特表 2024-534877 骨損傷を治療するための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-09-26

(54)【発明の名称】骨損傷を治療するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/36 20060101AFI20240918BHJP

   A61L 27/22 20060101ALI20240918BHJP

   A61L 27/12 20060101ALI20240918BHJP

   A61L 27/02 20060101ALI20240918BHJP

   A61L 27/54 20060101ALI20240918BHJP

   A61L 27/24 20060101ALI20240918BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20240918BHJP

   A61L 27/56 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 19/08 20060101ALI20240918BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20240918BHJP

【ＦＩ】

A61L27/36 100

A61L27/22

A61L27/36 110

A61L27/12

A61L27/02

A61L27/36 311

A61L27/54

A61L27/24

A61L27/36 400

A61L27/36 200

A61L27/38 111

A61L27/56

A61P19/08

A61P1/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024513734

(86)(22)【出願日】2022-08-31

(85)【翻訳文提出日】2024-04-30

(86)【国際出願番号】 US2022042258

(87)【国際公開番号】W WO2023034451

(87)【国際公開日】2023-03-09

(31)【優先権主張番号】63/239,161

(32)【優先日】2021-08-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ベルクロ

(71)【出願人】

【識別番号】518256430

【氏名又は名称】ボード オブ リージェンツ ザ ユニヴァーシティ オブ テキサス システム

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(74)【代理人】

【識別番号】100168631

【弁理士】

【氏名又は名称】佐々木 康匡

(72)【発明者】

【氏名】グラット ヴァイダ

【テーマコード（参考）】

4C081

【Ｆターム（参考）】

4C081AB02

4C081AB04

4C081AB06

4C081CD091

4C081CD111

4C081CD121

4C081CD23

4C081CD27

4C081CD28

4C081CD34

4C081CE01

4C081CE02

4C081CF031

4C081DA11

4C081DA12

4C081DA14

4C081DA15

(57)【要約】

本開示は、組成物及び生体模倣足場、ならびに対象における大きな分節骨欠損の治療、改善、及び治癒の促進のために使用される方法に関する。該方法は、上記組成物及び生体模倣足場を対象に移植することを含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組成物であって、
１）体外血腫であって、前記体外血腫は、（ａ）単離された全血、（ｂ）クエン酸ナトリウム、及び（ｃ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む、前記体外血腫と、
２）代用骨とを含む、前記組成物。

【請求項2】

組成物であって、
１）体外血腫であって、前記体外血腫は、（ａ）多血小板血漿、血漿、または赤血球を有する血漿、及び（ｂ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む、前記体外血腫と、
２）代用骨とを含む、前記組成物。

【請求項3】

前記体外血腫は、少なくとも１５０～３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン線維を含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記代用骨は、脱灰骨基質である、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項5】

前記代用骨は、生物学的製品、合成代用骨、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項6】

前記生物学的製品は、脱灰骨基質、ヒドロキシアパタイト、またはサンゴである、請求項５に記載の組成物。

【請求項7】

前記合成代用骨は、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムセメント、β－リン酸三カルシウムセラミック、生体活性ガラス、またはポリマーである、請求項５に記載の組成物。

【請求項8】

前記体外血腫は、クエン酸ナトリウムをさらに含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項9】

前記体外血腫は、抗生物質をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項10】

前記体外血腫は、１つ以上の成長因子をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

前記１つ以上の成長因子は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ－２）、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－９、ＢＭＰ－１４、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ－２）、またはそれらの組み合わせである、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記全血は、生細胞と、１つ以上の生物学的因子とを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項13】

前記血腫の形成後、前記全血の前記生細胞の約５０％～７０％は生存したままである、請求項１２に記載の組成物。

【請求項14】

前記体外血腫は、治療薬をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

前記体外血腫は、単離された全血と、エカリンと、クエン酸ナトリウムとを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項16】

前記体外血腫は、単離された全血と、塩化カルシウムと、クエン酸ナトリウムとを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項17】

前記体外血腫は、多血小板血漿と、エカリンとを含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項18】

前記体外血腫は、多血小板血漿と、塩化カルシウムとを含む、請求項２に記載の組成物。

【請求項19】

前記体外血腫は、単離された全血と、クエン酸ナトリウムと、トロンビンとを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項20】

前記体外血腫は、単離された全血、塩化カルシウム、またはオスクタリンと塩化カルシウム、及びクエン酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項21】

前記体外血腫中に存在するエカリンの濃度は少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項22】

前記体外血腫中に存在するエカリンの濃度は０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２Ｕ／ｍＬである、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項23】

骨形成タンパク質２（ＢＭＰ－２）をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項24】

前記治療薬は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ－２）である、請求項１４に記載の組成物。

【請求項25】

前記体外血腫中に存在する前記ＢＭＰ－２は少なくとも０．０１ｍｇの用量である、請求項２４に記載の組成物。

【請求項26】

前記ＢＭＰ－２は、組換えＢＭＰ－２である、請求項２４に記載の組成物。

【請求項27】

前記組換えＢＭＰ－２は、ヒトＢＭＰ－２を含む、請求項２６に記載の組成物。

【請求項28】

前記体外血腫は、成長因子と、血小板と、細胞とをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項29】

前記組成物は、ゲル、液体、粉末、ペースト、顆粒、またはパテとして製剤化される、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項30】

前記組成物は局所投与用に製剤化される、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項31】

前記体外血腫中に存在する前記エカリンの量は少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり、前記体外血腫中に存在する前記ＢＭＰ－２の量は少なくとも０．０１ｍｇである、請求項２３に記載の組成物。

【請求項32】

前記体外血腫と前記代用骨の比率は１０００：１～１：１０００である、先行請求項のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項33】

先行請求項のいずれか一項に記載の組成物を含むデバイス。

【請求項34】

単離された全血及び／または１つ以上の成長因子、１つ以上の代用骨、またはそれらの組み合わせを含む第１チャンバと、エカリンもしくは塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む第２チャンバとを含む、マルチコンパートメントデバイス。

【請求項35】

足場と、体外血腫とを含む、生体模倣足場であって、前記体外血腫は、（ａ）単離された全血、（ｂ）クエン酸ナトリウム、及び（ｃ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む、前記生体模倣足場。

【請求項36】

足場と、体外血腫とを含む、生体模倣足場であって、前記体外血腫は、（ａ）多血小板血漿、血漿、または赤血球を有する血漿、及び（ｂ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む、前記生体模倣足場。

【請求項37】

前記体外血腫は、少なくとも１５０～３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン線維を含む、請求項３５または３６に記載の生体模倣足場。

【請求項38】

代用骨をさらに含む、請求項３５または３６に記載の生体模倣足場。

【請求項39】

前記代用骨は、脱灰骨基質である、請求項３８に記載の生体模倣足場。

【請求項40】

前記代用骨は、生物学的製品または合成代用骨に由来する、請求項３９に記載の生体模倣足場。

【請求項41】

前記生物学的製品は、脱灰骨基質、ヒドロキシアパタイト、またはサンゴである、請求項４０に記載の生体模倣足場。

【請求項42】

前記合成代用骨は、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムセメント、β－リン酸三カルシウムセラミック、生体活性ガラス、またはポリマーである、請求項４０に記載の生体模倣足場。

【請求項43】

前記体外血腫と前記代用骨の比率は１０００：１～１：１０００である、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の生体模倣足場。

【請求項44】

前記体外血腫は、クエン酸ナトリウムをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の生体模倣足場。

【請求項45】

前記体外血腫は、抗生物質をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の生体模倣足場。

【請求項46】

前記体外血腫は、１つ以上の成長因子をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の生体模倣足場。

【請求項47】

前記１つ以上の成長因子は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ－２）、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－９、ＢＭＰ－１４、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ－２）、またはそれらの組み合わせである、先行請求項のいずれか一項に記載の生体模倣足場。

【請求項48】

前記単離された全血は、生細胞と、１つ以上の生物学的因子とを含む、請求項３５に記載の生体模倣足場。

【請求項49】

前記血腫の形成後、前記単離された全血の前記生細胞の約５０％～７０％は生存したままである、請求項４８に記載の生体模倣足場。

【請求項50】

前記体外血腫は、治療薬をさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の生体模倣足場。

【請求項51】

前記体外血腫は、単離された全血と、エカリンと、クエン酸ナトリウムとを含む、請求項３５に記載の生体模倣足場。

【請求項52】

前記体外血腫は、単離された全血と、塩化カルシウムと、クエン酸ナトリウムとを含む、請求項３５に記載の生体模倣足場。

【請求項53】

前記体外血腫は、多血小板血漿と、エカリンとを含む、請求項３６に記載の生体模倣足場。

【請求項54】

前記体外血腫は、多血小板血漿と、塩化カルシウムとを含む、請求項３６に記載の生体模倣足場。

【請求項55】

前記体外血腫は、単離された全血と、クエン酸ナトリウムと、トロンビンとを含む、請求項３５に記載の生体模倣足場。

【請求項56】

前記体外血腫は、単離された全血、塩化カルシウム、またはオスクタリンと塩化カルシウム、及びクエン酸ナトリウムを含む、請求項３５に記載の生体模倣足場。

【請求項57】

前記体外血腫中に存在するエカリンの濃度は少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬである、先行請求項のいずれか一項に記載の生体模倣足場。

【請求項58】

前記体外血腫中に存在するエカリンの濃度は０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２Ｕ／ｍＬである、先行請求項のいずれか一項に記載の生体模倣足場。

【請求項59】

前記体外血腫は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ－２）を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の生体模倣足場。

【請求項60】

前記治療薬は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ－２）である、請求項５０に記載の生体模倣足場。

【請求項61】

前記体外血腫中に存在する前記ＢＭＰ－２は少なくとも０．０１ｍｇの用量である、請求項５９に記載の生体模倣足場。

【請求項62】

前記ＢＭＰ－２は、組換えＢＭＰ－２である、請求項５９に記載の生体模倣足場。

【請求項63】

前記組換えＢＭＰ－２は、ヒトＢＭＰ－２を含む、請求項６２に記載の生体模倣足場。

【請求項64】

前記体外血腫は、成長因子と、血小板と、細胞とをさらに含む、先行請求項のいずれか一項に記載の生体模倣足場。

【請求項65】

前記体外血腫は、ゲル、液体、ペースト、粉末、パテ、または顆粒として製剤化される、先行請求項のいずれか一項に記載の生体模倣足場。

【請求項66】

前記体外血腫は、局所投与用に製剤化される、先行請求項のいずれか一項に記載の生体模倣足場。

【請求項67】

前記体外血腫中に存在する前記エカリンの量は少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり、前記体外血腫中に存在する前記ＢＭＰ－２の量は少なくとも０．０１ｍｇである、先行請求項のいずれか一項に記載の生体模倣足場。

【請求項68】

前記足場は、コラーゲン、キチン、生体吸収性ポリマー、ＰＥＥＫなどの非吸収性ポリマー、またはチタンもしくは金属合金である、先行請求項のいずれか一項に記載の生体模倣足場。

【請求項69】

骨治癒を促進する、または骨代替材料もしくはインプラントを製造する方法であって、前記方法は、治療を必要とする対象に、治療有効量の請求項１～３２のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。

【請求項70】

前記単離された全血は、生細胞と、１つ以上の生物学的因子とを含む、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記体外血腫は、単離された全血、エカリン、及びクエン酸ナトリウム；単離された全血、塩化カルシウム、及びクエン酸ナトリウム；多血小板血漿及びエカリン；または多血小板血漿及び塩化カルシウムを含む、請求項６９に記載の方法。

【請求項72】

前記体外血腫は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ－２）をさらに含む、請求項６９に記載の方法。

【請求項73】

前記ＢＭＰ－２は、組換えＢＭＰ－２である、請求項７２に記載の方法。

【請求項74】

前記組換えＢＭＰ－２は、ヒトＢＭＰ－２を含む、請求項７３に記載の方法。

【請求項75】

成長因子と、血小板と、細胞とをさらに含む、請求項６９に記載の方法。

【請求項76】

前記対象は、ヒトである、請求項６９に記載の方法。

【請求項77】

前記組成物は、血餅または足場として製剤化される、請求項６９に記載の方法。

【請求項78】

前記組成物は局所投与用に製剤化される、請求項６９に記載の方法。

【請求項79】

前記組成物は、局所的に投与される、移植される、または経皮的に送達される、請求項６９に記載の方法。

【請求項80】

前記組成物が移植される、請求項６９に記載の方法。

【請求項81】

前記組成物中に存在する前記エカリンの量は少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり、前記組成物中に存在する前記ＢＭＰ－２の量は少なくとも０．０１～５ｍｇである、請求項７１に記載の方法。

【請求項82】

前記対象は骨格異常を有する、請求項６９に記載の方法。

【請求項83】

前記骨格異常は、小さな骨格異常または大きな分節骨欠損である、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記対象は１つ以上の骨折を有する、請求項６９に記載の方法。

【請求項85】

前記対象は１つ以上の骨損傷を有する、請求項６９に記載の方法。

【請求項86】

前記対象は、歯の骨欠損を有する、請求項６９に記載の方法。

【請求項87】

前記代用骨は、脱灰骨基質である、請求項６９～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記代用骨は、生物学的製品、合成代用骨、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項６９に記載の方法。

【請求項89】

前記生物学的製品は、脱灰骨基質、ヒドロキシアパタイト、またはサンゴである、請求項８８に記載の方法。

【請求項90】

前記合成代用骨は、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムセメント、β－リン酸三カルシウムセラミック、生体活性ガラス、またはポリマーである、請求項８８に記載の方法。

【請求項91】

前記体外血腫と前記代用骨は、個別にまたは組み合わせて経皮的に送達される、請求項６９に記載の方法。

【請求項92】

インプラントを構築する方法であって、前記方法は、
ａ）骨欠損へのデポーインプラントの移植を容易にする形状及びサイズのうちの少なくとも１つに前記デポーインプラントの寸法を決定することと、
ｂ）
（ｉ）単離された全血とクエン酸ナトリウム、または多血小板血漿、血漿、もしくは赤血球を有する血漿、
（ｉｉ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウム、及び
（ｉｉｉ）足場を作成するための代用骨を導入することにより、前記足場を有するように前記デポーインプラントを構造化することとを含む、前記方法。

【請求項93】

前記足場は、５５～７５％の気孔率を有する、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

前記足場は、少なくとも１５０～３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン線維を含む、請求項９２に記載の方法。

【請求項95】

前記デポーインプラントの前記形状は円筒形または球形である、請求項９２に記載の方法。

【請求項96】

前記足場は血餅として構築される、請求項９２に記載の方法。

【請求項97】

１つ以上の成長因子をさらに含む、請求項９２に記載の方法。

【請求項98】

前記１つ以上の成長因子は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ－２）、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－９、ＢＭＰ－１４、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ－２）、またはそれらの組み合わせである、請求項９２に記載の方法。

【請求項99】

前記ＢＭＰ－２が前記足場に導入される、請求項９２に記載の方法。

【請求項100】

前記足場中に存在する前記エカリンの量は少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり、前記足場中に存在する前記ＢＭＰ－２の量は少なくとも０．０１ｍｇである、請求項９２に記載の方法。

【請求項101】

前記足場は、特定の骨欠損の前記サイズと形状に似ている、請求項９２に記載の方法。

【請求項102】

前記足場は走化性である、請求項９２に記載の方法。

【請求項103】

前記足場は、生血球と、適切な生物学的因子とを含む、請求項９２に記載の方法。

【請求項104】

前記代用骨は、脱灰骨基質である、請求項９２に記載の方法。

【請求項105】

前記代用骨は、生物学的製品、合成代用骨、またはそれらの組み合わせに由来する、請求項９２に記載の方法。

【請求項106】

前記生物学的製品は、脱灰骨基質、ヒドロキシアパタイト、またはサンゴである、請求項１０５に記載の方法。

【請求項107】

前記合成代用骨は、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムセメント、β－リン酸三カルシウムセラミック、生体活性ガラス、またはポリマーである、請求項１０５に記載の方法。

【請求項108】

対象の骨治癒を促進する方法であって、前記方法は、請求項３５～６８のいずれか一項に記載の生体模倣足場を前記対象の対象部位に移植することを含む、前記方法。

【請求項109】

前記対象は骨格異常を有する、請求項１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記骨格異常は、小さな骨格異常または大きな分節骨欠損である、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

前記対象は１つ以上の骨折を有する、請求項１０８に記載の方法。

【請求項112】

前記対象は１つ以上の骨損傷を有する、請求項１０８に記載の方法。

【請求項113】

前記対象は、歯の骨欠損を有する、請求項１０８に記載の方法。

【請求項114】

生体模倣足場を構築する方法であって、前記方法は、
ａ）骨欠損への足場の移植を容易にする形状及びサイズのうちの少なくとも１つに前記足場の寸法を決定することと、
ｂ）ａ）における前記足場と、
（ｉ）単離された全血とクエン酸ナトリウム、または多血小板血漿、血漿、もしくは赤血球を有する血漿、及び
（ｉｉ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む体外血腫とを組み合わせ、前記生体模倣足場を作成することとを含む、前記方法。

【請求項115】

前記体外血腫は、５５～７５％の気孔率を有する、請求項１１４に記載の方法。

【請求項116】

前記体外血腫は、少なくとも１５０～３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン線維を含む、請求項１１４に記載の方法。

【請求項117】

前記足場の前記形状は円筒形または球形である、請求項１１４に記載の方法。

【請求項118】

前記足場は、コラーゲン、キチン、生体吸収性ポリマー、ＰＥＥＫなどの非吸収性ポリマー、またはチタンもしくは金属合金である、請求項１１４に記載の方法。

【請求項119】

前記体外血腫は、代用骨をさらに含む、請求項１１４に記載の方法。

【請求項120】

前記代用骨は、脱灰骨基質である、請求項１１９に記載の方法。

【請求項121】

前記代用骨は、生物学的製品または合成代用骨に由来する、請求項１１９に記載の方法。

【請求項122】

前記生物学的製品は、脱灰骨基質、ヒドロキシアパタイト、またはサンゴである、請求項１２０に記載の方法。

【請求項123】

前記合成代用骨は、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムセメント、β－リン酸三カルシウムセラミック、生体活性ガラス、またはポリマーである、請求項１２１に記載の方法。

【請求項124】

前記体外血腫は、１つ以上の成長因子をさらに含む、請求項１１４に記載の方法。

【請求項125】

前記１つ以上の成長因子は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ－２）、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－９、ＢＭＰ－１４、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ－２）、またはそれらの組み合わせである、請求項１１４に記載の方法。

【請求項126】

前記ＢＭＰ－２は前記体外血腫に導入される、請求項１１４に記載の方法。

【請求項127】

前記体外血腫に存在するエカリンの量は少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり、前記足場中に存在する前記ＢＭＰ－２の量は少なくとも０．０１ｍｇである、請求項１１４に記載の方法。

【請求項128】

前記足場は、特定の骨欠損のサイズと形状に似ている、請求項１１４に記載の方法。

【請求項129】

前記足場は走化性である、請求項１１４に記載の方法。

【請求項130】

前記体外血腫は、生血球と、適切な生物学的因子とをさらに含む、請求項１１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年８月３１日に提出された米国仮出願第６３／２３９，１６１号の出願日の利益を主張する。この以前の出願の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

米国だけでも平均して年間７９０万件の骨折が発生しており、その約５～１０％が癒合の遅れ、癒合不全、重大でない大きさの欠損、または大きな骨欠損を引き起こしており、外科医にとって重大な治療上の課題となっている（Ｚｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ Ｓｕｒｇ．２０１６ Ｎｏｖ １６；１５１）。一般集団では、骨折の重症度、解剖学的位置、患者の併存疾患、喫煙、及び特定の薬剤の使用が、骨折治癒の問題に大きく寄与する可能性がある（Ｚｕｒａ，ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ Ｓｕｒｇ．２０１６ Ｎｏｖ １６；１５１）。脛骨、大腿骨、または上腕骨の癒合不全の治療費は、１件あたり３１，５００ドルから３４，４００ドルの範囲にあり、毎年の医療費の大きな負担となっている（Ｋａｎａｋａｒｉｓ ＮＫ，Ｇｉａｎｎｏｕｄｉｓ ＰＶ．Ｉｎｊｕｒｙ．２００７；３８ Ｓｕｐｐｌ ２：Ｓ７７ Ｓ８４；及びＷｕ，ｅｔ ａｌ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ．２０１３：５ ２１－３３）。

【0003】

さらに、イラクとアフガニスタンでの任務中に戦闘関連作戦で５万９０００人超の軍人が負傷し、そのうち５０％は大きな分節骨欠損を含む筋骨格外傷であった（Ｂｅｌｍｏｎｔ Ｊｒ．ＰＪ，ＭｃＣｒｉｓｋｉｎ ＢＪ，Ｓｉｅｇ ＲＮ，Ｂｕｒｋｓ Ｒ，Ｓｃｈｏｅｎｆｅｌｄ ＡＪ．Ｃｏｍｂａｔ ｗｏｕｎｄｓ ｉｎ Ｉｒａｑ ａｎｄ Ａｆｇｈａｎｉｓｔａｎ ｆｒｏｍ ２００５ ｔｏ ２００９．Ｊ Ｔｒａｕｍａ Ａｃｕｔｅ Ｃａｒｅ Ｓｕｒｇ．２０１２；７３：３－１２）。これらの紛争で受けた筋骨格外傷の７８％は四肢の重傷であったと推定される（Ｓｔａｎｓｂｕｒｙ ＬＧ，Ｌａｌｌｉｓｓ ＳＪ，Ｂｒａｎｓｔｅｔｔｅｒ ＪＧ，Ｂａｇｇ ＭＲ，Ｈｏｌｃｏｍｂ ＪＢ．Ａｍｐｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｕ．Ｓ．ｍｉｌｉｔａｒｙ ｐｅｒｓｏｎｎｅｌ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｃｏｎｆｌｉｃｔｓ ｉｎ Ａｆｇｈａｎｉｓｔａｎ ａｎｄ Ｉｒａｑ．Ｊ Ｏｒｔｈｏｐ Ｔｒａｕｍａ．２００８；２２：４３－４６）。このような骨損傷、特に局所的な組織の血管分布の減少と汚染された骨及び軟組織の破壊による高衝撃爆風損傷に関連する損傷は治りが悪い。このような合併症がなくても、臨界サイズを超える骨欠損には本来の治癒能力がない。大きな分節骨欠損を有する患者の管理は、軍人及び民間の外科医の両方が直面する最も困難な臨床問題の１つである（Ｐｏｌｌａｋ ＡＮ，Ｆｉｃｋｅ ＪＲ，Ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ Ｗａｒ Ｉｎｊｕｒｉｅｓ ＩＩＩ Ｓｅｓｓｉｏｎ Ｍｏｄｅｒａｔｏｒｓ．Ｅｘｔｒｅｍｉｔｙ ｗａｒ ｉｎｊｕｒｉｅｓ：ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ．２００８；１６：６２８－３４）。これらの致命的な損傷は、多くの場合、必然的に費用のかかる長期にわたる継続的な治療をもたらし、失敗や最終的には切断の重大なリスクを伴うため、これらの損傷を適切に管理する臨床医の能力を向上させることの重要性は、いくら強調してもしすぎることはない。イラクとアフガニスタン（ＯＩＦ／ＯＥＦ）だけでも軍事活動の結果、２，０００人超の兵士が少なくとも１回の切断術を必要としている（Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｈ．Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｕ．Ｓ．Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｃａｓｕａｌｔｙ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｆｒｅｅｄｏｍ’ｓ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ，Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｉｎｈｅｒｅｎｔ Ｒｅｓｏｌｖｅ，Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｎｅｗ Ｄａｗｎ，Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｉｒａｑｉ Ｆｒｅｅｄｏｍ，ａｎｄ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ Ｆｒｅｅｄｏｍ．Ｃｏｎｇｒ Ｒｅｓ Ｓｅｒｖ．２０１５；７）。さらに、非治癒の持続的な骨欠損は、仕事や軍務への復帰の遅れと関連しており、それに応じて個人の生活の質も低下する。従って、明らかに満たされない臨床ニーズがあり、これらの潜在的に致命的な損傷に対処するためのより効果的な治療戦略の開発への強力な動機となっている。

【発明の概要】

【0004】

本明細書に開示される組成物は、体外血腫であって、該体外血腫は、（ａ）単離された全血、（ｂ）クエン酸ナトリウム、及び（ｃ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む、体外血腫と、代用骨とを含む。

【0005】

本明細書に開示される組成物は、体外血腫であって、該体外血腫は、（ａ）多血小板血漿、血漿、または赤血球を有する血漿、及び（ｂ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む、体外血腫と、代用骨とを含む。

【0006】

本明細書に開示されるマルチコンパートメントデバイスは、単離された全血及び／または１つ以上の成長因子、１つ以上の代用骨、またはそれらの組み合わせを含む第１チャンバと、エカリンもしくは塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む第２チャンバとを含む。

【0007】

本明細書は、足場と、体外血腫とを含む、生体模倣足場を開示し、体外血腫は、（ａ）単離された全血、（ｂ）クエン酸ナトリウム、及び（ｃ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む。

【0008】

本明細書は、足場と、体外血腫とを含む、生体模倣足場を開示し、体外血腫は、（ａ）多血小板血漿、血漿、または赤血球を有する血漿、及び（ｂ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む。

【0009】

本明細書は、インプラントを構築する方法を開示し、該方法は、ａ）骨欠損へのデポーインプラントの移植を容易にする形状及びサイズのうちの少なくとも１つにデポーインプラントの寸法を決定することと、ｂ）（ｉ）単離された全血とクエン酸ナトリウム、または多血小板血漿、血漿、もしくは赤血球を有する血漿、（ｉｉ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウム、及び（ｉｉｉ）足場を作成するための代用骨を導入することにより、足場を有するようにデポーインプラントを構造化することとを含む。

【0010】

本明細書では、生体模倣足場を構築する方法を開示し、該方法は、ａ）骨欠損への足場の移植を容易にする形状及びサイズのうちの少なくとも１つに足場の寸法を決定することと、ｂ）ａ）における足場と、（ｉ）単離された全血とクエン酸ナトリウム、または多血小板血漿、血漿、もしくは赤血球を有する血漿、及び（ｉｉ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む体外血腫とを組み合わせ、生体模倣足場を作成することとを含む。

【0011】

本発明の組成物及び方法の他の特徴及び利点は、以下の説明、図面、及び特許請求の範囲に示される。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】手術後８週間のラットにおける５ｍｍの大腿骨欠損の治癒結果を示す。ＡＣＳ－吸収性コラーゲンスポンジ、ＢＭＰ２－骨形成タンパク質２、ＭｉｃｒｏＣＴ－マイクロコンピュータ断層撮影法、ＷＢ－全血。

【図2】脱灰骨基質（ＤＢＸと体外血腫（ＢＨ）を１：３及び１：６の比率で混合したＤＢＸ）の微細構造を示す。

【図3】３Ｄプリントされたチタン製カスタム脊椎ケージ内に送達された体外血腫を示す。

【図4】本明細書に開示されるように使用できる３Ｄの患者固有のチタン大腿骨インプラント（ケージ／足場）を示す。

【図5】体外血腫の成分を送達するために使用できる２チャンバ注射器の例を示す。１つのチャンバは凝固剤を送達でき、もう１つのチャンバは全血を単独で、または成長因子及び／または代用骨と組み合わせて送達できる。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本開示は、本明細書に含まれる以下の本発明の詳細な説明、図面及び実施例を参照することによってより容易に理解することができる。

【0014】

本組成物及び方法を開示及び説明する前に、それらは、別段の定めがない限り特定の合成方法に限定されず、または、別段の定めがない限り特定の試薬にも限定されず、したがって、当然のことながら異なるものになってもよいことを理解されたい。本明細書で使用する用語は、特定の態様のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。本明細書に記載されているものと類似するまたは同等の任意の方法及び材料を本発明の実践または試験において使用することができるが、例示的な方法及び材料を本明細書に記載する。

【0015】

さらに、別段に明記しない限り、本明細書に記述されているいずれの方法も、その工程が特定の順序で実行されることを必要とすると解釈されることを決して意図するものではないことが理解されるべきである。従って、方法の請求項がそのステップが従うべき順序を実際に記載していない場合、または該ステップが特定の順序に限定されるべきであることが請求項または説明に具体的に述べられていない場合、いかなる点でも順序が推測されることを決して意図しない。これは、ステップの配置または操作の流れに関する論理的な問題、文法構成または句読法から派生する明らかな意味、及び本明細書に記載の態様の数または種類を含めた、任意のあり得る非明示的な解釈の根拠に対して成り立つ。

【0016】

本明細書で言及される全ての出版物は、その出版物が引用される方法及び／または材料を開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。明細書中、本発明を、先行発明を理由にそのような刊行物に先行する権利がないとする承認として解釈されるべきものはなにもない。さらに、本明細書に提供する公開日は、実際の公開日と異なる場合があり、個別の確認が必要な場合がある。

【0017】

定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上別途明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。

【0018】

本明細書で使用する「または」という用語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを意味するとともに、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。

【0019】

本明細書の説明及び特許請求の範囲全体にわたって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という言葉ならびにその言葉の変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含むがそれらに限定されない」ことを意味しており、例えば、他の付加物、成分、整数またはステップを除外することを意図しない。特に、１つ以上のステップまたは操作を含むと記載された方法では、各ステップに示されたものを含むことが具体的に企図され（そのステップが「からなる」などの限定する用語を含まない限り）、各ステップが、例えば、そのステップに示されていない他の付加物、成分、整数またはステップを除外することを意図しないことを意味する。

【0020】

範囲は、本明細書では、「約」もしくは「およそ」１つの特定の値から、及び／または「約」もしくは「およそ」別の特定の値までのように表され得る。かかる範囲が表される場合、さらなる態様は、該１つの特定の値から、及び／または該他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」または「およそ」を使用することによって、該特定の値がさらなる態様を形成することが理解される。さらに、該範囲の各々の端点は、他の端点との関連において、及び他の端点とは独立しての両方で重要であることが理解される。また、本明細書に開示される多くの値があること、及び各値もまた、該値自体に加えて、「約」その特定の値として本明細書に開示されることも理解される。例えば、「１０」という値が開示される場合、「約１０」も開示される。また、２つの特定の単位間の各単位も開示されることが理解される。例えば、１０及び１５が開示される場合、１１、１２、１３、及び１４も開示される。

【0021】

本明細書で使用される、「任意の」または「任意に」という用語は、その後に記載される事象または状況が生じても生じなくてもよいこと、ならびにその記載が、該事象または状況が生じる場合及びそれが生じない場合を含むことを意味する。

【0022】

本明細書で使用される、「対象」という用語は、投与の標的、例えば、ヒトを指す。従って、本開示の方法の対象は、脊椎動物、例えば、哺乳動物、魚類、鳥類、ハ虫類、または両生類であり得る。「対象」という用語は、家庭用動物（例えば、ネコ、イヌなど）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、及び実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ショウジョウバエなど）も含む。一態様では、対象は哺乳動物である。別の態様では、対象はヒトである。この用語は、特定の年齢または性別を意味しない。従って、雌雄にかかわらず、成年、幼年、青年、及び新生対象、ならびに胎児が包含されることが意図される。

【0023】

本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、疾患、障害、または状態に罹患している対象を指す。「患者」という用語は、ヒト及び動物対象を含む。開示された方法のいくつかの態様では、「患者」は、例えば、投与ステップの前などに、骨損傷を治癒するための治療が必要であると診断されている。

【0024】

本明細書で使用されるとき、「治療」という用語は、特定の疾患、障害及び／または状態の１以上の症状または特徴を部分的にまたは完全に緩和する、改善する、軽減する、その発症を遅延させる、その進行を抑制するもしくは緩徐にする、その重症度を低減させる、及び／またはその発生率を低減させることを指す。疾患、障害及び／または状態と関連付けられる病態を発症するリスクを低下させる目的で、疾患、障害及び／または状態の徴候を示さない対象に対して、及び／または疾患、障害及び／または状態の初期の徴候のみを示す対象に対して、治療を施すことができる。例えば、病気、障害、及び／または状態は、骨損傷または骨折であり得る。

【0025】

大きな分節骨欠損を治療する現在の方法。骨格異常の治療は、自家骨移植、様々な骨移植代替品、イリザロフ法、巨大プロテーゼによる関節形成術、生物学的製品、そして最後の手段としての切断術など、多くの技術が採用されてきた。しかし、これらの既存の治療法は、複数回の手術を伴う長期にわたる治療を必要とし、費用が高く、合併症発生率が高く、治療失敗の重大なリスクを伴うという特徴がある。例えば、自家移植は依然として大きな分節骨欠損を治癒する場合の最適な治療法である（Ｋｈａｎ ＳＮ，Ｃａｍｍｉｓａ ＦＰ，Ｓａｎｄｈｕ ＨＳ，Ｄｉｗａｎ ＡＤ，Ｇｉｒａｒｄｉ ＦＰ，Ｌａｎｅ ＪＭ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ．２００５；１３：７７－８６）。自家骨移植は、依然として骨欠損を治療する際に選択される治療法であり、しかし、特に民間人や重傷を負った兵士の重度の外傷や骨折の癒合不全の場合、十分な自家移植片材料の供給が制限され得、ドナー部位の重大な罹患率と関連している。対照的に、骨移植片は大量に入手可能であるが、その使用には病気の伝染や免疫反応に関する懸念が生じる（Ｋｈａｎ ＳＮ，Ｃａｍｍｉｓａ ＦＰ，Ｓａｎｄｈｕ ＨＳ，Ｄｉｗａｎ ＡＤ，Ｇｉｒａｒｄｉ ＦＰ，Ｌａｎｅ ＪＭ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ．２００５；１３：７７－８６）、しかし、より重要なのは、それが吸収も再構築もうまくいかない死んだ骨で構成されるということである。また、負荷がかかると微小骨折が徐々に蓄積し、５年間の故障率が３０％以上になることもわかっている（Ｅｎｎｅｋｉｎｇ ＷＦ，Ｃａｍｐａｎａｃｃｉ ＤＡ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．２００１；８３－Ａ：９７１－９８６；及びＷｈｅｅｌｅｒ ＤＬ，Ｈａｙｎｉｅ ＪＬ，Ｂｅｒｒｅｙ Ｈ，Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ Ｍ，Ｅｎｎｅｋｉｎｇ Ｗ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ｉｎｓｔｒｕｍ．２００１；３７：２５１－２５６）。さらに、大きな分節骨欠損の治療を助けるために、様々な代用骨も開発されるが、これらのアプローチは転帰のわずかな改善に限定される。不十分な骨形成、貧弱な機械的特性及び取り扱い特性、生体適合性の欠如、予測不可能な吸収、及び関連する炎症反応が、このような材料にとって依然として大きな制限となっている（ＭｃＫｅｅ ＭＤ．Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ．２００６；１４：Ｓ１６３－７）。このため、仮骨延長術は、依然として８ｃｍを超える骨欠損に対して軍医によって選択される治療法である。しかし、この技術は扱いにくく、痛みを伴い、信頼性が低く、ピントラック感染症によって複雑になり、治癒が遅くなる可能性がある（Ｐｏｌｌａｋ ＡＮ，Ｆｉｃｋｅ ＪＲ，Ｊ Ａｍ Ａｃａｄ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｕｒｇ．２００８；１６：６２８－３４）。とりわけ、大きな分節骨欠損に対して利用可能な治療オプションの主な問題は、機能を迅速に回復することができず、屈折率を低下させることができないことである。

【0026】

骨形成の生物学の研究により、最も強力な骨形成誘導因子の一部である骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が発見された（Ｕｒｉｓｔ ＭＲ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ．１９９７；１２：３４３－６）。ＢＭＰファミリーの２つのメンバー、組換えヒトＢＭＰ－２（ｒｈＢＭＰ－２、ＩＮＦＵＳＥ（登録商標））と組換えヒトＢＭＰ－７（ｒｈＢＭＰ－７、ＯＰ－１（登録商標））の臨床使用が承認される。ＢＭＰは動物モデルで前臨床効果を示すが、臨床効果は期待外れであった。これらのタンパク質に対するわずかな臨床反応は、送達の問題に関連している。さらに、非常に高い生理学的用量のＢＭＰを使用する現在の治療法では、そのほとんどが適用部位から急速に浸出するため、異所性／異所性骨化や、抗体形成、インプラントの脱落、骨吸収、さらには癌などの他の多くの関連副作用の発生率と重症度が増加する可能性がある（Ｃａｒｒａｇｅｅ ＥＪ，Ｈｕｒｗｉｔｚ ＥＬ，Ｗｅｉｎｅｒ ＢＫ．Ｓｐｉｎｅ Ｊ．２０１１；１１：４７１－４９１）。従って、必要な用量を大幅に最小限に抑えてＢＭＰの有効性を向上させ、ＢＭＰの潜在的な副作用と関連する治療費を制限するには、適切な担体を開発する必要がある。

【0027】

自家骨移植に対する最も有望な代替法の１つは、吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）上に送達された組換えヒト骨形成タンパク質２（ｒｈＢＭＰ－２）の使用である。しかし、骨治癒の成功は、そのバースト放出及び体内での短い半減期に起因して、ｒｈＢＭＰ－２の常に高い生理学的用量を必要とし、その大部分は、コラーゲンスポンジが骨欠損領域への挿入後に圧縮されるとすぐに急速に浸出する。これは、異所性／異所性骨化の発症率及び重症度の増加、ならびに抗体形成、インプラントの除去、骨吸収、及び癌さえといった多くの他の関連する副作用をもたらす。より適切な担体は、これらの複雑な骨損傷を治療し、必要とされる用量を有意に減少させることによってＢＭＰの有効性を改善し、従って、それらの潜在的に危険な副作用を軽減するために明らかに必要とされる。

【0028】

近年、高濃度の血小板が濃縮された血漿である多血小板血漿（ＰＲＰ）が、筋骨格外傷の治療を含む幅広い用途で試験されている。ＰＲＰは、生理学的濃度を超える濃度で様々な成長因子やサイトカインを分泌し、フィブリン血塊の形態で細胞を支持する基質を生成すると考えられている。具体的には、骨治癒を促進するＰＲＰの効果（Ｉｑｂａｌ Ｊ，Ｐｅｐｋｏｗｉｔｚ ＳＨ，Ｋｌａｐｐｅｒ Ｅ．Ｃｕｒｒ Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ Ｒｅｐ．２０１１；９：２５８－２６３；及びＫｕｒｉｋｃｈｙ ＭＱ，Ａｌ－Ｒａｗｉ ＮＨ，Ａｙｏｕｂ ＲＳ，Ｍｏｈａｍｍｅｄ ＳＳ．Ｃｌｉｎ Ｏｒａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．２０１３；１７：８９７－９０４）は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）などの因子の濃度増加によるものであることが示唆される（Ｓｏｆｆｅｒ Ｅ， Ｏｕｈａｙｏｕｎ ＪＰ，Ａｎａｇｎｏｓｔｏｕ Ｆ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｏｒａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｅｎｄｏｄｏｎｔｉｃｓ．２００３．ｐｐ．５２１－５２８）。それにもかかわらず、口腔及び顎顔面の骨移植処置にＰＲＰを使用した実験（Ｓｉｍｍａｎ Ｒ，Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ａ，Ｂｏｈｉｎｃ ＲＪ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＷＣ，Ｒｕｓｓ ＡＪ．Ａｎｎ Ｐｌａｓｔ Ｓｕｒｇ．２００８；６１：３３７－４４）及び臨床研究の結果（Ｍａｒｘ ＲＥ， Ｃａｒｌｓｏｎ ＥＲ，Ｅｉｃｈｓｔａｅｄｔ ＲＭ，Ｓｃｈｉｍｍｅｌｅ ＳＲ，Ｓｔｒａｕｓｓ ＪＥ，Ｇｅｏｒｇｅｆｆ ＫＲ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ Ｅｎｄｏｄ．１９９８；８５：６３８－４６）には議論の余地があり、現在までＰＲＰが実際に骨治癒を改善または促進することを示唆する証拠はほとんどなく、実際、大部分の症例では骨形成が減少した（Ｃｈｏｉ Ｂ－Ｈ，Ｉｍ Ｃ－Ｊ，Ｈｕｈ Ｊ－Ｙ，Ｓｕｈ Ｊ－Ｊ，Ｌｅｅ Ｓ－Ｈ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｒａｌ Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ Ｓｕｒｇ．２００４；３３：５６－９；及びＭａｒｄｅｎ ＬＪ，Ｆａｎ ＲＳＰ，Ｐｉｅｒｃｅ ＧＦ，Ｒｅｄｄｉ ＡＨ，Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ＪＯ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９９３；９２：２８９７－２９０５）。この明らかな効果の欠如は、長骨や脊椎にも及ぶ。ヒツジを対象とした最近の研究では、大腿骨骨幹の骨切り術とそれに続く仮骨延長術を行ったが、ＰＲＰの適用により新しい骨の形成が改善されたことは示されなかった（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ａ，Ｖｅｌｅｚ Ｒ，Ｓｏｌｄａｄｏ Ｆ，Ｓａｅｎｚ－Ｒｉｏｓ ＪＣ，Ｂａｒｂｅｒ Ｉ，Ａｇｕｉｒｒｅ－Ｃａｎｙａｄｅｌｌ Ｍ．Ｉｎｊｕｒｙ．２０１３；４４：９０１－７）。同様に、げっ歯類の研究では、ＰＲＰは骨治癒（Ｐｒｙｏｒ ＭＥ，Ｙａｎｇ Ｊ，Ｐｏｌｉｍｅｎｉ Ｇ，Ｋｏｏ Ｋ，Ｈａｒｔｍａｎ ＭＪ，Ｇｒｏｓｓ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．２００５；７６：１２８７－１２９２；及びＲａｎｌｙ ＤＭ，Ｌｏｈｍａｎｎ ＣＨ，Ａｎｄｒｅａｃｃｈｉｏ Ｄ，Ｂｏｙａｎ ＢＤ，Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｚ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．２００７；８９：１３９－１４７）に有益な効果を示さないか、せいぜい再生能力が低いことが示されている（Ｓａｎｃｈｅｚ ＡＲ， Ｓｈｅｒｉｄａｎ ＰＪ，Ｅｃｋｅｒｔ ＳＥ，Ｗｅａｖｅｒ ＡＬ．Ｊ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．２００５；７６：１６３７－１６４４）。脊椎固定術後の骨治癒を促進する研究でも、動物（Ｌｉ Ｈ，Ｚｏｕ Ｘ，Ｘｕｅ Ｑ，Ｅｇｕｎｄ Ｎ，Ｌｉｎｄ Ｍ，Ｂｕｎｇｅｒ Ｃ．Ｅｕｒ Ｓｐｉｎｅ Ｊ．２００４；１３：３５４－８）にもヒト（Ｗｅｉｎｅｒ ＢＫ，Ｗａｌｋｅｒ Ｍ．Ｓｐｉｎｅ（Ｐｈｉｌａ Ｐａ １９７６）．２００３；２８：１９６８－１９７０）にも利点はなかった。これらの研究における様々な結果の原因となる要因は不明であるが、血小板中に存在するプロテアーゼが成長因子を分解し（Ｔｈｉｂａｕｌｔ Ｌ，Ｂｅａｕｓｅｊｏｕｒ Ａ，Ｄｅ Ｇｒａｎｄｍｏｎｔ ＭＪ，Ｌｅｍｉｅｕｘ Ｒ，Ｌｅｂｌａｎｃ ＪＦ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２００６；４６：１２９２－１２９９）、それによってＰＲＰ の組成が変化し、その実験的及び臨床的有効性が低下する可能性があることが示唆されている。さらに、ＰＲＰの活性化には、成長因子のバースト放出と総成長因子濃度の減少をもたらすトロンビンが必要である。ウシトロンビンは、トロンビンに対する抗体を刺激することでヒトの凝固タンパク質を妨害し、これが治癒過程に影響を与えると考えられている（Ｏｒｙａｎ Ａ，Ａｌｉｄａｄｉ Ｓ，Ｍｏｓｈｉｒｉ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１６；１６：２１３－３２）。これは、ＰＲＰが適切な構造的特性を備えた血餅を形成できないことにも関係する可能性がある。

【0029】

ＰＲＰのパフォーマンスが悪いことに基づいて、「第二世代」の濃縮血小板は、フランスの顎顔面外科医Ｊｏｓｅｐｈ Ｃｈｏｕｋｒｏｕｎによって開発され、多血小板フィブリン（ＰＲＦ）と呼ばれる（Ｃｈｏｕｋｒｏｕｎ Ｊ，Ｄｉｓｓ Ａ，Ｓｉｍｏｎｐｉｅｒｉ Ａ，Ｇｉｒａｒｄ Ｍ－Ｏ，Ｓｃｈｏｅｆｆｌｅｒ Ｃ，Ｄｏｈａｎ ＳＬ，ｅｔ ａｌ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ Ｅｎｄｏｄ．２００６；１０１：２９９－３０３）。これは、治癒と免疫に有利な血液成分を含む、より自然なフィブリン基質として説明されており、ＰＲＰに比べて特別な利点がある。例えば、凝固プロセスは、トロンビンをＰＲＰに加えると起こる急速な重合と比較して、より遅い自然重合によって起こる。最も重要なことは、ＰＲＦには抗凝固剤やトロンビン添加剤が必要ないことである（Ｄｏｈａｎ ＤＭ，Ｃｈｏｕｋｒｏｕｎ Ｊ，Ｄｉｓｓ Ａ，Ｄｏｈａｎ ＳＬ，Ｄｏｈａｎ ＡＪＪ，Ｍｏｕｈｙｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ Ｅｎｄｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ．２００６；１０１）。インビトロ研究では、ＰＲＦはＰＤＧＦ、ＴＧＦ－β、ＢＭＰなどの成長因子をより持続的に放出し、最大２８日間持続することも示す（Ｈｅ Ｌ，Ｌｉｎ Ｙ，Ｈｕ Ｘ，Ｚｈａｎｇ Ｙ，Ｗｕ Ｈ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ Ｅｎｄｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ．２００９；１０８：７０７－７１３）。この放出プロファイルは、１日以内にサイトカインと成長因子がバースト放出されることを特徴とするＰＲＰとは大きく異なる。それにもかかわらず、ＰＲＦを口腔及び顎顔面の外科手術に適用した場合、目立った改善は見られなかった（Ｃｈｏｕｋｒｏｕｎ Ｊ， Ｄｉｓｓ Ａ，Ｓｉｍｏｎｐｉｅｒｉ Ａ，Ｇｉｒａｒｄ Ｍ－Ｏ，Ｓｃｈｏｅｆｆｌｅｒ Ｃ， Ｄｏｈａｎ ＳＬ，ｅｔ ａｌ．Ｏｒａｌ Ｓｕｒｇ Ｏｒａｌ Ｍｅｄ Ｏｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ Ｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｌ Ｅｎｄｏｄ．２００６；１０１：２９９－３０３；及びＢｕｓｅｎｌｅｃｈｎｅｒ Ｄ，Ｈｕｂｅｒ ＣＤ，Ｖａｓａｋ Ｃ，Ｄｏｂｓａｋ Ａ，Ｇｒｕｂｅｒ Ｒ，Ｗａｔｚｅｋ Ｇ．Ｃｌｉｎ Ｏｒａｌ Ｉｍｐｌａｎｔｓ Ｒｅｓ．２００９；２０：１０７８－１０８３）。また一方、これは、ＰＲＰと同様に、不適切な構造的特性とともに、送達される血小板の量が不十分であることに関連している可能性がある。

【0030】

骨折治癒に対する血腫形成の影響。骨折血腫の形成は、骨損傷から数分以内に発生し、及び血液系からの活性化された凝固因子に加えて、骨膜、骨髄、周囲の軟組織に由来する多くの分子因子（骨形成因子及び血管形成因子を含む炎症促進性サイトカインや成長因子など）に関与する生物学的事象のカスケードを含む（Ｌａｉ ＢＦＬ，Ｚｏｕ Ｙ，Ｂｒｏｏｋｓ ＤＥ，Ｋｉｚｈａｋｋｅｄａｔｈｕ ＪＮ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｌｔｄ；２０１０；３１：５７４９－５７５８）。骨折部位では、持続的な失血を防ぐために血管が収縮し、続いて凝固カスケードが起こり、壊れた断片の間に血腫または血栓が形成される（Ｓｃｈｉｎｄｅｌｅｒ Ａ，ＭｃＤｏｎａｌｄ ＭＭ，Ｂｏｋｋｏ Ｐ，Ｌｉｔｔｌｅ ＤＧ．Ｓｅｍｉｎ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ．２００８；１９：４５９－６６）。凝固プロセスには、内因性と外因性の２つの主要な経路があり、共通の経路は凝固因子ＸからＸａへの変換である。凝固カスケードの最後のプロテアーゼであるトロンビンは、キモトリプシンファミリーの典型的なセリンプロテアーゼであり、凝固促進機能と抗凝固機能の両方を持っている（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ ＪＡ．Ｔｈｒｏｍｂｉｎ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ－Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｂ．Ｖ．；２０１２；１８２４：２４６－２５２）。正常な血液凝固中、凝固カスケードはチモーゲンプロトロンビンをセリンプロテアーゼトロンビンに変換することによって活性化する。次に、トロンビンは可溶性フィブリノーゲンを不溶性フィブリン線維に変換する。最後に、これらのフィブリン線維は、凝固第ＸＩＩＩ因子の助けを借りて、成熟した水かき状のフィブリン血塊の形成に寄与する（Ｃｈｅｒｎｙｓｈ ＩＮ，Ｎａｇａｓｗａｍｉ Ｃ，Ｐｕｒｏｈｉｔ ＰＫ，Ｗｅｉｓｅｌ ＪＷ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１２；２： ８７９）。従って、フィブリノーゲン、トロンビン、及び凝固第ＸＩＩＩ因子の濃度勾配は、フィブリン血塊の立体構造の調節に重要な役割を果たす（Ｗｏｌｂｅｒｇ ＡＳ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＲＡ．Ｔｒａｎｓｆｕｓ Ａｐｈｅｒ Ｓｃｉ． ２００８；３８：１５－２３）。フィブリン血塊の構造パラメータは、線維の直径、密度、分岐点の数、分岐点間の距離、及び細孔の寸法によって特徴付けることができる（Ｗｅｉｓｅｌ ＪＷ，Ｌｉｔｖｉｎｏｖ ＲＩ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１：１７１２－１７１９）。フィブリン線維の直径の増加はフィブリン線維の密度に反比例し、孔径に正比例する（Ｅｉｃｈｈｏｒｎ ＳＪ，Ｓａｍｐｓｏｎ ＷＷ．Ｊ Ｒ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．２００５；２：３０９－３１８；及びＫａｕｒ Ｓ，Ｓｕｎｄａｒｒａｊａｎ Ｓ，Ｒａｎａ Ｄ，Ｍａｔｓｕｕｒａ Ｔ，Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ Ｓ．Ｊ Ｍｅｍｂ Ｓｃｉ．２０１２；３９２－３９３：１０１－１１１）。さらに、線維の直径と密度は、フィブリン血塊の多孔性と表面積に影響を与え（Ｐｈａｍ ＱＰ，Ｓｈａｒｍａ Ｕ，Ａｎｔｏｎｉｏｓ Ｇ．Ｍｉｋｏｓ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２００６；７：２７９６－２８０５）、接着、増殖、分化などの幹細胞の生物学的機能に関与する（Ｂａｄａｍｉ ＡＳ，Ｋｒｅｋｅ ＭＲ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＭＳ，Ｒｉｆｆｌｅ ＪＳ，Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ＡＳ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２００６；２７：５９６－６０６）。例えば、低トロンビン濃度（＜１ｎＭ）では線溶に非常に敏感な太いフィブリン線維の多孔性ネットワークが生成されるが、高濃度のトロンビンでは線維素溶解に比較的耐性のある透過性の低いフィブリンネットワークを形成する細い線維が生成される（Ｇａｂｒｉｅｌ ＤＡ，Ｍｕｇａ Ｋ，Ｂｏｏｔｈｒｏｙｄ ＥＭ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：２４２５９－６３）。さらに、個々の太い線維はより高い機械的強度（剛性）を持つが、太い線維で構成されるフィブリン血塊は、多くの場合、線維の数が減少した結果、機械的強度が低くなる（Ｃａｒｌｉｓｌｅ ＣＲ，Ｃｏｕｌａｉｓ Ｃ，Ｇｕｔｈｏｌｄ Ｍ．Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ．２０１０；６：２９９７－３００３；及びＬｉｕ Ｗ，Ｔｈｏｍｏｐｏｕｌｏｓ Ｓ，Ｘｉａ Ｙ．Ａｄｖ Ｈｅａｌｔｈｃ Ｍａｔｅｒ．２０１２；１：１０－２５）。

【0031】

足場と開示された体外血腫との組み合わせは、それ自体では自然に治癒しない大きな部分欠損における骨再生を首尾よくかつ効率的に促進するために使用され得る。いくつかの態様では、上記組み合わせは、現在使用されている標準用量（１１μｇ）よりも約３３倍少ないｒｈＢＭＰ－２で使用され得る。本明細書で使用される場合、体内での５ｍｍ大腿骨欠損ラットモデルを使用した場合、体外血腫を介して送達されたｒｈＢＭＰ２（例えば、０．３３μｇ）は、吸収性コラーゲンスポンジで送達された場合よりもはるかに効率的であった。大きな骨欠損は、著しく低用量のｒｈＢＭＰ－２で一貫して治癒し、治癒した骨の質も、８週間終了時の仮骨サイズと骨形態計測パラメータに基づくと、吸収性コラーゲンスポンジ上で一部を含まずに送達されたｒｈＢＭＰ－２と比較して、体外血腫グループの方が優れていた。本明細書は、足場及び体外血腫を含む生体模倣足場を開示する。本明細書は、正常な骨折血腫を模倣するように設計及び作製することができるが、特定の濃度のカルシウム及びトロンビンまたはエカリンとともに非常に低用量のｒｈＢＭＰ－２をより効率的に送達することができる、足場及び体外血腫を含む生体模倣足場を開示する。他の骨形成タンパク質も、本明細書に記載の体外血腫に含まれ得る。足場と、体外血腫とを含む、生体模倣足場の設計及び使用は、少なくとも損傷時に形成された血腫が生物学的事象のカスケードを活性化する足場として機能するため、骨折時に形成される血腫を模倣するように行うことができる。骨折の治癒を開始するために、このカスケードは、血液系の凝固因子だけでなく、骨膜、骨髄、周囲の軟組織に由来する多くの分子因子（炎症促進性サイトカインや成長因子、骨形成因子や血管新生因子など）の活性化にも関与する。骨折部位の生体模倣足場に形成される血腫は、骨折の治癒方法に大きな影響を与える可能性があるが、この血腫を除去すると骨折の治癒が遅れる。

【0032】

本明細書は、大きな分節骨欠損の治癒を促進するために、誘発された血栓の構造的及び生物学的特性を改善する方法を開示する。例えば、兵士及び民間人の大きな分節骨欠損の治癒を大幅に改善及び促進するために、生来の骨折血腫の構造的特性を模倣するフィブリン血塊を構築することによって生成される体外血腫の足場を含む生体模倣足場が本明細書に記載される。

【0033】

血栓形成促進性ヘビ毒。多くのヘビ毒毒素は、凝固トロンビン様酵素及びプロトロンビン活性化毒素の作用によって止血に影響を与えるタンパク質分解酵素を含む。第Ｘ因子から（活性化された）Ｘａへの変換は、外因性凝固経路と内因性凝固経路の間の共通の接続点である。ヘビ毒酵素は、凝固カスケードの様々な段階を利用するために進化した。これらの毒は、血小板、内皮細胞、血漿タンパク質と脊椎動物の止血段階に影響を与える毒タンパク質との間に存在する脆弱な相互作用を利用するために進化した（Ｍｅｉｅｒ Ｊ，Ｓｔｏｃｋｅｒ Ｋ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９１；２１：１７１－１８２）。ヘビの種類に応じて、それぞれが特定の凝固促進因子を持っている。例えば、沿岸タイパン（Ｏｘｙｕｒａｎｕｓ ｓｃｕｔｅｌｌａｔｕｓ）の毒に含まれる凝固促進因子オスキュタリンは、哺乳動物の凝固因子Ｘと構造的及び機能的に類似する。オスクタリンは、グループＣのプロトロンビン活性化因子毒に属するセリンプロテアーゼであり、哺乳動物の第Ｘ因子とは異なり、独自の第Ｖａ因子様分子を含むため、非酵素的な第Ｖ因子を必要としない（Ｓｔ． Ｐｉｅｒｒｅ Ｌ， Ｍａｓｃｉ ＰＰ，Ｆｉｌｉｐｐｏｖｉｃｈ Ｉ，Ｓｏｒｏｋｉｎａ Ｎ，Ｍａｒｓｈ Ｎ，Ｍｉｌｌｅｒ ＤＪ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｉｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｖｅｎｏｍ ｏｆ Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｅｌａｐｉｄｓ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｅｖｏｌ．２００５；２２：１８５３－１８６４）。同様に、ノコギリヘラヘビ（Ｅｃｈｉｓ ｃａｒｉｎａｔｕｓ）の毒に含まれるエカリンは、塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂）やリン脂質などの補因子の関与なしに作用するメタロプロテイナーゼである。補因子の要件がないため、エカリンはカルボキシル化プロトロンビンと脱カルボキシル化プロトロンビンの両方をメイゾトロンビンに変換できる（Ｈｕｔｔｏｎ Ｒ．Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．１９９３；７：１７６－１８９）。メイゾトロンビンは、全血凝固中のトロンビン生成の中間製品であり、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換における酵素活性が限定されると報告される（Ｂｏｖｉｌｌ ＥＧ，Ｔｒａｃｙ ＲＰ，Ｈａｙｅｓ ＴＥ，Ｊｅｎｎｙ ＲＪ，Ｂｈｕｓｈａｎ ＦＨ，Ｍａｎｎ ＫＧ．Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ Ｖａｓｃ Ｂｉｏｌ． １９９５；１５：７５４－７５８；及びＫｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙ Ｓ，Ｍａｎｎ ＫＧ，Ｎｅｓｈｅｉｍ ＭＥ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８６；２６１：８９７７－８９８４）。一方、ラッセルクサリヘビ（Ｄａｂｉｏａ ｒｕｓｓｅｌｌｉ）の毒から単離されたセリンプロテアーゼＲＶＶ－Ｖは、カルシウム非依存的に第Ｖ因子を特異的に活性化する。同じくラッセルクサリヘビの毒から単離された、よく特徴付けられたもう１つのプロテアーゼＲＶＶ－Ｘは、第Ｘ因子の強力かつ特異的な活性化因子である。ＲＶＶ－Ｖとは対照的に、ＲＶＶ－Ｘは補因子としてＣａ²⁺を必要とするが、リン脂質は必要としないメタロプロテイナーゼである（Ｔａｋｅｙａ Ｈ，Ｎｉｓｈｉｄａ Ｓ，Ｍｉｙａｔａ Ｔ，Ｋａｗａｄａ ＳＩ，Ｓａｉｓａｋａ Ｙ，Ｍｏｒｉｔａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：１４１０９－１４１１７；及びＴｏｋｕｎａｇａ Ｆ，Ｎａｇａｓａｗａｑ Ｋ，Ｍｉｙａｔａｑ Ｔ，Ｉｗａｎａｇａｑｌｌ Ｓ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８８；２６３：１７４７１－１７４８１）。比較すると、正常な骨折部位では、第Ｘ因子が血小板膜上の第Ｖ因子に結合し、トロンビンの生成が何千倍も加速され、これが、一次止血栓を安定化させる成熟した血栓の形成につながるメカニズムである（Ｐｒｏｂｓｔ Ａ，Ｓｐｉｅｇｅｌ Ｈ－Ｕ．Ｊ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｓｕｒｇ．１９９７；１０：７７－８６）。前述のことは、ヘビ毒から単離された凝固促進因子が、血栓の構造的特性を変化させるためのより自然な凝固剤として適しているはずであることを示唆する。実際、ヘビ毒タンパク質は、凝固カスケードを支配し、血小板の機能を決定する複雑な生理学的機構を解明する上で重要である。さらに、それらは、その効力、選択性、及び高い生物学的有効性により、ヒト凝固因子と血小板糖タンパク質の構造的及び機能的関係を解明するのに役立ってきた（Ｈｏｎｇ Ｔ－Ｔ，Ｈｕａｎｇ Ｊ，Ｌｕｃｃｈｅｓｉ ＢＲ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００６；２９０：Ｈ９５９－６７；Ｈａｎ ＳＭ，Ｗｅａｖｅｒ ＦＡ， Ｃｏｍｅｒｏｔａ ＡＪ，Ｐｅｒｌｅｒ ＢＡ，Ｊｏｉｎｇ Ｍ．Ｊ Ｖａｓｃ Ｓｕｒｇ．２０１０；５１：６００－９；Ｓａｎｃｈｅｚ ＥＦ，Ｂｕｓｈ ＬＲ，Ｓｗｅｎｓｏｎ Ｓ，Ｍａｒｋｌａｎｄ ＦＳ．Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．１９９７；８７：２８９－３０２；Ｓｗｅｎｓｏｎ Ｓ，Ｂｕｓｈ ＬＲ，Ｍａｒｋｌａｎｄ ＦＳ．Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．２０００；３８４：２２７－３７；及びＳｈａｈ ＡＲ，Ｓｃｈｅｒ Ｌ．ＩＤｒｕｇｓ．２００７；１０：３２９－３５）。その結果、いくつかの活性毒化合物が同定、単離、特徴付け、精製され、現在は診断と医療の両方の目的で使用される（Ｋｉｎｇ ＧＦ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１１；１１：１４６９－８４；及びＢｕｔｌｅｒ ＭＳ．Ｎａｔ Ｐｒｏｄ Ｒｅｐ．２００８；２５：４７５－５１６）。本明細書に記載されるように、臨床的に使用された場合に副作用があることが示されているトロンビンの添加とは対照的に、代替凝固剤としてヘビ毒凝固酵素（ＳＶＣＥ）を含む組成物である（Ｏｒｙａｎ Ａ，Ａｌｉｄａｄｉ Ｓ，Ｍｏｓｈｉｒｉ Ａ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１６；１６：２１３－３２）。特定のＳＶＣＥは、対応する哺乳動物よりも触媒活性が高いことが示されており、追加のジスルフィド架橋の存在により熱安定性が高く、タンパク質分解に対する耐性が高いことが知られている（Ｋａｎｇ ＴＳ，Ｇｅｏｒｇｉｅｖａ Ｄ， Ｇｅｎｏｖ Ｎ，Ｍｕｒａｋａｍｉ ＭＴ， Ｓｉｎｈａ Ｍ，Ｋｕｍａｒ ＲＰ，ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｊ． ２０１１；２７８：４５４４－７６）。本明細書は、ヘビ毒酵素が血腫の特性を変化させる能力、及びラットモデルを使用して大きな分節欠損を治癒する能力を実証する生体模倣足場及び方法を開示する。

【0034】

ヘビ毒由来の凝固因子が好まれてきた理由はいくつかある。その理由は、例えば、他の凝固因子に影響を与えないこと、分子サイズが小さいため、使用時に体の免疫系によって認識されにくく、従って攻撃される可能性が低いことなどである。さらに、分子は体内の標的に選択的に結合するため、望ましくない副作用の可能性が最小限に抑えられる。エカリンは活性化に補因子を必要としないため、特に選択された。

【0035】

本開示は、骨損傷の治癒を促進し、生活の質を向上させ、高い治療コストを削減し、民間人及び兵士の重度の外傷及び戦場での損傷による切断率を減少させるための新規及び改良された治療戦略を開発するために重要である。本明細書に開示される結果は、自然治癒する骨折血腫の固有の構造的及び生物学的特性を模倣することによって、骨治癒の有効性を高める特性を備えた体外生成血腫の要件を提供することができる。本開示はまた、大きな分節骨欠損、亜臨界サイズ欠損の治癒を促進するための生体模倣足場を形成するために足場と組み合わせることができる骨誘導性及び骨伝導性の成長因子リザーバとしての体外血腫の開発、及び非治癒骨折の治療のために有用である体外血腫の開発にも重要である（癒合遅延または癒合不全）。体外血腫と、例えば、骨修復用途に適した機械的特性を備えて設計できる骨伝導性足場とを組み合わせる組成物が開示される。例えば、これらの足場を使用すると、かなりの距離にわたって骨を再生し、結果として生じる骨密度、構造、及び足場の再構築率を制御することができる。いくつかの態様では、足場は、現在の骨移植技術及び骨移植代替品を置き換えるために使用できる３Ｄプリントされた足場であり得る。

【0036】

民間または軍の臨床現場で高度に特殊な機器を必要とせず、手術室で必要量の全血と特定の濃度のヘビ毒凝固酵素を混合するだけで、迅速な製品翻訳が期待でき、またオンデマンドでの適用も期待できる。本明細書説明した結果は、血腫の適合構造的特性を生体材料足場の設計に組み込んで、現在再生医療で使用されている性能の悪い足場の骨修復を助ける能力を改善することにより、生体材料研究者にも利益をもたらす可能性がある。さらに、ヘビ毒から単離された凝固促進因子は、血栓の構造的特性を変えるための適切な凝固剤として使用され得るほか、病院や戦場で制御不能な出血を止めるために使用され得る。また、数秒以内に出血を止めることができ、持ち運びが容易で、保管期間が長く、再吸収性または除去が容易で、安価な製品も本明細書に開示される。これらのヘビは、瞬時に大規模な凝固障害を引き起こして獲物を殺すように進化したため、血液をゼラチンに変える非常に特異的な生物学的薬剤を開発した。しかし、適切に単離され、管理された条件下で慎重に調製されれば、エカリンなどの同じ凝固因子を代わりに使用して命を救うことができる。この驚くべき特性により、失血をすぐに制御することで、民間患者や戦場で負傷した兵士のさらなる失血を制限することができる。

【0037】

本明細書では、大きな骨欠損を治癒するための、生体適合性のあるヘビ毒誘発性体外血腫を開示する。また、本明細書はまた、その超微細構造的特性を改変し、それによって様々な臨床状況における挙動を変化させる特定の方法で体外血腫（血栓）を処理及び操作する方法を開示する。本明細書は、いくつかの異なる病状の治療に使用できるように、その構造的立体構造を変化させ、その生物学的活性を変化させる薬剤で全血または血液製剤を処理する方法を開示する。

【0038】

本明細書は、大きな骨欠損、亜臨界サイズ欠損の再生及び修復を改善するため、ならびに非治癒骨折（癒合遅延または癒合不全）の治療を改善するために使用され得る組成物、生体模倣足場、及び方法を開示する。本明細書は、重要な成長因子の連続放出のための一時的なリザーバとして機能することによって骨治癒を促進するために使用することができ、また適切な空間を提供することによって細胞の浸潤、増殖、及び分化を同時に助ける組織化された血栓（すなわち、生体模倣足場を形成するために足場と組み合わせることができる体外血腫）を開示する。本明細書は、自然治癒する骨折血腫を模倣する血栓（体外血腫）の生成を含む修復プロセスを作新するための生体模倣足場、組成物、及び方法を開示する。この概念は、ヘビ毒由来の凝固因子であるエカリンを使用して変化させることができ、代用骨及び／または足場と組み合わせて骨欠損に移植された場合に骨治癒を促進し、促進する固有骨折血腫を模倣する体外製品（体外血腫）の構造的特性である。ヘビ毒由来の凝固因子であるエカリンも止血に使用され得る。いくつかの態様では、組成物は、粉末、液体、または噴霧として製剤化され得る。

【0039】

本明細書は、全血、エカリン及びＢＭＰ－２を含む組成物を開示する。いくつかの態様では、エカリンは特定の濃度で存在することができる。いくつかの態様では、低用量または著しく低減された用量のＢＭＰ－２を、本明細書に開示される組成物に使用することができる。いくつかの態様では、開示された組成物は、骨欠損の治癒を促進するために使用することができる。いくつかの態様では、開示された組成物は、液体またはゲルとして製剤化され得る。

【0040】

本明細書に記載のタイプの治癒は、吸収性コラーゲンスポンジ（Ｉｎｆｕｓｅ（商標））上で送達されるｒｈＢＭＰ－２を使用する、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃによって販売される市販の製品によって提供される治癒よりも優れていた。本明細書に記載の組成物または製品は、骨治癒を開始するために足場と組み合わせる場合、著しく低い用量のＢＭＰ－２（例えば、ｒｈＢＭＰ－２）を必要とする。いくつかの態様では、ＢＭＰ－２の用量は、市販の製品または組成物よりも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０倍、またはそれ以上低くすることができる。

【0041】

本明細書に開示されるように、ＢＭＰ－２は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）のファミリーに属する。これらのタンパク質は、軟骨性骨新生物を誘導する能力を持つ骨成長因子である。いくつかの態様では、ＢＭＰ－２は組換えＢＭＰ－２であり得る。組換えＢＭＰ－２を生成する方法は当技術分野で知られており、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，３５４，９０１号に見出すことができる。

【0042】

また、本明細書は、体外血腫（例えば、特定の濃度の血液製剤と凝固剤（カルシウムとトロンビンまたはエカリン、成長因子の有無にかかわらず））を調製するために使用され得る成分の溶液に、３Ｄプリントされたケージ（例えば、インプラント）を注入／浸漬し、１５～２０分間凝固させた後、所望の治療／損傷部位に移植することにより、必要に応じて調製することができる生体模倣足場を開示する。本明細書に記載の足場及び体外血腫を含む生体模倣足場は現在、そのような非常に低い用量のｒｈＢＭＰ－２をそのような効率で効果的に送達することができ、一貫して確実に骨折治癒カスケードを開始して重大なサイズの骨欠損を首尾よく修復できる唯一の既知の組成物である。さらに、体外血腫の調達と調製は、術中にオンデマンドで非常に迅速に、わずかなコストで再現可能に行うことができる。

【0043】

組成物
本明細書に開示される組成物は、１）体外血腫であって、体外血腫は、（ａ）単離された全血、（ｂ）クエン酸ナトリウム、及び（ｃ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む、体外血腫と、２）代用骨とを含む。本明細書にも開示される組成物は、組成物であって、１）体外血腫であって、体外血腫は、（ａ）多血小板血漿、血漿、または赤血球を有する血漿、及び（ｂ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む、体外血腫と、２）代用骨とを含む、組成物を含む。いくつかの態様では、体外血腫は、（ａ）単離された全血、（ｂ）クエン酸ナトリウム、及び（ｃ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、（ａ）多血小板血漿、血漿、または赤血球を有する血漿、及び（ｂ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、クエン酸ナトリウムをさらに含み得る。いくつかの態様では、「赤血球を有する血漿」という語句は、血小板を含まない血漿を意味する。いくつかの態様では、体外血腫は、少なくとも１５０～３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン線維を含む。いくつかの態様では、エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムにより、少なくとも１５０～３００ｎｍ±１０％の厚さを有する１つ以上のフィブリン線維が形成され得る。本明細書で使用される「体外」という用語は、生物体の外部、例えば外部環境で形成され得る血腫を指す。いくつかの態様では、体外血腫は、（ａ）単離された全血及びクエン酸ナトリウム多血小板血漿、血漿単独、赤血球を有する血漿（血小板を含まない）、または他の血液製剤、及び（ｂ）１つ以上の凝固因子を含む。いくつかの態様では、体外血腫は、全血及び１つ以上の凝固因子を含み得る。

【0044】

本明細書で使用される場合、「全血」及び「血液」という用語は、血漿または血小板を含む成分が何も除去されない、身体から直接採取できる血液を意味するために使用される。いくつかの態様では、全血または血液は、本明細書に記載の組成物のいずれか、または本明細書に記載の体外血腫のいずれかを投与される対象または患者に由来し得る。いくつかの態様では、全血または血液は、ドナー対象または患者からのものであり得る。全血は、赤血球、白血球、血小板、血漿で構成される。いくつかの態様では、全血の代わりにフィブリンゲルを使用できる。

【0045】

当業者は、血液が、栄養素や酸素などの重要な物質を細胞に送達し、代謝老廃物をそれらの同じ細胞から輸送する特殊な体液であることを理解するであろう。脊椎動物では、血液は血漿中に浮遊する血球で構成される。血液は、血漿、赤血球（イリスロサイト）、血小板（プレート）、白血球（ルカサイト）などの様々な成分を含む。血漿は血液の約５５％を占める主な成分で、ほとんどがイオン、タンパク質、栄養素、老廃物を含む水で構成される。血漿は、体によって生成されるあらゆるタンパク質の一部を含み得る。例えば、血漿は、水（約９０％）と、イオン（Ｎａ⁺、Ｋ⁺、Ｍｇ⁺²、Ｃａ⁺²、Ｃｌ^-、ＨＣＯ₃ ^-、ＨＰＯ₄ ^-2、ＳＯ₄ ^-2）（Ｎｅｚａｆａｔｉ ｅｔ ａｌ．、２０１２）、タンパク質（例えば、主にアルブミン５５％、グロブリン、成長因子、酵素、ホルモン、抗体）、凝固因子（第Ｉ～ＸＩＩＩ因子）（ｌａｂｔｅｓｔｓｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ．ａｕ）、糖類（グルコース）、脂質（コレステロール）、ミネラル（ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、鉄、亜鉛、銅、セレン）（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４）、老廃物、及び溶存ガスなどの混合物とを含む。赤血球（イリスロサイト）は酸素と二酸化炭素を運ぶ役割を果たす。それらのサイズは約７～８μｍで、成熟してもミトコンドリアも核も含まず、平均寿命は１２０日である。女性には約３６０万～５００万個／ｍｍ³の赤血球があり、男性には約４２０万～５４０万個／ｍｍ³の赤血球がある。血小板（プレート）は血液凝固に関与する。正常な血小板数は約１５０，０００～４５０，０００／ｍｍ³の範囲である。白血球（ＷＢＣ、ルカサイト）は免疫系の一部であり、免疫応答で機能する。細胞の約１％が血液中に存在する。それらは、赤血球よりもサイズが大きく、正常な核とミトコンドリアを含有する。正常な白血球数は約５，０００～１０，０００／ｍｍ³の範囲である。白血球は５つの主要なタイプに分けられ、さらに２つの異なるグループに分けられ得る。顆粒球（好中球（ＷＢＣの６０～７０％または３，０００～７，０００／ｍｍ³）、好酸球（ＷＢＣの１～３％または５０～４００／ｍｍ³）、及び好塩基球（ＷＢＣの０．３～０．５％または２５～２００／ｍｍ³））、無顆粒球（リンパ球（ＷＢＣの２０～３０％または１，０００～４，０００／ｍｍ³）、及び単球（ＷＢＣの３～８％または１００～６００／ｍｍ³）。

【0046】

本明細書で使用される場合、「多血小板血漿」（自己調整血漿としても知られる）という用語は、全血に由来する濃縮形態の多血小板血漿タンパク質を指す。例えば、全血を遠心分離して赤血球を除去することができる。いくつかの態様では、「血漿単独（ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ ａｌｏｎｅ）」、「血漿単独（ｐｌａｓｍａ ａｌｏｎｅ）」、または「血漿」という用語は、通常、懸濁液中の全血中の血球を保持する、全血に由来する黄色がかった液体成分を指すことができる。例えば、血球がチューブの底に落ちるまで血液を遠心分離することにより、全血から血漿を分離することができ、その後血漿をチューブの上部から取り出すことができる。いくつかの態様では、「赤血球を有する血漿」という用語は、赤血球が加えられた「血漿単独」を指すことができる。例えば、赤血球は、全血がチューブの底に落ちるまで遠心分離することによって得ることができ、チューブの上部から血漿、白血球、血小板を除去した後に回収される。

【0047】

いくつかの態様では、組成物は、１つ以上の代用骨を含み得る。いくつかの態様では、１つ以上の代用骨は、生物学的製品に由来するものであってもよく、合成代用骨またはそれらの組み合わせであってもよい。生物学的製品に由来する代用骨の例は、脱灰骨基質（ＤＢＭ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）及びサンゴ、同種異系の海綿骨片、またはリーマー洗浄装置アスピレータ（ＲＩＡ）を使用して採取された長骨からの骨移植片を含む骨髄吸引濃縮物（ＢＭＡＣ）を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、１つ以上の代用骨は生物学的製品に由来することができ、生物学的製品は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、脱灰骨基質（ＤＢＭ）、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、サンゴ、同種異系の海綿骨片、またはリーマー洗浄装置アスピレータ（ＲＩＡ）を使用して採取された長骨からの骨移植片を含む骨髄吸引液濃縮物（ＢＭＡＣ）であり得る。いくつかの態様では、代用骨は合成代用骨であり得る。合成代用骨の例は、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムセメント、ベータリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）セラミックス、二相リン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）及びベータＴＣＰセラミックス）、生体活性ガラス、及びポリマーベースの代用骨を含むが、これらに限定されない。合成代用骨のさらなる例は、Ｃａｌｃｉｇｅｎ（登録商標）Ｓ硫酸カルシウム骨空洞充填剤、ＳＴＩＭＵＬＡＮ（登録商標）ビーズ、ＨｙｄｒｏＳｅｔ注入可能代用骨（リン酸カルシウム）、Ｏｓｓｉｌｉｘリン酸カルシウムセメント、Ｓｙｎｔｏｓｓ合成ベータリン酸三カルシウム骨移植材料、ＣＥＲＡＳＯＲＢ（登録商標）リン酸三カルシウム骨移植片、ＧＬ１８９４Ｐ／－２０ ５８Ｓ生体活性ガラス、ＵｎｉＧｒａｆｔ生体活性ガラス２００～６００ｕｍ、ＢｏｎＡｌｉｖｅ（ＢｏｎＡｌｉｖｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｌｔｄ、Ｆｉｎｌａｎｄ）、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（骨空洞充填剤）及びＣｅｒａｍｅｎｔ Ｇ （Ｂｏｎｅｓｕｐｐｏｒｔ Ｈｏｌｄｉｎｇ ＡＢ、Ｌｕｎｄ Ｓｗｅｄｅｎ）を含むが、これらに限定されない。ポリマーの例は、コラーゲン、ゼラチン、キトサン、及びポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）－ＧａｌａＦｌｅｘ Ｐ４ＨＢバイオポリマーなどの合成ポリマーを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、代用骨は、乾燥した、成形可能な、または注射可能な形態、及びペースト、粉末、パテ、顆粒、ゲル、スポンジ、またはストリップを含むがこれらに限定されない様々な形態で入手可能である。いくつかの態様では、代用骨は市販の製品であり得る。いくつかの態様では、代用骨は、脱灰骨基質（ＤＢＸ、ＭＴＦ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｅｄｉｓｏｎ，、ＮＪ）、ＲｅｇｅｎａＶａｔｅ ＤＢＭ、Ｐｕｒｏｓ ＤＢＭ、ＳｔａＧｒａｆｔ ＤＢＭ、またはＦｉｂｅｒＳｔａｃｋ ＤＢＭ（Ｚｉｍｍｅｒ Ｂｉｏｍｅｔ、Ｗａｒｓａｗ、ＩＮ）であり得る。いくつかの態様では、ＤＢＭは、コラーゲンと非コラーゲン性タンパク質の製品を生成するために脱灰された同種移植海綿骨または皮質骨であり得る。ＤＢＭの例は、Ｇｒａｆｔｏｎ ＤＢＭ（Ｏｓｔｅｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ、Ｅａｔｏｎｔｏｗｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、Ａｌｌｏｓｏｕｒｃｅ（Ｄｅｎｖｅｒ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、ＤｙｎａｇｒａｆｔＩＩ（Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、ＤＢＸ（Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓ、Ｐａｏｌｉ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、及びＯｓｔｅｏｆｉｌ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｓｏｆａｍｏｒ Ｄａｎｅｋ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を含むが、これらに限定されない。サンゴの例は、動物界、腔腸動物、強膜サンゴ、サンゴ科、ハマサンゴ種、及びゴニオポラス種を含むが、これらに限定されず、それぞれは、サンゴ質ヒドロキシアパタイト（ＣＨＡ）代用骨の開発に使用され得る。いくつかの態様では、代用骨はＢＭＰ、ｒｈＢＭＰ－２、またはＢＭＰ－２ではない。

【0048】

いくつかの態様では、体外血腫と代用骨の比率は、１０００：１～１：１０００、またはその間の任意の比率であり得る。いくつかの態様では、体外血腫と代用骨の比率は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０であり得る。いくつかの態様では、代用骨と体外血腫の比率は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０であり得る。

【0049】

いくつかの態様では、組成物、体外血腫、代用骨、または生体模倣足場は、１つ以上の成長因子を含み得る。いくつかの態様では、１つ以上の成長因子は、１つ以上の骨形成タンパク質であり得る。ＢＭＰの例は、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－９、及びＢＭＰ－１４（ＧＤＦ５としても知られる）を含むが、これらに限定されない。ＢＭＰ－１からＢＭＰ－１８を含むあらゆるＢＭＰが企図される。いくつかの態様では、１つ以上の成長因子は、血小板由来成長因子であり得る。いくつかの態様では、１つ以上の成長因子は、血管内皮成長因子であり得る。いくつかの態様では、１つ以上の成長因子は、線維芽細胞成長因子２であり得る。いくつかの態様では、１つ以上の成長因子は、骨形成タンパク質、血小板由来成長因子、血管内皮成長因子、線維芽細胞成長因子２、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上であり得る。いくつかの態様では、組成物、体外血腫、代用骨または生体模倣足場は、ＢＭＰ－２をさらに含み得る。いくつかの態様では、１つ以上の成長因子はＢＭＰ－２であり得る。いくつかの態様では、１つ以上の成長因子は、ＢＭＰ、ｒｈＢＭＰ－２、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－９、またはＢＭＰ－１４ではない。

【0050】

いくつかの態様では、全血は、生細胞を含み得る。いくつかの態様では、体外血腫の形成後、全血の生細胞の約５０％～７０％は生存したままである。いくつかの態様では、血腫の形成後、全血の生細胞の少なくとも５０％は生存したままである。いくつかの態様では、血腫の形成後、全血の生細胞の少なくとも６０％は生存したままである。いくつかの態様では、体外血腫の形成後、全血の生細胞の少なくとも７０％は生存したままである。いくつかの態様では、体外血腫の形成後、全血の生細胞の少なくとも８０％は生存したままである。いくつかの態様では、体外血腫の形成後、全血の生細胞の少なくとも９０％は生存したままである。いくつかの態様では、体外血腫の形成後、全血の生細胞の９０％超は生存したままである。

【0051】

いくつかの態様では、全血は、１つ以上の生物学的因子を含み得る。いくつかの態様では、「生物学的因子」または「他の生物学的因子」という用語は、水を除く全血の血漿成分を指す。他の生物学的因子の例は、イオン、タンパク質、凝固因子、糖、脂質、ミネラルなどを含むが、これらに限定されない。

【0052】

いくつかの態様では、全血中に存在する１つ以上の生物学的因子は、内因性生物学的因子であり得る。血小板は全血中に存在する。血小板中に多くの成長因子が存在する。多血小板血漿の血小板α顆粒内の成長因子は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング成長因子β１、β２、β３（ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、血小板由来血管新生因子（ＰＤＡＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）、血小板因子４（ＰＦ－４）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及び他のサイトカインを含むが、これに限定されない、創傷治癒に重要な不活性型の関連治癒分子とともに、有糸分裂促進性及び走化性成長因子を含有することが示される。さらに、血漿液は、成長因子ＩＧＦ－Ｉや肝細胞成長因子（ＨＧＦ）などの多数の生物学的に活性なタンパク質も含有する。通常の創傷治癒中に、捕捉された血小板が活性化されて脱顆粒し、その結果、α顆粒内容物が放出される。血小板中に存在する成長因子の例は、血小板由来成長因子、トランスフォーミング成長因子β１、β２、β３、血小板由来血管新生因子、インスリン様成長因子１、血小板因子４、上皮成長因子、上皮細胞成長因子、血管内皮細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、及び他のサイトカイン、ならびに、血小板由来内皮成長因子（ＰＤＥＧＦ）、インターロイキン１、オステオカルシン、及びオステオネクチンを含むが、これらに限定されない。血漿液中に存在する成長因子は、インスリン様成長因子１及び肝細胞成長因子を含むが、これらに限定されない。

【0053】

いくつかの態様では、体外血腫は、全血、エカリン、及びクエン酸ナトリウムを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、全血、塩化カルシウム、及びクエン酸ナトリウムを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、多血小板血漿及びエカリンを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、多血小板血漿及び塩化カルシウムを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、全血、塩化カルシウム、またはオスクタリンと塩化カルシウム、及びクエン酸ナトリウムを含み得る。いくつかの態様では、（ａ）単離された全血とクエン酸ナトリウム、多血小板血漿、または赤血球を有する血漿のうちの１つの組み合わせは、（ｂ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、または塩化カルシウムのうちの１つと組み合わせることができる。いくつかの態様では、（ａ）単離された全血とクエン酸ナトリウム、多血小板血漿、または赤血球を有する血漿のうちの１つの組み合わせは、（ｂ）トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムのうちの１つと組み合わせることができる。いくつかの態様では、本明細書に記載の体外血腫の組み合わせのいずれも、１つ以上の抗生物質をさらに含み得る。

【0054】

いくつかの態様では、体外血腫中に存在する塩化カルシウムの濃度は、１ｍＭ～２０ｍＭの範囲であり得る。いくつかの態様では、塩化カルシウムの濃度は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ｍＭ、またはそれらの間の任意の数であり得る。いくつかの態様では、塩化カルシウムの濃度は約１０ｍＭであり得る。

【0055】

いくつかの態様では、トロンビンの濃度は０．１～１Ｕ／ｍＬの範囲であり得る。いくつかの態様では、体外血腫中に存在するトロンビンの濃度は、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１Ｕ／ｍＬ、またはそれらの間の任意の数の以上であり得る。いくつかの態様では、体外血腫中に存在するトロンビンの濃度は０．５Ｕ／ｍＬであり得る。

【0056】

いくつかの態様では、体外血腫中に存在するエカリンの濃度は少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり得る。いくつかの態様では、体外血腫中に存在するエカリンの濃度は、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２Ｕ／ｍＬ、またはそれらの間の任意の数の以上であり得る。いくつかの態様では、体外血腫中に存在するエカリンの濃度は０．３Ｕ／ｍＬであり得る。いくつかの態様では、体外血腫中に存在するエカリンの濃度は０．６Ｕ／ｍＬであり得る。いくつかの態様では、体外血腫中に存在するエカリンの濃度は０．７５Ｕ／ｍＬであり得る。いくつかの態様では、体外血腫中に存在するエカリンの濃度は、０～２の任意の値（有理または非理数）であり得る。

【0057】

いくつかの態様では、本明細書に記載の体外血腫、代用骨、生体模倣足場または組成物は、ＢＭＰ－２をさらに含み得る。いくつかの態様では、ＢＭＰ－２は組換えＢＭＰ－２であり得る。いくつかの態様では、組換えＢＭＰ－２はヒトＢＭＰ－２を含み得る。いくつかの態様では、体外血腫、代用骨、組成物、または生体模倣足場に存在するＢＭＰ－２の用量は、少なくとも０．０１ｍｇであり得る。いくつかの態様では、体外血腫、代用骨、組成物、または生体模倣足場に存在するＢＭＰ－２の用量は、０．０１～５ｍｇであり得る。いくつかの態様では、体外血腫、代用骨、組成物、または生体模倣足場に存在するＢＭＰ－２の用量は、０．０１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０ｍｇ、またはそれらの間の任意の数であり得る。いくつかの態様では、組換えＢＭＰ－２は、約０．０１ｍｇ～約１２ｍｇの用量で使用され得る。いくつかの態様では、組換えＢＭＰ－２は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０ｍｇ、またはそれらの間の任意の用量で使用され得る。いくつかの態様では、組換えＢＭＰ－２は１２．０ｍｇを超える用量で使用され得る。いくつかの態様では、ＢＭＰ－２の用量は約１ｍｇ～５ｍｇであり得る。いくつかの態様では、体外血腫、代用骨、組成物、または生体模倣足場に存在するＢＭＰ－２の用量は、少なくとも０．０１μｇであり得る。いくつかの態様では、体外血腫、代用骨、組成物、または生体模倣足場に存在するＢＭＰ－２の用量は、０．０１～５μｇであり得る。いくつかの態様では、体外血腫、代用骨、組成物、または生体模倣足場に存在するＢＭＰ－２の用量は、０．０１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０μｇ、またはそれらの間の任意の数であり得る。いくつかの態様では、組換えＢＭＰ－２は、約０．０１μｇ～約１２μｇの用量で使用され得る。いくつかの態様では、組換えＢＭＰ－２は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０μｇ、またはそれらの間の任意の用量で使用され得る。いくつかの態様では、組換えＢＭＰ－２は１２．０μｇを超える用量で使用され得る。いくつかの態様では、ＢＭＰ－２の用量は約１μｇ～５μｇであり得る。いくつかの態様では、体外血腫、代用骨、組成物、または生体模倣足場に存在するＢＭＰ－２の用量は、０．３～０．４μｇであり得る。いくつかの態様では、体外血腫、代用骨、組成物、または生体模倣足場に存在するＢＭＰ－２の用量は、標準用量よりも低くなり得る。いくつかの態様では、体外血腫、代用骨、組成物、または生体模倣足場に存在するＢＭＰ－２の用量は、ＢＭＰ－２／ＡＣＳの標準用量または最低有効用量よりも１０～５０倍低くなり得る。

【0058】

いくつかの態様では、体外血腫中に存在するエカリンの量は少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり得、体外血腫中に存在するＢＭＰ－２の量は少なくとも０．０１ｍｇであり得る。

【0059】

いくつかの態様では、体外血腫中に存在するエカリンの量は少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり得、体外血腫中に存在するＢＭＰ－２の量は少なくとも０．０１μｇであり得る。

【0060】

いくつかの態様では、クエン酸ナトリウムの濃度は約３．２～４ｍｇ／ｍｌであり得る。いくつかの態様では、溶液は約３．２～４％（重量／体積）のクエン酸ナトリウムであり、溶液１部を全血９部と混合することができる。

【0061】

いくつかの態様では、本明細書に記載の体外血腫または組成物は、１つ以上の治療薬をさらに含み得る。いくつかの態様では、治療薬は成長因子であり得る。いくつかの態様では、治療薬はＢＭＰ－２であり得る。いくつかの態様では、治療薬は組換えＢＭＰ－２であり得る。いくつかの態様では、治療薬は、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、及び人工多能性幹細胞を含むが、これらに限定されない、幹細胞または分化前幹細胞であり得る。いくつかの態様では、治療薬はエカリンであり得る。

【0062】

いくつかの態様では、本明細書に開示される体外血腫、生体模倣足場または組成物は、液体またはゲルとして製剤化され得る。いくつかの態様では、本明細書に開示される体外血腫、生体模倣足場または組成物は、ペーストまたはパテとして製剤化され得る。いくつかの態様では、体外血腫は、凍結乾燥または粉末形態で製剤化され得る。上記凍結乾燥または粉末形態は、体外血腫を保管のためにより安定させることができる。いくつかの態様では、本明細書に開示される体外血腫、生体模倣足場または組成物は、液体、ゲル、粉末、顆粒、ペーストまたはパテとして製剤化され得る。いくつかの態様では、組成物は、凍結乾燥または粉末形態として製剤化され得る。上記凍結乾燥形態または粉末形態は、本明細書に開示される体外血腫、生体模倣足場、または組成物を保管のためにより安定させることができる。いくつかの態様では、成長因子（ＢＭＰなど）、凝固因子（エカリン、塩化カルシウムなど）、及びクエン酸ナトリウムは、凍結乾燥または粉末形態で入手できる。いくつかの態様では、本明細書に開示される体外血腫を作製するために使用される化合物は、全血または他の血液製剤（例えば、ＰＲＰ、血漿など）と混合する前に滅菌蒸留水に溶解することができる。希釈剤は滅菌蒸留水である。調製や保管のために追加の成分は必要ない。全血（または他の血液製剤）は、手術前（例えば直前）に患者から採取され、凝固を防ぐためにクエン酸添加され得る。いくつかの態様では、ドナー血液は、例えば、貧血、血友病、白血病、ＨＩＶなどを含むが、これらに限定されない血液疾患を有する患者に使用され得る。体外血腫の残りの成分は、保管のために追加の安定剤を必要としない。例えば、ＢＭＰ－２はボトルに入った状態で市販されており、すぐに使用でき、ＣａＣｌ₂は粉末形態で入手でき、場合によっては滅菌蒸留水にすでに溶解する場合もある（溶解後は非常に安定である）。ＢＭＰ－２とＣａＣｌ₂はどちらも室温で保管できる。エカリンは、－２０℃で保管された凍結乾燥形態（フリーズドライ）で入手でき、使用前に滅菌蒸留水に溶解できる。体外血腫は、本明細書に記載の成分を、埋める欠損の体積に基づいた体積で使用することにより、比較的簡単に調製することができる。このため、成分を調製した後、それらをチューブ／金型の中で混合することができる。一般に、体外血腫は約３０～４５分で形成され、その後骨欠損に挿入（または移植）できる。いくつかの態様では、本明細書に記載の体外血腫は、例えば、正確な使用履歴や温度ログの保持などの在庫管理を合理化できる、ほぼリアルタイムの組織追跡システムを含む無線周波数識別ベースのシステム（例えば、Ｓｍａｒｔｓｔｏｒａｇｅ（商標））を使用する「スマート保管システム」を使用して保管できる。

【0063】

足場
本明細書は、生体模倣足場を開示する。生体模倣足場は、本明細書に記載の足場のいずれか、及び本明細書に記載の体外血腫のいずれかを含み得る。

【0064】

本明細書は、足場と、体外血腫とを含む、生体模倣足場を開示し、体外血腫は、（ａ）単離された全血、（ｂ）クエン酸ナトリウム、及び（ｃ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む。本明細書は、足場と、体外血腫とを含む、生体模倣足場を開示し、体外血腫は、（ａ）多血小板血漿、血漿、または赤血球を有する血漿、及び（ｂ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む。いくつかの態様では、体外血腫は、少なくとも１５０～３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン線維を含む。いくつかの態様では、生体模倣足場は、１つ以上の代用骨をさらに含む。いくつかの態様では、生体模倣足場の体外血腫は、１つ以上の代用骨を含む。

【0065】

いくつかの態様では、本明細書に記載の体外血腫はさらに、足場などの担体と組み合わせることができる。例えば、担体は、生分解性生体材料足場（例えば、絹フィブロイン足場、ポリ（ラクチド－コ－グリコリド（ＰＬＧＡ））、または他の類似の再吸収性製品または材料）であり得る。このような担体は、体外血腫の追加の機械的支持を提供するために使用され得る。開示される生体模倣足場で使用される足場の例は、生体適合性足場、骨伝導性足場、コラーゲン、吸収性コラーゲン足場（コラーゲンタイプ１ウシまたはブタ）、コラーゲンウシ膜、または他の哺乳類もしくは非哺乳類（海洋など）由来のコラーゲン、キチン、ＰＬＡなどの生体吸収性ポリマー、またはＰＥＥＫなどの非吸収性ポリマー、あるいはチタンまたは再吸収性マグネシウム（マグネシウムカルシウム合金など）もしくは３Ｄプリントされた足場などの他の生体適合性金属合金を含むが、これらに限定されない。

【0066】

いくつかの態様では、本明細書に記載の体外血腫と組み合わせることができる足場は、生体適合性及び生分解性であり得る。例えば、足場は、治癒を低下させたり身体による拒絶反応を引き起こしたりするような重度の炎症反応を引き起こすことを防ぐために、無視できる程度の免疫反応を誘発する必要がある。いくつかの態様では、足場はそれに接着する細胞に対して修正可能であるため、細胞は正常に機能し、表面に移動し、最終的には足場を通って増殖することができる。本明細書に開示される足場は、細胞が独自の細胞外基質を生成できるように生分解性であり得る。この分解の副産物も無毒で、他の臓器からの干渉を受けることなく体外に排出される。

【0067】

いくつかの態様では、足場は、移植される解剖学的部位と一致する機械的特性を有し、移植中の外科的取り扱いを可能にするのに十分な強度を有することができる。さらに、足場は、細胞の浸潤と血管新生を可能にするのに十分であり得る。適切な足場を設計する際には、足場の構造を考慮することが重要である。例えば、足場は、細胞浸透及び細胞への栄養素の適切な拡散を確実にするために、相互接続された細孔構造及び高い多孔性を有することができる。多孔性の相互接続構造は、足場から老廃物を拡散させるために重要であり、足場分解の生成物は他の臓器や周囲の組織に干渉することなく体外に排出できなければならない。

【0068】

いくつかの態様では、足場は、３Ｄプリントされた足場であり得る。いくつかの態様では、３Ｄプリントされた足場はカスタム生産可能である。

【0069】

三次元足場は、ロボット蒸着または直接書き込み（ＤＷ）技術と呼ばれる３Ｄプリント技術を使用して製造され得る。この技術では、コンピュータ制御のプリントプロセスとコロイドインクを使用して三次元構造を形成する。これらの構造は、自己構成要素上に形成することも、断層撮影データ（Ｘ線、超音波検査、またはＭＲＩ）から個々の骨欠損を埋めるためにカスタムで形成することもできる。

【0070】

インクの製造とプリントシステム自体は、プリントノズルから出るときに固体になるレオロジー制御された水ベースのインクを使用する。これらのインクは、コロイドインクの取り扱い特性を制御する有機化学物質を含む水ベースのスラリー中の、細かく制御されたセラミック粒子で構成される。これにより、支持されない構造要素のたるみの有無にかかわらず、３Ｄ格子状構造を層状にプリントすることができる。

【0071】

このシステムを使用すると、ｘ－ｙ－ｚ制御ガントリーシステムのｘ及びｙ座標制御システムを使用して、小さな（直径約５０～４００μｍ）ノズルを通して支持板上にインクを押し出すことによって、第１層の要素をプリントすることができる。次に、Ｚ制御システムを使用してノズルを１ノズル直径よりわずかに小さい位置まで移動する。次に、次の層を第１の層の上にプリントする。これは、３Ｄ構造全体が完成するまで、一層ずつ続けられる。

【0072】

乾燥を防ぐために、構造全体をオイルバスでプリントすることができる。このシステムは３つのノズルとインクリザーバを有するため、最大３つの材料を使用して１つの構造をプリントすることができる。一時的インク（発射中に燃え尽きる材料のみからなるインク）も、プリントプロセスの一部として使用され得る。これらは、一時的な支持が必要な複雑な部品の支持構造をプリントするために使用され得る。

【0073】

次に、得られた構造を油浴から取り出し、乾燥させ、プログラム可能な炉で焼成して、最終的なセラミック構造を生成する。現在、焼成は約１１００℃で約４時間行われており、有機成分が実質的に燃え尽き、セラミック粒子が一緒に焼結して固体構造になる。これにより、予測可能な少量の収縮が発生する可能性があり、これをプリントプロセスで計算して、正確で予測可能な構造を生成することができる。

【0074】

プリントノズルは、通常は円筒形であり、円筒形ロッドのプリント構造を生成することができる。しかし、非円筒構造、または細胞の移動、成長、及び分化を制御するように設計されたサイズの表面縞模様を備えた構造を生成する形状のノズルを作製することができる。

【0075】

いくつかの態様では、様々な生体材料を使用して、本明細書に開示される足場を作製することができる。いくつかの態様では、生体材料は、セラミック、合成ポリマー及び／または天然ポリマー、またはそれらの組み合わせであり得る。セラミックの例は、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）及びリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）を含むが、これらに限定されない。合成ポリマーの例は、ポリスチレン、ポリ－１－乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）及びポリ－ｄｌ－乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）を含むが、これらに限定されない。天然ポリマーの例は、コラーゲン、様々なプロテオグリカン、アルギン酸ベースの基質、及びキトサンを含むが、これらに限定されない。天然ポリマーを使用する利点は、それらが生物学的に活性であり、通常、優れた細胞接着と増殖を促進することである。さらに、それらは生分解性でもあるため、宿主細胞は時間の経過とともに独自の細胞外基質を生成し、分解された足場を置き換えることができる。いくつかの態様では、足場は生体材料の組み合わせで作製することができる。いくつかの態様では、コラーゲンは多糖類（グリコサミノグリカンなど）と組み合わせることができる。いくつかの態様では、足場は化学架橋法を使用して調製され得る。

【0076】

いくつかの態様では、足場及び体外血腫を含む組成物または生体模倣足場は、局所投与用に製剤化され得る。いくつかの態様では、本明細書に開示される組成物（例えば、液体形態）または体外血腫（例えば、ゲル形態）は、本明細書に開示される担体または足場のいずれかと組み合わせて、局所的に投与するか、外科的に移植するか、経皮注射することができる。いくつかの態様では、液体製剤は、注射器を介して足場に送達され得る。いくつかの態様では、ゲル製剤は骨欠損部位に移植され得る。ゲル製剤は、骨欠損部位への移植のための骨のサイズ及び形状に対応する体外の金型を使用して調製され得る。いくつかの態様では、製剤は液体とゲルの間の中間形態であり得る。いくつかの態様では、中間製剤を固体足場または担体に適用して、固体足場自体に存在し得る隙間（例えば、大きな隙間）を埋めると同時に、独立して機械的支持も提供することができる。固体足場の例は、チタン製ケージまたは他の多孔性金属インプラントを含むが、これらに限定されない。このような足場は、骨格異常を再構築したり、脊椎固定を達成したりするために使用され得る。ＰＥＥＫ自体が生物学的に不活性であり、本質的に骨治癒能力を持たないことを考慮すると、本明細書に開示される製剤は、ＰＥＥＫ脊椎ケージが椎体間脊椎固定術に使用される場合、治癒を増強するために使用され得る。あるいは、本明細書に開示される製剤のいずれも、部分的または部分的な骨格異常を再構築するために使用され得るように、吸収性足場に注入または局所的に適用することができる。金属多孔性インプラントまたは吸収性足場と組み合わせて使用する場合、これに、（大腿骨、脛骨、または他の長骨の）くさび開き骨切り術、関節延長固定術部位、及び関節形成術に関連する骨欠損も含む。さらに、本明細書に開示される生体模倣足場、組成物及び体外血腫製剤のいずれも、足首、膝、手首、肩、股関節、またはリスフラン関節、手、手首、もしくは足の小さな関節を含むがこれらに限定されない他の小さな関節など、骨欠損のある他の関節固定術部位にも同じ方法で適用され得、そして二次的な解剖学的位置への移植のために骨移植片を採取する際に生じた骨欠損を埋める応用を含む。

【0077】

デバイス
本明細書は、本明細書に記載の組成物及び／または体外血腫のいずれかを送達するためのマルチコンパートメントデバイスを開示する。いくつかの態様では、マルチコンパートメントデバイスは、２つ以上のチャンバを含み得、または２つ以上のシリンジを使用して、体外血腫の成分及び代用骨を別々に送達することができる。いくつかの態様では、第１チャンバまたはシリンジは、所定の濃度の凝固剤（例えば、カルシウムとトロンビン、またはエカリン）を含み得る。いくつかの態様では、第２チャンバまたはシリンジは、全血のみを含み得る。いくつかの態様では、第２チャンバまたはシリンジは、外因性成長因子（例えば、ＢＭＰ２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ）と組み合わせた全血を含み得る。いくつかの態様では、第２チャンバまたはシリンジは、代用骨（例えば、ＤＢＭ、同種異系の海綿骨片）と組み合わせた全血を含み得る。いくつかの態様では、第２チャンバまたはシリンジは、外因性成長因子（例えば、ＢＭＰ２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ）代用骨と組み合わせた全血を含み得る。いくつかの態様では、第３チャンバまたはシリンジは、外因性成長因子及び追加の代用骨を含み得る。いくつかの態様では、第３チャンバまたはシリンジは、外因性成長因子を含み得る。いくつかの態様では、第３チャンバまたはシリンジは、１つ以上の代用骨を含み得る。いくつかの態様では、第４チャンバまたはシリンジは、１つ以上の代用骨を含み得る。

【0078】

方法
本明細書は、骨治癒を促進する方法を開示する。また、本明細書はまた、骨代替材料を調製する方法を開示する。さらに、本明細書は、インプラントまたは生体模倣足場または本明細書に記載の組成物のいずれかを調製する方法を開示する。いくつかの態様では、体外血腫を含む組成物は足場としても機能し得る。いくつかの態様では、体外血腫を含む組成物を足場と組み合わせて、生体模倣足場を形成または作製することができる。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法は組み合わせることができる。本明細書は、骨治癒の促進、骨代替材料の調製、インプラント、体外血腫を含む組成物、生体模倣足場、またはそれらの組み合わせの調製方法を開示する。

【0079】

本明細書は、骨治癒を促進する方法、または骨代替材料もしくはインプラントを調製する方法を開示する。いくつかの態様では、該方法は、治療を必要とする対象に、治療有効量の本明細書に開示される組成物のいずれかを投与することを含む。いくつかの態様では、該方法は、治療を必要とする対象に、本明細書に開示される体外血腫及び１つ以上の代用骨を含む治療有効量の組成物を投与することを含み得る。いくつかの態様では、該方法は、本明細書に記載の生体模倣足場のいずれかを対象の対象部位に移植することを含む。いくつかの態様では、生体模倣足場は、１つ以上の代用骨をさらに含み得る。

【0080】

いくつかの態様では、体外血腫は、（ａ）単離された全血、（ｂ）クエン酸ナトリウム、及び（ｃ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、（ａ）多血小板血漿、血漿、または赤血球を有する血漿、及び（ｂ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、クエン酸ナトリウムをさらに含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、少なくとも１５０～３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン線維を含む。いくつかの態様では、エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムにより、少なくとも１５０～３００ｎｍ±１０％の厚さを有する１つ以上のフィブリン線維が形成され得る。いくつかの態様では、体外血腫は、（ａ）単離された全血及びクエン酸ナトリウム多血小板血漿、血漿単独、赤血球を有する血漿（血小板を含まない）、または他の血液製剤、及び（ｂ）１つ以上の凝固因子を含む。いくつかの態様では、体外血腫は、全血及び１つ以上の凝固因子を含み得る。いくつかの態様では、全血は、１つ以上の生細胞を含み得る。いくつかの態様では、全血は、１つ以上の生物学的因子を含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、全血、エカリン、及びクエン酸ナトリウムを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、全血、塩化カルシウム、及びクエン酸ナトリウムを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、多血小板血漿及びエカリンを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、多血小板血漿及び塩化カルシウムを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、血漿及びエカリンを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、血漿及び塩化カルシウムを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、赤血球を有する血漿及びエカリンを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、赤血球を有する血漿及び塩化カルシウムを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、オスクタリンを含有する血漿及び塩化カルシウムを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、トロンビンを含有する血漿及び塩化カルシウムを含み得る。いくつかの態様では、体外血腫は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ－２）をさらに含み得る。いくつかの態様では、ＢＭＰ－２は組換えＢＭＰ－２であり得る。いくつかの態様では、組換えＢＭＰ－２はヒトＢＭＰ－２を含み得る。いくつかの態様では、組成物は、１つ以上の成長因子、１つ以上の血小板、及び１つ以上の細胞をさらに含み得る。いくつかの態様では、組成物は、血餅または足場として製剤化され得る。いくつかの態様では、足場は走化性であり得る。いくつかの態様では、足場は、骨治癒に役立つ内因性成長因子を引き付けることができる。

【0081】

いくつかの態様では、１つ以上の代用骨は、生物学的製品に由来するものであってもよく、合成代用骨またはそれらの組み合わせであってもよい。生物学的製品に由来する代用骨の例は、脱灰骨基質（ＤＢＭ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）及びサンゴ、同種異系の海綿骨片、またはリーマー洗浄装置アスピレータ（ＲＩＡ）を使用して採取された長骨からの骨移植片を含む骨髄吸引濃縮物（ＢＭＡＣ）を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、１つ以上の代用骨は生物学的製品に由来することができ、生物学的製品は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、脱灰骨基質（ＤＢＭ）、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）、サンゴ、同種異系の海綿骨片、またはリーマー洗浄装置アスピレータ（ＲＩＡ）を使用して採取された長骨からの骨移植片を含む骨髄吸引液濃縮物（ＢＭＡＣ）であり得る。いくつかの態様では、代用骨は合成代用骨であり得る。合成代用骨の例は、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムセメント、ベータリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）セラミックス、二相リン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）及びベータＴＣＰセラミックス）、生体活性ガラス、及びポリマーベースの代用骨を含むが、これらに限定されない。合成代用骨のさらなる例は、Ｃａｌｃｉｇｅｎ（登録商標）Ｓ硫酸カルシウム骨空洞充填剤、ＳＴＩＭＵＬＡＮ（登録商標）ビーズ、ＨｙｄｒｏＳｅｔ注入可能代用骨（リン酸カルシウム）、Ｏｓｓｉｌｉｘリン酸カルシウムセメント、Ｓｙｎｔｏｓｓ合成ベータリン酸三カルシウム骨移植材料、ＣＥＲＡＳＯＲＢ（登録商標）リン酸三カルシウム骨移植片、ＧＬ１８９４Ｐ／－２０ ５８Ｓ生体活性ガラス、ＵｎｉＧｒａｆｔ生体活性ガラス２００～６００ｕｍ、ＢｏｎＡｌｉｖｅ（ＢｏｎＡｌｉｖｅ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｌｔｄ、Ｆｉｎｌａｎｄ）、Ｃｅｒａｍｅｎｔ（骨空洞充填剤）及びＣｅｒａｍｅｎｔ Ｇ （Ｂｏｎｅｓｕｐｐｏｒｔ Ｈｏｌｄｉｎｇ ＡＢ、Ｌｕｎｄ Ｓｗｅｄｅｎ）を含むが、これらに限定されない。ポリマーの例は、コラーゲン、ゼラチン、キトサン、及びポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）－ＧａｌａＦｌｅｘ Ｐ４ＨＢバイオポリマーなどの合成ポリマーを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、代用骨は、乾燥した、成形可能な、または注射可能な形態、及びペースト、粉末、パテ、顆粒、ゲル、スポンジ、またはストリップを含むがこれらに限定されない様々な形態で入手可能である。いくつかの態様では、代用骨は市販の製品であり得る。いくつかの態様では、代用骨は、脱灰骨基質（ＤＢＸ、ＭＴＦ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ、Ｅｄｉｓｏｎ，、ＮＪ）、ＲｅｇｅｎａＶａｔｅ ＤＢＭ、Ｐｕｒｏｓ ＤＢＭ、ＳｔａＧｒａｆｔ ＤＢＭ、またはＦｉｂｅｒＳｔａｃｋ ＤＢＭ（Ｚｉｍｍｅｒ Ｂｉｏｍｅｔ、Ｗａｒｓａｗ、ＩＮ）であり得る。いくつかの態様では、ＤＢＭは、コラーゲンと非コラーゲン性タンパク質の製品を生成するために脱灰された同種移植海綿骨または皮質骨であり得る。ＤＢＭの例は、Ｇｒａｆｔｏｎ ＤＢＭ（Ｏｓｔｅｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ、Ｅａｔｏｎｔｏｗｎ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、Ａｌｌｏｓｏｕｒｃｅ（Ｄｅｎｖｅｒ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ）、ＤｙｎａｇｒａｆｔＩＩ（Ｉｎｔｅｇｒａ ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、ＤＢＸ（Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓ、Ｐａｏｌｉ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、及びＯｓｔｅｏｆｉｌ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｓｏｆａｍｏｒ Ｄａｎｅｋ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を含むが、これらに限定されない。サンゴの例は、動物界、腔腸動物、強膜サンゴ、サンゴ科、ハマサンゴ種、及びゴニオポラス種を含むが、これらに限定されず、それぞれは、サンゴ質ヒドロキシアパタイト（ＣＨＡ）代用骨の開発に使用され得る。いくつかの態様では、代用骨はＢＭＰ、ｒｈＢＭＰ－２、またはＢＭＰ－２ではない。

【0082】

いくつかの態様では、対象はヒトであり得る。いくつかの態様では、対象は骨格異常を有する。いくつかの態様では、骨格異常は、大きな分節骨欠損であり得る。いくつかの態様では、骨格異常は、小さな分節骨欠損であり得る。いくつかの態様では、骨格異常は、欠損が完全であるか不完全であるかに関係なく、欠損のサイズや体積とは無関係であり得る。いくつかの態様では、対象者は、歯の骨欠損を有する。

【0083】

いくつかの態様では、対象は、１つ以上の骨折を有する。いくつかの態様では、対象は、１つ以上の骨損傷を有する。

【0084】

いくつかの態様では、組成物は、血餅または足場として製剤化され得る。いくつかの態様では、組成物は、局所投与用に製剤化され、本明細書に開示される足場のいずれかと組み合わせることができる。いくつかの態様では、組成物は、担体または足場を介して局所的に投与され得る。いくつかの態様では、組成物は、担体または足場なしで局所的に投与され得る。いくつかの態様では、組成物は、移植または経皮送達され得る。いくつかの態様では、組成物は移植され得る。いくつかの態様では、組成物は、直接的または間接的に移植され得る。いくつかの態様では、組成物は、外科医によって、あるいはヒトもしくはロボット／半自律エージェントに代わって動作する任意の自律的もしくは半自律的送達デバイスによって送達され得る。いくつかの態様では、組成物は経皮送達され得る。

【0085】

本明細書は、インプラントを構築する方法を開示する。いくつかの態様では、該方法は、ａ）骨欠損へのデポーインプラントの移植を容易にする形状及びサイズのうちの少なくとも１つにデポーインプラントの寸法を決定することと、ｂ）（ｉ）単離された全血とクエン酸ナトリウム、または多血小板血漿、血漿、もしくは赤血球を有する血漿、（ｉｉ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウム、及び（ｉｉｉ）足場を作成するための代用骨を導入することにより、足場を有するようにデポーインプラントを構造化することとを含む。いくつかの態様では、足場は、５５～７５％の気孔率を有し得る。いくつかの態様では、足場は、少なくとも１５０～３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン線維を含む。いくつかの態様では、デポーインプラントの形状は円筒形または球形である。いくつかの態様では、足場は血餅として構築され得る。いくつかの態様では、１つ以上の成長因子は足場に導入され得る。いくつかの態様では、１つ以上の成長因子は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ－２）、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－９、ＢＭＰ－１４、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ－２）、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの態様では、ＢＭＰ－２は足場に導入され得る。いくつかの態様では、足場中に存在するエカリンの量は少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり得、足場中に存在するＢＭＰ－２の量は少なくとも０．０１ｍｇであり得る。いくつかの態様では、体外血腫と代用骨の比率は１０００：１～１：１０００である。いくつかの態様では、足場は、特定の骨欠損のサイズと形状に似ることができる。いくつかの態様では、足場は走化性であり得る。いくつかの態様では、足場は、生血球及び適切な生物学的因子を含み得る。いくつかの態様では、代用骨は、脱灰骨基質であり得る。いくつかの態様では、代用骨は、生物学的製品、合成代用骨、またはそれらの組み合わせに由来することができる。いくつかの態様では、生物学的製品は、脱灰骨基質、ヒドロキシアパタイト、またはサンゴであり得る。いくつかの態様では、合成代用骨は、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムセメント、β－リン酸三カルシウムセラミック、生体活性ガラス、またはポリマーであり得る。いくつかの態様では、１つ以上の成長因子は、ＢＭＰ、ｒｈＢＭＰ－２、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－９、またはＢＭＰ－１４ではない。

【0086】

また、本明細書は、生体模倣足場を構築する方法も開示する。いくつかの態様では、該方法は、ａ）骨欠損への足場の移植を容易にする形状及びサイズのうちの少なくとも１つに足場の寸法を決定することと、ｂ）ａ）における前記足場と、（ｉ）単離された全血とクエン酸ナトリウム、または多血小板血漿、血漿、もしくは赤血球を有する血漿、及び（ｉｉ）エカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、またはトロンビンと塩化カルシウムを含む体外血腫とを組み合わせ、生体模倣足場を作成することとを含む。いくつかの態様では、足場は、５５～７５％の気孔率を有し得る。いくつかの態様では、足場は、少なくとも１５０～３００ｎｍ±１０％の厚さを有するフィブリン線維を含む。いくつかの態様では、足場の形状は円筒形または球形である。いくつかの態様では、足場の形状は、理論的にはユークリッド空間内の個別のサブセットまたは体積を占めることができる他のあらゆる幾何学的形状または複数の形状とすることができる。いくつかの態様では、足場は、コラーゲン、キチン、生体吸収性ポリマー、ＰＥＥＫなどの非吸収性ポリマー、またはチタンもしくは金属合金であり得る。いくつかの態様では、１つ以上の成長因子は足場または体外血腫に導入され得る。いくつかの態様では、１つ以上の成長因子は、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ－２）、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－９、ＢＭＰ－１４、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ－２）、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの態様では、ＢＭＰ－２は足場または体外血腫に導入され得る。いくつかの態様では、足場または体外血腫中に存在するエカリンの量は少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり得、足場または体外血腫中に存在するＢＭＰ－２の量は少なくとも０．０１ｍｇであり得る。いくつかの態様では、体外血腫と代用骨の比率は１０００：１～１：１０００である。いくつかの態様では、体外血腫は、生血球及び適切な生物学的因子を含み得る。いくつかの態様では、代用骨は、脱灰骨基質であり得る。いくつかの態様では、代用骨は、生物学的製品、合成代用骨、またはそれらの組み合わせに由来することができる。いくつかの態様では、生物学的製品は、脱灰骨基質、ヒドロキシアパタイト、またはサンゴであり得る。いくつかの態様では、合成代用骨は、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムセメント、β－リン酸三カルシウムセラミック、生体活性ガラス、またはポリマーであり得る。いくつかの態様では、足場は、特定の骨欠損のサイズと形状に似ることができる。いくつかの態様では、足場は走化性であり得る。さらに、足場は、外科的除去を必要とせずに分解するように生分解性であり得る。いくつかの態様では、１つ以上の成長因子は、ＢＭＰ、ｒｈＢＭＰ－２、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－９、またはＢＭＰ－１４ではない。

【0087】

いくつかの態様では、組成物は、生体模倣足場の全体または一部として移植され得る。いくつかの態様では、組成物は、注射器を用いて担体または足場に注入され得る。いくつかの態様では、組成物中に存在するエカリンの量は少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり得、組成物中に存在するＢＭＰ－２の量は、少なくとも０．０１～５ｍｇ、またはその間の任意の量であり得る。いくつかの態様では、組成物中に存在するエカリンの量は少なくとも０．０５Ｕ／ｍＬであり得、組成物中に存在するＢＭＰ－２の量は少なくとも０．０１～１μｇ、またはその間の任意の量であり得る。いくつかの態様では、体外血腫と代用骨の比率は、１０００：１～１：１０００、またはその間の任意の比率であり得る。

【0088】

いくつかの態様では、治療計画は、あらゆる骨欠損を治療するための標準的な治療計画であり得る。簡単に説明すると、欠損創傷は創面切除され、内板、外固定器、または髄内釘で固定される。組成物、組成物と足場、及び本明細書に記載の生体模倣足場と体外血腫は、創傷を閉じる前に骨格異常にユニットとして挿入され得る。いくつかの態様では、組成物の成分、組成物の成分と足場、及び創傷を閉じる前に、生体模倣足場と本明細書に記載の体外血腫の成分を骨格異常に別々に挿入することができる。例えば、マルチコンパートメントデバイスは、２つ以上のチャンバを含み、または２つ以上のシリンジを使用して、体外血腫の成分及び代用骨を別々に送達することができる。いくつかの態様では、第１チャンバまたはシリンジは、所定の濃度の凝固剤（例えば、カルシウムとトロンビン、またはエカリン）を含み得る。いくつかの態様では、第２チャンバまたはシリンジは、全血のみを含み得る。いくつかの態様では、第２チャンバまたはシリンジは、外因性成長因子（例えば、ＢＭＰ２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ）と組み合わせた全血を含み得る。いくつかの態様では、第２チャンバまたはシリンジは、代用骨（例えば、ＤＢＭ、同種異系の海綿骨片）と組み合わせた全血を含み得る。いくつかの態様では、第２チャンバまたはシリンジは、外因性成長因子（例えば、ＢＭＰ２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ）代用骨と組み合わせた全血を含み得る。いくつかの態様では、第３チャンバまたはシリンジは、外因性成長因子及び追加の代用骨を含み得る。いくつかの態様では、第３チャンバまたはシリンジは、外因性成長因子を含み得る。いくつかの態様では、第３チャンバまたはシリンジは、１つ以上の代用骨を含み得る。いくつかの態様では、第４チャンバまたはシリンジは、１つ以上の代用骨を含み得る。いくつかの態様では、１つ以上の成長因子は、ＢＭＰ、ｒｈＢＭＰ－２、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－９、またはＢＭＰ－１４ではない。

【0089】

感染が存在しておらず、欠損が最終的な治療の準備ができている限り、治療計画は一貫して不変であり得る。本明細書に開示される組成物または生体模倣足場（またはインプラント）は、皮膚を通って、または体腔または解剖学的開口部を通って体内に進入することによって骨領域に挿入され、近くの構造へのさらなる損傷を最小限に抑えることができる。組成物、生体模倣足場、足場またはインプラントのサイズ及び形状を含むタイプの選択は、組成物、生体模倣足場、足場またはインプラントが移植される骨の形状及び／またはサイズ、骨密度のパーセンテージ（つまり、残りの骨の多孔性）、及び／または骨への足場またはインプラントの拡散の所望の速度と分布、あるいはそのような要因の組み合わせを含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、組成物、生体模倣足場、足場またはインプラントの形状は、骨または椎体の形状に一致するように構築され得、従って、組成物、生体模倣足場、インプラントもしくは体外血腫、または組成物、足場、生体模倣足場、インプラントもしくは体外血腫中に存在する成分のより均一な分布を可能にする。組成物、生体模倣足場またはインプラントの適用は、手術時または他の任意の適切な方法で行うことができる。

【0090】

いくつかの態様では、デポーインプラントまたは足場の形状は、球形または円筒形であり得る。いくつかの態様では、デポーインプラントまたは足場の形状は、球形、または臨床上の緊急性によって決定される他の任意の患者固有の幾何学形状、形態、または形であり得る。いくつかの態様では、円筒状は、長さが少なくとも５ｍｍ～約３０ｃｍ（またはそれ以上）であり得る。いくつかの態様では、円筒状は、直径が少なくとも１ｍｍ～約６０ｍｍ（またはそれ以上）であり得る。いくつかの態様では、円筒状は、直線及び／または湾曲であり得る。いくつかの態様では、円筒状は、真っ直ぐなロッドであっても、湾曲したロッドであってもよい。円筒またはロッドの形状は、一方向に沿って他の方向よりも長くなり得る長手方向軸を有する任意の形状であり得る。長手方向軸を横切るデポーの断面形状は、任意の形状であり得る。いくつかの態様では、断面形状は、楕円形、円形、三つ葉形、またはその他の形状であり得る。いくつかの態様では、デポーまたは足場は、そのような長手方向に直線であっても湾曲していてもよい。デポーまたは足場の端面は、平面形、円形、または回旋状のいずれかになるように成形され得る。

【0091】

インプラントデポーもしくは足場、または体外血腫の寸法は、骨欠損のサイズ及び治療される解剖学的部位に依存し得る。いくつかの態様では、足場は欠損の実際のサイズより約２０％長くすることができるため、欠損した骨の体積にしっかりとフィットして完全に埋められる。例えば、骨欠損のサイズが３ｃｍで、それが成人の大腿骨骨幹部である場合、インプラントデポーまたは足場または体外血腫は、例えば、直径約３～４ｃｍ、長さ３．６ｃｍの寸法で構築する必要がある。いくつかの態様では、インプラントデポー、足場、または体外血腫は、特定の骨欠損のサイズと形状に似ることができる。いくつかの態様では、インプラントデポーまたは足場は走化性であり得る。

【0092】

また、本明細書は、骨治癒を開始または促進するために、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用し、上記組成物を本明細書に記載の足場のいずれかと組み合わせる方法を開示する。また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、分節骨欠損を再構築する方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して生体模倣足場を作成し、本明細書に記載の生体模倣足場及び組成物のいずれかを使用して、腫瘍、外傷、または感染に起因する分節骨欠損を再構築する方法を開示し、あるいは、生体模倣足場は、触媒量のＢＭＰまたは１つ以上の代用骨を送達することで正常な骨折治癒カスケードを開始し、その後内因性成長因子を局所的に過剰活性化する。

【0093】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、危険性のある骨折（例えば、骨粗鬆症患者、糖尿病患者、高齢者、または喫煙者）を治療する方法も開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して、触媒量のＢＭＰまたは１つ異常の代用骨を送達することで正常な骨折治癒カスケードを開始し、その後内因性成長因子を局所的に過剰活性化し、本明細書に記載の生体模倣足場及び組成物のいずれかを使用して、危険性のある骨折を治療する方法を開示する。

【0094】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、非定型大腿骨骨折を治療する方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して体外血腫を作成し、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、非定型大腿骨骨折を経皮的に治療する方法を開示し、体外血腫は、触媒量のＢＭＰまたは１つ以上の代用骨を送達することで正常な骨折治癒カスケードを開始し、その後内因性成長因子を局所的に過剰活性化する。

【0095】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、変位が最小限に抑えられた大腿骨頸部骨折を治療する方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して体外血腫を作成し、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、変位が最小限に抑えられた大腿骨頚部骨折を経皮的に治療する方法を開示し、体外血腫は、触媒量のＢＭＰまたは１つ以上の代用骨を送達することで正常な骨折治癒カスケードを開始し、その後内因性成長因子を局所的に過剰活性化する。

【0096】

また、本明細書は、本明細書に記載の生体模倣足場及び組成物のいずれかを使用して、骨粗鬆症性機能不全骨折（骨盤、脊椎）を治療する方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して体外血腫を作成し、本明細書に記載の生体模倣足場及び組成物のいずれかを使用して、骨粗鬆症性機能不全骨折（例えば、骨盤、脊椎）を経皮的に治療する方法を開示し、体外血腫は、触媒量のＢＭＰまたは１つ以上の代用骨を送達することで正常な骨折治癒カスケードを開始し、その後内因性成長因子を局所的に過剰活性化する。

【0097】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して、脊椎ケージ（セラミック、ＰＥＥＫ、または金属合金のいずれか）などの足場と組み合わせて脊椎固定術を増強する方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して体外血腫の局所形成を誘導し、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して、すぐに完全な体重負荷を可能にし、より安定した固定を提供し、術後の回復を促進する脊椎ケージ（セラミック、ＰＥＥＫ、または金属合金のいずれか）などの足場と組み合わせて脊椎固定術を増強する方法を開示し、体外血腫は、触媒量のＢＭＰまたは１つ異常の代用骨を送達することで骨治癒カスケードを開始し、その後内因性成長因子を局所的に過剰活性化するケージ（足場）を構成する基材上に埋め込まれる。

【0098】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、長骨骨折の癒合遅延を（経皮的または開放的に）治療する方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して体外血腫を作成し、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、長骨骨折の癒合遅延を（経皮的または開放的に）治療する方法を開示し、体外血腫は、触媒量のＢＭＰまたは１つ以上の代用骨を送達することで骨折治癒カスケードを開始し、その後内因性成長因子を局所的に過剰活性化する。

【0099】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、長骨骨折の癒合不全を（経皮的または開放的に）治療する方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して体外血腫を作成し、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、確立された長骨骨折の癒合不全を（経皮的または開放的に）治療する方法を開示し、体外血腫は、触媒量のＢＭＰまたは１つ以上の代用骨を送達することで骨折治癒カスケードを開始し、その後内因性成長因子を局所的に過剰活性化する。

【0100】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、長骨骨折の治癒を改善する（例えば、加速する）方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して体外血腫を作成することにより、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、選択された候補者（ハイパフォーマンスアスリートなど）における長骨骨折の治癒を改善し（例えば加速し）、より迅速な回復を促進する方法を開示し、体外血腫は、触媒量のＢＭＰまたは１つ以上の代用骨を送達することで骨折治癒カスケードを開始し、その後内因性成長因子を局所的に過剰活性化する。

【0101】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、選択された獣医学に関する候補者（サラブレッド競走馬など）における長骨骨折の治癒を促進する方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して体外血腫を作成することにより、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、選択された獣医学に関する候補者（サラブレッド競走馬など）の長骨骨折の治癒を促進し、より迅速な回復を促進する方法を開示し、体外血腫は、触媒量のＢＭＰまたは１つ以上の代用骨を送達することで骨折治癒カスケードを開始し、その後内因性成長因子を局所的に過剰活性化する。

【0102】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、より迅速かつ予測可能な歯及び上顎顔面の再構築を促進する方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して体外血腫を作成することにより、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、より迅速かつ予測可能な歯及び上顎顔面の再構築を促進する方法を開示し、体外血腫は、触媒量のＢＭＰまたは１つ以上の代用骨を送達することで骨形成カスケードを開始し、その後内因性成長因子を局所的に過剰活性化する。

【0103】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、特発性顎骨吸収をもたらす状態を逆転させる方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して、体外血腫を作成し、局所的に骨を再生し、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して、特発性顎骨吸収をもたらす状態を逆転させる方法を開示する。

【0104】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、特発性骨壊死をもたらす状態を治療及び／または逆転させる方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して、経皮的または開放的に送達される体外血腫を作成し、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、特発性骨壊死をもたらす状態を逆転させる方法を開示する（キーンベック病、大腿骨頭の無血管性壊死、及び大腿顆を含むが、これらに限定されない他の様々な解剖学的部位の骨壊死など）。

【0105】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、大腿骨頭が潰れた大腿骨頭の特発性無血管壊死を引き起こす状態を治療及び／または逆転させる方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して、外科的股関節脱臼後の開放術で送達される体外血腫を作成し、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、大腿骨頭が潰れた大腿骨頭の特発性無血管性壊死を引き起こす状態を治療及び／または逆転させる方法を開示する。

【0106】

また、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、本明細書は、化学療法、アルコール依存症、喫煙、または他の外因性因子に起因する骨壊死を治療する方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して、経皮的または開放的に送達される体外血腫を作成し、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、化学療法、アルコール依存症、喫煙、または他の外因性因子に起因する骨壊死を治療する方法を開示する。

【0107】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、標準的な融合処置を増強する方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して体外血腫を作成し、本明細書に記載される任意の組成物及び生体模倣足場を使用して、任意の標準的な融合処置（例えば、股関節、膝、足首、手首、肘、肩、距骨下関節、手根骨、中足部などの限定的な融合、母趾、母指、小指（足指または指のいずれか）などの小さな関節の融合）を増強する方法を開示し、体外血腫は、触媒量のＢＭＰまたは１つ以上の代用骨を送達することで骨形成カスケードを開始し、その後内因性成長因子を局所的に過剰活性化する。

【0108】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、舟状骨腰部骨折の治癒を促進する方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して体外血腫を作成することにより、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、舟状骨腰部骨折の治癒を促進し、より迅速な回復を促進する方法を開示し、体外血腫は、触媒量のＢＭＰまたは１つ以上の代用骨を送達することで骨折治癒カスケードを開始し、その後内因性成長因子を局所的に過剰活性化する。

【0109】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、複雑な骨格異常を再構築する方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して体外血腫を作成することにより、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、外傷、腫瘍、または感染症のいずれによるものであっても、頭蓋骨の複雑な骨格異常を再構築する方法を開示し、体外血腫は、触媒量のＢＭＰまたは１つ以上の代用骨を送達することで骨形成カスケードを開始し、その後内因性成長因子を局所的に過剰活性化する。

【0110】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、胸骨切開の治癒を促進する方法を開示する。また、本明細書は、エカリンを使用して体外血腫を作成することにより、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを使用して、より迅速な回復を促進し、開胸手術に関連する胸骨切開の治癒を促進する方法を開示し、体外血腫は、触媒量のＢＭＰまたは１つ以上の代用骨を送達することで骨折治癒カスケードを開始し、その後内因性成長因子を局所的に過剰活性化する。

【0111】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを、エカリンで増強された特別に適合された骨内方成長表面を有する関節形成術の構成要素において使用して、骨治癒カスケードをより迅速に開始する構造基材上に埋め込まれた体外血腫の局所形成を誘導する方法を開示する。

【0112】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場のいずれかを、エカリンで増強された特別に適合された骨内方成長表面を備えたオッセオインテグレーションステム及び構成要素とともに使用して、骨治癒カスケードをより迅速に開始する構造基材上に埋め込まれた体外血腫の局所形成を誘導する方法を開示する。

【0113】

いくつかの態様では、１つまたは複数の代用骨はＢＭＰ、ｒｈＢＭＰ－２、ＢＭＰ－２、ＢＭＰ－７、ＢＭＰ－４、ＢＭＰ－６、ＢＭＰ－９、またはＢＭＰ－１４ではない。

【0114】

本明細書で使用される場合、「生体模倣血腫」という用語は、「体外血腫」を指すために使用され得る。

【0115】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して、出血を軽減するか出血を管理する方法を開示する。

【0116】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して、外科手術中の広範な静脈出血／浸出を管理する方法を開示する。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法では、本明細書に記載の組成物のいずれも、水性エアロゾルとして局所的に噴霧されるように製剤化され得る（エカリンを患部に分配するためにアトマイザーを使用する）。

【0117】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して、術中または緊急の負傷状況において、個々の損傷血管（例えば、大量出血者）からの出血を管理または停止する方法を開示する。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法では、本明細書に記載の組成物のいずれもビーズ（例えば、磁気ビーズ）上で投与され得る。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法では、本明細書に記載の組成物のいずれも、クランプ／クラムシェルとして血管の端に適用され、局所的にエカリンをクランプオフして送達することを同時に行うことができ、特定の損傷した血管端への適用を制限する。クランプまたはクランプ要素は、隣接する損傷した血管を締め付けることができ、組成物の全身投与の危険性を排除または最小限に抑えることができる。

【0118】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物のいずれかを選択的塞栓形成として使用する方法を開示する。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法では、本明細書に記載の組成物のいずれも、インターベンショナル放射線科医を介して１つ以上の標的血管に送達され、Ｘ線撮影に向けた長いカテーテルを使用して、骨盤内／腹腔内／食道／頭蓋内の出血を管理または停止し、これにより、指示された個別の病状に限定されたエカリンの選択的かつ高度に特異的な投与が可能になる（例えば、血管造影コイルを使用して実行される方法と同様）。

【0119】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して、機能性子宮出血を治療する方法を開示する。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法は、本明細書に記載の組成物のいずれかを罹患女性の子宮内に導入または配置するために使用され得る。いくつかの態様では、エカリンは、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）の一部として送達されるように製剤化され得る。

【0120】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して、血友病関連の変形性関節症を治療する方法を開示する。いくつかの態様では、エカリンは、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）の一部として送達されるように製剤化され得る。

【0121】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して、抗凝固剤（例えば、ワルファリン、クマジンなど）の過剰摂取に関連する変形性関節症を治療する方法を開示する。いくつかの態様では、エカリンは、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）の一部として送達されるように製剤化され得る。

【0122】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して、抗凝固剤（例えば、ワルファリン、クマジンなど）の過剰摂取に関連する特発性筋肉内出血を治療する方法を開示する。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法では、本明細書に記載の組成物のいずれも選択的塞栓として使用され得る。

【0123】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して、血友病に関連する特発性筋肉内出血を治療する方法を開示する。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法では、本明細書に記載の組成物のいずれも選択的塞栓として使用され得る。

【0124】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して、任意の待機的膝関節全置換術における術後関節症を治療する方法を開示する。いくつかの態様では、エカリンは、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）またはナノ粒子（複数可）の一部として送達されるように製剤化され得る。いくつかの態様では、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）またはナノ粒子（複数可）は、創傷を閉じる前に関節内にたっぷりと送達または散布することができる。

【0125】

また、本明細書は、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して、鼻出血を治療する方法を開示する。いくつかの態様では、エカリンは、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）の一部として送達されるように製剤化され得る。いくつかの態様では、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）は、布製の包装材料に埋め込むか、布製のシース内に封入して分布を制限し、局所的に封じ込めることができる。いくつかの態様では、エカリンは、布製の包装材料に埋め込まれるか、または布製のシース内に封入される生分解性コラーゲンビーズ（複数可）の一部となるように製剤化されるように、鼻パックの形態で送達され得る。

【0126】

また、本明細書に記載の組成物のいずれかを使用して、網膜出血を治療する方法を開示する。いくつかの態様では、本明細書に開示される方法では、本明細書に記載の組成物のいずれも選択的塞栓として使用され得る。いくつかの態様では、エカリンは、生分解性コラーゲンビーズ（複数可）またはナノ粒子（複数可）の一部として送達されるように製剤化され得る。いくつかの態様では、生分解性コラーゲンビーズまたはナノ粒子製剤を使用すると、再発のリスクを最小限に抑え、網膜剥離に積極的に対処する自己接着性の構造を作成することでベルクロタイプの効果を生み出すことができる。

【0127】

いくつかの態様では、「出血（ｂｌｅｅｄｉｎｇ）」は出血する（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）ものであり得る。いくつかの態様では、血液は、１つ異常の損傷した血管から循環系から漏れる可能性がある。いくつかの態様では、出血は内部出血または外部出血であり得る。

【0128】

製造品
本明細書に記載の組成物及び生体模倣足場は、例えば、骨欠損または本明細書に開示される任意の方法を治療するための治療法として使用するためのラベル付きの適切な容器に包装することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載の体外血腫を含む組成物は、例えば、骨欠損または本明細書に開示されるいずれかの方法を治療するための治療として使用するためのラベル付きの適切な容器に包装することができ、生体模倣足場の足場部分とは別に包装することができる。従って、包装された製品（例えば、本明細書に記載の組成物または体外血腫のいずれかの個々の成分を含む組成物を含有し、濃縮された濃度またはすぐに使用できる濃度で保管、出荷、または販売するために包装された足場、滅菌容器）及びキットは、少なくとも単離された全血とクエン酸ナトリウム、または多血小板血漿、血漿、もしくは赤血球を有する血漿、及びエカリン、オスクタリンと塩化カルシウム、塩化カルシウム、トロンビン、または本明細書に記載のトロンビンと塩化カルシウム、及び本開示の範囲内にある使用説明書を含む。製品は、本明細書に記載の生体模倣足場もしくは組成物または体外血腫を含有する容器（例えば、バイアル、瓶、ボトル、袋など）を含み得る。さらに、製品は、例えば、包装材料、使用説明書、注射器、緩衝液、または予防もしくは治療が必要な状態を治療もしくは監視するための他の対照試薬をさらに含み得る。製品は、説明文（例えば、製品の使用方法を説明するプリントラベルまたは挿入物、または他の媒体（例えば、オーディオテープまたはビデオテープ）を含み得る。説明文は、容器に関連付けることができ（例えば、容器に貼り付けられ）、生体模倣足場、その中の組成物または体外血腫が投与されるべき方法（例えば、投与の頻度及び経路）、その適応症、及び他の用途を説明することができる。生体模倣足場もしくは組成物または体外血腫は、投与の準備ができており（例えば、適切な用量単位で存在し）、薬学的に許容されるアジュバント、担体または他の希釈剤を含み得る。あるいは、化合物は、希釈剤を備える濃縮された形態で提供され、希釈に関する説明書も添付されている。

【実施例】

【0129】

実施例１、吸収性コラーゲン足場を凝固全血及びｒｈＢＭＰ－２と組み合わせて、ラットの大きな骨欠損を修復することに成功した。
自家骨移植に対する最も有望な代替法の１つは、吸収性コラーゲンスポンジ（ＡＣＳ）上に送達された組換えヒト骨形成タンパク質２（ｒｈＢＭＰ－２）の使用である。しかし、骨治癒の成功は、そのバースト放出及び体内での短い半減期に起因して、ｒｈＢＭＰ－２の常に高い生理学的用量を必要とし、その大部分は、コラーゲンスポンジが骨欠損領域への挿入後に圧縮されるとすぐに急速に浸出する。これは、異所性／異所性骨化の発症率及び重症度の増加、ならびに抗体形成、インプラントの除去、骨吸収、及び癌さえといった多くの他の関連する副作用をもたらす。より適切な担体は、これらの複雑な骨損傷を治療し、必要とされる用量を有意に減少させることによってＢＭＰの有効性を改善し、従って、それらの潜在的に危険な副作用を軽減するために明らかに必要とされる。

【0130】

骨折部位に形成される血腫は、周囲の組織に由来する分子因子を組み込んだ生物学的事象のカスケードを活性化する内因性足場として機能する。研究では、骨折部位に形成された血腫が骨折の治癒方法に大きな影響を及ぼし、この血腫を除去すると骨折の治癒が遅れることが示される。ＡＣＳの有効性を高めるために、内因性骨折血腫の固有の構造的及び生物学的特性を模倣する体外血腫とＡＣＳを組み合わせた。ラット大腿骨の５ｍｍの大臨界サイズ欠損モデルでは、全血、凝固剤及び低用量のｒｈＢＭＰ－２の混合物をＡＣＳと組み合わせることによって生じる体外血腫が、ＡＣＳとＢＭＰ－２の単独使用と比較して、骨の再生能力を著しく増強し、必要なｒｈＢＭＰ－２用量を減少させるかどうかが試験された。

【0131】

材料及び方法。ＡＣＳ／全血生体模倣足場の調製。安楽死時の末梢出血により、麻酔をかけた雄性ドナーのＦｉｓｈｅｒ ３４４ラットから血液を採取した。血液は、２１ゲージの針を使用した心臓穿刺によって収集された。凝固を防ぐために、血液９部を３．２％クエン酸三ナトリウム溶液１部と混合した。円筒形の生体模倣足場を作成するために、クエン酸血液を加える前に、０．５５μｇのｒｈＢＭＰ－２、１０ｍＭの塩化カルシウム、及び５Ｕ／ｍＬのトロンビン（体外血腫）を９６ウェルプレートの平底ウェルの底にピペットで移した。溶液を上下にピペッティングすることによって混合し、円筒形の乾燥ＡＣＳを含有する別のウェルに素早く移した。生体模倣足場を室温で１５分間インキュベートした後、ラットの５ｍｍの大腿骨欠損に移植した。全血を含まないＡＣＳを対照グループとして使用した。

【0132】

結果。ＡＣＳ／ＷＢ／ＢＭＰ２で治療した骨欠損は、手術後４週間で完全に架橋された。８週間後、骨欠損の治癒は完了し、皮質骨はほぼ完全に元の形状に回復したが、少量の髄内骨梁が残っており、治癒と再構築が進んでいることが示された。対照的に、ＡＣＳ／ＢＭＰ２で治療した骨欠損は８週間以内に治癒せず、一貫して癒合不全を引き起こした（図１）。

【0133】

結論。データは、全血と凝固剤の混合物を特定の濃度（自然の骨折血腫、体外血腫を模倣）でＡＣＳに加えることにより、生体模倣足場がＡＣＳ単独と比較してはるかに高い効率でｒｈＢＭＰ－２を送達できることを示す。さらに、この治癒は、かなり低い用量のｒｈＢＭＰ－２を使用して達成されたが、ＡＣＳに送達された同じ用量では、骨欠損の治癒を開始することさえできなかった。優れた治癒は、生体骨格が、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦなどの重要な成長因子の内因性リザーバである先天性骨折血腫によりよく似ており、従ってＡＣＳ単独よりも効率的にｒｈＢＭＰ－２に結合するためであると考えられる。さらに、ＡＣＳに体外血腫を追加する追加の利点は、送達されたｒｈＢＭＰ－２が足場内に安全に含まれることであり、異所性／異所性骨化や他の有害な副作用を防ぐことができる。この生体模倣足場を使用すると、治癒結果を損なうことなく、大幅に低減した用量でのｒｈＢＭＰ－２の送達が可能になる。

【0134】

実施例２、様々な代用骨と組み合わせた体外血腫。
体外血腫は、リーマー洗浄装置アスピレータ（ＲＩＡ）を使用して採取された長骨からの骨移植を含む、ＤＢＸ、ＤＢＭ、サンゴ、同種異系の海綿骨片、または骨髄吸引液濃縮物（ＢＭＡＣ）など、現在市場で入手可能な生物学的製品に由来する代用骨のいずれかと混合することができる。また、体外血腫は、硫酸カルシウム、リン酸カルシウムセメント、ベータ三カルシウム（ＴＣＰ）リン酸セラミック、二相リン酸カルシウム（ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）とベータＴＣＰセラミックス）、生体活性ガラス、ポリマーベースの代用骨などの合成代用骨と混合することができる。

【0135】

脱灰骨基質（ＤＢＭ）は、海綿骨及び皮質骨の代替品であり、乾燥した、成形可能な、または注射可能な形態として入手可能であり、ペースト、粉末、パテ、顆粒、ゲル、スポンジ、またはストリップとして存在することができる。ＤＢＭは脱灰によって骨移植片から調製され、細胞と基質タンパク質の接着のための枠組みを提供し、また、新しい骨の成長を誘導する骨形成物質も含有する。ＤＢＭの骨形成成分は、ＢＭＰ－２などのトランスフォーミング成長因子ベータファミリー（ＴＧＦ－Ｂ）の多くを含む成長因子の混合物である。ＤＢＭは生体力学的強度をほとんど提供しないが、骨伝導材料として、また程度は低いが骨誘導材料として機能する。整形外科では、ＤＢＭは自家骨移植片の機能拡張装置として使用されており、使用できる自家骨移植片が限られている場合に添加剤（機能拡張装置）として使用する場合には優れていたが、単独の製品としては骨形成を開始することはできない。これは、処理、ドナーの選択、最終滅菌、及び添加剤（ヒアルロン酸、プルオン酸、グリセリン、ゼラチンなど）による大きな骨欠損に特に当てはまり、これらの添加物により、生物活性が変動し、その結果、生物学的骨誘導性や臨床成績が予測不可能になる製品が生成される。同じことが、現在市場で入手可能な他の多くの代用骨にも当てはまる。

【0136】

対照的に、体外血腫は、治癒中の骨折血腫を模倣し、自然に治癒しない大きな分節骨欠損にｒｈＢＭＰ－２などの成長因子を効果的かつ効率的に送達するために開発された。主な概念は、内因性骨折血腫を模倣するために、自己血液を特定濃度の凝固剤と組み合わせて使用することであり、損傷時に形成された血腫には、生物学的事象のカスケードを活性化して骨治癒を開始する特定の微細構造特性が身体に含まれるからである。この血栓（血腫）は通常、赤血球、白血球、血小板などの血球を含む、骨治癒カスケードの開始に必要な成分を含有する。実際、血小板は、重要な血管新生及び骨形成成長因子を放出及び活性化することにより、骨治癒において重要な役割を果たす。送達ビヒクルとして体外血腫を使用した実験結果では、このモデルでは治癒に必要なＢＭＰ－２用量の一部を使用してラットの重大なサイズの欠損を治癒することができた。対照的に、吸収性コラーゲンスポンジは、そのような少量を使用しても治癒プロセスを開始することがまったくできなかった。さらに、骨の質は、ＢＭＰ－２を吸収性コラーゲンスポンジ上で投与した場合よりも大幅に良好であった。これらの結果に基づいて、ＤＢＭなどの１つ以上の代用骨と組み合わせた体外血腫を試験して、そのような組み合わせが血腫の有効性を高め、従って骨欠損の再生と治癒がより効率的かつ堅牢になるかどうかを確認した。例えば、図２は、脱灰骨基質製品（ＤＢＸ）の１つの構造を示しており、固体材料には細胞の動員と浸潤に重要な多孔性がないことが明確に示される。しかし、ＤＢＭが体外血腫と混合されると、結果として得られる足場は、内因性の治癒中の骨折血腫を模倣した微細構造を有する。さらに、組み合わせ製品として、体外血腫は骨折治癒を促進する重要な成分を含む。さらに、ＤＢＭを加えると、骨欠損部位で利用できる成長因子の量が増加し、骨の再生が効率的かつ確実に開始される。従って、ＤＢＭを含む構造的によく組織化された体外血腫は、成長因子を継続的に放出するための一時的なリザーバとしても機能し、細胞の浸潤、増殖、及び周囲の組織からの分化を促進する適切な環境を提供することができる。

【0137】

実施例３、足場と組み合わされた体外血腫。
患者専用の３Ｄプリントされたチタン製ケージは、大規模な分節骨損失及び脊椎固定術の治療に使用される（図３及び４）。これらのチタン製ケージは、長さ６ｃｍを超える分節骨欠損や脊椎の病状に対処するために使用される。これらの金属インプラントまたは足場は骨誘導性ではないため、これらのチタン製足場の細孔内で骨の再生及び組み込みを開始することができない。骨の治癒と再生を開始するために、整形外科医は現在、自家骨移植片、代用骨、及び成長因子を追加することで再生の可能性を高め、しかし、これらの製品はいずれも、特に長骨において、信頼性が高く、一貫性があり、堅牢な骨再生を開始することはできない。さらに、これらの特定のオプションには、残念ながら多くの欠点が伴う。例えば、自家骨移植片は必要な量を容易に入手できないことが多く、ドナー部位の潜在的な罹患率の問題がある。さらに、これらの移植片は、外科医が手動でケージ／足場の空洞／細孔に押し込む必要があるため、使いやすいものではなく（図４）、これは、時間がかかり、例えばケージの中心など、チタン製ケージ／足場内に均一なグラフトの組み込みを達成することはほとんど不可能である。成長因子も高濃度で送達する必要があり、これは異所性骨形成などの多くの有害な副作用と関連することが示される。さらに、ケージ／足場内に均一に組み込むことは単純な手順ではなく、多くの場合、成長因子を代用骨と組み合わせて使用する必要がある。当然ながら、代用骨自体も、自家骨移植片や成長因子と非常によく似た様々な欠点を伴い、主な問題は、予測不可能な生物学的骨誘導性と臨床成績に加えて、ケージ／足場の空洞／細孔に手動で押し込む必要があることである。

【0138】

この問題を克服するには、体外血腫は、成長因子やＤＢＭなどの代用骨と組み合わせても、チタン製ケージ／足場内へのより均一な取り込みを促進し、これは、体外血腫は液体（図３）として始まり完全に浸透し、同時に一貫した骨再生を促進するからである。この治療戦略は、代用骨が体外血腫自体内に送達され、内因性治癒骨折血腫の微細構造特性を模倣するため、うまく機能する。これにより、骨の再生を効率的かつ確実に開始するために必要な成長因子の量が増加する。さらに、構造的によく組織化された足場（例えば、体外血腫）は、成長因子を継続的に放出するための一時的なリザーバとしても機能し、細胞の浸潤、増殖、及び周囲の組織からの分化を促進する非常に好ましい環境を提供する。

【0139】

実施例４、癒合遅延、癒合不全、骨欠損の治療のための体外血腫の経皮送達。
体外血腫と代用骨（例えば、ＤＢＭ、骨片）及び／または成長因子（例えば、ＢＭＰ－２、ＰＤＧＦ）のいずれかとの混合物を経皮的に送達して、遅延した骨癒合、癒合不全、及び骨欠損の治癒を促進することができる。

【0140】

該方法は、以下のとおりである。関節鏡手術または内視鏡手術と同様に、外科医は細いチューブ（プラスチックまたは金属）をカニューレとして挿入し、ボタンホールほどの大きさの小さな切開部から光ファイバービデオカメラを導入できるようにする。遅延／癒合不全または骨欠損の内部の映像を高解像度ビデオモニタに送信できる。別の小さな切開を行って第２小さなチューブ（カニューレ）を導入し、このチューブを通して回転ブレードが挿入され、癒合不全部位に進入するときに傘のように徐々に展開し、この位置はＸ線透視検査で監視され得る。癒合不全の中心から約５～１０ｍｍ拡張し、限定的なデブリードマンを可能にして癒合不全部位内の線維化組織を除去し、足場を含む体外血腫の注入のための空間を準備する。このステップでは、生物学的製品を送達するための空洞を作成するだけでなく、骨治癒の成功を妨げることが知られている高密度の無血管線維化組織を除去する。オプションの第３小さな切開を作成して、別のカニューレ／チューブを挿入し、線維性癒合不全組織の創面切除で生じた破片を除去及び洗浄することができる。体外血腫の送達のために非癒合部位が準備されたら、例えば２つのチャンバを備えた注射器を使用できる（図５）。癒合不全の線維性組織を除去するために使用したのと同じチューブを通して、二室シリンジに取り付けられた長い針を挿入できる。チャンバの１つは凝固剤（カルシウムとトロンビン、またはエカリン）を含み、第２チャンバは、全血単独、または外因性成長因子（例えば、ＢＭＰ２、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ）及び／または代用骨（例えば、ＤＢＭ、同種異系の海綿骨片）と組み合わせたものを含有する。適用中、針に入るときに混合すると、これらの成分の相互作用によって体外血腫が形成され、骨治癒プロセスが開始される。体外血腫が癒合不全部位に送達された後、カニューレが除去され、切開が縫合糸で閉じられる。この処置により、患者の痛みが軽減され、感染症や他の合併症のリスクが制限され、手術時間が最小限に抑えられ、患者が回復して通常の活動に戻るまでの時間が短縮される。

【0141】

実施例５、血腫の構造的及び生物学的特性。
大きな分節骨欠損を治癒するためのアプローチ。骨折部位に形成された血腫が骨折の治癒方法に大きな影響を与えることは十分に確立される。例えば、研究では、血腫の除去は骨折の治癒を遅らせることが示される（Ｓｃｈｅｌｌ Ｈ，Ｐｅｔｅｒｓ Ａ，Ｄｕｄａ ＧＮ．Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ｆｒａｃｔｕｒｅ ｈｅｍａｔｏｍａ ａｎｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｆｒｅｓｈ ｈｅｍａｔｏｍａ ｄｅｌａｙｓ ｂｏｎｅ ｈｅａｌｉｎｇ ｉｎ ｓｈｅｅｐ．Ｂｏｎｅ．２０１２）。さらに、フィブリン線維の多孔性や厚さなど、形成されたフィブリン血塊の構造的特性が骨修復に影響を与えることを示唆する報告がある（Ｗａｎｇ Ｘ， Ｆｒｉｉｓ ＴＥ，Ｍａｓｃｉ ＰＰ，Ｃｒａｗｆｏｒｄ ＲＷ，Ｌｉａｏ Ｗ，Ｘｉａｏ Ｙ．Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｌｏｏｄ ｃｌｏｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂｙ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１ ｂｅｔａ ｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｏｎｅ ｄｅｆｅｃｔｓ ｈｅａｌｉｎｇ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ；２０１６；６：３５６４５；及びＷａｎｇ Ｘ，Ｆｒｉｉｓ Ｔ，Ｇｌａｔｔ Ｖ，Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ｒ，Ｘｉａｏ Ｙ．Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ Ｒｅｇｅｎ Ｍｅｄ．２０１７；１１：２８６４－２８７５．）。本明細書に記載の結果は、０．５ｍｍのラットの大腿骨欠損（正常に治癒している骨折）から単離された体内血腫は、手術３日後の５ｍｍの分節骨欠損（介入なしでは非治癒、３２０±６４ｎｍ）と比較して３５％薄いフィブリン線維（２０９±２０ｎｍ）を有していたことを実証する。さらに、０．５ｍｍと比較して５ｍｍの欠損では多孔性の低いネットワークも観察され（４２．５６％対５０．０３％）、グループ間で１６％の差が生じた。大きな骨欠損（５ｍｍ）と正常に治癒している骨折（０．５ｍｍ）で形成された血腫の間に生物学的特性の違いがあるかどうかを調べるために、ＲＮＡシーケンシング分析を使用して体内研究が実行された。

【0142】

炎症反応を媒介する遺伝子（例えば、Ｉｌ１ｂ－活性化マクロファージによって産生される、Ｓｄｆ１－炎症性骨破壊の領域で発現し、破骨細胞形成に対する抑制効果を媒介する）には大きな違いが見つかり、これらは主に５ｍｍ対０．５ｍｍの欠損で上方調節された。細胞外基質（ＥＣＭ）の構造成分に重要な遺伝子（Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ２ａ１、Ｃｏｌ３ａ１など）、ＥＣＭプロテアーゼ（Ｍｍｐ２など）及びその阻害剤（Ｔｉｍｐ１など）の大部分がダウンレギュレートされた。対照的に、細胞接着分子（例えば、Ｔｈｂｓ１）を調節する遺伝子は上方調節された。血管新生のプロセスに関与する遺伝子の分析により、新しい血管形成の強力な刺激因子であるアンギオゲニン（Ａｎｇ）が下方調節される一方、骨芽細胞系統の細胞も刺激する強力な血管収縮剤である血管新生サイトカインであるエンドセリン（Ｅｄｎ１）が上方調節されることが示される。骨形成に関連する遺伝子の発現は、骨芽細胞の分化（例えば、オステオカルシンとしても知られるＢｇｌａｐ－骨修復を開始するために骨芽細胞によって分泌される）及び骨形成（例えば、Ｂｍｐ７－骨の形質転換において重要な役割を果たす）に関与する下方調節された遺伝子の重要な部分を実証した。

【0143】

これらの結果は、正常に治癒している骨折と、骨治癒の初期段階における大きな骨欠損との間の遺伝子発現における重要な違いを初めて実証したものである。最も顕著な違いは、骨折後の重要な事象である炎症反応に関与する遺伝子セットに見出された。５ｍｍ対０．５ｍｍの欠損における炎症性遺伝子の上方調節は、大きな骨欠損が正常な骨折よりも強い炎症反応を誘発し、マクロファージ、線維芽細胞、ＭＳＣ、及び骨前駆細胞の補充の増加につながることを示唆している。侵入した炎症細胞は血管新生促進性サイトカインも産生し、これは、５ｍｍ対０．５ｍｍの欠損を比較したときに観察される上方調節を説明する。同時に、骨格の発達、骨ミネラル代謝、ＥＣＭの形成に重要な多くの遺伝子の下方調節は、大きな骨欠損では骨形成反応が低下していることを示唆している。

【0144】

ＳＶＣＥ、エカリンを使用して特定の構造的特性を備えた体外血栓を生成できるかどうか、またエカリンが幹細胞に対して毒性があるかどうかを決定するための体内研究も行われた。この結果は、血栓の構造的特性がエカリンの濃度に応じて変化することを説得力をもって示した。例えば、エカリンの濃度が高くなると、フィブリン線維がより薄くなり、平均太さは９３±３ｎｍになったたが、最低濃度では、フィブリン線維の太さは１７３±９ｎｍであった。１日から７日までの細胞増殖速度は、エカリンの濃度が増加するにつれて低下した。例えば、エカリンなしでは１４．８±２．６倍の増加であったのに対し、最高濃度では４．３±０．７倍の増加であったが、最低濃度では１３．７±３．１倍の増加であった。体外血腫内で培養された細胞は、７日間にわたって安定した細胞数を示した。従って、これらの結果は、エカリンは毒性を引き起こさないが、濃度が高くなると細胞増殖速度が低下する可能性があることを示唆している。

【0145】

これらの観察に基づいて、正常な骨折で形成された血腫（治癒する）の構造的及び生物学的特性を決定し、それらを介入なしでは非治癒の大きな骨欠損と比較するために追加の実験が実行される（以下の実施例を参照）。例えば、十分に組織化されたフィブリン血塊は、成長因子を継続的に放出するための一時的なレザーバとして機能し、細胞の浸潤、増殖、分化を助ける適切な空間を提供することにより、骨治癒を促進する能力について研究される。従って、修復プロセスを増強する主な機会は、治癒中の骨折血腫の固有の特性を模倣する血栓の生成にある。体外で生成した血腫の構造的特性は、ＳＶＣＥを使用して変更することができ、それによって内因性骨折血腫を模倣し、分節骨欠損に移植すると、骨治癒が増強及び加速される。様々なヘビ毒が、心臓病、がん、脳卒中の患者に使用されるだけでなく、狼瘡などの病気の診断目的にも使用され、成功を収めている。従って、これらの実験はまた、臨床的に使用すると副作用があることが示されるウシトロンビンの添加と比較して、代替凝固剤としてヘビ毒酵素エカリンの使用を調べる最初の実験となる（Ｄｉｅｓｅｎ ＤＬ，Ｌａｗｓｏｎ ＪＨ．Ｖａｓｃｕｌａｒ．２００８；１６：Ｓ２９－３６；Ｏｆｏｓｕ ＦＡ，Ｃｒｅａｎ Ｓ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＭＷ．Ｃｌｉｎ Ｔｈｅｒ．２００９；３１：６７９－６９１；及びＳａｎｄｓ ＪＪ，Ｎｕｄｏ ＳＡ，Ａｓｈｆｏｒｄ ＲＧ，Ｍｏｏｒｅ ＫＤ，Ｏｒｔｅｌ ＴＬ．Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．２０００；３５：７９６－８０１）。このアプローチは、ＢＭＰなどの成長因子の必要性を完全に排除するか、骨修復プロセスを増強するために必要な用量を大幅に最小限に抑えることにより、骨治癒をより確実に促進するために使用できる生体模倣足場であるため、改善された治療戦略として検討されるであろう。その結果、現在利用可能なものよりもより生得的な治療戦略が得られ、それは大幅なコスト削減をもたらし、そして最も重要なことに、高用量のＢＭＰに関連する多くの有害な副作用を排除するであろう。さらに、本明細書に記載の結果は、軍人だけでなく一般の人々の骨損傷の治療に重大な影響を与えることができる。

【0146】

実施例６、体内骨折血腫の構造的及び生物学的特性。
雄性ＳＡＳ Ｆｉｓｃｈｅｒラットのグループ（１０～１２週齢、ｎ＝３８、ｎ＝５～８／グループ）に骨欠損を作成し、外固定器（ＲＩＳｙｓｔｅｍ ＡＧ；Ｇｌａｔｔ Ｖ，Ｅｖａｎｓ ＣＨ， Ｍａｔｔｈｙｓ Ｒ．Ｅｕｒ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｅｒ．２０１２；２３：２８９－９８；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ２９９；及びＧｌａｔｔ Ｖ，Ｍｉｌｌｅｒ Ｍ，Ｉｖｋｏｖｉｃ Ａ， Ｌｉｕ Ｆ，Ｐａｒｒｙ Ｎ，Ｇｒｉｆｆｉｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．２０１２ Ｎｏｖ ２１；９４（２２）：２０６３－７３）で安定化させて、正常な骨治癒中に形成される血腫（０．５ｍｍ）と大きな分節骨欠損（５ｍｍ）の構造的及び生物学的特性を特徴付け、比較した。骨折治癒の経過を評価するために、同じ外固定装置を使用して可能である０．５ｍｍの骨切り術が行われた。骨切り術を使用する理由は、骨切り術が再現可能であり、より一貫したサイズの血腫形成を可能にするためであり、これは血腫の構造的特性の特徴付けに重要である。血栓が成熟した後、骨折血腫の構造的特性を評価するために、手術後３日目に動物を殺した。フィブリン線維の厚さ、密度、多孔性などの血腫の構造的特性を、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ、ｎ＝８／グループ）及びＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して評価した。さらに、異なるサンプルセットを使用して、ＲＮＡシーケンシングを使用して骨修復プロセスの開始に関与する差次的に発現された遺伝子を分析した（ｎ＝６／グループ）。組織を特徴付け、組織全体の形態について、マクロファージ（ＣＤ６８、ＣＤ４０、ＣＤ２０６）オステリックス、ＰＥＣＡＭ１、ｖＷＦ、ＶＥＧＦ、Ｉ型コラーゲン、Ｈ＆Ｅなど、修復プロセスの開始に関与する重要なタンパク質の存在を確認するために、組織学及び免疫組織化学（ＩＨＣ）（ｎ＝５／グループ）も行われる。この結果は、３日経過した血腫における構造的特性と特定の遺伝子及びタンパク質の発現との間に相関関係があるかどうかを決定するために使用された。

【0147】

方法。ラット、重大なサイズの欠損及び骨切り術モデル。体重約２００～２５０ｇ（１０～１２週齢）の雄性ＳＡＳ Ｆｉｓｃｈｅｒラットを、小動物用気化器を用いてイソフルラン（２％、２リットル／分）を投与することによって麻酔した。次いで、動物の左大腿部に２０ｍｇ／ｋｇのセファゾリン（抗生物質）及び０．０８ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィン（鎮痛剤）を筋肉内注射した。詳しい手術内容を見つけることができる（Ｇｌａｔｔ Ｖ，Ｍａｔｔｈｙｓ Ｒ．Ａｄｊｕｓｔａｂｌｅ ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ，ｅｘｔｅｒｎａｌ ｆｉｘａｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｔ ｆｅｍｕｒ ｏｓｔｅｏｔｏｍｙ ａｎｄ ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｂｏｎｅ ｄｅｆｅｃｔ ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１４）。簡単に説明すると、各動物の右後脚を剃り、クロルヘキシジンで消毒し、滅菌野に置き、右脚のみを露出する滅菌手術用ドレープで覆った。約３．５～４ｃｍの切開は、大転子から膝の顆上領域まで右大腿骨の表面の前側方に走る皮膚を通して行われた。大腿骨骨幹部は、大腿四頭筋とハムストリング筋の間を穏やかに切開することによって露出させた。外固定バーは最初にＧｉｇｌｉワイヤーソーガイドにクリップされ、次に大腿骨の前後側面に配置されてドリルをガイドし、ペンドリル（ＲＩＳｙｓｔｅｍ ＡＧ、Ｄａｖｏｓ Ｐｌａｔｚ、ＣＨ）を使用して４つのドリル穴の再現可能な位置決めが可能になった。取り付けピンを、近位側から始めて、事前に開けられた穴に一度に１つずつ挿入した。固定器を所定の位置に配置した後、ソーガイドを使用して欠損を作成した。このため、Ｇｉｇｌｉワイヤーソーを大腿骨の下の２つの溝に通して、前後の往復運動によって５ｍｍの部分欠損を作成し、１つのワイヤーソーを使用して０．５ｍｍの欠損を作成した。欠損が作成される場合、ソーガイドを取り外し、傷を何層にも重ねて閉じる。手術後３日間、ラットには１２時間ごとに鎮痛剤が、２４時間ごとに抗生物質が投与された。構造的及び生物学的分析のために、血腫を３日目に収集した。

【0148】

走査型電子顕微鏡法。体内骨折血腫と体外血栓も同様に治療された。サンプルを４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定した。Ｈｉｔａｃｈｉ ＳＵ１５１０ ＶＰ－ＳＥＭを用いて、１００－１，０００倍率で肉眼的形態を捕捉した。線維直径と密度を分析するために、サンプルを４％四酸化オスミウムで後固定し、エタノール溶液の勾配（２５～１００％）で脱水した。次に、血腫と血栓のスライスをライカＥＭクリティカルポイントドライヤーを使用して乾燥させ、シリコンチップ検査標本サポートに取り付け、金パラジウムでスパッタコーティングした後、１０，０００倍（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ５５００ ＳＥＭ／ＳＴＥＭ）で画像化して高解像度で構造的特性を明らかにした。画像はＩｍａｇｅＪを使用して分析された。

【0149】

ＲＮＡシーケンシング。ＲＮＡのパラレルーケンシング（ＲＮＡ－Ｓｅｑ）は、遺伝子転写物の存在量を包括的に測定できるハイスループットな方法である（Ｗａｎｇ Ｚ，Ｇｅｒｓｔｅｉｎ Ｍ，Ｓｎｙｄｅｒ Ｍ．ＲＮＡ－Ｓｅｑ：Ａ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ．２００９．ｐｐ．５７－６３）。骨折血腫における遺伝子の発現差を調べるために、サンプルを微量遠心管に収集し、液体窒素中ですぐに急速冷凍し、－８０℃で保管した。ＲＮＡ抽出は、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して、製造元のプロトコールに従って行われた。ＲＮＡの濃度と品質はナノドロップ分光光度計（ＮＤ－１０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）を使用して測定され、ＲＮＡの完全性はＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してメーカーのプロトコールに従って評価された。５ｍｍの骨欠損を作成するために除去された骨シリンダは、健康な骨の遺伝子発現状態を表す対照として使用された。包括的なトランスクリプトーム解析を使用して、骨修復の開始プロセスに大きな影響を与える上方調節及び／または下方調節される遺伝子を特定した。この作業は、ｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ３０００を使用して行われた。

【0150】

組織学及び免疫組織化学。サンプルはヘマトキシリンとエオシンで染色され、全体的な組織形態が観察される。標準的な免疫組織化学プロトコールをパラフィン包埋切片（５μｍ）に適用する。切片は、マクロファージ（ＣＤ６８及びＣＤ２０６）、オステリックス、ＰＥＣＡＭ１、ＩＩ型コラーゲン、Ｘ型コラーゲンなどのタンパク質の空間的発現を決定するための抗体パネルで標識される（Ｍａｅｓ Ｃ，Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｔ，Ｓｅｌｉｇ ＭＫ，Ｔｏｒｒｅｋｅｎｓ Ｓ，Ｒｏｔｈ ＳＩ，Ｍａｃｋｅｍ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ，ｂｕｔ ｎｏｔ ｍａｔｕｒｅ ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ，ｍｏｖｅ ｉｎｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ａｎｄ ｆｒａｃｔｕｒｅｄ ｂｏｎｅｓ ａｌｏｎｇ ｗｉｔｈ ｉｎｖａｄｉｎｇ ｂｌｏｏｄ ｖｅｓｓｅｌｓ．Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｌｔｄ；２０１０；１９：３２９－３４４）。

【0151】

これらの実験を実行するために、５ｍｍ及び０．５ｍｍの大腿骨欠損モデルが使用され、記載されている外固定装置で安定化された。これは十分に確立された研究モデルである。使用された主な結果測定は、走査型電子顕微鏡法、ＲＮＡシーケンシング、及び組織学／免疫組織化学であり、これらは日常的な手順である。本明細書に開示されるように、ＳＥＭ及びＲＮＡシーケンシングを使用したデータは、５ｍｍ欠損と比較して０．５ｍｍ欠損で形成された血腫間には構造的及び生物学的特性に識別可能な差異があることを示した。

【0152】

走査型電子顕微鏡画像は、骨折血腫の構造的特性を示す。例えば、正常に治癒している骨折（０．５ｍｍ）と大きな骨欠損（５ｍｍ）との間には、明らかな構造上の違いが観察される。より具体的には、正常な骨折（０．５ｍｍ）は、多孔性が高く、密度が低く、薄いフィブリン線維と、より粗い表面を示し、一方、大きな骨欠損（５ｍｍ）は、多孔性が低く、密度が高く、厚いフィブリン線維と、滑らかな表面を示した。

【0153】

実施例７、ヘビ毒凝固酵素を使用して体外で形成された血栓／血腫の構造的特性。
ＳＶＣＥ、エカリンは、様々な濃度のエカリンを使用して０．５ｍｍの骨切り術モデルで形成される自然な血腫の特性を模倣するために、血栓の構造的特性を変更するために使用された。実施例４で使用したのと同じ動物から、安楽死時に２１ゲージの針を使用した心臓穿刺によって全血を採取した。予想される血液の収量は、動物あたり約５～１０ｍＬであった。凝固を防ぐために、血液を血液９部に対して４％クエン酸ナトリウム溶液１部と混合した。ノコギリヘビ毒から精製された酵素であるエカリンは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。ｐＨ、イオン強度、カルシウムなどの変数は一定に保ち、血栓形成促進酵素の最終濃度はピコからナノモルの範囲で適用した。塩化カルシウム（ＣａＣｌ₂）及びＣａＣｌ₂＋組換えヒトトロンビンを対照として使用した。体外血栓は、欠損サイズにまたがる高さ５ｍｍ、ラットの大腿骨の平均直径と一致する直径４ｍｍの円筒形になるように設計される。高さ０．５ｍｍの血栓を対照として使用し、より少量の血液に同じ濃度のＳＶＣＥを加えると、形成された血栓に同じ構造的特性が生じるかどうかを決定した。構造的変化、特にフィブリン線維の厚さと密度、及び全体的な血餅構造は、ＳＥＭを使用して評価された。本明細書に記載の方法を使用すると、ラットの血栓を異なる構造特性で観察することができる。

【0154】

体外血栓の調製。体外で血栓を生成するために、安楽死時に心臓穿刺によって麻酔をかけたラットから５～１０ｍＬの全血を採取した。採取直後、凝固を防ぐために血液を４％クエン酸ナトリウム溶液と９：１で混合した。血液凝固を誘導するために、様々な濃度のエカリンが使用された。サンプルを室温で２時間放置して、完全に凝固させた。続いて、走査型電子顕微鏡用に処理する前に、体外血栓を４％ＰＦＡ中で４℃で一晩固定した。

【0155】

走査型電子顕微鏡法。体内骨折血腫と体外血栓は、基本的に同じ方法で治療された。サンプルを４％パラホルムアルデヒド中で一晩固定した。Ｈｉｔａｃｈｉ ＳＵ１５１０ ＶＰ－ＳＥＭを用いて、１００－１，０００倍率で肉眼的形態を捕捉した。線維直径と密度を分析するために、サンプルを４％四酸化オスミウムで後固定し、エタノール溶液の勾配（２５～１００％）で脱水した。次に、血腫と血栓のスライスをライカＥＭクリティカルポイントドライヤーを使用して乾燥させ、シリコンチップ検査標本サポートに取り付け、金パラジウムでスパッタコーティングした後、１０，０００倍（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓ５５００ ＳＥＭ／ＳＴＥＭ）で画像化して高解像度で構造的特性を明らかにした。画像はＩｍａｇｅＪを使用して分析された。本明細書で開示されるＳＶＣＥでは、０．５ｍｍの骨切り術モデルで形成される血腫の特性を模倣するために、全血または多血小板血漿（ＰＲＰ）のいずれかを使用して、様々な濃度のエカリンが血栓（体外血腫）の構造的特性を変更するために使用された。エカリン（０．１及び０．５Ｕ／ｍＬ）またはＣａＣｌ₂（１０ｍＭ）を凝固剤として使用した。本明細書に開示される結果は、全血またはＰＲＰのいずれかを使用して、エカリンの濃度を変えることによって、必要な構造的特性を有する体外血腫を生成することが可能であることを実証した。

【0156】

走査型電子顕微鏡画像は、体外のヘビ毒によって誘発された体外血腫の構造的特性を示す。これらの結果は、フィブリン線維の厚さと密度に影響を与えるヘビ毒酵素または塩化カルシウムを使用して、血栓の形態を操作できること、及び体外血腫の構造的特性が、ＰＲＰで作成されたものと比較して全血で作成されたものとは異なることを示す。

【0157】

実施例８、体外血腫が間葉系幹細胞（ＭＳＣ）にとって生存可能な環境を提供するかどうかを決定する。
これらの実験は、ＭＳＣがエカリンの存在下で生存する能力、及びエカリン誘発血栓内に播種された場合のＭＳＣの生存能力を決定し、これらの足場の生体適合性を評価するために行われる。様々な濃度でのエカリンの細胞生存率と潜在的な細胞毒性が２Ｄ及び３Ｄアッセイで測定される。ラット骨ＭＳＣは、細胞生存率を決定するために、異なる濃度のエカリンの存在下で培養される。細胞増殖（例えば、ＣｙＱＵＡＮＴ（商標）細胞増殖アッセイキット）及び細胞毒性（例えば、Ｖｙｂｒａｎｔ（商標）細胞毒性アッセイキット）は、１、７、１４、及び２１日目に測定される。続いて、決定された特定の構造特性とともに細胞の生存を考慮して、前の実験で確立された濃度でエカリンがクエン酸添加血液の混合物に追加される。凝固後、血栓は成長培地を含有する２４ウェルプレートに移される。

【0158】

エカリン誘発血栓の生体適合性を試験するために、１、７、１４、及び２１日目にサンプルを培養物から取り出して（ｎ＝３／グループ）、播種した細胞の生存率及び分化能力、ならびに細胞外基質を形成する能力を研究する。さらに、骨組織の再生能力を最大化するために必要な血栓内の細胞数が決定される。血栓内の細胞生存率は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細胞生存率アッセイと共焦点イメージングを使用して評価される。

【0159】

細胞の分化能力を試験するために、細胞は脂肪生成、軟骨形成、骨形成の分化培地で培養され、ｑＲＴ－ＰＣＲは、選択した時点での遺伝子の差次的発現を決定するために使用される。細胞生存率が確立されたら、０．５ｍｍ欠損／骨切り術による骨治癒中の自然血腫の構造的及び生物学的特性に最も似ている血腫を、体内のラットの５ｍｍの大腿骨欠損モデルに移植して、大きな分節骨欠損を治癒する能力を研究する。図５Ａ、図５Ｂの結果に基づいて、より低い濃度の凝固酵素（＜０．５Ｕ／ｍＬ）であるエカリンを使用すると、細胞に対して毒性がなくなることが予想される。

【0160】

細胞培養。ラット骨髄幹細胞は標準的なプロトコールに従って培養される。培地は３～４日ごとに交換する。

【0161】

２Ｄ細胞生存率アッセイ。ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（商標）Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ） は、１、３、７日目にウェルプレートで成長させたラット骨髄幹細胞の培地に直接加えられる。３７℃で２０分間インキュベートした後、メーカーの指示に従ってマルチプレートリーダーで蛍光を読み取る。

【0162】

２Ｄ細胞毒性アッセイ。ラット骨髄幹細胞は９６ウェルプレートで培養される。１日目、３日目、７日目に上清を収集し、メーカーの指示に従って乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の細胞毒性を測定するために使用する（Ｐｉｅｒｃｅ ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＡＧ， Ｒｅｉｎａｃｈ ＢＬ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。マイクロプレートリーダーを使用して、４９０ｎｍでの吸光度を測定し、６８０ｎｍでバックグラウンドを差し引く。

【0163】

３Ｄ体外血栓及び共焦点顕微鏡における生／死染色。ラット骨髄幹細胞は３Ｄ血栓内で培養される。１、３、及び７日目に、血栓を培地から除去し、矢状方向に半分に切断してから、２４ウェルプレート内の１０μＭカルセインＡＭストック及び１μＭエチジウムホモダイマ－１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）を含む無血清培地に浸漬する。４℃で３時間、３７℃、５％ＣＯ₂、湿度１００％で１時間インキュベートした後、共焦点顕微鏡を使用してサンプルを深さ２００μｍまで画像化する（Ｇａｎｔｅｎｂｅｉｎ－Ｒｉｔｔｅｒ Ｂ，Ｓｐｒｅｃｈｅｒ ＣＭ，Ｃｈａｎ Ｓ，Ｉｌｌｉｅｎ－Ｊｕｎｇｅｒ Ｓ，Ｇｒａｄ Ｓ．Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１；７４０：１２７－４０）。

【0164】

３Ｄ細胞分化アッセイ。細胞を播種した血栓は、製造元のプロトコールに従って、脂肪形成培地、軟骨形成培地、または骨形成培地（ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）のいずれかで培養される。細胞分化は、ｑＲＴ－ＰＣＲ及びカスタマイズされたＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアレイプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）を使用して評価される。

【0165】

リアルタイム定量ＰＣＲ法（ｑＲＴ－ＰＣＲ）。体外血栓は微量遠心管に収集され、液体窒素中ですぐに急速冷凍され、－８０℃で保管される。ＲＮＡ抽出は、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して、製造元のプロトコールに従って行われる。ＲＮＡの濃度と品質はナノドロップ分光光度計（ＮＤ－１０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）で測定され、ＲＮＡの完全性はＡｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用してメーカーのプロトコールに従って評価される。ＴａｑＭａｎ（商標）Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）を使用して、抽出したＲＮＡの１μｇをｃＤＮＡに逆転写し、その後カスタマイズされたＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲアレイプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｎｃ．）を使用して炎症、血管形成、及び骨形成関連遺伝子の発現を分析する。

【0166】

本明細書に開示されるように、これらの足場の生体適合性を評価するために、エカリンの存在下で骨髄ＭＳＣが生存する能力、及びエカリン誘発血栓内に播種した場合の骨髄間葉系幹細胞の能力がさらに研究される。ヘビ毒由来の様々な濃度の凝固酵素を使用しても、体外血栓に加えられたＭＳＣに対して毒性はなかった。酵素エカリンは高度に精製される。従って、体外血腫が体内に移植されると、エカリンは遊走細胞に対して毒性を示さないことが予想される。さらに、ラットモデルでの体内実験が行われ、２つの異なる濃度（０．３及び０．６Ｕ／ｍｌ）のエカリンが毒性を引き起こさないことが実証された。しかし、ヒト対象にとって特定の構造的及び生物学的特性を備えた血栓を生成するためにより高い濃度が必要であるため、エカリンが細胞に対して有毒であることが証明された場合、塩化カルシウムまたは本明細書に記載の他の凝固因子が凝固剤として考慮されることになる。本明細書で述べたように、トロンビンは、多血小板血漿中の凝固カスケードを活性化するために以前に使用され、しかし、この製品は骨修復のパフォーマンスが不十分であった（Ｄｉｅｓｅｎ ＤＬ，Ｌａｗｓｏｎ ＪＨ．Ｖａｓｃｕｌａｒ．２００８；及びＳａｎｄｓ ＪＪ，Ｎｕｄｏ ＳＡ，Ａｓｈｆｏｒｄ ＲＧ，Ｍｏｏｒｅ ＫＤ，Ｏｒｔｅｌ ＴＬ．Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ．２０００；３５：７９６－８０１）。これは、ＰＲＰに追加されたトロンビンが、血餅の構造的特性が考慮されておらず、純粋に活性化剤として使用されたという事実に関連することができる。いくつかの態様では、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ｈＦＧＦ－２、ＢＭＰ－２（他のＢＭＰ）などの成長因子を少量添加することもできる。

【0167】

走査型電子顕微鏡画像は、体外のヘビ毒によって誘発された体外血腫の構造的特性を示す。これらの結果は、細胞の生存率がヘビ毒酵素の存在によって大きな影響を受けなかったことを示しており、生体適合性を示唆している。

【0168】

実施例９、大きな骨欠損に挿入された体外で生成された体外血腫が、ラットの大腿骨の５ｍｍの大臨界サイズ欠損モデルにおける骨再生プロセスを促進できるかどうかを調査する。
雄性のＳＡＳ Ｆｉｓｃｈｅｒラットのグループ（１０～１２週齢、ｎ＝８～１６、パイロット研究ｎ＝４、体外血腫、ＢＭＰ－２、ＰＲＰ）に５ｍｍの大腿骨欠損を作成し、本明細書に記載の外固定器で安定化させた。体外血腫を骨折の隙間に移植して、大きな分節骨欠損の治癒を促進する能力を決定した。２つの対照グループを使用して、骨治癒プロセスを実験グループと比較した。第１対照グループの治癒は、現在臨床で使用されるのと同じ製品である吸収性コラーゲンスポンジ上に送達された組換えヒトＢＭＰ－２を使用して増強された（Ｉｎｆｕｓｅ（登録商標）、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ ｐｌｃ．、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）。これはＢＭＰ－２を使用した十分に確立された研究モデルであり、８週間以内に治癒すると報告される（Ｇｌａｔｔ Ｖ，Ｂａｒｔｎｉｋｏｗｓｋｉ Ｎ，Ｑｕｉｒｋ Ｎ，Ｓｃｈｕｅｔｚ Ｍ，Ｅｖａｎｓ Ｃ．Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｄｙｎａｍｉｚａｔｉｏｎ：Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｉｘａｔｏｒ Ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｍｏｄｅ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ｌａｒｇｅ－Ｂｏｎｅ－Ｄｅｆｅｃｔ Ｈｅａｌｉｎｇ ａｔ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ ｒｈＢＭＰ－２．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．２０１６；９８：６７７－８７；Ｙａｓｋｏ ＡＷ， Ｌａｎｅ ＪＭ，Ｆｅｌｌｉｎｇｅｒ ＥＪ，Ｒｏｓｅｎ Ｖ，Ｗｏｚｎｅｙ ＪＭ，Ｗａｎｇ ＥＡ．Ｔｈｅ ｈｅａｌｉｎｇ ｏｆ ｓｅｇｍｅｎｔａｌ ｂｏｎｅ ｄｅｆｅｃｔｓ，ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｒｈＢＭＰ－２）．Ａ ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ， ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ， ａｎｄ ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ．Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；１９９２；７４：６５９－７０；及びＧａｎｔｅｎｂｅｉｎ－Ｒｉｔｔｅｒ Ｂ，Ｓｐｒｅｃｈｅｒ ＣＭ， Ｃｈａｎ Ｓ，Ｉｌｌｉｅｎ－Ｊｕｎｇｅｒ Ｓ，Ｇｒａｄ Ｓ．Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｉｎ ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃａｒｒｉｅｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１；７４０：１２７－４０）、従って、使用した動物の数が減った（ｎ＝４）。第２対照グループでは、ＰＲＰを使用して、高濃度の血小板が濃縮されたフィブリン血塊と比較して、体外血腫が優れた治癒結果をもたらすかどうかを決定した。実験グループでは、作成された足場に骨欠損を再生する能力があるかどうかを決定するために、体外血腫が使用された。体外血腫の利点は以下のとおりである。（１）骨誘導性－重要な成長因子が長期間持続して新しい骨の形成を刺激し、及び（２）骨伝導性－よく組織化されたフィブリン構造は、間葉系幹細胞の移動と初期の石灰化に好ましい微小環境を作成する。この一連の概念実証実験の成功は、天然の成長因子のリザーバとして機能する体外血腫の開発や、ｒｈＢＭＰ－２のような増殖因子を添加することなく大きな骨欠損の治癒を改善する生体適合性の自己足場の開発につながると期待される。これを評価するために、動物を毎週Ｘ線で監視し、８週目に安楽死させた。安楽死後、治癒した欠損はマイクロコンピュータ断層撮影法（μＣＴ、全サンプル）による評価のために採取され、組織学／ＩＨＣ（ｎ＝４／グループ、ＢＭＰ－２グループｎ＝２）、及び生体力学的試験（ｎ＝１２／グループ、ＢＭＰ－２グループｎ＝６）に使用される。

【0169】

手術。ラットの手術は本明細書に記載されるように行われた。

【0170】

移植のための体外血腫の調製。体外で血栓を生成するために、安楽死時に心臓穿刺によって麻酔をかけたラットから５～１０ｍＬの全血を採取した。採取直後凝固を防ぐために血液を４％クエン酸ナトリウム溶液と９：１で混合した。エカリンは、０．５５μｇのｒｈＢＭＰ－２と組み合わせて、血液凝固を誘導するために、事前に決定された０．３及び０．６Ｕ／ｍｌの濃度で使用された。サンプルは、５ｍｍのラットの骨欠損に移植する前に、２２℃（室温）で４５分から１時間かけて凝固させた。

【0171】

多血小板血漿（ＰＲＰ）の調製とＢＭＰ－２。ラットの血液からＰＲＰを調製するために、安楽死時に心臓穿刺によって麻酔をかけたラットから５～１０ｍＬの全血を採取した。採取直後凝固を防ぐために血液を４％クエン酸ナトリウム溶液と９：１で混合した。全血をソフトブレーキを用いて室温で１５０ｘｇで１０分間遠心分離し、血小板層を血漿及び赤血球から分離した。下部の赤血球層を廃棄し、中間の血小板層と上部の血漿層を採取した。全血及びＰＲＰ中の血小板数は、ＰＲＰの品質をチェックするために細胞計数チャンバを使用して測定された。塩化カルシウムを加えてＰＲＰゲルを作成し、欠損隙間に埋め込んだ。組換えヒトＢＭＰ－２（５．５μｇ）を骨欠損の形状の吸収性コラーゲンスポンジキャリア（Ｉｎｆｕｓｅ（商標）Ｂｏｎｅ Ｇｒａｆｔ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）に適用し、インプラントとして使用した。

【0172】

骨治癒の評価。１６匹の動物からなる各グループの大腿骨を、毎週Ｘ線撮影し、安楽死後にμＣＴによって体内で評価する。１２個のサンプルが生体力学的試験を受け、４個が組織学に使用される。パイロット研究では、１グループあたり４匹の動物を使用した。

【0173】

Ｘ線。骨治癒は毎週Ｘ線撮影によって監視された。外科的処置で説明した全身麻酔下で、欠損に垂直な再現可能な標準画像が得られるように、ラットを腹側の位置に置き、後肢を横方向に回転させた。

【0174】

マイクロコンピュータ断層撮影法（μＣＴ）。大腿骨は、１０ｍｍ焦点スポットのマイクロフォーカスＸ線管を備えた卓上マイクロ断層撮影イメージングシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｓｋｙｓｃａｎ １１７２、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して走査される。大腿骨は、７５ｋｅＶのエネルギー及び２５０ｍｓの積分時間で１６μｍの等方性ボクセルサイズを使用して、標本あたり約６００μＣＴスライスで走査される。評価は４ｍｍの中央欠損領域に適用され、既存の皮質骨が分析に含まれないことを確認する。対象領域を評価するには、欠損の総横断面体積（ＴＶ、ｍｍ³）、骨体積（ＢＶ、ｍｍ³）、骨体積分率（ＢＶ／ＴＶ、％）、骨密度（ＢＭＤ、ｍｇ ＨＡ／ｃｃｍ）、極慣性モーメント（ｐＭＯＩ、ｍｍ⁴）の変数が評価される。画像は適応反復アルゴリズムを使用して閾値処理され、形態計測変数は、基礎となる構造に関する事前の仮定に依存しないダイレクト３Ｄ技術を使用して２値化された画像から計算される。

【0175】

機械的検査。非侵襲的イメージングの後、各グループからの１２個の標本がねじり破壊試験を受ける。各標本の端はポリメチルメタクリレートに埋め込まれ、試験モジュールとの適切で再現可能なグリップインターフェースを提供する。標本は、通常の変形制御の下、５ｒａｄ／分の一定の変形速度で破損するまで試験される。角度変形と加えられた荷重のデータは１０Ｈｚで取得される。トルクと回転のデータは、修復された欠損のねじり剛性と強度を計算するために使用される。

【0176】

骨サンプルの組織学。大腿骨（ｎ＝４）を氷冷した４％パラホルムアルデヒドで４８時間固定し、その後１４％ＥＤＴＡで最長４週間脱灰する。ピンは、埋め込み及び切片化の前に骨から除去される。固定及び脱灰された組織は、１００％までの段階的エタノールで脱水され、キシレンに移され、パラフィンに埋め込まれる。５ミクロンのパラフィン切片をポリＬ－リジンでコーティングしたスライド上に置き、一晩乾燥させてすぐに染色するか、４℃で保管する。光学顕微鏡で検査する前に、別の切片をヘマトキシリン及びエオシンまたはサフラニンＯ及びファストグリーンで染色する。サフラニンＯは、軟骨内骨化プロセスの監視の一環として軟骨を染色するために含まれる。

【0177】

電力分析及び統計。全ての個別グループのサンプルサイズは、収集されたデータの種類の１５％の変動係数に基づいており、アルファレベル０．０５と検出力８０％（ベータ＝０．２０）を使用する。検出力分析により、スチューデントｔ試験を使用した効果サイズ１．３に基づいて、グループあたりｎ＝８～１６匹の動物により、各結果パラメータについてグループ間の有意差を検出できることが明らかになった。これらのラットモデルの以前の経験により、ｎが１０であれば十分な統計的検出力が得られることが確認される。体内実験は三連で行われ、ＡＮＯＶＡ試験を使用して統計的有意性について比較される。サンプルサイズと検出力の計算は、ｎＱｕｅｒｙ Ａｄｖｉｃｅソフトウェアプログラムのバージョン４．０（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）を使用して決定された。統計分析は、ＳＡＳバージョン６．１２ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、ＮＣ）を使用して行われる。両側ｐ＜０．０５は統計的に有意であるとみなされる。

【0178】

体内の用量反応を決定する実験は、自然治癒する骨折血腫の構造的特性を模倣した特定の構造的特性を備えた体外血腫を作成するために重要である。体外血栓単独を使用して治癒を達成できない場合、体外血腫は、ラット骨髄間葉系幹細胞、現在臨床で使用される超生理学的用量と比較して大幅に減少した量のｒｈＢＭＰ－２、または他の成長因子のいずれかと組み合わされる。

【0179】

本明細書に開示されるように、８週間及び４週間の骨欠損治癒期間終了時の体内の研究の体内の結果（０．６Ｕ／ｍｌ＋０．５５μｇのＢＭＰ－２を備えたグループ）は、全血＋エカリン（０．１Ｕ／ｍＬ）及び多血小板血漿（ＰＲＰ）＋ＣａｌＣｌ₂（１０ｍＭ）が、試験した凝固因子の濃度では骨の治癒／再生を促進しないことを明確に示す。対照的に、０．３Ｕ／ｍＬのエカリンと１．１μｇまたは０．５５μｇのＢＭＰ－２を欠損に添加すると、５ｍｍのラット大腿骨欠損は治癒した。同量のＢＭＰ－２を使用してＭｅｄｔｒｏｎｉｃ（Ｉｎｆｕｓｅ（商標））が販売するコラーゲンスポンジ上で送達されたＢＭＰ－２は、骨欠損の治癒を開始しなかったことに注意することが重要である。興味深いことに、０．６Ｕ／ｍＬのエカリン＋０．５５μｇのＢＭＰ－２を使用した場合、治癒は低濃度のエカリンで観察されたものと比較してはるかに良好であった。この結果は、血栓（体外血腫）の超微細構造的特性が骨欠損の治癒促進に大きな影響を与えることを示すと思われる。

【0180】

実施例１０、生体模倣血腫：骨治癒に対するｒｈＢＭＰ－２／ＡＣＳに対する凝固剤及びｒｈＢＭＰ－２濃度の影響。
様々な濃度の凝固剤、エカリン、カルシウム／トロンビン、及びＢＭＰ－２が試験され、大きな分節骨欠損の治癒を開始する能力が実証された。試験されたエカリンの濃度は、０．３、０．６、及び０．７５Ｕ／ｍＬを含み、これらの濃度で治癒が正常に開始され、しかし、０．６Ｕ／ｍＬのエカリン濃度が、試験した用量の中で最良の結果を示した。同様に、凝固剤、１０ｍＭのＣａＣｌ₂と０．５Ｕ／ｍＬのトロンビンの組み合わせも、０．６Ｕ／ｍＬのエカリンと０．３３μｇのＢＭＰ－２と同様の方法で大きな骨欠損を効果的に治癒した。このラットモデルにおいて５ｍｍの骨欠損の治癒を一貫して開始したＢＭＰ－２の濃度は０．３３μｇである。この用量は、標準用量の１１μｇよりも３３倍低く、この用量は、５ｍｍの大腿骨欠損ラットモデル（５．５μｇ）において大きな分節骨を効率的に治癒するＢＭＰ－２／ＡＣＳ（ＡＣＳ＝吸収性コラーゲンスポンジ）の最低有効用量よりも１７倍低い。骨欠損の治癒を開始する試験を行った他の２つの用量は０．１６５μｇと０．０８２５μｇであり、しかし、これらの用量での応答は一貫性が低く、０．３３μｇと比較してそれぞれ７５％と５０％であった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【国際調査報告】