特表 2024-534838 ＮＫｐ４６結合ポリペプチド及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-26

(54)【発明の名称】ＮＫｐ４６結合ポリペプチド及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20240918BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240918BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20240918BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 31/04 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 31/10 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 31/12 20060101ALI20240918BHJP

   C12N 15/20 20060101ALN20240918BHJP

   C12N 15/24 20060101ALN20240918BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28

C12N15/13 ZNA

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/00 C

C07K19/00

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P35/02

A61P31/00

A61P31/04

A61P31/10

A61P31/12

C12N15/20

C12N15/24

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024512984

(86)(22)【出願日】2022-08-29

(85)【翻訳文提出日】2024-03-19

(86)【国際出願番号】 US2022075581

(87)【国際公開番号】W WO2023034740

(87)【国際公開日】2023-03-09

(31)【優先権主張番号】63/238,429

(32)【優先日】2021-08-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514199744

【氏名又は名称】インヒブルクス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ティマー ジョン シー．

(72)【発明者】

【氏名】エッケルマン ブレンダン ピー．

(72)【発明者】

【氏名】パンディット ラジェイ エー．

(72)【発明者】

【氏名】クラゴ ウィリアム

(72)【発明者】

【氏名】スルツマイアー フロリアン

(72)【発明者】

【氏名】キンケード ヘザー

(72)【発明者】

【氏名】カーン ナジャ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG03

4B064AG05

4B064AG08

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA88X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB42

4C085BB50

4C085DD62

4C085EE03

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA21

(57)【要約】

本明細書では、ＮＫｐ４６に結合するＶＨＨ含有ポリペプチドが提供される。ＶＨＨ含有ポリペプチドの使用も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＮＫｐ４６に結合し、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチド。

【請求項2】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項4】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項5】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項6】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項7】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項8】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項9】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項10】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項11】

少なくとも１つのＶＨＨドメイン又は各ＶＨＨドメインは、ヒト化されている、請求項１～１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項12】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１～配列番号１６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項13】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１～配列番号１６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項14】

少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１１又は配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項15】

２つのＶＨＨドメインを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項16】

３つのＶＨＨドメインを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項17】

免疫細胞活性化サイトカイン又はその機能部分を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項18】

前記免疫細胞活性化サイトカインは、ＮＫｐ４６に結合するＶＨＨドメインのＮ末端又はＣ末端に融合している、請求項１７に記載のポリペプチド。

【請求項19】

前記免疫細胞活性化サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、若しくはＩＦＮγ、又はそれらの弱毒化型若しくは改変型である、請求項１７又は１８に記載のポリペプチド。

【請求項20】

ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項21】

腫瘍抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、請求項２０に記載のポリペプチド。

【請求項22】

１－９２－ＬＦＡ－３、５Ｔ４、α４インテグリン、αＶインテグリン、α４β１インテグリン、α４β７インテグリン、ＡＧＲ２、抗ルイスＹ、アペリンＪ受容体、ＡＰＲＩＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＦＦ、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、補体Ｃ５、Ｃ－２４２、ＣＡ９、ＣＡ１９－９、（ルイスａ）、炭酸脱水酵素９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３２、（ＩＬ－２ＲＧ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１７２Ａ、ＣＤ２４８、ＣＤＨ６、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ－９０）、クローディン３、クローディン４、ｃＭｅｔ、コラーゲン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＳＦＲ、ＣＳＦＲ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＹＲ６１、ＤＬ４４、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、ＤＰＰ－４、ＤＳＧ１、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ３、ＲＳＶのＦタンパク質、ＦＡＰ、ＦＡＳ、ＦｃＲＨ５、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ８、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ－３、葉酸受容体α（ＦＲα）、ＧＡＬ３ＳＴ１、Ｇ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＧＤ２、ＧＩＴＲ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、Ｇｐ１３０、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＲＰ７８、ＨＡＶＣＡＲ１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＧＦ、ｈＧＨ、ＨＶＥＭ、ヒアルロニダーゼ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７／ＩＬ２７Ｒ（ｗｓｘ１）、ＩＬ２９、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ３１／ＩＬ３１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、インスリン受容体、Ｊａｇｇｅｄリガンド、Ｊａｇｇｅｄ １、Ｊａｇｇｅｄ ２、ＫＩＳＳ１－Ｒ、ＬＡＧ－３、ＬＩＦ－Ｒ、ルイスＸ、ＬＩＧＨＴ、ＬＲＰ４、ＬＲＲＣ２６、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ、ＬｙＰＤ１、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＭＲＰ４、ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６、ＣＡ－１２５）、Ｎａ／Ｋ ＡＴＰアーゼ、ＮＧＦ、ニカストリン、ＮＫＧ２Ａ、Ｎｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ １、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ ３、Ｎｏｔｃｈ ４、ＮＯＶ、ＯＳＭ－Ｒ、ＯＸ－４０、ＰＡＲ２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ホスファチジルセリン、Ｐ１ＧＦ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、ＲＡＡＧ１２、ＲＡＧＥ、ＳＬＣ４４Ａ４、スフィンゴシン－１－リン酸、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＡＰＡ１、ＴＥＭ－８、ＴＧＦβ、ＴＧＦβ受容体１（ＴＧＦＢＲ１）、ＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦＢＲ２）、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＭＥＭ３１、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲＳ１２Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、ＴＲＫ－Ａ、ＴＲＫ－Ｂ、ＴＲＯＰ－２、ｕＰＡＲ、ＶＡＰ１、ＶＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＷＩＳＰ－１、ＷＩＳＰ－２、及びＷＩＳＰ－３から選択される抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、請求項２０又は２１に記載のポリペプチド。

【請求項23】

ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインである、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項24】

ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する各抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインである、請求項２３に記載のポリペプチド。

【請求項25】

ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項26】

ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する各抗原結合ドメインは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、請求項２５に記載のポリペプチド。

【請求項27】

前記ポリペプチドの各ＶＨＨドメインは、ＮＫｐ４６に結合する、請求項１～２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項28】

各ＶＨＨドメインは、同じＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。

【請求項29】

各ＶＨＨドメインは、同じＶＨＨ配列を含む、請求項２７に記載のポリペプチド。

【請求項30】

前記ＮＫｐ４６は、ヒトＮＫｐ４６である、請求項１～２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項31】

前記ヒトＮＫｐ４６は、配列番号２９の配列を含む、請求項３０に記載のポリペプチド。

【請求項32】

Ｆｃ領域を含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項33】

前記Ｆｃ領域は、配列番号５３～配列番号８９から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載のポリペプチド。

【請求項34】

生理学的条件下で二量体を形成する、請求項３２又は３３に記載のポリペプチド。

【請求項35】

前記Ｆｃ領域のＣ末端に融合した免疫細胞活性化サイトカインを含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載のポリペプチド。

【請求項36】

第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む複合体であって、前記第１のポリペプチドは、請求項１～３５のいずれか一項に記載のポリペプチドであり、前記第１のポリペプチドは、第１のＦｃ領域を含み、前記第２のポリペプチドは、第２のＦｃ領域を含み、前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域は、同じか又は異なる、複合体。

【請求項37】

前記第２のポリペプチドは、ＮＫｐ４６に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメイン、少なくとも１つの免疫細胞活性化サイトカイン、及び／又はＮＫｐ４６以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、請求項３６に記載の複合体。

【請求項38】

ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する前記抗原結合ドメインが重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む場合、前記重鎖可変領域は、前記第２のＦｃ領域を含む重鎖定常領域に融合する、請求項３７に記載の複合体。

【請求項39】

前記第２のポリペプチドは、ＴＧＦβ受容体１、ＴＧＦβ受容体２、及びＮＫＧ２Ａから選択されるＮＫｐ４６以外の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む、請求項３７又は３８に記載の複合体。

【請求項40】

前記第２のポリペプチドは、腫瘍抗原に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む、請求項３７～３９のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項41】

前記第２のポリペプチドは、１－９２－ＬＦＡ－３、５Ｔ４、α４インテグリン、αＶインテグリン、α４β１インテグリン、α４β７インテグリン、ＡＧＲ２、抗ルイスＹ、アペリンＪ受容体、ＡＰＲＩＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＦＦ、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、補体Ｃ５、Ｃ－２４２、ＣＡ９、ＣＡ１９－９、（ルイスａ）、炭酸脱水酵素９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３２、（ＩＬ－２ＲＧ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１７２Ａ、ＣＤ２４８、ＣＤＨ６、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ－９０）、クローディン３、クローディン４、ｃＭｅｔ、コラーゲン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＳＦＲ、ＣＳＦＲ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＹＲ６１、ＤＬ４４、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、ＤＰＰ－４、ＤＳＧ１、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ３、ＲＳＶのＦタンパク質、ＦＡＰ、ＦＡＳ、ＦｃＲＨ５、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ８、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ－３、葉酸受容体α（ＦＲα）、ＧＡＬ３ＳＴ１、Ｇ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＧＤ２、ＧＩＴＲ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、Ｇｐ１３０、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＲＰ７８、ＨＡＶＣＡＲ１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＧＦ、ｈＧＨ、ＨＶＥＭ、ヒアルロニダーゼ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７／ＩＬ２７Ｒ（ｗｓｘ１）、ＩＬ２９、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ３１／ＩＬ３１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、インスリン受容体、Ｊａｇｇｅｄリガンド、Ｊａｇｇｅｄ １、Ｊａｇｇｅｄ ２、ＫＩＳＳ１－Ｒ、ＬＡＧ－３、ＬＩＦ－Ｒ、ルイスＸ、ＬＩＧＨＴ、ＬＲＰ４、ＬＲＲＣ２６、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ、ＬｙＰＤ１、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＭＲＰ４、ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６、ＣＡ－１２５）、Ｎａ／Ｋ ＡＴＰアーゼ、ＮＧＦ、ニカストリン、Ｎｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ １、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ ３、Ｎｏｔｃｈ ４、ＮＯＶ、ＯＳＭ－Ｒ、ＯＸ－４０、ＰＡＲ２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ホスファチジルセリン、Ｐ１ＧＦ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、ＲＡＡＧ１２、ＲＡＧＥ、ＳＬＣ４４Ａ４、スフィンゴシン－１－リン酸、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＡＰＡ１、ＴＥＭ－８、ＴＧＦβ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＭＥＭ３１、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲＳ１２Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、ＴＲＫ－Ａ、ＴＲＫ－Ｂ、ＴＲＯＰ－２、ｕＰＡＲ、ＶＡＰ１、ＶＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＷＩＳＰ－１、ＷＩＳＰ－２、及びＷＩＳＰ－３から選択される抗原に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む、請求項３７～４０のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項42】

前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＶＨＨドメイン又は各ＶＨＨドメインは、ヒト化されている、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項43】

前記第１のＦｃ領域は、ノブ突然変異を含み、前記第２のＦｃ領域は、ホール突然変異を含むか、又は前記第１のＦｃ領域は、ホール突然変異を含み、前記第２のＦｃ領域は、ノブ突然変異を含む、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項44】

前記第１のＦｃ領域は、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、前記第２のＦｃ領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異を含むか、又は前記第１のＦｃ領域は、ホール突然変異を含み、前記第２のＦｃ領域は、ノブ突然変異を含む、請求項４３に記載の複合体。

【請求項45】

Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異を含む前記Ｆｃ領域は、Ｈ４３５Ｒ又はＨ４３５Ｋ突然変異を含む、請求項４４に記載の複合体。

【請求項46】

前記ポリペプチドは、生理学的条件下で二量体であるか、又は前記複合体は、生理学的条件下で形成される、請求項３６～４５のいずれか一項に記載の複合体。

【請求項47】

請求項１～３５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項３６～４６のいずれか一項に記載の複合体と、細胞傷害性物質とを含む免疫複合体。

【請求項48】

前記細胞傷害性物質は、カリケアマイシン、アウリスタチン、ドラスタチン、ツブリシン、メイタンシノイド、クリプトフィシン、ズオカルマイシン、エスペラミシン、ピロロベンゾジアゼピン、及びエンジイン抗生物質から選択される、請求項４７に記載の免疫複合体。

【請求項49】

前記免疫複合体は、請求項３６～４６のいずれか一項に記載の複合体を含み、第２のポリペプチドは、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α、ＴＣＲβ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ６４、ＣＤ８９、又はＮＫＧ２Ｄに結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む、請求項４７又は４８に記載の免疫複合体。

【請求項50】

請求項１～３５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項３６～４６のいずれか一項に記載の複合体、又は請求項４７～４９のいずれか一項に記載の免疫複合体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。

【請求項51】

請求項１～３５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項３６～４６のいずれか一項に記載の複合体をコードする分離された核酸。

【請求項52】

請求項５１に記載の核酸を含むベクター。

【請求項53】

請求項５１に記載の核酸又は請求項５２に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項54】

請求項１～３５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項３６～４６のいずれか一項に記載の複合体を発現する宿主細胞。

【請求項55】

請求項１～３５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項３６～４６のいずれか一項に記載の複合体を生産する方法であって、前記ポリペプチド又は複合体の発現に適した条件下で請求項５３又は５４に記載の宿主細胞をインキュベートすることを含む、方法。

【請求項56】

前記ポリペプチド又は複合体を単離することを更に含む、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

ＮＫ細胞の増殖又は活性化を増加させる方法であって、ＮＫ細胞を請求項１～３５のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項３６～４６のいずれか一項に記載の複合体と接触させることを含む、方法。

【請求項58】

前記ＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで存在する、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

前記ＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで存在する、請求項５７に記載の方法。

【請求項60】

癌を治療する方法であって、癌又は感染性疾患を伴う被験体に請求項１～３５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項３６～４６のいずれか一項に記載の複合体、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の免疫複合体、又は請求項５０に記載の医薬組成物を薬学的有効量、投与することを含む、方法。

【請求項61】

前記癌は、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膠芽腫、肝癌、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓癌又は腎癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（口唇、舌、口腔、及び咽頭）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃部癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮又は子宮内膜癌、泌尿器系癌、外陰癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、有毛細胞白血病、並びに慢性骨髄芽球性白血病から選択される、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

追加の療法剤を投与することを更に含む、請求項６０又は６１に記載の方法。

【請求項63】

前記追加の療法剤は、抗癌剤である、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記抗癌剤は、化学療法剤、抗癌生物製剤、放射線療法薬、ＣＡＲ－Ｔ療法薬、及び腫瘍溶解性ウイルスから選択される、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記追加の療法剤は、抗癌生物製剤である、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記抗癌生物製剤は、腫瘍抗原に結合する結合ドメインを含む抗体である、請求項６４又は６５に記載の方法。

【請求項67】

癌細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害応答をリダイレクトする方法であって、癌を伴う被験体に請求項２２～３５のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項３６～４６のいずれか一項に記載の複合体、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の免疫複合体、又は請求項５０に記載の医薬組成物を薬学的有効量、投与することを含む、方法。

【請求項68】

感染性疾患を治療する方法であって、感染性疾患を伴う被験体に請求項１～４６のいずれか一項に記載のポリペプチド若しくは複合体、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の免疫複合体、又は請求項５０に記載の医薬組成物を薬学的有効量、投与することを含む、方法。

【請求項69】

前記感染性疾患は、細菌感染、ウイルス感染、又は真菌感染である、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

追加の療法剤を投与することを更に含む、請求項６８又は６９に記載の方法。

【請求項71】

前記追加の療法剤は、抗生物質、抗ウイルス剤、又は抗真菌剤である、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

病原体に対するナチュラルキラー媒介性細胞傷害応答をリダイレクトする方法であって、該病原体によって引き起こされる感染性疾患を伴う被験体に請求項１～４６のいずれか一項に記載のポリペプチド若しくは複合体、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の免疫複合体、又は請求項５０に記載の医薬組成物を薬学的有効量、投与することを含む、方法。

【請求項73】

前記ポリペプチド、複合体、又は免疫複合体は、前記病原体によって発現される抗原に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む、請求項６８～７２のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本願は、２０２１年８月３０日付で出願された米国仮出願第６３／２３８，４２９号の優先権の利益を主張し、その全体があらゆる目的で引用することにより本明細書の一部をなす。

【0002】

［配列表の参照による援用］
本願は、２０２２年８月１８日に作成された、０１２０２－００２９－００ＰＣＴ＿ＳＴ２６と題する、本願とともに電子フォーマットで提出された９９．１キロバイトのサイズの配列表を参照により援用する。

【0003】

本発明は、ＮＫｐ４６結合ポリペプチド、及びＮＫｐ４６結合ポリペプチドを使用してＮＫｐ４６の生物学的活性を調節する方法に関する。そのような方法には、限定されるものではないが、癌及び感染性疾患を治療する方法が含まれる。幾つかの実施の形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドと、免疫細胞活性化サイトカイン、及び／又はＮＫｐ４６以外の抗原に結合するポリペプチドとを含む融合ポリペプチドである。

【背景技術】

【0004】

ＣＤ３３５、ＬＹ９４ホモログ、又はＮＣＲ１としても知られるＮＫｐ４６は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される活性化細胞表面受容体である。ＮＫｐ４６は、自然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）ファミリーの一部であり、一般にウイルス感染細胞、真菌細胞、又は癌細胞上に提示されるストレスリガンドの受容体として機能する。ＮＫｐ４６のライゲーション及びクラスター化は、共受容体ＦｃεＲＩ及びＣＤ３ζを含む免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を介して活性化シグナルを駆動し、インターフェロン－γの発現及びＮＫ媒介性細胞傷害を誘導する。ＮＫｐ４６の発現は、ＮＫ細胞に限定され、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、又は顆粒球上では発現されない。ＮＫｐ４６遺伝子は、ヒトからカニクイザル、ラット、及びマウスまで保存されており、これらの動物における発現パターンもヒトと同様にＮＫ細胞に限定される。この発現パターン及び種の保存から、ＮＫｐ４６は、ＮＫを標的とする治療薬の理想的なＮＫ特異的マーカーであり、ＮＫ媒介性細胞傷害を駆動する強力なＮＫ活性化受容体でもある。

【0005】

ＮＫ細胞は、事前に感作することなくウイルス感染細胞及び癌細胞を死滅させ、サイトカインシグナル及びケモカインシグナルを介して樹状細胞、Ｔ細胞、及びＢ細胞の適応免疫応答を増強することができる重要な免疫細胞である（非特許文献１）。ＮＫ細胞は、標的細胞を認識し、死滅させる幾つかの機構を有する。ストレスリガンドは、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、及びＤＮＡＭ－１等の自然細胞傷害性受容体（ＮＣＲ）を介してＮＫ細胞の脱顆粒に関与し、これを活性化する。ＭＨＣクラスＩの消失は、多くのウイルスに共通する免疫回避戦略であり、ヒト癌においても観察される。ＮＫ細胞は、ＫＩＲ及びＮＫＧ２Ａからの抑制シグナルの遮断により、ＭＨＣクラスＩを発現していない細胞を認識し、死滅させることができる（非特許文献２）。抗体によるウイルス抗原又は癌抗原の抗体オプソニン化は、ＮＫ細胞上のＣＤ１６ａをアゴナイズし、ＮＫ細胞傷害の強力な活性化を誘導する。ＮＫ細胞の脱顆粒は、細胞傷害性タンパク質だけでなく、インターフェロン－γ及びＴＮＦ－α等の免疫刺激性サイトカイン、並びにＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＸＣＬ１、及びＸＣＬ２のような免疫増強ケモカインを放出する（非特許文献３及び非特許文献４）。これらの分泌因子は、効率的な適応免疫応答を調整するためにＤＣ、Ｔ細胞、及びＢ細胞を活性化し、動員する。

【0006】

多数の刺激性シグナル及び抑制性シグナルが、ＮＫ細胞の全体的な活性化状態を調整し、応答の閾値及び規模を制御する。ウイルス感染細胞のＮＫ媒介死滅に理想的な条件は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）又はインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）等のサイトカインからの支持を必要とする。ＩＬ－２及びＩＬ－１５は、ＣＤ１２２及びＣＤ１３２から構成される共通のヘテロ二量体シグナル伝達受容体を介してＴ細胞及びＮＫ細胞の増殖を刺激する強力なサイトカインである。また、ＩＬ－２は、ＣＤ２５を含むヘテロ三量体高親和性形態の受容体に連結することができる。ＩＬ－２及びＩＬ－１５は、ＮＫ細胞の生存及び増殖を増強することに加えて、グランザイム－Ｂ、パーフォリン、及びインターフェロン－γ等のエフェクター分子を発現するようにＮＫ細胞をプライミングすることができ、これらは脱顆粒時に放出され、標的細胞を破壊するように作用する。感染又は癌に起因する病的炎症は、ＮＫ細胞を疲弊し、効果のない状態にする可能性がある。ＩＬ－２又はＩＬ－１５による刺激は、疲弊したＮＫ細胞を再活性化し、抑制性の免疫シグナルを克服することができる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Vidal et al. Curr Opin Virol 1(6):497-512 (2011)

【非特許文献2】Raulet and Vance Nat Rev Immunol 6(7):520-531 (2006)

【非特許文献3】Fauriat et al. Blood 115(11):2167-2176 (2010)

【非特許文献4】Bottcher et al. Cell 172(5):1022-1037 (2018)

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

活性化分子等の分子をＮＫ細胞に特異的に標的化し、ＮＫ細胞応答の効力及び選択性を増大させることができるＮＫｐ４６結合ポリペプチドが必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0009】

ＮＫｐ４６結合ポリペプチド、及びＮＫｐ４６結合ポリペプチドを使用して、例えば癌又は感染性疾患を治療する方法が本明細書で提供される。幾つかの実施の形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＮＫｐ４６に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施の形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、１つ以上の付加的な結合ドメイン及び／又はサイトカイン配列を含む。

【0010】

幾つかの実施の形態を以下に提示する。

【0011】

実施の形態１． ＮＫｐ４６に結合し、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、又は配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、又は配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチド。

【0012】

実施の形態２． 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、実施の形態１に記載のポリペプチド。

【0013】

実施の形態３． 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、実施の形態１に記載のポリペプチド。

【0014】

実施の形態４． 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、実施の形態１に記載のポリペプチド。

【0015】

実施の形態５． 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、実施の形態１に記載のポリペプチド。

【0016】

実施の形態６． 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、実施の形態１に記載のポリペプチド。

【0017】

実施の形態７． 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、実施の形態１に記載のポリペプチド。

【0018】

実施の形態８． 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、実施の形態１に記載のポリペプチド。

【0019】

実施の形態９． 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、実施の形態１に記載のポリペプチド。

【0020】

実施の形態１０． 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、及び配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、実施の形態１に記載のポリペプチド。

【0021】

実施の形態１１． 少なくとも１つのＶＨＨドメイン又は各ＶＨＨドメインは、ヒト化されている、実施の形態１～１０のいずれか一形態に記載のポリペプチド。

【0022】

実施の形態１２． 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１～配列番号１６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む、実施の形態１～１１のいずれか一形態に記載のポリペプチド。

【0023】

実施の形態１３． 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１～配列番号１６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、実施の形態１～１２のいずれか一形態に記載のポリペプチド。

【0024】

実施の形態１４． 少なくとも１つのＶＨＨドメインは、配列番号１１又は配列番号１５のアミノ酸配列を含む、実施の形態１～１３のいずれか一形態に記載のポリペプチド。

【0025】

実施の形態１５． ２つのＶＨＨドメインを含む、実施の形態１～１４のいずれか一形態に記載のポリペプチド。

【0026】

実施の形態１６． ３つのＶＨＨドメインを含む、実施の形態１～１４のいずれか一形態に記載のポリペプチド。

【0027】

実施の形態１７． 免疫細胞活性化サイトカイン又はその機能部分を含む、実施の形態１～１６のいずれか一形態に記載のポリペプチド。

【0028】

実施の形態１８． 前記免疫細胞活性化サイトカインは、ＮＫｐ４６に結合するＶＨＨドメインのＮ末端又はＣ末端に融合している、実施の形態１７に記載のポリペプチド。

【0029】

実施の形態１９． 前記免疫細胞活性化サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、若しくはＩＦＮγ、又はそれらの弱毒化型若しくは改変型である、実施の形態１７又は１８に記載のポリペプチド。

【0030】

実施の形態２０． ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、実施の形態１～１９のいずれか一形態に記載のポリペプチド。

【0031】

実施の形態２１． 腫瘍抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、実施の形態２０に記載のポリペプチド。

【0032】

実施の形態２２． １－９２－ＬＦＡ－３、５Ｔ４、α４インテグリン、αＶインテグリン、α４β１インテグリン、α４β７インテグリン、ＡＧＲ２、抗ルイスＹ、アペリンＪ受容体、ＡＰＲＩＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＦＦ、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、補体Ｃ５、Ｃ－２４２、ＣＡ９、ＣＡ１９－９、（ルイスａ）、炭酸脱水酵素９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３２、（ＩＬ－２ＲＧ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１７２Ａ、ＣＤ２４８、ＣＤＨ６、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ－９０）、クローディン３、クローディン４、ｃＭｅｔ、コラーゲン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＳＦＲ、ＣＳＦＲ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＹＲ６１、ＤＬ４４、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、ＤＰＰ－４、ＤＳＧ１、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ３、ＲＳＶのＦタンパク質、ＦＡＰ、ＦＡＳ、ＦｃＲＨ５、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ８、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ－３、葉酸受容体α（ＦＲα）、ＧＡＬ３ＳＴ１、Ｇ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＧＤ２、ＧＩＴＲ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、Ｇｐ１３０、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＲＰ７８、ＨＡＶＣＡＲ１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＧＦ、ｈＧＨ、ＨＶＥＭ、ヒアルロニダーゼ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７／ＩＬ２７Ｒ（ｗｓｘ１）、ＩＬ２９、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ３１／ＩＬ３１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、インスリン受容体、Ｊａｇｇｅｄリガンド、Ｊａｇｇｅｄ １、Ｊａｇｇｅｄ ２、ＫＩＳＳ１－Ｒ、ＬＡＧ－３、ＬＩＦ－Ｒ、ルイスＸ、ＬＩＧＨＴ、ＬＲＰ４、ＬＲＲＣ２６、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ、ＬｙＰＤ１、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＭＲＰ４、ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６、ＣＡ－１２５）、Ｎａ／Ｋ ＡＴＰアーゼ、ＮＧＦ、ニカストリン、ＮＫＧ２Ａ、Ｎｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ １、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ ３、Ｎｏｔｃｈ ４、ＮＯＶ、ＯＳＭ－Ｒ、ＯＸ－４０、ＰＡＲ２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ホスファチジルセリン、Ｐ１ＧＦ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、ＲＡＡＧ１２、ＲＡＧＥ、ＳＬＣ４４Ａ４、スフィンゴシン－１－リン酸、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＡＰＡ１、ＴＥＭ－８、ＴＧＦβ、ＴＧＦβ受容体１（ＴＧＦＢＲ１）、ＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦＢＲ２）、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＭＥＭ３１、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲＳ１２Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、ＴＲＫ－Ａ、ＴＲＫ－Ｂ、ＴＲＯＰ－２、ｕＰＡＲ、ＶＡＰ１、ＶＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＷＩＳＰ－１、ＷＩＳＰ－２、及びＷＩＳＰ－３から選択される抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、実施の形態２０又は２１に記載のポリペプチド。

【0033】

実施の形態２３． ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインである、実施の形態２０～２２のいずれか一形態に記載のポリペプチド。

【0034】

実施の形態２４． ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する各抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインである、実施の形態２３に記載のポリペプチド。

【0035】

実施の形態２５． ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、実施の形態２０～２２のいずれか一形態に記載のポリペプチド。

【0036】

実施の形態２６． ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する各抗原結合ドメインは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、実施の形態２５に記載のポリペプチド。

【0037】

実施の形態２７． 前記ポリペプチドの各ＶＨＨドメインは、ＮＫｐ４６に結合する、実施の形態１～２２のいずれか一形態に記載のポリペプチド。

【0038】

実施の形態２８． 各ＶＨＨドメインは、同じＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列を含む、実施の形態２７に記載のポリペプチド。

【0039】

実施の形態２９． 各ＶＨＨドメインは、同じＶＨＨ配列を含む、実施の形態２７に記載のポリペプチド。

【0040】

実施の形態３０． 前記ＮＫｐ４６は、ヒトＮＫｐ４６である、実施の形態１～２９のいずれか一形態に記載のポリペプチド。

【0041】

実施の形態３１． 前記ヒトＮＫｐ４６は、配列番号２９の配列を含む、実施の形態３０に記載のポリペプチド。

【0042】

実施の形態３２． Ｆｃ領域を含む、実施の形態１～３１のいずれか一形態に記載のポリペプチド。

【0043】

実施の形態３３． 前記Ｆｃ領域は、配列番号５３～配列番号８９から選択されるアミノ酸配列を含む、実施の形態３２に記載のポリペプチド。

【0044】

実施の形態３４． 生理学的条件下で二量体を形成する、実施の形態３２又は３３に記載のポリペプチド。

【0045】

実施の形態３５． 前記Ｆｃ領域のＣ末端に融合した免疫細胞活性化サイトカインを含む、実施の形態３２～３４のいずれか一形態に記載のポリペプチド。

【0046】

実施の形態３６． 第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む複合体であって、前記第１のポリペプチドは、実施の形態１～３５のいずれか一形態に記載のポリペプチドであり、前記第１のポリペプチドは、第１のＦｃ領域を含み、前記第２のポリペプチドは、第２のＦｃ領域を含み、前記第１のＦｃ領域及び前記第２のＦｃ領域は、同じか又は異なる、複合体。

【0047】

実施の形態３７． 前記第１又は第２のポリペプチドは、ＮＫｐ４６に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメイン、少なくとも１つの免疫細胞活性化サイトカイン、及び／又はＮＫｐ４６以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む、実施の形態３６に記載の複合体。

【0048】

実施の形態３８． ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する前記抗原結合ドメインが重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む場合、前記重鎖可変領域は、前記第１又は第２のＦｃ領域を含む重鎖定常領域に融合する、実施の形態３７に記載の複合体。

【0049】

実施の形態３９． 前記第１又は第２のポリペプチドは、ＴＧＦβ受容体１、ＴＧＦβ受容体２、及びＮＫＧ２Ａから選択されるＮＫｐ４６以外の抗原に結合する抗原結合ドメインを含む、実施の形態３７又は３８に記載の複合体。

【0050】

実施の形態４０． 前記第１又は第２のポリペプチドは、腫瘍抗原に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む、実施の形態３７～３９のいずれか一形態に記載の複合体。

【0051】

実施の形態４１． 前記第１又は第２のポリペプチドは、１－９２－ＬＦＡ－３、５Ｔ４、α４インテグリン、αＶインテグリン、α４β１インテグリン、α４β７インテグリン、ＡＧＲ２、抗ルイスＹ、アペリンＪ受容体、ＡＰＲＩＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＦＦ、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、補体Ｃ５、Ｃ－２４２、ＣＡ９、ＣＡ１９－９、（ルイスａ）、炭酸脱水酵素９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３２、（ＩＬ－２ＲＧ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１７２Ａ、ＣＤ２４８、ＣＤＨ６、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ－９０）、クローディン３、クローディン４、ｃＭｅｔ、コラーゲン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＳＦＲ、ＣＳＦＲ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＹＲ６１、ＤＬ４４、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、ＤＰＰ－４、ＤＳＧ１、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ３、ＲＳＶのＦタンパク質、ＦＡＰ、ＦＡＳ、ＦｃＲＨ５、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ８、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ－３、葉酸受容体α（ＦＲα）、ＧＡＬ３ＳＴ１、Ｇ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＧＤ２、ＧＩＴＲ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、Ｇｐ１３０、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＲＰ７８、ＨＡＶＣＡＲ１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＧＦ、ｈＧＨ、ＨＶＥＭ、ヒアルロニダーゼ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７／ＩＬ２７Ｒ（ｗｓｘ１）、ＩＬ２９、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ３１／ＩＬ３１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、インスリン受容体、Ｊａｇｇｅｄリガンド、Ｊａｇｇｅｄ １、Ｊａｇｇｅｄ ２、ＫＩＳＳ１－Ｒ、ＬＡＧ－３、ＬＩＦ－Ｒ、ルイスＸ、ＬＩＧＨＴ、ＬＲＰ４、ＬＲＲＣ２６、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ、ＬｙＰＤ１、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＭＲＰ４、ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６、ＣＡ－１２５）、Ｎａ／Ｋ ＡＴＰアーゼ、ＮＧＦ、ニカストリン、Ｎｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ １、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ ３、Ｎｏｔｃｈ ４、ＮＯＶ、ＯＳＭ－Ｒ、ＯＸ－４０、ＰＡＲ２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ホスファチジルセリン、Ｐ１ＧＦ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、ＲＡＡＧ１２、ＲＡＧＥ、ＳＬＣ４４Ａ４、スフィンゴシン－１－リン酸、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＡＰＡ１、ＴＥＭ－８、ＴＧＦβ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＭＥＭ３１、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲＳ１２Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、ＴＲＫ－Ａ、ＴＲＫ－Ｂ、ＴＲＯＰ－２、ｕＰＡＲ、ＶＡＰ１、ＶＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＷＩＳＰ－１、ＷＩＳＰ－２、及びＷＩＳＰ－３から選択される抗原に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む、実施の形態３７～４０のいずれか一形態に記載の複合体。

【0052】

実施の形態４２． 前記第２のポリペプチドの少なくとも１つのＶＨＨドメイン又は各ＶＨＨドメインは、ヒト化されている、実施の形態３６～４１のいずれか一形態に記載の複合体。

【0053】

実施の形態４３． 前記第１のＦｃ領域は、ノブ突然変異を含み、前記第２のＦｃ領域は、ホール突然変異を含むか、又は前記第１のＦｃ領域は、ホール突然変異を含み、前記第２のＦｃ領域は、ノブ突然変異を含む、実施の形態３６～４２のいずれか一形態に記載の複合体。

【0054】

実施の形態４４． 前記第１のＦｃ領域は、Ｔ３６６Ｗ突然変異を含み、前記第２のＦｃ領域は、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異を含むか、又は前記第１のＦｃ領域は、ホール突然変異を含み、前記第２のＦｃ領域は、ノブ突然変異を含む、実施の形態４３に記載の複合体。

【0055】

実施の形態４５． Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ突然変異を含む前記Ｆｃ領域は、Ｈ４３５Ｒ又はＨ４３５Ｋ突然変異を含む、実施の形態４４に記載の複合体。

【0056】

実施の形態４６． 前記ポリペプチドは、生理学的条件下で二量体であるか、又は前記複合体は、生理学的条件下で形成される、実施の形態３６～４５のいずれか一形態に記載の複合体。

【0057】

実施の形態４７． 実施の形態１～３５のいずれか一形態に記載のポリペプチド又は実施の形態３６～４６のいずれか一形態に記載の複合体と、細胞傷害性物質とを含む免疫複合体。

【0058】

実施の形態４８． 前記細胞傷害性物質は、カリケアマイシン、アウリスタチン、ドラスタチン、ツブリシン、メイタンシノイド、クリプトフィシン、ズオカルマイシン、エスペラミシン、ピロロベンゾジアゼピン、及びエンジイン抗生物質から選択される、実施の形態４７に記載の免疫複合体。

【0059】

実施の形態４９． 前記免疫複合体は、実施の形態３６～４６のいずれか一形態に記載の複合体を含み、第２のポリペプチドは、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α、ＴＣＲβ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ６４、ＣＤ８９、又はＮＫＧ２Ｄに結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む、実施の形態４７又は４８に記載の免疫複合体。

【0060】

実施の形態５０． 実施の形態１～３５のいずれか一形態に記載のポリペプチド、実施の形態３６～４６のいずれか一形態に記載の複合体、又は実施の形態４７～４９のいずれか一形態に記載の免疫複合体と、薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物。

【0061】

実施の形態５１． 実施の形態１～３５のいずれか一形態に記載のポリペプチド又は実施の形態３６～４６のいずれか一形態に記載の複合体をコードする分離された核酸。

【0062】

実施の形態５２． 実施の形態５１に記載の核酸を含むベクター。

【0063】

実施の形態５３． 実施の形態５１に記載の核酸又は実施の形態５２に記載のベクターを含む宿主細胞。

【0064】

実施の形態５４． 実施の形態１～３５のいずれか一形態に記載のポリペプチド又は実施の形態３６～４６のいずれか一形態に記載の複合体を発現する宿主細胞。

【0065】

実施の形態５５． 実施の形態１～３５のいずれか一形態に記載のポリペプチド又は実施の形態３６～４６のいずれか一形態に記載の複合体を生産する方法であって、前記ポリペプチド又は複合体の発現に適した条件下で実施の形態５３又は５４に記載の宿主細胞をインキュベートすることを含む、方法。

【0066】

実施の形態５６． 前記ポリペプチド又は複合体を単離することを更に含む、実施の形態５５に記載の方法。

【0067】

実施の形態５７． ＮＫ細胞の増殖又は活性化を増加させる方法であって、ＮＫ細胞を実施の形態１～３５のいずれか一形態に記載のポリペプチド又は実施の形態３６～４６のいずれか一形態に記載の複合体と接触させることを含む、方法。

【0068】

実施の形態５８． 前記ＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで存在する、実施の形態５７に記載の方法。

【0069】

実施の形態５９． 前記ＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで存在する、実施の形態５７に記載の方法。

【0070】

実施の形態６０． 癌を治療する方法であって、癌又は感染性疾患を伴う被験体に実施の形態１～３５のいずれか一形態に記載のポリペプチド、実施の形態３６～４６のいずれか一形態に記載の複合体、実施の形態４７～４９のいずれか一形態に記載の免疫複合体、又は実施の形態５０に記載の医薬組成物を薬学的有効量、投与することを含む、方法。

【0071】

実施の形態６１． 前記癌は、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膠芽腫、肝癌、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓癌又は腎癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（口唇、舌、口腔、及び咽頭）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃部癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮又は子宮内膜癌、泌尿器系癌、外陰癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、有毛細胞白血病、並びに慢性骨髄芽球性白血病から選択される、実施の形態６０に記載の方法。

【0072】

実施の形態６２． 追加の療法剤を投与することを更に含む、実施の形態６０又は６１に記載の方法。

【0073】

実施の形態６３． 前記追加の療法剤は、抗癌剤である、実施の形態６２に記載の方法。

【0074】

実施の形態６４． 前記抗癌剤は、化学療法剤、抗癌生物製剤、放射線療法薬、ＣＡＲ－Ｔ療法薬、及び腫瘍溶解性ウイルスから選択される、実施の形態６３に記載の方法。

【0075】

実施の形態６５． 前記追加の療法剤は、抗癌生物製剤である、実施の形態６４に記載の方法。

【0076】

実施の形態６６． 前記抗癌生物製剤は、腫瘍抗原に結合する結合ドメインを含む抗体である、実施の形態６４又は６５に記載の方法。

【0077】

実施の形態６７． 癌細胞に対するＮＫ細胞媒介性細胞傷害応答をリダイレクトする方法であって、癌を伴う被験体に実施の形態２２～３５のいずれか一形態に記載のポリペプチド、実施の形態３６～４６のいずれか一形態に記載の複合体、実施の形態４７～４９のいずれか一形態に記載の免疫複合体、又は実施の形態５０に記載の医薬組成物を薬学的有効量、投与することを含む、方法。

【0078】

実施の形態６８． 感染性疾患を治療する方法であって、感染性疾患を伴う被験体に実施の形態１～４６のいずれか一形態に記載のポリペプチド若しくは複合体、実施の形態４７～４９のいずれか一形態に記載の免疫複合体、又は実施の形態５０に記載の医薬組成物を薬学的有効量、投与することを含む、方法。

【0079】

実施の形態６９． 前記感染性疾患は、細菌感染、ウイルス感染、又は真菌感染である、実施の形態６８に記載の方法。

【0080】

実施の形態７０． 追加の療法剤を投与することを更に含む、実施の形態６８又は６９に記載の方法。

【0081】

実施の形態７１． 前記追加の療法剤は、抗生物質、抗ウイルス剤、又は抗真菌剤である、実施の形態７０に記載の方法。

【0082】

実施の形態７２． 病原体に対するナチュラルキラー媒介性細胞傷害応答をリダイレクトする方法であって、該病原体によって引き起こされる感染性疾患を伴う被験体に実施の形態１～４６のいずれか一形態に記載のポリペプチド若しくは複合体、実施の形態４７～４９のいずれか一形態に記載の免疫複合体、又は実施の形態５０に記載の医薬組成物を薬学的有効量、投与することを含む、方法。

【0083】

実施の形態７３． 前記ポリペプチド、複合体、又は免疫複合体は、前記病原体によって発現される抗原に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む、実施の形態６８～７２のいずれか一形態に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0084】

【図1】図１Ａ～図１Ｊは、フローサイトメトリーによって評価したＮＫｐ４６結合ＶＨＨドメインとＦｃドメインとを含むポリペプチドの結合を示す図である。図１Ａ及び図１Ｂ、並びに図１Ｉは、ヒトＮＫｐ４６でトランスフェクションしたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞への結合を示す。図１Ｃ及び図１Ｄは、カニクイザルＮＫｐ４６でトランスフェクションしたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞への結合を示す。図１Ｅ及び図１Ｆは、マウスＮＫｐ４６でトランスフェクションしたＨＥＫ－２９３Ｆ細胞への結合を示す。トランスフェクションしていないＨＥＫ－２９３Ｆ細胞への結合は、図１Ｇ及び図１Ｈ、並びに図１Ｊに示す。図１Ｉ及び図１Ｊは、二価ＶＨＨとホモ二量体Ｆｃとを含むポリペプチドとしてフォーマットされたＮＫｐ４６標的化ＶＨＨドメインの結合を示す。

【図2】図２Ａ～図２Ｉは、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ１６^＋ＮＫ細胞（図２Ａ及び図２Ｂ）、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＣＤ１６－ＮＫ細胞（図２Ｃ及び図２Ｄ）、全ＮＫ細胞（図２Ｇ）、及びＣＤ４^＋Ｔ細胞（図２Ｅ及び図２Ｆ、並びに図２Ｈ）上でのヘテロ二量体ＦｃのＣ末端に融合したＩＬ－２変異体と、ＮＫｐ４６結合ＶＨＨドメインとを含むポリペプチド（ｈｚ５Ｄ７ｖ１２－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ホール及びｈｚ５Ｄ７ｖ１２－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ノブ－突然変異体ＩＬ－２、又はｈｚ５Ｄ７ｖ１７－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ホール及びｈｚ５Ｄ７ｖ１７－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ノブ－突然変異体ＩＬ－２）、ヘテロ二量体Ｆｃ及びＮＫｐ４６標的化ＶＨＨドメインを含み、ＩＬ－２を含まないポリペプチド（ｈｚ５Ｄ７ｖ１２－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ホール及びｈｚ５Ｄ７ｖ１２－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ノブ）、ヘテロ二量体ＦｃのＣ末端に融合したＩＬ－２変異体と、標的化されていないＶＨＨとを含むポリペプチド（標的化されていないＶＨＨ－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ホール及び標的化されていないＶＨＨ－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ノブ－突然変異体ＩＬ－２）、並びに野生型組換えＩＬ－２の細胞内ＳＴＡＴ５リン酸化レベルによって測定される活性を示す図である。シグナル伝達活性の特異性は、ＮＫ細胞（図２Ａ～図２Ｄ、及び図２Ｇ）において示され、野生型組換えＩＬ－２のみがＣＤ４^＋（図２Ｅ及び図２Ｆ、並びに図２Ｈ）又はＣＤ８^＋Ｔ細胞（図２Ｉ）に対して活性を有する。

【図3】最適用量のセツキシマブ（２０ｎＭ）の活性と比べた、最適以下の用量のセツキシマブ（０．２ｎＭ）と組み合わせた、ヘテロ二量体ＦｃのＣ末端に融合したＩＬ－２変異体と、ＮＫｐ４６標的化ＶＨＨドメインとを含むポリペプチド（ｈｚ５Ｄ７ｖ１２－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ホール及びｈｚ５Ｄ７ｖ１２－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ノブ－突然変異体ＩＬ－２）、ヘテロ二量体ＦｃのＣ末端に融合したＩＬ－２変異体と、標的化されていないＶＨＨとを含むポリペプチド（標的化されていないＶＨＨ－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ホール及び標的化されていないＶＨＨ－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ノブ－突然変異体ＩＬ－２）、及び野生型組換えＩＬ－２のＡＤＣＣ活性を示す図である。

【図4】図４Ａ及び図４Ｂは、リツキシマブの配列類似体である抗ＣＤ２０抗体、又はその脱フコシル化変異体と組み合わせた場合の、ヘテロ二量体ＦｃのＣ末端に融合したＩＬ－２変異体と、ＮＫｐ４６標的化ＶＨＨドメインとを含むポリペプチド（ｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体ＩＬ－２）によるＲａｊｉ Ｂ細胞リンパ腫細胞株に対するＮＫ細胞ＡＤＣＣ活性の増強を示す図である。図４Ａは、抗ＣＤ２０抗体の滴定を示し、図４Ｂは、１ｎＭの抗ＣＤ２０抗体の存在下でＮＫ細胞対標的細胞（Ｒａｊｉ）の比率を変化させることの影響を示す。

【図5】図５Ａ～図５Ｄは、５ｎＭのダラツムマブの配列類似体である抗ＣＤ３８抗体、又は５ｎＭの抗ＢＣＭＡ抗体と組み合わせる場合には多発性骨髄腫細胞株ＮＣＩ－Ｈ９２９（図５Ａ）；１０ｎＭのタファシタマブの配列類似体である抗ＣＤ１９ Ｆｃ改変抗体、又は１ｎＭのオビヌツズマブの配列類似体である抗ＣＤ１９ Ｆｃ改変抗体と組み合わせる場合にはＢ細胞リンパ腫細胞株Ｒａｊｉ（図５Ｂ）；５ｎＭの抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ、又は５０ｎＭの抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブと組み合わせる場合には肺癌細胞株Ａ５４９（図５Ｃ）又は乳癌細胞株ＳＫＢＲ３（図５Ｄ）に対する、ヘテロ二量体ＦｃのＣ末端に融合したＩＬ－２変異体と、ＮＫｐ４６標的化ＶＨＨドメインとを含むポリペプチド（ｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体ＩＬ－２）によるＮＫ細胞ＡＤＣＣ活性の増強を示す図である。ここでは、様々なＮＫ細胞対標的細胞の比率を比較した。ｃｘ１１３１４は、全ての組合せ条件において１ｎＭで使用した。

【図6】図６Ａ～図６Ｃは、カニクイザルにおけるＮＫｐ４６結合ＶＨＨドメインと、ヘテロ二量体Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合したＩＬ－２変異体とを含むポリペプチド（ｈｚ５Ｄ７ｖ１２－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体ＩＬ－２）の０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、又は３ｍｇ／ｋｇでの単回投与の活性を示す図である。動物の末梢血における亜集団の増加は、投与の１０日後（図６Ａ）及び１４日後（図６Ｂ）に示される。図４Ｃは、投与の４日後及び１０日後のグランザイムＢ発現の増加を示す。

【図7】皮下Ｒａｊｉ腫瘍異種移植マウスモデルにおけるヘテロ二量体Ｆｃを含むｓｄＡｂのＣ末端に融合したＩＬ－２変異体と、ＮＫｐ４６標的化ＶＨＨドメインとを含むポリペプチド（ｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体ＩＬ－２）によって誘導される腫瘍体積の変化によって測定される抗腫瘍効力を示す図である。ｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体ＩＬ－２は、矢印によって示されるように週１回で３回投与し、単剤として又はリツキシマブ類似体と組み合わせて静脈内投与した。コントロール群には、ビヒクルのみ又はリツキシマブ類似体単独による処理が含まれていた。

【図8】図８Ａ及び図８Ｂは、ＮＫｐ４６結合ＶＨＨドメインと、ヘテロ二量体Ｆｃと、Ｆｃ領域のＣ末端に融合したＩＬ－２変異体とを含むポリペプチド（ｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体ＩＬ－２）による化学療法誘導ＮＫ細胞欠陥の回復を示す図である。図８Ａは、単独での又はレナリドミド及び／又はｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体ＩＬ－２と組み合わせたデキサメタゾンによる３日間の処理後のフローサイトメトリーによって決定されるヒト末梢血中のＮＫ細胞数に対する効果を示す。図８Ｂは、ダラツムマブの配列類似体（抗ｈＣＤ３８－ｈＩｇＧ１）と組み合わせた場合の多発性骨髄腫標的細胞株（ＭＭ１Ｓ）に対する単独での又はｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体ＩＬ－２と組み合わせた化学療法薬（デキサメタゾン及びレナリドミド）で前処理したＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0085】

本明細書にて提供される実施形態は、ＮＫｐ４６結合ポリペプチド、及び例えば癌又は感染性疾患を治療する様々な方法におけるその使用に関する。

【0086】

本明細書においてＮＫｐ４６結合ポリペプチドが提供される。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＮＫｐ４６に結合する少なくとも１つのＶＨＨを含む。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＮＫ標的化サイトカイン活性のための操作されたサイトカインを含む。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、別の抗原にも結合する、例えば別の抗原に結合するＶＨＨドメインを含む。幾つかのかかる実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは二重特異性である。この二重特異性ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ポリペプチドによって標的化された他の抗原を発現する細胞へとＮＫ媒介性細胞傷害をリダイレクトし得る。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＮＫｐ４６及び別の抗原に結合する三機能性ポリペプチドであり、操作されたサイトカインを含む。この三機能性ポリペプチドは、ＮＫ細胞に対するサイトカイン活性に焦点を当て得る一方で、第２の標的化ドメインは、ポリペプチドを特定の細胞型、例えば癌細胞に標的化する。

【0087】

定義及び様々な実施形態
本明細書に使用されるセクションの見出しは編成のみを目的とし、記載される主題を限定すると解釈されるものではない。

【0088】

特許出願、特許公報、及びＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号を含む本明細書で引用される全ての参考文献は、各個別の参考文献が、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすと具体的かつ個別に示されているかのように、引用することにより本明細書の一部をなす。

【0089】

本明細書に記載又は参照される技術及び手順は、一般に十分に理解されており、通常、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003))、the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.)、PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995))、Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL、及びANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))、Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984)、Methods in Molecular Biology, Humana Press、Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press、Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987)、Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press、Cell and Tissue Culture Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell eds., 1993-8) J. Wiley and Sons、Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.）、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)、PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994）、Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)、Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)、Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)、Antibodies (P. Finch, 1997)、Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)、Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)、Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)、The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)、及びCancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993)並びにそれらの最新版に記載される広く利用されている方法論等の当業者による慣例的な方法論を用いて使用される。

【0090】

別段の規定がない限り、本開示に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈により別段の要求がない限り、又は明白に特段の指示がない限り、単数名辞は複数を含み、複数名辞は単数を含むものとする。様々な出典又は参考文献の間での定義の矛盾については、本明細書に示される定義が優先される。

【0091】

一般に、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)でのようなＥＵインデックスの番号付けである。「ＫａｂａｔでのようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。

【0092】

本明細書に記載される本発明の実施形態は、「からなる（consisting）」実施形態及び／又は「から本質的になる（consisting essentially of）」実施形態を含むと理解される。本明細書で使用される場合に、単数形（"a", "an", and "the"）は、特段の指示がない限り複数の参照を含む。本明細書での「又は」という用語の使用は、選択肢が互いに排他的であることを意味すると解釈されない。

【0093】

本出願では、「又は」の使用は、明白に特段の指定がない限り又は当業者によって理解されない限り、「及び／又は」を意味する。多項従属請求項の文脈では、「又は」の使用は、２項以上の先行する独立請求項又は従属請求項を引用する。

【0094】

「参照試料」、「参照細胞」、又は「参照組織」という語句は、少なくとも１つの未知の特徴を有する試料との比較として使用され得る少なくとも１つの既知の特徴を有する試料を示す。幾つかの実施形態においては、参照試料は、陽性又は陰性の指標として使用され得る。参照試料を使用することで、未知の特徴を有する試料中に存在するタンパク質及び／又はｍＲＮＡのレベルに対して、例えば、健康な組織中に存在するタンパク質及び／又はｍＲＮＡのレベルを確立することができる。幾つかの実施形態においては、参照試料は、同じ被験体に由来するが、試験される部分とは異なる被験体の部分に由来する試料である。幾つかの実施形態においては、参照試料は、癌を取り囲む又は癌に隣接する組織領域に由来する試料である。幾つかの実施形態においては、参照試料は、試験される被験体に由来するものではなく、対象の障害（例えば、特定の癌）を有する又は有しないことが既知の被験体に由来する試料である。幾つかの実施形態においては、参照試料は、同じ被験体に由来するものであるが、被験体が癌を発症する前の時点での試料である。幾つかの実施形態においては、参照試料は、同じ被験体又は異なる被験体からの良性癌試料に由来する試料である。比較のために陰性参照試料が使用される場合に、陰性参照試料における対象の分子の発現レベル又は量は、当業者が本開示を考慮して、該分子が存在しない及び／又は低いレベルの該分子が存在することを認識するレベルを示す。比較のために陽性参照試料が使用される場合に、陽性参照試料における対象の分子の発現レベル又は量は、当業者が本開示を考慮して、或るレベルの該分子が存在することを認識するレベルを示す。

【0095】

療法剤の投与から恩恵を受ける又は療法剤の投与に応答するという文脈において本明細書で使用される「便益」、「臨床的便益」、「応答性」、及び「治療的応答性」という用語は、様々なエンドポイント、例えば、減速及び完全な停止を含む疾患進行の或る程度の抑止、疾患エピソード及び／又は症状の数の減少、病変サイズの縮小、隣接する末梢器官及び／又は末梢組織内への疾患細胞浸潤の抑止（すなわち、減少、減速、又は完全な停止）、病気蔓延の抑止（すなわち、減少、減速、又は完全な停止）、障害に関連する１つ以上の症状の或る程度の軽減、治療後の無病提示、例えば無増悪生存期間の長さの増加、全生存期間の延長、より高い奏効率、及び／又は治療後の所与の時点での死亡率の低下を評価することによって推し量ることができる。「非応答性」又は「応答しない」被験体又は癌は、「応答する」という上記の条件を満たさないものである。

【0096】

「核酸分子」、「核酸」、及び「ポリヌクレオチド」という用語は、区別なく使用され、ヌクレオチドのポリマーを指し得る。そのようなヌクレオチドのポリマーは、天然及び／又は非天然のヌクレオチドを含み、限定されるものではないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＰＮＡを含み得る。「核酸配列」は、核酸分子又はポリヌクレオチドに含まれるヌクレオチドの線状配列を指す。

【0097】

「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために区別なく使用され、最小の長さに限定されない。そのようなアミノ酸残基のポリマーは、天然又は非天然のアミノ酸残基を含み、限定されるものではないが、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体、及び多量体を含み得る。この定義には、完全長タンパク質及びその断片の両方が含まれる。これらの用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアル化、アセチル化、リン酸化等を含む。さらに、本開示の目的で、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する欠失、付加、及び置換等の修飾（一般に性質について保存的）を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるような意図的なものであり得る、又はタンパク質を産生する宿主の突然変異若しくはＰＣＲ増幅によるエラーによるような偶発的なものであり得る。

【0098】

本明細書で使用される「ＮＫｐ４６」は、細胞内でのＮＫｐ４６前駆体のプロセシングから生ずるあらゆる天然の成熟ＮＫｐ４６を指す。この用語は、特段の指示がない限り、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザル又はアカゲザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）等の哺乳動物を含むあらゆる脊椎動物起源からのＮＫｐ４６を含む。この用語はまた、スプライス変異体又はアレル変異体等のＮＫｐ４６の天然に存在する変異体を含む。非限定的な例示的なヒトＮＫｐ４６アミノ酸配列は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｏ７６０３６に示されている。配列番号２９を参照されたい。非限定的な例示的な成熟ヒトＮＫｐ４６配列は、配列番号２９のアミノ酸２２～３０４であり得る。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６は、ＮＫ細胞上で発現されるが、ＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、又は顆粒球上では発現されない。ＮＫｐ４６は、ＮＫ細胞を活性化し、エフェクター機能を誘発する役割を果たし得る。

【0099】

「ナチュラルキラー細胞媒介性細胞傷害」又は「ＮＫ媒介性細胞傷害」という用語は、ＮＫ細胞からの細胞傷害性分子の放出による標的細胞の死滅を指す。これらの細胞傷害性分子、例えばグランザイム及びパーフォリンは、標的細胞と相互作用した場合にＮＫ細胞からエキソサイトーシスによって放出される分泌型リソソーム（溶解性顆粒としても知られる）に貯蔵されることがある。ＮＫ細胞の例示的な内因性標的は、ウイルス感染細胞又は腫瘍原性細胞である。ＮＫ細胞による分泌型リソソームのエキソサイトーシスは、無差別な細胞傷害を回避するように調節される。

【0100】

本明細書で使用される場合に、「リダイレクトされたＮＫ媒介性細胞傷害」は、ＮＫ細胞による標的細胞の細胞傷害を指し、標的細胞は、ＮＫ細胞によって内因的に標的化されない。言い換えると、リダイレクトされたＮＫ媒介性細胞傷害は、通常はＮＫ細胞の標的ではない細胞に向けられたＮＫ細胞傷害を指す。リダイレクトされたＮＫ媒介性細胞傷害は、標的細胞に対する内因性ＮＫ応答と比較して、この標的細胞に対するＮＫ細胞による細胞傷害がより大きいことを指す場合もある。リダイレクトされたＮＫ媒介性細胞傷害は、ＮＫ細胞を標的細胞にリダイレクトすることが可能な作用物質、例えばＮＫｐ４６に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインと、標的細胞上の抗原に結合する少なくとも１つのＶＨＨとを含むポリペプチドによって媒介され得る。このように、ＮＫｐ４６に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインと、標的細胞上の抗原に結合する少なくとも１つのＶＨＨとを含むポリペプチドは、ＮＫ細胞を標的細胞に指向させ、標的細胞に対するＮＫ媒介性細胞傷害を刺激するために使用することができる。

【0101】

本明細書で使用される場合に、「サイトカイン」は、細胞によって放出された小さな非抗体タンパク質であり、このタンパク質が別の細胞に対する作用を媒介する。本明細書で使用される場合に、「操作されたサイトカイン」は、固有の特性を有するように天然のサイトカインアミノ酸配列から変化させたサイトカインを指す。例えば、操作されたサイトカインは、弱毒化サイトカインであり得る。本明細書で使用される場合に、「弱毒化サイトカイン」は、その受容体に対する親和性が低下し、活性のためにその受容体への標的化を必要とするサイトカインである。例示的なサイトカインとしては、ＩＬ－２及びＩＬ－５が挙げられる。

【0102】

本明細書で使用される場合に、「ＮＫｐ４６結合ポリペプチド」及び「ＮＫｐ４６標的化ポリペプチド」は、ＮＫｐ４６に結合する、例えば特異的に結合する結合ドメインを含むポリペプチドを指すために区別なく使用される。

【0103】

抗原又はエピトープに「特異的に結合する」という用語は、当該技術分野で十分に理解されている用語であり、そのような特異的な結合を決定する方法も当該技術分野で十分に知られている。別の細胞又は物質と反応又は会合するよりも特定の細胞又は物質とより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間及び／又はより高い親和性で反応又は会合する場合に、分子は「特異的な結合」又は「優先的な結合」を示すと言及される。シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又はＶＨＨ含有ポリペプチドは、他の物質に結合するよりも高い親和性、アビディティーで、より容易に、及び／又はより長い持続時間で結合する場合に、標的に「特異的に結合」又は「優先的に結合」する。例えば、ＮＫｐ４６エピトープに特異的に又は優先的に結合するｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドは、他のＮＫｐ４６エピトープ又は非ＮＫｐ４６エピトープに結合するよりも高い親和性、アビディティーで、より容易に、及び／又はより長い持続時間でこのエピトープに結合するｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドである。また、この定義を解釈することにより、例えば、第１の標的に特異的又は優先的に結合するｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドが、第２の標的に特異的又は優先的に結合し得る又は結合し得ないことも理解される。したがって、「特異的な結合」又は「優先的な結合」は、排他的な結合を（含み得るものの）必ずしも必要としない。一般に、必ずしもそうとは限らないが、結合への言及は優先的な結合を意味する。「特異性」は、結合性タンパク質が抗原に選択的に結合する能力を指す。

【0104】

「抑止」又は「抑止する」という用語は、任意の表現型特徴の減少若しくは停止、又はその特徴の発生率、程度、若しくは可能性の減少若しくは停止を指す。「低減する」又は「抑止する」とは、参照と比較して、活性、機能、及び／又は量を減少させる、低減する、又は停止することである。幾つかの実施形態においては、「低減する」又は「抑止する」とは、１０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施形態においては、「低減する」又は「抑止する」とは、５０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施形態においては、「低減する」又は「抑止する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。幾つかの実施形態においては、上記の量は、或る期間にわたって、同じ期間にわたるコントロールに対して抑止又は減少される。

【0105】

本明細書で使用される場合に、「エピトープ」という用語は、抗原結合分子（例えば、ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチド）が結合する標的分子（例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、又は脂質等の抗原）上の部位を指す。エピトープは、しばしば、アミノ酸、ポリペプチド、又は糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面編成物を含み、特定の三次元構造的特徴及び特定の電荷特徴を有する。エピトープは、標的分子の連続残基及び／又は並置された非連続残基（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質部分）の両方から形成され得る。連続残基（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、糖、脂質部分）から形成されるエピトープは、通常、変性溶剤への曝露で保持されるが、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、通常、変性溶剤による処理で失われる。エピトープは、限定されるものではないが、少なくとも３個、少なくとも５個、又は８個～１０個の残基（例えば、アミノ酸又はヌクレオチド）を含み得る。幾つかの実施形態においては、エピトープは、２０残基（例えば、アミノ酸又はヌクレオチド）未満、１５残基未満、又は１２残基未満の長さである。２つの抗体は、それらが抗原に対して競合的結合を示す場合に、抗原内の同じエピトープに結合し得る。幾つかの実施形態においては、エピトープは、抗原結合分子上のＣＤＲ残基との或る特定の最小距離によって特定され得る。幾つかの実施形態においては、エピトープは、上記距離によって特定され得て、抗原結合分子の残基と抗原残基との間の結合（例えば、水素結合）に関与するそれらの残基に更に限定され得る。エピトープは、様々なスキャンによっても同様に特定され得る。例えば、アラニンスキャン又はアルギニンスキャンは、抗原結合分子が相互作用し得る１つ以上の残基を示すことができる。明示的に示されない限り、エピトープとしての残基のセットは、特定の抗原結合分子に対するエピトープの一部であることから他の残基を除外するものではない。むしろ、そのようなセットの存在は、最小のエピトープの列（又は種類のセット）を示す。したがって、幾つかの実施形態においては、エピトープとして特定された残基のセットは、抗原上のエピトープについての残基の排他的リストではなく、抗原に関連する最小のエピトープを示す。

【0106】

「非線状エピトープ」又は「立体構造エピトープ」は、エピトープに特異的な抗原結合分子が結合する抗原性タンパク質内の非連続的なポリペプチド、アミノ酸及び／又は糖を含む。幾つかの実施形態においては、少なくとも１つの残基がエピトープの他の示された残基と非連続的であるが、１つ以上の残基が他の残基と連続的である場合もある。

【0107】

「線状エピトープ」は、エピトープに特異的な抗原結合分子が結合する抗原性タンパク質内の連続的なポリペプチド、アミノ酸及び／又は糖を含む。幾つかの実施形態においては、線状エピトープ内の残基の全てが、抗原結合分子によって直接的に結合される（又は結合に関与する）必要があるわけではないことに留意されたい。幾つかの実施形態においては、線状エピトープは、事実上線状エピトープの配列からなるペプチドによる免疫化に由来し得る、又はタンパク質の残部から相対的に分離されたタンパク質の構造区間に由来し得る（こうして、抗原結合分子は、少なくとも主として、まさにその配列区間と相互作用し得る）。

【0108】

「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、慣例的な抗体（典型的には、少なくとも１つの重鎖及び少なくとも１つの軽鎖を含む）、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ、少なくとも１つのＶＨＨドメイン及びＦｃ領域を含む）、ＶＨＨ含有ポリペプチド（少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチド）、及び所望の抗原結合活性を示す限り上述のいずれかのフラグメントを含む抗体様抗原結合ドメインを含む様々なポリペプチドを包含する。幾つかの実施形態においては、抗体は二量体化ドメインを含む。そのような二量体化ドメインとしては、限定されるものではないが、重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３を含み、Ｃ_Ｈ１は典型的には、軽鎖定常ドメインＣＬと対をなす一方で、Ｃ_Ｈ３及び／又はヒンジは二量体化を介在する）及びＦｃ領域（ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３を含み、Ｃ_Ｈ３及び／又はヒンジは二量体化を介在する）が挙げられる。

【0109】

抗体という用語には、限定されるものではないが、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びラクダ（ラマを含む）、サメ、マウス、ヒト、カニクイザル等の様々な種の抗体も含まれる。

【0110】

本明細書で使用される「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原に結合するのに十分な抗体の部分を指す。幾つかの実施形態においては、慣例的な抗体の抗原結合ドメインは、３つの重鎖ＣＤＲ及び３つの軽鎖ＣＤＲを含む。したがって、幾つかの実施形態においては、抗原結合ドメインは、ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３と、抗原への結合を維持するのに必要とされるＦＲ１及び／又はＦＲ４の任意の部分とを含む重鎖可変領域、並びにＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３と、抗原への結合を維持するのに必要とされるＦＲ１及び／又はＦＲ４の任意の部分とを含む軽鎖可変領域を含む。幾つかの実施形態においては、ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドの抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインの３つのＣＤＲを含む。したがって、幾つかの実施形態においては、ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドの抗原結合ドメインは、ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３と、抗原への結合を維持するのに必要とされるＦＲ１及び／又はＦＲ４の任意の部分とを含むＶＨＨドメインを含む。

【0111】

本明細書で使用される「ＶＨＨ」又は「ＶＨＨドメイン」又は「ＶＨＨ抗原結合ドメイン」という用語は、ラクダ抗体又はサメ抗体等のシングルドメイン抗体の抗原結合部分を指す。幾つかの実施形態においては、ＶＨＨは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４と表される３つのＣＤＲと４つのフレームワーク領域とを含む。幾つかの実施形態においては、ＶＨＨは、ＶＨＨが実質的に抗原結合及び特異性を維持する限り、部分的なＦＲ１及び／又はＦＲ４のみを含むように又はそれらのフレームワーク領域の一方若しくは両方を欠くように、Ｎ末端又はＣ末端で切断されていてもよい。

【0112】

「シングルドメイン抗体」及び「ｓｄＡｂ」という用語は、軽鎖及びＦｃ領域を有しないＶＨＨドメイン等の少なくとも１つの単量体ドメインを含む抗体を指すために、本明細書において区別なく使用される。幾つかの実施形態においては、ｓｄＡｂは、それぞれのポリペプチドが少なくとも１つのＶＨＨドメイン及びＦｃ領域を含む２つのポリペプチドの二量体である。本明細書で使用される場合に、「シングルドメイン抗体」及び「ｓｄＡｂ」という用語は、多重ＶＨＨドメインを含むポリペプチド、例えば、構造ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－Ｆｃ又はＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－ＶＨＨ_３－Ｆｃを有し、ここで、ＶＨＨ_１、ＶＨＨ_２、及びＶＨＨ_３が同じか又は異なる場合があるポリペプチドを包含する。

【0113】

「ＶＨＨ含有ポリペプチド」という用語は、少なくとも１つのＶＨＨドメインを含むポリペプチドを指す。幾つかの実施形態においては、ＶＨＨポリペプチドは、２つ、３つ、又は４つ以上のＶＨＨドメインを含み、ここで、各ＶＨＨドメインは、同じ又は異なっていてもよい。幾つかの実施形態においては、ＶＨＨ含有ポリペプチドは、Ｆｃ領域を含む。幾つかのそのような実施形態においては、ＶＨＨ含有ポリペプチドは、ｓｄＡｂと称され得る。さらに、幾つかのそのような実施形態においては、ＶＨＨポリペプチドは、二量体を形成し得る。ｓｄＡｂとも称されるＶＨＨ含有ポリペプチドの非限定的な構造としては、ＶＨＨ_１－Ｆｃ、ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－Ｆｃ、及びＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－ＶＨＨ_３－Ｆｃが挙げられ、ここで、ＶＨＨ_１、ＶＨＨ_２、及びＶＨＨ_３は、同じ又は異なっていてもよい。そのような構造の幾つかの実施形態においては、或るＶＨＨは、リンカーによって別のＶＨＨに連結され得る、又は或るＶＨＨは、リンカーによってＦｃに連結され得る。幾つかのそのような実施形態においては、リンカーは、１個～２０個のアミノ酸、好ましくは、主にグリシン及び任意にセリンから構成される１個～２０個のアミノ酸を含む。幾つかの実施形態においては、リンカーは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号４５）、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４６）、及び／又はＧｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号４７）を含む。幾つかの実施形態においては、ＶＨＨ含有ポリペプチドがＦｃを含む場合に、それは二量体を形成する。したがって、構造ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－Ｆｃは、それが二量体を形成する場合に、四価であるとみなされる（すなわち、二量体は４つのＶＨＨドメインを有する）。同様に、構造ＶＨＨ_１－ＶＨＨ_２－ＶＨＨ_３－Ｆｃは、それが二量体を形成する場合に、六価であるとみなされる（すなわち、二量体は６つのＶＨＨドメインを有する）。

【0114】

「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体集団の抗体（ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドを含む）を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在し得る天然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する抗体である。したがって、モノクローナル抗体の試料は、抗原上の同じエピトープに結合することができる。「モノクローナル」という修飾成句は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体の性質を示し、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495により最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得る、又は米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような組換えＤＮＡ法によって作製され得る。モノクローナル抗体はまた、例えば、McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554に記載される技術を使用して作製されたファージライブラリーから単離され得る。

【0115】

「ＣＤＲ」という用語は、少なくとも１つの当業者に対する特定様式によって定義される相補性決定領域を示す。幾つかの実施形態においては、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けスキーム、Ｋａｂａｔ番号付けスキーム、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａとの組合せ、ＡｂＭ定義、及び／又は接触定義（contact definition）のいずれかに従って定義され得る。ＶＨＨは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と表される３つのＣＤＲを含む。幾つかの実施形態においては、ＣＤＲは、ＡｂＭ定義に従って定義される。

【0116】

本明細書で使用される「重鎖定常領域」という用語は、少なくとも３つの重鎖定常ドメイン、すなわち、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３を含む領域を指す。当然ながら、ドメイン内の機能を変えない欠失及び改変は、特段の指定がない限り、「重鎖定常領域」という用語の範囲内に含まれる。非限定的な例示的な重鎖定常領域としては、γ、δ、及びαが挙げられる。非限定的な例示的な重鎖定常領域としては、ε及びμも挙げられる。それぞれの重鎖定常領域は、１つの抗体アイソタイプに対応する。例えば、γ定常領域を含む抗体はＩｇＧ抗体であり、δ定常領域を含む抗体はＩｇＤ抗体であり、α定常領域を含む抗体はＩｇＡ抗体である。さらに、μ定常領域を含む抗体はＩｇＭ抗体であり、ε定常領域を含む抗体はＩｇＥ抗体である。或る特定のアイソタイプは、更にサブクラスに細分化され得る。例えば、ＩｇＧ抗体としては、限定されるものではないが、ＩｇＧ１（γ_１定常領域を含む）抗体、ＩｇＧ２（γ_２定常領域を含む）抗体、ＩｇＧ３（γ_３定常領域を含む）抗体、及びＩｇＧ４（γ_４定常領域を含む）抗体が挙げられ、ＩｇＡ抗体としては、限定されるものではないが、ＩｇＡ１（α_１定常領域を含む）抗体及びＩｇＡ２（α_２定常領域を含む）抗体が挙げられ、ＩｇＭ抗体としては、限定されるものではないが、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２が挙げられる。

【0117】

本明細書で使用される「Ｆｃ領域」は、Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３を含む重鎖定常領域の一部を指す。幾つかの実施形態においては、Ｆｃ領域は、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３を含む。幾つかの実施形態においては、Ｆｃ領域は、ヒンジを含まない。様々な実施形態において、Ｆｃ領域がヒンジを含む場合に、ヒンジ及び／又はＣ_Ｈ３は、２つのＦｃ含有ポリペプチド間の二量体化を介在する。様々な実施形態において、Ｆｃ領域がヒンジを含まない場合に、Ｃ_Ｈ３は、２つのＦｃ含有ポリペプチド間の二量体化を介在する。Ｆｃ領域は、本明細書で論じられる任意の抗体重鎖定常領域アイソタイプのものであり得る。幾つかの実施形態においては、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４である。

【0118】

本明細書で使用される「アクセプターヒトフレームワーク」は、本明細書で論じられるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来するアクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含むことができる、又はアミノ酸配列の変化を含み得る。幾つかの実施形態においては、アミノ酸の変化の数は、ＶＨＨ等の単一の抗原結合ドメイン内の全てのヒトフレームワークにわたって１０個未満、又は９個未満、又は８個未満、又は７個未満、又は６個未満、又は５個未満、又は４個未満、又は３個未満である。

【0119】

「親和性」は、分子（例えば、ｓｄＡｂ等の抗体又はＶＨＨ含有ポリペプチド）の単一の結合部位及びその結合相手（例えば、抗原）の間の非共有結合的相互作用の合計の強さを指す。分子Ｘのその相手Ｙに対する親和性又は見かけの親和性は、一般に、それぞれ解離定数（Ｋ_ｄ）又はＫ_{ｄ（見かけ）}によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載されている方法を含む、当該技術分野で既知の通常の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ Ｋ_ｄ、ＫｉｎＥｘＡ、フローサイトメトリー、及び／又は表面プラズモン共鳴デバイス等）によって測定され得る。このような方法としては、限定されるものではないが、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、Ｏｃｔｅｔ（商標）、又はフローサイトメトリーを要する方法が挙げられる。

【0120】

本明細書で使用される「Ｋ_ｄ」という用語は、抗原結合分子／抗原相互作用の平衡解離定数を指す。本明細書で「Ｋ_ｄ」という用語が使用される場合に、それには、Ｋ_ｄ及びＫ_{ｄ（見かけ）}が含まれる。

【0121】

幾つかの実施形態においては、抗原結合分子のＫ_ｄは、フローサイトメトリーによって、抗原発現細胞系統を使用し、各抗体濃度で測定された平均蛍光を非線形１サイト結合方程式（graphpad社のＰｒｉｓｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）にフィッティングして測定される。幾つかのそのような実施形態においては、Ｋ_ｄはＫ_{ｄ（見かけ）}である。

【0122】

「生物学的活性」という用語は、分子の任意の１つ以上の生物学的特性（ｉｎ ｖｉｖｏで見られるように天然に存在するか、又は組換え手段によって提供される若しくは可能となるかどうか）を指す。生物学的特性としては、限定されるものではないが、リガンドの結合、細胞増殖（ＮＫ細胞増殖等）の誘導又は増加、細胞活性化（ＮＫ細胞活性化等）の誘導又は増加、及びサイトカインの発現の誘導又は増加が挙げられる。

【0123】

「アゴニスト」抗体又は「活性化」抗体は、標的抗原の生物学的活性を増加及び／又は活性化する抗体である。幾つかの実施形態においては、アゴニスト抗体は、抗原に結合し、その生物学的活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％以上増加させる。

【0124】

「アンタゴニスト」抗体、「ブロッキング」抗体、又は「中和」抗体は、標的抗原の生物学的活性を抑止、低下及び／又は不活性化する抗体である。幾つかの実施形態においては、中和抗体は、抗原に結合し、その生物学的活性を少なくとも約２０％、４０％、６０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％以上低下させる。

【0125】

「親和性成熟」ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドは、ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドの抗原に対する親和性に改善をもたらす改変を有しない親ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドと比較して１つ以上のＣＤＲに１つ以上のそのような改変を有するｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドを指す。

【0126】

本明細書で使用される「ヒト化ＶＨＨ」は、１つ以上のフレームワーク領域が実質的にヒトフレームワーク領域で置き換えられたＶＨＨを指す。幾つかの場合には、ヒト免疫グロブリンの或る特定のフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化ＶＨＨは、当初のＶＨＨにもヒトフレームワーク配列にも見られないが、ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドの性能を更に改良及び最適化するために含まれる残基を含み得る。幾つかの実施形態においては、ヒト化ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチドは、ヒトＦｃ領域を含む。理解されるように、ヒト化配列は、その一次配列によって特定され得て、必ずしも抗体が作製された過程を示すわけではない。

【0127】

「エフェクター陽性Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｆｃ受容体結合、Ｃｌｑ結合及び補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節、並びにＢ細胞活性化等が挙げられる。このようなエフェクター機能は、一般に、Ｆｃ領域を結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わせることを要し、様々なアッセイを使用して評価することができる。

【0128】

「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列のヒトＦｃ領域としては、天然配列のヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域（非Ａアロタイプ及びＡアロタイプ）、天然配列のヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域、天然配列のヒトＩｇＧ３ Ｆｃ領域、及び天然配列のヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域、並びにそれらの天然に存在する変異体が挙げられる。

【0129】

「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により天然配列のＦｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により天然配列のＦｃ領域のアミノ酸配列とは異なるが、天然配列のＦｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持するアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、変異型Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、天然配列のＦｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において、少なくとも１個のアミノ酸置換、例えば、約１個～約１０個のアミノ酸置換、好ましくは、約１個～約５個のアミノ酸置換を有する。幾つかの実施形態においては、本明細書の変異型Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、それらと少なくとも約９０％の配列同一性、それらと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有する。

【0130】

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載している。幾つかの実施形態においては、ＦｃγＲは、天然のヒトＦｃＲである。幾つかの実施形態においては、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩサブクラス、ＦｃγＲＩＩサブクラス、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体であって、これらの受容体のアレル変異体及び選択的スプライシングされた形態を含む受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは同様のアミノ酸配列を有するが、主にその細胞質ドメインが異なる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)を参照されたい）。ＦｃＲは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)、Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)、及びde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)でレビューされている。将来特定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書では「ＦｃＲ」という用語によって包含される。例えば、「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語はまた、胎児性受容体ＦｃＲｎを含み、これは、母体のＩｇＧの胎児への移動（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）及び免疫グロブリンの恒常性の調節の役割を担う。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は既知である（例えば、Ghetie and Ward, Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)、Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)、Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)、国際公開第２００４／９２２１９号（Hintonら）を参照されたい）。

【0131】

本明細書で使用される「実質的に同様」又は「実質的に同じ」という用語は、当業者が２つ以上の値の間の差を、上記値によって測定される生物学的特徴の文脈内で生物学的意義及び／又は統計学的有意性が殆どない又は全くないとみなすような、２つ以上の数値の間の十分に高度な類似性を示す。幾つかの実施形態においては、２つ以上の実質的に同様の値は、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、又は５０％のいずれか１つの概数以下だけ異なる。

【0132】

ポリペプチド「変異体」とは、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後に、配列同一性の部分として保存的置換を一切考慮せずに、天然配列のポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体としては、例えば、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端で１つ以上のアミノ酸残基が付加又は欠失されているポリペプチドが挙げられる。幾つかの実施形態においては、変異体は、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。幾つかの実施形態においては、変異体は、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有する。幾つかの実施形態においては、変異体は、天然配列のポリペプチドと少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有する。

【0133】

本明細書で使用される場合に、ペプチド配列、ポリペプチド配列、又は抗体配列に関する「パーセント（％）のアミノ酸配列同一性」及び「ホモロジー」は、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後に、配列同一性の部分として保存的置換を一切考慮せずに、特定のペプチド配列又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントのアミノ酸配列同一性を決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（DNASTAR社）ソフトウェア等の公的に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当業者の技能の範囲内である様々な方法で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。

【0134】

アミノ酸置換には、限定されるものではないが、ポリペプチド中の或るアミノ酸を別のアミノ酸により置き換えることが含まれ得る。例示的な置換を表１に示す。アミノ酸置換を対象の抗体に導入し、産物を所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の減少、又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣの改善についてスクリーニングすることができる。

【0135】

【表1】

【0136】

共通の側鎖特性に従ってアミノ酸をグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0137】

非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスに交換することを伴う。

【0138】

「ベクター」という用語は、宿主細胞内で増殖され得る、クローニングされたポリヌクレオチド（単数又は複数）を含むように操作することができるポリヌクレオチドを記載するために使用される。ベクターは、以下のエレメントのうちの１つ以上を含み得る：複製起点、対象のポリペプチドの発現を調節する１つ以上の調節配列（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー等）、及び／又は１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性遺伝子及び比色アッセイで使用することができる遺伝子、例えば、β－ガラクトシダーゼ等）。「発現ベクター」という用語は、宿主細胞において対象のポリペプチドを発現するために使用されるベクターを指す。

【0139】

「宿主細胞」は、ベクター又は単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得る又はレシピエントであった細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞であり得る。例示的な真核細胞としては、霊長類動物細胞又は非霊長類動物細胞等の哺乳動物細胞、酵母等の真菌細胞、植物細胞、及び昆虫細胞が挙げられる。非限定的な例示的な哺乳動物細胞としては、限定されるものではないが、ＮＳＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞（Crucell社）、並びに２９３細胞及びＣＨＯ細胞、並びにそれらの派生物、例えば２９３－６Ｅ細胞、ＣＨＯ－ＤＧ４４細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＣＨＯ－Ｓ細胞、及びＣＨＯ－ＤＳ細胞が挙げられる。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれるが、自然突然変異、偶発突然変異、又は意図的突然変異のため、子孫は必ずしも当初の親細胞と完全に同一（形態又はゲノムＤＮＡ相補において）であるとは限らない。宿主細胞には、本明細書で提供されるポリヌクレオチド（複数の場合もある）と共にｉｎ ｖｉｖｏでトランスフェクションされた細胞も含まれる。

【0140】

本明細書で使用される「単離された」という用語は、典型的に天然に一緒に見出される又は一緒に産生される成分の少なくとも幾つかから分離された分子を指す。例えば、ポリペプチドは、それを産生した細胞の成分の少なくとも一部から分離される場合に、「単離された」と称される。ポリペプチドが発現後に細胞によって分泌される場合に、ポリペプチドを含む上清を、それを産生した細胞から物理的に分離することは、ポリペプチドを「単離する」とみなされる。同様に、ポリヌクレオチドは、それが典型的に天然に見られるより大きなポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合に、ゲノムＤＮＡ又はミトコンドリアＤＮＡ等）の一部ではない場合に、又は例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドの場合に、それを産生した細胞の成分の少なくとも一部から分離される場合に、「単離された」と称される。したがって、宿主細胞内のベクターに含まれるＤＮＡポリヌクレオチドは、「単離された」と称され得る。

【0141】

「個体」及び「被験体」という用語は、動物、例えば哺乳動物を指すために本明細書では区別なく使用される。幾つかの実施形態においては、限定されるものではないが、ヒト、齧歯類、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、哺乳動物実験動物、哺乳動物家畜、哺乳動物競技用動物（sport animals）、及び哺乳動物ペットを含む哺乳動物を治療する方法が提供される。幾つかの例では、「個体」又は「被験体」は、疾患又は障害の治療を必要とする個体又は被験体を指す。幾つかの実施形態においては、治療を受ける被験体は、被験体が治療に関連する障害を有する又は障害を患う十分なリスクがあると特定されたことを表す患者であり得る。

【0142】

本明細書で使用される「疾患」又は「障害」は、治療が必要とされる及び／又は所望される状態を指す。

【0143】

「腫瘍細胞」、「癌細胞」、「癌」、「腫瘍」、及び／又は「新生物」という用語は、特段の指定がない限り、本明細書では区別なく使用され、身体器官及び系の正常な機能を妨げる制御不能な増殖及び／又は異常な細胞生存の増加及び／又はアポトーシスの阻害を示す細胞（又は複数の細胞）を指す。この定義には、良性及び悪性の癌、白血病、リンパ腫及び多発性骨髄腫等の血液癌、ポリープ、過形成、並びに潜伏腫瘍又は微小転移が含まれる。

【0144】

「癌」及び「腫瘍」という用語は、固形癌及び血液癌／リンパ腺癌を包含するとともに、異形成等の悪性腫瘍、前悪性腫瘍、及び良性腫瘍も包含する。例示的な癌としては、限定されるものではないが、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌（胃腸癌を含む）、膠芽腫、肝癌、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓癌又は腎癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃部癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮又は子宮内膜癌、泌尿器系癌、外陰癌、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、並びにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬを含む）、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びワルデンストレームマクログロブリン血症、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、並びにその他の癌腫及び肉腫、並びに移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、並びに母斑症、浮腫（脳腫瘍に関連する浮腫等）及びメイグス症候群に関連する異常血管増殖が挙げられる。

【0145】

本明細書で使用される「非腫瘍細胞」という用語は、正常な細胞又は組織を指す。例示的な非腫瘍細胞としては、限定されるものではないが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、上皮細胞、線維芽細胞、肝細胞、間質性腎臓細胞、線維芽細胞様滑膜細胞、骨芽細胞、及び乳房、骨格筋、膵臓、胃、卵巣、小腸、胎盤、子宮、精巣、腎臓、肺、心臓、脳、肝臓、前立腺、結腸、リンパ器官、骨に位置する細胞、及び骨由来の間葉系幹細胞が挙げられる。本明細書で使用される「末梢に位置する細胞又は組織」という用語は、腫瘍細胞の近く及び／又は腫瘍微小環境内に位置しない非腫瘍細胞を指す。

【0146】

本明細書で使用される「腫瘍微小環境内の細胞又は組織」という用語は、腫瘍細胞を取り囲む及び／又は腫瘍細胞に栄養を与える細胞、分子、細胞外マトリックス及び／又は血管を指す。例示的な腫瘍微小環境内の細胞又は組織としては、限定されるものではないが、腫瘍血管系、腫瘍浸潤リンパ球、線維芽細網細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、癌関連線維芽細胞、周皮細胞、他の間質細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分、樹状細胞、抗原提示細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）及び腫瘍の近位に位置する他の免疫細胞が挙げられる。腫瘍細胞及び／又は腫瘍微小環境内に位置する細胞／組織を特定する方法は、本明細書で以下に記載されるように当該技術分野で十分に知られている。

【0147】

「感染性疾患」という用語は、本明細書で使用される場合に、病原性ウイルス、細菌、又は真菌によって引き起こされる疾患を指す。

【0148】

幾つかの実施形態においては、「増加」又は「減少」は、それぞれ、統計学的に有意な増加又は減少を指す。当業者に明らかであるように、「調節」はまた、試験作用物質が存在することを除き同じ条件と比較した、標的又は抗原のそのリガンド、結合相手、ホモ多量体形若しくはヘテロ多量体形へと会合する相手又は基質の１つ以上に対する親和性、アビディティー、特異性及び／又は選択性の変化（増加又は減少のいずれかであり得る）を引き起こすこと、標的又は抗原が存在する培地又は環境における１つ以上の条件（ｐＨ、イオン強度、補因子の存在等）に対する標的又は抗原の感受性の変化（増加又は減少のいずれかであり得る）を引き起こすこと、及び／又は細胞増殖若しくはサイトカイン産生を含み得る。これは、関与する標的に応じて、それ自体が既知の又は本明細書に記載される任意の適切な方法で及び／又は任意の適切なアッセイを使用して決定され得る。

【0149】

本明細書で使用される場合に、「免疫応答」は、疾患（例えば、癌又は癌転移）の発症を抑止若しくは未然防止する又はその症状を改善するのに十分である細胞性免疫応答及び／又は体液性免疫応答を包含することが意図される。「免疫応答」は、自然免疫系及び適応免疫系の両方の側面を包含し得る。

【0150】

本明細書で使用される場合に、「治療」は、有益な又は所望の臨床結果を得るための手法である。本明細書で使用される「治療」は、ヒトを含む哺乳動物における疾患用の療法薬の任意の投与又は適用を対象とする。本開示の目的では、有益な又は所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、１つ以上の症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の進展（例えば、転移、例えば肺又はリンパ節への転移）の未然防止又は遅延、疾患の再発の未然防止又は遅延、疾患の進行の遅延又は減速、疾患状態の改善、疾患又は疾患の進行の抑止、疾患又はその進行の抑止又は減速、その発達の阻止、及び寛解（部分的でも全体的でも）のいずれか１つ以上が挙げられる。「治療」には、増殖性疾患の病理学的結果の軽減も含まれる。本明細書で提供される方法は、治療のこれらの側面のいずれか１つ以上を企図している。上記に従って、治療という用語は、障害の全ての側面を１００パーセント除去する必要はない。

【0151】

「改善」とは、療法剤を投与しない場合と比べて、１つ以上の症状が軽減又は向上することを意味する。「改善」には、症状の持続期間が短縮又は減少することも含まれる。

【0152】

「抗癌剤」という用語は、本明細書では、その最も広い意味で、１つ以上の癌の治療に使用される作用物質を指すために使用される。そのような作用物質の例示的なクラスとしては、限定されるものではないが、化学療法剤、抗癌生物製剤（サイトカイン、受容体細胞外ドメイン－Ｆｃ融合物、及び抗体等）、放射線療法薬、ＣＡＲ－Ｔ療法薬、治療用オリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド及びｓｉＲＮＡ等）、及び腫瘍溶解性ウイルスが挙げられる。

【0153】

「生体試料」という用語は、生きている生き物又はかつて生きていた生き物からの或る量の物質を意味する。そのような物質としては、限定されるものではないが、血液（例えば、全血）、血漿、血清、尿、羊水、滑液、内皮細胞、白血球、単球、他の細胞、器官、組織、骨髄、リンパ節、及び脾臓が挙げられる。

【0154】

「コントロール」又は「参照」という用語は、分析物を含まないことが既知の組成物（「ネガティブコントロール」）又は分析物を含むことが既知の組成物（「ポジティブコントロール」）を指す。ポジティブコントロールは、既知の濃度の分析物を含み得る。

【0155】

本明細書で使用される場合に、「疾患の発症を遅延させる」とは、疾患（癌等）の発症を遅らせる、妨げる、減速させる、遅滞させる、安定化させる、抑制する、及び／又は引き延ばすことを意味する。この遅延は、疾患の病歴及び／又は治療される個体に応じて、様々な長さの時間となり得る。当業者に明らかであるように、十分な又は大幅な遅延は、事実上、個体が疾患を発症しないという点で未然防止を包含し得る。例えば、転移の発生等の末期癌を遅延させることができる。

【0156】

本明細書で使用される「未然防止」は、疾患の素因を有し得るが、まだ疾患と診断されていない被験体における疾患の発生又は再発に対する予防をもたらすことを含む。特段の指示がない限り、「低減する」、「抑止する」、又は「未然防止する」という用語は、全期間にわたる完全な未然防止を示すのではなく又は必要とするのではなく、測定される期間だけにわたる未然防止を示す又は必要とする。

【0157】

物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、並びに物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストが個体において所望の応答を誘発する能力等の要因によって変動し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な作用が物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の有毒作用又は有害作用を上回る量である。治療有効量は、１回以上の投与で送達され得る。治療有効量は、必要な投与量で必要な時間にわたって、所望の治療的結果及び／又は予防的結果を達成するのに有効な量を指す。

【0158】

「医薬製剤」及び「医薬組成物」という用語は、区別なく使用され、有効成分（複数の場合もある）の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態であり、製剤を投与する被験体に対して許容不可能なほど有毒な追加の成分を含まない調製物を指す。そのような製剤は滅菌され得る。

【0159】

「薬学的に許容可能な担体」は、被験体に投与するための「医薬組成物」を一緒に含む療法剤とともに使用される当該技術分野において慣用の非毒性の固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、カプセル化材料、製剤補助剤、又は担体を指す。薬学的に許容可能な担体は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、製剤の他の成分と適合性がある。薬学的に許容可能な担体は、使用される製剤にとって適切である。

【0160】

１つ以上の更なる療法剤と「組み合わせて」の投与には、同時（併用）投与及び任意の順序での連続投与が含まれる。

【0161】

「併用して」という用語は、本明細書では、２つ以上の療法剤の投与であって、投与の少なくとも一部が時間的に重複する、又は１つの療法剤の投与が他の療法剤の投与に対して短い期間に含まれる、又は両方の療法剤の治療効果が少なくとも或る期間にわたり重複する、投与を指すために使用される。

【0162】

「連続的に」という用語は、本明細書では、２つ以上の療法剤の投与であって、時間的に重複しない、又は療法剤の治療効果が重複しない、投与を指すために使用される。

【0163】

本明細書で使用される場合に、「～と組み合わせて」は、或る治療法の施与に別の治療法を加えることを指す。したがって、「～と組み合わせて」は、或る治療法を、個体に他の治療法を施す前、その間、又はその後に施すことを指す。

【0164】

「添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通例含まれる使用説明書であって、そのような治療製品の使用に関する指示、使用法、投与量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告に関する情報を含む、使用説明書を指すために使用される。

【0165】

「製造品」は、少なくとも１つの試薬、例えば、疾患若しくは障害（例えば、癌）の治療用の医薬、又は本明細書に記載されるバイオマーカーを特異的に検出するプローブを含む任意の製造物（例えば、パッケージ又は容器）又はキットである。幾つかの実施形態においては、製造物又はキットは、本明細書に記載される方法を実施するユニットとして宣伝、配送、又は販売される。

【0166】

「標識」及び「検出可能な標識」という用語は、例えば、抗体又は抗原に結合されて、特異的結合ペアのメンバー間の反応（例えば、結合）を検出可能にする部分を意味する。特異的結合ペアの標識されたメンバーは、「検出可能に標識された」と称される。したがって、「標識された結合性タンパク質」という用語は、結合性タンパク質の特定をもたらす標識が組み込まれたタンパク質を指す。幾つかの実施形態においては、標識は、視覚的に又は機器的手段により検出可能なシグナルを生成し得る検出可能なマーカー、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組み込み又はマーキングされたアビジン（例えば、蛍光マーカー又は光学的方法若しくは比色法により検出され得る酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出され得るビオチニル部のポリペプチドへの結合である。ポリペプチドの標識の例としては、限定されるものではないが、放射性同位体又は放射性核種（例えば、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３５Ｓ、^９０Ｙ、^９９Ｔｃ、^１１１Ｉｎ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１７７Ｌｕ、^１６６Ｈｏ、又は^１５３Ｓｍ）、色素原、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される予め決められたポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、及びガドリニウムキレート等の磁性剤が挙げられる。イムノアッセイに通常使用される標識の代表的な例としては、光を発する部分、例えば、アクリジニウム化合物、及び蛍光を発する部分、例えば、フルオレセインが挙げられる。この点について、その部分自体は検出可能に標識されていない場合もあるが、更に別の部分と反応すると検出可能になり得る。

【0167】

例示的なＮＫｐ４６結合ポリペプチド
ＮＫｐ４６結合ポリペプチドが本明細書で提供される。様々な実施形態において、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＮＫｐ４６に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＮＫｐ４６とウイルスヘマグルチニンタンパク質との結合を阻害する。幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＮＫｐ４６に結合する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つのＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＮＫｐ４６に結合する１つ、２つ、３つ、又は４つのＶＨＨドメインを含む。そのようなＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＮＫｐ４６以外の１つ以上の標的タンパク質に結合する１つ以上の付加的なＶＨＨドメインを含んでいてもよく、及び／又はサイトカイン配列等の１つ以上の付加的なポリペプチド配列を含んでいてもよい。

【0168】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＮＫｐ４６に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインとＦｃ領域とを含む。幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＮＫｐ４６に結合する１つ、２つ、３つ、又は４つのＶＨＨドメインとＦｃ領域とを含む。幾つかの実施形態においては、Ｆｃ領域は、生理学的条件でＮＫｐ４６結合ポリペプチドの二量体化を介在し、こうして二量体が形成されることにより、ＮＫｐ４６結合部位の数が２倍となる。例えば、ＮＫｐ４６に結合する３つのＶＨＨドメインとＦｃ領域とを含むＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、単量体としては三価であるが、生理学的条件では、Ｆｃ領域が二量体化を介在することができ、こうしてＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、そのような条件下で六価の二量体として存在する。

【0169】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、少なくとも２つのＶＨＨドメインを含み、ここで、第１のＶＨＨドメインは、ＮＫｐ４６の第１のエピトープに結合し、第２のＶＨＨドメインは、ＮＫｐ４６の第２のエピトープに結合する。ＮＫｐ４６結合ポリペプチドが、ＮＫｐ４６の第１のエピトープに結合するＶＨＨドメインと、ＮＫｐ４６の第２のエピトープに結合するＶＨＨドメインとを含む場合に、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、「二重エピトープ性」又は「二重特異性」と称され得る。

【0170】

非限定的な例示的なＮＫｐ４６結合ポリペプチドを表２に示す。指定のシングルドメイン抗体の配列は、本明細書の或る特定の配列の表に示す。

【0171】

【表2】

【0172】

様々な実施形態において、ＮＫｐ４６に結合するＶＨＨドメインは、配列番号１７のＣＤＲ１配列と、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１から選択されるＣＤＲ２配列と、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、及び配列番号２７から選択されるＣＤＲ３配列とを含む。様々な実施形態において、ＮＫｐ４６に結合するＶＨＨドメインは、配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号２２；配列番号１７、配列番号１９、及び配列番号２２；配列番号１７、配列番号２０、及び配列番号２２；配列番号１７、配列番号２１、及び配列番号２２；配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号２３；配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号２４；配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号２５；配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号２６;並びに配列番号１７、配列番号１８、及び配列番号２７から選択されるＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、及びＣＤＲ３配列を含む。様々な実施形態において、ＶＨＨドメインは、ヒト化されている。

【0173】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６に結合するＶＨＨドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６に結合するＶＨＨドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６から選択されるアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６に結合するＶＨＨドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１６から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、ＶＨＨドメインは、Ｋ１２５Ｄ、Ｋ１２５Ｅ、又はＫ１２５Ｒ突然変異を含む。

【0174】

様々な実施形態において、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＮＫｐ４６に結合する１つ、２つ、３つ、又は４つのＶＨＨドメインを含む。

【0175】

様々な実施形態において、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＮＫｐ４６に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインと、ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインとを含む。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメインは、ＶＨＨドメインである。例えば、幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６以外の抗原に結合する少なくとも１つのＶＨＨドメインは、Ｔ細胞抗原、ＮＫｐ４６ではないナチュラルキラー細胞抗原、又は腫瘍抗原に結合する。

【0176】

幾つかのこのような実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、多重特異性抗体と称されることがある。多重特異性とは、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドが、ＮＫｐ４６に加えて１つ以上の他の抗原に結合し得ることを意味する。

【0177】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、２つ以上の生物学的機能を媒介することがあり、ここで、１つの生物学的機能がＮＫｐ４６への結合である。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、二機能性（２つの機能を有する）又は三機能性（３つの機能を有する）である。例えば、下記のように、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、別の抗原（腫瘍抗原等）に結合し、サイトカイン活性も有し得る。

【0178】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、癌細胞に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、腫瘍抗原に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、１－９２－ＬＦＡ－３、５Ｔ４、α４インテグリン、αＶインテグリン、α４β１インテグリン、α４β７インテグリン、ＡＧＲ２、抗ルイスＹ、アペリンＪ受容体、ＡＰＲＩＬ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＢＡＦＦ、ＢＣＭＡ、ＢＴＬＡ、補体Ｃ５、Ｃ－２４２、ＣＡ９、ＣＡ１９－９、（ルイスａ）、炭酸脱水酵素９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ６、ＣＤ９、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４７、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ９５、ＣＤ１１７、ＣＤ１２３、ＣＤ１２５、ＣＤ１３２、（ＩＬ－２ＲＧ）、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１６６、ＣＤ１７２Ａ、ＣＤ２４８、ＣＤＨ６、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ６（ＮＣＡ－９０）、クローディン３、クローディン４、ｃＭｅｔ、コラーゲン、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＳＦＲ、ＣＳＦＲ－１、ＣＴＬＡ－４、ＣＴＧＦ、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＹＲ６１、ＤＬ４４、ＤＬＫ１、ＤＬＬ３、ＤＬＬ４、ＤＰＰ－４、ＤＳＧ１、ＥＤＡ、ＥＤＢ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖｉｉｉ、エンドセリンＢ受容体（ＥＴＢＲ）、ＥＮＰＰ３、ＥｐＣＡＭ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＢ２、ＥＲＢＢ３、ＲＳＶのＦタンパク質、ＦＡＰ、ＦＡＳ、ＦｃＲＨ５、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ８、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＬＴ－３、葉酸受容体α（ＦＲα）、ＧＡＬ３ＳＴ１、Ｇ－ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦＲ、ＧＤ２、ＧＩＴＲ、ＧＬＵＴ１、ＧＬＵＴ４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦＲ、ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体、Ｇｐ１３０、ＧＰＩＩＢ／ＩＩＩＡ、ＧＰＮＭＢ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＲＰ７８、ＨＡＶＣＡＲ１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＨＧＦ、ｈＧＨ、ＨＶＥＭ、ヒアルロニダーゼ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）、ＩＧＦ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＬ１１、ＩＬ１２、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ－１２Ｒ、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ１３、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７／ＩＬ２７Ｒ（ｗｓｘ１）、ＩＬ２９、ＩＬ－３１Ｒ、ＩＬ３１／ＩＬ３１Ｒ、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、インスリン受容体、Ｊａｇｇｅｄリガンド、Ｊａｇｇｅｄ １、Ｊａｇｇｅｄ ２、ＫＩＳＳ１－Ｒ、ＬＡＧ－３、ＬＩＦ－Ｒ、ルイスＸ、ＬＩＧＨＴ、ＬＲＰ４、ＬＲＲＣ２６、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ、ＬｙＰＤ１、ＭＣＳＰ、メソテリン、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＭＲＰ４、ＭＵＣ１、ムチン１６（ＭＵＣ１６、ＣＡ－１２５）、Ｎａ／Ｋ ＡＴＰアーゼ、ＮＧＦ、ニカストリン、ＮＫＧ２Ａ、Ｎｏｔｃｈ受容体、Ｎｏｔｃｈ １、Ｎｏｔｃｈ ２、Ｎｏｔｃｈ ３、Ｎｏｔｃｈ ４、ＮＯＶ、ＯＳＭ－Ｒ、ＯＸ－４０、ＰＡＲ２、ＰＤＧＦ－ＡＡ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ホスファチジルセリン、Ｐ１ＧＦ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＧＲ、ＲＡＡＧ１２、ＲＡＧＥ、ＳＬＣ４４Ａ４、スフィンゴシン－１－リン酸、ＳＴＥＡＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＴＡＧ－７２、ＴＡＰＡ１、ＴＥＭ－８、ＴＧＦβ、ＴＧＦβ受容体１（ＴＧＦＢＲ１）、ＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦＢＲ２）、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＭＥＭ３１、ＴＮＦα、ＴＮＦＲ、ＴＮＦＲＳ１２Ａ、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、トランスフェリン、トランスフェリン受容体、ＴＲＫ－Ａ、ＴＲＫ－Ｂ、ＴＲＯＰ－２、ｕＰＡＲ、ＶＡＰ１、ＶＣＡＭ－１、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、ＶＩＳＴＡ、ＷＩＳＰ－１、ＷＩＳＰ－２、又はＷＩＳＰ－３に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、細胞表面上にウイルスタンパク質を発現しているウイルス感染細胞に結合する少なくとも１つの結合ドメインを含む。

【0179】

幾つかの実施形態においては、ＮＫ細胞ではない細胞に結合する、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドに含まれる結合ドメインは、「二次標的化ドメイン」と称されることがある。このように、二次標的化ドメインは、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドを対象の細胞に標的化し、二次標的化ドメインに結合することが可能な抗原を発現するこの細胞に対してＮＫ媒介性細胞傷害をリダイレクトすることができる。例えば、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドの二次標的化ドメインは、腫瘍抗原に対する抗体であってもよく、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドと腫瘍抗原を発現する癌細胞との結合は、この癌細胞に対してＮＫ媒介性細胞傷害をリダイレクトする。幾つかの実施形態においては、二次標的化ドメインは、ＶＨＨ、シングルドメイン抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又は任意の他のタイプの抗体である。幾つかの実施形態においては、二次標的化ドメインは、抗体ではない。幾つかの実施形態においては、二次標的化ドメインは、天然の同族結合パートナー、操作された細胞外結合、Ａｎｔｉｃａｌｉｎ（操作されたリポカリン）、Ｄａｒｐｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ、Ｃｅｎｔｙｒｉｎ（操作されたフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン）、シスチンノットドメイン、Ａｆｆｉｌｉｎ、Ａｆｆｉｂｏｄｙ、又は操作されたＣ_Ｈ３ドメインである。

【0180】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＴＧＦβ受容体１、ＴＧＦβ受容体２、又はＮＫＧ２Ａに結合するＶＨＨドメイン等の結合ドメインを含む。

【0181】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、二次標的化を目的としない機能ドメインを含む。この機能ドメインは、様々な目的を果たすことができる。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、サイトカイン又はその機能部分を含む。幾つかの実施形態においては、サイトカインは、操作されたサイトカインである。幾つかの実施形態においては、操作されたサイトカインは、弱毒化サイトカインである。

【0182】

ＩＬ－２及びＩＬ－５は、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドに含まれ得る例示的なサイトカインである。ＩＬ－２及びＩＬ－５は、ＮＫ細胞の増殖を刺激し、グランザイム－Ｂ、パーフォリン、及びインターフェロン－γ等のエフェクター分子を発現するようにＮＫ細胞をプライミングすることができる。ＩＬ－２及びＩＬ－５はまた、ＮＫ細胞を再活性化し、免疫抑制シグナルを克服することができる。これらの方法においては、ＩＬ－２及びＩＬ－５は、リダイレクトされたＮＫ媒介性細胞傷害によって標的化された細胞に対するＮＫ応答を増強する役割を果たし得る。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＩＬ－２又はＩＬ－５の全て又は一部を含む。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、弱毒化ＩＬ－２又はＩＬ－５の全て又は一部を含む。

【0183】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、（ｉ）癌細胞によって発現される腫瘍抗原を標的とする二次標的化ドメインと、（ｉｉ）サイトカイン又はその機能部分とを含む。

【0184】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、Ｆｃ領域に融合した本明細書に記載される少なくとも１つのＶＨＨドメインを含む。幾つかの実施形態においては、Ｆｃ領域は、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、及び配列番号８９から選択される配列を有する。幾つかのこのような実施形態においては、Ｆｃ領域は、Ｃ末端リジンを更に含む。幾つかの実施形態においては、Ｆｃ領域のＣ末端アミノ酸は、リジン以外のアミノ酸である。

【0185】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６に結合するＶＨＨドメインはヒト化される。ヒト化抗体（ｓｄＡｂ又はＶＨＨ含有ポリペプチド等）は、治療分子として有用である。それというのも、ヒト化抗体は、抗体療法薬に対する免疫応答をもたらして療法薬の有効性を低下させ得る非ヒト抗体に対するヒト免疫応答を低減又は排除するからである。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体はまた、任意に、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。幾つかの実施形態においては、ヒト化抗体における幾つかのＦＲ残基は、例えば、抗体の特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基の元となる抗体）からの対応する残基で置換される。

【0186】

ヒト化抗体及びその作製方法は、例えば、Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13: 1619-1633においてレビューされており、例えば、Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-329、Queen et al., (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 86: 10029-10033、米国特許第５，８２１，３３７号、米国特許第７，５２７，７９１号、米国特許第６，９８２，３２１号、及び米国特許第７，０８７，４０９号、Kashmiri et al., (2005) Methods 36:25-34、Padlan, (1991) Mol. Immunol. 28:489-498（「リサーフェイシング（resurfacing）」を記載している）、Dall'Acqua et al., (2005) Methods 36:43-60（「ＦＲシャッフリング（FR shuffling）」を記載している）、並びにOsbourn et al., (2005) Methods 36:61-68及びKlimka et al., (2000) Br. J. Cancer, 83:252-260（ＦＲシャッフリングに対する「ガイド選択（guided selection）」アプローチを記載している）で更に記載されている。

【0187】

ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域としては、限定されるものではないが、「ベストフィット（best-fit）」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Sims et al. (1993) J. Immunol. 151 :2296を参照されたい）、重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285、及びPresta et al. (1993) J. Immunol, 151:2623を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞突然変異した）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, (2008) Front. Biosci. 13:1619-1633を参照されたい）、及びＦＲライブラリーのスクリーニングから得られるフレームワーク領域（例えば、Baca et al., (1997) J. Biol. Chem. 272: 10678-10684、及びRosok et al., (1996) J. Biol. Chem. 271 :22611-22618を参照されたい）が挙げられる。典型的には、ＶＨＨのＦＲ領域をヒトＦＲ領域と置き換えることで、ヒト化ＶＨＨが作製される。幾つかの実施形態においては、ヒトＦＲの或る特定のＦＲ残基を置き換えることで、ヒト化ＶＨＨの１つ以上の特性が改善される。そのような置き換えられた残基を有するＶＨＨドメインも、本明細書では更に「ヒト化」と称される。

【0188】

様々な実施形態において、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域であるか、又はヒトＦｃ領域に由来する。

【0189】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域に由来し、ＩｇＧ１ Ｅ２３３、Ｌ２３４、及びＬ２３５に対応する３つのアミノ酸欠失を下部ヒンジに含み、本明細書で「Ｆｃ ｘＥＬＬ」と称される。Ｆｃ ｘＥＬＬポリペプチドはＦｃγＲと結合しないため、「エフェクターサイレント」又は「エフェクターヌル」と称されるが、幾つかの実施形態においては、ｘＥＬＬ Ｆｃ領域はＦｃＲｎに結合するため、半減期の延長及びＦｃＲｎ媒介性リサイクリング（FcRn mediated recycling）と関連したトランスサイトーシスを伴う。

【0190】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域に由来し、突然変異Ｍ２５２Ｙ及びＭ４２８Ｖを含み、本明細書で「Ｆｃ－ＹＶ」と称される。幾つかの実施形態においては、そのような突然変異は、エンドソームの酸性ｐＨ（６．５近く）でＦｃＲｎへの結合を増強するのに対し、中性ｐＨ（約７．２）では検出可能な結合が失われることから、ＦｃＲｎ媒介性リサイクリングの増強及び半減期の延長が可能となる。

【0191】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドに含まれるＦｃ領域は、ヒトＦｃ領域に由来し、ヘテロ二量体化のために設計された突然変異を含み、本明細書において「ノブ」及び「ホール」と称される。本明細書で使用される場合に、「ノブインホール」及び「ＫｉＨ」は、このようなヘテロ二量体Ｆｃ領域を指す。幾つかの実施形態においては、「ノブ」Ｆｃ領域は、突然変異Ｔ３６６Ｗを含む。幾つかの実施形態においては、「ホール」Ｆｃ領域は、突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖを含む。幾つかの実施形態においては、ヘテロ二量体化に使用されるＦｃ領域は、ヘテロ二量体Ｆｃペアの第１のメンバー上の突然変異Ｓ３５４Ｃ等の追加の突然変異を含み、この突然変異は、ヘテロ二量体Ｆｃペアの第２のメンバー上の対応する突然変異Ｙ３４９Ｃと非対称ジスルフィドを形成する。幾つかの実施形態においては、ヘテロ二量体Ｆｃペアの一方のメンバーは、修飾Ｈ４３５Ｒ又はＨ４３５Ｋを含むことで、ＦｃＲｎ結合を維持しつつプロテインＡの結合を妨げる。幾つかの実施形態においては、ヘテロ二量体Ｆｃペアの一方のメンバーは、修飾Ｈ４３５Ｒ又はＨ４３５Ｋを含むのに対して、ヘテロ二量体Ｆｃペアの第２のメンバーは、Ｈ４３５で修飾されていない。様々な実施形態において、ホールＦｃ領域は、修飾Ｈ４３５Ｒ又はＨ４３５Ｋを含むが（修飾がＨ４３５Ｒである場合に、場合によっては「ホール－Ｒ」と称される）、ノブＦｃ領域はそれを含まない。幾つかの場合には、ホール－Ｒ突然変異は、存在し得るホモ二量体ホールＦｃ領域に対するヘテロ二量体の精製を改善する。

【0192】

ＮＫｐ４６結合ポリペプチドで使用され得る非限定的な例示的なＦｃ領域としては、配列番号５３～配列番号８９のアミノ酸配列を含むＦｃ領域が挙げられる。

【0193】

ＮＫｐ４６結合ポリペプチドの例示的な活性
様々な実施形態において、本明細書で提供されるＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでＮＫ細胞を刺激する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでのＮＫ細胞の刺激又は活性は、幾つかの実施形態においては、本明細書の実施例に示される方法を使用して決定され得る。

【0194】

幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、免疫細胞活性化サイトカイン、及び／又はＮＫｐ４６以外の抗原に結合し、ＮＫ細胞を刺激する抗原結合ドメインを含む。幾つかの実施形態においては、免疫細胞活性化サイトカイン、及び／又はＮＫｐ４６以外の抗原に結合する抗原結合ドメインのＮＫ細胞刺激活性は、単独で使用する場合よりも増加し、及び／又はＮＫｐ４６結合ＶＨＨに融合した場合に、より特異的に細胞傷害性ＮＫ細胞に標的化される。幾つかの実施形態においては、免疫細胞活性化サイトカイン、及び／又はＮＫｐ４６以外の抗原に結合する抗原結合ドメインの毒性は、ＮＫ細胞に特異的に標的化することによって減少する。

【0195】

幾つかの実施形態においては、本明細書で提供される免疫細胞活性化サイトカイン、及び／又はＮＫｐ４６以外の抗原に結合する抗原結合ドメインを含むＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏでのＮＫ細胞増殖を増加させる。

【0196】

幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、本明細書で提供されるＮＫｐ４６結合ＶＨＨと免疫細胞活性化サイトカインとを含む。幾つかのそのような実施形態において、免疫細胞活性化サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、又はＩＦＮγである。幾つかのそのような実施形態において、免疫細胞活性化サイトカインは、野生型免疫細胞活性化サイトカインである。幾つかの実施形態においては、免疫細胞活性化サイトカインは、野生型サイトカインの活性と比べて免疫細胞活性化サイトカインの活性を弱める突然変異を含む。幾つかの実施形態においては、免疫細胞活性化サイトカインを含むＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでＮＫ細胞の活性化及び増殖を刺激する。幾つかの実施形態においては、免疫細胞活性化サイトカインを含むＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、癌又は感染性疾患を治療する方法に使用される。

【0197】

活性化ＮＫ細胞の増殖の増加は、当該技術分野における任意の方法によって決定され得る。非限定的な例示的なアッセイは以下の通りである。ＮＫ細胞を１人以上の健康なヒトドナー、及び／又は特定の疾患若しくは障害を有する１人以上のヒトドナーから分離することができる。ＮＫ細胞を染色し、次いでサイトカインを含むポリペプチド、例えばサイトカインを含むＮＫｐ４６結合ポリペプチドと接触させた後、ＦＡＣＳによって分析する。染色の喪失は増殖を示す。幾つかの実施形態においては、ＮＫ細胞の増殖の増加は、例えば、異なるヒトドナーから分離されたＮＫ細胞の増殖を測定することによって、一連の実験又はプールされたＮＫ細胞からの平均として決定される。幾つかの実施形態においては、ＮＫ細胞の増殖の増加は、少なくとも５人若しくは少なくとも１０人の異なる健康なドナーからのＮＫ細胞を使用して実施される実験からの、又は少なくとも５人若しくは少なくとも１０人の異なる健康なドナーからのＮＫ細胞のプールからの平均として決定される。幾つかの実施形態においては、ＮＫ細胞の増殖の増加は、特定の疾患若しくは障害を有する少なくとも５人若しくは少なくとも１０人の異なるドナーからのＮＫ細胞を使用して実施される実験からの、又は特定の疾患若しくは障害を有する少なくとも５人若しくは少なくとも１０人の異なるドナーからのＮＫ細胞のプールからの平均として決定される。

【0198】

ポリペプチドの発現及び産生
ＮＫｐ４６結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子が提供される。幾つかの実施形態において、核酸分子はまた、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドの分泌を指示するリーダー配列もコードすることができ、そのリーダー配列は、典型的には、これが分泌されたポリペプチド中に存在しないように切断される。リーダー配列は、天然の重鎖（又はＶＨＨ）リーダー配列であり得る、又は別の異種リーダー配列であり得る。

【0199】

核酸分子は、当該技術分野で慣用の組換えＤＮＡ技術を使用して構築され得る。幾つかの実施形態においては、核酸分子は、選択された宿主細胞における発現に適した発現ベクターである。

【0200】

本明細書に記載されるＮＫｐ４６結合ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターが提供される。そのようなベクターとしては、限定されるものではないが、ＤＮＡベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター等が挙げられる。幾つかの実施形態においては、ＣＨＯ細胞若しくはＣＨＯ由来細胞等の所望の細胞型、又はＮＳＯ細胞におけるポリペプチドの発現のために最適化されたベクターが選択される。例示的なそのようなベクターは、例えば、Running Deer et al., Biotechnol. Prog. 20:880-889 (2004)に記載されている。

【0201】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、細菌細胞等の原核細胞において、又は真菌細胞（酵母等）、植物細胞、昆虫細胞、及び哺乳類細胞等の真核細胞において発現され得る。そのような発現は、例えば、当該技術分野で既知の手順に従って実施され得る。ポリペプチドの発現に使用され得る例示的な真核細胞としては、限定されるものではないが、ＣＯＳ７細胞を含むＣＯＳ細胞、２９３－６Ｅ細胞を含む２９３細胞、ＣＨＯ－Ｓ、ＤＧ４４、Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞及びＦＵＴ８ ＣＨＯ細胞を含むＣＨＯ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（商標）細胞（Crucell社）、並びにＮＳＯ細胞が挙げられる。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、酵母において発現され得る。例えば、米国特許出願公開第２００６／０２７００４５号を参照されたい。幾つかの実施形態においては、特定の真核宿主細胞は、ポリペプチドに対して所望の翻訳後修飾を行うその能力に基づいて選択される。例えば、幾つかの実施形態においては、ＣＨＯ細胞は、２９３細胞で産生される同じポリペプチドよりも高レベルのシアリル化を有するポリペプチドを産生する。

【0202】

所望の宿主細胞への１つ以上の核酸（ベクター等）の導入は、限定されるものではないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染等を含むあらゆる方法によって達成され得る。非限定的な例示的な方法は、例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3^rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)に記載されている。核酸は、任意の適切な方法に従って、所望の宿主細胞に一過的又は安定的にトランスフェクションされ得る。

【0203】

本明細書に記載される核酸又はベクターのいずれかを含む宿主細胞も提供される。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されるＮＫｐ４６結合ポリペプチドを発現する宿主細胞が提供される。宿主細胞で発現されたＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、任意の適切な方法によって精製され得る。そのような方法としては、限定されるものではないが、親和性マトリックス又は疎水性相互作用クロマトグラフィーの使用が挙げられる。適切なアフィニティーリガンドとしては、ＲＯＲ１ ＥＣＤ及びＦｃ領域に結合する作用物質が挙げられる。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、又は抗体アフィニティーカラムを使用して、Ｆｃ領域に結合することで、Ｆｃ領域を含むＮＫｐ４６結合ポリペプチドを精製することができる。疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えば、ブチルカラム又はフェニルカラムもまた、抗体等の幾つかのポリペプチドを精製するのに適切であり得る。イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー及び／又は陽イオン交換クロマトグラフィー）もまた、抗体等の幾つかのポリペプチドを精製するのに適切であり得る。混合モードクロマトグラフィー（例えば、逆相／陰イオン交換、逆相／陽イオン交換、親水性相互作用／陰イオン交換、親水性相互作用／陽イオン交換等）も、抗体等の幾つかのポリペプチドを精製するのに適切であり得る。ポリペプチドを精製する多くの方法が当該技術分野で知られている。

【0204】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、無細胞系において産生される。非限定的な例示的な無細胞系は、例えば、Sitaraman et al., Methods Mol. Biol. 498: 229-44 (2009)、Spirin, Trends Biotechnol. 22: 538-45 (2004)、Endo et al., Biotechnol. Adv. 21: 695-713 (2003)に記載されている。

【0205】

幾つかの実施形態においては、上記の方法によって作製されたＮＫｐ４６結合ポリペプチドが提供される。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、宿主細胞において作製される。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、無細胞系において作製される。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは精製される。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドを含む細胞培養培地が提供される。

【0206】

幾つかの実施形態においては、上記の方法によって作製された抗体を含む組成物が提供される。幾つかの実施形態においては、該組成物は、宿主細胞において作製されたＮＫｐ４６結合ポリペプチドを含む。幾つかの実施形態においては、該組成物は、無細胞系において作製されたＮＫｐ４６結合ポリペプチドを含む。幾つかの実施形態においては、該組成物は、精製されたＮＫｐ４６結合ポリペプチドを含む。

【0207】

ＮＫｐ４６結合ポリペプチドを使用して疾患を治療する例示的な方法
幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドを投与することを含む、個体における疾患を治療する方法が提供される。このような疾患としては、ＮＫ細胞の増殖及び活性化の増加から恩恵を受けるあらゆる疾患が挙げられる。幾つかの実施形態においては、個体における癌又は感染性疾患を治療する方法が提供される。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドを投与することを含む、個体におけるＮＫ細胞の増殖を増加させる方法が提供される。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドを治療用抗体と組み合わせて投与することを含む、個体における治療用抗体のＡＤＣＣ活性を増強する方法が提供される。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドを単独で又は治療用抗体と組み合わせて投与することを含む、個体におけるＮＫ細胞の細胞傷害能を増強する方法が提供される。幾つかの実施形態においては、化学療法剤による治療の前、治療中、又は治療後にＮＫｐ４６結合ポリペプチドを投与することを含む、個体におけるＮＫ細胞活性の化学療法抑制を克服する方法が提供される。幾つかの実施形態においては、化学療法剤による治療の前、治療中、又は治療後にＮＫｐ４６結合ポリペプチドを治療用抗体と組み合わせて投与することを含む、化学療法を受けている個体における治療用抗体のＡＤＣＣ活性を増強する方法が提供される。

【0208】

上記方法は、本明細書で提供されるＮＫｐ４６結合ポリペプチドを有効量、個体に投与することを含む。

【0209】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＮＫ媒介性細胞傷害をリダイレクトするために使用される。幾つかのこのような実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、細胞傷害性Ｔ細胞又は別のＮＫ細胞抗原に結合する結合ドメインも含む。幾つかのこのような実施形態においては、結合ドメインは、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α、ＴＣＲβ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ６４、ＣＤ８９、又はＮＫＧ２Ｄに結合する。結合ドメインは、幾つかの実施形態においては、ＶＨＨドメイン、又はＶＨ／ＶＬ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント等の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体結合ドメイン等であってもよい。

【0210】

幾つかのこのような実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、癌細胞に結合する結合ドメインも含む。癌細胞に結合する結合ドメインは、「標的化ドメイン」又は「二次標的化ドメイン」と称されることがある。幾つかの実施形態においては、癌細胞に結合する結合ドメインは、癌細胞に対してＮＫ媒介性細胞傷害をリダイレクトする。

【0211】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、サイトカインに連結される。幾つかの実施形態においては、サイトカインは、ＩＬ－２又はＩＬ－５である。

【0212】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、免疫複合体を形成するために細胞傷害性物質に連結される。免疫複合体に使用される様々な細胞傷害性物質が当該技術分野で既知であり、カリケアマイシン、アウリスタチン、ドラスタチン、ツブリシン、メイタンシノイド、クリプトフィシン、ズオカルマイシン、エスペラミシン、ピロロベンゾジアゼピン、及びエンジイン抗生物質が挙げられるが、これらに限定されない。

【0213】

本明細書で提供されるＮＫｐ４６結合ポリペプチドを使用して治療することができる非限定的な例示的な癌としては、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌、胃腸癌、膠芽腫、肝癌、肝細胞癌、上皮内新生物、腎臓癌又は腎癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃部癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮又は子宮内膜癌、泌尿器系癌、並びに外陰癌、リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ワルデンストレームマクログロブリン血症、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病が挙げられるが、これらに限定されない。

【0214】

ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、必要に応じて被験体に投与され得る。投与の頻度の決定は、治療される病態、治療される被験体の年齢、治療される病態の重症度、治療される被験体の全般的健康状態等の考慮に基づいて、主治医等の当業者によって行われ得る。幾つかの実施形態においては、有効用量のＮＫｐ４６結合ポリペプチドが被験体に１回以上投与される。幾つかの実施形態においては、有効用量のＮＫｐ４６結合ポリペプチドが、被験体に毎日、週に２回、毎週、２週間ごとに、月に１回等で投与される。有効用量のＮＫｐ４６結合ポリペプチドが被験体に少なくとも１回投与される。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドの有効用量は、少なくとも１ヶ月、少なくとも６ヶ月、又は少なくとも１年間にわたる複数回を含む複数回で投与され得る。

【0215】

幾つかの実施形態においては、医薬組成物は、癌若しくは感染性疾患を治療し（予防を含む）、ＮＫ細胞の細胞傷害能を増強させ、ＮＫ細胞の増殖若しくは活性化を増加させ、及び／又はＮＫ細胞活性の化学療法抑制を克服するのに有効な量で投与される。治療有効量は、典型的には、治療される被験体の体重、その被験体の身体的状態若しくは健康状態、治療される病態の広範さ、又は治療される被験体の年齢に依存する。一般に、抗体は、用量当たり約０．０５ｍｇ／ｋｇ（体重）～約１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の量で投与され得る。

【0216】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、限定されるものではないが、静脈内、動脈内、非経口、腹腔内、又は皮下を含む様々な経路によってｉｎ ｖｉｖｏで投与され得る。意図される用途に応じて、適切な製剤及び投与経路を選択することができる。

【0217】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドを使用する治療的処置は、ＮＫ細胞の増殖及び／又は活性化を増加させることによって、及び／又はＮＫ細胞を癌細胞に接触させることによって達成される。幾つかの実施形態においては、ＮＫ細胞の増殖及び／又は活性化の増加は、癌の成長を抑止する。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドを使用する治療的処置は、ＮＫ細胞の増殖及び／又は活性化を増加させることによって達成される。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドを使用する治療的処置は、ＮＫ細胞の細胞傷害能を増加させることによって達成される。

【0218】

医薬組成物
幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドを含む組成物は、多種多様な薬学的に許容可能な担体を含む製剤で提供される（例えば、Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed. (2003)、Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7^th ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004)、Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3^rd ed., Pharmaceutical Press (2000)を参照されたい）。賦形剤、アジュバント、及び希釈剤を含む様々な薬学的に許容可能な担体が利用可能である。さらに、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、張性調整剤、安定剤、湿潤剤等の様々な薬学的に許容可能な補助物質も利用可能である。非限定的な例示的な担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組合せが挙げられる。

【0219】

幾つかの実施形態においては、医薬組成物は、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＮＫｐ４６結合ポリペプチドを含む。

【0220】

併用療法
ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、単独で又は他の抗癌剤等の他の治療方式と組み合わせて投与され得る。ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、他の治療方式の前、実質的にそれと同時に、又はその後に供給され得る（すなわち、同時に又は連続的に）。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される治療方法は、放射線療法、化学療法、ワクチン接種、標的腫瘍療法、ＣＡＲ－Ｔ療法、腫瘍溶解性ウイルス療法、癌免疫療法、サイトカイン療法、外科的切除、クロマチン修飾、切除、冷却療法、腫瘍標的に対するアンチセンス剤、腫瘍標的に対するｓｉＲＮＡ剤、腫瘍標的に対するマイクロＲＮＡ剤若しくは抗癌剤／抗腫瘍剤、又は抗体、サイトカイン若しくは受容体細胞外ドメイン－Ｆｃ融合物等の生物製剤を施すことを更に含み得る。

【0221】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、化学療法剤による治療の前、治療中、又は治療後に投与される。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、腫瘍抗原に結合する結合ドメインを含む抗体と組み合わせて投与され、このようなドメインが結合し得る腫瘍抗原の非限定的な例が本明細書に提供される。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ、又はＨＥＲ２に結合する結合ドメインを含む抗体と組み合わせて投与される。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、腫瘍抗原ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ、又はＨＥＲ２に結合する結合ドメインを含む抗体と組み合わせて投与され、このような投与は、化学療法剤による治療の前、治療中、又は治療後である。

【0222】

幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、免疫刺激剤、例えば腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバー又はＢ７ファミリーのメンバーのアゴニストと同時に与えられる。免疫刺激性ＴＮＦＲＳＦメンバーの非限定的な例としては、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４１ＢＢ、ＣＤ２７、及びＨＶＥＭが挙げられる。Ｂ７ファミリーメンバーの非限定的な例としては、ＣＤ２８及びＩＣＯＳが挙げられる。したがって、幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＣＤ２８、及び／又はＩＣＯＳのアゴニスト、例えばアゴニスト抗体と同時に与えられる。

【0223】

幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、１つ以上の化学療法剤、ＣＡＲ－Ｔ療法薬、腫瘍溶解性ウイルス療法薬、サイトカイン療法薬、及び／又はＶＩＳＴＡ、ｇｐＮＭＢ、Ｂ７Ｈ４、ＨＨＬＡ２、ＣＤ７３、ＣＴＬＡ４、ＴＩＧＩＴ等の他のチェックポイント分子を標的とする作用物質等と同時に与えられる。

【0224】

幾つかの実施形態においては、本明細書で提供されるＮＫｐ４６結合ポリペプチド又は操作された細胞は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法薬と同時に与えられる。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法薬の例としては、ニボルマブ（BMS）、ピディリズマブ（CureTech、ＣＴ－０１１）、ペンブロリズマブ（Merck）、デュルバルマブ（Medimmune/AstraZeneca）、アテゾリズマブ（Genentech/Roche）、アベルマブ（Pfizer）、ＡＭＰ－２２４（Amplimmune）、ＢＭＳ－９３６５５９、ＡＭＰ－５１４（Amplimmune）、ＭＤＸ－１１０５（Merck）、ＴＳＲ－０４２（Tesaro/AnaptysBio、ＡＮＢ－０１１）、ＳＴＩ－Ａ１０１０（Sorrento Therapeutics）、ＳＴＩ－Ａ１１１０（Sorrento Therapeutics）、及びプログラム死－１（ＰＤ－１）又はプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に対する他の作用物質が挙げられる。

【0225】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチド及び付加的な作用物質は、単一の治療用組成物に配合され、ＮＫｐ４６結合ポリペプチド及び付加的な作用物質は、同時に投与される。代替的には、ＮＫｐ４６結合ポリペプチド及び付加的な作用物質は、互いに別個であり、例えば、それぞれが別個の治療用組成物に配合され、ＮＫｐ４６結合ポリペプチド及び付加的な作用物質は、同時に投与されるか、又はＮＫｐ４６結合ポリペプチド及び付加的な作用物質は、治療レジメン中の異なる時点で投与される。例えば、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、付加的な作用物質の投与前に投与されるか、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、付加的な作用物質の投与後に投与されるか、又はＮＫｐ４６結合ポリペプチド及び付加的な作用物質は、交互に投与される。ＮＫｐ４６結合ポリペプチド及び付加的な作用物質は、単回投与又は複数回投与で投与してもよい。

【0226】

幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチド及び付加的な作用物質（複数の場合もある）は、同時に投与される。例えば、ＮＫｐ４６結合ポリペプチド及び付加的な作用物質（複数の場合もある）は、単一の組成物に配合するか、又は２つ以上の別個の組成物として投与することができる。幾つかの実施形態においては、ＮＫｐ４６結合ポリペプチド及び付加的な作用物質（複数の場合もある）は、順次投与されるか、又はＮＫｐ４６結合ポリペプチド及び付加的な作用物質は、治療レジメン中の異なる時点で投与される。

【0227】

診断及び治療の非限定的な例示的な方法
幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される方法は、被験体及び／又は被験体（例えば、癌患者）からの検体を評価するのに有用である。幾つかの実施形態においては、評価は、診断、予後診断、及び／又は治療への奏効のうちの１つ以上である。

【0228】

幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される方法は、タンパク質の存在、非存在、又はレベルを評価することを含む。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される方法は、核酸の存在、非存在、又は発現のレベルを評価することを含む。これらの測定に本明細書に記載される組成物を使用することができる。例えば、幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される方法は、腫瘍の検体又は腫瘍から培養された細胞を、本明細書に記載される療法剤と接触させることを含む。

【0229】

幾つかの実施形態においては、評価により、治療（本明細書に記載される抗体による治療を含む）が指示され得る。幾つかの実施形態においては、評価により、切除後の補助療法を使用する又は差し控えることが指示され得る。補助治療とも呼ばれる補助療法は、一次治療、主治療、又は初回治療に加えてなされる治療である。非限定的な例として、補助療法は、全ての検出可能な疾患が取り除かれたが、潜在疾患のため再燃の統計的リスクが残っている場合に、通常は手術後になされる追加の治療であり得る。幾つかの実施形態においては、上記ポリペプチドは、癌の治療における補助療法薬として使用される。幾つかの実施形態においては、上記ポリペプチドは、癌の治療における単独補助療法薬として使用される。幾つかの実施形態においては、本明細書に記載されるポリペプチドは、癌の治療における補助療法薬としては差し控えられる。例えば、患者が本明細書に記載される抗体に応答する可能性が低い又は最小限の応答しか有しない場合に、生活の質のために、及び無効な化学療法による不必要な毒性を避けるために、治療を施さなくてもよい。このような場合に、緩和ケアが使用される場合がある。

【0230】

幾つかの実施形態においては、切除前に術前補助療法薬として上記ポリペプチドが投与される。幾つかの実施形態においては、術前補助療法薬は、任意の手術の前に腫瘍を縮小及び／又はダウングレードする療法薬を指す。幾つかの実施形態においては、術前補助療法薬は、手術前に癌患者に投与される化学療法薬を意味する。幾つかの実施形態においては、術前補助療法薬は、手術前に癌患者に投与される抗体を意味する。術前補助化学療法薬が通常考慮される癌型としては、例えば、乳癌、結腸直腸癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、及び肺癌が挙げられる。幾つかの実施形態においては、上記ポリペプチドは、癌の治療における術前補助療法薬として使用される。幾つかの実施形態においては、その使用は切除前である。

【0231】

幾つかの実施形態においては、本明細書に記載される方法で企図される腫瘍微小環境は、腫瘍血管系、腫瘍浸潤リンパ球、線維芽細網細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、癌関連線維芽細胞、周皮細胞、他の間質細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分、樹状細胞、抗原提示細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、他のリンパ系細胞、好中球、及び腫瘍の近位に位置する他の免疫細胞の１つ以上であるか、又はそれらの１つ以上を含む。

【0232】

キット
本明細書に記載されるＮＫｐ４６結合ポリペプチドのいずれか及び適切な包装を含む製造品及びキットも提供される。幾つかの実施形態においては、本発明は、（ｉ）ＮＫｐ４６結合ポリペプチドと、（ｉｉ）該キットを使用してＮＫｐ４６結合ポリペプチドを個体に投与するための使用説明書とを備えるキットを含む。

【0233】

本明細書に記載される組成物に適切な包装は、当該技術分野で知られており、例えば、バイアル（例えば、密封バイアル）、容器、アンプル、ボトル、広口瓶、フレキシブルな包装（例えば、密封マイラー又はプラスチックバッグ）等が含まれる。これらの製造品は、更に滅菌及び／又は密封され得る。本明細書に記載される組成物を含む単位剤形も提供される。これらの単位剤形は、単回又は多回単位剤形で適切な包装内で保存され得て、更に滅菌及び密封もされ得る。本発明のキットに提供される使用説明書は、典型的には、ラベル又は添付文書（例えば、キットに含まれる紙シート）に書かれた指示であるが、機械可読の指示（例えば、磁気記憶ディスク又は光学記憶ディスクに保持された指示）も許容可能である。抗体の使用に関する使用説明書は一般に、意図された治療又は工業的使用のための投与量、投与スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。キットは、個々の適切な治療を選択することの説明を更に含み得る。

【0234】

容器は、単位用量、バルク包装（例えば、多回用量包装）又はサブユニット用量であり得る。例えば、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、８週間、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月以上のいずれかの概数の期間等の長期間にわたって個体に効果的な治療をもたらすのに十分な用量の本明細書に開示される分子を含むキットも提供され得る。キットはまた、多回単位用量の分子及び使用説明書を含むことができ、薬局、例えば、病院薬局及び調剤薬局での保存及び使用に十分な量で包装され得る。幾つかの実施形態においては、キットは、再構成、再懸濁、又は再水和することで、一般的に抗体の安定な水性懸濁液を形成することができる乾燥（例えば、凍結乾燥）組成物を含む。

【実施例】

【0235】

以下で論じられる実施例は、本発明を純粋に例示することが意図され、決して本発明を限定するとみなされるべきではない。これらの実施例は、以下の実験が、実施された全て又は唯一の実験であることを表すとは意図されない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを保証するための努力がなされたが、幾らかの実験誤差及び偏差が考慮に入れられるべきである。特段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧であるか又は近大気圧である。

【0236】

実施例１：ＮＫｐ４６シングルドメイン抗体
ヒトＮＫｐ４６を標的とするシングルドメイン抗体を、ヒトＮＫｐ４６細胞外ドメインの組換え型によるラマ及びアルパカの免疫化によって生成した。ＮＫｐ４６ ＶＨＨドメインのアミノ酸配列は、以下に提示される或る特定の配列の表に示される。開示されるＶＨＨドメインのいずれかの残基１２５のリジン（Ｋ１２５）がアスパラギン酸（Ｋ１１７Ｄ）、グルタミン酸（Ｋ１２５Ｅ）、又はアルギニン（Ｋ１２５Ｒ）で置換されていてもよいことが示される。ｈｚ５Ｄ７ｖ１７と命名されたＶＨＨ（配列番号１５）は、残基１２５にアルギニン（Ｒ）を含む（或る特定の配列の表において太字及び下線で示す）。

【0237】

ＶＨＨ－Ｆｃ融合タンパク質としてフォーマットされたＮＫｐ４６結合ポリペプチドの結合をフローサイトメトリーによって評価した。ヒンジを欠くＩｇＧ１－Ｆｃ、又はホモ二量体Ｆｃ（図１Ｉ及び図１Ｊ）を使用した（ヒンジを欠くＦｃは、Ｆｃ^＊と注釈される）。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、完全長ヒトＮＫｐ４６、カニクイザルＮＫｐ４６、又はマウスＮＫｐ４６に続いてＩＲＥＳ及びＧＦＰをコードするプラスミドで一過的にトランスフェクションした。ＮＫｐ４６及びＧＦＰを発現するトランスフェクション細胞を用いて、ポリペプチドの結合を測定した。トランスフェクションした細胞をＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ_３、ｐＨ７．４）中、１ウェル当たり３００００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。トランスフェクションしていないＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＮＫｐ４６ネガティブコントロールとして使用し、別のプレートに１ウェル当たり３００００個の細胞でプレーティングした。次いで、試験ポリペプチドを最終濃度１０００ｎＭの２倍に希釈し、３倍、４倍、及び５倍の段階希釈を行った。最後のカラムには、二次のみのコントロールとしてＦＡＣＳバッファーのみを残した。被験物質の希釈物を等容量の細胞に添加し、アッセイプレートを４℃で３０分間インキュベートした。１ウェル当たり１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで２回洗浄した後、１０００倍～２０００倍希釈したα－ｈＦｃ－６４７二次を含むＦＡＣＳバッファーに細胞を再懸濁した。次いで、アッセイプレートを４℃で２０分間～３０分間インキュベートした。１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで更に１回洗浄した後、結合した抗体をフローサイトメトリーによって検出した。フローサイトメトリー検出は、IntellicytのｉＱｕｅ Ｐｌｕｓ又はＡｃｃｕｒｉ ｉＱｕｅで行った。ＮＫｐ４６トランスフェクション細胞は、ＧＦＰ陽性としてゲーティングされ、ポリペプチド結合は、６４７ｎｍでの蛍光中央値として測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析ソフトウェアを用いてデータをプロット及び分析し、結果を以下の表及び図１に示す。

【0238】

【表3】

【0239】

【表4】

【0240】

【表5】

【0241】

【表6】

【0242】

【表7】

【0243】

【表8】

【0244】

【表9】

【0245】

図１Ａ及び図１Ｂ、図１Ｉ並びに表３、表４及び表９に示されるように、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドは、１ｎＭ未満の親和性でヒトＮＫｐ４６に結合した。図１Ｃ及び図１Ｄ、並びに表５及び表６は、ＮＫｐ４６結合ポリペプチドが２ｎＭ未満の親和性でカニクイザルＮＫｐ４６に結合したことを示す。図１Ｅ及び図１Ｆ、並びに表７及び表８は、ほぼ全てのＮＫｐ４６標的化ポリペプチドが２ｎＭ未満の親和性でマウスＮＫｐ４６に結合したことを示す。図１Ｇ及び図１Ｈ、並びに図１Ｊは、ポリペプチドが、トランスフェクションしていないＨＥＫ－２９３Ｆ細胞に結合しなかったことを示す。

【0246】

実施例２：ＮＫｐ４６結合ＶＨＨとＩＬ－２変異体とを含むポリペプチドによって誘導される特異的ＩＬ－２シグナル伝達
ＮＫｐ４６結合ＶＨＨドメイン（ｈｚ５Ｄ７ｖ１２又はｈｚ５Ｄｖ１２）と、ヘテロ二量体ノブインホールＦｃ領域（「ＫｉＨ Ｆｃ」）と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２突然変異体とを含むポリペプチドのＮＫｐ４６標的化ＩＬ－２活性をホスホ－ＳＴＡＴ５アッセイにおいて評価した。以下の表に示されるように、コントロールタンパク質には、ｈｚ５Ｄ７ｖ１２及びヘテロ二量体ノブインホールＦｃ領域を含み、ＩＬ－２を含まないポリペプチド、標的化されていないＶＨＨと、ヘテロ二量体ノブインホールＦｃ領域のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２突然変異体とを含むポリペプチド、並びに野生型組換えＩＬ－２が含まれていた。リン酸化ＳＴＡＴ５（ｐＳＴＡＴ５）のレベルの増加は、ＩＬ－２受容体連結及びシグナル伝達の近接読み出し値として細胞内フローサイトメトリーによって測定した。ヒトＰＢＭＣを完全増殖培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、１％ａｎｔｉ－ａｎｔｉ）中、１ウェル当たり１００００００個の細胞で９６ウェルプレートにプレーティングした。次いで、試験ポリペプチドを最終濃度１００ｎＭの２倍に希釈し、５倍の段階希釈を行った。段階希釈物を細胞に添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、細胞を１００μＬのＣｙｔｏｆｉｘ固定バッファー（BD）中にて４℃で３０分間固定した。次いで、細胞を２００μＬのＦＡＣＳバッファー中で１回洗浄し、Ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（ＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ）中にて４℃で３０分間透過処理した。透過処理した細胞を１倍Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（eBioscience）中で合計３回洗浄した後、ＣＤ４（ＯＫＴ４、１：１００）、ＣＤ３（ＳＰ３４－２、１：５０）、ＣＤ１６（３Ｇ８、１：１０００）、ｐＳＴＡＴ５（ＳＲＢＣＺＸ、１：７０）、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ１６．２、１：５００）、及びＣＤ８（ＲＰＡ－Ｔ８、１：４０００）に対する蛍光標識抗体を含有する１倍Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中にて４℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞を１５０μＬのＦＡＣＳバッファーで洗浄し、ACEA BiosciencesのＮｏｖｏｃｙｔｅ－Ｑｕａｎｔｅｏｎフローサイトメーターを用いて分析した。ＩＬ－２シグナル伝達は、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ１６＋若しくはＣＤ３－ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＣＤ１６－、又は全ＮＫ細胞）又はＣＤ４ Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）、又はＣＤ８（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）上のｐＳＴＡＴ５を検出する蛍光標識抗体の頻度及び蛍光強度レベルの中央値の増加によって定量化した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析ソフトウェアを用いてデータをプロットし、分析した。

【0247】

図２に示されるように、ｈｚ５Ｄ７ｖ１２又はｈｚ５Ｄ７ｖ１７と、ヘテロ二量体ノブインホールＦｃ領域のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２突然変異体とを含むポリペプチドは、ＣＤ５６^ｄｉｍＣＤ１６＋ＮＫ細胞（図２Ａ及び図２Ｂ）及び全ＮＫ細胞（図２Ｇ）上にて０．４ｎＭ未満のＥＣ_５０で濃度依存的にｐＳＴＡＴ５のレベルの増加を誘導し、これは野生型組換えＩＬ－２の活性よりも低かった。ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ}ＣＤ１６－ＮＫ細胞では、ＥＣ_５０は０．０８ｎＭ未満であり（図２Ｃ及び図２Ｄ）、これは野生型組換えＩＬ－２のおよそ０．０６ｎＭのＥＣ_５０と同様であった。ＣＤ４又はＣＤ８ Ｔ細胞上でのｐＳＴＡＴ５の検出可能な増加は、ＮＫｐ４６標的化変異体ＩＬ－２によって誘導されなかった（図２Ｅ及び図２Ｆ、図２Ｈ及び図２Ｉ）。コントロールポリペプチドのいずれも、試験した細胞型のいずれにおいてもｐＳＴＡＴ５レベルの検出可能な増加を誘導せず、弱毒化ＩＬ－２がＩＬ－２受容体シグナル伝達活性を達成するために結合ドメインを介した細胞への標的化を必要とすることが示された。

【0248】

【表10】

【0249】

実施例３：ＮＫｐ４６結合ＶＨＨとＩＬ－２変異体とを含むポリペプチドによって誘導される抗体依存性細胞傷害作用の増強
ＮＫｐ４６結合ＶＨＨドメインｈｚ５Ｄ７ｖ１２又はｈｚ５Ｄ７ｖ１７と、ヘテロ二量体ノブインホールＦｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２突然変異体とを含むポリペプチド（ｈｚ５Ｄ７ｖ１２－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ホール及びｈｚ５Ｄ７ｖ１２－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ノブ－突然変異体ＩＬ－２、本明細書において「ｈｚ５Ｄ７ｖ１２－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体ＩＬ－２」とも称される）のＮＫｐ４６標的化ＩＬ－２活性の活性を、ＡＤＣＣ活性を示す抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブと組み合わせた抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）アッセイにおいて更に評価した。標的化されていないＶＨＨと、ヘテロ二量体ノブインホールＦｃ領域のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２突然変異体とを含むポリペプチド（標的化されていないＶＨＨ－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ホール及び標的化されていないＶＨＨ－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ノブ－突然変異体ＩＬ－２）、及び野生型組換えＩＬ－２をコントロールとして使用した。Ａ４３１細胞をＣＹＴＯ－ＩＤ ｒｅｄ長期細胞トレーサー（Enzo）で標識した後、１００μＬ中１ウェル当たり１００００個の細胞で９６ウェル平底プレートにプレーティングし、４時間接着させた。ヒトドナーから得られたＰＢＭＣを解凍し、フローサイトメトリーによってＮＫ細胞頻度について試験した。２５μＬの培地について最終希釈率２０００倍のＩｎｃｕｃｙｔｅ（商標） Ｃａｓｐａｓｅ－３／７ Ｇｒｅｅｎ Ｄｙｅ ｆｏｒ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ（Sartorius）２５μＬ、又は２５μＬの培地について最終濃度２０ｎＭ若しくは０．２ｎＭのセツキシマブ、最終濃度１ｎＭの野生型組換えＩＬ－２、又は最終濃度１ｎＭのＩＬ－２変異体融合ポリペプチド、及びＡ４３１細胞１個当たり１０個のＮＫ細胞の濃度に調整したヒトＰＢＭＣ ２５μＬを各ウェルに添加した。細胞を室温で１０分間沈降させた後、プレートを３７℃のＩｎｃｕｃｙｔｅイメージャーに２４時間入れ、３０分毎に画像を取得した。Ｃａｓｐａｓｅ－３／７及びＣＹＴＯ－ＩＤ ｒｅｄの重なりによってＡ４３１の死滅を決定し、２０ｎＭセツキシマブを使用した場合に観察されたレベルによって最大死滅を規定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析ソフトウェアを用いてデータをプロットし、分析した。

【0250】

図３に示されるように、０．２ｎＭセツキシマブを使用した場合、セツキシマブのＡＤＣＣ活性は、最大活性のおよそ６５％まで低下した。この最適以下のセツキシマブ用量の死滅活性は、弱毒化ＩＬ－２変異体と、ヘテロ二量体Ｆｃと、標的化されていないＶＨＨとを含むポリペプチド（標的化されていないＶＨＨ－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ホール及び標的化されていないＶＨＨ－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ノブ－突然変異体ＩＬ－２）によっては増強されなかったが、野生型組換えＩＬ－２、及びヘテロ二量体ＦｃのＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２変異体と、ＮＫｐ４６標的化ＶＨＨドメインとを含むポリペプチド（ｈｚ５Ｄ７ｖ１２－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ホール及びｈｚ５Ｄ７ｖ１２－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ノブ－突然変異体ＩＬ－２）はどちらも、最大死滅が達成されるように０．２ｎＭセツキシマブの活性を増強することができた。

【0251】

付加的な研究において、標的細胞の死滅を、ＰＢＭＣ ＡＤＣＣバイオアッセイ（Promega）を用いて評価した。このキットには、細胞溶解時に放出され、相補的ポリペプチドＬｇＢｉＴとの結合により発光シグナルを生成するＨｉＢｉｔ融合タンパク質を発現する標的細胞が含まれる。このアッセイにおいては、標的細胞を指定の被験物質（単独の又はｃｘ１１３１４と組み合わせた抗ＢＣＭＡ抗体、セツキシマブ（抗ＥＧＦＲ）、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２）、以下の配列類似体：リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、リツキシマブの脱フコシル化変異体（抗ＣＤ２０）、ダラツムマブ（抗ＣＤ３８）、タファシタマブ（抗ＣＤ１９）、オビヌツズマブ（抗ＣＤ１９））及びヒトＰＢＭＣの比で９６ウェル白色Ｕ型底プレートにおいて混合した。次いで、アッセイプレートを３７℃のインキュベーター内で５時間インキュベートした。続いて、ポリペプチドＬｇＢｉＴを含有する検出試薬を各ウェルに添加し、プレートリーダーで発光を読み取った。ＰＢＭＣ及び標的細胞を含むウェルに１００μｇ／ｍＬジギトニンを添加した最大溶解コントロール、並びに非処理コントロールを各実験に含めた。特異的溶解％は、非処理コントロール及びジギトニンコントロールと比べた各試料の相対光単位に基づいて算出した。

【0252】

図４及び図５に示されるように、ヘテロ二量体ＦｃのＣ末端に融合したＩＬ－２変異体と、ＮＫｐ４６標的化ＶＨＨドメインとを含むＮＫｐ４６結合ポリペプチド（ｈｚ５Ｄ７ｖ１２－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体ＩＬ－２）は、ＣＤ２０（図４Ａ及び図４Ｂ、並びに図５Ｂ）、ＣＤ１９（図５Ｂ）、ＣＤ３８（図５Ａ）、ＢＣＭＡ（図５Ａ）、ＨＥＲ２（図５Ｃ及び図５Ｄ）、及びＥＧＦＲ（図５Ｃ及び図５Ｄ）を含む細胞表面抗原を標的とする様々な抗体のＡＤＣＣ活性を大幅に増強した。

【0253】

実施例４：ＮＫｐ４６結合ＶＨＨとＩＬ－２変異体とを含むポリペプチドによって誘導されるカニクイザルＰＢＭＣ亜集団の細胞増加
ＮＫｐ４６結合ＶＨＨドメインｈｚ５Ｄ７ｖ１２と、ヘテロ二量体Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２突然変異体とを含むポリペプチド（ｈｚ５Ｄ７ｖ１２－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ホール及びｈｚ５Ｄ７ｖ１２－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ノブ－突然変異体ＩＬ－２）のｉｎ ｖｉｖｏ細胞増加に対する影響を非ヒト霊長類において試験した。カニクイザルに０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、又は３ｍｇ／ｋｇのポリペプチドを静脈内ボーラス注射した。投与の前並びに投与の４日後、１０日後、及び１４日後に研究動物から全血試料を採取した。各時点のＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（STEMCELL Technologies）にて密度遠心分離を用いて単離し、細胞を蛍光標識細胞型特異的抗体の組合せで染色した。Ｔ細胞は、Ｂ細胞マーカーＣＤ２０を発現しないＣＤ３^＋細胞として分類された。制御性Ｔ細胞（「Ｔ_ｒｅｇ」）は、ＣＤ２５も発現し、ＣＤ１２７のレベルが低下したＣＤ４^＋Ｔ細胞として定義された。ＮＫ細胞は、ＮＫＧ２Ａを発現するＣＤ３^－非Ｔ及び非Ｂ細胞として定義され、ＣＤ１６には陽性又は陰性のいずれかであった。ＣＤ２０陽性染色集団は、Ｂ細胞として分類された。投与１０日後の全血１ｍＬ当たりの細胞数を投与前の全血１ｍＬ当たりのベースライン数で除算することによって倍率変化を算出した。グランザイムＢ発現を、上記のＰＢＭＣ亜集団において付加的な固定、透過処理、及び染色工程を用いて測定した。簡潔に述べると、細胞を細胞表面マーカーについて蛍光標識細胞型特異的抗体の組合せで染色した後、ＦｏｘＰ３ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（eBioscience）を用いて固定し、透過処理した。次いで、グランザイムＢを特異的蛍光標識抗体で検出した。フローサイトメトリー検出は、ACEA BiosciencesのＮｏｖｏｃｙｔｅ－Ｑｕａｎｔｅｏｎフローサイトメーターで行った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析ソフトウェアを用いてデータをプロットし、分析した。４日目及び１０日目のグランザイムＢ蛍光中央値をベースライン（投与前）のＮＫ細胞の蛍光中央値で除算することによって倍率変化を算出した。結果を表１１及び図６Ａ～図６Ｃに示す。

【0254】

【表11】

【0255】

図６Ａ及び図６Ｂ、並びに表１１に示されるように、ＮＫｐ４６結合ＶＨＨドメインｈｚ５Ｄ７ｖ１２と、ヘテロ二量体Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２変異体とを含むポリペプチドの単回投与は、用量依存的なＮＫ細胞増加をもたらし、０．３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの用量では１０日目、３ｍｇ／ｋｇの用量では１４日目により高い増加が生じた。ＣＤ１６^＋及びＣＤ１６^－の両方のＮＫ細胞コンパートメントにおいて、試験した全ての用量レベルで２倍超の増加が見られ、３ｍｇ／ｋｇの用量で最大の倍率増加が見られた。Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びＴ_ｒｅｇ細胞集団を含む非ＮＫ細胞集団では増加は見られなかった。図６Ｃは、ＮＫｐ４６結合ＶＨＨドメインｈｚ５Ｄ７ｖ１２と、ヘテロ二量体Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２変異体とを含むポリペプチドの単回投与による処理も、細胞傷害性の代理マーカーであるグランザイムＢの上方調節によって実証されるように、ＮＫ細胞死滅能の増加をもたらしたことを示す。グランザイムＢの発現は、投与の４日後にピークに達したが、投与の１０日後に投与前レベルより上昇したままであった。グランザイムＢ発現の最大増加は、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、及び３ｍｇ／ｋｇの群においてそれぞれ３．９倍、４．１倍、及び５．１倍であった。これらのデータから、ＮＫｐ４６結合ＶＨＨドメイン（例えば、ｈｚ５Ｄ７ｖ１２）と、ヘテロ二量体Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２変異体とを含むポリペプチドがＮＫ細胞集団の細胞増殖及び活性をｉｎ ｖｉｖｏで特異的に誘導したことが示される。

【0256】

実施例５：ＮＫｐ４６結合ＶＨＨとＩＬ－２変異体とを含むポリペプチドによりヒト異種移植腫瘍マウスモデルにおいて誘導される抗腫瘍効力
ＮＫｐ４６結合ＶＨＨドメイン（ｈｚ５Ｄ７ｖ１７）と、ヘテロ二量体Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２突然変異体とを含むポリペプチド（ｈｚ５Ｄ７ｖ１７－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ホール及びｈｚ５Ｄ７ｖ１７－Ｆｃ ｘＥＬＬ－ノブ－突然変異体ＩＬ－２、本明細書において「ｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体ＩＬ－２」とも称される）のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を異種移植マウスモデルにおいて試験した。７週齢の雌性ＢＡＬＢ－Ｓｃｉｄマウス（１群当たり８匹）に、１００μＬのＨＢＳＳ中３．５×１０^６個のＲａｊｉ細胞を皮下接種した。腫瘍量が平均１００ｍｍ^３に達した時点で、動物に１ｍｇ／ｋｇのｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体ＩＬ－２、５ｍｇ／ｋｇの治療用抗体リツキシマブの配列類似体、両方のレジメンの組合せ、又はビヒクルコントロールのいずれかを投与した。全ての処理を３週間連続して週１回行った。ｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体ＩＬ－２及びビヒクルは静脈内投与し、リツキシマブ類似体は腹腔内投与した。腫瘍体積は、皮下腫瘤の長さ及び幅を週３回測定することによって決定した。腫瘍体積は、式Ｖ＝Ｌ×Ｗ×Ｗ／２を用いて算出した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ分析ソフトウェアを用いてデータをプロットし、分析した。

【0257】

図５に示されるように、ｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体ＩＬ－２を用いた単剤療法は、ビヒクルコントロールと比較して、ＢＡＬＢ－ＳｃｉｄマウスにおけるＲａｊｉ異種移植片の成長を遅延させる。Ｒａｊｉ腫瘍細胞上のＣＤ２０を認識し、腫瘍細胞を認識し、死滅させるようにＮＫ細胞を含むエフェクター細胞をリダイレクトすることができる治療用抗体リツキシマブの類似体は、顕著な抗腫瘍応答を誘導し、腫瘍体積が再び増加し始めるまでおよそ３週間持続する腫瘍の停滞をもたらす。併用療法においては、ｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体ＩＬ－２は、リツキシマブ類似体の活性を更に増強し、７／８匹の動物で腫瘍の完全かつ持続的な消失をもたらす。これらのデータから、ＮＫｐ４６結合ＶＨＨドメイン（例えば、ｈｚ５Ｄ７ｖ１７）と、ヘテロ二量体Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２変異体とを含むポリペプチドが、単剤としての抗腫瘍活性につながるｉｎ ｖｉｖｏ機能的応答を誘導し、リツキシマブのような治療用抗体の抗腫瘍応答を強力に増強することが示される。

【0258】

実施例６：ＮＫｐ４６結合ＶＨＨとＩＬ－２変異体とを含むポリペプチドによるＮＫ細胞の健康及び抗腫瘍活性の化学療法によって誘導される欠陥のレスキュー
ＮＫｐ４６結合ＶＨＨドメインｈｚ５Ｄ７ｖ１７と、ヘテロ二量体Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２突然変異体とを含むポリペプチド（ｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体）の活性を、標準治療の化学療法試薬であるデキサメタゾン及びレナリドミドと組み合わせて更に評価した。ヒトドナーから得られたＰＢＭＣを解凍し、５００ｎＭデキサメタゾン、２μＭレナリドミド、及び５ｎＭ ｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体の組合せで３日間処理した。全ての前処理条件には、ＮＫ細胞生存を支持する２ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２も含まれていた。各処理ＰＢＭＣ試料におけるＮＫ細胞頻度をフローサイトメトリーによって定量化し、培地のみのコントロールに対して正規化した。前処理したＰＢＭＣからのＮＫ細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）能を評価するために、ＮＫ細胞を富化し、ＮＫ細胞１０対ＭＭ１Ｓ細胞１の比率でのＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標） Ｖｉｏｌｅｔ標識ＭＭ１Ｓ（多発性骨髄腫）標的細胞及び１ｎＭのダラツムマブ配列類似体（抗ｈＣＤ３８－ｈＩｇＧ１）とともに１８時間共培養した。前処理条件は共培養中にわたって継続した。ＭＭ１Ｓの死滅は、生／死染色Ｚｏｍｂｉｅ Ａｑｕａ及び／又はアポトーシスマーカーＡｐｏｔｒａｃｋｅｒ ｇｒｅｅｎで陽性に染色されたＭＭ１Ｓ細胞の割合を定量化することでフローサイトメトリーによって決定した。

【0259】

図８Ａに示されるように、標準治療薬であるデキサメタゾン及びレナリドミドによるヒトＰＢＭＣの処理は、培地単独による処理と比較して、３日後におよそ５０％少ないＮＫ細胞数をもたらす。ｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体と化学療法レジメンとの共処理は、ＮＫ細胞の生存能力及び／又は増殖を回復させ、培地コントロールと同程度又はそれより多いＮＫ細胞数をもたらす。図８Ｂは、細胞をデキサメタゾン及びレナリドミドで前処理した場合に、ダラツムマブ類似体（抗ｈＣＤ３８－ｈＩｇＧ１）の存在下でのＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性がおよそ２０％低下することを示す。しかしながら、ｈｚ５Ｄ７ｖ１７－ＫｉＨ Ｆｃ突然変異体を前処理レジメンに加えることで、ＡＤＣＣ活性がレスキューされるか、又は更には増加する。これらのデータから、ＮＫｐ４６結合ＶＨＨドメインｈｚ５Ｄ７ｖ１７と、ヘテロ二量体Ｆｃ領域と、Ｆｃ領域のＣ末端に融合した弱毒化ＩＬ－２突然変異体とを含むポリペプチドが、デキサメタゾン及びレナリドミドのような標準治療の化学療法薬によるＮＫ細胞の抑制を克服し得ることが示される。

【0260】

本開示は、本発明の趣旨又は本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化され得る。したがって、上述の実施形態は、全ての点で例示としてみなされるべきであって、本開示を限定するものとはみなされない。したがって、本開示の範囲は、上述の詳細な説明ではなく、添付の特許請求の範囲によって示されるため、特許請求の範囲の意味及び均等の範囲内にある全ての変更は、本明細書に含まれることが意図される。

【0261】

【表12】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図1J】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【配列表】

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【国際調査報告】