▶ ハンミ・ファイン・ケミカル・カンパニー・リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-26
(54)【発明の名称】ｍＲＮＡキャップ類似体及びその用途
(51)【国際特許分類】
C07H 21/02 20060101AFI20240918BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240918BHJP
A61P 43/00 20060101ALN20240918BHJP
【ＦＩ】
C07H21/02 CSP
A61K31/7105
C12N15/11 Z
A61P43/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024513516
(86)(22)【出願日】2022-08-31
(85)【翻訳文提出日】2024-02-28
(86)【国際出願番号】 KR2022013062
(87)【国際公開番号】W WO2023033551
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】10-2021-0115942
(32)【優先日】2021-08-31
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517095722
【氏名又は名称】ハンミ・ファイン・ケミカル・カンパニー・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＨＡＮＭＩ ＦＩＮＥ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯ．， ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001519
【氏名又は名称】弁理士法人太陽国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】チェ、ポ スン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ナ リ
(72)【発明者】
【氏名】ノ、チン ミ
(72)【発明者】
【氏名】チュン、ヨン キュ
(72)【発明者】
【氏名】ミン、ス ヒョン
【テーマコード（参考）】
4C057
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C057AA17
4C057MM04
4C057MM05
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086ZC80
(57)【要約】
一態様は、化学式１の化合物、その製造中間体の製造方法、それを含むキャップ類似体、そのキャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡ、そのキャップ類似体を利用したｍＲＮＡ製造方法、そのキャップ類似体をｍＲＮＡ製造に使用するための用途、及びそのキャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡを含む目的とするペプチド発現またはタンパク質発現のための薬学組成物などに係わるものである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記化学式１の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩：【化1】
ここで、
ｎ＝０，１または２であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ただし、Ｒ１及びＲ２のうち少なくとも一つは、Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、Ｃ１～Ｃ６アルキルまたはＣ１～Ｃ６アルコキシであり、
Ｒ３は、メトキシ基であり、
Ｚ及びＺ’は、それぞれ独立して、天然窒素塩基である。
【請求項2】
前記化合物は、下記化学式１Ａの構造を有する、請求項１に記載の化合物：【化2】
ここで、
ｎ＝０，１または２であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、それぞれ独立して、存在しないか、あるいは一価陽イオン、二価陽イオン、またはそれらの組み合わせであり、このとき、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、化学式１Ａの化合物が電気的中性になるように選択され、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ただし、Ｒ１及びＲ２のうち少なくとも一つは、Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、Ｃ１～Ｃ６アルキルまたはＣ１～Ｃ６アルコキシであり、
Ｒ３は、メトキシ基であり、
Ｚ及びＺ’は、それぞれ独立して、天然窒素塩基である。
【請求項3】
Ｒ’は、Ｃ２～Ｃ６アルキルまたはＣ２～Ｃ６アルコキシである、請求項２に記載の化合物。
【請求項4】
前記一価陽イオンは、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、ＮＨ４＋及びＫ＋によって構成された群のうちから選択され、前記二価陽イオンは、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋及びＣａ２＋によって構成された群のうちから選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項5】
Ｚ、Ｚ’は、それぞれ独立して、グアニン、アデニン、シトシン及びウラシルによってなる群のうちから選択される、請求項２に記載の化合物。
【請求項6】
下記化学式の化合物によってなる群のうちから選択された、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩：【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
【化10】
【化11】
【化12】
【化13】
【化14】
【請求項7】
下記化学式１ａ及び下記化学式１ｂの化合物を、０．６５±０．０５：１のモル比で含む、水性組成物：【化15】
【化16】
ここで、Ｍ３においてそれぞれのＭは、互いに独立して存在しないか、あるいはＮａ＋、Ｌｉ＋、ＮＨ４＋及びＫ＋によって構成された群のうちから選択された一価陽イオン、またはＭｇ２＋、Ｚｎ２＋及びＣａ２＋によって構成された群のうちから選択された二価陽イオンであり、このとき、Ｍ３は、前記化合物が電気的中性になるように選択される。
【請求項8】
前記Ｍ３において、それぞれのＭは、いずれもＮａ＋である、請求項７に記載の水性組成物。
【請求項9】
前記水性組成物のｐＨは、１．０ないし８．０である、請求項７に記載の水性組成物。
【請求項10】
請求項１ないし９のうちいずれか１項に記載の化合物を含む、キャップ類似体。
【請求項11】
請求項１０に記載のキャップ類似体でもって、５’キャッピングされた、ｍＲＮＡ。
【請求項12】
請求項１０に記載のキャップ類似体を含む、５’キャッピングされた、ｍＲＮＡ製造用組成物またはそのキット。
【請求項13】
請求項１０に記載のキャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含む、目的とするペプチド発現またはタンパク質発現のための薬学組成物。
【請求項14】
下記化学式２の化合物またはその塩を、水相のアルカリ条件において、下記化学式３の化合物と反応させ、下記化学式４の化合物またはその塩を製造する段階と、化学式４の化合物またはその塩を、インサイチュ方式でもって、ｐＨ１．５～４．５条件において、化学式５の化合物と反応させる段階と、を含む、下記化学式６の化合物またはその塩の製造方法：
【化17】
【化18】
【化19】
【化20】
【化21】
前記化学式において、Ｒは、Ｃ１～Ｃ６アルキルまたはＣ１～Ｃ６アルコキシを意味し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ただし、Ｒ１及びＲ２のうちいずれか一つは、Ｈであり、残りは、Ｃ（＝Ｏ）－Ｒである。
【請求項15】
化学式６の化合物またはその塩をイミダゾールと反応させ、下記化学式７の化合物またはその塩を、製造する段階と、化学式７の化合物またはその塩を、インサイチュ方式でもって、塩化亜鉛及びトリエチルアンモニウムリン酸塩と反応させる段階と、を含む、下記化学式８の化合物またはその塩の製造方法：
【化22】
【化23】
【化24】
前記化学式において、Ｒは、Ｃ１～Ｃ６アルキルまたはＣ１～Ｃ６アルコキシを意味し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ（＝Ｏ）－Ｒであり、ただし、Ｒ１及びＲ２のうちいずれか一つは、Ｈであり、残りは、Ｃ（＝Ｏ）－Ｒである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、キャップ類似体、及びそれを利用したタンパク質発現方法に係り、さらに具体的には、キャップ類似体、それを含む５’キャッピングされたｍＲＮＡ、該５’キャッピングされたｍＲＮＡを含む、目的とするペプチド発現またはタンパク質発現のための薬学組成物、及び前記５’キャッピングされたｍＲＮＡを使用し、目的とするペプチドまたはタンパク質を生産する方法などに関する。
【背景技術】
【0002】
ＤＮＡ遺伝情報から、機能的に重要な特定タンパク質を発現させるためには、核において、ＤＮＡテンプレート鎖を基に、相補的な配列を有するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が合成される転写（transcription）過程が必要である。そのように合成されたｍＲＮＡは、核外に輸送され、細胞質において、リボソームを介して特定タンパク質を合成することになる翻訳（translation）過程を経ることになる。
【0003】
そのようなｍＲＮＡは、コーディングタンパク質を効率的に翻訳するために、転写後、成熟化過程（maturation process）を経ることになる。そのような過程において、三リン酸基を介する結合において、ｍＲＮＡ分子の５’末端に、７－メチルグアノシン（７ｍＧ）がその５’末端を介して連結される過程を、５’キャッピング過程（５’ capping process）と言う。前記５’キャッピング構造（５’キャップ０ ｍＲＮＡ構造と呼ぶ）というｍＲＮＡの５’末端を、５’エキソヌクレアーゼによる生分解から保護することができ、ｍＲＮＡが、核から細胞質に移動するのに影響を及ぼす。特に、５’キャッピング構造は、真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）によって認知され、翻訳開始複合体を形成することにより、タンパク質を発現させるのに重要な役割を果たす。
【0004】
そのようなキャッピングされたｍＲＮＡを臨床に適用するためには、７－メチルグアノシンが５’－トリホスフェート鎖を介して連結された最初ヌクレオチドの２’ヒドロキシル基がメチル化された構造（Ｃａｐ１ ｍＲＮＡ）を備えなければならない。前記メチル化がなされないＣａｐ０構造を適用する場合、Ｃａｐ０構造を認知するＭＤＡ５（細胞内センサータンパク質）は、Ｃａｐ０構造である外因性（exogenous）ｍＲＮＡが体内に導入されるとき、２’ヒドロキシル基を認識して免疫炎症反応を誘導し、それにより、ｅｌＦ４Ｅに対するｍＲＮＡの結合を損傷させ、タンパク質発現を阻害する。なお、２’ＯＨがメチル化された外因性Ｃａｐ１ ｍＲＮＡは、体内導入されても、ＭＤＡ５による認識がなされないために、免疫反応を誘導せず、従って、相対的に高いタンパク質発現を誘導することができるために、臨床に適する。
【0005】
最近では、前述の活性ｍＲＮＡの５’末端の構造的特徴を基に、試験管内ｍＲＮＡ合成研究が活発に進められており、特に、５’キャッピング方法も、持続的に開発されている。試験管内ｍＲＮＡ合成において、５’キャッピングは、大きく見て、２つの方式に分けられる。伝統的なキャッピング方式（conventional capping method）でもって、試験管内転写後、５’キャッピングに関与する酵素、すなわち、「キャッピング酵素」と呼ばれる混合物を処理することにより、５’末端が７－メチルグアノシンでキャッピングされた構造（ｃａｐ０）を得る方式である。ここにおいて、ｃａｐ１ＲＮＡ構造またはｃａｐ２ｍＲＮＡ構造を作るために、ワクシニアｍＲＮＡ（ヌクレオシド－２’－Ｏ）メチルトランスフェラーゼのようなヌクレオチドの２’ヒドロキシル基をメチル化させることができる酵素を追加して処理しなければならない。そのような伝統的なキャッピング方式は、酵素単価、処理回数などにより、製造コストが高く、酵素反応制御が困難であるという短所がある。
【0006】
そのような伝統的なキャッピング方式の短所を克服するために、共同転写キャッピング方法（co-transcriptional capping method）が研究されている。共同転写キャッピング方法とは、試験管内ｍＲＮＡ合成時、化学的に合成されたキャップ類似体（cap analog）を同時に導入し、キャップ類似体が、５’末端を構成するｍＲＮＡを合成する方式を言う。該共同転写キャッピング方法は、１世代の二量体キャップ類似体ｍＣＡＰ（７ｍＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ）から始まり、３世代と呼ばれるTriLink社のトリヌクレオチドキャップ類似体であるCleancap（登録商標）（７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＮ（２’ＯＭｅ）ｐＮ）（特許文献２）まで、各世代が有する短所を補強し、進歩性を有しながら進化してきた。ｍＣＡＰの場合、伝統的なキャッピング方式に比べ、低い生産単価を有するが、５’ｃａｐ０ ｍＲＮＡ構造に限り、ＤＮＡテンプレートにｍＣＡＰが塩基対合（base pairing）を形成するとき、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）と競争的に作用するという短所を有している。ＧＴＰより優勢にＤＮＡテンプレートに塩基対合を行うためには、ＧＴＰ使用量の４倍から１０倍に達する量を入れなければならないために、生産単価を増大させる要因になる。それだけではなく、ジヌクレオチド形態であるｍＣＡＰは、逆結合が発生したりし、双方向転写開始が生じ、試験管内の順方向ｍＲＮＡ合成効率を下げるという問題点が生じた。
【0007】
そのような逆方向転写開始の問題点を解決するために、２世代キャップ類似体である反リバースキャップ類似体（anti-reverse cap analog）（ＡＲＣＡと呼ばれる）が開発された（特許文献１）。該ＡＲＣＡは、二量体である７ｍＧｐｐｐＧにおいて、７－メチルグアノシンの２’ヒドロキシル基または３’ヒドロキシル基のいずれか一方を、メトキシ基で置換した７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＧ構造または７ｍＧ（２’ＯＭｅ）ｐｐｐＧ構造をなしている二量体キャップ類似体であり、キャップ類似体の逆結合を防止し、逆方向転写開始を完全に遮断する（非特許文献１）。また、２’ヒドロキシル基または３’ヒドロキシル基のいずれか一つに化学的変形を与えた前記ＡＲＣＡは、２’と３’とがいずれもヒドロキシル基のキャップ類似体より、タンパク質発現効率が増大すると確認された。２’ヒドロキシル基と３’ヒドロキシル基との化学的変形は、位置に係わりなく、同等レベルのタンパク質発現効率を示している。しかしながら、該２世代キャップ類似体は、ＧＴＰと競争的塩基対合問題を解決することができなかった。逆方向に生成されるｍＲＮＡを抑制したが、ｐｐｐＧ５’末端を有するｍＲＮＡ不純物（uncapped ｍＲＮＡと言う）の生成したり、ＧＴＰ対比で、過量のキャップ類似体を投入したりしなければならない問題点が依然として残っていた。また、ＡＲＣＡを利用した試験管内ｍＲＮＡ合成は、ｃａｐ１構造を合成することができず、先天性免疫反応を誘導するという短所を有している。
【0008】
TriLink社で開発された３世代キャップ類似体であるCleancap（登録商標）の場合、トリヌクレオチド以上の構造において、Ｃａｐ１構造（７ｍＧｐｐｐＮ（２’ＯＭｅ）ｐＮ）を酵素として利用せず、試験管内合成が可能である。また、ＧＴＰに比べ、塩基が１以上さらに多く存在するために、転写開始時、ＤＮＡテンプレート鎖とさらに強く水素結合して塩基対合が可能であるので、試験管内ｍＲＮＡ合成時、キャップ類似体投入量を減らすことができる。現在のところ商用化されたCleancap（登録商標）である７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧの場合、７－メチルグアノシンの３’ヒドロキシル基をメチル化させたトリヌクレオチドキャップであり、タンパク質発現効率が、２’ヒドロキシルキャップ、３’ヒドロキシルキャップである７ｍＧｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧより向上された性能を示している。
【0009】
前述のCleancap（登録商標）構造（７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ）を基盤に商用化されたｍＲＮＡワクチンには、ファイザー・ビオンテックのＢＮＴ１６２ｂ２がある。該ＢＮＴ１６２ｂ２は、全世界的に大流行を起こしたＲＮＡウイルスである第２型重症急性呼吸器症侯群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）による感染病対応のために開発された。Cleancap（登録商標）を核心原料として製造されるＢＮＴ１６２ｂ２は、全世界的Ｃｏｖｉｄ－１９大流行に対応するための需要を賄いきれず、一時、原料供給不足事態に遭遇した。伝播力が強いＲＮＡウイルス感染病に適切な対応が可能であるｍＲＮＡワクチンの量産のためには、原料の迅速であって経済性ある生産及び供給が必要であり、そのうちにおいても、最も高い生産コストを占めるキャップ類似体の効率的な製造と、迅速な供給とのための多様な研究開発が追加してなされなければならない。
【0010】
現在のところ商用化されたTriLink社トリヌクレオチドキャップ類似体の製造工程について述べれば、下記のように、大きく見て、６段階に分けられている（特許文献２）。
【0011】
【化1】
【0012】
前記反応式１－１で、前記Ｇは、グアノシンを意味し、７ｍＧは、７－メチルグアノシンを意味し、Ｎは、アデノシン、シチジン、グアノシン、ユリジンのうちいずれか一つのものを意味し、ｐは、－Ｐ（＝Ｏ）Ｏ２－を意味し、Ｍｅは、メチルを意味し、Ｉｍは、イミダゾリドを意味する。さらに、細部的に見るとき、最終製造工程に使用される反応物であるｐＮ（２’ＯＭｅ）ｐＮを合成する段階まで含めるのであるならば、最小１０段階以上の長い工程を経なければならない。
【0013】
特に、そのようなTriLink社のキャップ類似体の量産時、全体製造工程において、生産コストと合成期間とを増大させる主要因は、製造工程の段階間に行わなければならないイオン交換クロマトグラフィ（主に、ＤＥＡＥレジン）を利用した精製段階である。各製造段階別に、その中間体を精製した後、有機溶媒において、以下の段階工程を進めるために、カラム精製に使用された大量の緩衝溶液（主に、重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ：triethylammonium bicarbonate）バッファ）を蒸留しなければならない。全体製造工程において、ｐＧ（３’ＯＭｅ）、ｐｐＧ（３’ＯＭｅ）、ｐｐ７ｍＧ（３’ＯＭｅ）、ｐＮ（２’ＯＭｅ）ｐＮ、７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＮ（２’ＯＭｅ）ｐＮの生成段階ごとに精製を行わなければならないので、総５回のイオン交換カラム精製が必要である。特に、Ｇ（３’ＯＭｅ）製造のためには、グアノシンヌクレオシドが有する３個のヒドロキシル基において、３’－ＯＨだけが、選択的にモノエーテル化される必要があり、また生成物において、３’－モノエーテル化生成物だけを精製する必要があり、出発物質であるｐＧ（３’ＯＭｅ）の製造原価が高いという問題がある。そのような、長い工程、カラム精製、及び緩衝溶液の蒸留過程は、キャップ類似体の製造に必要な時間及びコストを増大させ、経済性を低くする。
【0014】
それと共に、ＡＲＣＡとTriLink社キャップ類似体との製造のための出発物質である３’－メトキシグアノシン（Ｇ（３’ＯＭｅ））を準備するためには、２’ヒドロキシル基と３’ヒドロキシル基とにメチル化反応を誘導し、３’メトキシで置換されたモノエーテル物質だけを単離してこそ、得ることができる物質である。その一例として、ＡＲＣＡ発明において記載された３’－メトキシグアノシンの製造工程について述べれば、下記のように、３段階に分けられている（非特許文献１）。
【0015】
【化2】
【0016】
前述の毎段階ごとに、フラッシュクロマトグラフィまたはDowex １ Х ２イオン交換クロマトグラフィを進めなければならず、各段階の収率が低く、量産が困難であり、生産単価が高くなる要因になる。最近では、この３’－メトキシグアノシン合成効率を増大させるための研究開発がなされているが、工程段階が長くなったりして、依然として、３’メトキシで置換されたモノエーテル物質単離に困難に遭遇している。それは、キャップ類似体合成のための原材料費を高くする主要因になる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0017】
【特許文献1】米国特許番号７，０７４，５９６
【特許文献2】米国特許番号１０，９１３，７６８
【非特許文献】
【0018】
【非特許文献1】ＲＮＡ９：１１０８－１１２２（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0019】
一態様は、５’－キャッピングされたｍＲＮＡ分子の試験管内合成効率を高くすることができ、キャッピングされたｍＲＮＡのタンパク質発現効率を高くするだけではなく、キャップ類似体自体の経済的生産が可能なキャップ類似体を提供するものである。
【0020】
他の一態様は、前記キャップ類似体製造のための中間体製造方法を提供するものである。
【0021】
さらに他の一態様は、前記キャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡを提供するものである。
【0022】
さらに他の一態様は、前記キャップ類似体を利用し、ｍＲＮＡを製造する方法を提供するものである。
【0023】
さらに他の一態様は、前記キャップ類似体を含む、５’キャッピングされたｍＲＮＡ製造用組成物またはそのキットを提供するものである。
【0024】
さらに他の一態様は、前記キャップ類似体を含む、目的とするペプチド発現またはタンパク質発現のための薬学組成物を提供するものである。
【0025】
さらに他の一態様は、前記キャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡを含む細胞を提供するものである。
【0026】
さらに他の一態様は、前記キャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質またはペプチドを含む細胞を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【0027】
一態様は、下記化学式１の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を提供する：
【0028】
【化3】
【0029】
ここで、
ｎ＝０，１または２であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ただし、Ｒ１及びＲ２のうち少なくとも一つは、Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、Ｃ１～Ｃ６アルキルまたはＣ１～Ｃ６アルコキシであり、
Ｒ３は、メトキシ基であり、
Ｚ及びＺ’は、それぞれ独立して、天然窒素塩基である。
ｎ＝０，１または２であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ただし、Ｒ１及びＲ２のうち少なくとも一つは、Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、Ｃ１～Ｃ６アルキルまたはＣ１～Ｃ６アルコキシであり、
Ｒ３は、メトキシ基であり、
Ｚ及びＺ’は、それぞれ独立して、天然窒素塩基である。
【0030】
他の一態様は、下記化学式１ａ及び化学式１ｂの化合物を、０．６５±０．０５：１のモル比で含む水性組成物を提供する：
【0031】
【化4】
【0032】
【化5】
【0033】
ここで、Ｍ３においてそれぞれのＭは、互いに独立して存在しないか、あるいはＮａ＋、Ｌｉ＋、ＮＨ４＋及びＫ＋によって構成された群のうちから選択された一価陽イオン、またはＭｇ２＋、Ｚｎ２＋及びＣａ２＋によって構成された群のうちから選択された二価陽イオンであり、このとき、Ｍ３は、前記化合物が電気的中性になるように選択される。
【0034】
さらに他の一態様は、前記化学式１の化合物を含むキャップ類似体を提供する。
【0035】
さらに他の一態様は、前記キャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡを提供する。
【0036】
さらに他の一態様は、前記キャップ類似体を、ｍＲＮＡ合成の間に含めることを含む、ｍＲＮＡの製造方法を提供する。
【0037】
さらに他の一態様は、前記キャップ類似体を含む、５’キャッピングされたｍＲＮＡ製造用組成物またはそのキットを提供する。
【0038】
さらに他の一態様は、前記キャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含む、目的とするペプチド発現またはタンパク質発現のための薬学組成物を提供する。
【0039】
さらに他の一態様は、前記キャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡを含む細胞を提供する。
【0040】
さらに他の一態様は、前記キャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質またはペプチドを含む細胞を提供する。
【0041】
さらに他の一態様は、
下記化学式２の化合物またはその塩を、水相のアルカリ条件において、下記化学式３の化合物と反応させ、下記化学式４の化合物またはその塩を製造する段階と、
化学式４の化合物またはその塩を、インサイチュ方式でもって、ｐＨ１．５～４．５条件において、化学式５の化合物と反応させる段階と、を含む、下記化学式６の化合物またはその塩の製造方法を提供する：
下記化学式２の化合物またはその塩を、水相のアルカリ条件において、下記化学式３の化合物と反応させ、下記化学式４の化合物またはその塩を製造する段階と、
化学式４の化合物またはその塩を、インサイチュ方式でもって、ｐＨ１．５～４．５条件において、化学式５の化合物と反応させる段階と、を含む、下記化学式６の化合物またはその塩の製造方法を提供する：
【0042】
【化6】
【0043】
【化7】
【0044】
【化8】
【0045】
【化9】
【0046】
【化10】
【0047】
前記化学式において、Ｒは、Ｃ１～Ｃ６アルキルまたはＣ１～Ｃ６アルコキシを意味し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ただし、Ｒ１及びＲ２のうちいずれか一つは、Ｈであり、残りは、Ｃ（＝Ｏ）－Ｒである。
【発明の効果】
【0048】
一態様によるキャップ類似体は、TriLink社のトリヌクレオチドキャップ類似体（７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ）のように、特定位置にだけ選択的に保護基を導入する必要がなく、その選択的に導入された化合物を精製するする必要がなく、３’－メトキシグアノシン（３’－methoxy guanosine）のような高価の出発物質を必要とせず、製造工程も簡略にすることができるために、合成の効率性と経済性とが向上されながらも、ｍＲＮＡをキャッピングするとき、すぐれたレベルのキャッピングｍＲＮＡの発現効率を可能にすることができる長所を有する。
【0049】
そのように、前記キャップ類似体は、機能及び生産コストの側面において、すぐれた長所を有しており、本開示のキャップ類似体を含むｍＲＮＡは、ヒトを含む哺乳類の疾病を治療したり予防したりするのに、非常に有用に使用されうる。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1】本発明の一具体例による中間体化合物（実施例８）を製造した後、１Ｈ ＮＭＲ測定結果を示したグラフである。
【図2】本発明の一具体例による中間体化合物（実施例９）を製造した後、１Ｈ ＮＭＲ測定結果を示したグラフである。
【図3】本発明の一具体例による化合物（実施例１６の化合物）を製造した後、１Ｈ ＮＭＲ測定結果を示したグラフである。
【図4】本発明の一具体例による化合物（実施例１５または１６の化合物）、あるいは７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧをキャップ類似体として使用し、試験管内転写（ＩＶＴ）収率測定後、７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ対比の実施例１５または１６の化合物の相対的なＩＶＴ収率（％）を示したグラフである。
【図5】本発明の一具体例による化合物（実施例１５または１６の化合物）、あるいは７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧそれぞれのＩＶＴ反応によって生成されたｍＲＮＡの翻訳活性を、当該ｍＲＮＡをHeLa細胞株に形質感染させて測定した結果を、ルシフェラーゼ発現量でもって示した図である。
【図6】本発明の一具体例による化合物（実施例１５または１６の化合物）、あるいは７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧそれぞれのＩＶＴ反応によって生成されたｍＲＮＡの翻訳活性を、当該ｍＲＮＡを、HeLa細胞株に形質感染させた後、２４時間時の結果を測定した結果を、ルシフェラーゼ発現量でもって示した図である。
【発明を実施するための形態】
【0051】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
【0052】
本発明で使用される全ての技術用語は、取り立てて定義されない以上、本発明の関連分野において通常の当業者が一般的に理解するような意味に使用される。また、本明細書には、望ましい方法や試料が記載されるが、それと類似していたり、あるいはそれと同等であったりするものも、本発明の範疇に含まれる。また、本明細書に記載された数値は、明示せずとも、「約」の意味を含むものであると見なす。本明細書に参考文献として記載される全ての刊行物の内容は、全体が本明細書に参照として統合される。
【0053】
用語の定義
本願で使用されている下記用語は、取り立てての言及がなければ、下記において定義されているような意味で使用される。
本願で使用されている下記用語は、取り立てての言及がなければ、下記において定義されているような意味で使用される。
【0054】
キャップ類似体とＤＮＡテンプレートとの複合体の脈絡において、本願に使用されているような用語「相補的」または「相補性」は、標準ワトソン・クリック（Watson/Crick）塩基対形成規則を称する。例えば、配列「５’－Ａ－Ｇ－Ｔ－Ｃ－３’」は、配列「３’－Ｔ－Ｃ－Ａ－Ｇ－５’」に対して相補的である。相補性は、完璧な必要がなく、二重体（duplicate）は、ミスマッチされた塩基対、変性または非マッチのヌクレオチドを含むものでもある。通常の技術者であるならば、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレオチドの塩基組成及びその配列、ミスマッチされた塩基対の発生率、イオン強度、混成化緩衝剤の成分、並びに反応条件を含む数多くの変数を実験的に考慮し、二重体安定性を決定することができる。
【0055】
相補性、２個の核酸鎖のヌクレオチド塩基のいずれもが、公認された塩基対形成規則によってマッチングされる場合、「完全」または「全体」でもあり、キャップ類似体とＤＮＡ標的とのヌクレオチド塩基のうち一部だけが、公認された塩基対形成規則によってマッチングされる場合、「部分」でもあるか、あるいは２個の核酸鎖ヌクレオチド塩基のうち、いずれも公認された塩基対形成規則によってマッチングされていない場合、「不在」でもある。
【0056】
本願に使用されているような用語「窒素塩基」は、天然に生じる全ての窒素塩基を含む。天然に生じる窒素塩基において、最も頻繁に見出される塩基環は、プリン環及びピリミジン環である。天然に生じるプリン環は、例えば、アデニン、グアニン及びＮ６－メチルアデニンを含む。天然に生じるピリミジン環は、例えば、シトシン、チミン、５－メチルシトシン、ウラシルを含む。天然に生じるヌクレオシドは、例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、ウリジン、イノシン、７－メチルグアノシンまたはウリジンのリボ誘導体、２’－Ｏ－メチル誘導体、あるいは２’－デオキシリボ誘導体を含むが、それらに限定されるものではない。
【0057】
用語「Ｃ１－Ｃｎアルキル」は、線状または分枝状の飽和された炭素１個ないし炭素ｎ個の炭化水素ラジカル鎖を意味する。具体的な例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｎ－ヘキシルなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【0058】
用語「Ｃ１－Ｃｎアルコキシ」は、酸素と結合された、線状または分枝状の飽和された炭素１個ないし炭素ｎ個の炭化水素ラジカル鎖を意味する。具体的な例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソブトキシ、ｎ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔ－ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
【0059】
物質の合成過程において、「インサイチュ（in situ）方式」とは、得られた生成物を追加の精製過程なしに、そのまま本来の容器内において、以下の段階の反応を行うことを意味する。
【0060】
一態様は、下記化学式１の構造を有する化合物に係わるものである：
【0061】
【化11】
【0062】
ここで、
ｎ＝０，１または２であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ただし、Ｒ１及びＲ２のうち少なくとも一つは、Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、Ｃ１－Ｃ６アルキルまたはＣ１－Ｃ６アルコキシであり、
Ｒ３は、メトキシ基であり、
Ｚ及びＺ’は、それぞれ独立して、天然窒素塩基である。
ｎ＝０，１または２であり、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ただし、Ｒ１及びＲ２のうち少なくとも一つは、Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、Ｃ１－Ｃ６アルキルまたはＣ１－Ｃ６アルコキシであり、
Ｒ３は、メトキシ基であり、
Ｚ及びＺ’は、それぞれ独立して、天然窒素塩基である。
【0063】
前述の薬学的に許容可能な塩は、医薬分野で一般的に使用される塩を意味し、具体的には、塩基付加塩でもある。前記塩には、例えば、一価金属塩、二価金属塩、アミン塩またはアミノ酸塩などがある。前記一価金属塩には、Ｎａ塩、Ｌｉ塩またはＫ塩などがあり、前記二価金属塩には、Ｃａ塩、Ｚｎ塩またはＭｇ塩などがあり、前記アミン塩には、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、アンモニア塩、ピリジン塩またはピコリン塩などがあり、前記アミノ酸塩には、アルギニン塩、リシン塩またはヒスチジン塩などがあるが、それらに制限されるものではない。
【0064】
前述の薬学的に許容可能な塩は、化学式１の化合物が、水性液状において、電気的中性である安定した形態をなすようにする塩の形態でもある。
【0065】
前記化学式１の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩は、例えば、下記化学式１Ａの化合物でもある：
【0066】
【化12】
【0067】
ここで、
ｎ＝０，１または２であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、それぞれ独立して、存在しないか、あるいは一価陽イオン、二価陽イオン、またはそれらの組み合わせであり、このとき、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、化学式１Ａの化合物が電気的中性になるように選択され、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ただし、Ｒ１及びＲ２のうち少なくとも一つは、Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、Ｃ１～Ｃ６アルキルまたはＣ１～Ｃ６アルコキシであり、
Ｒ３は、メトキシ基であり、
Ｚ及びＺ’は、それぞれ独立して、天然窒素塩基である。
ｎ＝０，１または２であり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、それぞれ独立して、存在しないか、あるいは一価陽イオン、二価陽イオン、またはそれらの組み合わせであり、このとき、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、化学式１Ａの化合物が電気的中性になるように選択され、
Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ただし、Ｒ１及びＲ２のうち少なくとも一つは、Ｃ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ここで、Ｒ’は、Ｃ１～Ｃ６アルキルまたはＣ１～Ｃ６アルコキシであり、
Ｒ３は、メトキシ基であり、
Ｚ及びＺ’は、それぞれ独立して、天然窒素塩基である。
【0068】
一具体例において、前記一価陽イオンは、Ｎａ＋、Ｌｉ＋、ＮＨ４＋及びＫ＋によって構成された群のうちから選択され、前記二価陽イオンは、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋及びＣａ２＋によって構成された群のうちから選択される。
【0069】
一具体例において、前記Ｒ’は、Ｃ２－Ｃ６アルキルまたはＣ２－Ｃ６アルコキシである化合物である。
【0070】
一具体例において、前記Ｒ’は、メチル、エチル、イソプロピル、イソプロポキシ、ｔ－ブチルまたはｔ－ブトキシである。
【0071】
一具体例において、前記化学式１においてＺ及びＺ’は、それぞれ独立して、天然のプリン塩基モイエティ形態またはピリミジン塩基モイエティ形態である。さらに具体的には、前述のＺ及びＺ’は、それぞれ独立して、グアニン、アデニン、シトシン、チミン及びウラシルによってなる群のうちから選択されうる。一具体例において、前述のＺ及びＺ’は、それぞれアデニン及びグアニンである。
【0072】
一具体例において、前記化学式１において、Ｒ１及びＲ２のうち一つだけＣ（＝Ｏ）－Ｒ’を有する場合、グアノシンの２’位置または３’位置に存在する構造異性体が、互いに動的平衡をなす混合物の形態で存在しうる。動的平衡をなす各構造異性体の比率（すなわち、２’位置に、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’が存在する異性体：３’位置に、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’が存在する異性体）は、具体的な化合物の構造によっても異なり、また周囲環境（例：温度、ｐＨ）によっても異なる。
【0073】
一具体例において、前記化学式１の化合物は、下記表１に列挙された化合物によってなる群のうちから選択された化合物、またはその薬学的に許容可能なである：
【0074】
表１
【表1-1】
【0075】
【表1-2】
【0076】
【表1-3】
【0077】
【表1-4】
【0078】
前記化合物名において、前記Ｇは、グアノシンを意味し、７ｍＧは、７－メチルグアノシンを意味し、Ａは、アデノシンを意味し、ｐは、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）Ｏ－、Ｍｅは、メチルを意味する。他の一態様は、下記化学式１ａ及び化学式１ｂの化合物を、０．６５±０．０５：１のモル比で含む水性組成物を提供する：
【0079】
【化13】
【0080】
【化14】
【0081】
ここで、Ｍ３においてそれぞれのＭは、互いに独立して存在しないか、あるいはＮａ＋、Ｌｉ＋、ＮＨ４＋及びＫ＋によって構成された群のうちから選択された一価陽イオン、またはＭｇ２＋、Ｚｎ２＋及びＣａ２＋によって構成された群のうちから選択された二価陽イオンであり、このとき、Ｍ３は、前記化合物が電気的中性になるように選択される。例えば、Ｍ３は、３つのＭがいずれもＮＨ４＋でもあり、Ｍ３のうち１つのＭは、Ｃａ２＋であり、１つのＭは、Ｋ＋であり、１つのＭは、不存在である場合を示しうる。一具体例において、前記Ｍ３のうちそれぞれのＭは、いずれもＮａ＋である。
【0082】
一具体例において、前記水性組成物のｐＨは１．０ないし８．０である。
【0083】
前記化学式１ａ及び化学式１ｂの化合物は、例えば、２５℃±５、ｐＨ１．０～８．０の水性組成物の中において、０．６５±０．０５：１のモル比の混合物として存在しうる。
【0084】
前記化学式１の化合物は、例えば、下記実施例で例示された方法によって製造されうる。通常の技術者であるならば、下記実施例の例示された方法を適切に変形し、反応条件、反応順序、反応化合物を変形させ、前記化合物を製造することもできる。
【0085】
前記化学式１の化合物の実施例に例示された製造方法は、簡略にするための略語でもって表示するのである。
【0086】
【化15】
【0087】
前記反応式２で、前記Ｇは、グアノシンであり、７ｍＧは、７－メチルグアノシンであり、Ｎは、グアニン、アデニン、シトシン、ウラシルのうちいずれか一つであり、ｐは、－Ｐ（＝Ｏ）Ｏ２－であり、Ｒ’は、Ｃ１～Ｃ６アルキルまたはＣ１～Ｃ６アルコキシであり、Ｉｍは、イミダゾリドである。前記化学式１の化合物の製造方法において、中間体ｐ７ｍＧ（２’ and／or ３’ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’）及びｐｐ７ｍＧ（２’ and／or ３’ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’）の合成は、それぞれインサイチュでなされうる。
【0088】
前記中間体ｐ７ｍＧ（２’ and／or ３’ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’）において、モノエステルである中間体ｐ７ｍＧ（２’ or ３’ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’）の製造方法として、一具体例は、
【0089】
下記化学式２の化合物またはその塩を、水相のアルカリ条件において、下記化学式３の化合物と反応させ、下記化学式４の化合物またはその塩を製造する段階と、
【0090】
化学式４の化合物またはその塩を、インサイチュ方式でもって、ｐＨ１．５～４．５条件において、化学式５の化合物と反応させる段階と、を含む。
【0091】
下記化学式６の化合物（ｐ７ｍＧ（２’ or ３’ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’）に該当する）またはその塩の製造方法を提供する：
【0092】
【化16】
【0093】
【化17】
【0094】
【化18】
【0095】
【化19】
【0096】
【化20】
【0097】
前記化学式において、Ｒは、Ｃ１～Ｃ６アルキルまたはＣ１～Ｃ６アルコキシを意味し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ（＝Ｏ）－Ｒ’であり、ただし、Ｒ１及びＲ２のうちいずれか一つは、Ｈであり、残りは、Ｃ（＝Ｏ）－Ｒである。
【0098】
一実施形態において、前記アルカリ条件は、具体的には、ｐＨ９．５～１１．５でもあり、例えば、水酸化ナトリウムを利用して形成されうる。一実施形態において、弱酸性条件である前記ｐＨ１．５～４．５は、例えば、酢酸を利用して形成されうる。
【0099】
前記中間体ｐｐ７ｍＧ（２’ and／or ３’ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’）において、モノエステルである中間体ｐｐ７ｍＧ（２’ or ３’ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’）の製造方法として、一具体例は、
前記化学式６の化合物またはその塩をイミダゾールと反応させ、下記化学式７の化合物またはその塩を製造する段階と、
化学式７の化合物またはその塩を、インサイチュ方式でもって、塩化亜鉛及びトリエチルアンモニウムリン酸塩と反応させる段階と、を含む、
下記化学式８の化合物（ｐｐ７ｍＧ（２’ or ３’ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’）に該当する）またはその塩の製造方法を提供する：
前記化学式６の化合物またはその塩をイミダゾールと反応させ、下記化学式７の化合物またはその塩を製造する段階と、
化学式７の化合物またはその塩を、インサイチュ方式でもって、塩化亜鉛及びトリエチルアンモニウムリン酸塩と反応させる段階と、を含む、
下記化学式８の化合物（ｐｐ７ｍＧ（２’ or ３’ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’）に該当する）またはその塩の製造方法を提供する：
【0100】
【化21】
【0101】
【化22】
【0102】
前記化学式において、Ｒは、Ｃ１～Ｃ６アルキルまたはＣ１～Ｃ６アルコキシを意味し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、ＨまたはＣ（＝Ｏ）－Ｒであり、ただし、Ｒ１及びＲ２のうちいずれか一つは、Ｈであり、残りは、Ｃ（＝Ｏ）－Ｒである。
【0103】
前記化学式７の化合物またはその塩を製造する段階においては、イミダゾールと共に、トリフェニルホスフィン、２，２－ジピリジルジスルフィド及びトリエチルアミンが、イミダゾールカップリングの一助となる活性化試薬として共に反応されうる。
【0104】
前記化学式１の化合物の一具体例は、代表的なものとして、下記反応式３に示された方法によって製造されうる。
【0105】
【化23】
【0106】
前記反応式３において、「２’isomer」は、３’位置のピバロイル基が、３’位置の代わりに、２’位置に存在する２’構造異性体を意味し、「＋２’ isomer」は、２’構造異性体が共に存在する混合物であるものを意味する。
【0107】
前記反応式３の例示的な具体的な製造方法の詳細は、下記実施例に説明されている。
【0108】
前記反応式３は、簡略にするための略語で表示されうる。
【0109】
【化24】
【0110】
ここで、前記Ｇは、グアノシンを意味し、７ｍＧは、７－メチルグアノシンを意味し、Ａは、アデノシンを意味し、ｐは、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）Ｏ－を意味し、Ｍｅは、メチルを意味し、Ｉｍは、イミダゾリドを意味する。
【0111】
前記反応式２及び３に表示された製造方法は、グアノシンのモノエステル化（または、ジエステル化）と７－メチル化との過程を、インサイチュ方式でもって進め、ｐ７ｍＧ（２’ and／or ３’ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’）を製造し、７－メチルグアノシン二リン酸塩（ｐｐ７ｍＧ（２’ and／or ３’ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’））製造工程も、イミダゾリド化と二リン酸化とを、インサイチュ方式でもって短縮させ、７－メチルグアノシン二リン酸塩（ｐｐ７ｍＧ（２’ and／or ３’ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’））までの合成段階を、従来のTriLink社のトリヌクレオチドキャップ類似体製法（下記［反応式１－１］の方法）に比べ、２段階短縮させうる。
【0112】
すなわち、化学式１の化合物を、総４段階によって製造することができ、各段階後に精製を行った後、その次の段階を遂行することができる。従って、４回の精製過程が必要である。それは、従来のTriLink社の商用化されたキャップ類似体の製法が、５回の中間体精製過程が必要であるところに比べ、精製回数が１回減少されたものである。従って、化学式１の化合物は、従来公知されたキャップ類似体製造方法に比べ、工程の回数、及び精製の回数が減り、さらに経済的に製造されうる。
【0113】
前記精製方法は、各段階別に独立し、イオンクロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィなどを介して行われうる。一具体例において、前記精製方法は、逆相クロマトグラフィである。
【0114】
また、従来の２世代キャップ類似体または３世代キャップ類似体の場合、キャップ類似体製造に係わる純粋原料費において、最も多くのコストを占める部分は、出発物質である３’－Ｏ－メチルグアノシンヌクレオシド（Ｇ（３’ＯＭｅ））原料の単価であるが、それは、グアノシンヌクレオシドが有する３個のヒドロキシル基のうち３’ヒドロキシルだけ選択的にメチル化を誘導しなければならない困難な工程過程を経なければならず、３’モノエステル化生成物のみを選択的に精製しなければならない精製過程を経なければならないためである。それに反し、前記化学式１の化合物は、単価が廉価なグアノシン一リン酸を出発物質として使用して製造されうる。具体的に説明すれば、２’位置または３’位置に、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’を一つだけ有するモノエステル形態を有する一具体例による前記化学式１の化合物の場合は、グアノシン一リン酸の２’または３’のヒドロキシ基を、自発的に－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’で置換する反応を導入し、２’または３’のうちいずれか一方だけで反応が進められるようにして製造されうる。すなわち、３’に選択的に反応が進められるように努力する必要がない。さらに、２’位置または３’位置に、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’を一つだけ有するモノエステル形態は、化学式１の化合物は、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ’が、２’位置または３’位置に存在する構造異性体が、互いに動的平衡を有する混合物の形態を維持することになる。従って、ある一構造異性体だけみを精製する必要もない。言い換えれば、特定位置のヒドロキシルだけ選択的にエステル化する困難な工程過程を経る必要もなく、その特定モノエステル化生成物のみを選択的に精製しなければならない精製過程も必要ない。結果として、低い単価の出発物質を使用し、目的とする化学式１の化合物を製造することができるので、製造コストを顕著に節減させうる。
【0115】
また、前記モノエステル形態の化学式１の化合物であり、キャッピングされたｍＲＮＡは、タンパク質発現効率が、従来のTriLink社のトリヌクレオチド３’－メトキシキャップ類似体（７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ）でキャッピングされる場合よりも高いという点においても、終局的に、タンパク質合成に必要なコストを節減させうる。
【0116】
前記モノエステル形態の化学式１化合物以外に、化学式１の化合物の他の実施形態である２’－ＯＨと３’－ＯＨとのいずれもがエステル化されたジエステル形態の化学式１の化合物も、目的生成物がジエステル化物であるので、選択的な位置におけるモノエステル化、及びそのモノエステル化物の分離精製なしに製造されうるという利点がある。
【0117】
結局、従来のキャップ類似体製造のための出発物質である３’－Ｏ－メチルグアノシンヌクレオシドは、本願発明のキャップ類似体の製造のための出発物質であるグアノシン一リン酸に比べ、ｋｇ当たりの価格が３８０倍ほど高いということを勘案すれば、化学式１の化合物は、従来のキャップ類似体化合物に比べ、顕著に高い経済性でもって製造されうる。
【0118】
前述のように、化学式１の化合物であるキャップ類似体は、従来のTriLink社のトリヌクレオチドキャップ類似体に比べ、合成段階及び精製回数の低減を介し、時間及びコストの側面において経済的に製造しうる。また、前記精製過程は、逆相カラムによって遂行され、該逆相カラムは、従来のイオン交換カラムに比べて効率的であるために、逆相カラム精製過程も、前記化学式１の化合物製法の経済性にさらに寄与しうる。さらには、さらに具体的に説明すれば、以下の通りである。
【0119】
前記化学式１の化合物の製造方法の一具体例においては、原料が廉価であり、需給が容易なグアノシン一リン酸ナトリウム塩を出発物質として使用し、グアノシンのモノエステル化と７－メチル化との過程を、インサイチュ方式でもって進め、ｐ７ｍＧ（２’ or ３’ monopivalic）を得て、７－メチルグアノシン二リン酸塩（ｐｐ７ｍＧ（２’ or ３’ monopivalic））製造工程も、イミダゾリド化と二リン酸化とをインサイチュでもって短縮させ、７－メチルグアノシン二リン酸塩（ｐｐ７ｍＧ（２’ or ３’ monopivalic））までの合成段階を、従来のTriLink社のトリヌクレオチドキャップ類似体製法（下記［反応式１－１］の方法）に比べ、２段階短縮させうる。
【0120】
【化25】
【0121】
また、TriLink社のトリヌクレオチドキャップ類似体７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＮ（２’ＯＭｅ）ｐＮの製造方法は、前記反応式１－１において、総５回のイオン交換カラム精製を経なければならない一方（精製対象：ｐＧ（３’ＯＭｅ）、ｐｐＧ（３’ＯＭｅ）、ｐｐ７ｍＧ（３’ＯＭｅ）、ｐＮ（２’ＯＭｅ）ｐＮ、７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＮ（２’ＯＭｅ）ｐＮ）（米国特許１０，９１３，、７６８参照）、前記化学式１の化合物は、前記反応式２（精製対象：ｐ７ｍＧ（２’ and／or ３’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｒ’）、ｐｐ７ｍＧ（２’ and／or ３’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｒ’）、ｐＮ（２’ＯＭｅ）ｐＮ、７ｍＧ（２’ and／or ３’Ｃ（＝Ｏ）Ｏ－Ｒ’）ｐｐｐＮ（２’ＯＭｅ）ｐＮ）において、総４回の逆相カラム精製を介して製造しうる。すなわち、全体工程において、総精製回数が１回減少されうる。また、従来のキャップ類似体合成法は、各段階における生成物が、イオン交換カラム精製を経なければならない一方、本願の化学式１の化合物の合成法は、各段階における生成物を、同一体積のイオン交換カラムに比べ、カラム体積当たり１回精製対象物の注入量が１０倍ほど多い逆相カラムだけで精製が可能である。従って、化学式１の化合物の製法は、バッファに使用されるトリエチルアミン、レジンなどの精製のための原料コストを、６０～８０％ほど節減させることができる。それは、前記化学式１の化合物の製法においては、７－メチルグアノシンの極性度が高い２’ヒドロキシル基または３’ヒドロキシル基を、非極性度が高いアルキルエステル基またはアルコキシエステル基で置換して反応がなされ、それにより、各段階別生成物の非極性度が増大され、従来のキャップ類似体の製造段階別生成物が、イオン化程度により、イオンカラムで分離されならなければならなかった工程の代わりに、逆相カラムにおいて、非極性度による分離が可能になったためである。
【0122】
前記化学式１の化合物は、試験管内ｍＲＮＡの合成時、ｍＲＮＡの５’キャッピングのためのキャップ類似体として使用されうる。すなわち、試験管内ｍＲＮＡの合成時、キャップ類似体として、化学式１の化合物を同時に導入し、５’末端が、キャップ類似体で構成されたｍＲＮＡを合成しうる。
【0123】
他の一態様は、前記化学式１の化合物を含むキャップ類似体を提供する。
【0124】
具体的には、前記キャップ類似体は、前記化学式１の化合物自体でもあり、前記化学式１の化合物に加え、開始部位において、ＤＮＡテンプレート上の配列につき、相補的な混成化配列を追加して含むものでもある。本願に提供された方法及び組成物に使用するためのキャップ類似体の混成化配列の長さは、テンプレートヌクレオチド配列の実体、及びそのようなプライマーが、ＤＮＡテンプレートと混成化されるか、あるいは試験管内転写の間に使用される温度を含むいくつかの要因に左右される。転写に使用するためのキャップ類似体の混成化ヌクレオチド配列の目的とする長さは、当該技術分野の通常の技術者が、一般的な実験によって容易に決定することができる。例えば、混成化ヌクレオチドの長さは、目的とする混成化の特異性または選択性に基づいて決定されうる。
【0125】
一具体例において、キャップ類似体のヌクレオチド長（キャップを含む）は、約３個ないし約９個であり、さらに具体的には、約３個ないし約７個であり、さらに一層具体的には、約３個ないし約５個である。一具体例において、前記キャップ類似体のヌクレオチド長は、３個である。キャップ類似体内の混成化配列の長さは、キャップ類似体の全体長と同一であるか、あるいはそれよりもさらに短いのである。
【0126】
前記キャップ類似体を利用し、５’キャッピングされたｍＲＮＡを製造しうる。
【0127】
従って、一特定態様は、前記化学式１の化合物を含むキャップ類似体を、ｍＲＮＡ合成間に含めることを含む、５’キャッピングされたｍＲＮＡの製造方法を提供する。
【0128】
また、一特定態様は、前記化学式１の化合物を含むキャップ類似体を含む、５’キャッピングされたｍＲＮＡ製造用組成物またはそのキットを提供する。
【0129】
また、一特定態様は、前記化学式１の化合物を含むキャップ類似体を、ｍＲＮＡの合成に使用するための用途を提供する。
【0130】
また、一特定態様は、前記化学式１の化合物を含むキャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡを提供する。
【0131】
前記化学式１の化合物を含むキャップ類似体を使用し、５’キャッピングされたｍＲＮＡを製造する方法は、当該技術分野に公知された任意の方法によって遂行されうる。
【0132】
一具体例において、５’キャッピングされたｍＲＮＡは、試験管内ｍＲＮＡの合成時、化学的に合成されたキャップ類似体を同時に導入し、キャップ類似体が５’末端を構成するｍＲＮＡ合成方法である共同転写キャッピング法によって製造されうる。具体的には、化学式１の化合物であるキャップ類似体を、ポリヌクレオチドテンプレートのＲＮＡポリメラーゼによって転写がなされる条件下において、ＲＮＡポリメラーゼを含む混合物内に導入する段階と、その混合物を、前記テンプレートの転写を許容するのに十分な時間の間、インキュベーションする段階と、を含むものでもある。
【0133】
前述の一態様による化学式１の化合物を含むキャップ類似体は、標準ＧＴＰ，ＡＴＰ，ＣＴＰまたはＵＴＰを利用する開始の効能と比較し、試験管内ｍＲＮＡの転写効率を増大させ、その後、翻訳過程において転写されたキャッピングされたｍＲＮＡのタンパク質発現効率を増大させうる。前記転写効率の増強により、一般的な方法でもってｍＲＮＡを合成するところに比べ、ｍＲＮＡの合成が、例えば、約１０％、約２０％、約４０％、約６０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％または約５００％ほど増大されうる。
【0134】
前記一態様による化学式１の化合物を含むキャップ類似体は、５’キャッピングされたｍＲＮＡ分子のタンパク質発現量を、従来のTriLink社のトリヌクレオチド３’－メトキシキャップ類似体（７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ）より高いレベルで増大させうる。さらに具体的には、化学式１の化合物において、２’または３’のＯＨ残基のうちいずれか一方だけがモノエステル化されたキャップ類似体が、従来のTriLink社のトリヌクレオチド３’－メトキシキャップ類似体（７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ）に比べ、５’キャッピングされたｍＲＮＡ分子のタンパク質発現量を顕著にさらに高いレベルに増大させうる（実験例２参照）。
【0135】
従って、一態様による化学式１の化合物を含むキャップ類似体は、３世代キャップ類似体と同等であるか、あるいはそれ以上のタンパク質発現効率を有し、キャップ類似体自体の製造工程及び精製工程の数を減らし、精製効率を高くすることができ、製造単価を低くすることができるという長所を有する。
【0136】
一具体例において、５’キャッピングされたｍＲＮＡを製造する方法は、変形された少なくとも１以上のＮＴＰ（nucleoside triphosphate）を、転写反応に追加して付加することができる。前述の少なくとも１つの変形されたＮＴＰの変形は、ｍＲＮＡのＲＮＡポリメラーゼ媒介された合成を、実質的に損傷させない。前述の変形されたＮＴＰは、例えば、１以上の変形されたヌクレオシド塩基、１以上の変形された糖、１以上の変形された５’－トリホスフェートを含むものでもある。そのように変形されたＮＴＰは、キャップ類似体の３’末端上に混入され、それは、転写を遮断せず、プライマーの追加の伸長を支援する。前述の変形されたＮＴＰの変形基は、検出可能な標識、または検出可能なマーカーでもある。従って、転写後、検出可能な標識またはマーカーを含む製造されたｍＲＮＡは、大きさ、質量、色相及び／または親和性捕獲によって確認されうる。一具体例において、前記検出可能な標識またはマーカーは、蛍光染料であり、親和性捕獲標識は、ビオチンである。
【0137】
一具体例において、転写反応の１以上の構成要素（キャップ類似体及び／またはＮＴＰ）は、検出可能な標識またはマーカーでもって標識させうる。従って、転写後、ｍＲＮＡ分子は、例えば、大きさ、質量、親和性捕獲または色相によって確認されうる。例えば、前述の検出可能な標識は、蛍光染料であり、親和性捕獲標識は、ビオチンである。
【0138】
前述の５’キャッピングされたｍＲＮＡ製造用キットまたはその組成物は、通常のｍＲＮＡ合成のための全ての転写試薬（例えば、ＦＬｕｃ ｍＲＮＡ）を含むものでもある。さらに具体的には、前記キットは、類似体；転写用に表示された容器；ｍＲＮＡ合成を行うためのマニュアル；１以上の非変形のＮＴＰ、１以上の変形されたＮＴＰ（例えば、メチルシュードウリジン５’－トリホスフェート）、ＲＮＡポリメラーゼ、他の酵素、反応緩衝剤、マグネシウム、及びＤＮＡテンプレートによってなる群から選択された１以上の試薬を含むものでもある。
【0139】
一態様によるキャップ類似体を利用して製造された５’キャッピングされたｍＲＮＡは、その構造内に前記キャップ類似体を含み、前記５’キャッピングされたｍＲＮＡを生体に投与し、生体内においてタンパク質を発現させるのに使用されうる。
【0140】
従って、さらに他の一態様は、前記キャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡを生体内に投与し、生体内において、目的とするペプチド発現またはタンパク質発現を行う方法を提供する。
【0141】
また、他の一態様は、前記キャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡ、及び薬学的に許容される担体を含む、目的とするペプチド発現またはタンパク質発現のための薬学組成物を提供する。
【0142】
前述の目的とするペプチドまたはタンパク質の種類により、生体内において目的とする疾病の治療効果または予防効果を獲得しうる。従って、ペプチドまたはタンパク質の発現による治療または予防が可能な任意の疾病の治療または予防に使用されうる。特定のペプチドまたはタンパク質の種類の発現により、治療または予防が可能な疾病が公知されており、前記薬学組成物を利用し、前記ペプチドまたは前記タンパク質の発現を誘発させ、目的とする疾病の予防または治療に使用されうる。
【0143】
また、他の一態様は、前記キャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡを、ペプチドまたはタンパク質の生体内発現により、効果がある任意の疾病の予防または治療に使用するための医薬用途を提供する。
【0144】
前記薬学組成物、及び治療方法または予防方法は、遺伝子代替治療（gene replacement therapy）、ゲノム編集（genome editing）、免疫抗癌療法（cancer immunotherapy）、またはワクチンを利用した治療または予防などに使用されうる。一具体例において、前記薬学組成物は、ｍＲＮＡワクチンである。
【0145】
前記薬学組成物は、注射による投与、または特定の病態を治療または予防するために関連技術分野の通常の技術者に公知された他の適切な経路による投与用に剤形化されうる。注射可能な組成物は、薬学的に許容される担体として、例えば、滅菌生理食塩水を含む。注射可能な組成物はまた、脂質内またはリン脂質内の懸濁液剤、リポソーム懸濁液剤、または水性エマルジョンとして剤形化されうる。前述の薬学組成物を剤形化する方法は、当該技術分野で通常の知識を有する者に広く公知されている。
【0146】
一具体例において、前記薬学組成物は、活性成分である前記キャップ類似体を含むｍＲＮＡを、約０．０１％ないし１％の濃度で含むものでもある。前記濃度は、投与頻度、投与用量、投与方法などによっても異なる。
【0147】
一具体例において、前記薬学組成物は、哺乳類、具体的には、ヒトに投与することができ、その投与量は、個体の健康状態、疾病の重症度、体重、年齢、人種などによっても異なり、当該技術分野における専門家が、適切な投与量を決定することができる。一具体例において、ヒトに対する投与量は、０．０００１ないし１００ｍｇ／日の範囲内であり、さらに具体的には、約０．１ないし５０ｍｇ／日の範囲内である。
【0148】
前記一態様によるキャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡは、生体内またはインビトロ（in vitro）において細胞に導入され、タンパク質またはペプチドを発現しうる。
【0149】
従って、他の一態様は、前述の一態様によるキャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡを含む細胞を提供する。
【0150】
さらに他の一態様は、前記一態様によるキャップ類似体でもって、５’キャッピングされたｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質またはペプチドを含む細胞を提供する。
【0151】
前記ｍＲＮＡを利用し、生体内または生体外において、細胞内でタンパク質またはペプチドを発現させる方法は、当該技術分野に公知されており、そのような従来の一般的な方法により、適切に細胞内において、タンパク質またはペプチドを発現させうる。
【実施例】
【0152】
以下、本発明の理解の一助とするために、実施例を提示する。下記実施例は、本発明を例示するものであるのみ、本発明の範疇内及び技術思想範囲内において、多様な変更及び修正が可能であるということは、当業者において明白なことであり、そのような変更及び修正は、添付された特許請求の範囲に属するということは、言うまでもないのである。
【0153】
略語の説明
以下で使用される略語は、以下の通りである：
ＴＢＳＣｌ：塩化ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル
ＤＭＡＰ：４－ジメチルアミノピリジン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＴＥＰ：トリエチルホスフェート
ＤＰＳ：２，２’－ジピリジルジスルフィド
ＰＰｈ３：トリフェニルホスフィン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳ：ジメチルスルフェート
ＰＷ：純水
ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＣＡ：卜リクロロ酢酸
ＩＶＴ：試験管内転写
以下で使用される略語は、以下の通りである：
ＴＢＳＣｌ：塩化ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル
ＤＭＡＰ：４－ジメチルアミノピリジン
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＴＥＰ：トリエチルホスフェート
ＤＰＳ：２，２’－ジピリジルジスルフィド
ＰＰｈ３：トリフェニルホスフィン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳ：ジメチルスルフェート
ＰＷ：純水
ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＣＡ：卜リクロロ酢酸
ＩＶＴ：試験管内転写
【0154】
実施例１ないし７：７－メチル－２’，３’－ピバロイル－グアノシン５’－二リン酸塩イミダゾリド（ｉｍ－ｐｐ７ｍＧ（２’，３’ pivaloyl））（７）の製造
【0155】
【化26】
【0156】
実施例１：５’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－グアノシン（１）の製造
グアノシン２０ｇ（７０．６ｍｍｏｌ）を、ジメチルスルホキシド２００ｍｌに溶解させた後、窒素下において、トリエチルアミン２１．６ｇ（１５５．４ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルクロリド２１．２ｇ（１４１．２ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン８６０ｍｇ（７ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２４時間撹拌した後、０～５℃の蒸留水に徐々に滴加して生成された沈殿物を濾過した。濾過された沈殿物を、フラッシュカラムクロマトグラフィを利用して精製し、目的化合物２４．４ｇ（８７％）（１）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD, 25℃): δ= 7.96 (s, 1H), 5.89 (d, 1H), 4.47 (t, 1H), 4.33 (t, 1H), 4.08 (m, 1H), 3.94 ~ 3.87 (m, 2H), 0.94 (m, 9H), 0.12 (m, 6H)
グアノシン２０ｇ（７０．６ｍｍｏｌ）を、ジメチルスルホキシド２００ｍｌに溶解させた後、窒素下において、トリエチルアミン２１．６ｇ（１５５．４ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリルクロリド２１．２ｇ（１４１．２ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン８６０ｍｇ（７ｍｍｏｌ）を添加した。室温で２４時間撹拌した後、０～５℃の蒸留水に徐々に滴加して生成された沈殿物を濾過した。濾過された沈殿物を、フラッシュカラムクロマトグラフィを利用して精製し、目的化合物２４．４ｇ（８７％）（１）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD, 25℃): δ= 7.96 (s, 1H), 5.89 (d, 1H), 4.47 (t, 1H), 4.33 (t, 1H), 4.08 (m, 1H), 3.94 ~ 3.87 (m, 2H), 0.94 (m, 9H), 0.12 (m, 6H)
【0157】
実施例２：２’，３’－ピバロイル－５’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－グアノシン（２）の製造
５’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－グアノシン１０ｇ（２５．２ｍｍｏｌ）（１）を、無水ピリジン１００ｍｌに溶かし、ピバル酸無水物２３．４ｇ（１２５．６ｍｍｏｌ）を添加して室温で撹拌した。反応完結後、酢酸エチル５００ｍｌを投入し、飽和重曹水溶液４００ｍｌ、２０％クエン酸４００ｍｌで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧蒸留した。フラッシュカラムクロマトグラフィを利用し、目的化合物１０．２６ｇ（７２％）（２）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 25℃): δ= 10.70 (s, 1H), 7.83 (d, 1H), 6.51 (br, 2H), 5.93 (d, 1H), 5.69 (m, 1H), 5.40 (m, 1H), 4.21 (m, 1H), 3.86 (m, 2H), 1.20 (s, 9H), 1.04 (s, 9H), 0.88 (s, 9H), 0.08 (s, 6H)
５’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－グアノシン１０ｇ（２５．２ｍｍｏｌ）（１）を、無水ピリジン１００ｍｌに溶かし、ピバル酸無水物２３．４ｇ（１２５．６ｍｍｏｌ）を添加して室温で撹拌した。反応完結後、酢酸エチル５００ｍｌを投入し、飽和重曹水溶液４００ｍｌ、２０％クエン酸４００ｍｌで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧蒸留した。フラッシュカラムクロマトグラフィを利用し、目的化合物１０．２６ｇ（７２％）（２）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 25℃): δ= 10.70 (s, 1H), 7.83 (d, 1H), 6.51 (br, 2H), 5.93 (d, 1H), 5.69 (m, 1H), 5.40 (m, 1H), 4.21 (m, 1H), 3.86 (m, 2H), 1.20 (s, 9H), 1.04 (s, 9H), 0.88 (s, 9H), 0.08 (s, 6H)
【0158】
実施例３：２’，３’－ピバロイル－グアノシン（３）の製造
２’，３’－ピバロイル－５’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－グアノシン１０ｇ（１７．６ｍｍｏｌ）（２）をジクロロメタン３００ｍＬに溶かし、蒸留水８ｍｌとトリフルオロ酢酸７０ｍｌとを順に添加した。３０分撹拌した後、２Ｎ水酸化ナトリウムで中和させた。有機層と水層とを分離させ、該水層をジクロロメタン３００ｍｌで抽出して有機層を集め、飽和重曹水溶液と塩水とで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧蒸留した。フラッシュカラムクロマトグラフィを利用し、目的化合物５．１６ｇ（６４．７％）（３）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 25℃): δ= 10.69 (s, 1H), 7.97 (d, 1H), 6.49 (br, 2H), 5.92 (d, 1H), 5.72 (dd, 1H), 5.45 (t, 1H), 5.40 (dd, 1H), 4.16 (m, 1H), 3.67 (m, 2H), 1.21 (m, 9H), 1.05 (m, 9H)
２’，３’－ピバロイル－５’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル－グアノシン１０ｇ（１７．６ｍｍｏｌ）（２）をジクロロメタン３００ｍＬに溶かし、蒸留水８ｍｌとトリフルオロ酢酸７０ｍｌとを順に添加した。３０分撹拌した後、２Ｎ水酸化ナトリウムで中和させた。有機層と水層とを分離させ、該水層をジクロロメタン３００ｍｌで抽出して有機層を集め、飽和重曹水溶液と塩水とで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥させ、減圧蒸留した。フラッシュカラムクロマトグラフィを利用し、目的化合物５．１６ｇ（６４．７％）（３）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 25℃): δ= 10.69 (s, 1H), 7.97 (d, 1H), 6.49 (br, 2H), 5.92 (d, 1H), 5.72 (dd, 1H), 5.45 (t, 1H), 5.40 (dd, 1H), 4.16 (m, 1H), 3.67 (m, 2H), 1.21 (m, 9H), 1.05 (m, 9H)
【0159】
実施例４：２’，３’－ピバロイル－グアノシン５’－モノホスフェート（ｐＧ（２’，３’ pivaloyl））（４）の製造
２’，３’－ピバロイル－グアノシン４．５１ｇ（１０ｍｍｏｌ）（３）をトリエチルホスフェート４０ｍＬに投入し、６０～７０℃で溶解した。反応液を０℃に冷却させ、塩化ホスホリル２．８ｍＬ（３０ｍｍｏｌ）を添加した後、室温に昇温させ、窒素下で３時間撹拌した。１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムバッファ１００ｍＬ（ｐＨ８．５）を徐々に滴加し、８時間撹拌した後、蒸留水１Ｌを投入した。反応液を、Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ）を利用して分離し、メタノール５０ｍＬで４回共沸し、目的化合物のトリエチルアンモニウム塩３．７９ｇ（収率６０．０％）（４）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 25℃): δ= 10.72 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 6.68 (br, 2H), 5.94 (d, 1H), 5.83 (m, 1H), 5.46 (m, 1H), 4.28 (m, 1H), 4.00 (m, 2H), 1.21 (m, TEA overlapped, 9H), 1.03 (m, 9H). LC-MS (ESI, m/z) = 532.17 [M + H+]
２’，３’－ピバロイル－グアノシン４．５１ｇ（１０ｍｍｏｌ）（３）をトリエチルホスフェート４０ｍＬに投入し、６０～７０℃で溶解した。反応液を０℃に冷却させ、塩化ホスホリル２．８ｍＬ（３０ｍｍｏｌ）を添加した後、室温に昇温させ、窒素下で３時間撹拌した。１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムバッファ１００ｍＬ（ｐＨ８．５）を徐々に滴加し、８時間撹拌した後、蒸留水１Ｌを投入した。反応液を、Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ）を利用して分離し、メタノール５０ｍＬで４回共沸し、目的化合物のトリエチルアンモニウム塩３．７９ｇ（収率６０．０％）（４）を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 25℃): δ= 10.72 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 6.68 (br, 2H), 5.94 (d, 1H), 5.83 (m, 1H), 5.46 (m, 1H), 4.28 (m, 1H), 4.00 (m, 2H), 1.21 (m, TEA overlapped, 9H), 1.03 (m, 9H). LC-MS (ESI, m/z) = 532.17 [M + H+]
【0160】
実施例５：２’，３’－ピバロイル－グアノシン５’－二リン酸塩（ｐｐＧ（２’，３’ pivaloyl））（５）の製造
ｐＧ（２’，３’ pivaloyl）トリエチルアンモニウム塩３．１６ｇ（５．０ｍｍｏｌ）（４）をジメチルホルムアミド２５０ｍＬに投入した後、イミダゾール３．４０ｇ（５０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン６．５６ｇ（２５ｍｍｏｌ）、２，２’－ジピリジルジスルフィド５．５１ｇ（２５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン０．５１ｇ（５．０ｍｍｏｌ）を添加して５時間撹拌した。過塩素酸ナトリウム２．４５ｇ（２０ｍｍｏｌ）をアセトン４３０ｍＬに溶かした溶液に、反応液を投入し、４℃に冷却させた後、生成された結晶を濾過し、冷たいアセトンで洗浄した後、真空乾燥させた。乾燥させたｉｍ－ｐＧ（２’，３’ pivaloyl）をジメチルホルムアミド３０ｍＬに投入し、塩化亜鉛１．３６ｇ（１０ｍｍｏｌ）、トリエチルアンモニウムホスフェート５．９８ｇ（３０ｍｍｏｌ）を投入した後、室温で３～１６時間撹拌した。反応完結後、反応液に、蒸留水８７０ｍＬ、エチレンジアミンテトラ酢酸９．７９ｇ（３３．５ｍｍｏｌ）混合液を投入した後、２０分間撹拌した。反応液を、１Ｍ重曹水溶液を利用し、ｐＨ６～７に中和させた後、反応液を、Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ）を利用して分離し、メタノール３５ｍＬで４回共沸し、目的化合物のトリエチルアンモニウム塩２．４４ｇ（収率６０．０％）（５）を得た。
1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 7.99 (s, 1H), 6.00 (d, 1H), 5.71 (m, 1H), 5.52 (m, 1H), 4.49 (m, 1H), 4.16 (m, 2H), 1.11 (m, TEA overlapped, 9H), 0.95 (m, 9H). 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃): δ= -8.38 (d, 1P), -10.69 (d, 1P)
ｐＧ（２’，３’ pivaloyl）トリエチルアンモニウム塩３．１６ｇ（５．０ｍｍｏｌ）（４）をジメチルホルムアミド２５０ｍＬに投入した後、イミダゾール３．４０ｇ（５０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン６．５６ｇ（２５ｍｍｏｌ）、２，２’－ジピリジルジスルフィド５．５１ｇ（２５ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン０．５１ｇ（５．０ｍｍｏｌ）を添加して５時間撹拌した。過塩素酸ナトリウム２．４５ｇ（２０ｍｍｏｌ）をアセトン４３０ｍＬに溶かした溶液に、反応液を投入し、４℃に冷却させた後、生成された結晶を濾過し、冷たいアセトンで洗浄した後、真空乾燥させた。乾燥させたｉｍ－ｐＧ（２’，３’ pivaloyl）をジメチルホルムアミド３０ｍＬに投入し、塩化亜鉛１．３６ｇ（１０ｍｍｏｌ）、トリエチルアンモニウムホスフェート５．９８ｇ（３０ｍｍｏｌ）を投入した後、室温で３～１６時間撹拌した。反応完結後、反応液に、蒸留水８７０ｍＬ、エチレンジアミンテトラ酢酸９．７９ｇ（３３．５ｍｍｏｌ）混合液を投入した後、２０分間撹拌した。反応液を、１Ｍ重曹水溶液を利用し、ｐＨ６～７に中和させた後、反応液を、Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ）を利用して分離し、メタノール３５ｍＬで４回共沸し、目的化合物のトリエチルアンモニウム塩２．４４ｇ（収率６０．０％）（５）を得た。
1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 7.99 (s, 1H), 6.00 (d, 1H), 5.71 (m, 1H), 5.52 (m, 1H), 4.49 (m, 1H), 4.16 (m, 2H), 1.11 (m, TEA overlapped, 9H), 0.95 (m, 9H). 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃): δ= -8.38 (d, 1P), -10.69 (d, 1P)
【0161】
実施例６：７－メチル－２’，３’－ピバロイル－グアノシン５’－二リン酸塩（ｐｐ７ｍＧ（２’，３’ pivaloyl））（６）の製造
ｐｐＧ（２’，３’ pivaloyl）トリエチルアンモニウム塩２．４４ｇ（３．０ｍｍｏｌ）（５）を蒸留水５０ｍＬに溶解させ、氷酢酸を利用し、反応液のｐＨを４．０に合わせた。反応液に、ジメチルスルフェート１０ｍＬ（１０５．４５ｍｍｏｌ）を３０分にわたって徐々に添加した後、４時間撹拌した。このとき、該反応液のｐＨは、０．１Ｎ水酸化ナトリウムを利用し、４．０±０．５に維持した。該反応液を、ジクロロメタン１５０ｍＬで３回抽出し、未反応ジメチルスルフェートを除去した後、水層をｐＨ５．５に合わせ、蒸留水５００ｍＬを投入した。該反応液を、Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ）を利用し、ｐｐ７ｍＧ（２’，３’ pivaloyl）を分離し、蒸留、真空乾燥し、トリエチルアンモニウム塩１．７４ｇ（収率８０％）（６）を得た。
1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 9.35 (s, 1H), 6.30 (d, 1H), 5.71 (m, 1H), 5.58 (m, 1H), 4.69 (m, 1H), 4.32 ~ 4.15 (m, 2H), 4.11 (s, 3H), 1.25(m, 9H), 1.19 (m, 9H). LC-MS (ESI, m/z) = 624.14 [M - H]-
ｐｐＧ（２’，３’ pivaloyl）トリエチルアンモニウム塩２．４４ｇ（３．０ｍｍｏｌ）（５）を蒸留水５０ｍＬに溶解させ、氷酢酸を利用し、反応液のｐＨを４．０に合わせた。反応液に、ジメチルスルフェート１０ｍＬ（１０５．４５ｍｍｏｌ）を３０分にわたって徐々に添加した後、４時間撹拌した。このとき、該反応液のｐＨは、０．１Ｎ水酸化ナトリウムを利用し、４．０±０．５に維持した。該反応液を、ジクロロメタン１５０ｍＬで３回抽出し、未反応ジメチルスルフェートを除去した後、水層をｐＨ５．５に合わせ、蒸留水５００ｍＬを投入した。該反応液を、Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ）を利用し、ｐｐ７ｍＧ（２’，３’ pivaloyl）を分離し、蒸留、真空乾燥し、トリエチルアンモニウム塩１．７４ｇ（収率８０％）（６）を得た。
1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 9.35 (s, 1H), 6.30 (d, 1H), 5.71 (m, 1H), 5.58 (m, 1H), 4.69 (m, 1H), 4.32 ~ 4.15 (m, 2H), 4.11 (s, 3H), 1.25(m, 9H), 1.19 (m, 9H). LC-MS (ESI, m/z) = 624.14 [M - H]-
【0162】
実施例７：７－メチル－２’，３’－ピバロイル－グアノシン５’－二リン酸塩イミダゾリド（ｉｍ－ｐｐ７ｍＧ（２’，３’ pivaloyl））（７）の製造
ｐｐ７ｍＧ（２’，３’ pivaloyl）トリエチルアンモニウム塩１．２６ｇ（１．７３ｍｍｏｌ）（６）をジメチルホルムアミド２５ｍＬに溶解させ、イミダゾール９４１．６３ｍｇ（１３．８３ｍｍｏｌ）、２，２’－ジピリジルジスルフィド１．１４ｇ（５．１９ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン０．４８２ｍＬ（３．４６ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン１．３６ｇ（５．１９ｍｍｏｌ）を投入した後、６～８時間撹拌した。過塩素酸ナトリウム８４７ｍｇ（６．９２ｍｍｏｌ）をアセトン１７５ｍＬに溶かした溶液に、該反応液を投入し、４℃に冷却させた後、生成された結晶を濾過し、冷たいアセトンで洗浄した後、真空乾燥させ、目的化合物９６７ｍｇ（収率８０．０％）を得た（７）。
ｐｐ７ｍＧ（２’，３’ pivaloyl）トリエチルアンモニウム塩１．２６ｇ（１．７３ｍｍｏｌ）（６）をジメチルホルムアミド２５ｍＬに溶解させ、イミダゾール９４１．６３ｍｇ（１３．８３ｍｍｏｌ）、２，２’－ジピリジルジスルフィド１．１４ｇ（５．１９ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン０．４８２ｍＬ（３．４６ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン１．３６ｇ（５．１９ｍｍｏｌ）を投入した後、６～８時間撹拌した。過塩素酸ナトリウム８４７ｍｇ（６．９２ｍｍｏｌ）をアセトン１７５ｍＬに溶かした溶液に、該反応液を投入し、４℃に冷却させた後、生成された結晶を濾過し、冷たいアセトンで洗浄した後、真空乾燥させ、目的化合物９６７ｍｇ（収率８０．０％）を得た（７）。
【0163】
実施例８ないし１０：７－メチル－３’－ピバロイル－グアノシン５’－二リン酸塩イミダゾリド（ｉｍ－ｐｐ７ｍＧ（２’ or ３’ monopivaloyl））（１０）の製造
【化27】
【0164】
実施例８：７－メチル－２’ or ３’－モノピバロイル－グアノシン一リン酸塩（ｐ７ｍＧ（２’ or ３’ monopivaloyl））（８）の製造
商業的に入手されたグアノシン一リン酸を、追加処理なしに、出発物質として使用した。グアノシン一リン酸５ｇ（１１．８ｍｍｏｌ）を蒸留水５０ｍｌに溶かし、１Ｍ水酸化ナトリウムを利用し、ｐＨ９．５に滴定した。常温において、ピバル酸無水物８．７９ｇ（４７．２ｍｍｏｌ）を添加し、室温で撹拌した。常温において、１Ｍ水酸化ナトリウムを利用し、ｐＨ９．５～９．６を維持し、４～１２時間反応させた。反応完結後、５０％酢酸を投入し、ｐＨを４．５に滴定した後、ジメチルスルフェート１４．９ｇ（１１８ｍｍｏｌ）を３０分にわたって徐々に添加した後、４時間撹拌した。このとき、反応液のｐＨは、１Ｍ水酸化ナトリウムを利用し、４．０±０．５に維持した。該反応液をジクロロメタン１５０ｍＬで３回抽出し、未反応ジメチルスルフェートを除去した後、水層をｐＨ５．５に滴定した。該反応液を、Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ）を利用し、表題の反応生成物（モル比で、２’－モノピバロイル化合物：３’－モノピバロイル化合物＝０．６±０．０５：１である混合物（図１））を分離し、蒸留、真空乾燥させ、トリエチルアンモニウム塩３．４ｇ（収率４３％）（８）を得た。
1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 6.17 (m, 0.6H, from 2'-monopivaloyl compound), 6.08 (m, 1H, from 3'-monopivaloyl compound), 5.50 (m, 0.6H, 2'H from 2'-monopivaloyl compound), 5.33 (m, 1H, 3'H from 3'-monopivaloyl compound), 4.89 (m, 1H, from 3'-monopivaloyl compound), 4.65 (m, 0.6H, from 2'-monopivaloyl compound), 4.51 (m, 1H, from 3'-monopivaloyl compound), 4.39 (m, 0.6H, from 2'-monopivaloyl compound), 3.96 ~ 4.15 (m, 8H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 3.13 (q, 9.6H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 1.18 ~ 1.24 (m, 28.8H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped). 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃): δ= 3.75 ~ 3.83 (s, 1.6 P, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped)
商業的に入手されたグアノシン一リン酸を、追加処理なしに、出発物質として使用した。グアノシン一リン酸５ｇ（１１．８ｍｍｏｌ）を蒸留水５０ｍｌに溶かし、１Ｍ水酸化ナトリウムを利用し、ｐＨ９．５に滴定した。常温において、ピバル酸無水物８．７９ｇ（４７．２ｍｍｏｌ）を添加し、室温で撹拌した。常温において、１Ｍ水酸化ナトリウムを利用し、ｐＨ９．５～９．６を維持し、４～１２時間反応させた。反応完結後、５０％酢酸を投入し、ｐＨを４．５に滴定した後、ジメチルスルフェート１４．９ｇ（１１８ｍｍｏｌ）を３０分にわたって徐々に添加した後、４時間撹拌した。このとき、反応液のｐＨは、１Ｍ水酸化ナトリウムを利用し、４．０±０．５に維持した。該反応液をジクロロメタン１５０ｍＬで３回抽出し、未反応ジメチルスルフェートを除去した後、水層をｐＨ５．５に滴定した。該反応液を、Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ）を利用し、表題の反応生成物（モル比で、２’－モノピバロイル化合物：３’－モノピバロイル化合物＝０．６±０．０５：１である混合物（図１））を分離し、蒸留、真空乾燥させ、トリエチルアンモニウム塩３．４ｇ（収率４３％）（８）を得た。
1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 6.17 (m, 0.6H, from 2'-monopivaloyl compound), 6.08 (m, 1H, from 3'-monopivaloyl compound), 5.50 (m, 0.6H, 2'H from 2'-monopivaloyl compound), 5.33 (m, 1H, 3'H from 3'-monopivaloyl compound), 4.89 (m, 1H, from 3'-monopivaloyl compound), 4.65 (m, 0.6H, from 2'-monopivaloyl compound), 4.51 (m, 1H, from 3'-monopivaloyl compound), 4.39 (m, 0.6H, from 2'-monopivaloyl compound), 3.96 ~ 4.15 (m, 8H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 3.13 (q, 9.6H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 1.18 ~ 1.24 (m, 28.8H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped). 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃): δ= 3.75 ~ 3.83 (s, 1.6 P, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped)
【0165】
実施例９：７－メチル－２’ or ３’－モノピバロイル－グアノシン５’－二リン酸塩（ｐｐ７ｍＧ（２’ or ３’ monopivaloyl））（９）の製造
ｐ７ｍＧ（２’ or ３’ monopivaloyl）トリエチルアンモニウム塩３．４ｇ（５．０７ｍｍｏｌ）（８）をジメチルホルムアミド７５ｍＬに投入した後、イミダゾール２．０７ｇ（３０．４ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン３．９９ｇ（１５．２ｍｍｏｌ）、２，２’－ジピリジルジスルフィド３．３５ｇ（１５．２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン０．５１ｇ（５．０７ｍｍｏｌ）を添加し、１～１２時間撹拌した。その後、塩化亜鉛２．０７ｇ（１５．２ｍｍｏｌ）、トリエチルアンモニウムリン酸塩６．０６ｇ（３０．４ｍｍｏｌ）を投入した後、室温で３～１６時間撹拌した。反応完結後、反応液に、蒸留水０．９４Ｌ、エチレンジアミンテトラ酢酸９．９３ｇ（３４ｍｍｏｌ）混合液を投入した後、２０分間撹拌した。該反応液を、１Ｍ重曹水溶液を利用し、ｐＨ６～７に中和させた後、該反応液を、Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ）を利用して分離し、メタノール３５ｍＬで４回共沸し、表題の反応生成物（モル比で２’－モノピバロイル化合物：３’－モノピバロイル化合物＝０．７±０．０５：１である混合物（図２））のトリエチルアンモニウム塩３．０２ｇ（収率８０％）（９）を得た。
1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 6.18 (m, 0.7H, 2'H from 2'-monopivaloyl compound), 6.10 (m, 1H, from 3'-monopivaloyl compound), 5.57 (m, 0.7H, 2'H from 2'-monopivaloyl compound), 5.37 (m, 1H, 2'H from 3'-monopivaloyl compound), 4.94 (m, 1H, from 3'-monopivaloyl compound), 4.72 (m, 0.7H, from 2'-monopivaloyl compound), 4.57 (m, 1H, from 3'-monopivaloyl compound), 4.41 (m, 0.7H, from 2'-monopivaloyl compound), 4.14 ~ 4.37 (m, 3.4H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 4.10 (m, 5.1H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 3.13 ~ 3.19 (m, 15.3H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 1.21 ~ 1.26 (m, 38.3H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped). 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃): δ= -8.71 ~ -9.08 (m, 1.7P, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), -10.42 ~ -10.63 (m, 1.7P, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped)
ｐ７ｍＧ（２’ or ３’ monopivaloyl）トリエチルアンモニウム塩３．４ｇ（５．０７ｍｍｏｌ）（８）をジメチルホルムアミド７５ｍＬに投入した後、イミダゾール２．０７ｇ（３０．４ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン３．９９ｇ（１５．２ｍｍｏｌ）、２，２’－ジピリジルジスルフィド３．３５ｇ（１５．２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン０．５１ｇ（５．０７ｍｍｏｌ）を添加し、１～１２時間撹拌した。その後、塩化亜鉛２．０７ｇ（１５．２ｍｍｏｌ）、トリエチルアンモニウムリン酸塩６．０６ｇ（３０．４ｍｍｏｌ）を投入した後、室温で３～１６時間撹拌した。反応完結後、反応液に、蒸留水０．９４Ｌ、エチレンジアミンテトラ酢酸９．９３ｇ（３４ｍｍｏｌ）混合液を投入した後、２０分間撹拌した。該反応液を、１Ｍ重曹水溶液を利用し、ｐＨ６～７に中和させた後、該反応液を、Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ）を利用して分離し、メタノール３５ｍＬで４回共沸し、表題の反応生成物（モル比で２’－モノピバロイル化合物：３’－モノピバロイル化合物＝０．７±０．０５：１である混合物（図２））のトリエチルアンモニウム塩３．０２ｇ（収率８０％）（９）を得た。
1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 6.18 (m, 0.7H, 2'H from 2'-monopivaloyl compound), 6.10 (m, 1H, from 3'-monopivaloyl compound), 5.57 (m, 0.7H, 2'H from 2'-monopivaloyl compound), 5.37 (m, 1H, 2'H from 3'-monopivaloyl compound), 4.94 (m, 1H, from 3'-monopivaloyl compound), 4.72 (m, 0.7H, from 2'-monopivaloyl compound), 4.57 (m, 1H, from 3'-monopivaloyl compound), 4.41 (m, 0.7H, from 2'-monopivaloyl compound), 4.14 ~ 4.37 (m, 3.4H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 4.10 (m, 5.1H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 3.13 ~ 3.19 (m, 15.3H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 1.21 ~ 1.26 (m, 38.3H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped). 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃): δ= -8.71 ~ -9.08 (m, 1.7P, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), -10.42 ~ -10.63 (m, 1.7P, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped)
【0166】
実施例１０：７－メチル－３’－ピバロイル－グアノシン５’－二リン酸塩イミダゾリド（ｉｍ－ｐｐ７ｍＧ（２’ or ３’ monopivaloyl））（１０）の製造
ｐｐ７ｍＧ（２’ or ３’ monopivaloyl）トリエチルアンモニウム塩１．２９ｇ（１．７３ｍｍｏｌ）（９）をジメチルホルムアミド２２ｍＬに溶解させ、イミダゾール７０７ｍｇ（１０．３８ｍｍｏｌ）、２，２’－ジピリジルジスルフィド１．１４ｇ（５．１９ｍｍｏｌ）を添加した。反応液に、トリエチルアミン１７５ｍｇ（１．７３ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン１．３６ｇ（５．１９ｍｍｏｌ）を投入した後、１～１２時間撹拌した。反応完結後、過塩素酸ナトリウム８４７ｍｇ（６．９２ｍｍｏｌ）をアセトン１７５ｍＬに溶かした溶液に、該反応液を投入し、４℃に冷却させた後、生成された結晶を濾過し、冷たいアセトンで洗浄した後、真空乾燥させ、目的化合物７９６ｍｇ（収率７５．０％）を得た（１０）。
ｐｐ７ｍＧ（２’ or ３’ monopivaloyl）トリエチルアンモニウム塩１．２９ｇ（１．７３ｍｍｏｌ）（９）をジメチルホルムアミド２２ｍＬに溶解させ、イミダゾール７０７ｍｇ（１０．３８ｍｍｏｌ）、２，２’－ジピリジルジスルフィド１．１４ｇ（５．１９ｍｍｏｌ）を添加した。反応液に、トリエチルアミン１７５ｍｇ（１．７３ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン１．３６ｇ（５．１９ｍｍｏｌ）を投入した後、１～１２時間撹拌した。反応完結後、過塩素酸ナトリウム８４７ｍｇ（６．９２ｍｍｏｌ）をアセトン１７５ｍＬに溶かした溶液に、該反応液を投入し、４℃に冷却させた後、生成された結晶を濾過し、冷たいアセトンで洗浄した後、真空乾燥させ、目的化合物７９６ｍｇ（収率７５．０％）を得た（１０）。
【0167】
実施例１１ないし１４：ｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ（１４）の製造
【化28】
【0168】
実施例１１：Ｎ２－イソブチリル－２’，３’－ジアセトキシ－グアノシン（１１）の製造
Ｎ２－イソブチリル－５’－Ｏ－ＤＭＴグアノシン２．４ｇ（３．６６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１２ｍｌに溶かした後、ピリジン１．４７ｍｌ（１８．３ｍｍｏｌ）、無水酢酸１．７８ｍｌ（１８．３ｍｍｏｌ）を投入し、室温で５時間撹拌した。反応液に酢酸エチル２４ｍｌを加えて抽出した後、重曹飽和水溶液１４．４ｍｌ、２０％クエン酸水溶液１４．４ｍｌ、蒸留水１４．４ｍｌで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧蒸留された残渣を一日窒素乾燥させた。乾燥物に、３％卜リクロロ酢酸水溶液３６ｍｌを添加し、室温で３時間反応させた後、メタノール２４ｍｌを加え、さらに２時間３０分間撹拌した。反応液を減圧蒸留し、ジクロロメタン３６ｍｌ、蒸留水１８ｍｌを加えた後、重曹飽和水溶液を投入して中和した。有機層を分離させた後、硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧蒸留した。減圧蒸留された残渣を、酢酸エチル１２ｍｌに溶かした後、室温でヘキセン１０８ｍｌに徐々に添加して結晶化させた。生成された結晶を濾過し、ヘキセン１２ｍｌで３回繰り返し洗浄した後、真空乾燥させ、目的化合物（１１）１．４３ｇ（収率８９．６％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝４３８．１６［Ｍ＋Ｈ＋］
Ｎ２－イソブチリル－５’－Ｏ－ＤＭＴグアノシン２．４ｇ（３．６６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン１２ｍｌに溶かした後、ピリジン１．４７ｍｌ（１８．３ｍｍｏｌ）、無水酢酸１．７８ｍｌ（１８．３ｍｍｏｌ）を投入し、室温で５時間撹拌した。反応液に酢酸エチル２４ｍｌを加えて抽出した後、重曹飽和水溶液１４．４ｍｌ、２０％クエン酸水溶液１４．４ｍｌ、蒸留水１４．４ｍｌで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧蒸留された残渣を一日窒素乾燥させた。乾燥物に、３％卜リクロロ酢酸水溶液３６ｍｌを添加し、室温で３時間反応させた後、メタノール２４ｍｌを加え、さらに２時間３０分間撹拌した。反応液を減圧蒸留し、ジクロロメタン３６ｍｌ、蒸留水１８ｍｌを加えた後、重曹飽和水溶液を投入して中和した。有機層を分離させた後、硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧蒸留した。減圧蒸留された残渣を、酢酸エチル１２ｍｌに溶かした後、室温でヘキセン１０８ｍｌに徐々に添加して結晶化させた。生成された結晶を濾過し、ヘキセン１２ｍｌで３回繰り返し洗浄した後、真空乾燥させ、目的化合物（１１）１．４３ｇ（収率８９．６％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝４３８．１６［Ｍ＋Ｈ＋］
【0169】
実施例１２：（Ｎ２－イソブチリル－２’，３’－ジアセトキシ－グアノシニル）－Ｎ６－ベンゾイル－２’－メトキシ－アデノシニルシアノエチルリン酸エステル（１２）の製造
５’－Ｏ－ＤＭＴ－Ｎ６－ベンゾイル－２’－メトキシ－アデノシンアミダイトの場合、商業的に入手し、追加処理なしに、出発物質として使用した。Ｎ２－イソブチリル－２’，３’－ジアセトキシ－グアノシン（１１）１．４３ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）と５’－Ｏ－ＤＭＴ－Ｎ６－ベンゾイル－２’－メトキシ－アデノシンアミダイト３．７８ｇ（４．２６ｍｍｏｌ）とを１Ｈ－テトラゾール２８．４ｍＬ（０．４５Ｍアセトニトリル溶液（１２．７９ｍｍｏｌ））に溶解させ、室温で１時間撹拌した。ヨウ素５４４ｍｇ（２．１５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン：蒸留水：ピリジン混合液（ｖ：ｖ：ｖ（７：２：１））５６．７ｍｌに溶かした後、その溶液を反応液に投入し、４５分間撹拌した。反応液に、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液７．２ｍｌを添加した後、ジクロロメタン４３ｍｌ、蒸留水１４．３ｍｌを加えた後、有機層を分離させた。分離された有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧蒸留した後、一日窒素乾燥させた。乾燥物に３％卜リクロロ酢酸水溶液２１．５ｍｌを添加し、室温で３時間反応させた後、メタノール１４．３ｍｌを加え、さらに２時間３０分間撹拌した。反応液を減圧蒸留し、ジクロロメタン２１．５ｍｌ、蒸留水１０．７ｍｌを加えた後、重曹飽和水溶液を投入して中和させた。分離された有機層を蒸留水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧蒸留した。減圧蒸留された残渣をジクロロメタン２８．６ｍｌに溶かした後、室温において、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル８６ｍｌに徐々に添加して結晶化させた。生成された結晶を濾過し、一日真空乾燥させ、目的化合物（１２）２．７ｇ（収率８７．８％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝９３８．２８［Ｍ＋Ｈ＋］
５’－Ｏ－ＤＭＴ－Ｎ６－ベンゾイル－２’－メトキシ－アデノシンアミダイトの場合、商業的に入手し、追加処理なしに、出発物質として使用した。Ｎ２－イソブチリル－２’，３’－ジアセトキシ－グアノシン（１１）１．４３ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）と５’－Ｏ－ＤＭＴ－Ｎ６－ベンゾイル－２’－メトキシ－アデノシンアミダイト３．７８ｇ（４．２６ｍｍｏｌ）とを１Ｈ－テトラゾール２８．４ｍＬ（０．４５Ｍアセトニトリル溶液（１２．７９ｍｍｏｌ））に溶解させ、室温で１時間撹拌した。ヨウ素５４４ｍｇ（２．１５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン：蒸留水：ピリジン混合液（ｖ：ｖ：ｖ（７：２：１））５６．７ｍｌに溶かした後、その溶液を反応液に投入し、４５分間撹拌した。反応液に、１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液７．２ｍｌを添加した後、ジクロロメタン４３ｍｌ、蒸留水１４．３ｍｌを加えた後、有機層を分離させた。分離された有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧蒸留した後、一日窒素乾燥させた。乾燥物に３％卜リクロロ酢酸水溶液２１．５ｍｌを添加し、室温で３時間反応させた後、メタノール１４．３ｍｌを加え、さらに２時間３０分間撹拌した。反応液を減圧蒸留し、ジクロロメタン２１．５ｍｌ、蒸留水１０．７ｍｌを加えた後、重曹飽和水溶液を投入して中和させた。分離された有機層を蒸留水で洗浄した後、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧蒸留した。減圧蒸留された残渣をジクロロメタン２８．６ｍｌに溶かした後、室温において、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル８６ｍｌに徐々に添加して結晶化させた。生成された結晶を濾過し、一日真空乾燥させ、目的化合物（１２）２．７ｇ（収率８７．８％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝９３８．２８［Ｍ＋Ｈ＋］
【0170】
実施例１３：ｐ（ＯＣＥ）２Ａｂｚ（２’ＯＭｅ）ｐ（ＯＣＥ）Ｇｉｂ（２’，３’ＯＡｃ）（１３）の製造
（Ｎ２－イソブチリル－２’，３’－ジアセトキシ－グアノシニル）－Ｎ６－ベンゾイル－２’－メトキシ－アデノシニルシアノエチルリン酸エステル（１２）２ｇ（２．１３ｍｍｏｌ）、ビス（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホアミダイト１．１１ｍｌ（４．２６ｍｍｏｌ）を、１Ｈ－テトラゾール９．４７ｍＬ（０．４５Ｍアセトニトリル溶液（４．２６ｍｍｏｌ））に溶解させ、室温で３０分間撹拌した。ヨウ素８１１ｍｇ（３．２ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン：蒸留水：ピリジン混合液（ｖ：ｖ：ｖ（７：２：１））３０ｍｌに溶かした後、その溶液を反応液に投入し、３０分間撹拌した。該反応液に１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液２０ｍｌを添加した後、ジクロロメタン１００ｍｌ、蒸留水４０ｍｌを加えた後、有機層を分離させた。分離された有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧蒸留した。減圧蒸留された濃縮液を、ジクロロメタン２７ｍｌを加えて溶かした後、室温でメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル１３３ｍｌに徐々に添加し、結晶化させた。生成された結晶を濾過し、一日真空乾燥させ、目的化合物（Ｎ２－イソブチリル－２’，３’－ジアセトキシ－グアノシニル）－Ｎ６－ベンゾイル－２’－メトキシ－５’－ジシアノエチルホスホリル－アデノシニルシアノエチルリン酸エステル（１３）２．２ｇ（収率９２．２％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝１１２４．３０［Ｍ＋Ｈ＋］
（Ｎ２－イソブチリル－２’，３’－ジアセトキシ－グアノシニル）－Ｎ６－ベンゾイル－２’－メトキシ－アデノシニルシアノエチルリン酸エステル（１２）２ｇ（２．１３ｍｍｏｌ）、ビス（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホアミダイト１．１１ｍｌ（４．２６ｍｍｏｌ）を、１Ｈ－テトラゾール９．４７ｍＬ（０．４５Ｍアセトニトリル溶液（４．２６ｍｍｏｌ））に溶解させ、室温で３０分間撹拌した。ヨウ素８１１ｍｇ（３．２ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフラン：蒸留水：ピリジン混合液（ｖ：ｖ：ｖ（７：２：１））３０ｍｌに溶かした後、その溶液を反応液に投入し、３０分間撹拌した。該反応液に１０％チオ硫酸ナトリウム水溶液２０ｍｌを添加した後、ジクロロメタン１００ｍｌ、蒸留水４０ｍｌを加えた後、有機層を分離させた。分離された有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧蒸留した。減圧蒸留された濃縮液を、ジクロロメタン２７ｍｌを加えて溶かした後、室温でメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル１３３ｍｌに徐々に添加し、結晶化させた。生成された結晶を濾過し、一日真空乾燥させ、目的化合物（Ｎ２－イソブチリル－２’，３’－ジアセトキシ－グアノシニル）－Ｎ６－ベンゾイル－２’－メトキシ－５’－ジシアノエチルホスホリル－アデノシニルシアノエチルリン酸エステル（１３）２．２ｇ（収率９２．２％）を得た。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ，ｍ／ｚ）＝１１２４．３０［Ｍ＋Ｈ＋］
【0171】
実施例１４：ｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ（１４）の製造
ｐ（ＯＣＥ）２Ａｂｚ（２’ＯＭｅ）ｐ（ＯＣＥ）Ｇｉｂ（２’，３’ＯＡｃ）（１３）２ｇ（１．７８ｍｍｏｌ）を、メタノール４４ｍＬと濃アンモニア４４ｍＬとの混合液に投入した後、５０～５５℃において２４時間撹拌した。反応が完結されれば、溶媒を減圧蒸留し、濃縮物にメタノール２０ｍＬを投入し、３回蒸留した。該濃縮液は、さらに蒸留水に溶解させた後、ＤＥＡＥセファロース（Sepharose）カラムと逆相クロマトグラフィとを利用して精製し、目的化合物のトリエチルアンモニウム塩（１４）１．１３ｇ（収率７０％）を得た。
1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 8.44 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 6.07 (m, 1H), 5.80 (m, 1H), 4.46 ~ 4.01 (m, 8H), 3.45 (m, 3H) LC-MS (ESI, m/z) = 707.13 [M + H+]
ｐ（ＯＣＥ）２Ａｂｚ（２’ＯＭｅ）ｐ（ＯＣＥ）Ｇｉｂ（２’，３’ＯＡｃ）（１３）２ｇ（１．７８ｍｍｏｌ）を、メタノール４４ｍＬと濃アンモニア４４ｍＬとの混合液に投入した後、５０～５５℃において２４時間撹拌した。反応が完結されれば、溶媒を減圧蒸留し、濃縮物にメタノール２０ｍＬを投入し、３回蒸留した。該濃縮液は、さらに蒸留水に溶解させた後、ＤＥＡＥセファロース（Sepharose）カラムと逆相クロマトグラフィとを利用して精製し、目的化合物のトリエチルアンモニウム塩（１４）１．１３ｇ（収率７０％）を得た。
1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 8.44 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 6.07 (m, 1H), 5.80 (m, 1H), 4.46 ~ 4.01 (m, 8H), 3.45 (m, 3H) LC-MS (ESI, m/z) = 707.13 [M + H+]
【0172】
実施例１５：７ｍＧ（２’，３’ pivaloyl）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ（１５）の製造
【化29】
【0173】
ジメチルホルムアミド２７．５ｍＬに、塩化マグネシウム０．５５ｇを添加して溶解した。反応液に、Ｉｍ－ｐｐ７ｍＧ（２’，３’ pivaloyl）（７）０．６９ｇ（０．９９ｍｍｏｌ）及びｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ（１４）０．５ｇ（０．５５ｍｍｏｌ）を投入し、室温で２４時間撹拌した。反応が完結された後、２５ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸水溶液２７５ｍＬを滴加し、反応を終結させて室温に冷却させた後、１Ｍ重曹水溶液で中和させた。反応液を、Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ）を利用して精製し、蒸留後、真空乾燥させた。乾燥された固体を２．５ｍｌ蒸留水に溶かした後、過塩素酸ナトリウム２９９ｍｇ（２．４４ｍｍｏｌ）をアセトン１５ｍＬに溶かした溶液に投入し、４℃に冷却させた後、生成された結晶を濾過し、冷たいアセトンで洗浄した後、真空乾燥させ、目的化合物のナトリウム塩（１５）０．４６ｇ（収率６０．０％）を得た。
1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 8.20 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 5.75 ~ 5.72 (m, 2H), 5.65 (m, 1H), 5.33 (m, 1H), 5.24 (m, 1H), 4.60 (m, 1H), 4.29 ~ 3.96 (m, 12H), 3.91 (m, 3H), 3.26 (m, 3H), 1.02 (s, 9H), 0.90 (s, 9H); 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃): δ= -0.32 (s, 1P), -11.01 ~ -11.22 (dd, 2P), -22.26 (t, 1P). LC-MS (ESI, m/z) = 1314.27 [M + H+]
1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 8.20 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 5.75 ~ 5.72 (m, 2H), 5.65 (m, 1H), 5.33 (m, 1H), 5.24 (m, 1H), 4.60 (m, 1H), 4.29 ~ 3.96 (m, 12H), 3.91 (m, 3H), 3.26 (m, 3H), 1.02 (s, 9H), 0.90 (s, 9H); 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃): δ= -0.32 (s, 1P), -11.01 ~ -11.22 (dd, 2P), -22.26 (t, 1P). LC-MS (ESI, m/z) = 1314.27 [M + H+]
【0174】
実施例１６：７ｍＧ（２’ or ３’ monopivaloyl）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ（１６）の製造
【化30】
【0175】
実施例１５と同一方法で実施するものの、前記実施例１５のＩｍ－ｐｐ７ｍＧ（２’，３’ pivaloyl）（７）の代わりに、出発物質として、実施例１０のＩｍ－ｐｐ７ｍＧ（２’ or ３’ monopivaloyl）０．６１ｇ（０．９９ｍｍｏｌ）（１０）を使用して反応させ、Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ）を利用し、分離精製して蒸留した後、塩変更し、表題の反応生成物（モル比で、２’－モノピバロイル化合物：３’－モノピバロイル化合物＝０．６５±０．０５：１である混合物（２５℃±５、ｐＨ１．０～８．０の水中条件）（図３参照））（１６）０．５ｇ（収率７０％）を製造した。
1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 8.30 (d, 1.65H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 8.00 (d, 1.65H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 7.85 (d, 1.65H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 5.88 ~ 5.73 (m, 4.95H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 5.30 (m, 0.65H, 2'H from 2'- monopivaloyl compound), 5.19 (m, 1H, 2'H from 3'-monopivaloyl compound), 4.86 (m, 1H, from 3'-monopivaloyl compound), 4.73 (m, 0.65H, from 2'-pivaloyl compound), 4.60 (t, 1H, 3'-pivaloyl compound), 4.53 (t, 0.65H, from 2'-pivaloyl compound), 4.43 ~ 4.13 (m, 19.80H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 4.00 (d, 4.95H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 3.37 (d, 4.95H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 1.16 (s, 9H, from 3'-monopivaloyl compound), 1.10 (s, 5.85H, from 2'-monopivaloyl compound); 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃): δ= -0.35 (s, 1.65P, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), -10.85 (dd, 3.3P, 2'-monopivaloyl and 3'- monopivaloyl compounds, overlapped), -22.31 (t, 1.65P, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compound, overlapped). LC-MS (ESI, m/z) = 1230.22 [M + H+]
1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 8.30 (d, 1.65H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 8.00 (d, 1.65H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 7.85 (d, 1.65H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 5.88 ~ 5.73 (m, 4.95H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 5.30 (m, 0.65H, 2'H from 2'- monopivaloyl compound), 5.19 (m, 1H, 2'H from 3'-monopivaloyl compound), 4.86 (m, 1H, from 3'-monopivaloyl compound), 4.73 (m, 0.65H, from 2'-pivaloyl compound), 4.60 (t, 1H, 3'-pivaloyl compound), 4.53 (t, 0.65H, from 2'-pivaloyl compound), 4.43 ~ 4.13 (m, 19.80H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 4.00 (d, 4.95H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 3.37 (d, 4.95H, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), 1.16 (s, 9H, from 3'-monopivaloyl compound), 1.10 (s, 5.85H, from 2'-monopivaloyl compound); 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃): δ= -0.35 (s, 1.65P, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compounds, overlapped), -10.85 (dd, 3.3P, 2'-monopivaloyl and 3'- monopivaloyl compounds, overlapped), -22.31 (t, 1.65P, 2'-monopivaloyl and 3'-monopivaloyl compound, overlapped). LC-MS (ESI, m/z) = 1230.22 [M + H+]
【0176】
実験例１：共同転写キャッピングを介するルシフェラーゼｍＲＮＡの試験管内転写
前述の実施例１５及び１６で製造された化合物を利用したｍＲＮＡ合成反応のために、Transcription bufferを使用し、前記バッファの組成は、Tris-Cl buffer: spermidine: Triton X＝４：２：１体積比の通りである。前記バッファ内に、５０μｇ／ｍｌルシフェラーゼＤＮＡ転写テンプレート、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＣＴＰ、１０ｍＭ ＵＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、及び８ｍＭの実施例１５または実施例１６で製造された化合物、３００ＫＵ／ｍｌ Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素、２ＫＵ／ｍｌ ＲＮａｓｅ阻害タンパク質、２０Ｕ／ｍｌ無機ヒ゜ロホスファターゼ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ塩化マグネシウム、及び１０ｍＭジチオトレイトールを付加し、転写反応混合物を製造した。また、陽性対照群として、実施例１５または１６の化合物の代わりに、７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ（Cleancap（登録商標）ＡＧ（３’ＯＭｅ）（TriLinkカタログＮ－７４１３）を使用し、転写反応混合物を製造した。前記転写反応混合物を、３７℃において２～３時間反応させた。その後、反応終結のために、反応物に、２ＫＵ／ｍＬ ＤＮａｓｅＩを添加させ、３７℃において１５～３０分間反応させた。反応が終結されたｍＲＮＡを、製造社の指示により、ＲＮｅａｓｙマキシキット（キアゲン（Qiagen）カタログ＃７５１６２）を使用するか、あるいは逆相高性能液体クロマトグラフィによって精製した。精製されたｍＲＮＡサンプルは、蛍光光度計（fluorometer）装備を利用して濃度を求め、濃度と反応体積とを乗じ、ｍＲＮＡ総量を算出した。その後、ｍＲＮＡ試験管内転写（ＩＶＴ）収率を導出するために、それぞれ互いに異なるキャップ類似体を利用して合成されたｍＲＮＡ総量を、投入されたＬ－ＤＮＡ含量で除算し、キャップ類似体によるＩＶＴ収率値を定量化させた。具体的に述べれば、ＩＶＴ収率値１００というのは、１μｇ Ｌ－ＤＮＡでもって、１００μｇ ｍＲＮＡが合成されたことを意味する。それは、下記の数式１によって算出されうる。その後、代表的な３世代キャップ類似体である７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ（Cleancap（登録商標）ＡＧ（３’ＯＭｅ））によるＩＶＴ収率値（数式１）を１００％と指定し、それぞれの実施例化合物によるＩＶＴ収率値（数式１）を、７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧの収率値（数式１）で除した後、１００を乗じ、７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ対比の実施例１５または１６の化合物によるＩＶＴ収率を百分率化（％）させた（数式２参照）。
前述の実施例１５及び１６で製造された化合物を利用したｍＲＮＡ合成反応のために、Transcription bufferを使用し、前記バッファの組成は、Tris-Cl buffer: spermidine: Triton X＝４：２：１体積比の通りである。前記バッファ内に、５０μｇ／ｍｌルシフェラーゼＤＮＡ転写テンプレート、１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＣＴＰ、１０ｍＭ ＵＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、及び８ｍＭの実施例１５または実施例１６で製造された化合物、３００ＫＵ／ｍｌ Ｔ７ ＲＮＡ重合酵素、２ＫＵ／ｍｌ ＲＮａｓｅ阻害タンパク質、２０Ｕ／ｍｌ無機ヒ゜ロホスファターゼ、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ塩化マグネシウム、及び１０ｍＭジチオトレイトールを付加し、転写反応混合物を製造した。また、陽性対照群として、実施例１５または１６の化合物の代わりに、７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ（Cleancap（登録商標）ＡＧ（３’ＯＭｅ）（TriLinkカタログＮ－７４１３）を使用し、転写反応混合物を製造した。前記転写反応混合物を、３７℃において２～３時間反応させた。その後、反応終結のために、反応物に、２ＫＵ／ｍＬ ＤＮａｓｅＩを添加させ、３７℃において１５～３０分間反応させた。反応が終結されたｍＲＮＡを、製造社の指示により、ＲＮｅａｓｙマキシキット（キアゲン（Qiagen）カタログ＃７５１６２）を使用するか、あるいは逆相高性能液体クロマトグラフィによって精製した。精製されたｍＲＮＡサンプルは、蛍光光度計（fluorometer）装備を利用して濃度を求め、濃度と反応体積とを乗じ、ｍＲＮＡ総量を算出した。その後、ｍＲＮＡ試験管内転写（ＩＶＴ）収率を導出するために、それぞれ互いに異なるキャップ類似体を利用して合成されたｍＲＮＡ総量を、投入されたＬ－ＤＮＡ含量で除算し、キャップ類似体によるＩＶＴ収率値を定量化させた。具体的に述べれば、ＩＶＴ収率値１００というのは、１μｇ Ｌ－ＤＮＡでもって、１００μｇ ｍＲＮＡが合成されたことを意味する。それは、下記の数式１によって算出されうる。その後、代表的な３世代キャップ類似体である７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ（Cleancap（登録商標）ＡＧ（３’ＯＭｅ））によるＩＶＴ収率値（数式１）を１００％と指定し、それぞれの実施例化合物によるＩＶＴ収率値（数式１）を、７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧの収率値（数式１）で除した後、１００を乗じ、７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧ対比の実施例１５または１６の化合物によるＩＶＴ収率を百分率化（％）させた（数式２参照）。
【0177】
【数1】
【0178】
【数2】
【0179】
それぞれの実施例、及び７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧによるＩＶＴ収率値を、独立して３回繰り返し進め、一元配置分散分析（one-way ＡＮＯＶＡ（analysis of variance））とTukey’s hoc testsとを介し、有意性を検証した。その結果は、図４の通りである。本発明の実施例１５と１６との化合物は、従来の３世代キャップ類似体である７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧのＩＶＴ収率と、ほぼ同一収率で合成されることを確認した。
【0180】
実験例２：HeLa細胞におけるルシフェラーゼｍＲＮＡの翻訳
実施例１５、実施例１６及び７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧそれぞれのＩＶＴ反応によって生成されたｍＲＮＡの翻訳活性は、ヘラ細胞株（Hela cell）に当該ｍＲＮＡを形質感染させて評価した。形質感染前、ＩＶＴ反応によって合成された全てのｍＲＮＡは、poly（Ａ） tailing工程を遂行した。具体的に説明すれば、ＤＮａｓｅ１を添加し、ｍＲＮＡ合成反応が終結されたＩＶＴ ｍＲＮＡを、ＩＶＴｍ ＲＮＡ：１０ｘ poly（Ａ）ポリメラーゼ反応バッファ：１０ｍＭ ＡＴＰ溶液：poly（Ａ）ポリメラーゼ酵素（４ＫＵ／ｍｌ）：ヌクレアーゼフリー水＝２０：１０：１０：２：５８の比率（体積／体積）で混合した後、３７℃において３０分～１時間反応させた後、反応終結のために、４℃においてインキュベーションした。反応が終結されたｍＲＮＡを、製造社の指示により、ＲＮｅａｓｙマキシキット（キアゲンカタログ＃７５１６２）を使用するか、あるいは逆相高性能液体クロマトグラフィによって精製し、形質転換に使用した。HeLa細胞を、５％ ＣＯ２の大気下において、３７℃において１０％ ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補充させたＤＭＥＭで培養した。それぞれのウェル当たり１Ｘ１０４個のHeLa細胞をプレーティングした後、翌日、細胞を、それぞれのウェル当たり１００ｎｇのｍＲＮＡで、形質感染試薬（messengerMAX lipofectamine；インビトロジェンカタログ＃ＬＭＲＮＡ００３）を使用して形質感染させた。形質感染試薬メーカーの推奨事項により、チューブＡに、複合培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ；Life Technologies）５μＬに、形質感染試薬０．３μＬを希釈し、室温で１０分間インキュベーションし、チューブＢには、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ １０μＬに、製造されたｍＲＮＡ ２００ｎｇを希釈して準備した。チューブＡとチューブＢとの溶液を混合した後、室温で５分間インキュベーションさせた。その後、インキュベーションされた混合溶液を使用し、細胞を形質感染させた。形質感染の６，１２，２４時間後、細胞を収去し、製造メーカーの推奨事項により、Renilla-GloTM Luciferase Assayキット（プロメガカタログ＃Ｅ２７１０）を使用し、ルシフェラーゼ活性を測定した。形質感染された細胞の培地を除去した後、５０μｌリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を投入した。その後、５０μｌのRenilla-GloTM Luciferase Assay試薬を入れて混合し、１０分間インキュベーションした後、Varioskan LUX Multimode Microplate Reader（サーモフィッシャー）を利用し、ルシフェラーゼ活性を検出した（図５）。全てのルシフェラーゼ活性測定試験は、それぞれ独立して、３回繰り返し進め、一元配置分散分析（one-way ＡＮＯＶＡ（analysis of variance））とTukey’s hoc testsとを介し、有意性を検証した。
実施例１５、実施例１６及び７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧそれぞれのＩＶＴ反応によって生成されたｍＲＮＡの翻訳活性は、ヘラ細胞株（Hela cell）に当該ｍＲＮＡを形質感染させて評価した。形質感染前、ＩＶＴ反応によって合成された全てのｍＲＮＡは、poly（Ａ） tailing工程を遂行した。具体的に説明すれば、ＤＮａｓｅ１を添加し、ｍＲＮＡ合成反応が終結されたＩＶＴ ｍＲＮＡを、ＩＶＴｍ ＲＮＡ：１０ｘ poly（Ａ）ポリメラーゼ反応バッファ：１０ｍＭ ＡＴＰ溶液：poly（Ａ）ポリメラーゼ酵素（４ＫＵ／ｍｌ）：ヌクレアーゼフリー水＝２０：１０：１０：２：５８の比率（体積／体積）で混合した後、３７℃において３０分～１時間反応させた後、反応終結のために、４℃においてインキュベーションした。反応が終結されたｍＲＮＡを、製造社の指示により、ＲＮｅａｓｙマキシキット（キアゲンカタログ＃７５１６２）を使用するか、あるいは逆相高性能液体クロマトグラフィによって精製し、形質転換に使用した。HeLa細胞を、５％ ＣＯ２の大気下において、３７℃において１０％ ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補充させたＤＭＥＭで培養した。それぞれのウェル当たり１Ｘ１０４個のHeLa細胞をプレーティングした後、翌日、細胞を、それぞれのウェル当たり１００ｎｇのｍＲＮＡで、形質感染試薬（messengerMAX lipofectamine；インビトロジェンカタログ＃ＬＭＲＮＡ００３）を使用して形質感染させた。形質感染試薬メーカーの推奨事項により、チューブＡに、複合培地（Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ；Life Technologies）５μＬに、形質感染試薬０．３μＬを希釈し、室温で１０分間インキュベーションし、チューブＢには、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ １０μＬに、製造されたｍＲＮＡ ２００ｎｇを希釈して準備した。チューブＡとチューブＢとの溶液を混合した後、室温で５分間インキュベーションさせた。その後、インキュベーションされた混合溶液を使用し、細胞を形質感染させた。形質感染の６，１２，２４時間後、細胞を収去し、製造メーカーの推奨事項により、Renilla-GloTM Luciferase Assayキット（プロメガカタログ＃Ｅ２７１０）を使用し、ルシフェラーゼ活性を測定した。形質感染された細胞の培地を除去した後、５０μｌリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を投入した。その後、５０μｌのRenilla-GloTM Luciferase Assay試薬を入れて混合し、１０分間インキュベーションした後、Varioskan LUX Multimode Microplate Reader（サーモフィッシャー）を利用し、ルシフェラーゼ活性を検出した（図５）。全てのルシフェラーゼ活性測定試験は、それぞれ独立して、３回繰り返し進め、一元配置分散分析（one-way ＡＮＯＶＡ（analysis of variance））とTukey’s hoc testsとを介し、有意性を検証した。
【0181】
本発明の実施例１６の化合物（１６）としてキャッピングされたｍＲＮＡは、形質感染後、６時間から２４時間まで、従来の７ｍＧ（３’ＯＭｅ）ｐｐｐＡ（２’ＯＭｅ）ｐＧとしてキャッピングされたｍＲＮＡに対し、さらに高いルシフェラーゼ活性を示した（図５）。また、形質感染後、２４時間目の結果において、実施例１６化合物としてキャッピングされたｍＲＮＡによって発現されたタンパク質残存率がさらに高いということを類推することができる（図６）。
【0182】
図５及び図６の結果によれば、本発明の一具体例によるメチルグアノシンの２’ヒドロキシル基または３’ヒドロキシル基の非選択的モノエステルへの変更は、従来のキャップ類似体構造においては、期待することができなかった顕著なタンパク質発現効率を示した。それは、グアノシンの２’または３’のヒドロキシル基のうちいずれか一つを選択的に変更せず、２’または３’のヒドロキシル基のうちいずれか一つを非選択的に、すなわち、自発的に置換する反応を導入し、モノエステル形態で製造し、そのモノエステル化物が、２’構造異性体間または３’構造異性体間の動的平衡を維持する特性をキャップ類似体化合物に導入した結果であると見られる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】