは、親抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持している。通常、抗原結合フラグメントは、活性がモルベースで表される場合、親抗体結合活性の少なくとも１０％を保持する。好ましくは、抗原結合フラグメントは、親抗体の標的に対する結合親和性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％又は１００％以上を保持する。抗原結合フラグメントの実例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）_２、Ｆｖフラグメント、線状抗体（ｌｉｎｅａｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、一本鎖抗体、ナノ抗体、単一ドメイン抗体及び多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。抗原結合フラグメントは、操作された抗体変異体であってもよい。操作された抗体変異体は、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ（２００５）Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２３： １１２６－１１３６で概説されている。

【0089】

本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）という用語は、抗原に結合できる細胞外ドメイン（細胞外結合ドメイン）、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン（膜貫通領域）及び細胞質シグナルをドメインに伝達するポリペプチド（即ち、細胞内シグナル伝達ドメイン）を含むことを指す。ヒンジドメインは、細胞外抗原結合領域に柔軟性を与える部分と考えることができる。細胞内シグナル伝達ドメインは、定義されたシグナル伝達経路を通じてセカンドメッセンジャーを産生することによって細胞内に情報を伝達して細胞活性を調節するタンパク質、又はそのようなメッセンジャーに対応してエフェクターとして機能するタンパク質を介して、ＣＡＲの細胞（例えば、ＣＡＲＴ細胞）の免疫エフェクター機能を促進できるシグナルを生成することを指す。細胞内シグナル伝達ドメインはシグナル伝達構造ドメインを含み、共刺激分子に由来する共刺激細胞内ドメインをさらに含んでもよい。

【0090】

「同一性」、「突然変異」は、２つのポリヌクレオチド配列間又は２つのポリペプチド間の配列類似性を指す。２つの比較配列内の位置がすべて同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子内の各位置がアデニンによって占められている場合、前記分子はその位置において相同である。２つの配列間の同一性のパーセンテージは、２つの配列が共有する一致又は相同な位置の数を、比較される位置の数×１００で割った関数である。例えば、配列が最適にアライメントされている場合、２つの配列の１０個の位置のうち６個が一致又は相同であれば、２つの配列は６０％相同である。一般に、比較は２つの配列を比較することで最大の同一性パーセンテージが得られる場合に行われる。

【0091】

「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」（一本鎖の場合）という用語は、本出願では互換的に使用される。「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」又は「ポリヌクレオチド配列」及び「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に使用される。

【0092】

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用できる組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物と結合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むが、これらに限定されない多くのベクターが当技術分野で知られている。従って、「ベクター」という用語には、自律的に複製するプラスミド又はウイルスが含まれる。この用語はまた、ポリリジン化合物、リポソームなど、細胞への核酸の導入を促進する非プラスミド及び非ウイルス化合物を含むものと解釈されるべきである。ウイルスベクターの実例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれるが、これらに限定されない。

【0093】

本出願で使用される場合、「細胞」及び「細胞株」という表現は互換的に使用され、そのような名称にはすべて子孫が含まれる。「宿主細胞」という用語は、ベクターを導入するために使用できる細胞を指し、大腸菌などの原核細胞、酵母細胞などの真菌細胞、又は線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞又はヒト細胞などの動物細胞が含まれるが、これらに限定されない。

【0094】

「トランスフェクション」という用語は、真核細胞に外因性核酸を導入することを指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染及びバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）を含む、当技術分野で知られている様々な手段によって達成することができる。

【0095】

「免疫細胞」という用語は、免疫応答を引き起こすことができる細胞を指し、「免疫細胞」及びその他の文法形式は、あらゆる起源の免疫細胞を指すことができる。「免疫細胞」には、例えば、骨髄で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が含まれる。「免疫細胞」という用語は、ヒト又はヒト以外の免疫細胞を指すことができる。例えば、免疫細胞は、自己Ｔ細胞、同種Ｔ細胞、自己ＮＫ細胞、同種ＮＫ細胞などの血液由来であってもよく、ＥＢＶウイルス感染を使用して調製したＮＫ細胞株、胚性幹細胞とｉＰＳＣから分化誘導したＮＫ細胞、及びＮＫ９２細胞株などの細胞株由来であってもよい。

【0096】

本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」という用語は、胸腺で成熟する一種のリンパ球を指す。Ｔ細胞は細胞媒介性免疫において重要な役割を果たし、細胞表面にＴ細胞受容体が存在する点で他のリンパ球（例えば、Ｂ細胞）と異なっている。「Ｔ細胞」には、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、及びγ－δＴ細胞を含む、ＣＤ３を発現するあらゆる種類の免疫細胞が含まれる。「細胞傷害性細胞」には、細胞傷害性応答を媒介することができるＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及び好中球が含まれる。本明細書で使用される場合、「ＮＫ細胞」という用語は、骨髄に由来し、自然免疫系において重要な役割を果たす一種のリンパ球を指す。ＮＫ細胞は、細胞表面に抗体や主要組織適合性複合体が存在しない場合でも、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、又はその他のストレスを受けた細胞に対して迅速な免疫応答を提供する。

【0097】

「任意選択」、「いずれか一つ」、「任意」又は「いずれか一項」は、その後に記載される事象又は状況が発生してもよいが、必ずしも発生する必要はないことを意味し、その説明には、当該事象又は状況が発生する状況又は発生しない状況が含まれることを意味する。例えば、「任意選択で一つの抗体重鎖可変領域を含む」は、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在してもよいが、必ずしも存在する必要はないことを意味する。本発明で使用される「一つ」及び「一種」は、本発明において１つ又は複数の文法的対象を指すために使用される。内容に明確に別段の指示がない限り、本発明では、「又は」という用語は、「及び／又は」という用語を意味し、それと互換的に使用される。「約」及び「およそ」は、通常、測定の性質又は精度を考慮して、測定される量の許容可能な程度の誤差を意味するものとする。例示的な誤差の程度は一般的にその１０％以内であり、より一般的にその５％以内である。本発明に開示される方法及び組成物は、特定の配列、変異配列、又はそれと実質的に同一若しくは類似の配列、例えば、特定された配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９９％又は以上同一である配列を有するポリペプチド及び核酸を包含する。アミノ酸配列の場合、「実質的に同一」という用語は、本発明では最初のアミノ酸配列を指すために使用される。

【0098】

本発明で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、対象及び有効成分と薬理学的及び／又は生理学的に適合する担体、例えば、当技術分野で周知の任意の適切な生理学的又は薬学的に許容される薬学的賦形剤を指し（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ， １９ｔｈ ｅｄ． Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ： Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９９５を参照）、且つｐＨ調節剤、賦形剤、充填剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤、希釈剤、浸透圧維持剤、吸収遅延剤、防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調節剤にはリン酸緩衝液が含まれるが、これに限定されない。界面活性剤には、Ｔｗｅｅｎ－８０などのカチオン性、アニオン性、又は非イオン性界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。イオン強度増強剤には、塩化ナトリウムが含まれるが、これに限定されない。防腐剤には、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの様々な抗菌剤及び抗真菌剤が含まれるが、これらに限定されない。浸透圧維持剤には、糖、ＮａＣｌ及びその類似物質が含まれるが、これらに限定されない。吸収遅延剤には、モノステアリン酸塩及びゼラチンが含まれるが、これらに限定されない。希釈剤には、水、水性緩衝液（緩衝生理食塩水など）、アルコール及びポリオール（グリセロールなど）などが含まれるが、これらに限定されない。防腐剤には、チメロサール、２－フェノキシエタノール、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの様々な抗菌剤及び抗真菌剤が含まれるが、これらに限定されない。安定剤は、医薬品中の有効成分の所望の活性を安定化させることができる当業者に一般的に理解される意味を有し、グルタミン酸ナトリウム、ゼラチン、ＳＰＧＡ、糖類（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、ラクトース、デキストラン、又はグルコース）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸、グリシン）、タンパク質（例えば、乾燥ホエー、アルブミン、又はカゼイン）、又はそれらの分解産物（例えば、ラクトアルブミン加水分解物）などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の薬学的に許容される担体は、当技術分野の通常の担体であってもよく、前記医薬賦形剤は、当技術分野の通常の医薬賦形剤である。

【0099】

本明細書で使用される場合、ＥＣ_５０という用語は、最大効果の５０％の濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５０％ ｏｆ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｅｃｔ）、即ち、最大効果の５０％をもたらす濃度を指す。

【0100】

本発明で使用される場合、「がん」、「腫瘍」という用語は、組織病理学的タイプ又は浸潤段階に関係なく、全てのタイプのがん性増殖又は腫瘍形成プロセス、転移組織又は悪性形質転換細胞、組織又は器官を含むことを意図している。例としては、固形腫瘍、血液がん、軟部組織腫瘍、及び転移性病変が含まれるが、これらに限定されない。

【0101】

当該分野における常識に基づいて、上記の各好ましい条件を任意に組み合わせて、本発明の各好ましい実例を得ることができる。

【0102】

本発明で使用される試薬及び原料はいずれも市販品として入手できる。

【0103】

本発明の積極的かつ進歩的効果は下記の通りである。

【0104】

１．本発明の抗体は、ヒトＢ７－Ｈ４及びカニクイザルＢ７－Ｈ４に結合する活性を有する。ある好ましい実施形態において、前記抗体は、従来のＩｇＧ抗体の半分のサイズである、「重鎖」のみを含む新規な完全ヒト抗体であってもよく、軽鎖を含まない特徴により、当該抗体は二重特異性抗体に使用することができ、軽鎖のミスマッチやヘテロ二量体化の問題を解決する。

【0105】

２．本発明の抗体をＢ７－Ｈ４×ＣＤ３二重特異性抗体として調製した場合、ヒトＢ７－Ｈ４及びカニクイザルＢ７－Ｈ４に結合する活性を依然として保持し、腫瘍細胞に対して強い殺傷効果を有し、誘導されたＩＬ－６やＩＦＮ－γなどの非特異的サイトカインの発現は非常に低く、ｉｎ ｖｉｖｏで強い抗腫瘍活性を示す。ある好ましい実施形態において、前記二重特異性抗体は、ヒトＦｃフラグメントを有する二重特異性抗体構造を有し、ＦｃのＦｃＲｎへの結合効果を保持し、それによってより長い半減期を有する。同時に、突然変異（ＡＡＡ）Ｆｃは、ＦｃｇＲへの結合を低減するために好ましく、それによってＦｃｇＲの架橋によって引き起こされる非特異的Ｔ細胞活性化を低減する。Ｂ７－Ｈ４末端にタンデムＶＨＨの形を使用できるため、軽鎖と重鎖のミスマッチを簡素化し、同時に良好な安定性と親水性を保持する。二価のタンデムＶＨＨは、一方ではＢ７－Ｈ４の親和性を高め、他方ではＢ７－Ｈ４を高度に発現する腫瘍細胞に対する選択性を高める。二重特異性抗体におけるＣＤ３末端の活性を最適化し、中強度の抗ＣＤ３抗体を使用することで、薬物の有効性の確保を前提に毒性を低減する。

【図面の簡単な説明】

【0106】

【図1】Ａ～Ｅは、ＦＡＣＳにより検出した抗ヒトＢ７－Ｈ４ ＨＣＡｂモノクローナル抗体の細胞レベルにおける結合を示す。

【図2】ＢＬＩ法による親和性の測定を示す。

【図3】Ａ～Ｃは、Ｂ７－Ｈ４×ＣＤ３二重特異性抗体の構造を示す。

【図4】Ａ～Ｅは、ＦＡＣＳにより検出したヒト、カニクイザル、及びマウスのＢ７－Ｈ４を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株における、Ｂ７－Ｈ４×ＣＤ３二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合を示す。

【図5】Ａ～Ｆは、ＦＡＣＳにより検出したＢ７－Ｈ４を内因的に発現する腫瘍細胞及びＴ細胞における、Ｂ７－Ｈ４×ＣＤ３二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合を示す。

【図6】Ａ～Ｅは、Ｔ細胞によるＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の殺滅の結果を示す。

【図7】Ａ～Ｄは、Ｔ細胞によるＯＶＣＡＲ－３細胞の殺滅の結果を示す。

【図8】Ａ～Ｃは、Ｔ細胞によるＤＬＤ－１、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の細胞殺滅の結果を示す。

【図9】Ａ及びＢは、非特異的サイトカインＩＬ－６の誘導の結果を示す。

【図10】Ａ及びＢは、非特異的サイトカインＴＮＦ－αの誘導の結果を示す。

【図11】Ａ及びＢは、非特異的サイトカインＩＦＮ－γの誘導の結果を示す。

【図12】Ａ～Ｃは、マウス腫瘍モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ薬効実験である。

【発明を実施するための形態】

【0107】

以下、実施例により本発明をさらに説明するが、それによって本発明は前記実施例の範囲に限定されるものではない。以下の実施例において、具体的な条件が示されていない実験方法は、通常の方法及び条件、或いは商品の説明書に従って選択される。

【0108】

実施例１．抗Ｂ７－Ｈ４ ＨＣＡＢ抗体分子の取得
Ｂ７－Ｈ４抗原を使用して、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する抗体分子を得るために、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ラクダなどの実験動物を免疫することができる。通常、得られる抗体分子は非ヒト由来抗体である。非ヒト由来抗体を得た後、免疫原性を低下させ、創薬可能性を向上させるために、抗体工学技術を使用してこれらの分子をヒト化する必要がある。しかし、抗体のヒト化プロセスには技術的に複雑さがあり、ヒト化分子は抗原に対する親和性が低下することがよくある。一方、トランスジェニック技術の進歩により、ヒト免疫グロブリン免疫レパートリーを持ち、内因性のマウス免疫レパートリーを欠失させた遺伝子操作マウスの作製が可能になる。このトランスジェニックマウスによって産生される抗体は完全ヒト配列を持っているため、さらなるヒト化の必要がなく、治療用抗体の開発効率を大幅に向上させる。ＨａｒｂｏｕｒＨＣＡｂマウス（ＨａｒｂｏｕｒＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＢＶ、ＷＯ２００２／０８５９４５Ａ３）は、ヒト免疫グロブリン免疫レパートリーを持つトランスジェニックマウスであり、従来のＩｇＧ抗体の半分のサイズである新規な「重鎖」のみの抗体を産生することができる。それにより産生された抗体は、ヒト抗体の「重鎖」可変ドメインとマウスＦｃ定常ドメインのみを持つ。軽鎖を含まない特徴により、当該抗体は軽鎖のミスマッチやヘテロ二量化の問題をほぼ解決し、この技術プラットフォームは従来の抗体プラットフォームでは実現が困難な製品の開発を可能にする。

【0109】

１．１ マウスの免疫
ＨＣＡＢマウスを、ヒトＢ７－Ｈ４を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ／ｈｕ Ｂ７－Ｈ４、ＫＹｉｎｎｏ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．， Ｌｔｄ）で免疫し、各マウスに１回あたり５×１０^６細胞を腹腔内注射により免疫した。免疫化の各ラウンドにおいて、各マウスが受けた総注射量は１００μｌであった。追加免疫の各ラウンドの間隔は少なくとも２週間であり、通常、追加免疫のラウンドは６～７回であった。免疫化時間は０、１４、２８、４２、５６、７０、８４、９６日目であり、４９日目と７７日目にマウスの血清抗体力価を検出した。最後の追加免疫は、ＨＣＡＢマウスの脾臓Ｂ細胞単離の５日前に実行した。

【0110】

１．２ 血清力価の検出
特定の時点でマウスの血清を採取し、血清におけるＢ７－Ｈ４タンパク質に結合する抗体の力価をＥＬＩＳＡ方法を使用して検出し、血清におけるＢ７－Ｈ４を過剰発現する細胞に結合する抗体の力価をＦＡＣＳ方法を使用して検出した。

【0111】

ＥＬＩＳＡ方法において、１μｇ／ｍＬのｈＢ７－Ｈ４－ＥＣＤ－ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃１０７３８－Ｈ０８Ｈ）を使用して１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレート（ｃｏｒｎｉｎｇ、９０１８）をコーティングし、４℃で一晩培養した。２回すすいだ後、プレートを１％のＢＳＡを含むＰＢＳＴで３７℃で２時間ブロッキングした。段階希釈した血清を１００μＬ／ウェルで加え、３７℃で１時間培養した。３回すすいだ後、１：５０００に希釈したａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ－ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ、カタログ番号：Ａ９０－２３１Ｐ）を１００μＬ／ウェルで加え、３７℃で３０分間培養した。３回すすいだ後、ＴＭＢ基質を１００μＬ／ウェルで加え、約１０分間培養し、１ＮのＨＣｌを５０μＬ／ウェルで加えて発色を止め、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｐｌｕｓ ３８４）。

【0112】

ＦＡＣＳ方法において、段階希釈したマウスの血清をＨＥＫ２９３Ｔ／ｈｕ Ｂ７－Ｈ４細胞と４℃で１時間培養した。細胞を２回洗浄した後、二次抗体Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１１５－６０５－０６２）を加え、４℃で１時間培養し、２回洗浄した後、細胞を再懸濁させ、フローサイトメトリー（ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ３０００）で検出した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をバックグラウンドコントロールとして使用た。

【0113】

１．３ ファージディスプレイ技術によるＨＣＡｂモノクローナル及び抗体配列の取得
ａ．ファージライブラリーの構築
実施例１．１で免疫したマウスから脾臓細胞を採取し、そこから脾臓Ｂ細胞を単離し、製品説明書（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号：１５５９６０１８）を参照してＴＲＩＺＯｌでＲＮＡを抽出した後、製品説明書（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号：１１７５６５００）を参照してＲＴ－ＰＣＲを実行した。ｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりＶＨＨフラグメントを増幅した。

【0114】

ＰＣＲ増幅系は下記の表に示された通りである。

【0115】

【0116】

ＰＣＲ増幅手順は下記の表に示された通りである。

【0117】

【0118】

得られたライゲーション産物をＳＳ３２０（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号：６０５１２－１）に形質転換し、次にファージライブラリーを調製した。３ラウンドのバイオパンニング（手順は下記の通り）を実行し、ビオチン化Ｂ７－Ｈ４を使用してＦＡＣＳでスクリーニングし、スクリーニングされたすべての候補（ｈｉｔ）をシーケンシング（手順は下記の通り）に送り、特定のクローンを生成した。

【0119】

ｂ．バイオパニング（Ｂｉｏ－Ｐａｎｎｉｎｇ）
ファージライブラリー（１Ｅ１３ファージ粒子）をストレプトアビジン（ＳＡ）コーティングビーズ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号：１１２０６）で非特異的に結合した分子を除去し、次にＳＡ－Ｂｉｏ－Ｂ７－Ｈ４ビーズ（製品説明書を参照）と室温で１時間培養した。次に１×ＰＢＳＴで１０回洗浄した。洗浄した後、磁性ビーズファージ混合物にｐＨ３．０のクエン酸緩衝液を加え、室温で１０分間培養し、次にｐＨ９．０のＴｒｉｓ－ＨＣｌ中和緩衝液を加え、ＳＳ３２０細胞を３７℃で４５分間感染させた。次に、５０μｌの２Ｅ１２／ｍｌのＭ１３Ｋ０７ヘルパーファージ（ＮＥＢ、カタログ番号：Ｎ０３１５Ｓ）を上記の感染細胞に加え、最後に新鮮な２×ＹＴ（１００μｇ／ｍｌのＡｍｐ、５０μｇ／ｍｌのＫａｎ、１ｍＭのＩＰＴＧを含む）を加え、３０℃で一晩培養した。一晩培養したものを遠心分離し、上清を回収し、２０％のＰＥＧ６０００／２．５ＭのＮａＣｌを上清液に加え（１：５、体積比）、次に４℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。遠心分離したファージペレットを１ｍｌの１×ＰＢＳに再懸濁させた。得られた上清液（ファージ粒子）を新しいチューブに移し、パンニングのラウンド２に備えた。パンニングのラウンド２とラウンド３のプロセスは上記のステップと同じであった。

【0120】

ｃ．初期スクリーニング
コロニーを選択してＹＴ／Ａｍｐ培地（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号：Ａ５０７０１６－０２５０）を含む９６ウェルプレートに入れ、３７℃で３時間増殖させた。ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで加え、３０℃で一晩誘導した。次に、上清液を遠心分離して沈殿させ、上清液を採取してＦＡＣＳ試験を実行した。ヒト及びサルのＢ７－Ｈ４によく結合するクローンを選択して配列決定を実行した。

【0121】

１．４ 抗Ｂ７－Ｈ４ Ｈ２Ｌ２抗体分子の取得
Ｂ７－Ｈ４組換えタンパク質又はＢ７－Ｈ４を過剰発現する細胞を使用して、Ｂ７－Ｈ４に特異的に結合する抗体分子を得るために、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ラクダなどの実験動物を免疫する。通常、得られる抗体分子は非ヒト由来抗体である。非ヒト由来抗体を得た後、免疫原性を低下させ、創薬可能性を向上させるために、抗体工学技術を使用してこれらの分子をヒト化する必要がある。しかし、抗体のヒト化プロセスには技術的に複雑さがあり、ヒト化分子は抗原に対する親和性が低下することがよくある。一方、トランスジェニック技術の進歩により、ヒト免疫グロブリン免疫レパートリーを持ち、内因性のマウス免疫レパートリーを欠失させた遺伝子操作マウスの作製が可能になる。Ｈａｒｂｏｒ Ｈ２Ｌ２マウス（Ｈａｒｂｏｕｒ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＢＶ）は、ヒト免疫グロブリン免疫レパートリーを持つトランスジェニックマウスであり、このトランスジェニックマウスによって産生される抗体は完全ヒト配列を持っているため、さらなるヒト化の必要がなく、治療用抗体の開発効率を大幅に向上させる。

【0122】

次に、下記のように、Ｂ細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏクローニング技術によって抗Ｂ７－Ｈ４抗体をスクリーニングした。

【0123】

マウスの脾臓を取り出し、粉砕し、２００メッシュのフィルターでろ過し、単一細胞懸濁液をマウスメモリーＢ細胞選別キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、＃１３０－０９５－８３８）に従って選別した。選別して得られた細胞を免疫蛍光染色した。

【0124】

Ｂ２００陽性細胞（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃１０３２２７）、ＩｇＭ陰性細胞（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４０６５０６）、Ｂ７－Ｈ４特異的陽性細胞（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、＃４０５２０７）をフローサイトメトリーソーターＳ３ｅで選別した。選別して得られた細胞を９６ウェル細胞培養プレートで１ウェル当たり５細胞の密度で培養し、照射したＥＬ４細胞をフィーダー細胞として細胞培養プレートに予め敷いた。

【0125】

１４日間の培養後、培養上清を回収してＥＬＩＳＡ検出を実行し、Ｂ７－Ｈ４タンパク質に対する結合活性を有するウェルについては、細胞を取り出し、ＲＴ－ＰＣＲを実行した（ＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（＃６３４８９２）、Ｉ－５^ＴＭ ２×Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（＃Ｉ５ＨＭ－５０００）。増幅により得られた軽鎖と重鎖をオーバーラップＰＣＲによってｓｃＦｖにスプライシングし、大腸菌で発現させ、発現上清をＥＬＩＳＡ検出に供し、陽性クローンを配列決定した。

【0126】

１．５ 抗Ｂ７－Ｈ４抗体の配列解析と配列最適化
スクリーニングにより得られた陽性クローンを使用して、実施例１．６に記載の方法に従って組換え抗体ＰＲ００６００４及びＰＲ００６００８を調製した。本実施例では、免疫化されたＨａｒｂｏｕｒＨＣＡｂマウスから得られた抗Ｂ７－Ｈ４モノクローナル抗体分子の可変ドメインの配列は、ヒト由来抗体配列であった。表１－１にその生殖系列遺伝子解析と翻訳後修飾部位（ＰＴＭ）解析を示す。

【0127】

ＰＲ００６００４とＰＲ００６００８は、ＣＤＲ２にアスパラギン酸異性化（ＤＧ）の可能性のある部位を含み、この潜在的な翻訳後修飾部位（ＰＴＭ）のリスクを低減するために、そのＤＧをＤＳに変異させ、それぞれ新しい分子ＰＲ００７４４０とＰＲ００７４４１を得た（表１－２）。

【0128】

さらに、ＰＲ００６００４の等電点を下げるために、抗体配列解析に基づいてＣＤＲ領域の塩基性アミノ酸を選択してランダムに変異させた。次に、ＦＡＣＳ結合実験を使用してスクリーニングを実行し、スクリーニングされた候補分子を発現・精製・同定した。表１－２は、抗体ＰＲ００６００４の配列に対してアミノ酸変異を実行することによって得られた新しい抗体分子の配列を示す。

【0129】

【表1-1】

【0130】

【表1-2】

【0131】

１．６ 抗Ｂ７－Ｈ４完全ヒト組換え抗体の調製
抗体重鎖をコードするプラスミドを哺乳動物宿主細胞（例えば、ヒト胚性腎臓細胞ＨＥＫ２９３）にトランスフェクションし、従来の組換えタンパク質発現及び精製技術を使用して、精製された抗Ｂ７－Ｈ４組換え重鎖抗体を得る。具体的には、ＨＥＫ２９３細胞をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ^ＴＭ Ｆ１７ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ培地（Ｔｈｅｒｍｏ、Ａ１３８３５０４）で増殖させた。一過性トランスフェクションを開始する前に、細胞濃度を６×１０Ｅ＋０５細胞／ｍＬに調節し、３７℃、８％のＣＯ_２のシェーカーで２４時間培養して、細胞濃度を１．２×１０Ｅ＋０６細胞／ｍＬの濃度にした。３０ｍＬの培養細胞を調製し、重鎖をコードする上記のプラスミド３０μｇを１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ、３１９８５０８８）に溶解させ、次に、１．５ｍＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭを１ｍｇ／ｍＬのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ、カタログ番号：２３９６６－２）１２０μＬに溶解させ、５分間静置した。プラスミドにＰＥＩをゆっくりと加え、室温で１０分間培養し、プラスミド－ＰＥＩ混合溶液を培養フラスコを振とうしながらゆっくりと滴下し、３７℃、８％のＣＯ_２のシェーカーで５日間培養した。細胞生存率を５日後に観察した。培養物を回収し、３３００Ｇで１０分間遠心分離して上清を採取し、次に上清を高速遠心分離して不純物を除去した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ^ＴＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：７１－５０２０－９１ ＡＥ）を含む重力カラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、＃７３１１５５０）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で平衡化し、２～５カラム容量ですすいだ。上清試料をカラムにロードした。カラムを５～１０カラム容量のＰＢＳですすいだ。０．１Ｍのグリシン（ｐＨ３．５）を使用して標的タンパク質を溶出し、次にＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を使用して中性に調節し、最後に限外ろ過チューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＦＣ９０１０２４）で濃縮してＰＢＳ緩衝液に交換し、精製された抗Ｂ７－Ｈ４重鎖抗体溶液を得た。

【0132】

１．７ ＳＥＣ－ＨＰＬＣによるタンパク質の純度及び凝集体の分析
本実施例では、分析用分子サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、タンパク質試料の純度及び凝集体の形態を分析する。分析用クロマトグラフィーカラムＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷｘｌ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃０８５４１、５μｍ、７．８ ｍｍ×３０ｃｍ）を高圧液体クロマトグラフＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）に接続し、ＰＢＳ緩衝液で室温で少なくとも１時間平衡化した。適量のタンパク質試料（少なくとも１０μｇ）を０．２２μｍフィルターでろ過してシステムに注入し、ＨＰＬＣプログラムを設定し、ＰＢＳ緩衝液を使用して試料を１．０ｍｌ／分の流速でカラムに最大２５分間流した。ＨＰＬＣは、試料中の異なる分子サイズの成分の保持時間を報告する分析レポートを生成した。

【0133】

１．８ ＨＰＬＣ－ＨＩＣによるタンパク質の純度及び疎水性の分析
分析用疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を使用して、タンパク質試料の純度及び疎水性を分析する。分析用クロマトグラフィーカラムＴＳＫｇｅ１ Ｂｕｔｙ１－ＮＰＲ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１４９４７、４．６ｍｍ×３．５ｃｍ）を高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）（モデル：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）に接続し、ＰＢＳ緩衝液で室温で少なくとも１時間平衡化した。設定方法は、１００％移動相Ａ（２０ｍＭのヒスチジン、１．８Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．０）から１００％移動相Ｂ（２０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０）への直線勾配を１６分以内に設定し、流速を０．７ｍＬ／ｍｉｎ、タンパク質試料の濃度を１ｍｇ／ｍＬ、注入量を２０μＬ、検出波長を２８０ｎｍに設定した。収集した後、ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用してクロマトグラムを統合し、関連データを計算し、試料中の異なる分子サイズの成分の保持時間を報告する分析レポートを生成した。

【0134】

１．９ ＤＳＦ又はＵＮｃｌｅによるタンパク質分子の熱安定性の測定
示差走査蛍光分析（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ、ＤＳＦ）は、タンパク質の熱安定性を測定するために一般的に使用されるハイスループットな方法である。リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ装置を使用して、折り畳まれていないタンパク質分子に結合した色素の蛍光強度の変化をモニタリングすることにより、タンパク質の変性プロセスを反映し、タンパク質分子の熱安定性を反映する。本実施例では、ＤＳＦ法を使用してタンパク質分子の熱変性温度（Ｔｍ）を測定した。１０μｇのタンパク質を９６ウェルＰＣＲプレート（Ｔｈｅｒｍｏ、＃ＡＢ－０７００／Ｗ）に加え、次に２μＬの１００×希釈した色素ＳＹＰＲＯＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃２００８１３８）を加え、その後、緩衝液を加えて１ウェルあたりの最終容量を４０μｌにした。ＰＣＲプレートを密封し、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ装置（Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ ＰＣＲシステム）に入れ、最初に２５℃で５分間培養し、次に０．２℃／０．２分の勾配で温度を２５℃から９５℃まで徐々に上昇させ、試験終了時に温度を２５℃まで下げた。ＦＲＥＴ走査モードを使用し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェアを使用してデータ分析を実行して、試料のＴｍを計算した。

【0135】

Ｕｎｃｌｅ（Ｕｎｃｈａｉｎｅｄ Ｌａｂｓ）は、全蛍光、静的光散乱（ＳＬＳ）、及び動的光散乱（ＤＬＳ）検出方法によってタンパク質の安定性を特徴付ける多機能ワンストップタンパク質安定性分析プラットフォームである。同じセットの試料について、融解温度（Ｔｍ）、凝集温度（Ｔａｇｇ）、粒子径（ｄｉａｍｅｔｅｒ）などのパラメーターを同時に得ることができる。本実施例では、Ｕｎｃｌｅの「Ｔｍ＆Ｔａｇｇ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｏｎａｌ ＤＬＳ」アプリケーションを選択して操作し、９μＬの試料をＵｎｉチューブに加え、温度を２５℃から９５℃まで０．３℃／分の勾配で徐々に上昇するように設定した。最初のＤＬＳ測定と最後のＤＬＳ測定をそれぞれ５秒間、４回実行した。実験の実行終了後、Ｕｎｃｌｅ分析ソフトウェアは重心平均（ＢＣＭ）式を使用して各試料のＴｍ値を計算した。

【0136】

得られた抗体の発現情報及び物理化学的性質は表１－３に示された通りである。

【0137】

【表1-3】

【0138】

１．１０ 抗Ｂ７－Ｈ４抗体の配列と番号
本発明において、列挙されたＣＤＲのアミノ酸配列はすべてＣｈｏｔｈｉａ定義に従って示されている。しかし、抗体のＣＤＲは、配列可変性に基づくＫａｂａｔの定義（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （Ｕ．Ｓ．）， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍａｒｙｌａｎｄ （１９９１）を参照）、及び構造ループ領域の位置に基づくＣｈｏｔｈｉａ定義（ＪＭｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－４８，１９９７を参照）などの当技術分野の様々な方法によって定義できることは当業者には周知である。本発明の技術的解決策において、Ｋａｂａｔ定義及びＣｈｏｔｈｉａ定義を含むＣｏｍｂｉｎｅｄ定義を使用して、可変ドメイン配列中のアミノ酸残基を決定することもできる。Ｃｏｍｂｉｎｅｄ定義は、Ｋａｂａｔ定義及びＣｈｏｔｈｉａ定義の範囲を結合し、これに基づいてより大きな範囲を取るものであり、詳細は表４を参照されたい。特に明記しない限り、所与の抗体又はその領域（例えば、可変領域）の「ＣＤＲ」及び「相補性決定領域」という用語は、本発明に記載の上記の公知実施形態のいずれかによって定義される相補性決定領域を包含すると理解されるべきであることが、当業者には理解されるべきである。本発明により請求される範囲はＣｈｏｔｈｉａ定義に基づいて示される配列であるが、他のＣＤＲ定義による対応するアミノ酸配列も本発明の保護範囲に入るべきである。

【0139】

【表1-4】

【0140】

ここで、Ｈａａ－Ｈｂｂは、抗体の重鎖のＮ末端から始まるａａ位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）からｂｂ位（Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム）までのアミノ酸配列を指すことができる。例えば、Ｈ２６～Ｈ３５は、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキームに従って、抗体の重鎖のＮ末端から始まる２６位から３５位までのアミノ酸配列を指すことができる。当業者は、Ｃｈｏｔｈｉａを使用してＣＤＲをコードする場合、いくつかの位置に挿入部位が存在することを知っているべきである（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ／を参照することができる）。

【0141】

表１－５、表１－６、表１－７及び表１－８は、本発明の抗Ｂ７－Ｈ４抗体の配列に対応する配列番号を示す。

【0142】

【表1-5】

【0143】

【表1-6】

【0144】

【表1-7】

【0145】

【表1-8】

【0146】

実施例２．ＦＡＣＳにより抗ヒトＢ７－Ｈ４ ＨＣＡｂモノクローナル抗体の細胞レベルにおける結合能力の検出
本実施例では、ヒトＢ７－Ｈ４に対する抗ヒトＢ７－Ｈ４ ＨＣＡｂモノクローナル抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合活性を研究するために、ヒトＢ７－Ｈ４を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕＢ７－Ｈ４、Ｈａｒｂｏｕｒ ＢｉｏＭｅｄ）、ＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ２９３／ｈｕＢ７－Ｈ４、Ｈａｒｂｏｕｒ ＢｉｏＭｅｄ）、カニクイザルＢ７－Ｈ４を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏＢ７－Ｈ４、Ｈａｒｂｏｕｒ ＢｉｏＭｅｄ）、マウスＢ７－Ｈ４を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｍＢ７－Ｈ４、Ｈａｒｂｏｕｒ ＢｉｏＭｅｄ）、及びＢ７－Ｈ４を内因性に過剰発現するＭＤＡ－ＭＢ－４６８乳がん細胞を使用して、細胞レベルでの抗体結合実験を実行した。簡単に説明すると、細胞を消化し、２％のＦＢＳを含むＰＢＳに再懸濁させ、細胞密度をそれぞれ１×１０^６細胞／ｍＬに調節した。９６ウェルＶボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号：３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで細胞を接種し、次に最終濃度の２倍で３倍濃度勾配希釈した試験抗体を１００μＬ／ウェルで加えた。細胞を４℃に置き、光を避けて２時間培養した。次に、予め冷却させたＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加えて細胞を２回洗浄し、５００ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに１００μＬ／ウェルで蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１０９－５４５－０６、１：５００希釈）を加え、４℃で、光を避けて６０分間培養した。予め冷却させたＰＢＳで１００μＬ／ウェルで細胞を２回洗浄し、５００ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を捨てた。最後に、予め冷却させたＰＢＳで２００μＬ／ウェルで細胞を再懸濁させ、ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ３０００を使用して蛍光シグナル値を読み取った。

【0147】

細胞表面のヒトＢ７－Ｈ４に対する抗体結合の結果は、表２－１、２－２、２－３、図１のＡ～Ｅに示された通りである。その結果、ＰＲ００６００４及びＰＲ００６００８はヒト、カニクイザルＢ７－Ｈ４及び腫瘍細胞ＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対してより優れた結合を示し、その中で、ＰＲ００６００８はより強い細胞結合を有し、マウスＢ７－Ｈ４と交差反応性を有することが示されている。ＰＲ００６００４の等電点低下突然変異型抗体のヒトＢ７－Ｈ４に対する結合は、ＰＲ００６００４そのものと比較してわずかに低下し、その中でＰＲ００７１９６の結合能は最も弱かった。ＰＲ００６００４及びＰＲ００６００８の翻訳後修飾部位（ＰＴＭ）突然変異体であるＰＲ００７４４０及びＰＲ００７４４１の結合活性は、親抗体と比較して有意な変化は見られなかった。

【0148】

【表2-1】

【0149】

【表2-2】

【0150】

【表2-3】

【0151】

実施例３．ＢＬＩ法による親和性の測定
アフィニティーテスト及び抗原、抗体の希釈のために、１０×キネティック緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、＃１８－１１０５）を１×に希釈した。バイオフィルム干渉（ＢＬＩ）技術により、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ ９６ｅ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）分子間相互作用分析装置を使用して、抗原と抗体の間の結合動態を分析した。

【0152】

抗原と抗体の親和性を測定する場合、センサーの回転速度は１０００ｒｐｍであった。まず、一列に並べたＡＨＣセンサー（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、＃１８－５０６０）を試験緩衝液中で１０分間平衡化し、次にＡＨＣセンサーを使用して捕捉高さ０．７ｎｍでＢ７－Ｈ４抗体を捕捉し、ＡＨＣセンサーを緩衝液中で１２０秒間平衡化した後、２倍勾配希釈したヒト又はサルＢ７－Ｈ４（濃度は１００～３．７５ｎＭ及び０ｎＭである）に１８０秒間結合し、３００秒間解離させた。最後に、ＡＨＣセンサーを１０ｍＭのグリシン－塩酸ｐＨ１．５溶液に浸して再生し、センサーに結合したタンパク質を溶出した。

【0153】

Ｏｃｔｅｔ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、バージョン１１．０）を使用してデータ分析を実行した場合、０ｎＭを参照ウェルとし、参照シグナルを差し引き（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ）、「１：１ Ｇｌｏｂａｌ ｆｉｔｔｉｎｇ」方法を選択してデータをフィッティングし、抗原と抗原結合タンパク質の結合の動態パラメーターを計算し、ｋ_ｏｎ（１／Ｍｓ）値、ｋ_ｄｉｓ（１／ｓ）値、及びＫ_Ｄ（Ｍ）値を得た（表３、図２を参照）。その結果、ＰＲ００６００４及びＰＲ００６００８はともにタンパク質レベルでの親和性が高く、その中でＰＲ００６００４はタンパク質レベルでの親和性がＰＲ００６００８よりもわずかに高いことが示されている。アミノ酸の突然変異により抗体のＴＭ値が増加した後、ＰＲ００７０７７、ＰＲ００７０７８は、それらの対応する親抗体であるＰＲ００６３９１、ＰＲ００６４０７と比較して、Ｂ７－Ｈ４に対する親和性に有意な変化を示さなかった。

【0154】

【表3】

【0155】

実施例４． Ｂ７－Ｈ４×ＣＤ３二重特異性抗体の構造と設計
Ｂ７－Ｈ４×ＣＤ３二重特異性抗体は２つの標的に同時に結合することができ、その一端は腫瘍細胞の表面に特異的に発現するＢ７－Ｈ４を認識することができ、もう一端はＴ細胞上のＣＤ３分子に結合することができる。Ｂ７－Ｈ４×ＣＤ３二重抗体分子が腫瘍細胞の表面に結合すると、腫瘍細胞付近のＴ細胞を動員して活性化し、それによって腫瘍細胞を死滅させることができる。

【0156】

本実施例では、実施例１で得られた抗Ｂ７－Ｈ４抗体と抗ＣＤ３抗体ＰＲ００３８８６（特許出願ＷＯ２０２１／０６３３３０に由来する、配列は表４－１に示される）を使用して、Ｂ７－Ｈ４×ＣＤ３二重特異性抗体を調製した。前記二重特異性抗体は、図３のＡ～Ｃに示される構造を有する。前記構造は、３つのポリペプチド鎖：アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＶＬ＿Ａ－ＣＬを含むポリペプチド鎖１又は第１のポリペプチド鎖、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３を含むポリペプチド鎖２又は第２のポリペプチド鎖、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＶＨ＿Ｂ－Ｌ－ＶＨ＿Ｂ－ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３又はＶＨ＿Ｂ－ｈ－ＣＨ２－ＣＨ３を含む、ポリペプチド鎖３又は第３のポリペプチド鎖を含む。ここで、ＶＨ＿Ａ及びＶＬ＿Ａはそれぞれ抗体Ａの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域であり、ＶＨ＿Ｂは重鎖抗体Ｂの重鎖可変領域であり、ＣＬは軽鎖定常領域ドメインであり、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３はそれぞれ重鎖定常領域の第１、第２及び第３ドメインであり、Ｌはリンカーペプチドであり、ｈはＩｇＧ抗体のヒンジ領域又は誘導体配列である。

【0157】

表４－２のＢ７－Ｈ４×ＣＤ３二重抗体分子ＲＰ００７３５４、ＰＲ００７３５５は同じ分子構造を有し、ポリペプチド鎖１とポリペプチド鎖－２の組成はＣＤ３のＦａｂ部分を標的とし、ポリペプチド鎖－３はＢ７－Ｈ４を標的とする１つのＶＨ部分（ＶＨ＿Ｂ）を含む。

【0158】

表４－２の他のＢ７－Ｈ４×ＣＤ３二重抗体分子（ＰＲ００６３９１、ＰＲ００６４０７、ＰＲ００６８４０、ＰＲ００７０７７、ＰＲ００７０７８、ＰＲ００７１６８）はすべて同じ分子構造を有し、ポリペプチド鎖１とポリペプチド鎖－２の組成はＣＤ３のＦａｂ部分を標的とし、ポリペプチド鎖－３はＢ７－Ｈ４を標的とする２つのＶＨ部分（ＶＨ＿Ｂ）を含む。ここで、２つのＶＨ＿Ｂの配列は同じであっても異なっていてもよく、２つのＶＨ＿ＢはリンカーペプチドＧＳ＿１５（配列番号６６）を介して連結される。さらに、ＰＲ００５８８５は「１＋１」Ｆａｂ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ非対称構造分子であり、その構造は、対応する抗Ｂ７－Ｈ４抗体のｓｃＦｖポリペプチド鎖、及び上記の抗ＣＤ３抗体の重鎖と軽鎖をそれぞれ含む３つのタンパク質鎖を含む。

【0159】

Ｆｃγ受容体の結合によって引き起こされる架橋とエフェクター機能の低下を防ぐために、「ＡＡ」二重突然変異体（Ｌ２３４ＡとＬ２３５Ａ）又は「ＡＡＡ」三重突然変異体（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡとＧ２３７Ａ）をポリペプチド鎖－２及びポリペプチド鎖－３の重鎖定常領域に導入した。さらに、相同な重鎖二量体の生成を減らすために、２つの重鎖の定常領域にそれぞれ異なるアミノ酸突然変異を導入し、それらに「ｋｎｏｂ－ｈｏｌｅ」突然変異と修飾ジスルフィド結合を持たせた。ＣＤ３を標的とするポリペプチド鎖－２に突然変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃを導入した。同時に、Ｂ７－Ｈ４を標的とするポリペプチド鎖－３に突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを導入した。ポリペプチド鎖－２のＦｃ定常領域配列は配列番号６８に示される配列であり、ポリペプチド鎖－３のＦｃ定常領域配列は配列番号６７に示される配列である。さらに、抗体分子の熱安定性を向上させるために、特許ＷＯ２０１２１００３４３Ａ１に従って、抗Ｂ７－Ｈ４のＶＨドメインに追加のジスルフィド結合を導入し、具体的には、抗Ｂ７－Ｈ４のＶＨドメインのＫａｂａｔ番号の４９位と６９位の２つのアミノ酸をＣｙｓに変更して、ジスルフィド結合を形成させ、即ち、Ｓ４９ＣとＩ７０Ｃの突然変異をそれぞれに導入した。表４－２は、本発明のＢ７－Ｈ４×ＣＤ３二重特異性抗体分子と、そのＣＤ３末端の親モノクローナル抗体及びＢ７－Ｈ４末端の親モノクローナル抗体を示し、表４－３は、本発明のＢ７－Ｈ４×ＣＤ３二重特異性抗体のポリペプチド鎖の配列に対応する配列番号を示す。

【0160】

実施例１．５に記載の方法を使用して、３つのポリペプチド鎖をコードする発現ベクターを、組換え発現のために哺乳動物宿主細胞に同時トランスフェクションし、精製された抗体タンパク質分子を得た。

【0161】

その安定性Ｔｍ、溶解度ＨＩＣ、一段階精製後の副生成物の分析などのデータは表１－３に示された通りである。

【0162】

表４－１は、本発明で使用される抗ＣＤ３抗体ＰＲ００３８８６の配列に対応する配列番号を示す。

【0163】

【表4-1】

【0164】

表４－２は、本発明のＢ７－Ｈ４×ＣＤ３二重抗体分子及びその親モノクローナル抗体を示す。

【0165】

【表4-2】

【0166】

表４－３は、本発明のＢ７－Ｈ４×ＣＤ３二重特異性抗体のポリペプチド鎖配列に対応する配列番号を示す。

【0167】

【表4-3】

【0168】

実施例５．ＦＡＣＳによるヒト、カニクイザル、及びマウスのＢ７－Ｈ４を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株におけるＢ７－Ｈ４×ＣＤ３二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合の検出
本実施例は、ヒト、カニクイザル、及びマウスのＢ７－Ｈ４に対するＢ７－Ｈ４のＣＤ３二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合活性を研究するためである。ヒトＢ７－Ｈ４を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕＢ７－Ｈ４、Ｈａｒｂｏｕｒ ＢｉｏＭｅｄ）、カニクイザルＢ７－Ｈ４を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｃｙｎｏＢ７－Ｈ４、Ｈａｒｂｏｕｒ ＢｉｏＭｅｄ）、マウスＢ７－Ｈ４を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞株（ＣＨＯ－Ｋ１／ｍＢ７－Ｈ４、Ｈａｒｂｏｕｒ ＢｉｏＭｅｄ）を使用して、細胞レベルでの抗体結合実験を実行した。簡単に説明すると、細胞を消化し、２％のＦＢＳを含むＰＢＳに再懸濁させ、細胞密度をそれぞれ１×１０^６細胞／ｍＬに調節した。９６ウェルＶボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号：３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで細胞を接種し、次に最終濃度の２倍で３倍濃度勾配希釈した試験抗体を１００μＬ／ウェルで加えた。細胞を４℃に置き、光を避けて２時間培養した。次に、予め冷却させたＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加えて細胞を２回洗浄し、５００ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに１００μＬ／ウェルで蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１０９－５４５－０６、１：５００で希釈）を加え、４℃で、光を避けて６０分間培養した。予め冷却させたＰＢＳで１００μＬ／ウェルで細胞を２回洗浄し、５００ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を捨てた。最後に、予め冷却させたＰＢＳで２００μＬ／ウェルで細胞を再懸濁させ、ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ３０００を使用して蛍光シグナル値を読み取った。

【0169】

細胞表面のヒトＢ７－Ｈ４、カニクイザルＢ７－Ｈ４、及びマウスＢ７－Ｈ４に結合する抗体のまとめは表５、図４のＡ～Ｅに示された通りである。その結果、二重抗体分子ＰＲ００６３９１、ＰＲ００６４０７、及びＰＲ００５８８５はいずれもヒト、カニクイザルＢ７－Ｈ４に対してより優れた結合を有し、その中で、二重抗体分子ＰＲ００６４０７はＰＲ００６３９１よりもヒト、カニクイザルＢ７－Ｈ４に対してより強い結合を有することが示されている。この結合傾向は、その親Ｂ７－Ｈ４分子ＰＲ００６００８、ＰＲ００６００４の結合能力と一致しているが、ＰＲ００５８８５はより高い最大ＭＦＩ値を有していた。ＰＲ００６４０７はマウスＢ７－Ｈ４と交差反応を有し、ＰＲ００６３９１はマウスＢ７－Ｈ４に結合せず、ＰＲ００５８８５はマウスＢ７－Ｈ４と弱い交差反応を有していた。他の抗体ＰＲ００７３５４、ＰＲ００７３５５、ＰＲ００７０７７、ＰＲ００７０７８、ＰＲ００７１６８の結合傾向も、それらの親Ｂ７－Ｈ４分子ＰＲ００６００８、ＰＲ００６００４の結合能力と一致していた。その中で、ＰＲ００７３５５及びＰＲ００７０７８はマウスＢ７－Ｈ４と交差反応性を有していた。

【0170】

【表5】

【0171】

実施例６．ＦＡＣＳによるＢ７－Ｈ４を内因的に発現する腫瘍細胞及びＴ細胞における、Ｂ７－Ｈ４×ＣＤ３二重特異性抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ結合の検出
Ｂ７－Ｈ４を内因的に発現する腫瘍細胞又はＣＤ３を発現する初代Ｔ細胞を使用して、細胞レベルでの抗体結合実験を実行した。２％のＢＳＡを含むＰＢＳでＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞又はヒトＴ細胞を再懸濁させた。細胞密度をそれぞれ１×１０^６細胞／ｍＬに調節した。９６ウェルＶボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３８９４）に１００μＬ細胞／ウェルで細胞を接種し、次に最終濃度の２倍で３倍濃度勾配希釈した試験抗体を１００μＬ／ウェルで加えた。細胞を４℃に置き、光を避けて２時間培養した。次に、２％のＢＳＡを含む予め冷却させたＰＢＳを１００μＬ／ウェルで加えて細胞を２回洗浄し、５００ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を捨てた。さらに１００μＬ／ウェルで蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ、Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ、Ｊａｃｋｓｏｎ、＃１０９－５４５－０９８、１：５００に希釈）を加え、４℃で、光を避けて６０分間培養した。２％のＢＳＡを含む予め冷却させたＰＢＳで１００μＬ／ウェルで細胞を２回洗浄し、５００ｇ、４℃で５分間遠心分離し、上清を捨てた。最後に、２％のＢＳＡを含む予め冷却させたＰＢＳで２００μＬ／ウェルで細胞を再懸濁させ、ＡＣＥＡ Ｎｏｖｏｃｙｔｅ３０００フローサイトメーターを使用して蛍光発光シグナル値を読み取った。

【0172】

結果は表６－１、表６－２、表６－３、図５のＡ～Ｆに示された通りである。その結果、これらの二重抗体分子はいずれもＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対して優れた結合能を示し、その中で、二重抗体分子ＰＲ００６４０７はＰＲ００６３９１よりもＭＤＡ－ＭＢ－４６８に強く結合し、その結果はＣＨＯ－Ｋ１／ｈｕ Ｂ７－Ｈ４の結合傾向と一致している。一方、ＰＲ００６８４０はより高い最大ＭＦＩを有していた。アミノ酸の突然変異により抗体のＴｍ値が増加した後、ＰＲ００７０７７、ＰＲ００７０７８、ＰＲ００７１６８は、それらの親で抗体あるＰＲ００６３９１、ＰＲ００６４０７、ＰＲ００６８４０と比較して、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対する結合能力は一致していた。一価Ｂ７－Ｈ４の二重抗体分子ＲＰ００７３５４及びＰＲ００７３５５と、二価Ｂ７－Ｈ４の二重抗体分子ＰＲ００７０７７及びＰＲ００７０７８との間の結合に有意差はなかった。ＰＲ００５８８５のＭＤＡ－ＭＢ－４６８に対する結合曲線はＰＲ００６３９１の結合曲線と類似していた。抗ＣＤ３末端に親和性の弱い抗ＣＤ３を使用しているため、これらの抗体はいずれもＴ細胞への結合が弱く、ＰＲ００７３５４は他の抗体に比べてＴ細胞への結合が増強されていた。

【0173】

【表6-1】

【0174】

【表6-2】

【0175】

【表6-3】

【0176】

実施例７．Ｔ細胞殺傷実験
本実験では、ヒト初代Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用し、Ｂ７－Ｈ４を高発現する細胞ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、Ｂ７－Ｈ４を低発現する細胞ＯＶＣＡＲ－３、Ｂ７－Ｈ４を極めて低発現する細胞ＤＬＤ－１、又は完全陰性細胞であるＭＤＡ－ＭＢ－２３１を標的細胞として使用した。ＡＣＥＡ社のＲＴＣＡ機器を使用して標的細胞の導電率を検出し、殺傷効率を反映した。９６ウェルプレートｅ－ｐｌａｔｅをまず５０μｌの完全培地で平衡化した。標的細胞を消化し、１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭ１６４０完全培地に再懸濁させ、４×１０^５／ｍＬに希釈し、ｅ－ｐｌａｔｅ ９６プレートに５０μｌ／ウェル、即ち２×１０^４／ウェルで広げ、３７℃で一晩培養した。翌日、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｔ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、＃１３０－０９６－５３５）を使用して、説明書の方法に従って初代Ｔ細胞を分離した。２×１０^５Ｔ細胞を含む新鮮な培地５０μｌを各ウェルに加え、次に４×濃度に勾配希釈した抗体５０μｌを加え、抗体の最高最終濃度は１０ｎＭであり、各抗体に合計８つの濃度であり、２つの重複を設定した。標的細胞の導電率をリアルタイムで検出し、一般に、２４時間時点のデータを使用して、標的細胞の殺傷効率＝（１－試料／空白対照）×１００％を計算した。２４時間後に上清を回収し、ＩＦＮ－γの濃度をＥＬＩＳＡ方法により検出した。ＥＬＩＳＡ検出方法は、ＩＦＮ ｇａｍｍａ Ｈｕｍａｎ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、＃８８－７３１６－７７）のキット操作説明書を参照した。

【0177】

結果は図６のＡ～Ｅ、図７のＡ～Ｄ、図８のＡ～Ｃに示された通りである。その結果、すべての二重抗体分子はＢ７－Ｈ４を発現する腫瘍細胞に対して有意な殺傷効果を有することが示された。その中で、同じＢ７－Ｈ４二価二重抗体分子ＰＲ００７０７７及びＰＲ００７０７８は、一価二重抗体分子ＰＲ００７３５４及びＰＲ００７３５５よりも有意に増強された殺傷効果を有していた。ＰＲ００６３９１と比較して、二重抗体分子ＰＲ００６４０７は、Ｂ７－Ｈ４を高発現するＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞又はＢ７－Ｈ４を中発現するＯＶＣＡＲ－３細胞において、より高い殺傷効果とより低いサイトカインＩＦＮ－ｇａｍｍａの発現を有していた。Ｂ７－Ｈ４を発現しないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において殺傷効果がなかった。同様に、アミノ酸の突然変異によりＴＭ値が増加した後の二重抗体分子ＰＲ００７０７８はＰＲ００７０７７と比較して、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８及びＯＶＣＡＲ－３細胞においてより高い殺傷効果とより低いサイトカインＩＦＮ－ｇａｍｍａの発現を有していた。Ｂ７－Ｈ４を極めて低発現するＤＬＤ－１細胞において殺傷効果がなかった。ＰＲ００６８４０二重抗体は、強い殺傷効果とサイトカイン分泌を同時に有していた。

【0178】

実施例８．非特異的サイトカインの誘導実験
本実験では、標的細胞の非存在下でＰＢＭＣによる非特異的サイトカインの産生を誘導する二重抗体分子の状態を検出するため、薬物の安全性を最初に判断することができる。１０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭ１６４０完全培地にヒトＰＢＭＣを再懸濁させ、２×１０^６／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５９９）に１００μｌ／ウェル、即ち２×１０^５／ウェルで広げ、２×抗体を１００ｕｌ加え、３７℃で一晩培養した。２４時間後に上清を回収し、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γの濃度をＥＬＩＳＡ方法により検出した。ＥＬＩＳＡ検出方法は、ＴＮＦ－α ｈｕｍａｎ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、＃８８－７３４６－８８）キット、ＩＬ－６ ｈｕｍａｎ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、＃８８－７０６６－８８）キット、ＩＦＮ ｇａｍｍａ Ｈｕｍａｎ Ｕｎｃｏａｔｅｄ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ、＃８８－７３１６－７７）キットの取扱説明書を参照した。

【0179】

結果は図９のＡとＢ、図１０のＡとＢ、図１１のＡとＢに示された通りである。その結果、二重抗体分子ＰＲ００７０７７、ＰＲ００７０７８、ＰＲ００７１６８によって誘導されたＩＬ－６及びＩＦＮ－γの発現は非常に低いが、ＴＮＦ－αは所定の発現があることが示された。異なるドナーの反応性は大きく異なっている。ＰＲ００５８８５は他の分子と比較してサイトカイン発現が最も低く、サイトカインストームのリスクが低い可能性が示唆された。

【0180】

実施例９．ヒトＰＢＭＣ免疫系を再構築したＮＣＧマウス腫瘍モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ薬効実験
ＯＶＣＡＲ－３モデルでは、細胞接種当日に、各ＮＣＧマウスに５×１０^６個のＯＶＣＡＲ３腫瘍細胞を皮下接種し、細胞をＰＢＳとマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（１：１）の混合溶液に再懸濁させ（０．１ｍＬ／マウス）、皮下接種した。マウスの平均腫瘍体積が１１０ｍｍ^３に達した時点で群に分け、１８匹のマウスを３群に分け、各マウスに５×１０^６個のヒトＰＢＭＣを静脈内接種し、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。翌日から投与を開始し、投与サイクルは週１回であり、合計３回静脈内投与した。投与を開始した後、体重及び腫瘍体積を週２回測定し、腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ^３）＝０．５×腫瘍長径×腫瘍短径^２である。実験観察は投与後２３日目に終了し、その後すべてのマウスを安楽死させた。

【0181】

結果は図１２Ａに示された通りである。溶媒対照群のマウスの平均腫瘍体積は、投与後２３日目で１６１２ｍｍ^３であった。試験薬ＰＲ００６３９１（０．２ｍｇ／ｋｇ）治療群の平均腫瘍体積は、投与後２３日目で１０５４ｍｍ^３であり、溶媒対照群と比較して有意差があり（ｐ値は０．０４である）、腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は３４．６％であった。試験薬ＰＲ００６４０７（０．２ｍｇ／ｋｇ）治療群の平均腫瘍体積は、投与後２３日目で７７０ｍｍ^３であり、溶媒対照群と比較して有意差があり（ｐ値は０．００１である）、腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は５２．２％であった。試験薬ＰＲ００５８８５（０．２ｍｇ／ｋｇ）治療群の平均腫瘍体積は、投与後２３日目で６８１ｍｍ^３であり、溶媒対照群と比較して有意差があり（ｐ値は０．００１である）、腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は５７．７７％であった。

【0182】

ＭＤＡ－ＭＢ－４６８モデルでは、細胞接種当日に、各ＮＣＧマウスに５×１０^６個のＭＤＡ－ＭＢ－４６８腫瘍細胞を皮下接種し、細胞をＰＢＳとマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（１：１）の混合溶液に再懸濁させ（０．１ｍＬ／マウス）、皮下接種した。マウスの平均腫瘍体積が１５０ｍｍ^３に達した時点で群に分け、４２匹のマウスを７群に分け、各マウスに５×１０^６個のヒトＰＢＭＣを静脈内接種し、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。翌日から投与を開始し、投与サイクルは週１回であり、合計４回静脈内投与した。投与を開始した後、体重及び腫瘍体積を週２回測定し、腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ^３）＝０．５×腫瘍長径×腫瘍短径^２である。実験観察は投与後２３日目に終了し、その後すべてのマウスを安楽死させた。

【0183】

結果は図１２Ｂに示された通りである。溶媒対照群のマウスの平均腫瘍体積は、投与後２３日目で８９３ｍｍ^３であった。試験薬ＰＲ００７０７７（０．１ｍｇ／ｋｇ）治療群の平均腫瘍体積は、投与後２３日目で５０７ｍｍ^３であり、溶媒対照群と比較して有意差があり（ｐ値は０．０１である）、腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は４３．１６％であった。試験薬ＰＲ００７０７７（０．５ｍｇ／ｋｇ）投与群の平均腫瘍体積は、投与後２３日目で３４３ｍｍ^３であり、溶媒対照群と比較して有意差があり（ｐ値は０．０００９である）、腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は６１．６％であった。試験薬ＰＲ００７０７８（０．１ｍｇ／ｋｇ）治療群の平均腫瘍体積は、投与後２３日目で４６４ｍｍ^３であり、溶媒対照群と比較して有意差があり（ｐ値は０．００６７である）、腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は４７．９％であった。試験薬ＰＲ００７０７８（０．５ｍｇ／ｋｇ）治療群の平均腫瘍体積は、投与後２３日目で３９０ｍｍ^３であり、溶媒対照群と比較して有意差があり（ｐ値は０．００２２である）、腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は５６．２％であった。試験薬ＰＲ００７１６８（０．１ｍｇ／ｋｇ）治療群の平均腫瘍体積は、投与後２３日目で４４６ｍｍ^３であり、溶媒対照群と比較して有意差があり（ｐ値は０．００９２である）、腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は５０．１％であった。試験薬ＰＲ００７１６８（０．５ｍｇ／ｋｇ）治療群の平均腫瘍体積は、投与後２３日目で２７５ｍｍ^３であり、溶媒対照群と比較して有意差があり（ｐ値は０．０００９である）、腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は６９．２％であった。

【0184】

ＣＴ２６－Ｂ７－Ｈ４モデルでは、細胞接種当日に、各ＢＡＬＢ／ｃ－ｈＣＤ３ＥＤＧノックインマウスに５×１０^５個のＣＴ２６－Ｂ７－Ｈ４腫瘍細胞を皮下接種し、細胞をＰＢＳに再懸濁させ（０．１ｍＬ／マウス）、皮下接種した。マウスの平均腫瘍体積が８４ｍｍ^３に達した時点で群に分け、２４匹のマウスを４群に分け、群分け当日から投与を開始し、投与サイクルは週１回であり、合計３回静脈内投与した。投与を開始した後、体重及び腫瘍体積を週２回測定し、腫瘍体積の計算式は、腫瘍体積（ｍｍ^３）＝０．５×腫瘍長径×腫瘍短径^２である。実験観察は投与後２０日目に終了し、その後すべてのマウスを安楽死させた。

【0185】

結果は１２Ｃに示された通りであり、溶媒対照群のマウスの平均腫瘍体積は、投与後２０日目で２０４３ｍｍ^３であった。試験薬ＰＲ００７０７７（０．５ｍｇ／ｋｇ）治療群の平均腫瘍体積は、投与後２０日目で１００７ｍｍ^３であり、溶媒対照群と比較して有意差があり（ｐ値は０．０２４である）、腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は５０．４％であった。試験薬ＰＲ００７０７８（０．５ｍｇ／ｋｇ）治療群の平均腫瘍体積は、投与後２０日目で１０６９ｍｍ^３であり、溶媒対照群と比較して有意差があり（ｐ値は０．０３１である）、腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は４５．５％であった。試験薬ＰＲ００７１６８（０．５ｍｇ／ｋｇ）治療群の平均腫瘍体積は、投与後２０日目で１１５５ｍｍ^３であり、溶媒対照群と比較して有意差があり（ｐ値は０．０５である）、腫瘍阻害率ＴＧＩ（％）は３９．９％であった。

【0186】

実施例１０．ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスにおける薬物動態
体重１８～２２ｇのメスＢＡＬＢ／ｃヌードマウス６匹を選択し、薬物を２．５ｍｇ／ｋｇの投与量で尾静脈注射により投与した。１群の３匹のマウスは投与前と投与後の５分、２４時間（１日）、４日目、１０日目に全血を採取し、もう１群の３匹のマウスは投与前と投与後の５時間、２日目、７日目、１４日目に全血を採取した。全血を３０分間静置して凝固させ、次に４℃、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、分離した血清試料を分析まで－８０℃で冷凍保存した。本実施例では、ＥＬＩＳＡ方法を使用してマウス血清中の薬物濃度を定量的に測定した。ＥＬＩＳＡ Ｆｃ末端全体検出方法は、９６ウェルプレートにコーティングされたヤギ抗ヒトＦｃポリクローナル抗体を使用して、マウス血清中のヒトＦｃ含有融合タンパク質を捕捉し、次にＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体を加えて実行された。ＥＬＩＳＡ Ｂ７－Ｈ４末端結合検出方法は、９６ウェルプレートにコーティングされた組換えヒトＢ７－Ｈ４タンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０７３８－Ｈ０８Ｈ）を使用して、マウス血清中のＢ７－Ｈ４×ＣＤ３二重抗体を捕捉し、次にＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体を加えて実行された。

【0187】

Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアバージョン８．２を使用し、ノンコンパートメントモデル（ＮＣＡ）を使用して血中薬物濃度データを分析し、薬物動態を評価し、結果は下記の表７に示された通りである。

【0188】

その結果、Ｆｃ末端全体検出方法で得られた最初の１４日間のデータから計算すると、マウスにおけるＰＲ００６４０７の半減期は約６日であり、マウスにおけるＰＲ００７０７８の半減期は約８日であることが示された。Ｂ７－Ｈ４末端結合検出方法で得られた最初の１４日間のデータから計算すると、マウスにおけるＰＲ００６４０７の半減期はわずか約１日であり、マウスにおけるＰＲ００７０７８の半減期は約１２日であった。これは、熱安定性修飾し、ジスルフィド結合を導入した抗体により、マウスにおける抗体の安定性を向上させることができることを示している。

【0189】

【表7】

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図7-1】

【図7-2】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-06-05

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ここで、
前記ＶＨは、下記の相補性決定領域（ＣＤＲ）又はその突然変異：配列番号５又は４のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ１、配列番号１５のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ２、及び、配列番号２５又は２４のアミノ酸配列に示されるＣＤＲ３を含み、
ここで、前記突然変異は、前記ＣＤＲのアミノ酸配列における３、２又は１個のアミノ酸の挿入、欠失又は置換であることを特徴とする、抗Ｂ７－Ｈ４抗体。

【請求項2】

前記ＣＤＲ２上の突然変異は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列にＧ２Ｐ、Ｓ４Ｇ、及びＳ５Ｒ／Ｄ／Ｅ／Ｔのうちの２又は１個のアミノ酸の置換を有するものであり、前記ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、好ましくは配列番号１１～１４、配列番号１６～１８のいずれか一つに示されることを特徴とし、
好ましくは、
前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５、１８及び２５に示され、或いは
前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５、１２、及び２５に示され、或いは
前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１１及び２４に示され、或いは
前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１７、及び２４に示され、或いは
前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１３、及び２４に示され、或いは
前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１４及び２４に示され、或いは
前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１５及び２４に示され、或いは
前記ＶＨに含まれるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４、１６及び２４に示されることを特徴とし、
より好ましくは、
前記ＶＨのフレームワーク領域はヒトＶＨのフレームワーク領域であり、
例えば、前記ヒトＶＨのフレームワーク領域は、アミノ酸配列が配列番号２に示されるＦＷＲ１、アミノ酸配列が配列番号７～９のいずれか一つに示されるＦＷＲ２、アミノ酸配列が配列番号２０～２２のいずれか一つに示されるＦＷＲ３、及びアミノ酸配列が配列番号２６又は２７に示されるＦＷＲ４を含み、
例えば、前記ＶＨは、配列番号３６～４５のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とし、
さらに好ましくは、
前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、例えばｓｃＦｖ、二重特異性抗体、多重特異性抗体、重鎖抗体又は単一ドメイン抗体であり、例えば、前記抗Ｂ７－Ｈ４抗体が重鎖抗体である場合、前記重鎖抗体は、配列番号４８～５７のいずれか一つに示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体。

【請求項3】

Ｂ７－Ｈ４を標的とするタンパク質機能領域Ｂ、及び非Ｂ７－Ｈ４を標的とするタンパク質機能領域Ａを含み、
ａ）前記タンパク質機能領域Ｂは、請求項１に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体から選択され、
好ましくは、構造が、式：Ｎ’－ＶＬ＿Ａ－ＣＬ－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖１、式：Ｎ’－ＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖２、式：Ｎ’－ＶＨ＿Ｂ１－リンカー－ＶＨ＿Ｂ２－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ’、又は式：Ｎ’－ＶＨ＿Ｂ－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖３を含み、ここで、前記ＶＬ＿Ａ及びＶＨ＿Ａは、それぞれ前記タンパク質機能領域ＡのＶＬ及びＶＨであり、前記ＶＨ＿Ｂ１及びＶＨ＿Ｂ２は、前記タンパク質機能領域ＢのＶＨであり、且つＶＨ＿Ｂ１及びＶＨ＿Ｂ２は、同じであっても異なってもよい、又は、
ｂ）前記タンパク質機能領域Ｂは、配列番号７２に示されるＨＣＤＲ１、配列番号７４に示されるＨＣＤＲ２、配列番号７６に示されるＨＣＤＲ３、配列番号７８に示されるＬＣＤＲ１、配列番号８０に示されるＬＣＤＲ２、配列番号８２に示されるＬＣＤＲ３を含み、
好ましくは、構造が、式：Ｎ’－ＶＬ＿Ａ－ＣＬ－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖１、式：Ｎ’－ＶＨ＿Ａ－ＣＨ１－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖２、式：Ｎ’－ＶＬ＿Ｂ－リンカー－ＶＨ＿Ｂ－ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３－Ｃ’に示されるポリペプチド鎖３を含み、ここで、前記ＶＬ＿Ａ及びＶＨ＿Ａは、それぞれ前記タンパク質機能領域ＡのＶＬ及びＶＨであり、前記ＶＬ＿Ｂ及びＶＨ＿Ｂは、前記タンパク質機能領域ＢのＶＬ及びＶＨである、
から選択されることを特徴とし、
より好ましくは、
前記タンパク質機能領域Ａは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗ＣＤ３抗体であり、前記ＶＨは、アミノ酸配列が配列番号３に示されるＶＨ ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号１０に示されるＶＨ ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列が配列番号２３に示されるＶＨ ＣＤＲ３を含み、前記ＶＬは、アミノ酸配列が配列番号２９に示されるＶＬ ＣＤＲ１、アミノ酸配列が配列番号３１に示されるＶＬ ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列が配列番号３３に示されるＶＬ ＣＤＲ３を含み、
例えば、前記抗ＣＤ３抗体は、アミノ酸配列が配列番号３５に示されるＶＨ、及びアミノ酸配列が配列番号４６に示されるＶＬを含み、
例えば、前記抗ＣＤ３抗体は、アミノ酸配列が配列番号４７に示される重鎖、及びアミノ酸配列が配列番号５８に示される軽鎖を含むことを特徴とし、
さらに好ましくは、
前記二重特異性抗体は、
アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６４に示されるポリペプチド鎖３、
或いは、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６０に示されるポリペプチド鎖３、
或いは、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６１に示されるポリペプチド鎖３、
或いは、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６２に示されるポリペプチド鎖３、
或いは、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６３に示されるポリペプチド鎖３、
或いは、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６５に示されるポリペプチド鎖３、
或いは、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号６９に示されるポリペプチド鎖３、
或いは、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号７０に示されるポリペプチド鎖３を含み、
或いは、前記二重特異性抗体は、アミノ酸配列が配列番号５８に示されるポリペプチド鎖１、アミノ酸配列が配列番号５９に示されるポリペプチド鎖２、アミノ酸配列が配列番号８６に示されるポリペプチド鎖３を含むことを特徴とする、二重特異性抗体。

【請求項4】

請求項１又は２に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、又は請求項３に記載の二重特異性抗体をコードする単離された核酸。

【請求項5】

請求項４に記載の単離された核酸を含み、
好ましくは、真核細胞発現ベクター及び／又は原核細胞発現ベクターを含む、組換え発現ベクター。

【請求項6】

請求項５に記載の組換え発現ベクターを含む形質転換体であって、
好ましくは、前記形質転換体の宿主細胞は、原核細胞及び／又は真核細胞であり、前記原核細胞は、好ましくはＴＧ１、ＢＬ２１細胞などの大腸菌細胞であり、前記真核細胞は、好ましくはＨＥＫ２９３細胞又はＣＨＯ細胞である、形質転換体。

【請求項7】

請求項１又は２に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、又は請求項３に記載の二重特異性抗体を含む、キメラ抗原受容体。

【請求項8】

請求項７に記載のキメラ抗原受容体を含み、
好ましくは、真核細胞であり、好ましくは単離されたヒト細胞であり、より好ましくはＴ細胞、又はＮＫ細胞などの免疫細胞であることを特徴とする、遺伝子改変細胞。

【請求項9】

請求項６に記載の形質転換体を培養し、培養物から抗Ｂ７－Ｈ４抗体又は二重特異性抗体を得るステップを含む、抗Ｂ７－Ｈ４抗体又は二重特異性抗体の調製方法。

【請求項10】

抗体部分及び複合体部分を含み、前記抗体部分は、請求項１又は２に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体又は請求項３に記載の二重特異性抗体を含み、前記複合体部分は、検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、又はそれらの組み合わせを含み、前記抗体部分と前記複合体部分とが、化学結合又はリンカーを介して結合する、抗体薬物複合体。

【請求項11】

請求項１又は２に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、請求項３に記載の二重特異性抗体、キメラ抗原受容体、遺伝子改変細胞及び／又は抗体薬物複合体を含み、
ここで、前記キメラ抗原受容体は、請求項１又は２に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、請求項３に記載の二重特異性抗体を含み、
前記遺伝子改変細胞は、前記キメラ抗原受容体を含み、
前記抗体薬物複合体は、抗体部分及び複合体部分を含み、前記抗体部分は、請求項１又は２に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体又は請求項３に記載の二重特異性抗体を含み、前記複合体部分は、検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、又はそれらの組み合わせを含み、前記抗体部分と前記複合体部分とが、化学結合又はリンカーを介して結合する、
好ましくは、液体剤形、気体剤形、固体剤形及び半固体剤形であり、及び／又は、経口、注射、経鼻、経皮又は粘膜投与することができ、
さらに好ましくは、化学治療剤、放射線治療剤、免疫阻害剤及び／又は細胞傷害性薬物を含む併用治療剤をさらに含む、医薬組成物。

【請求項12】

がんを治療及び／又は予防おける使用のための、請求項１又は２に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、請求項３に記載の二重特異性抗体、キメラ抗原受容体、遺伝子改変細胞、抗体薬物複合体及び／又は医薬組成物であって、
ここで、前記キメラ抗原受容体は、請求項１又は２に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、請求項３に記載の二重特異性抗体を含み、
前記遺伝子改変細胞は、前記キメラ抗原受容体を含み、
前記抗体薬物複合体は、抗体部分及び複合体部分を含み、前記抗体部分は、請求項１又は２に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体又は請求項３に記載の二重特異性抗体を含み、前記複合体部分は、検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、又はそれらの組み合わせを含み、前記抗体部分と前記複合体部分とが、化学結合又はリンカーを介して結合する、
前記医薬組成物は、請求項１又は２に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、請求項３に記載の二重特異性抗体、キメラ抗原受容体、遺伝子改変細胞及び／又は抗体薬物複合体を含み
好ましくは、前記がんは、肺がん、トリプルネガティブ乳がんなどの乳がん、卵巣がん、子宮内膜腫、胃がん、小腸がん、結腸がん、直腸がん、膵臓がん、腎臓がん、膀胱がん、前立腺がん、胆管がん、食道がん及び骨肉腫からなる群より選択される。

【請求項13】

請求項１又は２に記載の抗体、請求項３に記載の二重特異性抗体、キメラ抗原受容体、遺伝子改変細胞、抗体薬物複合体及び／又は医薬組成物、並びに任意選択の説明書を含む、キットであって、
ここで、前記キメラ抗原受容体は、請求項１又は２に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、請求項３に記載の二重特異性抗体を含み、
前記遺伝子改変細胞は、前記キメラ抗原受容体を含み、
前記抗体薬物複合体は、抗体部分及び複合体部分を含み、前記抗体部分は、請求項１又は２に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体又は請求項３に記載の二重特異性抗体を含み、前記複合体部分は、検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、又はそれらの組み合わせを含み、前記抗体部分と前記複合体部分とが、化学結合又はリンカーを介して結合する、
前記医薬組成物は、請求項１又は２に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体、請求項３に記載の二重特異性抗体、キメラ抗原受容体、遺伝子改変細胞及び／又は抗体薬物複合体を含む、キット。

【請求項14】

（１）請求項１１に記載の医薬組成物をそれを必要とする対象に投与するための注入モジュール、及び（２）任意選択の薬効モニタリングモジュールを含むことを特徴とする、薬物送達システム。

【請求項15】

請求項１又は２に記載の抗Ｂ７－Ｈ４抗体及び／又は請求項３に記載の二重特異性抗体を使用して検出するステップを含み、非診断及び／又は治療目的であることを特徴とする、Ｂ７－Ｈ４を検出する方法。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0038】

ある好ましい実施形態において、前記タンパク質機能領域Ａは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、その軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。前記タンパク質機能領域Ｂは、重鎖可変領域を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記タンパク質機能領域Ａは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、その軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。前記タンパク質機能領域Ｂは、重鎖可変領域を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記タンパク質機能領域Ａは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、その軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。前記タンパク質機能領域Ｂは、第１の重鎖可変領域及び第２の重鎖可変領域を含み、前記第１の重鎖可変領域ＶＨは、配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含み、前記第２の重鎖可変領域ＶＨは、配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含む。ある好ましい実施形態において、前記タンパク質機能領域Ａは、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、その軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含み、その重鎖可変領域ＶＨは、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含む。前記タンパク質機能領域Ｂは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域ＶＨは、配列番号８４に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域ＶＬは、配列番号８５に示されるアミノ酸配列を含む。

【国際調査報告】