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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-09-26
(54)【発明の名称】ＱＴ延長症候群を治療するための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240918BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240918BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240918BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240918BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240918BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240918BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240918BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240918BHJP
A61P 9/06 20060101ALI20240918BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240918BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240918BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61P9/06
A61K45/00
A61P43/00 111
A61P43/00 121
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024514395
(86)(22)【出願日】2022-09-02
(85)【翻訳文提出日】2024-03-25
(86)【国際出願番号】 IB2022058286
(87)【国際公開番号】W WO2023031881
(87)【国際公開日】2023-03-09
(31)【優先権主張番号】63/240,494
(32)【優先日】2021-09-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524081103
【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ ベルン
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】リー， ジン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA19
4C084MA02
4C084NA05
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZC412
4C084ZC75
4C085AA14
4C085BB11
4C085CC01
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE03
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045DA76
4H045EA21
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本開示は、抗ＫＣＮＱ１モノクローナル抗体、及びＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）の治療におけるそれらの使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトＫＣＮＱ１に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体が、配列番号１～６に記載される６つのＣＤＲのセットを含む、単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
配列番号７に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項3】
配列番号８に記載される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１又は請求項２に記載の抗体。
【請求項4】
前記抗原結合断片が、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖである、請求項１に記載の抗体。
【請求項5】
重鎖定常ドメインを更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項6】
軽鎖定常ドメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項7】
請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体と、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
【請求項8】
請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項9】
請求項８に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項10】
請求項８に記載の核酸又は請求項９に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項11】
真核細胞である、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項12】
前記真核細胞が、ＣＨＯ細胞、又はヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項13】
ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）に罹患している対象を治療する方法であって、前記対象に、ＱＴ延長症候群を治療するのに有効な量で、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
【請求項14】
前記ＱＴ延長症候群が、ＬＱＴＳ１、ＬＱＴＳ２又はＬＱＴＳ３である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
ＱＴ延長症候群の治療のために、前記対象に標準治療を投与することを更に含む、請求項１３又は請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記標準治療が、β遮断薬、植込み型除細動器（ＩＣＤ）、又は左心交感神経除神経である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記対象がまた、心筋症、糖尿病、てんかん又は神経学的併存疾患に罹患している、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記抗体を投与することが、前記抗体を受けなかった対象と比較して、より短い心再分極をもたらす、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記抗体を投与することが、前記抗体を受けなかった対象と比較して、突然の心停止を含む心室頻拍性不整脈の発生率の低下をもたらす、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記抗体を投与することが、前記対象におけるＫＣＮＱ１チャネル発現に影響を及ぼさない、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、ＱＴ延長症候群の治療のための材料及び方法に関する。
【0002】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月３日に出願された米国仮出願第６３／２４０，４９４号（この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に対する優先権の利益を主張する。
本出願は、２０２１年９月３日に出願された米国仮出願第６３／２４０，４９４号（この開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に対する優先権の利益を主張する。
【0003】
参照による配列表の組み込み
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５６２４２Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ＸＭＬ１０，５８７バイト－２０２２年９月１日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、開示の別個の部分として、コンピュータ可読形式の配列表（ファイル名：５６２４２Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ＸＭＬ１０，５８７バイト－２０２２年９月１日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイル）を含み、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）は、心臓性突然死のかなりの割合を占めている（１）。心臓電圧ゲートＫＣＮＨ２（ＬＱＴＳ ２型［ＬＱＴＳ２］）又はＫＣＮＱ１（ＬＱＴＳ １型［ＬＱＴＳ１］）カリウムイオン（Ｋ＋）チャネルの機能喪失につながる遺伝子変異が、最も一般的な原因である（２）。結果として、ＫＣＮＨ２（又はヒトＥｔｈｅｒ－ａ－ｇｏ－ｇｏ（ｈＥＲＧ）、Ｋｖ１１．１）及びＫＣＮＱ１（又はＫｖＬＱＴ１、Ｋｖ７．１）チャネル、ＩＫｒ及びＩＫｓにわたる対応する再分極電流がそれぞれ低減し、心再分極相が延長される。体表面心電図（ＥＣＧ）において、この遅延は、患者を生命を脅かす不整脈に陥れる延長したＱＴ間隔によって反映される。ＬＱＴＳ患者の現在の治療選択肢には、抗不整脈薬（β遮断薬を含む）、左心交感神経除神経、及び／又は心拍除細動器の植込みが含まれる（３）。
【0005】
一部のＬＱＴＳ患者は、電気的ストームの期間に入り、標準療法に耐性があり、繰り返しの除細動ショック及び死亡率の上昇に耐える（２）。更に、２型形態のＬＱＴＳを有する患者は、ＬＱＴＳ１個体と比較して、従来の治療にあまり反応しない（１０～１５）。
【0006】
ＬＱＴＳ３は、ＳＣＮ５ＡコードＮａｖ１．５ナトリウムイオン（Ｎａ＋）チャネルにおける機能獲得変異によって引き起こされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
一態様では、ヒトＫＣＮＱ１に特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体又はその抗原結合断片が本明細書に記載され、この抗体は、配列番号１～６に記載の６つのＣＤＲのセットを含む。
【0008】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号７に記載される軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８に記載される重鎖可変領域鎖アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列を含むエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、マウス抗体である。
【0009】
抗原結合断片も企図される。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片又はｓｃＦｖである。
【0010】
本明細書に記載される抗体をコードする核酸、並びに核酸をコードするベクター及びベクターを含む宿主細胞も企図される。
【0011】
別の態様では、ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）に罹患している対象を治療する方法であって、対象に、ＱＴ延長症候群を治療するのに有効な量で、抗体を投与することを含む、方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、ＱＴ延長症候群は、ＬＱＴＳ１、ＬＱＴＳ２又はＬＱＴＳ３である。
【0012】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、任意選択で、対象に、ＱＴ延長症候群の治療のために、標準治療を投与することを更に含む。いくつかの実施形態では、標準治療は、β遮断薬、植込み型除細動器（ＩＣＤ）、又は左心交感神経除神経である。
【0013】
いくつかの実施形態では、対象はまた、心筋症、糖尿病、てんかん又は神経学的併存疾患に罹患している。
【0014】
いくつかの実施形態では、抗体を投与することは、抗体を受けなかった対象と比較して、より短い心再分極をもたらす。いくつかの実施形態では、抗体を投与することは、抗体を受けなかった対象と比較して、突然の心停止を含む心室頻拍性不整脈の発生率の低下をもたらす。いくつかの実施形態では、抗体を投与することは、対象におけるＫＣＮＱ１チャネル発現に影響を及ぼさない。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＫＣＮＱ１＋／ＫＣＮＥ１＋細胞において記録されたＩＫｓに対する６つの異なるモノクローナルＫＣＮＱ１抗体の効果。試験電位の関数としてのＩＫｓステップ（図１Ａ）及びテール（図１Ｂ）の電流密度。対照細胞（ｎ＝１６、平均セル容量１７．２±２．２ｐＦ）と、３０μｇ／ｍｌの選択されたモノクローナル抗体で処理した細胞とを比較した、平均±ＳＥＭを示す：ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４（ｎ＝１５、平均セル容量１６．７±１．１ｐＦ）、ＩｇＧ１ ５－Ｄ４－Ｄ１（ｎ＝１２、平均セル容量１８．２±１．９ｐＦ）、ＩｇＧ２ｂ ７－Ｄ１２－Ｂ１１－Ｄ１２（ｎ＝８、平均セル容量１８．４±２．５ｐＦ）、ＩｇＧ２ｂ ９－Ｆ５－Ｈ２－２－Ｇ１１－Ｆ６（ｎ＝８、平均セル容量２０．８±３．４ｐＦ）、ＩｇＧ２ｂ １０－Ｆ１０－Ｄ７－Ｂ１（ｎ＝８、平均セル容量１７．７±１．９ｐＦ）、ＩｇＧ１ ３－Ａ１１－Ｈ３－Ｆ３（ｎ＝５、平均セル容量２６．０±６．３ｐＦ）。
【図2】ＩＫｓに対するＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４モノクローナル抗体の効果。対照条件下（図２Ａ、セル容量１３．７２ｐＦ）及び３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の存在下（図２Ｂ、１３．５９ｐＦ）での、ＣＨＯ ＫＣＮＱ１＋／ＫＣＮＥ１＋細胞において記録された代表的なＩＫｓ電流トレース。（図２Ｃ）及び（図２Ｄ）試験電位の関数としてのＩＫｓステップ電流密度及びテール電流密度。対照細胞（ｎ＝１６）と、３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４（ｎ＝１５）で処理された細胞とを比較した、平均±ＳＥＭを示す。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（図２Ｅ）ＩＫｓの電圧依存的な活性化。３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の存在下で、ＩＫｓ電流を、スロープ係数ｋに明らかな影響を与えることなく、対照細胞と比較してより多くの負の電位で活性化した（対照：Ｖ１／２＝２３．６±１．３ｍＶ、スロープ係数ｋ＝１６．９±１．２ｍＶ；ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４：Ｖ１／２＝１４．６±０．９ｍＶ、スロープ係数ｋ＝１７．５±１．０ｍＶ）。対照とＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４との間のＶ１／２を比較する場合、Ｐ＜０．０００１；対照とＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４との間のスロープ係数ｋを比較する場合、Ｐ値は有意ではない。（図２Ｆ）ＩＫｓの電圧依存的な不活性化。３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、スロープ係数ｋに影響を与えることなく、不活性化の電圧依存性の左方シフトにつながる（対照：Ｖ１／２＝２０．０±１．４ｍＶ、スロープ係数ｋ＝１５．９±１．４ｍＶ；ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４：Ｖ１／２＝８．７±１．１ｍＶ、スロープ係数ｋ＝１４．２±１．１ｍＶ）。対照とＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４との間のＶ１／２を比較する場合、Ｐ＜０．０００１；対照とＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４との間のスロープ係数ｋを比較する場合、Ｐ値は有意ではない。
【図3】抗ＫＣＮＱ１ポリクローナル抗体と比較した、ＣＨＯ ＫＣＮＱ１＋／ＫＣＮＥ１＋細胞に対するＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４モノクローナル抗体の効果。（図３Ａ）及び（図３Ｂ）試験電位の関数としてのＩＫｓステップ電流密度及びテール電流密度。対照細胞（ｎ＝１６）と、３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４（ｎ＝１５）で処理された細胞と、３０μｇ／ｍｌの抗ＫＣＮＱ１ポリクローナル抗体（ｎ＝２３）とを比較した、平均±ＳＥＭを示す。対照と３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４とを比較した場合、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。＋７０ｍＶでのＩＫｓステップ電流を除いて（Ｐ＝０．０１）、３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４で処理された細胞と、３０μｇ／ｍｌの抗ＫＣＮＱ１ポリクローナル抗体で処理された細胞とを比較した場合、Ｐ＞０．０５。
【図4】ｈｉＰＳＣ－ＣＭＣに対するＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４モノクローナル抗体の効果。対照条件下、及び３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の存在下で、ｈｉＰＳＣ－ＣＭＣにおいて記録された代表的な活動電位トレース（図４Ａ）。（図４Ｂ）バーは、対照細胞（ｎ＝１５）、並びに５μｇ／ｍｌ（ｎ＝４）、１０μｇ／ｍｌ（ｎ＝１０）、２０μｇ／ｍｌ（ｎ＝１１）、３０μｇ／ｍｌ（ｎ＝１４）及び６０μｇ／ｍｌ（ｎ＝１４）ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４で処理された心筋細胞のＡＰＤ９０の平均±ＳＥＭを表す。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。全ての測定は、３７℃で実施した。（図４Ｃ）５つの異なる濃度のＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４における絶対ＡＰＤ９０低減効果の濃度応答曲線。データを、平均ＡＰＤ９０±ＳＥＭとして表す。抗体濃度を、ベース１０対数スケールとしてプロットする。データに対するシグモイド曲線フィットを用いて、５．７μｇ／ｍｌ（Ｒ二乗＝０．９９６７）で半最大有効濃度（ＥＣ５０）を決定した。ＡＰＤ９０＝９０％再分極における活動電位持続時間；ｈｉＰＳＣ－ＣＭＣ＝ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞。
【図5】薬理学的ＬＱＴＳ ２型の状況におけるｈｉＰＳＣ－ＣＭＣに対するＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４モノクローナル抗体の効果。（図５Ａ）ＥＡＤ、心拍停止における不整脈性拍動変性を示す、１０ｎＭのＥ－４０３１でチャレンジしたｈｉＰＳＣ－ＣＭＣにおいて記録された代表的な活動電位。（図５Ｂ）３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４で処理し、１０ｎＭのＥ－４０３１でチャレンジしたｈｉＰＳＣ－ＣＭＣにおいて記録された代表的な活動電位。（図５Ｃ）バーは、１０ｎＭのＥ－４０３１（ｎ＝７）±３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４（ｎ＝８）でチャレンジしたｈｉＰＳＣ－ＣＭＣにおけるＥＡＤ、不整脈性拍動及び拍動停止の発生率を表す。（図５Ｄ）バーは、１０ｎＭのＥ－４０３１（ｎ＝７）±３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４（ｎ＝８）でチャレンジしたｈｉＰＳＣ－ＣＭＣの平均ＡＰＤ９０±ＳＥＭを表す。＊＊＊Ｐ＜０．００１。ＡＰＤ９０＝９０％再分極における活動電位持続時間；ＥＡＤ＝早期後脱分極；ｈｉＰＳＣ－ＣＭＣ＝ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞。
【図6】薬理学的ＬＱＴＳ ３型の状況におけるｈｉＰＳＣ－ＣＭＣに対するＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４モノクローナル抗体の効果。（図６Ａ）ＥＡＤ及び不整脈性拍動につながる、５ｎＭのＡＴＸ－ＩＩでチャレンジしたｈｉＰＳＣ－ＣＭＣにおいて記録された代表的な活動電位。（図６Ｂ）３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４で処理し、５ｎＭのＡＴＸ－ＩＩでチャレンジしたｈｉＰＳＣ－ＣＭＣにおいて記録された代表的な活動電位。（図６Ｃ）バーは、５ｎＭのＡＴＸ－ＩＩ（ｎ＝１６）±３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４（ｎ＝１４）でチャレンジしたｈｉＰＳＣ－ＣＭＣにおけるＥＡＤ及び不整脈性拍動の発生率を表す。（図６Ｄ）バーは、５ｎＭのＡＴＸ－ＩＩ（ｎ＝１６）±３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４（ｎ＝１４）でチャレンジしたｈｉＰＳＣ－ＣＭＣの平均ＡＰＤ９０±ＳＥＭを表す。＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。ＡＰＤ９０＝９０％再分極における活動電位持続時間；ＥＡＤ＝早期後脱分極；ｈｉＰＳＣ－ＣＭＣ＝ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞。
【図7】ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の構造的エピトープマッピング。（図７Ａ）７、１０及び１３アミノ酸長の重複する拘束性環状ペプチドに翻訳されたＫＣＮＱ１タンパク質の配列全体をカバーするＰＥＰｐｅｒＣＨＩＰ（登録商標）ペプチドマイクロアレイ。合計で、マイクロアレイは、対照として機能する追加のＨＡペプチド（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧ、１３４スポット）によってフレーム化された、２０４３個の異なるペプチドを複製したものを含有した。マイクロアレイを、０．１μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４でプローブし、続いて抗マウスＩｇＧ（赤色）及び抗ＨＡ ＩｇＧ（緑色）で染色した。反応スポット（赤色）の配列を示す。抗体結合に潜在的に寄与する残基を、青色で強調表示する。（図７Ｂ）コンセンサスモチーフＶＥＦＧの明確なエピトープピークを示すペプチドマイクロアレイの強度プロット。コンセンサスモチーフＦＧＴＥ及びＶＤＧＹを有するペプチドについて、有意に弱い相互作用が見出された。
【図8】ＫＣＮＱ１とＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４との間の分子相互作用。（図８Ａ）ヒトＫＣＮＱ１チャネル及びマウスＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の予測される構造。抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、オレンジ色で強調表示する。ＫＣＮＱ１の第３の細胞外ドメイン上の標的エピトープを、紫色で色付けし、チャネルの膜貫通セグメントを、緑色で示す。（図８Ｂ）ＫＣＮＱ１及びＩｇＧ２ａの予測される結合部位。表は、ＫＣＮＱ１チャネルへの水素及びイオン結合に関与する抗体の軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）のアミノ酸残基を示す。それぞれの結合エネルギー及び距離を列挙する。分子グラフィックスは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔソフトウェア（ＭＯＥ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）を使用してレンダリングした。
【図9】ＫＣＮＱ１チャネルペプチドへのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の結合。異なる濃度のＫＣＮＱ１チャネルペプチド（２倍で連続希釈）を１２０秒間注入し、続いて６００秒間解離させた。三重に実施された注入の代表的な結合センサーグラム。
【図10A】細胞表面ＫＣＮＱ１へのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の結合。市販されているウサギポリクローナルＫＣＮＱ１抗体（図１０Ｂ）及びマウスモノクローナルＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４（図１０Ａ）抗体は、２つの異なるＣＨＯ細胞株（ＫＣＮＱ１及びＫＣＮＥ１が融合するもの、及びそれらの）においてＫＣＮＱ１に結合する
【図10B】同上。
【図11】ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、ウサギのベースラインＱＴ間隔を短縮する。様々な用量のＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４で処置された遠隔測定されたウサギは、全ての試験用量でウサギにおけるベースラインＱＴ間隔の短縮を示す。短縮は、用量投与後６～１２時間の間に観察され、定常状態レベルの短縮は、投与後１２～２０時間で観察された。
【図12】ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、薬物誘導性ＱＴ延長及びトルサード・ド・ポワンツから保護する。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４モノクローナル抗体で処置したウサギは、用量依存的に薬物誘導性ＱＴ延長に対する保護を提供した。４０ｍｇ／ｋｇを薬物誘導性トルサード・ド・ポワンツから保護した。
【図13A】ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４処理は、ＫＣＮＱ１／ＫＣＮＥ１を発現するＨＥＫ２９３細胞における電流密度を増加させる。（図１３Ａ）電流密度は、３０μｇ／ｍＬの濃度のＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４モノクローナル抗体の存在下で増加した。（図１３Ｂ）電流密度は、６０μｇ／ｍＬの濃度のＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４モノクローナル抗体の存在下で増加した。
【図13B】同上。
【図14】ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、ＫＣＮＱ１／ＫＣＮＥ１ステップ電流密度を増加させる。ＩＫｓステップ電流密度は、対照（図１４Ｂ）と比較して、３０ｕｇ／ｍＬ及び６０ｕｇ／ｍＬのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４モノクローナル抗体（図１４Ａ）において、－２０ｍＶよりも正の膜電位で増加した。
【図15】ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、ＫＣＮＱ１／ＫＣＮＥ１テール電流密度を増加させる テール電流密度（図１５Ｂ）は、対照（図１５Ｂ）と比較して、６０ｕｇ／ｍＬのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４モノクローナル抗体（図１５ａ）において、－２０ｍＶよりも正の膜電位で増加した。
【図16A】２０ａａ ＫＣＮＱ１標的配列へのｍＡｂ結合の動態測定。（図１６Ａ）１×ＰＢＳ ｐＨ７．４、１×動態緩衝液及び１％ ＢＳＡ中の１ｍＭのＮ末端ビオチン化ＫＣＮＱ１ペプチド（Ｎｔｅｒｍ－ビオチン－（ＣＨ２Ｏ）４－ＡＥＫＤＡＶＮＥＳＧＲＶＥＦＧＳＹＡＤＡ－Ｃｔｅｒｍ（配列番号１０）へのｍＡｂ結合（１００ｍＭで）の代表的なＯｃｔｅｔセンサーグラム。（図１６Ｂ）ｍＡｂ－ＫＣＮＱ１ペプチド相互作用を、１：１結合モデルによって分析し、報告されたＫＤを、抗体解離（ｋｏｆｆ）及び会合（ｋｏｎ）速度定数から導出した。重複実行に基づいて、平均ＫＤ値を有するテーブルを計算した。
【図16B】同上。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本開示は、抗カリウム電圧ゲートチャネルサブファミリーＱメンバー１（ＫＣＮＱ１）モノクローナル抗体が、ＩＫＳチャネル上のアゴニストとして作用するという発見に基づいている。実施例に示されるように、ＫＣＮＱ１抗体濃度を２倍にすると、ＣＨＯ ＫＣＮＱ１＋／ＫＣＮＥ１＋細胞においてＩＫｓ電流密度が濃度依存的に増加した。パッチクランプ記録は、ＫＣＮＱ１抗体の二重の効果、すなわち、活性化の電圧依存性の負のシフト及びＩＫＳ不活性化の顕著な減速を開示した。総合すると、本明細書に提供されるデータは、再分極予備能を増強し、ＬＱＴＳ２の電気的安定性を回復させることによって、ＫＣＮＱ１モノクローナル抗体の治療的電位を示す。
【0017】
以前の研究（Ｍａｇｕｙ ｅｔ ａｌ．ＪＡＣＣ，７５：２１４０－２１５２，２０２０、その開示は、参照によりその全体が組み込まれる）は、ＫＣＮＱ１に対するポリクローナル抗体の効果を示した。抗ＫＣＮＱ１ポリクローナル抗体と同様に、電圧クランプ条件下でＩＫｓ電流を増加させるのに有効である、ＫＣＮＱ１に特異的に結合するモノクローナル抗体が本明細書に記載される。図３に示されるように、抗ＫＣＮＱ１モノクローナル抗体は、以前にＭａｇｕｙ ｅｔ ａｌ．（上記）に開示された抗ＫＣＮＱ１ポリクローナル抗体と同様に、ＩＫｓ電流を増加させた。
【0018】
抗体
一態様では、ヒトＫＣＮＱ１（配列番号９）に特異的に結合するモノクローナル抗体が本明細書に記載される。抗体は、当該技術分野において既知である任意のタイプの抗体、すなわち、免疫グロブリンであり得る。例示的な実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭのクラス又はアイソタイプの抗体である。例示的な実施形態では、本明細書に記載される抗体は、１つ以上のアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及び／又はミュー重鎖を含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載される抗体は、１つ以上のカッパ又はラムダ軽鎖を含む。
一態様では、ヒトＫＣＮＱ１（配列番号９）に特異的に結合するモノクローナル抗体が本明細書に記載される。抗体は、当該技術分野において既知である任意のタイプの抗体、すなわち、免疫グロブリンであり得る。例示的な実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭのクラス又はアイソタイプの抗体である。例示的な実施形態では、本明細書に記載される抗体は、１つ以上のアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及び／又はミュー重鎖を含む。例示的な実施形態では、本明細書に記載される抗体は、１つ以上のカッパ又はラムダ軽鎖を含む。
【0019】
本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、抗体（又は抗原結合断片）が、他のタンパク質よりも抗原（例えば、ＫＣＮＱ１）に優先的に結合することを意味する。いくつかの実施形態では、「特異的に結合する」とは、抗体が他のタンパク質よりも抗原に対して高い親和性を有することを意味する。抗原に特異的に結合する抗体は、１×１０－７Ｍ以下、２×１０－７Ｍ以下、３×１０－７Ｍ以下、４×１０－７Ｍ以下、５×１０－７Ｍ以下、６×１０－７Ｍ以下、７×１０－７Ｍ以下、８×１０－７Ｍ以下、９×１０－７Ｍ以下、１×１０－８Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下、３×１０－８Ｍ以下、４×１０－８Ｍ以下、５×１０－８Ｍ以下、６×１０－８Ｍ以下、７×１０－８Ｍ以下、８×１０－８Ｍ以下、９×１０－８Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下、３×１０－９Ｍ以下、４×１０－９Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、６×１０－９Ｍ以下、７×１０－９Ｍ以下、８×１０－９Ｍ以下、９×１０－９Ｍ以下、１×１０－１０Ｍ以下、２×１０－１０Ｍ以下、３×１０－１０Ｍ以下、４×１０－１０Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下、６×１０－１０Ｍ以下、７×１０－１０Ｍ以下、８×１０－１０Ｍ以下、９×１０－１０Ｍ以下、１×１０－１１Ｍ以下、２×１０－１１Ｍ以下、３×１０－１１Ｍ以下、４×１０－１１Ｍ以下、５×１０－１１Ｍ以下、６×１０－１１Ｍ以下、７×１０－１１Ｍ以下、８×１０－１１Ｍ以下、９×１０－１１Ｍ以下、１×１０－１２Ｍ以下、２×１０－１２Ｍ以下、３×１０－１２Ｍ以下、４×１０－１２Ｍ以下、５×１０－１２Ｍ以下、６×１０－１２Ｍ以下、７×１０－１２Ｍ以下、８×１０－１２Ｍ以下、又は９×１０－１２Ｍ以下の抗原に対する結合親和性を有し得る。上記の値をエンドポイントとして有する範囲が、本開示の状況において企図されることを理解されたい。例えば、抗体又はその抗原結合断片は、約１×１０－７Ｍ～約９×１０－１２Ｍの親和性又は１×１０－９～約９×１０－１２の親和性で配列番号９のＫＣＮＱ１に結合し得る。
【0020】
いくつかの又は任意の実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のＫＣＮＱ１、又はその天然に存在するバリアントに、１×１０－７Ｍ以下、１×１０－８Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、１×１０－１０Ｍ以下、１×１０－１１Ｍ以下、若しくは１×１０－１２Ｍ以下、又は１×１０－９～１×１０－１０の範囲、若しくは１×１０－１２～約１×１０－１３の範囲の親和性（Ｋｄ）で結合する。親和性は、様々な技法を使用して決定され、その例には、親和性ＥＬＩＳＡアッセイ及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））アッセイが含まれる。
【0021】
いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９１～２９７を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９２～２９８を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９３～２９９を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９４～３００を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２８８～２９７を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２８９～２９８を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９０～２９９を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９１～３００を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９２～３０１を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９３～３０２を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９４～３０３を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２８５～２９７を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２８６～２９８を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２８７～２９９を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２８８～３００を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２８９～３０１を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９０～３０２を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９１～３０３を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９２～３０４を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９３～３０５を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９４～３０６を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。
【0022】
いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９１～２９７を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。「クロスブロック」、「クロスブロックされた」、及び「クロスブロッキング」という用語は、本明細書で互換的に使用され、抗体がＫＣＮＱ１への他の抗体の結合を干渉する能力を意味する。抗体が別の抗体のＫＣＮＱ１への結合を干渉することができる程度、したがってクロスブロックと言えるかどうかは、競合結合アッセイを使用して決定することができる。いくつかの態様では、クロスブロッキング抗体又はその断片は、参照抗体のＫＣＮＱ１結合を、約４０％～約１００％、例えば約６０％～約１００％、具体的には７０％～１００％、より具体的には８０％～１００％の間で低下させる。クロスブロッキングを検出するための特に好適な定量アッセイは、表面プラズモン共鳴技術を使用して相互作用の程度を測定するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）マシンを使用する。別の好適な定量的クロスブロッキングアッセイは、ＥＬＩＳＡベースのアプローチを使用して、ＫＣＮＱ１への結合の観点から抗体間の競合を測定する。
【0023】
いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９２～２９８を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９３～２９９を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９４～３００を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２８８～２９７を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２８９～２９８を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９０～２９９を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９１～３００を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９２～３０１を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９３～３０２を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９４～３０３を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２８５～２９７を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２８６～２９８を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２８７～２９９を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２８８～３００を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２８９～３０１を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９０～３０２を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９１～３０３を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９２～３０４を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９３～３０５を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号９のアミノ酸２９４～３０６を含むＫＣＮＱ１のエピトープに結合する抗体によってクロスブロックするか、又はクロスブロックされる。
【0024】
「ＣＤＲ」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域の各々において３つのＣＤＲが存在し、これらは可変領域の各々について、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と称される。本明細書で使用される「６つのＣＤＲのセット」という用語は、抗原に結合することができる軽鎖可変領域及び重鎖可変領域に存在する３つのＣＤＲの群を指す。ＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに応じて異なる方法で定義されている。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７）及び（１９９１））は、抗体の任意の可変領域に適用可能な明確な残基付番システムを提供するだけでなく、３つのＣＤＲを画定する正確な残基境界も提供する。これらのＣＤＲは、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと称され得る。Ｃｈｏｔｈｉａ及び共同研究者ら（Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３（１９８９）は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ内のある特定の下位部分が、アミノ酸配列のレベルで大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格構造を採用することを見出した。これらの下位部分は、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３又はＨ１、Ｈ２及びＨ３として指定され、「Ｌ」及び「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖領域及び重鎖領域を指定する。これらの領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複する境界を有する、Ｃｈｏｔｈｉａ ＣＤＲと称され得る。Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複するＣＤＲを定義する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ（ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－１３９（１９９５））及びＭａｃＣａｌｌｕｍ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２６２（５）：７３２４５（１９９６））によって記載されている。更に他のＣＤＲ境界定義は、厳密には上記のシステムのうちの１つに従わないかもしれないが、それにもかかわらず、Ｋａｂａｔ ＣＤＲと重複するであろうが、それらは、特定の残基若しくは残基の群、又はＣＤＲ全体が抗原結合に有意に影響を及ぼさないという予測又は実験的所見に照らして短縮又は延長され得る。本明細書で使用される方法は、これらのシステムのうちのいずれかに従って定義されたＣＤＲを利用し得るが、好ましい実施形態は、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａにより定義されたＣＤＲを使用する。
【0025】
ＣＤＲは、例えば、好適な宿主細胞における目的のＣＤＲ及び発現をコードするポリヌクレオチドを構築することによって得られる。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体を産生する細胞のｍＲＮＡを鋳型として使用して可変領域を合成することによって調製される（例えば、Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２：１０６（１９９１）、Ｃｏｕｒｔｅｎａｙ－Ｌｕｃｋ，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １６６，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）、及びＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｉｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐａｇｅ １３７，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）を参照）。
【0026】
様々な態様では、抗体（又はその抗原結合断片）は、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、及びＣＤＲ－Ｌ３から選択されるＣＤＲに対して少なくとも７５％の同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の同一性）を有する少なくとも１つのＣＤＲ配列を含み、ＣＤＲ－Ｈ１は、配列番号１で示される配列を有し、ＣＤＲ－Ｈ２は、配列番号２で示される配列を有し、ＣＤＲ－Ｈ３は、配列番号３で示される配列を有し、ＣＤＲ－Ｌ１は、配列番号４で示される配列を有し、ＣＤＲ－Ｌ２は、「ＷＡＳ」のアミノ酸配列を有し、ＣＤＲ－Ｌ３は、配列番号６で示される配列を有する。様々な態様では、抗体（又はその抗原結合断片）は、配列番号１で示される配列を有するＣＤＲ－Ｈ１（その中に３つ、２つ、又は１つのアミノ酸置換を有する）、配列番号２で示される配列を有するＣＤＲ－Ｈ２（その中に３つ、２つ、又は１つのアミノ酸置換を有する）、配列番号３で示される配列を有するＣＤＲ－Ｈ３（その中に３つ、２つ、又は１つのアミノ酸置換を有する）、配列番号４で示される配列を有するＣＤＲ－Ｌ１（その中に３つ、２つ、又は１つのアミノ酸置換を有する）、ＣＤＲ－Ｌ２（その中に３つ、２つ、又は１つのアミノ酸置換を有する）、及び配列番号６で示される配列を有するＣＤＲ－Ｌ３（その中に３つ、２つ、又は１つのアミノ酸置換を有する）を含む。抗ＫＣＮＱ１抗体は、様々な態様では、ＣＤＲのうちの２つ、ＣＤＲのうちの３つ、ＣＤＲのうちの４つ、ＣＤＲのうちの５つ、又はＣＤＲのうちの６つ全てを含む。好ましい実施形態では、抗ＫＣＮＱ１抗体は、以下の６つのＣＤＲのセットを含む：配列番号１のＣＤＲ－Ｈ１、配列番号２のＣＤＲ－Ｈ２、配列番号３のＣＤＲ－Ｈ３、配列番号４のＣＤＲ－Ｌ１、配列番号６のＣＤＲ－Ｌ３、及びアミノ酸配列「ＷＡＳ」を有するＣＤＲ－Ｌ２。
【0027】
いくつかの又は任意の実施形態では、抗体は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び／又は配列番号８に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも７５％の同一性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。様々な態様では、配列番号７（又は配列番号８）と比較した配列の差異は、対応する配列におけるＣＤＲ領域の外側にある。
【0028】
いくつかの又は任意の実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0029】
本明細書に記載される抗ＫＣＮＱ１抗体の抗原結合断片もまた企図される。抗原結合断片は、少なくとも１つの抗原結合部位を有する抗体の任意の部分であり得、抗原結合断片は、抗原結合断片がＫＣＮＱ１を認識する能力を保持するより大きな構造（「抗体産物」）の一部であり得る。参照を容易にするために、抗原結合断片を含むこれらの抗体産物は、本明細書における「抗原結合断片」の開示に含まれる。抗原結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一特異性又は二重特異性Ｆａｂ２、三重特異性Ｆａｂ３、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、二重特異性ダイアボディ、三重特異性トリアボディ、ミニボディ、ＩｇＮＡＲの断片（例えば、Ｖ－ＮＡＲ）、ｈｃＩｇＧの断片（例えば、ＶｈＨ）、ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ発現ライブラリによって発現される断片等が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な態様では、抗原結合断片は、ドメイン抗体、ＶｈＨドメイン、Ｖ－ＮＡＲドメイン、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン等である。しかしながら、本開示の抗体断片は、これらの例示的な種類の抗体断片に限定されない。例示的な態様では、抗原結合断片は、Ｆａｂ断片である。例示的な態様では、抗原結合断片は、２つのＦａｂ断片を含む。例示的な態様では、抗原結合断片は、リンカーを介して接続された２つのＦａｂ断片を含む。例示的な態様では、抗原結合断片は、２つのＦａｂ断片を含むか又は２つのＦａｂ断片を含むミニボディである。例示的な態様では、抗原結合断片は、リンカーを介して接合された２つのＦａｂ断片を含むミニボディを含むか、又はミニボディである。ミニボディは、当該技術分野において既知である。例えば、Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６：３０５５－３０６１（１９９６）を参照されたい。例示的な態様では、抗原結合断片は、任意選択でアルカリホスファターゼドメインを含むリンカーを介して接合された２つのＦａｂ断片を含むミニボディを含むか、又はミニボディである。
【0030】
ドメイン抗体は、抗体の機能的結合単位を含み、抗体の重（ＶＨ）鎖又は軽（ＶＬ）鎖のいずれかの可変領域に対応し得る。ドメイン抗体は、およそ１３ｋＤａ、又は完全な抗体のおよそ１０分の１の分子量を有し得る。ドメイン抗体は、本明細書に記載されるものなどの完全な抗体に由来し得る。
【0031】
抗体又は抗原結合断片の産生方法
抗体を作製する好適な方法は、当該技術分野において既知である。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、及びＣＡ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１））に記載されている。本開示の方法で使用するためのモノクローナル抗体は、培養物中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技法を使用して調製されてもよい。これらには、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７，１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２，１９８３、Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８０：２０２６－２０３０，１９８３）及びＥＢＶ－ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．，ｐｐ７７－９６，（１９８５）が含まれるが、これらに限定されない。代替的には、ＥＢＶ－ハイブリドーマ法（Ｈａｓｋａｒｄ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２），３６１－６７（１９８４）、及びＲｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１，１４０－６７（１９８６））、及びバクテリオファージベクター発現系（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５－８１（１９８９）を参照）などの他の方法は、当該技術分野において既知である。更に、非ヒト動物における抗体を産生する方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、及び同第５，７１４，３５２号、並びに米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６Ａ１号に記載されている。抗体はまた、リンパ球集団におけるインビボ産生を誘導することによって、又はＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ８６：３８３３－３８３７；１９８９）、及びＷｉｎｔｅｒ Ｇ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ（Ｎａｔｕｒｅ ３４９： ２９３－２９９，１９９１）に開示されているような組換え免疫グロブリンライブラリ又は高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって産生され得る。抗体又は抗原結合断片の完全な配列が既知である場合、組換えタンパク質を産生する方法を用いてもよい。例えば、“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５（２）：１３５－１４６（２００８）を参照されたい。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、インビボで生成された場合、細胞培養物又は生体試料から単離される。
抗体を作製する好適な方法は、当該技術分野において既知である。例えば、標準的なハイブリドーマ法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）、及びＣＡ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（２００１））に記載されている。本開示の方法で使用するためのモノクローナル抗体は、培養物中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技法を使用して調製されてもよい。これらには、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７，１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｓｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ ４：７２，１９８３、Ｃｏｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８０：２０２６－２０３０，１９８３）及びＥＢＶ－ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．，ｐｐ７７－９６，（１９８５）が含まれるが、これらに限定されない。代替的には、ＥＢＶ－ハイブリドーマ法（Ｈａｓｋａｒｄ ａｎｄ Ａｒｃｈｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，７４（２），３６１－６７（１９８４）、及びＲｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１，１４０－６７（１９８６））、及びバクテリオファージベクター発現系（例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，１２７５－８１（１９８９）を参照）などの他の方法は、当該技術分野において既知である。更に、非ヒト動物における抗体を産生する方法は、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号、同第５，５６９，８２５号、及び同第５，７１４，３５２号、並びに米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６Ａ１号に記載されている。抗体はまた、リンパ球集団におけるインビボ産生を誘導することによって、又はＯｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ８６：３８３３－３８３７；１９８９）、及びＷｉｎｔｅｒ Ｇ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ（Ｎａｔｕｒｅ ３４９： ２９３－２９９，１９９１）に開示されているような組換え免疫グロブリンライブラリ又は高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって産生され得る。抗体又は抗原結合断片の完全な配列が既知である場合、組換えタンパク質を産生する方法を用いてもよい。例えば、“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ５（２）：１３５－１４６（２００８）を参照されたい。いくつかの実施形態では、抗体（又は抗原結合断片）は、インビボで生成された場合、細胞培養物又は生体試料から単離される。
【0032】
ファージディスプレイを使用して、本開示の抗体を生成することもできる。この点で、抗体の抗原結合可変（Ｖ）ドメインをコードするファージライブラリは、標準的な分子生物学及び組換えＤＮＡ技法を使用して生成することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）を参照）。所望の特異性を有する可変領域をコードするファージを、所望の抗原への特異的結合のために選択し、選択された可変ドメインを含む完全な又は部分的な抗体を再構築する。再構成された抗体をコードする核酸配列は、ハイブリドーマ産生に使用される骨髄腫細胞などの好適な細胞株に導入され、その結果、モノクローナル抗体の特性を有する抗体が細胞によって分泌される（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（上記）、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，（上記）、及び米国特許第６，２６５，１５０号を参照）。関連する方法はまた、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６９８号、米国特許第５，８３７，５００号、米国特許第５，７０２，８９２号に記載されている。米国特許第５，７８０，２７９号、米国特許第５，８２１，０４７号、米国特許第５，８２４，５２０号、米国特許第５，８５５，８８５号、米国特許第５，８５８，６５７号、米国特許第５，８７１，９０７号、米国特許第５，９６９，１０８号、米国特許第６，０５７，０９８号、及び米国特許第６，２２５，４４７号に記載される技法。
【0033】
抗体は、特異的重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックであるトランスジェニックマウスによって産生され得る。そのような方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、米国特許第５，５４５，８０６号及び同第５，５６９，８２５号、並びにＪａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（上記）に記載されている。
【0034】
モノクローナル抗体の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域の１つ、２つ、及び／又は３つのＣＤＲを含む組成物を生成することができる。例示的な抗体のＣＤＲは、本明細書では配列番号１～６として提供される。ヌクレオチド及びポリペプチド配列のクローニング及び発現のための技法は、当該技術分野において十分に確立されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）を参照）。増幅されたＣＤＲ配列を、適切な発現ベクターにライゲートする。１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、及び／又は６つのクローニングされたＣＤＲを含むベクターは、任意選択で、ＣＤＲに連結された追加のポリペプチドコード領域を含有する。
【0035】
化学的に構築された二重特異性抗体は、ヘテロ二官能性試薬スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオール）－プロピオネート（ＳＰＤＰ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）などの化学物質によって、異種Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２断片を化学的に架橋することによって調製されてもよい。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、それぞれ、パパイン又はペプシンで消化することによって、無傷の抗体から得ることができる（Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６－７０１（１９８４）、Ｔｉｔｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：４０１８－２２（１９８７））。
【0036】
抗体がどのように産生されるかにかかわらず、ＫＣＮＱ１のエピトープに結合する能力について抗体を試験する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、免疫沈降、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）、及び競合阻害アッセイを含む（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（下記）、及び米国特許出願公開第２００２／０１９７２６６号を参照）。
【0037】
抗体分子の抗原結合又はイディオタイプを含む抗体断片は、当該技術分野において既知の技法によって生成され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片は、抗体分子のペプシン消化によって産生され得、Ｆａｂ’断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成され得、２つのＦａｂ’断片は、抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することによって生成され得る。本開示は、抗原結合断片を生成する酵素法に限定されず、抗原結合断片は、好適な宿主細胞において断片をコードするポリヌクレオチドを発現することによって産生される組換え抗原結合断片であってもよい。
【0038】
本明細書に記載されるモノクローナル抗体の重鎖は、重鎖を含有する抗体の、１つ以上のＦｃ受容体への結合に影響を与える１つ以上の変異を更に含んでもよい。抗体のＦｃ部分の機能のうちの１つは、抗体がその標的と結合するときに免疫系と連通することである。これは、一般的に「エフェクター機能」と称される。連通は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、及び／又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）につながる。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、免疫系の細胞の表面上のＦｃ受容体へのＦｃの結合を通して媒介される。ＣＤＣは、Ｆｃと補体系のタンパク質、例えば、Ｃ１ｑとの結合を介して媒介される。
【0039】
抗体のエフェクター機能は、１つ以上の変異をＦｃに導入することによって増加又は減少され得る。本発明の実施形態は、エフェクター機能を増加させるように操作されたＦｃを有するヘテロ二量体抗体を含む（Ｕ．Ｓ．７，３１７，０９１及びＳｔｒｏｈｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２０：６８５－６９１，２００９；両方とも参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
【0040】
様々な実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるような抗体の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【0041】
抗体をコードする核酸を含むベクターもまた企図される。様々な実施形態では、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする核酸は、同じベクター又は異なるベクター上で発現される。
【0042】
更に提供されるのは、抗体重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域をコードする核酸、又は当該核酸を発現するベクターを含む宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。
【0043】
合成ペプチドを介して抗体軽鎖のＶドメインに連結された抗体重鎖の可変（Ｖ）ドメインを含む切断Ｆａｂ断片からなる一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）は、ルーチン組換えＤＮＡ技術の技法を使用して生成することができる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照）。同様に、ジスルフィド安定化可変領域断片（ｄｓＦｖ）は、組換えＤＮＡ技術によって調製することができる（例えば、Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７－７０４（１９９４）を参照）。
【0044】
組換え抗体断片、例えば、ｓｃＦｖは、異なる標的抗原に対する高い結合親和性及び特異性を有する安定した多量体オリゴマーに組み立てるように操作することもできる。そのような二重特異性抗体（二量体）、三重特異性抗体（三量体）又は四重特異性抗体（四量体）は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｋｏｒｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ．２００１ １８：９５－１０８，（２００１）及びＴｏｄｏｒｏｖｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２４８：４７－６６（２００１）を参照）。
【0045】
検出方法
試料中のＫＣＮＱ１の存在を検出するか、又は量を測定することが望ましい場合がある。この点において、本開示は、本明細書に記載される抗体又はその断片を使用して、試料中のＫＣＮＱ１の量を測定する方法を提供する。ＫＣＮＱ１の測定を決定するために、哺乳動物対象からの生体試料を、免疫複合体を形成するのに十分な時間、本明細書に記載される抗ＫＣＮＱ１抗体（又はその抗原結合断片）と接触させる。次いで、抗体と試料中のＫＣＮＱ１との間に形成される免疫複合体を検出する。生体試料中のＫＣＮＱ１の量は、抗体とＫＣＮＱ１との間に形成される免疫複合体の量を測定することによって任意選択で定量される。例えば、抗体が検出可能な標識を有する場合、抗体を定量的に測定することができるか、又は二次抗体を使用して免疫複合体を定量することができる。
試料中のＫＣＮＱ１の存在を検出するか、又は量を測定することが望ましい場合がある。この点において、本開示は、本明細書に記載される抗体又はその断片を使用して、試料中のＫＣＮＱ１の量を測定する方法を提供する。ＫＣＮＱ１の測定を決定するために、哺乳動物対象からの生体試料を、免疫複合体を形成するのに十分な時間、本明細書に記載される抗ＫＣＮＱ１抗体（又はその抗原結合断片）と接触させる。次いで、抗体と試料中のＫＣＮＱ１との間に形成される免疫複合体を検出する。生体試料中のＫＣＮＱ１の量は、抗体とＫＣＮＱ１との間に形成される免疫複合体の量を測定することによって任意選択で定量される。例えば、抗体が検出可能な標識を有する場合、抗体を定量的に測定することができるか、又は二次抗体を使用して免疫複合体を定量することができる。
【0046】
いくつかの実施形態では、生体試料は、組織試料、細胞試料、又は血液、唾液、血清、若しくは血漿などの生物学的流体試料を含む。
【0047】
抗体を試験試料とともにインキュベートするための条件は様々である。インキュベーション条件は、アッセイに用いられる形式、用いられる検出方法、及びアッセイに使用される抗体の種類及び性質に依存する。当業者は、一般的に利用可能な免疫学的アッセイフォーマットのうちのいずれか１つが、本開示の抗体（又はその断片）を用いるように容易に適合され得ることを認識するであろう。そのようなアッセイの例は、Ｃｈａｒｄ，Ｔ．，Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８６）、Ｂｕｌｌｏｃｋ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ Ｖｏｌ．１（１９８２），Ｖｏｌ．２（１９８３），Ｖｏｌ．３（１９８５）、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐ．，Ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ（１９８５）において見出すことができる。上記の方法において使用される試験試料は、アッセイフォーマット、検出方法の性質、及びアッセイされる試料として使用される組織、細胞又は流体に基づいて変動する。
【0048】
本明細書に記載されるアッセイは、例えば、動物研究、臨床試験、又は個々の患者の治療のモニタリングにおける特定の治療的処置レジメンの有効性を評価するのに有用であり得る。
【0049】
いくつかの実施形態では、抗ＫＣＮＱ１抗体（又はその抗原結合断片）は、固体支持体に結合され、結合は、固体支持体上のＫＣＮＱ１と抗体（又はその抗原結合断片）との間の複合体を検出することによって検出される。抗体（又はその断片）は、任意選択で、検出可能な標識を含み、結合は、ＫＣＮＱ１－抗体複合体中の標識を検出することによって検出される。
【0050】
ＫＣＮＱ１－抗体複合体の存在又は非存在の検出は、当該技術分野において既知である任意の方法を使用することによって達成され得る。例えば、標的分子（例えば、抗体）と相互作用するＫＣＮＱ１ペプチドのレポーター遺伝子転写アッセイから得られる転写産物は、典型的には、直接的又は間接的に検出可能な産物（例えば、β－ガラクトシダーゼ活性及びルシフェラーゼ活性）をコードする。無細胞結合アッセイの場合、構成要素のうちの１つは、通常、検出可能な標識を含むか、又は検出可能な標識にカップリングされる。直接検出（放射能、発光、光学密度若しくは電子密度など）又は間接検出（例えば、ＦＬＡＧエピトープなどのエピトープタグ、ワサビペルオキシダーゼなどの酵素タグ）を提供するものなどの多様な標識を使用することができる。標識は、抗体に結合するか、又は抗体の構造に組み込むことができる。
【0051】
標識及び他のアッセイ構成要素の性質に応じて、種々の方法を使用して、標識を検出することができる。例えば、標識は、固体基板に結合している間、又は固体基板からの分離の後に検出され得る。標識は、光学密度若しくは電子密度、放射性放出、非放射性エネルギー移動によって直接検出することができるか、又は抗体コンジュゲート若しくはストレプトアビジン－ビオチンコンジュゲートによって間接的に検出することができる。標識を検出するための方法は、当該技術分野において周知である。
【0052】
薬学的組成物
本明細書に記載される抗ＫＣＮＱ１抗体又はその抗原結合断片を含む薬学的組成物もまた企図される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解若しくは放出速度、吸着又は貫通を修正、維持又は保存するための製剤材料を含有する。そのような実施形態では、好適な製剤材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、プロリン、メチオニン又はリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（還元剤、酸素／遊離基スカベンジャー、及びキレート剤（例えば、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム）など）；緩衝液（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩又は他の有機酸など）；増量剤（マンニトール又はグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類；二糖類；及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；着色剤、香味剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤又は湿潤剤（プロン酸、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなど）；安定性向上剤（スクロース又はソルビトールなど）；張性向上剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトールソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は薬学的アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８”Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
本明細書に記載される抗ＫＣＮＱ１抗体又はその抗原結合断片を含む薬学的組成物もまた企図される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解若しくは放出速度、吸着又は貫通を修正、維持又は保存するための製剤材料を含有する。そのような実施形態では、好適な製剤材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、プロリン、メチオニン又はリジンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（還元剤、酸素／遊離基スカベンジャー、及びキレート剤（例えば、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム）など）；緩衝液（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩又は他の有機酸など）；増量剤（マンニトール又はグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類；二糖類；及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；着色剤、香味剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤又は湿潤剤（プロン酸、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなど）；安定性向上剤（スクロース又はソルビトールなど）；張性向上剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトールソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／又は薬学的アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８”Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
【0053】
本明細書に記載される特定の製剤材料の選択は、例えば、意図される投与経路、送達形態、及び所望の投与量によって駆動され得る。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（上記）を参照されたい。薬学的組成物中の一次ビヒクル又は担体は、本質的に水性であっても非水性であってもよい。例えば、好適なビヒクル又は担体は、注射用水、生理食塩水溶液、又は人工脳脊髄液であってもよく、場合によっては、非経口投与用の組成物に共通する他の材料で補充されてもよい。中性緩衝生理食塩水又は血清アルブミンと混合された生理食塩水は、更なる例示的なビヒクルである。特定の実施形態では、薬学的組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のＴｒｉｓ緩衝液、又は約ｐＨ４．０～５．５の酢酸緩衝液を含み、ソルビトール又はそのための好適な代替物を更に含み得る。ある特定の実施形態では、組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキ又は水溶液の形態で任意選択の製剤（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、上記）と混合することによって保管のために調製され得る。更に、いくつかの実施形態では、抗体又は（その抗原結合断片）は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として製剤化されてもよい。
【0054】
本発明の薬学的組成物は、非経口送達のために選択することができる。あるいは、組成物は、吸入のために、又は経口などの消化管を介した送達のために選択され得る。そのような薬学的に許容される組成物の調製は、当業者の範囲内である。製剤成分は、好ましくは、投与部位に許容される濃度で存在する。ある特定の実施形態では、緩衝液を使用して、組成物を生理学的ｐＨ又はわずかに低いｐＨ、典型的には、約５～約８のｐＨ範囲内で維持する。
【0055】
非経口投与が企図される場合、組成物は、薬学的に許容されるビヒクル中の所望の抗体又は断片を含む、パイロジェンフリーの非経口的に許容される水溶液の形態で提供され得る。非経口注射に特に好適なビヒクルは、抗体又は断片が無菌の等張溶液として製剤化され、適切に保存された無菌蒸留水である。ある特定の実施形態では、植込み型薬物送達デバイスを使用して、所望の抗体（又はその抗原結合断片）を導入することができる。
【0056】
持続送達又は制御送達製剤中の抗原結合タンパク質を伴う製剤を含む追加の薬学的組成物は、本明細書で企図される。リポソーム担体、生体浸食性微粒子又は多孔質ビーズ及びデポー注射などの様々な他の持続送達又は制御送達手段を製剤化するための技法は、当該技術分野において入手可能である。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号（これは、参照により組み込まれ、薬学的組成物の送達のための多孔質ポリマー微粒子の制御放出を説明する）を参照されたい。持続放出調製物は、成形品の形態の半透過性ポリマーマトリックス、例えば、フィルム又はマイクロカプセルを含み得る。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（各々が参照により組み込まれる、米国特許第３７７３９１９号及び欧州特許出願公開第ＥＰ０５８４８１号に開示されているような）、Ｌ－グルタミン酸及びガンマエチル－Ｌ－グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２：５４７－５５６）、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７－２７７及びＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８－１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１、上記）又はポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第ＥＰ１３３９８８号）が含まれ得る。持続放出組成物はまた、当該技術分野において既知のいくつかの方法のうちのいずれかによって調製され得るリポソームを含み得る。例えば、参照により組み込まれる、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：３６８８－３６９２、欧州特許出願公開第ＥＰ０３６６７６号、同第ＥＰ０８８０４６号及び同第ＥＰ１４３９４９号を参照されたい。
【0057】
抗体製剤の実施形態は、１つ以上の保存剤を更に含み得る。
【0058】
本明細書に記載される組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の共通経路を介して行われる。薬学的組成物は、任意の従来の方法、例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、眼内、小球後、肺内（例えば、用語放出）によって、経口、舌下、鼻、肛門、膣、若しくは経皮送達によって、又は特定の部位での外科的移植によって、対象に導入され得る。
【0059】
投与量
いくつかの実施形態では、１回以上の用量の抗体又は抗原結合断片は、ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）の対象を治療するのに有効な量及び時間で投与される。例えば、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片の１回以上の投与は、任意選択で、例えば、約１週間～約２４ヶ月（例えば、約１ヶ月～約１２ヶ月、約１ヶ月～約１８ヶ月、約１ヶ月～約９ヶ月、又は約１ヶ月～約６ヶ月、又は約１ヶ月～約３ヶ月）の治療期間にわたって実行される。いくつかの実施形態では、対象は、例えば、約１ヶ月～約１２ヶ月（５２週間）（例えば、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、又は約１１ヶ月）の治療期間にわたって、１回以上の用量の本明細書に記載される抗体又はその断片を投与される。
いくつかの実施形態では、１回以上の用量の抗体又は抗原結合断片は、ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）の対象を治療するのに有効な量及び時間で投与される。例えば、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片の１回以上の投与は、任意選択で、例えば、約１週間～約２４ヶ月（例えば、約１ヶ月～約１２ヶ月、約１ヶ月～約１８ヶ月、約１ヶ月～約９ヶ月、又は約１ヶ月～約６ヶ月、又は約１ヶ月～約３ヶ月）の治療期間にわたって実行される。いくつかの実施形態では、対象は、例えば、約１ヶ月～約１２ヶ月（５２週間）（例えば、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、又は約１１ヶ月）の治療期間にわたって、１回以上の用量の本明細書に記載される抗体又はその断片を投与される。
【0060】
特定の対象に選択された治療レジメンに応じて、複数回用量の抗体又は抗原結合断片を規則的な間隔で投与することが有利であり得る。いくつかの実施形態では、抗体又はその断片は、１年（１２ヶ月、５２週間）以下（例えば、９ヶ月以下、６ヶ月以下、又は３ヶ月以下）の期間にわたって定期的に投与される。この点で、抗体又はその断片は、ヒトに、約３日毎、又は約７日毎、又は約２週毎、又は３週毎、又は４週毎、又は５週毎、又は６週毎、又は７週毎、又は８週毎、又は９週毎、又は１０週毎、又は１１週毎、又は１２週毎、又は１３週毎、又は１４週毎、又は１５週毎、又は１６週毎、又は１７週毎、又は１８週毎、又は１９週毎、又は２０週毎、又は２１週毎、又は２２週毎、又は２３週毎、又は６ヶ月毎、又は１２ヶ月毎に１回投与される。
【0061】
様々な実施形態では、約５０ｍｇ～約１，０００ｍｇの抗体又はその抗原結合断片を含む１回以上の用量を、対象（例えば、ヒト対象）に投与する。例えば、用量は、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約１５ｍｇ、少なくとも約２５ｍｇ、少なくとも約５０ｍｇ、少なくとも約６０ｍｇ、少なくとも約７０ｍｇ、少なくとも約８０ｍｇ、少なくとも約９０ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、少なくとも約１２０ｍｇ、少なくとも約１５０ｍｇ、少なくとも約２００ｍｇ、少なくとも約２１０ｍｇ、少なくとも約２４０ｍｇ、少なくとも約２５０ｍｇ、少なくとも約２８０ｍｇ、少なくとも約３００ｍｇ、少なくとも約３５０ｍｇ、少なくとも約４００ｍｇ、少なくとも約４２０ｍｇ、少なくとも約４５０ｍｇ、少なくとも約５００ｍｇ、少なくとも約５５０ｍｇ、少なくとも約６００ｍｇ、少なくとも約６５０ｍｇ、少なくとも約７００ｍｇ、少なくとも約７５０ｍｇ、少なくとも約８００ｍｇ、少なくとも約８５０ｍｇ、少なくとも約９００ｍｇ、少なくとも約９５０ｍｇ、又は最大約１，０００ｍｇの抗体を含むことができる。これらのエンドポイントのうちのいずれか及び全ての間の範囲、例えば、約５０ｍｇ～約８０ｍｇ、約７０ｍｇ～約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ～約２７０ｍｇ、約７５ｍｇ～約１００ｍｇ、約１００ｍｇ～約１５０ｍｇ、約１４０ｍｇ～約２１０ｍｇ、又は約１５０ｍｇ～約２００ｍｇ、又は約１８０ｍｇ～約２７０ｍｇもまた企図される。用量は、週に複数回（例えば、週に２回又は３回）、週に１回、２週毎に１回、３週毎に１回、又は４週毎に１回などの任意の間隔で投与される。
【0062】
いくつかの実施形態では、１回以上の用量は、対象の体重キログラム（ｍｇ／ｋｇ）当たり約０．１～約５０ｍｇ（例えば、約５～約５０ｍｇ）、又は約１～約１００ｍｇの抗体（又はその抗原結合断片）を含むことができる。例えば、用量は、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約０．５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも１９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも２４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２７ｍｇ／ｋｇ、約２８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４２ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４３ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４４ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４６ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４７ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４８ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４９ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約６５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約７５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約８５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約９５ｍｇ／ｋｇ、又は最大約１００ｍｇ／ｋｇを含み得る。これらのエンドポイントのうちのいずれか及び全ての間の範囲、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約４０ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ～約３０ｍｇ／ｋｇ、又は約５ｍｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇもまた企図される。
【0063】
治療方法
別の態様では、ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）に罹患している対象を治療する方法であって、対象に、ＱＴ延長症候群を治療するのに有効な量で、抗体（若しくはその抗原結合断片）又は薬学的組成物を投与することを含む、方法が本明細書に記載される。
別の態様では、ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）に罹患している対象を治療する方法であって、対象に、ＱＴ延長症候群を治療するのに有効な量で、抗体（若しくはその抗原結合断片）又は薬学的組成物を投与することを含む、方法が本明細書に記載される。
【0064】
いくつかの実施形態では、ＱＴ延長症候群は、ＬＱＴＳ２又はＬＱＴＳ３である。いくつかの実施形態では、ＱＴ延長症候群は、ＬＱＴＳ２である。いくつかの実施形態では、ＱＴ延長症候群は、ＬＱＴＳ３である。
【0065】
いくつかの実施形態では、対象はまた、心筋症、糖尿病、てんかん又は神経学的併存疾患に罹患している。いくつかの実施形態では、抗体（又はその抗原結合断片）を投与することは、抗体（又はその抗原結合断片）を受けなかった対象と比較して、より短い心再分極をもたらす。いくつかの実施形態では、抗体（又はその抗原結合断片）を投与することは、抗体（又はその抗原結合断片）を受けなかった対象と比較して、突然の心停止を含む心室頻拍性不整脈の発生率の低下をもたらす。
【0066】
いくつかの実施形態では、抗体（又はその抗原結合断片）を投与することは、ベースラインでの対象の心再分極と比較して、対象のより短い心再分極（ＥＣＧ上のＱＴ若しくはＪＴ間隔、又はその変形、例えば、Ｂａｚｅｔｔ式（ＱＴ／ＲＲ１／２）、Ｆｒｉｄｅｒｉｃｉａ（ＱＴ／ＲＲ１／３）、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ（ＱＴ＋０．１５４（１－ＲＲ）、Ｈｏｄｇｅｓ（ＱＴ＋１．７５（ＨＲ－６０）、Ｒａｕｔａｈａｒｊｕ（ＱＴ×（１２０＋ＨＲ）／１８０）、心拍補正されたＪＴ（ＱＴｃ－ＱＲＳ））によって少なくとも５％（又は少なくとも１０％、又は少なくとも１５％、又は少なくとも２０％、又は少なくとも２５％、又は少なくとも３０％、又は少なくとも３５％、又は少なくとも４０％、又は少なくとも４５％、又は少なくとも５０％以上）補正されたＱＴ間隔）をもたらす。
【0067】
いくつかの実施形態では、抗体（又はその抗原結合断片）を投与することは、対象におけるＫＣＮＱ１チャネル発現に影響を及ぼさない。
【0068】
いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な又は最小限のオフターゲット効果、例えば、てんかん、神経精神併存症、糖尿病又は耐糖能障害、甲状腺障害を有しない。
【0069】
併用療法
本明細書に開示される抗ＫＣＮＱ１モノクローナル抗体は、単独で、又は任意選択で、ＬＱＴＳの治療に有用な他の治療剤と組み合わせて投与され得る。したがって、本明細書に記載される状態、疾患、又は障害の治療に有用であることが知られている任意の活性剤は、本発明の方法で使用され得、本発明の方法で使用されるアミノステロール組成物と組み合わせるか、又は別々に若しくは連続的に投与され得る。例示的な追加の薬剤には、プロパノロール（例えば、Ｉｎｄｅｒａｌ（登録商標））、アテノロール（例えば、Ｔｅｎｏｒｍｉｎ（登録商標））、メトプロロール（例えば、Ｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌ（登録商標）、Ｌｏｐｒｅｓｓｏｒ（登録商標））、ナドロール（例えば、Ｃｏｒｇａｒｄ（登録商標））、ビソプロロール（例えば、Ｚｅｂｅｔａ（登録商標）、Ｍｏｎｏｃｏｒ（登録商標））などのβ遮断薬；メキシレチン（例えば、Ｍｅｘｉｔｉｌ（登録商標））、ラノラジン（例えば、Ｒａｎｅｘａ（登録商標））などの抗不整脈薬；ジルチアゼム（例えば、Ｃａｒｄｉｚｅｍ（登録商標））及びベラパミル（例えば、Ｖｅｒｅｌａｎ（登録商標））などのカルシウムチャネル遮断薬；並びにジゴキシン（例えば、Ｌａｎｏｘｉｎ（登録商標）などのジギタリス由来の薬物が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される抗ＫＣＮＱ１モノクローナル抗体は、単独で、又は任意選択で、ＬＱＴＳの治療に有用な他の治療剤と組み合わせて投与され得る。したがって、本明細書に記載される状態、疾患、又は障害の治療に有用であることが知られている任意の活性剤は、本発明の方法で使用され得、本発明の方法で使用されるアミノステロール組成物と組み合わせるか、又は別々に若しくは連続的に投与され得る。例示的な追加の薬剤には、プロパノロール（例えば、Ｉｎｄｅｒａｌ（登録商標））、アテノロール（例えば、Ｔｅｎｏｒｍｉｎ（登録商標））、メトプロロール（例えば、Ｍｅｔｏｐｒｏｌｏｌ（登録商標）、Ｌｏｐｒｅｓｓｏｒ（登録商標））、ナドロール（例えば、Ｃｏｒｇａｒｄ（登録商標））、ビソプロロール（例えば、Ｚｅｂｅｔａ（登録商標）、Ｍｏｎｏｃｏｒ（登録商標））などのβ遮断薬；メキシレチン（例えば、Ｍｅｘｉｔｉｌ（登録商標））、ラノラジン（例えば、Ｒａｎｅｘａ（登録商標））などの抗不整脈薬；ジルチアゼム（例えば、Ｃａｒｄｉｚｅｍ（登録商標））及びベラパミル（例えば、Ｖｅｒｅｌａｎ（登録商標））などのカルシウムチャネル遮断薬；並びにジゴキシン（例えば、Ｌａｎｏｘｉｎ（登録商標）などのジギタリス由来の薬物が含まれるが、これらに限定されない。
【0070】
キット
薬学的組成物が製剤化されると、それは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体、結晶、又は脱水若しくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアルに保管され得る。そのような製剤は、すぐに使用できる形態で、又は投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥された）で保管され得る。本発明はまた、単回用量投与単位を製造するためのキットも提供する。本開示のキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第１の容器と、水性製剤を有する第２の容器との両方を含有してもよい。ある特定の実施形態では、単一及びマルチチャンバ型プリフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジ及び凍結乾燥シリンジ）を含むキットが提供される。
薬学的組成物が製剤化されると、それは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルション、固体、結晶、又は脱水若しくは凍結乾燥粉末として、滅菌バイアルに保管され得る。そのような製剤は、すぐに使用できる形態で、又は投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥された）で保管され得る。本発明はまた、単回用量投与単位を製造するためのキットも提供する。本開示のキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第１の容器と、水性製剤を有する第２の容器との両方を含有してもよい。ある特定の実施形態では、単一及びマルチチャンバ型プリフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジ及び凍結乾燥シリンジ）を含むキットが提供される。
【0071】
以下の実施例は、本開示の態様を更に例示するために提供されており、本開示を任意の特定の応用又は動作理論に限定するものではない。
【実施例】
【0072】
実施例１－材料及び方法
抗ＫＣＮＱ１抗体の生成：５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ（Ｓｃｈｉｌｔｉｇｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）による標準プロトコルを使用して、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体にカップリングしたＫＣＮＱ１チャネルペプチド配列（ＡＥＫＤＡＶＮＥＳＧＲＶＥＦＧＳＹＡＤＡ、配列番号１０（配列番号９のアミノ酸２８３～３０２））に対して免疫化した。簡潔に述べると、マウスは、５０μｇのＫＣＮＱ１ペプチドと完全フロイトアジュバントとの皮下注射、続いて不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）を補充した２５μｇのＫＣＮＱ１ペプチドの週次注射を受けた。４週目の最終的なブースター注射（５０μｇのＫＣＮＱ１ペプチド＋ＩＦＡ）の後、最も高い抗体価を有するマウス由来の脾臓細胞を収集し、ポリエチレングリコール（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ、Ｓｃｈｉｌｔｉｇｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）によって骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞を、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０／１％ Ｌ－グルタミンを含有する完全培地中で培養した。異なる継代の細胞の順次分離を、ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）及び完全培地を使用して実施した。限界希釈技法による反復サブクローニング及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるスクリーニングによって、ＫＣＮＱ１チャネル配列を標的とするＩｇＧを特異的に産生する６つのクローンが同定された。６つのモノクローナル抗体を、選択されたクローンから産生し、プロテインＧカラム（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ、Ｓｃｈｉｌｔｉｇｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）上で精製した。標準ＥＬＩＳＡを使用して、ＩｇＧサブタイプを決定した。モノクローナル抗体を滅菌した１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に収集し、Ａ２８０法を用いて濃度を決定した。
抗ＫＣＮＱ１抗体の生成：５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ（Ｓｃｈｉｌｔｉｇｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）による標準プロトコルを使用して、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）担体にカップリングしたＫＣＮＱ１チャネルペプチド配列（ＡＥＫＤＡＶＮＥＳＧＲＶＥＦＧＳＹＡＤＡ、配列番号１０（配列番号９のアミノ酸２８３～３０２））に対して免疫化した。簡潔に述べると、マウスは、５０μｇのＫＣＮＱ１ペプチドと完全フロイトアジュバントとの皮下注射、続いて不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）を補充した２５μｇのＫＣＮＱ１ペプチドの週次注射を受けた。４週目の最終的なブースター注射（５０μｇのＫＣＮＱ１ペプチド＋ＩＦＡ）の後、最も高い抗体価を有するマウス由来の脾臓細胞を収集し、ポリエチレングリコール（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ、Ｓｃｈｉｌｔｉｇｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）によって骨髄腫細胞と融合させた。ハイブリドーマ細胞を、１０％ウシ胎仔血清及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０／１％ Ｌ－グルタミンを含有する完全培地中で培養した。異なる継代の細胞の順次分離を、ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）及び完全培地を使用して実施した。限界希釈技法による反復サブクローニング及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるスクリーニングによって、ＫＣＮＱ１チャネル配列を標的とするＩｇＧを特異的に産生する６つのクローンが同定された。６つのモノクローナル抗体を、選択されたクローンから産生し、プロテインＧカラム（ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ、Ｓｃｈｉｌｔｉｇｈｅｉｍ，Ｆｒａｎｃｅ）上で精製した。標準ＥＬＩＳＡを使用して、ＩｇＧサブタイプを決定した。モノクローナル抗体を滅菌した１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に収集し、Ａ２８０法を用いて濃度を決定した。
【0073】
組換え抗体の産生：マウスＩｇＧ２ａの定常領域に融合した可変領域の配列は、哺乳動物の発現のために最適化されたシグナルペプチドと組み合わせて、ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ（Ｆｒａｎｃｅ）によって化学的に合成された。ｃＤＮＡを、制限酵素、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩを使用して発現ベクターｐＴＸ１に挿入した。次いで、Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｉｘ独自の方法で、プラスミドをＸｔｅｎＣＨＯ（商標）細胞内で一過性にトランスフェクトした。次いで、抗体をＸｔｅｎＣＨＯ（商標）細胞の上清から親和性精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルによる分離後、モノクローナル抗体を、還元及び非還元条件下でウェスタンブロットによって分析した。
【0074】
抗体動態及び親和性測定：ＣＭ５センサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ ８Ｋ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＰｒｏｔｅｏＧｅｎｉｘ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、室温で結合速度定数及び親和性定数を生成した。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４（１０μｇ／ｍｌ）を、製造業者のプロトコルに従って、アミドカップリングによってＣＭ５チップ上に固定化した。表面化学を、固定化前に１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びスルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）試薬を使用して活性化し、一方でエタノールアミンを使用して残りの活性エステルを不活性化した。試料を、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０で構成されたＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液中で調製した。抗原ペプチドを２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）に懸濁し、グリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を再生緩衝液として使用した。結合親和性を定義するために、相互作用の動態分析を、１０’０００共鳴単位（ＲＵ）の抗体固定化レベルを使用して実施した。このレベルは、リガンド（ＩｇＧ２ａ）に対する分析物（抗原ペプチド）の最大応答（Ｒｍａｘ）の計算に基づいて最適と考えられた。Ｒｍａｘ＝（ＭＷａｎａｌｙｔｅ／ＭＷｌｉｇａｎｄ）×ＲＬ×Ｓｍ（式中、ＭＷａｎａｌｙｔｅ及びＭＷｌｉｇａｎｄは、それぞれ、抗体（リガンド、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって決定されるように、１８０ｋＤａ）に対するペプチド（分析物、２．１２ｋＤａ）の分子量であり、ＲＬは、ＲＵで結合されたリガンドの目標量であり、Ｓｍは、分析物／リガンド相互作用の化学量論比を表す（Ｓｍ＝１）。１００ＲＵの理論上のＲｍａｘは、１０’０００ＲＵのリガンドで達成される。異なる濃度のモノクローナル抗体（７．８１２５ｎＭ～５００ｎＭ、２倍の段階希釈液）を、３０μｌ／分の流量で１２０秒間注入し、続いて６００秒の解離相を注入した。アッセイの再現性を評価するために、注入を三重に実施した。全てのデータを、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ評価ソフトウェアで処理し、分析した。
【0075】
高解像度構造的エピトープマッピング：抗体エピトープのマッピングは、切断されたペプチドを回避するために、Ｃ末端及びＮ末端で中性ＧＳＧＳＧＳＧリンカーで伸長されたＫＣＮＱ１タンパク質（ＮＰ＿０００２０９．２）の完全長配列を網羅するＰＥＰｐｅｒＰＲＩＮＴ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）によってＰＥＰｐｅｒＣＨＩＰ（登録商標）上で実施した。伸長した抗原配列を、Ｃ末端システインと適切に修飾されたＮ末端との間のチオエーテル連結を介して環化された、７、１０、及び１３の重複アミノ酸ペプチドに翻訳した。得られた構造的ＫＣＮＱ１ペプチドマイクロアレイは、複製された２０４３の異なるペプチドを含有し、追加のヘマグルチニン（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡＧ（配列番号１１）、１３４スポット）対照ペプチドによってフレーム化した。モノクローナル抗体を、０．１μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートした。ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＤｙＬｉｇｈｔ６８０を、二次抗体として用いた。走査には、ＬＩ－ＣＯＲ Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステムを使用した。スポット強度の定量化及びペプチドアノテーションは、ＰｅｐＳｌｉｄｅ（登録商標）Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて実施した。平均した前景強度の中央値に基づいて、強度マップを生成した。４０％の最大スポット間偏差を許容し、それ以外の場合、対応する強度値をゼロにした。
【0076】
分子ドッキング：以下の３次元構造を、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＰＤＢ）から取得し、以下のタンパク質を構築するための鋳型として用いた：ホモサピエンスＫＣＮＱ１－カルモジュリンチャネル複合体（ＰＤＢ：６ＵＺＺ）及びＭｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ免疫グロブリン２ａ（ＰＤＢ：１ＩＧＴ）。以前に得られたＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４配列を、モノクローナル抗体の３Ｄ構造をモデリングするための初期データとして組み込んだ。剛性抗原－抗体ドッキングを、分子作動環境（ＭＯＥ）プログラム（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）を使用して実施した。抗体及びＫＣＮＱ１チャネルは、それらのエネルギーを最小限に抑え、次いでＭＯＥアルゴリズムのデフォルトパラメータに従って３Ｄプロトン化することによってドッキングのために調製した。ＫＣＮＱ１チャネル（細胞外ドメイン）及び抗体（ＣＤＲ）の両方の標的部位を、ドッキングの前に特定した。膜貫通セグメントＳ１～Ｓ２、Ｓ３～Ｓ４及びＳ５～Ｓ６（細孔領域を含む）間のループは、Ｃｈｏｕａｂｅ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｏｕａｂｅ，Ｎｅｙｒｏｕｄ，Ｇｕｉｃｈｅｎｅｙ，Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ，Ｒｏｍｅｙ＆Ｂａｒｈａｎｉｎ，１９９７）によって定義されるように、ＫＣＮＱ１チャネル複合体の細胞外ドメインを構成する。Ｈ鎖及びＬ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔ付番スキーム（Ｋａｂａｔ，Ｗｕ，Ｐｅｒｒｙ，Ｆｏｅｌｌｅｒ＆Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，１９９１）を使用して予測された。細胞膜をシミュレートするために、細胞外チャネル領域には、大きなＡｔｏｍＱ特徴（半径２０Å）が設定され、一方、脂質二重層領域には、大きな排除体積（半径２０Å）が作成された。ＭＯＥプログラムを使用して、分子グラフィック及びタンパク質視覚化をレンダリングした。
【0077】
ＣＨＯ細胞培養及びパッチクランプ記録：ヒトＫＣＮＱ１／ＫＣＮＥ１チャネルを安定的に発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｂｉｏｓｗｉｓｓｔｅｃ Ｌｔｄ、Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ペニシリン１０．０００Ｕ／ｍｌ－ストレプトマイシン１０ｍｇ／ｍｌ、Ｂｉｏｓｗｉｓｓｔｅｃ Ｌｔｄ、Ｓｃｈａｆｆｈａｕｓｅｎ，ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによるＳｅｒａｇｌｏｂ）を補充したＨａｍのＦ－１２栄養ミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＢＶ、Ｚｕｇ，ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによるＧｉｂｃｏ（商標））中、３７℃、５％ ＣＯ２で培養した。トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、細胞を酵素的に分割した。パッチクランプ実験のために、ＣＨＯ細胞を、培養培地±モノクローナル抗体中の滅菌ペトリ皿（１０００～２０００細胞／ｃｍ２）上にプレーティングした。ＰＡＴＣＨＭＡＳＴＥＲ（ＨＥＫＡ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ ＧｍｂＨ、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって制御されるＥＰＣ－１０増幅器を使用して、室温で全セル構成のＩＫｓ電流を記録した。以下の外部溶液を（ｍｍｏｌ／Ｌで）使用した：１４０ＮａＣｌ、５ＫＣｌ、１ＭｇＣｌ２、１０ＨＥＰＥＳ、１．８ＣａＣｌ２、１０グルコース（ＮａＯＨで調整したｐＨ７．４）±モノクローナル抗体。ホウケイ酸ガラス毛細管（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，ＵＳＡ、先端抵抗５～７ＭΩ）を、（ｍｍｏｌ／Ｌで）以下で構成された内部溶液で充填した：１００Ｋ＋アスパラギン酸塩、２０ＫＣｌ、２ＭｇＣｌ２、１ＣａＣｌ２、１０ＥＧＴＡ、５Ｋ＋ＡＴＰ、１０ＨＥＰＥＳ、４０グルコース（ＫＯＨで調節したｐＨ７．２）。ＩＫ電流は、ＣＨＯ細胞を－６０ｍＶで保持し、－５０ｍＶ～＋７０ｍＶの脱分極試験パルス（３０００ｍｓ、０．１Ｈｚ）を１０ｍＶ増分ステップで印加し、続いて－４０ｍＶに再分極すること（２０００ｍｓ）によって測定した。ＩＫｓ電流を２．９ｋＨｚでローパスフィルタリングし、４ｋＨｚでサンプリングした。全細胞パッチクランプデータをＦＩＴＭＡＳＴＥＲ（ＨＥＫＡ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ ＧｍｂＨ、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。活性化曲線及び不活性化曲線は、ボルツマン関数で適合させた：Ｉ／Ｉｍａｘ＝１／（１＋ｅ（Ｖ１／２－Ｖｔ）／ｋ）、式中、Ｖ１／２＝半最大活性化電位、Ｖｔ＝試験パルス電位、ｋ＝スロープ係数（Ｍａｇｕｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２０２０）。
【0078】
ｈｉＰＳＣ－ＣＭＣ培養及びパッチクランプ記録：Ｎｃａｒｄｉａ（Ｐｌｕｒｉｃｙｔｅ（著作権）、Ｎｃａｒｄｉａ ＢＶ、Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）由来のヒト誘導多能性幹細胞由来心室心筋細胞（ｈｉＰＳＣ－ＣＭＣ）を、製造業者の指示に従って培養した（Ｍａｇｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２０２０）。ｈｉＰＳＣ－ＣＭＣを、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２，ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ ＢＶ、Ｚｕｇ，ＳｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによるＧｉｂｃｏＴＭ）中で１：１００に希釈したＣｏｒｎｉｎｇ Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＧｍｂＨ、Ｄｉｅｔｉｋｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからの成長因子低減基底膜マトリックス）でコーティングしたペトリ皿上に２５’０００細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした。前述のように、３７℃でＰＡＴＣＨＭＡＳＴＥＲ（ＨＥＫＡ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ ＧｍｂＨ、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって制御されるＥＰＣ－１０増幅器を用いた電流クランプ条件下で、解凍後７日目～１４日目の間に自発的な活動電位を記録した（Ｍａｇｕｙ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ａｍ Ｃｏｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２０２０）。外部溶液は、（ｍｍｏｌ／Ｌで）以下で構成された：１４０ＮａＣｌ、５ＫＣｌ、１ＭｇＣｌ２、１０ＨＥＰＥＳ、１．８ＣａＣｌ２、１０グルコース（ＮａＯＨで調整したｐＨ７．４）±モノクローナル抗体。ｈｉＰＳＣ－ＣＭＣにおいてＬＱＴＳ２を薬理学的に誘導するために、細胞を選択的ｈＥＲＧ遮断薬、１０ｎＭのＥ－４０３１（Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ、Ｉｓｒａｅｌ）に曝露し、インキュベーションの３０分後に記録を開始した。ＬＱＴＳ３の電気表現型をシミュレートするために、５分間のインキュベーション後に、イソギンチャク毒（５ｎＭ ＡＴＸ－ＩＩ、Ａｌｏｍｏｎｅ Ｌａｂｓ、Ｉｓｒａｅｌ）を使用して、後期ＩＮａ電流を選択的に増加させた。ホウケイ酸ガラスピペットは、２～４ＭΩの先端抵抗を有した。内部溶液は、（ｍｍｏｌ／Ｌで）以下を含有した：１１０Ｋ＋アスパラギン酸塩、２０ＫＣＬ、１ＭｇＣｌ２、５Ｍｇ２＋ＡＴＰ、０．１Ｌｉ＋ＧＴＰ、１０ＨＥＰＥＳ、５Ｎａ＋ホスホクレアチン、０．０５ＥＧＴＡ（ｐＨをＫＯＨで７．３に調節した）、２００μｇ／ｍｌのアムホテリシン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。活動電位をＦＩＴＭＡＳＴＥＲ（ＨＥＫＡ Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。活動電位持続時間（ＡＰＤ）を、９０％（ＡＰＤ９０）再分極時に決定した。
【0079】
統計分析：特に断りのない限り、結果は、平均±ＳＥＭとして示される。全てのデータを、Ｓｈａｐｉｒｏ－Ｗｉｌｋ試験に供して分布の正規性を評価した。正規分布データを有する群間の統計的差異は、一元分散分析、続いてＴｕｋｅｙの多重比較事後検定によって決定した。２つの群平均を比較するために、両側スチューデントｔ検定を適用して、正規分布データの統計的有意性を決定した。非正規分布の場合、マン・ホイットニーＵ検定を使用した。統計分析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、ＵＳＡ）を使用した。＜０．０５のｐ値は、統計学的に有意であると考えられた。
【0080】
実施例２－機能的ＫＣＮＱ１モノクローナル抗体の選択
ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡによって試験して、分泌された抗体がＫＣＮＱ１チャネルペプチドに対する特異性を保持したことを確認した。４０のハイブリドーマクローンのうち、特異性を有する機能性ＩｇＧ抗体を産生する６つが同定された（すなわち、３－Ａ１１－Ｈ３－Ｆ３、５－Ｄ４－Ｄ１、７－Ｄ１２－Ｂ１１－Ｄ１２、８－Ｆ１１－Ｄ－４、９－Ｆ５－Ｈ２－２－Ｇ１１－Ｆ６及び１０－Ｆ１０－Ｄ７－Ｂ１）。全細胞パッチクランプ実験を実施して、ヒトＩＫｓチャネルを安定的に発現するＣＨＯ細胞におけるＩＫｓ電流に対する６つ全てのモノクローナル抗体の効果を研究した。３０μｇ／ｍｌ ＩｇＧの濃度を試験する選択は、ポリクローナルＫＣＮＱ１抗体に関する以前のデータに基づいた（Ｍａｇｕｙ，Ｋｕｃｅｒａ，Ｗｅｐｆｅｒ，Ｆｏｒｅｓｔ，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ＆Ｌｉ，２０２０）。図１に例示されるように、ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４（配列番号１～６に記載されるＣＤＲを含む）は、ポリクローナル抗体集団の効果を最もよく複製した。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、平均ＩＫｓステップ電流を＋７０ｍＶで１．６倍、平均ＩＫｓテール電流を－４０ｍＶに再分極すると１．５倍増加させた（図２Ａ～２Ｄ）。モノクローナル抗体で処理したＣＨＯ細胞の容量は、対照群と同様であった。ポリクローナルＫＣＮＱ１抗体に類似して、ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、半最大活動電位（Ｖ１／２）を－９ｍＶシフトし、一方、不活性化の電圧依存性をより負の電位に１１ｍＶシフトした（図２Ｅ～２Ｆ）。電圧感度を反映する活性化及び不活性化スロープ係数ｋは変化しなかった。
ハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡによって試験して、分泌された抗体がＫＣＮＱ１チャネルペプチドに対する特異性を保持したことを確認した。４０のハイブリドーマクローンのうち、特異性を有する機能性ＩｇＧ抗体を産生する６つが同定された（すなわち、３－Ａ１１－Ｈ３－Ｆ３、５－Ｄ４－Ｄ１、７－Ｄ１２－Ｂ１１－Ｄ１２、８－Ｆ１１－Ｄ－４、９－Ｆ５－Ｈ２－２－Ｇ１１－Ｆ６及び１０－Ｆ１０－Ｄ７－Ｂ１）。全細胞パッチクランプ実験を実施して、ヒトＩＫｓチャネルを安定的に発現するＣＨＯ細胞におけるＩＫｓ電流に対する６つ全てのモノクローナル抗体の効果を研究した。３０μｇ／ｍｌ ＩｇＧの濃度を試験する選択は、ポリクローナルＫＣＮＱ１抗体に関する以前のデータに基づいた（Ｍａｇｕｙ，Ｋｕｃｅｒａ，Ｗｅｐｆｅｒ，Ｆｏｒｅｓｔ，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ＆Ｌｉ，２０２０）。図１に例示されるように、ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４（配列番号１～６に記載されるＣＤＲを含む）は、ポリクローナル抗体集団の効果を最もよく複製した。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、平均ＩＫｓステップ電流を＋７０ｍＶで１．６倍、平均ＩＫｓテール電流を－４０ｍＶに再分極すると１．５倍増加させた（図２Ａ～２Ｄ）。モノクローナル抗体で処理したＣＨＯ細胞の容量は、対照群と同様であった。ポリクローナルＫＣＮＱ１抗体に類似して、ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、半最大活動電位（Ｖ１／２）を－９ｍＶシフトし、一方、不活性化の電圧依存性をより負の電位に１１ｍＶシフトした（図２Ｅ～２Ｆ）。電圧感度を反映する活性化及び不活性化スロープ係数ｋは変化しなかった。
【0081】
実施例３－ＫＣＮＱ１モノクローナル抗体ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の特徴付け
次に、心再分極に対するＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の効果を様々な濃度で試験した（図４Ａ及び４Ｂ）。全ての活動電位（ＡＰ）パラメータを表１に記載する。
次に、心再分極に対するＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の効果を様々な濃度で試験した（図４Ａ及び４Ｂ）。全ての活動電位（ＡＰ）パラメータを表１に記載する。
【表1】
【0082】
モノクローナル抗体によるＡＰＤ９０の濃度依存的な低下が、シグモイド濃度－応答関係で観察された（図４Ｃ）。半最大有効濃度（ＥＣ５０）を、５．７μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４で計算した。それぞれのＫＣＮＱ１ペプチドに結合するモノクローナル抗体の動態は、ＳＰＲ技法で決定された（図９）。抗体－抗原相互作用について、以下の平均会合速度定数（オンレート、ｋａ）、平均解離速度定数（オフレート、ｋｄ）、及び平均平衡解離速度定数（ＫＤ）の値を計算した（±標準偏差）：ｋａ＝９．０９×１０４±１．５３×１０３Ｍ－１ｓ－１、ｋｄ＝８．２０×１０－４±５．３４×１０－５ｓ－１、ＫＤ＝９．０２×１０－９±６．９９×１０－１０Ｍ。したがって、同定されたモノクローナル抗体ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、ナノモル範囲のＫＤ値と全体的に高い親和性を示す。
【0083】
実施例４－ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の構造的エピトープマッピング
コンセンサスモチーフＶＥＦＧ（我々の標的エピトープに対応する配列、すなわち、ＫＣＮＱ１の第５の膜貫通ドメインと第６の膜貫通ドメインとの間の細胞外ループ）を有する隣接するペプチドによって形成されるエピトープ様スポットパターンに対する非常に強い抗体応答が、全てのペプチド長で観察された（図７）。この配列に先行するアルギニン（Ｒ）アミノ酸は、同様に、抗体結合に寄与し得る。コンセンサスモチーフ
を有するペプチドについては、更なる有意に弱い相互作用が見出され、おそらくマイナー配列相同性（下線付きアミノ酸位置）に基づく交差反応によるものである。それにもかかわらず、両方のペプチド配列は細胞内に位置しているため、循環抗体に容易にアクセスすることはできない。
コンセンサスモチーフＶＥＦＧ（我々の標的エピトープに対応する配列、すなわち、ＫＣＮＱ１の第５の膜貫通ドメインと第６の膜貫通ドメインとの間の細胞外ループ）を有する隣接するペプチドによって形成されるエピトープ様スポットパターンに対する非常に強い抗体応答が、全てのペプチド長で観察された（図７）。この配列に先行するアルギニン（Ｒ）アミノ酸は、同様に、抗体結合に寄与し得る。コンセンサスモチーフ
【化1】
【0084】
実施例５－ＫＣＮＱ１－８－Ｆ１１－Ｄ４ ＩｇＧ２ａドッキング
ペプチドベースのエピトープマッピングアプローチは、ＫＣＮＱ１チャネルの三次及び／又は四次構造の関与を特定する可能性が低いため、計算ドッキングを実施した。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の可変領域の重（Ｈ）及び軽（Ｌ）鎖コード配列をｍＲＮＡから増幅させ、クローニングし、親和性精製モノクローナル抗体のタンパク質配列決定と比較することによって検証した。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の軽鎖及び重鎖可変配列は、それぞれ、配列番号７及び８に記載されている。配列を確認するために、組換えマウスＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４抗体を開発し、ヒトＩＫｓを安定的に発現するＣＨＯ細胞に対してパッチクランプ測定を実施した。３０μｇ／ｍｌの組換え抗体の存在下で、ＩＫｓテール電流が１．５倍増加した一方で、＋７０ｍＶでの対照細胞と比較して、ＩＫｓステップ電流の同様の１．６倍の増加が観察された。次いで、計算ドッキング方法を使用して、ＩｇＧ２ａの表面曝露可変領域とＫＣＮＱ１チャネルとの間で抗原－抗体結合部位を検索した（図８Ａ）。軽鎖（Ｃｙｓ９４）及び重鎖（Ｔｙｒ５８、Ａｓｐ６１）からの重要な残基は、チャネルの第３の細胞外ループのＡｓｐ２８６及びＬｙｓ２８５アミノ酸への水素結合接触を媒介すると予測された（図８Ｂ）。重鎖のＩｇＧ軽鎖のＡｓｐ１残基及びＡｓｐ６１は、それぞれ、ＫＣＮＱ１のＡｓｐ２８６及びＬｙｓ２８５とイオン相互作用を形成する（図８Ｂ）。
ペプチドベースのエピトープマッピングアプローチは、ＫＣＮＱ１チャネルの三次及び／又は四次構造の関与を特定する可能性が低いため、計算ドッキングを実施した。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の可変領域の重（Ｈ）及び軽（Ｌ）鎖コード配列をｍＲＮＡから増幅させ、クローニングし、親和性精製モノクローナル抗体のタンパク質配列決定と比較することによって検証した。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の軽鎖及び重鎖可変配列は、それぞれ、配列番号７及び８に記載されている。配列を確認するために、組換えマウスＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４抗体を開発し、ヒトＩＫｓを安定的に発現するＣＨＯ細胞に対してパッチクランプ測定を実施した。３０μｇ／ｍｌの組換え抗体の存在下で、ＩＫｓテール電流が１．５倍増加した一方で、＋７０ｍＶでの対照細胞と比較して、ＩＫｓステップ電流の同様の１．６倍の増加が観察された。次いで、計算ドッキング方法を使用して、ＩｇＧ２ａの表面曝露可変領域とＫＣＮＱ１チャネルとの間で抗原－抗体結合部位を検索した（図８Ａ）。軽鎖（Ｃｙｓ９４）及び重鎖（Ｔｙｒ５８、Ａｓｐ６１）からの重要な残基は、チャネルの第３の細胞外ループのＡｓｐ２８６及びＬｙｓ２８５アミノ酸への水素結合接触を媒介すると予測された（図８Ｂ）。重鎖のＩｇＧ軽鎖のＡｓｐ１残基及びＡｓｐ６１は、それぞれ、ＫＣＮＱ１のＡｓｐ２８６及びＬｙｓ２８５とイオン相互作用を形成する（図８Ｂ）。
【0085】
実施例６－インビトロでのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４モノクローナル抗体の治療可能性
ｈｉＰＳＣ－ＣＭＣにおいてＬＱＴＳ ２型を薬理学的に誘導するために、選択的ｈＥＲＧ阻害剤（Ｅ－４０３１）を使用した。１０ｎＭの濃度でのＥ－４０３１は、ＡＰＤ９０の４倍の増加（表２）及び頻繁な早期後脱分極（ＥＡＤ、７１．４％、図５Ａ）をもたらした。１つの細胞は、不整脈性拍動をも発症し、その後、拍動停止で変性した（図５Ａ）。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、３０μｇ／ｍｌの濃度でＡＰＤ９０を有意に短縮した（図５Ｂ、表２）。更に、モノクローナル抗体は、不整脈性事象を完全に鈍化させた（図５Ｃ）。
ｈｉＰＳＣ－ＣＭＣにおいてＬＱＴＳ ２型を薬理学的に誘導するために、選択的ｈＥＲＧ阻害剤（Ｅ－４０３１）を使用した。１０ｎＭの濃度でのＥ－４０３１は、ＡＰＤ９０の４倍の増加（表２）及び頻繁な早期後脱分極（ＥＡＤ、７１．４％、図５Ａ）をもたらした。１つの細胞は、不整脈性拍動をも発症し、その後、拍動停止で変性した（図５Ａ）。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、３０μｇ／ｍｌの濃度でＡＰＤ９０を有意に短縮した（図５Ｂ、表２）。更に、モノクローナル抗体は、不整脈性事象を完全に鈍化させた（図５Ｃ）。
【表2】
【0086】
次に、後期ＩＮａ電流ＡＴＸ－ＩＩを特異的に強化する（Ｋａｒａｇｕｅｕｚｉａｎ，Ｐｅｚｈｏｕｍａｎ，Ａｎｇｅｌｉｎｉ＆Ｏｌｃｅｓｅ，２０１７）、ＡＴＸ－ＩＩを使用したＬＱＴＳ ３型の細胞モデルにおけるＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４モノクローナル抗体の効果を研究した。５ｎＭのＡＴＸ－ＩＩは、ＡＰＤ９０を２倍延長し（表３）、ＥＡＤ（２５％、図６Ａ）、並びに不整脈性拍動（８１．３％、図６Ａ）を誘発した。細胞を３０μｇ／ｍｌのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４で処理したとき、ＡＰＤ９０は一貫して正規化され（図６Ｂ～６Ｄ、表３）、ＥＡＤは抑制され、不整脈性拍動は低減した（図６Ｃ）。
【表3】
【0087】
考察：
本研究は、抗不整脈治療に適応可能なマウスモノクローナル抗体を同定した。まとめると、ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、細胞外細孔ループを特異的に標的とし、ＫＣＮＱ１チャネルを開放する。得られたＫ＋流出（ＩＫｓ電流の増加）は、ｈｉＰＳＣ－ＣＭＣにおける心再分極相を短縮する。その治療可能性は、薬理学的ＬＱＴＳ２の細胞モデルにおいて検証された。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、病理学的に遅延したＡＰＤを正常化し、不整脈性事象を抑制した。更に、その種の最初のものとして、モノクローナル抗体は、ＬＱＴＳ３の状況において、インビトロで好ましい転帰を証明した：ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、ＡＰＤを短縮し、抗不整脈特性を示した。ポリクローナル抗体を用いた以前のデータに基づいて、ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４を３０μｇ／ｍｌの濃度で試験した（Ｍａｇｕｙ，Ｋｕｃｅｒａ，Ｗｅｐｆｅｒ，Ｆｏｒｅｓｔ，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ＆Ｌｉ，２０２０）。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４のＫＤをナノモル範囲で測定し、膜結合標的に対するモノクローナル抗体に最適な高い結合親和性を示した（Ｔｉｗａｒｉ，Ａｂｒａｈａｍ，Ｈａｒｒｏｌｄ，Ｚｕｔｓｈｉ＆Ｓｉｎｇｈ，２０１７）。抗体－抗原相互作用をマッピングするために使用される実験的及び計算的方法の両方が、第５の膜貫通セグメントと第６の膜貫通セグメントとの間の予想される第３の細胞外ドメインを標的の特異的部位として描写した。構造的エピトープマッピングは、抗体とコンセンサスモチーフＶＥＦＧとの間の強い相互作用を示した。対照的に、ＫＣＮＱ１チャネルの三次及び四次構造を考慮したドッキングシミュレーションは、より近位のＫ及びＤアミノ酸残基に対する関連性を予測した。両方の知見は、ＬＱＴＳにおける治療有効性に対するそれぞれの重要性を一致して強調する。
本研究は、抗不整脈治療に適応可能なマウスモノクローナル抗体を同定した。まとめると、ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、細胞外細孔ループを特異的に標的とし、ＫＣＮＱ１チャネルを開放する。得られたＫ＋流出（ＩＫｓ電流の増加）は、ｈｉＰＳＣ－ＣＭＣにおける心再分極相を短縮する。その治療可能性は、薬理学的ＬＱＴＳ２の細胞モデルにおいて検証された。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、病理学的に遅延したＡＰＤを正常化し、不整脈性事象を抑制した。更に、その種の最初のものとして、モノクローナル抗体は、ＬＱＴＳ３の状況において、インビトロで好ましい転帰を証明した：ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、ＡＰＤを短縮し、抗不整脈特性を示した。ポリクローナル抗体を用いた以前のデータに基づいて、ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４を３０μｇ／ｍｌの濃度で試験した（Ｍａｇｕｙ，Ｋｕｃｅｒａ，Ｗｅｐｆｅｒ，Ｆｏｒｅｓｔ，Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ＆Ｌｉ，２０２０）。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４のＫＤをナノモル範囲で測定し、膜結合標的に対するモノクローナル抗体に最適な高い結合親和性を示した（Ｔｉｗａｒｉ，Ａｂｒａｈａｍ，Ｈａｒｒｏｌｄ，Ｚｕｔｓｈｉ＆Ｓｉｎｇｈ，２０１７）。抗体－抗原相互作用をマッピングするために使用される実験的及び計算的方法の両方が、第５の膜貫通セグメントと第６の膜貫通セグメントとの間の予想される第３の細胞外ドメインを標的の特異的部位として描写した。構造的エピトープマッピングは、抗体とコンセンサスモチーフＶＥＦＧとの間の強い相互作用を示した。対照的に、ＫＣＮＱ１チャネルの三次及び四次構造を考慮したドッキングシミュレーションは、より近位のＫ及びＤアミノ酸残基に対する関連性を予測した。両方の知見は、ＬＱＴＳにおける治療有効性に対するそれぞれの重要性を一致して強調する。
【0088】
実施例７－ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４のハイコンテントイメージング
以下の実験を実施して、ウサギ抗ＫＣＮＱ１（細胞外）抗体（Ａｌｏｍｏｎｅ ｌａｂｓ）及びマウスモノクローナル抗体ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４が、以下の細胞株におけるＫＣＮＱ１の細胞外ループに結合することができるかどうかを決定した。
以下の実験を実施して、ウサギ抗ＫＣＮＱ１（細胞外）抗体（Ａｌｏｍｏｎｅ ｌａｂｓ）及びマウスモノクローナル抗体ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４が、以下の細胞株におけるＫＣＮＱ１の細胞外ループに結合することができるかどうかを決定した。
【0089】
（１）ヒトＫｖ７．１／ＫＣＮＥ１（ＫｖＬＱＴ１／ｍｉｎＫ）－ＣＨＯ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ研究所から一緒に連結されたテトラサイクリン誘導性ＣＨＯ細胞株ＫＣＮＱ１－ＫＣＮＥ１）。カタログ番号ＣＴ６１０１
（２）上記と同様であるが、誘導されない（陰性対照として）。
（３）ＣＨＯ ＫｖＬＱＴ１／ＭｉｎＫ（ＫＣＮＱ１及びＫＣＮＥ１が別々に発現した）細胞株
（４）ＣＨＯ Ｋ１－ＷＴ（追加の陰性対照）。
（２）上記と同様であるが、誘導されない（陰性対照として）。
（３）ＣＨＯ ＫｖＬＱＴ１／ＭｉｎＫ（ＫＣＮＱ１及びＫＣＮＥ１が別々に発現した）細胞株
（４）ＣＨＯ Ｋ１－ＷＴ（追加の陰性対照）。
【0090】
簡潔に述べると、試験抗体を、氷冷アッセイ緩衝液で２回洗浄し、次いで４℃で１～２時間インキュベートした細胞に添加した。次いで、細胞を氷冷アッセイ緩衝液で３回洗浄し、フルオロフォアコンジュゲート二次抗体を氷冷アッセイ緩衝液中で適切な希釈で添加し、遮光しながら４℃で１時間インキュベートした。次に、５００ｎＭのＨｏｅｓｃｈｔ染料を、最終使用のために氷冷ＰＢＳを添加し、室温で５分間インキュベートし、氷冷アッセイ緩衝液で３回洗浄し、次いで排水した。次いで、顕微鏡検査を進める前に、氷冷ＰＢＳを添加して細胞を覆った。
【0091】
結果は、ウサギポリクローナルＫＣＮＱ１（細胞外）及びマウスモノクローナルＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４抗体が、誘導性及び安定性ＣＨＯＫ１細胞株の両方でＫＣＮＱ１に結合することを示した（図１０Ａ及び１０Ｂを参照）。
【0092】
実施例８－インビボでのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４モノクローナル抗体のＱＴ間隔の短縮
ウサギ（雄、ニュージーランドホワイト）に、リード２位のＭｉｌｌａｒ ＥＣＧ遠隔測定電極を移植し、７日の最小回復期間を与えた。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４を、１０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ５．２、０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、９％（ｗ／ｖ）のスクロース中、２０ｍｇ／ｍＬで製剤化した。遠隔測定されたウサギを、様々な用量のＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４（５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクルで処置した。
ウサギ（雄、ニュージーランドホワイト）に、リード２位のＭｉｌｌａｒ ＥＣＧ遠隔測定電極を移植し、７日の最小回復期間を与えた。ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４を、１０ｍＭの酢酸塩、ｐＨ５．２、０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０、９％（ｗ／ｖ）のスクロース中、２０ｍｇ／ｍＬで製剤化した。遠隔測定されたウサギを、様々な用量のＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４（５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクルで処置した。
【0093】
実験日に、モノクローナル抗体又はビヒクルを２ｍＬ／ｋｇで（辺縁耳静脈を介して）静脈内注射する前に、ＥＣＧを５分間連続的に記録した。動物を、連続的なＥＣＧ記録のためにプラスチックケージ内に移し、投与後２３時間まで５分毎に測定値を記録した。ＥＣＧを、記録しながらリアルタイムで自動的に分析した。ＱＴ間隔の定常状態短縮（すなわち、２３時間）に続いて、動物をケタミン／キシラジンで麻酔し、メトキサミン＋ドフェチリドチャレンジ（カールソンモデル）のために調製した。カールソンのチャレンジは、動物がＴｄＰに進行するか、又は４０分のメトキサミン注入が経過するまで継続した。図１１に示されるように、ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４での処置は、全ての試験用量でウサギのＱＴ間隔の短縮をもたらした。ＱＴ間隔の初期短縮は、投与後６～１２時間で観察され、投与後約１２～２０時間でプラトー／定常状態短縮が観察された。
【0094】
実施例９－ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４モノクローナル抗体は、用量依存的に薬物誘導性ＱＴ延長に対する保護を提供した
抗ＫＣＮＱ１抗体がＱＴ延長症候群のモデルにおいて効果を有するかどうかを決定するために、ウサギに、様々な用量のＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４（５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ若しくは４０ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクルを投与した２３時間後に、ドフェチリド及びメトキサミンでチャレンジして、動物においてより長いＱＴ間隔を誘導した。ドフェチリド注入後、５分毎に最大３０分間ＥＣＧ記録を行った。図１２に示されるように、ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４治療は、薬物誘導性ＱＴ延長及び不整脈から保護する。カールソンモデル誘導を、投与後２３時間で実施した。薬物誘導性ＱＴ延長に対する用量依存的な保護が観察された。最高用量（４０ｍｇ／ｋｇ）では、カールソンモデルの誘導後のＱＴ間隔は、ビヒクルよりも１００ｍｓ短かった。この用量で処置したウサギは、トルサード・ド・ポワンツを経験しなかった。
抗ＫＣＮＱ１抗体がＱＴ延長症候群のモデルにおいて効果を有するかどうかを決定するために、ウサギに、様々な用量のＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４（５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ若しくは４０ｍｇ／ｋｇ）又はビヒクルを投与した２３時間後に、ドフェチリド及びメトキサミンでチャレンジして、動物においてより長いＱＴ間隔を誘導した。ドフェチリド注入後、５分毎に最大３０分間ＥＣＧ記録を行った。図１２に示されるように、ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４治療は、薬物誘導性ＱＴ延長及び不整脈から保護する。カールソンモデル誘導を、投与後２３時間で実施した。薬物誘導性ＱＴ延長に対する用量依存的な保護が観察された。最高用量（４０ｍｇ／ｋｇ）では、カールソンモデルの誘導後のＱＴ間隔は、ビヒクルよりも１００ｍｓ短かった。この用量で処置したウサギは、トルサード・ド・ポワンツを経験しなかった。
【0095】
実施例１０－ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の機能的特徴付け
この研究の目的は、手動パッチクランプ技法を使用して、哺乳動物細胞におけるＩＫｓチャネル複合体（ＫＣＮＱ１＋ＫＣＮＥ１）に対する試験抗体の影響を決定することであった。
この研究の目的は、手動パッチクランプ技法を使用して、哺乳動物細胞におけるＩＫｓチャネル複合体（ＫＣＮＱ１＋ＫＣＮＥ１）に対する試験抗体の影響を決定することであった。
【0096】
ｔｓＡ２０１細胞（形質転換されたヒト胚性腎臓２９３細胞）を、１０％のウシ胎仔血清及び１００μｇ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、及び０．２５ １００μｇ／ｍｌのアンフォトレシンを補充した改変イーグル培地（ＭＥＭ）中で増殖させた。ＴｓＡ２０１細胞は、構築物で使用されるｐＣＤＮＡ３．１などのＳＶ４０ベクターを含有するベクターのより高いレベルの発現を可能にする、ＳＶ４０大腫瘍抗原で安定的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞である。細胞を、空気／５％ ＣＯ２インキュベーター内で３７℃に維持した。トランスフェクションの前日、細胞をＭＥＭで洗浄し、トリプシン／ＥＧＴＡで１分間処理し、２５ｍｍのカバースリップ上にプレーティングした。リポフェクタミン２０００を使用して、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＥ１及びＧＦＰ ｃＤＮＡをトランスフェクトした。
【0097】
緑色蛍光タンパク質ｃＤＮＡ（ＧＦＰ、１μｇ）を、ＫＣＮＱ１及びＫＣＮＥ１とともに共トランスフェクトして、トランスフェクトされた細胞を同定した。抗体処理は、トランスフェクションの２４時間後に開始して、２４時間の期間行った。電気生理学的手順：細胞を含有するカバースリップを、インキュベーターから取り出し、外部バス溶液を含有する超融合チャンバ（体積２５０μｌ）に配置し、室温で維持した。試験抗体（３０μｇ／ｍＬ）は、実験を通して外部溶液中に存在した。全細胞電流記録は、Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器を使用して実施した。パッチ電極を、水平マイクロピペットプラー上の薄壁ホウケイ酸ガラスから引っ張り、火炎研磨した。電極は、対照充填溶液で充填した場合、１．５～３．０ｍＷの抵抗を有した。全ての測定で、アナログ容量補正及び６０％～８５％の直列抵抗補正を使用した。データを、１０～２０ｋＨｚでサンプリングし、デジタル化前に５～１０ｋＨｚでフィルタリングし、ｐＣｌａｍｐ１０ソフトウェアを使用して後の分析のためにコンピュータに保存した。－８０ｍＶ～＋８０ｍＶのパルスを用いる４秒ステッププロトコル、続いて２秒間の－４０ｍＶへの再分極化ステップからなる電流－電圧（Ｉ－Ｖ）プロトコルを適用した。保持電位は－９０ｍＶであり、パルス間隔は１５秒であった。
【0098】
結果：
電流密度は、ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の存在下で、３０μｇ／ｍＬ（図１３Ａ）及び６０μｇ／ｍＬ（図１３Ｂ）の濃度で増加した。特に、ＩＫｓステップ及びテール電流密度は、３０μｇ／ｍＬ及び６０μｇ／ｍＬのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の両方で－２０ｍＶよりも正の膜電位で増加した（図１４及び１５）。重要なことに、－２０ｍＶよりも正の膜電位での電流密度の増加は、ＩＫｓチャネルが開いている生理学的に関連する電位に対応する（Ｊｅｓｐｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２０：４０８－４１６，２００５）。３０ｕｇ／ｍＬ及び６０ｕｇ／ｍＬの両方で、ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、活性化の電圧依存性をより負の電位に有意にシフトした（それぞれ、表４及び５）。
電流密度は、ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の存在下で、３０μｇ／ｍＬ（図１３Ａ）及び６０μｇ／ｍＬ（図１３Ｂ）の濃度で増加した。特に、ＩＫｓステップ及びテール電流密度は、３０μｇ／ｍＬ及び６０μｇ／ｍＬのＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の両方で－２０ｍＶよりも正の膜電位で増加した（図１４及び１５）。重要なことに、－２０ｍＶよりも正の膜電位での電流密度の増加は、ＩＫｓチャネルが開いている生理学的に関連する電位に対応する（Ｊｅｓｐｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２０：４０８－４１６，２００５）。３０ｕｇ／ｍＬ及び６０ｕｇ／ｍＬの両方で、ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、活性化の電圧依存性をより負の電位に有意にシフトした（それぞれ、表４及び５）。
【表4】
【表5】
【0099】
結論：ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、ヒトＩＫｓチャネルを発現するように一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＫ＋流出を増加させた。
【0100】
実施例１１－ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の結合親和性
ＫＣＮＱ１チャネルタンパク質の細胞外ループ領域に対応する標的ペプチドに対するマウスモノクローナル抗ＫＣＮＱ１モノクローナル抗体ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の親和性を決定するために、以下の実験を実施した。
ＫＣＮＱ１チャネルタンパク質の細胞外ループ領域に対応する標的ペプチドに対するマウスモノクローナル抗ＫＣＮＱ１モノクローナル抗体ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４の親和性を決定するために、以下の実験を実施した。
【0101】
ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４とのＫＣＮＱ１ペプチド相互作用の結合動態を、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６バイオレイヤー干渉法（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用してモニタリングした。全ての測定は、１，０００ｒｐｍの軌道振れ速度を有する９６ウェルプレートを使用して、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、１×動態緩衝液及び１％ ＢＳＡを含有するアッセイ特異的緩衝液中、２５℃で二重に実施した。結合曲線は、最初に１ｍＭのＮ末端ビオチン化ＫＣＮＱ１ペプチドをストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサーチップに２．５分間固定し、続いて５分間ベースライン平衡化ステップを行うことによって生成された。次いで、バイオセンサーチップを、１００ｍＭのｍＡｂを含むウェルに５分間沈めて、ｍＡｂ－ペプチド複合体の形成をモニタリングし、続いてアッセイ緩衝液中で５分間抗体解離を行った。抗体結合／解離によって引き起こされるバイオセンサー先端の表面から反射される白色光の干渉パターンのシフトを、リアルタイムでモニタリングした。抗体－ペプチド相互作用を１：１結合モデルによって分析し、解離定数（ＫＤ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍの非線形適合モデルを使用して導出された解離（ｋｏｆｆ）及び会合（ｋｏｎ）結合速度定数の比として決定した。
【0102】
結果：
ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、高い親和性（ＫＤ＝約４ｎＭ）でＫＣＮＱ１ペプチドと相互作用した。図１６を参照されたい。
ＩｇＧ２ａ ８－Ｆ１１－Ｄ４は、高い親和性（ＫＤ＝約４ｎＭ）でＫＣＮＱ１ペプチドと相互作用した。図１６を参照されたい。
【0103】
参考文献：
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【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【配列表】
【国際調査報告】