特表 2024-534825 条件付きリガンド交換により産生されたペプチドＭＨＣ複合体を使用する免疫細胞の選択

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-26

(54)【発明の名称】条件付きリガンド交換により産生されたペプチドＭＨＣ複合体を使用する免疫細胞の選択

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240918BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240918BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240918BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 5/10 20060101ALN20240918BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240918BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 Z ZNA

C12Q1/02

C12N5/0783

C12P21/02 C

C12N15/85 Z

A61K35/17

A61K48/00

A61P37/02

A61P35/00

A61P31/12

C12N5/10

C12N15/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024511981

(86)(22)【出願日】2022-08-24

(85)【翻訳文提出日】2024-04-18

(86)【国際出願番号】 EP2022073595

(87)【国際公開番号】W WO2023025851

(87)【国際公開日】2023-03-02

(31)【優先権主張番号】21192884.1

(32)【優先日】2021-08-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(31)【優先権主張番号】63/236,558

(32)【優先日】2021-08-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520184664

【氏名又は名称】イマティクス ユーエス，アイエヌシー．

(71)【出願人】

【識別番号】506258073

【氏名又は名称】イマティクス バイオテクノロジーズ ゲーエムベーハー

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】シュパルト，シュテファニー

(72)【発明者】

【氏名】ヴァーグナー，クラウディア

(72)【発明者】

【氏名】マウラー，ドミニク

(72)【発明者】

【氏名】シュスター，ハイコ

(72)【発明者】

【氏名】ヴァルター，シュテッフェン

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B063QA18

4B063QQ08

4B063QQ13

4B063QR48

4B063QR55

4B063QS33

4B063QX02

4B064AG01

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA13

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA46

4C084AA13

4C084NA13

4C084ZB07

4C084ZB26

4C084ZB33

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB63

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB07

4C087ZB26

4C087ZB33

(57)【要約】

本発明は、ペプチドＡ(ＰＡ)と主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)分子の複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質を表面に発現する免疫細胞を選択する方法であって、(ｉ)異なる抗原結合タンパク質を発現する複数の免疫細胞を提供し；(ii)複数の免疫細胞とＭＨＣ分子１(Ｍ１)とペプチドＡ(ＰＡ)を含む複合体１ＡおよびＭ１とペプチドＢ(ＰＢ)を含む複合体１Ｘを含む第一組成物を接触させ；(iii)複数の免疫細胞とＭＨＣ分子２(Ｍ２)とＰＡを含む複合体２ＡおよびＭ２とペプチドＣ(ＰＣ)を含む複合体２Ｘを含む第二組成物を接触させ；(iv)複合体１Ａに特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現する細胞を複数の免疫細胞から選択する
工程を含み、ここで、複合体１Ａおよび２Ａではなく、複合体１Ｘおよび２Ｘが規定の化学的または物理的刺激での刺激により解離させ；そして、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列が少なくとも１個のアミノ酸が異なるものである、方法に関する。本発明は、さらに、本発明の何れかの方法により選択された免疫細胞、該免疫細胞を使用する処置方法、抗原結合タンパク質を表面に発現する細胞を選択するためのキットおよび本発明の方法における使用に適するペプチドに関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ペプチドＡ(ＰＡ)と主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)分子の複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質を表面に発現する免疫細胞を選択する方法であって、次の：
(ｉ)種々の抗原結合タンパク質を発現する複数の免疫細胞を提供し；
(ii)複数の免疫細胞と
(ａ)ＭＨＣ分子１(Ｍ１)およびペプチドＡ(ＰＡ)を含む複合体１Ａおよび
(ｂ)Ｍ１とペプチドＢ(ＰＢ)を含む複合体１Ｘ
を含む第一組成物を接触させ；
(iii)複数の免疫細胞と
(ａ)ＭＨＣ分子２(Ｍ２)およびＰＡを含む複合体２Ａおよび
(ｂ)Ｍ２とペプチドＣ(ＰＣ)を含む複合体２Ｘ
を含む第二組成物を接触させ；
(iv)複数の免疫細胞から複合体１Ａ；特に複合体１Ａおよび複合体２Ａ両方に特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現する免疫細胞を選択する
工程を含み；ここで、複合体１Ａおよび２Ａではなく、複合体１Ｘおよび２Ｘが規定の刺激、好ましくは規定の化学的および／または物理的刺激での刺激により解離し；そして
ここで、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列が少なくとも１個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５個、６個、７個または８個のアミノ酸が異なるものである、方法。

【請求項2】

第一組成物が
(ｉ)複合体１Ｘ(Ｍ１およびＰＢを含む)を提供し
(ii)ＰＡを提供し、そして
(iii)既定の刺激を提供し、それにより
－ ＰＢのＭ１からの解離および
－ ＰＡのＭ１への結合
を生じさせ、複合体１Ａの形成をもたらすことにより得て；好ましくはここで主に複合体１Ａおよび残存量の複合体１Ｘを含む組成物を得る；および／または
第二組成物を
(ｉ)複合体２Ｘ(Ｍ２およびＰＣを含む)を提供し
(ii)ＰＡを提供し、そして
(iii)既定の刺激を提供し、それにより
－ ＰＣからのＭ２の解離および
－ ＰＡのＭ２への結合
を生じさせて、複合体２Ａの形成をもたらすことにより得て；
好ましくはここで主に複合体２Ａおよび残存量の複合体２Ｘを含む組成物を得る、
請求項１の方法。

【請求項3】

ＰＢおよびＰＣが、既定の刺激により活性化されたとき、それぞれＰＢまたはＰＣのペプチド主鎖内の共有結合を切断させる条件付きで反応性の基を含み、
ここで、ＰＢおよびＰＣに含まれる条件付きで反応性の基が同一でも異なってもよい、好ましくは同一である、かつ
好ましくは、条件付きで反応性の基が光活性化可能基、亜ジチオン酸活性化可能基または過ヨウ素酸活性化可能基、好ましくは光活性化可能基を含む、より好ましくは光活性化可能基が３－アミノ－３－(２－ニトロ)フェニル－プロピオン酸またはその光活性化可能構造的等価物を含む、
請求項１～２の何れかの方法。

【請求項4】

Ｍ１および／またはＭ２、好ましくはＭ１およびＭ２がＭＨＣ－Ｉ分子である、好ましくは同じアレルのＭＨＣ－Ｉ分子または同じアレルのＭＨＣ誘導体または抗原ペプチド結合フラグメントである、請求項１～３の何れかの方法。

【請求項5】

免疫細胞がＴ細胞、より好ましくはＣＤ８Ｔ細胞であるおよび／または抗原結合タンパク質がＴ細胞受容体(ＴＣＲ)である、請求項１～４の何れかの方法。

【請求項6】

工程ii)が
(ｉ)さらに複数の細胞と共刺激分子、好ましくは抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１３７および／または抗ＣＤ１３４に対する抗体、より好ましくは抗ＣＤ２８および／または抗ＣＤ３との接触を含む；
(ii)さらに複数の細胞とＩＬ－２および／またはＩＬ－１２の接触を含む；および／または
(iii)少なくとも３日、好ましくは少なくとも７日、より好ましくは少なくとも１０日実施される；および／または
工程iv)が、検出、特徴づけおよび単離の少なくとも１個および所望により単細胞または細胞集団の培養を含む、
請求項１～５の何れかの方法。

【請求項7】

ＰＡが好ましくはウイルス抗原ペプチド、細菌抗原ペプチドおよび腫瘍関連抗原ペプチド(ＴＡＡ)から選択される抗原ペプチドである、より好ましくはＰＡがＴＡＡである、請求項１～６の何れかの方法。

【請求項8】

配列番号１～１９、２１～３８および４０～６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ここで、配列番号１～配列番号６６において、Ｘが条件付きで反応性の基、好ましくは条件付きで反応性のアミノ酸アナログを表す、条件付きペプチド。

【請求項9】

条件付きペプチドが、該ペプチドが提示されるＭＨＣアレルを発現する個体で高頻度で提示される親ペプチド由来である、好ましくは件付きペプチドが配列番号１～１８、２１～３８、４０～５６および５８～６６からなる群から選択される、より好ましくは配列番号３～１８、２１～３８、４０～４８、５１～５６および５９～６６からなる群から選択される、請求項８の条件付きペプチド。

【請求項10】

請求項１～７の何れかの方法により選択された免疫細胞。

【請求項11】

ｐＭＨＣ複合体１Ａに特異的に結合する抗原結合タンパク質をコードする核酸の配列を決定する方法であって：
(ｉ)請求項１～７の何れかの方法で選択した免疫細胞から抗原結合タンパク質をコードする核酸を単離し；そして
(ii)核酸配列を決定する
工程を含む、方法。

【請求項12】

抗原結合タンパク質を発現する宿主細胞を産生する方法であって：
(ｉ)宿主細胞を準備し；
(ii) 請求項１～７の何れかの方法で選択した免疫細胞から抗原結合タンパク質をコードする核酸を単離し；
(iii)工程(ii)で単離した核酸または抗原結合タンパク質もしくはその抗原結合フラグメントをコードする該核酸の一部を含む遺伝子構築物を産生し；そして
(iv)該宿主細胞に該遺伝子構築物を導入する
工程を含む、方法。

【請求項13】

抗原結合タンパク質を産生する方法であって、請求項１２の方法により産生した宿主細胞を提供し、該宿主細胞に導入した遺伝子構築物を発現させることを含む、方法。

【請求項14】

ｐＭＨＣ複合体の製造のための、請求項８または９のペプチドの使用。

【請求項15】

好ましくは表面にペプチドとＭＨＣ分子の複合体と特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現する細胞を選択するための、キットであって：
ａ)ペプチドＢ(ＰＢ)とＭＨＣ分子１(Ｍ１)を含む複合体１Ｘ；およびペプチドＣ(ＰＣ)とＭＨＣ分子２(Ｍ２)を含む複合体２Ｘ；または
ｂ) ペプチド(ＰＢ)およびペプチド(ＰＣ)および所望によりＰＢおよびＰＣが結合し、それにより複合体１Ｘおよび２Ｘを各々形成するＭＨＣ分子、特にＭ１および／またはＭ２；および
ｃ)所望によりβ２－ミクログロブリン
を含み；ここで、複合体１Ｘおよび２Ｘが規定の化学的および／または物理的刺激での刺激により解離し；そして、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列が少なくとも１個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個のアミノ酸が異なる、ペプチドＡ(ＰＡ)およびＭ１またはＭ２を含む複合体１Ａに特異的に結合する抗原結合タンパク質の選択のためである、キット。

【請求項16】

請求項１～７の何れかの方法により選択された免疫細胞、請求項１２の方法により産生された宿主細胞および／または請求項１４の抗原結合タンパク質、核酸および／またはベクターを含む、医薬組成物。

【請求項17】

医薬に使用するための、好ましくは新生物疾患の処置または予防の方法に使用するための、請求項１～７の何れかの方法により選択された免疫細胞、請求項１２の方法により産生された宿主細胞および／または請求項１４の抗原結合タンパク質、核酸および／またはベクター。

【請求項18】

請求項１３の方法により産生された抗原結合タンパク質、該抗原結合タンパク質をコードする核酸または該核酸を含むベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ペプチドとＭＨＣ分子の複合体(ｐＭＨＣ複合体)に特異的に結合する抗原結合タンパク質を表面に発現する免疫細胞を選択する方法であって、免疫細胞と、異なる条件付きリガンドを含むｐＭＨＣ複合体から条件付きリガンド交換により産生された第一および第二ｐＭＨＣ複合体の連続的な(subsequent)接触を含む、方法に関する。本発明は、さらに、本発明の方法により選択された免疫細胞、該免疫細胞を使用する処置方法、抗原結合タンパク質を表面に発現する細胞を選択するためのキットおよび本発明の方法において使用するのに適する条件付きペプチドに関する。

【背景技術】

【0002】

Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)ベースの免疫療法は、癌、ウイルス感染症および他の免疫変調疾患の処置のための最も有望かつ画期的アプローチの一つとなってきている。ＴＣＲベースの治療の開発および実施化における多くの鍵となる工程は、ペプチド－ＭＨＣ(ｐＭＨＣ)複合体の産生を必要とする。ＭＨＣ分子はペプチドリガンド非存在下では不安定であり、これが、各個々のｐＭＨＣ複合体の産生が、ハイスループット適用に不適合である時間のかかるインビトロ再折りたたみおよび精製を必要とする理由である。最近、規定の刺激への暴露により分解する、ＭＨＣ分子のための条件付きペプチドリガンドが開発された。目的のペプチドの付加により、条件付きリガンドは置き換えられ得る。この条件付きリガンド交換は、Ｔ細胞同定および特徴づけの分野における種々の応用のための多数の異なるｐＭＨＣ複合体の迅速かつ容易な産生を可能とする。

【0003】

本発明は、配列番号１～１９、２１～３８および４０～６６からなる群から選択される配列を有する、弱い免疫原性の条件付きペプチドを提供する。これらの条件付きペプチドは、とりわけ次の利点の１以上を提供する：(ｉ)低免疫原性により条件付きペプチド：ＭＨＣ複合体に特異的な免疫細胞の刺激／増殖の非存在または低減、(ii)条件付きペプチドとＭＨＣ分子の間の強い結合、(iii)条件付きペプチド：ＭＨＣ複合体の高再折りたたみ収率、(iv)既定の刺激の非存在下で安定な条件付きペプチド：ＭＨＣ複合体、(ｖ)条件付きペプチド：ＭＨＣ複合体の低凝集率、(vi)条件付きペプチド：ＭＨＣ複合体の低分解率および(vii)既定の刺激によるＭＨＣ分子からのペプチドの高解離率。

【0004】

さらに、本発明は、条件付きリガンド交換を使用する、抗原結合タンパク質を発現する免疫細胞の選択のための画期的アプローチを提供する。このアプローチの提供により、本発明者らは、先行技術のいくつかの課題を克服した。本発明の免疫細胞を選択する方法は、条件付きリガンド交換により産生されたｐＭＨＣ複合体の使用を可能とし、ここで、偽陽性免疫細胞を選択するリスクは顕著に低減するかまたは排除される。故に、本方法は、とりわけ次の利点の１以上を提供する：本方法は(ｉ)安価、(ii)速い、(iii)簡単、(iv)ハイスループット適用に適するおよび(ｖ)より正確である。

【発明の概要】

【0005】

本発明の第一の態様は、ペプチドＡ(ＰＡ)と主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)分子の複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質を表面に発現する免疫細胞を選択する方法であって、次の：
(ｉ)種々の抗原結合タンパク質を発現する複数の免疫細胞を提供し；
(ii)複数の免疫細胞と
(ａ)ＭＨＣ分子１(Ｍ１)とペプチドＡ(ＰＡ)を含む複合体１Ａおよび
(ｂ)Ｍ１とペプチドＢ(ＰＢ)を含む複合体１Ｘ
を含む第一組成物を接触させ；
(iii)複数の免疫細胞と
(ａ)ＭＨＣ分子２(Ｍ２)とＰＡを含む複合体２Ａおよび
(ｂ)Ｍ２とペプチドＣ(ＰＣ)を含む複合体２Ｘ
を含む第二組成物を接触させ；
(iv)複合体１Ａに特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現する細胞を複数の免疫細胞から選択する
工程を含み；ここで、複合体１Ａおよび２Ａではなく、複合体１Ｘおよび２Ｘが規定の刺激での刺激により解離し；そして、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列は少なくとも１個のアミノ酸が異なるものである、
方法に関する。

【0006】

本発明の第二態様は、配列番号１～１９、２１～３８および４０～６６の何れかのアミノ酸配列を有する条件付きペプチドに関し、ここで、各配列において、Ｘは条件付きで反応性の基を表す。

【0007】

本発明の第三の態様は、本発明の第一の態様の方法により選択された免疫細胞に関する。

【0008】

本発明の第四の態様は、ｐＭＨＣ複合体１Ａに特異的に結合する抗原結合タンパク質をコードする核酸の配列を決定する方法であって：
(ｉ)本発明の第一の態様の方法で選択した免疫細胞から抗原結合タンパク質をコードする核酸を単離し；そして
(ii)核酸の配列を決定する
工程を含む、方法に関する。

【0009】

本発明の第五の態様は、抗原結合タンパク質を発現する宿主細胞を産生する方法であって：
(ｉ)宿主細胞を準備し；
(ii)本発明の第一の態様の方法で選択した免疫細胞から抗原結合タンパク質をコードする核酸を単離し；
(iii)工程(ii)で単離した核酸または抗原結合タンパク質もしくはその抗原結合フラグメントをコードする該核酸の一部を含む遺伝子構築物を産生し；そして
(iv)該宿主細胞に該遺伝子構築物を導入する
工程を含む、方法に関する。

【0010】

本発明の第六の態様は、本発明の第五の態様の方法により産生された宿主細胞を提供し、該宿主細胞に導入された遺伝子構築物を発現することを含む、抗原結合タンパク質を産生する方法に関する。

【0011】

本発明の第七の態様は、本発明の第六の態様の方法により産生された抗原結合タンパク質に関する。

【0012】

本発明の第八の態様は、本発明の第七の態様の抗原結合タンパク質をコードする核酸または該核酸を含むベクターに関する。

【0013】

本発明の第九の態様は、下に定義するキットに関する。具体的態様において、キットは、表面にペプチドとＭＨＣ分子の複合体と特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現する細胞を選択するためである。該キットは：
ａ)ペプチドＢ(ＰＢ)とＭＨＣ分子１(Ｍ１)を含む複合体１Ｘ；およびペプチドＣ(ＰＣ)とＭＨＣ分子２(Ｍ２)を含む複合体２Ｘ；または
ｂ)ペプチド(ＰＢ)およびペプチド(ＰＣ)ならびに所望によりＰＢおよびＰＣが結合し、それにより複合体１Ｘおよび２Ｘを各々形成するＭＨＣ分子、特にＭ１および／またはＭ２；および
ｃ)所望によりβ２－ミクログロブリン(β２Ｍ)
を含み；ここで、複合体１Ｘおよび２Ｘは、規定の刺激での刺激により解離し；そして、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列は少なくとも１個のアミノ酸が異なるものである。

【0014】

本発明の第十の態様は、本発明の第一の態様の方法により選択された免疫細胞、本発明の第五の態様の方法により産生された宿主細胞、本発明の第七の態様の抗原結合タンパク質および／または本発明の第八の態様の核酸またはベクターを含む、医薬組成物に関する。

【0015】

本発明の第十一の態様は、医薬において使用するための、本発明の第一の態様の方法により選択された免疫細胞、本発明の第五の態様の方法により産生された宿主細胞、本発明の第七の態様の抗原結合タンパク質および／または本発明の第八の態様の核酸またはベクターに関する。

【0016】

本発明の第十二の態様は、新生物疾患を診断、処置または予防する方法において使用するための、本発明の第一の態様の方法により選択された免疫細胞、本発明の第五の態様の方法により産生された宿主細胞、本発明の第七の態様の抗原結合タンパク質および／または本発明の第八の態様の核酸またはベクターに関する。

【0017】

本発明の第十三の態様は、ｐＭＨＣ複合体の産生のための、本発明の第二の態様のペプチドの使用に関する。

【図面の簡単な説明】

【0018】

【図1】例示的プロセス概要を示す。Ｔ細胞を血液製剤から単離する(１)。例えば、ＵＶ介在ペプチド交換(２)により産生された標的特異的ｐＨＬＡ分子と、例えば、抗ＣＤ２８抗体を共に使用して、例えば、人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)(３)を産生する。例えば、可溶性サイトカイン存在下のＴ細胞とａＡＰＣのインキュベーションは、抗原ペプチド特異的刺激、故に増殖をもたらす(４)。色素結合多量体を産生するためのｐＨＬＡ(５)は、例えば、異なる条件付きリガンドを使用する第二ＵＶ交換反応(６)により産生される。標的特異的Ｔ細胞はｐＨＬＡ多量体染色(７)を介して検出および／または単離される。

【0019】

【図2】ＵＶ介在ペプチド交換後に産生されるタンパク質を示す。レスキューペプチド存在下(灰色)またはレスキューペプチド非存在下(黒色)に条件付きｐＨＬＡのＵＶ暴露後にβ２ｍ ＥＬＩＳＡにより測定したタンパク質収率の例示的結果を示す。条件付きｐＨＬＡは、A*03_HNRNPR-002、B*07_MUDENG-002およびA*02_DDX5-005であった。レスキューペプチドは、それぞれHADV-014(A*03)、HIV-007(B*07)およびMLA-001(A*02)であった。Ｎ＝４実験の平均値を示す。タンパク質収率は、適用タンパク質濃度の％として示す。データから、ＥＣ単量体がＵＶ交換を介して産生されたとき、ＵＶペプチドは常にレスキューペプチドと完全に交換されるわけではなく、低濃縮ＵＶ単量体の残存量に至ることが示唆される。

【0020】

【図3】条件付きリガンドに対する健常HLA-A*02＋ドナーの特異的インビトロＣＤ８＋ Ｔ細胞応答の例示的結果を示す。ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、抗ＣＤ２８ ｍＡｂおよびFLUM-003のMLA-001によるＵＶ介在リガンド交換により産生したHLA-A*02_FLUM-003×MLA-001で被覆した人工ＡＰＣを使用して、プライミングした。３サイクルの刺激後、ペプチド反応性細胞の検出を、交換ｐＨＬＡ分子(Ａ)または標準再折り畳みｐＨＬＡ分子(Ｂ)を使用する２Ｄ多量体染色または１Ｄ染色(ＣおよびＤ)により実施した。生存可能単細胞を、ＣＤ８＋リンパ球についてゲーティングした。ＣＤ８＋リンパ球中の特異的多量体＋細胞の頻度を示す。これらのデータは、低量の残存ＵＶ単量体であっても、多量体染色により条件付きリガンドに特異的な細胞を検出するのに十分であることを示す。

【0021】

【図4】条件付きペプチドリガンドおよびその親ペプチドを認識する高度に特異的なＴ細胞集団の存在を示す。ＨＬＡ適合健常個体のＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ２８ ｍＡｂおよびｐＨＬＡ分子で被覆した人工ＡＰＣを使用してプライミングした。３サイクルの刺激後、ペプチド反応性細胞の検出を、標準再折り畳みｐＨＬＡ分子を使用する多量体染色により実施した。条件あたり１２ウェルを試験した。刺激および読み出しを、それぞれ同じペプチドまたは関連親ペプチドまたは条件付きペプチド(斜体)との組み合わせとして実施した。グラフＡはHLA-A*03に結合する示されるペプチドを含む分子の結果を示し、グラフＢはHLA-B*07に結合する示されるペプチドを含む分子の結果を示す。

【0022】

【図5】ＵＶペプチド反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞の多量体染色を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ２８ｍＡｂおよびHLA-B*07_MUDENG-002(Ａ)またはHLA-A*03_HNRNPR-002×HADV-14で被覆した人工ＡＰＣを使用してプライミングした。３サイクルの刺激後、ペプチド反応性細胞の検出を、標準再折り畳みｐＨＬＡ分子を使用する多量体染色により実施した(ＡおよびＢ)。生存可能単細胞を、ＣＤ８＋リンパ球についてゲーティングした。ＣＤ８＋リンパ球中の特異的多量体＋細胞の頻度を示す。いずれの場合も、それぞれＣＤ８＋細胞の２.４％または６.７％のＵＶペプチド特異的Ｔ細胞集団が多量体染色により検出でき、ヒト源タンパク質由来のＵＶペプチドも、低濃度でも、特異的Ｔ細胞集団を刺激および増殖できることを示す。

【0023】

【図6】偽陽性Ｔ細胞集団の検出を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ２８ ｍＡｂおよびFLUM-003のCMV-001によるＵＶ介在リガンド交換により産生したHLA-A*02_FLUM-003×CMV-001で被覆した人工ＡＰＣを使用して、プライミングした。３サイクルの刺激後、細胞を、３つの並行読み出し条件により分析した。ペプチド反応性細胞の検出を、標準再折り畳みｐＨＬＡ分子(プレートＡ)、FLUM-003のCMV-001またはMLA-001によるＵＶ介在リガンド交換により産生したｐＨＬＡ分子(プレートＢ)またはRPL19-005のCMV-001またはMLA-001によるＵＶ介在リガンド交換により産生したｐＨＬＡ分子(プレートＣ)を使用する２Ｄ多量体染色により実施した。生存可能単細胞を、ＣＤ８＋リンパ球についてゲーティングした。ＣＤ８＋リンパ球中の特異的多量体＋細胞の頻度を示す。いくつかの例で(図６、刺激位置１および２参照)、FLUM-003特異的細胞が、多量体染色のためのＥＣ単量体の産生と同じＵＶ単量体を使用したとき刺激および検出され(プレートＢ)、一方多量体染色のためのＥＣ単量体の産生とは他のＵＶ単量体を使用して、FLUM-003特異的細胞の望まない検出は阻止された(プレートＣ)。

【発明を実施するための形態】

【0024】

発明の詳細な記載
Ｔ細胞受容体(ＴＣＲ)ベースの免疫療法は、癌、ウイルス感染症および他の免疫変調疾患の処置のための最も有望かつ画期的アプローチの一つとなってきている。ＴＣＲベースの治療の開発および実施化おける多くの鍵となる工程は、ペプチド－ＭＨＣ(ｐＭＨＣ)複合体の産生を必要とする。ＭＨＣ分子はペプチドリガンド非存在下では不安定であり、これが、各個々のｐＭＨＣ複合体の産生が、ハイスループット適用に不適合である時間のかかるインビトロ再折りたたみおよび精製を必要とする理由である。最近、規定の刺激への暴露により分解するＭＨＣ分子のための条件付きペプチドリガンドが開発された。この刺激中の目的のペプチド(またはレスキューペプチド)の添加により、条件付きリガンドはこのペプチドにより置き換えられ、ＭＨＣ分子の分解を阻止することができる。この条件付きリガンド交換は、Ｔ細胞同定および特徴づけの分野における種々の応用のための多数の異なるｐＭＨＣ複合体の迅速かつ容易な産生を可能とする。特に汎用されている条件付きリガンド交換は、条件付きリガンドがＵＶ暴露により開裂される、いわゆるＵＶ交換である。

【0025】

この分野でなされてきた全ての進歩をもってしても、標的と特異的に結合するＴＣＲを同定することを目的とするＴＣＲ同定過程は、時間と費用のかかる過程のままである。最初に同定したＴＣＲを、個々の実験におけるさらなる特徴づけの間に選択解除するならば、これはまた極めて時間と費用がかかる。従って、表面にペプチドとＭＨＣ分子の複合体と特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現する免疫細胞を選択するさらに改善された方法が必要である。

【0026】

以前報告されてきたこととは対照的に、本発明者らは、例えば、ＵＶ暴露後、ＭＨＣ分子に結合した条件付きリガンドが相当量残存することを発見した。本発明者らは、このような残存条件付きリガンドを含むｐＭＨＣ複合体を、連続的工程、例えばＴ細胞の刺激、検出および／または分類に使用すれば、目的のペプチドではなく、代わりに条件付きリガンドを含むｐＭＨＣ複合体についてＴ細胞特異的の刺激、検出または分類につながり得ると考えた。現在まで文献に開示されている条件付きリガンドは、主にウイルスペプチドまたは非ヒトペプチド由来である。これらのペプチドは高度に免疫原性であるため、観察される問題、すなわち同定されたＴＣＲが条件付きリガンド自体を指向する可能性は、それゆえに、特にウイルスおよび非ヒトペプチドの関連において顕著である。

【0027】

この問題を解決するため、本発明者らは、ヒト起源のペプチド由来の新規条件付きペプチドリガンドを同定した。さらに、これらペプチドは健常組織で高度に発現され、故に免疫原性が低く、それにより上記問題を低減する。本発明は、配列番号１～１９、２１～３８および４０～６６からなる群から選択される配列を有する弱い免疫原性の条件付きペプチドを提供する。これらの条件付きペプチドは、とりわけ次の利点の１以上を提供する：(ｉ)低免疫原性による条件付きペプチドのＭＨＣ複合体に特異的な免疫細胞の刺激／増殖の非存在または低減、(ii)条件付きペプチドとＭＨＣ分子の間の強い結合、(iii)条件付きペプチドによるＭＨＣ複合体の再折りたたみの高収率、(iv)既定の刺激の非存在下での安定な条件付きペプチドＭＨＣ複合体、(ｖ)条件付きペプチドＭＨＣ複合体の低凝集率、(vi)条件付きペプチドＭＨＣ複合体の低分解率および(vii)既定の刺激によるＭＨＣ分子からのペプチドの高解離率。

【0028】

偽陽性ＴＣＲの同定をさらに低減するために、本発明者らは、免疫細胞を、２個の異なる条件付きリガンドを使用して、２個の条件付きリガンド交換により産生されたｐＭＨＣ複合体と連続的に接触させる、規定の特異性を有する抗原結合タンパク質を発現する免疫細胞の選択のための画期的アプローチを開発した。換言すると、第一工程、特にプライミングまたは刺激工程におけるｐＭＨＣ複合体の産生に使用する条件付きペプチドリガンドは、第二工程、特に同定または選択工程におけるｐＭＨＣ複合体の産生に使用する条件付きペプチドリガンドと異なる。本発明者らは、このアプローチが偽陽性免疫細胞、すなわち目的のリガンドを含むｐＭＨＣ複合体ではなく、条件付きリガンドを含むｐＭＨＣ複合体に特異的な細胞の選択を顕著に低減することを示した。このアプローチの提供により、本発明者らは、上記の先行技術の課題を解決した。本発明の免疫細胞を選択する方法により、条件付きリガンド交換により産生されたｐＭＨＣ複合体の使用を可能とし、ここで、偽陽性免疫細胞を選択するリスクは顕著に低減するかまたは排除される。故に、本方法は、とりわけ次の利点の１以上を提供する：本方法は、(ｉ)安価、(ii)速い、(iii)簡単、(iv)ハイスループット適用に適するおよび(ｖ)より正確である。

【0029】

本発明を下に詳述する前に、本発明はここに記載する特定の方法、プロトコールおよび反応剤に、これらが変わり得るため、限定されないことは理解されるべきである。また、ここで使用する用語は特定の実施態様を説明するのみの目的であり、添付する特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定する意図がないことも理解されるべきである。特に断らない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、当業者により共通して理解されるのと同じ意味を有する。

【0030】

本明細書をとおして、いくつかの文献が引用されている。ここに引用する各文献(全ての特許、特許出願、科学的刊行物、製造業者の説明書、指示書など)は、上記のものであれ下記のものであれ、引用によりその全体を本明細書に包含させる。本発明が、先行発明のために、このような開示に先行する権利を有しないことを認めるものとして解釈されるべきではない。ここで引用する文献のいくつかは、「引用により包含される」として特徴づけられる。このような包含される引用文献に示される定義または教示と、本明細書に示される定義または教示の間に矛盾がある場合、本明細書の記載が優先する。

【0031】

以下に、本発明の要素を記載する。これらの要素は具体的実施態様と共に列記されているが、さらなる実施態様を作成するために、あらゆる方法で、かつあらゆる数値を組み合わせ得ることは理解されるべきである。種々の記載される実施例および好ましい実施態様は、本発明を限定すると解釈してはならず、単に実施態様を明示的に記載するものである。この記載は、明示的に記載される実施態様と、あらゆる数の開示されたおよび／または好ましい要素を組み合わせる実施態様を指示および包含すると理解されるべきである。さらに、本明細書における全ての記載される要素のあらゆる並べ替えおよび組み合わせは、他の文脈に反しない限り、本明細書に記載にされていると解釈されるべきである。

【0032】

定義
本発明の実施に際し、特に断らない限り、当分野における文献に説明される、化学、生化学および組み換えＤＮＡ技術の慣用の方法が用いられる(例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989参照)。

【0033】

以下に、本発明を特徴づけるために本明細書で頻繁に使用される用語の定義を提供する。これらの用語は、使用される各場合、本明細書の他の部分において、それぞれ定義された意味および好ましい意味を有する。

【0034】

本明細書および特許請求の範囲をとおして、文脈から他の解釈が必要でない限り、用語「含む」および「含み」および「含んで」などのその変形は、記載する整数もしくは工程または整数もしくは工程群の包含を含意するが、あらゆる他の整数もしくは工程または整数もしくは工程群の除外を含意しない。ここで使用する用語「含む」の使用はまた具体的に記載される特性以外の特性が存在しない実施態様(すなわち「からなる」)も開示する。

【0035】

この明細書および添付する特許請求の範囲で使用される単数表現は、文脈に反しない限り、複数対象を含む。

【0036】

本明細書をとおして、用語「および／または」は、それが接続する１以上の場合が起こり得ると解釈すべき文法的接続詞である。例えば、表現「このような天然配列タンパク質は、標準組み換えおよび／または合成方法を使用して製造できる」は、天然配列タンパク質が標準組み換えおよび合成方法を使用して製造できるまたは天然配列タンパク質が標準組み換え方法を使用して製造できるまたは天然配列タンパク質が合成方法を使用して製造できることを示す。

【0037】

用語「細胞」は、本発明において、核および細胞小器官を含み、原生動物、真菌、植物および動物で見られ得る真核生物細胞をいう。動物は、哺乳動物細胞を含み得る。哺乳動物細胞は、とりわけヒト細胞、マウスもしくはラット細胞などの齧歯類細胞、サル細胞、ブタ細胞またはイヌ細胞を含む。真菌細胞は、とりわけ酵母細胞を含む。生命工学、例えば酵母表面ディスプレイで使用される典型的酵母細胞は、出芽酵母細胞である。

【0038】

用語「免疫細胞」は、本発明において、免疫系の細胞をいう。免疫系は、最終的にＢおよびＴリンパ球およびナチュラルキラー(ＮＫ)細胞に分化するリンパ系幹細胞および最終的に顆粒球および単球に分化する骨髄芽細胞を含む前駆体細胞ならびに十分に分化した白血球などの種々の細胞型を含む。分化した白血球は胸腺、脾臓、骨髄またはリンパ節由来細胞であり、顆粒球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および単球、マクロファージおよび肥満細胞および樹状細胞の主要な群に分類され得る。顆粒球はさらに好中球、好酸球および好塩基球顆粒球に分けられ、これは、血液循環中の細菌、ウイルスまたは真菌を貪食する。Ｂリンパ球は、形質細胞およびＢ記憶細胞の前駆体である。Ｔ細胞群は、制御Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞および細胞毒性Ｔ細胞を含む。Ｔヘルパー細胞は形質細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化するが、制御Ｔ細胞はＢ細胞および他のＴ細胞の機能を阻害し、故に、免疫応答を減退させる。Ｔ記憶細胞は長寿命であり、特異的抗原の記憶を有し、細胞毒性Ｔ細胞が腫瘍抗原または攻撃対象細胞の抗原との相互作用により、腫瘍細胞またはウイルスにより攻撃された細胞を認識し、殺滅する。Ｔ細胞および各Ｔ細胞の特異的表面マーカーにより説明されるその表面表現型の例を、下の表１に示す(Dong and Martinez, Nature Reviews Immunology, 2010による)：

【表1】

【0039】

用語「抗原提示細胞」は、抗原を処理し、Ｔ細胞表面に抗原ペプチドとＭＨＣ分子の複合体(ｐＭＨＣ複合体)を提示する細胞をいう。抗原提示細胞は専門および非専門の２個のカテゴリーに入る。専門抗原提示細胞は、ＭＨＣ－II分子を共刺激分子およびパターン認識受容体と共に発現する。非専門抗原提示細胞は、ＭＨＣ－Ｉ分子を発現する。

【0040】

用語「人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)」は、ペプチド－ＭＨＣ複合体および共刺激シグナル(例えば抗ＣＤ２８抗体)が結合した合成担体、例えばミクロ粒子またはナノ粒子をいう。天然抗原提示細胞に類似するサイズを有する(すなわち約４～２０μm、例えば５～１０μmの直径を有する)ミクロ粒子が好ましい。合成担体は、例えばポリ(グリコール酸)、ポリ(乳－コ－グリコール酸)、酸化鉄、リポソーム、脂質二重層、セファロース、ポリスチレンおよびポリイソシアノペプチドから選択され得る。合成担体はストレプトアビジンで被覆され得る。好ましい実施態様において、ａＡＰＣは、ペプチド－ＭＨＣ複合体および抗ＣＤ２８抗体が結合したストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズである。

【0041】

用語「腫瘍浸潤リンパ球」(ＴＩＬ)は、本発明において、腫瘍に向かって遊走し、腫瘍間質または腫瘍自体に高頻度で見られ得る、Ｔ細胞およびＢ細胞をいう。ＴＩＬは、典型的にＡＣＴまたは自己細胞療法に使用され得る白血球の細胞集団を含む。このような治療は、種々の臨床治験において、例えば、転移黒色腫の患者での有望な結果がすでに示されている(Guo et al.; “Recent updates on cancer immunotherapy”; Precision Clinical Medicine, 1(2), 2018-65-74)。ＡＣＴにおいては、ＴＩＬは外科的に切除した腫瘍または腫瘍断片から単離した単細胞懸濁液から、エクスビボで増殖される。ＴＩＬは、高用量のサイトカイン、例えばＩＬ－２を用いて増殖される。最良の腫瘍反応性を示す選択されたＴＩＬ系統が、次いで、典型的に２週間の期間抗ＣＤ３活性化を使用する「迅速増殖プロトコール」(ＲＥＰ)でさらに増殖される。最終ＲＥＰ後ＴＩＬが患者に注入され、戻される。本過程はまた養子移入ＴＩＬが腫瘍部位周囲に十分接近できるように、内因性リンパ球を枯渇する予備化学療法レジメンも含み得る。

【0042】

用語「免疫細胞濃縮画分」は、本発明において、免疫細胞の相対的豊富さが天然に存在する細胞混合物における豊富さと比較して増加されている、天然に存在する細胞集団、例えば血液由来の細胞集団をいう。健常ヒト対象の血液１mlは、例えば４７０万～６１０万(男性)、４２０万～５４０万(女性)の赤血球、４,０００～１１,０００の白血球および２００,０００～５００,０００の血小板を含む。故に、血中で、免疫細胞は血液細胞の総数の０.０６％～０.２５％しか占めない。故に、血液の免疫細胞濃縮画分は、免疫細胞を０.２５％超、１％超、５％超、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、好ましくは５０％超、６０％超、７０％超、さらにより好ましくは８０％超、８５％超、最も好ましくは９０％超含み得る。免疫細胞濃縮画分は、免疫細胞の１以上のサブタイプが濃縮されていてよい。例えば、免疫細胞濃縮画分は、リンパ系幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、形質細胞または組み合わせが濃縮され得る。通常、免疫細胞濃縮画分における免疫細胞は、目的の免疫細胞の表面マーカーに特異的に結合する１以上の蛍光標識抗体を使用して、選択される。Ｔ細胞またはＴ細胞群内の細画分の選択に適当な表面マーカーは、上の表１に示される。細胞毒性Ｔ細胞は、例えばＣＤ８に特異的に結合する抗体を使用してまたはＣＤ８およびＣＤ３に特異的に結合する抗体を使用して、選択され得る。

【0043】

用語「細胞集団」は、本発明において、均質または不均質、すなわち異なる特徴の細胞の混合物であり得る、複数の細胞をいう。血液は、異なる細胞の混合物である細胞集団の例である。均質細胞集団は、特定のサブタイプの選択またはクローン増殖により得られ得る。

【0044】

用語「免疫細胞特異的表面マーカー」は、本発明において、免疫細胞の同定および分類を助けるモノグラムとして働く、細胞表面抗原をいう。異なるＴ細胞サブタイプを特徴づけるこのようなマーカーの例は、上の表１に示される。免疫細胞特異的表面マーカーの大部分は、細胞の原形質膜内の分子または抗原である。これらの分子は、マーカーとして働くだけでなく、機能的役割も有する。

【0045】

用語「増殖因子」または「分化因子」は、本発明においては相互交換可能に使用され、細胞成長、細胞増殖および細胞分化を刺激し、複数細胞過程を制御できる、分子をいう。増殖因子は、通常タンパク質またはステロイドホルモンである。一般的な分子の例を次に挙げる(非網羅的羅列)：コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、マクロファージコロニー刺激因子(M-ＣＳＦ)、顆粒球コロニー刺激因子(G-ＣＳＦ)および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-ＣＳＦ)などの増殖因子；上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)；エリスロポエチン(ＥＰＯ)；線維芽細胞増殖因子(ＦＧＦ)；ウシ胎児ソマトトロピン(ＦＢＳ)；肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)；インスリン；インスリン様増殖因子(ＩＧＦ)；インターロイキン；ニューレグリン；ニューロトロフィン；Ｔ細胞増殖因子(ＴＣＧＦ)；トランスフォーミング増殖因子(ＴＧＦ)；腫瘍壊死因子アルファ(ＴＮＦα)および血管内皮細胞増殖因子(ＶＥＧＦ)。

【0046】

用語「抗原結合タンパク質」は、ＭＨＣと複合体の抗原ペプチドに特異的に結合できる抗原結合部位を含む、ポリペプチドまたは２以上のポリペプチドの複合体をいう。抗原結合タンパク質の例は、抗体、Ｂ細胞受容体(ＢＣＲ)、ＴＣＲ、一本鎖抗体、一本鎖ＴＣＲおよびキメラ抗原受容体(ＣＡＲ)である。本明細書で使用する、用語抗原結合タンパク質は、可溶性形式、膜結合形式、単価、二価および多価形式、一特異的、二特異的および多特異的形式、一本鎖形式および２以上の鎖を含む形式を含む、複数形式を含む。用語抗原結合タンパク質はまた抗原結合タンパク質の抗原結合フラグメント、例えばＴＣＲの抗原結合フラグメントを含む(下記参照)。好ましい実施態様において、抗原結合タンパク質はＴＣＲである。

【0047】

用語「Ｔ細胞受容体」(ＴＣＲ)は、本発明において、シグナル伝達介在に関与するＣＤ３複合体のバリアントタンパク質と結合した、免疫グロブリンスーパーファミリーのヘテロ二量体細胞表面タンパク質をいう。ＴＣＲは、構造的に類似するが、解剖学的部位およびおそらく機能が極めて異なる、αβおよびγδ形態で存在する。天然ヘテロ二量体αβＴＣＲおよびγδＴＣＲの細胞外部分は各々２個のポリペプチドを含み、その各々膜近位定常ドメインおよび膜遠位可変ドメインを含む。定常および可変ドメインの各々は、鎖内ジスルフィド結合を含む。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域(ＣＤＲ)に類似する高度に多形のループを含む。ＴＣＲ遺伝子療法の使用は、現在のハードルのいくつかを克服する。例えば、対象の(患者の)自身のＴ細胞が所望の特異性を備えることおよび短期間で十分な数のＴ細胞を産生することを可能とし、疲弊を回避する。このような実施態様において、ＴＣＲは強力なＴ細胞(例えば中心記憶Ｔ細胞または幹細胞特徴を備えたＴ細胞)に伝達され、導入による良好な持続、保護および機能を確実にし得る。ＴＣＲ操作されたＴ細胞を、化学療法または照射によりリンパ球減少された癌患者に注入し、効率的生着を可能とするが、免疫抑制を阻害する。天然アルファ－ベータヘテロ二量体ＴＣＲは、アルファ鎖およびベータ鎖を含む。各アルファ鎖は、可変、連結および定常領域を含み、ベータ鎖はまた通常可変両基と連結領域の間に短多様性領域を含むが、この多様性領域はしばしば連結領域の一部と考えられる。ＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖の定常またはＣ領域は、それぞれＴＲＡＣおよびＴＲＢＣと称される(Lefranc, (2001), Curr Protoc Immunol Appendix 1: Appendix 10)。各可変領域は、フレームワーク配列に包埋された３個の「相補性決定領域」(ＣＤＲ)を含み、一つはＣＤＲ３と称される超可変領域である。アルファ鎖ＣＤＲはＣＤＲａ１、ＣＤＲａ２、ＣＤＲａ３と称され、ベータ鎖ＣＤＲはＣＤＲｂ１、ＣＤＲｂ２、ＣＤＲｂ３と称される。フレームワーク、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列および部分的に定義されるＣＤＲ３配列により区別される、数タイプのアルファ鎖可変(Ｖアルファ)領域および数タイプのベータ鎖可変(Ｖベータ)領域がある。Ｖアルファタイプは、ＩＭＧＴ命名法で固有のＴＲＡＶ番号により称され、ＶベータタイプはＩＭＧＴ命名法で固有のＴＲＢＶ番号により称される(Folch and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(1): 42-54; Scaviner and Lefranc, (2000), Exp Clin Immunogenet 17(2): 83-96; LeFranc and LeFranc, (2001), "T cell Receptor Factsbook", Academic Press)。免疫グロブリン抗体およびＴＣＲ遺伝子のさらなる情報について、国際ImMunoGeneTics information system(登録商標), Lefranc M-P et al (Nucleic Acids Res. 2015 Jan;43 (Database issue) : D413-22; およびhttp://www.imgt.org/参照)。慣用のＴＣＲ抗原結合部位は、通常、アルファ鎖およびベータ鎖可変領域の各々からのＣＤＲセットを含む６個のＣＤＲを含み、ここで、ＣＤＲ１およびＣＤＲ３配列がＭＨＣタンパク質と複合体の抗原ペプチドの認識および結合に関連し、ＣＤＲ２配列はＭＨＣタンパク質の認識および結合に関連する。抗体に類似して、ＴＣＲは、ＣＤＲ間に介在するアミノ酸配列であるフレームワーク領域、すなわち種々のＴＣＲ間で比較的保存されているＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖可変領域の部分を含む。ＴＣＲのアルファ鎖およびベータ鎖は各々４個のＦＲを含み、ここで、それぞれＦＲ１－ａ、ＦＲ２－ａ、ＦＲ３－ａ、ＦＲ４－ａおよびＦＲ１－ｂ、ＦＲ２－ｂ、ＦＲ３－ｂ、ＦＲ４－ｂと命名される。従って、アルファ鎖可変ドメインは故に(ＦＲ１－ａ)－(ＣＤＲａ１)－(FR2-1)－(ＣＤＲａ２)－(ＦＲ３－ａ)－(ＣＤＲａ３)－(ＦＲ４－ａ)と指定でき、ベータ鎖可変ドメインは故に(ＦＲ１－ｂ)－(ＣＤＲｂ１)－(ＦＲ２－ｂ)－(ＣＤＲｂ２)－(ＦＲ３－ｂ)－(ＣＤＲｂ３)－(ＦＲ４－ｂ)と指定できる。

【0048】

用語「Ｂ細胞受容体」(ＢＣＲ)は、Ｂ細胞表面の膜貫通タンパク質複合体をいう。構造的に、ＢＣＲは、ジスルフィド架橋により連結された、１アイソタイプの膜結合免疫グロブリン分子(ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇＥ)およびシグナル伝達部分：Ｉｇ－α／Ｉｇ－β(ＣＤ７９)ヘテロ二量体を含む。二量体の各メンバーは原形質膜を横断し、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を担持する細胞質テイルを有する。抗原を認識するＢＣＲの部分は、Ｖ、ＤおよびＪと称される３個の異種遺伝子領域からなり、これは免疫系に特有の組み合わせ過程において遺伝子レベルで接合および組み換えされる。Ｂ細胞が、その受容体と結合する抗原(その「同種抗原」)と初めて遭遇することにより活性化されたとき、該細胞は増殖し、分化して、抗体分泌型血漿Ｂ細胞および記憶Ｂ細胞の集団を産生する。ＢＣＲは、生化学的シグナル伝達によりおよび抗原提示細胞と共に免疫シナプスからの抗原の物理的獲得によりＢ細胞活性化を制御し、抗原との相互作用において２個の重大な機能を有する。一つの機能は、受容体オリゴマー化の変化に関与するシグナル伝達である。第二の機能は、後続の抗原のプロセシングおよびヘルパーＴ細胞へのペプチドの提示のための内在化への介在である。

【0049】

用語「抗体」は、本発明において、膜貫通領域を欠き、故に、血流および体腔に放出され得る、分泌免疫グロブリンをいう。ヒト抗体は、それが有する重鎖に基づき、種々のアイソタイプに分類される。ヒトＩｇ重鎖には、ギリシャ文字でα、γ、δ、εおよびμと記される５タイプがある。存在する重鎖のタイプは抗体のクラスを定義し、すなわちこれらの鎖は、それぞれＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体に見られ、各々異なる役割を演じ、異なるタイプの抗原に対する適切な免疫応答を指示する。異なる重鎖は、サイズおよび組成が異なり；そして約４５０アミノ酸を含み得る(Janeway et al. (2001) Immunobiology, Garland Science)。ＩｇＡは、腸、呼吸器管および尿生殖器管などの粘膜領域ならびに唾液、涙および母乳に見られ、病原体によるコロニー形成を予防する(Underdown & Schiff (1986) Annu. Rev. Immunol. 4:389-417)。ＩｇＤは、主に抗原に曝されていないＢ細胞の抗原受容体として機能し、抗微生物因子を生じるための好塩基球および肥満細胞の活性化に関与する(Geisberger et al. (2006) Immunology 118:429-437; Chen et al. (2009) Nat. Immunol. 10:889-898)。ＩｇＥは、肥満細胞および好塩基球からのヒスタミン放出の引き金を引くアレルゲンへの結合を介して、アレルギー反応に関与する。ＩｇＥはまた寄生虫に対する保護にも関与する(Pier et al. (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASM Press)。ＩｇＧは、侵襲病原体に対する抗体ベースの免疫の大部分を提供し、胎盤を通過して胎児に受動免疫を与える唯一の抗体アイソタイプである(Pier et al. (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASM Press)。ヒトにおいて、４個の異なるＩｇＧサブグラス(ＩｇＧｌ、２、３および４)があり、血清における豊富さの順で名付けられており、ＩｇＧｌが最も豊富(約６６％)で、ＩｇＧ２(約２３％)、ＩｇＧ３(約７％)およびＩｇＧ(約４％)と続く。異なるＩｇＧクラスの生物学的プロファイルは、各ヒンジ領域の構造により決定される。ＩｇＭは、Ｂ細胞表面に単量体形態および極めて高いアビディティーの分泌型五量体形態で発現される。ＩｇＭは、十分なＩｇＧが産生される前のＢ細胞介在(液性)免疫の初期段階における病原体排除に関与する(Geisberger et al. (2006) Immunology 118:429-437)。抗体は単量体として見られるだけでなく、２個のＩｇ単位の二量体(例えばＩｇＡ)、４個のＩｇ単位の四量体(例えば硬骨魚のＩｇＭ)または５個のＩｇ単位の五量体(例えば哺乳動物ＩｇＭ)を形成することも知られる。抗体は、典型的にジスルフィド結合を介して接続された２個の同一重鎖および同一２個の軽鎖を含み、「Ｙ字」型巨大分子を模倣する、４個のポリペプチド鎖からなる。鎖の各々は、幾つかの免疫グロブリンドメインを含み、その一部は定常ドメインであり、その他は可変ドメインである。免疫グロブリンドメインは、２個の～シートに配置された７～９個の逆平行～鎖の２層サンドイッチからなる。典型的に、抗体重鎖は、４個のＩｇドメインを含み、その３個が定常(ＣＨドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３)ドメインであり、１個が可変ドメイン(ＶＨ)である。軽鎖は、典型的に１個の定常Ｉｇドメイン(ＣＬ)および１個の可変Ｉｇドメイン(ＶＬ)を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、より保存された、フレームワーク領域(ＦＲ)と称される領域が散在する、相補性決定領域(ＣＤＲ)と称される超可変性領域にさらに細分される。各ＶＨおよびＶＬは３個のＣＤＲおよび４個のＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端方向で、次の順番で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合に介在し得る。ここで使用する用語抗体はまたキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体も包含する。

【0050】

用語「キメラ抗原受容体」(ＣＡＲ；キメラ免疫受容体、キメラＴ細胞受容体、人工Ｔ細胞受容体としても知られる)は、本発明において、免疫エフェクター細胞、好ましくはＴ細胞に任意の特異性を移植する、操作された受容体である。細胞は、混成膜受容体分子であり、ターゲティング特異性およびＴ細胞活性化両方を提供するＣＡＲを遺伝的に備える。最も一般的な形態のＣＡＲは、ＣＤ３膜貫通およびエンドドメインに融合したモノクローナル抗体に由来する、一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)の誘導体である。ＣＡＲは、Ｔ細胞を細胞外部分の抗体由来結合ドメインを介して所望の細胞標的に標的化し、標的に遭遇したとき、Ｔ細胞活性化が細胞内部分シグナル伝達ドメインを介して起こる。適当な細胞、特にＴ細胞へのこれら受容体のコード配列の導入は、一般にレトロまたはレンチウイルスベクターにより促進される。受容体は、異なる起源の部分からなるため、キメラと呼ばれる。

【0051】

ここで使用する抗体、ＴＣＲまたはＢＣＲまたはＣＡＲの「抗原結合フラグメント」または「結合フラグメント」なる用語は、親タンパク質より長さは短いが、親タンパク質の結合特異性および／または選択性を担う１以上のアミノ酸配列を含むため、親タンパク質の抗原に特異的に結合する能力を実質的に保持する、抗体、ＴＣＲ、ＢＣＲまたはＣＡＲのフラグメント、特にアミノ酸鎖をいう。ＴＣＲの、ＭＨＣとの複合体における特異的抗原ペプチドへの結合がＣＤＲ１およびＣＤＲ３配列により定義されるため、ＴＣＲの抗原結合フラグメントは、少なくとも親ＴＣＲのＣＤＲ１およびＣＤＲ３配列を含む。当業者は、ＣＤＲにフレームワーク領域(ＦＲ)が散在していなければならないが、その特異的アミノ酸配列は標的抗原特異性に重大ではないことを知っている。機能的ＴＣＲフラグメントのさらなる例は、ＴＣＲアルファ、ベータ、ガンマまたはデルタ可変ドメインなどの単一可変ドメインまたは「Ｖ_α－Ｃ_α」または「Ｖ_β－Ｃ_β」などのα、β、δ、γ鎖のフラグメントまたはその一部を含む。このようなフラグメントはまたさらに対応するヒンジ領域を含むべきである。具体的態様において、抗原結合フラグメントは特異的に複合体１Ａ；特に複合体１Ａおよび複合体２Ａ両方に結合する。抗体、ＴＣＲ、ＢＣＲまたはＣＡＲの抗原結合機能は、完全長抗体、ＴＣＲ、ＢＣＲまたはＣＡＲのフラグメントにより実施され得ることが示されている。抗原結合フラグメントは、例えば、結合特異性が親タンパク質の結合特異性と同一であるまたは１５％、１０％、８％、５％、３％、２％もしくは１％を超えて増減しないならば、結合特異性を実質的に保持していると考えられる。

【0052】

ある例において、抗原結合フラグメントは、例えば、下記のとおり測定した親タンパク質の標的に対するそのＫ_Ｄが、親タンパク質のＫ_Ｄと同一であるまたは１０倍、５倍、３倍もしくは２倍を超えて増減しないならば、結合特異性を実質的に保持していると考えられる。ここで使用する用語「フラグメント」は、天然に存在するフラグメント(例えばスプライスバリアントまたはペプチドフラグメント)ならびに人工的に構築したフラグメント、特に遺伝子工学的手段により得たものをいう。「抗体の抗原結合フラグメント」の例は、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインからなる単価フラグメントであるＦａｂフラグメント；(ii)ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ’)_２フラグメント；(iii)ＶＨおよびＣＨドメインからなるＦｄフラグメント；(iv)抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、(ｖ)ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546)；(vi)単離相補性決定領域(ＣＤＲ)および(vii)所望により合成リンカーにより連結され得る２以上の単離ＣＤＲの組み合わせを含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２個のドメイン、ＶＬおよびＶＨは別の遺伝子によりコードされるが、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して単価分子を形成する単一タンパク質鎖としての製造を可能とする、合成リンカーにより、組み換え方法を使用して連結されてよい(一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として既知；例えば、Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883参照)。このような一本鎖抗体も、抗体、ＢＣＲまたはＣＡＲの「抗原結合フラグメント」なる用語に包含されることが意図される。用語「ＴＣＲの抗原結合部分」は、アルファ鎖およびベータ鎖またはガンマ鎖およびデルタ鎖、ＴＣＲの少なくともＣＤＲ１およびＣＤＲ３、好ましくはアルファ鎖およびベータ鎖またはガンマ鎖およびデルタ鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。これらＣＤＲは、好ましくはその天然フレームワーク領域の状況に含まれるが、またアルファ、ベータ、ガンマまたはデルタ鎖における配置であったのと類似の方法で互いに配置させる、他のタンパク質 － いわゆるタンパク質足場 － にも含まれ得る。ＴＣＲの抗原結合部分は、好ましくはアルファ鎖およびベータ鎖またはガンマ鎖およびデルタ鎖の可変ドメインを含む。抗体、ＴＣＲ、ＢＣＲまたはＣＡＲの抗原結合フラグメントは、単量体、二量体、三量体、四量体または多量体タンパク質複合体に含まれ、１以上の異なる抗原結合特異性を有するこのような複合体を提供し得る。抗体の抗原結合フラグメントを使用して、例えば二重特異性抗体、テトラボディまたはナノボディと称される、単価、二価または多価結合分子が作られるさらなる形式は当分野で知られる。ｓｃＦＶに類似して、一本鎖ＴＣＲは、リンカーにより連結された１タンパク質鎖にアルファ鎖およびベータ鎖の可変ドメインを含む。

【0053】

用語「抗原」は、当分野では、少なくとも１個のエピトープ、好ましくはＢ細胞またはＴ細胞応答またはＢ細胞およびＴ細胞応答を誘発するエピトープを含む、物質、好ましくは免疫原性ペプチドをいう。用語「タンパク質抗原」は、抗原結合タンパク質のパラトープに特異的に結合するエピトープを含む、タンパク質またはタンパク質もしくはタンパク質複合体の一部をいう。タンパク質抗原は、典型的に天然に存在するタンパク質であり、どんな長さでもよい。タンパク質抗原が少なくとも２５アミノ酸を含むのが好ましい。抗原性タンパク質がＴＣＲであるとき、抗原は、抗原ペプチドＭＨＣ分子の複合体である。

【0054】

用語「エピトープ」は、抗原性決定基としても知られ、免疫系により認識される抗原の一部である。用語エピトープは、本発明において、抗原の機能的エピトープをいう。機能的エピトープは、通常特異的三次元構造特徴および特異的荷電特徴を有し、抗原と抗原結合タンパク質のパラトープの非共有結合的相互作用に寄与する残基、典型的にアミノ酸または多糖である。非共有結合的相互作用は、静電気引力、ファン・デル・ワールス引力、水素結合および疎水性相互作用を含む。機能的エピトープは、抗原結合タンパク質の構造的エピトープを構成する残基のサブグループである。構造的エピトープは、抗原結合タンパク質に覆われた全残基、すなわち抗原結合タンパク質のフットプリントを含む。典型的に、抗体に結合した抗原の機能的エピトープは、４～１０個のアミノ酸を含む。同様に、ＭＨＣ提示であるペプチドの機能的エピトープは、典型的に４～８個のアミノ酸を含む。

【0055】

「抗原ペプチド」は、本発明において、ＭＨＣ分子のペプチドリガンド結合ポケットに結合できるタンパク質のフラグメントをいう。抗原ペプチドは、ＭＨＣ分子により抗原提示細胞表面に提示され得る。異なる抗原ペプチドは、異なる強度のＴ細胞応答を誘導し得る。本発明において、強いＴ細胞応答を誘導する抗原ペプチドは、高度に免疫原性と記載し、弱いＴ細胞応答を誘導する抗原ペプチドは、弱い免疫原性と記載する。抗原ペプチドの例は、ウイルスペプチド、細菌ペプチドおよび腫瘍関連抗原ペプチドである。ＭＨＣ－Ｉにより提示される抗原ペプチドは、典型的に８～１２アミノ酸長を有する。ＭＨＣ－IIにより提示される抗原ペプチドは、典型的に１３～２５アミノ酸長を有する。

【0056】

「ウイルス抗原ペプチド」は、本発明において、典型的に罹患細胞である抗原提示細胞の表面に主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)分子により提示される、ウイルスタンパク質の短いフラグメントである。ウイルス抗原ペプチドはウイルス起源であり、すなわち該細胞は典型的に該ウイルスに感染している。ウイルス抗原ペプチドは、本発明において、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)抗原ペプチド、ヒトサイトメガロウイルス(ＨＣＭＶ)抗原ペプチド、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)抗原ペプチド、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)抗原ペプチド、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)抗原ペプチド、Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)抗原ペプチド、エプスタイン・バールウイルス(ＥＢＶ)抗原ペプチド、インフルエンザ抗原ペプチド、ヒトアデノウイルス(ＨＡＤＶ)抗原ペプチドからなる群から選択される抗原ペプチドであり得る。

【0057】

「細菌抗原ペプチド」は、本発明において、典型的に罹患細胞である抗原提示細胞の表面にＭＨＣ分子により提示される、細菌タンパク質の短いフラグメントである。細菌抗原ペプチドは細菌起源であり、すなわち該細胞は典型的に細菌に感染している。このような細菌抗原ペプチドは、例えば、結核菌から、感染の状況で発見されている。従って、細菌抗原ペプチドは、本発明において、結核菌抗原ペプチドであり得る。

【0058】

用語「腫瘍関連抗原ペプチド」(ＴＡＡ)は、本発明において、腫瘍細胞により優先的にまたは排他的に発現される、酵素、受容体、転写因子などの全タンパク質クラス由来の自己細胞抗原ペプチをいう。ＴＡＡは、発現異常自己抗原、変異自己抗原および腫瘍特異的抗原に広義に分類され得る。腫瘍細胞により優先的に発現されるＴＡＡは、正常組織でも見られ得る。しかしながら、正常カウンターパートと比較してタンパク質構造の改変または腫瘍細胞内の異常細胞内局在化により、正常組織における発現と腫瘍における発現の程度が異なる。ここに記載する方法および実施態様で使用され得るＴＡＡは、例えば、米国公報２０１６０１８７３５１、米国公報２０１７０１６５３３５、米国公報２０１７００３５８０７、米国公報２０１６０２８０７５９、米国公報２０１６０２８７６８７、米国公報２０１６０３４６３７１、米国公報２０１６０３６８９６５、米国公報２０１７００２２２５１、米国公報２０１７０００２０５５、米国公報２０１７００２９４８６、米国公報２０１７００３７０８９、米国公報２０１７０１３６１０８、米国公報２０１７０１０１４７３、米国公報２０１７００９６４６１、米国公報２０１７０１６５３３７、米国公報２０１７０１８９５０５、米国公報２０１７０１７３１３２、米国公報２０１７０２９６６４０、米国公報２０１７０２５３６３３、米国公報２０１７０２６０２４９、米国公報２０１８００５１０８０および米国公報２０１８０１６４３１５(これら公報の各々の内容およびそこに記載の配列表は全体として引用により本明細書に包含させる)に記載のＴＡＡを含む。さらに、ＴＡＡは、本発明において、ＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスII分子、好ましくはＭＨＣクラスＩ分子の特異的リガンドである。

【0059】

用語「ＭＨＣ」は、本発明において、「主要組織適合性複合体」をいう。ＭＨＣは、適応免疫系に必須の細胞表面タンパク質(ＭＨＣ分子)をコードする、密接に連結した多型遺伝子のセットを含む、脊椎動物ＤＮＡ上の大遺伝子座である。ＭＨＣ分子は、脊椎動物における改変天然または外来タンパク質に対する獲得免疫の確立に必須の役割を有し、これは、次に組織内の組織適合性を決定する。ＭＨＣ分子の主機能は、自己タンパク質または病原体由来のペプチドに結合し、それらを適切なＴ細胞による認識のために細胞表面に提示することである。ＭＨＣ遺伝子ファミリーは３個のサブグループ：クラスＩ、クラスIIおよびクラスIIIに分割される。ペプチドとＭＨＣクラスＩの複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ８陽性Ｔ細胞により認識され、一方ペプチドとＭＨＣクラスII分子の複合体は、適切なＴＣＲを有するＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞により認識される。両タイプの応答、ＣＤ８およびＣＤ４依存は、Ｔ細胞の抗腫瘍効果に共同でかつ相乗的に寄与するため、腫瘍関連抗原および対応するＴＣＲの同定および特徴づけは、ワクチンおよび細胞治療などの癌免疫療法に重要である。

【0060】

本発明において、用語「ＭＨＣ分子」は、天然に存在するＭＨＣ分子、その誘導体またはその抗原ペプチド結合フラグメントをいう。天然に存在するＭＨＣ－Ｉ分子は、ＭＨＣ－Ｉ重鎖とも称するアルファ鎖およびβ２－ミクログロブリン分子を構成するベータ鎖からなる。アルファ鎖は、３個のアルファドメイン、すなわちα１ドメイン、α２ドメインおよびα３ドメインを含む。α１およびα２ドメインは、主にペプチドＭＨＣ(ｐＭＨＣ)複合体を産生するためのペプチドリガンドの結合のためのペプチド結合溝の形成に寄与する。ＭＨＣ－Ｉ分子は、典型的に細胞質タンパク質に由来するペプチドに結合し、これは、ユビキチン化後プロテアソームにより分解され、その後抗原プロセシング(ＴＡＰ)と関連する特異的トランスポーターを介して、サイトゾルから小胞体(ＥＲ)に輸送される。ＭＨＣ－Ｉ分子は、典型的に８～１２アミノ酸長のペプチドに結合する。天然に存在するＭＨＣ－II分子はアルファ鎖およびベータ鎖からなり、ここで、アルファ鎖は２個のアルファドメイン、α１ドメイン、α２ドメインを含み、ベータ鎖は２個のベータドメイン、β１ドメインおよびβ２ドメインを含む。ＭＨＣ IIは、典型的に不変鎖と称されるタンパク質と複合体でＥＲに折りたたまれ、次いで後期エンドソーム区画に輸送され、そこで不変鎖はカテプシンプロテアーゼにより開裂され、短フラグメントがＭＨＣ－II分子のペプチド結合溝と結合したままであり、クラスII関連不変鎖ペプチド(ＣＬＩＰ)と称される。このプレースホルダーペプチドは、次いで、通常、エンドサイトーシス区画で利用可能なタンパク質分解されたタンパク質由来の高親和性ペプチドに対して交換される。ＭＨＣ－II分子は、１０～３０アミノ酸長のペプチド、典型的に１３～２５アミノ酸長のペプチドと結合する。

【0061】

用語「ＭＨＣ分子誘導体」は、それが由来するＭＨＣ分子と同じペプチド結合親和性および特異性を有するが、他の特徴、例えば安定性または他の分子、例えばＣＤ８への結合に関して異なり得る、ＭＨＣ分子のバリアントをいう。ある実施態様において、ＭＨＣ誘導体は安定化ＭＨＣ分子である。好ましくは、安定化ＭＨＣ分子は、ジスルフィド結合した安定化ＭＨＣ分子である。ＷＯ２０２００５３３９８。例えば、HLA-A*02:01は、８４位と１３９位または２２位と７１位または２２位と７１位および５１位と１７５位の間のジスルフィド架橋により安定化され得る(ここで、位置は、www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/nomenclature/alignments.htmlに示される参照配列Acc. No. HLA0001を使用したＩＧＭＴ命名法に従い示される)。ある実施態様において、ＭＨＣ誘導体は、ＣＤ８への結合が増加または減少したＭＨＣバリアント、例えばDockree et. al., 2017に記載のバリアントＡ２４５Ｖ(結合減少)およびバリアントＱ１１５Ｅ(結合増加)である。

【0062】

ここで使用する用語「ＭＨＣ分子の抗原ペプチド結合フラグメント」は、親の、天然に存在するＭＨＣ分子より長さは短いが、親ＭＨＣ分子の結合特異性および／または選択性を担うアミノ酸配列または配列を含むため、親タンパク質の抗原ペプチドに特異的に結合する能力を保持した、ＭＨＣ分子のフラグメント、特にアミノ酸鎖をいう。抗原ペプチドがＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合するため、ＭＨＣ分子の抗原ペプチド結合フラグメントは、少なくともペプチド結合溝を形成するアミノ酸を含む。ＭＨＣ－Ｉ分子の抗原ペプチド結合フラグメントは、好ましくはα１およびα２ドメインを含む。ＭＨＣ－II分子の抗原ペプチド結合フラグメントは、好ましくはα１およびβ１ドメインを含む。

【0063】

用語「ペプチドＭＨＣ複合体(ｐＭＨＣ複合体)」は、ＭＨＣ分子、好ましくはヒトＭＨＣ分子と抗原ペプチドの複合体をいう。本発明において、用語(タンパク質)複合体は、２以上のタンパク質(またはタンパク質とペプチド)が非共有結合タンパク質－タンパク質相互作用により連結することを意味する。故に、ｐＭＨＣ複合体において、抗原ペプチドはＭＨＣ分子に非共有結合で結合する。特に、抗原ペプチドは、ＭＨＣ分子により形成されるペプチド受容溝に位置する。

【0064】

用語「ヒト白血球抗原(ＨＬＡ)複合体」はヒトＭＨＣをいう。本発明の好ましい実施態様において、ＭＨＣ分子はＨＬＡ分子である。ＨＬＡ分子は、別のヒトとの間ではアミノ酸配列が異なる。しかしながら、ＨＬＡは、ＨＬＡの国際的に合意された命名法、ＩＭＧＴ命名法により同定され得る。HLA-A遺伝子は染色体６の短アームに位置し、HLA-Aの大型、α鎖構成要素をコードする。HLA-A α鎖の変動は、ＨＬＡ機能の手がかりである。この変動は集団の遺伝子多様性を促進する。各ＨＬＡが特定の構造のペプチドに対して異なる親和性を有するため、ＨＬＡの多様性が大きくなるほど、細胞表面に‘提示される’抗原の多様性が大きくなることを意味する。各個体は、各々が各親からの、２個までのタイプのHLA-Aを発現できる。ある個体は、両親から同じHLA-Aを受け継ぎ、個体ＨＬＡ多様性が低減する。しかしながら、個体の大部分は、HLA-Aの２個の異なるコピーを受ける。同じパターンが全ＨＬＡ群で続く。換言すると、全ての一人の人間は、現在１７４０個の活性タンパク質をコードする２４３２個の既知HLA-Aアレルの１個または２個しか発現できない。HLA-A*02は特異的ＨＬＡアレルを意味し、ここで、文字ＡはどのアレルにＨＬＡ遺伝子が属するかを意味し、接頭辞＊０２はＡ２血清型を示す。

【0065】

用語「ペプチドＨＬＡ複合体(ｐＨＬＡ複合体)」は、ＨＬＡ分子、好ましくはHLA-A、HLA-ＢまたはHLA-Ｃ分子と抗原ペプチドの複合体をいう。

【0066】

本発明において、ＰＢおよびＰＣは条件付きペプチドであり、ＰＡはレスキューペプチドである。用語「条件付きリガンド交換」は、条件付きｐＭＨＣ複合体を介するｐＭＨＣ複合体の産生のためのテクノロジーである。換言すると、用語条件付きリガンド交換は、ＭＨＣ分子に結合した条件付きペプチド(ＰＢまたはＰＣ)のレスキューペプチド(ＰＡ)での交換をいう。

【0067】

用語「条件付きペプチド」、「条件付きリガンド」および「条件付きペプチドリガンド」は相互交換可能に使用される。本発明において、条件付きペプチドは、ＭＨＣ分子に結合でき、規定の刺激によりこのＭＨＣ分子から開裂するペプチドをいう。既定の刺激は、化学的および／または物理的刺激であってよく、温度上昇、ｐＨ変化、過ヨウ素酸との接触、亜ジチオン酸との接触およびＵＶ照射またはこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。温度上昇に応答した条件付きリガンド交換はLuimstra et al., 2018に記載される。ｐＨ変化に応答した条件付きリガンド交換はＷＯ２００６／０８０８３７に記載される。過ヨウ素酸との接触による条件付きリガンド交換はＷＯ２００６／０８０８３７に記載される。亜ジチオン酸との接触による条件付きリガンド交換はChoo et al., 2014に記載される。ＵＶ照射による条件付きリガンド交換は、例えばToebes et al., 2006に記載される。条件付きリガンド交換のための既定の刺激が過ヨウ素酸との接触、亜ジチオン酸との接触またはＵＶ照射であるならば、条件付きペプチドは、通常、既定の刺激により活性化されたとき、条件付きペプチドのペプチド主鎖内の共有結合の切断を行う、条件付きで反応性の基を含む(開裂可能な条件付きで反応性の基)。用語条件付きペプチドは、このような条件付きペプチドの非開裂形態をいう。開裂したペプチドがＭＨＣ分子から解離することが予測される。

【0068】

適当な開裂可能な条件付きで反応性の基は、例えば光活性化可能基(すなわちＵＶ光により活性化され得る基、例えば３－アミノ－３－(２－ニトロ)フェニル－プロピオン酸または光活性化可能なその構造的等価物)、亜ジチオン酸活性化可能基(例えばアゾベンゼン部分)または過ヨウ素酸活性化可能基(例えば１,２－ジヒドロキシ部分、１－アミノ－２－ヒドロキシ部分または４－アミノ－４－デオキシ－L-トレオン酸)である。

【0069】

用語「条件付きｐＭＨＣ複合体」は、条件付きペプチドとＭＨＣ分子の複合体をいう。条件付きペプチドが開裂可能ペプチドであるとき、条件付きｐＭＨＣ複合体は、条件付きペプチドをその非開裂形態で含む。これは、(１)条件付きｐＭＨＣ複合体が既定の刺激に曝されていないまたは(２)条件付きｐＭＨＣ複合体が既定の刺激に曝されているが、条件付きペプチドの切断が起こっていないためであり得る。本発明の好ましい実施態様において、ＭＨＣ分子はＨＬＡ分子である。故に、好ましい実施態様において、ｐＭＨＣ複合体はｐＨＬＡ複合体であり、条件付きｐＭＨＣ複合体は条件付きｐＨＬＡ複合体である。

【0070】

用語「レスキューペプチド」は、本発明において、ｐＭＨＣ複合体における条件付きペプチドの置き換えに使用するペプチドをいう。既定の刺激への暴露後条件付きペプチドがＭＨＣ分子から開裂されたとき、レスキューペプチドは、ＭＨＣ分子の空ペプチドリガンド結合ポケットに結合する。レスキューペプチドの結合により、新規(非条件付き)ｐＭＨＣ複合体が形成される。レスキューペプチドは、好ましくは条件付きで反応性の基を含まない。

【0071】

「ＵＶ交換」は、条件付きリガンド交換の好ましい実施態様であり、ここで、既定の刺激はＵＶ照射である。「ＵＶ照射」刺激は、３００～４００nm、好ましくは３５０～３８０nm、より好ましくは約３６６nmの波長を有するＵＶ光での、好ましくは０℃～２５℃の温度で約１５～９０分間、好ましくは約３０～６０分間の照射をいう。ＵＶ照射刺激中、ｐＭＨＣ／ｐＨＬＡ複合体は好ましくは溶液、より好ましくは緩衝液、例えばＰＢＳおよびＴＢＳＡ(２０nM Ｔｒｉｓ塩基ｐＨ８、１５０mM ＮａＣｌ、０.０２％Ｎａ－酸)から選択される緩衝液中にある。

【0072】

「ＵＶペプチド」は、条件付きペプチドの好ましい実施態様である。用語ＵＶペプチドは、ＵＶ暴露により開裂可能(すなわち、ペプチド主鎖の切断)であるペプチドをいう。ＵＶペプチドは、アミノ酸残基のＵＶ感受性アミノ酸残基での交換により親ペプチドから産生される(アミノ酸配列における条件付きで反応性の基(Ｘ)により表される)。好ましくは、このＵＶ感受性アミノ酸残基は３－アミノ－３－(２－ニトロ)フェニル－プロピオン酸残基または光活性化可能なその構造的等価物である。

【0073】

用語「親ペプチド」は、条件付きペプチド、特にＵＶペプチド産生のための鋳型として使用するペプチドをいう。好ましくは、親ペプチドは、排他的にタンパク質を構成するアミノ酸を含む。条件付きペプチドは、アミノ酸、好ましくは１個または２個のアミノ酸、より好ましくは１個のアミノ酸の条件付きで反応性の基、特に条件付きで反応性のアミノ酸アナログでの置き換えにより、親ペプチドから産生される。条件付きペプチドは、親ペプチドと比較して、さらなるアミノ酸置換を含み得る。親ペプチドは、例えばウイルスペプチドまたはヒトペプチドであり得る。本発明の本方法および実施態様において、親ペプチドが自己ヒトペプチドであるのが好ましい。親ペプチドはヒトで高度に発現および／または高頻度で提示され、故に、非免疫原性または弱い免疫原性のみであることが期待され得るのが特に好ましい。非免疫原性または弱い免疫原性親ペプチドから産生される条件付きペプチドもまた非免疫原性または弱い免疫原性のみ(高度に免疫原性親ペプチドから産生される条件付きペプチドと比較して)であることが期待され得る。好ましい実施態様において、親ペプチドは、親ペプチドの１個または２個のアミノ酸が条件付きで反応性のアミノ酸アナログで置き換えられていることにより由来する条件付きペプチドと異なる。

【0074】

「ＵＶ単量体」は、条件付きｐＨＬＡ複合体の好ましい実施態様である。用語「ＵＶ単量体」は、ＵＶペプチドを含むｐＨＬＡ複合体をいう。ＵＶ単量体を使用して、ＵＶ単量体をＵＶ光に曝し、レスキューペプチドを提供することにより、ＥＣ単量体を産生し得る。

【0075】

用語「ＥＣ単量体」は、ＵＶ誘導ペプチド交換(すなわちＵＶペプチドのレスキューペプチドでの交換)によりＵＶ単量体から産生されるｐＨＬＡ複合体をいう。用語ＥＣ単量体は、故に、ＰＡを含むｐＨＬＡ複合体をいう。多量体は数個のＥＣ単量体から形成され得る。

【0076】

用語「Ｓｔｄ単量体」は標準再折りたたみプロトコールを使用して産生されるｐＨＬＡ複合体をいう。

【0077】

用語「Ｋ _Ｄ 」(「mol／Ｌ」で測定、「Ｍ」と略すこともある)は、本発明において、結合部分(例えばＴＣＲなどの抗原結合タンパク質)と標的分子(例えばＭＨＣと複合体の抗原ペプチド)の間の特定の相互作用の解離平衡定数をいう。親和性は、表面プラズマ共鳴(ＳＰＲ)ベースのアッセイ(例えばBIAcoreアッセイ)；バイオレイヤー干渉(ＢＬＩ)、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)；および競合アッセイ(例えば放射免疫アッセイ(ＲＩＡ))を含むが、これらに限定されない当分野で知られる一般的方法により測定できる。低親和性抗原結合タンパク質は、一般にゆっくり結合し、容易に解離する傾向にあり、一方高親和性抗原結合タンパク質は、一般に速く結合し、長く結合したままである傾向にある。結合親和性を測定する多種多様な方法が当分野で知られ、その何れも本発明の目的で使用できる。

【0078】

「最大半量有効濃度」は、「ＥＣ_５０」ともいい、典型的に特定した暴露時間後のベースラインと最高の間の半分の応答を誘導する分子の濃度をいう。ＥＣ_５０および親和性は逆相関であり、分子のＥＣ_５０値が低いほど、親和性が高い。一例において、「ＥＣ_５０」は、特定した暴露時間後のベースラインと最高の間の半分の応答を誘導する本発明の抗原結合タンパク質の濃度である。ＥＣ_５０値は、例えばＥＬＩＳＡなどの結合アッセイまたはフローサイトメトリーまたは機能的アッセイを使用して、種々の既知の方法により実験的に評価できる。

【0079】

用語「特異的に結合する」は、本発明において、ＴＣＲなどの抗原結合タンパク質または抗体が好ましくは唯一の抗原ペプチド(標的抗原ペプチド)を特異的に認識または結合し、好ましくは他の抗原ペプチド(非標的抗原ペプチド)に結合(交差反応性)しないまたは実質的にしない、すなわち標的抗原ペプチドと非標的ペプチド、特に標的ペプチドと類似配列を有する非標的ペプチド(類似ペプチドとも称する)を区別する、特徴をいう。類似ペプチドの中で、本発明の抗原結合タンパク質に検出可能な程度で結合しないものがいくつかある、例えばバックグラウンドレベルを超える結合シグナルまたは機能的応答が検出不可能であるペプチドがあることを当業者は認識し、ここで、「バックグラウンドレベル」は、非相同、「非類似」ペプチドで観察されるまたはペプチド非存在下で観察される結合シグナルまたは機能的応答をいう。他の類似ペプチドについて、低い結合であるが、しかしながら顕著ではない結合が検出可能であり得る。これらのペプチドもまた「関連する可能性のある」類似ペプチドとも記載し得る。

【0080】

抗原結合タンパク質は
－ ＭＨＣと複合体の類似ペプチドの結合のＫ_ＤがＭＨＣと複合体の標的抗原ペプチドの結合のＫ_Ｄと比較して、２５倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、７５倍以上または１００倍以上増加するならば；
－ 機能的アッセイにおいて、ＭＨＣと複合体の類似ペプチドに対する応答が、ＭＨＣと複合体の標的ペプチドに対する応答と比較して顕著に低減する、特に２５倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、７５倍以上または１００倍以上低減するならば；または
－ 機能的アッセイにおいて決定したＥＣ_５０が、ＭＨＣと複合体の標的抗原ペプチドと比較して、ＭＨＣと複合体の類似ペプチドで２５倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、７５倍以上または１００倍以上増加しているならば、
類似ペプチドと顕著に結合しないと考える。

【0081】

「機能的応答」は、機能的アッセイにおいて測定した応答をいう。「機能的アッセイ」は、本発明において、抗原結合タンパク質が免疫細胞で発現され、該免疫細胞がＭＨＣと複合体の抗原ペプチドを提示する抗原提示細胞と共培養される、アッセイをいう。抗原結合タンパク質がペプチド：ＭＨＣ複合体に特異的に結合できるならば、これは免疫細胞の活性化をもたらす。好ましくは、抗原結合タンパク質はＴＣＲであり、免疫細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞の活性化は、当業者に知られる方法、例えばＴ細胞からのサイトカイン(例えばTNF-αおよび／またはIFN-γ)の放出の測定またはＴ細胞による抗原提示細胞の殺滅の測定、例えば抗原提示細胞からの細胞間タンパク質の放出の測定で決定できる。後者の種類の機能的アッセイは細胞毒性アッセイとも称される。適当な細胞内タンパク質は、例えば抗原提示細胞により発現される内因性ＬＤＨまたはトランスジェニックタンパク質、例えばルシフェラーゼである。Ｔ２細胞などの抗原提示細胞への負荷に使用する抗原ペプチドの濃度を変えることにより、最大半量有効濃度(ＥＣ_５０)を機能的アッセイにおいて決定し得る。

【0082】

用語「発現」は、本発明において、ヒト組織におけるタンパク質またはペプチドの存在をいう。タンパク質またはペプチドの発現なる用語は、それが、細胞のリボソーム機構におけるタンパク質生合成の過程中、その核酸配列からそのアミノ酸配列に翻訳されることを意味する。発現したタンパク質は、細胞内または細胞外、例えば細胞の表面に位置し得る。タンパク質が発現されるヒト組織は、健常または罹患組織であり得る。

【0083】

「ハウスキーピング遺伝子」は、本発明において、典型的に、基本的細胞機能の維持に必要であり、正常および病態生理学的条件下に、生物の全細胞で発現される、構成的遺伝子である。一部ハウスキーピング遺伝子は、大部分の非病的状態で比較的一定割合で発現されるが、他のハウスキーピング遺伝子の発現は、実験条件により変わり得る。ハウスキーピング遺伝子は、ゲノムにおける活性遺伝子の大部分を占め、その発現は明らかに生存に重要である。ハウスキーピング遺伝子発現レベルは、種々の組織の代謝要求に合うよう微調整される。ハウスキーピング遺伝子の例を、次の通り挙げる(非網羅的)：転写因子、翻訳因子、リプレッサー分子、ＲＮＡスプライシング分子、ＲＮＡ結合タンパク質、リボソームタンパク質、ミトコンドリアリボソームタンパク質、ＲＮＡポリメラーゼ、タンパク質プロセシング遺伝子、ヒートショックタンパク質、ヒストン、細胞周期、アポトーシス、癌遺伝子、ＤＮＡ修復、ＤＮＡ複製、代謝関与遺伝子、例えば炭水化物代謝、クエン酸サイクル、脂質代謝、アミノ酸代謝に関与する遺伝子、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、シトクロムＣオキシダーゼ、ATPase、リソソーム、プロテアソーム、リボヌクレアーゼ、チオレダクターゼ、受容体、チャネル、トランスポーター、ＨＬＡ／免疫グロブリン／細胞認識、キナーゼ、細胞骨格、増殖因子、腫瘍壊死因子α。

【0084】

用語「アミノ酸配列同一性」は、本発明において、配列同一性のパーセンテージをいい、比較ウィンドウにわたり２個の最適に配列された配列の比較により決定され、ここで、比較ウィンドウにおける配列の部分は、２個の配列の差異的配列のために、対照配列(付加または欠失を含まない)と比較して、付加または欠失(すなわちギャップ)を含み得る。パーセンテージは、両配列で同一核酸塩基またはアミノ酸残基がある位置の数を決定して、適合位置の数を得て、適合位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で除し、結果を１００倍して、配列同一性のパーセンテージをもたらすことにより計算される。

【0085】

用語「同一」は、本発明において、同じである、すなわちアミノ酸または核酸の同じ配列を含む、２以上のポリペプチドまたは核酸配列、２以上の配列または部分配列をいう。配列は、次の配列比較アルゴリズムの一つまたは手動整列および目視検査を使用して測定して、比較ウィンドウまたは指定領域にわたる最高対応について比較および整列したとき、同じであるアミノ酸残基が特定したパーセンテージ(例えば、特定した領域にわたり少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性)であるならば、互いに「実質的に同一」である。これらの定義はまた試験配列の相補体もいう。従って、用語「少なくとも８０％配列同一性」は、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列比較に関連して、明細書をとおして使用する。この表現は、好ましくは各対照ポリペプチドまたは各対照ポリヌクレオチドに対する少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性をいう。

【0086】

用語「配列比較」は、本発明において、ある配列が対照配列として働き、それに対して試験配列を比較する過程をいう。配列比較アルゴリズムを使用するとき、試験および対照配列をコンピューターにインプットし、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを一般に使用するかまたは別のパラメータを指定できる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき対照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性または類似性を計算する。２個の配列を比較し、配列同一性パーセンテージの計算のために比較すべき対照配列が特定されていない場合、特に断らない限り、配列同一性は、比較する２個の配列の長い方を参照して計算される。対照配列が指定されるならば、配列同一性は、特に断らない限り、配列番号で示される対照配列の完全長に基づき決定される。

【0087】

比較のための配列の整列方法は当分野で周知である。比較のための配列の最適整列は、例えば、Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2:482, 1970)の局所相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970)の相同性整列アルゴリズム、Pearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988)の類似性の検索の方法、これらアルゴリズムのコンピューター制御の実行(例えば、Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ)または手動整列および目視検査(例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)参照)により実施され得る。パーセント配列同一性および配列類似性決定に適するアルゴリズムは、それぞれAltschul et al. (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977)およびAltschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)に記載されるBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を介して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まずデータベース配列の同じ長さのワードと整列したとき、マッチするまたはある正の値の閾値スコアＴを満たす、クエリー配列における長さＷの短ワードの同定により、高スコアリング配列対(ＨＳＰ)を同定する。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される(Altschul et al., supra)。これらの初期近隣ワードヒットはそれらを含む長いＨＳＰを見つけるための検索開始の種として働く。ワードヒットは、累積整列スコアが増加され得る限り、各配列に沿って両方向で拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ(マッチング残基対のリワードスコア；常に＞０)およびＮ(ミスマッチング残基のペナルティスコア；常に＜０)を使用して、計算される。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの拡張は、累積整列スコアがその最高の達成された値から量Ｘ低下したとき；累積スコアが１以上の負のスコアの残基の整列の累積により０以下になったとき；またはいずれかの配列の端に達したとき、停止される。BLASTアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは整列の感受性および速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列について)は、デフォルトとしてワード長(Ｗ)１１、期待値(Ｅ)１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムは、デフォルトとしてワード長３および期待値(Ｅ)１０およびBLOSUM62スコアリングマトリックス(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989参照)整列(Ｂ)５０、期待値(Ｅ)１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４および両鎖の比較を使用する。

【0088】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の他の指標は、アミノ酸配列間のマッチが偶然起こる確率の指標を提供する、最小合計確率(Ｐ(Ｎ))である。例えば、アミノ酸は、試験アミノ酸と対照アミノ酸の比較における最小合計確率が約０.２未満、典型的に約０.０１未満、より典型的に約０.００１未満であるならば、対照配列に類似すると考えられる。アミノ酸が化学的に関連するアミノ酸で置換される半保存的および特に保存的アミノ酸置換が好ましい。典型的置換は、脂肪族アミノ酸間、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸間、酸性残基を有するアミノ酸間、２６アミド誘導体間、塩基性残基を有するアミノ酸間または芳香族残基を有するアミノ酸間である。典型的半保存的および保存的置換を下表２に示す。

【0089】

【表2】

【0090】

Ａ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、ＷまたはＹからＣへの変更は、新規システインが遊離チオールのままであるならば、半保存的である。さらに、立体的に嵩高い位置でのグリシンは置換すべきではなく、Ｐはアルファ螺旋またはベータシート構造を有するタンパク質の部分に導入すべきではないことを当業者は認識する。

【0091】

用語「検出可能標識」は、本発明において、異なる分子または細胞を、この異なる分子が、標識が発揮する性質または特異的特徴により選択されることを可能とるために、標識する分子をいう。例えば、その後の分子は、標識されたタンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡまたはビーズもしくは他の適当な物質などの合成物質であり得る。タンパク質に関して、標識戦略は、ビオチン、レポーター酵素、フルオロフォア、磁気標識および放射性同位体を含む異なる分子の標的タンパク質またはペプチドまたはヌクレオチド配列への共有結合をもたらす。単一細胞を、シーケンシング実験において、短ＤＮＡまたはＲＮＡバーコード‘タグ’を使用して標識して、同じ細胞由来のリードを同定できる。標識は蛍光標識、例えばキサンテン、アクリジン、オキサジン、シアニン、スチリル色素、クマリン、ポルフィリン、金属－リガンド－複合体、蛍光タンパク質、ナノ結晶、ペリレンおよびフタロシアニン、ストレプトアビジン－フィコエリスリン(SA-PE)、ストレプトアビジン－アロフィコシアニン(SA-APC)またはストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット４２１(SA-BV421)；ＲＮＡバーコードまたはＤＮＡバーコードまたは放射性標識であり得る。放射性標識は、典型的に１以上の原子が放射性カウンターパート、すなわち放射性同位体で置き換えられている分子である。タンパク質、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡを放射性標識し得る。磁気標識は、例えば特定の表面抗原に対する抗体で被覆され得る、磁気ビーズまたは磁気ナノ粒子である。磁気標識を磁気活性化細胞分類(ＭＡＣＳ)で使用し得る。

【0092】

用語「検出可能に異なる」は、本発明において、２個の標識が存在するが、発するシグナルによってのみ異なり得るシナリオをいう。例えば、２個の細胞を蛍光標識で標識し得て、ここで、一方の細胞に結合した蛍光標識は、赤色シグナルであり得て、第二細胞に結合した蛍光シグナルは緑色シグナルであり得る。例示した細胞の２個の標識は、故に、検出可能に異なる。

【0093】

用語「フローサイトメトリー分析」は、本発明において、サンプルの特異的細胞集団または細胞亜集団の化学的および物理的性質の測定を含む技術をいう。サンプルは、通常懸濁液であり、検出単位、典型的にフルオロフォアを発するレーザービームおよび光検出器をとおるとき、１細胞の流れをもたらすよう調節される。検出シグナル、例えば細胞の貫通により散乱される光は、細胞、すなわちその成分の特徴である。複数細胞を、この技術により短時間で分析できる。フローサイトメトリーの日常的適用は、細胞計数、細胞分類、細胞特徴および機能の決定、疾患、例えば癌の診断、バイオマーカー検出または微生物検出である。人気のフローサイトメトリー技術は、蛍光活性化細胞分類(ＦＡＣＳ)である。ＦＡＣＳ技術は、特定の細胞集団の個々の標識プロファイルに基づき細胞分類することを可能とする、１以上の標的細胞を蛍光色素タグまたは標識で標識できる能力を利用する。

【0094】

用語「磁気活性化細胞分類」(ＭＡＣＳ)は、特定の細胞表面抗原に対応する抗体がコンジュゲートした機能的ミクロまたはナノ粒子を利用する分類技術をいう。磁場勾配の適用下、磁気により標的とされた細胞を、用いる抗原に関して正のまたは負の形式で分類できる。当業者は、様々な種類の分類分析を十分知っている。

【0095】

用語「疾患」は、組織、臓器または個体がその機能をもはや効率的に充足しない、異常な状態、特に疾病または傷害などの異常な医学的状態をいう。対照的に、異常な状態が存在しないかつ組織、臓器または個体に病理所見がないならば、ここでは健常組織、臓器または個体という。健常組織において、細胞の無作為な遊走はなく、細胞は組織を特徴づける構造で互いに接着し、機能を助ける。健常組織に転移は存在しない。典型的に、しかし必ずしもそうではないが、疾患はその疾患の存在を示す特異的症状または徴候が付随する。このような症状または徴候の存在は、故に、組織、臓器または個体が疾患を有する指標である。これらの症状または徴候の変更はこのような疾患の進行の指標であり得る。疾患の進行は、典型的に疾患の悪化または改善を示すこのような症状または徴候の増減により特徴づけられる。疾患の「悪化」は、組織、臓器または生物が効率的にその機能を充足させる能力の減少により特徴づけられ、一方疾患の「改善」は、典型的に組織、臓器または生物が効率的にその機能を充足させる能力の増加により特徴づけられる。疾患を「発症するリスク」にある組織、臓器または個体は、健常状態であるが、疾患発現の可能性を示す。典型的に、疾患を発症するリスクは、そのような疾患の早期のまたは弱い徴候または症状が付随する。そのような場合、疾患はなお処置により予防され得る。疾患の例は、感染症、外傷性疾患、炎症性疾患、皮膚状態、内分泌疾患、腸疾患、神経障害、関節疾患、遺伝子障害、自己免疫性疾患および種々のタイプの癌を含むが、これらに限定されない。ここで定義する健常組織は、通常健常細胞を含むまたはそれからなる。

【0096】

用語「免疫疾患」は、本発明において、免疫系により誘発される疾患をいう。

【0097】

用語「新生物疾患」は、本発明において、細胞の異常増殖により特徴づけられる疾患をいい、腫瘍としても知られる。新生物疾患は、腫瘍増殖を引き起こす状態である。悪性腫瘍は癌であり、ゆっくりまたは急速に成長し、複数組織および臓器に転移または拡散するリスクがあり得る。「腫瘍」は、急速な、未制御細胞増殖により増殖し、新規増殖を開始させる刺激がなくなった後も増殖し続ける異常細胞または組織群を意味する。腫瘍は、正常組織との構造的秩序および機能的協調を一部または完全に欠き、通常良性または悪性であり得る明らかな組織塊を形成する。新生物疾患は癌に至り得て、ここで、癌タイプ疾患の例は、基底細胞癌、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、バーキットリンパ腫、頸部癌、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、食道癌、網膜芽細胞腫、胃(胃体)癌、消化器間質腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、中咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、胸膜肺芽腫、前立腺癌、咽頭癌、甲状腺癌および尿道癌を含むが、これらに限定されない。

【0098】

「ウイルスまたは細菌により引き起こされる疾患」はまたウイルスまたは細菌感染症とも称され得る。本発明において、疾患を引き起こすウイルスは、例えば、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)、ヒトサイトメガロウイルス(ＨＣＭＶ)、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)、Ｂ型肝炎ウイルス(ＨＢＶ)、Ｃ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)、ヒトパピローマウイルス感染(ＨＰＶ)、エプスタイン・バールウイルス(ＥＢＶ)、インフルエンザウイルスを構成する群から選択され得る。本発明において、疾患を引き起こす細菌は結核菌であり得る。この細菌により引き起こされる疾患は、故に、結核である。抗原結合タンパク質がウイルス抗原ペプチド、例えば、ＨＩＶペプチドを標的とするとき、抗原結合タンパク質をＨＩＶ処置に使用し得ることは、当業者には理解される。従って、ウイルスまたは細菌抗原ペプチドをターゲティングする抗原結合タンパク質は、故に、該抗原性ウイルスまたは細菌抗原ペプチドが由来するウイルスまたは細菌の処置に適する。

【0099】

用語「処置する」または「処置」は、治療的処置(すなわちある疾患を有する対象)および／または予防的または防止的処置(すなわちある疾患を発症しやすい対象)両方を含む。治療的処置は、障害または状態の１以上の症状の回復、軽減および／または進行の阻止を意味する。予防的処置は、障害または状態の１以上の症状の発生の予防を意味する。それ故に、処置は疾患の完全な治癒をもたらす処置だけでなく、疾患進行を減速させる、疾患発生を阻止または遅延させるおよび／または対象の生存を延長する処置もいう。

【0100】

本明細書において、用語「対象」、「個体」および「患者」は相互交換可能に使用され、本発明により利益を受け得るあらゆる哺乳動物をいう。特に、「個体」はヒトである。処置が予防である場合、個体は健常であり得る。

【0101】

用語「処置を必要とする対象」は、本発明において、疾患、例えば免疫疾患、新生物疾患またはウイルスにより引き起こされる疾患または細菌により引き起こされる疾患に罹患しているまたは罹患するリスクのある対象をいう。新生物疾患、例えば癌は、細胞の未制御のおよび／または不適切な増殖を含む。新生物障害または疾患は、例えば、腫瘍関連抗原(ＴＡＡ)の発現により特徴づけられる腫瘍疾患であり得る。

【0102】

用語「アミノ酸」は、本発明において、２０の天然または遺伝子によりコードされるアルファ－アミノ酸：アラニン(ＡｌａまたはＡ)、アルギニン(ＡｒｇまたはＲ)、アスパラギン(ＡｓｎまたはＮ)、アスパラギン酸(ＡｓｐまたはＤ)、システイン(ＣｙｓまたはＣ)、グルタミン(ＧｌｎまたはＱ)、グルタミン酸(ＧｌｕまたはＥ)、グリシン(ＧｌｙまたはＧ)、ヒスチジン(ＨｉｓまたはＨ)、イソロイシン(ＩｌｅまたはＩ)、ロイシン(ＬｅｕまたはＬ)、リシン(ＬｙｓまたはＫ)、メチオニン(ＭｅｔまたはＭ)、フェニルアラニン(ＰｈｅまたはＦ)、プロリン(ＰｒｏまたはＰ)、セリン(ＳｅｒまたはＳ)、スレオニン(ＴｈｒまたはＴ)、トリプトファン(ＴｒｐまたはＷ)、チロシン(ＴｙｒまたはＹ)およびバリン(ＶａｌまたはＶ)をいう。これら２０の天然アミノ酸の構造は、例えば、Stryer et al., Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company (2002)に示される。さらなるアミノ酸、例えばセレノシステインおよびピロリシンも遺伝子によりコードされ得る(Stadtman (1996) “Selenocysteine,” Annu Rev Biochem. 65:83-100 and Ibba et al. (2002) “Genetic code: introducing pyrrolysine,” Curr Biol. 12(13):R464-R466)。アミノ酸は、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を形成し得る。本明細書で使用する用語「ペプチド」は、ペプチド結合により形成されたアミノ酸の短ポリマーをいう。タンパク質と同じ化学(ペプチド)結合を有するが、一般に長さが短い。本明細書において使用する、ペプチドは、典型的に８～２５アミノ酸長を有する。

【0103】

用語「核酸」は、本発明において、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基または両者の一本または二本鎖オリゴマーまたはポリマーをいう。ヌクレオチド単量体は、核酸塩基、５炭素糖(例えばリボースまたは２’－デオキシリボースであるが、これらに限定されない)および１～３個のリン酸基からなる。典型的に、核酸は、個々のヌクレオチド単量体間のホスホジエステル結合を介して形成される。本発明において、用語核酸は、リボ核酸(ＲＮＡ)およびデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)分子を含むが、これらに限定されず、また他の結合を含む核酸の合成形態も含む(例えば、Nielsen et al. (Science 254:1497-1500, 1991)に記載のペプチド核酸)。典型的に、核酸は、一本または二本鎖分子であり、天然に存在するヌクレオチドからなる。核酸の一本鎖の記載はまた(少なくとも部分的に)相補鎖の配列を規定する。核酸は一本鎖または二本鎖でよく、または二本および一本鎖配列両方の部分を含み得る。例として、二本鎖核酸分子は３’または５’オーバーハングを有し得て、そのようなものとして、全長にわたり完全に二本鎖である必要はないまたはそう想定されない。核酸は生物学的、生化学的または化学的合成方法またはＲＮＡの増幅および逆転写の方法を含むが、これに限定されない当分野で知られる方法の何れかにより得ることができる。用語核酸は、染色体または染色体部分、ベクター(例えば、発現ベクター)、発現カセット、ネイキッドＤＮＡまたはＲＮＡポリマー、プライマー、プローブ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、ｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ミクロＲＮＡ(ｍｉＲＮＡ)または低分子干渉ＲＮＡ(ｓｉＲＮＡ)を含む。核酸は、例えば、一本鎖、二本鎖または三本鎖であり得て、ある特定の長さに限定されない。特に断らない限り、特定の核酸配列は、明示的に示す任意の配列に加えて、相補的配列を含むまたはコードする。

【0104】

用語「ベクター」は、本発明において、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはポリペプチドおよび目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む混合物をいい、細胞に導入できるまたはその中に含まれているタンパク質および／または核酸を導入できる。ベクターの例は、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体を含むが、これらに限定されない。ベクターを使用して、例えば外来または異種ＤＮＡなどの目的の遺伝子産物を宿主細胞に導入できる。ベクターは、宿主細胞におけるベクターの自律複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含み得る。外来ＤＮＡは、宿主細胞で天然に見られず、例えば、ベクター分子を複製する、選択可能またはスクリーニング可能マーカーをコードするまたは導入遺伝子をコードするＤＮＡである、異種ＤＮＡをいう。宿主細胞に入ると、ベクターは宿主染色体ＤＮＡと無関係にまたは同時に複製でき、数コピーのベクターおよびその挿入ＤＮＡが産生され得る。さらに、ベクターはまた挿入ＤＮＡのｍＲＮＡ分子への転写を可能にする必要な要素も含み得るかまたは他の方法で挿入ＤＮＡの複数コピーのＲＮＡへの複製を引き起こす。ベクターはさらに目的の遺伝子の発現を制御する「発現制御配列」を包含し得る。典型的に、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、インスレーターまたはリプレッサーなどのポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。１以上の目的の遺伝子産物をコードする１を超えるポリヌクレオチドを含むベクターにおいて、発現は、１以上の発現制御配列により一緒にまたは別々に制御され得る。より具体的に、ベクターに含まれる各ポリヌクレオチドは別々の発現制御配列により制御され得るかまたはベクターに含まれる全ポリヌクレオチドは単一発現制御配列により制御され得る。単一発現制御配列により制御される単一ベクターに含まれるポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレームを形成し得る。ある発現ベクターは、さらに発現ｍＲＮＡの半減期を延長するおよび／またはｍＲＮＡのタンパク質分子への翻訳をさせる挿入ＤＮＡに隣接した配列要素を含む。故に、挿入ＤＮＡによりコードされるｍＲＮＡおよびポリペプチドの分子の多くは、迅速に合成され得る。このようなベクターは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどの制御要素を含み、対象への投与により該ポリペプチドの発現を引き起こすかまたは指示し得る。動物細胞のための発現ベクターで使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例は、ＳＶ４０の早期プロモーターおよびエンハンサー(Mizukami T. et al. 1987)、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターおよびエンハンサー(Kuwana Y et al. 1987)、免疫グロブリンＨ鎖のプロモーター(Mason JO et al. 1985)およびエンハンサー(Gillies SD et al. 1983)などを含む。動物細胞のためのあらゆる発現ベクターを、ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子が挿入および発現され得る限り、使用できる。適当なベクターの例は、pAGE107(Miyaji H et al. 1990)、pAGE103(Mizukami T et al. 1987)、pHSG274(Brady G et al. 1984)、pKCR(O’Hare K et al. 1981)、pSG1ベータd2-4-(Miyaji H et al. 1990)などを含む。プラスミドの他の例は、複製起点を含む複製プラスミドまたは統合的プラスミド、例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲを含む。

【0105】

用語「Ｔ細胞受容体ライブラリー」は、本発明において、多数の異なるＴ細胞受容体(ＴＣＲ)タンパク質またはそのフラグメントを含み、ここで、各ＴＣＲタンパク質またはそのフラグメントが異なる、ライブラリーをいう。

【0106】

本明細書特許請求の範囲および明細書をとおして頻繁に使用される用語の略語：

【表3】

【0107】

実施態様
次に、本発明の種々の態様をより詳細に定義する。このように定義される各態様は、明らかに反する指示がない限り、任意の他の１以上の態様と組み合わせ得る。特に、好ましいまたは有利であるとして定義されるあらゆる特性は、好ましいまたは有利あるとして示される任意の１以上の他の特性と組み合わせ得る。

【0108】

本発明の第一の態様は、ペプチドＡ(ＰＡ)と主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)分子の複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質を表面に発現する免疫細胞を選択する方法であって、次の：
(ｉ)種々の抗原結合タンパク質を発現する複数の免疫細胞を提供し；
(ii)複数の免疫細胞と
(ａ)ＭＨＣ分子１(Ｍ１)とペプチドＡ(ＰＡ)を含む複合体１Ａおよび
(ｂ)Ｍ１とペプチドＢ(ＰＢ)を含む複合体１Ｘ
を含む第一組成物を接触させ；
(iii)複数の免疫細胞と
(ａ)ＭＨＣ分子２(Ｍ２)とＰＡを含む複合体２Ａおよび
(ｂ)Ｍ２とペプチドＣ(ＰＣ)を含む複合体２Ｘ
を含む第二組成物を接触させ；
(iv)複数の免疫細胞から複合体１Ａ；特に複合体１Ａおよび複合体２Ａ両方に特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現する細胞を選択する
工程を含み、ここで、複合体１Ａおよび２Ａではなく、複合体１Ｘおよび２Ｘが規定の刺激、好ましくは規定の化学的および／または物理的刺激により解離し；そして、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列は少なくとも１個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５個、６個、７個または８個のアミノ酸が異なるものである、方法に関する。ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列が大きく異なることが、小さく異なるよりも好ましい。発現「ＰＢおよびＰＣは少なくとも１個のアミノ酸が異なる」は、ＰＢおよびＰＣが少なくとも１個のタンパク質を構成するアミノ酸が異なることを意味することを意図する。下記のとおり、ある実施態様において、ＰＢおよびＰＣは、条件付きで反応性のアミノ酸アナログであり得る条件付きで反応性の基を含む。条件付きで反応性のアミノ酸アナログでのみ異なり、タンパク質を構成するアミノ酸で異ならないＰＢおよびＰＣのペアは、本発明で必要な「ＰＢおよびＰＣは少なくとも１個のアミノ酸異なる」との基準を満たさない。

【0109】

第一組成物は、(ｉ)複合体１Ｘ(Ｍ１およびＰＢを含む)を提供し、(ii)ＰＡを提供し、そして(iii)既定の刺激を提供して、それによりＰＢのＭ１からの解離およびＰＡのＭ１への結合を生じさせ、複合体１Ａの形成をもたらすことにより得られ、好ましくはここで主に複合体１Ａおよび残存量の複合体１Ｘを含む組成物が得られる。好ましい実施態様において、既定の刺激はＰＢにおける共有結合を切断させ、それによりＰＢからＭ１を解離させる。

【0110】

第二組成物は(ｉ)複合体２Ｘ(Ｍ２およびＰＣを含む)を提供し、(ii)ＰＡを提供し、そして(iii)既定の刺激を提供して、それによりＰＣのＭ２からの遊離およびＰＡのＭ２への結合を生じさせ、複合体２Ａの形成をもたらすことにより得られ、好ましくはここで主に複合体２Ａおよび残存量の複合体２Ｘを含む組成物が得られる。好ましい実施態様において、既定の刺激はＰＣにおける共有結合を切断させ、それによりＰＣをＭ２から遊離させる。

【0111】

好ましくは、本発明の第一の態様の方法は、複合体１Ｘを規定の刺激に付して複合体１Ａを産生し、ＰＡを提供する；および複合体２Ｘを規定の刺激に付して複合体２Ａを産生し、ＰＡを提供する工程を含む。

【0112】

「残存量の複合体１Ｘまたは２Ｘ」は、少なくとも０.１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％および／または２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％または５％未満の複合体１Ｘまたは２Ｘが、それぞれ第一または第二組成物に含まれることを意味する。

【0113】

「主に複合体１Ａまたは２Ａ」は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％および／または９９.９％、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％または８５％未満の複合体１Ａまたは２Ａが、それぞれ第一または第二組成物に含まれることを意味する。

【0114】

ある実施態様において、免疫細胞はＴ細胞またはＢ細胞である。免疫細胞がＴ細胞であるのが好ましい。より好ましくは、Ｔ細胞はＣＤ８ Ｔ細胞である。ある実施態様において、抗原結合タンパク質はＴＣＲ、ＢＣＲまたはその抗原結合フラグメントである。抗原結合タンパク質がＴＣＲであるのが最も好ましい。

【0115】

既定の化学的および／または物理的刺激は、温度上昇、ｐＨ変化、過ヨウ素酸との接触、亜ジチオン酸との接触および光、特にＵＶ照射またはこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。既定の刺激が温度上昇を含む／であるならば、温度変化が１０℃未満から２０℃超、より好ましくは１０℃未満、特に１～１０℃から２５～４５℃であるのが好ましい。既定の刺激がｐＨ変化を含む／であるならば、変化は天然ｐＨから酸性またはアルカリ性ｐＨ、好ましくは約７～８から約５～６であるのが好ましい。既定の刺激が亜ジチオン酸との接触であるならば、ＰＢおよび／またはＰＣは亜ジチオン酸活性化可能基を含む。既定の刺激が過ヨウ素酸との接触であるならば、ＰＢおよび／またはＰＣは過ヨウ素酸活性化可能基を含む。既定の刺激がＵＶ照射であるならば、ＰＢおよび／またはＰＣは光活性化可能基を含む。

【0116】

好ましい実施態様において、既定の化学的および／または物理的刺激は過ヨウ素酸との接触、亜ジチオン酸との接触およびＵＶ照射からなる群から選択される。ある実施態様において、既定の刺激を、度上昇および／またはｐＨ変化と組み合わせて、刺激を増強する。最も好ましい実施態様において、既定の刺激はＵＶ照射である。当業者は、例えばRodenko et al., 2006、Toebes et al. 2006、Bakker et al., 2008、Chang et al, 2013およびFrosig et al., 2015に記載の、ペプチドリガンド交換のための適当なＵＶ刺激を十分知っている。

【0117】

Ｍ１および／またはＭ２、特にＭ１およびＭ２がＭＨＣ－Ｉ分子であるのが好ましい。Ｍ１およびＭ２が同じアレルのＭＨＣ－Ｉ分子であるまたは同じアレルのＭＨＣ誘導体または抗原ペプチド結合フラグメントであるのがさらに好ましい。ＭＨＣ－Ｉ分子が天然に存在するＭＨＣ分子またはその抗原ペプチド結合フラグメントであるのが好ましい。ある例において、ＣＤ８への結合が増加または減少したＭＨＣバリアントがＭＨＣ誘導体として使用され得る。

【0118】

Ｍ１およびＭ２はペプチド特異性は異ならない。換言すると、Ｍ１およびＭ２は同じペプチドリガンドに結合する。特に、Ｍ１およびＭ２は本質的に同じ親和性でＰＡに結合する。しかしながら、Ｍ１およびＭ２は、Ｍ１およびＭ２がＭＨＣ－Ｉ分子であるならば、アルファ３ドメインなどの、ペプチド結合に重大ではない領域／ドメインが異なり得る。好ましい実施態様において、Ｍ１およびＭ２は同一である。重要なことに、これは、さらに下記のとおり、通常Ｍ１およびＭ２が異なる担体および／または検出可能標識に結合することを排除しない。

【0119】

Ｍ１および／またはＭ２が担体に直接的または間接的に結合するのが好ましい。担体は細胞または合成担体であり得る。細胞は抗原提示細胞(ＡＰＣ)、好ましくはヒトＡＰＣであり得る。合成担体は粒子、タンパク質、特にストレプトアビジン、フィラメント、マイクロアレイチップおよびＥＬＩＳＡプレートから選択され得る。粒子はミクロ粒子、ナノ粒子、マイクロビーズまたはナノビーズであり得る。このような粒子は、通常ポリマー製である。マイクロビーズは、磁気または常磁性ビーズであり得る。合成担体は、カップリング残基のペアの第一メンバーを含むまたはそれからなり得る。ある実施態様において、合成担体は、カップリング残基のペアの第一メンバーで共有結合または非共有結合によって被覆され得る。カップリング残基のペアの第二メンバーは、Ｍ１またはＭ２に共有結合でまたは非共有結合でカップリングされる。好ましい第一および第二カップリング残基のペアは、ストレプトアビジンおよびビオチンを含む。当業者は、カップリング残基の他のペアを知っている。好ましい実施態様において、合成担体はストレプトアビジンで被覆され、これはビオチン部分を含むＭ１またはＭ２の固定化を可能とする。逆に、ビオチンで被覆された合成担体は、ストレプトアビジン部分を含むＭ１またはＭ２の固定化を可能とする。他の好ましい実施態様において、合成担体は、第二メンバーの少なくとも２個の結合部位、好ましくは３個、４個、５個、６個、７個または８個の結合部位、特に好ましくは４個の結合部位を有するカップリング残基のペアの第一メンバーからなり、２以上のＭ１(またはＭ２)の複合体の形成を可能とし、ここで、各Ｍ１(またはＭ２)は、カップリング残基のペアの第二メンバーに共有結合でまたは非共有結合で、好ましくは共有結合でカップリングされる。好ましい態様において、ストレプトアビジンはカップリング残基のペアの第一メンバーであり、ビオチンはカップリング残基のペアの第二メンバーである。ストレプトアビジンはビオチンに対する４個の結合部位を有する。故に、ビオチンを含むペプチドおよびＭ１(またはＭ２)の複合体がストレプトアビジンと接触したら、４個のペプチドが充填されているＭ１(またはＭ２)分子がストレプトアビジンに非共有結合で結合する可溶性四量体が形成される。このような可溶性多量体化ｐＭＨＣ複合体は、本発明の方法の工程(iii)に特に有用である。

【0120】

マイクロビーズの好ましい実施態様は、ストレプトアビジンで被覆されたポリスチレンビーズである。ペプチド－ＭＨＣ複合体が結合したミクロ粒子、例えばストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズは、人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)とも称され得る。故に、特にＭ１および／またはＭ２は、人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)に含まれる。

【0121】

特に好ましい実施態様において、Ｍ１はＡＰＣに結合するまたはミクロ粒子に結合するおよび／またはＭ２ビオチン部分を含むおよびストレプトアビジンに結合する、特に各々ビオチン部分を含む４個のＭ２はストレプトアビジンタンパク質のストレプトアビジンタンパク質に結合し、故にＭＨＣ四量体を形成する。

【0122】

好ましい実施態様において、Ｍ１および／またはＭ２、好ましくはＭ２またはＭ１および／またはＭ２、好ましくはＭ２が結合する担体は検出可能標識を含む。当業者はＭＨＣ分子または担体を標識する方法を熟知している。検出可能標識は同一でも異なってもよい。検出可能標識は蛍光標識からなる群から選択され得て、好ましくは蛍光標識はキサンテン、アクリジン、オキサジン、シアニン、スチリル色素、クマリン、ポルフィリン、金属－リガンド－複合体、蛍光タンパク質、ナノ結晶、ペリレンおよびフタロシアニン、より好ましくはストレプトアビジン－フィコエリスリン(SA-PE)、ストレプトアビジン－フィコエリスリン－シアニン５(SA-PE-Cy5)、ストレプトアビジン－アロフィコシアニン(SA-APC)、ストレプトアビジン－アロフィコシアニン－シアニン７(SA-APC-Cy7)、ストレプトアビジン－ペリジニンクロロフィル－Ａタンパク質(SA-PerCP)、ストレプトアビジン－ペリジニンクロロフィル－Ａタンパク質－シアニン５.５(SA-PerCP/Cy5.5)、ストレプトアビジン－フィコエリスリン－シアニン７(SA-PE-Cy7)、ストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット４２１(SA-BV421)、ストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット５１０(SA-BV510)、ストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット５７０(SA-BV570)、ストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット６０５(SA-BV605)、ストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット６５０(SA-BV650)、ストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット７１１、ストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット７８５(SA-BV785)、ストレプトアビジンVioBlue(SAVioBlue)、ストレプトアビジンアロフィコシアニンVio770(SA APC Vio770)、ストレプトアビジンペリジニンクロロフィル－Ａタンパク質Vio700(SA PerCPVio700)、ストレプトアビジンフィコエリスリンVio 770(SA PE Vio770)またはストレプトアビジン－フィコエリスリン－Dazzle594；磁気標識；ＲＮＡバーコード；ＤＮＡバーコード；および放射性標識からなる群から選択され得る。磁気標識は、特定の表面抗原に対する抗体で被覆できる磁気ビーズまたは磁気ナノ粒子を含む。好ましい実施態様において、標識は、フローサイトメトリー分析、好ましくは蛍光活性化細胞分類(ＦＡＣＳ)または微小流体分析または磁気活性化細胞分類(ＭＡＣＳ)などの分取分類分析により検出可能である。

【0123】

好ましい実施態様において、工程(ｉ)で提供される複数の免疫細胞は健常対象または疾患に罹患している対象の末梢血から得るまたは末梢血の画分から得る。疾患は免疫疾患、新生物疾患、好ましくは癌および／または腫瘍、ウイルスにより引き起こされる疾患または細菌により引き起こされる疾患からなる群から選択されるのが好ましい。好ましくは、ウイルスにより引き起こされる疾患はウイルス感染症であり；そして細菌により引き起こされる疾患は細菌感染症である。好ましくは、ウイルス感染症はＨＩＶ、ＨＣＭＶ、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルスからなる群から選択されるウイルスにより引き起こされる。より好ましくは、ウイルス感染症はＨＩＶにより引き起こされる。好ましくは、細菌感染症は結核菌により引き起こされる。このような疾患は結核である。より好ましい実施態様において、疾患は癌および／または腫瘍である。最も好ましい実施態様において、疾患はＴＡＡ提示癌などの癌である。

【0124】

好ましくは、画分は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＣＤ８ Ｔ細胞またはＣＤ４ Ｔ細胞に富む。免疫細胞濃縮画分は、好ましくは、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４およびＣＤ１９からなる群から選択される、１以上の免疫細胞特異的表面マーカーの検出可能な標識により選択されることが想定され得る。好ましい実施態様において、工程(ｉ)で提供される複数の細胞は、表現型決定されているＴ細胞である。Ｔ細胞の表現型決定は、好ましくは１以上のＴ細胞マーカー、好ましくはＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７(ＣＣＲ７)、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＴＮＦα、ＩＬ７Ｒおよびテロメア長からなる群から選択されるものの存在の定量的または定性的決定を含む。

【0125】

好ましい実施態様において、工程ii)はさらに複数の細胞と共刺激分子、好ましくは抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１３７および／または抗ＣＤ１３４、より好ましくは抗ＣＤ２８および／または抗ＣＤ３に対する抗体の接触を含む；および／または工程ii)はさらに複数の細胞とＩＬ－２および／またはＩＬ－１２の接触を含む；および／または工程ii)を少なくとも３日間、好ましくは少なくとも７日間、より好ましくは少なくとも１０日間実施する。工程(ii)の好ましい実施態様は免疫細胞の刺激、好ましくはＴ細胞の刺激である。工程(ii)の特に好ましい実施態様は、ａＡＰＣを使用するＴ細胞の刺激である。

【0126】

好ましい実施態様において、工程iii)は、さらに、複数の細胞と生存能色素および／または標識表面マーカー；好ましくはＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８および／またはＣＤ６９；より好ましくはＣＤ３および／またはＣＤ８の接触を含む。

【0127】

工程iv)で選択される細胞は、単細胞でも細胞集団でもよい。好ましい実施態様において、工程iv)は、検出、特徴づけおよび単離の少なくとも１個および所望により単細胞または細胞集団の培養を含む。

【0128】

工程(iii)および(iv)の好ましい実施態様は、それぞれ多量体染色およびフローサイトメトリーによる検出である。本発明において、多量体染色は、四量体またはデキストラマーなどの標識ペプチド：ＭＨＣ多量体で細胞表面に発現された抗原結合タンパク質を染色することをいう。ペプチド：ＭＨＣ多量体は、複合体２Ｘ(すなわちＰＣ：ＭＨＣ複合体)から産生された複合体２Ａ(すなわちＰＡ：ＭＨＣ複合体)を単量体として含む。染色細胞は、フローサイトメトリーにより検出できる。好ましくは、ペプチド：ＭＨＣ多量体は蛍光標識されている。多量体染色アッセイの例は、材料および方法セクションに記載する。多量体染色の分析は、少なくとも一次元(複合体２Ａについて)であるが、さらなる次元、例えば２個の異なるフルオロフォアでの同じペプチド：ＭＨＣ多量体標識を用いる二次元または１以上の次元を使用する類似ペプチドのための染色をも含み得る。

【0129】

工程(iii)および(iv)の他の可能性のある実施態様は、機能的アッセイ、例えば、ＩＦＮγ放出アッセイなどのＴＣＲ活性化アッセイである。

【0130】

本発明の第一の態様による方法のある好ましい適用は、抗原ペプチド、特にＴＡＡの免疫原性に関する情報を得ることである。このような実施態様において、工程(ii)は刺激工程であり、工程(iii)および(iv)は一体となって読み出し工程(多量体染色およびフローサイトメトリーによる読み出しを含む)である。本発明者らは、ｐＨＬＡ複合体および抗ＣＤ２８抗体を搭載したａＡＰＣでのＣＤ８＋ Ｔ細胞の反復刺激を含む、インビトロ免疫学的標的バリデーションプラットフォームを設定した。続いて、ｐＨＬＡ複合体に反応性のＣＤ８＋ Ｔ細胞数を定量する。

【0131】

本発明の第一の態様の方法の他の好ましい適用は、ある抗原ペプチド、特にＴＡＡに特異的なＴ細胞の単離である。このような実施態様において、工程(ii)は刺激工程であり、工程(iii)は、好ましくはＦＡＣＳによる、単離工程である。

【0132】

本発明の第一の態様の方法において、表面にＰＡとＭＨＣ分子の複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現する免疫細胞が選択される。本発明において、故に、ＰＡは「標的ペプチド(リガンド)」または「目的のペプチド(リガンド)」または「レスキューペプチド」と記載され得る。対照的に、ＰＢおよびＰＣの両者は「条件付きペプチド(リガンド)」である。Ｍ１またはＭ２と一緒になって、ＰＢおよびＰＣは条件付きｐＭＨＣ複合体(それぞれ複合体１Ｘおよび複合体２Ｘ)を形成する。これらの複合体は、既定の化学的および／または物理的刺激への暴露により解離するよう設計される。解離すると、ＰＡはＭ１およびＭ２のペプチド結合ポケットと結合し、それぞれ複合体１Ａおよび２Ａの形成に至る。

【0133】

ＰＡ、ＰＢおよび／またはＰＣ、好ましくはＰＡ、ＰＢおよびＰＣは、ＭＨＣ－Ｉ結合ペプチドであるのが好ましい。ＭＨＣ－Ｉ結合ペプチドは、８～１２アミノ酸、好ましくは８～１１アミノ酸の長さを有する。

【0134】

ＰＡ、ＰＢおよびＰＣは、同じＨＬＡアロタイプにより提示される。ＰＡ、ＰＢおよびＰＣを提示するＨＬＡアロタイプは、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-J、HLA-K、HLA-Lからなる群から選択され得る。好ましくは、HLA-Aタンパク質はHLA-A1、HLA-A2、HLA-A3およびHLA-A11からなる群から選択される。好ましいHLA-Aアレルは、HLA-A*02:01；HLA-A*01:01、HLA-A*03:01またはHLA-A*24:02である。好ましいHLA-Bアレルは、HLA-B*07:02；HLA-B*08:01、HLA-B*15:01、HLA-B*35:01またはHLA-B*44:05である。

【0135】

本発明において、抗原ペプチドが結合するＨＬＡアレルは、抗原ペプチドの名称に続いて示される(カッコ内)。例えば(A*03)は、抗原ペプチドがHLA-A*03に結合することを示す。

【0136】

ＰＡは、ウイルス抗原ペプチド、細菌抗原ペプチドおよび腫瘍関連抗原ペプチド(ＴＡＡ)などの抗原ペプチドから選択される。最も好ましい実施態様において、ＰＡはＴＡＡである。本発明の方法でレスキューペプチド／目的のペプチドとして使用し得るペプチドの例は、HADV-014(A*03)、HIV-007(B*07)(ウイルスペプチド)およびMLA-001(A*02)(ＴＡＡ)である。

【0137】

本発明のある実施態様において、ＰＢおよびＰＣは、温度上昇および／またはｐＨ変化によりｐＭＨＣ複合体から解離するが、好ましくはＰＡはしない。本発明の好ましい実施態様において、ＰＢおよびＰＣは、該既定の化学的および／または物理的刺激で活性化されたとき、それぞれＰＢまたはＰＣのペプチド主鎖内の共有結合を切断させる、条件付きで反応性の基を含むが、ＰＡは含まない。切断は、ｐＭＨＣ複合体からのＰＢおよびＰＣのフラグメントの解離をもたらす。このような条件付きで反応性の基はまた開裂可能な条件付きで反応性の基とも称され得る。ある実施態様において、開裂可能な条件付きで反応性の基は、光活性化可能基、過ヨウ素酸活性化可能基および亜ジチオン酸活性化可能基からなる群から選択される。好ましい実施態様において、亜ジチオン酸活性化可能基はアゾベンゼン部分を含む。好ましい実施態様において、過ヨウ素酸活性化可能基は１,２－ジヒドロキシ部分またはその機能的等価物を含む。過ヨウ素酸および１,２－ジヒドロキシ系と等価の別の系がある。このような系は、過ヨウ素酸開裂可能な部位を含む１－アミノ－２－ヒドロキシ系およびポリオール、炭水化物、糖アミノ酸ハイブリッドである。ジヒドロキシエチレンペプチドアイソステアは、Thaisrivongs et al., 1991, Thaisrivongs et al., 1993およびOjima et al., 1998に記載される。他の過ヨウ素酸感受性化合物である４－アミノ－４－デオキシ－L-トレオン酸(ジオール含有アミノ酸構成要素)の合成は、Musich and Rapoport, 1978に記載される。開裂可能な条件付きで反応性の基は、光活性化可能基、特にＵＶ感受性基、好ましくは３－アミノ－３－(２－ニトロ)フェニル－プロピオン酸またはその光活性化可能構造的等価物であるのが好ましい。

【0138】

ＰＢおよびＰＣは、１個または２個、好ましくは１個の開裂可能な条件付きで反応性の基を含み得る。ＰＢおよびＰＣが１個の開裂可能な条件付きで反応性の基を含むとき、ＰＢおよびＰＣは、開裂可能な条件付きで反応性の基の各側で少なくとも１個、２個、３個または４個のアミノ酸が異なるのが好ましい。ＰＢおよびＰＣに含まれる開裂可能な条件付きで反応性の基は同一でも異なってもよい。本発明の最も好ましい実施態様において、ＰＢおよびＰＣはＵＶ感受性基を含むが、ＰＡは含まない。

【0139】

ＵＶ交換テクノロジーに使用するための、親ペプチドからＵＶ感受性ペプチドの産生は、Toebes et al. 2006、Bakker et al., 2008、Chang et al, 2013およびFrosig et al., 2015に記載される。

【0140】

本発明の第一の態様の方法での使用に適する条件付きペプチドおよび特にＵＶ感受性ペプチドを次の段落に記載する。

【0141】

ＭＨＣ分子と条件付きペプチドの間の結合は、標準再折りたたみ技術(好ましくはβ２ミクログロブリン存在下)による条件付きｐＭＨＣ複合体の形成の成功を確実にし、かつ既定の刺激の非存在下で安定なｐＭＨＣ複合体を提供するのに十分強いのが好ましい。ＭＨＣ分子と条件付きペプチドの間の結合は、好ましくは既定の刺激への暴露後／時、条件付きペプチド(またはそれらのフラグメント)がＭＨＣ分子から解離するようなものでなければならない。ペプチドとＭＨＣ分子の結合強度は、絶対的または相対的Syfpeithiスコアまたは、NetMHCpanランクを使用して、記載され得る。条件付きペプチドが開裂可能な条件付きで反応性の基を含むとき、SyfpeithiスコアおよびNetMHCpanランクは親ペプチドについてのみ決定され得るが、条件付きペプチドにはしない。しかしながら、条件付きペプチドがＭＨＣ分子に対して親ペプチドと類似の結合強度を有することが期待され得る。

【0142】

「Syfpeithi」は、Ｔ細胞エピトープの予測を可能とするための、あるペプチド内の全アミノ酸を評価するスコアリング系である。「Syfpeithiスコア」は、次の規則により計算され得る：あるペプチドのアミノ酸は、アンカー、補助的アンカーまたは好ましい残基により、特定の値が与えられる。理想的アンカーは１０点、異常なアンカーは６～８点、補助的アンカーは４～６および好ましい残基は１～４点を与える。結合能に負に影響すると考えられるアミノ酸は、－１～－３の値を与える(Rammensee et al., 1999)。「相対的Syfpeithiスコア」は、特異的アレルに対する最高スコアのパーセンテージとして計算する。

【0143】

「NetMHCpan」は、人工神経ネットワークを使用するペプチド－ＭＨＣ－Ｉ相互作用の親和性の定量的予測をもたらす他のスコアリング系である(Nielsen et al., 2007)。

【0144】

条件付きペプチドが条件付きで反応性の基を含むのが好ましい。好ましい実施態様において、条件付きで反応性の基は、親ペプチドのアミノ酸残基を置き換える条件付きで反応性のアミノ酸アナログである。このような実施態様において、アミノ酸アナログは、ＭＨＣ結合のためにあるアミノ酸を必要としない位置(この位置でのアミノ酸選択性を欠く)であるのが好ましい。好ましくは、アミノ酸アナログは、最初または最後の位置を除くＰＢおよび／またはＰＣのアミノ酸配列の任意の位置に存在する。既定の刺激により、条件付きで反応性のアミノ酸アナログが、刺激への接近性を確実とするために、溶媒暴露位置に位置する必要があることもある。

【0145】

複合体１Ｘおよび／または２Ｘ(ＭＨＣ分子とＰＢおよび／またはＰＣにより形成)が、ＵＶ暴露非存在下で高再折りたたみ収率、高安定性を有し、低凝集率；および／または低分解率であるならば、さらに好ましい。再折りたたみ収率は、例えばNanodropまたはBradfordアッセイにより決定され得る。用語「安定性」は、本発明において、ｐＭＨＣ複合体におけるペプチドとＭＨＣ分子の結合の安定性をいう。ｐＭＨＣ複合体の安定性、例えば、室温(約２０℃)で例えば１時間、ＰＢＳなどの緩衝液中の安定性を、ＥＬＩＳＡにより評価できる。凝集率および分解率は、文献に記載され、例えばJones et al., 1993にレビューされている、種々の分析技術を使用して、定性的および／または定量的に評価され得る。凝集および分解を測定するために、ｐＭＨＣ複合体を含むサンプルを、選択した時間、負荷条件に曝し、続いて適切な分析技術を使用して定量的および所望により定性的分析することができる。本発明において、これらの方法は、特に、濁度(例えば動的光散乱法(ＤＬＳ)または光遮蔽法(ＬＯ)により)の測定によりおよび／または目視検査(例えば色および透明度の決定により)の測定による、分解の評価または凝集物形成(例えばサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)を使用して)の評価をいう。

【0146】

他の重要な特性は、既定の刺激への暴露に続くペプチド主鎖の切断後の高解離率である。解離率は、ＵＶ交換で使用したＵＶ刺激後の、しかし、レスキューペプチド非存在下の、ｐＭＨＣ複合体の量の測定により決定され得る(実施例１参照)。

【0147】

条件付きペプチド候補が、条件付きリガンド交換における使用、特に本発明の方法における使用に適するか否かの決定は、ペプチドとＭＨＣ分子の結合強度、再折りたたみ収率、ＵＶ暴露非存在下の安定性、凝集率、分解率および切断後の解離率の上記基準の組み合わせに依存することを当業者は認識する。故に、再折りたたみ収率が低いが、凝集および分解率も低い条件付きペプチドも、本発明の方法における使用に適する可能性があることは理解される。

【0148】

本発明の第一の態様の方法に使用するためのペプチドのさらなる詳述は、下に見られ得る(本発明の第二の態様で提供されるペプチドの記載参照)。

【0149】

本発明者らは、驚くべきことに、ＵＶ暴露後、相当量の条件付きｐＭＨＣ複合体が残存し続けることを示した(実施例１)。この残存量の条件付きｐＭＨＣ複合体は、条件付きｐＭＨＣ複合体に存在する条件付きペプチドが弱い免疫原性であっても(実施例３)、特異的免疫細胞(Ｔ細胞)増殖を刺激するのに十分である(実施例２)。工程(ii)における条件付きｐＭＨＣ複合体に特異的な免疫細胞(Ｔ細胞)の選択を防止するために、本発明者らは、工程(ｉ)および(ii)において異なる条件付きペプチド(すなわち異なる条件付きｐＭＨＣ複合体)の使用を定義する、本発明の第一態様による発明的方法を提供する(実施例４)。

【0150】

ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列が異なるのが、結果的に本発明の鍵となる特性である。幾つかの場合、１個だけのアミノ酸の差異が十分であり得る。本発明者らは、１個だけのアミノ酸差異が、第一ペプチドを含むｐＭＨＣ複合体で刺激したＴ細胞が、第二ペプチドを含むｐＭＨＣ複合体で検出されることを阻止するのに十分であることを示している(図４)。しかしながら、ＰＢおよびＰＣは、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個のアミノ酸が異なるのが好ましく、ＰＢおよびＰＣが少なくとも５個、６個、７個または８個のアミノ酸異なるのがより好ましい(数が多いほど好ましい)。換言すると、ＰＢおよびＰＣは、好ましくは８～１２アミノ酸長を有するため、ＰＢおよびＰＣは９０％未満のアミノ酸同一性、好ましくは８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％または２０％未満のアミノ酸同一性を有するのが好ましい。ＰＢおよびＰＣが９０％未満のアミノ酸類似性、好ましくは８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％または２０％未満のアミノ酸類似性を有するのも好ましい。

【0151】

好ましい実施態様において、ＰＢおよびＰＣは、配列番号１～６６、より好ましくは配列番号１～１８、２１～３８、４０～５６および５８～６６、より好ましくは配列番号３～１８、２１～３８、４０～４８、５１～５６および５９～６６、さらにより好ましくは配列番号３～１４、１６～１８、２１、２２、２４～２６、２９～３８、４０～４２、４４、４６～４８、５１～５６および５９～６６のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群から選択される。これらのペプチドの利点は、本発明の第二の態様に関して下に記載される。

【0152】

好ましい実施態様において、
ｉ) Ｍ１およびＭ２はHLA-A*01:01またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列はMUC16-010、MUC16-011、RNF213-010、RNF213-011、AXIN1-003、AXIN1-004、CLTC-002、CLTC-003、CLTC-004、好ましくはCLTC-002およびMUC16-010からなる群から選択され、より好ましくはＰＢはCLTC-002であり、かつＰＣはMUC16-010であり、ここで、MUC16-010は配列番号１を含むかまたはそれからなり、MUC16-011は配列番号２を含むかまたはそれからなり、RNF213-010は配列番号３を含むかまたはそれからなり、RNF213-011は配列番号４を含むかまたはそれからなり、AXIN1-003は配列番号５を含むかまたはそれからなり、AXIN1-004は配列番号６を含むかまたはそれからなり、CLTC-002は配列番号７を含むかまたはそれからなり、CLTC-003は配列番号８を含むかまたはそれからなり、そしてCLTC-004は配列番号９を含むかまたはそれからなる；または
ii) Ｍ１およびＭ２はHLA-A*02:01またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列はDDX5-002、DDX5-003、DDX5-004、DDX5-005、DDX5-006、RPL19-003、RPL19-004、RPL19-005およびFLUM-003、好ましくはDDX5-002、DDX5-003、DDX5-004、DDX5-005、DDX5-006、RPL19-003、RPL19-004、RPL19-005、より好ましくはDDX5-005およびRPL19-005からなる群から選択され、さらにより好ましくはＰＢはDDX5-005であり、かつＰＣはRPL19-005であり、ここで、DDX5-002は配列番号１０を含むかまたはそれからなり、DDX5-003は配列番号１１を含むかまたはそれからなり、DDX5-004は配列番号１２を含むかまたはそれからなり、DDX5-005は配列番号１３を含むかまたはそれからなり、DDX5-006は配列番号１４を含むかまたはそれからなり；RPL19-002は配列番号１６を含むかまたはそれからなり、RPL19-003は配列番号１７を含むかまたはそれからなり、RPL19-002は配列番号１８を含むかまたはそれからなり；FLUM-003は配列番号１９を含むかまたはそれからなる；または
iii) Ｍ１およびＭ２はHLA-A*03:01またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列はUVLA3-001、GIBB-002、GIBB-003、HNRNPR-002、HNRNPR-003およびHNRNPR-004、好ましくはGIBB-002およびHNRNPR-002からなる群から選択され、より好ましくはＰＢはGIBB-002であり、かつＰＣはHNRNPR-002であり、ここで、UVLA3-001は配列番号２０を含むかまたはそれからなり、GIBB-002は配列番号２１を含むかまたはそれからなり、GIBB-003は配列番号２２を含むかまたはそれからなり、HNRNPR-002は配列番号２４を含むかまたはそれからなり、HNRNPR-003は配列番号２５を含むかまたはそれからなり、HNRNPR-004は配列番号２６を含むかまたはそれからなる；または
iv) Ｍ１およびＭ２はHLA-A*24:02またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列はTEG-002、TEG-003、TEG-004、TEG-005、TEG-006、TEG-007、ＰＰＰ１CA-002、ＰＰＰ１CA-003、ＰＰＰ１CA-005、好ましくはTEG-007およびＰＰＰ１CA-005からなる群から選択され、より好ましくはＰＢはTEG-007であり、かつＰＣはＰＰＰ１CA-005であり、ここで、TEG-002は配列番号２９を含むかまたはそれからなり、TEG-003は配列番号３０を含むかまたはそれからなり、TEG-004は配列番号３１を含むかまたはそれからなり、TEG-005は配列番号３２を含むかまたはそれからなり、TEG-006は配列番号３３を含むかまたはそれからなり、TEG-007は配列番号３４を含むかまたはそれからなり、ＰＰＰ１CA-002は配列番号３５を含むかまたはそれからなり、ＰＰＰ１CA-003は配列番号３６を含むかまたはそれからなり、ＰＰＰ１CA-005は配列番号３８を含むかまたはそれからなる；または
ｖ) Ｍ１およびＭ２はHLA-B*07:02またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列は異なり、UVLB7-001、HLA-DPB1-002、HLA-DPB1-003、HLA-DPB1-004、CHCHD2-003およびMUDENG-002、好ましくはMUDENG-002およびDPB1-004からなる群から選択され、より好ましくはＰＢはMUDENG-002であり、かつＰＣはDPB1-004であり、ここで、UVLB7-001は配列番号３９を含むかまたはそれからなり、HLA-DPB1-002は配列番号４０を含むかまたはそれからなり、HLA-DPB1-003は配列番号４１を含むかまたはそれからなり、HLA-DPB1-004は配列番号４２を含むかまたはそれからなり、CHCHD2-003は配列番号４４を含むかまたはそれからなり、そしてMUDENG-002は配列番号４６を含むかまたはそれからなる；または
vi) Ｍ１およびＭ２はHLA-B*08:01またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列はMKI-003、MKI-004、VIM-004、VIM-005、COPA-008、PDCD10-002、PDCD10-003、MIR286-002、EBV-020、SPTAN-002およびLOC646214-003、好ましくはMKI-003、COPA-008、PDCD10-003、MIR286-002、EBV-020、SPTAN-002およびLOC646214-003、より好ましくはSPTAN-002およびLOC646214-003からなる群から選択され、さらにより好ましくはＰＢはSPTAN-002であり、かつＰＣはLOC646214-003であり、ここで、MKI-003は配列番号４９を含むかまたはそれからなり、MKI-004は配列番号５０を含むかまたはそれからなり、VIM-004は配列番号５１を含むかまたはそれからなり、VIM-005は配列番号５２を含むかまたはそれからなり、COPA-008は配列番号５３を含むかまたはそれからなり、PDCD10-002は配列番号５４を含むかまたはそれからなり、PDCD10-003は配列番号５５を含むかまたはそれからなり、MIR286-002は配列番号５６を含むかまたはそれからなり、EBV-020は配列番号５７を含むかまたはそれからなり、SPTAN-002は配列番号５８を含むかまたはそれからなり、LOC646214-003は配列番号５９を含むかまたはそれからなり；
vii) Ｍ１およびＭ２はHLA-B*44:02またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列はSPTBN1-002、SPTBN1-003、SPTBN1-004、CLTC-006、CLTC-007、CSE1-005およびCSE1-006、好ましくはSPTBN1-004およびCSE1-005からなる群から選択され、より好ましくはＰＢはSPTBN1-004であり、かつＰＣはCSE1-005であり、ここで、SPTBN1-002は配列番号６０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-003は配列番号６１を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-004は配列番号６２を含むかまたはそれからなり、CLTC-006は配列番号６３を含むかまたはそれからなり、CLTC-007は配列番号６４を含むかまたはそれからなり、CSE1-005は配列番号６５を含むかまたはそれからなり、そしてCSE1-006は配列番号６６を含むかまたはそれからなる；または
viii) Ｍ１およびＭ２はHLA-B*44:05またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列はSPTBN1-002、SPTBN1-003、SPTBN1-004、CLTC-006、CLTC-007、CSE1-005およびCSE1-006、好ましくはSPTBN1-004およびCLTC-006からなる群から選択され、より好ましくはＰＢはSPTBN1-004であり、かつＰＣはCLTC-006であり、ここで、SPTBN1-002は配列番号６０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-003は配列番号６１を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-004は配列番号６２を含むかまたはそれからなり、CLTC-006は配列番号６３を含むかまたはそれからなり、CLTC-007は配列番号６４を含むかまたはそれからなり、CSE1-005は配列番号６５を含むかまたはそれからなり、そしてCSE1-006は配列番号６６を含むかまたはそれからなる。

【0153】

配列番号１～配列番号６６において、Ｘは条件付きで反応性の基、特に光活性化可能、亜ジチオン酸活性化可能または過ヨウ素酸活性化可能、好ましくは光活性化可能基を含む条件付きで反応性のアミノ酸アナログ、より好ましくは３－アミノ－３－(２－ニトロ)フェニル－プロピオン酸を表す。

【0154】

本発明の第一の態様について記載した全ての好ましい実施態様は、適用可能であれば、本発明の次の態様にも適用される。

【0155】

本発明の第二の態様は、配列番号１～１９、２１～３８および４０～６６、好ましくは配列番号１～１４、１６～１９、２１～２６、２９～３６、３８、４０～４２、４４および４６～６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する条件付きペプチドに関する。各配列において、Ｘは条件付きで反応性の基を表す。

【0156】

本願ペプチドは、条件付きで反応性の基、特に光活性化可能、亜ジチオン酸活性化可能または過ヨウ素酸活性化可能基を含む条件付きで反応性のアミノ酸アナログを含む、条件付きペプチドである。ペプチドは、１個のアミノ酸残基が条件付きで反応性の基、特に条件付きで反応性のアミノ酸アナログで置換されている親ペプチドに由来する。好ましい実施態様において、条件付きで反応性のアミノ酸アナログは、光活性化可能、亜ジチオン酸活性化可能または過ヨウ素酸活性化可能基、好ましくは光活性化可能基を含む。好ましい過ヨウ素酸活性化可能基はジヒドロキシ部分を含む。好ましい亜ジチオン酸活性化可能基はアゾベンゼン部分を含む。好ましい光活性化可能基は、３－アミノ－３－(２－ニトロ)フェニル－プロピオン酸またはその光活性化可能構造的等価物、例えば３－アミノ－３－(４－ニトロ)フェニル－プロピオン酸を含む。好ましい実施態様において、ペプチドは光活性化可能基を含むＵＶペプチドである。

【0157】

本発明の第一の態様の方法における使用に適する条件付きペプチド(ＰＢおよび／またはＰＣ)および本発明の第二の態様の条件付きペプチドは、全て条件付きリガンド交換における使用、特にＵＶ交換における使用に適する。全ペプチドをＵＶ交換反応で試験した。特に良好に働くペプチドは、表５で(++)または(+++)として特定される。

【0158】

次の特性は、両ＰＢおよび／またはＰＣ(すなわち本発明の第一の態様の方法の条件付きペプチド)および本発明の第二の態様で提供される条件付きペプチドを特徴づける：
－ ＭＨＣ分子と条件付きペプチドの結合強度は強力である。換言すると、ＭＨＣ分子と条件付きペプチドの親和性は高い。好ましい実施態様において、条件付きペプチドの親ペプチドは少なくとも０.４、好ましくは少なくとも０.５、より好ましくは少なくとも０.６、さらにより好ましくは少なくとも０.７の相対的Syfpeithiスコアを有する(相対的Syfpeithiスコアが高いほど、結合が強いことを示す)；および／または２以下、１.５以下、１以下、０.５以下、好ましくは０.２以下、０.１以下、より好ましくは０.０５以下、０.０２以下、さらにより好ましくは０.０１以下または０.００５以下のNetMHCpanランクを有する(NetMHCpanランクが低いほど、結合が強いことを示す)(表４)。好ましい実施態様において、NetMHCpanランクは、NetMHCpan version 4.0を使用して決定したNetMHCpanランクをいう。

【0159】

－ 再折りたたみ収率(標準再折りたたみ技術による条件付きｐＭＨＣ複合体の形成の成功)は高い。好ましい実施態様において、再折りたたみ収率は、再折りたたみ反応においてＨＬＡ鎖あたり１molあたり、少なくとも０.５、少なくとも０.２、少なくとも０.１、少なくとも０.０５、好ましくは少なくとも０.０２５mol ｐＨＬＡである。

【0160】

－ 条件付きｐＭＨＣ複合体は、既定の刺激の非存在下、特にＵＶ暴露非存在下、高安定性を有する。好ましい実施態様において、条件付きｐＭＨＣ複合体は、室温(約２０℃)で、緩衝液、例えばＰＢＳ中、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間または少なくとも２４時間安定である。既定の刺激の非存在下のｐＭＨＣ複合体の安定性は、ＳＥＣで測定して、例えばｐＭＨＣ単量体含量として決定され得る。

【0161】

－ 条件付きペプチドは、既定の刺激への暴露に続くペプチド主鎖の切断後、高解離率を有する。好ましくは、条件付きペプチドの少なくとも約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％または約１００％が既定の刺激への暴露後ＭＨＣ分子から解離する。

【0162】

上記のとおり、本発明者らは、驚くべきことにＵＶ暴露後、相当量の残存条件付きｐＭＨＣ複合体が残ることを示した(実施例１)。この方法で産生したｐＭＨＣ複合体をＴ細胞の刺激に使用したとき、条件付きｐＭＨＣに特異的なＴ細胞が産生されるリスクが伴う。このリスクを低減するために、本発明者らは、適当な条件付きペプチドの選択について、さらなる基準を適用した：条件付きペプチドは非免疫原性または弱い免疫原性のみであるよう選択される。

【0163】

文献に記載される条件付きペプチドは、しばしばウイルスまたは非ヒト親ペプチド由来である(Toebes et al., 2006, Frosig et al. 2015, Chang et al., 2013)。このようなペプチドは、高度に免疫原性であることが示されている。対照的に、本発明の第二の態様のペプチドは、好ましくは自己ヒトペプチド由来である。親ペプチドは、非免疫原性または弱い免疫原性のみであるように選択されている。故に、それ由来の条件付きペプチドも、非免疫原性または弱い免疫原性のみであるであることが期待され得る。

【0164】

ペプチドの免疫原性は、例えば、ペプチド－ＭＨＣ複合体およびヒトＴ細胞の増殖を刺激するための共刺激分子で被覆された人工抗原提示細胞の使用により、免疫原性アッセイにおいて決定され得る。刺激を繰り返した後、ペプチドが免疫原性であるとき、ペプチド－ＭＨＣに特異的なＴ細胞が増殖され、フローサイトメトリーにより検出できる。「弱い免疫原性ペプチド」は、本発明において、その特定のペプチドに特異的なＴ細胞の前駆体頻度が、Ｔ細胞、特にＣＤ８＋ Ｔ細胞の０.１％未満、０.０１％未満、０.００１％未満、０.００１％未満、０.０００１％未満であることを意味する。好ましくは、刺激は、１５～２５日間、より好ましくは３週間、好ましくはその後の３刺激サイクルである。好ましくは、検出は多量体染色による。刺激および検出の条件例は材料および方法セクションに記載される。好ましい実施態様において、第二の態様における、本発明の条件付きペプチドでのＴ細胞、特にＣＤ８＋ Ｔ細胞の刺激は、刺激ウェルの１０％未満、８％未満、６％未満、５％未満、３％未満または１％未満が、条件付きペプチドについて検出可能な特異的Ｔ細胞を有し、ここで、各刺激ウェルは刺激前約１０００細胞を含む。好ましい実施態様において、同じ条件下、既知対照ペプチド、特に高または中間免疫原性を有することが知られるウイルスペプチドまたはメラニン細胞／黒色腫(Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ)タンパク質(前駆体頻度１０００中１)などの免疫優勢抗原からのペプチドでの刺激は、刺激ウェルの少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％または、あるドナーにおいて、１００％が検出可能特異的Ｔ細胞を有するようになる。好ましくは、免疫原性アッセイを少なくとも２個の異なるドナーの細胞を使用して実施し、条件付きペプチドに特異的なＣＤ８＋細胞の検出される数は少なくとも２個のドナーからの平均を表す。

【0165】

さらに、ペプチドの免疫原性は、ペプチドが、関連するＨＬＡアロタイプを発現するヒト個体において高度に発現および／または高頻度で提示、特に高頻度で提示されるならば、弱いことが予測される。条件付き本発明の第二の態様のペプチドおよびそれが由来する親ペプチドの「関連するＨＬＡアロタイプ」は、表４および５に見られ得る。「高頻度で提示」は、本発明において、そのペプチドが、正常組織で検出頻度が少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％または少なくとも９８％であることを意味する。この文脈における「正常組織」は、(組織)病理学的変化の可視微視的／巨視的または分子徴候(例えば腫瘍または感染症のため)を示さず、関連するＨＬＡアロタイプを発現するヒトの任意の臓器由来であり得る組織をいう。好ましくは、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％または少なくとも９８％の検出の頻度が、数個の異なる臓器および／または関連するＨＬＡアロタイプを発現する異なる数人由来の複数正常組織サンプルで決定される。検出頻度は、関連するＨＬＡアロタイプの全試験サンプル中の、サンプルのパーセンテージとして決定され、ここで、各ペプチドは、正常組織からのＨＬＡ提示ペプチドの単離および後続の最先端液体クロマトグラフィー結合マススペクトロメトリーによる配列分析後に検出された。

【0166】

好ましい実施態様において、親ペプチドは、正常組織で少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％の検出頻度を有する。このような親ペプチドおよびそれ由来の条件付きペプチドは、弱い免疫原性のみであるであることが期待され得る。

【0167】

組織と無関係に関連するＨＬＡアロタイプを発現する個体の実質的に全細胞で高頻度で提示されるペプチドは、「ハウスキーピングペプチド」と記載され得る。故に、４６の好ましい実施態様において、本発明の第二の態様の条件付きペプチドはハウスキーピングペプチド由来である。

【0168】

好ましくは、本発明の第二の態様の条件付きペプチドは、配列番号１～１８、２１～３８、４０～５６または５８～６６、好ましくは配列番号１～１４、１６～１８、２１～２６、２９～３６、３８、４０～４２、４４、４６～５６または５８～６６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるペプチドの群から選択される。

【0169】

好ましい実施態様において、本発明の第二の態様の条件付きペプチドは、配列番号１～１８、２１～３８、４０～５６および５８～６６、好ましくは配列番号１～１４、１６～１８、２１～２６、２９～３６、３８、４０～４２、４４、４６～５６および５８～６６からなる群から選択される。

【0170】

より好ましくは、本発明の第二の態様の条件付きペプチドは、配列番号３～１８、２１～３８、４０～４８、５１～５６および５９～６６、好ましくは配列番号３～１４、１６～１８、２１、２２、２４～２６、２９～３８、４０～４２、４４、４６～４８、５１～５６および５９～６６のアミノ酸配列を含むまたはそれからなるペプチドの群から選択される。

【0171】

さらにより好ましい実施態様において、本発明の第二の態様の条件付きペプチドは、配列番号３～１８、２１～３８、４０～４８、５１～５６および５９～６６、好ましくは配列番号３～１４、１６～１８、２１、２２、２４～２６、２９～３８、４０～４２、４４、４６～４８、５１～５６および５９～６６を含むまたはそれからなる群から選択される。

【0172】

ある実施態様において、本発明の第二の態様の条件付きペプチドは、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02、HLA-B*07:02、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01またはHLA-B*44:05に特異的である。

【0173】

ある実施態様において、本発明の第二の態様の条件付きペプチドはMUC16-010、MUC16-011、RNF213-010、RNF213-011、AXIN1-003、AXIN1-004、CLTC-002、CLTC-003、CLTC-004、好ましくはRNF213-010、RNF213-011、AXIN1-003、AXIN1-004、CLTC-002、CLTC-003、CLTC-004、より好ましくはCLTC-002からなる群から選択され、ここで、MUC16-010は配列番号１を含むかまたはそれからなり、MUC16-011は配列番号２を含むかまたはそれからなり、RNF213-010は配列番号３を含むかまたはそれからなり、RNF213-011は配列番号４を含むかまたはそれからなり、AXIN1-003は配列番号５を含むかまたはそれからなり、AXIN1-004は配列番号６を含むかまたはそれからなり、CLTC-002は配列番号７を含むかまたはそれからなり、CLTC-003は配列番号８を含むかまたはそれからなり、そしてCLTC-004は配列番号９を含むかまたはそれからなる。これらの条件付きペプチドは、HLA-A*01:01に特異的である。

【0174】

ある実施態様において、本発明の第二の態様の条件付きペプチドはDDX5-002、DDX5-003、DDX5-004、DDX5-005、DDX5-006、RPL19-003、RPL19-004、RPL19-005およびFLUM-003、好ましくはDDX5-002、DDX5-003、DDX5-004、DDX5-005、DDX5-006、RPL19-003、RPL19-004およびRPL19-005、より好ましくはDDX5-002、DDX5-003、DDX5-004、DDX5-005、DDX5-006、RPL19-003、RPL19-004およびRPL19-005、より好ましくはDDX5-005およびRPL19-005からなる群から選択され、ここで、DDX5-002は配列番号１０を含むかまたはそれからなり、DDX5-003は配列番号１１を含むかまたはそれからなり、DDX5-004は配列番号１２を含むかまたはそれからなり、DDX5-005は配列番号１３を含むかまたはそれからなり、DDX5-006は配列番号１４を含むかまたはそれからなり；RPL19-002は配列番号１６を含むかまたはそれからなり、RPL19-003は配列番号１７を含むかまたはそれからなり、RPL19-002は配列番号１８を含むかまたはそれからなり；FLUM-003は配列番号１９を含むかまたはそれからなる。これらの条件付きペプチドは、HLA-A*02:01に特異的である。

【0175】

ある実施態様において、本発明の第二の態様の条件付きペプチドはGIBB-002、GIBB-003、HNRNPR-002、HNRNPR-003およびHNRNPR-004、好ましくはGIBB-002およびHNRNPR-002からなる群から選択され、ここで、GIBB-002は配列番号２１を含むかまたはそれからなり、GIBB-003は配列番号２２を含むかまたはそれからなり、HNRNPR-002は配列番号２４を含むかまたはそれからなり、HNRNPR-003は配列番号２５を含むかまたはそれからなり、HNRNPR-004は配列番号２６を含むかまたはそれからなる。これらの条件付きペプチドは、HLA-A*03:01に特異的である。

【0176】

ある実施態様において、本発明の第二の態様の条件付きペプチドはTEG-002、TEG-003、TEG-004、TEG-005、TEG-006、TEG-007、ＰＰＰ１CA-002、ＰＰＰ１CA-003、ＰＰＰ１CA-005、好ましくはTEG-007およびＰＰＰ１CA-005からなる群から選択され、ここで、TEG-002は配列番号２９を含むかまたはそれからなり、TEG-003は配列番号３０を含むかまたはそれからなり、TEG-004は配列番号３１を含むかまたはそれからなり、TEG-005は配列番号３２を含むかまたはそれからなり、TEG-006は配列番号３３を含むかまたはそれからなり、TEG-007は配列番号３４を含むかまたはそれからなり、ＰＰＰ１CA-002は配列番号３５を含むかまたはそれからなり、ＰＰＰ１CA-003は配列番号３６を含むかまたはそれからなり、ＰＰＰ１CA-005は配列番号３８を含むかまたはそれからなる。これらの条件付きペプチドは、HLA-A*24:02に特異的である。

【0177】

ある実施態様において、本発明の第二の態様の条件付きペプチドはHLA-DPB1-002、HLA-DPB1-003、HLA-DPB1-004、CHCHD2-003およびMUDENG-002、好ましくはMUDENG-002およびDPB1-004からなる群から選択され、ここで、HLA-DPB1-002は配列番号４０を含むかまたはそれからなり、HLA-DPB1-003は配列番号４１を含むかまたはそれからなり、HLA-DPB1-004は配列番号４２を含むかまたはそれからなり、CHCHD2-003は配列番号４４を含むかまたはそれからなり、そしてMUDENG-002は配列番号４６を含むかまたはそれからなる。これらの条件付きペプチドは、HLA-B*07:02に特異的である。

【0178】

ある実施態様において、本発明の第二の態様の条件付きペプチドはMKI-003、MKI-004、VIM-004、VIM-005、COPA-008、PDCD10-002、PDCD10-003、MIR286-002、EBV-020、SPTAN-002およびLOC646214-003、好ましくはMKI-003、MKI-004、VIM-004、VIM-005、COPA-008、PDCD10-002、PDCD10-003、MIR286-002、SPTAN-002およびLOC646214-003、より好ましくはMKI-003、MKI-004、VIM-004、VIM-005、COPA-008、PDCD10-002、PDCD10-003、MIR286-002およびLOC646214-003、さらにより好ましくはMKI-003、COPA-008、PDCD10-003、MIR286-002、EBV-020、SPTAN-002およびLOC646214-003、さらにより好ましくはSPTAN-002およびLOC646214-003からなる群から選択され、ここで、MKI-003は配列番号４９を含むかまたはそれからなり、MKI-004は配列番号５０を含むかまたはそれからなり、VIM-004は配列番号５１を含むかまたはそれからなり、VIM-005は配列番号５２を含むかまたはそれからなり、COPA-008は配列番号５３を含むかまたはそれからなり、PDCD10-002は配列番号５４を含むかまたはそれからなり、PDCD10-003は配列番号５５を含むかまたはそれからなり、MIR286-002は配列番号５６を含むかまたはそれからなり、EBV-020は配列番号５７を含むかまたはそれからなり、SPTAN-002は配列番号５８を含むかまたはそれからなり、LOC646214-003は配列番号５９を含むかまたはそれからなる。これらの条件付きペプチドは、HLA-B*08:01に特異的である。

【0179】

ある実施態様において、本発明の第二の態様の条件付きペプチドはSPTBN1-002、SPTBN1-003、SPTBN1-004、CLTC-006、CLTC-007、CSE1-005およびCSE1-006、好ましくはSPTBN1-004およびCSE1-005からなる群から選択され、ここで、SPTBN1-002は配列番号６０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-003は配列番号６１を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-004は配列番号６２を含むかまたはそれからなり、CLTC-006は配列番号６３を含むかまたはそれからなり、CLTC-007は配列番号６４を含むかまたはそれからなり、CSE1-005は配列番号６５を含むかまたはそれからなり、そしてCSE1-006は配列番号６６を含むかまたはそれからなる。これらの条件付きペプチドは、HLA-B*44:02に特異的である。

【0180】

ある実施態様において、本発明の第二の態様の条件付きペプチドはSPTBN1-002、SPTBN1-003、SPTBN1-004、CLTC-006、CLTC-007、CSE1-005およびCSE1-006、好ましくはSPTBN1-004およびCSE1-005からなる群から選択され、ここで、SPTBN1-002は配列番号６０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-003は配列番号６１を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-004は配列番号６２を含むかまたはそれからなり、CLTC-006は配列番号６３を含むかまたはそれからなり、CLTC-007は配列番号６４を含むかまたはそれからなり、CSE1-005は配列番号６５を含むかまたはそれからなり、そしてCSE1-006は配列番号６６を含むかまたはそれからなる。これらの条件付きペプチドは、HLA-B*44:05に特異的である。

【0181】

本発明の第三の態様は、本発明の第一の態様の方法により選択された免疫細胞に関する。

【0182】

本発明の第四の態様は、ｐＭＨＣ複合体１Ａに特異的に結合する抗原結合タンパク質をコードする核酸の配列を決定する方法であって：
(ｉ)本発明の第一の態様の方法で選択した免疫細胞から抗原結合タンパク質をコードする核酸を単離し；そして
(ii)核酸の配列を決定する
工程を含む、方法に関する。好ましい実施態様において、第四の態様の方法は、選択免疫細胞から抗原結合タンパク質をコードする核酸を単離する前、本発明の第一の態様の方法による表面に抗原結合タンパク質を発現する免疫細胞の選択を含む。

【0183】

本発明の第一の方法で選択される細胞表面に発現される抗原結合タンパク質は好ましくはＴＣＲである。結果として、本発明の第四の態様の方法により決定される核酸配列によりコードされる抗原結合タンパク質も好ましくはＴＣＲである。

【0184】

本発明の次の態様は、本発明の第一および第三の態様の方法で同定された抗原結合タンパク質、特にＴＣＲのためのさらなる方法および使用に関する。これらの態様に関して、用語「抗原結合タンパク質」はまた本発明の第一および第三の態様の方法で同定された抗原結合タンパク質、特にＴＣＲの誘導体または抗原結合フラグメントも含む。故に、ある実施態様において、抗原結合タンパク質はＴＣＲまたはその抗原結合フラグメント；ＢＣＲまたはその抗原結合フラグメントまたは抗体またはその抗原結合フラグメントである。他の実施態様において、抗原結合タンパク質は、ＴＣＲまたは少なくともアルファ鎖およびベータ鎖の可変ドメインを含むその一部である。他の実施態様において、抗原結合タンパク質は、本発明の第一および第四の態様の方法で同定された抗原結合タンパク質、特にＴＣＲのＣＤＲ１およびＣＤＲ３および所望によりＣＤＲ２配列を含み、好ましくはフレームワークまたは他のＴＣＲまたは抗体に挿入されている。

【0185】

本発明の第五の態様は、抗原結合タンパク質を発現する宿主細胞を産生する方法であって：
(ｉ)宿主細胞を提供し；
(ii)本発明の第一の態様の方法で選択した免疫細胞から抗原結合タンパク質をコードする核酸を単離し；
(iii)工程(ii)で単離した核酸または抗原結合タンパク質もしくはその抗原結合フラグメントをコードする該核酸の一部を含む遺伝子構築物を産生し；そして
(iv)該宿主細胞に該遺伝子構築物を導入する
工程を含む、方法に関する。

【0186】

好ましい実施態様において、第五の態様の方法は、選択免疫細胞から抗原結合タンパク質をコードする核酸を単離する前、本発明の第一の態様の方法による表面に抗原結合タンパク質を発現する免疫細胞の選択を含む。

【0187】

ある実施態様において、遺伝子構築物は発現ベクターである。好ましくは、抗原結合タンパク質またはその抗原結合フラグメントをコードする配列は適当なベクターに挿入される。

【0188】

好ましい実施態様において、宿主細胞はリンパ球、好ましくはＴリンパ球またはＴリンパ球前駆細胞、例えばＣＤ４またはＣＤ８陽性Ｔ細胞；またはチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞または酵母細胞などの組み換え発現用細胞である。ある実施態様において、このような組み換え宿主細胞を、少なくとも１個の本発明の抗原結合タンパク質またはその一部の産生に使用できる。好ましくは、宿主細胞は、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分をコードする核酸および／またはベクターで形質転換、形質導入またはトランスフェクトされる。抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質の一部をコードする核酸での宿主細胞の形質導入またはトランスフェクションは、当分野で周知の方法、例えばＵＳ２０１９０２１６８５２に記載の方法を使用して、実施される。他の実施態様において、抗原結合タンパク質またはその抗原結合部分を含む宿主細胞は、真核生物細胞、例えば、植物、動物、真菌もしくは藻類であり得てまたは原核生物細胞、例えば、細菌もしくは原生動物であり得る。宿主細胞は、培養細胞または初代、すなわち、生物、例えば、ヒトから直接単離された、細胞であり得る。宿主細胞は、接着Ｔ細胞または懸濁細胞、すなわち、懸濁液で増殖する細胞であり得る。組み換えＴＣＲまたはそのフラグメントなどの抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質の一部を産生する目的で、宿主細胞は好ましくは哺乳動物細胞である。最も好ましくは、宿主細胞はヒト細胞である。宿主細胞はどんな細胞型でもよく、どんなタイプの組織に由来してもよく、どんな発達段階にあってもよいが、宿主細胞は、好ましくは末梢血白血球(ＰＢＬ)または末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、Ｔ細胞またはＢ細胞である。より好ましくは、宿主細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、培養Ｔ細胞、例えば、初代Ｔ細胞または培養Ｔ細胞株、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１などからのＴ細胞または哺乳動物から得たＴ細胞、好ましくはヒト患者からのＴ細胞またはＴ細胞前駆体などの任意のＴ細胞であり得る。哺乳動物から得るならば、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ節、胸腺または他の組織または流体を含むが、これらに限定されない多数の源から得られ得る。好ましくは、Ｔ細胞はヒトＴ細胞である。より好ましくは、Ｔ細胞はヒトから単離されたＴ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４陽性および／またはＣＤ８陽性、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１およびＴｈ２細胞、ＣＤ８陽性Ｔ細胞(例えば、細胞毒性Ｔ細胞)、腫瘍浸潤細胞(ＴＩＬ)、記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞を含むが、これらに限定されないどんなタイプのＴ細胞でもよく、どんな発達段階にあってよい。好ましくは、Ｔ細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞またはＣＤ４陽性Ｔ細胞である。他の実施態様において、宿主細胞は、組み換え発現のための任意の細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞である。

【0189】

本発明の第六の態様は、本発明の第五の態様の方法により産生された宿主細胞を提供し、該宿主細胞に導入された遺伝子構築物を発現することを含む、抗原結合タンパク質を産生する方法に関する。

【0190】

本発明の第七の態様は、本発明の第六の態様の方法により産生された抗原結合タンパク質に関する。

【0191】

本発明の第八の態様は、本発明の第七の態様の抗原結合タンパク質をコードする核酸または該核酸を含むベクターに関する。

【0192】

本発明の第九の態様は、下に定義するキットに関する。具体的態様において、キットは、表面にペプチドとＭＨＣ分子の複合体と特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現する細胞を選択するためである。該キットは：
ａ)ペプチドＢ(ＰＢ)とＭＨＣ分子１(Ｍ１)を含む複合体１Ｘ；およびペプチドＣ(ＰＣ)とＭＨＣ分子２(Ｍ２)を含む複合体２Ｘ；または
ｂ)ペプチド(ＰＢ)およびペプチド(ＰＣ)ならびに所望によりＰＢおよびＰＣが結合し、それにより複合体１Ｘおよび２Ｘを各々形成するＭＨＣ分子、特にＭ１および／またはＭ２；および
ｃ)所望によりβ２－ミクログロブリン(β２Ｍ)
を含み；ここで、複合体１Ｘおよび２Ｘは、規定の刺激での刺激により解離し；そして、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列は少なくとも１個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個のアミノ酸が異なる。好ましくは、キットは、ペプチドＡ(ＰＡ)およびＭ１またはＭ２を含む複合体１Ａに特異的に結合する抗原結合タンパク質の選択のために提供される。

【0193】

キットの好ましい実施態様において、
ｉ) Ｍ１およびＭ２はHLA-A*01:01またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列はMUC16-010、MUC16-011、RNF213-010、RNF213-011、AXIN1-003、AXIN1-004、CLTC-002、CLTC-003、CLTC-004、好ましくはCLTC-002およびMUC16-010からなる群から選択され、より好ましくはＰＢはCLTC-002であり、かつＰＣはMUC16-010であり、ここで、MUC16-010は配列番号１を含むかまたはそれからなり、MUC16-011は配列番号２を含むかまたはそれからなり、RNF213-010は配列番号３を含むかまたはそれからなり、RNF213-011は配列番号４を含むかまたはそれからなり、AXIN1-003は配列番号５を含むかまたはそれからなり、AXIN1-004は配列番号６を含むかまたはそれからなり、CLTC-002は配列番号７を含むかまたはそれからなり、CLTC-003は配列番号８を含むかまたはそれからなり、そしてCLTC-004は配列番号９を含むかまたはそれからなる；または
ii) Ｍ１およびＭ２はHLA-A*02:01またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列はDDX5-002、DDX5-003、DDX5-004、DDX5-005、DDX5-006、RPL19-003、RPL19-004、RPL19-005およびFLUM-003、好ましくはDDX5-002、DDX5-003、DDX5-004、DDX5-005、DDX5-006、RPL19-003、RPL19-004、RPL19-005、より好ましくはDDX5-005およびRPL19-005からなる群から選択され、さらにより好ましくはＰＢはDDX5-005であり、かつＰＣはRPL19-005であり、ここで、DDX5-002は配列番号１０を含むかまたはそれからなり、DDX5-003は配列番号１１を含むかまたはそれからなり、DDX5-004は配列番号１２を含むかまたはそれからなり、DDX5-005は配列番号１３を含むかまたはそれからなり、DDX5-006は配列番号１４を含むかまたはそれからなり；RPL19-002は配列番号１６を含むかまたはそれからなり、RPL19-003は配列番号１７を含むかまたはそれからなり、RPL19-002は配列番号１８を含むかまたはそれからなり；FLUM-003は配列番号１９を含むかまたはそれからなる；または
iii) Ｍ１およびＭ２はHLA-A*03:01またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列はUVLA3-001、GIBB-002、GIBB-003、HNRNPR-002、HNRNPR-003およびHNRNPR-004、好ましくはGIBB-002およびHNRNPR-002からなる群から選択され、より好ましくはＰＢはGIBB-002であり、かつＰＣはHNRNPR-002であり、ここで、UVLA3-001は配列番号２０を含むかまたはそれからなり、GIBB-002は配列番号２１を含むかまたはそれからなり、GIBB-003は配列番号２２を含むかまたはそれからなり、HNRNPR-002は配列番号２４を含むかまたはそれからなり、HNRNPR-003は配列番号２５を含むかまたはそれからなり、HNRNPR-004は配列番号２６を含むかまたはそれからなる；または
iv) Ｍ１およびＭ２はHLA-A*24:02またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列はTEG-002、TEG-003、TEG-004、TEG-005、TEG-006、TEG-007、ＰＰＰ１CA-002、ＰＰＰ１CA-003、ＰＰＰ１CA-005、好ましくはTEG-007およびＰＰＰ１CA-005からなる群から選択され、より好ましくはＰＢはTEG-007であり、かつＰＣはＰＰＰ１CA-005であり、ここで、TEG-002は配列番号２９を含むかまたはそれからなり、TEG-003は配列番号３０を含むかまたはそれからなり、TEG-004は配列番号３１を含むかまたはそれからなり、TEG-005は配列番号３２を含むかまたはそれからなり、TEG-006は配列番号３３を含むかまたはそれからなり、TEG-007は配列番号３４を含むかまたはそれからなり、ＰＰＰ１CA-002は配列番号３５を含むかまたはそれからなり、ＰＰＰ１CA-003は配列番号３６を含むかまたはそれからなり、ＰＰＰ１CA-005は配列番号３８を含むかまたはそれからなる；または
ｖ) Ｍ１およびＭ２はHLA-B*07:02またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列は異なり、UVLB7-001、HLA-DPB1-002、HLA-DPB1-003、HLA-DPB1-004、CHCHD2-003およびMUDENG-002、好ましくはMUDENG-002およびDPB1-004からなる群から選択され、より好ましくはＰＢはMUDENG-002であり、かつＰＣはDPB1-004であり、ここで、UVLB7-001は配列番号３９を含むかまたはそれからなり、HLA-DPB1-002は配列番号４０を含むかまたはそれからなり、HLA-DPB1-003は配列番号４１を含むかまたはそれからなり、HLA-DPB1-004は配列番号４２を含むかまたはそれからなり、CHCHD2-003は配列番号４４を含むかまたはそれからなり、そしてMUDENG-002は配列番号４６を含むかまたはそれからなる；または
vi) Ｍ１およびＭ２はHLA-B*08:01またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列はMKI-003、MKI-004、VIM-004、VIM-005、COPA-008、PDCD10-002、PDCD10-003、MIR286-002、EBV-020、SPTAN-002およびLOC646214-003、好ましくはMKI-003、COPA-008、PDCD10-003、MIR286-002、EBV-020、SPTAN-002およびLOC646214-003、より好ましくはSPTAN-002およびLOC646214-003からなる群から選択され、さらにより好ましくはＰＢはSPTAN-002であり、かつＰＣはLOC646214-003であり、ここで、MKI-003は配列番号４９を含むかまたはそれからなり、MKI-004は配列番号５０を含むかまたはそれからなり、VIM-004は配列番号５１を含むかまたはそれからなり、VIM-005は配列番号５２を含むかまたはそれからなり、COPA-008は配列番号５３を含むかまたはそれからなり、PDCD10-002は配列番号５４を含むかまたはそれからなり、PDCD10-003は配列番号５５を含むかまたはそれからなり、MIR286-002は配列番号５６を含むかまたはそれからなり、EBV-020は配列番号５７を含むかまたはそれからなり、SPTAN-002は配列番号５８を含むかまたはそれからなり、LOC646214-003は配列番号５９を含むかまたはそれからなり；
vii) Ｍ１およびＭ２はHLA-B*44:02またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列はSPTBN1-002、SPTBN1-003、SPTBN1-004、CLTC-006、CLTC-007、CSE1-005およびCSE1-006、好ましくはSPTBN1-004およびCSE1-005からなる群から選択され、より好ましくはＰＢはSPTBN1-004であり、かつＰＣはCSE1-005であり、ここで、SPTBN1-002は配列番号６０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-003は配列番号６１を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-004は配列番号６２を含むかまたはそれからなり、CLTC-006は配列番号６３を含むかまたはそれからなり、CLTC-007は配列番号６４を含むかまたはそれからなり、CSE1-005は配列番号６５を含むかまたはそれからなり、そしてCSE1-006は配列番号６６を含むかまたはそれからなる；または
viii) Ｍ１およびＭ２はHLA-B*44:05またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列はSPTBN1-002、SPTBN1-003、SPTBN1-004、CLTC-006、CLTC-007、CSE1-005およびCSE1-006、好ましくはSPTBN1-004およびCLTC-006からなる群から選択され、より好ましくはＰＢはSPTBN1-004であり、かつＰＣはCLTC-006であり、ここで、SPTBN1-002は配列番号６０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-003は配列番号６１を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-004は配列番号６２を含むかまたはそれからなり、CLTC-006は配列番号６３を含むかまたはそれからなり、CLTC-007は配列番号６４を含むかまたはそれからなり、CSE1-005は配列番号６５を含むかまたはそれからなり、そしてCSE1-006は配列番号６６を含むかまたはそれからなる。

【0194】

本発明の第十の態様は、本発明の第一の態様の方法により選択された免疫細胞、本発明の第五の態様の方法により産生された宿主細胞、本発明の第七の態様の抗原結合タンパク質および／または本発明の第八の態様の核酸またはベクターを含む、医薬組成物に関する。

【0195】

本発明の第十一の態様は、医薬に使用するための、本発明の第一の態様の方法により選択された免疫細胞、本発明の第五の態様の方法により産生された宿主細胞、本発明の第七の態様の抗原結合タンパク質および／または本発明の第八の態様の核酸またはベクターに関する。

【0196】

本発明の第十二の態様は、新生物疾患を診断、処置または予防する方法に使用するための、本発明の第一の態様の方法により選択された免疫細胞、本発明の第五の態様の方法により産生された宿主細胞、本発明の第七の態様の抗原結合タンパク質および／または本発明の第八の態様の核酸またはベクターに関する。

【0197】

本発明の他の態様は、処置を必要とする対象に、治療有効量の本発明の第一の態様の方法により選択されたおよび／または本発明の第五の態様の方法により産生された免疫細胞および／または本発明の第七の態様の抗原結合タンパク質または本発明の第八の態様の核酸を投与することを含む、新生物疾患を処置する方法に関する。好ましい実施態様において、本方法は、養子細胞導入を含む。

【0198】

新生物疾患がＴＡＡ提示癌などの癌であり、本発明における抗原結合タンパク質が該ＴＡＡに特異的に結合するのが好ましい。

【0199】

本発明のさらに他の態様は、処置を必要とする対象における新生物疾患を処置する方法であって：
(ｉ)Ｔ細胞を含む対象の免疫細胞集団を提供し；
(ii)工程(ｉ)の免疫細胞集団と
(ａ)ＭＨＣ分子１(Ｍ１)とペプチドＡ(ＰＡ)を含む複合体１Ａおよび
(ｂ)Ｍ１とペプチドＢ(ＰＢ)を含む複合体１Ｘ
を含む第一組成物を接触させ；
(iii)免疫細胞集団と
(ａ)ＭＨＣ分子２(Ｍ２)とＰＡを含む複合体２Ａおよび
(ｂ)Ｍ２とペプチドＣ(ＰＣ)を含む複合体２Ｘ
を含む第二組成物を接触させ；
(iv)免疫細胞集団から複合体１Ａ；特に複合体１Ａおよび複合体２Ａ両方に特異的に結合するＴＣＲを発現する少なくとも１個のＴ細胞を選択し；そして
(ｖ)培養により少なくとも１個の選択Ｔ細胞の数を増加させ；そして
(vi)培養Ｔ細胞を対象に再導入する
工程を含み；
ここで、複合体１Ａおよび２Ａではなく、複合体１Ｘおよび２Ｘが規定の刺激での刺激により解離し；そして、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列は少なくとも１個のアミノ酸が異なるものである、方法に関する。

【0200】

このアプローチは、処置を必要とする対象起源の細胞を選択し、増殖させ、対象に導入して戻す、養子細胞導入アプローチである。

【0201】

本発明の第十三の態様は、ｐＭＨＣ複合体調製のための、本発明の第二の態様のペプチドの使用に関する。

【0202】

好ましい実施態様において、ｐＭＨＣ複合体は、条件付きリガンド交換に使用するための条件付きｐＭＨＣ複合体である。

【0203】

次に、本発明を次の図および実施例を参照して、さらに詳細に記載する。本発明を、先の記載において詳細に説明し、記載しているが、実施例は、限定的ではなく、説明的または例示的であることが意図される。

【実施例】

【0204】

実施例セクション
材料および方法
ペプチド合成およびｐＨＬＡ分子の再折りたたみ
合成ペプチドを、ペプチドシンセサイザーPrelude(Gyros)を使用して、標準固相９－フルオレニルメチルオキシカルボニル戦略を使用して、産生した。純度を、ＵＶ検出を用いる逆相ＨＰＬＣ(Thermo)により評価した。ＵＶ切断を可能とするために、ＵＶ感受性３－アミノ－３－(２－ニトロ)フェニル－プロピオン酸残基(アミノ酸配列で(Ｘ)と略す)を親ペプチドのアミノ酸(ａａ)配列内の１個のａａの置換のために使用して、条件付きＨＬＡリガンドを産生した(Toebes et al., 2006)。ビオチニル化ｐＨＬＡ複合体を、先に記載されたとおり(Altman et al., 1996; Garboczi et al., 1992)、合成ペプチドおよび組み換えＨＬＡ分子から産生した。ｐＨＬＡ複合体における正しい合成ペプチドの存在(合成ペプチドの配列同一性)を、ダイレクトインフュージョン高解像度ＭＳ２(Orbitrap Velos, Thermo Fisher Scientific)により確認した。

【0205】

ＵＶ介在リガンド交換によるｐＨＬＡ産生
ＵＶ介在ペプチド交換およびＥＬＩＳＡアッセイによるｐＨＬＡ濃度測定は、Rodenko et al. (Rodenko et al., 2006)の記載に基づいた。簡潔には、ＵＶ単量体(ＵＶ感受性ｐＨＬＡ複合体)(最終濃度(ｆ.ｃ.)：それぞれ刺激について０.５μMおよび読み出しについて２μM)およびレスキューペプチドを、１:100モル比で混合し、３０～６０分間、ＵＶ光(３６６nm)を照射した。遠心分離後、上清を取り、交換反応の成功を、β２－ミクログロブリン(β２ｍ)ＥＬＩＳＡにより試験した。

【0206】

β２ｍ ＥＬＩＳＡ
９６ウェルMAXISorpプレート(ＮＵＮＣ)を、一夜、２μg／mlストレプトアビジンのＰＢＳ溶液で、室温で被覆し、４回洗浄し、１時間、３７℃で遮断緩衝液(２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ)で遮断した。再折り畳みHLA-A*02:01／MLA-001単量体は標準として利用した。ＵＶ交換サンプルを１時間、３７℃でインキュベートし、４回洗浄し、２μg／ml ＨＲＰコンジュゲート抗β２ｍ(Origene, Rockville, MD, USA)と１時間、３７℃でインキュベートし、再び洗浄し、ＮＨ_２ＳＯ_４で停止するＴＭＢ溶液(Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany)で検出した。吸収を４５０nmで測定した。

【0207】

Ｔ細胞単離および培養
ペプチド－ＨＬＡ複合体(ｐＨＬＡ)および抗ＣＤ２８抗体を搭載した人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)によるインビトロ刺激を実施するために、本発明者らは、まず、インフォームドコンセント後、University clinics Mannheim, Germanyから得た健常ドナーの新鮮ＨＬＡ適合白血球アフェレーシス製品から、ＣＤ８マイクロビーズ(Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germany)を使用して、陽性選択によりＣＤ８＋ Ｔ細胞を単離した。
ＰＢＭＣおよび単離ＣＤ８＋リンパ球を、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清(CC Pro, Oberdorla, Germany)、１００Ｕ／mlペニシリン／１００μg／mlストレプトマイシン(Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany)、１mM ピルビン酸ナトリウム(CC Pro, Oberdorla, Germany)および２０μg／ml ゲンタマイシン(Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany)添加RPMI-Ｇｌｕｔａｍａｘ(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)からなるＴ細胞培地(ＴＣＭ)で、使用までインキュベートした。２.５ng／ml ＩＬ－７(PromoCell, Heidelberg, Germany)および１０Ｕ／ml ＩＬ－２(Novartis Pharma, Nuernberg, Germany)も、この工程でＴＣＭに添加した。

【0208】

ａＡＰＣ(ｐＨＬＡ／抗ＣＤ２８被覆ビーズ)の産生
精製共刺激マウスＩｇＧ２ａ抗ヒトＣＤ２８ Ａｂ ９.３(Jung et al., 1987)を、製造業者(Perbio, Bonn, Germany)の推奨どおり、スルホ－N-ヒドロキシスクシンイミドビオチンを使用して、化学的にビオチニル化した。使用したビーズは、５.６μm直径ストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子(Bangs Laboratories, Illinois, USA)であった。
８００.０００ビーズ／２００μlを、９６ウェルプレート中、４個までの異なるビオチニル化ｐＨＬＡ複合体(総量５０ng／ウェル)の存在下で被覆し、洗浄し、その後６００ng ビオチニル化抗ＣＤ２８を２００μl／ウェルの体積で添加した。

【0209】

Ｔ細胞刺激
９６ウェルプレート中、１×１０^６ ＣＤ８＋ Ｔ細胞と２×１０^５ 洗浄ａＡＰＣを、５ng／ml ＩＬ－１２(PromoCell)添加２００μl ＴＣＭ中、３日間、３７℃で共インキュベートすることにより刺激を開始した。次いで、培地の半分を８０Ｕ／ml ＩＬ－２添加新鮮ＴＣＭに交換し、インキュベートを４日間、３７℃で続けた。この刺激サイクルを計３回続けた。
各アッセイ内で、高度に免疫原性ペプチドを含むｐＨＬＡ複合体および弱い免疫原性自己ペプチドを含むｐＨＬＡ複合体は、それぞれ陽性または陰性対照刺激として利用した。

【0210】

蛍光ｐＨＬＡ多量体の産生
蛍光標識ｐＨＬＡ多量体を、先に記載(Rodenko et al., 2006)のとおり、産生した。

【0211】

読み出し
条件あたり８個までの異なるｐＨＬＡ分子を使用するｐＨＬＡ多量体読み出しについて、二次元組み合わせコーディングアプローチを、先に記載のとおり(Andersen et al., 2012a; Andersen et al., 2012b)、５個の異なる蛍光色素へのカップリングを含むわずかな改変をして、使用した。最後に、多量体分析を、細胞を生存／死近ＩＲ色素(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)、ＣＤ８－ＦＩＴＣ抗体クローンＳＫ１(BD, Heidelberg, Germany)および蛍光ｐＨＬＡ多量体で染色することにより実施した。分析について、適切なレーザーおよびフィルターを備えたBD LSRII SORPまたはMACSQuant(登録商標)X FLOWサイトメーターを使用した。ペプチド特異的細胞を、総ＣＤ８＋細胞のパーセンテージとして計算した。多量体分析の評価を、FlowJo^TMソフトウェア(FlowJo, BD, Ashland, USA)を使用して、実施した。特異的多量体＋ＣＤ８＋リンパ球のインビトロプライミングを、陰性対照刺激との比較により検出した。

【0212】

分類
ペプチド特異的細胞の分類について、適切なレーザーおよびフィルターを備えたBD FACSAria^TM III SORP Cell Sorterを使用する。細胞をＴＣＭ中に分類し、さらに使用するまで培養する。

【0213】

組織サンプルからのＨＬＡペプチドの単離
急速冷凍組織サンプルからのＨＬＡペプチドプールを、HLA-A*02特異的抗体ＢＢ７.２、HLA-A、－Ｂ、－Ｃ特異的抗体ｗ６／３２、ＣＮＢｒ活性化セファロース、酸処理および限外濾過を使用する、わずかに改変したプロトコール(Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999)により、固形組織からの免疫沈殿により得た。脂肪組織；副腎；胆管；膀胱；血液細胞；血管；骨髄；脳；乳房；食道；眼；胆嚢；頭頸部；心臓；大腸；小腸；腎臓；肝臓；肺；リンパ節；中枢神経；末梢神経；卵巣；膵臓；副甲状腺；腹膜；下垂体；胎盤；胸膜；前立腺；骨格筋；皮膚；脊髄；脾臓；胃；精巣；胸腺；甲状腺；気管；輸尿管および子宮を含む種々組織検体由来の１０００を超えるサンプルを試験した。

【0214】

マススペクトロメトリー分析
得られたＨＬＡペプチドプールを、逆相クロマトグラフィー(nanoAcquityUPLC系、Waters)により疎水性に従って分類し、溶出ペプチドをＥＳＩ源を備えたLTQ velosおよびフュージョンハイブリッド型質量分析計(ThermoElectron)で分析した。ペプチドプールを、直接、１.７μm Ｃ１８逆相材(Waters)を充填した分析的溶融シリカマイクロキャピラリーカラム(７５μm内径×２５０mm)に載せ、４００nL／分の流速を適用した。続いて、ペプチドを、３００nL／分の流速で１０％～３３％Ｂの２工程１８０分間バイナリー勾配を使用して、分離した。勾配は、溶媒Ａ(０.１％ギ酸水溶液)および溶媒Ｂ(０.１％ギ酸のアセトニトリル溶液)からなった。金被覆ガラスキャピラリー(PicoTip, New Objective)を、nanoESI源への導入に使用した。LTQ-Orbitrap質量分析計を、ＴＯＰ５戦略を使用するデータ依存モードで操作した。すなわち、走査サイクルを、オービトラップ(Ｒ＝３００００)で高質量精度の完全走査により開始し、続いて、またオービトラップ(Ｒ＝７５００)であるＭＳ／ＭＳ走査を、先に選択したイオンの動的除外と共に５個の最も豊富な前駆体イオンで行う。タンデムマススペクトルを、固定誤検出率(ｑ≦０.０５)および付加的マニュアルコントロールのSEQUESTで解釈した。同定ペプチド配列が不確実である場合、さらに、産生された天然ペプチド断片化パターンと合成配列同一対照ペプチドの断片化パターンの比較により、検証した。

【0215】

実施例１：ＵＶ交換後のＥＣ単量体収率および残存ＵＶ単量体の定量
ＵＶ単量体ＵＶ暴露後のｐＨＬＡ複合体の存在を、β２ｍ ＥＬＩＳＡにより分析した。ＵＶ暴露を、レスキューペプチド存在下(灰色棒)または非存在下(黒色棒)実施した。結合ペプチドの非存在下、ＨＬＡ分子は不安定であり、折り畳まれていない。驚くべきことに、本発明者らは、ｐＨＬＡ開始濃度と比較して、レスキューペプチド非存在下でＵＶ暴露後８～１５％のｐＨＬＡが検出できることを発見し、ＵＶ暴露中相当数のＵＶ単量体がインタクトのままであることが示された(図２)。これらの予想外の結果は、ＥＣ単量体をＵＶ交換を介して産生したとき、ＵＶペプチドは常にレスキューペプチドと完全に交換されるわけではなく、低濃縮ＵＶ単量体の残存量に至ることを示唆する。

【0216】

実施例２：ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は残存ＵＶ単量体に向かう
本発明者らは、これらの条件付きｐＨＬＡ複合体のバックグラウンド値は、Ｔ細胞の刺激または検出に使用したならば、誤った結果となるリスクを有し得るとの仮説を立てた。本発明者らは、残存ＵＶ単量体がＵＶペプチドを認識するＴ細胞の活性化および検出に十分であることを示すことができた。ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、A*02:01_FLUM-003×MLA-001分子(ここで、FLUM-003はMLA-001により交換されている条件付きリガンドである)被覆人工抗原提示細胞(ａＡＰＣ)で刺激した。細胞を、ｐＨＬＡ単量体が条件付きリガンドとしてFLUM-003を使用するＵＶ交換に由来する２個の異なる多量体(ＡＰＣ：A*02:01_FLUM-003×MLA-001およびＰＥ：A*02:01_FLUM-003×ADF-001)の組み合わせで染色したとき、強いＡＰＣ単一陽性集団に加えて、第二のＰＥ＋ＡＰＣ＋二重陽性集団が検出され得る(図３、Ａ)。この集団は、同じ刺激ウェルからの細胞を、ｐＨＬＡ単量体が標準ｐＨＬＡ再折りたたみにより産生された多量体で染色したとき、観察されなかった(図３、Ｂ)。標準ｐＨＬＡ再折りたたみ由来のA*02:01_FLUM-003またはA*02:01_ADF-001特異的多量体での多量体染色は、ADF-001特異的細胞ではなく、FLUM-003特異的細胞の存在を確認した(図３、Ｃ＋Ｄ)。これらの結果は、低量の残存条件付きｐＨＬＡ分子でも、多量体染色による条件付きリガンドに特異的な細胞の検出に十分であることを明らかに示す。

【0217】

実施例３：ヒトタンパク質由来の親ペプチドおよびＵＶペプチドの免疫原性
ＵＶペプチドFLUM-003(KILGFVF(X)V)が高度に免疫原性のInfluenca A MatrixペプチドGILGFVFTL(FLUM-001)由来であるため、本発明者らは、弱い免疫原性ヒトタンパク質由来のＵＶペプチドもまた、健常ヒト血中に多数の自己反応性ＣＤ８＋細胞が存在するため、望まないＴ細胞集団を刺激するリスクを有するか否かを分析した。本発明者らは、弱い免疫原性ヒトタンパク質由来のＵＶペプチドまたはその各親ペプチドを含むｐＨＬＡ分子を搭載したａＡＰＣでのインビトロプライミング後、ペプチド特異的Ｔ細胞集団の刺激および増殖があることを示した(図４)。さらなる実験において、ＣＤ８＋細胞を、ヒトＵＶペプチドを担持する標準再折り畳みｐＨＬＡ分子(図５、ＡのB*07:02_MUDENG-002)またはヒトＵＶペプチドを含むＵＶ単量体を使用するＵＶ交換後に得たｐＨＬＡ分子(A*03:01_HNRNPR-002×HADV-014；図５、Ｂ)を使用して、刺激した。いずれの場合も、それぞれ２.４％または６.７％のＣＤ８＋細胞のＵＶペプチド特異的Ｔ細胞集団が多量体染色により検出できた。これは、ヒト源タンパク質由来のＵＶペプチドも、ＵＶ交換後存在する残存ＵＶ単量体の場合のような低濃度であっても、特異的Ｔ細胞集団を刺激および増殖できることを示す(図５、Ｂ)。

【0218】

実施例４：刺激および検出のための種々の異なるＵＶペプチドのＵＶ単量体の使用は偽陽性シグナル検出を阻止する
結果に基づき、本発明者らは、ペプチド特異的Ｔ細胞の刺激および検出両方のためのｐＨＬＡ分子のＵＶ介在産生について同一ＵＶペプチドを有する単一ＵＶ単量体の使用が、検出細胞がレスキューペプチドまたはＵＶペプチドについて特異的であるならば、区別できないため、偽陽性結果になるか否かの試験を設定した。

【0219】

本発明者らは、抗ＣＤ２８ ｍＡｂおよびHLA-A*02_FLUM-003×CMV-001被覆ａＡＰＣでプライミング後、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を分析した。読み出しのために、細胞を分割し、標準再折り畳みｐＨＬＡ分子由来ｐＨＬＡ多量体(図６、プレートＡ)、FLUM-003のＵＶ介在リガンド交換により産生されたｐＨＬＡ分子(これはまた刺激にも使用した)(図６、プレートＢ)または他のＵＶ単量体、RPL19-005のＵＶ介在リガンド交換により産生したｐＨＬＡ分子(図６、プレートＣ)で染色した。本発明者らは、いくつかの例で(図６、刺激位置１および２参照)、FLUM-003特異的細胞は、同じＵＶ単量体を使用したならば、刺激および検出され、一方多量体染色のためのｐＨＬＡの産生のための他のＵＶ単量体の使用は、このFLUM-003特異的細胞の望まない検出を阻止したことを示した。FLUM-003特異的細胞不含ウェルの染色(図６、位置３)は、二重陽性集団の検出が、FLUM-003のＵＶ介在リガンド交換により産生されたｐＨＬＡの非特異的染色によるものではなく、多量体溶液中の低量の残存A*02_FLUM-003による特異的検出によることを確認した。
各々異なるＨＬＡアロタイプについて確立された、異なるＵＶペプチドを含む２個のＵＶ単量体を使用する本発明によるアプローチで、偽陽性シグナル検出は阻止できる。

【0220】

【表4】

【0221】

【表5】

【表5】

【0222】

参考文献：
Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, McHeyzer-Williams MG, Bell JI, McMichael AJ, Davis MM (1996). Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science 274, 94-96.
Andersen RS, Kvistborg P, Frosig TM, Pedersen NW, Lyngaa R, Bakker AH, Shu CJ, Straten P, Schumacher TN, Hadrup SR (2012b). Parallel detection of antigen-specific T cell responses by combinatorial encoding of MHC multimers. Nat Protoc 7, 891-902.
Bakker AH, Hoppes R, Linnemann C, Toebes M, Rodenko B, Berkers CR, Hadrup SR, van Esch WJE, Heemskerk MHM, Ovaa H, Schumacher TNM (2008). Conditional MHC class I ligands and peptide exchange technology for the human MHC gene products HLA-A1, -A3, -A11, and -B7. Proc Natl Acad Sci U S A., 105(10):3825-30
Chang CXL, Tan AT, Or MY, Toh KY, Lim PY, Chia ASE, Froesig TM, Nadua KD, Oh H-LJ, Leong HN, Hadrup SR, Gehring AJ, Tan Y-J, Bertoletti A Grotenbreg GM (2013). Conditional ligands for Asian HLA variants facilitate the definition of CD8+ T-cell responses in acute and chronic viral diseases. Eur. J. Immunol. 2013. 43: 1109-1120
Choo JAL, Thong SY, Yap J, van Esch WJE, Raida M, Meijers R, Lescar J, Verhelst SHL, Grotenbreg GM (2014). Bioorthogonal Cleavage and Exchange of Major Histocompatibility Complex Ligands by Employing Azobenzene-Containing Peptides. Angew Chem Int Ed Engl., 53(49):13390-4.
Dockree T, Holland CJ, Clement M, Ladell K, McLaren JE, van den Berg HA, Gostick E, Miners KL, Llewellyn-Lacey S, Bridgeman JS, Man S, Bailey M, Burrows SR, Price DA, Wooldridge L (2017). CD8 + T-cell specificity is compromised at a defined MHCI/CD8 affinity threshold. Immunol Cell Biol. 95, 68-76
Falk K, Roetzschke O, Stevanovic S, Jung G, Rammensee HG (1991). Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. Nature 351: 290-296
Frosig TM, Yap J, Seremet T, Lyngaa R, Svane IM, Straten PT, Heemskerk MHM, Grotenbreg GM, Hadrup SR (2015). Design and Validation of Conditional Ligands for HLA-B*08:01, HLA-B*15:01, HLA-B*35:01, and HLA-B*44:05. Cytometry Part A 87A, 967-975
Garboczi DN, Hung DT, Wiley DC (1992). HLA-A2-peptide complexes: refolding and crystallization of molecules expressed in Escherichia coli and complexed with single antigenic peptides. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 3429-3433.
Jung G, Ledbetter JA, Muller-Eberhard HJ (1987). Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates. Proc Natl Acad Sci U S A 84, 4611-4615.
Luimstra JJ, Garstka MA, Roex MCJ, Redeker A, Janssen GMC, van Veelen PA, Arens R, Falkenburg JHF, Neefjes J, Ovaa H (2018). A flexible MHC class I multimer loading system for large-scale detection of antigen-specific T cells. J Exp Med. 215(5):1493-1504
Musich JA and Rapoport H. Synthesis of Anthopleurine, the alarm pheromone from anthopleura elegantissima Journal of the American Chemical Society 1978, vol. 100, pp. 4865-4872
Jones JSJ (1993). Analysis of polypeptides and proteins. A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90
Nielsen M, Lundegaard C, Blicher T, Lamberth K, Harndahl M, Justesen S, Roder G, Peters B, Sette A, Lund O, Buus S (2007). NetMHCpan, a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and -B locus protein of known sequence. PLoS One 2(8):e796
Ojima I, Wang H, Wang T, and Ng EW (1998). New approaches to the asymmetric synthesis of dipeptide isosteres via beta-lactam synthon method. Tetrahedron Letters vol. 39, pp. 923-926.
Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S (1990). Immunogenetics 50: 213-219
Rodenko B, Toebes M, Hadrup SR, van Esch WJ, Molenaar AM, Schumacher TN, Ovaa H (2006). Generation of peptide-MHC class I complexes through UV-mediated ligand exchange. Nat Protoc 1, 1120-1132.
Seeger FH, Schirle M, Gatfield J, Arnold D, Keilholz W, Nickolaus P, Rammensee HG, Stevanovic S (1999). Immunogenetics 49: 571-576
Thaisrivongs S, Tomasselli AG, Moon JB, Hui J, McQuade TJ, Turner SR, Strohbach JW, Howe WJ, Tarpley WG, Heinrikson RL (1991). Inhibitors of the protease from human immunodeficiency virus: design and modelling of a compound containing a dihydroxyethylene isostere insert with high binding affinity and effective antiviral activity. Journal of Medicinal Chemistry vol. 34, pp. 2344-2356;
Thaisrivongs S, Turner SR, Strohbach JW, TenBrink RE, Tarpley WG, McQuade TJ, Heinrikson RL, Tomasselli AG, Moon JB, Hui JO, Howe WJ (1993). Inhibitors of the protease from human immunodeficiency virus: synthesis, enzyme inhibition, and antiviral activity of a series of compounds containing the dihydroxyethylene transition-state isostere. Journal of Medicinal Chemistry, vol. 36, pp. 941-952;
Toebes M, Coccoris M, Bins A, Rodenko B, Gomez R, Nieuwkoop NJ, van de KW, Rimmelzwaan GF, Haanen JB, Ovaa H, et al. (2006). Design and use of conditional MHC class I ligands. Nat Med 12, 246-251.

【0223】

実施態様
１. ペプチドＡ(ＰＡ)と主要組織適合性複合体(ＭＨＣ)分子の複合体に特異的に結合する抗原結合タンパク質を表面に発現する免疫細胞を選択する方法であって、次の：
(ｉ)異なる抗原結合タンパク質を発現する複数の免疫細胞を提供し；
(ii)複数の免疫細胞と
(ａ)ＭＨＣ分子１(Ｍ１)およびペプチドＡ(ＰＡ)を含む複合体１Ａおよび
(ｂ)Ｍ１とペプチドＢ(ＰＢ)を含む複合体１Ｘ
を含む第一組成物を接触させ；
(iii)複数の免疫細胞と
(ａ)ＭＨＣ分子２(Ｍ２)およびＰＡを含む複合体２Ａおよび
(ｂ)Ｍ２とペプチドＣ(ＰＣ)を含む複合体２Ｘ
を含む第二組成物を接触させ；
(iv)複数の免疫細胞から複合体１Ａ；特に複合体１Ａおよび複合体２Ａ両方に特異的に結合する原結合タンパク質を発現する免疫細胞を選択する
工程を含み；ここで、複合体１Ａおよび２Ａではなく、複合体１Ｘおよび２Ｘが規定の刺激、好ましくは規定の化学的および／または物理的刺激での刺激により解離し；そして、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列は少なくとも１個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも５個、６個、７個または８個のアミノ酸が異なるものである、方法。

【0224】

２.
－ 第一組成物を、
(ｉ)複合体１Ｘ(Ｍ１およびＰＢを含む)を提供し
(ii)ＰＡを提供し、そして
(iii)既定の刺激を提供し、それにより
－ ＰＢのＭ１からの解離および
－ ＰＡのＭ１への結合
を生じさせ、複合体１Ａの形成をもたらすことにより得て；
好ましくはここで主に複合体１Ａおよび残存量の複合体１Ｘを含む組成物を得る；および／または
－ 第二組成物を
－ (ｉ)複合体２Ｘ(Ｍ２およびＰＣを含む)を提供し
－ (ii)ＰＡを提供し、そして
－ (iii)既定の刺激を提供し、それにより
－ ＰＣからのＭ２の解離および
－ＰＡのＭ２への結合
を生じさせて、複合体２Ａの形成をもたらすことにより得て；
－ 好ましくはここで主に複合体２Ａおよび残存量の複合体２Ｘを含む組成物を得る、態様１の方法。

【0225】

３. 既定の刺激が物理的および／または化学的刺激である、態様１または２の方法。

【0226】

４. 既定の化学的または物理的刺激が温度上昇、特に１０℃未満から２５～４５℃、ｐＨ変化、特に中性から酸性またはアルカリ性ｐＨ、過ヨウ素酸との接触、亜ジチオン酸との接触およびＵＶ照射またはこれらの組み合わせからなる群、好ましくは温度上昇、特に１０℃未満から２５～４５℃、過ヨウ素酸との接触、亜ジチオン酸との接触およびＵＶ照射またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、態様１～３の何れかの方法。

【0227】

５. ＰＢおよびＰＣが、既定の刺激により活性化されたとき、それぞれＰＢまたはＰＣのペプチド主鎖内の共有結合を切断させる条件付きで反応性の基を含み、ここで、ＰＢおよびＰＣに含まれる条件付きで反応性の基は同一でも異なってもよい、好ましくは同一である、態様１～４の何れかの方法。

【0228】

６. Ｍ１および／またはＭ２、好ましくはＭ１およびＭ２がＭＨＣ－Ｉ分子である、態様１～５の何れかの方法。

【0229】

７. Ｍ１およびＭ２が同じアレルのＭＨＣ－Ｉ分子または同じアレルのＭＨＣ誘導体または抗原ペプチド結合フラグメントである、態様１～６の何れかの方法。

【0230】

８. Ｍ１および／またはＭ２、好ましくはＭ２がビオチン部分またはストレプトアビジン部分、好ましくはビオチン部分に結合している、態様１～７の何れかの方法。

【0231】

９. Ｍ１および／またはＭ２は担体に直接的または間接的に結合し、ここで、好ましくは、担体は、細胞、特に抗原提示細胞または、特に粒子、フィラメント、マイクロアレイチップおよびＥＬＩＳＡプレートからなる群から選択される、より特にストレプトアビジン、ストレプトアビジン－デキストランコンジュゲート、ナノビーズおよびマイクロビーズからなる群から選択される合成担体である、態様１～８の何れかの方法。

【0232】

１０. 条件付きで反応性の基が最初または最後の位置を除くＰＢおよび／またはＰＣのアミノ酸配列の任意の位置に存在するアミノ酸アナログである、態様２～９の何れかの方法。

【0233】

１１. 条件付きで反応性の基が光活性化可能基、亜ジチオン酸活性化可能基または過ヨウ素酸活性化可能基、好ましくは光活性化可能基を含む、態様２～１０の何れかの方法。

【0234】

１２. 光活性化可能基が３－アミノ－３－(２－ニトロ)フェニル－プロピオン酸またはその光活性化可能構造的等価物を含むおよび／またはジヒドロキシ部分を含む過ヨウ素酸感受性基である、態様１１の方法。

【0235】

１３. 免疫細胞がＴ細胞、より好ましくはＣＤ８Ｔ細胞である、態様１～１２の何れかの方法。

【0236】

１４. 抗原結合タンパク質がＴ細胞受容体(ＴＣＲ)である、態様１～１３の何れかの方法。

【0237】

１５. 工程(ｉ)で提供される複数の細胞が健常対象または疾患に罹患している対象の末梢血または末梢血画分から得られる、態様１～１４の何れかの方法。

【0238】

１６. 疾患が免疫疾患および新生物疾患、好ましくは新生物疾患、より好ましくは癌かなる群から選択される、態様１５の方法。

【0239】

１７. 画分が免疫細胞、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＣＤ８Ｔ細胞またはＣＤ４ Ｔ細胞が富化されている、態様１５または１６の方法。

【0240】

１８. 免疫細胞富化画分が、好ましくはＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４およびＣＤ１９からなる群から選択される１以上の免疫細胞特異的表面マーカーの検出可能な標識により選択される、態様１７の方法。

【0241】

１９. 工程(ｉ)で提供される複数の細胞が表現型決定されているＴ細胞である、態様１～１８の何れかの方法。

【0242】

２０. Ｔ細胞の表現型決定が、好ましくはＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６９、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７(ＣＣＲ７)、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＴＮＦα、ＩＬ７Ｒおよびテロメア長からなる群から選択される１以上のＴ細胞マーカーの存在の定量的または定性的決定を含む、態様１９の方法。

【0243】

２１. 工程ii)およびiii)が続いて実施され、好ましくは工程iii)が工程ii)に続いて実施される、態様１～２０の何れかの方法。

【0244】

２２. Ｍ１および／またはＭ２、好ましくはＭ２が検出可能標識または検出可能標識を含む担体に結合しており、ここで、検出可能標識は同一でも異なってもよい、態様１～２１の何れかの方法。

【0245】

２３. 検出可能標識が蛍光標識、磁気標識、ＲＮＡバーコード、ＤＮＡバーコードおよび放射性標識からなる群から選択される、態様２１または２２の方法。

【0246】

２４. 蛍光標識がキサンテン、アクリジン、オキサジン、シアニン、スチリル色素、クマリン、ポルフィリン、金属－リガンド－複合体、蛍光タンパク質、ナノ結晶、ペリレンおよびフタロシアニン、より好ましくはストレプトアビジン－フィコエリスリン(SA-PE)、ストレプトアビジン－フィコエリスリン－シアニン５(SA-PE-Cy5)、ストレプトアビジン－アロフィコシアニン(SA-APC)、ストレプトアビジン－アロフィコシアニン－シアニン７(SA-APC-Cy7)、ストレプトアビジン－ペリジニンクロロフィル－Ａタンパク質(SA-PerCP)、ストレプトアビジン－ペリジニンクロロフィル－Ａタンパク質－シアニン５.５(SA-PerCP/Cy5.5)、ストレプトアビジン－フィコエリスリン－シアニン７(SA-PE-Cy7)、ストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット４２１(SA-BV421)、ストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット５１０(SA-BV510)、ストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット５７０(SA-BV570)、ストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット６０５(SA-BV605)、ストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット６５０(SA-BV650)、ストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット７１１、ストレプトアビジン－ブリリアントバイオレット７８５(SA-BV785)、ストレプトアビジンVioBlue(SAVioBlue)、ストレプトアビジンアロフィコシアニンVio770(SA APC Vio770)、ストレプトアビジンペリジニンクロロフィル－Ａタンパク質Vio700(SA PerCPVio700)、ストレプトアビジンフィコエリスリンVio 770(SA PE Vio770)およびストレプトアビジン－フィコエリスリン－Dazzle594からなる群から選択される、態様２３の方法。

【0247】

２５. 標識がフローサイトメトリー分析、好ましくは蛍光活性化細胞分類(ＦＡＣＳ)または微小流体分析または分取分類分析様磁気活性化細胞分類(ＭＡＣＳ)により検出可能である、態様２３～２４の何れかの方法。

【0248】

２６. 工程iv)で選択される細胞が単細胞または細胞集団である、態様１～２５の何れかの方法。

【0249】

２７. 工程ii)が
(ｉ)さらに複数の細胞と共刺激分子、好ましくは抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１３７および／または抗ＣＤ１３４に対する抗体、より好ましくは抗ＣＤ２８および／または抗ＣＤ３の接触を含む；
(ii)さらに複数の細胞とＩＬ－２および／またはＩＬ－１２の接触を含む；および／または
(iii)少なくとも３日間、好ましくは少なくとも７日間、より好ましくは少なくとも１０日間実施する
、態様１～２６の何れかの方法。

【0250】

２８. 工程iii)がさらに複数の細胞と生存能色素および／または標識表面マーカー；好ましくはＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８および／またはＣＤ６９；より好ましくはＣＤ３および／またはＣＤ８との接触を含む、態様１～２７の何れかの方法。

【0251】

２９. 工程iv)が検出、特徴づけおよび単離の少なくとも１個および所望により単細胞または細胞集団の培養を含む、態様１～２８の何れかの方法。

【0252】

３０. ＰＡが、好ましくはウイルス抗原ペプチド、細菌抗原ペプチドおよび腫瘍関連抗原ペプチド(ＴＡＡ)から選択される抗原ペプチドである、より好ましくはＰＡがＴＡＡである、態様１～２９の何れかの方法。

【0253】

３１. ＰＡ、ＰＢおよび／またはＰＣが
－ ＭＨＣ－Ｉ結合ペプチドである；および／または
－ ８～１２アミノ酸長、好ましくは８～１１アミノ酸長を有する、
態様１～３０の何れかの方法。

【0254】

３２. ＰＢおよび／またはＰＣが
－ ＭＨＣ結合についてあるアミノ酸を必要としない位置に条件付きで反応性の基を含む；
－ 条件付きで反応性の基を溶媒暴露位置に含む；
－ 少なくとも０.４、好ましくは少なくとも０.５、より好ましくは少なくとも０.６、さらにより好ましくは少なくとも０.７の相対的Syfpeithiスコアを有する；および／または
－ ０.２以下、０.１以下、０.０５以下、０.０２以下、０.０１以下、好ましくは０.００５以下のNetMHCpanランクを有する、
態様１～３１の何れかの方法。

【0255】

３３. ＰＢおよび／またはＰＣがＭＨＣ分子と一体となってそれぞれ複合体１Ｘおよび／または２Ｘを形成し、ここで、１Ｘおよび／または２Ｘが
－ ＨＬＡ１molあたり少なくとも０.５、少なくとも０.２、少なくとも０.１、少なくとも０.０５、好ましくは少なくとも０.０２５molのｐＨＬＡ再折りたたみ収率を有する；
－ ＵＶ暴露非存在下、室温で、ＰＢＳなどの緩衝液中、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間または少なくとも２４時間安定である；
－ 低凝集を有する；
－ 低分解率を有する；および／または
－ 約＞５０％、好ましくは約＞７０％、より好ましくは約＞９０％の切断後の解離率を有する、
態様２～３２の何れかの方法。

【0256】

３４. ＰＢおよび／またはＰＣがＰＢおよびＰＣが提示されるＭＨＣアレルを発現する個体で高頻度で提示されるペプチド由来である、態様１～３３の何れかの方法。

【0257】

３５. ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列が少なくとも１個のアミノ酸が異なり、
ｉ) Ｍ１およびＭ２はHLA-A*01:01またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列がMUC16-010、MUC16-011、RNF213-010、RNF213-011、AXIN1-003、AXIN1-004、CLTC-002、CLTC-003、CLTC-004、好ましくはCLTC-002およびMUC16-010からなる群から選択され、より好ましくはＰＢがCLTC-002であり、かつＰＣがMUC16-010であり、ここで、MUC16-010が配列番号１を含むかまたはそれからなり、MUC16-011が配列番号２を含むかまたはそれからなり、RNF213-010が配列番号３を含むかまたはそれからなり、RNF213-011が配列番号４を含むかまたはそれからなり、AXIN1-003が配列番号５を含むかまたはそれからなり、AXIN1-004が配列番号６を含むかまたはそれからなり、CLTC-002が配列番号７を含むかまたはそれからなり、CLTC-003が配列番号８を含むかまたはそれからなり、そしてCLTC-004が配列番号９を含むかまたはそれからなる；または
ii) Ｍ１およびＭ２がHLA-A*02:01またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列がDDX5-002、DDX5-003、DDX5-004、DDX5-005、DDX5-006、RPL19-003、RPL19-004、RPL19-005およびFLUM-003、好ましくはDDX5-002、DDX5-003、DDX5-004、DDX5-005、DDX5-006、RPL19-003、RPL19-004、RPL19-005、より好ましくはDDX5-005およびRPL19-005からなる群から選択され、さらにより好ましくはＰＢがDDX5-005であり、かつＰＣがRPL19-005であり、ここで、DDX5-002が配列番号１０を含むかまたはそれからなり、DDX5-003が配列番号１１を含むかまたはそれからなり、DDX5-004が配列番号１２を含むかまたはそれからなり、DDX5-005が配列番号１３を含むかまたはそれからなり、DDX5-006が配列番号１４を含むかまたはそれからなり；RPL19-002が配列番号１６を含むかまたはそれからなり、RPL19-003が配列番号１７を含むかまたはそれからなり、RPL19-002が配列番号１８を含むかまたはそれからなり；FLUM-003が配列番号１９を含むかまたはそれからなる；または
iii) Ｍ１およびＭ２がHLA-A*03:01またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列がUVLA3-001、GIBB-002、GIBB-003、HNRNPR-002、HNRNPR-003およびHNRNPR-004、好ましくはGIBB-002およびHNRNPR-002からなる群から選択され、より好ましくはＰＢがGIBB-002であり、かつＰＣがHNRNPR-002であり、ここで、UVLA3-001が配列番号２０を含むかまたはそれからなり、GIBB-002が配列番号２１を含むかまたはそれからなり、GIBB-003が配列番号２２を含むかまたはそれからなり、HNRNPR-002が配列番号２４を含むかまたはそれからなり、HNRNPR-003が配列番号２５を含むかまたはそれからなり、HNRNPR-004が配列番号２６を含むかまたはそれからなる；または
iv) Ｍ１およびＭ２がHLA-A*24:02またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列がTEG-002、TEG-003、TEG-004、TEG-005、TEG-006、TEG-007、ＰＰＰ１CA-002、ＰＰＰ１CA-003、ＰＰＰ１CA-005、好ましくはTEG-007およびＰＰＰ１CA-005からなる群から選択され、より好ましくはＰＢがTEG-007であり、かつＰＣがＰＰＰ１CA-005であり、ここで、TEG-002が配列番号２９を含むかまたはそれからなり、TEG-003が配列番号３０を含むかまたはそれからなり、TEG-004が配列番号３１を含むかまたはそれからなり、TEG-005が配列番号３２を含むかまたはそれからなり、TEG-006が配列番号３３を含むかまたはそれからなり、TEG-007が配列番号３４を含むかまたはそれからなり、ＰＰＰ１CA-002が配列番号３５を含むかまたはそれからなり、ＰＰＰ１CA-003が配列番号３６を含むかまたはそれからなり、ＰＰＰ１CA-005が配列番号３８を含むかまたはそれからなる；または
ｖ) Ｍ１およびＭ２がHLA-B*07:02またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列が異なり、UVLB7-001、HLA-DPB1-002、HLA-DPB1-003、HLA-DPB1-004、CHCHD2-003およびMUDENG-002、好ましくはMUDENG-002およびDPB1-004からなる群から選択され、より好ましくはＰＢがMUDENG-002であり、かつＰＣがDPB1-004であり、ここで、UVLB7-001が配列番号３９を含むかまたはそれからなり、HLA-DPB1-002が配列番号４０を含むかまたはそれからなり、HLA-DPB1-003が配列番号４１を含むかまたはそれからなり、HLA-DPB1-004が配列番号４２を含むかまたはそれからなり、CHCHD2-003が配列番号４４を含むかまたはそれからなり、そしてMUDENG-002が配列番号４６を含むかまたはそれからなる；または
vi) Ｍ１およびＭ２がHLA-B*08:01またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列がMKI-003、MKI-004、VIM-004、VIM-005、COPA-008、PDCD10-002、PDCD10-003、MIR286-002、EBV-020、SPTAN-002およびLOC646214-003、好ましくはMKI-003、COPA-008、PDCD10-003、MIR286-002、EBV-020、SPTAN-002およびLOC646214-003、より好ましくはSPTAN-002およびLOC646214-003からなる群から選択され、さらにより好ましくはＰＢがSPTAN-002であり、かつＰＣがLOC646214-003であり、ここで、MKI-003が配列番号４９を含むかまたはそれからなり、MKI-004が配列番号５０を含むかまたはそれからなり、VIM-004が配列番号５１を含むかまたはそれからなり、VIM-005が配列番号５２を含むかまたはそれからなり、COPA-008が配列番号５３を含むかまたはそれからなり、PDCD10-002が配列番号５４を含むかまたはそれからなり、PDCD10-003が配列番号５５を含むかまたはそれからなり、MIR286-002が配列番号５６を含むかまたはそれからなり、EBV-020が配列番号５７を含むかまたはそれからなり、SPTAN-002が配列番号５８を含むかまたはそれからなり、LOC646214-003が配列番号５９を含むかまたはそれからなり；
vii) Ｍ１およびＭ２がHLA-B*44:02またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列がSPTBN1-002、SPTBN1-003、SPTBN1-004、CLTC-006、CLTC-007、CSE1-005およびCSE1-006、好ましくはSPTBN1-004およびCSE1-005からなる群から選択され、より好ましくはＰＢがSPTBN1-004であり、かつＰＣがCSE1-005であり、ここで、SPTBN1-002が配列番号６０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-003が配列番号６１を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-004が配列番号６２を含むかまたはそれからなり、CLTC-006が配列番号６３を含むかまたはそれからなり、CLTC-007が配列番号６４を含むかまたはそれからなり、CSE1-005が配列番号６５を含むかまたはそれからなり、そしてCSE1-006が配列番号６６を含むかまたはそれからなる；または
viii) Ｍ１およびＭ２がHLA-B*44:05またはそのＭＨＣ誘導体もしくはその抗原ペプチド結合フラグメントであり、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列がSPTBN1-002、SPTBN1-003、SPTBN1-004、CLTC-006、CLTC-007、CSE1-005およびCSE1-006、好ましくはSPTBN1-004およびCLTC-006からなる群から選択され、より好ましくはＰＢがSPTBN1-004であり、かつＰＣがCLTC-006であり、ここで、SPTBN1-002が配列番号６０のアミノ酸配列を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-003が配列番号６１を含むかまたはそれからなり、SPTBN1-004が配列番号６２を含むかまたはそれからなり、CLTC-006が配列番号６３を含むかまたはそれからなり、CLTC-007が配列番号６４を含むかまたはそれからなり、CSE1-005が配列番号６５を含むかまたはそれからなり、そしてCSE1-006が配列番号６６を含むかまたはそれからなり、
ここで、配列番号１～配列番号６６において、Ｘが条件付きで反応性の基を表す、態様１～３４の何れかの方法。

【0258】

３６. 配列番号１～１９、２１～３８および４０～６６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有し、ここで、各配列において、Ｘが条件付きで反応性の基を表す、好ましくは条件付きで反応性のアミノ酸アナログである、条件付きペプチド。

【0259】

３７. 条件付きペプチドが、該ペプチドが提示されるＭＨＣアレルを発現する個体で高頻度で提示される親ペプチド由来である、態様３６の条件付きペプチド。

【0260】

３８. 該条件付きペプチドを含む条件付きペプチドＭＨＣ複合体が
－ ＨＬＡ鎖
１molあたり少なくとも０.５、少なくとも０.２、少なくとも０.１、少なくとも０.０５、好ましくは少なくとも０.０２５mol ｐＨＬＡの再折りたたみ収率を有する；
－ ＵＶ暴露非存在下、室温で、ＰＢＳなどの緩衝液中、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間または少なくとも２４時間安定である；
－ 低凝集を有する；
－ 低分解率を有する；および／または
－ 約＞５０％、好ましくは約＞７０％、より好ましくは約＞９０％の切断後の解離率を有する、
態様３６または３７の条件付きペプチド。

【0261】

３９. 条件付きペプチドが配列番号１～１８、２１～３８、４０～５６および５８～６６からなる群から選択される、好ましくは配列番号３～１８、２１～３８、４０～４８、５１～５６および５９～６６からなる群から選択される、態様３６～３８の何れかの条件付きペプチド。

【0262】

４０. 条件付きペプチドがHLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*03:01、HLA-A*24:02、HLA-B*07:02、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01またはHLA-B*44:05に特異的である、態様３６～３９の何れかの条件付きペプチド。

【0263】

４１. 態様１～３５の何れかの方法により選択された免疫細胞。

【0264】

４２. ｐＭＨＣ複合体１Ａに特異的に結合する抗原結合タンパク質をコードする核酸の配列を決定する方法であって：
(ｉ)態様１～３５の何れかの方法で選択した免疫細胞から抗原結合タンパク質をコードする核酸を単離し；そして
(ii)核酸配列を決定する
工程を含む、方法。

【0265】

４３. 抗原結合タンパク質を発現する宿主細胞を産生する方法であって：
(ｉ)宿主細胞を準備し；
(ii)態様１～３５の何れかの方法で選択した免疫細胞から抗原結合タンパク質をコードする核酸を単離し；
(iii)工程(ii)で単離した核酸または抗原結合タンパク質もしくはその抗原結合フラグメントをコードする該核酸の一部を含む遺伝子構築物を産生し；そして
(iv)該宿主細胞に該遺伝子構築物を導入する
工程を含む、方法。

【0266】

４４. 抗原結合タンパク質を産生する方法であって、態様４３の方法により産生した宿主細胞を提供し、該宿主細胞に導入した遺伝子構築物を発現させることを含む、方法。

【0267】

４５. 抗原結合タンパク質がＴＣＲまたはその抗原結合フラグメントであり、ここで、好ましくは、ＴＣＲまたはその抗原結合フラグメントが６個のＣＤＲ配列を含む、態様４３または４４の方法。

【0268】

４６. 態様４４の方法により産生された抗原結合タンパク質。

【0269】

４７. 態様４６の抗原結合タンパク質をコードする核酸または該核酸を含むベクター。

【0270】

４８. 好ましくは表面にペプチドとＭＨＣ分子の複合体と特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現する細胞を選択するための、キットであって：
ａ)ペプチドＢ(ＰＢ)およびＭＨＣ分子１(Ｍ１)を含む複合体１Ｘ；およびペプチドＣ(ＰＣ)とＭＨＣ分子２(Ｍ２)を含む複合体２Ｘ；または
ｂ)ペプチド(ＰＢ)およびペプチド(ＰＣ)ならびに所望によりＰＢおよびＰＣが結合し、それにより複合体１Ｘおよび２Ｘを各々形成するＭＨＣ分子、特にＭ１および／またはＭ２；および
ｃ)所望によりβ２－ミクログロブリン
を含み；ここで、複合体１Ｘおよび２Ｘが規定の化学的および／または物理的刺激での刺激により解離し；そして、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列が少なくとも１個のアミノ酸、好ましくは少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個のアミノ酸が異なる、ペプチドＡ(ＰＡ)およびＭ１またはＭ２を含む複合体１Ａに特異的に結合する抗原結合タンパク質の選択のためである、キット。

【0271】

４９. 態様１～３５の何れかの方法により選択された免疫細胞、態様４３の方法により産生された宿主細胞、態様４６の抗原結合タンパク質および／または態様４７の核酸またはベクターを含む、医薬組成物。

【0272】

５０. 医薬として使用するための、態様１～３５の何れかの方法により選択された免疫細胞、態様４０の方法により産生された宿主細胞、態様４４の抗原結合タンパク質および／または態様４５の核酸またはベクター。

【0273】

５１. 新生物疾患の処置または予防の方法において使用するための、態様１～３５の何れかの方法により選択された免疫細胞、態様４３の方法により産生された宿主細胞、態様４６の抗原結合タンパク質および／または態様４７の核酸またはベクター。

【0274】

５２. 処置を必要とする対象に治療有効量の態様１～３５の何れかの方法により選択された免疫細胞、態様４３の方法により産生された宿主細胞、態様４６の抗原結合タンパク質および／または態様４７の核酸またはベクターを投与することを含む、新生物疾患を処置する方法。

【0275】

５３. 処置を必要とする対象における新生物疾患を処置する方法であって：
(ｉ)Ｔ細胞を含む対象の免疫細胞集団を提供し；
(ii)工程(ｉ)の免疫細胞集団と
(ａ)ＭＨＣ分子１(Ｍ１)とペプチドＡ(ＰＡ)を含む複合体１Ａおよび
(ｂ)Ｍ１とペプチドＢ(ＰＢ)を含む複合体１Ｘ
を含む第一組成物を接触させ；
(iii)免疫細胞集団と
(ａ)ＭＨＣ分子２(Ｍ２)とＰＡを含む複合体２Ａおよび
(ｂ)Ｍ２およびペプチドＣ(ＰＣ)を含む複合体２Ｘ
を含む第二組成物を接触させ；
(iv)免疫細胞集団から複合体１Ａ；特に複合体１Ａおよび複合体２Ａ両方に特異的に結合するＴＣＲを発現する少なくとも１個のＴ細胞を選択し；そして
(ｖ)培養により少なくとも１個の選択Ｔ細胞の数を増加させ；そして
(vi)培養Ｔ細胞を対象に再導入する
工程を含み；ここで、複合体１Ａおよび２Ａではなく、複合体１Ｘおよび２Ｘが規定の刺激での刺激により解離し；そして、ＰＢおよびＰＣのアミノ酸配列が少なくとも１個のアミノ酸が異なるものである、方法。

【0276】

５４. ｐＭＨＣ複合体の製造のための、態様３６～３９の何れかのペプチドの使用。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

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【国際調査報告】