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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-26
(54)【発明の名称】治療用単一ドメイン抗体
(51)【国際特許分類】
A61K 39/395 20060101AFI20240918BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240918BHJP
C07K 14/47 20060101ALI20240918BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240918BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240918BHJP
A61K 45/06 20060101ALI20240918BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240918BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20240918BHJP
A61K 31/7068 20060101ALI20240918BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240918BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20240918BHJP
C07K 16/32 20060101ALN20240918BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240918BHJP
【ＦＩ】
A61K39/395 E
C07K16/18 ZNA
C07K14/47
A61P35/00
A61P35/02
A61K45/06
A61P43/00 121
A61K39/395 T
A61K31/704
A61K31/7068
A61K45/00
C12N15/13
C12P21/08
C07K16/32
C12N15/12
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024512121
(86)(22)【出願日】2022-08-26
(85)【翻訳文提出日】2024-02-22
(86)【国際出願番号】 US2022075526
(87)【国際公開番号】W WO2023028589
(87)【国際公開日】2023-03-02
(31)【優先権主張番号】63/237,987
(32)【優先日】2021-08-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】524008672
【氏名又は名称】シン バイオテクノロジー、エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】シン、シュナンダ
【テーマコード（参考）】
4B064
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA05
4C084AA17
4C084AA18
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZC751
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB11
4C085BB50
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA10
4C086EA17
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB26
4C086ZB27
4C086ZC75
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、細胞内成分に対して作られた単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を使用して、対象における異常な細胞増殖を防止するための組成物および方法であって、前記異常な細胞増殖は癌であり得る、組成物および方法を提供する。ｓｄＡｂは、１つまたは複数の化学療法薬と相乗的であり、癌に対する１つまたは複数の化学療法薬の治療効果を改善する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞内成分に対して作られた単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を使用して、対象における異常な細胞増殖を防止する方法。
【請求項2】
前記異常な細胞増殖が癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項3】
前記癌が、骨肉腫、線維肉腫、神経膠芽腫、白血病、膵臓癌、乳癌および前立腺癌を含む群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ｓｄＡｂが、１つまたは複数の化学療法薬と相乗的であり、癌に対する前記１つまたは複数の化学療法薬の治療効果を改善する、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記１つまたは複数の化学療法薬がドキソルビシンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記１つまたは複数の化学療法薬がゲムシタビンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記ｓｂＡｂが、１つまたは複数の化学療法薬の毒性を減少させ、前記処置された対象の生存を改善する、請求項４に記載の方法。
【請求項8】
前記ｓｂＡｂが１つまたは複数の化合物と組み合わせて使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記細胞内成分がタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記タンパク質が、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂまたはＳＴＡＴ６を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
ＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害するための方法であって、ＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項13】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
ＳＴＡＴ３の活性化を阻害するための方法であって、ＳＴＡＴ３の活性化を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項15】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
Ｔ細胞増殖を阻害するための方法であって、Ｔ細胞増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項17】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
視力を維持するための方法であって、視力を維持することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項19】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項21】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項23】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
ＣＤ４＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項25】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
ＣＤ４＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞増殖によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞増殖によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項27】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項29】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項30】
ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の増殖によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の増殖によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項31】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
ＣＤ４＋ＲＯＲγＴ＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＲＯＲγＴ＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項33】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
ＣＤ４＋ＲＯＲγＴ＋Ｔ細胞の増殖によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＲＯＲγＴ＋Ｔ細胞の増殖によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項35】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
ＣＤ４＋グランザイム－Ｂ＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋グランザイム－Ｂ＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項37】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
ＣＤ４＋グランザイム－Ｂ＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋グランザイム－Ｂ＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項39】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項41】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項43】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項45】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項47】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項49】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項に記載の方法。
【請求項50】
ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１αを含む群から選択される１つまたは複数のサイトカインによって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１αを含む群から選択される１つまたは複数のサイトカインによって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項51】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
Ｔｈ１、ＴｒｅｇおよびＴｈ１７病原性細胞の増殖を阻害するための方法であって、Ｔｈ１、ＴｒｅｇおよびＴｈ１７病原性細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項53】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
Ｔｈ１、ＴｒｅｇおよびＴｈ１７病原性細胞によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、Ｔｈ１、ＴｒｅｇおよびＴｈ１７病原性細胞によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項55】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記疾患が、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、アトピー性皮膚炎および１型糖尿病を含む群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項57】
自己免疫疾患によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、自己免疫疾患によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項58】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のインビトロモデルにおいて網膜上皮細胞によるＶＥＧＦ産生を阻害するための方法であって、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のインビトロモデルにおいて網膜上皮細胞によるＶＥＧＦ産生を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項60】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
ＡＭＤおよび眼の血管新生疾患によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＡＭＤおよび眼の血管新生疾患によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項62】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
ＶＥＧＦによって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＶＥＧＦによって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項64】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
ＰＤ－Ｌ１発現の下方制御のための方法であって、ＰＤ－Ｌ１発現の下方制御を必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項66】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
細胞の核内へのＳＴＡＴ３の移行を阻害するための方法であって、細胞の核内へのＳＴＡＴ３の移行を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項68】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
ＩＬ－６の作用を阻害するための方法であって、ＩＬ－６の作用を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項70】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
化学療法薬の有効性を増強するための方法であって、化学療法薬の有効性を増強することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項72】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項73】
前記化学療法薬がゲムシタビンを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項74】
細胞膜、血液脳関門および血液網膜関門を透過させるための方法であって、細胞膜、血液脳関門および血液網膜関門を透過させることを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項75】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項76】
化学療法薬の毒性を減少させるための方法であって、化学療法薬の毒性を減少させることを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項77】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項に記載の方法。
【請求項78】
前記化学療法薬がドキソルビシンである、請求項７６に記載の方法。
【請求項79】
ＳＴＡＴ３の機能を阻害するための方法であって、ＳＴＡＴ３の機能を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項80】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項81】
癌細胞におけるＫＲＡＳおよび変異ＫＲＡＳの機能を阻害するための方法であって、癌細胞におけるＫＲＡＳおよび変異ＫＲＡＳの機能を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項82】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項83】
ＶＥＧＦ産生を阻害するための方法であって、ＶＥＧＦ産生を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項84】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項85】
ＰＤ－Ｌ１発現を阻害するための方法であって、ＰＤ－Ｌ１発現を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【請求項86】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項８５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年８月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／２３７，９８７号の恩典を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
本出願は、２０２１年８月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／２３７，９８７号の恩典を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【0002】
配列表
本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は、２０２２年８月１９日に作成された「ｓｅｑ ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２６」という表題のファイルとして提供されており、サイズが３，０００バイトである。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、電子形式の配列表とともに出願されている。配列表は、２０２２年８月１９日に作成された「ｓｅｑ ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２６」という表題のファイルとして提供されており、サイズが３，０００バイトである。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【0003】
シグナル伝達および転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）は、シグナル伝達分子かつ転写因子であり、一方、Ｋｉｒｓｔｅｎ ＲＡＳの哺乳動物ホモログ（ＫＲＡＳ）は、ＧＴＰ結合タンパク質を中継するシグナルである。いずれも、細胞増殖、生存、分化、アポトーシス、細胞遊走、幹細胞自己再生、炎症および血管新生を制御する。ＳＴＡＴ３およびＫＲＡＳの変異活性型（例えば、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｖ）の異常な発現は、複数の癌の誘導および維持において十分に確立されている。腫瘍過程におけるそれらの中心的役割故に、ＳＴＡＴ３およびＫＲＡＳ変異タンパク質は抗癌標的と考えられてきた。しかしながら、ＳＴＡＴ３およびＫＲＡＳ変異タンパク質はまた、薬物動態学的障壁および毒性障壁のために臨床的に「薬になり得ない」細胞内分子であると考えられている。癌細胞中のこれらのタンパク質の阻害は、腫瘍量を低下させ、癌の臨床管理を強化すると思われるが、この重要な課題は、満たされていない要求であり続けている。
【0004】
伝統的な化学療法は、単独では、しばしば処置に不十分であり、重大な毒性をもたらすことがあり得、膵臓癌、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、神経膠芽腫および肉腫を含む多くのヒト悪性腫瘍の処置を困難にする。さらに、新しい標的療法は、しばしば重要なシグナル伝達経路の遮断に関連する癌細胞における薬物耐性の発生のために、最終的にしばしば無効になり得る。発癌性変異、腫瘍抑制遺伝子の喪失、正常なタンパク質の過剰発現またはこれらの事象のいくつかの組み合わせも薬物耐性に寄与する。ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）／ＳＴＡＴ経路は、細胞増殖、分化および炎症応答の重要な調節因子である。リン酸化されたＳＴＡＴ３（ｐ－ＳＴＡＴ３）の上昇は、固形腫瘍を有する癌の予後不良と関連付けられてきた。活性化されたＳＴＡＴ３は、核に移行するホモ二量体を形成し、そこでＤＮＡを結合して、細胞の増殖、増殖、抗アポトーシス、血管新生、免疫抑制および浸潤／遊走に関連する標的遺伝子の転写を開始する。腫瘍プロセスにおけるその中心的な役割のために、ＳＴＡＴ３は、１９９８年に癌遺伝子として最初に記載されて以来、抗癌標的となり得ると考えられており、インビトロおよびインビボ実験腫瘍モデルにおける抗腫瘍活性についてのＳＴＡＴ３阻害剤の評価に至った。しかしながら、主として薬物動態、有効性および安全性が支障となって、これらの阻害剤の大部分は、癌処置のための臨床的使用に移行するには至っていない。ＫＲＡＳ変異体は、ヒト癌の約２５％に対するドライバー変異であることが示されているが、膵臓癌（９８％）および結腸直腸癌（５３％）で最も頻繁に存在する。変異型は、ＧＴＰを加水分解せずにＧＤＰを保持し、それによって恒常的に活性になる。多くの研究者が、数十年にわたってＫＲＡＳ変異体に対する小分子標的の開発に注力してきた。しかしながら、これらの小分子がＫＲＡＳを結合するための結合ポケットを検出する上での問題のため、これはほぼ不可能な課題となっており、処置における使用に関して承認されている阻害性薬物はこれまでのところ存在しない。
【0005】
癌細胞は、化学療法および放射線療法に対して耐性になるための回避機構としてｐ－ＳＴＡＴ３を利用する。小分子阻害剤でＳＴＡＴ３を阻害することは、癌の増殖を抑制し、アポトーシスを活性化し、血管新生を阻害するだけでなく、膵臓癌の間質を構築し直すことも示されている。第１相試験中にヒト患者においてＳＴＡＴ３を阻害することは、これが安全で耐容性が高いアプローチであることを実証している。研究は、ＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害すること、ＤＮＡ結合を阻害すること、または機能的なＳＴＡＴ３二量体の形成を妨げることのいずれかによって作用する、ＳＴＡＴ３の新規な小分子阻害剤を同定することに焦点を当ててきた。
【0006】
ラクダ科動物の抗体は、重鎖あたり１つの可変ドメインを有する２つの重鎖免疫グロブリン（ＶＨＨ）から構成される。ラクダ科動物のＶＨＨは複数の細胞外標的（例えば、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１７、ＴＮＦ－α、ＶＷＦなど）を標的とするために使用されており、いくつかのＶＨＨはヒト臨床試験の様々な段階にあり（第ＩＩ相および第ＩＩＩ相）、大きな副作用または毒性は報告されていない。１つのＶＨＨ、すなわちカプラシズマブが、ＦＤＡによって承認されており、成人後天性血栓性血小板減少性紫斑病を処置するために市販化に成功している。
【0007】
本発明は、１５ｋＤａの単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ＳＢＴ－１００（配列番号１）の治療的使用に関する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、ＳＴＡＴ３およびＫＲＡＳタンパク質の両方にナノモル濃度の親和性で結合し、腫瘍細胞の細胞質中に透過し、ＳＴＡＴ３のリン酸化および核移行を損ない、最終的にＶＥＧＦレベルおよびＰＤ－Ｌ１発現の低下、ウイルス複製の減少および有意な癌細胞増殖阻害をもたらすことができる。さらに、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、インビトロでＫＲＡＳ ＧＴＰアーゼ活性およびＥＲＫの下流のリン酸化を阻害する。複数のヒト癌細胞株の増殖をインビトロで阻害することに加えて、ＫＲＡＳ（Ｇ１３Ｄ）変異を有するトリプルネガティブ乳癌細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）およびＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）変異を有する膵臓癌細胞株（ＰＡＮＣ－１）の両方の無胸腺異種移植マウスモデルにおいて、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置は、観察可能な毒性なしに腫瘍体積を低下させる。ＳＢＴ－１００（配列番号１）はまた、血液脳関門（ＢＢＢ）を透過するその能力において他に類を見ないように見受けられる。これらの結果は、癌治療を改善するために、到達困難な異常な細胞内転写因子およびシグナル伝達タンパク質を１つのＶＨＨによって同時に標的とすることが実現可能であることを実証している。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、細胞内成分に対して作られた単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を使用して、対象における異常な細胞増殖を防止する方法を含む。一局面において、異常な細胞増殖は、例えば、骨肉腫、線維肉腫、神経膠芽腫、白血病、膵臓癌、乳癌および前立腺癌などの癌である。別の局面において、ｓｄＡｂは、１つまたは複数の化学療法薬と相乗的であり、例えばドキソルビシンおよびゲムシタビンなどの、癌に対する１つまたは複数の化学療法薬の治療効果を改善する。一局面において、ｓｂＡｂは、１つまたは複数の化学療法薬の毒性を減少させ、処置された対象の生存を改善する。別の局面において、ｓｂＡｂは、１つまたは複数の化合物と組み合わせて使用される。一局面において、細胞内成分は、例えば、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂまたはＳＴＡＴ６などのタンパク質を含む。前記ｓｄＡｂがＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む、請求項１に記載の方法。ＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害するための方法であって、ＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害することを必要とする患者への、例えば、ＳＢＴ－１００（配列番号１）などのｓｄＡｂの投与を含む、方法。
【0009】
別の態様において、本発明は、ＳＴＡＴ３の活性化を阻害するための方法であって、ＳＴＡＴ３の活性化を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0010】
別の態様において、本発明は、Ｔ細胞増殖を阻害するための方法であって、Ｔ細胞増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0011】
別の態様において、本発明は、視力を維持するための方法であって、視力を維持することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0012】
別の態様において、本発明は、ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0013】
別の態様において、本発明は、ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0014】
別の態様において、本発明は、ＣＤ４＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0015】
別の態様において、本発明は、ＣＤ４＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞増殖によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞増殖によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）（配列番号１）を含む。
【0016】
別の態様において、本発明は、ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）（配列番号１）を含む。
【0017】
別の態様において、本発明は、ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の増殖によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＬ－１７＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の増殖によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0018】
別の態様において、本発明は、ＣＤ４＋ＲＯＲγＴ＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＲＯＲγＴ＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0019】
別の態様において、本発明は、ＣＤ４＋ＲＯＲγＴ＋Ｔ細胞の増殖によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＲＯＲγＴ＋Ｔ細胞の増殖によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0020】
別の態様において、本発明は、ＣＤ４＋グランザイム－Ｂ＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋グランザイム－Ｂ＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0021】
別の態様において、本発明は、ＣＤ４＋グランザイム－Ｂ＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋グランザイム－Ｂ＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0022】
別の態様において、本発明は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0023】
別の態様において、本発明は、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0024】
別の態様において、本発明は、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0025】
別の態様において、本発明は、ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋Ｔ細胞の増殖を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋Ｔ細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0026】
別の態様において、本発明は、ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＣＤ４＋ＩＬ－１０＋Ｔ細胞によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0027】
別の態様において、本発明は、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１αを含む群から選択される１つまたは複数のサイトカインによって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＩＬ－１７、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２３、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－１αを含む群から選択される１つまたは複数のサイトカインによって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0028】
別の態様において、本発明は、Ｔｈ１、ＴｒｅｇおよびＴｈ１７病原性細胞の増殖を阻害するための方法であって、Ｔｈ１、ＴｒｅｇおよびＴｈ１７病原性細胞の増殖を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0029】
別の態様において、本発明は、Ｔｈ１、ＴｒｅｇおよびＴｈ１７病原性細胞によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、Ｔｈ１、ＴｒｅｇおよびＴｈ１７病原性細胞によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。別の局面において、疾患は、関節リウマチ、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、アトピー性皮膚炎および１型糖尿病を含む群から選択される。
【0030】
別の態様において、本発明は、自己免疫疾患によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、自己免疫疾患によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0031】
別の態様において、本発明は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のインビトロモデルにおいて網膜上皮細胞によるＶＥＧＦ産生を阻害するための方法であって、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）のインビトロモデルにおいて網膜上皮細胞によるＶＥＧＦ産生を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0032】
別の態様において、本発明は、ＡＭＤおよび眼の血管新生疾患によって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＡＭＤおよび眼の血管新生疾患によって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0033】
別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦによって引き起こされる疾患を阻害するための方法であって、ＶＥＧＦによって引き起こされる疾患を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0034】
別の態様において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１発現の下方制御のための方法であって、ＰＤ－Ｌ１発現の下方制御を必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0035】
別の態様において、本発明は、細胞の核内へのＳＴＡＴ３の移行を阻害するための方法であって、細胞の核内へのＳＴＡＴ３の移行を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0036】
別の態様において、本発明は、ＩＬ－６の作用を阻害するための方法であって、ＩＬ－６の作用を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0037】
別の態様において、本発明は、化学療法薬の有効性を増強する方法であって、化学療法薬の有効性を増強することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。別の局面において、化学療法薬はゲムシタビンを含む。
【0038】
別の態様において、本発明は、細胞膜、血液脳関門および血液網膜関門を透過させるための方法であって、細胞膜、血液脳関門および血液網膜関門を透過させることを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0039】
別の態様において、本発明は、化学療法薬の毒性を減少させるための方法であって、化学療法薬の毒性を減少させることを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。一局面において、化学療法薬はドキソルビシンである。別の局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0040】
別の態様において、本発明は、ＳＴＡＴ３の機能を阻害するための方法であって、ＳＴＡＴ３の機能を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0041】
別の態様において、本発明は、癌細胞におけるＫＲＡＳおよび変異ＫＲＡＳの機能を阻害するための方法であって、癌細胞におけるＫＲＡＳおよび変異ＫＲＡＳの機能を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0042】
別の態様において、本発明は、ＶＥＧＦ産生を阻害するための方法であって、ＶＥＧＦ産生を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0043】
別の態様において、本発明は、ＰＤ－Ｌ１発現を阻害するための方法であって、ＰＤ－Ｌ１発現を阻害することを必要とする患者へのｓｄＡｂの投与を含む、方法を含む。一局面において、ｓｄＡｂは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）を含む。
【0044】
本発明のこれらおよび他の特徴、局面および利点は、以下の説明、添付の特許請求の範囲および添付の図面に関してよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0045】
【0046】
【図2】図２は、Ａ）処理されていない、Ｂ）ＳＢＴ－１００（配列番号１）処理で６時間処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるリン酸化されたＳＴＡＴ３と総ＳＴＡＴ３の両方の細胞内レベルを示す蛍光画像；Ｃ）処理されていないか、またはＤ）６時間のＳＢＴ－１００（配列番号１）処理後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるｔＳＴＡＴ３の共焦点画像を表す。Ｅ）処理されていないか、またはＦ）６時間のＳＢＴ－１００（配列番号１）処理後のいずれかのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるｐＳＴＡＴ３の蛍光画像が示されている。Ｇ）処理されていないか、またはＨ）６時間のＳＢＴ－１００（配列番号１）処理後のいずれかのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるｐＳＴＡＴ３の共焦点画像が示されている。
【0047】
【0048】
【0049】
【0050】
【0051】
【0052】
【0053】
【0054】
【0055】
【0056】
【0057】
【0058】
【0059】
【0060】
【発明を実施するための形態】
【0061】
本明細書で使用される場合、以下の用語およびその変形は、そのような用語が使用される文脈によって異なる意味が明確に意図されない限り、以下に与えられている意味を有する。
【0062】
本明細書で使用される「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語および同様の指示対象は、文脈におけるそれらの使用が別段の指示をしない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。
【0063】
「抗原決定基」という用語は、抗原結合分子（本発明のｓｄＡｂまたはポリペプチドなど）によって、より具体的には抗原結合分子の抗原結合部位によって認識される抗原上のエピトープを指す。「抗原決定基」および「エピトープ」という用語も互換的に使用され得る。特定の抗原決定基、エピトープ、抗原またはタンパク質に結合することができる、親和性を有する、および／または特異性を有するアミノ酸配列は、抗原決定基、エピトープ、抗原またはタンパク質「に対する」または「に対して作られた」と言われる。
【0064】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などのこの用語の変形は、他の付加要素、成分、整数または工程を排除することを意図しない。
【0065】
本明細書に記載されるｓｄＡｂ、ポリペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置換され、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性にほとんどまたは本質的に影響を及ぼさないアミノ酸置換として一般に記述することができる、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を含有することができると考えられる。保存的アミノ酸置換は当技術分野で周知である。保存的置換は、以下の群（ａ）～（ｅ）内の１つのアミノ酸が同じ群内の別のアミノ酸によって置換される置換である：（ａ）小さい脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；（ｂ）極性の負に荷電した残基およびそれらの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｃ）極性の正に荷電した残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；（ｄ）大きな脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；ならびに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。他の保存的置換としては、ＡｌａからＧｌｙもしくはＳｅｒへ；ＡｒｇからＬｙｓへ；ＡｓｎからＧｌｎもしくはＨｉｓへ；ＡｓｐからＧｌｕへ；ＣｙｓからＳｅｒへ；ＧｌｎからＡｓｎへ；ＧｌｕからＡｓｐへ；ＧｌｙからＡｌａもしくはＰｒｏへ；ＨｉｓからＡｓｎもしくはＧｌｎへ；ＩｌｅからＬｅｕもしくはＶａｌへ；ＬｅｕからＩｌｅもしくはＶａｌへ；ＬｙｓからＡｒｇ、ＧｌｎもしくはＧｌｕへ；ＭｅｔからＬｅｕ、ＴｙｒもしくはＩｌｅへ；ＰｈｅからＭｅｔ、ＬｅｕもしくはＴｙｒへ；ＳｅｒからＴｈｒへ；ＴｈｒからＳｅｒへ；ＴｒｐからＴｙｒへ；ＴｙｒからＴｒｐへ；および／またはＰｈｅからＶａｌ、ＩｌｅもしくはＬｅｕへの置換が挙げられる。
【0066】
本明細書で使用される「ドメイン」は、一般に、抗体鎖の球状領域、特に重鎖抗体の球状領域、またはそのような球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。
【0067】
ｓｄＡｂのアミノ酸配列および構造は、典型的には、それぞれ、「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」と；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」と；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」と；および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と称される、４つのフレームワーク領域または「ＦＲ」から構成される。フレームワーク領域は、それぞれ「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」と、「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」と、および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」称される３つの相補性決定領域または「ＣＤＲ」によって中断されている。
【0068】
本明細書で使用される場合、「ヒト化ｓｄＡｂ」という用語は、天然に存在するＶＨＨ配列のアミノ酸配列中の１つまたは複数のアミノ酸残基が、ヒト由来の従来の４鎖抗体からのＶＨドメイン中の対応する位置に存在するアミノ酸残基の１つまたは複数によって置き換えられたｓｄＡｂを意味する。これは、当技術分野で周知の方法によって行われ得る。例えば、ｓｄＡｂのＦＲは、ヒト可変ＦＲによって置き換えられ得る。
【0069】
本明細書で使用される場合、「単離された」核酸またはアミノ酸は、その供給源または培地、別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分または高分子または夾雑物、不純物または微量成分などの、その核酸またはアミノ酸に通常伴っている少なくとも１つの他の成分から分離されている。
【0070】
「哺乳動物」という用語は、哺乳綱に属する個体として定義され、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、イヌおよびネコなどの、家畜および農耕動物ならびに動物園、スポーツおよびペット動物を含むがこれらに限定されない。
【0071】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」は、薬学的投与に適合する、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。適切な担体は、当該分野の標準的な参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例には、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）および５％ヒト血清アルブミンが含まれるが、これらに限定されない。リポソーム、カチオン性脂質および不揮発性油などの非水性ビヒクルも使用され得る。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来の媒体または作用物質が上で定義した治療剤と適合しない場合を除いて、本発明の組成物におけるその使用が企図される。
【0072】
「定量的イムノアッセイ」とは、抗体を使用することによって試料中に存在する抗原の量を測定する任意の手段を指す。定量的イムノアッセイを行うための方法としては、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、特異的分析物標識および再捕捉アッセイ（ＳＡＬＲＡ）、液体クロマトグラフィー、質量分析、蛍光活性化セルソーティングなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0073】
「溶液」という用語は、溶媒および溶質を含む組成物を指し、真の溶液および懸濁液を含む。溶液の例としては、液体に溶解された固体、液体または気体、および液体に懸濁された微粒子またはミセルが挙げられる。
【0074】
「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子または抗原結合タンパク質分子が結合することができる異なる種類の抗原または抗原決定基の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性および／またはアビディティに基づいて決定され得る。抗原と抗原結合性タンパク質との解離の平衡定数（ＫＤ）によって表される親和性は、抗原決定基と抗原結合性タンパク質上の抗原結合部位との間の結合強度の尺度であり、ＫＤの値が低いほど、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合強度がより強くなる（あるいは、親和性は、１／ＫＤである親和定数（ＫＡ）として表すこともできる）。当業者に明らかなように、親和性は、関心対象の特異的抗原に応じて決定され得る。アビディティは、抗原結合分子と抗原との間の結合の強さの尺度である。アビディティは、抗原決定基と抗原結合分子上のその抗原結合部位との間の親和性および抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方に関連する。抗原または抗原決定基への抗原結合タンパク質の特異的結合は、例えばスキャッチャード解析ならびに／またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイなどの競合結合アッセイなどの任意の公知の方法によって決定され得る。
【0075】
本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、本発明のｓｄＡｂを産生するために使用される遺伝子工学的方法（例えば、クローニングおよび増幅）の使用を指す。
【0076】
「単一ドメイン抗体」、「ｓｄＡｂ」または「ＶＨＨ」は、一般に、３つの相補性決定領域によって中断された４つのフレームワーク領域から構成されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質として定義され得る。これは、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４と表される。本発明のｓｄＡｂはまた、ｓｄＡｂアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはタンパク質を含む。典型的には、ｓｄＡｂはラマなどのラクダ科動物で産生されるが、当技術分野で周知の技術を使用して合成的に生成することもできる。本明細書で使用される場合、天然に存在する重鎖抗体中に存在する可変ドメインは、「ＶＨドメイン」と呼ばれる従来の４鎖抗体中に存在する重鎖可変ドメインおよび「ＶＬドメイン」と呼ばれる従来の４鎖抗体中に存在する軽鎖可変ドメインと区別するために、「ＶＨＨドメイン」とも呼ばれる。「ＶＨＨ」および「ｓｄＡｂ」本明細書では互換的に使用される。ｓｄＡｂまたはポリペプチドのアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔら（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、ＵＳ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１）によって与えられるＶＨドメインに対する一般的なナンバリングに従う。このナンバリングによれば、ｓｄＡｂのＦＲ１は位置１～３０のアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＣＤＲ１は位置３１～３６のアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＦＲ２は位置３６～４９のアミノ酸を含み、ｓｄＡｂのＣＤＲ２は位置５０～６５のアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＦＲ３は位置６６～９４のアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＣＤＲ３は位置９５～１０２のアミノ酸残基を含み、ｓｄＡｂのＦＲ４は位置１０３～１１３のアミノ酸残基を含む。
【0077】
「合成」という用語は、インビトロ化学合成または酵素合成による産生を指す。
【0078】
本明細書で使用される「標的」という用語は、ｓｄＡｂによって認識される任意の成分、抗原または部分を指す。「細胞内標的」という用語は、細胞内に存在する任意の成分、抗原または部分を指す。「膜貫通標的」は、細胞膜内に位置する成分、抗原または部分である。「細胞外標的」は、細胞の外側に位置する成分、抗原または部分を指す。
【0079】
本明細書で使用される「治療用組成物」は、薬学的組成物、遺伝物質、生物製剤および他の物質などの、治療効果を有することが意図される物質を意味する。遺伝物質には、遺伝子ベクター、遺伝子調節エレメント、遺伝子構造エレメント、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの直接的または間接的な遺伝子治療効果を有することが意図される物質が含まれる。生物製剤には、治療効果を有することが意図された、生命体であるまたは生命体に由来する物質が含まれる。
【0080】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」および「予防有効量」という語句は、疾患または疾患の明白な症候の処置、予防または管理において治療上の利益を提供する量を指す。治療有効量は、疾患、疾患の症候または疾患に対する素因を治癒する、治す、緩和する、軽減する、変化させる、治療する、寛解させる、改善する、または影響を与える目的で、疾患または症状、疾患の症候または疾患に対する素因を処置し得る。治療上有効な具体的な量は、通常の医療従事者によって容易に決定され得、例えば、疾患の種類、患者の病歴および年齢、疾患の病期、ならびに他の治療薬の投与などの当技術分野で公知の要因に応じて変化し得る。
【0081】
ＳＴＡＴ３は、ＩＬ－６、他のサイトカインおよび細胞内キナーゼによって活性化され、その結果、Ｐ－ＳＴＡＴ３が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）などの遺伝子を作動させ、ＣＮＶおよび炎症性疾患に必要なＴＨ１７細胞の分化を促進する細胞内転写因子である。ＳＴＡＴ３を阻害すると、ＶＥＧＦ産生が停止され、ＴＨ１７細胞の生成が妨げられる。
【0082】
血清中でのＶＨＨの半減期は短いにもかかわらず、血管形成が十分でなく、容易に接近できない組織中に存在する抗原を標的とする能力のために、ラクダ科動物のＶＨＨは、臨床使用に関してますます検討されている。さらに、ＶＨＨは、室温および還元的な細胞質環境において安定である。腫瘍形成に関与する２つの異なる非相同細胞内標的（ＳＴＡＴ３およびＫＲＡＳ）に結合することができる、細胞透過能を有するＶＨＨ、ＳＢＴ－１００（配列番号１）が本明細書に記載されている。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、（１）細胞膜を横切って細胞内ＳＴＡＴ３に結合し、（２）ＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害し、（３）総ＳＴＡＴ３を減少させ、（４）活性化されたＳＴＡＴ３の核内へのＩＬ－６媒介性移行を遮断して、ｐＳＴＡＴ３二量体がその標的遺伝子に結合するのを妨げ、（５）重要な血管新生因子であり、腫瘍細胞の公知の調節因子である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を阻害し、（６）腫瘍細胞表面上のチェックポイント阻害剤ＰＤ－Ｌ１の細胞表面発現を阻害し、これにより免疫正常マウスにおいて抗腫瘍免疫を改善し得、（７）ＫＲＡＳ－ＧＴＰアーゼ活性および下流のＥＲＫリン酸化を阻害して細胞増殖を阻害し、（８）１１のヒト癌に対してインビトロで広範囲の抗腫瘍細胞増殖を示し、（９）トリプルネガティブ乳癌細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）および膵臓癌（ＰＡＮＣ－１）についての無胸腺異種移植マウスモデルにおいて、観察可能な毒性なしに腫瘍（活性化ＫＲＡＳ変異を有するヒト癌）退縮を誘導する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）の生物学的効果は可逆的であり、インビトロで少なくとも７２時間、インビボで７日間持続する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）はまた、ＢＢＢを透過するその能力において他に類を見ないように見受けられる。細胞膜を透過し、細胞内のＫＲＡＳおよびＳＴＡＴ３を結合するＳＢＴ－１００（配列番号１）の能力は、インビトロおよびインビボでの癌の成長および増殖の機能的抑制につながる。これは、ヒト癌を阻害するＳＢＴ－１００（配列番号１）の広範な適用を示すために、複数のヒト癌を用いて実証された。
【0083】
本発明は、細胞膜を透過してＳＴＡＴ３に結合し、ＫＲＡＳ（変異型および非変異型）と交差反応する能力を有し、ｎＭ結合親和性を有する二重特異性抗体として作用するＳＢＴ－１００（配列番号１）の能力に関する。（１）細胞膜を横切って細胞内ＳＴＡＴ３に結合し、（２）ＳＴＡＴ３のリン酸化を阻害し、（３）総ＳＴＡＴ３を減少させ、（４）活性化されたＳＴＡＴ３の核内へのＩＬ－６媒介性移行を遮断し、ｐ－ＳＴＡＴ３二量体がその標的遺伝子に結合するのを妨げ、（５）重要な血管新生因子であり、腫瘍細胞の公知の調節因子である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を阻害し、（６）腫瘍細胞表面上のチェックポイント阻害剤ＰＤ－Ｌ１の細胞表面発現を阻害し、これにより免疫正常マウスにおいて抗腫瘍免疫を改善し得、（７）ＫＲＡＳ－ＧＴＰアーゼ活性および下流のＥＲＫリン酸化を阻害し、これにより細胞増殖を阻害し、（８）インビトロで広範囲の抗腫瘍細胞増殖を示し、（９）ＫＲＡＳ（Ｇ１３Ｄ）変異を有するトリプルネガティブ乳癌細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）およびＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）変異を有する膵臓癌細胞株（ＰＡＮＣ－１）についての無胸腺異種移植マウスモデルにおいて、観察可能な毒性なしに腫瘍退縮を誘導するので、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、抗癌薬として治療的に投与され得る。さらに、ＳＢＴ－１００（配列番号１）の生物学的効果は、インビトロで７２時間およびインビボで７日間の間持続する。
【0084】
加齢黄斑変性（ＡＭＤ）を処置する上での現在の標準的な治療は、ＶＥＧＦを標的とすることを含み、３～４週間毎の眼内注射を必要とする。この抗ＶＥＧＦ抗体療法は、１つのサイトカイン経路のみを標的とし、他のサイトカイン経路は影響を受けない。
【0085】
より高いレベルの全身性炎症マーカーであるＣＲＰおよびＩＬ－６は、独立して、ＡＭＤの進行と関連する。ＡＭＤにおける脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）膜は、増加したＩＬ－６と関連している。全身のＩＬ－６レベルは、ＡＭＤの発生および進行と相関することが示されている。ＩＬ－６シグナル伝達は、後期新生血管ＡＭＤにおける網膜下線維形成の発病に寄与し得る。
【0086】
老化した眼における増加したＩＬ－１０は、マクロファージの活性化および血管増殖を誘導するＳＴＡＴ３シグナル伝達を活性化する。マクロファージにおけるＩＬ－１０受容体媒介性シグナル伝達およびＳＴＡＴ３活性化の両方の標的化された阻害は、老化表現型を逆転させる。
【0087】
ＩＬ－１７は、ＡＭＤの病原性炎症に関与している。ＩＬ－１７は、ＶＥＧＦ非依存的に血管新生を刺激する強い潜在能力を有する。ＩＬ－１７Ａは、ＡＲＰＥ－１９細胞において細胞生存率を低下させ、細胞代謝を変化させ、アポトーシスを誘導する。老化およびＡＭＤ様変性は、マウスにおける眼のＩＬ－１７発現の増加に関連する。
【0088】
骨髄系細胞におけるＳＯＣＳ３の遺伝的欠失は、自発的なＳＴＡＴ３活性化および加速されたＣＮＶ形成をもたらした。小ペプチドＬＬＬ１２を用いたＳＴＡＴ３活性化の阻害は、レーザーによって誘発されたＣＮＶを抑制した。循環免疫細胞におけるＳＴＡＴ３活性化は、新生血管加齢黄斑変性に関連している。
【0089】
ＳＴＡＴ３は、ＶＥＧＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびＩＬ－１７を転写する転写因子である。これらのサイトカインは全て、ＡＭＤを促進する網膜中の炎症性変化を引き起こす。したがって、ＳＴＡＴ３の阻害は、これらのＡＭＤを引き起こすサイトカインの産生を停止させるであろう。
【0090】
ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色によって実証されるように、６時間以内に細胞内に移行する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、ヒト網膜上皮細胞によるＶＥＧＦタンパク質産生を１２時間以内にゼロ近くまで阻害する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、２４～４８時間以内にＰＤ－Ｌ１細胞表面発現を１／１０に阻害する。ＶＥＧＦおよびＰＤ－Ｌ１はいずれも、ＳＢＴ－１００（配列番号１）によって阻害されるＳＴＡＴ３転写因子の遺伝子標的である。
【0091】
ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、１５分でＢＢＢを通過し、マウス脳のニューロンおよびグリア細胞内で染色され得る。マウスおよびラットにおけるＳＢＴ－１００（配列番号１）の血清半減期は１時間である。癌異種移植モデルにおけるＳＢＴ－１００（配列番号１）の生物学的半減期は１２～２４時間である。網膜の生物学的半減期は、少なくとも２４～４８時間である。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、１１の異なる種類のヒト癌および網膜細胞の細胞膜を透過し、ＢＢＢを横切り、網膜血液関門も通過する。
【0092】
炎症カスケードおよび血管シグナル伝達経路を遮断することによって、ＳＴＡＴ３を阻害することは、角膜血管新生、増殖性糖尿病性網膜症、乾性角結膜炎、ＡＭＤおよびブドウ膜炎などの多くの眼の炎症性および新生血管性症状を処置する上で有効であり得る。角膜血管新生は、角膜の透明性を維持する、血管新生因子と抗血管新生因子の間のバランスの崩壊によって引き起こされる。増殖性糖尿病性網膜症（ＰＤＲ）は、主に、網膜内の血管が閉じて血流が妨げられているときに起こる。元の血管が閉鎖した領域に血液を供給しようとして、網膜は新しい血管を成長させることによって応答する（血管新生）。これらの新しい血管は異常であり、不適切な血流を網膜に供給し、新しい血管は、網膜にしわまたは剥離を引き起こす瘢痕組織をしばしば伴う。網膜虚血は、その後網膜の損傷をもたらす線維性および新生血管の成長を誘導する血管増殖因子を促進する。乾性角結膜炎は、眼表面の破壊であり、涙膜は角膜の炎症および損傷をもたらす。不十分な涙膜（乾燥）による結膜および角膜の慢性的な両側性乾燥による。ＡＭＤ－脈絡膜新生血管膜（ＣＮＶＭ）からの網膜下新生血管膜は、網膜の下で成長して視力を乱す新しい血管である。ＣＮＶＭは、多くの重篤な眼疾患、最も一般的には「滲出型」加齢黄斑変性（ＡＭＤ）に関連する。
【0093】
ブドウ膜炎および多発性硬化症などの中枢神経系（ＣＮＳ）自己免疫疾患は、血液網膜関門（ＢＲＢ）、血液脳関門（ＢＢＢ）および周皮細胞、血管周囲マクロファージ、密着して結合した内皮細胞、ミュラー／ミクログリアのグリア境界膜によって構成される神経血管単位（ＮＶＵ）によって維持される脳、脊髄または神経網膜の免疫特権の破壊の結果として生じる。これらの構造は、末梢免疫系からＣＮＳ組織を隔離し、グランザイムＢを産生するＴｈ１７細胞は、ＢＢＢまたはＢＲＢの破壊を促進することによってＣＮＳ自己免疫疾患を開始する初期事象に関与する。しかしながら、ミクログリア細胞の持続的活性化および他の炎症性細胞の動員は、炎症応答を増幅し、慢性ブドウ膜炎または多発性硬化症に特徴的な病理学を担う。それにもかかわらず、マウスにおいてブドウ膜炎を抑制するためにサイトカインまたは免疫抑制化合物などの生物製剤を使用する介入研究は、疾患改善と病原性Ｔｈ１７細胞の抑制との強い相関を常に示す。その後の研究により、Ｔｈ１７分化および発達に対するＳＴＡＴ３の必要性が明らかにされたが、他の研究では、ＳＴＡＴ３の標的化された欠失がＥＡＥまたはＥＡＵの発達を妨げることが示された。これらの研究により、Ｔｈ１７細胞を標的とすることが、自己免疫疾患および自己炎症性疾患を抑制および緩和するための実行可能な治療アプローチであるという現在確立されている概念が導かれた。
【0094】
ブドウ膜炎は、寛解および再発性眼内炎症の反復サイクルを特徴とする視力を脅かす可能性がある眼内炎症性疾患の多様な群であり、視力障害は、患者の生活の質に影響を及ぼすため、公衆衛生上極めて重要である。網膜へのＴｈ１７細胞の動員の増加は、ブドウ膜炎の病態生理学に関与しており、現在の治療法には、眼周囲または硝子体内のコルチコステロイドが含まれる。しかしながら、慢性ブドウ膜炎を処置するための眼周囲または硝子体内コルチコステロイドの長期使用には、緑内障などの重篤な副作用の発生が伴い、代替療法の開発を推し進める原因となっている。Ｔｈ１７細胞を誘導することができない遺伝子改変マウスは、ブドウ膜炎の発症に対して抵抗性であるので、Ｔｈ１７細胞の分化および拡大のために必要とされるＳＴＡＴ３経路を標的とすることが、ブドウ膜炎を緩和するための治療法になり得るとして提案されている。しかしながら、ＳＴＡＴ３経路を標的とすることに対する主な障害は、ＳＴＡＴ３が細胞内タンパク質であり、ＳＴＡＴ３特異的抗体にアクセスできないことに加えて、低分子量ＳＴＡＴ３阻害性ペプチドまたは模倣物の予測不可能な薬物動態学的特徴である。
【0095】
ブドウ膜炎は、自己免疫症状、外傷および感染症から起こり得る虹彩、毛様体または脈絡膜の眼炎症である。腫脹を生じ、眼壁（ブドウ膜）内の組織の中間層を破壊する炎症性疾患の群を表す一般用語。これらの疾患には、交感性眼炎、散弾状網脈絡膜症、ベーチェット病、フォークト・小柳・原田病および眼サルコイドーシスが含まれる。ブドウ膜炎は、ブドウ膜に限らず、水晶体、網膜、視神経および硝子体にも影響を及ぼし、視力低下または失明をもたらす。ブドウ膜炎は、米国における視力喪失の１０％の原因である一群の眼内炎症性疾患である。Ｔｈ１７ Ｔヘルパー細胞サブセットは、マウスおよびヒトにおけるブドウ膜炎の病因に関与している。ＳＴＡＴ３は、Ｔｈ１７細胞の分化において極めて重要な役割を果たしており、Ｔｈ１７細胞を標的化して欠失させたマウスは、ヒトブドウ膜炎のマウスモデルである実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）を発症しない。その結果、ブドウ膜炎および他の炎症性疾患の治療法としてＳＴＡＴ３経路を標的とする薬物および生物製剤の開発に大きな関心が寄せられている。
【0096】
ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、インビトロでは６時間未満で細胞膜を素早く通過し、インビボでは１５分未満でＢＢＢを通過する。細胞に入ると、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、ナノモル濃度の親和性でＫＲＡＳおよびＳＴＡＴ３に非共有結合する。不可逆的な共有結合を形成する小分子阻害剤とは異なり、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、ＫＲＡＳおよびＳＴＡＴ３への非共有結合性の可逆的結合のために、毒性を生じる可能性がより低い。ＫＲＡＳのＧＴＰアーゼ活性の遮断およびその後のｐＥＲＫ１／２のレベルの減少は、細胞増殖、生存およびアポトーシス回避を促進するＫＲＡＳ経路の能力を阻害する。同時に、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、ＳＴＡＴ３にも結合し、ＳＴＡＴ３のリン酸化の阻害を引き起こして、ＳＴＡＴ３が核内に移行できないようにし、ＳＴＡＴ３がそのＤＮＡプロモーターに結合するのを妨げる。ＳＢＴ－１００（配列番号１）の阻害能力および抗炎症能力の絶好の例は、ＳＴＡＴ３がＶＥＧＦおよびＰＤ－Ｌ１などの核内の標的遺伝子を転写することを妨げることによって、インビトロで癌細胞および正常細胞に対するＩＬ－６の作用を遮断するＳＢＴ－１００（配列番号１）の能力によっても実証される。
【0097】
ＶＥＧＦは、新しい血管の発達を引き起こすことによって、腫瘍の成長および転移において極めて重要な役割を果たす。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、インビトロで網膜上皮細胞によるＶＥＧＦの産生を１２時間という迅速さで著しく低下させ、単回投与の生物学的効果は少なくとも４８時間持続する。これは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）が癌における抗腫瘍効果を低減し得、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）などの新生血管症状における失明を低減し得ることを示唆している。失明のためのインビボモデルにおいて、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は視力の著しい改善を与えることが示された。ＳＴＡＴ３の他の遺伝子標的は、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１である。ＩＦＡは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）が２４時間以内にＴＮＢＣ（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）上のＰＤ－Ｌ１発現を減少させることを実証する。同様の結果が骨肉腫（ＳＪＳＡ－１）についても得られ、ＦＡＣＳ分析は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）が４８時間以内にＰＤ－Ｌ１発現を減少させることを示した。これは、チェックポイント阻害剤遺伝子を下方制御することによる免疫療法への新しいアプローチに相当する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）を使用するこの戦略は、ＳＴＡＴ３の利用可能性を減少させることを通じてＰＤ－Ｌ１分子およびおそらくはＰＤ－１分子の数を減少させ得るので、ニボルマブおよびペンブロリズマブが遮断する細胞表面標的の存在がより少なくなる。これは、チェックポイント阻害剤の応答を増強し得るか、またはチェックポイント阻害剤の投与量の低下を可能にし得る。ＳＴＡＴ３は炎症促進性メディエータであるので、ＳＢＴ－１００（配列番号１）によるＳＴＡＴ３阻害はまた、肺臓炎および重症ＣＯＶＩＤ－１９病態などの、チェックポイント阻害剤療法に関連する炎症性合併症の一部を減少させ得る。
【0098】
これらの結果は、ＫＲＡＳ（Ｇ１３Ｄ）変異を有するＴＮＢＣ腫瘍（少なくとも５０～１００ｍｍ３）を有する無胸腺ヌードマウス異種移植片における腫瘍退縮の形態で、ＳＢＴ－１００（配列番号１）の有効性を確認する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）の治療効果は、最後の用量後少なくとも７日間持続した。同様に、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、ゲムシタビンと組み合わせた場合、腫瘍増殖の抑制を増強した。ＰＡＮＣ－１は、ＫＲＡＳ非依存性であるため、処置することが困難な悪性腫瘍であることが知られている。これらの実験は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）が、単独でまたは他の化学療法剤と組み合わせて、インビボで著しい腫瘍増殖抑制を引き起こすことを示唆している。
【0099】
本明細書に記載されているＳＢＴ－１００（配列番号１）の最も独特な局面は、細胞内透過性および非相同なＫＲＡＳとの交差反応性である。細胞膜およびＢＢＢを透過するというＳＢＴ－１００（配列番号１）の新規な特性は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）に、ＳＴＡＴ３媒介性である疾患またはＫＲＡＳ変異を有する癌を標的とする上で多大な臨床的可能性を与える。
【0100】
例
例１：材料および方法
例１：材料および方法
【0101】
ＳＢＴ－１００（配列番号１）の開発：そのＮ末端にＧＳＴタグが融合された組換え完全長ヒトＳＴＡＴ３（ＳＴＡＴ３－１４９６Ｈ）は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ（Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ）によって提供された。簡潔に述べると、組換えヒトＳＴＡＴ３での免疫化のためにカメラス・バクトリアヌス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）を使用した。ＳＢＴ－１００（配列番号１）ＶＨＨの生成：ラクダ科動物を関連抗原で免疫した。免疫化期間後、末梢白血球（ＰＷＢＣ）を収集し、関心対象のＶＨＨを探すためにファージディスプレイライブラリーを作製した。パニングプロセスが完了したら、ＳＴＡＴ３およびＫＲＡＳに対するＶＨＨの結合親和性によってＶＨＨを同定した。最終的なエンドトキシンレベルは、１ＥＵ／ｍｇ未満であった。ＳＢＴ－１００（配列番号１）のアミノ酸配列（配列番号１）は、ＨＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＡＮＧＧＲＳＣＭＧＷＦＲＱＶＰＧＫＥＲＥＧＶＳＧＩＳＴＧＧＬＩＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＴＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＭＹＹＣＡＴＳＲＦＤＣＹＲＧＳＷＦＮＲＹＭＹＮＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ）である。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、米国特許第１４，９２２，０９３号に以前に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【0102】
細胞株および細胞培養：細胞株ＰＡＮＣ－１、ＢｘＰＣ３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－４６８、ＭＣＦ－７、ＢＴ４７４、Ｕ８７、ＳＪＳＡ－１、ＨＴ－１０８０、ＨＥｐ２、ＤＵ－１４５および網膜上皮細胞（ＡＲＰＥ－１９）は全て、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。ウシ胎児血清を含むまたは含まないＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ培地のいずれかの中で、全ての細胞を３７℃、５％ＣＯ２で増殖させた。
【0103】
免疫蛍光および免疫組織化学染色：免疫組織化学および免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）染色のために、標準的な手順を使用した。ＩＦのための一次抗体は、抗ｔ－ＳＴＡＴ３：（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ｐ－ＳＴＡＴ３：（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＰＤ－Ｌ１：（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＶＨＨ抗体：（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－抗ウサギＩｇＧ：（ＡＦ抗ｒａｂＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）であった。ブロッキング溶液、１°および２°抗体希釈液は１％ＢＰ：（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）であった。全ての細胞インキュベーションは、培地中で、５％ＣＯ２インキュベータ中において、３７℃で行われた。４，５００細胞／ウェルをチャンバースライドに播種し、一晩接着させた。様々な時点で細胞をＳＢＴ－１００（配列番号１）で処理し、次いで、－２０℃で、１００％メタノールで固定した。
【0104】
ＩＦＡ：ウェルを３０分間以上ブロッキングし、ブロッキング剤を除去し、一次抗体を以下の希釈で添加した後、５℃で一晩インキュベートした：抗ＶＨＨ＝１：５００、抗ｔ－ＳＴＡＴ３＝１：３００、抗Ｐ－ＳＴＡＴ３＝１：１２５、抗ＰＤ－Ｌ１＝１：３００。ウェルをＰＢＳで洗浄し、ＡＦ抗ｒａｂＩｇＧ（１：３００）と１時間以上インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、カバーガラスをかぶせ、蛍光顕微鏡によって検査した。ＤＡＰＩ染色のために、ウェルを０．１４３ｍＭ ＤＡＰＩとともに７分間インキュベートし、カバーガラスを適用する前にＰＢＳで洗浄した。Ｎｉｋｏｎ ８０ｉ顕微鏡および適切な波長フィルターを使用して、従来の蛍光顕微鏡検査を行った。添付のＳｐｏｔ ＲＴ３カメラ（モデル２５．４、２Ｍｐスライダー）および付属のＳｐｏｔ ５．１ソフトウェアを使用して画像を撮影した。
【0105】
共焦点顕微鏡法：Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８共焦点顕微鏡を使用して共焦点画像を得た。Ｆｉｊｉソフトウェアを使用して画像を定量化した。
【0106】
腫瘍内およびＢＢＢ方法論のためのＩＨＣ染色：確立されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍を有する無胸腺ヌードマウス（ｎ＝３）に、ＳＢＴ－１００（配列番号１）（１ｍｇ／ｋｇ）をＩＰ注射した。１５分後、マウスを屠殺し、その脳および腫瘍を採取した。１０％ホルマリン中に組織を２４時間配置した後、７０％エタノールに移した。組織をデルマトーム（ＡＭＬ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）で切片に切断した。ヤギ抗Ｉｌａｍａコンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ）二次抗体（１：１０，０００）をこれらの組織切片とともに室温で１０分間インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ ２０で３分間２回洗浄した。組織切片のストレプトアビジン／ペルオキシダーゼ複合体中でのインキュベーションを室温で５分間行い、次いでＰＢＳで５分間洗浄した。次に、組織切片をペルオキシダーゼ基質溶液（ＡＥＣ）と１５分間インキュベートし、水道水中で５分間洗浄し、ヘマトキシリンＱＳ（各切片上に１滴）で対比染色し、３０秒間インキュベートした。次いで、水が無色になるまで、組織切片を水道水ですすいだ。切片を水性封入剤中に封入し、１５分後、これらのスライドをＯｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１蛍光顕微鏡で観察した。
【0107】
ウエスタンブロット（Ｓｌｏｔ Ｂｌｏｔ）：標準的な手順を免疫ブロッティングのために使用した。一次抗体は、抗βアクチン：（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ｔ－ＳＴＡＴ３：（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗Ｐ－ＳＴＡＴ３：（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ＰＤ－Ｌ１：（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＨＲＰ－抗ウサギＩｇＧ：（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）であった。ブロッキング緩衝液、一次および二次抗体希釈液＝５％ ＢＴ：（ＴＢＳ中５％ ＢＳＡ）ＴＢＳ＝トリス緩衝生理食塩水：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．５ ＴＢＳＴ＝ＴＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０。簡潔には、２×１０５個のＭＤＡ細胞／ウェルを６ウェルプレートの各ウェルに播種し、培地中で、５％ＣＯ２インキュベータ中において３７℃で一晩接着させた。培地を除去し、培地中のＳＢＴ－１００（配列番号１）を添加した。示された時間のインキュベーション後、培地を除去し、細胞の接着性単層を氷冷したＰＢＳで洗浄し、次いで、ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を添加したＴＢＳ＋０．０５％ ＳＤＳ中で細胞をこすり取ることによって細胞の溶解を行った。非接着性細胞が明白であった処理のその後の時点で、これらの細胞を遠心分離によって収集し、溶解を行い、接着性細胞集団の可溶化液と合わせた。
【0108】
ウエスタンブロットの定量：ＢＣＡタンパク質アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、各画分のタンパク質濃度を決定した。細胞画分のそれぞれからの等量のタンパク質（典型的には約１０μｇ／スロット）をＴＢＳで２００μｌ／スロットに希釈し、スロットブロット装置を介して、１００％メタノール中で事前に活性化され、次いでＴＢＳ中で平衡化されたＰＶＤＦ膜上に搭載した。５％ＢＴ中でブロットを１時間以上ブロッキングし、次いで、抗体の以下の希釈液中で、５℃で一晩インキュベートした：抗βアクチン＝１：１０００、抗ｔ－ＳＴＡＴ３＝１：１０００、抗Ｐ－ＳＴＡＴ３＝１：７５０、抗ＰＤ－Ｌ１＝１：１０００。ブロットをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＴＢＳ中に短時間平衡化し、次いで、ＨＲＰ－抗ｒａｂＩｇＧ（１：５０００）と事前に１時間以上インキュベートした。洗浄工程を繰り返し、製造業者のプロトコルに従って、ブロットを化学発光ＨＲＰ基質とインキュベートした。ケミイメージャを用いて反応を可視化した。Ｆｉｊｉ画像処理パッケージ内に含まれるＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して定量化を行った。
【0109】
ｐ－ＳＴＡＴ３核移行のＩＬ－６刺激および阻害：細胞（ＨＥｐ－２およびＰＡＮＣ－１）を４つのＰｅｒｍａｎｏｘチャンバースライド上で増殖させた。ＳＢＴ－１００（配列番号１）抗体を一晩添加し（培地中に１～１０希釈）、スライドを３７℃に保った。陰性対照試料にはＳＢＴ－１００（配列番号１）抗体を添加しなかった。翌日、細胞をＩＬ－６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００ｎｇ／ｍｌ）で１５分間刺激した。刺激後、氷冷した１００％メタノール中で、チャンバースライドを２０℃で１０分間、直ちに固定した。スライドを乾燥させ、前述のＩＦＡ工程を進めた。ＰＢＳ中３％ ＢＳＡにより室温で１時間、その後、一次抗体であるＳｔａｔ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により、４℃で一晩、スライドをブロッキングした。二次抗体抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を室温で１時間添加した。最後に、チャンバースライドを洗浄し、封入剤で封入し、Ｎｉｋｏｎ蛍光顕微鏡で観察した。
【0110】
Ｐｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＴＰアーゼ－Ｇｌｏ（商標）Ａｓｓａｙ）：このアッセイでは、ＨＥＫ ２９３ ＩＬ－６ ＳＴＡＴ３レポーター細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を使用してＳＴＡＴ３転写活性を測定した。この細胞株において、４０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－６による誘導は、ＳＴＡＴ３転写因子を活性化してルシフェラーゼレポーター発現を推進し、次いで、ルシフェラーゼレポーター発現を標準的なルミノメーターで測定することができる。１０５細胞／ウェルをＳＢＴ－１００（配列番号１）抗体とともにまたは抗体なしで４８時間インキュベートした。ＩＣ５０値を試験するために、１００ｕｇ／ｍｌで開始する８点の２倍滴定を行った。インキュベーションの最後の１８時間の間にＩＬ－６を添加した。全ての時点は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）阻害剤の添加から計時される。４８時間で、細胞を溶解し、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈマイクロプレートリーダーを使用して発光測定を行った。結果を対照ウェル（細胞＋ＩＬ－６）のパーセントとして表す。
【0111】
ヒトＶＥＧＦ－Ａ ＥＬＩＳＡアッセイ：ヒトＶＥＧＦ－Ａ ＥＬＩＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）アッセイを、２４ウェルフォーマットから９６ウェルプレートフォーマットで実施するように改変した。ＡＲＰＥ－１９細胞をＤＭＥＭ中１０％ ＦＢＳで血清飢餓状態にし、一晩インキュベートした。次いで、培地を、１００、１０、１もしくは０．１μｇ／ｍｌのＳＢＴ－１００（配列番号１）、抗ＥＭＰ ２抗体（Ａｂｃａｍ）または培地のみを含有する培地と交換し、１２、２４または４８時間インキュベートした。適切な時点で、上清を除去し、≦－６５℃で保存した。ＲＩＰＡ溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて細胞を溶解し、細胞可溶化液のタンパク質含有量をＢＣＡアッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。キットの説明書に従ってＨｕｍａｎ ＶＥＧＦ－Ａ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を利用して、ＶＥＧＦ－Ａを測定した。対照カラムとして陰性対照を用いたＤｕｎｎｅｔｔ多重比較検定でのＡＮＯＶＡによる実験統計解析を行った。対照として陰性対照を用いたＤｕｎｎｅｔｔ多重比較検定でのＡＮＯＶＡによる統計解析を行った。
【0112】
フローサイトメトリー分析：ＳＪＳＡ－１細胞を５０ ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＦＮ－γ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）とともに２４時間インキュベートし、次いで培地を５０μｇ／ｍｌのＳＢＴ－１００（配列番号１）を含有する培地と交換し、４８時間インキュベートした。次いで、細胞を採取し、以下の抗体で染色した：ＣＤ２７６（Ｃｌｏｎｅ ＭＩＨ－４２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２７４（Ｃｌｏｎｅ ２９Ｅ．２Ａ３、Ｂｉｌｅｇｅｎｄ）およびＣＤ２００（Ｃｌｏｎｅ ＯＸ－１０４、Ｂｉｌｅｇｅｎｄ）。染色したら、試料をＢＤ Ｃｅｌｅｓｔａ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒに通し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用してデータを分析した。
【0113】
ＭＴＴアッセイ：これらの実験のために、９０％の密集度に達するまで癌細胞を増殖させた。細胞を洗浄し、トリプシン処理し、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いて計数した。３－［４，５－ジメチルチアロリル］－２，５－ジフェニル－テトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カタログ１１４６５００７００１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、増殖試験を行った。このために、細胞を９６ウェルプレートに５×１０３の密度で播種した。細胞を２４時間接着させ、表２に記載されているように適切な濃度（１００ｕｇ／ｍｌで開始する段階希釈）で処理した。３日目に、製造業者によって示されるように、１０ｕｌのＭＴＴ試薬（０．５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに添加した。４時間のインキュベーション期間後、１００ｕｌの可溶化溶液を添加し、プレートを一晩インキュベータ中に置いた。Ｂｉｏｔｅｋプレートリーダー（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して、全てのプレートを５７０ｎｍの波長で読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ ＩｎＳｔａｔ３（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して、全てのデータを分析した。一元配置ＡＮＯＶＡを使用して、処置群をビヒクル対照群と比較した。有意差（ｐ＜０．０５）が観察された場合、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ多重比較検定を行った。
【0114】
酵素アッセイにおけるＫＲＡＳ阻害活性の測定：ＫＲＡＳのＧＴＰアーゼ活性はＧＴＰをＧＤＰに変換する。ＧＴＰアーゼ－Ｇｌｏ試薬キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）は、この活性を測定するために設計されている。Ｇｌｏ試薬は、加水分解されていないＧＴＰをＡＴＰに変換し、発光シグナルを生じる。ＫＲＡＳ活性が阻害されると、ＧＴＰは加水分解されないままであり、高い発光シグナルが予想される。ＫＲＡＳが阻害されなければ、ＧＴＰはＧＤＰに変換され、低いシグナルが観察される。ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて発光を測定した。製造業者の緩衝液中に供給された成熟した活性なＫＲＡＳ（ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＢＣ Ｃａｎａｄａ）の活性を、阻害剤の希釈系列の存在に対して試験した。いくつかの阻害剤の存在下で、Ｐｒｏｍｅｇａ ＧＴＰアーゼ／ＧＡＰ緩衝液中およびＳＢＴ－１００（配列番号１）緩衝液中で市販のＫＲＡＳ ＧＴＰアーゼ活性を滴定した。ＫＲＡＳのＧＴＰアーゼ活性に対する緩衝液条件の阻害および効果を比較した。
【0115】
動物：全ての動物を病原体のない条件下で飼育し、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＡＡＡＬＡＣ）によって認定されているＩｌｌｉｎｏｉｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＩＩＴ）Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｕｓｅ ａｎｄ Ｃａｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）に従って実験を行った。５～６週齢の無胸腺ヌード－Ｆｏｘｎ１ｎｕ雌マウスをＥＮＶＩＧＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。動物を１週間隔離し、２０℃～２６℃および５０％の相対湿度で、１２時間の明暗サイクルでケージあたり５匹のマウスを飼育した。飲料水および食餌（２０％粗タンパク質、４．５％粗脂肪および６．０％粗繊維からなるＰｉｃｏＬａｂ Ｒｏｄｅｎｔ Ｄｉｅｔ ２０ Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ）を自由に動物に供給した。
【0116】
マウス異種移植モデル：第５継代の腫瘍細胞を移植に使用し、対数期増殖中に採取した。１００μｌの培地あたり５×１０６細胞の濃度のＰＡＮＣ－１細胞またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を右脇腹に皮下注射した。腫瘍が触知可能になったら直ちに、腫瘍測定を開始した。その後、腫瘍を週に２回測定した。ノギスを使用して腫瘍を二次元で測定し、以下の式を使用して体積を計算した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝（ｗ２×ｌ）／２；式中、ｗ＝腫瘍の幅、ｌ＝腫瘍のｍｍでの長さである。ＰＡＮＣ－１腫瘍については、腫瘍が７９～１７２ｍｍ３、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍については５５～１５０ｍｍ３のサイズ範囲に達したときに、層別化された無作為サンプリングアルゴリズムを使用して動物を無作為化した。腹腔内経路を介して注射されたＳＢＴ－１００（配列番号１）またはビヒクルによる動物の処置を、１日目と表記される無作為化の翌日に開始した。Ｓｔｕｄｙ Ｌｏｇ Ｓｔｕｄｙ Ｄｉｒｅｃｔｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｓｔｕｄｙ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使用して、動物を無作為化し、データ（例えば、投薬、体重、腫瘍測定値、臨床観察）を収集し、データ統計解析を行った。
【0117】
例２：抗ＳＴＡＴ３および抗ＫＲＡＳラクダ科動物ＶＨＨ：ＳＢＴ－１００（配列番号１）の結合特性
【0118】
そのＮ末端にＧＳＴタグが融合された組換え完全長ヒトＳＴＡＴ３（ＳＴＡＴ３－１４９６Ｈ）は、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＭａｒｔ（Ｓｈｉｒｌｅｙ、ＮＹ、ＵＳＡ）によって提供された。簡潔に述べると、組換えヒトＳＴＡＴ３での免疫化のためにカメラス・バクトリアヌス（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）を使用した。免疫化プロトコルが完了した後、全ＲＮＡ単離および２ラウンドのネステッドＰＣＲのために末梢血細胞を収集して、ＶＨＨライブラリーを作製した。次に、ヒトＳＴＡＴ３およびヒトＫＲＡＳタンパク質への細胞透過および結合を最もよく示したクローンを選択した。このスクリーニングでは、組換えＳＴＡＴ３ならびにＫＲＡＳ、野生型および変異型（Ｇ１２Ｄ）の両方へのＳＢＴ－１００（配列番号１）の高親和性結合が、Ｂｉａｃｏｒｅ ３０００を使用して観察された（表１）。偵察のために、試料をチップ上に流し、リガンドへの試料の結合をリアルタイムで監視した。親和定数（ＫＤ）は、解離速度と会合速度の比として決定した。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、野生型ＫＲＡＳをＫＤ＝４．２０×１０－９で結合し、ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）をＫＤ＝１．５０×１０－８で結合し、ＳＴＡＴ３をＫＤ＝２．２４×１０－８で結合する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は無関係の抗原（１２－リポキシゲナーゼ）を結合しない。ＳＴＡＴ３およびＫＲＡＳ分子は本質的に高度に保存されているが、それらはそれらのタンパク質配列において有意な相同性を共有しない。ＳＢＴ－１００（配列番号１）の免疫原であるＳＴＡＴ３への結合は予想されたが、ＫＲＡＳに対する交差反応性は予想されなかった。使用した抗ＫＲＡＳ ＶＨＨ（ＳＢＴ－１０２）（配列番号２）の配列は、ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＳＣＡＶＳＧＮＩＧＳＳＹＣＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＫＲＥＡＶＡＲＩＶＲＤＧＡＴＧＹＡＤＹＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＳＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＲＬＩＰＥＤＴＡＩＹＹＣＡＡＤＬＰＰＧＣＬＴＱＡＩＷＮＦＧＹＲＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳであった。したがって、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、野生型ＫＲＡＳ、ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）（最も一般的な変異体）およびＫＲＡＳ（Ｇ１３Ｄ）変異を有する癌に結合し、それらの癌を阻害することができる。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、ＫＲＡＳ ＧＴＰアーゼ活性部位付近の共通のエピトープを結合し、それによってＳＢＴ－１００（配列番号１）を汎ＫＲＡＳ阻害剤にする可能性が高い。ＳＢＴ－１００（配列番号１）ｓｄＡｂのＫＲＡＳおよびＳＴＡＴ３への二重特異的結合は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）ｓｄＡｂが、次いでＳＢＴ－１００（配列番号１）をＫＲＡＳに近接させる高濃度のＳＴＡＴ３とともに細胞の内側に濃縮することを可能にし得る。
【0119】
表１はまた、抗エボラＶＰ２４ ＶＨＨ（ＳＢＴ－１０６）（配列番号３：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＶＹＳＹＮＴＮＣＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＶＡＶＩＹＡＡＧＧＬＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＱＥＮＧＫＮＴＶＹＬＴＭＮＲＬＫＰＥＤＴＡＭＹＹＣＡＡＫＲＷＣＳＳＷＮＲＧＥＥＹＮＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ）および抗ＨＩＶ－１逆転写酵素（ＲＴ）ＶＨＨ（ＳＢＴ－１０７）（配列番号４）：ＭＧＤＶＱＬＶＥＳＧＧＤＳＶＲＡＧＧＳＬＱＬＳＣＫＡＳＧＹＴＹＮＳＲＶＤＩＲＳＭＧＷＦＲＱＹＰＧＫＥＲＥＧＶＡＴＩＮＩＲＮＳＶＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＱＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＡＬＫＰＥＤＴＡＭＹＹＣＡＬＳＤＲＦＡＡＱＶＰＡＲＹＧＩＲＰＳＤＹＮＹＷＧＥＧＴＬＶＴＶＳＳＳＳＧＬＥ）の、それぞれ、エボラＶＰ２４およびＨＩＶ－１ ＲＴへの結合を示す。
【表1】
【0120】
例３：ＳＢＴ－１００（配列番号１）による細胞透過
【0121】
ＭＤＡ－ＭＤ－２３１ ＴＮＢＣ細胞株の免疫蛍光分析（ＩＦＡ）を使用して、ＳＢＴ－１００（配列番号１）ＶＨＨが細胞膜を透過し、細胞内ＳＴＡＴ３を結合する能力を決定した。ＳＢＴ－１００（配列番号１）で処理された細胞は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）の細胞内局在化を示したのみならず、ＴＮＢＣ細胞株であるＭＤＡ－ＭＤ－２３１において抗ＧＳＴタグ抗体を使用していくらかの膜会合が示された。図１Ａは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）抗体とともにインキュベートされたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の免疫蛍光染色を示し、緑色のチャネルに抗Ｈｉｓタグ抗体を使用した陽性の細胞質染色を有する。図１Ｂは、ビヒクルのみで処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の陰性対照を示す。予想通り、ビヒクルで処理した細胞は染色を示さなかった。さらなる陰性対照として、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を抗ＨＩＶ－１逆転写酵素ＶＨＨとともに培養した（図１Ｃ）；ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞はＨＩＶ－１ウイルスを産生しないので、従来の蛍光顕微鏡法ではこれらの細胞において細胞内染色は認められなかった。図１Ｄは、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の細胞質全体に位置する顆粒状染色を示す、抗ＶＨＨ抗体を介したＳＢＴ－１００（配列番号１）検出の共焦点画像を示す。共焦点蛍光顕微鏡法により、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）で処理した後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の細胞質全体に分散された顆粒状染色として存在することが明らかになった（図１Ｄ）。図１Ａおよび図１ＤにおけるＳＢＴ－１００（配列番号１）の観察された染色は細胞質ゾル性であり、エンドサイトーシス性ではない。
【0122】
ＳＴＡＴ３の細胞内レベルに対するＳＢＴ－１００（配列番号１）の効果を決定した。図２Ａおよび図２Ｂに示されているように、ＩＦＡは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）がリン酸化されたＳＴＡＴ３および総（ｔ）ＳＴＡＴ３の両方の細胞内レベルを低下させることを示す。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞は、処理されないか（図２Ａ）または１５０μｇ／ｍｌのＳＢＴ－１００（配列番号１）で６時間処理された（図２Ｂ）。主として核および核周辺から細胞全体に分散したｔＳＴＡＴ３へのｔＳＴＡＴ３の再分布が存在し、核局在化ｔ－ＳＴＡＴ３が、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において低下していることを示している。非処理（図２Ｃ）または１５０μｇ／ｍｌのＳＢＴ－１００（配列番号１）処理の６時間後（図２Ｄ）のいずれかのＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるｔＳＴＡＴ３の共焦点画像は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）による処理がＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるリン酸化された（ｐ）ＳＴＡＴ３の細胞内レベルを減少させることを実証する。さらに、ｔＳＴＡＴ３染色された核およびＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）染色された核の両方に対する共焦点蛍光画像分析は、核／細胞中心部から細胞の細胞質全体にわたる染色への、ＳＢＴ－１００（配列番号１）によって誘導されたｔＳＴＡＴ３染色のこの再分布をさらに裏付ける（図２Ｃおよび２Ｄ）。オンラインツール「Ｐｒｏｔ Ｐｉ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｐｉ．ｃｈ／Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ／ＰｒｏｔｅｉｎＴｏｏｌ＃Ｒｅｓｕｌｔｓ）を使用したタンパク質配列分析は、生理学的ｐＨでわずか＋２．３４の理論的正味電荷を与え、示唆された＋１４の最適な正味電荷から大幅に逸脱していた。したがって、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、細胞を透過し、非相同なタンパク質（ＳＴＡＴ３およびＫＲＡＳ）を結合し、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するその能力において他に類を見ないようである。ＶＨＨによる細胞透過は他の者によって示されているが、これは分子のカチオン性リサーフェシング後にのみ見られた。ＳＢＴ－１００（配列番号１）が細胞膜を透過する能力は、ポリカチオン性リサーフェシング、遺伝子工学またはモノマーのコンジュゲーションを含まない。
【0123】
例４：ＳＴＡＴ３のリン酸化および核移行の阻害とそれに続くチェックポイント分子の低下
【0124】
ＳＢＴ－１００（配列番号１）の細胞透過能の実証に続いて、インビトロでのｐＳＴＡＴ３に対する効果を評価した。ＩＦＡは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）がｔＳＴＡＴ３の細胞内レベルを減少させたことを示した。さらに、主として核および核周辺から細胞全体に分散したｔＳＴＡＴ３へのｔＳＴＡＴ３の再分布が存在し、核局在化ｔＳＴＡＴ３が、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処理されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において低下していることを示している。ｔＳＴＡＴ３染色された核およびＤＡＰＩ染色された核の両方に対する共焦点蛍光画像分析は、核／細胞中心部から細胞の細胞質全体にわたる染色への、ＳＢＴ－１００（配列番号１）によって誘導されたｔＳＴＡＴ３染色のこの再分布をさらに裏付ける（図２Ｃおよび２Ｄ）。ＩＦＡ研究は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）とともにインキュベートされたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞が６時間以内に減少したｐＳＴＡＴ３レベルを示すことを実証した。処理されていないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（図２Ｅおよび図２Ｇ）または６時間の１５０μｇ／ｍｌ ＳＢＴ－１００（配列番号１）処理後に顕微鏡観察を行った（図２Ｆおよび図２Ｈ）。図２Ｅ、図２Ｆ、図２Ｇおよび図２Ｈは、処置後の低下したｐＳＴＡＴ３レベルを示す。ＳＢＴ－１００（配列番号１）によって誘導されたｐＳＴＡＴ３の細胞局在化の変化は、ｔＳＴＡＴ３の変化と極めて類似していた。これらのデータは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）が、総ＳＴＡＴ３およびリン酸化されたＳＴＡＴ３の両方の、細胞質から核への移行を妨げることを示唆している。このため、従来の蛍光画像および共焦点蛍光画像はいずれも、ＳＢＴ－１００（配列番号１）がＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞中のｐＳＴＡＴ３の細胞内レベルを減少させることを明らかにした。
【0125】
ＳＴＡＴ３の転写遺伝子標的である、ＰＤ－Ｌ１などの癌細胞における免疫チェックポイント阻害剤に対するＳＢＴ－１００（配列番号１）の効果を調べた。チェックポイント分子は腫瘍細胞の表面に発現され、最終的にＴ細胞の活性化機能を抑制し、免疫抑制性腫瘍微小環境に寄与する。ＩＬ－６およびＩＦＮ－γなどの炎症性サイトカインは、ＰＤ－Ｌ１（ＣＤ２７４）、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）およびＯＸ－２（ＣＤ２００）などのチェックポイント分子の発現を促進する。ヒト骨肉腫細胞株ＳＪＳＡ－１をＳＢＴ－１００（配列番号１）とともに培養することにより、ＳＢＴ－１００（配列番号１）の存在下または非存在下で、ＳＪＳＡ－１骨肉腫細胞において７５ｕｇ／ｍｌのＩＦＮ－γで刺激すると、Ｂ７－Ｈ３、ＯＸ－２およびＰＤ－Ｌ１の細胞表面発現の減少がもたらされた（データは示さず）。Ｂ７－Ｈ３は約１／３に減少し、ＯＸ－２は約１／４に減少し、ＰＤ－Ｌ１は約１／４に減少した。ＳＢＴ－１００（配列番号１）での２４時間の処理後にＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を分析して、他の細胞型内のＰＤ－Ｌ１タンパク質合成レベルの潜在的変化を調べた。ＳＢＴ－１００（配列番号１）なしおよびＳＢＴ－１００（配列番号１）ありのいずれかで、７５ｕｇ／ｍｌのＩＦＮ－γで２４時間刺激されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において、ＰＤ－Ｌ１発現の蛍光顕微鏡観察が示された（データは示さず）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現の共焦点蛍光顕微鏡観察が、ＳＢＴ－１００（配列番号１）の添加ありまたはなしのいずれかで、７５ｕｇ／ｍｌのＩＦＮ－γによる２４時間の刺激の際に示される（データは示さず）。ＩＦＡを使用したＰＤ－Ｌ１染色は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）によって媒介される膜および細胞内タンパク質レベルの低下を示し、細胞のＰＤ－Ｌ１の発現の局在化に関する公表されたデータと一致していた。インターフェロン（ＩＦＮ）－γは、ＰＤ－Ｌ１発現を誘導することが知られており、ＩＦＮ－γによる処理後に細胞内染色および膜染色の両方が増加した（データは示さず）。これは、抗体による、遺伝子発現レベルでのチェックポイント阻害剤の下方制御の最初の実証である。
【0126】
イムノブロット技術を使用して、タンパク質レベルの変化を定量した。図３Ａは、２４時間での、ＳＢＴ－１００（配列番号１）ありおよびなしでの、ｐＳＴＡＴ３、ｔＳＴＡＴ３およびＰＤ－Ｌ１についてのＭＤＡ－ＭＢ－２３１タンパク質抽出物のイムノブロッティングの代表的な画像を示す。処理されていないＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞ならびに陽性対照としてＳＴＡＴ３阻害剤であるＳ３１－２０１を使用してＳＢＴ－１００（配列番号１）で３時間、６時間および２４時間処理された細胞からのタンパク質抽出物のイムノブロッティングによって、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞のＳＢＴ－１００（配列番号１）処理によって誘導されたｔＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ３およびＰＤ－Ｌ１タンパク質のレベルの変化を定量した（図３Ｂおよびデータは示さず）。各データ点は、その最終濃度が５０μｇ／ｍｌ～１００μｇ／ｍｌの間で変動する４つの異なるＳＢＴ－１００（配列番号１）調製物でＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞が処理された３～５回の独立した実験から得られた、β－アクチンに対して正規化された値の平均±標準偏差を表す。複製イムノブロットを、調べている３つのタンパク質のそれぞれに対する抗体と反応させた。化学発光検出後、各抽出物中の各タンパク質のシグナル強度を、その試料中に存在するβ－アクチンの強度に対して正規化した。次いで、各処理された試料中のレベルを処理されていない細胞で見られるレベル（１に設定）と比較して、ＳＢＴ－１００（配列番号１）投与後の時点で、誘導されたｔＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ３およびＰＤ－Ｌ１のレベルの差を定量した。ＰＤ－Ｌ１のレベルを減少させることが示されている公知のＳＴＡＴ３リン酸化阻害剤であるＳ３Ｉ－２０１を陽性対照として使用した。ＳＢＴ－１００（配列番号１）処理は、ｔＳＴＡＴ３、ｐ－ＳＴＡＴ３およびＰＤ－Ｌ１のレベルを低下させ、３つのタンパク質は全て２４時間での低下が最も顕著であった。このように、定量により、免疫蛍光によって観察されたデータが確認された。
【0127】
核（青色のＤＡＰＩ）染色と同時に生じた緑色の抗体特異的蛍光の定量化によって、市販のｔＳＴＡＴ３抗体およびｐＳＴＡＴ３抗体による染色の核部分を二次元画像から決定した。ＳＢＴ－１００（配列番号１）での６時間の処理後に、元のｔＳＴＡＴ３染色の４１％および元のｐＳＴＡＴ３染色の７０％が核内に残存していた。共焦点顕微鏡観察によって得られた対応するＺスタック画像の三次元投影に基づくと、なお存在するｔＳＴＡＴ３のうち、核内に残存するものはなかった。２次元画像においてＤＡＰＩと共染色されたいずれのｔＳＴＡＴ３も、核膜を取り囲む細胞質中に存在した。ＩＦＡ系におけるｐＳＴＡＴ３抗体の染色強度は極めて低いために、当該抗体を使用したこの分析は不可能である。これらのデータは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）が、Ｓ３Ｉ－２０１と同様に、２４時間の処理の間、ｔＳＴＡＴ３、ｐＳＴＡＴ３およびＰＤ－Ｌ１を減少させたことを示している。減少の前に、３つのタンパク質種の全てにおいて早期（３時間）の増加が存在するようであった。ｔＳＴＡＴ３の低下は６時間で明らかであり、ｐＳＴＡＴ３の低下に先行したのに対して、ＰＤ－Ｌ１レベルの低下はＳＢＴ－１００（配列番号１）による処理の２４時間後に明らかであった。総合すると、これらのデータは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）へのＳＴＡＴ－３の結合が、ｐＳＴＡＴ３転写因子のレベルを減少させることによってＰＤ－Ｌ１翻訳を減少させるという仮説を支持する。
【0128】
例５：ＩＬ－６誘導性ＳＴＡＴ３核移行の阻害およびＳＴＡＴ３媒介性ＶＥＧＦ産生の抑制
【0129】
ＩＬ－６は活性化されたｐＳＴＡＴ３の核移行を調節する上で重要な役割を果たすので、ＳＢＴ－１００（配列番号１）がＩＬ－６活性を阻害することによってその活性を媒介するかどうかを決定するために実験を行った。図４に示されているように、ＳＢＴ－１００（配列番号１）とのＨＥｐ－２およびＰＡＮＣ－１細胞のＩＬ－６刺激は、ｐＳＴＡＴ３の核移行を阻害し、その後、ＨＥｐ－２細胞およびＰＡＮＣ－１細胞の増殖を低下させた。Ｈｅｐ－２細胞におけるリン酸化されたＳＴＡＴ３の蛍光顕微鏡観察が、通常の条件下（図４Ａ）、ＩＬ－６刺激時（図４Ｂ）およびＩＬ－６刺激とＳＢＴ－１００（配列番号１）処理の両方（図４Ｃ）で示されている。Ｐａｎｃ－１細胞におけるリン酸化されたＳＴＡＴ３の蛍光顕微鏡観察が、通常の条件下（図４Ｄ）、ＩＬ－６刺激時（図４Ｅ）およびＩＬ－６刺激とＳＢＴ－１００（配列番号１）処理の両方（図４Ｆ）で示されている。レポーター細胞アッセイを行って、ＳＴＡＴ３プロモーターをルシフェラーゼ遺伝子に連結する構築物で形質移入されたＨＥＫ ２９３細胞からのルシフェラーゼ発現を測定した。ＩＬ－６刺激後にＳＢＴ－１００（配列番号１）処理したＨＥＫ ２９３Ｔ細胞におけるＳＴＡＴ３ルシフェラーゼレポーターアッセイは、ＳＴＡＴ３二量体が核に移行し、ＳＴＡＴ３プロモーターに結合してルシフェラーゼ活性を誘導することを示す。ＳＢＴ－１００（配列番号１）の添加は、用量依存的にこの効果を消失させた。したがって、ＳＴＡＴ３活性に対するＩＬ－６の作用は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）によって著しく阻害された。このアッセイは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）による処理が、１００μｇ／ｍＬの用量で、ＩＬ－６誘導性の、ｐＳＴＡＴ３のそのＤＮＡプロモーターへの結合をほぼ１００％低下させ、２．６８μｇ／ｍＬ（０．１８μＭ）のＩＣ５０であることを示した（データは示さず）。
【0130】
１２、２４および４８時間の時点で、１００ｕｇ／ｍｌのＳＢＴ－１００（配列番号１）は、ＶＥＧＦタンパク質産生の９９％を超える抑制を与えた（ｐ＜０．０１）
【0131】
癌細胞では、ＳＴＡＴ３は、ＶＥＧＦなどの細胞の増殖および生存に必要な多くの遺伝子を転写する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）がＶＥＧＦ産生を阻害する能力を決定するために、ＶＥＧＦを大量に産生する網膜上皮細胞を使用した。漸増濃度のＳＢＴ－１００（配列番号１）の存在下でＩＬ－６で刺激された網膜上皮細胞において、ＶＥＧＦレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。１２、２４および４８時間の時点で、１００μｇ／ｍＬのＳＢＴ－１００（配列番号１）は、ＶＥＧＦタンパク質産生の９９％を超える抑制を与えた（データは示さず）この実験において試験されたいずれの濃度でも細胞毒性は観察されなかった（データは示さず）。ＶＥＧＦは、癌細胞の増殖および生存にとって極めて重要なサイトカインであり、ＶＥＧＦ機能の阻害が癌患者（結腸直腸癌、肺癌、神経膠芽腫、腎臓癌、子宮頸癌および卵巣癌）の全生存を有意に改善することができることは周知である。例えば、ベバシズマブは、細胞外空間においてＶＥＧＦを結合することによってＶＥＧＦの作用を妨げる。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は細胞膜を透過し、ＳＴＡＴ３機能を阻害して、著しく減少したＶＥＧＦタンパク質産生をもたらす。これは、ベバシズマブと比較してＶＥＧＦを阻害する完全に独特の方法である。
【0132】
ＣＯＶＩＤ－１９に重度に感染した患者の血液中には高レベルのＩＬ－６が存在する。ＩＬ－６は、多くの癌の腫瘍微小環境において重要な役割を果たし、黄斑変性およびブドウ膜炎を引き起こす眼におけるＳＴＡＴ３媒介性炎症を促進する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、ＳＴＡＴ３を結合し、阻害することにより、患者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を低下させ得る。ＩＬ－６の作用を遮断することにより、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、肺の炎症を軽減するのに役立ち得、肺の炎症の軽減は、その後、患者の肺コンプライアンスおよび酸素化を改善し得る。
【0133】
例６：ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、インビトロにおいて、ＫＲＡＳ変異およびｐＳＴＡＴ３の恒常的発現を有するヒト癌の増殖を阻害する
【0134】
ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、膵臓癌（ＰＡＮＣ－１およびＢｘＰＣ３）、ＴＮＢＣ（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３）、ＥＲ＋ＰＲ＋乳癌（ＭＣＦ－７）、ＨＥＲ－２＋増幅乳癌（ＢＴ４７４）、神経膠芽腫（Ｕ８７）、骨肉腫（ＳＪＳＡ－１）、線維肉腫（ＨＴ－１０８０）および転移性化学療法抵抗性前立腺癌（ＤＵ－１４５）を含む様々な癌に由来する１１のヒト細胞株において増殖を障害した（表２）。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞はＫＲＡＳ（Ｇ１３Ｄ）を有し、ＰＡＮＣ－１細胞はＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）活性化変異を有する。これらの癌細胞のほとんどは、ｐＳＴＡＴ３の恒常的発現を有する。これらの結果は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）が広範囲の抗癌活性を有することを実証している。このデータは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）が、活性化ＫＲＡＳ変異を有するまたは有さない、恒常的ｐＳＴＡＴ３発現を伴うヒト悪性腫瘍に対して有意な（ｐ＜０．００１）腫瘍細胞阻害効果（８５～９３％）を有することを示唆している。
【表2】
【0135】
例７：ＫＲＡＳ ＧＴＰアーゼ活性の阻害および下流ｐＥＲＫシグナル伝達の抑制
【0136】
結合データは、ＫＲＡＳおよびＳＴＡＴ３タンパク質ならびにリポキシゲナーゼを使用して決定されたとおり、ＳＢＴ－１００（配列番号１）がＫＲＡＳおよびＳＴＡＴ３に対して二重特異性であるのに対して、ＳＢＴ－１０２は、ナノモル濃度の親和性でヒトＫＲＡＳおよびその最も一般的な変異ＫＲＡＳ（Ｇ１２Ｄ）に対して単一特異性であるが、ＳＴＡＴ３を結合しないことを実証している（表１）。ＧＴＰアーゼ活性を用いて、ＫＲＡＳに対するＳＢＴ－１００（配列番号１）およびＳＢＴ－１０２（配列番号２）の生化学的効果を実証した。ＫＲＡＳ ＧＴＰアーゼ活性の読み取りとして、発光（ＲＬＵ）を測定した。試薬をＳＢＴ－１００（配列番号１）、ＳＢＴ－１０２（配列番号２）または抗ＫＲＡＳポリクローナル抗体のいずれかとともにインキュベートし、ＲＬＵを測定した。ＫＲＡＳ ＧＴＰアーゼ活性は、漸増用量のＳＢＴ－１００（配列番号１）およびＳＢＴ－１０２（配列番号２）によって阻害され、その阻害的結合活性を実証した（図５Ａ）。ここでは、抗ＫＲＡＳポリクローナル抗体を陽性対照として使用した。ＳＢＴ－１００（配列番号１）、ＳＢＴ－１０２（配列番号２）および抗ＫＲＡＳポリクローナル抗体によるＫＲＡＳ ＧＴＰアーゼ活性の阻害は用量依存的に起こり、３つの間で結果は同等であった。ＳＢＴ－１００（配列番号１）処理ありまたはなしで、様々なＫＲＡＳ変異癌細胞におけるリン酸化されたＥＲＫ１／２について、ウエスタンブロット分析を行った（図５Ｂ）。レーン１（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、レーン３（ＰＡＮＣ－１）およびレーン５（ＢｘＰＣ３）では、癌細胞をビヒクルのみとインキュベートした。レーン２（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）、レーン４（ＰＡＮＣ－１）およびレーン６（ＢｘＰＣ３）では、癌細胞を１００ｕｇ／ｍｌのＳＢＴ－１００（配列番号１）とともに７２時間インキュベートした。結果は、ＥＲＫの下流のリン酸化（ｐＥＲＫ）が、ＫＲＡＳ変異を有するＭＤＡ－ＭＤ－２３１およびＰＡＮＣ－１癌細胞株の両方において阻害されることを示している。ＫＲＡＳを結合し、そのＧＴＰアーゼ活性を阻害することにより、ＳＢＴ－１００（配列番号１）はＫＲＡＳシグナル伝達経路を遮断する。より大きな基底ＳＴＡＴ３活性を有する癌細胞は、より大きな程度でＳＢＴ－１００（配列番号１）を細胞質内に捕捉し、それにより、ＫＲＡＳを阻害するＳＢＴ－１００（配列番号１）の能力を増強する可能性がある。これは、これらの癌細胞株間でのｐＥＲＫレベルが異なることに対する説明である可能性が高い。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１は、ＰＡＮＣ－１よりはるかに高いレベルのＳＴＡＴ３を有することが実証されている。これは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）がＫＲＡＳを結合し、阻害する時間の短縮をもたらし得る。さらに、文献は、ＰＡＮＣ－１がＫＲＡＳ非依存性であるのに対して、ＫＲＡＳ変異を有する他の癌はＫＲＡＳ依存性であることを示している。これも、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１と比較して、ＰＡＮＣ－１におけるｐＥＲＫレベルの低下がより低いことを説明し得る。したがって、ＳＢＴ－１００（配列番号１）はＫＲＡＳに結合し、その後、ＫＲＡＳ ＧＴＰアーゼ活性の阻害および下流のＫＲＡＳシグナル伝達の抑制がｐＥＲＫレベルを低下させ、ｐＥＲＫレベルの低下が活性化ＫＲＡＳ変異を有する癌細胞の増殖の阻害をもたらす。
【0137】
例８：腫瘍担持マウスにおけるＳＢＴ－１００（配列番号１）による腫瘍体積の低下
【0138】
ＴＮＢＣ細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）または膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ－１）を皮下注射された無胸腺マウスをＳＢＴ－１００（配列番号１）で１４日間処置し、７日間回復させた後、腫瘍体積を測定した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍は、処置の開始前に５０～１００ｍｍ３であった（図６）。腫瘍担持マウスを、屠殺するまで１４日間、腹腔内注射によってＰＢＳを与えた対照群と、５ｍｇ／ｋｇのＳＢＴ－１００（配列番号１）（１日２回）を与えた処置群とに無作為に分けた。処置群は腫瘍増殖の急速な抑制を示し、これは１４日間の処置期間後も維持された。７日の処置後観察期間中、腫瘍増殖のリバウンドは起こらず、全てのマウスは処置を生き延び、正常な体重を維持した。ＳＢＴ－１００（配列番号１）の最後の用量の後、観察期間中にＭＤＡ－ＭＢ－２３１の有意な増殖は存在しなかった。
【0139】
ＰＡＮＣ－１腫瘍は処置前に１００～１５０ｍｍ３であり、次いで、全て１４日間腹腔内注射を介した、対照（ＰＢＳ）、ゲムシタビンのみ（２０ｍｇ／ｋｇ、１日１回）、ＳＢＴ－１００（配列番号１）のみ（１００ｍｇ／ｋｇ、１日２回）およびゲムシタビンとＳＢＴ－１００（配列番号１）の４つの群に無作為化した。１４日間の処置期間の後、７日間の観察期間が存在した。研究の終了時に、ゲムシタビンのみの群は、対照群に対して１４．９３％の腫瘍増殖抑制を有していた（表３）。ＳＢＴ－１００（配列番号１）のみの群は、対照群に対して１９．１７％の腫瘍増殖抑制を有していた。最後に、ゲムシタビンとＳＢＴ－１００（配列番号１）を併用した群は、対照群に対して３１．５２％の抑制を示した（ｐ＜０．０５）。処置されたマウスはいずれも死亡せず、またはＳＢＴ－１００（配列番号１）による体重減少を有さなかった。ＳＢＴ－１００（配列番号１）の潜在的毒性を決定するために、マウスにＳＢＴ－１００（配列番号１）が与えられた全ての異種移植研究からの体重データを合わせた。３週間の異種移植研究の間、処置のためにＳＢＴ－１００（配列番号１）を受けた群に有意な体重減少は存在しなかった（データは示さず）。観察可能な毒性が存在しない理由としては、可逆的である生物学的効果が最長７日間持続する一方、血清半減期が短いことが挙げられ得る。さらに、正常な成体組織中でのＳＴＡＴ３の役割は限られている。成体マウスにおけるＳＴＡＴ３の条件的破壊は、致死性をもたらす胚の標的化とは異なり、致死性であることなしに様々な程度で異なる系に影響を及ぼすことが示されている。癌細胞における異常なレベルの細胞内ＳＴＡＴ３発現のために、注入されたＳＢＴ－１００（配列番号１）が癌病変内に優先的に蓄積している可能性もあり得る。
【0140】
【表3】
【0141】
インビボでの別の重要な発見は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することであった。大きな確立されたＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍（＞２００ｍｍ３）を有する無胸腺ヌードマウスに、１５分間、５ｍｇ／ｋｇのＳＢＴ－１００（配列番号１）を１回ＩＰ注射し、次いで屠殺した。免疫組織化学分析は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切った、癌細胞の内側でのＳＢＴ－１００（配列番号１）の局在化を実証する。（図７Ａ）腫瘍塊のこの代表的な切片は、矢印によって示されるようにＴＮＢＣ細胞内での細胞内染色を示す。これらの細胞は、密な腫瘍間質によって取り囲まれている。（図７Ｂ）矢印は、腫瘍担持マウスの脳内のニューロンおよびグリア細胞の細胞内染色の集合を指す。塩基性ｐＩを有するＶＨＨは自発的にＢＢＢを通過することができる（９．３では通過できるが、７．７では通過できない）ことが実証されている。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は８．２２の塩基性ｐＩを有しており（Ｐｒｏｔ Ｐｉオンラインツールを使用して計算）、これはＢＢＢ通過を可能にする報告されたｐＩの範囲外である。
【0142】
例９：眼疾患
【0143】
実験的自己免疫性ブドウ膜炎（ＥＡＵ）をマウスにおいて誘導した。これを行うために、ＣＦＡおよび百日咳毒素のエマルジョン中の光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）でマウスを免疫した。ＥＡＵが誘導されたら、次いで、ＳＢＴ１００を眼に注射した。１５および１８日目に眼底検査、１５日目に光干渉断層撮影（ＯＣＴ）および１４日目に網膜電図検査（ＥＲＧ）によって、ブドウ膜炎に対するＳＢＴ－１００（配列番号１）の効果を調べた。眼底検査は、拡大レンズおよび光を使用して眼の眼底（網膜および視神経を含む眼の内側の後部）を確認する検査である。マウスを１８日目に屠殺し、組織学のために眼を回収し、細胞内サイトカイン分析をＦＡＣＳによって行った。図８に示されているように、ＥＡＵ臨床スコアは、眼底検査によって測定した場合、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置マウスにおいて減少する。眼底検査画像は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）がブドウ膜炎を改善したことを示した（データは示さず）。ＯＣＴの結果は、視神経乳頭および硝子体における炎症細胞の動員の低下を示した（図９）。図１０Ａ～図１０Ｄは、ＳＢＴ－１００（配列番号１）処置されたＥＡＵマウスにおける改善された視覚機能を示すＥＲＧ結果を表す。図１１は、ＳＢＴ－１００（配列番号１）での処置細胞内サイトカイン染色分析は、ＩＬ－１７を分泌する病原性Ｔｈ１７細胞の有意な低下をもたらすことを示す。したがって、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、ヒトブドウ膜炎のマウスモデルにおいてブドウ膜炎の重症度を減弱させ、単一ドメインＳＢＴ－１００（配列番号１）がブドウ膜炎および他の炎症性疾患の治療法として使用され得ることを示唆した。
【0144】
例１０：ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、溶解された癌細胞株からのＳＴＡＴ３を結合する
【0145】
ＳＰＴ－１００がリン酸化されていないＳＴＡＴ３を結合することができることは以前に示されている。図１２は、リン酸化されたＳＴＡＴ３とＳＢＴ－１００（配列番号１）の結合を実証する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）、陽性対照（市販のＳＴＡＴ３）または陰性対照（市販のＳＴＡＴ１）を予め搭載したＤｙｎａｂｅａｄｓとともに、細胞可溶化液を４℃で１時間インキュベートした。結合したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した後、ＳＴＡＴ３（７９Ｄ７）ウサギｍＡｂ＃４９０４を用いたウエスタンブロット分析を行った。図１２は、ＳＴＡＴ３細胞の量を示す：レーン１はＰＡＮＣ－１細胞であり、レーン２はＤＵ１４５細胞であり、レーン３はＨｅＬａ細胞であり、レーン４はマウスＳＴＡＴ３（ヒトＳＴＡＴ３と９９％相同）と４Ｔ１細胞であり、レーン５はＰＡＮＣ－１およびＫＲＡＳを有する陰性対照であり、レーン６はＰＣ－３細胞である。イムノブロットは、ＰＡＮＣ－１細胞が低い細胞内ＳＴＡＴ３を有し、ＤＵ１４５前立腺癌細胞が高い濃度のＳＴＡＴ３を有することを示す。これは、より少ないＳＴＡＴ３を有する他の細胞と比較して、ＳＴＡＴ３がより効果的に抑制される理由を説明し得る。
【0146】
例１１：ウイルス感染症におけるＳＴＡＴ３
【0147】
エボラウイルスによる感染は、宿主の免疫応答を損ない、サイトカインストームを引き起こす。エボラウイルスＶＰ２４タンパク質は、カリオフェリンα１を結合し、ＳＴＡＴ１の核蓄積を遮断する。エボラウイルスインターフェロンアンタゴニストＶＰ２４はＳＴＡＴ１を直接結合する。ＳＴＡＴ１の非存在下では、抗ウイルス状態は確立されない。ＳＴＡＴ３シグナル伝達は、ＥＢＶ、ＭＣＭＶ、ＨＣＭＶ、ＨＳＶ、ＶＺＶおよびＨＣＶを含むＤＮＡおよびＲＮＡウイルスによって活性化される。Ｉ型ＩＦＮ媒介性の抗ウイルス応答を抑制することまたは微小管動態を制御することによる多数のウイルスの複製のためには、ＳＴＡＴ３の活性化または増大した発現が必要とされる。ＳＴＡＴ３阻害剤はウイルス複製を著しく減少させる。
【0148】
ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、Ｈｅｌａ細胞（図１３Ａ）およびＨＦＦ細胞（図１３Ｂ）においてエボラウイルス増殖を阻害する。さらに、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、ベロ細胞（図１４Ａ）およびＨＦＦ細胞（図１４Ｂ）においてジカウイルス（ダカール、セネガル）増殖を阻害する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、異なる細胞株においてベネズエラウマ脳炎（ＴＣ８３）ウイルス増殖を阻害する（図１５）。ＳＢＴ－１００（配列番号１）はチクングニアウイルス増殖を阻害する（図１６）
【0149】
【表4】
【0150】
ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、デング、マールブルク、アレナウイルス（ラッサおよびフニンウイルス）、ブニヤウイルスを含む出血熱ウイルス；蚊媒介脳炎ウイルス、西ナイルウイルス（ＷＮＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）などのトガウイルス（アルファウイルス）；チクングニアウイルスならびに重度急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）および中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）を含むコロナウイルスなどの他のウイルスの複製を阻害し得る。
【0151】
上に示されているように、ＳＢＴ－１００（配列番号１）はＩＬ－６を阻害する。ＩＬ－６は炎症の重要なメディエータであり、炎症を媒介するためにＳＴＡＴ３経路を使用する。ＣＯＶＩＤ－１９に重度に感染した患者の血液中には高レベルのＩＬ－６が存在する。ＩＬ－６は、多くの癌の腫瘍微小環境において重要な役割を果たし、黄斑変性およびブドウ膜炎を引き起こす眼におけるＳＴＡＴ３媒介性炎症を促進する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、ＳＴＡＴ３を結合し、阻害することにより、患者におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を低下させ得る。ＩＬ－６の作用を遮断することにより、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、肺の炎症を軽減するのに役立ち得、肺の炎症の軽減は、その後、患者の肺コンプライアンスおよび酸素化を改善し得る。
【0152】
本発明は、特定の好ましい態様を参照してかなり詳細に説明されているが、他の態様も可能である。本方法のために開示された工程は、例えば、限定することを意図するものでも、各工程が本方法に必須であることを示すことを意図するものでもなく、例示的な工程にすぎない。したがって、添付の特許請求の範囲は、本開示に含まれる好ましい態様の説明に限定されるべきではない。本明細書で引用される全ての参考文献は、その全体が参照により組み入れられる。
【0153】
上記の説明が以下の特許請求の範囲に含まれない追加の主題を開示している限り、本発明は公衆に提供されておらず、そのような追加の発明を請求するために１つまたは複数の出願を出願する権利が留保される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E-2F】
【図2G-2H】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11】
【図12】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞内成分に対して作られた単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を使用して、対象における異常な細胞増殖を防止する方法。
【請求項2】
前記異常な細胞増殖が癌である、請求項２に記載の方法。
【請求項3】
前記癌が、骨肉腫、線維肉腫、神経膠芽腫、白血病、膵臓癌、乳癌および前立腺癌を含む群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ｓｄＡｂが、１つまたは複数の化学療法薬と相乗的であり、癌に対する前記１つまたは複数の化学療法薬の治療効果を改善する、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記１つまたは複数の化学療法薬がドキソルビシンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記１つまたは複数の化学療法薬がゲムシタビンを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記ｓｂＡｂが、１つまたは複数の化学療法薬の毒性を減少させ、前記処置された対象の生存を改善する、請求項４に記載の方法。
【請求項8】
前記ｓｂＡｂが１つまたは複数の化合物と組み合わせて使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記細胞内成分がタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記タンパク質が、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂまたはＳＴＡＴ６を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
前記ｓｄＡｂが配列番号１を含む、請求項１に記載の方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0148】
表４に示すように、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、Ｈｅｌａ細胞およびＨＦＦ細胞においてエボラウイルス増殖を阻害する。さらに、ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、ベロ細胞およびＨＦＦ細胞においてジカウイルス（ダカール、セネガル）増殖を阻害する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）は、異なる細胞株においてベネズエラウマ脳炎（ＴＣ８３）ウイルス増殖を阻害する。ＳＢＴ－１００（配列番号１）はチクングニアウイルス増殖を阻害する。
【国際調査報告】